体液、細胞および組織中のリパーゼおよび／またはホスホリパーゼを阻害するための因子およびそれを含む組成物
本発明は、代謝症候群、心臓血管障害及び炎症性疾患の予防及び治療のための体液、細胞及び組織中のリパーゼ及び／又はホスホリパーゼを阻害するタンパク質、及び前記タンパク質を含む組成物に関する。前記タンパク質は、植物種から分離されるか或いは組換えＤＮＡ技術により合成又は生成される。最も好ましい実施形態において、本発明のタンパク質は、５〜１００個のアミノ酸残基を含有し、分子量が０．５〜１０ｋＤであり、グリコシル化を有するかまたは有さない。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、体液、細胞及び組織中のリパーゼ及び／又はホスホリパーゼ酵素を阻害又は軽減するタンパク質及びその組成物に関する。本発明に記載のタンパク質及びその組成物は、体液、細胞及び組織中のリパーゼ及びホスホリパーゼ酵素活性がもたらす臨床的な症状発現及び疾患の予防又は治療に有用である。本発明は、体液、細胞及び組織中のリパーゼ及び／又はホスホリパーゼ酵素の阻害剤であるタンパク質の分離、精製、特徴付けに関する。本発明は、トリプシン不活化に対して精製タンパク質の安定な組成物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
（先行技術の説明）
リパーゼ及びホスホリパーゼは、哺乳動物の代謝の重要な制御要素である。これらは他の代謝酵素クラスとは区別される共通の特徴を数多く共有しており、中でも最も重要なのが、これらの「二次元」基質、即ち、脂肪の小滴、リポタンパク質、リン脂質層、生体膜との結合であり、結果として開裂機序及び調節に影響を及ぼしている。
【０００３】
膵リパーゼ（ＰＬ）は、トリグリセリドを部分的に加水分解し、胆汁酸と共に複合体を形成し、腸粘膜を経て吸収される脂肪酸とモノグリセリドとを得るのに効果的であると考えられている。肝リパーゼ（ＨＬ）及びリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）の２つは、循環血漿リポタンパク質中に存在するトリグリセリド及びリン脂質の加水分解を担う主な脂肪分解酵素である。何れのリパーゼも細胞表面プロテオグリカンを介して血管内皮に付着する。ＨＬは主にカイロミクロンレムナント、中間密度リポタンパク質及び高密度リポタンパク質の代謝に関与しているのに対して、ＬＰＬはカイロミクロン及び超低密度リポタンパク質からのトリグリセリドの加水分解を触媒する。こうした脂肪分解酵素としての従来の機能に加えて、ＨＬ及びＬＰＬは、細胞表面受容体及び／又はプロテオグリカンへのリポタンパク質の相互作用を媒介するリガンドとして働くようである。
【０００４】
肝臓外の部位でのトリグリセリドリッチリポタンパク質結合脂肪酸の蓄積及び分布はＬＰＬにより促進される。この酵素は又、全リポタンパク質粒子及び親油性ビタミンの細胞の取り込みを含めた幾つかの非脂肪分解に関連する機能に関与している。種々の脂質障害、肥満及びアテローム硬化症の病因には、ＬＰＬ発現の組織特異的な変異が関わっている。血管壁の細胞、特にマクロファージにより発現したＬＰＬには、泡沫細胞形成及びアテローム硬化症の促進に寄与する酵素の作用が更に確認された。コレステロールエステル転移タンパク質及びリポタンパク質リパーゼ系に特異的に作用する薬剤の開発が進められている。
【０００５】
過去数年間にわたり、ＨＬ及びＬＰＬがリポタンパク質代謝及びｉｎ ｖｉｖｏのアテローム硬化症の発症を調節する新規の代替機序についての本発明者の理解において大きな進歩を遂げた。又、トリグリセリドリッチリポタンパク質の血管内代謝についての本発明者等の理解にも進歩が見られた。今では、トリグリセリドリッチリポタンパク質結合アポリポタンパク質Ｅ、リポタンパク質リパーゼ及び肝リパーゼと、ヘパラン硫酸プロテオグリカン及びリポタンパク質受容体との複雑な細胞外相互作用が、トリグリセリドリッチリポタンパク質の肝細胞内への取り込みを促進することが知られている。最近の研究では、取り込まれたトリグリセリドリッチリポタンパク質の細胞内運命が極めて複雑であることも明らかになった。細胞内エンドソーム区画内部のトリグリセリドリッチリポタンパク質成分の単離には、アポリポタンパク質Ｅの再循環が含まれるのに対して、アポリポタンパク質Ｂと結びついている残りの脂質コアは、リソソームによる分解の影響を受けやすい。
【０００６】
糖尿病患者におけるアテローム硬化症の高い発症率は、マクロファージのＬＰＬ活性と相関している。多くの証拠が集まったことにより、血管壁でマクロファージがＬＰＬを生成すると、病変内部では脂質の蓄積が促進され、アテローム硬化症の発症が助長される場合があることが示唆されている。
【０００７】
代謝症候群及び心臓血管障害を治療する薬剤標的としてのリパーゼの可能性がますます認められている。現在、脂質の吸収及び代謝に関する疾患の最先端療法は、体液、細胞及び組織のリパーゼ活性を阻害又は軽減すべきであると考えられている。
【０００８】
リパーゼ阻害剤は、種々の天然産物、特に微生物供給源に由来するものが報告されている。このような阻害剤の例には、トリグリセリド及びコレステロールエステルの加水分解を阻害するストレプトマイセス種由来のリプスタチン及びパンクリシンＡ−Ｅ又はこれらの合成誘導体が含まれており（Ｈｏｃｈｕｌｉら、Ｌｉｐｓｔａｔｉｎ，ａｎｄ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｌｉｐａｓｅ，Ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｔｏｘｙｔｒｉｃｉｎｉ，ＩＩ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｅｌｕｃｉｄａｔｉｏｎ，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．（Ｔｏｋｙｏ），１９８７ Ａｕｇ．，４０（８）：１０８６−９１；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら、Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｌｉｐｓｔａｔｉｎ，ａ Ｌｉｐａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｏｎ Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｏｆ Ｆａｔ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｒａｔ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１９８９ Ｆｅｂ．２０，１００１（３）：２４９−５５；Ｙｏｓｈｉｎａｒｉら、Ｐａｎｃｌｉｃｉｎｓ，Ｎｏｖｅｌ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｌｉｐａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，ＩＩ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｅｌｕｃｉｄａｔｉｏｎ，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．（Ｔｏｋｙｏ），１９９４ Ｄｅｃ．，４７（１２）：１３７６−８４）、肥満の治療に使用されている（特許文献１）。しかも、幾つかの分子がＣａｓｓｉａ ｎｏｍａｍｅから分離したタンニンを含む植物供給源から同定されている（特許文献２）。ＬＰＬはアテローム硬化症の病因に関与していることが明らかにされている（Ｍｅａｄら、Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｐａｓｅ，ａ Ｋｅｙ Ｒｏｌｅ ｉｎ Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ？，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９９ Ｎｏｖ．２６，４６２（１−２）：１−６）。ＬＰＬの阻害はアテローム硬化の進行を予防すると考えられている（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎら、Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｐａｓｅ Ｍｅｄｉａｔｅｓ ｔｈｅ Ｕｐｔａｋｅ ｏｆ Ｇｌｙｃａｔｅｄ ＬＤＬ ｉｎ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ，Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ，ａｎｄ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，５０，１６４３−１６５３，２００１）。
【０００９】
ホスホリパーゼは、膜リン脂質に特異的に作用して加水分解し、シグナル伝達及び炎症プロセスに関わるメディエーターを産生する。アラキドン酸の産生では、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）の役割は周知であり、ロイコトリエン及びプロスタグランジン合成を担っている。ＰＬＡ２阻害剤は、種々の炎症性疾患及び変性疾患の薬剤として提唱されている。リポタンパク質関連ホスホリパーゼＡ２がアテローム硬化症に関与することが明らかにされており、アテローム硬化症の治療のためにリポタンパク質関連ホスホリパーゼＡ２を阻害することが提唱されている（Ｌｅａｃｈら、Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＰＬＡ２ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ−Ａ Ｎｏｖｅｌ，Ｎｏｎ−Ｌｉｐｉｄ Ｌｏｗｅｒｉｎｇ Ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｆａｒｍａｃｏ，２００１ Ｊａｎ−Ｆｅｂ，５６（ｌ−２）：４５−５０）。
【特許文献１】米国特許第５，５４０，９１７号明細書
【特許文献２】米国特許第５，６２９，３３８号明細書
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（要旨）
本発明は、体液、細胞及び組織中のリパーゼ及び／又はホスホリパーゼ酵素を阻害又は軽減するタンパク質、及び前記タンパク質を含む組成物に関する。本発明に記載のタンパク質及び前記タンパク質を含む組成物は、体液、細胞及び組織中のリパーゼ及び／又はホスホリパーゼ酵素活性がもたらす臨床的な症状発現及び疾患の予防又は治療に有用である。
【００１１】
好ましい実施形態において、リパーゼ及び／又はホスホリパーゼ阻害活性を有するタンパク質は、組換え技術により合成、生成するか又は天然の供給源から分離することができる。
【００１２】
最も好ましい実施形態において、タンパク質は、Ｍｏｒｉｎｇａ属に属する植物種の種子から分離される。
【００１３】
好ましい実施形態において、タンパク質は、簡潔で、効果的であり、費用効率が高いプロセスにより精製される。
【００１４】
最も好ましい実施形態において、タンパク質は、トリプシン阻害剤と合わせることによりトリプシン不活化から保護される。
【００１５】
好ましい実施形態において、リパーゼ及び／又はホスホリパーゼを阻害するための組成物は、本発明に記載のタンパク質の治療有効量及び薬学的に不活性なアジュバント、希釈剤又は担体を含む。
【００１６】
好ましい実施形態において、本発明に記載のタンパク質を含むリパーゼ及び／又はホスホリパーゼを阻害するための組成物は、他の有効成分と合わせられ得る。
【００１７】
本発明に記載のタンパク質又は前記タンパク質を含む組成物は、生理的条件下でリパーゼ及び／又はホスホリパーゼを阻害する能力があると考えられており、それによって代謝症候群、心臓血管障害及び炎症性疾患の予防又は治療に即した有効性があると考えられる。
【００１８】
好ましい実施形態において、本発明に記載のタンパク質又はタンパク質を含む組成物は、代謝症候群、心臓血管障害及び炎症性疾患の予防及び治療のために、体液、細胞及び組織中のリパーゼ及び／又はホスホリパーゼを阻害するのに有用である。
【００１９】
別の実施形態において、本発明に記載のタンパク質又はタンパク質を含む組成物は、肥満、糖尿病及びアテローム硬化症のような代謝障害の予防又は治療に使用することができる。
【００２０】
更に別の実施形態において、本発明に記載のタンパク質又はタンパク質を含む組成物は、単球系細胞、血管細胞、肝細胞及び脂肪組織に脂質が蓄積するのを阻害又は軽減するのに使用することができる。
【００２１】
更に別の実施形態において、本発明に記載のタンパク質又はタンパク質を含む組成物は、ホスホリパーゼの活性化及び／又は作用によって引き起こされる関節炎、アテローム硬化症及び敗血症性ショック等の炎症性疾患の予防又は治療に使用することができる。
【００２２】
更に別の実施形態において、本発明に記載のタンパク質又はタンパク質を含む組成物は、皮膚及び頭髪の手入れ用及び美容調製物（ｃｏｓｍｅｔｉｃ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）のために使用することができる。
【００２３】
更に別の実施形態において、本発明に記載のタンパク質又はタンパク質を含む組成物は、リパーゼ及び／又はホスホリパーゼを分泌する微生物病原体によって引き起こされる細胞及び組織の損傷の予防又は治療に使用することができる。
【００２４】
リパーゼの阻害特性に基づく更に別の実施形態において、タンパク質を含む組成物は、体液、細胞及び組織中のリパーゼ及び／又はホスホリパーゼ活性によって引き起こされるか、または悪化させる疾患を治療及び予防する動物薬において使用することができる。
【００２５】
好ましい実施形態において、本発明は、代謝症候群、心臓血管障害及び炎症性疾患を予防及び治療するための体液、細胞及び組織中のリパーゼ及び／又はホスホリパーゼの阻害に有用な、タンパク質を単独でか、又は薬学的に許容される適切なアジュバントを含む薬学的処方物も提供する。
【００２６】
好ましい実施形態において、本発明は、トリプシン阻害から保護するための安定したタンパク質の送達にも関する。好ましい実施形態において、本発明は、分離したタンパク質の経口送達も提供する。
【００２７】
本発明は又、本発明に記載のタンパク質の治療有効量を単独でか、又は薬学的に許容されるアジュバントと組み合わせて医薬品を製造する方法も提供する。本発明に記載のタンパク質は、他の有効成分と合わせられ得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
（本発明の説明）
本発明は、５〜１００個のアミノ酸残基を含有し、分子量が０．５〜１０ｋＤの範囲であり、グリコシル化を有するかまたは有さないタンパク質に関する。このタンパク質は、リパーゼ及び／又はホスホリパーゼの酵素活性に対する阻害作用又は軽減作用を有する。このタンパク質は組換えＤＮＡ技術により合成又は生成される場合もあれば、植物材料から分離される場合もある。
【００２９】
本発明に開示されるタンパク質は、Ｍｏｒｉｎｇａ属に属する種から分離され、更に好ましくはＭｏｒｉｎｇａ植物の種子から分離される。このタンパク質は、本明細書の以下の実施例に開示する方法により分離することができる。次に、分離したタンパク質は、適切な技術により精製される。次に、精製タンパク質は、以下の配列について、ＳＤＳ ＰＡＧＥ及びＬＣ−ＭＳ技術によって特徴付けられる。
【００３０】
上記タンパク質は、以下の配列番号１：ＣＧＱＱＬＲＮＩＳＰＰＱＲＣＰＳＬＲＱＡＶＱＬＡＨＱＱＱＧＱＧＰＱＱＶＲＱＭＹＲの部分的な配列番号を有する。
【００３１】
更に、このタンパク質を、リパーゼ阻害活性について合成基質及び天然基質の存在下で試験した。
【００３２】
トリプシン存在下で、Ｍｏｒｉｎｇａ種子タンパク質の活性について前記タンパク質を更に解析した。
【００３３】
Ｍｏｒｉｎｇａ種子タンパク質は、トリプシン存在下ではリパーゼ阻害活性を失うことが明らかにされた。そこで、トリプシン不活化に対するタンパク質保護に関する試験を実施した。トリプシン阻害剤の存在下では、このタンパク質がリパーゼ阻害剤として有効であることが明らかにされた。
【００３４】
本発明のリパーゼ／ホスホリパーゼ阻害剤との組み合わせのために、天然に存在するトリプシン阻害剤の内、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、ライマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｌｉｍｅｎｓｉｓ）、Ｐｒｏｓｏｐｉｓ ｊｕｌｉｆｉｏｒａの種子、ヒマワリ種子（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｓ）等及びこれらの組み合わせを選択した。ダイズタンパク質存在下で、リパーゼ阻害についてタンパク質を試験した。
【００３５】
本発明は、本発明に記載のタンパク質の治療有効量及び薬学的に不活性なアジュバント、希釈剤又は担体を含む、リパーゼ及び／又はホスホリパーゼを阻害するための組成物にも関する。本発明に記載のタンパク質を含む、リパーゼ又はホスホリパーゼを阻害するための組成物は又、別の有効成分と合わせられ得る。
【００３６】
本発明に記載のタンパク質又は前記タンパク質を含む組成物は、生理的条件下でリパーゼ及び／又はホスホリパーゼを阻害する能力を有すると考えられており、それによって代謝症候群、心臓血管障害及び炎症性疾患の予防又は治療に即した有効性があると考えられる。
【００３７】
本発明に記載のタンパク質又はタンパク質を含む組成物は、代謝症候群、心臓血管障害及び炎症性疾患を予防及び治療するために、体液、細胞及び組織中のリパーゼ及び／又はホスホリパーゼを阻害するのに有用である。
【００３８】
好ましい実施形態において、本発明に記載のタンパク質又はタンパク質を含む組成物は、肥満、糖尿病及びアテローム硬化症のような代謝障害の予防又は治療に使用することができる。
【００３９】
更なる態様において、本発明に記載のタンパク質又はタンパク質を含む組成物は、単球系細胞、血管細胞、肝細胞及び脂肪組織に脂質が蓄積するのを阻害又は軽減するのに使用することができる。
【００４０】
更に他の態様において、本発明に記載のタンパク質又はタンパク質を含む組成物は、ホスホリパーゼの活性化及び／又は作用によって引き起こされる関節炎、アテローム硬化症及び敗血症性ショック等の炎症性疾患の予防及び治療に使用することができる。
【００４１】
更に別の態様において、本発明に記載のタンパク質又はタンパク質を含む組成物は、リパーゼ及び／又はホスホリパーゼを分泌する微生物病原体によって引き起こされる細胞及び組織の損傷を予防又は治療するために使用することができる。
【００４２】
更に別の態様において、本発明に記載のタンパク質又はタンパク質を含む組成物は、皮膚及び頭髪の手入れ用及び美容調製物のために使用することができる。
【００４３】
本発明に記載のタンパク質又は前記タンパク質を含む組成物は、従来の任意の経口、頬側、鼻内、単位投薬形態の吸入スプレーによってか、非経口（例えば、静脈内、筋肉内、皮下、胸骨内（ｉｎｔｒａｓｔｅｍａｌ）又は注入技術による）、局所（例えば、粉末、軟膏又はドロップ）、経皮、槽内、膣内、腹腔内、膀胱内又は直腸に投与することができる。本発明の別の態様において、本発明の化合物及び少なくとも１つの他の薬学的に活性な因子を、個別に投与する場合もあれば、両方を含む薬学的組成物で投与する場合もある。このような投与には、一般的に経口が好まれる。しかし、治療されている患者が嚥下することができないか、経口投与が困難であるか望ましくなければ、非経口又は経皮投与が妥当な場合がある。
【００４４】
本発明に記載のタンパク質又は前記タンパク質を含む組成物は、任意の改変放出処方物、制御放出処方物又は持続放出処方物の形態で投与することができる。
【００４５】
従って、体液、細胞及び組織中のリパーゼ及び／又はホスホリパーゼ活性を軽減するための本発明にしたがう処方物は、必須有効成分として、本発明のタンパク質を含む。
【００４６】
好ましい実施形態において、本発明は、体液、細胞及び組織中のリパーゼ及び／又はホスホリパーゼ活性を軽減するための、本発明のタンパク質を含む処方物を提供し、このタンパク質は、単独でか、或いは既知の薬学的に許容される不活性なアジュバント、希釈剤又は担体と組み合わせて処方され得る。
【００４７】
本発明によるタンパク質を含む処方物は、１つ以上の常用添加剤、担体、助剤等と共に配合することができる。これは、経口投与用に配合することができ、医薬分野で使用することができる。経口投与に適切な形態の例には、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、球状体、シロップ剤及び飲料が挙げられる。好ましい実施形態において、これは球状体の形態で処方される。最も好ましい実施形態において、この球状体は腸溶性コーティングされる。
【００４８】
適切な担体材料の例は、水、ゼラチン、アラビアゴム、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、植物油、ポリアルキレングリコール、ワセリン等である。薬学的処方物は、固体形態（例えば、錠剤、糖衣剤、坐剤又はカプセル剤として）又は液体形態（例えば、溶液、懸濁物又はエマルジョンとして）で調合され得る。医薬調製物は滅菌される場合もあれば、保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧を変えるための塩又は緩衝剤等のアジュバントを含有する場合もある。これらは治療上価値がある物質を含有することができる。
【００４９】
本発明による処方物を調製するため、必須成分は、１つ以上の薬学的に許容されるビヒクル、担体、賦形剤、結合剤、防腐剤、酸化防止剤、安定化剤、矯味剤、緩衝剤等と混合され、続いて所望の単位投薬形態に形成される。
【００５０】
本発明にしたがう処方に際して、錠剤、カプセル剤等に混合することができるアジュバントの例には、アラビアゴム、コーンスターチ及びゼラチン等の結合剤、ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、結晶セルロース等の賦形剤、α化デンプン及びアルギン酸等の膨潤剤、ショ糖、ラクトース及びサッカリン等の甘味剤及びペパーミント及びチェリー等の矯味剤が挙げられる。カプセル剤への処方に際して、油等の液体担体も上述のアジュバントと共に混合することができる。
【００５１】
更に、コーティング剤としてか、或いは調製物の物理的形態を変えるために、他の材料を加えることもできる。例えば、錠剤は、シュラック、糖又は任意の酸性ｐＨ耐性ポリマーでコーティングすることができる。シロップ剤及びエリキシル剤は、甘味剤としてショ糖を、防腐剤としてメチルパラベン又はプロピルパラベンを、及び／又は矯味剤としてペパーミント又はオレンジ風味を共に添加することができる。
【００５２】
本発明によれば、上記処方物は、総血清脂質コレステロールを下げる医薬として、そして肥満、虚血性心疾患、動脈硬化症、脳血管性痴呆、糖尿病、血管障害性パーキンソン病、炎症性疾患等の治療のために使用することができる。
【００５３】
本発明に記載の処方物は、乾燥重量に換算して約１０〜２０００ｍｇ／日の量で１日１回又は数回投与してもよい。
【００５４】
本発明による処方物の有効成分は、血清脂質レベル又は血中総コレステロールレベル或いは組織中の脂肪の蓄積を軽減するために種々の食物に添加することができる。本発明による有効成分を添加することができる食物の例には、茶飲料、ジュース、コーヒー、飲料、炭酸飲料、チューイングガム、キャンディー、キャラメル、チョコレート及びアイスクリームが挙げられる。
【００５５】
更なる態様において、本発明に記載のタンパク質又はこのタンパク質を含む組成物は、動物の体液、細胞及び組織中のリパーゼ及び／又はホスホリパーゼ活性によって引き起こされるか、または悪化される疾患を治療及び予防するための動物薬として有用な場合がある。
【００５６】
本発明は更に、上記タンパク質を含む処方物の投与により体液、細胞及び組織中のリパーゼ及び／又はホスホリパーゼ活性を阻害又は軽減するための方法にも関する。本発明は、本明細書で以下に開示する特異的な酵素検定を使用した、このタンパク質がリパーゼ及び／又はホスホリパーゼの強力な阻害剤であるという本発明者等の発見に基づく。更に、本発明は、処方の間、このタンパク質が安定なままであり、それによってこのタンパク質の活性が維持されるという本発明者等の観察にも基づく。ｉｎ ｖｉｔｒｏの結果を確認した後、そのリパーゼ活性について動物試験を実施した。
【００５７】
本発明の更なる態様及び特徴を、以下の非限定的な実施例に例示する。
【実施例】
【００５８】
（実施例１）
Ｍｏｒｉｎｇａ種子からのリパーゼ阻害タンパク質の分離
粉末状にした種子１００ｇｍを、ＭＱ水１リットルに室温にて４８時間浸漬した。その抽出液をＷｈａｔｍａｎ濾紙で濾過した。凍結乾燥器（−５０℃）を使用して濾液を２日間濃縮し、適切な技法で精製したタンパク質単離物を得た。Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を使用してタンパク質を評価した。
【００５９】
結果：粉末１０ｍｇには、タンパク質が４９４μｇ含まれていた。
【００６０】
（実施例２）
分離したタンパク質の精製
Ｍｏｒｉｎｇａ種子の粉末試料を水に浸漬した。抽出液を濾過した後、清澄な抽出液を０．１Ｍリン酸緩衝液（１：１）と混合した。次に、その溶液を遠心分離し、上清を回収して、室温にて３０分間アセトン沈殿（冷アセトン）に供した。得られた溶液を遠心分離し、沈殿物を回収してｐＨ８．０の０．１Ｍリン酸緩衝液に溶解した。この溶液をよく混合してＴＣＡ沈殿に供した。その溶液を再び遠心分離した。最後に、粘着性のある沈殿物をｐＨ８．０の０．１Ｍリン酸緩衝液に撹拌することによって溶解した。次に、上のタンパク質溶液をゲル濾過クロマトグラフィーで精製し、５０ｍＭ、ｐＨ８．０のリン酸緩衝液で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０カラムを使用して純粋なタンパク質を得た。Ｂｒａｄｆｏｒｄマイクロプレート検定により、回収した画分のタンパク質活性について検討し、タンパク質の純度を、クマシーブリリアントブルーで染色した１７％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｌａｅｍｍｌｉ，１９７０）ゲルで泳動（ｒｕｎ）することによって確認した。
【００６１】
（実施例３）
タンパク質の特徴付け
Ｍｏｒｉｎｇａ種子から分離したタンパク質を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１７％）を実行し、クマシーブルーで染色した。５＋／−１ｋＤバンドを切り出し、シリコン処理したチューブに移して５０％メタノール２００μＬで一晩洗浄、脱色した。ゲル片をアセトニトリル中で脱水し、０．１Ｍ炭酸水素アンモニウム中の１０ｍＭジチオールスレイトール３０μＬで再水和し、室温にて０．５時間還元した。ＤＴＴ溶液を除去し、０．１Ｍ炭酸水素アンモニウム中の５０ｍＭヨードアセトアミド３０μＬで、試料を室温にて０．５時間アルキル化した。試薬を除去し、アセトニトリル１００μＬ中でゲル片を脱水した。アセトニトリルを除去し、０．１Ｍ炭酸水素アンモニウム１００μＬ中でゲル片を再水和した。その断片をアセトニトリル１００μＬ中で脱水し、アセトニトリルを除去して、真空遠心分離により断片を完全に乾燥させた。氷上の５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム中の２０ｎｇ／μＬトリプシンで、ゲル片を１０分間再水和した。余分なトリプシン溶液を除去し、５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム２０μＬを添加した。試料を３７℃にて一晩消化し、ポリアクリルアミドから形成されたペプチドを５０％アセトニトリル／５％ギ酸の３０μＬアリコート２つで抽出した。これらの抽出液を合わせて、ＭＳ分析のために２５μＬまで蒸発させた。
【００６２】
Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＬＣＱイオントラップ型質量分析計装置と、Ｐｒｏｔａｎａナノスプレーイオン源を、自己充填式８ｃｍ×内径７５μｍ Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ １０μｍ Ｃ１８逆相キャピラリーカラムで接続して、ＬＣ−ＭＳ装置を構成した。抽出液を０．５〜５μＬ容量注入し、流速０．２５μＬ／分で、アセトニトリル／０．１Ｍ酢酸勾配によりペプチドをカラムから溶出した。ナノスプレーイオン源を２．８ｋＶで操作した。フルスキャン質量スペクトルを取得する機器の倍化動作（ｄｏｕｂｌｅ ｐｌａｙ）能力を使用して、消化液を分析してペプチド分子量及びプロダクトイオンスペクトルを決定し、連続的なスキャンでアミノ酸配列を決定した。
【００６３】
以下に示す通り、タンパク質の部分的な配列番号を確認した。
ＣＧＱＱＬＲＮＩＳＰＰＱＲＣＰＳＬＲＱＡＶＱＬＡＨＱＱＱＧＱＧＰＱＱＶＲＱＭＹＲ
（実施例３）
合成基質の存在下におけるＭｏｒｉｎｇａ種子タンパク質のリパーゼ阻害活性
リパーゼ検定
膵リパーゼを使用するという変更を伴って、Ｗｉｎｋｌｅｒ ａｎｄ Ｓｔｕｃｋｍａｎｎ，１９７９に記載の方法により酵素検定を実施した。９６ウェル形式を使用して検定を計画した。この検定で使用した基質はパルチミン酸ｐ−ニトロフェノール（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｎ−２７５２）であった。パルチミン酸ｐ−ニトロフェノール４．５ｍｇをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｄ−４５５１）２００μＬ中に溶解し、容積をＰｈ８．０の０．１Ｍリン酸緩衝液で１０ｍＬとした。０．１Ｍ−リン酸緩衝液中で、酵素を５ｍｇ／ｍＬ濃度で溶解することによりリパーゼ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｌ−３１２６）試料を調製した。反応混合物は基質溶液−１５０μＬ、リン酸緩衝液（ｐＨ８．０、０．１Ｍ）−４０μＬ及びリパーゼ溶液−１０μＬからなった。反応混合物を３７℃にてインキュベートし、インキュベート後に光学密度を４０５ｎｍで測定した。酵素活性を国際単位（ＩＵ）の形で表した。標準的な検定条件下で、基質（パルチミン酸ｐ−ニトロフェノール）／ｍＬ／分から遊離フェノール１ｎｍを放出する量をリパーゼの１酵素単位と定義した（Ｗｉｎｋｌｅｒ Ｋ．Ｗ．ａｎｄ Ｓｔｕｃｋｍａｎ Ｍ，１９７９ Ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｈｙａｌｕｒｏｎａｔｅ ａｎｄ ｓｏｍｅ ｏｔｈｅｒ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｇｒｅａｔｌｙ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｏｌｉｐａｓｅ ｂｙ Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ，Ｊ．ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １３８：６６３−６７０）。これはｐ−ニトロフェノールの標準グラフから導き出したものである。
【００６４】
Ｍｏｒｉｎｇａ種子タンパク質によるリパーゼ阻害
阻害検定を用量依存的な様式で実施した。タンパク質の濃度は、４０μｇ〜０．１５６μｇ／ｍＬ反応混合物と照合した。検定は、対照のリン酸緩衝液の代わりに阻害剤溶液４０μＬを使用したことを除き、上に記載した検定とほぼ同じであった。放出したｐ−ニトロフェノールを４０５ｎｍで記録した。単純に国際単位（ＩＵ）の変化に基づいて、阻害率換算で酵素阻害を表したが、これは標準グラフから算出したものである。
【００６５】
結果：
（表−１）
【００６６】
【表１】
結論：Ｍｏｒｉｎｇａタンパク質は、極めて低い濃度でも膵リパーゼを阻害することができた。
【００６７】
（実施例４）
天然基質の存在下におけるＭｏｒｉｎｇａ種子タンパク質の阻害活性
Ｉｓｈｉｉａ Ｃら、１９８８，Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｐａｓｅ ｂｙ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，Ｎｉｐｐｏｎ Ｓｈｏｋｕｈｉｎ Ｋｏｇｙｏ Ｇａｋｋａｉｓｈｉ，３５（６），４３０−４３９の変法にしたがうことにより、反応混合物中に遊離した遊離脂肪酸を滴定することによりリパーゼ活性を測定した。試験管内で、３７℃にて３０分間振盪させて反応を実施した。反応混合物を、ｐＨ−７．０のＭｃｌｌｖａｉｎｅ緩衝液１．５ｍＬ、オリーブオイル０．２４ｍＬ及び阻害剤溶液０．５ｍＬで調製し、水を入れて最終容積を５．５ｍＬとした。５分間のプレインキュベーション後、酵素溶液０．５ｍＬ（５．０ｍｇ）を添加して反応を開始した。次に、ｎ−プロピルアルコール：石油エーテル（１：４）の混合溶液１０ｍＬを添加して反応を停止し、次に混合物を２分間勢いよく振盪した。上層を１ｍＬピペットで取り、指示薬としてフェノールフタレインを使用して０．０２Ｍのアルコール性ＫＯＨで滴定した。阻害剤溶液を緩衝液に置き換えたことを除き、標準反応混合物を、記載したように調製した。標準検定条件下でμＭ／分放出した脂肪酸を酵素の１国際単位（ＩＵ）とみなした。
【００６８】
結果：
（表−２）
【００６９】
【表２】
結論：Ｍｏｒｉｎｇａ種子タンパク質は、天然基質であるオリーブオイルを加水分解している間に、膵リパーゼを阻害することができた。
【００７０】
（実施例５）
Ｍｏｒｉｎｇａ種子タンパク質のリパーゼ阻害活性に対するトリプシンの影響
Ｍｏｒｉｎｇａ種子タンパク質のトリプシン開裂後に、リパーゼ阻害活性を実施した。分離したタンパク質（５００μｇ／ｍＬ Ｂｒａｄｆｏｒｄ法により評価した）を、ｐＨ−９．０の５０ｍＭトリス緩衝液中のトリプシン（０．５％）及び試料緩衝液と共に１：１：２の割合で、３７℃にて２４時間インキュベートした。インキュベーション後、全試料を７０℃にて１０分間熱失活させた。対照におけるリン酸緩衝液の代わりに試験溶液（トリプシン処理済／未処理）４０μＬを使用したことを除き、先に記載の通りリパーゼ阻害検定を実施した。放出したｐ−ニトロフェノールを４０５ｎｍで記録した。単純に国際単位（ＩＵ）の変化に基づいて、阻害率換算でリパーゼ活性を表したが、これは標準グラフから算出したものである。
【００７１】
結果：トリプシン開裂後に、Ｍｏｒｉｎｇａ種子タンパク質がリパーゼ阻害活性を失ったことが観察されたが、これはタンパク質にリパーゼ阻害活性が存在することを示唆するものである。
【００７２】
（表−３）
【００７３】
【表３】
（実施例６）
ダイズタンパク質を用いての、トリプシンからのＭｏｒｉｎｇａ種子タンパク質の保護
安定した形態でＭｏｒｉｎｇａ種子タンパク質を存在させるためには、トリプシン阻害からこのタンパク質を保護することが必須であった。それゆえ、保護のためにダイズタンパク質を選択した。
【００７４】
ダイズ種子からのダイズタンパク質の分離
２リットルのガラスビーカー内で、ダイズ種子５００ｇｍとＭｉｌｌｉ Ｑ水１．５リットルとを装填し、水浴でビーカーを６５℃にて（外部温度）９０分間加熱した。９０分後、ダイズ種子抽出液を濾過し室温に冷却した。凍結乾燥器（−５０℃）を使用して濾液を２日間濃縮した。粗タンパク質が丸底フラスコの壁面に張り付き、これを、スパチュラを使用して擦過し粉末を細かくした。得られた総固体粉末タンパク質は１２．５ｇｍであり、吸湿性を備えていた。Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を使用してタンパク質を評価した。
【００７５】
結果：固体１０ｍｇにはタンパク質が１８．５２μｇ含有されていた。
【００７６】
タンパク質保護検定
種々の濃度のダイズタンパク質を使用して、トリプシンからＭｏｒｉｎｇａ種子タンパク質を保護することを実施した。Ｍｏｒｉｎｇａ種子タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ法による評価で４９．１μｇ／１００μＬ）を、トリプシン（０．５％）溶液１００μＬ及びｐＨ−９．０、５０ｍＭの緩衝液中の種々の濃度のダイズタンパク質１００μＬ及び試料緩衝液と共に１：１：１：１の比で、３７０℃にて２４時間インキュベートした。インキュベーション後、全試料を７０℃にて１０分間熱失活させた。対照におけるリン酸緩衝液の代わりに試験溶液（処理済／未処理）４０μＬを使用したことを除き、先に記載の通り検定を実施した。放出したｐ−ニトロフェノールを４０５ｎｍでのＯＤとして記録した。単純に国際単位（ＩＵ）の変化に基づいて、阻害率換算でリパーゼ活性を表したが、これは標準グラフから算出したものである。
【００７７】
（表−４）
【００７８】
【表４】
（実施例７）
タンパク質の組成物
Ｍｏｒｉｎｇａ種子タンパク質（５０．０ｇｍｓ）、微結晶性セルロース（３３６．０ｇｍｓ）及びラクトース（８４．０ｇｍｓ）を個別に４０＃を通過させ、適切なミキサー内で１５分間幾何学的（ｇｅｏｍｅｔｒｉｃａｌ）に撹拌した。トウモロコシデンプン（３０．０ｇｍｓ）と必要量の水を使用して、１０％デンプンペーストを調製した。ミキサーにデンプンペーストを加え、押し出しに適切な粘稠度の生地が形成されるまで混合を続けた。０．８ｍｍ放射状スクリーンを装着したＦｕｊｉ Ｐａｕｄａｌ ＥＸＤＳ−６０押し出し機内に、生地混合物を装填した。乾燥オーブンを使用して、押し出された生地（ｅｘｔｒｕｄｅ）を４０℃にて８時間乾燥させた。Ｆｕｊｉ Ｐａｕｄａｌ Ｑ２３０を使用して球状体化し、これらを４０℃にて一晩乾燥させる。乾燥した球状体を篩いにかけ、２４番を通過し、メッシュｎ０．４０上に保持された球状体を更に加工した。
【００７９】
１）密封（ｓｅａｌ）コーティング、２）腸溶性コーティングの２つの工程でコーティングを行った。
【００８０】
フィルム形成ポリマーとしてＨＰＭＣを使用することにより密封コーティングを行い、腸溶性ポリマーとしてＥｕｄｒａｇｉｔ Ｌ３０Ｄ５５を、着色剤として黄色酸化鉄を補って腸溶性コーティングを行った。サイズ０の透明な硬ゼラチンカプセルに、球状体を充填した。Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を使用して、コーティングした球状体並びに充填カプセルに関するｉｎ−ｖｉｔｒｏタンパク質分析を行った。
【００８１】
分析データ：
（表−５）
【００８２】
【表５】
試料Ａ＊＝球状体試料
試料Ｂ＊＊＝充填カプセル試料
グラフには濃度に対する吸光度をプロットした
Ｒ＝０．９５０４５８
得られた方程式：Ｙ＝１．１３６１６×Ｘ＋０．０６８２６８１
式中、Ｙは吸光度であり、Ｘは濃度（μｇ／μＬ）である
計算結果：
試料Ａ＊＝０．３９９０μｇ／μＬ
試料Ｂ＊＊＝０．３６６８μｇ／μＬ
上述のデータから、処方プロセス中は、タンパク質は破壊されていないことが推測できる。
【００８３】
（実施例８）
動物試験
４群のＷｉｓｔａｒ雄ラットにおいて、Ｍｏｒｉｎｇａ種子タンパク質にダイズタンパク質（先に分離した）を添えたものと添えないものを用いて、短期動物実験を実施した。雄Ｗｉｓｔａｒを一晩絶食させ、脂質エマルジョン（水中ヒマワリ油１０ｍＬ）１．２ｍＬ、あるいは脂質エマルジョン１．２ｍＬに、群ごとに定めた種々の処方物（群：対照、群１：Ｍｏｒｉｎｇａ固体抽出物５０ｍｇ（タンパク質２．５ｍｇ）、群２：タンパク質９２．６μｇを含有するダイズ固体抽出物５０ｍｇ及び群３：Ｍｏｒｉｎｇａ固体抽出物５０ｍｇ（タンパク質２．５ｍｇ）及びダイズ固体抽出物５０ｍｇ（タンパク質９２．６μｇ））をあわせてラットに経口投与した。血液試料を採取し、血漿トリアシルグリセロール濃度を決定した。
トリグリセリド濃度（ｍｇ／ｄｌ）
平均値：
【００８４】
【表６】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、体液、細胞及び組織中のリパーゼ及び／又はホスホリパーゼ酵素を阻害又は軽減するタンパク質及びその組成物に関する。本発明に記載のタンパク質及びその組成物は、体液、細胞及び組織中のリパーゼ及びホスホリパーゼ酵素活性がもたらす臨床的な症状発現及び疾患の予防又は治療に有用である。本発明は、体液、細胞及び組織中のリパーゼ及び／又はホスホリパーゼ酵素の阻害剤であるタンパク質の分離、精製、特徴付けに関する。本発明は、トリプシン不活化に対して精製タンパク質の安定な組成物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
（先行技術の説明）
リパーゼ及びホスホリパーゼは、哺乳動物の代謝の重要な制御要素である。これらは他の代謝酵素クラスとは区別される共通の特徴を数多く共有しており、中でも最も重要なのが、これらの「二次元」基質、即ち、脂肪の小滴、リポタンパク質、リン脂質層、生体膜との結合であり、結果として開裂機序及び調節に影響を及ぼしている。
【０００３】
膵リパーゼ（ＰＬ）は、トリグリセリドを部分的に加水分解し、胆汁酸と共に複合体を形成し、腸粘膜を経て吸収される脂肪酸とモノグリセリドとを得るのに効果的であると考えられている。肝リパーゼ（ＨＬ）及びリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）の２つは、循環血漿リポタンパク質中に存在するトリグリセリド及びリン脂質の加水分解を担う主な脂肪分解酵素である。何れのリパーゼも細胞表面プロテオグリカンを介して血管内皮に付着する。ＨＬは主にカイロミクロンレムナント、中間密度リポタンパク質及び高密度リポタンパク質の代謝に関与しているのに対して、ＬＰＬはカイロミクロン及び超低密度リポタンパク質からのトリグリセリドの加水分解を触媒する。こうした脂肪分解酵素としての従来の機能に加えて、ＨＬ及びＬＰＬは、細胞表面受容体及び／又はプロテオグリカンへのリポタンパク質の相互作用を媒介するリガンドとして働くようである。
【０００４】
肝臓外の部位でのトリグリセリドリッチリポタンパク質結合脂肪酸の蓄積及び分布はＬＰＬにより促進される。この酵素は又、全リポタンパク質粒子及び親油性ビタミンの細胞の取り込みを含めた幾つかの非脂肪分解に関連する機能に関与している。種々の脂質障害、肥満及びアテローム硬化症の病因には、ＬＰＬ発現の組織特異的な変異が関わっている。血管壁の細胞、特にマクロファージにより発現したＬＰＬには、泡沫細胞形成及びアテローム硬化症の促進に寄与する酵素の作用が更に確認された。コレステロールエステル転移タンパク質及びリポタンパク質リパーゼ系に特異的に作用する薬剤の開発が進められている。
【０００５】
過去数年間にわたり、ＨＬ及びＬＰＬがリポタンパク質代謝及びｉｎ ｖｉｖｏのアテローム硬化症の発症を調節する新規の代替機序についての本発明者の理解において大きな進歩を遂げた。又、トリグリセリドリッチリポタンパク質の血管内代謝についての本発明者等の理解にも進歩が見られた。今では、トリグリセリドリッチリポタンパク質結合アポリポタンパク質Ｅ、リポタンパク質リパーゼ及び肝リパーゼと、ヘパラン硫酸プロテオグリカン及びリポタンパク質受容体との複雑な細胞外相互作用が、トリグリセリドリッチリポタンパク質の肝細胞内への取り込みを促進することが知られている。最近の研究では、取り込まれたトリグリセリドリッチリポタンパク質の細胞内運命が極めて複雑であることも明らかになった。細胞内エンドソーム区画内部のトリグリセリドリッチリポタンパク質成分の単離には、アポリポタンパク質Ｅの再循環が含まれるのに対して、アポリポタンパク質Ｂと結びついている残りの脂質コアは、リソソームによる分解の影響を受けやすい。
【０００６】
糖尿病患者におけるアテローム硬化症の高い発症率は、マクロファージのＬＰＬ活性と相関している。多くの証拠が集まったことにより、血管壁でマクロファージがＬＰＬを生成すると、病変内部では脂質の蓄積が促進され、アテローム硬化症の発症が助長される場合があることが示唆されている。
【０００７】
代謝症候群及び心臓血管障害を治療する薬剤標的としてのリパーゼの可能性がますます認められている。現在、脂質の吸収及び代謝に関する疾患の最先端療法は、体液、細胞及び組織のリパーゼ活性を阻害又は軽減すべきであると考えられている。
【０００８】
リパーゼ阻害剤は、種々の天然産物、特に微生物供給源に由来するものが報告されている。このような阻害剤の例には、トリグリセリド及びコレステロールエステルの加水分解を阻害するストレプトマイセス種由来のリプスタチン及びパンクリシンＡ−Ｅ又はこれらの合成誘導体が含まれており（Ｈｏｃｈｕｌｉら、Ｌｉｐｓｔａｔｉｎ，ａｎｄ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｌｉｐａｓｅ，Ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｔｏｘｙｔｒｉｃｉｎｉ，ＩＩ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｅｌｕｃｉｄａｔｉｏｎ，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．（Ｔｏｋｙｏ），１９８７ Ａｕｇ．，４０（８）：１０８６−９１；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら、Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｌｉｐｓｔａｔｉｎ，ａ Ｌｉｐａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｏｎ Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｏｆ Ｆａｔ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｒａｔ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１９８９ Ｆｅｂ．２０，１００１（３）：２４９−５５；Ｙｏｓｈｉｎａｒｉら、Ｐａｎｃｌｉｃｉｎｓ，Ｎｏｖｅｌ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｌｉｐａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，ＩＩ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｅｌｕｃｉｄａｔｉｏｎ，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．（Ｔｏｋｙｏ），１９９４ Ｄｅｃ．，４７（１２）：１３７６−８４）、肥満の治療に使用されている（特許文献１）。しかも、幾つかの分子がＣａｓｓｉａ ｎｏｍａｍｅから分離したタンニンを含む植物供給源から同定されている（特許文献２）。ＬＰＬはアテローム硬化症の病因に関与していることが明らかにされている（Ｍｅａｄら、Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｐａｓｅ，ａ Ｋｅｙ Ｒｏｌｅ ｉｎ Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ？，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９９ Ｎｏｖ．２６，４６２（１−２）：１−６）。ＬＰＬの阻害はアテローム硬化の進行を予防すると考えられている（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎら、Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｐａｓｅ Ｍｅｄｉａｔｅｓ ｔｈｅ Ｕｐｔａｋｅ ｏｆ Ｇｌｙｃａｔｅｄ ＬＤＬ ｉｎ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ，Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ，ａｎｄ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，５０，１６４３−１６５３，２００１）。
【０００９】
ホスホリパーゼは、膜リン脂質に特異的に作用して加水分解し、シグナル伝達及び炎症プロセスに関わるメディエーターを産生する。アラキドン酸の産生では、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）の役割は周知であり、ロイコトリエン及びプロスタグランジン合成を担っている。ＰＬＡ２阻害剤は、種々の炎症性疾患及び変性疾患の薬剤として提唱されている。リポタンパク質関連ホスホリパーゼＡ２がアテローム硬化症に関与することが明らかにされており、アテローム硬化症の治療のためにリポタンパク質関連ホスホリパーゼＡ２を阻害することが提唱されている（Ｌｅａｃｈら、Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＰＬＡ２ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ−Ａ Ｎｏｖｅｌ，Ｎｏｎ−Ｌｉｐｉｄ Ｌｏｗｅｒｉｎｇ Ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｆａｒｍａｃｏ，２００１ Ｊａｎ−Ｆｅｂ，５６（ｌ−２）：４５−５０）。
【特許文献１】米国特許第５，５４０，９１７号明細書
【特許文献２】米国特許第５，６２９，３３８号明細書
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（要旨）
本発明は、体液、細胞及び組織中のリパーゼ及び／又はホスホリパーゼ酵素を阻害又は軽減するタンパク質、及び前記タンパク質を含む組成物に関する。本発明に記載のタンパク質及び前記タンパク質を含む組成物は、体液、細胞及び組織中のリパーゼ及び／又はホスホリパーゼ酵素活性がもたらす臨床的な症状発現及び疾患の予防又は治療に有用である。
【００１１】
好ましい実施形態において、リパーゼ及び／又はホスホリパーゼ阻害活性を有するタンパク質は、組換え技術により合成、生成するか又は天然の供給源から分離することができる。
【００１２】
最も好ましい実施形態において、タンパク質は、Ｍｏｒｉｎｇａ属に属する植物種の種子から分離される。
【００１３】
好ましい実施形態において、タンパク質は、簡潔で、効果的であり、費用効率が高いプロセスにより精製される。
【００１４】
最も好ましい実施形態において、タンパク質は、トリプシン阻害剤と合わせることによりトリプシン不活化から保護される。
【００１５】
好ましい実施形態において、リパーゼ及び／又はホスホリパーゼを阻害するための組成物は、本発明に記載のタンパク質の治療有効量及び薬学的に不活性なアジュバント、希釈剤又は担体を含む。
【００１６】
好ましい実施形態において、本発明に記載のタンパク質を含むリパーゼ及び／又はホスホリパーゼを阻害するための組成物は、他の有効成分と合わせられ得る。
【００１７】
本発明に記載のタンパク質又は前記タンパク質を含む組成物は、生理的条件下でリパーゼ及び／又はホスホリパーゼを阻害する能力があると考えられており、それによって代謝症候群、心臓血管障害及び炎症性疾患の予防又は治療に即した有効性があると考えられる。
【００１８】
好ましい実施形態において、本発明に記載のタンパク質又はタンパク質を含む組成物は、代謝症候群、心臓血管障害及び炎症性疾患の予防及び治療のために、体液、細胞及び組織中のリパーゼ及び／又はホスホリパーゼを阻害するのに有用である。
【００１９】
別の実施形態において、本発明に記載のタンパク質又はタンパク質を含む組成物は、肥満、糖尿病及びアテローム硬化症のような代謝障害の予防又は治療に使用することができる。
【００２０】
更に別の実施形態において、本発明に記載のタンパク質又はタンパク質を含む組成物は、単球系細胞、血管細胞、肝細胞及び脂肪組織に脂質が蓄積するのを阻害又は軽減するのに使用することができる。
【００２１】
更に別の実施形態において、本発明に記載のタンパク質又はタンパク質を含む組成物は、ホスホリパーゼの活性化及び／又は作用によって引き起こされる関節炎、アテローム硬化症及び敗血症性ショック等の炎症性疾患の予防又は治療に使用することができる。
【００２２】
更に別の実施形態において、本発明に記載のタンパク質又はタンパク質を含む組成物は、皮膚及び頭髪の手入れ用及び美容調製物（ｃｏｓｍｅｔｉｃ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）のために使用することができる。
【００２３】
更に別の実施形態において、本発明に記載のタンパク質又はタンパク質を含む組成物は、リパーゼ及び／又はホスホリパーゼを分泌する微生物病原体によって引き起こされる細胞及び組織の損傷の予防又は治療に使用することができる。
【００２４】
リパーゼの阻害特性に基づく更に別の実施形態において、タンパク質を含む組成物は、体液、細胞及び組織中のリパーゼ及び／又はホスホリパーゼ活性によって引き起こされるか、または悪化させる疾患を治療及び予防する動物薬において使用することができる。
【００２５】
好ましい実施形態において、本発明は、代謝症候群、心臓血管障害及び炎症性疾患を予防及び治療するための体液、細胞及び組織中のリパーゼ及び／又はホスホリパーゼの阻害に有用な、タンパク質を単独でか、又は薬学的に許容される適切なアジュバントを含む薬学的処方物も提供する。
【００２６】
好ましい実施形態において、本発明は、トリプシン阻害から保護するための安定したタンパク質の送達にも関する。好ましい実施形態において、本発明は、分離したタンパク質の経口送達も提供する。
【００２７】
本発明は又、本発明に記載のタンパク質の治療有効量を単独でか、又は薬学的に許容されるアジュバントと組み合わせて医薬品を製造する方法も提供する。本発明に記載のタンパク質は、他の有効成分と合わせられ得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
（本発明の説明）
本発明は、５〜１００個のアミノ酸残基を含有し、分子量が０．５〜１０ｋＤの範囲であり、グリコシル化を有するかまたは有さないタンパク質に関する。このタンパク質は、リパーゼ及び／又はホスホリパーゼの酵素活性に対する阻害作用又は軽減作用を有する。このタンパク質は組換えＤＮＡ技術により合成又は生成される場合もあれば、植物材料から分離される場合もある。
【００２９】
本発明に開示されるタンパク質は、Ｍｏｒｉｎｇａ属に属する種から分離され、更に好ましくはＭｏｒｉｎｇａ植物の種子から分離される。このタンパク質は、本明細書の以下の実施例に開示する方法により分離することができる。次に、分離したタンパク質は、適切な技術により精製される。次に、精製タンパク質は、以下の配列について、ＳＤＳ ＰＡＧＥ及びＬＣ−ＭＳ技術によって特徴付けられる。
【００３０】
上記タンパク質は、以下の配列番号１：ＣＧＱＱＬＲＮＩＳＰＰＱＲＣＰＳＬＲＱＡＶＱＬＡＨＱＱＱＧＱＧＰＱＱＶＲＱＭＹＲの部分的な配列番号を有する。
【００３１】
更に、このタンパク質を、リパーゼ阻害活性について合成基質及び天然基質の存在下で試験した。
【００３２】
トリプシン存在下で、Ｍｏｒｉｎｇａ種子タンパク質の活性について前記タンパク質を更に解析した。
【００３３】
Ｍｏｒｉｎｇａ種子タンパク質は、トリプシン存在下ではリパーゼ阻害活性を失うことが明らかにされた。そこで、トリプシン不活化に対するタンパク質保護に関する試験を実施した。トリプシン阻害剤の存在下では、このタンパク質がリパーゼ阻害剤として有効であることが明らかにされた。
【００３４】
本発明のリパーゼ／ホスホリパーゼ阻害剤との組み合わせのために、天然に存在するトリプシン阻害剤の内、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、ライマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｌｉｍｅｎｓｉｓ）、Ｐｒｏｓｏｐｉｓ ｊｕｌｉｆｉｏｒａの種子、ヒマワリ種子（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｓ）等及びこれらの組み合わせを選択した。ダイズタンパク質存在下で、リパーゼ阻害についてタンパク質を試験した。
【００３５】
本発明は、本発明に記載のタンパク質の治療有効量及び薬学的に不活性なアジュバント、希釈剤又は担体を含む、リパーゼ及び／又はホスホリパーゼを阻害するための組成物にも関する。本発明に記載のタンパク質を含む、リパーゼ又はホスホリパーゼを阻害するための組成物は又、別の有効成分と合わせられ得る。
【００３６】
本発明に記載のタンパク質又は前記タンパク質を含む組成物は、生理的条件下でリパーゼ及び／又はホスホリパーゼを阻害する能力を有すると考えられており、それによって代謝症候群、心臓血管障害及び炎症性疾患の予防又は治療に即した有効性があると考えられる。
【００３７】
本発明に記載のタンパク質又はタンパク質を含む組成物は、代謝症候群、心臓血管障害及び炎症性疾患を予防及び治療するために、体液、細胞及び組織中のリパーゼ及び／又はホスホリパーゼを阻害するのに有用である。
【００３８】
好ましい実施形態において、本発明に記載のタンパク質又はタンパク質を含む組成物は、肥満、糖尿病及びアテローム硬化症のような代謝障害の予防又は治療に使用することができる。
【００３９】
更なる態様において、本発明に記載のタンパク質又はタンパク質を含む組成物は、単球系細胞、血管細胞、肝細胞及び脂肪組織に脂質が蓄積するのを阻害又は軽減するのに使用することができる。
【００４０】
更に他の態様において、本発明に記載のタンパク質又はタンパク質を含む組成物は、ホスホリパーゼの活性化及び／又は作用によって引き起こされる関節炎、アテローム硬化症及び敗血症性ショック等の炎症性疾患の予防及び治療に使用することができる。
【００４１】
更に別の態様において、本発明に記載のタンパク質又はタンパク質を含む組成物は、リパーゼ及び／又はホスホリパーゼを分泌する微生物病原体によって引き起こされる細胞及び組織の損傷を予防又は治療するために使用することができる。
【００４２】
更に別の態様において、本発明に記載のタンパク質又はタンパク質を含む組成物は、皮膚及び頭髪の手入れ用及び美容調製物のために使用することができる。
【００４３】
本発明に記載のタンパク質又は前記タンパク質を含む組成物は、従来の任意の経口、頬側、鼻内、単位投薬形態の吸入スプレーによってか、非経口（例えば、静脈内、筋肉内、皮下、胸骨内（ｉｎｔｒａｓｔｅｍａｌ）又は注入技術による）、局所（例えば、粉末、軟膏又はドロップ）、経皮、槽内、膣内、腹腔内、膀胱内又は直腸に投与することができる。本発明の別の態様において、本発明の化合物及び少なくとも１つの他の薬学的に活性な因子を、個別に投与する場合もあれば、両方を含む薬学的組成物で投与する場合もある。このような投与には、一般的に経口が好まれる。しかし、治療されている患者が嚥下することができないか、経口投与が困難であるか望ましくなければ、非経口又は経皮投与が妥当な場合がある。
【００４４】
本発明に記載のタンパク質又は前記タンパク質を含む組成物は、任意の改変放出処方物、制御放出処方物又は持続放出処方物の形態で投与することができる。
【００４５】
従って、体液、細胞及び組織中のリパーゼ及び／又はホスホリパーゼ活性を軽減するための本発明にしたがう処方物は、必須有効成分として、本発明のタンパク質を含む。
【００４６】
好ましい実施形態において、本発明は、体液、細胞及び組織中のリパーゼ及び／又はホスホリパーゼ活性を軽減するための、本発明のタンパク質を含む処方物を提供し、このタンパク質は、単独でか、或いは既知の薬学的に許容される不活性なアジュバント、希釈剤又は担体と組み合わせて処方され得る。
【００４７】
本発明によるタンパク質を含む処方物は、１つ以上の常用添加剤、担体、助剤等と共に配合することができる。これは、経口投与用に配合することができ、医薬分野で使用することができる。経口投与に適切な形態の例には、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、球状体、シロップ剤及び飲料が挙げられる。好ましい実施形態において、これは球状体の形態で処方される。最も好ましい実施形態において、この球状体は腸溶性コーティングされる。
【００４８】
適切な担体材料の例は、水、ゼラチン、アラビアゴム、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、植物油、ポリアルキレングリコール、ワセリン等である。薬学的処方物は、固体形態（例えば、錠剤、糖衣剤、坐剤又はカプセル剤として）又は液体形態（例えば、溶液、懸濁物又はエマルジョンとして）で調合され得る。医薬調製物は滅菌される場合もあれば、保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧を変えるための塩又は緩衝剤等のアジュバントを含有する場合もある。これらは治療上価値がある物質を含有することができる。
【００４９】
本発明による処方物を調製するため、必須成分は、１つ以上の薬学的に許容されるビヒクル、担体、賦形剤、結合剤、防腐剤、酸化防止剤、安定化剤、矯味剤、緩衝剤等と混合され、続いて所望の単位投薬形態に形成される。
【００５０】
本発明にしたがう処方に際して、錠剤、カプセル剤等に混合することができるアジュバントの例には、アラビアゴム、コーンスターチ及びゼラチン等の結合剤、ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、結晶セルロース等の賦形剤、α化デンプン及びアルギン酸等の膨潤剤、ショ糖、ラクトース及びサッカリン等の甘味剤及びペパーミント及びチェリー等の矯味剤が挙げられる。カプセル剤への処方に際して、油等の液体担体も上述のアジュバントと共に混合することができる。
【００５１】
更に、コーティング剤としてか、或いは調製物の物理的形態を変えるために、他の材料を加えることもできる。例えば、錠剤は、シュラック、糖又は任意の酸性ｐＨ耐性ポリマーでコーティングすることができる。シロップ剤及びエリキシル剤は、甘味剤としてショ糖を、防腐剤としてメチルパラベン又はプロピルパラベンを、及び／又は矯味剤としてペパーミント又はオレンジ風味を共に添加することができる。
【００５２】
本発明によれば、上記処方物は、総血清脂質コレステロールを下げる医薬として、そして肥満、虚血性心疾患、動脈硬化症、脳血管性痴呆、糖尿病、血管障害性パーキンソン病、炎症性疾患等の治療のために使用することができる。
【００５３】
本発明に記載の処方物は、乾燥重量に換算して約１０〜２０００ｍｇ／日の量で１日１回又は数回投与してもよい。
【００５４】
本発明による処方物の有効成分は、血清脂質レベル又は血中総コレステロールレベル或いは組織中の脂肪の蓄積を軽減するために種々の食物に添加することができる。本発明による有効成分を添加することができる食物の例には、茶飲料、ジュース、コーヒー、飲料、炭酸飲料、チューイングガム、キャンディー、キャラメル、チョコレート及びアイスクリームが挙げられる。
【００５５】
更なる態様において、本発明に記載のタンパク質又はこのタンパク質を含む組成物は、動物の体液、細胞及び組織中のリパーゼ及び／又はホスホリパーゼ活性によって引き起こされるか、または悪化される疾患を治療及び予防するための動物薬として有用な場合がある。
【００５６】
本発明は更に、上記タンパク質を含む処方物の投与により体液、細胞及び組織中のリパーゼ及び／又はホスホリパーゼ活性を阻害又は軽減するための方法にも関する。本発明は、本明細書で以下に開示する特異的な酵素検定を使用した、このタンパク質がリパーゼ及び／又はホスホリパーゼの強力な阻害剤であるという本発明者等の発見に基づく。更に、本発明は、処方の間、このタンパク質が安定なままであり、それによってこのタンパク質の活性が維持されるという本発明者等の観察にも基づく。ｉｎ ｖｉｔｒｏの結果を確認した後、そのリパーゼ活性について動物試験を実施した。
【００５７】
本発明の更なる態様及び特徴を、以下の非限定的な実施例に例示する。
【実施例】
【００５８】
（実施例１）
Ｍｏｒｉｎｇａ種子からのリパーゼ阻害タンパク質の分離
粉末状にした種子１００ｇｍを、ＭＱ水１リットルに室温にて４８時間浸漬した。その抽出液をＷｈａｔｍａｎ濾紙で濾過した。凍結乾燥器（−５０℃）を使用して濾液を２日間濃縮し、適切な技法で精製したタンパク質単離物を得た。Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を使用してタンパク質を評価した。
【００５９】
結果：粉末１０ｍｇには、タンパク質が４９４μｇ含まれていた。
【００６０】
（実施例２）
分離したタンパク質の精製
Ｍｏｒｉｎｇａ種子の粉末試料を水に浸漬した。抽出液を濾過した後、清澄な抽出液を０．１Ｍリン酸緩衝液（１：１）と混合した。次に、その溶液を遠心分離し、上清を回収して、室温にて３０分間アセトン沈殿（冷アセトン）に供した。得られた溶液を遠心分離し、沈殿物を回収してｐＨ８．０の０．１Ｍリン酸緩衝液に溶解した。この溶液をよく混合してＴＣＡ沈殿に供した。その溶液を再び遠心分離した。最後に、粘着性のある沈殿物をｐＨ８．０の０．１Ｍリン酸緩衝液に撹拌することによって溶解した。次に、上のタンパク質溶液をゲル濾過クロマトグラフィーで精製し、５０ｍＭ、ｐＨ８．０のリン酸緩衝液で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０カラムを使用して純粋なタンパク質を得た。Ｂｒａｄｆｏｒｄマイクロプレート検定により、回収した画分のタンパク質活性について検討し、タンパク質の純度を、クマシーブリリアントブルーで染色した１７％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｌａｅｍｍｌｉ，１９７０）ゲルで泳動（ｒｕｎ）することによって確認した。
【００６１】
（実施例３）
タンパク質の特徴付け
Ｍｏｒｉｎｇａ種子から分離したタンパク質を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１７％）を実行し、クマシーブルーで染色した。５＋／−１ｋＤバンドを切り出し、シリコン処理したチューブに移して５０％メタノール２００μＬで一晩洗浄、脱色した。ゲル片をアセトニトリル中で脱水し、０．１Ｍ炭酸水素アンモニウム中の１０ｍＭジチオールスレイトール３０μＬで再水和し、室温にて０．５時間還元した。ＤＴＴ溶液を除去し、０．１Ｍ炭酸水素アンモニウム中の５０ｍＭヨードアセトアミド３０μＬで、試料を室温にて０．５時間アルキル化した。試薬を除去し、アセトニトリル１００μＬ中でゲル片を脱水した。アセトニトリルを除去し、０．１Ｍ炭酸水素アンモニウム１００μＬ中でゲル片を再水和した。その断片をアセトニトリル１００μＬ中で脱水し、アセトニトリルを除去して、真空遠心分離により断片を完全に乾燥させた。氷上の５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム中の２０ｎｇ／μＬトリプシンで、ゲル片を１０分間再水和した。余分なトリプシン溶液を除去し、５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム２０μＬを添加した。試料を３７℃にて一晩消化し、ポリアクリルアミドから形成されたペプチドを５０％アセトニトリル／５％ギ酸の３０μＬアリコート２つで抽出した。これらの抽出液を合わせて、ＭＳ分析のために２５μＬまで蒸発させた。
【００６２】
Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＬＣＱイオントラップ型質量分析計装置と、Ｐｒｏｔａｎａナノスプレーイオン源を、自己充填式８ｃｍ×内径７５μｍ Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ １０μｍ Ｃ１８逆相キャピラリーカラムで接続して、ＬＣ−ＭＳ装置を構成した。抽出液を０．５〜５μＬ容量注入し、流速０．２５μＬ／分で、アセトニトリル／０．１Ｍ酢酸勾配によりペプチドをカラムから溶出した。ナノスプレーイオン源を２．８ｋＶで操作した。フルスキャン質量スペクトルを取得する機器の倍化動作（ｄｏｕｂｌｅ ｐｌａｙ）能力を使用して、消化液を分析してペプチド分子量及びプロダクトイオンスペクトルを決定し、連続的なスキャンでアミノ酸配列を決定した。
【００６３】
以下に示す通り、タンパク質の部分的な配列番号を確認した。
ＣＧＱＱＬＲＮＩＳＰＰＱＲＣＰＳＬＲＱＡＶＱＬＡＨＱＱＱＧＱＧＰＱＱＶＲＱＭＹＲ
（実施例３）
合成基質の存在下におけるＭｏｒｉｎｇａ種子タンパク質のリパーゼ阻害活性
リパーゼ検定
膵リパーゼを使用するという変更を伴って、Ｗｉｎｋｌｅｒ ａｎｄ Ｓｔｕｃｋｍａｎｎ，１９７９に記載の方法により酵素検定を実施した。９６ウェル形式を使用して検定を計画した。この検定で使用した基質はパルチミン酸ｐ−ニトロフェノール（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｎ−２７５２）であった。パルチミン酸ｐ−ニトロフェノール４．５ｍｇをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｄ−４５５１）２００μＬ中に溶解し、容積をＰｈ８．０の０．１Ｍリン酸緩衝液で１０ｍＬとした。０．１Ｍ−リン酸緩衝液中で、酵素を５ｍｇ／ｍＬ濃度で溶解することによりリパーゼ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｌ−３１２６）試料を調製した。反応混合物は基質溶液−１５０μＬ、リン酸緩衝液（ｐＨ８．０、０．１Ｍ）−４０μＬ及びリパーゼ溶液−１０μＬからなった。反応混合物を３７℃にてインキュベートし、インキュベート後に光学密度を４０５ｎｍで測定した。酵素活性を国際単位（ＩＵ）の形で表した。標準的な検定条件下で、基質（パルチミン酸ｐ−ニトロフェノール）／ｍＬ／分から遊離フェノール１ｎｍを放出する量をリパーゼの１酵素単位と定義した（Ｗｉｎｋｌｅｒ Ｋ．Ｗ．ａｎｄ Ｓｔｕｃｋｍａｎ Ｍ，１９７９ Ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｈｙａｌｕｒｏｎａｔｅ ａｎｄ ｓｏｍｅ ｏｔｈｅｒ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｇｒｅａｔｌｙ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｏｌｉｐａｓｅ ｂｙ Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ，Ｊ．ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １３８：６６３−６７０）。これはｐ−ニトロフェノールの標準グラフから導き出したものである。
【００６４】
Ｍｏｒｉｎｇａ種子タンパク質によるリパーゼ阻害
阻害検定を用量依存的な様式で実施した。タンパク質の濃度は、４０μｇ〜０．１５６μｇ／ｍＬ反応混合物と照合した。検定は、対照のリン酸緩衝液の代わりに阻害剤溶液４０μＬを使用したことを除き、上に記載した検定とほぼ同じであった。放出したｐ−ニトロフェノールを４０５ｎｍで記録した。単純に国際単位（ＩＵ）の変化に基づいて、阻害率換算で酵素阻害を表したが、これは標準グラフから算出したものである。
【００６５】
結果：
（表−１）
【００６６】
【表１】
結論：Ｍｏｒｉｎｇａタンパク質は、極めて低い濃度でも膵リパーゼを阻害することができた。
【００６７】
（実施例４）
天然基質の存在下におけるＭｏｒｉｎｇａ種子タンパク質の阻害活性
Ｉｓｈｉｉａ Ｃら、１９８８，Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｐａｓｅ ｂｙ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，Ｎｉｐｐｏｎ Ｓｈｏｋｕｈｉｎ Ｋｏｇｙｏ Ｇａｋｋａｉｓｈｉ，３５（６），４３０−４３９の変法にしたがうことにより、反応混合物中に遊離した遊離脂肪酸を滴定することによりリパーゼ活性を測定した。試験管内で、３７℃にて３０分間振盪させて反応を実施した。反応混合物を、ｐＨ−７．０のＭｃｌｌｖａｉｎｅ緩衝液１．５ｍＬ、オリーブオイル０．２４ｍＬ及び阻害剤溶液０．５ｍＬで調製し、水を入れて最終容積を５．５ｍＬとした。５分間のプレインキュベーション後、酵素溶液０．５ｍＬ（５．０ｍｇ）を添加して反応を開始した。次に、ｎ−プロピルアルコール：石油エーテル（１：４）の混合溶液１０ｍＬを添加して反応を停止し、次に混合物を２分間勢いよく振盪した。上層を１ｍＬピペットで取り、指示薬としてフェノールフタレインを使用して０．０２Ｍのアルコール性ＫＯＨで滴定した。阻害剤溶液を緩衝液に置き換えたことを除き、標準反応混合物を、記載したように調製した。標準検定条件下でμＭ／分放出した脂肪酸を酵素の１国際単位（ＩＵ）とみなした。
【００６８】
結果：
（表−２）
【００６９】
【表２】
結論：Ｍｏｒｉｎｇａ種子タンパク質は、天然基質であるオリーブオイルを加水分解している間に、膵リパーゼを阻害することができた。
【００７０】
（実施例５）
Ｍｏｒｉｎｇａ種子タンパク質のリパーゼ阻害活性に対するトリプシンの影響
Ｍｏｒｉｎｇａ種子タンパク質のトリプシン開裂後に、リパーゼ阻害活性を実施した。分離したタンパク質（５００μｇ／ｍＬ Ｂｒａｄｆｏｒｄ法により評価した）を、ｐＨ−９．０の５０ｍＭトリス緩衝液中のトリプシン（０．５％）及び試料緩衝液と共に１：１：２の割合で、３７℃にて２４時間インキュベートした。インキュベーション後、全試料を７０℃にて１０分間熱失活させた。対照におけるリン酸緩衝液の代わりに試験溶液（トリプシン処理済／未処理）４０μＬを使用したことを除き、先に記載の通りリパーゼ阻害検定を実施した。放出したｐ−ニトロフェノールを４０５ｎｍで記録した。単純に国際単位（ＩＵ）の変化に基づいて、阻害率換算でリパーゼ活性を表したが、これは標準グラフから算出したものである。
【００７１】
結果：トリプシン開裂後に、Ｍｏｒｉｎｇａ種子タンパク質がリパーゼ阻害活性を失ったことが観察されたが、これはタンパク質にリパーゼ阻害活性が存在することを示唆するものである。
【００７２】
（表−３）
【００７３】
【表３】
（実施例６）
ダイズタンパク質を用いての、トリプシンからのＭｏｒｉｎｇａ種子タンパク質の保護
安定した形態でＭｏｒｉｎｇａ種子タンパク質を存在させるためには、トリプシン阻害からこのタンパク質を保護することが必須であった。それゆえ、保護のためにダイズタンパク質を選択した。
【００７４】
ダイズ種子からのダイズタンパク質の分離
２リットルのガラスビーカー内で、ダイズ種子５００ｇｍとＭｉｌｌｉ Ｑ水１．５リットルとを装填し、水浴でビーカーを６５℃にて（外部温度）９０分間加熱した。９０分後、ダイズ種子抽出液を濾過し室温に冷却した。凍結乾燥器（−５０℃）を使用して濾液を２日間濃縮した。粗タンパク質が丸底フラスコの壁面に張り付き、これを、スパチュラを使用して擦過し粉末を細かくした。得られた総固体粉末タンパク質は１２．５ｇｍであり、吸湿性を備えていた。Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を使用してタンパク質を評価した。
【００７５】
結果：固体１０ｍｇにはタンパク質が１８．５２μｇ含有されていた。
【００７６】
タンパク質保護検定
種々の濃度のダイズタンパク質を使用して、トリプシンからＭｏｒｉｎｇａ種子タンパク質を保護することを実施した。Ｍｏｒｉｎｇａ種子タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ法による評価で４９．１μｇ／１００μＬ）を、トリプシン（０．５％）溶液１００μＬ及びｐＨ−９．０、５０ｍＭの緩衝液中の種々の濃度のダイズタンパク質１００μＬ及び試料緩衝液と共に１：１：１：１の比で、３７０℃にて２４時間インキュベートした。インキュベーション後、全試料を７０℃にて１０分間熱失活させた。対照におけるリン酸緩衝液の代わりに試験溶液（処理済／未処理）４０μＬを使用したことを除き、先に記載の通り検定を実施した。放出したｐ−ニトロフェノールを４０５ｎｍでのＯＤとして記録した。単純に国際単位（ＩＵ）の変化に基づいて、阻害率換算でリパーゼ活性を表したが、これは標準グラフから算出したものである。
【００７７】
（表−４）
【００７８】
【表４】
（実施例７）
タンパク質の組成物
Ｍｏｒｉｎｇａ種子タンパク質（５０．０ｇｍｓ）、微結晶性セルロース（３３６．０ｇｍｓ）及びラクトース（８４．０ｇｍｓ）を個別に４０＃を通過させ、適切なミキサー内で１５分間幾何学的（ｇｅｏｍｅｔｒｉｃａｌ）に撹拌した。トウモロコシデンプン（３０．０ｇｍｓ）と必要量の水を使用して、１０％デンプンペーストを調製した。ミキサーにデンプンペーストを加え、押し出しに適切な粘稠度の生地が形成されるまで混合を続けた。０．８ｍｍ放射状スクリーンを装着したＦｕｊｉ Ｐａｕｄａｌ ＥＸＤＳ−６０押し出し機内に、生地混合物を装填した。乾燥オーブンを使用して、押し出された生地（ｅｘｔｒｕｄｅ）を４０℃にて８時間乾燥させた。Ｆｕｊｉ Ｐａｕｄａｌ Ｑ２３０を使用して球状体化し、これらを４０℃にて一晩乾燥させる。乾燥した球状体を篩いにかけ、２４番を通過し、メッシュｎ０．４０上に保持された球状体を更に加工した。
【００７９】
１）密封（ｓｅａｌ）コーティング、２）腸溶性コーティングの２つの工程でコーティングを行った。
【００８０】
フィルム形成ポリマーとしてＨＰＭＣを使用することにより密封コーティングを行い、腸溶性ポリマーとしてＥｕｄｒａｇｉｔ Ｌ３０Ｄ５５を、着色剤として黄色酸化鉄を補って腸溶性コーティングを行った。サイズ０の透明な硬ゼラチンカプセルに、球状体を充填した。Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を使用して、コーティングした球状体並びに充填カプセルに関するｉｎ−ｖｉｔｒｏタンパク質分析を行った。
【００８１】
分析データ：
（表−５）
【００８２】
【表５】
試料Ａ＊＝球状体試料
試料Ｂ＊＊＝充填カプセル試料
グラフには濃度に対する吸光度をプロットした
Ｒ＝０．９５０４５８
得られた方程式：Ｙ＝１．１３６１６×Ｘ＋０．０６８２６８１
式中、Ｙは吸光度であり、Ｘは濃度（μｇ／μＬ）である
計算結果：
試料Ａ＊＝０．３９９０μｇ／μＬ
試料Ｂ＊＊＝０．３６６８μｇ／μＬ
上述のデータから、処方プロセス中は、タンパク質は破壊されていないことが推測できる。
【００８３】
（実施例８）
動物試験
４群のＷｉｓｔａｒ雄ラットにおいて、Ｍｏｒｉｎｇａ種子タンパク質にダイズタンパク質（先に分離した）を添えたものと添えないものを用いて、短期動物実験を実施した。雄Ｗｉｓｔａｒを一晩絶食させ、脂質エマルジョン（水中ヒマワリ油１０ｍＬ）１．２ｍＬ、あるいは脂質エマルジョン１．２ｍＬに、群ごとに定めた種々の処方物（群：対照、群１：Ｍｏｒｉｎｇａ固体抽出物５０ｍｇ（タンパク質２．５ｍｇ）、群２：タンパク質９２．６μｇを含有するダイズ固体抽出物５０ｍｇ及び群３：Ｍｏｒｉｎｇａ固体抽出物５０ｍｇ（タンパク質２．５ｍｇ）及びダイズ固体抽出物５０ｍｇ（タンパク質９２．６μｇ））をあわせてラットに経口投与した。血液試料を採取し、血漿トリアシルグリセロール濃度を決定した。
トリグリセリド濃度（ｍｇ／ｄｌ）
平均値：
【００８４】
【表６】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
５〜１００個のアミノ酸残基を含み、分子量が０．５〜１０ｋＤの範囲であり、グリコシル化を有するかまたは有さないタンパク質であって、リパーゼ及び／又はホスホリパーゼ酵素活性に対する阻害作用又は軽減作用を有する、タンパク質。
【請求項２】
前記タンパク質が、以下の配列番号１：ＣＧＱＱＬＲＮＩＳＰＰＱＲＣＰＳＬＲＱＡＶＱＬＡＨＱＱＱＧＱＧＰＱＱＶＲＱＭＹＲの部分的な配列番号を有する、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
天然の供給源から、又は合成経路により、或いは組換えＤＮＡ技術により分離される、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項４】
前記好ましい分離方法が天然の供給源からの分離である、請求項３に記載のタンパク質。
【請求項５】
前記天然の供給源が植物材料である、請求項４に記載のタンパク質。
【請求項６】
前記植物材料がＭｏｒｉｎｇａ種に由来する、請求項５に記載のタンパク質。
【請求項７】
前記タンパク質が、抽出、濾過、アセトン及びＴＣＡでの沈殿に続いて、ゲル濾過クロマトグラフィーの工程を含むプロセスにより精製される、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項８】
前記タンパク質がトリプシン阻害剤と合わせることによりトリプシン不活化から保護される、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項９】
前記トリプシン阻害剤が、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、ライマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｌｉｍｅｎｓｉｓ）、Ｐｒｏｓｏｐｉｓ ｊｕｌｉｆｌｏｒａ種子、ヒマワリ種子（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）及び／又はこれらの組み合わせから選択される、請求項８に記載のタンパク質。
【請求項１０】
前記好ましく選択されるトリプシン阻害剤が、ダイズタンパク質である、請求項９に記載のタンパク質。
【請求項１１】
体液、細胞及び組織中のリパーゼ及び／又はホスホリパーゼを阻害するためのタンパク質を治療有効量含む組成物であって、該タンパク質が、５〜１００個のアミノ酸残基を含み、且つ分子量が０．５〜１０ｋＤの範囲であり、グリコシル化を有するかまたは有さない、組成物。
【請求項１２】
肥満、糖尿病、アテローム硬化症又は別の代謝症候群を予防又は治療するためのタンパク質を含む組成物であって、該タンパク質が、５〜１００個のアミノ酸残基を含み、且つ分子量が０．５〜１０ｋＤの範囲であり、グリコシル化を有するかまたは有さない、組成物。
【請求項１３】
心臓血管障害を予防又は治療するためのタンパク質を含む組成物であって、該タンパク質が、５〜１００個のアミノ酸残基を含み、且つ分子量が０．５〜１０ｋＤの範囲であり、グリコシル化を有するかまたは有さない、組成物。
【請求項１４】
ホスホリパーゼの活性化及び／又は作用によって引き起こされる関節炎、アテローム硬化症、敗血症性ショック及び他の炎症性疾患を予防又は治療するためのタンパク質を含む組成物であって、該タンパク質が、５〜１００個のアミノ酸残基を含み、且つ分子量が０．５〜１０ｋＤの範囲であり、グリコシル化を有するかまたは有さない、組成物。
【請求項１５】
単球系細胞、血管細胞、肝細胞及び脂肪組織に脂質が蓄積するのを阻害又は軽減するためのタンパク質を含む組成物であって、該タンパク質が、５〜１００個のアミノ酸残基を含み、且つ０．５〜１０ｋＤの範囲の分子量を有し、グリコシル化を有するかまたは有さない、組成物。
【請求項１６】
リパーゼ及びホスホリパーゼを分泌する微生物病原体によって引き起こされる細胞及び組織の損傷を予防又は治療するためのタンパク質を含む組成物であって、該タンパク質が、５〜１００個のアミノ酸残基を含み、且つ０．５〜１０ｋＤの範囲の分子量を有し、グリコシル化を有するかまたは有さない、組成物。
【請求項１７】
タンパク質を含む皮膚及び頭髪の手入れ及び美容調製物のためのタンパク質を含む組成物であって、該タンパク質が、５〜１００個のアミノ酸残基を含み、且つ分子量が０．５〜１０ｋＤの範囲であり、グリコシル化を有するかまたは有さない、組成物。
【請求項１８】
体液、細胞及び組織中のリパーゼ及び／又はホスホリパーゼ活性によって引き起こされるか、または悪化される疾患を治療及び予防するための動物薬で使用するタンパク質を含む組成物であって、該タンパク質が、５〜１００個のアミノ酸残基を含み、且つ分子量が０．５〜１０ｋＤの範囲であり、グリコシル化を有するかまたは有さない、組成物。
【請求項１９】
前記タンパク質が、天然の供給源から、又は合成経路により、或いは組換えＤＮＡ技術により分離される、請求項１１〜１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記好ましいタンパク質分離方法が、天然の供給源からの分離である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記天然の供給源が植物材料である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記植物材料がＭｏｒｉｎｇａ種に由来する、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記タンパク質が、抽出、濾過、アセトン及びＴＣＡでの沈殿に続いて、ゲル濾過クロマトグラフィーの工程を含むプロセスにより精製される、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記タンパク質がトリプシン阻害剤と合わせることによりトリプシン不活化から保護される、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記トリプシン阻害剤が、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、ライマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｌｉｍｅｎｓｉｓ）、Ｐｒｏｓｏｐｉｓ ｊｕｌｉｆｌｏｒａの種子、ヒマワリ種子（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）及び／又はこれらの組み合わせから選択される、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記好ましく選択されるトリプシン阻害剤が、ダイズタンパク質である、請求項２５による組成物。
【請求項２７】
タンパク質を単独でか、又は既知の薬学的に許容され且つ不活性なアジュバント、希釈剤又は担体と組み合わせて含む処方物であって、該タンパク質が、５〜１００個のアミノ酸残基を含み、且つ分子量が０．５〜１０ｋＤの範囲であり、グリコシル化を有するかまたは有さない、処方物。
【請求項２８】
請求項１に記載のタンパク質を単独でか、又は少なくとも１つの追加の有効成分と組み合わせて含む処方物。
【請求項２９】
乾燥重量に換算して約１０〜２０００ｍｇ／日の量で１日１回又は数回投与され得る、請求項１に記載のタンパク質を含む処方物。
【請求項３０】
前記処方物が、経口、静脈内、鼻腔内及び経皮からなる群から選択される経路を介して投与されるように適合される、請求項２７に記載の処方物。
【請求項３１】
経口投与に適切な形態が、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、球状体、シロップ剤及び飲料を含み、更に好ましくは、球状体の形態である、請求項２７に記載の処方物。
【請求項３２】
前記処方物を、従来の投薬レジメンにしたがうことによって投与することができる、請求項２７に記載の処方物。
【請求項３３】
前記処方物を、任意の改変放出処方物、制御放出処方物又は持続放出処方物により投与することができる、請求項２７に記載の処方物。
【請求項３４】
体液、細胞及び組織中のリパーゼ及びホスホリパーゼを阻害するための方法であって、請求項１に記載のタンパク質の有効量を含む組成物を必要とする患者に投与する工程を含む、方法。
【請求項３５】
体液、細胞及び組織中のリパーゼ及びホスホリパーゼを阻害するための方法であって、請求項１に記載のタンパク質の有効量を含む組成物を必要とする患者に投与する工程を含む、方法。
【請求項３６】
体液、細胞及び組織中のリパーゼ及びホスホリパーゼを阻害する方法であって、請求項１に記載のタンパク質の有効量を含む組成物を必要とする患者に投与する工程を含む、方法。
【請求項３７】
単球系細胞、血管細胞、肝細胞及び脂肪組織に脂質が蓄積するのを阻害又は軽減するための方法であって、請求項１に記載のタンパク質の有効量を含む組成物を必要とする患者に投与する工程を含む、方法。
【請求項３８】
肥満、糖尿病、アテローム硬化症又は別の代謝症候群を予防又は治療するための方法であって、請求項１に記載のタンパク質の有効量を含む組成物を必要とする患者に投与する工程を含む、方法。
【請求項３９】
ホスホリパーゼの活性化及び／又は作用によって引き起こされる関節炎、敗血症性ショック及び他の炎症性疾患を予防又は治療するための方法であって、請求項１に記載のタンパク質の有効量を含む組成物を必要とする患者に投与する工程を含む、方法。
【請求項４０】
リパーゼ及びホスホリパーゼを分泌する微生物病原体によって引き起こされる細胞及び組織の損傷を予防又は治療するための方法であって、請求項１に記載のタンパク質の有効量を含む組成物を必要とする患者に投与する工程を含む、方法。
【請求項４１】
実施例を参照して実質的に本明細書に記載された上記の請求項に記載の、体液、細胞及び組織中のリパーゼ及び／又はホスホリパーゼを阻害するためのタンパク質、及びそれを含む組成物。
【請求項１】
５〜１００個のアミノ酸残基を含み、分子量が０．５〜１０ｋＤの範囲であり、グリコシル化を有するかまたは有さないタンパク質であって、リパーゼ及び／又はホスホリパーゼ酵素活性に対する阻害作用又は軽減作用を有する、タンパク質。
【請求項２】
前記タンパク質が、以下の配列番号１：ＣＧＱＱＬＲＮＩＳＰＰＱＲＣＰＳＬＲＱＡＶＱＬＡＨＱＱＱＧＱＧＰＱＱＶＲＱＭＹＲの部分的な配列番号を有する、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
天然の供給源から、又は合成経路により、或いは組換えＤＮＡ技術により分離される、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項４】
前記好ましい分離方法が天然の供給源からの分離である、請求項３に記載のタンパク質。
【請求項５】
前記天然の供給源が植物材料である、請求項４に記載のタンパク質。
【請求項６】
前記植物材料がＭｏｒｉｎｇａ種に由来する、請求項５に記載のタンパク質。
【請求項７】
前記タンパク質が、抽出、濾過、アセトン及びＴＣＡでの沈殿に続いて、ゲル濾過クロマトグラフィーの工程を含むプロセスにより精製される、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項８】
前記タンパク質がトリプシン阻害剤と合わせることによりトリプシン不活化から保護される、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項９】
前記トリプシン阻害剤が、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、ライマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｌｉｍｅｎｓｉｓ）、Ｐｒｏｓｏｐｉｓ ｊｕｌｉｆｌｏｒａ種子、ヒマワリ種子（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）及び／又はこれらの組み合わせから選択される、請求項８に記載のタンパク質。
【請求項１０】
前記好ましく選択されるトリプシン阻害剤が、ダイズタンパク質である、請求項９に記載のタンパク質。
【請求項１１】
体液、細胞及び組織中のリパーゼ及び／又はホスホリパーゼを阻害するためのタンパク質を治療有効量含む組成物であって、該タンパク質が、５〜１００個のアミノ酸残基を含み、且つ分子量が０．５〜１０ｋＤの範囲であり、グリコシル化を有するかまたは有さない、組成物。
【請求項１２】
肥満、糖尿病、アテローム硬化症又は別の代謝症候群を予防又は治療するためのタンパク質を含む組成物であって、該タンパク質が、５〜１００個のアミノ酸残基を含み、且つ分子量が０．５〜１０ｋＤの範囲であり、グリコシル化を有するかまたは有さない、組成物。
【請求項１３】
心臓血管障害を予防又は治療するためのタンパク質を含む組成物であって、該タンパク質が、５〜１００個のアミノ酸残基を含み、且つ分子量が０．５〜１０ｋＤの範囲であり、グリコシル化を有するかまたは有さない、組成物。
【請求項１４】
ホスホリパーゼの活性化及び／又は作用によって引き起こされる関節炎、アテローム硬化症、敗血症性ショック及び他の炎症性疾患を予防又は治療するためのタンパク質を含む組成物であって、該タンパク質が、５〜１００個のアミノ酸残基を含み、且つ分子量が０．５〜１０ｋＤの範囲であり、グリコシル化を有するかまたは有さない、組成物。
【請求項１５】
単球系細胞、血管細胞、肝細胞及び脂肪組織に脂質が蓄積するのを阻害又は軽減するためのタンパク質を含む組成物であって、該タンパク質が、５〜１００個のアミノ酸残基を含み、且つ０．５〜１０ｋＤの範囲の分子量を有し、グリコシル化を有するかまたは有さない、組成物。
【請求項１６】
リパーゼ及びホスホリパーゼを分泌する微生物病原体によって引き起こされる細胞及び組織の損傷を予防又は治療するためのタンパク質を含む組成物であって、該タンパク質が、５〜１００個のアミノ酸残基を含み、且つ０．５〜１０ｋＤの範囲の分子量を有し、グリコシル化を有するかまたは有さない、組成物。
【請求項１７】
タンパク質を含む皮膚及び頭髪の手入れ及び美容調製物のためのタンパク質を含む組成物であって、該タンパク質が、５〜１００個のアミノ酸残基を含み、且つ分子量が０．５〜１０ｋＤの範囲であり、グリコシル化を有するかまたは有さない、組成物。
【請求項１８】
体液、細胞及び組織中のリパーゼ及び／又はホスホリパーゼ活性によって引き起こされるか、または悪化される疾患を治療及び予防するための動物薬で使用するタンパク質を含む組成物であって、該タンパク質が、５〜１００個のアミノ酸残基を含み、且つ分子量が０．５〜１０ｋＤの範囲であり、グリコシル化を有するかまたは有さない、組成物。
【請求項１９】
前記タンパク質が、天然の供給源から、又は合成経路により、或いは組換えＤＮＡ技術により分離される、請求項１１〜１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記好ましいタンパク質分離方法が、天然の供給源からの分離である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記天然の供給源が植物材料である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記植物材料がＭｏｒｉｎｇａ種に由来する、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記タンパク質が、抽出、濾過、アセトン及びＴＣＡでの沈殿に続いて、ゲル濾過クロマトグラフィーの工程を含むプロセスにより精製される、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記タンパク質がトリプシン阻害剤と合わせることによりトリプシン不活化から保護される、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記トリプシン阻害剤が、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、ライマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｌｉｍｅｎｓｉｓ）、Ｐｒｏｓｏｐｉｓ ｊｕｌｉｆｌｏｒａの種子、ヒマワリ種子（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）及び／又はこれらの組み合わせから選択される、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記好ましく選択されるトリプシン阻害剤が、ダイズタンパク質である、請求項２５による組成物。
【請求項２７】
タンパク質を単独でか、又は既知の薬学的に許容され且つ不活性なアジュバント、希釈剤又は担体と組み合わせて含む処方物であって、該タンパク質が、５〜１００個のアミノ酸残基を含み、且つ分子量が０．５〜１０ｋＤの範囲であり、グリコシル化を有するかまたは有さない、処方物。
【請求項２８】
請求項１に記載のタンパク質を単独でか、又は少なくとも１つの追加の有効成分と組み合わせて含む処方物。
【請求項２９】
乾燥重量に換算して約１０〜２０００ｍｇ／日の量で１日１回又は数回投与され得る、請求項１に記載のタンパク質を含む処方物。
【請求項３０】
前記処方物が、経口、静脈内、鼻腔内及び経皮からなる群から選択される経路を介して投与されるように適合される、請求項２７に記載の処方物。
【請求項３１】
経口投与に適切な形態が、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、球状体、シロップ剤及び飲料を含み、更に好ましくは、球状体の形態である、請求項２７に記載の処方物。
【請求項３２】
前記処方物を、従来の投薬レジメンにしたがうことによって投与することができる、請求項２７に記載の処方物。
【請求項３３】
前記処方物を、任意の改変放出処方物、制御放出処方物又は持続放出処方物により投与することができる、請求項２７に記載の処方物。
【請求項３４】
体液、細胞及び組織中のリパーゼ及びホスホリパーゼを阻害するための方法であって、請求項１に記載のタンパク質の有効量を含む組成物を必要とする患者に投与する工程を含む、方法。
【請求項３５】
体液、細胞及び組織中のリパーゼ及びホスホリパーゼを阻害するための方法であって、請求項１に記載のタンパク質の有効量を含む組成物を必要とする患者に投与する工程を含む、方法。
【請求項３６】
体液、細胞及び組織中のリパーゼ及びホスホリパーゼを阻害する方法であって、請求項１に記載のタンパク質の有効量を含む組成物を必要とする患者に投与する工程を含む、方法。
【請求項３７】
単球系細胞、血管細胞、肝細胞及び脂肪組織に脂質が蓄積するのを阻害又は軽減するための方法であって、請求項１に記載のタンパク質の有効量を含む組成物を必要とする患者に投与する工程を含む、方法。
【請求項３８】
肥満、糖尿病、アテローム硬化症又は別の代謝症候群を予防又は治療するための方法であって、請求項１に記載のタンパク質の有効量を含む組成物を必要とする患者に投与する工程を含む、方法。
【請求項３９】
ホスホリパーゼの活性化及び／又は作用によって引き起こされる関節炎、敗血症性ショック及び他の炎症性疾患を予防又は治療するための方法であって、請求項１に記載のタンパク質の有効量を含む組成物を必要とする患者に投与する工程を含む、方法。
【請求項４０】
リパーゼ及びホスホリパーゼを分泌する微生物病原体によって引き起こされる細胞及び組織の損傷を予防又は治療するための方法であって、請求項１に記載のタンパク質の有効量を含む組成物を必要とする患者に投与する工程を含む、方法。
【請求項４１】
実施例を参照して実質的に本明細書に記載された上記の請求項に記載の、体液、細胞及び組織中のリパーゼ及び／又はホスホリパーゼを阻害するためのタンパク質、及びそれを含む組成物。
【公表番号】特表２００９−５１１４６６（Ｐ２００９−５１１４６６Ａ）
【公表日】平成２１年３月１９日（２００９．３．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５３４１４６（Ｐ２００８−５３４１４６）
【出願日】平成１７年１０月５日（２００５．１０．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＮ２００５／０００３３０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０３９９１１
【国際公開日】平成１９年４月１２日（２００７．４．１２）
【出願人】（５０６３８３７２２）リライアンス ライフ サイエンシーズ プライベイト リミテッド (9)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年３月１９日（２００９．３．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１０月５日（２００５．１０．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＮ２００５／０００３３０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０３９９１１
【国際公開日】平成１９年４月１２日（２００７．４．１２）
【出願人】（５０６３８３７２２）リライアンス ライフ サイエンシーズ プライベイト リミテッド (9)
【Ｆターム（参考）】
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