不溶性薬剤の制御放出のための、シクロデキストリンおよびポリ（アミドアミン）に基づく超分岐ポリマー
ビスアクリルアミドへのα−、β−またはγ−シクロデキストリンおよびアミンのマイケル型重付加により得ることができる超分岐水溶性ポリマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬剤の制御放出系に関し、特に、疎水性の高い薬剤、特にタキサン（パクリタキセルまたはドセタキセル）、カンプトテシンおよびその誘導体ならびにエトポシドのような抗腫瘍薬剤と複合して水媒体に溶解させ、それらを注射によっても投与し得るようにすることができる親水性ポリマーの使用を含むものである。現在まで、これらの薬剤は、特定の種類の癌に対して最も効果的であると知られているものであるが、それらの投与にはその不溶性が原因で重大な問題がある。本発明は、同じ溶解制限を示すアシクロビルや関連薬剤のような難溶性抗ウイルス薬剤にも適用される。
【背景技術】
【０００２】
文献に記載の多くの努力にかかわらず、タキサン（パクリタキセルまたはドセタキセル）、カンプトテシンおよびその誘導体、エトポシドおよび難水溶性抗ウイルス化合物（例えば、アシクロビル）の投与の問題は、なお、満足できる程度に解決されるべきものである。前述の全ての薬剤が、患者において重度の副作用、例えば、末梢性神経障害、徐脈、粘膜および静脈系への毒性を誘発する。
【０００３】
例えば、パクリタキセルは、現在、エタノール５０％を含むヒマシ油ポリエトキシル化誘導体Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（登録商標）を用いて２ｍｇ／ｍｌの濃度で処方される。製剤は注射により投与される。パクリタキセルへの重度の過敏症は、通常、その投与に用いられるＣｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（登録商標）に関与している。その結果、過敏症の危険を低下させるために、パクリタキセルの投与の前に、患者は、経口的にデキサメタゾンを用いて、または静脈内にジフェンヒドラミンおよびラニチジンを用いて前処理を受ける。Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）の使用を避ければ、患者へのこの前処理の必要および関連する危険性はないだろう。さらに、パクリタキセル治療の費用が著しく低下する。
【０００４】
患者へのタキサンの投与を改良するための多くの努力が文献に記載されてきているが、今まで、決定的改良を明確に提供したものは無かった。前記努力のうち、以下のものが挙げられる。
【０００５】
パクリタキセルを加えたブロックコポリマーのナノ粒子、例えば、メトキシ−ＰＥＧ−ポリカプロラクトン（非特許文献１）またはメトキシ−ＰＥＧ−ポリ乳酸−コ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）（非特許文献２）または疎水化ポリ（Ｌ−リシンシトラミドイミド）（非特許文献３）の生分解性化合物。
【０００６】
ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸またはポリリシンのような水溶性ポリマーと組み合わされたポリマー（特許文献１）、またはポリエチレングリコール誘導体と組み合わされたプロドラッグ。
【０００７】
パクリタキセルとシクロデキストリンとの包接錯体。シクロデキストリンは、α−１−４結合により結合された６−８グリコシド単位を有する環式オリゴ糖であり、その構造中に疎水性空隙を有することを特徴とし、水不溶性薬剤を可溶化することができる。例えば、２−６−ジメチル−β−シクロデキストリンは、パクリタキセルと包接化合物を形成することが知られており、その溶解度は２．３モル／Ｌ（約３ｇ／Ｌ）である（非特許文献４）。タキサンと修飾シクロデキストリンとの包接錯体の主な欠点は、水性媒体への乏溶性である。実際、水溶性溶媒、例えばアルコール中のパクリタキセル溶液を、シクロデキストリン誘導体の水溶液と混合することによる錯体の形成は、当初は有望であると思われていた。しかしながら、得られる透明溶液は、やがて、不溶性パクリタキセルを再放出し、それが分かれて結晶するときに錯体から取り去られる。パクリタキセル溶液を凍結乾燥し続いて残渣を水中に再溶解することは、この場合でもパクリタキセルが結晶して除去されるので、やはり役に立たない。この問題は、シクロデキストリンダイマーを用いてある程度解決されるのみである。さらに、これらのダイマー中において個々のシクロデキストリンがアミノ架橋により相互に結合されて、分子にある程度の毒性を与える。
【０００８】
シクロデキストリン基がポリマー鎖に沿ってランダム分布しているシクロデキストリン直鎖ポリマー。これらのポリマーは、パクリタキセルまたは類似の薬剤との錯体の形成において、遊離シクロデキストリンと同じ制限を受ける。何故なら、ポリマー中に存在する異なるシクロデキストリン単位は、溶液中のポリマーが比較的拡張した構造を得たときには、ポリマー鎖に沿って分布することにより離れることで、それらの連携が阻害されるからである。
【０００９】
カンプトテシンについては、その安定性（ラクトン環のカルボキシレート型への開環）および溶解性の問題を克服するために、複数の手法が検討されてきた。特に、α−シクロデキストリンとの錯体形成により、カンプトテシンの安定性が向上し、それにより、溶解性および細胞毒性プロフィールが改善される（非特許文献５）。
【００１０】
アシクロビルは、半減期が短く（約２時間）、その吸収は完全ではない（生物学的利用能が約１５〜３０％である）。その限定された経口的生物学的利用能故に、アシクロビルは一日当たり５回（４時間毎に２００ｍｇ）経口的に摂取しなくてはならず、一方、静脈内製剤（５ｍｇ／ｋｇ）は少なくとも５日間、８時間毎に投与しなくてはならない。さらに、アシクロビルの静脈内一回量は、尿細管内での沈降を防止するために、ゆっくりと１時間かかって投与すべきである。
【００１１】
抗ウイルス薬剤の効能を増加させるために、例えばポリ（イソブチルシアノアクリレート）ナノカプセル中への封入（非特許文献６）のような種々の送達手法が提案された。粒状送達系は、抗ウイルス薬剤の徐放を促進することができた。局所投与用のアシクロビル含有ＰＬＧＡミクロ粒子が開発され（非特許文献７）、アシクロビル付加ナノ粒子は、培養細胞においてＩ型単純ヘルペスウイルスに対する効能増加を示した（非特許文献８）。７９％までのアシクロビルを含む、デキストランまたはキトサン上にグラフトされたアクリルアミドの半相互貫入ポリマーネットワーク微粒子を、エマルジョン−架橋法により調製した（非特許文献９）。
【００１２】
アシクロビルの経口的生物学的利用能を向上させるためのプロドラッグも設計された（非特許文献１０）。
【００１３】
β−シクロデキストリンとのポリ（アミドアミン）（ＰＡＡ）コポリマーは、１１％ｗ／ｗまでの薬剤を錯化させることにより可溶化することができ、アシクロビル錯体は、培養細胞においてＩ型単純ヘルペスウイルスに対して、遊離薬剤よりも高い抗ウイルス活性を示す（非特許文献１１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】ＵＳ ６４４１０２５
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｓ．Ｙｅｏｎ Ｋｉｍ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２２ （２００１ １６９７−１７０４）
【非特許文献２】Ｊｉ−Ｈｅｕｎｇ Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｆｏｒ ａｄｖａｎｃｅｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，１０ ６４９，１９９９
【非特許文献３】Ｍ．Ｖｅｒｔ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｖｏｌ．１５ Ｎｏ．２，９９−１１４（２０００）
【非特許文献４】Ｈ．Ｈａｍａｈａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２００６，１０２，３６９−３７１
【非特許文献５】Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．２００２，１５，１６３−１７０
【非特許文献６】Ｈｉｌｌａｉｒｅａｕ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ，Ｊ，Ｐｈａｒｍ．２００６，３２４，３７−４２
【非特許文献７】ｄｅ Ｊａｌｏｎ，２００１，２２６，１８１，１８４
【非特許文献８】ｄｅ Ｊｅｌｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒｏｐ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．（２００３）５６，１８３−１８７
【非特許文献９】Ｒｏｋｈａｄｅ ｅｔ ａｌ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｐｏｌｙｍ．（２００７）６０５−６０７
【非特許文献１０】Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃ．Ｓｃｉ．２００４，２３，３１９−３２５
【非特許文献１１】Ｂｅｎｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ ２００８，１２６，１７−２５
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
（発明の詳細な開示）
本発明は、シクロデキストリン単位がエーテル基によりポリ（アミドアミン）の短いセグメントに結合されているものであって、ビスアクリルアミドへのα−、β−またはγ−シクロデキストリンおよびアミンのマイケル型重付加により調製される新規超分岐ポリマーに関する。本発明のポリマーの構造のスキームを図１に示す。
【００１７】
これらのポリマーは、完全に水溶性であり、僅かに架橋しているものは、高度の親水性であり、溶液に見える透明水懸濁液を与える。多くの場合、これらのポリマー懸濁液は、ナノ粒子の状態である。
【００１８】
好ましくは、ポリ（アミドアミン）セグメントは両性であり、例えば、アミンコモノマーは２−メチルピペラジンであり、ビスアクリルアミドは２，２−ビスアクリルアミド酢酸である。実際、両性ポリ（アミドアミン）、特に、前述したモノマーから得られるＩＳＡ２３と称するポリ（アミドアミン）は、高度に生体適合性であると分かった。何故なら、これらは、生物の防御系により認識されず、健全な実験動物において長時間循環することができ、また腫瘍を有する実験動物においては、所謂ＥＰＲ効果（血管透過性亢進と蓄積効果（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ Ｅｆｆｅｃｔ））により腫瘍塊中で選択的に濃縮されるからである。この効果は、正常毛細血管の壁を通過することはできないが、腫瘍塊中の新生毛細血管のより分離された壁は通過することができる、血液循環中に存在する高分子ポリマーが原因である。これらは、いったん腫瘍中に貫入すると、腫瘍は充分なリンパ排液系を有さないので、殆ど出てこない。さらに、これらのポリ（アミドアミン）は、高度に親水性であるので、水不溶性物質を溶解する性能が高い。最後に、前記ポリ（アミドアミン）は、標的細胞または細胞群、例えば、腫瘍細胞への正確な誘導を確保することができるペプチド単位を導入することにより容易に官能化することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の超分岐ＰＡＡ／シクロデキストリンポリマーの一般構造を示す図である。
【図２】実施例１に報告されたように合成された超分岐ＰＡＡ／β−シクロデキストリンポリマーの構造を示す図である。
【図３】実施例１に報告されたように合成された超分岐ＰＡＡ／β−シクロデキストリンポリマーの１Ｈ ＮＭＲスペクトルである。
【図４】実施例１のポリマーのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルである。
【図５】単官能連鎖停止剤としてのＮ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミドを用いて合成された超分岐ＰＡＡ／β-シクロデキストリン（実施例２）の模式的に示したものである。
【図６】連鎖停止剤としてのＮ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミドを用いて合成された超分岐ＰＡＡ／β-シクロデキストリン（実施例２）の１Ｈ ＮＭＲスペクトルである。
【図７】水性分散液からの実施例３のポリマーのＴＥＭ顕微鏡写真である（倍率：６９０００×）。
【図８】実施例３に報告されたポリマーのＤＳＣ波形を示す図である。
【図９】実施例３に報告されたポリマーのパクリタキセル錯体の、その水性分散液の凍結乾燥の前（ａ）および後（ｂ）における、ＴＥＭ顕微鏡写真である。
【図１０】典型的超分岐ＰＡＡ-シクロデキストリンポリマーとの錯体からの、パクリタキセル放出速度を示す図である。
【図１１】遊離パクリタキセルおよび、超分岐ＰＡＡ-シクロデキストリンポリマーとのその錯体の、試験管内細胞毒性アッセイのグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
より詳しくは、本発明は、以下のようなポリマーに関する：
水酸基の少なくとも一つがアルコキシ基に転換されているα−シクロデキストリン、β−シクロデキストリンもしくはγ−シクロデキストリンまたはその誘導体から、シクロデキストリン単位（ＣＤ、図１参照）が誘導される：
ポリアミドアミンセグメントが以下に示す構造を有する：
【００２１】
【化１】
【００２２】
（式中：
Ｒ1およびＲ3は、同一または異なって、ＨまたはＣ1-4アルキル基であり、
Ｒ2はＣ1-4アルキレン基である、
または
Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、単一環式構造の一部であり、順にＲ1およびＲ3と同じ性質の側鎖置換基を有し、
Ｒ4およびＲ6は、同一または異なって、ＨまたはＣ1-6アルキル基である、または、前記残基の一つが順にＲ1およびＲ3と同じ性質の側鎖置換基を有している、
または
Ｒ4、Ｒ5およびＲ6は、単一環式構造の一部であり、順にＲ1、Ｒ2およびＲ3と同じ性質の側鎖置換基を有する、
または
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5およびＲ6は先に定義したようなアルキルまたはアルキレン基であり、順に、第１級、第２級または第３級アミノ基、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基およびアルコールヒドロキシ基のようなさらなる置換基を有し、
ｎは、１〜５０、好ましくは２〜１０の範囲である。）。
【００２３】
前記ポリマーの単純化した構造を図１に示す。これらポリマーにおいて、シクロデキストリン単位は、例えば図２に示すように、一または二以上のヒドロキシル基を介して、エーテル結合によって、ポリ（アミドアミン）セグメントに結合される。
【００２４】
前述のように、本発明のポリマーは、第１級または２級アミンとアルカリ活性化シクロデキストリンとの混合物を、ビスアクリルアミドにマイケル型重付加することにより得られる。重合は、１０〜６０℃、好ましくは２０〜３５℃の範囲の温度で、１時間〜８日間、好ましくは８時間〜３日間、最も好ましくは１〜２日間の範囲の時間行われる。用いられる溶媒は、好ましくはプロトン性のもの、最も好ましくは水である。
【００２５】
本発明のポリマーを用いて、水不溶性活性分子を可溶化し含むことができる。好ましくは、本発明のポリマーにより、難水溶性薬剤、特に、タキサン、カンプトテシンおよび誘導体、アシクロビルおよび関連薬剤の水性注射可能薬製剤を調製することができる。前記製剤は、本発明のポリマー２０ｍｇ／ｍｌ〜１６０ｍｇ／ｍｌを含み、好ましくは、ドセタキセルまたはパクリタキセルの場合は活性分子を１ｍｇ／ｍｌ〜８ｍｇ／ｍｌ含み、カンプトテシンまたは類似誘導体の場合は１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ含み、アシクロビルおよび関連薬剤の場合は１ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ含む。さらに、前記製剤は、従来から使用されていると共に注射可能製剤の調製のための規制要求を満たす他の共溶媒または賦形剤を含むことができる。
【００２６】
本発明のポリマーおよびその製剤は、凍結乾燥することができる。得られる固体生成物は、活性分子の存在下および不存在下に単純に手で撹拌して水中に容易に再懸濁させることができる。
【００２７】
超分岐の非架橋（または、制御された架橋度の）構造は、出発混合物の化学量論量、温度および反応時間を適度に変化させて得られる。
【００２８】
用いられる調製手順は、以下の理論的根拠に基づく。
【００２９】
含まれる重合反応は、段階的重付加である。別々に２つの相補的官能基「ａ」および「ｂ」（「ａ」は慣例によりマイナー官能基）を有するモノマーを含む重合において、プロセスを支配する２つのパラメーターは、以下のように定義される初期化学量論比「ｒ」：
【００３０】
【数１】
【００３１】
（式中、Ｎａ0およびＮｂ0は、初期に存在する官能基ａおよびｂの数である）および、以下のように定義される変換度「ｐ」：
【００３２】
【数２】
【００３３】
（式中、Ｎａは、観察時に存在する官能基ａの数である）
であることが良く知られている。
【００３４】
定義として、ｒおよびｐの両方が明らかに１以下である。
【００３５】
２以上の官能基を有するモノマーを含む段階的重合（マルチまたは多官能性段階的重合）により、「臨界進歩度」と呼ばれる特定の値「ｐC」より高いｐ値で不溶性架橋生成物が得られる。ｐ＞ｐCの場合、系はその可動性を失い、この理由のために、ｐCは「ゲルポイント」とも呼ばれる。
【００３６】
多官能性モノマーに関する官能基が一つのタイプのみの場合、臨界進歩度ｐCは、Ｆｌｏｒｙ−Ｓｔｏｃｋｍａｙｅｒ式（例えば、Ｇ．Ｏｄｉａｎ“Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ”３ｒｄ Ｅｄ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＵＳＡ，１９９１を参照）：
【００３７】
【数３】
【００３８】
により表わされる。
【００３９】
ρは、系内に初期に存在する同じタイプの官能基の合計量に対する、官能基数が２を超えるモノマーの官能基の比：
【００４０】
【数４】
【００４１】
であり、ｒは前述のように定義される。
【００４２】
式（３）において、ｐCとｒが相関していることが明らかである。特に、ｒCと記載される臨界化学量論比が存在し、そこで系はゲル化することなく、超分岐しているがなお可溶性であるポリマーを産出する。
【００４３】
ｐ（および、従ってｐCも）は１を超えられないので、ｐC＝１と仮定して式（３）から理論的ｒC値を得、ｒについて解く。次に、以下の式：
【００４４】
【数５】
【００４５】
を用い、ρ＝１の場合、すなわち、系において、多官能モノマーがそのような官能基を有する唯一のものである場合、式（４）は下記式に換算される。
【００４６】
【数６】
【００４７】
式５は、潜在的マルチ官能性モノマーの活性官能基数を決めるための便利なツールを提供する、すなわち、この場合、マルチ官能性モノマーすなわちシクロデキストリンの水素の数は、付加反応の影響を受け易い。これは、過剰な二重結合を有する化学量論的に不均衡な反応体混合物についてｒCを実験的に決めることにより達成することができる。操作としては、進行的に過剰の二重結合を有する一連の不均衡反応混合物を、最大変換度に達するのに充分な時間、重合させることができる。ゲル化を阻害する最少過剰二重結合により、直ちにｒCが得られ、次にｆが得られる。採用された反応条件下において、β−シクロデキストリンのｆが決められ、５．５〜６の範囲であった。
【００４８】
さらに、式（３）と式（５）の両方を利用して、可溶性超分岐ポリマーまたは架橋度が制御された架橋ポリマーを得ることができる。実際、ｒ＜ｒCで全ての変換度において、超分岐されているが架橋されていない生成物が得られる。逆に、ｒ＞ｒCにおいては、変換度ｐ＜ｐCにおいて超分岐されているが架橋されていない生成物が得られ、変換度ｐ＞ｐCにおいて架橋生成物が得られる。
【００４９】
いずれの場合にも、ｒ(ｒCまたはｐ(ｐCの場合、すなわち、両方の値が臨界値から僅かにのみ相違している場合に、僅かに架橋された生成物が得られる。
【００５０】
単官能性化合物が存在している場合は、式（３）が有効でないことが一般的に認められており；これらの系のために、以下の代替式が考案された：
【００５１】
【数７】
【００５２】
（式中、ｆW.AおよびｆW.Bは、モノマー官能基の重量平均（単官能を含む）であり、以下のように定義される：
【００５３】
【数８】
【００５４】
（式中、ｆA.jおよびｆB.jは、それぞれＡ型およびＢ型の各モノマーの官能基を表し、ここで、ＮA.jおよびＮB.jは、系における対応するモル数である（例えば、Ｇ．Ｏｄｉａｎ“Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ”３ｒｄ Ｅｄ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＵＳＡ，１９９１を参照）））。
【００５５】
この場合にも、系がゲル化せず、超分岐しているがなお可溶性であるポリマーを生成する、臨界比ｒCを決めることができる。これは、ｐC＝１とし、ｒについて解くことにより決定される。得られる式は以下のものである：
【００５６】
【数９】
【００５７】
前述の事項を、以下の実施例によりさらに説明する。
【実施例】
【００５８】
（実施例１）
磁気撹拌器および窒素入口を備える２口丸底フラスコにおいて、２，２−ビス（アクリルアミド）酢酸ＢＡＣ（８ｍｍｏｌ，１．６１４７ｇ；９８．１８％）および水酸化リチウム一水和物（８ｍｍｏｌ，０．３９９０ｇ；９９．００％）を、窒素流下に蒸留水（４．５ｍｌ）に溶解した。結晶前に精製された２−メチルピペラジンＭｅＰを加えた（４ｍｍｏｌ，０．４２８２ｇ；９３．５６％）。完全な溶解後に、β−シクロデキストリン（１ｍｍｏｌ，１．１４６４ｇ；０．９９％，水１３．７％ｗ／ｗを含む）および水酸化リチウム一水和物（４．５ｍｍｏｌ，０．１９０７ｇ；９９．００％）を加えた。反応混合物のｐＨは１２．５であった。反応を、窒素雰囲気下に暗所にて２８℃で２４時間続けた。次に、溶液を蒸留水（２０ｍｌ）で希釈し、３７％ＨＣｌでｐＨ３に酸性化し、公称分画分子量３０００の膜を通して限外濾過し、最後に凍結乾燥した。収率は７２％であった。
【００５９】
生成物の1Ｈ ＮＭＲ分析は、β−シクロデキストリン含量３９．５％（ｗ／ｗ）を示した（図３）。ＬＳ−ＳＥＣオンライン分析は、数平均分子量７０００および重量平均分子量１７０００を示した。ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ分析を、図４に示す。これは、ＢＡＣ／ＭｅＰセグメントにより結合されたβ−シクロデキストリン単位を有するマクロ分子の分布に一致している。
【００６０】
（実施例２）
磁気撹拌器および窒素入口を備える２口丸底フラスコにおいて、２，２−ビス（アクリルアミド）酢酸ＢＡＣ（８ｍｍｏｌ，１．６１４７ｇ；９８．１８％）および水酸化リチウム一水和物（８ｍｍｏｌ，０．３９９０ｇ；９９．００％）を、窒素流下に蒸留水（３ｍｌ）に溶解した。結晶前に精製された２−メチルピペラジンＭｅＰを加えた（４ｍｍｏｌ，０．４２８２ｇ；９３．５６％）。完全な溶解後に、β−シクロデキストリン（１ｍｍｏｌ，１．１４６４ｇ；０．９９％，水１３．７％ｗ／ｗを含む）、水酸化リチウム一水和物（４．５ｍｍｏｌ，０．１９０７ｇ；９９．００％）、および最後に、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（６．８９１ｍｍｏｌ，０．６９７ｇ；９９．１３％）を加えた。反応混合物のｐＨは１２．５であった。反応混合物を、窒素流下に暗所にて３０℃で１週間反応させた。次に、生成物を単離し、前述の場合のように精製した。収率は６３．８％であった。このポリマーの構造を図５に報告する。
【００６１】
生成物の1Ｈ ＮＭＲ分析を図６に報告する。これは、β−シクロデキストリン含量３９．３６％（ｗ／ｗ）の証拠を与えている。ＬＳ−ＳＥＣオンライン分析は、数平均分子量８７００および重量平均分子量３６３００を示した。
【００６２】
（実施例３）
４．５ｍｌの代わりに３．０ｍｌの水を用いて、実施例１に報告のように反応を行った。これらの条件において、僅かに架橋しているが高度に親水性の生成物を得た。これは、水中において、溶液に見える微細で透明な分散液を提供する。これらをＴＥＭ顕微鏡観察により分析し、その結果を図７に示すが、ナノ寸法粒子を明らかに示している。
【００６３】
（実施例４）
β−シクロデキストリンをα−シクロデキストリン（０．９７３ｇ）に置き換えて、実施例１に報告のように反応を行った。得られるポリマーは、シクロデキストリン含量が３３重量％であった（1Ｈ ＮＭＲデータ）。ＬＳ−ＳＥＣオンライン分析は、数平均分子量１４０００および重量平均分子量３８０００を示した。収率は５９％であった。
【００６４】
（実施例５）
β−シクロデキストリンをγ−シクロデキストリン（１．２９７ｇ）に置き換えて、実施例１に報告のように反応を行った。得られるポリマーは、シクロデキストリン含量が４０重量％であった（1Ｈ ＮＭＲデータ）。ＬＳ−ＳＥＣオンライン分析は、数平均分子量１７０００および重量平均分子量４２０００を示した。収率は６７％であった。
【００６５】
（実施例６）
２−メチルピペラジンをＮ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミン（０．３５３ｇ，４ｍｍｏｌ）に置き換えて、実施例１に報告のように反応を行った。得られるポリマーは、シクロデキストリン含量が４４重量％であった（1Ｈ ＮＭＲデータ）。ＬＳ−ＳＥＣオンライン分析は、数平均分子量１６０００および重量平均分子量４８０００を示した。収率は６６％であった。
【００６６】
（実施例７）
この実施例は、β−シクロデキストリンの官能基の数（ｆexp）の実験的決定、および架橋されているまたは完全に可溶性の一連の超分岐ポリマーの調製を報告する
β−シクロデキストリン分子は、７つの第１級水酸基を含み、従って、理論的に、７つの活性化二重結合を有するようにマイケル型付加を受けることができる。換言すれば、β−シクロデキストリンは、７価モノマーであると見なすことができる。しかしながら、採用された条件下において、実際の官能基数は、反応が進行すると増加する立体障害が主な原因で、より少ない。従って、反応を制御するために、実際の官能基数ｆを、一連の反応を行うことにより実験的に決めた。実験において、反応種間のモル比（ｒ）は、異なるβ−シクロデキストリン官能基数が４．５〜６．０であると仮定して計算された臨界モル比（ｒC）に等しく、反応を完了近くまで進め、生じる場合はゲル化の発生を観察した。全ての反応は２８℃の温度で行った。結果を表１に示す。
【００６７】
表１の結果は、採用された条件下においてβ−シクロデキストリンの実際の官能基数ｆが５．５〜６であることを、明らかに示している。
【００６８】
【表１】
【００６９】
（実施例８）
この実施例は、超分岐ＰＡＡ−シクロデキストリンポリマーの可溶化性能を報告する
非常に貧水溶性の薬剤のモデルとしてパクリタキセルを用いて、ポリマーの可溶化性能を決めた。２３ｍｇ／ｍｌの濃度の各タイプのポリマー水溶液３ｍｌを含むスクリューキャップしたバイアルに、パクリタキセル４ｍｇを加えた。混合物を、撹拌下に２４時間インキュベーションした。全てのポリマーは、パクリタキセルを可溶化して乳白色のナノ懸濁液を形成することができた。全てのサンプルを遠心分離し、上澄み液を、Ｃ１８カラムを用いて逆相ＨＰＬＣにより分析し、２２７ｎｍで検出した。移動相は、０．１７Ｍ酢酸アンモニウムｐＨ５．０：メタノール：アセトニトリルの混合物（５０：１０：４０ｖ／ｖ）であった。ポリマーは、パクリタキセルの水溶性を著しく向上させた。上澄液中のパクリタキセルの濃度は、ポリマーの構造により１．２５ｍｇ／ｍｌ〜３．８ｍｇ／ｍｌの範囲であった。
【００７０】
（実施例９）
この実施例は、可溶性で僅かに架橋した超分岐ＰＡＡ−シクロデキストリンポリマーのパクリタキセル負荷性能を報告する
パクリタキセル負荷性能は、凍結乾燥サンプルを用いて決めた。パクリタキセルポリマー凍結乾燥固形物約５ｍｇを秤量し、メタノールに溶解させた。移動相で希釈後、薬剤の量をＣ１８カラムを用いて逆相ＨＰＬＣにより決め、２２７ｎｍで検出した。移動相は、０．１７Ｍ酢酸アンモニウムｐＨ５．０：メタノール：アセトニトリルの混合物（５０：１０：４０ｖ／ｖ）であった。負荷パクリタキセルの百分率を表２に報告する。
【００７１】
【表２】
【００７２】
（実施例１０）
この実施例は、超分岐ＰＡＡ−シクロデキストリンポリマーの熱安定性の決定について報告する
示差走査熱量分析（ＤＳＣ）分析を用いて、一連のポリマーの熱安定性を決めた。ポリマー約３ｍｇをアルミニウムサンプルパン中に秤量し、次に、ＤＳＣ７熱量計（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて窒素置換下に２５〜３００℃の範囲で１０℃／分の速度で加熱した。典型的波形を図８に報告する。全てのポリマーは、少なくとも２００℃まで安定であった。これにより、オートクレーブ内において殺菌することができた。
【００７３】
（実施例１１）
この実施例は、超分岐ＰＡＡ−シクロデキストリンポリマー／パクリタキセル錯体の、その水性ナノ懸濁液の凍結乾燥に対する安定性について報告する
異なるポリマーのパクリタキセルナノ懸濁液を凍結乾燥して乾燥粉末を得、これを、振盪することにより凝集現象無しに水に容易に再懸濁することができた。
【００７４】
サンプルの形態的局面を検証するために、凍結乾燥の前後において薬剤のナノ懸濁液の透過電子顕微鏡検査を行った。凍結乾燥の前後におけるパクリタキセルを含む僅かに架橋したポリマーの顕微鏡写真を図９に報告する。これは、系がその構造を維持し、薬剤が結晶しなかったことを示している。
【００７５】
（実施例１２）
この実施例は、超分岐ＰＡＡ−シクロデキストリンポリマーとの錯体からの、パクリタキセルのインビトロ放出速度の決定について報告する
透析膜袋（分画分子量３０００Ｄａ）および、沈降媒体としての１％ＳＤＳ溶液を用いて、ポリマー系からのパクリタキセルのインビトロ放出を行った。袋全体を、ＳＤＳ溶液５０ｍｌ中に入れた。定められた時間において、溶液０．５ｍＬを引き出し、パクリタキセル濃度をＨＰＬＣ法により分析した。
【００７６】
典型的放出曲線を、図１０に報告する。
【００７７】
（実施例１３）
この実施例は、超分岐ＰＡＡ−シクロデキストリンポリマーとのパクリタキセル錯体のインビトロ細胞毒性アッセイの決定について報告する
５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気中、３７℃で、１０％熱不活性化ウシ胎児血清と抗生物質を加えたＲＰＭＩ １６４０媒体中の単層中でヒト乳癌細胞（ＭＣＦ−７）を成長させた。指数的に成長している細胞を、２４穴プレートに播種し、種々の濃度のパクリタキセル（遊離または、僅かに架橋したポリマー中に含まれる）で２４時間および４８時間処理した。パクリタキセルの濃度は、溶液およびナノスポンジについて０．５〜３．０μｇ／ｍｌの範囲で変化した。
【００７８】
細胞生存能力を、トリパンブルー色素排除試験により調べた。細胞毒性は、対照細胞（未処理細胞）に対する百分率として表わした。
【００７９】
パクリタキセルの細胞毒性研究は、図１１に報告されたグラフにより示されるように、錯体が、単純なパクリタキセルよりも、より有効であることを示した。
【００８０】
（実施例１４）
この実施例は、超分岐ＰＡＡ−シクロデキストリンポリマーのカンプトテシン負荷性能の決定について報告する。結果を表３に示す。
【００８１】
【表３】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬剤の制御放出系に関し、特に、疎水性の高い薬剤、特にタキサン（パクリタキセルまたはドセタキセル）、カンプトテシンおよびその誘導体ならびにエトポシドのような抗腫瘍薬剤と複合して水媒体に溶解させ、それらを注射によっても投与し得るようにすることができる親水性ポリマーの使用を含むものである。現在まで、これらの薬剤は、特定の種類の癌に対して最も効果的であると知られているものであるが、それらの投与にはその不溶性が原因で重大な問題がある。本発明は、同じ溶解制限を示すアシクロビルや関連薬剤のような難溶性抗ウイルス薬剤にも適用される。
【背景技術】
【０００２】
文献に記載の多くの努力にかかわらず、タキサン（パクリタキセルまたはドセタキセル）、カンプトテシンおよびその誘導体、エトポシドおよび難水溶性抗ウイルス化合物（例えば、アシクロビル）の投与の問題は、なお、満足できる程度に解決されるべきものである。前述の全ての薬剤が、患者において重度の副作用、例えば、末梢性神経障害、徐脈、粘膜および静脈系への毒性を誘発する。
【０００３】
例えば、パクリタキセルは、現在、エタノール５０％を含むヒマシ油ポリエトキシル化誘導体Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（登録商標）を用いて２ｍｇ／ｍｌの濃度で処方される。製剤は注射により投与される。パクリタキセルへの重度の過敏症は、通常、その投与に用いられるＣｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（登録商標）に関与している。その結果、過敏症の危険を低下させるために、パクリタキセルの投与の前に、患者は、経口的にデキサメタゾンを用いて、または静脈内にジフェンヒドラミンおよびラニチジンを用いて前処理を受ける。Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）の使用を避ければ、患者へのこの前処理の必要および関連する危険性はないだろう。さらに、パクリタキセル治療の費用が著しく低下する。
【０００４】
患者へのタキサンの投与を改良するための多くの努力が文献に記載されてきているが、今まで、決定的改良を明確に提供したものは無かった。前記努力のうち、以下のものが挙げられる。
【０００５】
パクリタキセルを加えたブロックコポリマーのナノ粒子、例えば、メトキシ−ＰＥＧ−ポリカプロラクトン（非特許文献１）またはメトキシ−ＰＥＧ−ポリ乳酸−コ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）（非特許文献２）または疎水化ポリ（Ｌ−リシンシトラミドイミド）（非特許文献３）の生分解性化合物。
【０００６】
ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸またはポリリシンのような水溶性ポリマーと組み合わされたポリマー（特許文献１）、またはポリエチレングリコール誘導体と組み合わされたプロドラッグ。
【０００７】
パクリタキセルとシクロデキストリンとの包接錯体。シクロデキストリンは、α−１−４結合により結合された６−８グリコシド単位を有する環式オリゴ糖であり、その構造中に疎水性空隙を有することを特徴とし、水不溶性薬剤を可溶化することができる。例えば、２−６−ジメチル−β−シクロデキストリンは、パクリタキセルと包接化合物を形成することが知られており、その溶解度は２．３モル／Ｌ（約３ｇ／Ｌ）である（非特許文献４）。タキサンと修飾シクロデキストリンとの包接錯体の主な欠点は、水性媒体への乏溶性である。実際、水溶性溶媒、例えばアルコール中のパクリタキセル溶液を、シクロデキストリン誘導体の水溶液と混合することによる錯体の形成は、当初は有望であると思われていた。しかしながら、得られる透明溶液は、やがて、不溶性パクリタキセルを再放出し、それが分かれて結晶するときに錯体から取り去られる。パクリタキセル溶液を凍結乾燥し続いて残渣を水中に再溶解することは、この場合でもパクリタキセルが結晶して除去されるので、やはり役に立たない。この問題は、シクロデキストリンダイマーを用いてある程度解決されるのみである。さらに、これらのダイマー中において個々のシクロデキストリンがアミノ架橋により相互に結合されて、分子にある程度の毒性を与える。
【０００８】
シクロデキストリン基がポリマー鎖に沿ってランダム分布しているシクロデキストリン直鎖ポリマー。これらのポリマーは、パクリタキセルまたは類似の薬剤との錯体の形成において、遊離シクロデキストリンと同じ制限を受ける。何故なら、ポリマー中に存在する異なるシクロデキストリン単位は、溶液中のポリマーが比較的拡張した構造を得たときには、ポリマー鎖に沿って分布することにより離れることで、それらの連携が阻害されるからである。
【０００９】
カンプトテシンについては、その安定性（ラクトン環のカルボキシレート型への開環）および溶解性の問題を克服するために、複数の手法が検討されてきた。特に、α−シクロデキストリンとの錯体形成により、カンプトテシンの安定性が向上し、それにより、溶解性および細胞毒性プロフィールが改善される（非特許文献５）。
【００１０】
アシクロビルは、半減期が短く（約２時間）、その吸収は完全ではない（生物学的利用能が約１５〜３０％である）。その限定された経口的生物学的利用能故に、アシクロビルは一日当たり５回（４時間毎に２００ｍｇ）経口的に摂取しなくてはならず、一方、静脈内製剤（５ｍｇ／ｋｇ）は少なくとも５日間、８時間毎に投与しなくてはならない。さらに、アシクロビルの静脈内一回量は、尿細管内での沈降を防止するために、ゆっくりと１時間かかって投与すべきである。
【００１１】
抗ウイルス薬剤の効能を増加させるために、例えばポリ（イソブチルシアノアクリレート）ナノカプセル中への封入（非特許文献６）のような種々の送達手法が提案された。粒状送達系は、抗ウイルス薬剤の徐放を促進することができた。局所投与用のアシクロビル含有ＰＬＧＡミクロ粒子が開発され（非特許文献７）、アシクロビル付加ナノ粒子は、培養細胞においてＩ型単純ヘルペスウイルスに対する効能増加を示した（非特許文献８）。７９％までのアシクロビルを含む、デキストランまたはキトサン上にグラフトされたアクリルアミドの半相互貫入ポリマーネットワーク微粒子を、エマルジョン−架橋法により調製した（非特許文献９）。
【００１２】
アシクロビルの経口的生物学的利用能を向上させるためのプロドラッグも設計された（非特許文献１０）。
【００１３】
β−シクロデキストリンとのポリ（アミドアミン）（ＰＡＡ）コポリマーは、１１％ｗ／ｗまでの薬剤を錯化させることにより可溶化することができ、アシクロビル錯体は、培養細胞においてＩ型単純ヘルペスウイルスに対して、遊離薬剤よりも高い抗ウイルス活性を示す（非特許文献１１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】ＵＳ ６４４１０２５
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｓ．Ｙｅｏｎ Ｋｉｍ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２２ （２００１ １６９７−１７０４）
【非特許文献２】Ｊｉ−Ｈｅｕｎｇ Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｆｏｒ ａｄｖａｎｃｅｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，１０ ６４９，１９９９
【非特許文献３】Ｍ．Ｖｅｒｔ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｖｏｌ．１５ Ｎｏ．２，９９−１１４（２０００）
【非特許文献４】Ｈ．Ｈａｍａｈａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２００６，１０２，３６９−３７１
【非特許文献５】Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．２００２，１５，１６３−１７０
【非特許文献６】Ｈｉｌｌａｉｒｅａｕ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ，Ｊ，Ｐｈａｒｍ．２００６，３２４，３７−４２
【非特許文献７】ｄｅ Ｊａｌｏｎ，２００１，２２６，１８１，１８４
【非特許文献８】ｄｅ Ｊｅｌｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒｏｐ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．（２００３）５６，１８３−１８７
【非特許文献９】Ｒｏｋｈａｄｅ ｅｔ ａｌ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｐｏｌｙｍ．（２００７）６０５−６０７
【非特許文献１０】Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃ．Ｓｃｉ．２００４，２３，３１９−３２５
【非特許文献１１】Ｂｅｎｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ ２００８，１２６，１７−２５
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
（発明の詳細な開示）
本発明は、シクロデキストリン単位がエーテル基によりポリ（アミドアミン）の短いセグメントに結合されているものであって、ビスアクリルアミドへのα−、β−またはγ−シクロデキストリンおよびアミンのマイケル型重付加により調製される新規超分岐ポリマーに関する。本発明のポリマーの構造のスキームを図１に示す。
【００１７】
これらのポリマーは、完全に水溶性であり、僅かに架橋しているものは、高度の親水性であり、溶液に見える透明水懸濁液を与える。多くの場合、これらのポリマー懸濁液は、ナノ粒子の状態である。
【００１８】
好ましくは、ポリ（アミドアミン）セグメントは両性であり、例えば、アミンコモノマーは２−メチルピペラジンであり、ビスアクリルアミドは２，２−ビスアクリルアミド酢酸である。実際、両性ポリ（アミドアミン）、特に、前述したモノマーから得られるＩＳＡ２３と称するポリ（アミドアミン）は、高度に生体適合性であると分かった。何故なら、これらは、生物の防御系により認識されず、健全な実験動物において長時間循環することができ、また腫瘍を有する実験動物においては、所謂ＥＰＲ効果（血管透過性亢進と蓄積効果（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ Ｅｆｆｅｃｔ））により腫瘍塊中で選択的に濃縮されるからである。この効果は、正常毛細血管の壁を通過することはできないが、腫瘍塊中の新生毛細血管のより分離された壁は通過することができる、血液循環中に存在する高分子ポリマーが原因である。これらは、いったん腫瘍中に貫入すると、腫瘍は充分なリンパ排液系を有さないので、殆ど出てこない。さらに、これらのポリ（アミドアミン）は、高度に親水性であるので、水不溶性物質を溶解する性能が高い。最後に、前記ポリ（アミドアミン）は、標的細胞または細胞群、例えば、腫瘍細胞への正確な誘導を確保することができるペプチド単位を導入することにより容易に官能化することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の超分岐ＰＡＡ／シクロデキストリンポリマーの一般構造を示す図である。
【図２】実施例１に報告されたように合成された超分岐ＰＡＡ／β−シクロデキストリンポリマーの構造を示す図である。
【図３】実施例１に報告されたように合成された超分岐ＰＡＡ／β−シクロデキストリンポリマーの１Ｈ ＮＭＲスペクトルである。
【図４】実施例１のポリマーのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルである。
【図５】単官能連鎖停止剤としてのＮ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミドを用いて合成された超分岐ＰＡＡ／β-シクロデキストリン（実施例２）の模式的に示したものである。
【図６】連鎖停止剤としてのＮ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミドを用いて合成された超分岐ＰＡＡ／β-シクロデキストリン（実施例２）の１Ｈ ＮＭＲスペクトルである。
【図７】水性分散液からの実施例３のポリマーのＴＥＭ顕微鏡写真である（倍率：６９０００×）。
【図８】実施例３に報告されたポリマーのＤＳＣ波形を示す図である。
【図９】実施例３に報告されたポリマーのパクリタキセル錯体の、その水性分散液の凍結乾燥の前（ａ）および後（ｂ）における、ＴＥＭ顕微鏡写真である。
【図１０】典型的超分岐ＰＡＡ-シクロデキストリンポリマーとの錯体からの、パクリタキセル放出速度を示す図である。
【図１１】遊離パクリタキセルおよび、超分岐ＰＡＡ-シクロデキストリンポリマーとのその錯体の、試験管内細胞毒性アッセイのグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
より詳しくは、本発明は、以下のようなポリマーに関する：
水酸基の少なくとも一つがアルコキシ基に転換されているα−シクロデキストリン、β−シクロデキストリンもしくはγ−シクロデキストリンまたはその誘導体から、シクロデキストリン単位（ＣＤ、図１参照）が誘導される：
ポリアミドアミンセグメントが以下に示す構造を有する：
【００２１】
【化１】
【００２２】
（式中：
Ｒ1およびＲ3は、同一または異なって、ＨまたはＣ1-4アルキル基であり、
Ｒ2はＣ1-4アルキレン基である、
または
Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、単一環式構造の一部であり、順にＲ1およびＲ3と同じ性質の側鎖置換基を有し、
Ｒ4およびＲ6は、同一または異なって、ＨまたはＣ1-6アルキル基である、または、前記残基の一つが順にＲ1およびＲ3と同じ性質の側鎖置換基を有している、
または
Ｒ4、Ｒ5およびＲ6は、単一環式構造の一部であり、順にＲ1、Ｒ2およびＲ3と同じ性質の側鎖置換基を有する、
または
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5およびＲ6は先に定義したようなアルキルまたはアルキレン基であり、順に、第１級、第２級または第３級アミノ基、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基およびアルコールヒドロキシ基のようなさらなる置換基を有し、
ｎは、１〜５０、好ましくは２〜１０の範囲である。）。
【００２３】
前記ポリマーの単純化した構造を図１に示す。これらポリマーにおいて、シクロデキストリン単位は、例えば図２に示すように、一または二以上のヒドロキシル基を介して、エーテル結合によって、ポリ（アミドアミン）セグメントに結合される。
【００２４】
前述のように、本発明のポリマーは、第１級または２級アミンとアルカリ活性化シクロデキストリンとの混合物を、ビスアクリルアミドにマイケル型重付加することにより得られる。重合は、１０〜６０℃、好ましくは２０〜３５℃の範囲の温度で、１時間〜８日間、好ましくは８時間〜３日間、最も好ましくは１〜２日間の範囲の時間行われる。用いられる溶媒は、好ましくはプロトン性のもの、最も好ましくは水である。
【００２５】
本発明のポリマーを用いて、水不溶性活性分子を可溶化し含むことができる。好ましくは、本発明のポリマーにより、難水溶性薬剤、特に、タキサン、カンプトテシンおよび誘導体、アシクロビルおよび関連薬剤の水性注射可能薬製剤を調製することができる。前記製剤は、本発明のポリマー２０ｍｇ／ｍｌ〜１６０ｍｇ／ｍｌを含み、好ましくは、ドセタキセルまたはパクリタキセルの場合は活性分子を１ｍｇ／ｍｌ〜８ｍｇ／ｍｌ含み、カンプトテシンまたは類似誘導体の場合は１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ含み、アシクロビルおよび関連薬剤の場合は１ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ含む。さらに、前記製剤は、従来から使用されていると共に注射可能製剤の調製のための規制要求を満たす他の共溶媒または賦形剤を含むことができる。
【００２６】
本発明のポリマーおよびその製剤は、凍結乾燥することができる。得られる固体生成物は、活性分子の存在下および不存在下に単純に手で撹拌して水中に容易に再懸濁させることができる。
【００２７】
超分岐の非架橋（または、制御された架橋度の）構造は、出発混合物の化学量論量、温度および反応時間を適度に変化させて得られる。
【００２８】
用いられる調製手順は、以下の理論的根拠に基づく。
【００２９】
含まれる重合反応は、段階的重付加である。別々に２つの相補的官能基「ａ」および「ｂ」（「ａ」は慣例によりマイナー官能基）を有するモノマーを含む重合において、プロセスを支配する２つのパラメーターは、以下のように定義される初期化学量論比「ｒ」：
【００３０】
【数１】
【００３１】
（式中、Ｎａ0およびＮｂ0は、初期に存在する官能基ａおよびｂの数である）および、以下のように定義される変換度「ｐ」：
【００３２】
【数２】
【００３３】
（式中、Ｎａは、観察時に存在する官能基ａの数である）
であることが良く知られている。
【００３４】
定義として、ｒおよびｐの両方が明らかに１以下である。
【００３５】
２以上の官能基を有するモノマーを含む段階的重合（マルチまたは多官能性段階的重合）により、「臨界進歩度」と呼ばれる特定の値「ｐC」より高いｐ値で不溶性架橋生成物が得られる。ｐ＞ｐCの場合、系はその可動性を失い、この理由のために、ｐCは「ゲルポイント」とも呼ばれる。
【００３６】
多官能性モノマーに関する官能基が一つのタイプのみの場合、臨界進歩度ｐCは、Ｆｌｏｒｙ−Ｓｔｏｃｋｍａｙｅｒ式（例えば、Ｇ．Ｏｄｉａｎ“Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ”３ｒｄ Ｅｄ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＵＳＡ，１９９１を参照）：
【００３７】
【数３】
【００３８】
により表わされる。
【００３９】
ρは、系内に初期に存在する同じタイプの官能基の合計量に対する、官能基数が２を超えるモノマーの官能基の比：
【００４０】
【数４】
【００４１】
であり、ｒは前述のように定義される。
【００４２】
式（３）において、ｐCとｒが相関していることが明らかである。特に、ｒCと記載される臨界化学量論比が存在し、そこで系はゲル化することなく、超分岐しているがなお可溶性であるポリマーを産出する。
【００４３】
ｐ（および、従ってｐCも）は１を超えられないので、ｐC＝１と仮定して式（３）から理論的ｒC値を得、ｒについて解く。次に、以下の式：
【００４４】
【数５】
【００４５】
を用い、ρ＝１の場合、すなわち、系において、多官能モノマーがそのような官能基を有する唯一のものである場合、式（４）は下記式に換算される。
【００４６】
【数６】
【００４７】
式５は、潜在的マルチ官能性モノマーの活性官能基数を決めるための便利なツールを提供する、すなわち、この場合、マルチ官能性モノマーすなわちシクロデキストリンの水素の数は、付加反応の影響を受け易い。これは、過剰な二重結合を有する化学量論的に不均衡な反応体混合物についてｒCを実験的に決めることにより達成することができる。操作としては、進行的に過剰の二重結合を有する一連の不均衡反応混合物を、最大変換度に達するのに充分な時間、重合させることができる。ゲル化を阻害する最少過剰二重結合により、直ちにｒCが得られ、次にｆが得られる。採用された反応条件下において、β−シクロデキストリンのｆが決められ、５．５〜６の範囲であった。
【００４８】
さらに、式（３）と式（５）の両方を利用して、可溶性超分岐ポリマーまたは架橋度が制御された架橋ポリマーを得ることができる。実際、ｒ＜ｒCで全ての変換度において、超分岐されているが架橋されていない生成物が得られる。逆に、ｒ＞ｒCにおいては、変換度ｐ＜ｐCにおいて超分岐されているが架橋されていない生成物が得られ、変換度ｐ＞ｐCにおいて架橋生成物が得られる。
【００４９】
いずれの場合にも、ｒ(ｒCまたはｐ(ｐCの場合、すなわち、両方の値が臨界値から僅かにのみ相違している場合に、僅かに架橋された生成物が得られる。
【００５０】
単官能性化合物が存在している場合は、式（３）が有効でないことが一般的に認められており；これらの系のために、以下の代替式が考案された：
【００５１】
【数７】
【００５２】
（式中、ｆW.AおよびｆW.Bは、モノマー官能基の重量平均（単官能を含む）であり、以下のように定義される：
【００５３】
【数８】
【００５４】
（式中、ｆA.jおよびｆB.jは、それぞれＡ型およびＢ型の各モノマーの官能基を表し、ここで、ＮA.jおよびＮB.jは、系における対応するモル数である（例えば、Ｇ．Ｏｄｉａｎ“Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ”３ｒｄ Ｅｄ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＵＳＡ，１９９１を参照）））。
【００５５】
この場合にも、系がゲル化せず、超分岐しているがなお可溶性であるポリマーを生成する、臨界比ｒCを決めることができる。これは、ｐC＝１とし、ｒについて解くことにより決定される。得られる式は以下のものである：
【００５６】
【数９】
【００５７】
前述の事項を、以下の実施例によりさらに説明する。
【実施例】
【００５８】
（実施例１）
磁気撹拌器および窒素入口を備える２口丸底フラスコにおいて、２，２−ビス（アクリルアミド）酢酸ＢＡＣ（８ｍｍｏｌ，１．６１４７ｇ；９８．１８％）および水酸化リチウム一水和物（８ｍｍｏｌ，０．３９９０ｇ；９９．００％）を、窒素流下に蒸留水（４．５ｍｌ）に溶解した。結晶前に精製された２−メチルピペラジンＭｅＰを加えた（４ｍｍｏｌ，０．４２８２ｇ；９３．５６％）。完全な溶解後に、β−シクロデキストリン（１ｍｍｏｌ，１．１４６４ｇ；０．９９％，水１３．７％ｗ／ｗを含む）および水酸化リチウム一水和物（４．５ｍｍｏｌ，０．１９０７ｇ；９９．００％）を加えた。反応混合物のｐＨは１２．５であった。反応を、窒素雰囲気下に暗所にて２８℃で２４時間続けた。次に、溶液を蒸留水（２０ｍｌ）で希釈し、３７％ＨＣｌでｐＨ３に酸性化し、公称分画分子量３０００の膜を通して限外濾過し、最後に凍結乾燥した。収率は７２％であった。
【００５９】
生成物の1Ｈ ＮＭＲ分析は、β−シクロデキストリン含量３９．５％（ｗ／ｗ）を示した（図３）。ＬＳ−ＳＥＣオンライン分析は、数平均分子量７０００および重量平均分子量１７０００を示した。ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ分析を、図４に示す。これは、ＢＡＣ／ＭｅＰセグメントにより結合されたβ−シクロデキストリン単位を有するマクロ分子の分布に一致している。
【００６０】
（実施例２）
磁気撹拌器および窒素入口を備える２口丸底フラスコにおいて、２，２−ビス（アクリルアミド）酢酸ＢＡＣ（８ｍｍｏｌ，１．６１４７ｇ；９８．１８％）および水酸化リチウム一水和物（８ｍｍｏｌ，０．３９９０ｇ；９９．００％）を、窒素流下に蒸留水（３ｍｌ）に溶解した。結晶前に精製された２−メチルピペラジンＭｅＰを加えた（４ｍｍｏｌ，０．４２８２ｇ；９３．５６％）。完全な溶解後に、β−シクロデキストリン（１ｍｍｏｌ，１．１４６４ｇ；０．９９％，水１３．７％ｗ／ｗを含む）、水酸化リチウム一水和物（４．５ｍｍｏｌ，０．１９０７ｇ；９９．００％）、および最後に、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（６．８９１ｍｍｏｌ，０．６９７ｇ；９９．１３％）を加えた。反応混合物のｐＨは１２．５であった。反応混合物を、窒素流下に暗所にて３０℃で１週間反応させた。次に、生成物を単離し、前述の場合のように精製した。収率は６３．８％であった。このポリマーの構造を図５に報告する。
【００６１】
生成物の1Ｈ ＮＭＲ分析を図６に報告する。これは、β−シクロデキストリン含量３９．３６％（ｗ／ｗ）の証拠を与えている。ＬＳ−ＳＥＣオンライン分析は、数平均分子量８７００および重量平均分子量３６３００を示した。
【００６２】
（実施例３）
４．５ｍｌの代わりに３．０ｍｌの水を用いて、実施例１に報告のように反応を行った。これらの条件において、僅かに架橋しているが高度に親水性の生成物を得た。これは、水中において、溶液に見える微細で透明な分散液を提供する。これらをＴＥＭ顕微鏡観察により分析し、その結果を図７に示すが、ナノ寸法粒子を明らかに示している。
【００６３】
（実施例４）
β−シクロデキストリンをα−シクロデキストリン（０．９７３ｇ）に置き換えて、実施例１に報告のように反応を行った。得られるポリマーは、シクロデキストリン含量が３３重量％であった（1Ｈ ＮＭＲデータ）。ＬＳ−ＳＥＣオンライン分析は、数平均分子量１４０００および重量平均分子量３８０００を示した。収率は５９％であった。
【００６４】
（実施例５）
β−シクロデキストリンをγ−シクロデキストリン（１．２９７ｇ）に置き換えて、実施例１に報告のように反応を行った。得られるポリマーは、シクロデキストリン含量が４０重量％であった（1Ｈ ＮＭＲデータ）。ＬＳ−ＳＥＣオンライン分析は、数平均分子量１７０００および重量平均分子量４２０００を示した。収率は６７％であった。
【００６５】
（実施例６）
２−メチルピペラジンをＮ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミン（０．３５３ｇ，４ｍｍｏｌ）に置き換えて、実施例１に報告のように反応を行った。得られるポリマーは、シクロデキストリン含量が４４重量％であった（1Ｈ ＮＭＲデータ）。ＬＳ−ＳＥＣオンライン分析は、数平均分子量１６０００および重量平均分子量４８０００を示した。収率は６６％であった。
【００６６】
（実施例７）
この実施例は、β−シクロデキストリンの官能基の数（ｆexp）の実験的決定、および架橋されているまたは完全に可溶性の一連の超分岐ポリマーの調製を報告する
β−シクロデキストリン分子は、７つの第１級水酸基を含み、従って、理論的に、７つの活性化二重結合を有するようにマイケル型付加を受けることができる。換言すれば、β−シクロデキストリンは、７価モノマーであると見なすことができる。しかしながら、採用された条件下において、実際の官能基数は、反応が進行すると増加する立体障害が主な原因で、より少ない。従って、反応を制御するために、実際の官能基数ｆを、一連の反応を行うことにより実験的に決めた。実験において、反応種間のモル比（ｒ）は、異なるβ−シクロデキストリン官能基数が４．５〜６．０であると仮定して計算された臨界モル比（ｒC）に等しく、反応を完了近くまで進め、生じる場合はゲル化の発生を観察した。全ての反応は２８℃の温度で行った。結果を表１に示す。
【００６７】
表１の結果は、採用された条件下においてβ−シクロデキストリンの実際の官能基数ｆが５．５〜６であることを、明らかに示している。
【００６８】
【表１】
【００６９】
（実施例８）
この実施例は、超分岐ＰＡＡ−シクロデキストリンポリマーの可溶化性能を報告する
非常に貧水溶性の薬剤のモデルとしてパクリタキセルを用いて、ポリマーの可溶化性能を決めた。２３ｍｇ／ｍｌの濃度の各タイプのポリマー水溶液３ｍｌを含むスクリューキャップしたバイアルに、パクリタキセル４ｍｇを加えた。混合物を、撹拌下に２４時間インキュベーションした。全てのポリマーは、パクリタキセルを可溶化して乳白色のナノ懸濁液を形成することができた。全てのサンプルを遠心分離し、上澄み液を、Ｃ１８カラムを用いて逆相ＨＰＬＣにより分析し、２２７ｎｍで検出した。移動相は、０．１７Ｍ酢酸アンモニウムｐＨ５．０：メタノール：アセトニトリルの混合物（５０：１０：４０ｖ／ｖ）であった。ポリマーは、パクリタキセルの水溶性を著しく向上させた。上澄液中のパクリタキセルの濃度は、ポリマーの構造により１．２５ｍｇ／ｍｌ〜３．８ｍｇ／ｍｌの範囲であった。
【００７０】
（実施例９）
この実施例は、可溶性で僅かに架橋した超分岐ＰＡＡ−シクロデキストリンポリマーのパクリタキセル負荷性能を報告する
パクリタキセル負荷性能は、凍結乾燥サンプルを用いて決めた。パクリタキセルポリマー凍結乾燥固形物約５ｍｇを秤量し、メタノールに溶解させた。移動相で希釈後、薬剤の量をＣ１８カラムを用いて逆相ＨＰＬＣにより決め、２２７ｎｍで検出した。移動相は、０．１７Ｍ酢酸アンモニウムｐＨ５．０：メタノール：アセトニトリルの混合物（５０：１０：４０ｖ／ｖ）であった。負荷パクリタキセルの百分率を表２に報告する。
【００７１】
【表２】
【００７２】
（実施例１０）
この実施例は、超分岐ＰＡＡ−シクロデキストリンポリマーの熱安定性の決定について報告する
示差走査熱量分析（ＤＳＣ）分析を用いて、一連のポリマーの熱安定性を決めた。ポリマー約３ｍｇをアルミニウムサンプルパン中に秤量し、次に、ＤＳＣ７熱量計（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて窒素置換下に２５〜３００℃の範囲で１０℃／分の速度で加熱した。典型的波形を図８に報告する。全てのポリマーは、少なくとも２００℃まで安定であった。これにより、オートクレーブ内において殺菌することができた。
【００７３】
（実施例１１）
この実施例は、超分岐ＰＡＡ−シクロデキストリンポリマー／パクリタキセル錯体の、その水性ナノ懸濁液の凍結乾燥に対する安定性について報告する
異なるポリマーのパクリタキセルナノ懸濁液を凍結乾燥して乾燥粉末を得、これを、振盪することにより凝集現象無しに水に容易に再懸濁することができた。
【００７４】
サンプルの形態的局面を検証するために、凍結乾燥の前後において薬剤のナノ懸濁液の透過電子顕微鏡検査を行った。凍結乾燥の前後におけるパクリタキセルを含む僅かに架橋したポリマーの顕微鏡写真を図９に報告する。これは、系がその構造を維持し、薬剤が結晶しなかったことを示している。
【００７５】
（実施例１２）
この実施例は、超分岐ＰＡＡ−シクロデキストリンポリマーとの錯体からの、パクリタキセルのインビトロ放出速度の決定について報告する
透析膜袋（分画分子量３０００Ｄａ）および、沈降媒体としての１％ＳＤＳ溶液を用いて、ポリマー系からのパクリタキセルのインビトロ放出を行った。袋全体を、ＳＤＳ溶液５０ｍｌ中に入れた。定められた時間において、溶液０．５ｍＬを引き出し、パクリタキセル濃度をＨＰＬＣ法により分析した。
【００７６】
典型的放出曲線を、図１０に報告する。
【００７７】
（実施例１３）
この実施例は、超分岐ＰＡＡ−シクロデキストリンポリマーとのパクリタキセル錯体のインビトロ細胞毒性アッセイの決定について報告する
５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気中、３７℃で、１０％熱不活性化ウシ胎児血清と抗生物質を加えたＲＰＭＩ １６４０媒体中の単層中でヒト乳癌細胞（ＭＣＦ−７）を成長させた。指数的に成長している細胞を、２４穴プレートに播種し、種々の濃度のパクリタキセル（遊離または、僅かに架橋したポリマー中に含まれる）で２４時間および４８時間処理した。パクリタキセルの濃度は、溶液およびナノスポンジについて０．５〜３．０μｇ／ｍｌの範囲で変化した。
【００７８】
細胞生存能力を、トリパンブルー色素排除試験により調べた。細胞毒性は、対照細胞（未処理細胞）に対する百分率として表わした。
【００７９】
パクリタキセルの細胞毒性研究は、図１１に報告されたグラフにより示されるように、錯体が、単純なパクリタキセルよりも、より有効であることを示した。
【００８０】
（実施例１４）
この実施例は、超分岐ＰＡＡ−シクロデキストリンポリマーのカンプトテシン負荷性能の決定について報告する。結果を表３に示す。
【００８１】
【表３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビスアクリルアミドへのα−、β−またはγ−シクロデキストリンおよびアミンのマイケル型重付加により得ることができる、超分岐水溶性ポリマー。
【請求項２】
α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリンもしくはγ−シクロデキストリンまたはその誘導体の水酸基の少なくとも一つが、メトキシ基に転換されている、請求項１に記載のポリマー。
【請求項３】
ポリアミド−アミノセグメントが以下の式を有するものである、請求項１または２に記載のポリマー：
【化１】
（式中：
Ｒ1およびＲ3は、同一または異なって、ＨまたはＣ1-4アルキル基であり、
Ｒ2はＣ1-4アルキレン基である、
または
Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、単一環式構造の一部であり、順にＲ1およびＲ3と同じ性質の側鎖置換基を有し、
Ｒ4およびＲ6は、同一または異なって、ＨまたはＣ1-6アルキル基である、または、同じ残基の一つが順にＲ1およびＲ3と同じ性質の側鎖置換基を有している、
または
Ｒ4、Ｒ5およびＲ6は、単一環式構造の一部であり、順にＲ1、Ｒ2およびＲ3と同じ性質の側鎖置換基を有する、
または
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5およびＲ6は先に定義したようなアルキルまたはアルキレン基であり、順に、第１級、第２級または第３級アミノ基、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基およびヒドロキシアルコール基から選択されるさらなる置換基を有し、
ｎは、１〜５０、好ましくは２〜１０の範囲である。）。
【請求項４】
水不溶性薬剤用の可溶化剤として請求項１〜３のいずれかに記載のポリマーを含む薬製剤。
【請求項５】
薬剤が、タキサン（パクリタキセルまたはドセタキセル）、カンプトテシンおよびその誘導体、エトポシドおよびアシクロビルから選択される、請求項４に記載の薬製剤。
【請求項１】
ビスアクリルアミドへのα−、β−またはγ−シクロデキストリンおよびアミンのマイケル型重付加により得ることができる、超分岐水溶性ポリマー。
【請求項２】
α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリンもしくはγ−シクロデキストリンまたはその誘導体の水酸基の少なくとも一つが、メトキシ基に転換されている、請求項１に記載のポリマー。
【請求項３】
ポリアミド−アミノセグメントが以下の式を有するものである、請求項１または２に記載のポリマー：
【化１】
（式中：
Ｒ1およびＲ3は、同一または異なって、ＨまたはＣ1-4アルキル基であり、
Ｒ2はＣ1-4アルキレン基である、
または
Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、単一環式構造の一部であり、順にＲ1およびＲ3と同じ性質の側鎖置換基を有し、
Ｒ4およびＲ6は、同一または異なって、ＨまたはＣ1-6アルキル基である、または、同じ残基の一つが順にＲ1およびＲ3と同じ性質の側鎖置換基を有している、
または
Ｒ4、Ｒ5およびＲ6は、単一環式構造の一部であり、順にＲ1、Ｒ2およびＲ3と同じ性質の側鎖置換基を有する、
または
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5およびＲ6は先に定義したようなアルキルまたはアルキレン基であり、順に、第１級、第２級または第３級アミノ基、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基およびヒドロキシアルコール基から選択されるさらなる置換基を有し、
ｎは、１〜５０、好ましくは２〜１０の範囲である。）。
【請求項４】
水不溶性薬剤用の可溶化剤として請求項１〜３のいずれかに記載のポリマーを含む薬製剤。
【請求項５】
薬剤が、タキサン（パクリタキセルまたはドセタキセル）、カンプトテシンおよびその誘導体、エトポシドおよびアシクロビルから選択される、請求項４に記載の薬製剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２０１０−５３０９０６（Ｐ２０１０−５３０９０６Ａ）
【公表日】平成２２年９月１６日（２０１０．９．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１１５３０（Ｐ２０１０−５１１５３０）
【出願日】平成２０年６月１０日（２００８．６．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００４６２４
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１５１７７５
【国際公開日】平成２０年１２月１８日（２００８．１２．１８）
【出願人】（５０９３４０１１５）ルレデーラ フンダシオン パラ エル デサローヨ テクノロジコ イ ソシアル (1)
【氏名又は名称原語表記】Ｌ’ＵＲＥＤＥＲＲＡ， ＦＵＮＤＡＣＩＯＮ ＰＡＲＡ ＥＬ ＤＥＳＡＲＲＯＬＬＯ ＴＥＣＮＯＬＯＧＩＣＯ Ｙ ＳＯＣＩＡＬ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年９月１６日（２０１０．９．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月１０日（２００８．６．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００４６２４
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１５１７７５
【国際公開日】平成２０年１２月１８日（２００８．１２．１８）
【出願人】（５０９３４０１１５）ルレデーラ フンダシオン パラ エル デサローヨ テクノロジコ イ ソシアル (1)
【氏名又は名称原語表記】Ｌ’ＵＲＥＤＥＲＲＡ， ＦＵＮＤＡＣＩＯＮ ＰＡＲＡ ＥＬ ＤＥＳＡＲＲＯＬＬＯ ＴＥＣＮＯＬＯＧＩＣＯ Ｙ ＳＯＣＩＡＬ
【Ｆターム（参考）】
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