乳癌耐性蛋白阻害剤
ＢＣＲＰを阻害する薬剤のスクリーニングに有用な癌細胞およびＢＣＲＰを阻害する薬剤を提供する。
下記式（１）、（２）、（３）、（４）又は（５）：
で表されるフラボノイド化合物、又はその配糖体、エステル若しくは塩を有効成分とするＢＣＲＰ阻害剤、および該ＢＣＲＰ阻害剤とＢＣＲＰの基質となり得る抗癌剤を含有する抗癌剤。
下記式（１）、（２）、（３）、（４）又は（５）：
で表されるフラボノイド化合物、又はその配糖体、エステル若しくは塩を有効成分とするＢＣＲＰ阻害剤、および該ＢＣＲＰ阻害剤とＢＣＲＰの基質となり得る抗癌剤を含有する抗癌剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は乳癌耐性蛋白（ＢＣＲＰ）阻害剤およびＢＣＲＰ阻害剤のスクリーニングに有用なＳＮ−３８耐性癌細胞に関する。
【背景技術】
癌化学療法において、治療開始時から抗癌剤に無効である自然耐性や、抗癌剤を長期に連用するとその効果が低下する獲得耐性の出現は大きな問題となっている。この抗癌剤に対する耐性の克服は、癌化学療法の治療成績向上につながることが期待され、これまでに様々な耐性機構の存在が明らかにされてきた。その中でも抗癌剤を細胞外へ能動輸送し、その細胞内蓄積量を減少させる薬剤輸送蛋白質の発現は、耐性機構の中心的な役割を果たしていると考えられている。
特に、１９７０年代に発見されたＭＤＲ１遺伝子にコードされる薬剤輸送蛋白質Ｐ−糖蛋白質は、化学構造や作用機序が異なる複数の抗癌剤に対して交叉耐性を生じることから、多剤耐性克服剤の有力な標的分子とされてきた。しかし、Ｐ−糖蛋白質だけでは抗癌剤耐性機構を説明しきれないことも次第に明らかとなり、さらに新しい薬剤輸送蛋白質を標的分子とした耐性克服剤の開発が望まれている。
その様な中、１９９８年に、Ｐ−糖蛋白質と同じくＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）トランスポータースーパーファミリーと呼ばれる一群に属する薬剤輸送蛋白質として、乳癌耐性蛋白質（ＢＣＲＰ）が発見された（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５，１５６６５−１５６７０（１９９８））。ＢＣＲＰの構造にはＡＴＰ結合カセットが一つしか存在せず、二つのＡＴＰ結合カセットを有するＰ−糖蛋白質や他の薬剤輸送蛋白質とは構造的に異なっている。ＢＣＲＰは塩酸イリノテカン（ＣＰＴ−１１）やトポテカン等のトポイソメラーゼＩ阻害剤、ミトキサントロン等のトポイソメラーゼＩＩ阻害剤に対する耐性機構に深く関与する。一方、ＢＣＲＰはＰ−糖蛋白質により排出されるパクリタキセルやビンクリスチン等に対しては作用しないこと、またＰ−糖蛋白質ではほとんど細胞外へ排出されないＣＰＴ−１１やＳＮ−３８（ＣＰＴ−１１の活性体）等のカンプトテシン誘導体の排出に関わることから（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９，５９３８−５９４６（１９９９））、Ｐ−糖蛋白質とは異なる基質特異性を有することが明らかにされている。さらに、ＢＣＲＰは経口投与された抗癌剤のバイオアベイラビリティの限界にも関与していることが示唆されている（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０，２９４３−２９５０（２００２））。これらの事実から、ＢＣＲＰを阻害する薬剤は、従来の耐性克服剤では克服され得なかった抗癌剤の耐性に対して克服効果を発揮し、さらには抗癌剤のバイオアベイラビリティをも向上させることが期待され、その開発が望まれる。
これまでに、抗癌剤に対する耐性克服を目的として数多くのＰ−糖蛋白質阻害剤が開発されている。一方、ＢＣＲＰに対する特異的な阻害剤に関する報告は少なく、またその阻害作用も十分とはいえないことから、より強力なＢＣＲＰ阻害作用を有する薬剤が要望されていた（Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｔｈｅｒ．１，４２７−４３４（２００２））。なお、フラボノイド化合物の中にはＰ−糖蛋白質に対して阻害作用を示すものが報告されている（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４１，４１６１−４１６４（１９９８）；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２９５，８３２−８４０（２００２））が、ＢＣＲＰに対して阻害作用を示すフラボノイド化合物については知られていない。
本発明は、ＢＣＲＰを阻害する薬剤のスクリーニングに有用な癌細胞およびＢＣＲＰを阻害する薬剤を提供することを目的とする。
【発明の開示】
本発明者は、上記課題を解決すべく、ヒト非小細胞肺癌由来の癌細胞であるＡ５４９細胞をＳＮ−３８含有培地にて継代培養することにより、ＢＣＲＰを高発現することで抗癌剤耐性を獲得したヒト癌細胞を樹立した。さらに、該癌細胞を用いて、耐性克服作用を指標に様々な植物由来の成分についてスクリーニングを行った結果、下記式（１）、（２）、（３）、（４）又は（５）で表されるフラボノイド化合物に強力なＢＣＲＰ阻害作用があることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、下記式（１）、（２）、（３）、（４）又は（５）：
〔式中、Ｒ１は水素原子、水酸基、ハロゲン原子、低級アルコキシ基又は低級アルキル基を示し、７個のＲ２は同一でも異なってもよく、水素原子、水酸基、低級アルコキシ基、低級アルキル基、低級アルケニル基又は糖残基を示すか、或は隣接するＲ１と共に低級アルキル基で置換されていてもよいピラン環を形成してもよく、Ｒ３は水素原子、水酸基、ハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、アミノ基又はニトロ基を示す。〕
〔式中、Ｒ４は水素原子、水酸基、ハロゲン原子、低級アルコキシ基、低級アルキル基又は低級アルケニル基を示し、７個のＲ５は同一でも異なってもよく、水素原子、水酸基、低級アルコキシ基又は低級アルキル基を示すか、或は隣接する二つのＲ５は共に低級アルキル基で置換されていてもよいピラン環を形成してもよく、Ｒ６は水素原子、水酸基、ハロゲン原子、低級アルコキシ基、低級アルキル基、アミノ基又はニトロ基を示す。〕
〔式中、Ｒ７は水素原子、水酸基、ハロゲン原子、低級アルコキシ基又は低級アルキル基を示し、２個のＲ８は同一でも異なってもよく、水素原子、水酸基、低級アルコキシ基又は低級アルキル基を示し、Ｒ９は水素原子、水酸基、ハロゲン原子又は低級アルコキシ基を示し、５個のＲ１０は同一でも異なってもよく、水素原子、水酸基又は低級アルコキシ基を示す。〕
〔式中、３個のＲ１１は同一でも異なってもよく、水素原子、水酸基又は低級アルコキシ基を示す。〕
〔式中、Ｒ１２は水素原子又は低級アルケニル基を示し、Ｒ１３は水素原子又は水酸基を示し、Ｒ１４は水素原子を示す。〕
で表されるフラボノイド化合物、又はその配糖体、エステル若しくは塩を有効成分とするＢＣＲＰ阻害剤、ＢＣＲＰ関与の耐性を獲得した癌に対する抗癌剤耐性克服剤、又はＢＣＲＰを発現し、抗癌剤に対して低感受性の癌に対する抗癌剤耐性克服剤を提供するものである。
また本発明は、上記のＢＣＲＰ阻害剤およびＢＣＲＰの基質となり得る抗癌剤を含有する抗癌剤を提供するものである。
また、本発明は下記式（６）：
〔式中、Ｒ１５はアミノ基またはニトロ基を示す。〕
で表される新規なフラボノイド化合物を提供するものである。
さらに本発明は、ＢＣＲＰを高発現するＳＮ−３８耐性ヒト非小細胞肺癌Ａ５４９細胞を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
図１は、Ａ５４９／ＳＮ−３８−４細胞のＳＮ−３８（Ａ）およびミトキサントロン（Ｂ）に対する耐性獲得の程度を示す図である。
図２は、Ａ５４９細胞およびＡ５４９／ＳＮ−３８細胞における各種薬剤輸送蛋白質のｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲ法により解析した結果を示す図である。
図３は、Ａ５４９細胞およびＡ５４９／ＳＮ−３８細胞におけるＢＣＲＰ（Ａ）およびＭＲＰ２（Ｂ）ｍＲＮＡの発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により定量的に解析した結果を示す図である。
図４は、Ａ５４９細胞およびＡ５４９／ＳＮ−３８−４細胞のＳＮ−３８（Ａ）およびＳＮ−３８グルクロン酸抱合体（Ｂ）の蓄積量を示す図である。
図５は、Ｐ３８８／ＢＣＲＰ細胞のＳＮ−３８耐性に対するフラボノイド化合物〔化合物１−１（Ａ）、化合物１−４（Ｂ）、化合物１−６（Ｃ）、化合物１−１４（Ｄ）、化合物３−４（Ｅ）、化合物３−６（Ｆ）〕の克服作用を示す図である。
図６は、フラボノイド化合物によるＰ３８８／ＢＣＲＰ細胞のＳＮ−３８蓄積増大作用を示す図である。
図７は、フラボノイド化合物によるＭＣＦ−７細胞のＳＮ−３８蓄積増大作用を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
ヒト非小細胞肺癌Ａ５４９細胞は、培養が容易であり、マウスに移植することが可能であるとともに、ＣＰＴ−１１の活性本体であるＳＮ−３８に対して高い感受性を示すことが知られている（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１，１７８９−１７９６（１９９８））。このＡ５４９細胞を培地中のＳＮ−３８濃度を段階的に上げながら継続的に培養することにより、ＳＮ−３８耐性Ａ５４９細胞を樹立した。得られたＳＮ−３８耐性Ａ５４９細胞は、後記の実施例に示すように、ＢＣＲＰを高発現し、ＳＮ−３８の細胞内蓄積を減少させることにより耐性を獲得しており、ＢＣＲＰ阻害剤のスクリーニングに有用である。ＳＮ−３８耐性Ａ５４９細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏのスクリーニングに用いてもよく、また、マウスに移植することによりｉｎ ｖｉｖｏのスクリーニングに用いることも可能である。
当該細胞を用いて、ＳＮ−３８耐性克服作用を指標に様々な植物由来の成分についてスクリーニングを行った結果、フラボノイド化合物に強力なＢＣＲＰ阻害作用があることを見出した。
本発明のフラボノイド化合物は、上記の式（１）で示されるフラボン誘導体、式（２）で示されるフラバノン誘導体、式（３）で示されるカルコン誘導体、式（４）で示されるイソフラボン誘導体、又は式（５）で表されるフラボノイド誘導体である。
式（１）〜（４）中、Ｒ１〜Ｒ１１としての低級アルコキシ基は、炭素数１〜４であるのが好ましく、特にメトキシ基が好ましい。また、Ｒ１〜Ｒ８としての低級アルキル基は、炭素数１〜４であるのが好ましく、特にメチル基が好ましい。式（１）、（２）及び（５）中のＲ２、Ｒ４又はＲ１２としての低級アルケニル基は、炭素数２〜５であるのが好ましく、特に３−メチル−１又は２−ブテニル基が好ましい。ハロゲン原子としては、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素原子が挙げられ、塩素又は臭素原子が好ましい。式（１）において隣接するＲ１とＲ２が形成するピラン環は、炭素数１−４の低級アルキル基、特にメチル基、で置換されていてもよい。式（２）においてピラン環を形成する隣接する二つのＲ５は、ジヒドロベンゾピラン環上にあるのが好ましい。隣接する二つのＲ５が形成するピラン環は、炭素数１−４の低級アルキル基、特にメチル基、で置換されていてもよい。
式（６）において、Ｒ１５がニトロ基である化合物（２’−ニトロ−４’，５，５’，６，７，８−ヘキサメトキシフラボン）は２’−ニトロノビレチンとも呼ばれ、Ｒ１５がアミノ基である化合物（２’−アミノ−４’，５，５’，６，７，８−ヘキサメトキシフラボン）は２’−アミノノビレチンとも呼ばれ、いずれも新規化合物である。
上記のフラボノイド化合物には、例えばβ−Ｄ−グルコシド等の糖が付加した配糖体も含まれる。また、ナトリウム、カリウム、塩酸塩等が付加して薬理学的に許容される塩を形成することができ、斯かる塩もまた本発明に含まれる。さらには、例えば酢酸、プロピオン酸、乳酸、酪酸等の低級脂肪酸類が付加して、薬理学的に許容されるエステルを形成することができ、斯かるエステル体もまた本発明に含まれる。また、フラボノイド化合物は水和物等の溶媒和物の形態で存在することもあり、当該溶媒和物も本発明に含まれる。さらには、各異性体及びその混合物も本発明に含まれる。
本発明のフラボノイド化合物の由来については特に制限はなく、植物由来のものであってもよいし、化学合成品や半合成品であってもよい。植物から本発明のフラボノイド化合物を取得する方法に特に限定はなく、例えば植物の根、茎、葉、果実、及び／又は花部を水、メタノール、エタノール等の低級アルコール又はアセトンのような水溶性有機溶媒で室温又は加熱にて抽出する方法、水とこれらの水溶性有機溶媒との混合物により抽出する方法、更にクロロホルム、ジクロロメタン、酢酸エステル類、トルエン、又は炭酸ガスによる超臨界流体等の疎水性有機溶媒とメタノール等の水溶性有機溶媒の混合物により抽出する方法があるが、特に、根、茎、及び／又は葉を細断または粉砕し、メタノール等の低級アルコールで抽出するのが好ましい。そして、得られた抽出物はさらにカラムクロマトグラフィー等を用いて分画、精製することにより、本発明のフラボノイド化合物を単離することができる。
式（６）でＲ１５がニトロ基である２’−ニトロ−４’，５，５’，６，７，８−ヘキサメトキシフラボンは、４’，５，５’，６，７，８−ヘキサメトキシフラボンを慣用の方法に従ってニトロ化することにより製造することができる。ニトロ化剤としては、例えば硝酸−硫酸のような混酸が用いられる。
式（６）でＲ１５がアミノ基である２’−アミノ−４’，５，５’，６，７，８−ヘキサメトキシフラボンは、２’−ニトロ−４’，５，５’，６，７，８−ヘキサメトキシフラボンを常法に従って還元することにより製造することができる。
本発明のフラボノイド化合物は、そのままでも投与することができるが、効果を低減させない範囲内で、分散補助剤、賦形剤等の通常製剤化に使用されるような担体と混合し、粉剤、液剤、カプセル剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤、顆粒剤、丸剤、錠剤、トローチ剤、リモネーデ剤等の経口剤又は注射剤等の剤形で使用することができる。
この様な担体としては、例えば、マンニトール、乳糖、デキストラン等の水溶性の単糖類ないしオリゴ糖類もしくは多糖類；例えばヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース等のゲル形成性又は水溶性のセルロース類；例えば結晶性セルロース、α−セルロース、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム、及びそれらの誘導体等の水吸収性でかつ水難溶性のセルロース類；例えばヒドロキシプロピル澱粉、カルボキシメチル澱粉、架橋澱粉、アミロース、アミロペクチン、ペクチン及びそれらの誘導体等の水吸収性でかつ水難溶性の多糖類；例えばアラビアガム、トラガントガム、グリコマンナン及びそれらの誘導体等の水吸収性でかつ水難溶性のガム類；例えばポリビニルピロリドン、架橋ポリアクリル酸及びその塩、架橋ポリビニルアルコール、ポリヒドロキシエチルメタクリレート及びそれらの誘導体等の架橋ビニル重合体類；リン脂質、コレステロール等のリポソーム等分子集合体を形成する脂質類等を挙げることができる。
本発明のフラボノイド化合物の溶解性が低い場合には、可溶化処理を施すことができる。可溶化処理としては通常医薬に適用できる方法、例えば、ポリオキシエチレンアルコールエーテル類、ポリオキシエチレンアシルエステル類、ソルビタンアシルエステル類やポリオキシエチレンソルビタンアシルエステル類等の界面活性剤を添加する方法、ポリエチレングリコール等の水溶性高分子を使用する方法等が挙げられる。また、必要により、可溶性の塩にする方法、シクロデキストリン等を用いて包接化合物を形成させる方法等も使用できる。可溶化処理の方法は、目的とするフラボノイド化合物に応じて適宜変更できる。
ＢＣＲＰ阻害剤は、抗癌剤の投与によってＢＣＲＰ関与の耐性を獲得した癌に対しては抗癌剤耐性克服剤として使用することが出来る。また、もとからＢＣＲＰを発現し、抗癌剤に対して低感受性の癌に対しては抗癌剤効果増強剤として使用することが出来る。ＢＣＲＰ阻害剤を有効成分とする抗癌剤耐性克服剤および抗癌剤効果増強剤の対象となる抗癌剤としては、ＢＣＲＰの基質となり得る抗癌剤であれば特に制限はないが、例えば塩酸イリノテカン／ＣＰＴ−１１（活性本体：ＳＮ−３８）やトポテカン等のトポイソメラーゼＩ阻害剤や、ミトキサントロン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ビスアントレン、エトポシド等のトポイソメラーゼＩＩ阻害剤や、メトトレキサート等の葉酸代謝拮抗薬等が挙げられる。
本発明のＢＣＲＰ阻害剤の投与量は、投与法や患者の症状等に合わせて適宜調整すればよいが、成人１日あたり１ｍｇ〜１０ｇ、更に１００ｍｇ〜１０ｇ、特に５００ｍｇ〜１０ｇ投与するのが好ましい。また、抗癌剤とＢＣＲＰ阻害剤との比率は、特に限定されず、その好適な範囲は用いる抗癌剤、阻害剤の種類等により異なるが、例えば抗癌剤として塩酸イリノテカンを用いる場合には、抗癌剤：ＢＣＲＰ阻害剤が重量換算で１：１〜１：５００、特に１：１〜１：１００、更に１：１〜１：１０の比率とすることが好ましい。
本発明に用いられるフラボノイド化合物の具体例を表１、表２、表３、表４及び表５に示す。
【実施例】
次に本発明を実施例を挙げて更に詳細に説明するが、これは単に例示であって本発明を限定するものではない。
実施例１：３’，５−ジヒドロキシ−４’，６，７−トリメトキシフラボン（化合物１−６）の単離
ブラジル産生薬のカルケージャ３６８ｇをメタノールで二時間還流し、抽出液を減圧乾固した。得られたエキス８．１ｇのうち、５．０９ｇを中圧クロマトグラフィーによりヘキサンで溶出した後（Ａ画分）、ヘキサン−酢酸エチル（４：１）混合溶液で溶出し（Ｂ画分）、続いて酢酸エチル溶出して（Ｃ画分）、更にメタノールで溶出した（Ｄ画分）。得られたＣ画分１．５３ｇのうち、１．０ｇを中圧クロマトグラフィーにより２５４ｎｍにてモニターしながらヘキサンで溶出した後、ヘキサン−酢酸エチル（２：１）混合溶液、同（１：１）混合溶液、続いて酢酸エチル、メタノールの順に溶出し、１２画分を得た。ヘキサン−酢酸エチル混合溶液（２：１）で溶出されたＣ６画分（１００．１ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィー〔Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８ ＧＰ、６．０×２５０ｍｍ、アセトニトリル−水の（４５：５５）混合溶液で溶出〕で分析した結果、保持時間１５．２分のピークを示す画分が得られた。このＣ６画分をクロロホルム−メタノール（１：１）混合溶液により再結晶し、化合物１−６を４７．９ｍｇ得た。この化合物の分析結果は次の通りである。
ＩＲ νｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：１６４９（Ｃ＝Ｏ）
ＥＩ−ＭＳ ｍ／ｚ：３１５［Ｍ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：３．７４（Ｃ６−ＯＣＨ３，ｓ），３．８８（Ｃ４’−ＯＣＨ３，ｓ），３．９４（Ｃ７−ＯＣＨ３，ｓ），６．８３（Ｃ３−Ｈ，ｓ），６．９２（Ｃ８−Ｈ，ｓ），７．１０（Ｃ５’−Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．４８（Ｃ２’−Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ），７．５７（８．５，Ｃ６’−Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ），９．４４（Ｃ３’−ＯＨ，ｓ），１２．９０（Ｃ５−ＯＨ，ｓ），
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：５６．２（Ｃ６−ＯＣＨ３），５６．９（Ｃ７−ＯＣＨ３），６０．５（Ｃ６−ＯＣＨ３），９２．０（Ｃ−８），１０３．７（Ｃ−３），１０５．４（Ｃ−１０），１１２．５（Ｃ−５’），１１３．２（Ｃ−２’），１１９．３（Ｃ−６’），１２３．２（Ｃ−１’），１３２．２（Ｃ−６），１４７．０（Ｃ−３’），１５１．７（Ｃ−４’），１５２．０（Ｃ−５），１５３．１（Ｃ−９），１５９．１（Ｃ−７），１６４．３（Ｃ−２），１８２．５（Ｃ−４）
実施例２：５，４’−ジヒドロキシ−６，７−ジメトキシフラボン（化合物１−１９）の単離
高砂薬業（株）より入手したインチンコウ（茵陳蒿）５００ｇをメタノールで二時間還流し、抽出液を減圧乾固した。得られたエキス４０．１ｇのうち５．０７ｇをシリカゲルにまぶし、中圧クロマトグラフィーによりヘキサンで溶出した後（Ａ画分）、ヘキサン−酢酸エチル（４：１）混合溶液で溶出し（Ｂ画分）、続いて酢酸エチル溶出して（Ｃ画分）、更にメタノールで溶出した（Ｄ画分）。得られたＣ画分１．５６ｇのうち１．５ｇを中圧クロマトグラフィーにより２５４ｎｍにてモニターしながらクロロホルムで溶出した後、クロロホルム−メタノール（９９：１）混合溶液、同（１９：１）混合溶液、続いて同（９：１）混合溶液、メタノールの順に溶出し、１４画分を得た。クロロホルムで溶出されたＣ６画分（１１２．４ｍｇ）をメタノールに溶解し、Ｃ６メタノール不溶性画分（７０ｍｇ）を得た。このＣ６メタノール不溶性画分を高速液体クロマトグラフィー〔Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８ ＧＰ、６．０×２５０ｍｍ、アセトニトリル−０．７％蟻酸溶液の（３０：７０）混合溶液で溶出〕で分析した結果、保持時間２８．０分のピークを示した。この保持時間２８．０分のピークを有する画分を精製して得た化合物１−１９の分析結果は次の通りである。
ＩＲ νｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：１６５５（Ｃ＝Ｏ）
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：３１５［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣＬ３）δ：３．８７（ＯＣＨ３，ｓ），３．９９（ＯＣＨ３，ｓ），６．５７（Ｃ３−Ｈ，ｓ），６．６２（Ｃ８−Ｈ，ｓ），６．９６（Ｃ３’−Ｈ，Ｃ５’−Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１．７），７．７９（Ｃ２’−Ｈ，Ｃ６’−Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１．５），９．８９（Ｃ４’−ＯＨ，ｓ），１２．８８（Ｃ５−ＯＨ，ｓ）
実施例３：２’−ニトロ−４’，５，５’，６，７，８−ヘキサメトキシフラボン（化合物１−２０）の合成
４’，５，５’，６，７，８−ヘキサメトキシフラボン８３１ｍｇを氷浴中で濃硫酸１７ｍｌに溶解した。溶液に５％発煙硝酸−硫酸混液１．７ｍｌを滴下し、そのまま氷浴中で３０分間攪拌した。反応液を５０ｍｌの氷水にあけ、１０分間攪拌した。析出した結晶を吸引濾過し、結晶を酢酸エチルにて洗浄した。水層は酢酸エチル５０ｍｌにて２回抽出した。得られた酢酸エチル層を減圧下濃縮乾固した。得られた固形物を先の結晶と併せ、シリカゲルカラムクロマトグラフィー［関東化学製ＳｉＯ２、ヘキサン−酢酸エチル（１：１）で溶出］にて分画した。目的の画分を減圧下濃縮乾固することにより、２’−ニトロ−４’，５，５’，６，７，８−ヘキサメトキシフラボンを得た（収量３２６ｍｇ：収率３５％）。
ＩＲ νｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：３４８９，２９４３，２８３８，１６５５，１５３０
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：４４８［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：３．８３（３Ｈ，ｓ），３．９５（３Ｈ，ｓ），３．９７（３Ｈ，ｓ），３．９８（３Ｈ，ｓ），４．０３（３Ｈ，ｓ），４．０８（３Ｈ，ｓ），６．４１（１Ｈ，ｓ），７．００（１Ｈ，ｓ），７．６７（１Ｈ，ｓ）
実施例４：２’−アミノ−４’，５，５’，６，７，８−ヘキサメトキシフラボン（化合物１−５）の合成
２’−ニトロ−４’，５，５’，６，７，８−ヘキサメトキシフラボン１３５ｍｇを濃塩酸−メタノール（１：１）混液５ｍｌに溶解し、鉄粉末５１．６ｍｇを加え、室温にて４時間攪拌した。反応液に精製水２０ｍｌ、酢酸エチル２０ｍｌを加え、分液した。得られた水層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液にてｐＨ８に調整し、酢酸エチル１３０ｍｌにて２回抽出した。酢酸エチル層を飽和食塩水７０ｍｌにて洗浄後、無水硫酸マグネシウムにて乾燥した。硫酸マグネシウムを濾別し、酢酸エチルにて洗浄した後、酢酸エチル層を減圧下濃縮乾固した。得られた固形物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［関東化学製ＳｉＯ２、ヘキサン−酢酸エチル（１：１）で溶出］にて分画した。目的の画分を減圧下濃縮乾固することにより、２’−アミノ−４’，５，５’，６，７，８−ヘキサメトキシフラボンを得た（収量６６ｍｇ：収率５２％）。
ＩＲ νｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：３４９６，３３２６，１６２４，１５６０，１５２０
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：４１８［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：３．８５（３Ｈ，ｓ），３．８９（３Ｈ，ｓ），３．９６（６Ｈ，ｓ），３．９９（３Ｈ，ｓ），４．０９（３Ｈ，ｓ），６．２８（１Ｈ，ｓ），６．４８（１Ｈ，ｓ），６．９６（１Ｈ，ｓ）
実施例５：４’，５−ジヒドロキシ−３，３’，７−トリメトキシフラボン（化合物１−２２）の単離
タイ産生薬のＰｏｇｏｓｔｅｍｏｎ ｃａｂｌｉｎの枝葉５３．８ｇをメタノールで一週間室温抽出し、抽出液を減圧乾固した。得られたエキス４．９ｇのうち、４．７ｇを中圧クロマトグラフィーによりヘキサンで溶出した後（Ａ画分）、ヘキサン−酢酸エチル（４：１）混合溶液で溶出し（Ｂ画分）、続いて酢酸−エチル溶出して（Ｃ画分）、更にメタノールで溶出した（Ｄ画分）。得られたＢ画分１．３ｇのうち、０．５ｇを遠心クロマトグラフィーにより２５４ｎｍにてモニターしながらクロロホルムで溶出した後、クロロホルム−メタノール（９：１）混合溶液、メタノールの順に溶出し、１８画分を得た。クロロホルム−メタノール（９：１）混合溶液で溶出されたＢ９画分（１４．８ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィー（Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８ ＧＰ、６．０×２５０ｍｍ、アセトニトリル−水の（４５：５５）混合溶液で溶出）で分析した結果、保持時間１４．５分のピークを示す画分が得られた。この化合物の分析結果は次の通りである。
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：３４５［Ｍ＋Ｈ］＋，３４３［Ｍ−Ｈ］−
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：３．８５（Ｃ３’−ＯＣＨ３，ｓ），３．８８（Ｃ７’−ＯＣＨ３，ｓ），３．９８（Ｃ３−ＯＣＨ３，ｓ），６．３６（Ｃ６−Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．４），６．４４（Ｃ３−Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．４），７．０９（Ｃ５’−Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８），７．６７（Ｃ６’−Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．８，２．０），７．７０（Ｃ２’−Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：５５．８（Ｃ３’−ＯＣＨ３），５６．１（Ｃ７−ＯＣＨ３），６０．２（Ｃ３−ＯＣＨ３），９２．２（Ｃ−８），９７．８（Ｃ−６），１０６．０（Ｃ−１０），１１０．９（Ｃ−２’），１１４．６（Ｃ−５’），１２２．４（Ｃ−１’），１２２．７（Ｃ−６’），１３８．８（Ｃ−３），１４６．３（Ｃ−３’），１４８．３（Ｃ−４’），１５５．９（Ｃ−２），１５６．７（Ｃ−５），１６２．０（Ｃ−９），１６５．４（Ｃ−７），１７８．７（Ｃ−４）
実施例６：５−ヒドロキシ−３’，４’，７−トリメトキシフラボン（化合物１−２３）の単離
中国産生薬の独角柑（Ｓｔｒｉｇａ ａｓｉａｔｉｃａの全草）約３００ｇをメタノールで二時間還流抽出し、抽出液を減圧乾固した。得られたエキス６．８ｇのうち、５．０ｇを中圧クロマトグラフィーによりヘキサンで溶出した後（Ａ画分）、ヘキサン−酢酸エチル（４：１）混合溶液で溶出し（Ｂ画分）、続いて酢酸−エチル溶出して（Ｃ画分）、更にメタノールで溶出した（Ｄ画分）。得られたＢ画分４８０ｍｇを遠心クロマトグラフィーにより２５４ｎｍにてモニターしながらクロロホルムで溶出した後、クロロホルム−メタノール（９：１）混合溶液、メタノールの順に溶出し、９画分を得た。クロロホルムで溶出されたＢ３およびＢ４画分（各４２．３ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィー（Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８ ＧＰ、６．０×２５０ｍｍ、アセトニトリル−メタノール−水の（４５：５：５０）混合溶液で溶出）で分析し、保持時間１６．５分のピークを分取した。この化合物の分析結果は次の通りである。
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：３２９［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：３．８９，３．９７，３．９９（Ｃ７，Ｃ３’，Ｃ４’−ＯＣＨ３，ｓ），６．３８（Ｃ６−Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．４），６．５０（Ｃ８−Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．４），６．５９（Ｃ３−Ｈ，ｓ），６．９８（Ｃ５’−Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８），７．３４（Ｃ２’−Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．４），７．５３（Ｃ６’−Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．８，２．４），１２．７９（Ｃ５−ＯＨ，ｓ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：５５．８（Ｃ７−ＯＣＨ３），５６．１（Ｃ３’−ＯＣＨ３，Ｃ４’−ＯＣＨ３），９２．７（Ｃ−２），９８．１（Ｃ−８），１０４．７（Ｃ−３），１０５．６（Ｃ−１０），１０８．９（Ｃ−２’），１１１．２（Ｃ−５’），１２０．１（Ｃ−６’），１２３．８（Ｃ−１’），１４９．３（Ｃ−３’），１５２．３（Ｃ−４’），１５１．７（Ｃ−４’），１５７．７（Ｃ−９），１６２．２（Ｃ−２），１６４．０（Ｃ−５），１６５．５（Ｃ−７），１８２．４（Ｃ−４）
実施例７：３，３’，４’，５，６，７，８−ヘプタメトキシフラボン（化合物１−２４）および３’，４’，５，６−ペンタメトキシフラボン（化合物１−２５）の単離
中国産生薬の橘皮（Ｃｉｔｒｕｓ ｔａｎｇｅｒｉｎａの果皮）約２Ｋｇをメタノールで二時間還流抽出し、抽出液を減圧乾固した。得られたエキス３５６．５ｇのうち、３５．２ｇを中圧クロマトグラフィーによりヘキサンで溶出した後（Ａ画分）、ヘキサン−酢酸エチル（４：１）混合溶液で溶出し（Ｂ画分）、続いて酢酸−エチル溶出して（Ｃ画分）、更にメタノールで溶出した（Ｄ画分）。得られたＣ画分５５６ｍｇを中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィにより２５４ｎｍにてモニターしながらクロロホルムで溶出した後、クロロホルム−メタノール（９８：２）混合溶液、同（９５：５）混合溶液、メタノールの順に溶出し１０画分を得た。クロロホルムで溶出されたＣ３およびＣ４画分（計２３０ｍｇ）を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィにより２５４ｎｍにてモニターしながらヘキサンで溶出した後、ヘキサン−酢酸エチル（１９：１）混合溶液、同（９：１）、（８：２）、（７：３）、（５：５）、（１：２）混合溶液、酢酸エチル、メタノールの順に溶出し１０画分を得た。ヘキサン−酢酸エチル（５：５）混合溶液で溶出されたＣ２３Ｇ画分（９０．０ｍｇ）および（１：２）混合溶液で溶出されたＣ２３Ｊ画分（５．２ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィー（Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８ ＧＰ、６．０×２５０ｍｍ、アセトニトリル−５％蟻酸−メタノール−水の（３０：１０：２０：４０）混合溶液で溶出）で分析した結果、保持時間１８．３分（化合物１−２４）および１０．６分（化合物１−２５）のピークを示す画分が得られた。この化合物の分析結果は次の通りである。
化合物１−２４
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：４３３［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：３．９１（ＯＣＨ３，ｓ），３．９６（ＯＣＨ３，ｓ），３．９８（ＯＣＨ３×２，ｓ），３．９９（ＯＣＨ３，ｓ），４．０２（ＯＣＨ３，ｓ），４．１１（ＯＣＨ３，ｓ），７．０３（Ｃ５’−Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３），７．８２（Ｃ２’−Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．４），７．８５（Ｃ６’−Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．３，２．４）
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：５６．６，５６．７（Ｃ３’，Ｃ４’−ＯＣＨ３），６０．５，６２．４，６２．５，６２．７，６３．０（Ｃ３，Ｃ５，Ｃ６，Ｃ７，Ｃ８−ＯＣＨ３），１０７．４（Ｃ−２’），１１１．７（Ｃ−５’），１１５．２（Ｃ−１０），１２２．７（Ｃ−６’），１２４．１（Ｃ−１’），１３８．６（Ｃ−８），１４１．５（Ｃ−６），１４４．６（Ｃ−３），１４７．４（Ｃ−５），１４８．９（Ｃ−９），１４９．５（Ｃ−３’），１５１．８（Ｃ−２），１５２．０（Ｃ−７），１５３．８（Ｃ−４’），１７４．６（Ｃ−４）
化合物１−２５
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：３７３［Ｍ＋Ｈ］＋，３７１［Ｍ−Ｈ］−
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：３．９３（ＯＣＨ３，ｓ），３．９６（ＯＣＨ３，ｓ），３．９８（ＯＣＨ３，ｓ），３．９９（ＯＣＨ３×２，ｓ），６．６０（Ｃ３−Ｈ，ｓ），６．８０（Ｃ８−Ｈ，ｓ），６．９７（Ｃ５’−Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８），７．３３（Ｃ２’−Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０），７．５１（Ｃ６’−Ｈ，Ｊ＝８．３，２．０）
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：５６．３，５６．３，５６．５（Ｃ７，Ｃ３’，Ｃ４’−ＯＣＨ３），６１．７，６２．５（Ｃ５，Ｃ６−ＯＣＨ３），９６．４（Ｃ−８），１０７．６（Ｃ−３），１０８．８（Ｃ−２’），１１１．３（Ｃ−５’），１１２．９（Ｃ−１０），１１９．８（Ｃ−６’），１２４．３（Ｃ−１’），１４０．４（Ｃ−６），１３９．３（Ｃ−３’），１５２．０（Ｃ−４’），１５２．６（Ｃ−９），１５４．７（Ｃ−５），１５７．８（Ｃ−７），１６１．３（Ｃ−２），１７７．４（Ｃ−４）
実施例８：５−ヒドロキシ−６，７−ジメトキシフラボン−４’−グルコシド（化合物１−２６）の単離
北海道産のチシマアザミの茎葉５５．０ｇをメタノールで一週間室温抽出し、抽出液を減圧乾固した。得られたエキス１３．５ｇのうち、５．１ｇを中圧クロマトグラフィーによりヘキサンで溶出した後（Ａ画分）、ヘキサン−酢酸エチル（４：１）混合溶液で溶出し（Ｂ画分）、続いて酢酸−エチル溶出して（Ｃ画分）、更にメタノールで溶出した（Ｄ画分）。得られたＤ画分３．８ｇのうち２．０ｇを中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィにより２５４ｎｍにてモニターしながらクロロホルムで溶出した後、クロロホルム−メタノール（９：１）混合溶液、同（８：１）、（３：７）混合溶液、メタノールの順に溶出し１０画分を得た。クロロホルム−メタノール（９：１）混合溶液で溶出されたＤ４画分１．３４ｇをクロロホルムにて再結晶し、白色結晶を得た。高速液体クロマトグラフィー（Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８ ＧＰ、６．０×２５０ｍｍ、アセトニトリル−水の（２０：８０）混合溶液で溶出）で分析した結果、保持時間２７．６分のピークを示す化合物が得られた。この化合物の分析結果は次の通りである。
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：４７７［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：３．７４（Ｃ７−ＣＨ３，ｓ），３．９４（Ｃ６’−ＣＨ３，ｓ），４．５９（ｔ，Ｊ＝５．６），５．０４（ｄ，Ｊ＝７．８），５．０６（ｄ，Ｊ＝５．６），５．１３（ｄ，Ｊ＝４．４），５．３７（ｄ，Ｊ＝４．６），６．９８（Ｃ８−Ｈ，ｓ），６．９６（Ｃ３−Ｈ，ｓ），７．２０（Ｃ３’−Ｈ，Ｃ５’−Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０），８．０７（Ｃ２’−Ｈ，Ｃ６’−Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０），１２．９（Ｃ５−ＯＨ，ｓ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：５６．５（Ｃ７−ＯＣＨ３），６０．０（Ｃ６−ＯＣＨ３），６０．６（Ｃ−６’’），６９．６（Ｃ−４’’），７３．１（Ｃ−２’’），７６．５（Ｃ−３’’），７７．２（Ｃ−５’’），９１．７（Ｃ−８），９９．８（Ｃ−１’’），１０３．６（Ｃ−３），１０５．２（Ｃ−１０），１１６．６（Ｃ−３’，Ｃ−５’），１２３．８（Ｃ−１’），１２８．２（Ｃ−２’，Ｃ−６’），１３１．９（Ｃ−６），１５２．０（Ｃ−５），１５２．７（Ｃ−９），１５８．７（Ｃ−７），１６０．３（Ｃ−４’），１６３．４（Ｃ−２），１８２．３（Ｃ−４）
実施例９：５−ヒドロキシ−７−メトキシフラボン−４´−グルコシド（化合物１−２７）の製造
化合物１−１（５，４’−ジヒドロキシ−７−メトキシフラボン）（１００ｍｇ）をアセトンに溶解し、これにα−Ｄ−アセトブロモグルコース（６４７ｍｇ）と炭酸カリウム（２３１ｍｇ）を加え、激しく攪拌しながら一昼夜煮沸還流した。濾過により不溶物を除き、濾取物をクロロホルムで洗浄し、濾洗液を合し、これを減圧下濃縮乾固した。残留物をクロロホルム／メタノール系でシリカゲルクロマトグラフィーにて精製した。これを無水メタノールに懸濁し、２８％ＮａＯＭｅを滴下し、室温で０．５ｈ攪拌した。反応混合物に水を加え、イオン交換樹脂（スルホン酸−＋Ｈ型）で中和した。樹脂を濾過により除き、溶媒を減圧下濃縮乾固し、クロロホルム／メタノール系でシリカゲルクロマトグラフィーにて精製して、目的物を得た（収量１０ｍｇ：収率６％）。
淡黄色結晶、ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：４４７［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ３．１８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９Ｈｚ），３．２８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９Ｈｚ），３．３２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９Ｈｚ），３．４１（１Ｈ，ｍ），３．５０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６Ｈｚ，１２Ｈｚ），３．７１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２Ｈｚ，１１Ｈｚ），３．８８（３Ｈ，ｓ），５．０４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ），６．４０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ），６．８３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ），６．９４（１Ｈ，ｓ），７．２１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ），８．０７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ）
実施例１０：４Ｈ，８Ｈ−ベンゾ［１，２−ｂ：３，４−ｂ’］ジピラン−４−オン，２−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−５−ヒドロキシ−８，８−ジメチル−３−（３−メチル−２−ブテニル）（化合物１−２８）の単離
タイ産生薬のＪａｃｋ Ｆｒｕｉｔ Ｔｒｅｅ（Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌｕｓの木部）１６９ｇをメタノールで一週間室温抽出し、抽出液を減圧乾固した。得られたエキス８．１ｇのうち、４．７ｇを中圧クロマトグラフィーによりヘキサンで溶出した後（Ａ画分）、ヘキサン−酢酸エチル（４：１）混合溶液で溶出し（Ｂ画分）、続いて酢酸−エチル溶出して（Ｃ画分）、更にメタノールで溶出した（Ｄ画分）。得られたＣ画分３．２ｇを中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィにより２５４ｎｍにてモニターしながらクロロホルムで溶出した後、クロロホルム−メタノール（９８：２）混合溶液、同（１９：１）、（９：１）、（４：１）、（２：１）、（１：１）混合溶液、メタノールの順に溶出し１０画分を得た。クロロホルムで溶出されたＣ４画分（２１７ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィー（Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８ ＧＰ、６．０×２５０ｍｍ、アセトニトリル−水の（７０：３０）混合溶液で溶出）で分析し、保持時間９．８分（化合物１−２８）のピークを分取した。この化合物の分析結果は次の通りである。
化合物１−２８
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：４２１［Ｍ＋Ｈ］＋，４１９［Ｍ−Ｈ］−
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ：１．３６（ＣＨ３，ｓ），１．４３（ＣＨ３×２，ｓ），１．５８（ＣＨ３，ｓ），３．０８（Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８），５．０９（Ｈ，ｔｔ，Ｊ＝６．８，３．９），５．６６（Ｃ９−Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．８），６．２５（Ｃ６−Ｈ，ｓ），６．３９（Ｃ５’−Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．３，２．４），６．４０（Ｃ３’−Ｈ，ｓ），６．６７（Ｃ１０−Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．８），７．０６（Ｃ６’−Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３）
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ：２４．６（ＣＨ３），２５．６（ＣＨ３），２８．３（Ｃ８−ＣＨ３×２），７８．７（Ｃ−８），９５．４（Ｃ−６），１０３．５（Ｃ−３’），１０５．８，１０７．７（Ｃ−９），１１３．０（Ｃ−１’），１１６．１（Ｃ−５’），１２１．８（Ｃ−３），１２２．５，１３２．２（Ｃ−１０），１３２．５，１５７．０，１５７．５（Ｃ−２’），１５８．７（Ｃ−４’），１６０．３（Ｃ−７），１６１．７（Ｃ−２），１６３．４（Ｃ−５），１８３．６（Ｃ−４）
実施例１１：２’，４’，５−トリヒドロキシ−７−メトキシ６−（３−メチル−１−ブテニル）−３−（３−メチル−２−ブテニル）−フラボン（化合物１−２９）の単離
タイ産生薬のＪａｃｋ Ｆｒｕｉｔ Ｔｒｅｅ（Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌｕｓの木部）１６９ｇをメタノールで一週間室温抽出し、抽出液を減圧乾固した。得られたエキス８．１ｇのうち、４．７ｇを中圧クロマトグラフィーによりヘキサンで溶出した後（Ａ画分）、ヘキサン−酢酸エチル（４：１）混合溶液で溶出し（Ｂ画分）、続いて酢酸−エチル溶出して（Ｃ画分）、更にメタノールで溶出した（Ｄ画分）。
クロロホルムで溶出されたＣ４画分（２１７ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィー（Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８ ＧＰ、６．０×２５０ｍｍ、アセトニトリル−水の（７０：３０）混合溶液で溶出）で分析し、保持時間８．５分（化合物１−２９）のピークを分取した。この化合物の分析結果は次の通りである。
化合物１−２９
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：４３７［Ｍ＋Ｈ］＋，４３５［Ｍ＋Ｈ］−
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ：１．０２（Ｃ１７，ｌＣ１８−ＣＨ３，ｄ，Ｊ＝６．８３），１．３３（Ｃ１２−ＣＨ３，ｓ），１．５２（Ｃ１３−ＣＨ３，ｓ），２．３３（Ｃ１６−Ｈ，ｍ），３．０２，３．０４（Ｃ９−ＣＨ２，ｓ），３．７７（Ｃ７−ＯＣＨ３，ｓ），５．０４（Ｃ１０−Ｈ，ｔｔ，Ｊ＝５．４，１．５），６．３３（Ｃ８−Ｈ，ｓ），６．３４（Ｃ５’−Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．３），６．３６（Ｃ３’−Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．４），６．４３（Ｃ１４−Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１６．１，１．０），６．５６（Ｃ１５−Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１６．１，７．３），７．０２（Ｃ６’−Ｈ，Ｊ＝８．３）
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ：１８．５（Ｃ−１３），２４．１（Ｃ−１７，Ｃ−１８），２５．８（Ｃ−９），２６．７（Ｃ−１２），３５．２（Ｃ−１６），５７．３（Ｃ７−ＯＣＨ３），９１．５（Ｃ−８），１０４．６（Ｃ−３’），１０６．７（Ｃ−４ａ），１０８．８（Ｃ−５’），１１１．２（Ｃ−６），１１４．１（Ｃ−１’），１１８．０（Ｃ−１４），１２２．９（Ｃ−３），１２３．７（Ｃ−１０），１３３．４（Ｃ−１１），１３３．５（Ｃ−６’），１４３．５（Ｃ−１５），１５８．６（Ｃ−２’），１５８．６（Ｃ−８ａ），１６０．４（Ｃ−５），１６２．６（Ｃ−４’），１６４．３（Ｃ−２），１６５．０（Ｃ−７），１８４．６（Ｃ−４）
実施例１２：２Ｈ，６Ｈ−ベンゾ［１，２−ｂ：５，４−ｂ’］ジピラン−６−オン，７，８−ジヒドロ−５−ヒドロキシ−８−（４−ヒドロキシフェニル）−２，２−ジメチル−１０−（３−メチル−２−ブテニル）（化合物２−３）の単離
タイ産生薬のＡｌｂｉｚｚｉａ ｍｙｒｉｏｐｈｙｌｌａの枝６０．０ｇをメタノールで一週間室温抽出し、抽出液を減圧乾固した。得られたエキス４．４ｇのうち、３．８０ｇを中圧クロマトグラフィーによりヘキサンで溶出した後（Ａ画分）、ヘキサン−酢酸エチル（４：１）混合溶液で溶出し（Ｂ画分）、続いて酢酸−エチル溶出して（Ｃ画分）、更にメタノールで溶出した（Ｄ画分）。得られたＢ画分１．２ｇを高速液体クロマトグラフィー（Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８ ＧＰ、６．０×２５０ｍｍ、アセトニトリル−水の（７０：３０）混合溶液で溶出）で分析した結果、保持時間１５．２分のピークを示す画分が得られた。この化合物の分析結果は次の通りである。
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：４０７［Ｍ＋Ｈ］＋，４０５［Ｍ−Ｈ］−
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：１．４３，１．４５（Ｃ２’’’−ＣＨ３×２，ｓ），１．６５（Ｃ３’’−ＣＨ３×２，ｓ），２．８０（Ｃ３−Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１７．１，３．２），３．３９（Ｃ３−Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１７．１，２．９），３．２１（Ｃ１’’−Ｈ２，ｄ，Ｊ＝７．３），５．１４（Ｃ２’’−Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３），５．３４（Ｃ２−Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２．７，２．９），５．５０（Ｃ３−‘’’Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．０），６．６３（Ｃ４’’’−Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．０），６．８７（Ｃ３，−Ｈ，Ｃ５’−Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８），７．３２（Ｃ２’−Ｈ，Ｃ６’−Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８）
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：１７．８（Ｃ−５’’−ＣＨ３），２１．５（Ｃ−１’’），２５．８（Ｃ４’’−ＣＨ３），２８．３（Ｃ−６’’’−ＣＨ３），２８．４（Ｃ−５’’’−ＣＨ３），４３．２（Ｃ−３），７８．１（Ｃ−２’’’），７８．５（Ｃ−２），１０２．７（Ｃ−１０），１０２．８（Ｃ−６），１０８．６（Ｃ−８），１１５．５（Ｃ−３’，Ｃ−５’），１１５．７（Ｃ−４’’’），１２２．５（Ｃ−２’’），１２６．０（Ｃ−１’），１２７．７（Ｃ−２’，Ｃ−６’），１３１．１（Ｃ−３’’’），１５５．８（Ｃ−４’），１５６．６（Ｃ−９），１５９．３（Ｃ−５），１６０．０（Ｃ−７），１９６．４（Ｃ−４）
実施例１３：６Ｈ，７Ｈ−［１］ベンゾピラノ［４，３−ｂ］［１］ベンゾピラン−７−オン，３，８，１０−トリヒドロキシ−９−（３−メチル−１−ブテニル）−６−（２−メチル−１−プロペニル）（化合物５−１）の単離
タイ産生薬のＪａｃｋ Ｆｒｕｉｔ Ｔｒｅｅ（Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌｕｓの木部）１６９ｇをメタノールで一週間室温抽出し、抽出液を減圧乾固した。得られたエキス８．１ｇのうち、４．７ｇを中圧クロマトグラフィーによりヘキサンで溶出した後（Ａ画分）、ヘキサン−酢酸エチル（４：１）混合溶液で溶出し（Ｂ画分）、続いて酢酸−エチル溶出して（Ｃ画分）、更にメタノールで溶出した（Ｄ画分）。得られたＣ画分３．２ｇを中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィにより２５４ｎｍにてモニターしながらクロロホルムで溶出した後、クロロホルム−メタノール（９８：２）混合溶液、同（１９：１）、（９：１）、（４：１）、（２：１）、（１：１）混合溶液、メタノールの順に溶出し１０画分を得た。クロロホルムで溶出されたＣ３画分を高速液体クロマトグラフィー（Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８ ＧＰ、６．０×２５０ｍｍ、アセトニトリル−水の（７０：３０）混合溶液で溶出）で分析し、保持時間１０．８分（化合物５−１）のピークを分取した。
この化合物の分析結果は次の通りである。
化合物５−１
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：４２１［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ：１．９２（ＣＨ３×２，ｄ，Ｊ＝６．６），１．７０（ＣＨ３，ｄ，Ｊ＝１．２），１．９５（ＣＨ３，ｄ，Ｊ＝１．２），２．４１（ＣＨ，ｍ），５．４０（ＣＨ＝，ｄｔ，Ｊ＝９．５，１．２），６．１４（Ｃ６−Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．３），６．３０（Ｃ２−Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．２），６．４２（Ｃ１１−Ｈ，ｓ），６．５０（Ｃ４−Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．５，２．２），６．５３（＝ＣＨ，ｄｄ，Ｊ＝１６．１，１．０），６．６８（ＣＨ＝，ｄｄ，Ｊ＝１６．１，７．０），７．５９（Ｃ５−Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５）
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ：１９．３（ＣＨ３），２３．９（ＣＨ３×２），２６．６（ＣＨ３），３５．０，６７．３，７１．３，９５．０（Ｃ−１１），１０５．６（Ｃ−４），１０６．０，１０９．３，１１０．９，１１１．６，１１８．０（Ｃ−２），１２３．２，１２６．８（Ｃ−５），１４０．４，１４３．２，１５６．９，１５７．６（Ｃ−５），１６０．１，１６１．２（Ｃ−８），１６３．６（Ｃ−３），１６５．３（Ｃ−１０），１８０．４（Ｃ−７）
実施例１４：ＳＮ−３８耐性Ａ５４９細胞の樹立
ヒト非小細胞肺癌Ａ５４９細胞は、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有したＨａｍ’ｓ Ｆ−１２培地（１０％ＦＢＳ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１２）を使用して５％ＣＯ２，３７℃条件下で継代培養した。ＳＮ−３８耐性Ａ５４９細胞は、Ａ５４９細胞を培地中のＳＮ−３８濃度を段階的（４〜１０ｎｇ／ｍｌ）に増加させて２ヶ月間継代培養して選択した。さらに、このＳＮ−３８耐性Ａ５４９細胞から限界希釈法によるクローン化を行い、６株のクローン化ＳＮ−３８耐性Ａ５４９細胞（Ａ５４９／ＳＮ−３８−１〜６）を樹立した。
実施例１５：Ａ５４９／ＳＮ−３８細胞の抗癌剤感受性試験
Ａ５４９またはＡ５４９／ＳＮ−３８−１〜６の各細胞を１０％ＦＢＳ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１２に懸濁し、９６ウェルマイクロプレートに播種して５％ＣＯ２、３７℃条件下で培養した（２ ｘ １０３ ｃｅｌｌｓ／５０μｌ／ｗｅｌｌ）。一晩培養後、抗癌剤を溶解した１０％ＦＢＳ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１２を５０μｌ加え、５％ＣＯ２、３７℃条件下で４８時間培養した。培養後、生細胞測定用試薬〔ＴｅｔｒａＣｏｌｏｒ ＯＮＥ（商標名）、生化学工業製〕を使用して、添付の操作手順に従って生細胞数を測定した。各種抗癌剤に対するＡ５４９細胞およびＡ５４９／ＳＮ−３８細胞６株の感受性を表６および図１に示す。なお、ＩＣ５０値は細胞増殖を５０％抑制する抗癌剤の濃度である。また、相対耐性度は、Ａ５４９／ＳＮ−３８細胞におけるＩＣ５０値をＡ５４９細胞におけるＩＣ５０値で除した値であり、この値が大きいほど耐性獲得が大きいことを意味する。Ａ５４９／ＳＮ−３８細胞は、ＢＣＲＰの基質であるＳＮ−３８およびミトキサントロンに対して特に強い耐性を示した。
実施例１６ Ａ５４９／ＳＮ−３８細胞のＲＴ−ＰＣＲ解析
Ａ５４９細胞、Ａ５４９／ＳＮ−３８細胞６株およびＢＣＲＰを発現していることが知られるヒト乳癌ＭＣＦ−７細胞における各種薬剤輸送蛋白質のｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲ法により解析した。細胞よりＲＮＡ抽出用試薬〔ＩＳＯＧＥＮ（商標名）、ニッポンジーン製〕を用いて全ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ用試薬〔Ｒｅａｄｙ・Ｔｏ・Ｇｏ ＲＴ−ＰＣＲ Ｂｅａｄｓ（商標名）、アマシャム ファルマシア バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ）製〕およびサーマルサイクラー〔ｉＣｙｃｌｅｒ（商標名）、バイオ・ラッド（ＢＩＯ−ＲＡＤ）製〕を使用して添付の操作手順に従ってＲＴ−ＰＣＲを行った（全ＲＮＡ：０．５μｇ）。ＰＣＲ産物は、２％アガロースゲルを用いて電気泳動後、エチジウムブロマイド染色を施してトランスイルミネーターにて検出した。また、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ用試薬〔ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＲＴ−ＰＣＲ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（商標名）、アプライド バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）製〕およびＰＣＲプロダクト自動検出／定量システム〔ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７０００（商標名）、アプライド バイオシステムズ製〕を使用して添付の操作手順に従ってリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法を行い、定量的な解析を行った（全ＲＮＡ０．１μｇ）。なお、ＢＣＲＰ、ＭＤＲ１、ＭＲＰ１、ＭＲＰ２、ＭＲＰ３および内在性コントロール遺伝子のＧ３ＰＤＨに対する各ＰＣＲプライマーは、それぞれ公知のｍＲＮＡ塩基配列（アクセッション番号Ｎｏ．ＡＦ０９８９５１、ＡＦ０１６５３５、Ｌ０５６２８、Ｕ６３９７０、ＡＦ００９６７０、Ｍ３３１９７）よりデザインした。ＲＴ−ＰＣＲの結果を図２に、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲの結果を図３に示す。Ａ５４９細胞に比較してＡ５４９／ＳＮ−３８細胞６株では全てにおいてＢＣＲＰの発現が顕著に増加していた。一方、ＢＣＲＰと同じくＳＮ−３８を基質とするＭＲＰ２の発現量に大きな違いは認められなかった。また、その他の薬剤輸送蛋白質についてもＡ５４９細胞およびＡ５４９／ＳＮ−３８細胞間で発現量に違いは認められなかった。これらの結果から、ＢＣＲＰがＡ５４９／ＳＮ−３８細胞の抗癌剤耐性機構に関与することが示唆された。なお、本ＲＴ−ＰＣＲ解析で、ヒト乳癌ＭＣＦ−７細胞におけるＢＣＲＰ発現も確認された。一方、薬剤輸送蛋白質の発現の他にも、トポイソメラーゼ−Ｉ、トポイソメラーゼ−ＩＩ、Ｂｃｌ−２、ＢａｘおよびＩκＢαの発現をウェスタンブロット法により、トポイソメラーゼ−Ｉ活性についてＤＮＡ弛緩反応を指標に検討したが、これらがＡ５４９／ＳＮ−３８細胞の抗癌剤耐性機構に関与することを示唆するデータは得られなかった。
実施例１７：Ａ５４９／ＳＮ−３８細胞の抗癌剤蓄積量
Ａ５４９細胞またはＡ５４９／ＳＮ−３８−４細胞（４ ｘ １０６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を懸濁した１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０ １ｍｌにＳＮ−３８ＤＭＳＯ溶液１μｌ（最終濃度：３００ｎｇ／ｍｌ）を加えて３７℃にて６０分間インキュベート後、遠心（２℃、１，４００ ｘ ｇ、１ｍｉｎ）して上清を除去した。沈殿した細胞に氷冷ＰＢＳを加えて再懸濁後、遠心（２℃、１，４００ ｘ ｇ、１ｍｉｎ）して細胞を洗浄した。この洗浄操作をさらに１回行った後、ＰＢＳ ３７５μｌを加えて超音波処理により細胞を破壊した。この細胞破壊液にメタノール３７５μｌおよび１０％硫酸亜鉛溶液１５μｌを加えて攪拌後、遠心（２℃、１２，５００ ｘ ｇ、５ｍｉｎ）して上清を回収した。蛍光強度測定用の白色９６ウェルマイクロプレートに回収した上清を分注後（２００μ／ｗｅｌｌ）、マイクロプレート蛍光光度計〔ＳＰＥＣＴＲＡ ｍａｘ ＧＥＭＩＮＩ ＸＳ（商標名）、モレキュラー デバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）製〕により上清中のＳＮ−３８およびＳＮ−３８グルクロン酸抱合体量を測定し（ＳＮ−３８：励起波長３８０ｎｍ、測定波長５６０ｎｍ；ＳＮ−３８グルクロン酸抱合体：励起波長３７０ｎｍ、測定波長４３０ｎｍ）、細胞内の蓄積量を算出した。その結果、図４に示すように、Ａ５４９／ＳＮ−３８−４細胞のＳＮ−３８蓄積量はＡ５４９細胞におけ蓄積量に比較して約１／５に減少していた。この結果はＡ５４９／ＳＮ−３８細胞の抗癌剤耐性機構にＢＣＲＰが関与することを支持するものである。一方、ＳＮ−３８グルクロン酸抱合体は両細胞においてほとんど検出されず、グルクロン酸抱合活性の耐性機構への関与はないことが示された。
実施例１８：フラボノイド化合物によるＡ５４９／ＳＮ−３８細胞の抗癌剤耐性に対する克服作用
Ａ５４９細胞またはＡ５４９／ＳＮ−３８−４細胞を１０％ＦＢＳ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１２に懸濁し、９６ウェルマイクロプレートに播種して５％ＣＯ２、３７℃条件下で培養した（２ ｘ １０３ ｃｅｌｌｓ／５０μｌ／ｗｅｌｌ）。一晩培養後、フラボノイド化合物およびＳＮ−３８を溶解した１０％ＦＢＳ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１２をそれぞれ２５μｌ加え、５％ＣＯ２、３７℃条件下で４８時間培養した。培養後、ＴｅｔｒａＣｏｌｏｒ ＯＮＥを使用して、添付の操作手順に従って生細胞数を測定した。各フラボノイド化合物の耐性克服効果を表７にＥＣ５０値で示す。なお、ＥＣ５０値は、相対耐性度を５０％低下させる時のフラボノイド化合物の濃度である。その結果、フラボノイド化合物はＡ５４９／ＳＮ−３８−４細胞のＳＮ−３８耐性に対して強力な克服作用を示した。一方、濃度依存的に耐性を克服する濃度範囲において、フラボノイド化合物自体はＡ５４９細胞およびＡ５４９／ＳＮ−３８−４細胞の増殖に影響を及ぼさなかった。この結果は、本発明のフラボノイド化合物がＢＣＲＰを阻害し、癌細胞の抗癌剤耐性を克服することを示唆するものである。
実施例１９：フラボノイド化合物によるＭＣＦ−７細胞の抗癌剤に対する感受性増強作用
ＢＣＲＰを発現していることが知られるヒト乳癌ＭＣＦ−７細胞（Ｂｌｏｏｄ ９９，３７６３−３７７０（２００２））を用いて、癌細胞の抗癌剤に対する感受性に及ぼすフラボノイド化合物の作用を検討した。ＭＣＦ−７細胞を１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０に懸濁し、９６ウェルマイクロプレートに播種して５％ＣＯ２、３７℃条件下で培養した（３ ｘ １０３ ｃｅｌｌｓ／５０μｌ／ｗｅｌｌ）。一晩培養後、フラボノイド化合物およびＳＮ−３８を溶解した１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０をそれぞれ２５μｌ加え、５％ＣＯ２、３７℃条件下で４８時間培養した。培養後、ＴｅｔｒａＣｏｌｏｒ ＯＮＥを使用して、添付の操作手順に従って生細胞数を測定した。表８にフラボノイド化合物によるＭＣＦ−７細胞のＳＮ−３８に対する感受性の変化を、ＩＣ５０値（細胞増殖を５０％抑制するＳＮ−３８の濃度）で表した。その結果、フラボノイド化合物はＭＣＦ−７細胞のＳＮ−３８に対する感受性を増強した。一方、濃度依存的に感受性を増強する濃度範囲において、フラボノイド化合物自体はＭＣＦ−７細胞の増殖に影響を及ぼさなかった。この結果は、本発明のフラボノイド化合物がＢＣＲＰを阻害し、抗癌剤に対する癌細胞の感受性を増強することを示唆するものである。
実施例２０：フラボノイド化合物によるヒトＢＣＲＰ遺伝子導入マウス白血病Ｐ３８８細胞の抗癌剤耐性に対する克服作用
マウス白血病Ｐ３８８細胞またはヒトＢＣＲＰ遺伝子導入Ｐ３８８細胞（Ｐ３８８／ＢＣＲＰ細胞、財団法人癌研究会癌化学療法センター 杉本芳一氏より入手）を１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０に懸濁して９６ウェルマイクロプレートに播種後（１ ｘ １０４ ｃｅｌｌｓ／５０μｌ／ｗｅｌｌ）、フラボノイド化合物およびＳＮ−３８を溶解した１０％ＦＢＳ／ＲＰＮＩ１６４０をそれぞれ２５μｌ加え、５％ＣＯ２、３７℃条件下で４８時間培養した。培養後、ＴｅｔｒａＣｏｌｏｒ ＯＮＥを使用して、添付の操作手順に従って生細胞数を測定した。その結果を図５に示す。フラボノイド化合物はＰ３８８／ＢＣＲＰ細胞のＳＮ−３８耐性に対して強力な克服作用を示した。一方、Ｐ３８８細胞のＳＮ−３８に対する感受性に対しては影響を及ぼさなかった。この結果は、本発明のフラボノイド化合物にＢＣＲＰ阻害作用があることを確証づけるものである。
実施例２１：フラボノイド化合物によるＭＥＳ−ＳＡ／Ｄｘ５細胞の多剤耐性に及ぼす作用
ヒト子宮癌ＭＥＳ−ＳＡ細胞またはＰ−糖蛋白質を高発現して多剤耐性を獲得したＭＥＳ−ＳＡ／Ｄｘ５細胞（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４５，４０９１−４０９６（１９８５））を１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭに懸濁し、９６ウェルマイクロプレートに播種して５％ＣＯ２、３７℃条件下で培養した（３ ｘ １０３ ｃｅｌｌｓ／５０μｌ／ｗｅｌｌ）。一晩培養後、フラボノイド化合物およびパクリタキセルを溶解した１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭをそれぞれ２５μｌ加え、５％ＣＯ２、３７℃条件下で４８時間培養した。培養後、ＴｅｔｒａＣｏｌｏｒ ＯＮＥを使用して、添付の操作手順に従って生細胞数を測定した。各フラボノイド化合物の多剤耐性に及ぼす作用を表９にＥＣ５０値で示す。なお、ＥＣ５０値は、相対耐性度を５０％低下させる時のフラボノイド化合物の濃度である。その結果、検討した濃度範囲において、フラボノイド化合物はＭＥＳ−ＳＡ／Ｄｘ５細胞のパクリタキセル耐性に影響を及ぼさなかった。また、フラボノイド化合物自体はＭＥＳ−ＳＡ細胞およびＭＥＳ−ＳＡ／Ｄｘ５細胞の増殖に影響を及ぼさなかった。この結果から、本発明のフラボノイド化合物はＰ−糖蛋白質には作用せず、ＢＣＲＰに対して特異性を有することが示された。
実施例２２：フラボノイド化合物によるＢＣＲＰ発現細胞の抗癌剤蓄積量に及ぼす作用
Ｐ３８８細胞およびＰ３８８／ＢＣＲＰ細胞（１ ｘ １０７ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）、またはＭＣＦ−７細胞（３ ｘ １０６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を懸濁した１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０ １ｍｌにフラボノイド化合物およびＳＮ−３８（最終濃度：５００ｎｇ／ｍｌ）を加えて３７℃にて６０分間インキュベート後、遠心（２℃、１，４００ ｘ ｇ、１ｍｉｎ）して上清を除去した。沈殿した細胞に氷冷１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０を加えて再懸濁後、遠心（２℃、１，４００ ｘ ｇ、１ｍｉｎ）して細胞を洗浄した。この洗浄操作をさらに１回行った後、ＰＢＳ ３７５μｌを加えて超音波処理により細胞を破壊した。この細胞破壊液にメタノール３７５μｌおよび１０％硫酸亜鉛溶液１５μｌを加えて攪拌後、遠心（２℃、１２，５００ ｘ ｇ、５ｍｉｎ）して上清を回収した。蛍光強度測定用の白色９６ウェルマイクロプレートに回収した上清を分注後（２００μ／ｗｅｌｌ）、マイクロプレート蛍光光度計により上清中のＳＮ−３８量を測定し（ＳＮ−３８：励起波長３８０ｎｍ、測定波長５６０ｎｍ）、細胞内の蓄積量を算出した。その結果、図６に示すように、本発明のフラボノイド化合物はＰ３８８／ＢＣＲＰ細胞のＳＮ−３８細胞内蓄積量を増加させた。また、図７に示すように、本発明のフラボノイド化合物はＭＣＦ−７細胞のＳＮ−３８蓄積量を増加させた。この結果は、本発明のフラボノイド化合物がＢＣＲＰを阻害し、抗癌剤の細胞内取り込み量を増加させることを示唆するものである。
実施例２３：フラボノイド化合物のｉｎ ｖｉｖｏにおける抗癌剤耐性克服効果
６週齢のＣＤＦ１系、雌マウス（５匹／群）の腹腔内に、Ｐ３８８細胞またはＰ３８８／ＢＣＲＰ（１ ｘ １０６ ｃｅｌｌｓ／ｍｏｕｓｅ）を移植し、フラボノイド化合物および塩酸イリノテカン（ＣＰＴ−１１）を腫瘍移植１日後より１０日後まで１日１回、計１０回腹腔内に投与した。なお、フラボノイド化合物はエタノール、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート〔Ｔｗｅｅｎ ８０（商標名）、東京化成工業製〕および５％グルコース混合液（エタノール／Ｔｗｅｅｎ ８０／５％グルコース＝５：５：９０）に懸濁し、ＣＰＴ−１１は生理食塩水に溶解して投与し、対照群には溶媒のみを投与した。腫瘍移植後のマウスの生存日数を調べ、次式より延命率Ｔ／Ｃ（％）を求め、抗腫瘍効果を判定した。
延命率Ｔ／Ｃ（％）＝
（投与群マウスの平均生存日数）÷（対照群マウスの平均生存日数）×１００
結果を表１０に示す。本発明のフラボノイド化合物はｉｎ ｖｉｖｏにおいてもＢＣＲＰを阻害し、抗癌剤耐性克服効果を発揮することが示された。
実施例２４：以下に示す成分を混和して、その混和物を打錠した。
本発明によって、ＢＣＲＰが関与する抗癌剤耐性を克服することが可能となる。また、もとからＢＣＲＰを発現する癌に対して抗癌剤の効果を増強させることが可能である。さらには抗癌剤のバイオアベイラビリティを向上させることも期待され、癌化学療法における治療成績の向上につながることが期待される。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【技術分野】
本発明は乳癌耐性蛋白（ＢＣＲＰ）阻害剤およびＢＣＲＰ阻害剤のスクリーニングに有用なＳＮ−３８耐性癌細胞に関する。
【背景技術】
癌化学療法において、治療開始時から抗癌剤に無効である自然耐性や、抗癌剤を長期に連用するとその効果が低下する獲得耐性の出現は大きな問題となっている。この抗癌剤に対する耐性の克服は、癌化学療法の治療成績向上につながることが期待され、これまでに様々な耐性機構の存在が明らかにされてきた。その中でも抗癌剤を細胞外へ能動輸送し、その細胞内蓄積量を減少させる薬剤輸送蛋白質の発現は、耐性機構の中心的な役割を果たしていると考えられている。
特に、１９７０年代に発見されたＭＤＲ１遺伝子にコードされる薬剤輸送蛋白質Ｐ−糖蛋白質は、化学構造や作用機序が異なる複数の抗癌剤に対して交叉耐性を生じることから、多剤耐性克服剤の有力な標的分子とされてきた。しかし、Ｐ−糖蛋白質だけでは抗癌剤耐性機構を説明しきれないことも次第に明らかとなり、さらに新しい薬剤輸送蛋白質を標的分子とした耐性克服剤の開発が望まれている。
その様な中、１９９８年に、Ｐ−糖蛋白質と同じくＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）トランスポータースーパーファミリーと呼ばれる一群に属する薬剤輸送蛋白質として、乳癌耐性蛋白質（ＢＣＲＰ）が発見された（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５，１５６６５−１５６７０（１９９８））。ＢＣＲＰの構造にはＡＴＰ結合カセットが一つしか存在せず、二つのＡＴＰ結合カセットを有するＰ−糖蛋白質や他の薬剤輸送蛋白質とは構造的に異なっている。ＢＣＲＰは塩酸イリノテカン（ＣＰＴ−１１）やトポテカン等のトポイソメラーゼＩ阻害剤、ミトキサントロン等のトポイソメラーゼＩＩ阻害剤に対する耐性機構に深く関与する。一方、ＢＣＲＰはＰ−糖蛋白質により排出されるパクリタキセルやビンクリスチン等に対しては作用しないこと、またＰ−糖蛋白質ではほとんど細胞外へ排出されないＣＰＴ−１１やＳＮ−３８（ＣＰＴ−１１の活性体）等のカンプトテシン誘導体の排出に関わることから（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９，５９３８−５９４６（１９９９））、Ｐ−糖蛋白質とは異なる基質特異性を有することが明らかにされている。さらに、ＢＣＲＰは経口投与された抗癌剤のバイオアベイラビリティの限界にも関与していることが示唆されている（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０，２９４３−２９５０（２００２））。これらの事実から、ＢＣＲＰを阻害する薬剤は、従来の耐性克服剤では克服され得なかった抗癌剤の耐性に対して克服効果を発揮し、さらには抗癌剤のバイオアベイラビリティをも向上させることが期待され、その開発が望まれる。
これまでに、抗癌剤に対する耐性克服を目的として数多くのＰ−糖蛋白質阻害剤が開発されている。一方、ＢＣＲＰに対する特異的な阻害剤に関する報告は少なく、またその阻害作用も十分とはいえないことから、より強力なＢＣＲＰ阻害作用を有する薬剤が要望されていた（Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｔｈｅｒ．１，４２７−４３４（２００２））。なお、フラボノイド化合物の中にはＰ−糖蛋白質に対して阻害作用を示すものが報告されている（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４１，４１６１−４１６４（１９９８）；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２９５，８３２−８４０（２００２））が、ＢＣＲＰに対して阻害作用を示すフラボノイド化合物については知られていない。
本発明は、ＢＣＲＰを阻害する薬剤のスクリーニングに有用な癌細胞およびＢＣＲＰを阻害する薬剤を提供することを目的とする。
【発明の開示】
本発明者は、上記課題を解決すべく、ヒト非小細胞肺癌由来の癌細胞であるＡ５４９細胞をＳＮ−３８含有培地にて継代培養することにより、ＢＣＲＰを高発現することで抗癌剤耐性を獲得したヒト癌細胞を樹立した。さらに、該癌細胞を用いて、耐性克服作用を指標に様々な植物由来の成分についてスクリーニングを行った結果、下記式（１）、（２）、（３）、（４）又は（５）で表されるフラボノイド化合物に強力なＢＣＲＰ阻害作用があることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、下記式（１）、（２）、（３）、（４）又は（５）：
〔式中、Ｒ１は水素原子、水酸基、ハロゲン原子、低級アルコキシ基又は低級アルキル基を示し、７個のＲ２は同一でも異なってもよく、水素原子、水酸基、低級アルコキシ基、低級アルキル基、低級アルケニル基又は糖残基を示すか、或は隣接するＲ１と共に低級アルキル基で置換されていてもよいピラン環を形成してもよく、Ｒ３は水素原子、水酸基、ハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、アミノ基又はニトロ基を示す。〕
〔式中、Ｒ４は水素原子、水酸基、ハロゲン原子、低級アルコキシ基、低級アルキル基又は低級アルケニル基を示し、７個のＲ５は同一でも異なってもよく、水素原子、水酸基、低級アルコキシ基又は低級アルキル基を示すか、或は隣接する二つのＲ５は共に低級アルキル基で置換されていてもよいピラン環を形成してもよく、Ｒ６は水素原子、水酸基、ハロゲン原子、低級アルコキシ基、低級アルキル基、アミノ基又はニトロ基を示す。〕
〔式中、Ｒ７は水素原子、水酸基、ハロゲン原子、低級アルコキシ基又は低級アルキル基を示し、２個のＲ８は同一でも異なってもよく、水素原子、水酸基、低級アルコキシ基又は低級アルキル基を示し、Ｒ９は水素原子、水酸基、ハロゲン原子又は低級アルコキシ基を示し、５個のＲ１０は同一でも異なってもよく、水素原子、水酸基又は低級アルコキシ基を示す。〕
〔式中、３個のＲ１１は同一でも異なってもよく、水素原子、水酸基又は低級アルコキシ基を示す。〕
〔式中、Ｒ１２は水素原子又は低級アルケニル基を示し、Ｒ１３は水素原子又は水酸基を示し、Ｒ１４は水素原子を示す。〕
で表されるフラボノイド化合物、又はその配糖体、エステル若しくは塩を有効成分とするＢＣＲＰ阻害剤、ＢＣＲＰ関与の耐性を獲得した癌に対する抗癌剤耐性克服剤、又はＢＣＲＰを発現し、抗癌剤に対して低感受性の癌に対する抗癌剤耐性克服剤を提供するものである。
また本発明は、上記のＢＣＲＰ阻害剤およびＢＣＲＰの基質となり得る抗癌剤を含有する抗癌剤を提供するものである。
また、本発明は下記式（６）：
〔式中、Ｒ１５はアミノ基またはニトロ基を示す。〕
で表される新規なフラボノイド化合物を提供するものである。
さらに本発明は、ＢＣＲＰを高発現するＳＮ−３８耐性ヒト非小細胞肺癌Ａ５４９細胞を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
図１は、Ａ５４９／ＳＮ−３８−４細胞のＳＮ−３８（Ａ）およびミトキサントロン（Ｂ）に対する耐性獲得の程度を示す図である。
図２は、Ａ５４９細胞およびＡ５４９／ＳＮ−３８細胞における各種薬剤輸送蛋白質のｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲ法により解析した結果を示す図である。
図３は、Ａ５４９細胞およびＡ５４９／ＳＮ−３８細胞におけるＢＣＲＰ（Ａ）およびＭＲＰ２（Ｂ）ｍＲＮＡの発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により定量的に解析した結果を示す図である。
図４は、Ａ５４９細胞およびＡ５４９／ＳＮ−３８−４細胞のＳＮ−３８（Ａ）およびＳＮ−３８グルクロン酸抱合体（Ｂ）の蓄積量を示す図である。
図５は、Ｐ３８８／ＢＣＲＰ細胞のＳＮ−３８耐性に対するフラボノイド化合物〔化合物１−１（Ａ）、化合物１−４（Ｂ）、化合物１−６（Ｃ）、化合物１−１４（Ｄ）、化合物３−４（Ｅ）、化合物３−６（Ｆ）〕の克服作用を示す図である。
図６は、フラボノイド化合物によるＰ３８８／ＢＣＲＰ細胞のＳＮ−３８蓄積増大作用を示す図である。
図７は、フラボノイド化合物によるＭＣＦ−７細胞のＳＮ−３８蓄積増大作用を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
ヒト非小細胞肺癌Ａ５４９細胞は、培養が容易であり、マウスに移植することが可能であるとともに、ＣＰＴ−１１の活性本体であるＳＮ−３８に対して高い感受性を示すことが知られている（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１，１７８９−１７９６（１９９８））。このＡ５４９細胞を培地中のＳＮ−３８濃度を段階的に上げながら継続的に培養することにより、ＳＮ−３８耐性Ａ５４９細胞を樹立した。得られたＳＮ−３８耐性Ａ５４９細胞は、後記の実施例に示すように、ＢＣＲＰを高発現し、ＳＮ−３８の細胞内蓄積を減少させることにより耐性を獲得しており、ＢＣＲＰ阻害剤のスクリーニングに有用である。ＳＮ−３８耐性Ａ５４９細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏのスクリーニングに用いてもよく、また、マウスに移植することによりｉｎ ｖｉｖｏのスクリーニングに用いることも可能である。
当該細胞を用いて、ＳＮ−３８耐性克服作用を指標に様々な植物由来の成分についてスクリーニングを行った結果、フラボノイド化合物に強力なＢＣＲＰ阻害作用があることを見出した。
本発明のフラボノイド化合物は、上記の式（１）で示されるフラボン誘導体、式（２）で示されるフラバノン誘導体、式（３）で示されるカルコン誘導体、式（４）で示されるイソフラボン誘導体、又は式（５）で表されるフラボノイド誘導体である。
式（１）〜（４）中、Ｒ１〜Ｒ１１としての低級アルコキシ基は、炭素数１〜４であるのが好ましく、特にメトキシ基が好ましい。また、Ｒ１〜Ｒ８としての低級アルキル基は、炭素数１〜４であるのが好ましく、特にメチル基が好ましい。式（１）、（２）及び（５）中のＲ２、Ｒ４又はＲ１２としての低級アルケニル基は、炭素数２〜５であるのが好ましく、特に３−メチル−１又は２−ブテニル基が好ましい。ハロゲン原子としては、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素原子が挙げられ、塩素又は臭素原子が好ましい。式（１）において隣接するＲ１とＲ２が形成するピラン環は、炭素数１−４の低級アルキル基、特にメチル基、で置換されていてもよい。式（２）においてピラン環を形成する隣接する二つのＲ５は、ジヒドロベンゾピラン環上にあるのが好ましい。隣接する二つのＲ５が形成するピラン環は、炭素数１−４の低級アルキル基、特にメチル基、で置換されていてもよい。
式（６）において、Ｒ１５がニトロ基である化合物（２’−ニトロ−４’，５，５’，６，７，８−ヘキサメトキシフラボン）は２’−ニトロノビレチンとも呼ばれ、Ｒ１５がアミノ基である化合物（２’−アミノ−４’，５，５’，６，７，８−ヘキサメトキシフラボン）は２’−アミノノビレチンとも呼ばれ、いずれも新規化合物である。
上記のフラボノイド化合物には、例えばβ−Ｄ−グルコシド等の糖が付加した配糖体も含まれる。また、ナトリウム、カリウム、塩酸塩等が付加して薬理学的に許容される塩を形成することができ、斯かる塩もまた本発明に含まれる。さらには、例えば酢酸、プロピオン酸、乳酸、酪酸等の低級脂肪酸類が付加して、薬理学的に許容されるエステルを形成することができ、斯かるエステル体もまた本発明に含まれる。また、フラボノイド化合物は水和物等の溶媒和物の形態で存在することもあり、当該溶媒和物も本発明に含まれる。さらには、各異性体及びその混合物も本発明に含まれる。
本発明のフラボノイド化合物の由来については特に制限はなく、植物由来のものであってもよいし、化学合成品や半合成品であってもよい。植物から本発明のフラボノイド化合物を取得する方法に特に限定はなく、例えば植物の根、茎、葉、果実、及び／又は花部を水、メタノール、エタノール等の低級アルコール又はアセトンのような水溶性有機溶媒で室温又は加熱にて抽出する方法、水とこれらの水溶性有機溶媒との混合物により抽出する方法、更にクロロホルム、ジクロロメタン、酢酸エステル類、トルエン、又は炭酸ガスによる超臨界流体等の疎水性有機溶媒とメタノール等の水溶性有機溶媒の混合物により抽出する方法があるが、特に、根、茎、及び／又は葉を細断または粉砕し、メタノール等の低級アルコールで抽出するのが好ましい。そして、得られた抽出物はさらにカラムクロマトグラフィー等を用いて分画、精製することにより、本発明のフラボノイド化合物を単離することができる。
式（６）でＲ１５がニトロ基である２’−ニトロ−４’，５，５’，６，７，８−ヘキサメトキシフラボンは、４’，５，５’，６，７，８−ヘキサメトキシフラボンを慣用の方法に従ってニトロ化することにより製造することができる。ニトロ化剤としては、例えば硝酸−硫酸のような混酸が用いられる。
式（６）でＲ１５がアミノ基である２’−アミノ−４’，５，５’，６，７，８−ヘキサメトキシフラボンは、２’−ニトロ−４’，５，５’，６，７，８−ヘキサメトキシフラボンを常法に従って還元することにより製造することができる。
本発明のフラボノイド化合物は、そのままでも投与することができるが、効果を低減させない範囲内で、分散補助剤、賦形剤等の通常製剤化に使用されるような担体と混合し、粉剤、液剤、カプセル剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤、顆粒剤、丸剤、錠剤、トローチ剤、リモネーデ剤等の経口剤又は注射剤等の剤形で使用することができる。
この様な担体としては、例えば、マンニトール、乳糖、デキストラン等の水溶性の単糖類ないしオリゴ糖類もしくは多糖類；例えばヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース等のゲル形成性又は水溶性のセルロース類；例えば結晶性セルロース、α−セルロース、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム、及びそれらの誘導体等の水吸収性でかつ水難溶性のセルロース類；例えばヒドロキシプロピル澱粉、カルボキシメチル澱粉、架橋澱粉、アミロース、アミロペクチン、ペクチン及びそれらの誘導体等の水吸収性でかつ水難溶性の多糖類；例えばアラビアガム、トラガントガム、グリコマンナン及びそれらの誘導体等の水吸収性でかつ水難溶性のガム類；例えばポリビニルピロリドン、架橋ポリアクリル酸及びその塩、架橋ポリビニルアルコール、ポリヒドロキシエチルメタクリレート及びそれらの誘導体等の架橋ビニル重合体類；リン脂質、コレステロール等のリポソーム等分子集合体を形成する脂質類等を挙げることができる。
本発明のフラボノイド化合物の溶解性が低い場合には、可溶化処理を施すことができる。可溶化処理としては通常医薬に適用できる方法、例えば、ポリオキシエチレンアルコールエーテル類、ポリオキシエチレンアシルエステル類、ソルビタンアシルエステル類やポリオキシエチレンソルビタンアシルエステル類等の界面活性剤を添加する方法、ポリエチレングリコール等の水溶性高分子を使用する方法等が挙げられる。また、必要により、可溶性の塩にする方法、シクロデキストリン等を用いて包接化合物を形成させる方法等も使用できる。可溶化処理の方法は、目的とするフラボノイド化合物に応じて適宜変更できる。
ＢＣＲＰ阻害剤は、抗癌剤の投与によってＢＣＲＰ関与の耐性を獲得した癌に対しては抗癌剤耐性克服剤として使用することが出来る。また、もとからＢＣＲＰを発現し、抗癌剤に対して低感受性の癌に対しては抗癌剤効果増強剤として使用することが出来る。ＢＣＲＰ阻害剤を有効成分とする抗癌剤耐性克服剤および抗癌剤効果増強剤の対象となる抗癌剤としては、ＢＣＲＰの基質となり得る抗癌剤であれば特に制限はないが、例えば塩酸イリノテカン／ＣＰＴ−１１（活性本体：ＳＮ−３８）やトポテカン等のトポイソメラーゼＩ阻害剤や、ミトキサントロン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ビスアントレン、エトポシド等のトポイソメラーゼＩＩ阻害剤や、メトトレキサート等の葉酸代謝拮抗薬等が挙げられる。
本発明のＢＣＲＰ阻害剤の投与量は、投与法や患者の症状等に合わせて適宜調整すればよいが、成人１日あたり１ｍｇ〜１０ｇ、更に１００ｍｇ〜１０ｇ、特に５００ｍｇ〜１０ｇ投与するのが好ましい。また、抗癌剤とＢＣＲＰ阻害剤との比率は、特に限定されず、その好適な範囲は用いる抗癌剤、阻害剤の種類等により異なるが、例えば抗癌剤として塩酸イリノテカンを用いる場合には、抗癌剤：ＢＣＲＰ阻害剤が重量換算で１：１〜１：５００、特に１：１〜１：１００、更に１：１〜１：１０の比率とすることが好ましい。
本発明に用いられるフラボノイド化合物の具体例を表１、表２、表３、表４及び表５に示す。
【実施例】
次に本発明を実施例を挙げて更に詳細に説明するが、これは単に例示であって本発明を限定するものではない。
実施例１：３’，５−ジヒドロキシ−４’，６，７−トリメトキシフラボン（化合物１−６）の単離
ブラジル産生薬のカルケージャ３６８ｇをメタノールで二時間還流し、抽出液を減圧乾固した。得られたエキス８．１ｇのうち、５．０９ｇを中圧クロマトグラフィーによりヘキサンで溶出した後（Ａ画分）、ヘキサン−酢酸エチル（４：１）混合溶液で溶出し（Ｂ画分）、続いて酢酸エチル溶出して（Ｃ画分）、更にメタノールで溶出した（Ｄ画分）。得られたＣ画分１．５３ｇのうち、１．０ｇを中圧クロマトグラフィーにより２５４ｎｍにてモニターしながらヘキサンで溶出した後、ヘキサン−酢酸エチル（２：１）混合溶液、同（１：１）混合溶液、続いて酢酸エチル、メタノールの順に溶出し、１２画分を得た。ヘキサン−酢酸エチル混合溶液（２：１）で溶出されたＣ６画分（１００．１ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィー〔Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８ ＧＰ、６．０×２５０ｍｍ、アセトニトリル−水の（４５：５５）混合溶液で溶出〕で分析した結果、保持時間１５．２分のピークを示す画分が得られた。このＣ６画分をクロロホルム−メタノール（１：１）混合溶液により再結晶し、化合物１−６を４７．９ｍｇ得た。この化合物の分析結果は次の通りである。
ＩＲ νｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：１６４９（Ｃ＝Ｏ）
ＥＩ−ＭＳ ｍ／ｚ：３１５［Ｍ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：３．７４（Ｃ６−ＯＣＨ３，ｓ），３．８８（Ｃ４’−ＯＣＨ３，ｓ），３．９４（Ｃ７−ＯＣＨ３，ｓ），６．８３（Ｃ３−Ｈ，ｓ），６．９２（Ｃ８−Ｈ，ｓ），７．１０（Ｃ５’−Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．４８（Ｃ２’−Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ），７．５７（８．５，Ｃ６’−Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ），９．４４（Ｃ３’−ＯＨ，ｓ），１２．９０（Ｃ５−ＯＨ，ｓ），
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：５６．２（Ｃ６−ＯＣＨ３），５６．９（Ｃ７−ＯＣＨ３），６０．５（Ｃ６−ＯＣＨ３），９２．０（Ｃ−８），１０３．７（Ｃ−３），１０５．４（Ｃ−１０），１１２．５（Ｃ−５’），１１３．２（Ｃ−２’），１１９．３（Ｃ−６’），１２３．２（Ｃ−１’），１３２．２（Ｃ−６），１４７．０（Ｃ−３’），１５１．７（Ｃ−４’），１５２．０（Ｃ−５），１５３．１（Ｃ−９），１５９．１（Ｃ−７），１６４．３（Ｃ−２），１８２．５（Ｃ−４）
実施例２：５，４’−ジヒドロキシ−６，７−ジメトキシフラボン（化合物１−１９）の単離
高砂薬業（株）より入手したインチンコウ（茵陳蒿）５００ｇをメタノールで二時間還流し、抽出液を減圧乾固した。得られたエキス４０．１ｇのうち５．０７ｇをシリカゲルにまぶし、中圧クロマトグラフィーによりヘキサンで溶出した後（Ａ画分）、ヘキサン−酢酸エチル（４：１）混合溶液で溶出し（Ｂ画分）、続いて酢酸エチル溶出して（Ｃ画分）、更にメタノールで溶出した（Ｄ画分）。得られたＣ画分１．５６ｇのうち１．５ｇを中圧クロマトグラフィーにより２５４ｎｍにてモニターしながらクロロホルムで溶出した後、クロロホルム−メタノール（９９：１）混合溶液、同（１９：１）混合溶液、続いて同（９：１）混合溶液、メタノールの順に溶出し、１４画分を得た。クロロホルムで溶出されたＣ６画分（１１２．４ｍｇ）をメタノールに溶解し、Ｃ６メタノール不溶性画分（７０ｍｇ）を得た。このＣ６メタノール不溶性画分を高速液体クロマトグラフィー〔Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８ ＧＰ、６．０×２５０ｍｍ、アセトニトリル−０．７％蟻酸溶液の（３０：７０）混合溶液で溶出〕で分析した結果、保持時間２８．０分のピークを示した。この保持時間２８．０分のピークを有する画分を精製して得た化合物１−１９の分析結果は次の通りである。
ＩＲ νｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：１６５５（Ｃ＝Ｏ）
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：３１５［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣＬ３）δ：３．８７（ＯＣＨ３，ｓ），３．９９（ＯＣＨ３，ｓ），６．５７（Ｃ３−Ｈ，ｓ），６．６２（Ｃ８−Ｈ，ｓ），６．９６（Ｃ３’−Ｈ，Ｃ５’−Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１．７），７．７９（Ｃ２’−Ｈ，Ｃ６’−Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１．５），９．８９（Ｃ４’−ＯＨ，ｓ），１２．８８（Ｃ５−ＯＨ，ｓ）
実施例３：２’−ニトロ−４’，５，５’，６，７，８−ヘキサメトキシフラボン（化合物１−２０）の合成
４’，５，５’，６，７，８−ヘキサメトキシフラボン８３１ｍｇを氷浴中で濃硫酸１７ｍｌに溶解した。溶液に５％発煙硝酸−硫酸混液１．７ｍｌを滴下し、そのまま氷浴中で３０分間攪拌した。反応液を５０ｍｌの氷水にあけ、１０分間攪拌した。析出した結晶を吸引濾過し、結晶を酢酸エチルにて洗浄した。水層は酢酸エチル５０ｍｌにて２回抽出した。得られた酢酸エチル層を減圧下濃縮乾固した。得られた固形物を先の結晶と併せ、シリカゲルカラムクロマトグラフィー［関東化学製ＳｉＯ２、ヘキサン−酢酸エチル（１：１）で溶出］にて分画した。目的の画分を減圧下濃縮乾固することにより、２’−ニトロ−４’，５，５’，６，７，８−ヘキサメトキシフラボンを得た（収量３２６ｍｇ：収率３５％）。
ＩＲ νｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：３４８９，２９４３，２８３８，１６５５，１５３０
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：４４８［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：３．８３（３Ｈ，ｓ），３．９５（３Ｈ，ｓ），３．９７（３Ｈ，ｓ），３．９８（３Ｈ，ｓ），４．０３（３Ｈ，ｓ），４．０８（３Ｈ，ｓ），６．４１（１Ｈ，ｓ），７．００（１Ｈ，ｓ），７．６７（１Ｈ，ｓ）
実施例４：２’−アミノ−４’，５，５’，６，７，８−ヘキサメトキシフラボン（化合物１−５）の合成
２’−ニトロ−４’，５，５’，６，７，８−ヘキサメトキシフラボン１３５ｍｇを濃塩酸−メタノール（１：１）混液５ｍｌに溶解し、鉄粉末５１．６ｍｇを加え、室温にて４時間攪拌した。反応液に精製水２０ｍｌ、酢酸エチル２０ｍｌを加え、分液した。得られた水層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液にてｐＨ８に調整し、酢酸エチル１３０ｍｌにて２回抽出した。酢酸エチル層を飽和食塩水７０ｍｌにて洗浄後、無水硫酸マグネシウムにて乾燥した。硫酸マグネシウムを濾別し、酢酸エチルにて洗浄した後、酢酸エチル層を減圧下濃縮乾固した。得られた固形物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［関東化学製ＳｉＯ２、ヘキサン−酢酸エチル（１：１）で溶出］にて分画した。目的の画分を減圧下濃縮乾固することにより、２’−アミノ−４’，５，５’，６，７，８−ヘキサメトキシフラボンを得た（収量６６ｍｇ：収率５２％）。
ＩＲ νｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：３４９６，３３２６，１６２４，１５６０，１５２０
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：４１８［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：３．８５（３Ｈ，ｓ），３．８９（３Ｈ，ｓ），３．９６（６Ｈ，ｓ），３．９９（３Ｈ，ｓ），４．０９（３Ｈ，ｓ），６．２８（１Ｈ，ｓ），６．４８（１Ｈ，ｓ），６．９６（１Ｈ，ｓ）
実施例５：４’，５−ジヒドロキシ−３，３’，７−トリメトキシフラボン（化合物１−２２）の単離
タイ産生薬のＰｏｇｏｓｔｅｍｏｎ ｃａｂｌｉｎの枝葉５３．８ｇをメタノールで一週間室温抽出し、抽出液を減圧乾固した。得られたエキス４．９ｇのうち、４．７ｇを中圧クロマトグラフィーによりヘキサンで溶出した後（Ａ画分）、ヘキサン−酢酸エチル（４：１）混合溶液で溶出し（Ｂ画分）、続いて酢酸−エチル溶出して（Ｃ画分）、更にメタノールで溶出した（Ｄ画分）。得られたＢ画分１．３ｇのうち、０．５ｇを遠心クロマトグラフィーにより２５４ｎｍにてモニターしながらクロロホルムで溶出した後、クロロホルム−メタノール（９：１）混合溶液、メタノールの順に溶出し、１８画分を得た。クロロホルム−メタノール（９：１）混合溶液で溶出されたＢ９画分（１４．８ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィー（Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８ ＧＰ、６．０×２５０ｍｍ、アセトニトリル−水の（４５：５５）混合溶液で溶出）で分析した結果、保持時間１４．５分のピークを示す画分が得られた。この化合物の分析結果は次の通りである。
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：３４５［Ｍ＋Ｈ］＋，３４３［Ｍ−Ｈ］−
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：３．８５（Ｃ３’−ＯＣＨ３，ｓ），３．８８（Ｃ７’−ＯＣＨ３，ｓ），３．９８（Ｃ３−ＯＣＨ３，ｓ），６．３６（Ｃ６−Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．４），６．４４（Ｃ３−Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．４），７．０９（Ｃ５’−Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８），７．６７（Ｃ６’−Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．８，２．０），７．７０（Ｃ２’−Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：５５．８（Ｃ３’−ＯＣＨ３），５６．１（Ｃ７−ＯＣＨ３），６０．２（Ｃ３−ＯＣＨ３），９２．２（Ｃ−８），９７．８（Ｃ−６），１０６．０（Ｃ−１０），１１０．９（Ｃ−２’），１１４．６（Ｃ−５’），１２２．４（Ｃ−１’），１２２．７（Ｃ−６’），１３８．８（Ｃ−３），１４６．３（Ｃ−３’），１４８．３（Ｃ−４’），１５５．９（Ｃ−２），１５６．７（Ｃ−５），１６２．０（Ｃ−９），１６５．４（Ｃ−７），１７８．７（Ｃ−４）
実施例６：５−ヒドロキシ−３’，４’，７−トリメトキシフラボン（化合物１−２３）の単離
中国産生薬の独角柑（Ｓｔｒｉｇａ ａｓｉａｔｉｃａの全草）約３００ｇをメタノールで二時間還流抽出し、抽出液を減圧乾固した。得られたエキス６．８ｇのうち、５．０ｇを中圧クロマトグラフィーによりヘキサンで溶出した後（Ａ画分）、ヘキサン−酢酸エチル（４：１）混合溶液で溶出し（Ｂ画分）、続いて酢酸−エチル溶出して（Ｃ画分）、更にメタノールで溶出した（Ｄ画分）。得られたＢ画分４８０ｍｇを遠心クロマトグラフィーにより２５４ｎｍにてモニターしながらクロロホルムで溶出した後、クロロホルム−メタノール（９：１）混合溶液、メタノールの順に溶出し、９画分を得た。クロロホルムで溶出されたＢ３およびＢ４画分（各４２．３ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィー（Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８ ＧＰ、６．０×２５０ｍｍ、アセトニトリル−メタノール−水の（４５：５：５０）混合溶液で溶出）で分析し、保持時間１６．５分のピークを分取した。この化合物の分析結果は次の通りである。
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：３２９［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：３．８９，３．９７，３．９９（Ｃ７，Ｃ３’，Ｃ４’−ＯＣＨ３，ｓ），６．３８（Ｃ６−Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．４），６．５０（Ｃ８−Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．４），６．５９（Ｃ３−Ｈ，ｓ），６．９８（Ｃ５’−Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８），７．３４（Ｃ２’−Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．４），７．５３（Ｃ６’−Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．８，２．４），１２．７９（Ｃ５−ＯＨ，ｓ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：５５．８（Ｃ７−ＯＣＨ３），５６．１（Ｃ３’−ＯＣＨ３，Ｃ４’−ＯＣＨ３），９２．７（Ｃ−２），９８．１（Ｃ−８），１０４．７（Ｃ−３），１０５．６（Ｃ−１０），１０８．９（Ｃ−２’），１１１．２（Ｃ−５’），１２０．１（Ｃ−６’），１２３．８（Ｃ−１’），１４９．３（Ｃ−３’），１５２．３（Ｃ−４’），１５１．７（Ｃ−４’），１５７．７（Ｃ−９），１６２．２（Ｃ−２），１６４．０（Ｃ−５），１６５．５（Ｃ−７），１８２．４（Ｃ−４）
実施例７：３，３’，４’，５，６，７，８−ヘプタメトキシフラボン（化合物１−２４）および３’，４’，５，６−ペンタメトキシフラボン（化合物１−２５）の単離
中国産生薬の橘皮（Ｃｉｔｒｕｓ ｔａｎｇｅｒｉｎａの果皮）約２Ｋｇをメタノールで二時間還流抽出し、抽出液を減圧乾固した。得られたエキス３５６．５ｇのうち、３５．２ｇを中圧クロマトグラフィーによりヘキサンで溶出した後（Ａ画分）、ヘキサン−酢酸エチル（４：１）混合溶液で溶出し（Ｂ画分）、続いて酢酸−エチル溶出して（Ｃ画分）、更にメタノールで溶出した（Ｄ画分）。得られたＣ画分５５６ｍｇを中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィにより２５４ｎｍにてモニターしながらクロロホルムで溶出した後、クロロホルム−メタノール（９８：２）混合溶液、同（９５：５）混合溶液、メタノールの順に溶出し１０画分を得た。クロロホルムで溶出されたＣ３およびＣ４画分（計２３０ｍｇ）を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィにより２５４ｎｍにてモニターしながらヘキサンで溶出した後、ヘキサン−酢酸エチル（１９：１）混合溶液、同（９：１）、（８：２）、（７：３）、（５：５）、（１：２）混合溶液、酢酸エチル、メタノールの順に溶出し１０画分を得た。ヘキサン−酢酸エチル（５：５）混合溶液で溶出されたＣ２３Ｇ画分（９０．０ｍｇ）および（１：２）混合溶液で溶出されたＣ２３Ｊ画分（５．２ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィー（Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８ ＧＰ、６．０×２５０ｍｍ、アセトニトリル−５％蟻酸−メタノール−水の（３０：１０：２０：４０）混合溶液で溶出）で分析した結果、保持時間１８．３分（化合物１−２４）および１０．６分（化合物１−２５）のピークを示す画分が得られた。この化合物の分析結果は次の通りである。
化合物１−２４
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：４３３［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：３．９１（ＯＣＨ３，ｓ），３．９６（ＯＣＨ３，ｓ），３．９８（ＯＣＨ３×２，ｓ），３．９９（ＯＣＨ３，ｓ），４．０２（ＯＣＨ３，ｓ），４．１１（ＯＣＨ３，ｓ），７．０３（Ｃ５’−Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３），７．８２（Ｃ２’−Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．４），７．８５（Ｃ６’−Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．３，２．４）
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：５６．６，５６．７（Ｃ３’，Ｃ４’−ＯＣＨ３），６０．５，６２．４，６２．５，６２．７，６３．０（Ｃ３，Ｃ５，Ｃ６，Ｃ７，Ｃ８−ＯＣＨ３），１０７．４（Ｃ−２’），１１１．７（Ｃ−５’），１１５．２（Ｃ−１０），１２２．７（Ｃ−６’），１２４．１（Ｃ−１’），１３８．６（Ｃ−８），１４１．５（Ｃ−６），１４４．６（Ｃ−３），１４７．４（Ｃ−５），１４８．９（Ｃ−９），１４９．５（Ｃ−３’），１５１．８（Ｃ−２），１５２．０（Ｃ−７），１５３．８（Ｃ−４’），１７４．６（Ｃ−４）
化合物１−２５
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：３７３［Ｍ＋Ｈ］＋，３７１［Ｍ−Ｈ］−
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：３．９３（ＯＣＨ３，ｓ），３．９６（ＯＣＨ３，ｓ），３．９８（ＯＣＨ３，ｓ），３．９９（ＯＣＨ３×２，ｓ），６．６０（Ｃ３−Ｈ，ｓ），６．８０（Ｃ８−Ｈ，ｓ），６．９７（Ｃ５’−Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８），７．３３（Ｃ２’−Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０），７．５１（Ｃ６’−Ｈ，Ｊ＝８．３，２．０）
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：５６．３，５６．３，５６．５（Ｃ７，Ｃ３’，Ｃ４’−ＯＣＨ３），６１．７，６２．５（Ｃ５，Ｃ６−ＯＣＨ３），９６．４（Ｃ−８），１０７．６（Ｃ−３），１０８．８（Ｃ−２’），１１１．３（Ｃ−５’），１１２．９（Ｃ−１０），１１９．８（Ｃ−６’），１２４．３（Ｃ−１’），１４０．４（Ｃ−６），１３９．３（Ｃ−３’），１５２．０（Ｃ−４’），１５２．６（Ｃ−９），１５４．７（Ｃ−５），１５７．８（Ｃ−７），１６１．３（Ｃ−２），１７７．４（Ｃ−４）
実施例８：５−ヒドロキシ−６，７−ジメトキシフラボン−４’−グルコシド（化合物１−２６）の単離
北海道産のチシマアザミの茎葉５５．０ｇをメタノールで一週間室温抽出し、抽出液を減圧乾固した。得られたエキス１３．５ｇのうち、５．１ｇを中圧クロマトグラフィーによりヘキサンで溶出した後（Ａ画分）、ヘキサン−酢酸エチル（４：１）混合溶液で溶出し（Ｂ画分）、続いて酢酸−エチル溶出して（Ｃ画分）、更にメタノールで溶出した（Ｄ画分）。得られたＤ画分３．８ｇのうち２．０ｇを中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィにより２５４ｎｍにてモニターしながらクロロホルムで溶出した後、クロロホルム−メタノール（９：１）混合溶液、同（８：１）、（３：７）混合溶液、メタノールの順に溶出し１０画分を得た。クロロホルム−メタノール（９：１）混合溶液で溶出されたＤ４画分１．３４ｇをクロロホルムにて再結晶し、白色結晶を得た。高速液体クロマトグラフィー（Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８ ＧＰ、６．０×２５０ｍｍ、アセトニトリル−水の（２０：８０）混合溶液で溶出）で分析した結果、保持時間２７．６分のピークを示す化合物が得られた。この化合物の分析結果は次の通りである。
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：４７７［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：３．７４（Ｃ７−ＣＨ３，ｓ），３．９４（Ｃ６’−ＣＨ３，ｓ），４．５９（ｔ，Ｊ＝５．６），５．０４（ｄ，Ｊ＝７．８），５．０６（ｄ，Ｊ＝５．６），５．１３（ｄ，Ｊ＝４．４），５．３７（ｄ，Ｊ＝４．６），６．９８（Ｃ８−Ｈ，ｓ），６．９６（Ｃ３−Ｈ，ｓ），７．２０（Ｃ３’−Ｈ，Ｃ５’−Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０），８．０７（Ｃ２’−Ｈ，Ｃ６’−Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０），１２．９（Ｃ５−ＯＨ，ｓ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：５６．５（Ｃ７−ＯＣＨ３），６０．０（Ｃ６−ＯＣＨ３），６０．６（Ｃ−６’’），６９．６（Ｃ−４’’），７３．１（Ｃ−２’’），７６．５（Ｃ−３’’），７７．２（Ｃ−５’’），９１．７（Ｃ−８），９９．８（Ｃ−１’’），１０３．６（Ｃ−３），１０５．２（Ｃ−１０），１１６．６（Ｃ−３’，Ｃ−５’），１２３．８（Ｃ−１’），１２８．２（Ｃ−２’，Ｃ−６’），１３１．９（Ｃ−６），１５２．０（Ｃ−５），１５２．７（Ｃ−９），１５８．７（Ｃ−７），１６０．３（Ｃ−４’），１６３．４（Ｃ−２），１８２．３（Ｃ−４）
実施例９：５−ヒドロキシ−７−メトキシフラボン−４´−グルコシド（化合物１−２７）の製造
化合物１−１（５，４’−ジヒドロキシ−７−メトキシフラボン）（１００ｍｇ）をアセトンに溶解し、これにα−Ｄ−アセトブロモグルコース（６４７ｍｇ）と炭酸カリウム（２３１ｍｇ）を加え、激しく攪拌しながら一昼夜煮沸還流した。濾過により不溶物を除き、濾取物をクロロホルムで洗浄し、濾洗液を合し、これを減圧下濃縮乾固した。残留物をクロロホルム／メタノール系でシリカゲルクロマトグラフィーにて精製した。これを無水メタノールに懸濁し、２８％ＮａＯＭｅを滴下し、室温で０．５ｈ攪拌した。反応混合物に水を加え、イオン交換樹脂（スルホン酸−＋Ｈ型）で中和した。樹脂を濾過により除き、溶媒を減圧下濃縮乾固し、クロロホルム／メタノール系でシリカゲルクロマトグラフィーにて精製して、目的物を得た（収量１０ｍｇ：収率６％）。
淡黄色結晶、ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：４４７［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ３．１８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９Ｈｚ），３．２８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９Ｈｚ），３．３２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９Ｈｚ），３．４１（１Ｈ，ｍ），３．５０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６Ｈｚ，１２Ｈｚ），３．７１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２Ｈｚ，１１Ｈｚ），３．８８（３Ｈ，ｓ），５．０４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ），６．４０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ），６．８３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ），６．９４（１Ｈ，ｓ），７．２１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ），８．０７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ）
実施例１０：４Ｈ，８Ｈ−ベンゾ［１，２−ｂ：３，４−ｂ’］ジピラン−４−オン，２−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−５−ヒドロキシ−８，８−ジメチル−３−（３−メチル−２−ブテニル）（化合物１−２８）の単離
タイ産生薬のＪａｃｋ Ｆｒｕｉｔ Ｔｒｅｅ（Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌｕｓの木部）１６９ｇをメタノールで一週間室温抽出し、抽出液を減圧乾固した。得られたエキス８．１ｇのうち、４．７ｇを中圧クロマトグラフィーによりヘキサンで溶出した後（Ａ画分）、ヘキサン−酢酸エチル（４：１）混合溶液で溶出し（Ｂ画分）、続いて酢酸−エチル溶出して（Ｃ画分）、更にメタノールで溶出した（Ｄ画分）。得られたＣ画分３．２ｇを中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィにより２５４ｎｍにてモニターしながらクロロホルムで溶出した後、クロロホルム−メタノール（９８：２）混合溶液、同（１９：１）、（９：１）、（４：１）、（２：１）、（１：１）混合溶液、メタノールの順に溶出し１０画分を得た。クロロホルムで溶出されたＣ４画分（２１７ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィー（Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８ ＧＰ、６．０×２５０ｍｍ、アセトニトリル−水の（７０：３０）混合溶液で溶出）で分析し、保持時間９．８分（化合物１−２８）のピークを分取した。この化合物の分析結果は次の通りである。
化合物１−２８
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：４２１［Ｍ＋Ｈ］＋，４１９［Ｍ−Ｈ］−
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ：１．３６（ＣＨ３，ｓ），１．４３（ＣＨ３×２，ｓ），１．５８（ＣＨ３，ｓ），３．０８（Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８），５．０９（Ｈ，ｔｔ，Ｊ＝６．８，３．９），５．６６（Ｃ９−Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．８），６．２５（Ｃ６−Ｈ，ｓ），６．３９（Ｃ５’−Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．３，２．４），６．４０（Ｃ３’−Ｈ，ｓ），６．６７（Ｃ１０−Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．８），７．０６（Ｃ６’−Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３）
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ：２４．６（ＣＨ３），２５．６（ＣＨ３），２８．３（Ｃ８−ＣＨ３×２），７８．７（Ｃ−８），９５．４（Ｃ−６），１０３．５（Ｃ−３’），１０５．８，１０７．７（Ｃ−９），１１３．０（Ｃ−１’），１１６．１（Ｃ−５’），１２１．８（Ｃ−３），１２２．５，１３２．２（Ｃ−１０），１３２．５，１５７．０，１５７．５（Ｃ−２’），１５８．７（Ｃ−４’），１６０．３（Ｃ−７），１６１．７（Ｃ−２），１６３．４（Ｃ−５），１８３．６（Ｃ−４）
実施例１１：２’，４’，５−トリヒドロキシ−７−メトキシ６−（３−メチル−１−ブテニル）−３−（３−メチル−２−ブテニル）−フラボン（化合物１−２９）の単離
タイ産生薬のＪａｃｋ Ｆｒｕｉｔ Ｔｒｅｅ（Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌｕｓの木部）１６９ｇをメタノールで一週間室温抽出し、抽出液を減圧乾固した。得られたエキス８．１ｇのうち、４．７ｇを中圧クロマトグラフィーによりヘキサンで溶出した後（Ａ画分）、ヘキサン−酢酸エチル（４：１）混合溶液で溶出し（Ｂ画分）、続いて酢酸−エチル溶出して（Ｃ画分）、更にメタノールで溶出した（Ｄ画分）。
クロロホルムで溶出されたＣ４画分（２１７ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィー（Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８ ＧＰ、６．０×２５０ｍｍ、アセトニトリル−水の（７０：３０）混合溶液で溶出）で分析し、保持時間８．５分（化合物１−２９）のピークを分取した。この化合物の分析結果は次の通りである。
化合物１−２９
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：４３７［Ｍ＋Ｈ］＋，４３５［Ｍ＋Ｈ］−
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ：１．０２（Ｃ１７，ｌＣ１８−ＣＨ３，ｄ，Ｊ＝６．８３），１．３３（Ｃ１２−ＣＨ３，ｓ），１．５２（Ｃ１３−ＣＨ３，ｓ），２．３３（Ｃ１６−Ｈ，ｍ），３．０２，３．０４（Ｃ９−ＣＨ２，ｓ），３．７７（Ｃ７−ＯＣＨ３，ｓ），５．０４（Ｃ１０−Ｈ，ｔｔ，Ｊ＝５．４，１．５），６．３３（Ｃ８−Ｈ，ｓ），６．３４（Ｃ５’−Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．３），６．３６（Ｃ３’−Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．４），６．４３（Ｃ１４−Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１６．１，１．０），６．５６（Ｃ１５−Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１６．１，７．３），７．０２（Ｃ６’−Ｈ，Ｊ＝８．３）
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ：１８．５（Ｃ−１３），２４．１（Ｃ−１７，Ｃ−１８），２５．８（Ｃ−９），２６．７（Ｃ−１２），３５．２（Ｃ−１６），５７．３（Ｃ７−ＯＣＨ３），９１．５（Ｃ−８），１０４．６（Ｃ−３’），１０６．７（Ｃ−４ａ），１０８．８（Ｃ−５’），１１１．２（Ｃ−６），１１４．１（Ｃ−１’），１１８．０（Ｃ−１４），１２２．９（Ｃ−３），１２３．７（Ｃ−１０），１３３．４（Ｃ−１１），１３３．５（Ｃ−６’），１４３．５（Ｃ−１５），１５８．６（Ｃ−２’），１５８．６（Ｃ−８ａ），１６０．４（Ｃ−５），１６２．６（Ｃ−４’），１６４．３（Ｃ−２），１６５．０（Ｃ−７），１８４．６（Ｃ−４）
実施例１２：２Ｈ，６Ｈ−ベンゾ［１，２−ｂ：５，４−ｂ’］ジピラン−６−オン，７，８−ジヒドロ−５−ヒドロキシ−８−（４−ヒドロキシフェニル）−２，２−ジメチル−１０−（３−メチル−２−ブテニル）（化合物２−３）の単離
タイ産生薬のＡｌｂｉｚｚｉａ ｍｙｒｉｏｐｈｙｌｌａの枝６０．０ｇをメタノールで一週間室温抽出し、抽出液を減圧乾固した。得られたエキス４．４ｇのうち、３．８０ｇを中圧クロマトグラフィーによりヘキサンで溶出した後（Ａ画分）、ヘキサン−酢酸エチル（４：１）混合溶液で溶出し（Ｂ画分）、続いて酢酸−エチル溶出して（Ｃ画分）、更にメタノールで溶出した（Ｄ画分）。得られたＢ画分１．２ｇを高速液体クロマトグラフィー（Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８ ＧＰ、６．０×２５０ｍｍ、アセトニトリル−水の（７０：３０）混合溶液で溶出）で分析した結果、保持時間１５．２分のピークを示す画分が得られた。この化合物の分析結果は次の通りである。
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：４０７［Ｍ＋Ｈ］＋，４０５［Ｍ−Ｈ］−
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：１．４３，１．４５（Ｃ２’’’−ＣＨ３×２，ｓ），１．６５（Ｃ３’’−ＣＨ３×２，ｓ），２．８０（Ｃ３−Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１７．１，３．２），３．３９（Ｃ３−Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１７．１，２．９），３．２１（Ｃ１’’−Ｈ２，ｄ，Ｊ＝７．３），５．１４（Ｃ２’’−Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３），５．３４（Ｃ２−Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２．７，２．９），５．５０（Ｃ３−‘’’Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．０），６．６３（Ｃ４’’’−Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．０），６．８７（Ｃ３，−Ｈ，Ｃ５’−Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８），７．３２（Ｃ２’−Ｈ，Ｃ６’−Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８）
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：１７．８（Ｃ−５’’−ＣＨ３），２１．５（Ｃ−１’’），２５．８（Ｃ４’’−ＣＨ３），２８．３（Ｃ−６’’’−ＣＨ３），２８．４（Ｃ−５’’’−ＣＨ３），４３．２（Ｃ−３），７８．１（Ｃ−２’’’），７８．５（Ｃ−２），１０２．７（Ｃ−１０），１０２．８（Ｃ−６），１０８．６（Ｃ−８），１１５．５（Ｃ−３’，Ｃ−５’），１１５．７（Ｃ−４’’’），１２２．５（Ｃ−２’’），１２６．０（Ｃ−１’），１２７．７（Ｃ−２’，Ｃ−６’），１３１．１（Ｃ−３’’’），１５５．８（Ｃ−４’），１５６．６（Ｃ−９），１５９．３（Ｃ−５），１６０．０（Ｃ−７），１９６．４（Ｃ−４）
実施例１３：６Ｈ，７Ｈ−［１］ベンゾピラノ［４，３−ｂ］［１］ベンゾピラン−７−オン，３，８，１０−トリヒドロキシ−９−（３−メチル−１−ブテニル）−６−（２−メチル−１−プロペニル）（化合物５−１）の単離
タイ産生薬のＪａｃｋ Ｆｒｕｉｔ Ｔｒｅｅ（Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌｕｓの木部）１６９ｇをメタノールで一週間室温抽出し、抽出液を減圧乾固した。得られたエキス８．１ｇのうち、４．７ｇを中圧クロマトグラフィーによりヘキサンで溶出した後（Ａ画分）、ヘキサン−酢酸エチル（４：１）混合溶液で溶出し（Ｂ画分）、続いて酢酸−エチル溶出して（Ｃ画分）、更にメタノールで溶出した（Ｄ画分）。得られたＣ画分３．２ｇを中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィにより２５４ｎｍにてモニターしながらクロロホルムで溶出した後、クロロホルム−メタノール（９８：２）混合溶液、同（１９：１）、（９：１）、（４：１）、（２：１）、（１：１）混合溶液、メタノールの順に溶出し１０画分を得た。クロロホルムで溶出されたＣ３画分を高速液体クロマトグラフィー（Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８ ＧＰ、６．０×２５０ｍｍ、アセトニトリル−水の（７０：３０）混合溶液で溶出）で分析し、保持時間１０．８分（化合物５−１）のピークを分取した。
この化合物の分析結果は次の通りである。
化合物５−１
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：４２１［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ：１．９２（ＣＨ３×２，ｄ，Ｊ＝６．６），１．７０（ＣＨ３，ｄ，Ｊ＝１．２），１．９５（ＣＨ３，ｄ，Ｊ＝１．２），２．４１（ＣＨ，ｍ），５．４０（ＣＨ＝，ｄｔ，Ｊ＝９．５，１．２），６．１４（Ｃ６−Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．３），６．３０（Ｃ２−Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．２），６．４２（Ｃ１１−Ｈ，ｓ），６．５０（Ｃ４−Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．５，２．２），６．５３（＝ＣＨ，ｄｄ，Ｊ＝１６．１，１．０），６．６８（ＣＨ＝，ｄｄ，Ｊ＝１６．１，７．０），７．５９（Ｃ５−Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５）
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ：１９．３（ＣＨ３），２３．９（ＣＨ３×２），２６．６（ＣＨ３），３５．０，６７．３，７１．３，９５．０（Ｃ−１１），１０５．６（Ｃ−４），１０６．０，１０９．３，１１０．９，１１１．６，１１８．０（Ｃ−２），１２３．２，１２６．８（Ｃ−５），１４０．４，１４３．２，１５６．９，１５７．６（Ｃ−５），１６０．１，１６１．２（Ｃ−８），１６３．６（Ｃ−３），１６５．３（Ｃ−１０），１８０．４（Ｃ−７）
実施例１４：ＳＮ−３８耐性Ａ５４９細胞の樹立
ヒト非小細胞肺癌Ａ５４９細胞は、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有したＨａｍ’ｓ Ｆ−１２培地（１０％ＦＢＳ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１２）を使用して５％ＣＯ２，３７℃条件下で継代培養した。ＳＮ−３８耐性Ａ５４９細胞は、Ａ５４９細胞を培地中のＳＮ−３８濃度を段階的（４〜１０ｎｇ／ｍｌ）に増加させて２ヶ月間継代培養して選択した。さらに、このＳＮ−３８耐性Ａ５４９細胞から限界希釈法によるクローン化を行い、６株のクローン化ＳＮ−３８耐性Ａ５４９細胞（Ａ５４９／ＳＮ−３８−１〜６）を樹立した。
実施例１５：Ａ５４９／ＳＮ−３８細胞の抗癌剤感受性試験
Ａ５４９またはＡ５４９／ＳＮ−３８−１〜６の各細胞を１０％ＦＢＳ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１２に懸濁し、９６ウェルマイクロプレートに播種して５％ＣＯ２、３７℃条件下で培養した（２ ｘ １０３ ｃｅｌｌｓ／５０μｌ／ｗｅｌｌ）。一晩培養後、抗癌剤を溶解した１０％ＦＢＳ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１２を５０μｌ加え、５％ＣＯ２、３７℃条件下で４８時間培養した。培養後、生細胞測定用試薬〔ＴｅｔｒａＣｏｌｏｒ ＯＮＥ（商標名）、生化学工業製〕を使用して、添付の操作手順に従って生細胞数を測定した。各種抗癌剤に対するＡ５４９細胞およびＡ５４９／ＳＮ−３８細胞６株の感受性を表６および図１に示す。なお、ＩＣ５０値は細胞増殖を５０％抑制する抗癌剤の濃度である。また、相対耐性度は、Ａ５４９／ＳＮ−３８細胞におけるＩＣ５０値をＡ５４９細胞におけるＩＣ５０値で除した値であり、この値が大きいほど耐性獲得が大きいことを意味する。Ａ５４９／ＳＮ−３８細胞は、ＢＣＲＰの基質であるＳＮ−３８およびミトキサントロンに対して特に強い耐性を示した。
実施例１６ Ａ５４９／ＳＮ−３８細胞のＲＴ−ＰＣＲ解析
Ａ５４９細胞、Ａ５４９／ＳＮ−３８細胞６株およびＢＣＲＰを発現していることが知られるヒト乳癌ＭＣＦ−７細胞における各種薬剤輸送蛋白質のｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲ法により解析した。細胞よりＲＮＡ抽出用試薬〔ＩＳＯＧＥＮ（商標名）、ニッポンジーン製〕を用いて全ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ用試薬〔Ｒｅａｄｙ・Ｔｏ・Ｇｏ ＲＴ−ＰＣＲ Ｂｅａｄｓ（商標名）、アマシャム ファルマシア バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ）製〕およびサーマルサイクラー〔ｉＣｙｃｌｅｒ（商標名）、バイオ・ラッド（ＢＩＯ−ＲＡＤ）製〕を使用して添付の操作手順に従ってＲＴ−ＰＣＲを行った（全ＲＮＡ：０．５μｇ）。ＰＣＲ産物は、２％アガロースゲルを用いて電気泳動後、エチジウムブロマイド染色を施してトランスイルミネーターにて検出した。また、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ用試薬〔ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＲＴ−ＰＣＲ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（商標名）、アプライド バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）製〕およびＰＣＲプロダクト自動検出／定量システム〔ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７０００（商標名）、アプライド バイオシステムズ製〕を使用して添付の操作手順に従ってリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法を行い、定量的な解析を行った（全ＲＮＡ０．１μｇ）。なお、ＢＣＲＰ、ＭＤＲ１、ＭＲＰ１、ＭＲＰ２、ＭＲＰ３および内在性コントロール遺伝子のＧ３ＰＤＨに対する各ＰＣＲプライマーは、それぞれ公知のｍＲＮＡ塩基配列（アクセッション番号Ｎｏ．ＡＦ０９８９５１、ＡＦ０１６５３５、Ｌ０５６２８、Ｕ６３９７０、ＡＦ００９６７０、Ｍ３３１９７）よりデザインした。ＲＴ−ＰＣＲの結果を図２に、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲの結果を図３に示す。Ａ５４９細胞に比較してＡ５４９／ＳＮ−３８細胞６株では全てにおいてＢＣＲＰの発現が顕著に増加していた。一方、ＢＣＲＰと同じくＳＮ−３８を基質とするＭＲＰ２の発現量に大きな違いは認められなかった。また、その他の薬剤輸送蛋白質についてもＡ５４９細胞およびＡ５４９／ＳＮ−３８細胞間で発現量に違いは認められなかった。これらの結果から、ＢＣＲＰがＡ５４９／ＳＮ−３８細胞の抗癌剤耐性機構に関与することが示唆された。なお、本ＲＴ−ＰＣＲ解析で、ヒト乳癌ＭＣＦ−７細胞におけるＢＣＲＰ発現も確認された。一方、薬剤輸送蛋白質の発現の他にも、トポイソメラーゼ−Ｉ、トポイソメラーゼ−ＩＩ、Ｂｃｌ−２、ＢａｘおよびＩκＢαの発現をウェスタンブロット法により、トポイソメラーゼ−Ｉ活性についてＤＮＡ弛緩反応を指標に検討したが、これらがＡ５４９／ＳＮ−３８細胞の抗癌剤耐性機構に関与することを示唆するデータは得られなかった。
実施例１７：Ａ５４９／ＳＮ−３８細胞の抗癌剤蓄積量
Ａ５４９細胞またはＡ５４９／ＳＮ−３８−４細胞（４ ｘ １０６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を懸濁した１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０ １ｍｌにＳＮ−３８ＤＭＳＯ溶液１μｌ（最終濃度：３００ｎｇ／ｍｌ）を加えて３７℃にて６０分間インキュベート後、遠心（２℃、１，４００ ｘ ｇ、１ｍｉｎ）して上清を除去した。沈殿した細胞に氷冷ＰＢＳを加えて再懸濁後、遠心（２℃、１，４００ ｘ ｇ、１ｍｉｎ）して細胞を洗浄した。この洗浄操作をさらに１回行った後、ＰＢＳ ３７５μｌを加えて超音波処理により細胞を破壊した。この細胞破壊液にメタノール３７５μｌおよび１０％硫酸亜鉛溶液１５μｌを加えて攪拌後、遠心（２℃、１２，５００ ｘ ｇ、５ｍｉｎ）して上清を回収した。蛍光強度測定用の白色９６ウェルマイクロプレートに回収した上清を分注後（２００μ／ｗｅｌｌ）、マイクロプレート蛍光光度計〔ＳＰＥＣＴＲＡ ｍａｘ ＧＥＭＩＮＩ ＸＳ（商標名）、モレキュラー デバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）製〕により上清中のＳＮ−３８およびＳＮ−３８グルクロン酸抱合体量を測定し（ＳＮ−３８：励起波長３８０ｎｍ、測定波長５６０ｎｍ；ＳＮ−３８グルクロン酸抱合体：励起波長３７０ｎｍ、測定波長４３０ｎｍ）、細胞内の蓄積量を算出した。その結果、図４に示すように、Ａ５４９／ＳＮ−３８−４細胞のＳＮ−３８蓄積量はＡ５４９細胞におけ蓄積量に比較して約１／５に減少していた。この結果はＡ５４９／ＳＮ−３８細胞の抗癌剤耐性機構にＢＣＲＰが関与することを支持するものである。一方、ＳＮ−３８グルクロン酸抱合体は両細胞においてほとんど検出されず、グルクロン酸抱合活性の耐性機構への関与はないことが示された。
実施例１８：フラボノイド化合物によるＡ５４９／ＳＮ−３８細胞の抗癌剤耐性に対する克服作用
Ａ５４９細胞またはＡ５４９／ＳＮ−３８−４細胞を１０％ＦＢＳ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１２に懸濁し、９６ウェルマイクロプレートに播種して５％ＣＯ２、３７℃条件下で培養した（２ ｘ １０３ ｃｅｌｌｓ／５０μｌ／ｗｅｌｌ）。一晩培養後、フラボノイド化合物およびＳＮ−３８を溶解した１０％ＦＢＳ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１２をそれぞれ２５μｌ加え、５％ＣＯ２、３７℃条件下で４８時間培養した。培養後、ＴｅｔｒａＣｏｌｏｒ ＯＮＥを使用して、添付の操作手順に従って生細胞数を測定した。各フラボノイド化合物の耐性克服効果を表７にＥＣ５０値で示す。なお、ＥＣ５０値は、相対耐性度を５０％低下させる時のフラボノイド化合物の濃度である。その結果、フラボノイド化合物はＡ５４９／ＳＮ−３８−４細胞のＳＮ−３８耐性に対して強力な克服作用を示した。一方、濃度依存的に耐性を克服する濃度範囲において、フラボノイド化合物自体はＡ５４９細胞およびＡ５４９／ＳＮ−３８−４細胞の増殖に影響を及ぼさなかった。この結果は、本発明のフラボノイド化合物がＢＣＲＰを阻害し、癌細胞の抗癌剤耐性を克服することを示唆するものである。
実施例１９：フラボノイド化合物によるＭＣＦ−７細胞の抗癌剤に対する感受性増強作用
ＢＣＲＰを発現していることが知られるヒト乳癌ＭＣＦ−７細胞（Ｂｌｏｏｄ ９９，３７６３−３７７０（２００２））を用いて、癌細胞の抗癌剤に対する感受性に及ぼすフラボノイド化合物の作用を検討した。ＭＣＦ−７細胞を１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０に懸濁し、９６ウェルマイクロプレートに播種して５％ＣＯ２、３７℃条件下で培養した（３ ｘ １０３ ｃｅｌｌｓ／５０μｌ／ｗｅｌｌ）。一晩培養後、フラボノイド化合物およびＳＮ−３８を溶解した１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０をそれぞれ２５μｌ加え、５％ＣＯ２、３７℃条件下で４８時間培養した。培養後、ＴｅｔｒａＣｏｌｏｒ ＯＮＥを使用して、添付の操作手順に従って生細胞数を測定した。表８にフラボノイド化合物によるＭＣＦ−７細胞のＳＮ−３８に対する感受性の変化を、ＩＣ５０値（細胞増殖を５０％抑制するＳＮ−３８の濃度）で表した。その結果、フラボノイド化合物はＭＣＦ−７細胞のＳＮ−３８に対する感受性を増強した。一方、濃度依存的に感受性を増強する濃度範囲において、フラボノイド化合物自体はＭＣＦ−７細胞の増殖に影響を及ぼさなかった。この結果は、本発明のフラボノイド化合物がＢＣＲＰを阻害し、抗癌剤に対する癌細胞の感受性を増強することを示唆するものである。
実施例２０：フラボノイド化合物によるヒトＢＣＲＰ遺伝子導入マウス白血病Ｐ３８８細胞の抗癌剤耐性に対する克服作用
マウス白血病Ｐ３８８細胞またはヒトＢＣＲＰ遺伝子導入Ｐ３８８細胞（Ｐ３８８／ＢＣＲＰ細胞、財団法人癌研究会癌化学療法センター 杉本芳一氏より入手）を１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０に懸濁して９６ウェルマイクロプレートに播種後（１ ｘ １０４ ｃｅｌｌｓ／５０μｌ／ｗｅｌｌ）、フラボノイド化合物およびＳＮ−３８を溶解した１０％ＦＢＳ／ＲＰＮＩ１６４０をそれぞれ２５μｌ加え、５％ＣＯ２、３７℃条件下で４８時間培養した。培養後、ＴｅｔｒａＣｏｌｏｒ ＯＮＥを使用して、添付の操作手順に従って生細胞数を測定した。その結果を図５に示す。フラボノイド化合物はＰ３８８／ＢＣＲＰ細胞のＳＮ−３８耐性に対して強力な克服作用を示した。一方、Ｐ３８８細胞のＳＮ−３８に対する感受性に対しては影響を及ぼさなかった。この結果は、本発明のフラボノイド化合物にＢＣＲＰ阻害作用があることを確証づけるものである。
実施例２１：フラボノイド化合物によるＭＥＳ−ＳＡ／Ｄｘ５細胞の多剤耐性に及ぼす作用
ヒト子宮癌ＭＥＳ−ＳＡ細胞またはＰ−糖蛋白質を高発現して多剤耐性を獲得したＭＥＳ−ＳＡ／Ｄｘ５細胞（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４５，４０９１−４０９６（１９８５））を１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭに懸濁し、９６ウェルマイクロプレートに播種して５％ＣＯ２、３７℃条件下で培養した（３ ｘ １０３ ｃｅｌｌｓ／５０μｌ／ｗｅｌｌ）。一晩培養後、フラボノイド化合物およびパクリタキセルを溶解した１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭをそれぞれ２５μｌ加え、５％ＣＯ２、３７℃条件下で４８時間培養した。培養後、ＴｅｔｒａＣｏｌｏｒ ＯＮＥを使用して、添付の操作手順に従って生細胞数を測定した。各フラボノイド化合物の多剤耐性に及ぼす作用を表９にＥＣ５０値で示す。なお、ＥＣ５０値は、相対耐性度を５０％低下させる時のフラボノイド化合物の濃度である。その結果、検討した濃度範囲において、フラボノイド化合物はＭＥＳ−ＳＡ／Ｄｘ５細胞のパクリタキセル耐性に影響を及ぼさなかった。また、フラボノイド化合物自体はＭＥＳ−ＳＡ細胞およびＭＥＳ−ＳＡ／Ｄｘ５細胞の増殖に影響を及ぼさなかった。この結果から、本発明のフラボノイド化合物はＰ−糖蛋白質には作用せず、ＢＣＲＰに対して特異性を有することが示された。
実施例２２：フラボノイド化合物によるＢＣＲＰ発現細胞の抗癌剤蓄積量に及ぼす作用
Ｐ３８８細胞およびＰ３８８／ＢＣＲＰ細胞（１ ｘ １０７ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）、またはＭＣＦ−７細胞（３ ｘ １０６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を懸濁した１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０ １ｍｌにフラボノイド化合物およびＳＮ−３８（最終濃度：５００ｎｇ／ｍｌ）を加えて３７℃にて６０分間インキュベート後、遠心（２℃、１，４００ ｘ ｇ、１ｍｉｎ）して上清を除去した。沈殿した細胞に氷冷１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０を加えて再懸濁後、遠心（２℃、１，４００ ｘ ｇ、１ｍｉｎ）して細胞を洗浄した。この洗浄操作をさらに１回行った後、ＰＢＳ ３７５μｌを加えて超音波処理により細胞を破壊した。この細胞破壊液にメタノール３７５μｌおよび１０％硫酸亜鉛溶液１５μｌを加えて攪拌後、遠心（２℃、１２，５００ ｘ ｇ、５ｍｉｎ）して上清を回収した。蛍光強度測定用の白色９６ウェルマイクロプレートに回収した上清を分注後（２００μ／ｗｅｌｌ）、マイクロプレート蛍光光度計により上清中のＳＮ−３８量を測定し（ＳＮ−３８：励起波長３８０ｎｍ、測定波長５６０ｎｍ）、細胞内の蓄積量を算出した。その結果、図６に示すように、本発明のフラボノイド化合物はＰ３８８／ＢＣＲＰ細胞のＳＮ−３８細胞内蓄積量を増加させた。また、図７に示すように、本発明のフラボノイド化合物はＭＣＦ−７細胞のＳＮ−３８蓄積量を増加させた。この結果は、本発明のフラボノイド化合物がＢＣＲＰを阻害し、抗癌剤の細胞内取り込み量を増加させることを示唆するものである。
実施例２３：フラボノイド化合物のｉｎ ｖｉｖｏにおける抗癌剤耐性克服効果
６週齢のＣＤＦ１系、雌マウス（５匹／群）の腹腔内に、Ｐ３８８細胞またはＰ３８８／ＢＣＲＰ（１ ｘ １０６ ｃｅｌｌｓ／ｍｏｕｓｅ）を移植し、フラボノイド化合物および塩酸イリノテカン（ＣＰＴ−１１）を腫瘍移植１日後より１０日後まで１日１回、計１０回腹腔内に投与した。なお、フラボノイド化合物はエタノール、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート〔Ｔｗｅｅｎ ８０（商標名）、東京化成工業製〕および５％グルコース混合液（エタノール／Ｔｗｅｅｎ ８０／５％グルコース＝５：５：９０）に懸濁し、ＣＰＴ−１１は生理食塩水に溶解して投与し、対照群には溶媒のみを投与した。腫瘍移植後のマウスの生存日数を調べ、次式より延命率Ｔ／Ｃ（％）を求め、抗腫瘍効果を判定した。
延命率Ｔ／Ｃ（％）＝
（投与群マウスの平均生存日数）÷（対照群マウスの平均生存日数）×１００
結果を表１０に示す。本発明のフラボノイド化合物はｉｎ ｖｉｖｏにおいてもＢＣＲＰを阻害し、抗癌剤耐性克服効果を発揮することが示された。
実施例２４：以下に示す成分を混和して、その混和物を打錠した。
本発明によって、ＢＣＲＰが関与する抗癌剤耐性を克服することが可能となる。また、もとからＢＣＲＰを発現する癌に対して抗癌剤の効果を増強させることが可能である。さらには抗癌剤のバイオアベイラビリティを向上させることも期待され、癌化学療法における治療成績の向上につながることが期待される。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）、（２）、（３）、（４）又は（５）：
〔式中、Ｒ１は水素原子、水酸基、ハロゲン原子、低級アルコキシ基又は低級アルキル基を示し、７個のＲ２は同一でも異なってもよく、水素原子、水酸基、低級アルコキシ基、低級アルキル基、低級アルケニル基又は糖残基を示すか、或は隣接するＲ１と共に低級アルキル基で置換されていてもよいピラン環を形成してもよく、Ｒ３は水素原子、水酸基、ハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、アミノ基又はニトロ基を示す。〕
〔式中、Ｒ４は水素原子、水酸基、ハロゲン原子、低級アルコキシ基、低級アルキル基又は低級アルケニル基を示し、７個のＲ５は同一でも異なってもよく、水素原子、水酸基、低級アルコキシ基又は低級アルキル基を示すか、或は隣接する二つのＲ５は共に低級アルキル基で置換されていてもよいピラン環を形成してもよく、Ｒ６は水素原子、水酸基、ハロゲン原子、低級アルコキシ基、低級アルキル基、アミノ基又はニトロ基を示す。〕
〔式中、Ｒ７は水素原子、水酸基、ハロゲン原子、低級アルコキシ基又は低級アルキル基を示し、２個のＲ８は同一でも異なってもよく、水素原子、水酸基、低級アルコキシ基又は低級アルキル基を示し、Ｒ９は水素原子、水酸基、ハロゲン原子又は低級アルコキシ基を示し、５個のＲ１０は同一でも異なってもよく、水素原子、水酸基又は低級アルコキシ基を示す。〕
〔式中、３個のＲ１１は同一でも異なってもよく、水素原子、水酸基又は低級アルコキシ基を示す。〕
〔式中、Ｒ１２は水素原子又は低級アルケニル基を示し、Ｒ１３は水素原子又は水酸基を示し、Ｒ１４は水素原子を示す。〕
で表されるフラボノイド化合物、又はその配糖体、エステル若しくは塩を有効成分とする乳癌耐性蛋白阻害剤。
【請求項２】
請求項１記載のフラボノイド化合物（１）、（２）、（３）、（４）又は（５）、その配糖体、エステル若しくは塩を有効成分とする、ＢＣＲＰ関与の耐性を獲得した癌に対する抗癌剤耐性克服剤又はＢＣＲＰを発現し、抗癌剤に対して低感受性の癌に対する抗癌剤効果増強剤。
【請求項３】
請求項１記載のフラボノイド化合物（１）、（２）、（３）、（４）又は（５）、又はその配糖体、エステル若しくは塩、およびＢＣＲＰの基質となり得る抗癌剤を含有する抗癌剤。
【請求項４】
下記式（６）：
〔式中、Ｒ１５はアミノ基またはニトロ基を示す。〕
で表されるフラボノイド化合物。
【請求項５】
式（６）においてＲ１５がニトロ基を示す請求項４記載のフラボノイド化合物。
【請求項６】
式（６）においてＲ１５がアミノ基を示す請求項４記載のフラボノイド化合物。
【請求項７】
ＢＣＲＰを高発現する７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン（ＳＮ−３８）耐性ヒト非小細胞肺癌Ａ５４９細胞。
【請求項１】
下記式（１）、（２）、（３）、（４）又は（５）：
〔式中、Ｒ１は水素原子、水酸基、ハロゲン原子、低級アルコキシ基又は低級アルキル基を示し、７個のＲ２は同一でも異なってもよく、水素原子、水酸基、低級アルコキシ基、低級アルキル基、低級アルケニル基又は糖残基を示すか、或は隣接するＲ１と共に低級アルキル基で置換されていてもよいピラン環を形成してもよく、Ｒ３は水素原子、水酸基、ハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、アミノ基又はニトロ基を示す。〕
〔式中、Ｒ４は水素原子、水酸基、ハロゲン原子、低級アルコキシ基、低級アルキル基又は低級アルケニル基を示し、７個のＲ５は同一でも異なってもよく、水素原子、水酸基、低級アルコキシ基又は低級アルキル基を示すか、或は隣接する二つのＲ５は共に低級アルキル基で置換されていてもよいピラン環を形成してもよく、Ｒ６は水素原子、水酸基、ハロゲン原子、低級アルコキシ基、低級アルキル基、アミノ基又はニトロ基を示す。〕
〔式中、Ｒ７は水素原子、水酸基、ハロゲン原子、低級アルコキシ基又は低級アルキル基を示し、２個のＲ８は同一でも異なってもよく、水素原子、水酸基、低級アルコキシ基又は低級アルキル基を示し、Ｒ９は水素原子、水酸基、ハロゲン原子又は低級アルコキシ基を示し、５個のＲ１０は同一でも異なってもよく、水素原子、水酸基又は低級アルコキシ基を示す。〕
〔式中、３個のＲ１１は同一でも異なってもよく、水素原子、水酸基又は低級アルコキシ基を示す。〕
〔式中、Ｒ１２は水素原子又は低級アルケニル基を示し、Ｒ１３は水素原子又は水酸基を示し、Ｒ１４は水素原子を示す。〕
で表されるフラボノイド化合物、又はその配糖体、エステル若しくは塩を有効成分とする乳癌耐性蛋白阻害剤。
【請求項２】
請求項１記載のフラボノイド化合物（１）、（２）、（３）、（４）又は（５）、その配糖体、エステル若しくは塩を有効成分とする、ＢＣＲＰ関与の耐性を獲得した癌に対する抗癌剤耐性克服剤又はＢＣＲＰを発現し、抗癌剤に対して低感受性の癌に対する抗癌剤効果増強剤。
【請求項３】
請求項１記載のフラボノイド化合物（１）、（２）、（３）、（４）又は（５）、又はその配糖体、エステル若しくは塩、およびＢＣＲＰの基質となり得る抗癌剤を含有する抗癌剤。
【請求項４】
下記式（６）：
〔式中、Ｒ１５はアミノ基またはニトロ基を示す。〕
で表されるフラボノイド化合物。
【請求項５】
式（６）においてＲ１５がニトロ基を示す請求項４記載のフラボノイド化合物。
【請求項６】
式（６）においてＲ１５がアミノ基を示す請求項４記載のフラボノイド化合物。
【請求項７】
ＢＣＲＰを高発現する７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン（ＳＮ−３８）耐性ヒト非小細胞肺癌Ａ５４９細胞。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０６９２３３
【国際公開日】平成１６年８月１９日（２００４．８．１９）
【発行日】平成１８年５月２５日（２００６．５．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０４８３０（Ｐ２００５−５０４８３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００１０５４
【国際出願日】平成１６年２月３日（２００４．２．３）
【出願人】（０００００６８８４）株式会社ヤクルト本社 (132)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年８月１９日（２００４．８．１９）
【発行日】平成１８年５月２５日（２００６．５．２５）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００１０５４
【国際出願日】平成１６年２月３日（２００４．２．３）
【出願人】（０００００６８８４）株式会社ヤクルト本社 (132)
【Ｆターム（参考）】
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