単一分岐ヘパリン結合増殖因子類似体
配列が、ヘパリン結合増殖因子レセプター（ＨＢＧＦＲ）に結合する特定のＨＢＧＦの類似体であるか、あるいは任意の特定のＨＢＧＦの類似体ではなくてもＨＢＧＦＲに結合する、単一のアミノ酸残基で分岐している２つの実質的に同様の配列（ホモ二量体配列）を有するヘパリン結合増殖因子（ＨＢＧＦ）類似体。ホモ二量体配列は、ＨＢＧＦの任意の部分から誘導されうる。合成ＨＢＧＦ類似体は、ホルモン、サイトカイン、リンホカイン、ケモカイン又はインターロイキンの類似体であることができ、任意のＨＢＧＦＲに結合することができる。更に提供されるものは、医療装置用の調合剤、医薬組成物、及びこれらを使用する方法である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２個の配列が単一分岐点から分岐し、単一分岐点が少なくとも１個の三官能性アミノ酸残基を含み、分岐点が更にヘパリン結合配列に共有結合している、ホモ二量体合成ヘパリン結合増殖因子類似体を含む、ヘパリン結合増殖因子の合成ペプチド及び類似体の分野に関する。本発明は、更に、可溶性薬剤としての及び医療装置用の被覆としての、そのような類似体の臨床使用に関する。
【０００２】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国仮出願第６０／６５５，５７０号（２００５年２月２２日出願）の表題「単一分岐ヘパリン結合増殖因子」の出願の優先権及び利益を主張し、この明細書及び請求の範囲は参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
以下の考察は、多数の筆者及び出版年の出版物を参照する。本明細書におけるそのような出版物の考察は、より完全な背景を提供し、そのような出版物が特許性を決定する目的において従来技術であることの承認として解釈されるべきではない。
【０００４】
ヘパリン結合増殖因子（ＨＢＧＦ）は、現在同定されている２３個の線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ１〜２３）、ＨＢＢＭ（ヘパリン結合脳分裂促進因子）、ＨＢ−ＧＡＦ（ヘパリン結合増殖関連因子）、ＨＢ−ＥＧＦ（ヘパリン結合ＥＧＦ様因子）、ＨＢ−ＧＡＭ（ヘパリン結合増殖関連分子）、ＴＧＦ−α（形質転換増殖因子α）、ＴＧＦ−β（形質転換増殖因子β）、ＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）、ＥＧＦ（表皮増殖因子）、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）、ＩＧＦ−１（インスリン様増殖因子１）、ＩＧＦ−２（インスリン様増殖因子２）、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）、ＩＬ−１（インターロイキン１）、ＩＬ−２（インターロイキン２）、ＩＦＮ−α（インターフェロンα）、ＩＦＮ−γ（インターフェロンγ）、ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子α）、ＳＤＧＦ（シュワン細胞腫由来増殖因子）、並びにヘパリンに親和性を有する他の多くの増殖因子、サイトカイン、リンホカイン及びケモカインを含む、多数の種類の増殖因子から構成される。
【０００５】
ヘパリン結合増殖因子レセプターに結合する天然ＨＢＧＦからのペプチドも同定されている。例えば、Ray et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:7047-7052 (1997)を参照すること。これらの著者は、ＦＧＦ−２からの２個のアミノ酸配列が、神経前駆細胞のＦＧＦ−２の分裂促進活性を阻止するのに十分であることを実証した。第１ペプチドは、アミノ酸６５−７４からの１０個のアミノ酸配列であり、第２ペプチドはアミノ酸１１５−１２９から延びている。
【０００６】
代替的な手法において、ヘパリン結合増殖因子レセプター（ＨＢＧＦＲ）に結合する人工ペプチドが、ファージディスプレー法により同定された。Ballinger et al., Nature BioTechnology 17:1199-1204 (1999）は、この技術を使用して、Ｃ１９と呼ばれ、ＦＧＦ−２レセプターに結合するが、それ自体生物学的活性を刺激できない、２８個のアミノ酸ペプチドを単離した。このペプチドは、あらゆる既知のＦＧＦにより同定されるアミノ酸配列を有さない。
【０００７】
広範囲の疾患及び傷害の予防又は治療に有用なＨＢＧＦを、天然の供給源から精製することができるか、又は組み換えＤＮＡ法により産生することができるが、そのような調製は、高価であり、一般に調製することが難しい。
【０００８】
ヘパリン結合増殖因子類似体を生成するために幾つかの努力がなされてきた。例えば、天然ＰＤＧＦは、頭−頭（ＡＡ若しくはＢＢ）ホモ二量体、又は（ＡＢ若しくはＢＡ）ヘテロ二量体で配列されるＡ鎖及びＢ鎖として生じる。したがって、米国特許第６，３５０，７３１号（Jehanliら）は、２つの合成ＰＤＧＦレセプター結合ドメインが、ポリグリシン又はＮ−（４−カルボキシ−シクロヘキシルメチル）−マレイミド（ＳＭＣＣ）鎖を介して共有結合して、天然活性ポリペプチド二量体を模倣することを開示する。
【０００９】
米国特許第６，２３５，７１６号（Ben-Sasson）は、血管新生因子の類似体を開示する。この類似体は、マルチリンカー主鎖により結合している２つ以上の血管新生相同性領域を含む分岐多価リガンドである。
【００１０】
米国特許第５，７７０，７０４号（第′７０４号特許）（Godowski）は、レセプターチロシンキナーゼ、サイトカインレセプター及び多数の神経成長因子レセプタースーパーファミリーを活性化する複合体を開示する。複合体は、同族レセプターに結合することができる少なくとも２個のリガンドを含み、それにより、それぞれのリガンドの結合がこれらのレセプターのオリゴマー化を誘導する。第′７０４号特許に開示されているリガンドは、多様な非タンパク質性ポリマーに、特に、ポリビニルアルコール及びポリビニルピロリドンのような疎水性ポリマーに、並びにポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールを含むポリビニルアルケンエーテルに、共有結合により結合する。リガンドは、それぞれＨＧＦに結合し、それによって、レセプター二量体化及びＨＧＦレセプター二量体の生物学的活性の活性化を引き起こす、肝細胞増殖因子（ＨＦＧ）ペプチド変異体を含む。
【００１１】
米国特許第６，２８４，５０３号（第′５０３号特許）（Caldwellら）は、細胞付着、細胞増殖、細胞選択及び生物学的アッセイのために、疎水性表面及び疎水性被覆表面への細胞及び生体分子の付着を調節する組成物及び方法を開示する。この組成物は、反応性末端基活性化ポリマーに結合している生体分子である。末端基活性化ポリマーは、ブロックコポリマー界面活性剤主鎖及び活性化又は反応性基を含む。ブロックコポリマーは、疎水性表面に吸着することができる疎水性領域と、疎水性領域が疎水性表面に吸着するときに表面から延びる親水性領域とを有する、あらゆる界面活性剤であることができる。第′５０３号特許は、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦα、ＴＧＦβ、ＮＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＧＨ及びＧＨＲＦ、並びにマルチ−ＣＳＦ（ＩＩ−３）、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ及びＭ−ＣＳＦのような天然及び組み換え増殖因子を含む末端基活性化ポリマーに、結合していることができる生体分子を開示する。
【００１２】
他の研究者たちは、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）の相同体及び類似体を含む組成物を記載する。例えば、米国特許第５，６７９，６７３号（Lappi及びBaird）、米国特許第５，９８９，８６６号（Deisherら）、及び米国特許第６，２９４，３５９号（Fiddesら）を参照すること。これらの開示は、毒性部分に結合し、ＦＧＦレセプター担持細胞を標的にするＦＧＦ同位体又は類似体であるか、或いはＦＧＦ相同体又は類似体により結合されるとＦＧＦレセプターにより伝達されるシグナルを通す生物学的経路を調節する相同体又は類似体のいずれかに関連する。
【００１３】
Kochendoerferらの一連の特許出願は、合成ケモカイン及び赤血球生成刺激タンパク質を含むポリマー改質タンパク質を開示する。例えば、国際公報第０２／０４１０５、同第０２／１９９６３号及び同第０２／２００３３号を参照すること。これらは、ポリペプチド鎖が得られるように、タンパク質の１つ以上のグリコシル化部位に結合している水溶性ポリマーと化学的に連結した、赤血球生成合成タンパク質のポリペプチド鎖のペプチドセグメントを含む。これらの出願は、同じくポリマー改質され、アンタゴニストであると言われている合成ケモカインも開示する。しかし、ヘパリン結合ドメインは開示されていない。米国特許第５，７７３，５６９号及び同第５，８３０，８５１号（Wrightonら）に開示されているように、他のエリスロポエチン模倣が知られている。
【００１４】
国際公報第００／１８９２１号（Ballinger及びKavanaugh）は、直接的に又は結合基を介して「オリゴマー化ドメイン」に結合している、ＦＧＦレセプター親和性を有する融合タンパク質からなる組成物を開示する。オリゴマー化ドメインは、約２０〜３００個の残基の長さの範囲であり、転写因子、ＩｇＧのＦｃ部分、ロイシンジッパーなどのような作成物を含む。開示されたオリゴマー化ドメインはホモ二量体ドメインである、ここでは、単一のＦＧＦレセプター親和性融合タンパク質がロイシンジッパーのような単一のドメインに結合し、次に、それぞれ単一のＦＧＦレセプター親和性融合タンパク質を有する２個の平行したロイシンジッパーがジスルフィド結合により架橋するように、ロイシンジッパーのアミノとカルボキシの両方の末端でシステイン残基により同様の分子に結合する。融合タンパク質は、ヘパリン結合ドメインと言われる多量体化ドメインとしてｊｕｎを使用する、ヘパリン結合ドメインを含むことができることも開示される。したがって、Ballinger及びKavanaughにより開示された組成物は、オリゴマー化ドメインに共有結合している単一レセプター結合配列から全て構成され、それによって、それぞれ単一のレセプター結合配列を有する２つ以上の同様のオリゴマー化ドメインが、オリゴマー化ドメインによりもたらされる連合により結合するか、あるいは化学架橋されて個別の成分の共有結合をもたらす。米国特許出願第１０／６４４，７０３号（表題 合成ヘパリン結合増殖因子類似体、２００３年８月１９日出願）及び米国特許出願第１０／２２４，２６８号（表題 合成ヘパリン結合増殖因子類似体、２００２年８月２０日出願）を含む幾人かの発明者が共通している一連の出願は、２つのレセプター結合ドメインが、２個の異なるアミノ酸残基の側鎖に、又は末端基と側鎖に結合している作成物を開示する。
【００１５】
上記に記載された相同体、類似体、複合体又はリガンドは、それぞれレセプター結合ドメインを含む。しかし、開示されたどの組成物も、単一の残基の末端基と側鎖基を介して単一の残基に結合している２つのレセプター結合ドメインを更に含まない。ＨＢＧＦの新規ペプチド類似体、特にアゴニストとして機能するもの、好ましくはＨＢＧＦＲに特異性の２つのレセプター結合ドメインを含有するものに対する必要性が依然として存在する。ヘパリン結合増殖因子レセプターの費用効果の高い合成ペプチドアゴニスト、特に、医療装置を被覆するため、可溶性の生物学的製剤として、及び多様な状態を治療する医薬品として有用な、合成ヘパリン結合増殖因子アゴニストの必要性が依然として存在する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の一つの態様は、式Ｉ：
【００１７】
【化１】
【００１８】
〔式中、
Ｘは、それぞれ、（ｉ）最低３個のアミノ酸残基を有し、（ｉｉ）最大約５０個のアミノ酸残基を有し、（ｉｉｉ）ヘパリン結合増殖因子レセプター（ＨＢＧＦＲ）に結合する、ペプチド鎖であり；
Ｒ1は、各Ｘに共有結合している単一の三官能性アミノ酸残基であり；
Ｒ2は、それぞれ独立して、Ｒ1とＸに共有結合している、炭素、酸素、硫黄、窒素及びその混合物を含む０〜約２０個の主鎖原子の鎖を含むリンカーであり；
Ｒ3は、それぞれ、末端基がＮＨ2のように水素（Ｈ）であるか、或いはＮ−末端ＮＨ2、ＮＨ3+若しくはＮＨ基又は対応するアシル化誘導体を含む直鎖又は分岐鎖Ｃ1〜Ｃ17のアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルケン、アルケニル又はアラルキル鎖を有するアシル基であり；
Ｒ4は、末端基がカルボキシルのようにＯＨであるか、ＮＨ2であるか、Ｎ−末端ＮＨ2、ＮＨ3+若しくはＮＨ基又は対応するアシル化誘導体を含む直鎖又は分岐鎖Ｃ1〜Ｃ17のアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルケン、アルケニル又はアラルキル鎖を有するアシル基であるか、又はＮＨ−Ｒ3であり；
Ｙは、Ｒ1とＺに共有結合している０〜約５０個の主鎖原子の鎖を含むリンカーであり；そして
Ｚは、（ｉ）最低１個のヘパリン結合モチーフ、（ｉｉ）最大約１０個のヘパリン結合モチーフ、及び（ｉｉｉ）最大約３０個のアミノ酸を含むアミノ酸配列を含むヘパリン結合ドメインを含む、非シグナル伝達ペプチド鎖である〕
で示される、ヘパリン結合増殖因子類似体である。
【００１９】
本発明の別の態様は、Ｙが、（ｉ）疎水性であり、（ｉｉ）最低約９個、最大約５０個の原子の鎖を含み、（ｉｉｉ）Ｘが結合するヘパリン結合増殖因子レセプター（ＨＢＧＦＲ）の天然リガンドにおいて見出されないリンカーを更に含むことを提供する。
【００２０】
本発明の別の態様は、式Ｉ〜ＩＶのヘパリン結合増殖因子類似体が、合成ヘパリン結合増殖因子類似体が０．１５MのＮａＣｌ中でヘパリンに結合するが、１MのＮａＣｌにより溶離されるようなヘパリン結合活性を有することを提供する。
【００２１】
本発明の別の態様は、式ＩＩ：
【００２２】
【化２】
【００２３】
（式中、Ｒ1はジアミンアミノ酸である）で示されるヘパリン結合増殖因子類似体を提供する。他の特徴は全て式Ｉにおいて表されたとおりである。
【００２４】
本発明の別の態様は、式ＩＩのヘパリン結合増殖因子類似体のＲ1が、２，３−ジアミノプロピオニルアミノ酸、２，４−ジアミノブチルアミノ酸、リシン及びオルニチンからなる群より選択されるＬ−又はＤ−ジアミンアミノ酸残基であることを提供する。
【００２５】
本発明の別の態様は、式ＩＩＩ：
【００２６】
【化３】
【００２７】
〔式中、
Ｃは炭素であり、Ｈは水素であり、Ｎは窒素であり、そしてＯは酸素である〕で示されるヘパリン結合増殖因子類似体を提供する。他の特徴は全て式Ｉにおいて表されたとおりである。
【００２８】
本発明のさらに別の態様は、式ＩＶ：
【００２９】
【化４】
【００３０】
〔式中、
Ｒ1は、Ｒ1の側鎖が反応性スルフヒドリルを含む三官能性アミノ酸であり；そして
Ｒ2は、側鎖が反応性スルフヒドリルを含む三官能性アミノ酸を含み、ここでＲ2はジスルフィド結合によりＲ1に共有結合している〕
で示されるヘパリン結合増殖因子類似体を提供する。
【００３１】
本発明の別の態様は、Ｒ1及びＲ2が、それぞれ独立して、Ｌ−又はＤ−システイン、Ｌ−又はＤ−ペニシラミン、３−メルカプトフェニルアラニン及び前記のいずれかの誘導体からなる群より選択されるＬ−又はＤ−３−メルカプトアミノ酸である、式ＩＩＩのヘパリン結合増殖因子類似体を提供する。
【００３２】
本発明の別の態様は、式Ｖ：
【００３３】
【化５】
【００３４】
〔式中、
Ｐｒｇ Ｇｒｐは、ＯＨ又はカルボキシ末端保護基であり；そして
Ｃは炭素であり、Ｈは水素であり、Ｎは窒素であり、Ｏは酸素であり、そしてＳは硫黄である〕で示されるヘパリン結合増殖因子類似体を提供する。他の特徴は全て式Ｉにおいて表されたとおりである。
【００３５】
本発明のなお別の態様は、式ＶＩ：
【００３６】
【化６】
【００３７】
〔式中、
Ｒ1は、側鎖が第１反応性基を含む三官能性アミノ酸であり；そして
Ｒ2は、側鎖が第２反応性基を含む三官能性アミノ酸を含み、ここでＲ2は、第１反応性基と第２反応性基の間の共有結合によりＲ1に共有結合している〕で示されるヘパリン結合増殖因子類似体を提供する。他の特徴は全て式Ｉにおいて表されたとおりである。
【００３８】
本発明のなお別の態様は、式Ｉ〜ＶＩのうちのいずれかのＸ及びＺが合成ペプチド鎖であることを提供する。
【００３９】
本発明のさらに別の態様は、２個の配列が、同一であり、かつヘパリン結合増殖因子レセプターに特異的に結合し、１個の配列が、単一の残基に共有結合している非増殖因子ヘパリン結合配列を含む、単一の残基から分岐している２個の配列を有する合成ペプチドを含む、ヘパリン結合増殖因子類似体を提供する。
【００４０】
別の態様において、単一の残基は三官能性アミノ酸残基を含む。
【００４１】
なお別の態様では、非増殖因子ヘパリン結合配列がリンカーにより単一の残基に共有結合していることが提供される。
【００４２】
さらに別の態様は、２〜約５０個の主鎖原子を有するヘパリン結合増殖因子類似体を提供する。
【００４３】
本発明の別の態様において、式Ｉ〜ＶＩのいずれかのＹは、１〜約３３個のエチレングルコール単位を含む。
【００４４】
本発明の別の態様によると、式Ｉ〜ＶＩのいずれかのＹは、１〜約２０個の炭素原子の、分岐鎖又は非分岐鎖、飽和又は不飽和アルキル鎖を含む。
【００４５】
本発明のさらに別の態様において、式Ｉ〜ＶＩのいずれかのＹは、〔ＮＨ2−（ＣＨ2）pＣＯ〕qを含み、ここで、ｐは１〜約１０であり、そしてｑは１〜約２０である。
【００４６】
本発明の別の態様において、式Ｉ〜ＶＩのいずれかのＹは、１〜約１６個のＧｌｙ残基を含むペプチド配列を含む。
【００４７】
本発明の別の態様では、式Ｉ〜ＶＩのいずれかのＺは、ＢｘＢＢ又はＢＢＢｘｘＢであり、ここで、Ｂは、それぞれ独立して、リシン、アルギニン、オルニチン又はヒスチジンであり、そしてｘは、それぞれ独立して、天然に生じるアミノ酸である。
【００４８】
本発明の別の態様において、式Ｉ〜ＶＩのいずれかのＺは、少なくとも２個のヘパリン結合モチーフを含む。
【００４９】
本発明のなお別の態様において、式Ｉ〜ＶＩのいずれかのＲ1とＹの間の共有結合は、アミド、ジスルフィド、チオエーテル、シッフ塩基、還元シッフ塩基、イミド、第二級アミン、カルボニル、尿素、ヒドラゾン又はオキシム結合を含む。
【００５０】
本発明のなお別の態様において、式Ｉ〜ＶＩのいずれかのＲ1と各Ｘとの間の共有結合は、アミド、ジスルフィド、チオエーテル、シッフ塩基、還元シッフ塩基、イミド、第二級アミン、カルボニル、尿素、ヒドラゾン又はオキシム結合を含む。
【００５１】
本発明の別の態様において、式Ｉ〜ＶＩのいずれかのＹとＺの間の共有結合は、アミド、ジスルフィド、チオエーテル、シッフ塩基、還元シッフ塩基、イミド、第二級アミン、カルボニル、尿素、ヒドラゾン又はオキシム結合を含む。
【００５２】
本発明の別の態様において、式Ｉ〜ＶＩのいずれかのＸは、配列番号７から配列番号１０７のいずれか、その一部分、その相同体、又はその一部分の相同体であり、そしてＺは、配列番号１から配列番号６のいずれかを含む。
【００５３】
本発明のなお別の態様において、式Ｉ〜ＶＩのいずれかのＲ2は、グリシン、直鎖アミノカルボン酸、二官能性アミノ−ＰＥＧ−酸スペーサー及びこれらの組み合わせからなる群より選択される１〜約３個のアミノ酸残基を含む。
【００５４】
本発明のさらに別の態様において、式Ｉ〜ＶＩのいずれかのＹは、グリシン、直鎖アミノカルボン酸、二官能性アミノ−ＰＥＧ−酸スペーサー及びこれらの組み合わせからなる群より選択される１〜約１０個のアミノ酸残基を含む。
【００５５】
本発明の別の態様において、式Ｉ〜ＶＩのいずれかのＸは、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１１、ＦＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３、ＦＧＦ−１４、ＦＧＦ−１５、ＦＧＦ−１６、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−１８、ＦＧＦ−１９、ＦＧＦ−２０、ＦＧＦ−２１、ＦＧＦ−２２、ＦＧＦ−２３、ＨＢＢＭ（ヘパリン結合脳分裂促進因子）、ＨＢ−ＧＡＦ（へパリン結合増殖関連因子）、ＨＢ−ＥＧＦ（ヘパリン結合ＥＧＦ様因子）、ＨＢ−ＧＡＭ（プレイオトロフィン、ＰＴＮ、ＨＡＲＰとしても知られている、ヘパリン結合増殖関連分子）、ＴＧＦ−α（形質転換増殖因子α）、ＴＧＦ−β（形質転換増殖因子β）、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）、ＥＧＦ（表皮増殖因子）、ＩＧＦ−１（インスリン様増殖因子１）、ＩＧＦ−２（インスリン様増殖因子２）、ＰＤＧＦ（血小板由来成長因子）、ランテス、ＳＤＦ−１、分泌ちぢれ毛関連タンパク質１（ＳＦＲＰ−１）、小型誘導性サイトカインＡ３（ＳＣＹＡ３）、誘導性サイトカインサブファミリーＡメンバー２０（ＳＣＹＡ２０）、誘導性サイトカインサブファミリーＢメンバー１４（ＳＣＹＢ１４）、誘導性サイトカインサブファミリーＤメンバー１（ＳＣＹＤ１）、ストローマ細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）、トロンボスポンジン１、２、３及び４（ＴＨＢＳ１〜４）、血小板第４因子（ＰＦ４）、水晶体上皮由来増殖因子（ＬＥＤＧＦ）、ミジキン（ＭＫ）、マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１）、モエシン（ＭＳＮ）、肝細胞増殖因子（ＳＦとも称される、ＨＧＦ）、胎盤増殖因子、ＩＬ−１（インターロイキン１）、ＩＬ−２（インターロイキン２）、ＩＬ−３（インターロイキン３）、ＩＬ−６（インターロイキン６）、ＩＬ−７（インターロイキン７）、ＩＬ−１０（インターロイキン１０）、ＩＬ−１２（インターロイキン１２）、ＩＦＮ−α（インターフェロンα）、ＩＦＮ−γ（インターフェロンγ）、ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子α）、ＳＤＧＦ（シュワン細胞腫由来増殖因子）、神経成長因子、神経突起成長促進因子２（ＮＥＧＦ２）、ニューロトロフィン、ＢＭＰ−２（骨形成タンパク質２）、ＯＰ−１（ＢＭＰ−７とも称される、骨形成タンパク質１）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、インターフェロンγ誘導性タンパク質２０、ランテス、及びＨＩＶ−ｔａｔ−トランス活性化因子、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）、血管関連遊走細胞タンパク質（ＡＡＭＰ）、アンギオスタチン、ベータセリン（ＢＴＣ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、高システイン血管新生インデューサー６１（ＣＹＣＲ６１）、エンドスタチン、フラクタルカイン／ニューロアクチン、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ＧＲＯ２、肝細胞癌由来増殖因子（ＨＤＧＦ）、及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）のうちのいずれかで見出されるアミノ酸配列、又は前記のいずれかで見出されるアミノ酸配列の相同体を含む。
【００５６】
本発明のなお別の態様において、医薬組成物は、式Ｉ〜ＶＩのいずれかのヘパリン結合増殖因子類似体又は薬学的に許容されるその塩と、医薬担体とを含む。
【００５７】
本発明の他の態様、目的、利点及び新規特性、並びに特許性の更なる範囲は、部分的には以下の詳細な説明で記載され、部分的には以下の実験により当業者に明白になるか、又は本発明の実施により学ぶことができる。本発明の目的及び利点を、添付の請求項で特に指摘されている有用性及び組み合わせによって理解及び実現することができる。
【００５８】
本発明の追加の目的及び利点は、以下の詳細な説明を添付図面と一緒に読むことにより明白となる。
【課題を解決するための手段】
【００５９】
本発明のそれぞれの合成ＨＢＧＦ類似体は、ＨＢＧＦＲに結合する特定のＨＢＧＦの類似体であるか、あるいはあらゆる特定のＨＢＧＦの類似体であることなくＨＢＧＦＲに結合する、２個の実質的に同様の配列（ホモ二量体配列）を含む。ホモ二量体配列は、ＨＢＧＦの任意の部分から誘導されうる。合成ＨＢＧＦ類似体は、ホルモン、サイトカイン、リンホカイン、ケモカイン又はインターロイキンの類似体であることができ、前記のいずれかのうちの任意のＨＢＧＦＲに結合することができる。
【００６０】
本発明の一つの態様は、本発明の合成ＨＢＧＦ類似体が式Ｉ〜ＶＩのいずれかの式の分子であることを提供する。ＨＢＧＦには、ヘパリンに選択的に結合するあらゆる増殖因子が含まれる。例えば、ＨＢＧＦは、既知のＦＧＦ（ＦＧＦ−１〜ＦＧＦ−２３）、アクチビンＶ、ＨＢＢＭ（ヘパリン結合脳分裂促進因子）、ＨＢ−ＧＡＦ（へパリン結合増殖関連因子）、ＨＢ−ＥＧＦ（ヘパリン結合ＥＧＦ様因子）、ＨＢ−ＧＡＭ（プレイオトロフィン、ＰＴＮ、ＨＡＲＰとしても知られている、ヘパリン結合増殖関連分子）、ＴＧＦ−α（形質転換増殖因子α）、ＴＧＦ−β（形質転換増殖因子β）、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）、ＥＧＦ（表皮増殖因子）、ＩＧＦ−１（インスリン様増殖因子１）、ＩＧＦ−２（インスリン様増殖因子２）、ＰＤＧＦ（血小板由来成長因子）、ランテス、ＳＤＦ−１、分泌ちぢれ毛関連タンパク質１（ＳＦＲＰ−１）、小型誘導性サイトカインＡ３（ＳＣＹＡ３）、誘導性サイトカインサブファミリーＡメンバー２０（ＳＣＹＡ２０）、誘導性サイトカインサブファミリーＢメンバー１４（ＳＣＹＢ１４）、誘導性サイトカインサブファミリーＤメンバー１（ＳＣＹＤ１）、ストローマ細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）、トロンボスポンジン１、２、３及び４（ＴＨＢＳ１〜４）、血小板第４因子（ＰＦ４）、水晶体上皮由来増殖因子（ＬＥＤＧＦ）、ミジキン（ＭＫ）、マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１）、モエシン（ＭＳＮ）、肝細胞増殖因子（ＳＦとも称される、ＨＧＦ）、胎盤増殖因子、ＩＬ−１（インターロイキン１）、ＩＬ−２（インターロイキン２）、ＩＬ−３（インターロイキン３）、ＩＬ−６（インターロイキン６）、ＩＬ−７（インターロイキン７）、ＩＬ−１０（インターロイキン１０）、ＩＬ−１２（インターロイキン１２）、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−α（インターフェロンα）、ＩＦＮ−γ（インターフェロンγ）、ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子α）、ＳＤＧＦ（シュワン細胞腫由来増殖因子）、神経成長因子、神経突起成長促進因子２（ＮＥＧＦ２）、ニューロトロフィン、ＢＭＰ−２（骨形成タンパク質２）、ＯＰ−１（ＢＭＰ−７とも称される、骨形成タンパク質１）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、インターフェロンγ誘導性タンパク質２０、ランテス、及びＨＩＶ−ｔａｔ−トランス活性化因子、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）、血管関連遊走細胞タンパク質（ＡＡＭＰ）、アンギオスタチン、ベータセリン（ＢＴＣ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、高システイン血管新生インデューサー６１（ＣＹＣＲ６１）、エンドスタチン、フラクタルカイン／ニューロアクチン、又はグリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ＧＲＯ２、肝細胞癌由来増殖因子（ＨＤＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、並びにヘパリンに親和性を有する多くの増殖因子、サイトカイン、インターロイキン及びケモカインのいずれかであることができる。本発明の作用物質を、通常ヘパリンに結合しない増殖因子、サイトカイン、インターロイキン及びケモカインの直接の類似体への適切な結合配列の導入によって、ヘパリン結合親和性を持つように修飾できることも考慮される。
【００６１】
これら及び他のＨＢＧＦの多くのアミノ酸配列は、ncbi.nlm.nih.gov/entrezで見出されるワールドワイドウエブのアドレスによってアクセス可能なインターネットサイトで、National Library of Medicine Protein Databaseから入手可能である。前記のインターネットサイトのＨＢＧＦアミノ酸配列は、参照により本明細書に組み込まれる。これら及び他のＨＢＧＦのレセプター結合ドメインのアミノ酸配列を組み込んでいる合成ＨＢＧＦ類似体の使用が、本発明において特に考慮される。
【００６２】
本発明の特定の実施態様において、本発明の合成ＨＢＧＦ類似体は、式Ｉ〜ＶＩのいずれかの式の分子から実質的になり、すなわち、式Ｉ〜ＶＩのいずれかの式の分子は、合成ＨＢＧＦ類似体組成物において主要な活性成分である。
【００６３】
式Ｉ〜ＶＩのヘパリン結合増殖因子：式Ｉ〜ＶＩの合成ＨＢＧＦ類似体の領域Ｘ及びＺは、アミノ酸残基を含み、場合により領域Ｙは、アミノ酸残基を含む。アミノ酸残基は、−ＮＨＲＣＯ−として定義され、ここでＲは、水素又は任意の有機基であることができる。アミノ酸はＤ−アミノ酸又はＬ−アミノ酸であることができる。加えて、アミノ酸は、アミノ酸の炭素鎖の長さに応じて、αアミノ酸、βアミノ酸、γアミノ酸又はδアミノ酸などであることができる。
【００６４】
本発明の合成ＨＢＦＧ類似体のＸ、Ｙ及びＸ成分領域のアミノ酸は、タンパク質で天然に見出される２０個のアミノ酸のいずれかを含むことができ、すなわち、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、アスパルギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン酸、（Ｇｌｕ、Ｅ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（Iｌｅ、Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、リシン（Ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）及びバリン（Ｖａｌ、Ｖ）である。
【００６５】
更に、本発明の合成ＨＢＦＧ類似体のＸ、Ｙ及びＸ成分領域のアミノ酸は、タンパク質に天然に見出されない天然に生じるアミノ酸のいずれかを含むことができ、例えば、βアラニン、ベタイン（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシン）、ホモセリン、ホモシステイン、γアミノ酪酸、オルニチン及びシトルリンである。
【００６６】
加えて、本発明の合成ＨＢＦＧ類似体のＸ、Ｙ及びＸ成分領域のアミノ酸には、非生物アミノ酸のいずれかを含むことができ、すなわち、例えば天然で見出されない直鎖アミノカルボン酸のような生物系で通常見出されないものである。直鎖アミノカルボン酸の例には、６−アミノヘキサン酸、７−アミノヘプタン酸、９−アミノノナン酸などが含まれる。
【００６７】
式Ｉにおいて、２つのＸ領域が直接に又はＲ2基を介してＲ1に共有結合しており、ここでＲ1は、三官能性アミノ酸残基、好ましくは三官能性αアミノ酸残基である。そのような共有結合は、化学的に許容されるあらゆる官能基でありうることが理解されるべきである。三官能性アミノ酸残基が、システインのような反応性スルフヒドリル側鎖を有するアミノ酸である場合、第１のＸは、Ｎ末端アミン基を介して共有結合し、第２のＸは、Ｒ2がジスルフィド結合を介して共有結合している第２のシステイン残基を含む場合では、反応性スルフヒドリル側鎖を介して共有結合し、そしてＹは、そのＣ末端カルボキシル基を介して第２のシステインに共有結合していることが可能であり、考慮される。
【００６８】
特に好ましい実施態様において、Ｒ1はジアミン三官能性アミノ酸残基であり、ここで、Ｒ1は、Ｒ1のカルボキシル基を介してＹに共有結合しており、そして２個のＸ基は、αアミノ酸と側鎖のεアミノ酸を介してＲ1に共有結合している。したがって、Ｒ1の好ましい基には、２，３−ジアミノプロピルアミノ酸、２，４−ジアミノブチルアミノ酸、リシン又はオルニチンが含まれる。
【００６９】
式Ｉ〜ＶＩのＸ領域として特に有用なアミノ酸配列には、天然増殖因子のアミノ酸配列と１若しくは２か所が異なるか、又はほとんど異ならない、天然に生じるＨＢＧＦのフラグメントの相同体が含まれる。そのような配列は、好ましくは、元のアミノ酸が周知の原則に従って同様の性質のアミノ酸に代えられる保守的変化を含み、例えば、アラニンのような非極性アミノ酸を、バリン、ロイシン、イソロイシン又はプロリンと代えること、又は１つの酸性若しくは塩基性アミノ酸を同じ酸性若しくは塩基性の性質を持つ別のアミノ酸で置換することである。
【００７０】
別の代替案では、合成ＨＢＧＦ類似体のＸ領域は、あらゆるＨＢＧＦのアミノ酸配列に検出可能な相同性を示さないアミノ酸配列を含むことができる。同族増殖因子とほとんど又は全くアミノ酸配列相同性を有さないが、それでもＨＢＧＦＲに結合する、本発明の合成類似体のＸ領域の成分として有用なペプチド又は増殖因子類似体を、例えばファージディスプレーによる選択を含む広範囲な方法にいずれかにより得ることができる。例えば、Sidhu et al. Phage display for selection of novel binding peptides. Methods Enzymol. 328:333-63 (2000)を参照すること。
【００７１】
本発明の合成ＨＢＧＦ類似体のＸ領域は、ＨＢＧＦＲに効果的に結合するアミノ酸配列を含むあらゆる長さを有することができる。好ましくは合成ＨＢＧＦ類似体のＸ領域は、少なくともおよそ３個のアミノ酸残基の最小長を有する。より好ましくは合成ＨＢＧＦ類似体のＸ領域は、少なくともおよそ６個のアミノ酸残基の最小長を有する。最も好ましくは合成ＨＢＧＦ類似体のＸ領域は、少なくともおよそ１０個のアミノ酸残基の最小長を有する。本発明の合成ＨＢＧＦ類似体のＸ領域は、また、好ましくはおよそ５０個までのアミノ酸残基の最大長、より好ましくはおよそ４０個までのアミノ酸残基の最大長、最も好ましくはおよそ３０個までのアミノ酸残基の最大長を有する。
【００７２】
式Ｉ、ＩＶ又はＶＩのＲ2領域は、原子の鎖又は鎖を形成する原子の組み合わせを含むことができる。典型的には、鎖は、例えば、アミノ酸（例えば、上記で提示されているような、タンパク質で見出されるアミノ酸；オルニチン及びシトルリンのような、タンパク質で見出されない天然に生じるアミノ酸；若しくはアミノヘキサン酸の様な非天然アミノ酸；又は前記のアミノ酸のいずれかの組み合わせ）から形成される原子の鎖のような、場合により酸素、窒素又は硫黄原子も含むことができる、炭素原子の鎖である。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、アミノポリエチレングルコール、ビス−アミン−ＰＥＧ、及び当業者に既知の他のポリエチレングルコールの変異体のような作用物質を同様に使用することができることも考慮される。
【００７３】
式Ｉ、ＩＶ又はＶＩのＲ2領域の原子の鎖は、ＸとＲ1に共有結合している。共有結合は、例えば、ペプチド結合若しくは他のアミド結合、又はチオエーテル若しくはエステル結合であることができる。存在する場合、Ｒ2領域は、好ましくは最低約３個の主鎖原子の鎖を含む。例えば、共有結合がペプチド結合である場合、Ｒ2領域は、少なくとも１個、少なくとも２個又は少なくとも３個のアミノ酸の鎖から形成されうる。しかし、ペプチド結合以外が用いられる場合、Ｒ2領域は、架橋部分を更に含むことができる。例えば、Ｒ1がＣｙｓ又は反応性スルフヒドリルを有する別の三官能性アミノ酸である場合、Ｒ2領域は、スルフヒドリル反応性ホモ−二官能性架橋リンカー及び第２のＣｙｓからなるリンカーであることができるか、あるいは、Ｒ1側鎖のスルフヒドリルとＸのカルボキシル基に結合している架橋のようなヘテロ−二官能性架橋リンカーを含むことができる。
【００７４】
本発明の合成ＨＢＧＦ類似体において、一つの好ましい実施態様では、式Ｉ〜ＶＩのいずれかのＹ領域は、ＨＢＧＦ類似体をポリスチレン又はポリカプロラクトン表面などに非共有結合するのに十分なほど疎水性であるリンカーである。加えて、Ｙ領域は、他の疎水性表面、特に医療装置で使用される物質で形成された疎水性表面に結合することができる。そのような表面は典型的には疎水性表面である。適切な表面の例には、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリテトラフルオロエチレン、発泡ポリテトラフルオロエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリアミド、ポリアクリレート、ポリウレタン、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリエチルビニルアセテート、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（エチルレン−コ−ビニルアセテート）、ポリカプロラクトン、ポリラクチド、ポリグリコリド及び前記のいずれかの２個以上のコポリマーのような疎水性ポリマー；２，４，６，８−テトラメチルシクロテトラシロキサンのようなシロキサン；天然及び人造ゴム；ガラス；並びにステンレススチール、チタン、白金及びニチノールを含む金属から形成されるものが含まれるが、これらに限定はされない。好ましくは、疎水性表面へのＨＢＧＦ類似体の結合は、酵素結合免疫測定法又は生物学的検定法のような分析法により検出されるのに十分な量である。
【００７５】
本発明の実施態様によると、式Ｉ〜ＶＩのＹ領域は、原子の鎖又は鎖を形成する原子の組み合わせを含む。典型的には、鎖は、例えば、アミノ酸（例えば、上記で提示されているような、タンパク質で見出されるアミノ酸；オルニチン及びシトルリンのような、タンパク質で見出されない天然に生じるアミノ酸；若しくは直鎖アミノカルボン酸のような非天然アミノ酸；又は前記のアミノ酸のいずれかの組み合わせ）から形成される原子の鎖のような、場合により酸素、窒素又は硫黄原子も含むことができる、炭素原子の鎖である。
【００７６】
式Ｉ〜ＶＩのＹ領域の原子の鎖は、Ｒ1とペプチドＺに共有結合している。共有結合は、例えば、ペプチド、アミド、チオエーテル又はエステル結合であることができる。好ましくは、Ｙ領域は、最低約９個の主鎖原子の鎖を含む。より好ましくは、Ｙ領域は、最低約１２個の原子の鎖を含む。最も好ましくは、Ｙ領域は、最低約１５個の原子の鎖を含む。例えば、Ｙ領域は、少なくとも４個、少なくとも５個、又は少なくとも６個のアミノ酸の鎖から形成されうる。あるいは、Ｙ領域は、少なくとも１個、少なくとも２個、又は少なくとも３個のアミノヘキサン酸残基の鎖から形成されうる。
【００７７】
好ましくは、Ｙ領域は、最大約５０個の主鎖原子の鎖を含む。より好ましくは、Ｙ領域は、最大約４５個の原子の鎖を含む。最も好ましくは、Ｙ領域は、最大約３５個の原子の鎖を含む。例えば、Ｙ領域は、約１２個まで、約１５個まで、又は約１７個までのアミノ酸の鎖から形成されうる。
【００７８】
Ｙ領域のアミノ酸配列は、好ましくは人工配列であり、すなわち、ＨＢＧＦの天然リガンドで見出される４個以上のアミノ酸残基のアミノ酸配列を一つも含まない。
【００７９】
特定の実施態様において、Ｙ領域は、疎水性アミノ酸残基又は疎水性アミノ酸残基の鎖を含む。例えば、Ｙ領域は、例えばアミノヘキサン酸残基、例えば１個、２個、３個又はそれ以上のアミノヘキサン酸残基のような、１個以上の直鎖アミノカルボン酸を含む。あるいは、Ｙ領域は、約１２個まで、約１５個まで、又は約１７個までのエチレングリコール残基を含むことができる。別の代替的実施態様において、Ｙ領域は、アミノ酸疎水性残基の組み合わせを含むことができる。
【００８０】
別の特定の実施態様において、分子のＹ領域は、１〜約２０個の炭素原子の、分岐鎖又は非分岐鎖、飽和又は不飽和アルキル鎖を含むことができる。更なる実施態様において、Ｙ領域は、例えばエチレングリコール残基のような親水性残基の鎖を含むことができる。例えば、Ｙ領域は、少なくとも約３個、又は少なくとも約４個、又は少なくとも約５個のエチレングリコール残基を含むことができる。
【００８１】
式Ｉの分子のＺ領域は、ヘパリン結合領域であり、Verrecchio et al. J.Biol.Chem. 275:7701 (2000）で記載されているように、１個以上のヘパリン結合モチーフ、ＢＢｘＢ又はＢＢＢｘｘＢを含むことができる。あるいは、Ｚ領域は、ＢＢｘＢとＢＢＢｘｘＢのモチーフの両方を含むことができる（ここでＢは、リシン、アルギニン又はヒスチジンを表し、そしてｘは、天然に生じる又は非天然に生じるアミノ酸を表す）。例えば、ヘパリン結合モチーフは、配列［ＫＲ］［ＫＲ］［ＫＲ］Ｘ（２）［ＫＲ］（配列番号１）により表すことができ、最初の３個のアミノ酸がそれぞれ独立してリシン又はアルギニンから選択され、続く任意の２個のアミノ酸及び６個のアミノ酸がリシン又はアルギニンであることを示す。
【００８２】
ヘパリン結合モチーフの数は変わる。例えば、Ｚ領域は、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、又は少なくとも５個のヘパリン結合モチーフを含むことができる。１個を越えるヘパリン結合モチーフがある場合、モチーフは同一でも異なっていてもよい。あるいは、Ｚ領域は、最大約１０個までのヘパリン結合モチーフを含む。別の代替的実施態様において、Ｚ領域は、少なくとも４個、少なくとも６個、又は少なくとも８個のアミノ酸残基を含む。更に、特定の実施態様において、Ｚ領域は、約２０個まで、約２５個まで、又は約３０個までのアミノ酸残基を含む。部分的にはＺ領域のヘパリンへの結合活性は、選択された特定のヘパリン結合モチーフ及びＺにおけるそのようなモチーフの数によって決定されることが理解される。したがって、特定の用途において、そのようなモチーフの選択及び数は、Ｚ領域の最適なヘパリン結合を提供するために変わることができる。
【００８３】
好ましい実施態様において、Ｚ領域のアミノ酸配列は、ＲＫＲＫＬＥＲＩＡＲ（配列番号２）である。別の実施態様において、Ｚ領域のアミノ酸配列は、ＲＫＲＫＬＧＲＩＡＲ（配列番号３）である。なお別の実施態様において、Ｚ領域のアミノ酸配列は、ＲＫＲＫＬＷＲＡＲＡ（配列番号４）である。なお別の実施態様において、Ｚ領域のアミノ酸配列は、ＲＫＲＬＤＲＩＡＲ（配列番号５）であり、Ｊｕｎ／ＡＰ−１ ＤＮＡ結合ドメインの残基２７０−２７９の配列の修飾から誘導されるヘパリン結合モチーフを提供する（Busch et al. Trans-Repressor Activity of Nuclear Glycosaminoglycans on Fos and Jun/AP-1 Oncoprotein-mediated Transcription. J. Cell Biol. 116:31-42, 1992）。なお別の実施態様において、Ｚ領域のアミノ酸配列は、ＲＫＲＫＬＥＲＩＡＲＣ（配列番号６）である。末端システイン残基の存在によって、場合により、蛍光色素、放射性同位体及び他の検出可能なマーカーのような検出可能な試薬を含む他の分子を、Ｚ領域に結合する機会、並びに毒素、免疫原などを結合する機会を得る。
【００８４】
既知のヘパリン結合ドメインにほとんど又は全く配列相同性を持たないヘパリン結合ドメインも、本発明において考慮される。本明細書で使用されるとき、用語「ヘパリン結合」は、−ＮＨＳＯ3-及び硫酸修飾多糖、ヘパリンに結合すること、また、関連する修飾多糖、ヘパランに結合することを意味する。そのようなドメインは、０．１５MのＮａＣｌを含む生理溶液中で結合を示すことが考慮され、０．５M ＮａＣｌを越える塩濃度で非錯化することが予測される。
【００８５】
本発明の合成ＨＢＧＦ類似体のＺ領域は、約０．１５MのＮａＣｌまで、場合により約０．４８MのＮａＣｌまでの低塩濃度でヘパリンに対する結合特性を付与し、ヘパリンと因子類似体のＺ領域との間に錯体を形成する。錯体は、１MのＮａＣｌで解離して、ヘパリン錯体から合成ＨＢＧＦ類似体を放出することができる。
【００８６】
Ｚ領域は、非シグナル伝達ペプチドである。したがって、単独で使用する場合、Ｚ領域は、ＨＢＧＦのレセプターに結合できるヘパリンに結合するが、Ｚ領域ペプチドの結合だけでは、レセプターによるシグナル伝達を開始又は阻止しない。
【００８７】
Ｚ領域のＣ末端は、ブロックされていても遊離であってもよい。例えば、Ｚ領域のＣ末端は、末端アミノ酸の遊離カルボキシル基であることができるか、あるいはＺ領域のＣ末端は、例えばアミド基のようなブロックトカルボキシル基であることができる。
【００８８】
定義：ここで及び他で使用されるとき、以下の用語は示された意味を有する。
【００８９】
用語「アルケン」には、１個以上の二重炭素−炭素結合を含む不飽和炭化水素が含まれる。そのようなアルケン基の例には、エチレン、プロピレンなどが含まれる。
【００９０】
用語「アルケニル」には、少なくとも１個の二重結合を含む、炭素原子２〜６個の直鎖一価炭化水素基又は炭素原子３〜６個の分岐鎖一価炭化水素基が含まれ、その例には、エテニル、２−プロペニルなどが含まれる。
【００９１】
本明細書で特定される「アルキル」基には、直鎖又は分岐鎖の配置での指定された長さのアルキル基が含まれる。そのようなアルキル基の例にはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、sec−ブチル、第三級ブチル、ペンチル、イソペンチル、ヘキシル、イソヘキシルなどが含まれる。
【００９２】
用語「アリール」には、環原子６〜１２個の、場合により、アルキル、ハロアルキル、シクロアルキル、アルコキシ、アルキルチオ、ハロ、ニトロ、アシル、シアノ、アミノ、一置換アミノ、二置換アミノ、ヒドロキシ、カルボキシ又はアルコキシカルボニルから選択される１つ以上の置換基で独立して置換されている、一価又は二環式芳香族炭化水素が含まれる。アリール基の例には、フェニル、ビフェニル、ナフチル、１−ナフチル及び２−ナフチル、それらの誘導体などが含まれる。
【００９３】
用語「アラルキル」には、基−ＲaＲbが含まれ、ここで、Ｒaはアルキレン（二価アルキル）基であり、そしてＲbは上記で定義されたアリール基である。アラルキル基の例には、ベンジル、フェニルエチル、３−（３−クロロフェニル）−２−メチルペンチルなどが含まれる。用語「脂肪族」には、例えばアルカン、アルケン、アルキン及びこれらの誘導体のような、炭化水素鎖を有する化合物が含まれる。
【００９４】
用語「アシル」には、基ＲＣＯ−が含まれ、ここでＲは、有機基である。一例は、アシル基ＣＨ3ＣＯ−である。
【００９５】
ペプチド又は脂肪族部分は、上記で定義されたアルキル又は置換アルキル基が１個以上のカルボニル｛−（Ｃ＝Ｏ）−｝基を介して結合している場合、「アシル化」されている。ペプチドは、最も一般的には、Ｎ末端においてアシル化されている。
【００９６】
「アミド」には、カルボニル基（−ＣＯ．ＮＨ2）に結合している三価窒素を有する化合物が含まれる。
【００９７】
「アミン」には、アミノ基（−ＮＨ2）を含む化合物が含まれる。
【００９８】
「ジアミンアミノ酸」は、２個の反応性アミン基と１個の反応性カルボキシル基を含むアミノ基又は残基である。代表的な例には、２，３−ジアミノプロピルアミノ酸、２，４−ジアミノブチルアミノ酸、リシン又はオルニチンが含まれる。
【００９９】
本明細書で使用されるとき、用語「相同性」は、配列が整列したとき、アミノ酸の位置の１か所以上でアミノ酸配列が異なるペプチドを意味する。例えば、２個の相同性ペプチドのアミノ酸配列では、整列したアミノ酸配列の５〜１０個のアミノ酸のうちで１個のアミノ酸残基しか異なることができない。あるいは、２個の、アミノ酸が１０〜１５個の相同性ペプチドでは、整列したとき２個以下のアミン酸残基が異なることができる。別の代替案において、２個の、アミノ酸が１５〜２０個又はそれ以上の相同性ペプチドでは、整列したとき３個までのアミン酸残基が異なることができる。もっと長いペプチドにおいて、相同性ペプチドでは、２個のペプチド相同体のアミノ酸配列が整列したとき、およそ５％、１０％、２０％又は２５％までのアミノ酸残基が異なることができる。
【０１００】
「三官能性アミノ酸」は、３個の反応性基を持つアミノ酸又は残基であり、第１はＮ−末端アミンであり、第２はＣ末端カルボキシルであり、第３は側鎖の全て又は一部を含む。したがって三官能性アミノ酸には、単なる例として、ジアミンアミノ酸；システイン、ペニシラミン又は３−メルカプトフェニルアラニンを含む、メルカプトアミノ酸のような側鎖に反応性スルフヒドリル基を有するアミノ酸；アスパルギン酸及びグルタミン酸のような、側鎖に反応性カルボキシル基を有するアミノ酸；並びにアルギニンのような、側鎖に反応性グアナジウム基を有するアミノ酸が含まれる。
【０１０１】
ＦＧＦ合成類似体：別の特定の態様において、本発明は合成ＦＧＦペプチド類似体を提供する。合成ＦＧＦ類似体は、Ｘが、ＦＧＦ−１〜ＦＧＦ−２３の２３個のＦＧＦを全て含む、既知のＦＧＦのいずれかのような任意のＦＧＦでありうるＦＧＦ類似体である、上記の式Ｉ〜ＶＩのいずれかにより表される。
【０１０２】
式Ｉ〜ＶＩの分子のＸ領域は、例えばＦＧＦ−２又はＦＧＦ−７のような、ＦＧＦで見出されるアミノ酸配列を含むことができる。あるいは、Ｘ領域は、分子により結合されているＦＧＦＲの天然リガンドで見出されない配列を含むことができる。
【０１０３】
式Ｉ〜ＶＩのいずれかの合成ＦＧＦペプチド類似体のＹ領域は、必ずしも疎水性でなくてもよく、したがって、存在する場合は、極性、塩基性、酸性、親水性又は疎水性であることができる。したがって、合成ＦＧＦペプチド類似体のＹ領域のアミノ酸残基は、あらゆるアミノ酸、又は極性、イオン性、疎水性又は親水性基を含むことができる。
【０１０４】
合成ＦＧＦペプチド類似体のＸ領域は、線維芽細胞増殖因子で見出されるアミノ酸配列又は線維芽細胞増殖因子のアミノ酸配列に相同性のアミノ酸配列と１００％同一であるアミノ酸配列を含むことができる。例えば、Ｘ領域は、線維芽細胞増殖因子のアミノ酸配列に、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、又は少なくとも約９０％相同性があるアミノ酸配列を含むことができる。線維芽細胞増殖因子は、既知又は未だに同定されていない線維芽細胞増殖因のうちのいずれかを含む、あらゆる線維芽細胞増殖因であることができる。
【０１０５】
特定の実施態様において、本発明の合成ＦＧＦ類似体は、ＨＢＧＦＲのアゴニストである。ＨＢＧＦＲに結合すると、合成ＨＢＧＦ類似体は、ＨＢＧＦＲによるシグナルを開始する。
【０１０６】
更なる特定の実施態様において、本発明の合成ＦＧＦ類似体は、ＨＢＧＦＲのアンタゴニストトである。ＨＢＧＦＲに結合すると、合成ＨＢＧＦ類似体は、ＨＢＧＦＲによるシグナル伝達を阻止する。
【０１０７】
本発明の別の特定の実施態様において、合成ＦＧＦ類似体は、ＦＧＦ−２（塩基性ＦＧＦ又はｂＦＧＦとしても知られている）の類似体である。本発明の別の特定の実施態様において、合成ＦＧＦ類似体の、ＦＧＦレセプターへの結合は、ＦＧＦレセプターによるシグナルを開始する。更なる特定の実施態様において、合成ＦＧＦ類似体の、ＦＧＦレセプターへの結合は、ＦＧＦレセプターによるシグナル伝達を阻止する。
【０１０８】
なお更なる特定の実施態様において、本発明は、ＦＧＦ−２の合成ＦＧＦ類似体を提供する。別の特定の実施態様において、本発明は、ＦＧＦ−２のＸ領域のアミノ酸配列がＹＲＳＲＫＹＴＳＷＹＶＡＬＫＲ（配列番号７）である、ＦＧＦ−２のＦＧＦ類似体を提供する。なお別の特定の実施態様において、本発明は、Ｘ領域のアミノ酸配列がＮＲＦＨＳＷＤＣＩＫＴＷＡＳＤＴＦＶＬＶＣＹＤＤＧＳＥＡ（配列番号８）である、合成ＦＧＦ類似体を提供する。なお別の特定の実施態様において、本発明は、Ｘ領域のアミノ酸配列がＨＩＫＬＱＬＱＡＥＥＲＧＶＶＳ（配列番号９）である、合成ＦＧＦ−２類似体を提供する。
【０１０９】
なお更なる特定の実施態様において、本発明は、Ｘ領域がＹＩＳＫＫＨＡＥＫＮＷＦＶＧＬＫＫ（配列番号１０）である、ＦＧＦ−１の合成ＦＧＦ類似体を提供する。この配列は、ＦＧＦ−１のβ９及びβ１０ループを架橋するアミノ酸から誘導される。なお別の特定の実施態様において、Ｘ領域が、ＦＧＦ−１のβ４及びβ５領域から誘導されるアミノ酸に対応するＨＩＱＬＱＬＳＡＥＳＶＧＥＶＹ（配列番号１１）である、ＦＧＦ−１類似体が提供される。
【０１１０】
なお更なる特定の実施態様において、本発明は、Ｘ領域がＹＡＳＡＫＷＴＨＮＧＧＥＭＦＶＡＬＮＱＫ（配列番号１２）である、ＦＧＦ−７の合成ＦＲＧ類似体を提供する。ＦＧＦ−７の合成ＦＲＧ類似体合のなお別の実施態様において、Ｘ領域は、アミノ酸配列ＹＮＩＭＥＩＲＴＶＡＶＧＩＶＡ（配列番号１３）である。
【０１１１】
ヒトＦＧＦのＣ末端における標的配列から主に誘導される他のＦＧＦレセプター結合ドメインは、表１で示される以下の配列を含む。
【０１１２】
【表１】
【０１１３】
ＶＥＧＦ合成類似体：別の特定の態様において、本発明は合成ＶＥＧＦペプチド類似体を提供する。一つの実施態様において表される合成ＶＥＧＦ類似体には、Ｘ領域のアミノ酸配列がＡＰＭＡＥＧＧＧＱＮＨＨＥＷＫＦＭＤＶ（配列番号２５）である、ＶＥＧＦ類似体が含まれる。別の実施態様では、Ｘ領域のアミノ酸配列がＧＡＴＷＬＰＰＮＰＴＫ（配列番号２６）である、合成ＶＥＧＦペプチド類似体が提供される。なお別の実施態様では、Ｘ領域のアミノ酸配列がＮＦＬＬＳＷＶＨＷＳＬＡＬＬＬＹＬＨＨＡ（配列番号２７）である、合成ＶＥＧＦペプチド類似体が提供される。
【０１１４】
ＢＭＰ合成類似体：別の特定の態様において、本発明は合成ＢＭＰペプチド類似体を提供する。合成骨形成タンパク質類似体は、Ｘ領域がアミノ酸配列ＬＹＶＤＦＳＤＶＧＷＮＤＷ（配列番号：２８）、ＡＩＳＭＬＹＬＤＥＮＥＫＶＶＬ（配列番号：２９）、ＩＳＭＬＹＬＤＥＮＥＫＶＶＬＫＮＹ（配列番号３０）、ＥＫＶＶＬＫＮＹＱＤＭＶＶＥＧ（配列番号：３１）、ＬＶＶＫＥＮＥＤＬＹＬＭＳＩＡＣ（配列番号：３２）、ＡＦＹＣＨＧＥＣＰＦＰＬＡＤＨＬ（配列番号：３３）、ＰＦＰＬＡＤＨＬＮＳＴＮＨＡＩＶＱＴＬＶＮＳＶ（配列番号：３４）、ＴＱＬＮＡＩＳＶＬＹＦＤＤＳＳＮＶＩＬＫＫＹＲＮＭＶＶ（配列番号８７）及び／又はＨＥＬＹＶＳＦＲＤＬＧＷＱＤＷＩＩＡＰＥＧＹＡＡＹ（配列番号：８８）を含む実施態様を含む。
【０１１５】
あるいは、別の特定の態様において、本発明は、合成アビニンＡを提供し、合成アビニンＡタンパク質類似体は、Ｘ領域がアミノ酸配列ＳＭＬＹＹＤＤＧＱＮＩＩＫＫ（配列番号８９）、ＫＫＩＩＮＱＧＤＤＹＹＬＭＳ（配列番号９０）及び／又はＳＭＬＹＹＤＤＧＱＮＩＩＫＫＤＩ（配列番号９１）を含む実施態様を含む。
【０１１６】
あるいは、別の特定の態様において、本発明は、合成Ｇ−ＣＳＦを提供し、合成Ｇ−ＣＳＦタンパク質類似体は、Ｘ領域がアミノ酸配列ＡＳＳＬＰＱＳＦＬＬＫＣＬＥＱＶＲＫＩＱ（配列番号９２）、ＬＤＶＡＤＦＡＴＴＩＷＱＱＭＥＥＬ（配列番号９３）及び／又はＹＫＬＡＨＰＥＥＬＶＬ（配列番号９４）を含む実施態様を含む。
【０１１７】
あるいは、別の特定の態様において、本発明は、合成ＧＭ−ＣＳＦを提供し、合成ＧＭ−ＣＳＦタンパク質類似体は、Ｘ領域がアミノ酸配列ＷＥＨＶＮＡＩＱＥＡＲＲＬＬＮＬ（配列番号９５）、ＬＱＴＲＬＥＬＹＫＱＧＬＲＧＳＬＴＫＬＫＧＰＬＴＭＭＡＳＨＹＫＱＨ（配列番号９６）及び／又はＳＦＫＥＮＬＫＤＦＬＬＶＩ（配列番号９７）を含む実施態様を含む。
【０１１８】
あるいは、別の特定の態様において、本発明は、合成ＩＦＮ−βを提供し、合成ＩＦＮ−βタンパク質類似体は、Ｘ領域がアミノ酸配列ＳＶＱＡＲＷＥＡＡＦＤＬＤＬＹ（配列番号９８）、ＹＬＤＬＤＦＡＡＥＷＲＡＱＶＳ（配列番号９９）及び／又はＳＳＳＴＧＷＮＥＴＩＶＥＮＬＩ（配列番号１００）を含む実施態様を含む。
【０１１９】
あるいは、別の特定の態様において、本発明は、合成ＰＤＧＦを提供し、合成ＰＤＧＦタンパク質類似体は、Ｘ領域がアミノ酸配列ＫＴＲＴＥＶＦＥＩＳＲＲＬＩＤＲＴＮＡＮＦＬＶＷ（配列番号１０１）及び／又はＱＶＲＫＩＥＩＶＲＫＫＰＩＦＫＫ（配列番号１０２）を含む実施態様を含む。
【０１２０】
あるいは、別の特定の態様において、本発明は、合成ＳＤＦ−１を提供し、合成ＳＤＦ−１タンパク質類似体は、Ｘ領域がアミノ酸配列ＫＰＶＳＬＳＹＲＣＰＣＲＦＦＥＳＨＶＡ（配列番号１０３）及び／又はＫＷＩＱＥＹＬＥＫ（配列番号１０４）を含む実施態様を含む。
【０１２１】
あるいは、別の特定の態様において、本発明は、形質転換増殖因子ファミリーメンバーペプチドが内在性又は人工ＢＭＰペプチド又はＴＧＦペプチドの活性を増強するのに特に有用であり、かつ式Ｉ〜ＶＩのいずれかの作成物のＸ領域の全て又は一部を形成する配列を（「好ましいレセプター結合ドメイン」の項目の下に）示している表２で示されている、合成ＢＭＰ、ＴＧＦ及びＧＤＦ（増殖分化因子）ペプチド類似体を提供する。
【０１２２】
【表２】
【０１２３】
驚くべきことに、また有利なことに、式Ｉ〜ＶＩのものを含む本発明の化合物において、通常のＮ→Ｃ配向で示されている配列ＡＩＳＭＬＹＬＤＥＮＥＫＶＶＬ（配列番号２９）を考慮し、式ＩＩを使用すると、Ｒ1側鎖又はＮ末端アミンに結合している第１のアミノ酸は、（そのカルボキシル基を介して結合して、それによってペプチド結合を形成する）Ｎ末端アミノ酸残基であり、Ｎ末端アミノ酸残基に結合している第２のアミノ酸は２位の残基であるなどのように、Ｘ領域を逆方向で合成することができ、それにもかかわらず化合物は、生物活性を保持し、ＢＭＰレセプターに特異的に結合していることが見出された。Ｒ1がジアミンアミノ酸であるＲ1のアミンを有するペプチド結合を形成するのは従来のＮ末端アミノ酸残基のカルボニル基であるので、そのような作成物は、従来のＮ→Ｃ配向に対して逆配列を有することを見ることができる。したがって、この場合でも従来のＮ→Ｃ配向を用いて、前記の配列を逆方向で用いることができ、得られた本発明の化合物は、生物活性があり、本明細書に記載されたとおりに用いることができる。好ましい実施態様によると、Ｘ領域は、配列ＬＶＶＫＥＮＥＤＬＹＬＭＳＩＡ（配列番号５７）であり、ここでも配列は従来のＮ→Ｃ配向で考慮されている。
【０１２４】
ＬＶＶＫＥＮＥＤＬＹＬＭＳＩＡ（配列番号５７）に加えて、その相同体を含み、全体的に又は部分的に用いることができる他の逆配列には、ＹＮＫＬＶＶＫＥＮＥＤＬＹＬＭＳＩ（配列番号５８）、ＫＫＬＩＶＮＳＳＥＤＦＹＬ（配列番号５９）、ＷＤＮＷＧＶＤＳＦＤＶＹＬ（配列番号６０）、ＧＥＶＶＭＤＱＹＮＫＬＶＶＫＥ（配列番号６１）、ＬＨＤＡＬＰＦＰＣＥＧＨＣＹＦＡ（配列番号６２）、ＶＳＮＶＬＴＱＶＩＡＨＮＴＳＮＬＨＤＡＬＰＦＰ（配列番号６３）及びＬＶＶＫＥＮＥＤＬＹＬＭＳＩＡＣ（配列番号６４）が含まれるが、これらに限定はされない。
【０１２５】
本発明の特定の実施態様において、式ＩのＲ2領域は、それぞれ異なっており、式ＩＶ及びＶＩにおいて、１個のＲ1基しか提供されていない。式Ｉにおいてさえも、そのような領域は異なっていることができることが考慮され、例えば式Ｉにおいて、Ｒ1は、リシンのようなジアミンアミノ酸であることができる。合成の際に直交保護基を利用してαアミン又はεアミンのいずれかを保護し、その後、アミノ酸残基又は他の基のうちの１つを加えてＲ2基を形成し、次に直交保護基を除去し、Ｒ1の脱保護アミンとＲ2の末端アミンからのＸ基の平行合成を進めることが可能である。
【０１２６】
ヘパリン結合増殖因子類似体を合成する方法：本発明の類似体の合成は、当該技術分野で周知の多様な化学的方法のいずれかにより達成することができる。そのような方法には、多くの市販のペプチド合成機のうちのいずれかによる、ベンチスケール固相合成及び自動ペプチド合成が含まれる。好ましくは、合成機は、９９％を越える１サイクルあたりのカップリング効率を有する。
【０１２７】
本発明の類似体は、段階的合成によるか、又は同様の周知の技術によりカップリングできる一連のフラグメントの合成により産生することができる。例えば、Nyfeler, Peptide synthesis via fragment condensation. Methods Mol. Biol. 35:303-16 (1994);及びMerrifield, Concept and early development of solid-phase peptide synthesis. Methods in Enzymol. 289:3-13 (1997)を参照すること。これらの方法は、個別のペプチドを調製するのに日常的に使用されている。本発明の類似体を、Ｘ、Ｙ及びＺ成分を構成するペプチドのような成分の部分から組み立て、その後、そのような成分の部分を類似体に組み立てることが可能である。例えば、Dawson and Kent, Synthesis of native proteins by chemical ligation. Annu. Rev. Biochem. 69:923-960 (2000);及びEom et al., Tandem ligation of multipartite peptides with cell-permeable activity. J. Am. Chem. Soc. 125:73-82 (2003)を参照すること。しかし、好ましい実施態様において、本発明の化合物は、樹脂に結合している式Ｉ〜ＶＩのＺ領域のＣ末端残基及び段階的に進行する合成を用いて、固相合成により合成される。樹脂からのペプチドの開裂の前、その間又はその後のいずれかでの脱保護のために、必要であれば、従来の保護基が用いられる。単なる例として、式ＩのＲ1の位置のものに加えて、１つ以上のリシン残基を含む本発明の化合物において、そのような追加的なリシン残基は、保護基により慣用的に保護され、合成の後で脱保護される。
【０１２８】
ＨＢＧＦＲへの結合のように、望ましい特性のためにスクリーニングするのに使用できるペプチドライブラリーは、これらの方法を適合させて調製できる。例えば、 Fox, Multiple peptide synthesis, Mol. Biotechnol. 3:249-58 (1995);及びWade and Tregear, Solid phase peptide synthesis: recent advances and applications. Austral. Biotechnol. 3:332-6 (1993)を参照すること。
【０１２９】
特定の実施態様において、本発明の合成ＨＢＧＦ類似体は、ＨＢＧＦＲのアゴニストである。ＨＢＧＦＲに結合すると、合成ＨＢＧＦ類似体は、ＨＢＧＦＲによるシグナルを開始する。
【０１３０】
別の特定の実施態様において、本発明の合成ＨＢＧＦ類似体は、ＨＢＧＦＲのアンタゴニストである。ＨＢＧＦＲに結合すると、合成ＨＢＧＦ類似体は、ＨＢＧＦＲによるシグナル伝達を阻止する。
【０１３１】
特定の態様において、本発明は、細胞と、式Ｉ〜ＶＩの合成ＨＢＧＦ類似体の有効量とを接触させることによって、細胞における増殖因子レセプターシグナル伝達を刺激する方法を提供する。有効量は、当業者によって容易に決定することができる。シグナル伝達は、細胞からのサイトカイン放出、細胞の増殖又は分化の刺激又は阻害、細胞の走化性、哺乳動物の免疫系の刺激又は阻害により生じることができる。
【０１３２】
本発明のＨＢＧＦの使用方法：例えば癌療法及び放射線防護での使用を含む、例えば多様な疾患の予防又は治療のための可溶性薬剤としての投与のような、可溶性の予防又は治療用医薬品を含む、多数の方法で有用な生物活性分子の費用効果の高い潜在的に無制限の供給源を提供する。
【０１３３】
本発明の合成ＨＢＧＦ類似体は、例えば、細胞の成長および増殖を刺激するため又は傷を治癒するための、例えば生物学的反応を促進する縫合糸、移植片及び医用器具のような医療装置の被覆用の生物活性剤としても有用である。
【０１３４】
一つの態様において、本発明は、放射線の有害な量に暴露された哺乳類を治療する方法及び組成物を提供する。方法は、ＦＧＦ類似体である本発明の合成ＨＢＧＦ類似体の有効量を哺乳動物に投与することを含む。この治療は、粘膜炎、胃腸管系症候群（ＧＩ症候群）又は放射線への暴露により起こりうるような放射線壊死の予防又は治療に特に有用である。ＨＢＧＦ類似体は、非経口、経口、又は局所投与することができる。あるいは、ＨＢＧＦ類似体は、例えば類似体被覆医療装置により局所領域的に送達できる。関連する実施態様において、本発明は、化学療法剤の毒性を改善する用量の化学療法剤を哺乳動物に投与する、哺乳動物の治療方法を提供する。上記に記載された特定の実施態様において、哺乳動物はヒトである。方法の別の特定の実施態様において、ＨＢＧＦ類似体は、ＦＧＦ−２類似体又はＦＧＦ−７類似体である。
【０１３５】
別の態様において、本発明は、ＢＭＰ−２の類似体のような、ＢＭＰ ＨＢＧＦＲに反応性のあるＸ領域を有する本発明のＨＢＧＦ類似体を提供することによる、骨損傷のある哺乳動物を治療する方法及び組成物を提供する。例えば、本発明のそのようなＨＢＧＦ類似体を、医薬品として投与することができるか、又は骨基質若しくは骨移植材料への添加剤として用いることができる。
【０１３６】
別の態様において、本発明は、細胞又は臓器移植部位を調製するための方法及び組成物を提供する。一つの実施態様において、本発明のＦＧＦ−２のホモ二量体ＨＢＧＦ類似体を、経皮経路により投与して、インスリン分泌膵臓細胞の移植の前に、局所血管形成を刺激し、それによって移植細胞の生存を改善する。同様に、本発明のＦＧＦ−２のホモ二量体ＨＢＧＦ類似体は、筋幹細胞の移植の前に虚血性心臓組織に投与される。
【０１３７】
別の態様において、本発明は、医療装置の血液接触表面への細胞付着及びその上での細胞保持を増やす方法及び組成物を提供する。一つの実施態様において、本発明のＶＥＧＦのホモ二量体ＨＢＧＦ類似体を、血管移植片材料に適用し、これにより、結合された類似体が血液から循環内皮幹細胞を動員して結合させ、それによって移植片表面の内皮化をもたらし、それによりもたらされた長期血栓抵抗性が移植片に付与される。
【０１３８】
別の態様において、本発明は、膜誘導組織増殖を増加及び提供する方法及び組成物を提供する。
【０１３９】
別の態様において、本発明は、潰瘍を含む治療が困難な皮膚損傷の治療のための方法及び組成物を提供する。一つの実施態様において、ＴＧＦ−β１のホモ二量体ＨＢＧＦ類似体を、潰瘍化褥瘡及び同様の治療が困難な皮膚損傷の治療のために、薬学的に許容されるクリーム又はゲルで局所適用する。
【０１４０】
なお別の態様において、本発明は、インビトロで細胞集団を選択的に増加する方法及び組成物を提供する。例えば、ＴＧＦ−β１のホモ二量体ＨＢＧＦ類似体を、組織培地中で配合して、軟骨細胞、軟骨細胞を生じる幹細胞又は軟骨細胞を生じる多機能細胞の増殖を特異的に刺激する。同様に、ＶＥＧＦのホモ二量体ＨＢＧＦ類似体を用いて、内皮細胞の増殖を刺激することができる。
【０１４１】
本明細書で使用されるとき、用語「医療装置」は、生物体、好ましくは哺乳動物、特にヒトにおいて、臓器、組織、血液又は他の体液に接触する１つ以上の表面を有する装置を意味する。医療装置には、例えば、患者に戻される血液に接触する、血液酸素供給器、血液ポンプ、血液センサー、血液を運ぶ管などのような外科手術で使用される体外装置が含まれる。この用語は、血管又は心臓に移植された、移植血管、ステント、ペースメーカー導出、心臓弁などのようなヒト又は動物の体内において血液に接触するように移植された内部人工器官も含むことができる。この用語は、更に、モニタリング又は修復の目的で血管又は心臓に入れられたカテーテル、ガイドワイヤなどのような、一時的な血管内使用のための装置を含むことができる。この用語は、更に、神経電極、筋肉電極、植え込み型パルス発生器、植え込み型薬剤ポンプ、及び細動除去器を含むことができる。更に、医療装置という用語は、縫合糸、移植片材料、創傷被覆、神経誘導、骨ロウ、動脈瘤コイル、塞栓形成粒子、マイクロビーズ、人工歯根、人工骨、組織骨格、人工関節、又は制御放出薬剤送達装置を含むことができる。
【０１４２】
医療装置の表面は、例えば、ステンレススチール、チタン、白金、タングステン、セラミック、ポリウレタン、ポリテトラフルオロエチレン、発泡ポリテトラフルオロエチレン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリアミド、ポリアクリレート、ポリウレタン、ポリビニルアルコール、ポリカプロラクトン、ポリアクチド、ポリグリコシド、ポリシロキサン（例えば、２，４，６，８−テトラメチルシクロテトラシロキサン）、天然ゴム若しくは人造ゴム、又はこれらのブロックポリマー若しくはコポリマーのような、医療装置での使用が適切な慣用的に使用される材料のいずれかにより形成することができる。
【０１４３】
生物分子を医療装置の表面に被覆する方法は既知である。例えば、米国特許第５，８６６，１１３号（Hendriksら）を参照すること（この明細書は参照により本明細書に組み込まれる）。米国特許第５，９５５，５８８号（Tsangら）は、抗血栓性被覆組成物及び医療装置におけるその使用方法を教示し、参照により本明細書に組み込まれる。米国特許第６，３４２，５９１号（Zamoraら）は、細胞付着組成物を調節するための、医療装置用の両親媒性被覆を教示し、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４４】
一つの実施態様において、本発明は、活性ペプチドを哺乳動物へ送達する方法を提供し、その方法は、（ｉ）医療装置の表面に非共有結合で結合している式Ｉ〜ＶＩの合成ＨＢＧＦ類似体で表面が被覆されている医療装置を提供すること、及び（ｉｉ）医療装置を哺乳動物の表面に設置するか又は医療装置を哺乳動物の中に移植することを含む。
【０１４５】
上記の方法の特定の実施態様において、非共有結合は、合成ＨＢＧＦ類似体のヘパリン結合ドメインと、医療装置の表面に結合しているヘパリン含有化合物との間の会合である。医療装置の表面に結合しているヘパリン含有化合物は、例えばベンジル−ビス（ジメチルシリルメチル）オキシカルバモイル−ヘパリンのような、あらゆるヘパリン含有化合物であることができる。
【０１４６】
上記の方法の別の特定の実施態様において、医療装置は、式Ｉ〜ＶＩの合成ＨＢＧＦ類似体で被覆される前に、ヘパリン含有化合物でプレコートされていない。
【０１４７】
ヘパリン結合増殖因子類似体の医薬用途：本発明のＨＢＧＦ類似体を、医療用途と畜産又は獣医用との両方において医薬組成物の活性成分として使用することができる。典型的には、ＨＢＧＦ類似体又は医薬組成物は、ヒトで使用されるが、他の哺乳動物で使用することもできる。用語「患者」は、個々の哺乳類を示すことが意図され、明細書及び請求項全体を通してそのように使用される。本発明の主な用途はヒトの患者に関わるが、本発明は、実験室、農場、動物園、野生、ペット、競技用、又は他の動物に適用することができる。
【０１４８】
本発明のＨＢＧＦ類似体は、任意の薬学的に許容される塩の形態であることができる。用語「薬学的に許容される塩」は、無機又は有機塩基及び無機又は有機酸を含む、薬学的に許容される非毒性塩基又は酸から調製される塩を意味する。無機塩基から誘導される塩には、アルミニウム、アンモニウム、カルシウム、銅、第二鉄、第一鉄、リチウム、マグネシウム、マンガン塩、第一マンガン、カリウム、ナトリウム、亜鉛などが含まれる。特に好ましいものは、アンモニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム及びナトリウム塩である。薬学的に許容される有機非毒性塩基から誘導される塩には、アルギニン、ベタイン、カフェイン、コリン、Ｎ，Ｎ′−ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチル−モルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リシン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、トリプロピルアミン、トロメタミンなどのような、第一級、第二級及び第三級アミン、天然に生じるアミンを含む置換アミン、環状アミン、並びに塩基性イオン交換樹脂の塩が含まれる。
【０１４９】
本発明のＨＢＧＦ類似体が塩基性である場合、酸付加塩は、無機及び有機酸を含む薬学的に許容される非毒性酸から調製することができる。そのような酸には、酢酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、ショウノウスルホン酸、カルボン酸、クエン酸、エテンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、グルコン酸、グルタミン酸、臭化水素酸、塩酸、イセチオン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、マロン酸、粘液酸、硝酸、パモン酸、パントテン酸、リン酸、プロピオン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸、ｐ−トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸などが含まれる。本発明のＨＢＧＦ類似体の酸付加塩は、ＨＢＧＦ類似体に適切な溶媒と、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸、酒石酸、マレイン酸、コハク酸又はメタンスルホン酸のような酸の過剰量で調製される。酢酸塩形態が特に有用である。本発明のＨＢＧＦ類似体が酸性部分を含む場合、適切な薬学的に許容される塩は、ナトリウム若しくはカリウム塩のようなアルカリ金属塩、又はカルシウム若しくはマグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩を含むことができる。
【０１５０】
本発明は、本発明のＨＢＧＦ類似体と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。担体は、液体配合物であることができ、一つの実施態様において、緩衝された等張の水溶液であることができる。薬学的に許容される担体は、本明細書後記で記載される、稀釈剤、担体などのような賦形剤、及び安定剤、防腐剤、可溶化剤、緩衝剤などのような添加剤も含む。
【０１５１】
したがって、本発明のＨＢＧＦ類似体組成物は、本発明のＨＢＧＦ類似体の少なくとも１つを、所望であれば、稀釈剤、担体などのような賦形剤、及び安定剤、防腐剤、可溶化剤、緩衝剤などのような添加剤を含む薬学的に許容される担体の１つ以上と一緒に含む、医薬組成物に配合又は混合することができる。配合賦形剤は、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、ヒドロキシセルロース、アカシア、ＰＥＧ、ＰＥＯ、マンニトール、塩化ナトリウム又はクエン酸ナトリウム、並びにスクロース、デキストロース、ラクトースなど及び前記の組み合わせを含むいくつもの単糖類を含むことができる。注入又は他の液体投与製剤では、少なくとも１つ以上の緩衝構成成分を含む水が好ましく、安定剤、防腐剤及び可溶化剤を用いることもできる。固体投与製剤では、デンプン、糖、脂肪酸などのような、多様な増粘、充填、増量及び担体添加剤のいずれかを用いることができる。局所投与製剤では、多様なクリーム、軟膏、ゲル、ローションなどのいずれかを用いることができる。大部分の医薬製剤では、非活性成分が、重量又は容量に基づいて調合剤の大部分を構成する。医薬製剤では、多様な計量放出、徐放又は徐効製剤及び添加剤のいずれかを用いることができることも考慮され、これによって本発明のＨＢＧＦ類似体の送達を経時的に実施するように、用量を配合することができる。
【０１５２】
実際に使用する場合には、本発明のＨＢＧＦ類似体を、活性成分として、従来の医薬混合技術に従って医薬担体と混合物中で組み合わせることができる。担体は、例えば経口、非経口（静脈内を含む）、尿道、膣内、経鼻、口腔内、舌下などの投与に望ましい調製形態に応じた多様な形態を取ることができる。組成物を経口投与形態に調製するには、例えば懸濁剤、エリキシル剤及び液剤のような経口液体調合剤の場合は、例えば水、グリコール、油、アルコール、風味剤、防腐剤、着色剤などのような、又は例えば粉末剤、硬質及び軟質カプセル剤及び錠剤のような経口固体調合剤の場合は、デンプン、糖、微晶質セルロース、稀釈剤、造粒剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤などのような担体のような、通常の医薬媒質のいずれかを用いることができる。
【０１５３】
注入用に適切な医薬形態には、滅菌水性液剤又は分散剤、及び滅菌注入用液剤又は分散剤のその場での調製用の滅菌粉末剤が含まれる。全ての場合において、形態は滅菌でなければならず、シリンジにより投与できる程度に流体でなければならない。形態は、製造及び保存条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌のような微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール、例えばグリセロール、プロピレングルコール又は液体ポリエチレングルコール、これらの適切な混合物、及び植物油を含有する溶媒又は分散体媒質であることができる。
【０１５４】
ＨＢＧＦ類似体医薬組成物が注入により投与される場合、注入は、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、又は当該技術分野で既知の他の方法であることができる。あるいは本発明のＨＢＧＦ類似体を、当該技術分野で既知のあらゆる方法により、錠剤、カプセル剤、カプレット剤、懸濁剤、粉末剤、凍結乾燥調合剤、坐剤、点眼薬、皮膚パッチ剤、経口可溶性製剤、噴霧剤、エアゾール剤などが含まれるが、これらに限定はされない製剤に配合することができ、緩衝剤、結合剤、賦形剤、安定剤、酸化防止剤及び当該技術で既知の他の作用物質と混合し、配合することができる。一般に、本発明のＨＢＧＦ類似体が細胞の表皮層を越えて導入される、あらゆる投与経路を用いることができる。したがって投与方法には、粘膜を通す投与、口腔内投与、経口投与、経皮投与、吸入投与、経鼻投与、尿道投与、膣内投与などが含まれる。
【０１５５】
一般に、患者に投与される本発明のＨＢＧＦ類似体の実際の量は、投与様式、使用される製剤、及び望ましい反応に応じてかなり広範囲にわたって変わる。前記の方法のいずれかにより又は当該技術分野で既知の他の方法のいずれかにより、望ましい治療効果をもたらすのに十分な量の治療用量が投与される。
【０１５６】
ヘパリン結合増殖因子：線維芽細胞増殖因子ＦＧＦは、間葉、上皮及び神経外胚葉細胞型の正常な増殖及び分化を制御する関連するタンパク質のファミリーを構成する。相同体は、多種多様な種で見出されている。ＦＧＦは、ヘパリンに非常に高い親和性を示し、したがって、ヘパリン結合増殖因子（ＨＢＧＦ）とも称される。本明細書中で使用されるように、用語ＨＢＧＦには、全てのＦＧＦが含まれる。
【０１５７】
２つの主要な型のＦＧＦが知られている。ＦＧＦの第１の型は、最初に脳組織から単離された。これは、３Ｔ３細胞のようなネズミ線維芽細胞に対するその増殖促進活性により同定された。その塩基性のｐＩのため、因子は、塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ又はＨＢＧＦ−２、ヘパリン結合増殖因子−２）と命名され、現在は、一般にＦＧＦ−２と称される。これはＦＧＦファミリーのプロトタイプである。
【０１５８】
同様に脳組織から単離されているＦＧＦの別の型は、酸性ＦＧＦ（ａＦＧＦ、またＨＢＧＦ−１、ヘパリン結合増殖因子−１又はＨＢＧＦ−α、ヘパリン結合増殖因子αとしても知られている）であり、現在、一般にＦＧＦ−１と称される。これは、筋芽細胞に対するその増殖促進活性による同定された。
【０１５９】
同じファミリーに属する他の線維芽細胞増殖因子には、ＦＧＦ−３（又はＨＢＧＦ−３、ヘパリン結合増殖因子３、元はｉｎｔ−２と称される；Fekete, Trends in Neurosci. 23:332 (2000)を参照すること）、ＦＧＦ−４（又ＨＢＧＦ−４、ヘパリン結合増殖因子４、最初は腫瘍遺伝子ｈｓｔの産物として認識される；Sakamoto et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:12368-7を参照すること）、及びＦＧＦ−５（元はＨＢＧＦ−５と称される、Bates et al. Biosynthesis of human fibroblast growth factor 5. Mol. Cell. Biol. 11:1840-1845 (1991); Burgess and Maciag, The heparin-binding (fibroblast) growth factor family of proteins. Ann. Rev. Biochem. 58: 575-606 (1989);及びZhan et al. The human FGF-5 oncogene encodes a novel protein related to fibroblast growth factors. Mol. Cell. Biol. 8:3487-3495 (1988)を参照すること）が含まれる。
【０１６０】
ＦＧＦ−６は、ＨＢＧＦ−６としても知られており、時々、ｈｓｔ−２又は腫瘍遺伝子ｈｓｔ−１関連増殖因子と称される（Iida et al. Human hst-2 (FGF-6) oncogene: cDNA cloning and characterization. Oncogene 7:303-9 (1992);及びMaries et al. Characterization of the HST-related FGF-6 gene, a new member of the fibroblast growth factor gene family. Oncogene 4:335-40 (1989)を参照すること）。
【０１６１】
ＦＧＦ−７又はＫ−ＦＧＦは、ＫＧＦ又はケラチノサイト増殖因子としても知られている（Aaronson et al. Keratinocyte growth factor. A fibroblast growth factor family member with unusual target cell specificity. Annals NY Acad. Sci. 638:62-77 (1991)); Finch et al. Human KGF is FGF-related with properties of a paracrine effector of epithelial cell growth. Science 245:752-5 (1989); Marchese et al. Human keratinocyte growth factor activity on proliferation and differentiation of human keratmocytes: differentiation response distinguishes KGF from EGF family. J. Cellular Physiol. 144: 326-32 (1990)を参照すること）。
【０１６２】
ＦＧＦ−８は、アンドロゲン誘導増殖因子ＡＩＧＦと同一であることが見出されており、十分に研究されてきた（Blunt et al. Overlapping expression and redundant activation of mesenchymal fibroblast growth factor (FGF) receptors by alternatively spliced FGF-8 ligands. J. Biol. Chem. 272:3733-8 (1997); Dubrulle et al. FGF signaling controls somite boundary position and regulates segmentation clock control of spatiotemporal Hox gene activation. Cell 106:219-232 (2001); Gemel et al. Structure and sequence of human FGF8. Genomics 35:253-257 (1996); Tanaka et al. A novel isoform of human fibroblast growth factor 8 is induced by androgens and associated with progression of esophageal carcinoma. Dig. Dis. Sci. 46:1016-21 (2001)を参照すること)。
【０１６３】
ＦＧＦ−９は、元はグリア活性化因子又はＨＢＧＦ−９と呼ばれていた。Miyamoto et al. Molecular cloning of a novel cytokine cDNA encoding the ninth member of the fibroblast growth factor family, which has a unique secretion pattern. Mol. Cell. Biol. 13:4251-9 (1993);及びNaruo et al. Novel secretory heparin-binding factors from human glioma cells (glia-activating factors) involved in glial cell growth. J. Biol. Chem. 268: 2857-64 (1993)を参照すること。
【０１６４】
ＦＧＦ−１０は、ＫＧＦ−２、ケラチノサイト増殖因子２とも称される（Kok et al. Cloning and characterization of a cDNA encoding a novel fibroblast growth factor preferentially expressed in human heart. Biochem. Biophys. Res. Comm. 255:717-721, (1999)を参照すること）。
【０１６５】
幾つかのＦＧＦ関連因子が線維芽細胞増殖因子相同性因子（ＦＨＦ）として記載されており、ＦＧＦ−１１（ＦＨＦ−３）、ＦＧＦ−１２（ＦＨＦ−１）、ＦＧＦ−１３（ＦＨＦ−２、Greene et al. Identification and characterization of a novel member of the fibroblast growth factor family. Eur. J. Neurosci. 10:1911-1925 (1998)を参照すること）及びＦＧＦ−１４（ＦＨＦ−４）とも称される。
【０１６６】
ＦＧＦ−１５は、神経系の発生中で発現し、転写因子Ｅ２Ａ−Ｐｂｘ１により調節される遺伝子として同定された。McWhirter et al. A novel fibroblast growth factor gene expressed in the developing nervous system is a downstream target of the chimeric homeodomain oncoprotein E2A-Pbx1. Development 124:3221-3232 (1997)。
【０１６７】
ＦＧＦ−１６を、２０７アミノ酸のＦＧＦを発現する相同性に基づくポリメラーゼ鎖反応により、ラットの心臓からｃＤＮＡクローンとして単離した。ＦＧＦ−１６はＦＧＦ−９と７３％同一である。Miyake et al. Structure and expression of a novel member, FGF-16, of the fibroblast growth factor family. Biochem. Biophys. Res. Commun. 243:148-152 (1998).
【０１６８】
ＦＧＦ−１７をコードするｃＤＮＡを、ラットの胚から単離し、２１６アミノ酸のタンパク質をコードする。３Ｔ３線維芽細胞で発現すると、マウスＦＧＦ−１７は形質転換している。胚形成の際に、ＦＧＦ−１７は、前脳、中脳−後脳接合部、骨格発生及び動脈発生の特定の部位で発現する。Hoshikawa et al. Structure and expression of a novel fibroblast growth factor, FGF-17, preferentially expressed in the embryonic brain. Biochem. Biophys. Res. Commun. 244:187-191 (1998);及びXu et al. Genomic structure, mapping, activity and expression of fibroblast growth factor 17. Mechanisms of Development 83:165-178 (1999)を参照すること。
【０１６９】
ＦＧＦ−１８をコードするｃＤＮＡを、ラットの胚から単離し、２０７アミノ酸のタンパク質をコードする。ＦＧＦ−１８は、グリコシル化されたタンパク質であり、ＦＧＦ−８及びＦＧＦ−１７に最も類似している。組み換えネズミＦＧＦ−１８の注入は、間葉と上皮の両方由来の組織において、特に肝臓及び小腸において、増殖を誘発することが示された。組み換えラットＦＧＦ−１８は、ＰＣ１２細胞において神経突起成長を誘発する。組み換えネズミＦＧＦ−１８タンパク質は、インビトロでＮＩＨ ３Ｔ３線維芽細胞の増殖をヘパラン硫酸依存的に刺激する。一般的な情報については、Hu et al. FGF-18, a novel member of the fibroblast growth factor family, stimulates hepatic and intestinal proliferation. Mol. Cell. Biol. 18:6063-6074 (1998);及びOhbayashi et al. Structure and expression of the mRNA encoding a novel fibroblast growth factor, FGF-18. J. Biol. Chem. 273:18161-18164 (1998)を参照すること。
【０１７０】
ＦＧＦ−１９は、ＦＧＦファミリーの他のファミリーとかすかに関係している。ＦＧＦ−１９ｍＲＮＡは、胎生軟骨、皮膚及び網膜、並びに成人の胆嚢を含む幾つかの組織で発現する。これは、結腸腺癌細胞株で過剰発現する。ＦＧＦ−１９は、ＦＧＦ−４レセプターに対して高い親和性のあるヘパリン依存性リガンドである。Xie et al. FGF-19, a novel fibroblast growth factor with unique specificity for FGFR4 Cytokine 11:729-735 (1999)を参照すること。
【０１７１】
ＦＧＦ−２０は、正常な脳、特に小脳及び一部の癌細胞株で発現する。ＦＧＦ−２０ｍＲＮＡは、黒質緻密部で優先的に発現する。組み換えＦＧＦ−２０タンパク質は、多様な細胞型でＤＮＡ合成を誘導し、複数のＦＧＦレセプターにより認識される。ＦＧＦ−２０は腫瘍遺伝子のように機能し、３Ｔ３線維芽細胞株で発現すると、形質転換表現型を生じる。これらの形質転換細胞は、ヌードマウスにおいて腫瘍形成性である。Jeffers et al. Identification of a novel human fibroblast growth factor and characterization of its role in oncogenesis. Cancer Res. 61:3131-8 (2001);及びOhmachi et al. FGF-20, a novel neurotrophic factor, preferentially expressed in the substantia nigra pars compacta of rat brain. Biochem. Biophys. Res. Commun. 277:355-60 (2000)を参照すること。
【０１７２】
ＦＧＦ−２１をマウスの胚から単離した。ＦＧＦ−２１ｍＲＮＡは、肝臓で最も豊富にあり、胸腺ではレベルが低い。ＦＧＦ−２１は、ヒトＦＧＦ−１９に最も類似している。Nishimura et al. Identification of a novel FGF, FGF-21, preferentially expressed in the liver. Biochim. Biophys. Acta 1492:203-6 (2000)を参照すること。
【０１７３】
ＦＧＦ−２２（１７０アミノ酸）をコードするｃＤＮＡを、ヒトの胎盤から単離した。ＦＧＦ−２２は、ＦＧＦ−１０及びＦＧＦ−７に最も類似している。ネズミＦＧＦ−２２ｍＲＮＡは、皮膚に優先的に発現する。皮膚におけるＦＧＦ−２２ｍＲＮＡは、毛嚢の内毛根鞘で優先的に見出される。Nakatake et al. Identification of a novel fibroblast growth factor, FGF-22, preferentially expressed in the inner root sheath of the hair follicle. Biochim. Biophys. Acta 1517:460-3 (2001)を参照すること。
【０１７４】
ＦＧＦ−２３は、ＦＧＦ−２１及びＦＧＦ−１９に最も類似している。ヒトＦＧＦ−２３遺伝子は、ヒトＦＧＦ−６遺伝子に結合する染色体１２ｐ１３に位置する。ＦＧＦ−２３ｍＲＮＡは、主に脳に（視床腹外側核に優先的に）発現し、胸腺に低レベルで発現する。ＦＧＦ−２３遺伝子のミスセンス突然変異は、常染色体優性低リン酸血症性くる病の患者で見出された。ＦＧＦ−２３の過剰産生は、腎臓リン酸の消耗により引き起こされる低リン酸血症により特徴づけられる腫瘍随伴性疾患である、腫瘍誘発骨軟化症を引き起こす。Yamashita et al. Identification of a novel fibroblast growth factor, FGF-23, preferentially expressed in the ventrolateral thalamic nucleus of the brain. Biochem. Biophys. Res. Commun. 277:494-8 (2000);及びShimada et al. Cloning and characterization of FGF23 as a causative factor of tumor-induced osteomalacia. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 98:6500-5 (2001)を参照すること。
【０１７５】
ＨＢＢＭ（ヘパリン結合脳分裂促進因子）を、最初に、幾つかの種の脳組織からヘパリン結合タンパク質として単離し、それは、ヘパリン結合神経突起促進因子と同一である。Huber et al. Amino-terminal sequences of a novel heparin- binding protein with mitogenic activity for endothelial cells from human bovine, rat, and chick brain: high interspecies homology. Neurochem. Res. 15:435-439 (1990)を参照すること。
【０１７６】
ＨＢ−ＧＡＦ（ヘパリン結合増殖関連因子）は、ＨＢＮＦ（ヘパリン結合神経突起促進因子）と同一な神経栄養及び分裂促進因子である。Kuo et al. Characterization of heparin-binding growth-associated factor receptor in NIH 3T3 cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 182:188-194 (1992)を参照すること。
【０１７７】
ＨＢ−ＥＧＦ（ヘパリン結合ＥＧＦ様因子）は、細胞株Ｕ９３７の調整培地で見出され、また、マクロファージ及びヒト血管平滑筋細胞により合成される。ＨＢ−ＥＧＦは、８６アミノ酸のモノマーヘパリン結合Ｏ−グリコシル化タンパク質であり、２０８アミノ酸の前駆体からプロセスされる。ＨＢ−ＥＧＦの幾つかの切断型が記載されている。ＨＢ−ＥＧＦは、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞、ケラチノサイト及び平滑筋細胞にとって強力な分裂促進因子であるが、内皮細胞にとってはそうではない。平滑筋細胞に対する分裂促進活性は、ＥＧＦよりもかなり強力であり、細胞表面ヘパラン硫酸プロテオグリカンとの相互作用を伴うと思われる。ＨＢ−ＥＧＦは創傷液の主要な増殖因子成分であり、創傷治癒に重要な役割を果たすことができる。Abraham et al. Heparin-binding EGF-like growth factor: characterization of rat and mouse cDNA clones, protein domain conservation across species, and transcript expression in tissues. Biochem. Biophys. Res. Commun. 190:125-133 (1993); Higashiyama et al. A heparin-binding growth factor secreted by macrophage like cells that is related to EGF. Science 251:936-9 (1991);及びMarikovsky et al. Appearance of heparin-binding EGF-like growth factor in wound fluid as a response to injury. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 90:3889-93を参照すること。
【０１７８】
ＨＢＮＦ（ヘパリン結合神経突起促進因子）とも称されるＨＢ−ＧＡＭ（ヘパリン結合増殖関連分子）は、幾つかの種の脳組織からヘパリン結合タンパク質として単離された１５．３kDaのタンパク質である。ＨＢ−ＧＡＭは、軟寒天においてＳＷ−１３細胞の増殖を促進する。Courty et al. Mitogenic properties of a new endothelial cell growth factor related to pleiotrophin. Biochem. Biophys. Res. Commun. 180: 145-151 (1991);及びHampton et al. Structural and functional characterization of full-length heparin-binding growth associated molecule. Mol. Biol. Cell. 3:85-93 (1992)。
【０１７９】
ＴＧＦ−ベータ（ＴＧＦ−β）は、ＴＧＦ−αと関係しない、既知のＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４及びＴＧＦ−β５の少なくとも５個のアイソフォームで存在する。これらのアミノ酸配列は、７０〜８０％のオーダーで相同性を示す。ＴＧＦ−β１が一般的な形態であり、ほぼ偏在的に見出されるが、他のアイソフォームは、細胞及び組織のより限定された範囲で発現する。
【０１８０】
ＴＧＦ−ベータは、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーとして知られているタンパク質のファミリーのプロトタイプである。このファミリーには、インヒビン、アクチビンＡ、ＭＩＳ（ミュラー活性化物質）及びＢＭＰ（骨形成タンパク質）が含まれる。Burt, Evolutionary grouping of the transforming growth factor-beta superfamily. Biochem. Biophys. Res. Commun. 184:590- 5 (1992)。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１８１】
実施例１．本発明の化合物を、Ｘが配列ＡＩＳＭＬＹＬＤＥＫＶＶＬ（配列番号１０５）を有するＢＭＰ−２レセプター結合アミノ酸配列であり、ここで配列が、Ｒ2が０原子であり、そしてＲ1がリシンである式ＩのＲ1の三官能性アミノ酸から平行に成長している一般構造式Ｉを用いて、固相ペプチド化学により合成した。得られた合成増殖修飾因子類似体は、以下の特定の構造：
【０１８２】
【化７】
【０１８３】
であり、時々、Ｂ２Ａ２−Ｋ−ＮＳと称される。前記の構造において、「Ａｈｘ」は６−アミノヘキサン酸であり、時々、「６−Ａｈｘ」又は「Ｈｅｘ」とも称される。この単一の文字は、天然にコードされたアミノ酸のための標準的なアミノ酸単一文字略号である。
【０１８４】
実施例２．本発明の化合物を、Ｘが配列ＬＹＦＤＥＳＳＮＶＩＬＫＫ（配列番号１０６）を有するＢＭＰ−２レセプター結合アミノ酸配列であり、ここで配列が、Ｒ2が０原子であり、そしてＲ1がリシンである式ＩのＲ1の三官能性アミノ酸から平行に成長している一般構造式Ｉを用いて、固相ペプチド化学により合成した。得られた合成増殖修飾因子類似体は、以下の特定の構造：
【０１８５】
【化８】
【０１８６】
であり、時々、Ｂ７Ａ１−Ｋ−ＮＳと称される。前記の構造において、「Ａｈｘ」は６−アミノヘキサン酸であり、時々、「６−Ａｈｘ」又は「Ｈｅｘ」とも称される。この単一の文字は、天然にコードされたアミノ酸のための標準的なアミノ酸単一文字略号である。
【０１８７】
実施例３．本発明の化合物を、Ｘが配列ＩＳＭＬＹＬＤＥＮＥＫＶＶＬＫＮＹ（配列番号３０）を有するＢＭＰ−２レセプター結合アミノ酸配列であり、ここで配列が、Ｒ1がリシンである式ＩのＲ1三官能性アミノ酸から平行に成長している一般構造式Ｉを用いて、固相ペプチド化学により合成する。得られた合成増殖修飾因子類似体は、以下の特定の構造：
【０１８８】
【化９】
【０１８９】
である。
【０１９０】
前記の構造において、「Ａｈｘ」は６−アミノヘキサン酸であり、時々、「６−Ａｈｘ」又は「Ｈｅｘ」とも称される。この単一の文字は、天然にコードされたアミノ酸のための標準的なアミノ酸単一文字略号である。
【０１９１】
実施例４．合成ＦＧＦ類似体ＹＲＳＲＫＹＳＳＷＹＶＡＬＫＲＫ（Ｈ−ＹＲＳＲＫＹＳＳＷＹＶＡＬＫＲ）−Ａｈｘ−Ａｈｘ−Ａｈｘ−ＲＫＲＫＬＤＲＩＡＲ−ＮＨ2は、標準固相ペプチド合成法により合成した。化合物ＹＲＳＲＫＹＳＳＷＹＶＡＬＫＲＫ（Ｈ−ＹＲＳＲＫＹＳＳＷＹＶＡＬＫＲ）−Ａｈｘ−Ａｈｘ−Ａｈｘ−ＲＫＲＫＬＤＲＩＡＲ−ＮＨ2において、式ＩのＲ1基は、単一の三官能性アミノ酸残基であり、ここではジアミノアミノ酸、リシン（Ｋ）であった。実施例４のペプチドは、推定分子量の５６８１を有する。
【０１９２】
実施例４のペプチドを、反復サイクルでアミノ基を一時的に保護するためにＦｍｏｃ化学を使用して、置換樹脂で固相合成により段階的に組み立てた。保護基は必要に応じて使用した。鎖の分岐は、単一のリシル残基のαアミノ基及び側鎖アミノ基からの同一の鎖の段階的な成長によって達成された。完成したペプチド鎖を、酸不安定側鎖保護基も除去する酸分解により、Ｃ末端アミドとして樹脂から切断した。実施例４のペプチドを、Ａが水中の０．１％トリフルオロ酢酸であり、Ｂがアセトニトリル中の０．１％トリフルオロ酢酸である、０〜６０％のＢの連続勾配溶離を１mL／分で６０分間実施するＣ18カラムを使用する、逆相ＨＰＬＣにより精製した。実施例４の化合物の一般構造を、下記に示す。
【０１９３】
【化１０】
【０１９４】
実施例５．以下の構造：
T1A1-K-NS
H-PIVYYVGRKPKVEQK(H-PIVYYVGRKPKVEQ)-Ahx-Ahx-Ahx- RKRKLERIAR-NH2
T1A2-K-NS
H-YIWSLDTQYSKVLK(H-YIWSLDTQYSKVL)-AhX-AhX-AhX- RKRKLERIAR-NH2
の２つのペプチドを、実施例４のＴＧＦの類似体として合成した。
【０１９５】
実施例６．ペプチドを、ＰＤＧＦ−ＢＢの候補アゴニストとして合成し、ＰＢＡ２−１Ｃと表した。このペプチドをＲ1位置で単一のリシン（Ｋ）から分岐し、ここで分岐配列ＣＶＲＫＩＥＩＶＲＫＫ（配列番号１０７）のＮ末端残基はシステイン（Ｃ）残基であった。得られた作成物は、２つのＸ領域がＮ末端システインでジスルフィド結合により連結している環状ペプチドであった。
【０１９６】
【化１１】
【０１９７】
ペプチドを、１ml／分の流速（２１４nmで検出）で６０分間実施する０〜６０％のアセトニトリル／水（０．１％トリフルオロ酢酸）の直線勾配を使用する、Ｃ１８カラムのＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。精製したペプチドは、図６で示されているように、ＲＰ−ＨＰＬＣによる分析で単一の均一ピークを生成した。
【０１９８】
表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）分析。実時間生体分子相互作用をBIAcore 2000システム（Biacore Inc., Piscataway, NJ）で分析した。可溶性ＰＤＧＦレセプター、ヒトＰＤＧＦ−Ｒ−α及びＰＤＧＦ−Ｒ−βの組み換えキメラ（R &D Systems, Minneapolis, MN）を、研究等級ＣＭ５チップ（Biacore Inc., Piscataway, NJ）に固定した。ＥＤＣ／ＮＨＳによる活性化に続いて、レセプターを活性化ＣＭ５チップに固定した。動態学データを得るために、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝剤中の検体の異なる濃度を、５０μl／分の流速でセンサーチップの上に注入した。ペプチド結合を共鳴単位（ＲＵ）で測定した。それぞれの検体注入の終了時に（１２０秒）、緩衝剤をセンサーの表面を通過させて、解離相をモニタリングした。ブランクフローセルの基準共鳴を、それぞれの注入用検体についてレセプター含有フローセルから引いて、それぞれの相互作の動態パラメーターを、BIAEVALUATIONソフトウエア（Biacore Inc., Piscataway, NJ）により実験データを１：１相互作用に大域的に当てはめて決定した。会合速度定数及び解離速度定数（それぞれｋa及びｋd）、並びに平衡解離定数（ＫD）を、レセプター及びＰＡＢ２−１について表３で表す。
【０１９９】
【表３】
【０２００】
細胞増殖。細胞増殖に対するＰＢＡ２−１Ｃの効果を、Ｃ２Ｃ１２細胞で決定した。細胞を９６ウエルプレートに１ウエルあたり２０００細胞で播種し、付着させた。培地を、低血清を含有するものに代えて、１０ng/mlのヘパリン、次にＰＢＡ２−１を加えた。３日間のインキュベーションの後、細胞数を、Molecular ProbesからのCyQUANT（登録商標） Cell Proliferation Assay Kit (C-7026)で決定した。図７は、細胞増殖に対するペプチドＰＢＡ２−１の効果を示す。データは、平均±ＳＤで報告されている。
【０２０１】
実施例７．以下の一般構造のペプチドを合成する。
【０２０２】
【化１２】
【０２０３】
望ましい場合には、任意の適切なカルボキシル保護基を、Ｒ1の位置でシステインとジスルフィド結合を形成するのに用いた第２のシステインに対して用いる。合成は、保護基なしで進行できるが、ほとんどの合成方法では、保護基を用いることが望ましい。保護基を合成の後に除去することができるか、あるはその場所に放置することができる。一つの実施態様において、メチル、エチル、ベンジル又は置換ベンジルエステルのようなエステルを、Ｃ末端保護基として用いる。アリルエステル又はｔ−ブチルエステルを含む、他のエステルを用いることができる。
【０２０４】
実施例８．ＳＤＦ−１の模倣、ＳＤ１−１と表されるペプチドを、NovaSyn TGR樹脂（EMD BioSciences, La Jolla, CA）を使用して、標準Ｆｍｏｃプロトコールに従って合成した。アミノヘキサン酸（Ａｈｘ）を含むＦｍｏｃアミノ酸を、Peptides International, Inc. (Lexington, KY)から得た。ＳＤ１−１は、以下の配列：
KPVSLSYRAPARFFESHVAK(KPVSLSYRAPARFFESHVA)HXHXHXRKRKLERIAR-アミド
を有する。
【０２０５】
ＳＤＦ−１を、１ml／分の流速（２１４nmで検出）で６０分間実施する０〜６０％のアセトニトリル／水（０．１％トリフルオロ酢酸）の直線勾配を使用する、Ｃ１８カラムのＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。精製したペプチドは、図１で示されているように、ＲＰ−ＨＰＬＣによる分析で単一の均一ピークを生成した。
【０２０６】
細胞増殖。Ｓｕｐ−Ｔ１細胞を、American Type Culture Collection (Manassas, VA)から得て、培養中で増殖させた。細胞増殖に対するＳＤ１−１の効果をモニタリングするために、Ｓｕｐ−Ｔ１細胞を、９６ウエルプレートに１ウエルあたり１００，０００細胞で播種し、付着させた。培地を、低血清＋ＳＤ１−１を含有するものに代え、細胞を３日間インキュベートし、その後、相対的な細胞数を、市販のキットを使用して決定した。ここで図２を参照すると、グラフの下のデータは、平均±ＳＤで報告されている。市販の組み換えヒトＳＤＦ−１（菱形）を、ＳＤＦ−１（三角）により刺激された増殖と比較する基準及び陽性対照として使用した。
【０２０７】
細胞移動。ＳＤ１−１を、市販の細胞移動アッセイを使用して、Ｃ２Ｃ１２細胞の移動を誘導するその能力について評価した。Ｃ２Ｃ１２細胞を、重合コラーゲンの薄層で被覆されている８μm孔径のポリカーボネート膜を含むトランスウエルインサートに播種した。インサートを、ＳＤ１−１を含む培地を有するウエルの中に入れた。膜を通して移動する細胞を、インサート膜の底部で見出した。これらの細胞を染色し、染色を抽出し、標準マイクロプレート読取機（５６０nm）で検出した。ここで図３を参照すると、ＳＤ１−１ペプチドに反応した細胞移動の結果が、ＳＤＦ−１ペプチド又は対照と比較して示されている。データは、平均±ＳＤで報告されている。
【０２０８】
実施例９．ＰＤＧＦの模倣、ＰＢＡ２−１と表されるペプチドを、NovaSyn TGR樹脂（EMD BioSciences, La Jolla, CA）を使用して、標準Ｆｍｏｃプロトコールに従って合成した。アミノヘキサン酸（Ａｈｘ）を含むＦｍｏｃアミノ酸を、Peptides International, Inc. (Lexington, KY)から得た。ＰＢＡ２−１は、以下の配列：
VRKIEIVRKKK(VRKIEIVRKK)HxHxHxRKRKLERIAR-アミド
を有する。
【０２０９】
ＰＢＡ２−１を、１ml／分の流速（２１４nmで検出）で６０分間実施する０〜６０％のアセトニトリル／水（０．１％トリフルオロ酢酸）の直線勾配を使用する、Ｃ１８カラムのＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。精製したペプチドは、図４で示されているように、ＲＰ−ＨＰＬＣによる分析で単一の均一ピークを生成した。
【０２１０】
表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）分析。実時間生体分子相互作用をBIAcore 2000システム（Biacore Inc., Piscataway, NJ）で分析した。可溶性ＰＤＧＦレセプター、ヒトＰＤＧＦ−Ｒ−α及びＰＤＧＦ−Ｒ−βの組み換えキメラ（R &D Systems, Minneapolis, MN）を、研究等級ＣＭ５チップ（Biacore Inc., Piscataway, NJ）に固定した。ＥＤＣ／ＮＨＳによる活性化に続いて、レセプターを活性化ＣＭ５チップに固定した。動態学データを得るために、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝剤中の検体の異なる濃度を、５０μl／分の流速でセンサーチップの上に注入した。ペプチド結合を共鳴単位（ＲＵ）で測定した。それぞれの検体注入の終了時に（１２０秒）、緩衝剤をセンサーの表面を通過させて、解離相をモニタリングした。ブランクフローセルの基準共鳴を、それぞれの注入用検体についてレセプター含有フローセルから引いて、それぞれの相互作の動態パラメーターを、BIAEVALUATIONソフトウエア（Biacore Inc., Piscataway, NJ）により実験データを１：１相互作用に大域的に当てはめて決定した。会合速度定数及び解離速度定数（それぞれｋa及びｋd）、並びに平衡解離定数（ＫD）を、レセプター及びＰＡＢ２−１について表４で表す。
【０２１１】
【表４】
【０２１２】
細胞増殖。細胞増殖に対するＰＢＡ２−１の効果を、Ｃ２Ｃ１２細胞で決定した。細胞を９６ウエルプレートに１ウエルあたり２０００細胞で播種し、付着させた。培地を、低血清を含有するものに代えて、１０ng/mlのヘパリン、次にＰＢＡ２−１を加えた。３日間のインキュベーションの後、細胞数を、Molecular ProbesからのCyQUANT（登録商標） Cell Proliferation Assay Kit (C-7026)で決定した。図５は、ＰＢＡ２−１ペプチドの濃度範囲にわたる、細胞増殖に対するペプチドＰＢＡ２−１の効果を示す。データは、平均±ＳＤで報告されている。
【０２１３】
前記実施例は、前記実施例で使用された本発明の一般的又は特別に記載されたペプチド配列、反応体及び／又は操作条件を換えて繰り返しても同様の成功を収めることができる。
【０２１４】
実施例１０．ペプチドを、ＢＭＰ−７の配列に基づいて合成した。ペプチドをＢ７Ａ１−６と表し、配列：
AISVLYFDDSSNVILKKK(AISVLYFDDSSNVILKK)HxHxHxRKRKLERIAR-アミド
を有した。
【０２１５】
このペプチドを、Ｃ２Ｃ１２細胞を使用し、組み換えＢＭＰ−７の存在下で、終点としてアルカリホスファターゼ産生を使用して評価した。アルカリホスファターゼアッセイを、マウスの多機能細胞株Ｃ２Ｃ１２を使用して実施した。細胞を９６ウエル（１×１０４／ウエル）プレートで平板培養し、２４時間かけて付着させた。次に培地を、ＢＭＰ−７及び／又はＢ７Ａ１−６を含む低血清培地と代えた。数日後、細胞をすすぎ、溶解し、アルカリフォスファターゼ活性を、ｐ−ニトロフェニルホスフェートを基質として使用して測定した。Ｂ７Ａ１−６は、図８で示されているように、ＢＭＰ−７の活性の用量依存的抑制を有した。
【０２１６】
実施例１１．ペプチドを、Ｇ−ＣＳＦの配列に基づいて合成し、ＧＣＳＦ１と表した。ＧＣＳＦ１は、配列：
SFLLKALEQVRKIQYK(SFLLKALEQVRKIQY)HxHxHxRKRKLERIAR-アミド
を有した。このペプチドを、０．０１ngのｒｈＧＣＳＦの存在下、Ｍ−ＮＳＦ−６０細胞を使用して、増殖の増加を評価した。図９で示されているように、市販のＭＴＸキットを使用してモニタリングすると、ペプチドは細胞増殖を増加した。
【０２１７】
本発明は、好ましい実施態様に対する特定の参照によって詳細に記載されてきたが、他の実施態様でも同じ結果を達成することができる。本発明の変更及び修正は、当業者には明白であり、そのような修正及び等価物は、全て添付の請求項で網羅されていることが意図される。上記で引用された全ての参考文献、出願、特許、及び公報の開示の全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２１８】
本発明は、好ましい実施態様の観点から記載されてきたが、多様な修正及び改善を、本発明の範囲を逸脱することなく、記載された実施態様に対して行うことができることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【０２１９】
【図１】本発明の一つの実施態様のＳＤ１−１類似体のＲＰ−ＨＰＬＣプロフィールを示す。
【図２】本発明の一つの実施態様の細胞増殖のＳＤＦ−１及びＳＤ１−１類似体濃度依存性誘導のグラフを示す。
【図３】本発明の一つの実施態様のＳＤＦ−１及びＳＤ１−１類似体誘導細胞移動のグラフを示す。
【図４】本発明の一つの実施態様のＰＤＧＦ類似体のＲＰ−ＨＰＬＣプロフィールを示す。
【図５】本発明の一つの実施態様のＰＤＧＦ類似体ＰＢＡ２−１を用いる細胞増殖アッセイの結果を示す。
【図６】本発明の一つの実施態様のＰＢＡ２−１Ｃ類似体のＲＰ−ＨＰＬＣによる分析を示す。
【図７】本発明の一つの実施態様の細胞増殖に対する類似体ＰＢＡ２−１の効果を示す。
【図８】本発明の一つの実施態様のＢ７Ａ１−６類似体によるＢ７Ａ１−６の活性の用量依存性抑制を示す。
【図９】本発明の一つの実施態様のＧＣＳＦ−１類似体により増加された細胞増殖を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２個の配列が単一分岐点から分岐し、単一分岐点が少なくとも１個の三官能性アミノ酸残基を含み、分岐点が更にヘパリン結合配列に共有結合している、ホモ二量体合成ヘパリン結合増殖因子類似体を含む、ヘパリン結合増殖因子の合成ペプチド及び類似体の分野に関する。本発明は、更に、可溶性薬剤としての及び医療装置用の被覆としての、そのような類似体の臨床使用に関する。
【０００２】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国仮出願第６０／６５５，５７０号（２００５年２月２２日出願）の表題「単一分岐ヘパリン結合増殖因子」の出願の優先権及び利益を主張し、この明細書及び請求の範囲は参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
以下の考察は、多数の筆者及び出版年の出版物を参照する。本明細書におけるそのような出版物の考察は、より完全な背景を提供し、そのような出版物が特許性を決定する目的において従来技術であることの承認として解釈されるべきではない。
【０００４】
ヘパリン結合増殖因子（ＨＢＧＦ）は、現在同定されている２３個の線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ１〜２３）、ＨＢＢＭ（ヘパリン結合脳分裂促進因子）、ＨＢ−ＧＡＦ（ヘパリン結合増殖関連因子）、ＨＢ−ＥＧＦ（ヘパリン結合ＥＧＦ様因子）、ＨＢ−ＧＡＭ（ヘパリン結合増殖関連分子）、ＴＧＦ−α（形質転換増殖因子α）、ＴＧＦ−β（形質転換増殖因子β）、ＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）、ＥＧＦ（表皮増殖因子）、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）、ＩＧＦ−１（インスリン様増殖因子１）、ＩＧＦ−２（インスリン様増殖因子２）、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）、ＩＬ−１（インターロイキン１）、ＩＬ−２（インターロイキン２）、ＩＦＮ−α（インターフェロンα）、ＩＦＮ−γ（インターフェロンγ）、ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子α）、ＳＤＧＦ（シュワン細胞腫由来増殖因子）、並びにヘパリンに親和性を有する他の多くの増殖因子、サイトカイン、リンホカイン及びケモカインを含む、多数の種類の増殖因子から構成される。
【０００５】
ヘパリン結合増殖因子レセプターに結合する天然ＨＢＧＦからのペプチドも同定されている。例えば、Ray et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:7047-7052 (1997)を参照すること。これらの著者は、ＦＧＦ−２からの２個のアミノ酸配列が、神経前駆細胞のＦＧＦ−２の分裂促進活性を阻止するのに十分であることを実証した。第１ペプチドは、アミノ酸６５−７４からの１０個のアミノ酸配列であり、第２ペプチドはアミノ酸１１５−１２９から延びている。
【０００６】
代替的な手法において、ヘパリン結合増殖因子レセプター（ＨＢＧＦＲ）に結合する人工ペプチドが、ファージディスプレー法により同定された。Ballinger et al., Nature BioTechnology 17:1199-1204 (1999）は、この技術を使用して、Ｃ１９と呼ばれ、ＦＧＦ−２レセプターに結合するが、それ自体生物学的活性を刺激できない、２８個のアミノ酸ペプチドを単離した。このペプチドは、あらゆる既知のＦＧＦにより同定されるアミノ酸配列を有さない。
【０００７】
広範囲の疾患及び傷害の予防又は治療に有用なＨＢＧＦを、天然の供給源から精製することができるか、又は組み換えＤＮＡ法により産生することができるが、そのような調製は、高価であり、一般に調製することが難しい。
【０００８】
ヘパリン結合増殖因子類似体を生成するために幾つかの努力がなされてきた。例えば、天然ＰＤＧＦは、頭−頭（ＡＡ若しくはＢＢ）ホモ二量体、又は（ＡＢ若しくはＢＡ）ヘテロ二量体で配列されるＡ鎖及びＢ鎖として生じる。したがって、米国特許第６，３５０，７３１号（Jehanliら）は、２つの合成ＰＤＧＦレセプター結合ドメインが、ポリグリシン又はＮ−（４−カルボキシ−シクロヘキシルメチル）−マレイミド（ＳＭＣＣ）鎖を介して共有結合して、天然活性ポリペプチド二量体を模倣することを開示する。
【０００９】
米国特許第６，２３５，７１６号（Ben-Sasson）は、血管新生因子の類似体を開示する。この類似体は、マルチリンカー主鎖により結合している２つ以上の血管新生相同性領域を含む分岐多価リガンドである。
【００１０】
米国特許第５，７７０，７０４号（第′７０４号特許）（Godowski）は、レセプターチロシンキナーゼ、サイトカインレセプター及び多数の神経成長因子レセプタースーパーファミリーを活性化する複合体を開示する。複合体は、同族レセプターに結合することができる少なくとも２個のリガンドを含み、それにより、それぞれのリガンドの結合がこれらのレセプターのオリゴマー化を誘導する。第′７０４号特許に開示されているリガンドは、多様な非タンパク質性ポリマーに、特に、ポリビニルアルコール及びポリビニルピロリドンのような疎水性ポリマーに、並びにポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールを含むポリビニルアルケンエーテルに、共有結合により結合する。リガンドは、それぞれＨＧＦに結合し、それによって、レセプター二量体化及びＨＧＦレセプター二量体の生物学的活性の活性化を引き起こす、肝細胞増殖因子（ＨＦＧ）ペプチド変異体を含む。
【００１１】
米国特許第６，２８４，５０３号（第′５０３号特許）（Caldwellら）は、細胞付着、細胞増殖、細胞選択及び生物学的アッセイのために、疎水性表面及び疎水性被覆表面への細胞及び生体分子の付着を調節する組成物及び方法を開示する。この組成物は、反応性末端基活性化ポリマーに結合している生体分子である。末端基活性化ポリマーは、ブロックコポリマー界面活性剤主鎖及び活性化又は反応性基を含む。ブロックコポリマーは、疎水性表面に吸着することができる疎水性領域と、疎水性領域が疎水性表面に吸着するときに表面から延びる親水性領域とを有する、あらゆる界面活性剤であることができる。第′５０３号特許は、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦα、ＴＧＦβ、ＮＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＧＨ及びＧＨＲＦ、並びにマルチ−ＣＳＦ（ＩＩ−３）、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ及びＭ−ＣＳＦのような天然及び組み換え増殖因子を含む末端基活性化ポリマーに、結合していることができる生体分子を開示する。
【００１２】
他の研究者たちは、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）の相同体及び類似体を含む組成物を記載する。例えば、米国特許第５，６７９，６７３号（Lappi及びBaird）、米国特許第５，９８９，８６６号（Deisherら）、及び米国特許第６，２９４，３５９号（Fiddesら）を参照すること。これらの開示は、毒性部分に結合し、ＦＧＦレセプター担持細胞を標的にするＦＧＦ同位体又は類似体であるか、或いはＦＧＦ相同体又は類似体により結合されるとＦＧＦレセプターにより伝達されるシグナルを通す生物学的経路を調節する相同体又は類似体のいずれかに関連する。
【００１３】
Kochendoerferらの一連の特許出願は、合成ケモカイン及び赤血球生成刺激タンパク質を含むポリマー改質タンパク質を開示する。例えば、国際公報第０２／０４１０５、同第０２／１９９６３号及び同第０２／２００３３号を参照すること。これらは、ポリペプチド鎖が得られるように、タンパク質の１つ以上のグリコシル化部位に結合している水溶性ポリマーと化学的に連結した、赤血球生成合成タンパク質のポリペプチド鎖のペプチドセグメントを含む。これらの出願は、同じくポリマー改質され、アンタゴニストであると言われている合成ケモカインも開示する。しかし、ヘパリン結合ドメインは開示されていない。米国特許第５，７７３，５６９号及び同第５，８３０，８５１号（Wrightonら）に開示されているように、他のエリスロポエチン模倣が知られている。
【００１４】
国際公報第００／１８９２１号（Ballinger及びKavanaugh）は、直接的に又は結合基を介して「オリゴマー化ドメイン」に結合している、ＦＧＦレセプター親和性を有する融合タンパク質からなる組成物を開示する。オリゴマー化ドメインは、約２０〜３００個の残基の長さの範囲であり、転写因子、ＩｇＧのＦｃ部分、ロイシンジッパーなどのような作成物を含む。開示されたオリゴマー化ドメインはホモ二量体ドメインである、ここでは、単一のＦＧＦレセプター親和性融合タンパク質がロイシンジッパーのような単一のドメインに結合し、次に、それぞれ単一のＦＧＦレセプター親和性融合タンパク質を有する２個の平行したロイシンジッパーがジスルフィド結合により架橋するように、ロイシンジッパーのアミノとカルボキシの両方の末端でシステイン残基により同様の分子に結合する。融合タンパク質は、ヘパリン結合ドメインと言われる多量体化ドメインとしてｊｕｎを使用する、ヘパリン結合ドメインを含むことができることも開示される。したがって、Ballinger及びKavanaughにより開示された組成物は、オリゴマー化ドメインに共有結合している単一レセプター結合配列から全て構成され、それによって、それぞれ単一のレセプター結合配列を有する２つ以上の同様のオリゴマー化ドメインが、オリゴマー化ドメインによりもたらされる連合により結合するか、あるいは化学架橋されて個別の成分の共有結合をもたらす。米国特許出願第１０／６４４，７０３号（表題 合成ヘパリン結合増殖因子類似体、２００３年８月１９日出願）及び米国特許出願第１０／２２４，２６８号（表題 合成ヘパリン結合増殖因子類似体、２００２年８月２０日出願）を含む幾人かの発明者が共通している一連の出願は、２つのレセプター結合ドメインが、２個の異なるアミノ酸残基の側鎖に、又は末端基と側鎖に結合している作成物を開示する。
【００１５】
上記に記載された相同体、類似体、複合体又はリガンドは、それぞれレセプター結合ドメインを含む。しかし、開示されたどの組成物も、単一の残基の末端基と側鎖基を介して単一の残基に結合している２つのレセプター結合ドメインを更に含まない。ＨＢＧＦの新規ペプチド類似体、特にアゴニストとして機能するもの、好ましくはＨＢＧＦＲに特異性の２つのレセプター結合ドメインを含有するものに対する必要性が依然として存在する。ヘパリン結合増殖因子レセプターの費用効果の高い合成ペプチドアゴニスト、特に、医療装置を被覆するため、可溶性の生物学的製剤として、及び多様な状態を治療する医薬品として有用な、合成ヘパリン結合増殖因子アゴニストの必要性が依然として存在する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の一つの態様は、式Ｉ：
【００１７】
【化１】
【００１８】
〔式中、
Ｘは、それぞれ、（ｉ）最低３個のアミノ酸残基を有し、（ｉｉ）最大約５０個のアミノ酸残基を有し、（ｉｉｉ）ヘパリン結合増殖因子レセプター（ＨＢＧＦＲ）に結合する、ペプチド鎖であり；
Ｒ1は、各Ｘに共有結合している単一の三官能性アミノ酸残基であり；
Ｒ2は、それぞれ独立して、Ｒ1とＸに共有結合している、炭素、酸素、硫黄、窒素及びその混合物を含む０〜約２０個の主鎖原子の鎖を含むリンカーであり；
Ｒ3は、それぞれ、末端基がＮＨ2のように水素（Ｈ）であるか、或いはＮ−末端ＮＨ2、ＮＨ3+若しくはＮＨ基又は対応するアシル化誘導体を含む直鎖又は分岐鎖Ｃ1〜Ｃ17のアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルケン、アルケニル又はアラルキル鎖を有するアシル基であり；
Ｒ4は、末端基がカルボキシルのようにＯＨであるか、ＮＨ2であるか、Ｎ−末端ＮＨ2、ＮＨ3+若しくはＮＨ基又は対応するアシル化誘導体を含む直鎖又は分岐鎖Ｃ1〜Ｃ17のアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルケン、アルケニル又はアラルキル鎖を有するアシル基であるか、又はＮＨ−Ｒ3であり；
Ｙは、Ｒ1とＺに共有結合している０〜約５０個の主鎖原子の鎖を含むリンカーであり；そして
Ｚは、（ｉ）最低１個のヘパリン結合モチーフ、（ｉｉ）最大約１０個のヘパリン結合モチーフ、及び（ｉｉｉ）最大約３０個のアミノ酸を含むアミノ酸配列を含むヘパリン結合ドメインを含む、非シグナル伝達ペプチド鎖である〕
で示される、ヘパリン結合増殖因子類似体である。
【００１９】
本発明の別の態様は、Ｙが、（ｉ）疎水性であり、（ｉｉ）最低約９個、最大約５０個の原子の鎖を含み、（ｉｉｉ）Ｘが結合するヘパリン結合増殖因子レセプター（ＨＢＧＦＲ）の天然リガンドにおいて見出されないリンカーを更に含むことを提供する。
【００２０】
本発明の別の態様は、式Ｉ〜ＩＶのヘパリン結合増殖因子類似体が、合成ヘパリン結合増殖因子類似体が０．１５MのＮａＣｌ中でヘパリンに結合するが、１MのＮａＣｌにより溶離されるようなヘパリン結合活性を有することを提供する。
【００２１】
本発明の別の態様は、式ＩＩ：
【００２２】
【化２】
【００２３】
（式中、Ｒ1はジアミンアミノ酸である）で示されるヘパリン結合増殖因子類似体を提供する。他の特徴は全て式Ｉにおいて表されたとおりである。
【００２４】
本発明の別の態様は、式ＩＩのヘパリン結合増殖因子類似体のＲ1が、２，３−ジアミノプロピオニルアミノ酸、２，４−ジアミノブチルアミノ酸、リシン及びオルニチンからなる群より選択されるＬ−又はＤ−ジアミンアミノ酸残基であることを提供する。
【００２５】
本発明の別の態様は、式ＩＩＩ：
【００２６】
【化３】
【００２７】
〔式中、
Ｃは炭素であり、Ｈは水素であり、Ｎは窒素であり、そしてＯは酸素である〕で示されるヘパリン結合増殖因子類似体を提供する。他の特徴は全て式Ｉにおいて表されたとおりである。
【００２８】
本発明のさらに別の態様は、式ＩＶ：
【００２９】
【化４】
【００３０】
〔式中、
Ｒ1は、Ｒ1の側鎖が反応性スルフヒドリルを含む三官能性アミノ酸であり；そして
Ｒ2は、側鎖が反応性スルフヒドリルを含む三官能性アミノ酸を含み、ここでＲ2はジスルフィド結合によりＲ1に共有結合している〕
で示されるヘパリン結合増殖因子類似体を提供する。
【００３１】
本発明の別の態様は、Ｒ1及びＲ2が、それぞれ独立して、Ｌ−又はＤ−システイン、Ｌ−又はＤ−ペニシラミン、３−メルカプトフェニルアラニン及び前記のいずれかの誘導体からなる群より選択されるＬ−又はＤ−３−メルカプトアミノ酸である、式ＩＩＩのヘパリン結合増殖因子類似体を提供する。
【００３２】
本発明の別の態様は、式Ｖ：
【００３３】
【化５】
【００３４】
〔式中、
Ｐｒｇ Ｇｒｐは、ＯＨ又はカルボキシ末端保護基であり；そして
Ｃは炭素であり、Ｈは水素であり、Ｎは窒素であり、Ｏは酸素であり、そしてＳは硫黄である〕で示されるヘパリン結合増殖因子類似体を提供する。他の特徴は全て式Ｉにおいて表されたとおりである。
【００３５】
本発明のなお別の態様は、式ＶＩ：
【００３６】
【化６】
【００３７】
〔式中、
Ｒ1は、側鎖が第１反応性基を含む三官能性アミノ酸であり；そして
Ｒ2は、側鎖が第２反応性基を含む三官能性アミノ酸を含み、ここでＲ2は、第１反応性基と第２反応性基の間の共有結合によりＲ1に共有結合している〕で示されるヘパリン結合増殖因子類似体を提供する。他の特徴は全て式Ｉにおいて表されたとおりである。
【００３８】
本発明のなお別の態様は、式Ｉ〜ＶＩのうちのいずれかのＸ及びＺが合成ペプチド鎖であることを提供する。
【００３９】
本発明のさらに別の態様は、２個の配列が、同一であり、かつヘパリン結合増殖因子レセプターに特異的に結合し、１個の配列が、単一の残基に共有結合している非増殖因子ヘパリン結合配列を含む、単一の残基から分岐している２個の配列を有する合成ペプチドを含む、ヘパリン結合増殖因子類似体を提供する。
【００４０】
別の態様において、単一の残基は三官能性アミノ酸残基を含む。
【００４１】
なお別の態様では、非増殖因子ヘパリン結合配列がリンカーにより単一の残基に共有結合していることが提供される。
【００４２】
さらに別の態様は、２〜約５０個の主鎖原子を有するヘパリン結合増殖因子類似体を提供する。
【００４３】
本発明の別の態様において、式Ｉ〜ＶＩのいずれかのＹは、１〜約３３個のエチレングルコール単位を含む。
【００４４】
本発明の別の態様によると、式Ｉ〜ＶＩのいずれかのＹは、１〜約２０個の炭素原子の、分岐鎖又は非分岐鎖、飽和又は不飽和アルキル鎖を含む。
【００４５】
本発明のさらに別の態様において、式Ｉ〜ＶＩのいずれかのＹは、〔ＮＨ2−（ＣＨ2）pＣＯ〕qを含み、ここで、ｐは１〜約１０であり、そしてｑは１〜約２０である。
【００４６】
本発明の別の態様において、式Ｉ〜ＶＩのいずれかのＹは、１〜約１６個のＧｌｙ残基を含むペプチド配列を含む。
【００４７】
本発明の別の態様では、式Ｉ〜ＶＩのいずれかのＺは、ＢｘＢＢ又はＢＢＢｘｘＢであり、ここで、Ｂは、それぞれ独立して、リシン、アルギニン、オルニチン又はヒスチジンであり、そしてｘは、それぞれ独立して、天然に生じるアミノ酸である。
【００４８】
本発明の別の態様において、式Ｉ〜ＶＩのいずれかのＺは、少なくとも２個のヘパリン結合モチーフを含む。
【００４９】
本発明のなお別の態様において、式Ｉ〜ＶＩのいずれかのＲ1とＹの間の共有結合は、アミド、ジスルフィド、チオエーテル、シッフ塩基、還元シッフ塩基、イミド、第二級アミン、カルボニル、尿素、ヒドラゾン又はオキシム結合を含む。
【００５０】
本発明のなお別の態様において、式Ｉ〜ＶＩのいずれかのＲ1と各Ｘとの間の共有結合は、アミド、ジスルフィド、チオエーテル、シッフ塩基、還元シッフ塩基、イミド、第二級アミン、カルボニル、尿素、ヒドラゾン又はオキシム結合を含む。
【００５１】
本発明の別の態様において、式Ｉ〜ＶＩのいずれかのＹとＺの間の共有結合は、アミド、ジスルフィド、チオエーテル、シッフ塩基、還元シッフ塩基、イミド、第二級アミン、カルボニル、尿素、ヒドラゾン又はオキシム結合を含む。
【００５２】
本発明の別の態様において、式Ｉ〜ＶＩのいずれかのＸは、配列番号７から配列番号１０７のいずれか、その一部分、その相同体、又はその一部分の相同体であり、そしてＺは、配列番号１から配列番号６のいずれかを含む。
【００５３】
本発明のなお別の態様において、式Ｉ〜ＶＩのいずれかのＲ2は、グリシン、直鎖アミノカルボン酸、二官能性アミノ−ＰＥＧ−酸スペーサー及びこれらの組み合わせからなる群より選択される１〜約３個のアミノ酸残基を含む。
【００５４】
本発明のさらに別の態様において、式Ｉ〜ＶＩのいずれかのＹは、グリシン、直鎖アミノカルボン酸、二官能性アミノ−ＰＥＧ−酸スペーサー及びこれらの組み合わせからなる群より選択される１〜約１０個のアミノ酸残基を含む。
【００５５】
本発明の別の態様において、式Ｉ〜ＶＩのいずれかのＸは、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１１、ＦＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３、ＦＧＦ−１４、ＦＧＦ−１５、ＦＧＦ−１６、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−１８、ＦＧＦ−１９、ＦＧＦ−２０、ＦＧＦ−２１、ＦＧＦ−２２、ＦＧＦ−２３、ＨＢＢＭ（ヘパリン結合脳分裂促進因子）、ＨＢ−ＧＡＦ（へパリン結合増殖関連因子）、ＨＢ−ＥＧＦ（ヘパリン結合ＥＧＦ様因子）、ＨＢ−ＧＡＭ（プレイオトロフィン、ＰＴＮ、ＨＡＲＰとしても知られている、ヘパリン結合増殖関連分子）、ＴＧＦ−α（形質転換増殖因子α）、ＴＧＦ−β（形質転換増殖因子β）、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）、ＥＧＦ（表皮増殖因子）、ＩＧＦ−１（インスリン様増殖因子１）、ＩＧＦ−２（インスリン様増殖因子２）、ＰＤＧＦ（血小板由来成長因子）、ランテス、ＳＤＦ−１、分泌ちぢれ毛関連タンパク質１（ＳＦＲＰ−１）、小型誘導性サイトカインＡ３（ＳＣＹＡ３）、誘導性サイトカインサブファミリーＡメンバー２０（ＳＣＹＡ２０）、誘導性サイトカインサブファミリーＢメンバー１４（ＳＣＹＢ１４）、誘導性サイトカインサブファミリーＤメンバー１（ＳＣＹＤ１）、ストローマ細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）、トロンボスポンジン１、２、３及び４（ＴＨＢＳ１〜４）、血小板第４因子（ＰＦ４）、水晶体上皮由来増殖因子（ＬＥＤＧＦ）、ミジキン（ＭＫ）、マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１）、モエシン（ＭＳＮ）、肝細胞増殖因子（ＳＦとも称される、ＨＧＦ）、胎盤増殖因子、ＩＬ−１（インターロイキン１）、ＩＬ−２（インターロイキン２）、ＩＬ−３（インターロイキン３）、ＩＬ−６（インターロイキン６）、ＩＬ−７（インターロイキン７）、ＩＬ−１０（インターロイキン１０）、ＩＬ−１２（インターロイキン１２）、ＩＦＮ−α（インターフェロンα）、ＩＦＮ−γ（インターフェロンγ）、ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子α）、ＳＤＧＦ（シュワン細胞腫由来増殖因子）、神経成長因子、神経突起成長促進因子２（ＮＥＧＦ２）、ニューロトロフィン、ＢＭＰ−２（骨形成タンパク質２）、ＯＰ−１（ＢＭＰ−７とも称される、骨形成タンパク質１）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、インターフェロンγ誘導性タンパク質２０、ランテス、及びＨＩＶ−ｔａｔ−トランス活性化因子、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）、血管関連遊走細胞タンパク質（ＡＡＭＰ）、アンギオスタチン、ベータセリン（ＢＴＣ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、高システイン血管新生インデューサー６１（ＣＹＣＲ６１）、エンドスタチン、フラクタルカイン／ニューロアクチン、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ＧＲＯ２、肝細胞癌由来増殖因子（ＨＤＧＦ）、及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）のうちのいずれかで見出されるアミノ酸配列、又は前記のいずれかで見出されるアミノ酸配列の相同体を含む。
【００５６】
本発明のなお別の態様において、医薬組成物は、式Ｉ〜ＶＩのいずれかのヘパリン結合増殖因子類似体又は薬学的に許容されるその塩と、医薬担体とを含む。
【００５７】
本発明の他の態様、目的、利点及び新規特性、並びに特許性の更なる範囲は、部分的には以下の詳細な説明で記載され、部分的には以下の実験により当業者に明白になるか、又は本発明の実施により学ぶことができる。本発明の目的及び利点を、添付の請求項で特に指摘されている有用性及び組み合わせによって理解及び実現することができる。
【００５８】
本発明の追加の目的及び利点は、以下の詳細な説明を添付図面と一緒に読むことにより明白となる。
【課題を解決するための手段】
【００５９】
本発明のそれぞれの合成ＨＢＧＦ類似体は、ＨＢＧＦＲに結合する特定のＨＢＧＦの類似体であるか、あるいはあらゆる特定のＨＢＧＦの類似体であることなくＨＢＧＦＲに結合する、２個の実質的に同様の配列（ホモ二量体配列）を含む。ホモ二量体配列は、ＨＢＧＦの任意の部分から誘導されうる。合成ＨＢＧＦ類似体は、ホルモン、サイトカイン、リンホカイン、ケモカイン又はインターロイキンの類似体であることができ、前記のいずれかのうちの任意のＨＢＧＦＲに結合することができる。
【００６０】
本発明の一つの態様は、本発明の合成ＨＢＧＦ類似体が式Ｉ〜ＶＩのいずれかの式の分子であることを提供する。ＨＢＧＦには、ヘパリンに選択的に結合するあらゆる増殖因子が含まれる。例えば、ＨＢＧＦは、既知のＦＧＦ（ＦＧＦ−１〜ＦＧＦ−２３）、アクチビンＶ、ＨＢＢＭ（ヘパリン結合脳分裂促進因子）、ＨＢ−ＧＡＦ（へパリン結合増殖関連因子）、ＨＢ−ＥＧＦ（ヘパリン結合ＥＧＦ様因子）、ＨＢ−ＧＡＭ（プレイオトロフィン、ＰＴＮ、ＨＡＲＰとしても知られている、ヘパリン結合増殖関連分子）、ＴＧＦ−α（形質転換増殖因子α）、ＴＧＦ−β（形質転換増殖因子β）、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）、ＥＧＦ（表皮増殖因子）、ＩＧＦ−１（インスリン様増殖因子１）、ＩＧＦ−２（インスリン様増殖因子２）、ＰＤＧＦ（血小板由来成長因子）、ランテス、ＳＤＦ−１、分泌ちぢれ毛関連タンパク質１（ＳＦＲＰ−１）、小型誘導性サイトカインＡ３（ＳＣＹＡ３）、誘導性サイトカインサブファミリーＡメンバー２０（ＳＣＹＡ２０）、誘導性サイトカインサブファミリーＢメンバー１４（ＳＣＹＢ１４）、誘導性サイトカインサブファミリーＤメンバー１（ＳＣＹＤ１）、ストローマ細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）、トロンボスポンジン１、２、３及び４（ＴＨＢＳ１〜４）、血小板第４因子（ＰＦ４）、水晶体上皮由来増殖因子（ＬＥＤＧＦ）、ミジキン（ＭＫ）、マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１）、モエシン（ＭＳＮ）、肝細胞増殖因子（ＳＦとも称される、ＨＧＦ）、胎盤増殖因子、ＩＬ−１（インターロイキン１）、ＩＬ−２（インターロイキン２）、ＩＬ−３（インターロイキン３）、ＩＬ−６（インターロイキン６）、ＩＬ−７（インターロイキン７）、ＩＬ−１０（インターロイキン１０）、ＩＬ−１２（インターロイキン１２）、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−α（インターフェロンα）、ＩＦＮ−γ（インターフェロンγ）、ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子α）、ＳＤＧＦ（シュワン細胞腫由来増殖因子）、神経成長因子、神経突起成長促進因子２（ＮＥＧＦ２）、ニューロトロフィン、ＢＭＰ−２（骨形成タンパク質２）、ＯＰ−１（ＢＭＰ−７とも称される、骨形成タンパク質１）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、インターフェロンγ誘導性タンパク質２０、ランテス、及びＨＩＶ−ｔａｔ−トランス活性化因子、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）、血管関連遊走細胞タンパク質（ＡＡＭＰ）、アンギオスタチン、ベータセリン（ＢＴＣ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、高システイン血管新生インデューサー６１（ＣＹＣＲ６１）、エンドスタチン、フラクタルカイン／ニューロアクチン、又はグリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ＧＲＯ２、肝細胞癌由来増殖因子（ＨＤＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、並びにヘパリンに親和性を有する多くの増殖因子、サイトカイン、インターロイキン及びケモカインのいずれかであることができる。本発明の作用物質を、通常ヘパリンに結合しない増殖因子、サイトカイン、インターロイキン及びケモカインの直接の類似体への適切な結合配列の導入によって、ヘパリン結合親和性を持つように修飾できることも考慮される。
【００６１】
これら及び他のＨＢＧＦの多くのアミノ酸配列は、ncbi.nlm.nih.gov/entrezで見出されるワールドワイドウエブのアドレスによってアクセス可能なインターネットサイトで、National Library of Medicine Protein Databaseから入手可能である。前記のインターネットサイトのＨＢＧＦアミノ酸配列は、参照により本明細書に組み込まれる。これら及び他のＨＢＧＦのレセプター結合ドメインのアミノ酸配列を組み込んでいる合成ＨＢＧＦ類似体の使用が、本発明において特に考慮される。
【００６２】
本発明の特定の実施態様において、本発明の合成ＨＢＧＦ類似体は、式Ｉ〜ＶＩのいずれかの式の分子から実質的になり、すなわち、式Ｉ〜ＶＩのいずれかの式の分子は、合成ＨＢＧＦ類似体組成物において主要な活性成分である。
【００６３】
式Ｉ〜ＶＩのヘパリン結合増殖因子：式Ｉ〜ＶＩの合成ＨＢＧＦ類似体の領域Ｘ及びＺは、アミノ酸残基を含み、場合により領域Ｙは、アミノ酸残基を含む。アミノ酸残基は、−ＮＨＲＣＯ−として定義され、ここでＲは、水素又は任意の有機基であることができる。アミノ酸はＤ−アミノ酸又はＬ−アミノ酸であることができる。加えて、アミノ酸は、アミノ酸の炭素鎖の長さに応じて、αアミノ酸、βアミノ酸、γアミノ酸又はδアミノ酸などであることができる。
【００６４】
本発明の合成ＨＢＦＧ類似体のＸ、Ｙ及びＸ成分領域のアミノ酸は、タンパク質で天然に見出される２０個のアミノ酸のいずれかを含むことができ、すなわち、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、アスパルギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン酸、（Ｇｌｕ、Ｅ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（Iｌｅ、Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、リシン（Ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）及びバリン（Ｖａｌ、Ｖ）である。
【００６５】
更に、本発明の合成ＨＢＦＧ類似体のＸ、Ｙ及びＸ成分領域のアミノ酸は、タンパク質に天然に見出されない天然に生じるアミノ酸のいずれかを含むことができ、例えば、βアラニン、ベタイン（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシン）、ホモセリン、ホモシステイン、γアミノ酪酸、オルニチン及びシトルリンである。
【００６６】
加えて、本発明の合成ＨＢＦＧ類似体のＸ、Ｙ及びＸ成分領域のアミノ酸には、非生物アミノ酸のいずれかを含むことができ、すなわち、例えば天然で見出されない直鎖アミノカルボン酸のような生物系で通常見出されないものである。直鎖アミノカルボン酸の例には、６−アミノヘキサン酸、７−アミノヘプタン酸、９−アミノノナン酸などが含まれる。
【００６７】
式Ｉにおいて、２つのＸ領域が直接に又はＲ2基を介してＲ1に共有結合しており、ここでＲ1は、三官能性アミノ酸残基、好ましくは三官能性αアミノ酸残基である。そのような共有結合は、化学的に許容されるあらゆる官能基でありうることが理解されるべきである。三官能性アミノ酸残基が、システインのような反応性スルフヒドリル側鎖を有するアミノ酸である場合、第１のＸは、Ｎ末端アミン基を介して共有結合し、第２のＸは、Ｒ2がジスルフィド結合を介して共有結合している第２のシステイン残基を含む場合では、反応性スルフヒドリル側鎖を介して共有結合し、そしてＹは、そのＣ末端カルボキシル基を介して第２のシステインに共有結合していることが可能であり、考慮される。
【００６８】
特に好ましい実施態様において、Ｒ1はジアミン三官能性アミノ酸残基であり、ここで、Ｒ1は、Ｒ1のカルボキシル基を介してＹに共有結合しており、そして２個のＸ基は、αアミノ酸と側鎖のεアミノ酸を介してＲ1に共有結合している。したがって、Ｒ1の好ましい基には、２，３−ジアミノプロピルアミノ酸、２，４−ジアミノブチルアミノ酸、リシン又はオルニチンが含まれる。
【００６９】
式Ｉ〜ＶＩのＸ領域として特に有用なアミノ酸配列には、天然増殖因子のアミノ酸配列と１若しくは２か所が異なるか、又はほとんど異ならない、天然に生じるＨＢＧＦのフラグメントの相同体が含まれる。そのような配列は、好ましくは、元のアミノ酸が周知の原則に従って同様の性質のアミノ酸に代えられる保守的変化を含み、例えば、アラニンのような非極性アミノ酸を、バリン、ロイシン、イソロイシン又はプロリンと代えること、又は１つの酸性若しくは塩基性アミノ酸を同じ酸性若しくは塩基性の性質を持つ別のアミノ酸で置換することである。
【００７０】
別の代替案では、合成ＨＢＧＦ類似体のＸ領域は、あらゆるＨＢＧＦのアミノ酸配列に検出可能な相同性を示さないアミノ酸配列を含むことができる。同族増殖因子とほとんど又は全くアミノ酸配列相同性を有さないが、それでもＨＢＧＦＲに結合する、本発明の合成類似体のＸ領域の成分として有用なペプチド又は増殖因子類似体を、例えばファージディスプレーによる選択を含む広範囲な方法にいずれかにより得ることができる。例えば、Sidhu et al. Phage display for selection of novel binding peptides. Methods Enzymol. 328:333-63 (2000)を参照すること。
【００７１】
本発明の合成ＨＢＧＦ類似体のＸ領域は、ＨＢＧＦＲに効果的に結合するアミノ酸配列を含むあらゆる長さを有することができる。好ましくは合成ＨＢＧＦ類似体のＸ領域は、少なくともおよそ３個のアミノ酸残基の最小長を有する。より好ましくは合成ＨＢＧＦ類似体のＸ領域は、少なくともおよそ６個のアミノ酸残基の最小長を有する。最も好ましくは合成ＨＢＧＦ類似体のＸ領域は、少なくともおよそ１０個のアミノ酸残基の最小長を有する。本発明の合成ＨＢＧＦ類似体のＸ領域は、また、好ましくはおよそ５０個までのアミノ酸残基の最大長、より好ましくはおよそ４０個までのアミノ酸残基の最大長、最も好ましくはおよそ３０個までのアミノ酸残基の最大長を有する。
【００７２】
式Ｉ、ＩＶ又はＶＩのＲ2領域は、原子の鎖又は鎖を形成する原子の組み合わせを含むことができる。典型的には、鎖は、例えば、アミノ酸（例えば、上記で提示されているような、タンパク質で見出されるアミノ酸；オルニチン及びシトルリンのような、タンパク質で見出されない天然に生じるアミノ酸；若しくはアミノヘキサン酸の様な非天然アミノ酸；又は前記のアミノ酸のいずれかの組み合わせ）から形成される原子の鎖のような、場合により酸素、窒素又は硫黄原子も含むことができる、炭素原子の鎖である。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、アミノポリエチレングルコール、ビス−アミン−ＰＥＧ、及び当業者に既知の他のポリエチレングルコールの変異体のような作用物質を同様に使用することができることも考慮される。
【００７３】
式Ｉ、ＩＶ又はＶＩのＲ2領域の原子の鎖は、ＸとＲ1に共有結合している。共有結合は、例えば、ペプチド結合若しくは他のアミド結合、又はチオエーテル若しくはエステル結合であることができる。存在する場合、Ｒ2領域は、好ましくは最低約３個の主鎖原子の鎖を含む。例えば、共有結合がペプチド結合である場合、Ｒ2領域は、少なくとも１個、少なくとも２個又は少なくとも３個のアミノ酸の鎖から形成されうる。しかし、ペプチド結合以外が用いられる場合、Ｒ2領域は、架橋部分を更に含むことができる。例えば、Ｒ1がＣｙｓ又は反応性スルフヒドリルを有する別の三官能性アミノ酸である場合、Ｒ2領域は、スルフヒドリル反応性ホモ−二官能性架橋リンカー及び第２のＣｙｓからなるリンカーであることができるか、あるいは、Ｒ1側鎖のスルフヒドリルとＸのカルボキシル基に結合している架橋のようなヘテロ−二官能性架橋リンカーを含むことができる。
【００７４】
本発明の合成ＨＢＧＦ類似体において、一つの好ましい実施態様では、式Ｉ〜ＶＩのいずれかのＹ領域は、ＨＢＧＦ類似体をポリスチレン又はポリカプロラクトン表面などに非共有結合するのに十分なほど疎水性であるリンカーである。加えて、Ｙ領域は、他の疎水性表面、特に医療装置で使用される物質で形成された疎水性表面に結合することができる。そのような表面は典型的には疎水性表面である。適切な表面の例には、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリテトラフルオロエチレン、発泡ポリテトラフルオロエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリアミド、ポリアクリレート、ポリウレタン、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリエチルビニルアセテート、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（エチルレン−コ−ビニルアセテート）、ポリカプロラクトン、ポリラクチド、ポリグリコリド及び前記のいずれかの２個以上のコポリマーのような疎水性ポリマー；２，４，６，８−テトラメチルシクロテトラシロキサンのようなシロキサン；天然及び人造ゴム；ガラス；並びにステンレススチール、チタン、白金及びニチノールを含む金属から形成されるものが含まれるが、これらに限定はされない。好ましくは、疎水性表面へのＨＢＧＦ類似体の結合は、酵素結合免疫測定法又は生物学的検定法のような分析法により検出されるのに十分な量である。
【００７５】
本発明の実施態様によると、式Ｉ〜ＶＩのＹ領域は、原子の鎖又は鎖を形成する原子の組み合わせを含む。典型的には、鎖は、例えば、アミノ酸（例えば、上記で提示されているような、タンパク質で見出されるアミノ酸；オルニチン及びシトルリンのような、タンパク質で見出されない天然に生じるアミノ酸；若しくは直鎖アミノカルボン酸のような非天然アミノ酸；又は前記のアミノ酸のいずれかの組み合わせ）から形成される原子の鎖のような、場合により酸素、窒素又は硫黄原子も含むことができる、炭素原子の鎖である。
【００７６】
式Ｉ〜ＶＩのＹ領域の原子の鎖は、Ｒ1とペプチドＺに共有結合している。共有結合は、例えば、ペプチド、アミド、チオエーテル又はエステル結合であることができる。好ましくは、Ｙ領域は、最低約９個の主鎖原子の鎖を含む。より好ましくは、Ｙ領域は、最低約１２個の原子の鎖を含む。最も好ましくは、Ｙ領域は、最低約１５個の原子の鎖を含む。例えば、Ｙ領域は、少なくとも４個、少なくとも５個、又は少なくとも６個のアミノ酸の鎖から形成されうる。あるいは、Ｙ領域は、少なくとも１個、少なくとも２個、又は少なくとも３個のアミノヘキサン酸残基の鎖から形成されうる。
【００７７】
好ましくは、Ｙ領域は、最大約５０個の主鎖原子の鎖を含む。より好ましくは、Ｙ領域は、最大約４５個の原子の鎖を含む。最も好ましくは、Ｙ領域は、最大約３５個の原子の鎖を含む。例えば、Ｙ領域は、約１２個まで、約１５個まで、又は約１７個までのアミノ酸の鎖から形成されうる。
【００７８】
Ｙ領域のアミノ酸配列は、好ましくは人工配列であり、すなわち、ＨＢＧＦの天然リガンドで見出される４個以上のアミノ酸残基のアミノ酸配列を一つも含まない。
【００７９】
特定の実施態様において、Ｙ領域は、疎水性アミノ酸残基又は疎水性アミノ酸残基の鎖を含む。例えば、Ｙ領域は、例えばアミノヘキサン酸残基、例えば１個、２個、３個又はそれ以上のアミノヘキサン酸残基のような、１個以上の直鎖アミノカルボン酸を含む。あるいは、Ｙ領域は、約１２個まで、約１５個まで、又は約１７個までのエチレングリコール残基を含むことができる。別の代替的実施態様において、Ｙ領域は、アミノ酸疎水性残基の組み合わせを含むことができる。
【００８０】
別の特定の実施態様において、分子のＹ領域は、１〜約２０個の炭素原子の、分岐鎖又は非分岐鎖、飽和又は不飽和アルキル鎖を含むことができる。更なる実施態様において、Ｙ領域は、例えばエチレングリコール残基のような親水性残基の鎖を含むことができる。例えば、Ｙ領域は、少なくとも約３個、又は少なくとも約４個、又は少なくとも約５個のエチレングリコール残基を含むことができる。
【００８１】
式Ｉの分子のＺ領域は、ヘパリン結合領域であり、Verrecchio et al. J.Biol.Chem. 275:7701 (2000）で記載されているように、１個以上のヘパリン結合モチーフ、ＢＢｘＢ又はＢＢＢｘｘＢを含むことができる。あるいは、Ｚ領域は、ＢＢｘＢとＢＢＢｘｘＢのモチーフの両方を含むことができる（ここでＢは、リシン、アルギニン又はヒスチジンを表し、そしてｘは、天然に生じる又は非天然に生じるアミノ酸を表す）。例えば、ヘパリン結合モチーフは、配列［ＫＲ］［ＫＲ］［ＫＲ］Ｘ（２）［ＫＲ］（配列番号１）により表すことができ、最初の３個のアミノ酸がそれぞれ独立してリシン又はアルギニンから選択され、続く任意の２個のアミノ酸及び６個のアミノ酸がリシン又はアルギニンであることを示す。
【００８２】
ヘパリン結合モチーフの数は変わる。例えば、Ｚ領域は、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、又は少なくとも５個のヘパリン結合モチーフを含むことができる。１個を越えるヘパリン結合モチーフがある場合、モチーフは同一でも異なっていてもよい。あるいは、Ｚ領域は、最大約１０個までのヘパリン結合モチーフを含む。別の代替的実施態様において、Ｚ領域は、少なくとも４個、少なくとも６個、又は少なくとも８個のアミノ酸残基を含む。更に、特定の実施態様において、Ｚ領域は、約２０個まで、約２５個まで、又は約３０個までのアミノ酸残基を含む。部分的にはＺ領域のヘパリンへの結合活性は、選択された特定のヘパリン結合モチーフ及びＺにおけるそのようなモチーフの数によって決定されることが理解される。したがって、特定の用途において、そのようなモチーフの選択及び数は、Ｚ領域の最適なヘパリン結合を提供するために変わることができる。
【００８３】
好ましい実施態様において、Ｚ領域のアミノ酸配列は、ＲＫＲＫＬＥＲＩＡＲ（配列番号２）である。別の実施態様において、Ｚ領域のアミノ酸配列は、ＲＫＲＫＬＧＲＩＡＲ（配列番号３）である。なお別の実施態様において、Ｚ領域のアミノ酸配列は、ＲＫＲＫＬＷＲＡＲＡ（配列番号４）である。なお別の実施態様において、Ｚ領域のアミノ酸配列は、ＲＫＲＬＤＲＩＡＲ（配列番号５）であり、Ｊｕｎ／ＡＰ−１ ＤＮＡ結合ドメインの残基２７０−２７９の配列の修飾から誘導されるヘパリン結合モチーフを提供する（Busch et al. Trans-Repressor Activity of Nuclear Glycosaminoglycans on Fos and Jun/AP-1 Oncoprotein-mediated Transcription. J. Cell Biol. 116:31-42, 1992）。なお別の実施態様において、Ｚ領域のアミノ酸配列は、ＲＫＲＫＬＥＲＩＡＲＣ（配列番号６）である。末端システイン残基の存在によって、場合により、蛍光色素、放射性同位体及び他の検出可能なマーカーのような検出可能な試薬を含む他の分子を、Ｚ領域に結合する機会、並びに毒素、免疫原などを結合する機会を得る。
【００８４】
既知のヘパリン結合ドメインにほとんど又は全く配列相同性を持たないヘパリン結合ドメインも、本発明において考慮される。本明細書で使用されるとき、用語「ヘパリン結合」は、−ＮＨＳＯ3-及び硫酸修飾多糖、ヘパリンに結合すること、また、関連する修飾多糖、ヘパランに結合することを意味する。そのようなドメインは、０．１５MのＮａＣｌを含む生理溶液中で結合を示すことが考慮され、０．５M ＮａＣｌを越える塩濃度で非錯化することが予測される。
【００８５】
本発明の合成ＨＢＧＦ類似体のＺ領域は、約０．１５MのＮａＣｌまで、場合により約０．４８MのＮａＣｌまでの低塩濃度でヘパリンに対する結合特性を付与し、ヘパリンと因子類似体のＺ領域との間に錯体を形成する。錯体は、１MのＮａＣｌで解離して、ヘパリン錯体から合成ＨＢＧＦ類似体を放出することができる。
【００８６】
Ｚ領域は、非シグナル伝達ペプチドである。したがって、単独で使用する場合、Ｚ領域は、ＨＢＧＦのレセプターに結合できるヘパリンに結合するが、Ｚ領域ペプチドの結合だけでは、レセプターによるシグナル伝達を開始又は阻止しない。
【００８７】
Ｚ領域のＣ末端は、ブロックされていても遊離であってもよい。例えば、Ｚ領域のＣ末端は、末端アミノ酸の遊離カルボキシル基であることができるか、あるいはＺ領域のＣ末端は、例えばアミド基のようなブロックトカルボキシル基であることができる。
【００８８】
定義：ここで及び他で使用されるとき、以下の用語は示された意味を有する。
【００８９】
用語「アルケン」には、１個以上の二重炭素−炭素結合を含む不飽和炭化水素が含まれる。そのようなアルケン基の例には、エチレン、プロピレンなどが含まれる。
【００９０】
用語「アルケニル」には、少なくとも１個の二重結合を含む、炭素原子２〜６個の直鎖一価炭化水素基又は炭素原子３〜６個の分岐鎖一価炭化水素基が含まれ、その例には、エテニル、２−プロペニルなどが含まれる。
【００９１】
本明細書で特定される「アルキル」基には、直鎖又は分岐鎖の配置での指定された長さのアルキル基が含まれる。そのようなアルキル基の例にはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、sec−ブチル、第三級ブチル、ペンチル、イソペンチル、ヘキシル、イソヘキシルなどが含まれる。
【００９２】
用語「アリール」には、環原子６〜１２個の、場合により、アルキル、ハロアルキル、シクロアルキル、アルコキシ、アルキルチオ、ハロ、ニトロ、アシル、シアノ、アミノ、一置換アミノ、二置換アミノ、ヒドロキシ、カルボキシ又はアルコキシカルボニルから選択される１つ以上の置換基で独立して置換されている、一価又は二環式芳香族炭化水素が含まれる。アリール基の例には、フェニル、ビフェニル、ナフチル、１−ナフチル及び２−ナフチル、それらの誘導体などが含まれる。
【００９３】
用語「アラルキル」には、基−ＲaＲbが含まれ、ここで、Ｒaはアルキレン（二価アルキル）基であり、そしてＲbは上記で定義されたアリール基である。アラルキル基の例には、ベンジル、フェニルエチル、３−（３−クロロフェニル）−２−メチルペンチルなどが含まれる。用語「脂肪族」には、例えばアルカン、アルケン、アルキン及びこれらの誘導体のような、炭化水素鎖を有する化合物が含まれる。
【００９４】
用語「アシル」には、基ＲＣＯ−が含まれ、ここでＲは、有機基である。一例は、アシル基ＣＨ3ＣＯ−である。
【００９５】
ペプチド又は脂肪族部分は、上記で定義されたアルキル又は置換アルキル基が１個以上のカルボニル｛−（Ｃ＝Ｏ）−｝基を介して結合している場合、「アシル化」されている。ペプチドは、最も一般的には、Ｎ末端においてアシル化されている。
【００９６】
「アミド」には、カルボニル基（−ＣＯ．ＮＨ2）に結合している三価窒素を有する化合物が含まれる。
【００９７】
「アミン」には、アミノ基（−ＮＨ2）を含む化合物が含まれる。
【００９８】
「ジアミンアミノ酸」は、２個の反応性アミン基と１個の反応性カルボキシル基を含むアミノ基又は残基である。代表的な例には、２，３−ジアミノプロピルアミノ酸、２，４−ジアミノブチルアミノ酸、リシン又はオルニチンが含まれる。
【００９９】
本明細書で使用されるとき、用語「相同性」は、配列が整列したとき、アミノ酸の位置の１か所以上でアミノ酸配列が異なるペプチドを意味する。例えば、２個の相同性ペプチドのアミノ酸配列では、整列したアミノ酸配列の５〜１０個のアミノ酸のうちで１個のアミノ酸残基しか異なることができない。あるいは、２個の、アミノ酸が１０〜１５個の相同性ペプチドでは、整列したとき２個以下のアミン酸残基が異なることができる。別の代替案において、２個の、アミノ酸が１５〜２０個又はそれ以上の相同性ペプチドでは、整列したとき３個までのアミン酸残基が異なることができる。もっと長いペプチドにおいて、相同性ペプチドでは、２個のペプチド相同体のアミノ酸配列が整列したとき、およそ５％、１０％、２０％又は２５％までのアミノ酸残基が異なることができる。
【０１００】
「三官能性アミノ酸」は、３個の反応性基を持つアミノ酸又は残基であり、第１はＮ−末端アミンであり、第２はＣ末端カルボキシルであり、第３は側鎖の全て又は一部を含む。したがって三官能性アミノ酸には、単なる例として、ジアミンアミノ酸；システイン、ペニシラミン又は３−メルカプトフェニルアラニンを含む、メルカプトアミノ酸のような側鎖に反応性スルフヒドリル基を有するアミノ酸；アスパルギン酸及びグルタミン酸のような、側鎖に反応性カルボキシル基を有するアミノ酸；並びにアルギニンのような、側鎖に反応性グアナジウム基を有するアミノ酸が含まれる。
【０１０１】
ＦＧＦ合成類似体：別の特定の態様において、本発明は合成ＦＧＦペプチド類似体を提供する。合成ＦＧＦ類似体は、Ｘが、ＦＧＦ−１〜ＦＧＦ−２３の２３個のＦＧＦを全て含む、既知のＦＧＦのいずれかのような任意のＦＧＦでありうるＦＧＦ類似体である、上記の式Ｉ〜ＶＩのいずれかにより表される。
【０１０２】
式Ｉ〜ＶＩの分子のＸ領域は、例えばＦＧＦ−２又はＦＧＦ−７のような、ＦＧＦで見出されるアミノ酸配列を含むことができる。あるいは、Ｘ領域は、分子により結合されているＦＧＦＲの天然リガンドで見出されない配列を含むことができる。
【０１０３】
式Ｉ〜ＶＩのいずれかの合成ＦＧＦペプチド類似体のＹ領域は、必ずしも疎水性でなくてもよく、したがって、存在する場合は、極性、塩基性、酸性、親水性又は疎水性であることができる。したがって、合成ＦＧＦペプチド類似体のＹ領域のアミノ酸残基は、あらゆるアミノ酸、又は極性、イオン性、疎水性又は親水性基を含むことができる。
【０１０４】
合成ＦＧＦペプチド類似体のＸ領域は、線維芽細胞増殖因子で見出されるアミノ酸配列又は線維芽細胞増殖因子のアミノ酸配列に相同性のアミノ酸配列と１００％同一であるアミノ酸配列を含むことができる。例えば、Ｘ領域は、線維芽細胞増殖因子のアミノ酸配列に、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、又は少なくとも約９０％相同性があるアミノ酸配列を含むことができる。線維芽細胞増殖因子は、既知又は未だに同定されていない線維芽細胞増殖因のうちのいずれかを含む、あらゆる線維芽細胞増殖因であることができる。
【０１０５】
特定の実施態様において、本発明の合成ＦＧＦ類似体は、ＨＢＧＦＲのアゴニストである。ＨＢＧＦＲに結合すると、合成ＨＢＧＦ類似体は、ＨＢＧＦＲによるシグナルを開始する。
【０１０６】
更なる特定の実施態様において、本発明の合成ＦＧＦ類似体は、ＨＢＧＦＲのアンタゴニストトである。ＨＢＧＦＲに結合すると、合成ＨＢＧＦ類似体は、ＨＢＧＦＲによるシグナル伝達を阻止する。
【０１０７】
本発明の別の特定の実施態様において、合成ＦＧＦ類似体は、ＦＧＦ−２（塩基性ＦＧＦ又はｂＦＧＦとしても知られている）の類似体である。本発明の別の特定の実施態様において、合成ＦＧＦ類似体の、ＦＧＦレセプターへの結合は、ＦＧＦレセプターによるシグナルを開始する。更なる特定の実施態様において、合成ＦＧＦ類似体の、ＦＧＦレセプターへの結合は、ＦＧＦレセプターによるシグナル伝達を阻止する。
【０１０８】
なお更なる特定の実施態様において、本発明は、ＦＧＦ−２の合成ＦＧＦ類似体を提供する。別の特定の実施態様において、本発明は、ＦＧＦ−２のＸ領域のアミノ酸配列がＹＲＳＲＫＹＴＳＷＹＶＡＬＫＲ（配列番号７）である、ＦＧＦ−２のＦＧＦ類似体を提供する。なお別の特定の実施態様において、本発明は、Ｘ領域のアミノ酸配列がＮＲＦＨＳＷＤＣＩＫＴＷＡＳＤＴＦＶＬＶＣＹＤＤＧＳＥＡ（配列番号８）である、合成ＦＧＦ類似体を提供する。なお別の特定の実施態様において、本発明は、Ｘ領域のアミノ酸配列がＨＩＫＬＱＬＱＡＥＥＲＧＶＶＳ（配列番号９）である、合成ＦＧＦ−２類似体を提供する。
【０１０９】
なお更なる特定の実施態様において、本発明は、Ｘ領域がＹＩＳＫＫＨＡＥＫＮＷＦＶＧＬＫＫ（配列番号１０）である、ＦＧＦ−１の合成ＦＧＦ類似体を提供する。この配列は、ＦＧＦ−１のβ９及びβ１０ループを架橋するアミノ酸から誘導される。なお別の特定の実施態様において、Ｘ領域が、ＦＧＦ−１のβ４及びβ５領域から誘導されるアミノ酸に対応するＨＩＱＬＱＬＳＡＥＳＶＧＥＶＹ（配列番号１１）である、ＦＧＦ−１類似体が提供される。
【０１１０】
なお更なる特定の実施態様において、本発明は、Ｘ領域がＹＡＳＡＫＷＴＨＮＧＧＥＭＦＶＡＬＮＱＫ（配列番号１２）である、ＦＧＦ−７の合成ＦＲＧ類似体を提供する。ＦＧＦ−７の合成ＦＲＧ類似体合のなお別の実施態様において、Ｘ領域は、アミノ酸配列ＹＮＩＭＥＩＲＴＶＡＶＧＩＶＡ（配列番号１３）である。
【０１１１】
ヒトＦＧＦのＣ末端における標的配列から主に誘導される他のＦＧＦレセプター結合ドメインは、表１で示される以下の配列を含む。
【０１１２】
【表１】
【０１１３】
ＶＥＧＦ合成類似体：別の特定の態様において、本発明は合成ＶＥＧＦペプチド類似体を提供する。一つの実施態様において表される合成ＶＥＧＦ類似体には、Ｘ領域のアミノ酸配列がＡＰＭＡＥＧＧＧＱＮＨＨＥＷＫＦＭＤＶ（配列番号２５）である、ＶＥＧＦ類似体が含まれる。別の実施態様では、Ｘ領域のアミノ酸配列がＧＡＴＷＬＰＰＮＰＴＫ（配列番号２６）である、合成ＶＥＧＦペプチド類似体が提供される。なお別の実施態様では、Ｘ領域のアミノ酸配列がＮＦＬＬＳＷＶＨＷＳＬＡＬＬＬＹＬＨＨＡ（配列番号２７）である、合成ＶＥＧＦペプチド類似体が提供される。
【０１１４】
ＢＭＰ合成類似体：別の特定の態様において、本発明は合成ＢＭＰペプチド類似体を提供する。合成骨形成タンパク質類似体は、Ｘ領域がアミノ酸配列ＬＹＶＤＦＳＤＶＧＷＮＤＷ（配列番号：２８）、ＡＩＳＭＬＹＬＤＥＮＥＫＶＶＬ（配列番号：２９）、ＩＳＭＬＹＬＤＥＮＥＫＶＶＬＫＮＹ（配列番号３０）、ＥＫＶＶＬＫＮＹＱＤＭＶＶＥＧ（配列番号：３１）、ＬＶＶＫＥＮＥＤＬＹＬＭＳＩＡＣ（配列番号：３２）、ＡＦＹＣＨＧＥＣＰＦＰＬＡＤＨＬ（配列番号：３３）、ＰＦＰＬＡＤＨＬＮＳＴＮＨＡＩＶＱＴＬＶＮＳＶ（配列番号：３４）、ＴＱＬＮＡＩＳＶＬＹＦＤＤＳＳＮＶＩＬＫＫＹＲＮＭＶＶ（配列番号８７）及び／又はＨＥＬＹＶＳＦＲＤＬＧＷＱＤＷＩＩＡＰＥＧＹＡＡＹ（配列番号：８８）を含む実施態様を含む。
【０１１５】
あるいは、別の特定の態様において、本発明は、合成アビニンＡを提供し、合成アビニンＡタンパク質類似体は、Ｘ領域がアミノ酸配列ＳＭＬＹＹＤＤＧＱＮＩＩＫＫ（配列番号８９）、ＫＫＩＩＮＱＧＤＤＹＹＬＭＳ（配列番号９０）及び／又はＳＭＬＹＹＤＤＧＱＮＩＩＫＫＤＩ（配列番号９１）を含む実施態様を含む。
【０１１６】
あるいは、別の特定の態様において、本発明は、合成Ｇ−ＣＳＦを提供し、合成Ｇ−ＣＳＦタンパク質類似体は、Ｘ領域がアミノ酸配列ＡＳＳＬＰＱＳＦＬＬＫＣＬＥＱＶＲＫＩＱ（配列番号９２）、ＬＤＶＡＤＦＡＴＴＩＷＱＱＭＥＥＬ（配列番号９３）及び／又はＹＫＬＡＨＰＥＥＬＶＬ（配列番号９４）を含む実施態様を含む。
【０１１７】
あるいは、別の特定の態様において、本発明は、合成ＧＭ−ＣＳＦを提供し、合成ＧＭ−ＣＳＦタンパク質類似体は、Ｘ領域がアミノ酸配列ＷＥＨＶＮＡＩＱＥＡＲＲＬＬＮＬ（配列番号９５）、ＬＱＴＲＬＥＬＹＫＱＧＬＲＧＳＬＴＫＬＫＧＰＬＴＭＭＡＳＨＹＫＱＨ（配列番号９６）及び／又はＳＦＫＥＮＬＫＤＦＬＬＶＩ（配列番号９７）を含む実施態様を含む。
【０１１８】
あるいは、別の特定の態様において、本発明は、合成ＩＦＮ−βを提供し、合成ＩＦＮ−βタンパク質類似体は、Ｘ領域がアミノ酸配列ＳＶＱＡＲＷＥＡＡＦＤＬＤＬＹ（配列番号９８）、ＹＬＤＬＤＦＡＡＥＷＲＡＱＶＳ（配列番号９９）及び／又はＳＳＳＴＧＷＮＥＴＩＶＥＮＬＩ（配列番号１００）を含む実施態様を含む。
【０１１９】
あるいは、別の特定の態様において、本発明は、合成ＰＤＧＦを提供し、合成ＰＤＧＦタンパク質類似体は、Ｘ領域がアミノ酸配列ＫＴＲＴＥＶＦＥＩＳＲＲＬＩＤＲＴＮＡＮＦＬＶＷ（配列番号１０１）及び／又はＱＶＲＫＩＥＩＶＲＫＫＰＩＦＫＫ（配列番号１０２）を含む実施態様を含む。
【０１２０】
あるいは、別の特定の態様において、本発明は、合成ＳＤＦ−１を提供し、合成ＳＤＦ−１タンパク質類似体は、Ｘ領域がアミノ酸配列ＫＰＶＳＬＳＹＲＣＰＣＲＦＦＥＳＨＶＡ（配列番号１０３）及び／又はＫＷＩＱＥＹＬＥＫ（配列番号１０４）を含む実施態様を含む。
【０１２１】
あるいは、別の特定の態様において、本発明は、形質転換増殖因子ファミリーメンバーペプチドが内在性又は人工ＢＭＰペプチド又はＴＧＦペプチドの活性を増強するのに特に有用であり、かつ式Ｉ〜ＶＩのいずれかの作成物のＸ領域の全て又は一部を形成する配列を（「好ましいレセプター結合ドメイン」の項目の下に）示している表２で示されている、合成ＢＭＰ、ＴＧＦ及びＧＤＦ（増殖分化因子）ペプチド類似体を提供する。
【０１２２】
【表２】
【０１２３】
驚くべきことに、また有利なことに、式Ｉ〜ＶＩのものを含む本発明の化合物において、通常のＮ→Ｃ配向で示されている配列ＡＩＳＭＬＹＬＤＥＮＥＫＶＶＬ（配列番号２９）を考慮し、式ＩＩを使用すると、Ｒ1側鎖又はＮ末端アミンに結合している第１のアミノ酸は、（そのカルボキシル基を介して結合して、それによってペプチド結合を形成する）Ｎ末端アミノ酸残基であり、Ｎ末端アミノ酸残基に結合している第２のアミノ酸は２位の残基であるなどのように、Ｘ領域を逆方向で合成することができ、それにもかかわらず化合物は、生物活性を保持し、ＢＭＰレセプターに特異的に結合していることが見出された。Ｒ1がジアミンアミノ酸であるＲ1のアミンを有するペプチド結合を形成するのは従来のＮ末端アミノ酸残基のカルボニル基であるので、そのような作成物は、従来のＮ→Ｃ配向に対して逆配列を有することを見ることができる。したがって、この場合でも従来のＮ→Ｃ配向を用いて、前記の配列を逆方向で用いることができ、得られた本発明の化合物は、生物活性があり、本明細書に記載されたとおりに用いることができる。好ましい実施態様によると、Ｘ領域は、配列ＬＶＶＫＥＮＥＤＬＹＬＭＳＩＡ（配列番号５７）であり、ここでも配列は従来のＮ→Ｃ配向で考慮されている。
【０１２４】
ＬＶＶＫＥＮＥＤＬＹＬＭＳＩＡ（配列番号５７）に加えて、その相同体を含み、全体的に又は部分的に用いることができる他の逆配列には、ＹＮＫＬＶＶＫＥＮＥＤＬＹＬＭＳＩ（配列番号５８）、ＫＫＬＩＶＮＳＳＥＤＦＹＬ（配列番号５９）、ＷＤＮＷＧＶＤＳＦＤＶＹＬ（配列番号６０）、ＧＥＶＶＭＤＱＹＮＫＬＶＶＫＥ（配列番号６１）、ＬＨＤＡＬＰＦＰＣＥＧＨＣＹＦＡ（配列番号６２）、ＶＳＮＶＬＴＱＶＩＡＨＮＴＳＮＬＨＤＡＬＰＦＰ（配列番号６３）及びＬＶＶＫＥＮＥＤＬＹＬＭＳＩＡＣ（配列番号６４）が含まれるが、これらに限定はされない。
【０１２５】
本発明の特定の実施態様において、式ＩのＲ2領域は、それぞれ異なっており、式ＩＶ及びＶＩにおいて、１個のＲ1基しか提供されていない。式Ｉにおいてさえも、そのような領域は異なっていることができることが考慮され、例えば式Ｉにおいて、Ｒ1は、リシンのようなジアミンアミノ酸であることができる。合成の際に直交保護基を利用してαアミン又はεアミンのいずれかを保護し、その後、アミノ酸残基又は他の基のうちの１つを加えてＲ2基を形成し、次に直交保護基を除去し、Ｒ1の脱保護アミンとＲ2の末端アミンからのＸ基の平行合成を進めることが可能である。
【０１２６】
ヘパリン結合増殖因子類似体を合成する方法：本発明の類似体の合成は、当該技術分野で周知の多様な化学的方法のいずれかにより達成することができる。そのような方法には、多くの市販のペプチド合成機のうちのいずれかによる、ベンチスケール固相合成及び自動ペプチド合成が含まれる。好ましくは、合成機は、９９％を越える１サイクルあたりのカップリング効率を有する。
【０１２７】
本発明の類似体は、段階的合成によるか、又は同様の周知の技術によりカップリングできる一連のフラグメントの合成により産生することができる。例えば、Nyfeler, Peptide synthesis via fragment condensation. Methods Mol. Biol. 35:303-16 (1994);及びMerrifield, Concept and early development of solid-phase peptide synthesis. Methods in Enzymol. 289:3-13 (1997)を参照すること。これらの方法は、個別のペプチドを調製するのに日常的に使用されている。本発明の類似体を、Ｘ、Ｙ及びＺ成分を構成するペプチドのような成分の部分から組み立て、その後、そのような成分の部分を類似体に組み立てることが可能である。例えば、Dawson and Kent, Synthesis of native proteins by chemical ligation. Annu. Rev. Biochem. 69:923-960 (2000);及びEom et al., Tandem ligation of multipartite peptides with cell-permeable activity. J. Am. Chem. Soc. 125:73-82 (2003)を参照すること。しかし、好ましい実施態様において、本発明の化合物は、樹脂に結合している式Ｉ〜ＶＩのＺ領域のＣ末端残基及び段階的に進行する合成を用いて、固相合成により合成される。樹脂からのペプチドの開裂の前、その間又はその後のいずれかでの脱保護のために、必要であれば、従来の保護基が用いられる。単なる例として、式ＩのＲ1の位置のものに加えて、１つ以上のリシン残基を含む本発明の化合物において、そのような追加的なリシン残基は、保護基により慣用的に保護され、合成の後で脱保護される。
【０１２８】
ＨＢＧＦＲへの結合のように、望ましい特性のためにスクリーニングするのに使用できるペプチドライブラリーは、これらの方法を適合させて調製できる。例えば、 Fox, Multiple peptide synthesis, Mol. Biotechnol. 3:249-58 (1995);及びWade and Tregear, Solid phase peptide synthesis: recent advances and applications. Austral. Biotechnol. 3:332-6 (1993)を参照すること。
【０１２９】
特定の実施態様において、本発明の合成ＨＢＧＦ類似体は、ＨＢＧＦＲのアゴニストである。ＨＢＧＦＲに結合すると、合成ＨＢＧＦ類似体は、ＨＢＧＦＲによるシグナルを開始する。
【０１３０】
別の特定の実施態様において、本発明の合成ＨＢＧＦ類似体は、ＨＢＧＦＲのアンタゴニストである。ＨＢＧＦＲに結合すると、合成ＨＢＧＦ類似体は、ＨＢＧＦＲによるシグナル伝達を阻止する。
【０１３１】
特定の態様において、本発明は、細胞と、式Ｉ〜ＶＩの合成ＨＢＧＦ類似体の有効量とを接触させることによって、細胞における増殖因子レセプターシグナル伝達を刺激する方法を提供する。有効量は、当業者によって容易に決定することができる。シグナル伝達は、細胞からのサイトカイン放出、細胞の増殖又は分化の刺激又は阻害、細胞の走化性、哺乳動物の免疫系の刺激又は阻害により生じることができる。
【０１３２】
本発明のＨＢＧＦの使用方法：例えば癌療法及び放射線防護での使用を含む、例えば多様な疾患の予防又は治療のための可溶性薬剤としての投与のような、可溶性の予防又は治療用医薬品を含む、多数の方法で有用な生物活性分子の費用効果の高い潜在的に無制限の供給源を提供する。
【０１３３】
本発明の合成ＨＢＧＦ類似体は、例えば、細胞の成長および増殖を刺激するため又は傷を治癒するための、例えば生物学的反応を促進する縫合糸、移植片及び医用器具のような医療装置の被覆用の生物活性剤としても有用である。
【０１３４】
一つの態様において、本発明は、放射線の有害な量に暴露された哺乳類を治療する方法及び組成物を提供する。方法は、ＦＧＦ類似体である本発明の合成ＨＢＧＦ類似体の有効量を哺乳動物に投与することを含む。この治療は、粘膜炎、胃腸管系症候群（ＧＩ症候群）又は放射線への暴露により起こりうるような放射線壊死の予防又は治療に特に有用である。ＨＢＧＦ類似体は、非経口、経口、又は局所投与することができる。あるいは、ＨＢＧＦ類似体は、例えば類似体被覆医療装置により局所領域的に送達できる。関連する実施態様において、本発明は、化学療法剤の毒性を改善する用量の化学療法剤を哺乳動物に投与する、哺乳動物の治療方法を提供する。上記に記載された特定の実施態様において、哺乳動物はヒトである。方法の別の特定の実施態様において、ＨＢＧＦ類似体は、ＦＧＦ−２類似体又はＦＧＦ−７類似体である。
【０１３５】
別の態様において、本発明は、ＢＭＰ−２の類似体のような、ＢＭＰ ＨＢＧＦＲに反応性のあるＸ領域を有する本発明のＨＢＧＦ類似体を提供することによる、骨損傷のある哺乳動物を治療する方法及び組成物を提供する。例えば、本発明のそのようなＨＢＧＦ類似体を、医薬品として投与することができるか、又は骨基質若しくは骨移植材料への添加剤として用いることができる。
【０１３６】
別の態様において、本発明は、細胞又は臓器移植部位を調製するための方法及び組成物を提供する。一つの実施態様において、本発明のＦＧＦ−２のホモ二量体ＨＢＧＦ類似体を、経皮経路により投与して、インスリン分泌膵臓細胞の移植の前に、局所血管形成を刺激し、それによって移植細胞の生存を改善する。同様に、本発明のＦＧＦ−２のホモ二量体ＨＢＧＦ類似体は、筋幹細胞の移植の前に虚血性心臓組織に投与される。
【０１３７】
別の態様において、本発明は、医療装置の血液接触表面への細胞付着及びその上での細胞保持を増やす方法及び組成物を提供する。一つの実施態様において、本発明のＶＥＧＦのホモ二量体ＨＢＧＦ類似体を、血管移植片材料に適用し、これにより、結合された類似体が血液から循環内皮幹細胞を動員して結合させ、それによって移植片表面の内皮化をもたらし、それによりもたらされた長期血栓抵抗性が移植片に付与される。
【０１３８】
別の態様において、本発明は、膜誘導組織増殖を増加及び提供する方法及び組成物を提供する。
【０１３９】
別の態様において、本発明は、潰瘍を含む治療が困難な皮膚損傷の治療のための方法及び組成物を提供する。一つの実施態様において、ＴＧＦ−β１のホモ二量体ＨＢＧＦ類似体を、潰瘍化褥瘡及び同様の治療が困難な皮膚損傷の治療のために、薬学的に許容されるクリーム又はゲルで局所適用する。
【０１４０】
なお別の態様において、本発明は、インビトロで細胞集団を選択的に増加する方法及び組成物を提供する。例えば、ＴＧＦ−β１のホモ二量体ＨＢＧＦ類似体を、組織培地中で配合して、軟骨細胞、軟骨細胞を生じる幹細胞又は軟骨細胞を生じる多機能細胞の増殖を特異的に刺激する。同様に、ＶＥＧＦのホモ二量体ＨＢＧＦ類似体を用いて、内皮細胞の増殖を刺激することができる。
【０１４１】
本明細書で使用されるとき、用語「医療装置」は、生物体、好ましくは哺乳動物、特にヒトにおいて、臓器、組織、血液又は他の体液に接触する１つ以上の表面を有する装置を意味する。医療装置には、例えば、患者に戻される血液に接触する、血液酸素供給器、血液ポンプ、血液センサー、血液を運ぶ管などのような外科手術で使用される体外装置が含まれる。この用語は、血管又は心臓に移植された、移植血管、ステント、ペースメーカー導出、心臓弁などのようなヒト又は動物の体内において血液に接触するように移植された内部人工器官も含むことができる。この用語は、更に、モニタリング又は修復の目的で血管又は心臓に入れられたカテーテル、ガイドワイヤなどのような、一時的な血管内使用のための装置を含むことができる。この用語は、更に、神経電極、筋肉電極、植え込み型パルス発生器、植え込み型薬剤ポンプ、及び細動除去器を含むことができる。更に、医療装置という用語は、縫合糸、移植片材料、創傷被覆、神経誘導、骨ロウ、動脈瘤コイル、塞栓形成粒子、マイクロビーズ、人工歯根、人工骨、組織骨格、人工関節、又は制御放出薬剤送達装置を含むことができる。
【０１４２】
医療装置の表面は、例えば、ステンレススチール、チタン、白金、タングステン、セラミック、ポリウレタン、ポリテトラフルオロエチレン、発泡ポリテトラフルオロエチレン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリアミド、ポリアクリレート、ポリウレタン、ポリビニルアルコール、ポリカプロラクトン、ポリアクチド、ポリグリコシド、ポリシロキサン（例えば、２，４，６，８−テトラメチルシクロテトラシロキサン）、天然ゴム若しくは人造ゴム、又はこれらのブロックポリマー若しくはコポリマーのような、医療装置での使用が適切な慣用的に使用される材料のいずれかにより形成することができる。
【０１４３】
生物分子を医療装置の表面に被覆する方法は既知である。例えば、米国特許第５，８６６，１１３号（Hendriksら）を参照すること（この明細書は参照により本明細書に組み込まれる）。米国特許第５，９５５，５８８号（Tsangら）は、抗血栓性被覆組成物及び医療装置におけるその使用方法を教示し、参照により本明細書に組み込まれる。米国特許第６，３４２，５９１号（Zamoraら）は、細胞付着組成物を調節するための、医療装置用の両親媒性被覆を教示し、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４４】
一つの実施態様において、本発明は、活性ペプチドを哺乳動物へ送達する方法を提供し、その方法は、（ｉ）医療装置の表面に非共有結合で結合している式Ｉ〜ＶＩの合成ＨＢＧＦ類似体で表面が被覆されている医療装置を提供すること、及び（ｉｉ）医療装置を哺乳動物の表面に設置するか又は医療装置を哺乳動物の中に移植することを含む。
【０１４５】
上記の方法の特定の実施態様において、非共有結合は、合成ＨＢＧＦ類似体のヘパリン結合ドメインと、医療装置の表面に結合しているヘパリン含有化合物との間の会合である。医療装置の表面に結合しているヘパリン含有化合物は、例えばベンジル−ビス（ジメチルシリルメチル）オキシカルバモイル−ヘパリンのような、あらゆるヘパリン含有化合物であることができる。
【０１４６】
上記の方法の別の特定の実施態様において、医療装置は、式Ｉ〜ＶＩの合成ＨＢＧＦ類似体で被覆される前に、ヘパリン含有化合物でプレコートされていない。
【０１４７】
ヘパリン結合増殖因子類似体の医薬用途：本発明のＨＢＧＦ類似体を、医療用途と畜産又は獣医用との両方において医薬組成物の活性成分として使用することができる。典型的には、ＨＢＧＦ類似体又は医薬組成物は、ヒトで使用されるが、他の哺乳動物で使用することもできる。用語「患者」は、個々の哺乳類を示すことが意図され、明細書及び請求項全体を通してそのように使用される。本発明の主な用途はヒトの患者に関わるが、本発明は、実験室、農場、動物園、野生、ペット、競技用、又は他の動物に適用することができる。
【０１４８】
本発明のＨＢＧＦ類似体は、任意の薬学的に許容される塩の形態であることができる。用語「薬学的に許容される塩」は、無機又は有機塩基及び無機又は有機酸を含む、薬学的に許容される非毒性塩基又は酸から調製される塩を意味する。無機塩基から誘導される塩には、アルミニウム、アンモニウム、カルシウム、銅、第二鉄、第一鉄、リチウム、マグネシウム、マンガン塩、第一マンガン、カリウム、ナトリウム、亜鉛などが含まれる。特に好ましいものは、アンモニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム及びナトリウム塩である。薬学的に許容される有機非毒性塩基から誘導される塩には、アルギニン、ベタイン、カフェイン、コリン、Ｎ，Ｎ′−ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチル−モルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リシン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、トリプロピルアミン、トロメタミンなどのような、第一級、第二級及び第三級アミン、天然に生じるアミンを含む置換アミン、環状アミン、並びに塩基性イオン交換樹脂の塩が含まれる。
【０１４９】
本発明のＨＢＧＦ類似体が塩基性である場合、酸付加塩は、無機及び有機酸を含む薬学的に許容される非毒性酸から調製することができる。そのような酸には、酢酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、ショウノウスルホン酸、カルボン酸、クエン酸、エテンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、グルコン酸、グルタミン酸、臭化水素酸、塩酸、イセチオン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、マロン酸、粘液酸、硝酸、パモン酸、パントテン酸、リン酸、プロピオン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸、ｐ−トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸などが含まれる。本発明のＨＢＧＦ類似体の酸付加塩は、ＨＢＧＦ類似体に適切な溶媒と、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸、酒石酸、マレイン酸、コハク酸又はメタンスルホン酸のような酸の過剰量で調製される。酢酸塩形態が特に有用である。本発明のＨＢＧＦ類似体が酸性部分を含む場合、適切な薬学的に許容される塩は、ナトリウム若しくはカリウム塩のようなアルカリ金属塩、又はカルシウム若しくはマグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩を含むことができる。
【０１５０】
本発明は、本発明のＨＢＧＦ類似体と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。担体は、液体配合物であることができ、一つの実施態様において、緩衝された等張の水溶液であることができる。薬学的に許容される担体は、本明細書後記で記載される、稀釈剤、担体などのような賦形剤、及び安定剤、防腐剤、可溶化剤、緩衝剤などのような添加剤も含む。
【０１５１】
したがって、本発明のＨＢＧＦ類似体組成物は、本発明のＨＢＧＦ類似体の少なくとも１つを、所望であれば、稀釈剤、担体などのような賦形剤、及び安定剤、防腐剤、可溶化剤、緩衝剤などのような添加剤を含む薬学的に許容される担体の１つ以上と一緒に含む、医薬組成物に配合又は混合することができる。配合賦形剤は、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、ヒドロキシセルロース、アカシア、ＰＥＧ、ＰＥＯ、マンニトール、塩化ナトリウム又はクエン酸ナトリウム、並びにスクロース、デキストロース、ラクトースなど及び前記の組み合わせを含むいくつもの単糖類を含むことができる。注入又は他の液体投与製剤では、少なくとも１つ以上の緩衝構成成分を含む水が好ましく、安定剤、防腐剤及び可溶化剤を用いることもできる。固体投与製剤では、デンプン、糖、脂肪酸などのような、多様な増粘、充填、増量及び担体添加剤のいずれかを用いることができる。局所投与製剤では、多様なクリーム、軟膏、ゲル、ローションなどのいずれかを用いることができる。大部分の医薬製剤では、非活性成分が、重量又は容量に基づいて調合剤の大部分を構成する。医薬製剤では、多様な計量放出、徐放又は徐効製剤及び添加剤のいずれかを用いることができることも考慮され、これによって本発明のＨＢＧＦ類似体の送達を経時的に実施するように、用量を配合することができる。
【０１５２】
実際に使用する場合には、本発明のＨＢＧＦ類似体を、活性成分として、従来の医薬混合技術に従って医薬担体と混合物中で組み合わせることができる。担体は、例えば経口、非経口（静脈内を含む）、尿道、膣内、経鼻、口腔内、舌下などの投与に望ましい調製形態に応じた多様な形態を取ることができる。組成物を経口投与形態に調製するには、例えば懸濁剤、エリキシル剤及び液剤のような経口液体調合剤の場合は、例えば水、グリコール、油、アルコール、風味剤、防腐剤、着色剤などのような、又は例えば粉末剤、硬質及び軟質カプセル剤及び錠剤のような経口固体調合剤の場合は、デンプン、糖、微晶質セルロース、稀釈剤、造粒剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤などのような担体のような、通常の医薬媒質のいずれかを用いることができる。
【０１５３】
注入用に適切な医薬形態には、滅菌水性液剤又は分散剤、及び滅菌注入用液剤又は分散剤のその場での調製用の滅菌粉末剤が含まれる。全ての場合において、形態は滅菌でなければならず、シリンジにより投与できる程度に流体でなければならない。形態は、製造及び保存条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌のような微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール、例えばグリセロール、プロピレングルコール又は液体ポリエチレングルコール、これらの適切な混合物、及び植物油を含有する溶媒又は分散体媒質であることができる。
【０１５４】
ＨＢＧＦ類似体医薬組成物が注入により投与される場合、注入は、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、又は当該技術分野で既知の他の方法であることができる。あるいは本発明のＨＢＧＦ類似体を、当該技術分野で既知のあらゆる方法により、錠剤、カプセル剤、カプレット剤、懸濁剤、粉末剤、凍結乾燥調合剤、坐剤、点眼薬、皮膚パッチ剤、経口可溶性製剤、噴霧剤、エアゾール剤などが含まれるが、これらに限定はされない製剤に配合することができ、緩衝剤、結合剤、賦形剤、安定剤、酸化防止剤及び当該技術で既知の他の作用物質と混合し、配合することができる。一般に、本発明のＨＢＧＦ類似体が細胞の表皮層を越えて導入される、あらゆる投与経路を用いることができる。したがって投与方法には、粘膜を通す投与、口腔内投与、経口投与、経皮投与、吸入投与、経鼻投与、尿道投与、膣内投与などが含まれる。
【０１５５】
一般に、患者に投与される本発明のＨＢＧＦ類似体の実際の量は、投与様式、使用される製剤、及び望ましい反応に応じてかなり広範囲にわたって変わる。前記の方法のいずれかにより又は当該技術分野で既知の他の方法のいずれかにより、望ましい治療効果をもたらすのに十分な量の治療用量が投与される。
【０１５６】
ヘパリン結合増殖因子：線維芽細胞増殖因子ＦＧＦは、間葉、上皮及び神経外胚葉細胞型の正常な増殖及び分化を制御する関連するタンパク質のファミリーを構成する。相同体は、多種多様な種で見出されている。ＦＧＦは、ヘパリンに非常に高い親和性を示し、したがって、ヘパリン結合増殖因子（ＨＢＧＦ）とも称される。本明細書中で使用されるように、用語ＨＢＧＦには、全てのＦＧＦが含まれる。
【０１５７】
２つの主要な型のＦＧＦが知られている。ＦＧＦの第１の型は、最初に脳組織から単離された。これは、３Ｔ３細胞のようなネズミ線維芽細胞に対するその増殖促進活性により同定された。その塩基性のｐＩのため、因子は、塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ又はＨＢＧＦ−２、ヘパリン結合増殖因子−２）と命名され、現在は、一般にＦＧＦ−２と称される。これはＦＧＦファミリーのプロトタイプである。
【０１５８】
同様に脳組織から単離されているＦＧＦの別の型は、酸性ＦＧＦ（ａＦＧＦ、またＨＢＧＦ−１、ヘパリン結合増殖因子−１又はＨＢＧＦ−α、ヘパリン結合増殖因子αとしても知られている）であり、現在、一般にＦＧＦ−１と称される。これは、筋芽細胞に対するその増殖促進活性による同定された。
【０１５９】
同じファミリーに属する他の線維芽細胞増殖因子には、ＦＧＦ−３（又はＨＢＧＦ−３、ヘパリン結合増殖因子３、元はｉｎｔ−２と称される；Fekete, Trends in Neurosci. 23:332 (2000)を参照すること）、ＦＧＦ−４（又ＨＢＧＦ−４、ヘパリン結合増殖因子４、最初は腫瘍遺伝子ｈｓｔの産物として認識される；Sakamoto et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:12368-7を参照すること）、及びＦＧＦ−５（元はＨＢＧＦ−５と称される、Bates et al. Biosynthesis of human fibroblast growth factor 5. Mol. Cell. Biol. 11:1840-1845 (1991); Burgess and Maciag, The heparin-binding (fibroblast) growth factor family of proteins. Ann. Rev. Biochem. 58: 575-606 (1989);及びZhan et al. The human FGF-5 oncogene encodes a novel protein related to fibroblast growth factors. Mol. Cell. Biol. 8:3487-3495 (1988)を参照すること）が含まれる。
【０１６０】
ＦＧＦ−６は、ＨＢＧＦ−６としても知られており、時々、ｈｓｔ−２又は腫瘍遺伝子ｈｓｔ−１関連増殖因子と称される（Iida et al. Human hst-2 (FGF-6) oncogene: cDNA cloning and characterization. Oncogene 7:303-9 (1992);及びMaries et al. Characterization of the HST-related FGF-6 gene, a new member of the fibroblast growth factor gene family. Oncogene 4:335-40 (1989)を参照すること）。
【０１６１】
ＦＧＦ−７又はＫ−ＦＧＦは、ＫＧＦ又はケラチノサイト増殖因子としても知られている（Aaronson et al. Keratinocyte growth factor. A fibroblast growth factor family member with unusual target cell specificity. Annals NY Acad. Sci. 638:62-77 (1991)); Finch et al. Human KGF is FGF-related with properties of a paracrine effector of epithelial cell growth. Science 245:752-5 (1989); Marchese et al. Human keratinocyte growth factor activity on proliferation and differentiation of human keratmocytes: differentiation response distinguishes KGF from EGF family. J. Cellular Physiol. 144: 326-32 (1990)を参照すること）。
【０１６２】
ＦＧＦ−８は、アンドロゲン誘導増殖因子ＡＩＧＦと同一であることが見出されており、十分に研究されてきた（Blunt et al. Overlapping expression and redundant activation of mesenchymal fibroblast growth factor (FGF) receptors by alternatively spliced FGF-8 ligands. J. Biol. Chem. 272:3733-8 (1997); Dubrulle et al. FGF signaling controls somite boundary position and regulates segmentation clock control of spatiotemporal Hox gene activation. Cell 106:219-232 (2001); Gemel et al. Structure and sequence of human FGF8. Genomics 35:253-257 (1996); Tanaka et al. A novel isoform of human fibroblast growth factor 8 is induced by androgens and associated with progression of esophageal carcinoma. Dig. Dis. Sci. 46:1016-21 (2001)を参照すること)。
【０１６３】
ＦＧＦ−９は、元はグリア活性化因子又はＨＢＧＦ−９と呼ばれていた。Miyamoto et al. Molecular cloning of a novel cytokine cDNA encoding the ninth member of the fibroblast growth factor family, which has a unique secretion pattern. Mol. Cell. Biol. 13:4251-9 (1993);及びNaruo et al. Novel secretory heparin-binding factors from human glioma cells (glia-activating factors) involved in glial cell growth. J. Biol. Chem. 268: 2857-64 (1993)を参照すること。
【０１６４】
ＦＧＦ−１０は、ＫＧＦ−２、ケラチノサイト増殖因子２とも称される（Kok et al. Cloning and characterization of a cDNA encoding a novel fibroblast growth factor preferentially expressed in human heart. Biochem. Biophys. Res. Comm. 255:717-721, (1999)を参照すること）。
【０１６５】
幾つかのＦＧＦ関連因子が線維芽細胞増殖因子相同性因子（ＦＨＦ）として記載されており、ＦＧＦ−１１（ＦＨＦ−３）、ＦＧＦ−１２（ＦＨＦ−１）、ＦＧＦ−１３（ＦＨＦ−２、Greene et al. Identification and characterization of a novel member of the fibroblast growth factor family. Eur. J. Neurosci. 10:1911-1925 (1998)を参照すること）及びＦＧＦ−１４（ＦＨＦ−４）とも称される。
【０１６６】
ＦＧＦ−１５は、神経系の発生中で発現し、転写因子Ｅ２Ａ−Ｐｂｘ１により調節される遺伝子として同定された。McWhirter et al. A novel fibroblast growth factor gene expressed in the developing nervous system is a downstream target of the chimeric homeodomain oncoprotein E2A-Pbx1. Development 124:3221-3232 (1997)。
【０１６７】
ＦＧＦ−１６を、２０７アミノ酸のＦＧＦを発現する相同性に基づくポリメラーゼ鎖反応により、ラットの心臓からｃＤＮＡクローンとして単離した。ＦＧＦ−１６はＦＧＦ−９と７３％同一である。Miyake et al. Structure and expression of a novel member, FGF-16, of the fibroblast growth factor family. Biochem. Biophys. Res. Commun. 243:148-152 (1998).
【０１６８】
ＦＧＦ−１７をコードするｃＤＮＡを、ラットの胚から単離し、２１６アミノ酸のタンパク質をコードする。３Ｔ３線維芽細胞で発現すると、マウスＦＧＦ−１７は形質転換している。胚形成の際に、ＦＧＦ−１７は、前脳、中脳−後脳接合部、骨格発生及び動脈発生の特定の部位で発現する。Hoshikawa et al. Structure and expression of a novel fibroblast growth factor, FGF-17, preferentially expressed in the embryonic brain. Biochem. Biophys. Res. Commun. 244:187-191 (1998);及びXu et al. Genomic structure, mapping, activity and expression of fibroblast growth factor 17. Mechanisms of Development 83:165-178 (1999)を参照すること。
【０１６９】
ＦＧＦ−１８をコードするｃＤＮＡを、ラットの胚から単離し、２０７アミノ酸のタンパク質をコードする。ＦＧＦ−１８は、グリコシル化されたタンパク質であり、ＦＧＦ−８及びＦＧＦ−１７に最も類似している。組み換えネズミＦＧＦ−１８の注入は、間葉と上皮の両方由来の組織において、特に肝臓及び小腸において、増殖を誘発することが示された。組み換えラットＦＧＦ−１８は、ＰＣ１２細胞において神経突起成長を誘発する。組み換えネズミＦＧＦ−１８タンパク質は、インビトロでＮＩＨ ３Ｔ３線維芽細胞の増殖をヘパラン硫酸依存的に刺激する。一般的な情報については、Hu et al. FGF-18, a novel member of the fibroblast growth factor family, stimulates hepatic and intestinal proliferation. Mol. Cell. Biol. 18:6063-6074 (1998);及びOhbayashi et al. Structure and expression of the mRNA encoding a novel fibroblast growth factor, FGF-18. J. Biol. Chem. 273:18161-18164 (1998)を参照すること。
【０１７０】
ＦＧＦ−１９は、ＦＧＦファミリーの他のファミリーとかすかに関係している。ＦＧＦ−１９ｍＲＮＡは、胎生軟骨、皮膚及び網膜、並びに成人の胆嚢を含む幾つかの組織で発現する。これは、結腸腺癌細胞株で過剰発現する。ＦＧＦ−１９は、ＦＧＦ−４レセプターに対して高い親和性のあるヘパリン依存性リガンドである。Xie et al. FGF-19, a novel fibroblast growth factor with unique specificity for FGFR4 Cytokine 11:729-735 (1999)を参照すること。
【０１７１】
ＦＧＦ−２０は、正常な脳、特に小脳及び一部の癌細胞株で発現する。ＦＧＦ−２０ｍＲＮＡは、黒質緻密部で優先的に発現する。組み換えＦＧＦ−２０タンパク質は、多様な細胞型でＤＮＡ合成を誘導し、複数のＦＧＦレセプターにより認識される。ＦＧＦ−２０は腫瘍遺伝子のように機能し、３Ｔ３線維芽細胞株で発現すると、形質転換表現型を生じる。これらの形質転換細胞は、ヌードマウスにおいて腫瘍形成性である。Jeffers et al. Identification of a novel human fibroblast growth factor and characterization of its role in oncogenesis. Cancer Res. 61:3131-8 (2001);及びOhmachi et al. FGF-20, a novel neurotrophic factor, preferentially expressed in the substantia nigra pars compacta of rat brain. Biochem. Biophys. Res. Commun. 277:355-60 (2000)を参照すること。
【０１７２】
ＦＧＦ−２１をマウスの胚から単離した。ＦＧＦ−２１ｍＲＮＡは、肝臓で最も豊富にあり、胸腺ではレベルが低い。ＦＧＦ−２１は、ヒトＦＧＦ−１９に最も類似している。Nishimura et al. Identification of a novel FGF, FGF-21, preferentially expressed in the liver. Biochim. Biophys. Acta 1492:203-6 (2000)を参照すること。
【０１７３】
ＦＧＦ−２２（１７０アミノ酸）をコードするｃＤＮＡを、ヒトの胎盤から単離した。ＦＧＦ−２２は、ＦＧＦ−１０及びＦＧＦ−７に最も類似している。ネズミＦＧＦ−２２ｍＲＮＡは、皮膚に優先的に発現する。皮膚におけるＦＧＦ−２２ｍＲＮＡは、毛嚢の内毛根鞘で優先的に見出される。Nakatake et al. Identification of a novel fibroblast growth factor, FGF-22, preferentially expressed in the inner root sheath of the hair follicle. Biochim. Biophys. Acta 1517:460-3 (2001)を参照すること。
【０１７４】
ＦＧＦ−２３は、ＦＧＦ−２１及びＦＧＦ−１９に最も類似している。ヒトＦＧＦ−２３遺伝子は、ヒトＦＧＦ−６遺伝子に結合する染色体１２ｐ１３に位置する。ＦＧＦ−２３ｍＲＮＡは、主に脳に（視床腹外側核に優先的に）発現し、胸腺に低レベルで発現する。ＦＧＦ−２３遺伝子のミスセンス突然変異は、常染色体優性低リン酸血症性くる病の患者で見出された。ＦＧＦ−２３の過剰産生は、腎臓リン酸の消耗により引き起こされる低リン酸血症により特徴づけられる腫瘍随伴性疾患である、腫瘍誘発骨軟化症を引き起こす。Yamashita et al. Identification of a novel fibroblast growth factor, FGF-23, preferentially expressed in the ventrolateral thalamic nucleus of the brain. Biochem. Biophys. Res. Commun. 277:494-8 (2000);及びShimada et al. Cloning and characterization of FGF23 as a causative factor of tumor-induced osteomalacia. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 98:6500-5 (2001)を参照すること。
【０１７５】
ＨＢＢＭ（ヘパリン結合脳分裂促進因子）を、最初に、幾つかの種の脳組織からヘパリン結合タンパク質として単離し、それは、ヘパリン結合神経突起促進因子と同一である。Huber et al. Amino-terminal sequences of a novel heparin- binding protein with mitogenic activity for endothelial cells from human bovine, rat, and chick brain: high interspecies homology. Neurochem. Res. 15:435-439 (1990)を参照すること。
【０１７６】
ＨＢ−ＧＡＦ（ヘパリン結合増殖関連因子）は、ＨＢＮＦ（ヘパリン結合神経突起促進因子）と同一な神経栄養及び分裂促進因子である。Kuo et al. Characterization of heparin-binding growth-associated factor receptor in NIH 3T3 cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 182:188-194 (1992)を参照すること。
【０１７７】
ＨＢ−ＥＧＦ（ヘパリン結合ＥＧＦ様因子）は、細胞株Ｕ９３７の調整培地で見出され、また、マクロファージ及びヒト血管平滑筋細胞により合成される。ＨＢ−ＥＧＦは、８６アミノ酸のモノマーヘパリン結合Ｏ−グリコシル化タンパク質であり、２０８アミノ酸の前駆体からプロセスされる。ＨＢ−ＥＧＦの幾つかの切断型が記載されている。ＨＢ−ＥＧＦは、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞、ケラチノサイト及び平滑筋細胞にとって強力な分裂促進因子であるが、内皮細胞にとってはそうではない。平滑筋細胞に対する分裂促進活性は、ＥＧＦよりもかなり強力であり、細胞表面ヘパラン硫酸プロテオグリカンとの相互作用を伴うと思われる。ＨＢ−ＥＧＦは創傷液の主要な増殖因子成分であり、創傷治癒に重要な役割を果たすことができる。Abraham et al. Heparin-binding EGF-like growth factor: characterization of rat and mouse cDNA clones, protein domain conservation across species, and transcript expression in tissues. Biochem. Biophys. Res. Commun. 190:125-133 (1993); Higashiyama et al. A heparin-binding growth factor secreted by macrophage like cells that is related to EGF. Science 251:936-9 (1991);及びMarikovsky et al. Appearance of heparin-binding EGF-like growth factor in wound fluid as a response to injury. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 90:3889-93を参照すること。
【０１７８】
ＨＢＮＦ（ヘパリン結合神経突起促進因子）とも称されるＨＢ−ＧＡＭ（ヘパリン結合増殖関連分子）は、幾つかの種の脳組織からヘパリン結合タンパク質として単離された１５．３kDaのタンパク質である。ＨＢ−ＧＡＭは、軟寒天においてＳＷ−１３細胞の増殖を促進する。Courty et al. Mitogenic properties of a new endothelial cell growth factor related to pleiotrophin. Biochem. Biophys. Res. Commun. 180: 145-151 (1991);及びHampton et al. Structural and functional characterization of full-length heparin-binding growth associated molecule. Mol. Biol. Cell. 3:85-93 (1992)。
【０１７９】
ＴＧＦ−ベータ（ＴＧＦ−β）は、ＴＧＦ−αと関係しない、既知のＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４及びＴＧＦ−β５の少なくとも５個のアイソフォームで存在する。これらのアミノ酸配列は、７０〜８０％のオーダーで相同性を示す。ＴＧＦ−β１が一般的な形態であり、ほぼ偏在的に見出されるが、他のアイソフォームは、細胞及び組織のより限定された範囲で発現する。
【０１８０】
ＴＧＦ−ベータは、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーとして知られているタンパク質のファミリーのプロトタイプである。このファミリーには、インヒビン、アクチビンＡ、ＭＩＳ（ミュラー活性化物質）及びＢＭＰ（骨形成タンパク質）が含まれる。Burt, Evolutionary grouping of the transforming growth factor-beta superfamily. Biochem. Biophys. Res. Commun. 184:590- 5 (1992)。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１８１】
実施例１．本発明の化合物を、Ｘが配列ＡＩＳＭＬＹＬＤＥＫＶＶＬ（配列番号１０５）を有するＢＭＰ−２レセプター結合アミノ酸配列であり、ここで配列が、Ｒ2が０原子であり、そしてＲ1がリシンである式ＩのＲ1の三官能性アミノ酸から平行に成長している一般構造式Ｉを用いて、固相ペプチド化学により合成した。得られた合成増殖修飾因子類似体は、以下の特定の構造：
【０１８２】
【化７】
【０１８３】
であり、時々、Ｂ２Ａ２−Ｋ−ＮＳと称される。前記の構造において、「Ａｈｘ」は６−アミノヘキサン酸であり、時々、「６−Ａｈｘ」又は「Ｈｅｘ」とも称される。この単一の文字は、天然にコードされたアミノ酸のための標準的なアミノ酸単一文字略号である。
【０１８４】
実施例２．本発明の化合物を、Ｘが配列ＬＹＦＤＥＳＳＮＶＩＬＫＫ（配列番号１０６）を有するＢＭＰ−２レセプター結合アミノ酸配列であり、ここで配列が、Ｒ2が０原子であり、そしてＲ1がリシンである式ＩのＲ1の三官能性アミノ酸から平行に成長している一般構造式Ｉを用いて、固相ペプチド化学により合成した。得られた合成増殖修飾因子類似体は、以下の特定の構造：
【０１８５】
【化８】
【０１８６】
であり、時々、Ｂ７Ａ１−Ｋ−ＮＳと称される。前記の構造において、「Ａｈｘ」は６−アミノヘキサン酸であり、時々、「６−Ａｈｘ」又は「Ｈｅｘ」とも称される。この単一の文字は、天然にコードされたアミノ酸のための標準的なアミノ酸単一文字略号である。
【０１８７】
実施例３．本発明の化合物を、Ｘが配列ＩＳＭＬＹＬＤＥＮＥＫＶＶＬＫＮＹ（配列番号３０）を有するＢＭＰ−２レセプター結合アミノ酸配列であり、ここで配列が、Ｒ1がリシンである式ＩのＲ1三官能性アミノ酸から平行に成長している一般構造式Ｉを用いて、固相ペプチド化学により合成する。得られた合成増殖修飾因子類似体は、以下の特定の構造：
【０１８８】
【化９】
【０１８９】
である。
【０１９０】
前記の構造において、「Ａｈｘ」は６−アミノヘキサン酸であり、時々、「６−Ａｈｘ」又は「Ｈｅｘ」とも称される。この単一の文字は、天然にコードされたアミノ酸のための標準的なアミノ酸単一文字略号である。
【０１９１】
実施例４．合成ＦＧＦ類似体ＹＲＳＲＫＹＳＳＷＹＶＡＬＫＲＫ（Ｈ−ＹＲＳＲＫＹＳＳＷＹＶＡＬＫＲ）−Ａｈｘ−Ａｈｘ−Ａｈｘ−ＲＫＲＫＬＤＲＩＡＲ−ＮＨ2は、標準固相ペプチド合成法により合成した。化合物ＹＲＳＲＫＹＳＳＷＹＶＡＬＫＲＫ（Ｈ−ＹＲＳＲＫＹＳＳＷＹＶＡＬＫＲ）−Ａｈｘ−Ａｈｘ−Ａｈｘ−ＲＫＲＫＬＤＲＩＡＲ−ＮＨ2において、式ＩのＲ1基は、単一の三官能性アミノ酸残基であり、ここではジアミノアミノ酸、リシン（Ｋ）であった。実施例４のペプチドは、推定分子量の５６８１を有する。
【０１９２】
実施例４のペプチドを、反復サイクルでアミノ基を一時的に保護するためにＦｍｏｃ化学を使用して、置換樹脂で固相合成により段階的に組み立てた。保護基は必要に応じて使用した。鎖の分岐は、単一のリシル残基のαアミノ基及び側鎖アミノ基からの同一の鎖の段階的な成長によって達成された。完成したペプチド鎖を、酸不安定側鎖保護基も除去する酸分解により、Ｃ末端アミドとして樹脂から切断した。実施例４のペプチドを、Ａが水中の０．１％トリフルオロ酢酸であり、Ｂがアセトニトリル中の０．１％トリフルオロ酢酸である、０〜６０％のＢの連続勾配溶離を１mL／分で６０分間実施するＣ18カラムを使用する、逆相ＨＰＬＣにより精製した。実施例４の化合物の一般構造を、下記に示す。
【０１９３】
【化１０】
【０１９４】
実施例５．以下の構造：
T1A1-K-NS
H-PIVYYVGRKPKVEQK(H-PIVYYVGRKPKVEQ)-Ahx-Ahx-Ahx- RKRKLERIAR-NH2
T1A2-K-NS
H-YIWSLDTQYSKVLK(H-YIWSLDTQYSKVL)-AhX-AhX-AhX- RKRKLERIAR-NH2
の２つのペプチドを、実施例４のＴＧＦの類似体として合成した。
【０１９５】
実施例６．ペプチドを、ＰＤＧＦ−ＢＢの候補アゴニストとして合成し、ＰＢＡ２−１Ｃと表した。このペプチドをＲ1位置で単一のリシン（Ｋ）から分岐し、ここで分岐配列ＣＶＲＫＩＥＩＶＲＫＫ（配列番号１０７）のＮ末端残基はシステイン（Ｃ）残基であった。得られた作成物は、２つのＸ領域がＮ末端システインでジスルフィド結合により連結している環状ペプチドであった。
【０１９６】
【化１１】
【０１９７】
ペプチドを、１ml／分の流速（２１４nmで検出）で６０分間実施する０〜６０％のアセトニトリル／水（０．１％トリフルオロ酢酸）の直線勾配を使用する、Ｃ１８カラムのＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。精製したペプチドは、図６で示されているように、ＲＰ−ＨＰＬＣによる分析で単一の均一ピークを生成した。
【０１９８】
表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）分析。実時間生体分子相互作用をBIAcore 2000システム（Biacore Inc., Piscataway, NJ）で分析した。可溶性ＰＤＧＦレセプター、ヒトＰＤＧＦ−Ｒ−α及びＰＤＧＦ−Ｒ−βの組み換えキメラ（R &D Systems, Minneapolis, MN）を、研究等級ＣＭ５チップ（Biacore Inc., Piscataway, NJ）に固定した。ＥＤＣ／ＮＨＳによる活性化に続いて、レセプターを活性化ＣＭ５チップに固定した。動態学データを得るために、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝剤中の検体の異なる濃度を、５０μl／分の流速でセンサーチップの上に注入した。ペプチド結合を共鳴単位（ＲＵ）で測定した。それぞれの検体注入の終了時に（１２０秒）、緩衝剤をセンサーの表面を通過させて、解離相をモニタリングした。ブランクフローセルの基準共鳴を、それぞれの注入用検体についてレセプター含有フローセルから引いて、それぞれの相互作の動態パラメーターを、BIAEVALUATIONソフトウエア（Biacore Inc., Piscataway, NJ）により実験データを１：１相互作用に大域的に当てはめて決定した。会合速度定数及び解離速度定数（それぞれｋa及びｋd）、並びに平衡解離定数（ＫD）を、レセプター及びＰＡＢ２−１について表３で表す。
【０１９９】
【表３】
【０２００】
細胞増殖。細胞増殖に対するＰＢＡ２−１Ｃの効果を、Ｃ２Ｃ１２細胞で決定した。細胞を９６ウエルプレートに１ウエルあたり２０００細胞で播種し、付着させた。培地を、低血清を含有するものに代えて、１０ng/mlのヘパリン、次にＰＢＡ２−１を加えた。３日間のインキュベーションの後、細胞数を、Molecular ProbesからのCyQUANT（登録商標） Cell Proliferation Assay Kit (C-7026)で決定した。図７は、細胞増殖に対するペプチドＰＢＡ２−１の効果を示す。データは、平均±ＳＤで報告されている。
【０２０１】
実施例７．以下の一般構造のペプチドを合成する。
【０２０２】
【化１２】
【０２０３】
望ましい場合には、任意の適切なカルボキシル保護基を、Ｒ1の位置でシステインとジスルフィド結合を形成するのに用いた第２のシステインに対して用いる。合成は、保護基なしで進行できるが、ほとんどの合成方法では、保護基を用いることが望ましい。保護基を合成の後に除去することができるか、あるはその場所に放置することができる。一つの実施態様において、メチル、エチル、ベンジル又は置換ベンジルエステルのようなエステルを、Ｃ末端保護基として用いる。アリルエステル又はｔ−ブチルエステルを含む、他のエステルを用いることができる。
【０２０４】
実施例８．ＳＤＦ−１の模倣、ＳＤ１−１と表されるペプチドを、NovaSyn TGR樹脂（EMD BioSciences, La Jolla, CA）を使用して、標準Ｆｍｏｃプロトコールに従って合成した。アミノヘキサン酸（Ａｈｘ）を含むＦｍｏｃアミノ酸を、Peptides International, Inc. (Lexington, KY)から得た。ＳＤ１−１は、以下の配列：
KPVSLSYRAPARFFESHVAK(KPVSLSYRAPARFFESHVA)HXHXHXRKRKLERIAR-アミド
を有する。
【０２０５】
ＳＤＦ−１を、１ml／分の流速（２１４nmで検出）で６０分間実施する０〜６０％のアセトニトリル／水（０．１％トリフルオロ酢酸）の直線勾配を使用する、Ｃ１８カラムのＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。精製したペプチドは、図１で示されているように、ＲＰ−ＨＰＬＣによる分析で単一の均一ピークを生成した。
【０２０６】
細胞増殖。Ｓｕｐ−Ｔ１細胞を、American Type Culture Collection (Manassas, VA)から得て、培養中で増殖させた。細胞増殖に対するＳＤ１−１の効果をモニタリングするために、Ｓｕｐ−Ｔ１細胞を、９６ウエルプレートに１ウエルあたり１００，０００細胞で播種し、付着させた。培地を、低血清＋ＳＤ１−１を含有するものに代え、細胞を３日間インキュベートし、その後、相対的な細胞数を、市販のキットを使用して決定した。ここで図２を参照すると、グラフの下のデータは、平均±ＳＤで報告されている。市販の組み換えヒトＳＤＦ−１（菱形）を、ＳＤＦ−１（三角）により刺激された増殖と比較する基準及び陽性対照として使用した。
【０２０７】
細胞移動。ＳＤ１−１を、市販の細胞移動アッセイを使用して、Ｃ２Ｃ１２細胞の移動を誘導するその能力について評価した。Ｃ２Ｃ１２細胞を、重合コラーゲンの薄層で被覆されている８μm孔径のポリカーボネート膜を含むトランスウエルインサートに播種した。インサートを、ＳＤ１−１を含む培地を有するウエルの中に入れた。膜を通して移動する細胞を、インサート膜の底部で見出した。これらの細胞を染色し、染色を抽出し、標準マイクロプレート読取機（５６０nm）で検出した。ここで図３を参照すると、ＳＤ１−１ペプチドに反応した細胞移動の結果が、ＳＤＦ−１ペプチド又は対照と比較して示されている。データは、平均±ＳＤで報告されている。
【０２０８】
実施例９．ＰＤＧＦの模倣、ＰＢＡ２−１と表されるペプチドを、NovaSyn TGR樹脂（EMD BioSciences, La Jolla, CA）を使用して、標準Ｆｍｏｃプロトコールに従って合成した。アミノヘキサン酸（Ａｈｘ）を含むＦｍｏｃアミノ酸を、Peptides International, Inc. (Lexington, KY)から得た。ＰＢＡ２−１は、以下の配列：
VRKIEIVRKKK(VRKIEIVRKK)HxHxHxRKRKLERIAR-アミド
を有する。
【０２０９】
ＰＢＡ２−１を、１ml／分の流速（２１４nmで検出）で６０分間実施する０〜６０％のアセトニトリル／水（０．１％トリフルオロ酢酸）の直線勾配を使用する、Ｃ１８カラムのＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。精製したペプチドは、図４で示されているように、ＲＰ−ＨＰＬＣによる分析で単一の均一ピークを生成した。
【０２１０】
表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）分析。実時間生体分子相互作用をBIAcore 2000システム（Biacore Inc., Piscataway, NJ）で分析した。可溶性ＰＤＧＦレセプター、ヒトＰＤＧＦ−Ｒ−α及びＰＤＧＦ−Ｒ−βの組み換えキメラ（R &D Systems, Minneapolis, MN）を、研究等級ＣＭ５チップ（Biacore Inc., Piscataway, NJ）に固定した。ＥＤＣ／ＮＨＳによる活性化に続いて、レセプターを活性化ＣＭ５チップに固定した。動態学データを得るために、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝剤中の検体の異なる濃度を、５０μl／分の流速でセンサーチップの上に注入した。ペプチド結合を共鳴単位（ＲＵ）で測定した。それぞれの検体注入の終了時に（１２０秒）、緩衝剤をセンサーの表面を通過させて、解離相をモニタリングした。ブランクフローセルの基準共鳴を、それぞれの注入用検体についてレセプター含有フローセルから引いて、それぞれの相互作の動態パラメーターを、BIAEVALUATIONソフトウエア（Biacore Inc., Piscataway, NJ）により実験データを１：１相互作用に大域的に当てはめて決定した。会合速度定数及び解離速度定数（それぞれｋa及びｋd）、並びに平衡解離定数（ＫD）を、レセプター及びＰＡＢ２−１について表４で表す。
【０２１１】
【表４】
【０２１２】
細胞増殖。細胞増殖に対するＰＢＡ２−１の効果を、Ｃ２Ｃ１２細胞で決定した。細胞を９６ウエルプレートに１ウエルあたり２０００細胞で播種し、付着させた。培地を、低血清を含有するものに代えて、１０ng/mlのヘパリン、次にＰＢＡ２−１を加えた。３日間のインキュベーションの後、細胞数を、Molecular ProbesからのCyQUANT（登録商標） Cell Proliferation Assay Kit (C-7026)で決定した。図５は、ＰＢＡ２−１ペプチドの濃度範囲にわたる、細胞増殖に対するペプチドＰＢＡ２−１の効果を示す。データは、平均±ＳＤで報告されている。
【０２１３】
前記実施例は、前記実施例で使用された本発明の一般的又は特別に記載されたペプチド配列、反応体及び／又は操作条件を換えて繰り返しても同様の成功を収めることができる。
【０２１４】
実施例１０．ペプチドを、ＢＭＰ−７の配列に基づいて合成した。ペプチドをＢ７Ａ１−６と表し、配列：
AISVLYFDDSSNVILKKK(AISVLYFDDSSNVILKK)HxHxHxRKRKLERIAR-アミド
を有した。
【０２１５】
このペプチドを、Ｃ２Ｃ１２細胞を使用し、組み換えＢＭＰ−７の存在下で、終点としてアルカリホスファターゼ産生を使用して評価した。アルカリホスファターゼアッセイを、マウスの多機能細胞株Ｃ２Ｃ１２を使用して実施した。細胞を９６ウエル（１×１０４／ウエル）プレートで平板培養し、２４時間かけて付着させた。次に培地を、ＢＭＰ−７及び／又はＢ７Ａ１−６を含む低血清培地と代えた。数日後、細胞をすすぎ、溶解し、アルカリフォスファターゼ活性を、ｐ−ニトロフェニルホスフェートを基質として使用して測定した。Ｂ７Ａ１−６は、図８で示されているように、ＢＭＰ−７の活性の用量依存的抑制を有した。
【０２１６】
実施例１１．ペプチドを、Ｇ−ＣＳＦの配列に基づいて合成し、ＧＣＳＦ１と表した。ＧＣＳＦ１は、配列：
SFLLKALEQVRKIQYK(SFLLKALEQVRKIQY)HxHxHxRKRKLERIAR-アミド
を有した。このペプチドを、０．０１ngのｒｈＧＣＳＦの存在下、Ｍ−ＮＳＦ−６０細胞を使用して、増殖の増加を評価した。図９で示されているように、市販のＭＴＸキットを使用してモニタリングすると、ペプチドは細胞増殖を増加した。
【０２１７】
本発明は、好ましい実施態様に対する特定の参照によって詳細に記載されてきたが、他の実施態様でも同じ結果を達成することができる。本発明の変更及び修正は、当業者には明白であり、そのような修正及び等価物は、全て添付の請求項で網羅されていることが意図される。上記で引用された全ての参考文献、出願、特許、及び公報の開示の全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２１８】
本発明は、好ましい実施態様の観点から記載されてきたが、多様な修正及び改善を、本発明の範囲を逸脱することなく、記載された実施態様に対して行うことができることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【０２１９】
【図１】本発明の一つの実施態様のＳＤ１−１類似体のＲＰ−ＨＰＬＣプロフィールを示す。
【図２】本発明の一つの実施態様の細胞増殖のＳＤＦ−１及びＳＤ１−１類似体濃度依存性誘導のグラフを示す。
【図３】本発明の一つの実施態様のＳＤＦ−１及びＳＤ１−１類似体誘導細胞移動のグラフを示す。
【図４】本発明の一つの実施態様のＰＤＧＦ類似体のＲＰ−ＨＰＬＣプロフィールを示す。
【図５】本発明の一つの実施態様のＰＤＧＦ類似体ＰＢＡ２−１を用いる細胞増殖アッセイの結果を示す。
【図６】本発明の一つの実施態様のＰＢＡ２−１Ｃ類似体のＲＰ−ＨＰＬＣによる分析を示す。
【図７】本発明の一つの実施態様の細胞増殖に対する類似体ＰＢＡ２−１の効果を示す。
【図８】本発明の一つの実施態様のＢ７Ａ１−６類似体によるＢ７Ａ１−６の活性の用量依存性抑制を示す。
【図９】本発明の一つの実施態様のＧＣＳＦ−１類似体により増加された細胞増殖を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
〔式中、
Ｘは、それぞれ、（ｉ）最低３個のアミノ酸残基を有し、（ｉｉ）最大約５０個のアミノ酸残基を有し、（ｉｉｉ）ヘパリン結合増殖因子レセプター（ＨＢＧＦＲ）に結合する、ペプチド鎖であり；
Ｒ1は、各Ｘに共有結合している単一の三官能性アミノ酸残基であり；
Ｒ2は、それぞれ独立して、Ｒ1とＸに共有結合している、炭素、酸素、硫黄、窒素及びその混合物を含む０〜約２０個の主鎖原子の鎖を含むリンカーであり；
Ｒ3は、それぞれ、末端基がＮＨ2のように水素（Ｈ）であるか、或いはＮ−末端ＮＨ2、ＮＨ3+若しくはＮＨ基又は対応するアシル化誘導体を含む直鎖又は分岐鎖Ｃ1〜Ｃ17のアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルケン、アルケニル又はアラルキル鎖を有するアシル基であり；
Ｒ4は、末端基がカルボキシルのようにＯＨであるか、ＮＨ2であるか、Ｎ−末端ＮＨ2、ＮＨ3+若しくはＮＨ基又は対応するアシル化誘導体を含む直鎖又は分岐鎖Ｃ1〜Ｃ17のアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルケン、アルケニル又はアラルキル鎖を有するアシル基であるか、又はＮＨ−Ｒ3であり；
Ｙは、Ｒ1とＺに共有結合している０〜約５０個の主鎖原子の鎖を含むリンカーであり；そして
Ｚは、（ｉ）最低１個のヘパリン結合モチーフ、（ｉｉ）最大約１０個のヘパリン結合モチーフ、及び（ｉｉｉ）最大約３０個のアミノ酸を含むアミノ酸配列を含むヘパリン結合ドメインを含む、非シグナル伝達ペプチド鎖である〕
で示される、ヘパリン結合増殖因子類似体。
【請求項２】
Ｘ及びＺが合成ペプチド鎖である、請求項１記載のヘパリン結合増殖因子類似体。
【請求項３】
Ｙが、（ｉ）疎水性であり、（ｉｉ）最低約９個、最大約５０個の原子の鎖を含み、（ｉｉｉ）Ｘが結合するヘパリン結合増殖因子レセプター（ＨＢＧＦＲ）の天然リガンドにおいて見出されないリンカーを更に含む、請求項１記載のヘパリン結合増殖因子類似体。
【請求項４】
ヘパリン結合増殖因子類似体が、合成ヘパリン結合増殖因子類似体が０．１５MのＮａＣｌ中でヘパリンに結合するが、１MのＮａＣｌにより溶離されるようなヘパリン結合活性を有する、請求項１記載のヘパリン結合増殖因子類似体。
【請求項５】
式ＩＩ：
【化２】
（式中、Ｒ1はジアミンアミノ酸である）
で示される、請求項１記載のヘパリン結合増殖因子類似体。
【請求項６】
Ｒ1が、２，３−ジアミノプロピオニルアミノ酸、２，４−ジアミノブチルアミノ酸、リシン及びオルニチンからなる群より選択されるＬ−又はＤ−ジアミンアミノ酸残基である、請求項１記載のヘパリン結合増殖因子類似体。
【請求項７】
式ＩＩＩ：
【化３】
〔式中、
Ｃは炭素であり、Ｈは水素であり、Ｎは窒素であり、そしてＯは酸素である〕
で示される、請求項５記載のヘパリン結合増殖因子類似体。
【請求項８】
作成物が、式ＩＶ：
【化４】
〔式中、
Ｒ1は、Ｒ1の側鎖が反応性スルフヒドリルを含む三官能性アミノ酸であり；そして
Ｒ2は、側鎖が反応性スルフヒドリルを含む三官能性アミノ酸を含み、ここでＲ2はジスルフィド結合によりＲ1に共有結合している〕
で示される、請求項１記載のヘパリン結合増殖因子類似体。
【請求項９】
Ｒ1及びＲ2が、それぞれ独立して、Ｌ−又はＤ−システイン、Ｌ−又はＤ−ペニシラミン、３−メルカプトフェニルアラニン及び前記のいずれかの誘導体からなる群より選択されるＬ−又はＤ−３−メルカプトアミノ酸である、請求項８記載のヘパリン結合増殖因子類似体。
【請求項１０】
式Ｖ：
【化５】
〔式中、
Ｐｒｇ Ｇｒｐは、ＯＨ又はカルボキシ末端保護基であり；そして
Ｃは炭素であり、Ｈは水素であり、Ｎは窒素であり、Ｏは酸素であり、そしてＳは硫黄である〕
で示される、請求項８記載のヘパリン結合増殖因子類似体。
【請求項１１】
作成物が、式ＶＩ：
【化６】
〔式中、
Ｒ1は、側鎖が第１反応性基を含む三官能性アミノ酸であり；そして
Ｒ2は、側鎖が第２反応性基を含む三官能性アミノ酸を含み、ここでＲ2は、第１反応性基と第２反応性基の間の共有結合によりＲ1に共有結合している〕
で示される、請求項１記載のヘパリン結合増殖因子類似体。
【請求項１２】
２個の配列が、同一であり、かつヘパリン結合増殖因子レセプターに特異的に結合し、１個の配列が、単一の残基に共有結合している非増殖因子ヘパリン結合配列を含む、単一の残基から分岐している２個の配列を有する合成ペプチドを含む、ヘパリン結合増殖因子類似体。
【請求項１３】
非増殖因子ヘパリン結合配列がリンカーにより単一の残基に共有結合している、請求項１２記載のヘパリン結合増殖因子類似体。
【請求項１４】
リンカーが、２〜約５０個の主鎖原子を含む、請求項１３記載のヘパリン結合増殖因子類似体。
【請求項１５】
単一の残基が三官能性アミノ酸残基を含む、請求項１２記載のヘパリン結合増殖因子類似体。
【請求項１６】
Ｙが１〜約３３個のエチレングルコール単位を含む、請求項１記載のヘパリン結合増殖因子類似体。
【請求項１７】
Ｙが、１〜約２０個の炭素原子の、分岐鎖又は非分岐鎖、飽和又は不飽和アルキル鎖を含む、請求項１記載のヘパリン結合増殖因子類似体。
【請求項１８】
Ｙが、〔ＮＨ2−（ＣＨ2）pＣＯ〕qを含み、ここで、ｐが１〜約１０であり、そしてｑが１〜約２０である、請求項１記載のヘパリン結合増殖因子類似体。
【請求項１９】
Ｙが、１〜約１６個のＧｌｙ残基を含むペプチド配列を含む、請求項１記載のヘパリン結合増殖因子類似体。
【請求項２０】
Ｚのヘパリン結合モチーフが、ＢｘＢＢ又はＢＢＢｘｘＢであり、ここで、Ｂが、それぞれ独立して、リシン、アルギニン、オルニチン又はヒスチジンであり、そしてｘが、それぞれ独立して、天然に生じるアミノ酸である、請求項１記載のヘパリン結合増殖因子類似体。
【請求項２１】
Ｚが少なくとも２個のヘパリン結合モチーフを含む、請求項１記載のヘパリン結合増殖因子類似体。
【請求項２２】
Ｒ1とＹの間の共有結合が、アミド、ジスルフィド、チオエーテル、シッフ塩基、還元シッフ塩基、イミド、第二級アミン、カルボニル、尿素、ヒドラゾン又はオキシム結合を含む、請求項１記載のヘパリン結合増殖因子類似体。
【請求項２３】
Ｒ1と各Ｘとの間の共有結合が、アミド、ジスルフィド、チオエーテル、シッフ塩基、還元シッフ塩基、イミド、第二級アミン、カルボニル、尿素、ヒドラゾン又はオキシム結合を含む、請求項１記載のヘパリン結合増殖因子類似体。
【請求項２４】
ＹとＺの間の共有結合が、アミド、ジスルフィド、チオエーテル、シッフ塩基、還元シッフ塩基、イミド、第二級アミン、カルボニル、尿素、ヒドラゾン又はオキシム結合を含む、請求項１記載のヘパリン結合増殖因子類似体。
【請求項２５】
Ｘが、配列番号７から配列番号１０７のいずれか、その一部分、その相同体、又はその一部分の相同体であり、そしてＺが、配列番号１から配列番号６のいずれかを含む、請求項１記載のヘパリン結合増殖因子類似体。
【請求項２６】
Ｒ2が、グリシン、直鎖アミノカルボン酸、二官能性アミノ−ＰＥＧ−酸スペーサー及びこれらの組み合わせからなる群より選択される１〜約３個のアミノ酸残基を含む、請求項１記載のヘパリン結合増殖因子類似体。
【請求項２７】
Ｙが、グリシン、直鎖アミノカルボン酸、二官能性アミノ−ＰＥＧ−酸スペーサー及びこれらの組み合わせからなる群より選択される１〜約１０個のアミノ酸残基を含む、請求項１記載のヘパリン結合増殖因子類似体。
【請求項２８】
Ｘが、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１１、ＦＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３、ＦＧＦ−１４、ＦＧＦ−１５、ＦＧＦ−１６、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−１８、ＦＧＦ−１９、ＦＧＦ−２０、ＦＧＦ−２１、ＦＧＦ−２２、ＦＧＦ−２３、ＨＢＢＭ（ヘパリン結合脳分裂促進因子）、ＨＢ−ＧＡＦ（へパリン結合増殖関連因子）、ＨＢ−ＥＧＦ（ヘパリン結合ＥＧＦ様因子）、ＨＢ−ＧＡＭ（プレイオトロフィン、ＰＴＮ、ＨＡＲＰとしても知られている、ヘパリン結合増殖関連分子）、ＴＧＦ−α（形質転換増殖因子α）、ＴＧＦ−β（形質転換増殖因子β）、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）、ＥＧＦ（表皮増殖因子）、ＩＧＦ−１（インスリン様増殖因子１）、ＩＧＦ−２（インスリン様増殖因子２）、ＰＤＧＦ（血小板由来成長因子）、ランテス、ＳＤＦ−１、分泌ちぢれ毛関連タンパク質１（ＳＦＲＰ−１）、小型誘導性サイトカインＡ３（ＳＣＹＡ３）、誘導性サイトカインサブファミリーＡメンバー２０（ＳＣＹＡ２０）、誘導性サイトカインサブファミリーＢメンバー１４（ＳＣＹＢ１４）、誘導性サイトカインサブファミリーＤメンバー１（ＳＣＹＤ１）、ストローマ細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）、トロンボスポンジン１、２、３及び４（ＴＨＢＳ１〜４）、血小板第４因子（ＰＦ４）、水晶体上皮由来増殖因子（ＬＥＤＧＦ）、ミジキン（ＭＫ）、マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１）、モエシン（ＭＳＮ）、肝細胞増殖因子（ＳＦとも称される、ＨＧＦ）、胎盤増殖因子、ＩＬ−１（インターロイキン１）、ＩＬ−２（インターロイキン２）、ＩＬ−３（インターロイキン３）、ＩＬ−６（インターロイキン６）、ＩＬ−７（インターロイキン７）、ＩＬ−１０（インターロイキン１０）、ＩＬ−１２（インターロイキン１２）、ＩＦＮ−α（インターフェロンα）、ＩＦＮ−γ（インターフェロンγ）、ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子α）、ＳＤＧＦ（シュワン細胞腫由来増殖因子）、神経成長因子、神経突起成長促進因子２（ＮＥＧＦ２）、ニューロトロフィン、ＢＭＰ−２（骨形成タンパク質２）、ＯＰ−１（ＢＭＰ−７とも称される、骨形成タンパク質１）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、インターフェロンγ誘導性タンパク質２０、ランテス、及びＨＩＶ−ｔａｔ−トランス活性化因子、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）、血管関連遊走細胞タンパク質（ＡＡＭＰ）、アンギオスタチン、ベータセリン（ＢＴＣ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、高システイン血管新生インデューサー６１（ＣＹＣＲ６１）、エンドスタチン、フラクタルカイン／ニューロアクチン、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ＧＲＯ２、肝細胞癌由来増殖因子（ＨＤＧＦ）、及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）のうちのいずれかで見出されるアミノ酸配列、又は前記のいずれかで見出されるアミノ酸配列の相同体を含む、請求項１記載のヘパリン結合増殖因子類似体。
【請求項２９】
請求項１、５、７、８，１０若しくは１１のいずれか１項記載のヘパリン結合増殖因子類似体又は薬学的に許容されるその塩と、医薬担体とを含む医薬組成物。
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
〔式中、
Ｘは、それぞれ、（ｉ）最低３個のアミノ酸残基を有し、（ｉｉ）最大約５０個のアミノ酸残基を有し、（ｉｉｉ）ヘパリン結合増殖因子レセプター（ＨＢＧＦＲ）に結合する、ペプチド鎖であり；
Ｒ1は、各Ｘに共有結合している単一の三官能性アミノ酸残基であり；
Ｒ2は、それぞれ独立して、Ｒ1とＸに共有結合している、炭素、酸素、硫黄、窒素及びその混合物を含む０〜約２０個の主鎖原子の鎖を含むリンカーであり；
Ｒ3は、それぞれ、末端基がＮＨ2のように水素（Ｈ）であるか、或いはＮ−末端ＮＨ2、ＮＨ3+若しくはＮＨ基又は対応するアシル化誘導体を含む直鎖又は分岐鎖Ｃ1〜Ｃ17のアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルケン、アルケニル又はアラルキル鎖を有するアシル基であり；
Ｒ4は、末端基がカルボキシルのようにＯＨであるか、ＮＨ2であるか、Ｎ−末端ＮＨ2、ＮＨ3+若しくはＮＨ基又は対応するアシル化誘導体を含む直鎖又は分岐鎖Ｃ1〜Ｃ17のアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルケン、アルケニル又はアラルキル鎖を有するアシル基であるか、又はＮＨ−Ｒ3であり；
Ｙは、Ｒ1とＺに共有結合している０〜約５０個の主鎖原子の鎖を含むリンカーであり；そして
Ｚは、（ｉ）最低１個のヘパリン結合モチーフ、（ｉｉ）最大約１０個のヘパリン結合モチーフ、及び（ｉｉｉ）最大約３０個のアミノ酸を含むアミノ酸配列を含むヘパリン結合ドメインを含む、非シグナル伝達ペプチド鎖である〕
で示される、ヘパリン結合増殖因子類似体。
【請求項２】
Ｘ及びＺが合成ペプチド鎖である、請求項１記載のヘパリン結合増殖因子類似体。
【請求項３】
Ｙが、（ｉ）疎水性であり、（ｉｉ）最低約９個、最大約５０個の原子の鎖を含み、（ｉｉｉ）Ｘが結合するヘパリン結合増殖因子レセプター（ＨＢＧＦＲ）の天然リガンドにおいて見出されないリンカーを更に含む、請求項１記載のヘパリン結合増殖因子類似体。
【請求項４】
ヘパリン結合増殖因子類似体が、合成ヘパリン結合増殖因子類似体が０．１５MのＮａＣｌ中でヘパリンに結合するが、１MのＮａＣｌにより溶離されるようなヘパリン結合活性を有する、請求項１記載のヘパリン結合増殖因子類似体。
【請求項５】
式ＩＩ：
【化２】
（式中、Ｒ1はジアミンアミノ酸である）
で示される、請求項１記載のヘパリン結合増殖因子類似体。
【請求項６】
Ｒ1が、２，３−ジアミノプロピオニルアミノ酸、２，４−ジアミノブチルアミノ酸、リシン及びオルニチンからなる群より選択されるＬ−又はＤ−ジアミンアミノ酸残基である、請求項１記載のヘパリン結合増殖因子類似体。
【請求項７】
式ＩＩＩ：
【化３】
〔式中、
Ｃは炭素であり、Ｈは水素であり、Ｎは窒素であり、そしてＯは酸素である〕
で示される、請求項５記載のヘパリン結合増殖因子類似体。
【請求項８】
作成物が、式ＩＶ：
【化４】
〔式中、
Ｒ1は、Ｒ1の側鎖が反応性スルフヒドリルを含む三官能性アミノ酸であり；そして
Ｒ2は、側鎖が反応性スルフヒドリルを含む三官能性アミノ酸を含み、ここでＲ2はジスルフィド結合によりＲ1に共有結合している〕
で示される、請求項１記載のヘパリン結合増殖因子類似体。
【請求項９】
Ｒ1及びＲ2が、それぞれ独立して、Ｌ−又はＤ−システイン、Ｌ−又はＤ−ペニシラミン、３−メルカプトフェニルアラニン及び前記のいずれかの誘導体からなる群より選択されるＬ−又はＤ−３−メルカプトアミノ酸である、請求項８記載のヘパリン結合増殖因子類似体。
【請求項１０】
式Ｖ：
【化５】
〔式中、
Ｐｒｇ Ｇｒｐは、ＯＨ又はカルボキシ末端保護基であり；そして
Ｃは炭素であり、Ｈは水素であり、Ｎは窒素であり、Ｏは酸素であり、そしてＳは硫黄である〕
で示される、請求項８記載のヘパリン結合増殖因子類似体。
【請求項１１】
作成物が、式ＶＩ：
【化６】
〔式中、
Ｒ1は、側鎖が第１反応性基を含む三官能性アミノ酸であり；そして
Ｒ2は、側鎖が第２反応性基を含む三官能性アミノ酸を含み、ここでＲ2は、第１反応性基と第２反応性基の間の共有結合によりＲ1に共有結合している〕
で示される、請求項１記載のヘパリン結合増殖因子類似体。
【請求項１２】
２個の配列が、同一であり、かつヘパリン結合増殖因子レセプターに特異的に結合し、１個の配列が、単一の残基に共有結合している非増殖因子ヘパリン結合配列を含む、単一の残基から分岐している２個の配列を有する合成ペプチドを含む、ヘパリン結合増殖因子類似体。
【請求項１３】
非増殖因子ヘパリン結合配列がリンカーにより単一の残基に共有結合している、請求項１２記載のヘパリン結合増殖因子類似体。
【請求項１４】
リンカーが、２〜約５０個の主鎖原子を含む、請求項１３記載のヘパリン結合増殖因子類似体。
【請求項１５】
単一の残基が三官能性アミノ酸残基を含む、請求項１２記載のヘパリン結合増殖因子類似体。
【請求項１６】
Ｙが１〜約３３個のエチレングルコール単位を含む、請求項１記載のヘパリン結合増殖因子類似体。
【請求項１７】
Ｙが、１〜約２０個の炭素原子の、分岐鎖又は非分岐鎖、飽和又は不飽和アルキル鎖を含む、請求項１記載のヘパリン結合増殖因子類似体。
【請求項１８】
Ｙが、〔ＮＨ2−（ＣＨ2）pＣＯ〕qを含み、ここで、ｐが１〜約１０であり、そしてｑが１〜約２０である、請求項１記載のヘパリン結合増殖因子類似体。
【請求項１９】
Ｙが、１〜約１６個のＧｌｙ残基を含むペプチド配列を含む、請求項１記載のヘパリン結合増殖因子類似体。
【請求項２０】
Ｚのヘパリン結合モチーフが、ＢｘＢＢ又はＢＢＢｘｘＢであり、ここで、Ｂが、それぞれ独立して、リシン、アルギニン、オルニチン又はヒスチジンであり、そしてｘが、それぞれ独立して、天然に生じるアミノ酸である、請求項１記載のヘパリン結合増殖因子類似体。
【請求項２１】
Ｚが少なくとも２個のヘパリン結合モチーフを含む、請求項１記載のヘパリン結合増殖因子類似体。
【請求項２２】
Ｒ1とＹの間の共有結合が、アミド、ジスルフィド、チオエーテル、シッフ塩基、還元シッフ塩基、イミド、第二級アミン、カルボニル、尿素、ヒドラゾン又はオキシム結合を含む、請求項１記載のヘパリン結合増殖因子類似体。
【請求項２３】
Ｒ1と各Ｘとの間の共有結合が、アミド、ジスルフィド、チオエーテル、シッフ塩基、還元シッフ塩基、イミド、第二級アミン、カルボニル、尿素、ヒドラゾン又はオキシム結合を含む、請求項１記載のヘパリン結合増殖因子類似体。
【請求項２４】
ＹとＺの間の共有結合が、アミド、ジスルフィド、チオエーテル、シッフ塩基、還元シッフ塩基、イミド、第二級アミン、カルボニル、尿素、ヒドラゾン又はオキシム結合を含む、請求項１記載のヘパリン結合増殖因子類似体。
【請求項２５】
Ｘが、配列番号７から配列番号１０７のいずれか、その一部分、その相同体、又はその一部分の相同体であり、そしてＺが、配列番号１から配列番号６のいずれかを含む、請求項１記載のヘパリン結合増殖因子類似体。
【請求項２６】
Ｒ2が、グリシン、直鎖アミノカルボン酸、二官能性アミノ−ＰＥＧ−酸スペーサー及びこれらの組み合わせからなる群より選択される１〜約３個のアミノ酸残基を含む、請求項１記載のヘパリン結合増殖因子類似体。
【請求項２７】
Ｙが、グリシン、直鎖アミノカルボン酸、二官能性アミノ−ＰＥＧ−酸スペーサー及びこれらの組み合わせからなる群より選択される１〜約１０個のアミノ酸残基を含む、請求項１記載のヘパリン結合増殖因子類似体。
【請求項２８】
Ｘが、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１１、ＦＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３、ＦＧＦ−１４、ＦＧＦ−１５、ＦＧＦ−１６、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−１８、ＦＧＦ−１９、ＦＧＦ−２０、ＦＧＦ−２１、ＦＧＦ−２２、ＦＧＦ−２３、ＨＢＢＭ（ヘパリン結合脳分裂促進因子）、ＨＢ−ＧＡＦ（へパリン結合増殖関連因子）、ＨＢ−ＥＧＦ（ヘパリン結合ＥＧＦ様因子）、ＨＢ−ＧＡＭ（プレイオトロフィン、ＰＴＮ、ＨＡＲＰとしても知られている、ヘパリン結合増殖関連分子）、ＴＧＦ−α（形質転換増殖因子α）、ＴＧＦ−β（形質転換増殖因子β）、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）、ＥＧＦ（表皮増殖因子）、ＩＧＦ−１（インスリン様増殖因子１）、ＩＧＦ−２（インスリン様増殖因子２）、ＰＤＧＦ（血小板由来成長因子）、ランテス、ＳＤＦ−１、分泌ちぢれ毛関連タンパク質１（ＳＦＲＰ−１）、小型誘導性サイトカインＡ３（ＳＣＹＡ３）、誘導性サイトカインサブファミリーＡメンバー２０（ＳＣＹＡ２０）、誘導性サイトカインサブファミリーＢメンバー１４（ＳＣＹＢ１４）、誘導性サイトカインサブファミリーＤメンバー１（ＳＣＹＤ１）、ストローマ細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）、トロンボスポンジン１、２、３及び４（ＴＨＢＳ１〜４）、血小板第４因子（ＰＦ４）、水晶体上皮由来増殖因子（ＬＥＤＧＦ）、ミジキン（ＭＫ）、マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１）、モエシン（ＭＳＮ）、肝細胞増殖因子（ＳＦとも称される、ＨＧＦ）、胎盤増殖因子、ＩＬ−１（インターロイキン１）、ＩＬ−２（インターロイキン２）、ＩＬ−３（インターロイキン３）、ＩＬ−６（インターロイキン６）、ＩＬ−７（インターロイキン７）、ＩＬ−１０（インターロイキン１０）、ＩＬ−１２（インターロイキン１２）、ＩＦＮ−α（インターフェロンα）、ＩＦＮ−γ（インターフェロンγ）、ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子α）、ＳＤＧＦ（シュワン細胞腫由来増殖因子）、神経成長因子、神経突起成長促進因子２（ＮＥＧＦ２）、ニューロトロフィン、ＢＭＰ−２（骨形成タンパク質２）、ＯＰ−１（ＢＭＰ−７とも称される、骨形成タンパク質１）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、インターフェロンγ誘導性タンパク質２０、ランテス、及びＨＩＶ−ｔａｔ−トランス活性化因子、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）、血管関連遊走細胞タンパク質（ＡＡＭＰ）、アンギオスタチン、ベータセリン（ＢＴＣ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、高システイン血管新生インデューサー６１（ＣＹＣＲ６１）、エンドスタチン、フラクタルカイン／ニューロアクチン、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ＧＲＯ２、肝細胞癌由来増殖因子（ＨＤＧＦ）、及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）のうちのいずれかで見出されるアミノ酸配列、又は前記のいずれかで見出されるアミノ酸配列の相同体を含む、請求項１記載のヘパリン結合増殖因子類似体。
【請求項２９】
請求項１、５、７、８，１０若しくは１１のいずれか１項記載のヘパリン結合増殖因子類似体又は薬学的に許容されるその塩と、医薬担体とを含む医薬組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２００８−５３１５０５（Ｐ２００８−５３１５０５Ａ）
【公表日】平成２０年８月１４日（２００８．８．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５５６４２７（Ｐ２００７−５５６４２７）
【出願日】平成１８年２月２２日（２００６．２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００６３９７
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０９１７２７
【国際公開日】平成１８年８月３１日（２００６．８．３１）
【出願人】（５０３０４４７０９）バイオサーフェス エンジニアリング テクノロジーズ，インク． (5)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年８月１４日（２００８．８．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年２月２２日（２００６．２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００６３９７
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０９１７２７
【国際公開日】平成１８年８月３１日（２００６．８．３１）
【出願人】（５０３０４４７０９）バイオサーフェス エンジニアリング テクノロジーズ，インク． (5)
【Ｆターム（参考）】
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