変形運動計測装置及び変形運動計測方法
【課題】 ナノオーダーでの生物現象を高時間分解能で計測する。
【解決手段】 反射型電子顕微鏡４は、バイオセル１２の表面に入射線１５を照射し、その反射散乱線２１の二次元強度分布である連続画像を撮影する。透過型電子顕微鏡５は、反射型電子顕微鏡５による撮影終了後に、静止したバイオセル１２の表面１２ａの三次元形状と、静止した生体試料１１の三次元形状を撮影する。解析装置は、反射型電子顕微鏡４及び透過型電子顕微鏡５の撮影した画像に基づいて、反射型電子顕微鏡４の撮影開始時刻から撮影終了時刻までの生体試料１１の変形及び運動を計算する。
【解決手段】 反射型電子顕微鏡４は、バイオセル１２の表面に入射線１５を照射し、その反射散乱線２１の二次元強度分布である連続画像を撮影する。透過型電子顕微鏡５は、反射型電子顕微鏡５による撮影終了後に、静止したバイオセル１２の表面１２ａの三次元形状と、静止した生体試料１１の三次元形状を撮影する。解析装置は、反射型電子顕微鏡４及び透過型電子顕微鏡５の撮影した画像に基づいて、反射型電子顕微鏡４の撮影開始時刻から撮影終了時刻までの生体試料１１の変形及び運動を計算する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変形運動計測装置及び変形運動計測方法に関する。特に、本発明は、ナノオーダーでの生体試料の変形及び運動の計測に適した装置及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明者は、１００万枚／秒での高速撮影を実現可能な高速ビデオカメラを既に提案している（特許文献１参照）。一方、現在の顕微鏡下での微小な生体試料の撮影速度は３０〜６０枚／秒程度が一般的である。しかし、このような低速の撮影速度では変形や運動を到底計測できないナノオーダーでの現象がある。この種の現象としては、蛋白質の細胞内での急激な構造変化、イオンチャンネルのイオン放出時の瞬間的開閉機構、レーザ穿孔、バイオ分子モータ等がある。
【０００３】
微小試料の高速撮影には、可視光顕微鏡よりも透過型電子顕微鏡（TEM: Transmission Electron Scope）や反射型電子顕微鏡（SEM）のような電子顕微鏡が適している。しかし、透過型電子顕微鏡は生きたまま微生物や生体内部の動きを観察することは困難である。その理由は２つある。第１に透過型電子顕微鏡の内部は高真空であるが、生体は真空中では死滅するので容器中で生かしておく必要がある。第２に、透過型電子顕微鏡の内部において仮に厚さの薄い溶液中で生体を生かしておくことができたとしても、必要な透過電子像が得られるような大量の電子を浴びれば、生体は直ちに死滅する。一方、反射型電子顕微鏡では、微生物や生体の表面の状態は観察できても内部は観察できない。
【０００４】
【特許文献１】特開２００１−３４５４４１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ナノオーダーでの生物現象を含む微小試料の変形や運動を高時間分解能で計測することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書において、「容器」という語は、その内部に被観察物を保持することができ、かつ被観察物の変形及び運動によりその表面の形状が変化するものをいう。特に、容器という語は、被観察物である生体試料をその内部に保持するための電子顕微鏡用試料セルであるバイオセルを含む。
【０００７】
また、本明細書において、「計測線」という語は、容器や被観察物の計測に使用される粒子又はエネルギの流れをいい、電子、イオン、及び正孔のような荷電粒子の流れ、紫外線、可視光線、及び赤外線等の光を含む電磁波、並びにＸ線に加えα線、γ線、β線、及び中性子線を含む放射線を包含する。
【０００８】
本発明の第１の態様は、容器内に保持された被観察物の変形及び運動を計測するための計測装置であって、前記被観察物は第１の時間から第２の時間の間変形及び運動を行い、かつ前記被観察物の変形及び運動が前記容器の表面を変形させるものにおいて、前記容器の表面に計測線を照射する照射部と、前記容器の表面で反射及び散乱された計測線の二次元強度分布を検出する検出部とを有し、前記第１の時刻から前記第２の時刻までの時間間隔を隔てた個々の撮影時刻における前記二次元強度分布である連続画像を撮影する第１の撮影部と、前記容器に計測線を照射する照射部と、前記容器及び被観察物を透過した計測線を検出する検出部とを有し、前記第２の時刻に静止した前記容器の表面の三次元形状である容器表面静止画像と、前記第２の時刻に静止した前記被観察物の三次元形状である被観察物静止画像とを撮影する第２の撮影部と、前記連続画像、前記容器表面静止画像、及び前記被観察物静止画像に基づいて、前記第１の時刻から前記第２の時刻までの個々の前記撮影時刻における前記被観察物の変形及び運動を算出する解析部とを備えることを特徴とする変形運動計測装置を提供する。
【０００９】
具体的には、前記解析部は、前記撮影時刻の一つにおける前記被観察物の変形及び運動を、その撮影時刻の直前の撮影時刻における前記被観察物の変形及び運動に基づいて仮定し、この仮定した前記被観察物の変形及び運動に基づいて算出した前記第反射及び散乱された計測線の二次元強度分布が、前記第１の撮影部で実際に撮影された前記撮影時刻の二次元強度分布と適合すれば、前記仮定した前記被観察物の変形及び運動を前記撮影時刻の被観察物の変形及び運動として決定する。
【００１０】
被観察物が変形及び運動を継続している第１の時刻から第２の時刻の間は、第１の撮影部からの計測線は容器の表面によって反射及び散乱されるだけで、容器及び被観察物を透過しない。第２の時刻に被観察物が変形及び運動を停止して静止した後に、第２の撮影部の計測線が容器及び被観察物を透過する。例えば、容器がバイオセルで被観察物が生体試料である場合、生体試料が変形及び運動を継続している間は、計測線はバイオセル及び生体試料を透過しない。従って、計測線として電子線を採用し、バイオセル内の生体試料を死滅させることなく、高時間分解能での生体試料の変形及び運動の計測が可能である。詳細には、第１の撮影部として１００万枚／秒程度の撮影速度を有する反射型電子顕微鏡を採用し、第２の撮影部として透過型電子顕微鏡を採用して３次元電子線トモグラフィにより詳細な３次元形状を得ることで１００万枚／秒程度の高時間分解能を実現することができる。
【００１１】
本発明の第２の態様は、容器内に保持された被観察物の変形及び運動を計測するための計測方法であって、前記被観察物は第１の時間から第２の時間の間変形及び運動を行い、かつ前記被観察物の変形及び運動が前記容器の表面を変形させるものにおいて、前記第１の時間から前記第２の時間の間、時間間隔を隔てた個々の撮影時刻毎に、前記容器の表面に計測線を照射して前記容器の表面で反射及び散乱された計測線の二次元強度分布を撮影し、前記第２の時刻以降に前記容器に計測線を照射し、前記容器及び前記被観察物を透過した計測線により、前記第２の時刻に静止した前記容器の表面の三次元形状である容器表面静止画像と、前記第２の時刻に静止した前記被観察物の三次元形状である被観察物静止画像とを取得し、前記連続画像、前記容器表面静止画像、及び前記被観察物静止画像に基づいて、前記第１の時刻から前記第２の時刻までの個々の前記撮影時刻における前記被観察物の変形及び運動を算出することを特徴とする、変形運動計測方法を提供する。
【００１２】
具体的には、前記撮影時刻の一つにおける前記被観察物の三次元形状及び運動を、その撮影時刻の直前の撮影時刻における前記被観察物の変形及び運動に基づいて仮定し、前記仮定した前記被観察物の形状及び運動に基づいて前記計測線の反射及び散乱の二次元強度分布を算出し、前記仮定した前記被観察物の形状及び運動に基づいて算出した二次元強度分布と、前記第１の撮影部で実際に撮影された前記撮影時刻の二次元強度分布と比較し、前記仮定した前記被観察物の三次元形状及び運動に基づいて算出した二次元強度分布が、前記第１の撮影部で実際に撮影された前記撮影時刻の二次元強度分布と適合すれば、前記仮定した前記被観察物の形状及び運動を前記撮影時刻の被観察物の形状及び運動に決定する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の装置及び方法によれば、被観察物が変形及び運動を継続している間は容器及び被観察物に計測線を透過させることなく、被観察物の変形及び運動を計測することできる。従って、容器がバイオセルで被観察物が生体試料である場合であっても、バイオセル内の生体試料を死滅せることなく、高時間分解能での生体試料の変形及び運動の計測が可能であり、蛋白質の細胞内での急激な構造変化、イオンチャンネルのイオン放出時の瞬間的開閉機構、レーザ穿孔、バイオ分子モータ等のようなナノオーダーの現象の計測を実現できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
次に、添付図面を参照して本発明の実施形態を詳細に説明する。
【００１５】
図１を参照すると、本発明の実施形態に係る変形運動計測装置（以下、単に「計測装置」という。）１は、撮影装置２と解析装置３を備える。
【００１６】
撮影装置２は、反射型電子顕微鏡（第１の撮影部）４と透過型電子顕微鏡（透過型電子顕微鏡）５とを組み合わせたもので、共通のチャンバ６を有する。このチャンバ６は正面視で十字状を呈し、その中央には試料８を保持する試料台９が配設されている。試料台９の姿勢は、符号１０で概略的に示す駆動装置により調整することができる。
【００１７】
図２を併せて参照すると、試料８は被観察物である生体試料１１をバイオセル１２内に保持したものである。生体試料１１は変形及び運動を行うものであればよい。生体試料１１には、例えば蛋白質、細胞膜のチャンネル、バイオ分子モータ等がある。バイオセル１２の表面１２ａは、反射型電子顕微鏡４からの入射線１５を反射及び散乱させるが、透過はさせない。また、バイオセル１２の表面１２ａは、生体試料１１の変形及び運動を追従して変形する。なお、生体試料１１の３次元の運動をすべて考慮する場合、図２において破線の矢印で概念的に示すように、生体試料１１の運動の自由度は６度である。
【００１８】
チャンバ６の図において左向きに延びる部分６ａには、反射型電子顕微鏡４の電子銃１６、絞り１７、及び電磁レンズ１８が配設されている。電子銃１６からの入射線１５は、絞り１７及び電磁レンズ１８を介して試料８に向けて照射される。
【００１９】
また、チャンバ６の図において右向きに延びる部分６ｂには、反射型電子顕微鏡４のセンサ１９と電磁レンズ２０が配設されている。センサ１９は、例えばＣＣＤ型撮像素子等のような電子の二次元強度分布を検出ないしは撮影でき、かつ１００万枚／秒程度の撮影速度を有するものである。試料８で反射及び散乱された電子線（反射散乱線２１）は、電磁レンズ２０を介してセンサ１９に入射し、反射散乱線２１の二次元強度分布がセンサ１９で検出ないしは撮影される。
【００２０】
図１にのみ概略的に示す反射型電子顕微鏡４のコントローラ２３は、電子銃１６、センサ１９、及び駆動装置１０の動作を制御する。また、コントローラ２３は、センサ１９により検出された反射散乱線２１の二次元強度分布を取得し、解析装置３に送る。コントローラ２３は、電子銃１６に試料８に対して連続的に入射線１５を照射させ、センサ１９には一定の時間間隔Δｔ（図３参照）で連続的に反射散乱線２１を検出ないしは撮影させる。この時間間隔Δｔは生体試料１１の変形及び運動の計測の時間分解能を決定するので、より短いことが好ましい。例えば、センサ１９の撮影速度は１００万枚／秒程度であることが好ましい。
【００２１】
図２を参照すると、反射型電子顕微鏡４の電子銃１６からの入射線１５は並行線である。入射線１５はバイオセル１２の表面１２ａに対して浅い角度で照射され、入射線１５のバイオセル１２の表面１２ａに対する角度θは鋭角である。入射線１５の角度θは、駆動装置１０で試料８の姿勢を変えることで調整することができる。また、入射線１５の二次元強度分布は正規分布である。一方、バイオセル１２の表面１２ａで反射及び散乱された反射散乱線２１の二次元強度分布は、バイオセル１２の表面１２ａの形状と相関を有する。また、前述のようにバイオセル１２の表面１２ａは生体試料１１の変形及び運動に追従して変形する。従って、センサ１９で撮影される個々の撮影時刻における反射散乱線２１の二次元強度分布は、バイオセル１２内の生体試料１１の三次元形状、変形、及び運動と相関を有する。
【００２２】
再度図１を参照すると、チャンバ６の図において上向きに延びる部分６ｃには、透過型電子顕微鏡５の電子銃２５、絞り２６、及び電磁レンズ２５が配設されている。電子銃２５が発する電子線（入射線２８）は、絞り２６及び電磁レンズ２７を介して試料８に向けて照射される。
【００２３】
また、チャンバ６の図において下向きに延びる部分６ｄには、透過型電子顕微鏡５のセンサ２９と磁気レンズ３０が配設されている。センサ２９は、例えばＣＣＤ型撮像素子等からなる。試料８（バイオセル１２及び生体試料１１）を透過した電子線（透過線３１）は、電磁レンズ３０を介してセンサ２９に入射する。
【００２４】
図１にのみ概略的に示す透過型電子顕微鏡５のコントローラ３２は、電子銃２５とセンサ２９の動作を制御する。また、コントローラ３２は、反射型電子顕微鏡４による撮影が時刻ｔ２に終了した後に（生体試料１１が変形及び運動を停止後）に、電子銃２５に試料８に対して入射線２８を照射させ、センサ２９に透過線３１を検出ないしは撮影させる。前述のように反射型電子顕微鏡４が連続的な撮影を行うのに対し、透過型電子顕微鏡５による撮影は単発的に行われる。コントローラ３２は、３次元電子線トモグラフィにより、静止した生体試料１１の三次元形状と静止したバイオセル１２の表面１２ａの形状とを撮影する。コントローラ３２は、これら静止した生体試料１１の三次元形状（被観察物静止画像）と、静止したバイオセル１２の表面１２ａの形状（容器表面静止画像）とを解析装置３に送る。
【００２５】
解析装置３は、画像記憶部４１と処理部４２とを備える。画像記憶部４１には反射型電子顕微鏡４から受信した連続画像（符号４３で概念的に示す。）を記憶する。また、画像記憶部４１は透過型電子顕微鏡５から受信した静止した生体試料１１の三次元形状（符号４４で概念的に示す。）を記憶する。さらに、画像記憶部４１は透過型電子顕微鏡５から受信した静止したバイオセル１２の表面１２ａの形状（符号４５で概念的に示す。）を記憶する。さらにまた、画像記憶部４１は、個々の撮影時刻における生体試料１１の変形及び運動を含む処理部４２の処理結果を記憶する。
【００２６】
処理部４２は、反射型電子顕微鏡４の連続画像、静止した生体試料１１の三次元形状、及び静止したバイオセル１２の表面１２ａの形状に基づいて、反射型電子顕微鏡４の撮影開始（図３の時刻ｔ１）から撮影終了（図３の時刻ｔ２）までの間の個々の撮影時刻（時間間隔Δｔ）における生体試料１１の変形及び運動を計算する。処理部４２には、この計算を実行するための２つのアルゴリズムないしは計算モデルが記憶ないしは格納されている。第１の計算モデル４６は、生体試料１１の形及び運動とそれに対応するバイオセル１２の表面１２ａの形状を関連づけるものである。換言すれば、ある時刻における生体試料１１の変形及び運動が与えられれば、第１の計算モデル４６によってその時刻におけるバイオセル１２の表面１２ａの形状を計算することができる。第２の計算モデル４７は、バイオセル１２の表面１２ａの形状と反射型電子顕微鏡４のセンサ２９で検出される電子像の二次元強度分布を関連づけるものである。換言すれば、ある時刻におけるバイオセル１２の表面１２ａの形状が与えられれば、第２の計算モデル４７によってその時刻におけるセンサ２９で検出される電子像の二次元強度分布を計算することができる。
【００２７】
次に、図４のフローチャートを参照して、計測装置１による生体試料１１の変形及び運動の計測を説明する。
【００２８】
まず、ステップＳ４−１において、反射型電子顕微鏡４による連続撮影を行う。図３を併せて参照すると、撮影開始時刻ｔ１から撮影終了時刻ｔ２までの間、反射型電子顕微鏡４の電子銃１６から試料８に入射線１５を照射し、バイオセル１２の表面１２ａで反射及び散乱された反射散乱線２１を、一定の時間間隔Δｔをあけた撮影時刻毎にセンサ１９により検出ないしは撮影する。撮影終了時刻ｔ２に生体試料１１が死滅し、撮影終了時刻ｔ２以降の生体試料１１は変形及び運動を行わず静止している。また、それに伴って、撮影終了時刻ｔ２以降は、バイオセル１２の表面１２ａが静止している。反射端電子顕微鏡４によって撮影された各撮影時刻毎の反射散乱線２１の二次元強度分布は、解析装置３の画像記憶部４１に記憶される（図１の符号４３参照）。
【００２９】
前述のように反射型電子顕微鏡４の入射線１５は、バイオセル１２の表面１２ａで反射され、生体試料１１及びバイオセル１２を透過しない。従って、ステップＳ４−１の反射型電子顕微鏡４による撮影（撮影開始時刻ｔ１から撮影終了時刻ｔ２）までの間、生体試料１１を死滅させることなく、撮影（反射散乱線２１の電子像の二次元強度分布の撮影）を行うことができる。
【００３０】
次に、ステップＳ４−２において、透過型電子顕微鏡５による撮影を行う。図３に示すように、この透過型電子顕微鏡５による撮影は、反射型電子顕微鏡４の撮影終了時刻ｔ２以降、すなわち生体試料１１及びバイオセル１２の表面１２ａが静止後に実行される。透過型電子顕微鏡５の電子銃２５から試料８に照射された入射線２８は、バイオセル１２及び生体試料１１を透過し、透過線３１がセンサ２９により検出ないしは撮影される。透過型電子顕微鏡５のコントローラ３２は、撮影した透過線３１に基づいて３次元電子線トモグラフィにより、静止した生体試料１１の三次元形状、及び静止したバイオセル１２の表面１２ａの形状を得る。これらの三次元形状は解析装置３の画像記憶部４１に記憶される（図１の符号４４，４５参照）。
【００３１】
ステップＳ４−３〜Ｓ４−１１では、反射端電子顕微鏡４によって撮影された各撮影時刻毎の反射散乱線２１の二次元強度分布、透過型電子顕微鏡５により撮影された静止した静止した生体試料１１の三次元形状、及び透過型電子顕微鏡５により撮影された静止したバイオセル１２の表面１２ａの形状に基づいて、解析装置３の処理部４２が各撮影時刻における生体試料１１の変形及び運動を算出する。
【００３２】
前述のように、反射型電子顕微鏡４の撮影終了時刻ｔ２については、反射散乱線２１の二次元強度分布、生体試料１１の三次元形状、及びバイオセル１２の表面１２ａの形状が測定されている。図３において矢印αで概念的に示すように、解析装置３の処理部４６は、まず撮影終了時刻ｔ２における既知の情報から撮影終了時刻ｔ２の直前の撮影時刻ｔ２−Δｔにおける生体試料１１の変形及び運動を算出する。次に、処理部４６は、算出した撮影時刻ｔ２−Δｔにおける生体試料１１の変形及び運動に基づいて、撮影時刻ｔ２−Δｔの直前の撮影時刻ｔ２−２・Δｔにおける生体試料１１の変形及び運動を算出する。このように処理部４６は、反射型電子顕微鏡４の撮影終了時刻ｔ２から撮影開始時刻ｔ１まで、時間間隔Δｔ毎の撮影時刻を遡りつつ、生体試料１１の変形及び運動を算出する。
【００３３】
ステップＳ４−３では、自然数である変数ｎを初期値である１に設定する。変数ｎの最大値ｎｍａｘは、反射型電子顕微鏡４の撮影開始時刻ｔ１から撮影終了時刻ｔ２までに撮影された連続画像の枚数に対応する。換言すれば、ｔ１＝ｔ２−（ｎｍａｘ−１）・Δｔである。
【００３４】
ステップＳ４−４では、撮影時刻ｔ２−ｎ・Δｔの生体試料１１の変形及び運動を仮定する。この生体試料１１の変形及び運動には、直後の撮影時刻、すなわち撮影時刻ｔ２−（ｎ−１）・Δｔにおける生体試料１１の変形及び運動等が使用される。今、ｎは初期値「１」であるので、反射型電子顕微鏡４で検出された撮影終了時刻ｔ２における反射散乱線２１の二次元強度分布、透過型電子顕微鏡５で検出された撮影終了時刻ｔ２における生体試料１１の三次元形状、及び透過型電子顕微鏡５で検出された撮影終了時刻ｔ２におけるバイオセル１２の表面１２ａの形状に基づいて、撮影終了時刻ｔ２の直前の撮影時刻ｔ２−Δｔにおける生体試料１１の変形及び運動が仮定される。
【００３５】
次に、ステップＳ４−５では、時刻ｔ２−ｎ・Δｔにおけるバイオセル１２の表面１２ａの形状を算出する。このバイオセル１２の表面１２ａの形状の算出は、ステップＳ４−４で仮定した撮影時刻ｔ２−ｎ・Δｔの生体試料１１の変形及び運動に第１の計算モデル（図１の符号４６参照）を適用することでなされる。今、ｎは初期値「１」であるので、仮定した撮影時刻ｔ２−Δｔにおける生体試料１１の変形及び運動に第１の計算モデルを適用することで、バイオセル１２の表面１２ａの形状を算出する。
【００３６】
次に、ステップＳ４−６では、撮影時刻ｔ２−ｎ・Δｔにおける反射散乱光２１の電子像の二次元強度分布を算出する。この二次元強度分布の算出は、ステップＳ４−５で算出した時刻ｔ２−ｎ・Δｔにおけるバイオセル１２の表面１２ａの形状に第２の計算モデル（図１の符号４７参照）を適用することでなされる。今、ｎは初期値「１」であるので、算出した撮影時刻ｔ２−Δｔにおけるバイオセル１２の表面１２ａの形状に第２の計算モデルを適用することで、反射散乱光２１の二次元強度分布を算出する。
【００３７】
次に、ステップＳ４−７において、ステップＳ４−６で算出した撮影時刻ｔ２−ｎ・Δｔにおける反射散乱光２１の電子像の二次元強度分布と、実際に反射型電子顕微鏡４で撮影された撮影時刻ｔ２−ｎ・Δｔにおける反射散乱光２１の電子像の二次元強度分布を比較する。ステップＳ４−８において、両者が適合、すなわち一致しているかその差が予め定められた許容範囲内である場合は、ステップＳ４−４における生体試料１１の変形及び運動の仮定が正しいないしは妥当であるので、仮定した生体試料１１の変形及び運動をその撮影時刻ｔ２−ｎ・Δｔにおける生体試料１１の変形及び運動に決定する。この場合、ステップＳ４−９に移行する。一方、ステップＳ４−８において両者が適合しない場合には、ステップＳ４−４に戻り、撮影時刻ｔ２−ｎ・Δｔの生体試料１１の変形及び運動を仮定を修正し、ステップＳ４−５〜Ｓ４−８の処理を繰り返す。今、ｎは初期値「１」であるので、算出した撮影時刻ｔ２−Δｔにおける反射散乱光２１の電子像の二次元強度分布と、実際に反射型電子顕微鏡４で撮影された撮影時刻ｔ２−Δｔにおける反射散乱光２１の電子像の二次元強度分布を比較する。ステップＳ４−８で両者が適合していればステップＳ４−９に移行し、適合していなければステップＳ４−４に戻り再度撮影時刻ｔ２−Δｔにおける生体試料１１の変形及び運動の仮定を修正する。
【００３８】
ステップＳ４−９では、ステップＳ４−４において仮定した時刻ｔ２−ｎ・Δｔにおける生体試料１１の変形及び運動を、画像記憶部４１に記憶する。続いて、ステップＳ４−１０において変数ｎに「１」を加算する。さらに、ステップＳ４−１１においてｔ１≦ｔ２−ｎ・Δｔでない場合、すなわち撮影開始時刻ｔ１まで生体試料１１の変形及び運動の算出が終了していない場合には、ステップＳ４−４に戻る。
【００３９】
今、変数ｎは初期値「１」であるので、ステップＳ４−９で加算されて「２」となり、ステップＳ４−１１を介してステップＳ４−４に戻る。ステップＳ４−４〜Ｓ４−８で、時刻ｔ２−２・Δｔにおける生体試料１１の変形及び運動の計算が実行される。この際、ステップＳ４−４における生体試料１１の変形及び運動の仮定には、既に算出されている時刻ｔ２−Δｔにおける生体試料１１の変形及び運動が使用される。同様の処理が、ステップＳ４−１１においてｔ１≦ｔ２−ｎ・Δｔが成立するまで繰り返される。
【００４０】
以上の処理により、撮影開始時刻ｔ１から撮影終了時刻ｔ２までの各撮影時刻（時間間隔Δｔ）における生体試料１１の変形及び運動が算出され、画像記憶部４１に記憶される。時間間隔Δｔは反射型電子顕微鏡４の撮影速度で決まり、それに応じた時間分解能で生体試料１１の変形及び運動を計測することができる。例えば、前述のように反射型電子顕微鏡４の撮影速度が１００万枚／秒であれば、この時間分解能での生体試料１１の変形及び運動を計測することができる。
【００４１】
本発明は前記実施形態に限定されず、種々の変形が可能である。例えば、試料は、バイオセル以外の容器に生体試料以外の他の被観察物を封入したものでもよい。ただし、被観察物の変形及び運動に伴って、容器の表面が変形する必要がある。また、試料に照射する計測線は電子線に限定されず、イオン、及び正孔のような電子線以外の荷電粒子の流れ、紫外線、可視光線、及び赤外線等の光を含む電磁波、並びにＸ線に加えα線、γ線、β線、及び中性子線を含む放射線等であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】本発明の実施形態に係る変形運動計測装置を示す概略構成図。
【図２】反射型電子顕微鏡の入射線及び反射散乱線の二次元強度分布と、バイオセル内の生体試料の関係を説明するための概略図。
【図３】反射型電子顕微鏡による連続撮影を説明するための概略的なタイムチャート。
【図４】変形運動計測装置の動作を説明するためのフローチャート。
【符号の説明】
【００４３】
１ 変形運動計測装置
２ 撮影装置
３ 解析装置
４ 反射型電子顕微鏡
５ 透過型電子顕微鏡
６ チャンバ
８ 試料
９ 試料台
１０ 駆動装置
１１ 生体試料
１２ バイオセル
１５ 入射線
１６ 電子銃
１７ 絞り
１８ 電磁レンズ
１９ センサ
２０ 電磁レンズ
２１ 反射散乱線
２３ コントローラ
２５ 電子銃
２６ 絞り
２７ 電磁レンズ
２８ 入射線
２９ センサ
３０ 電磁レンズ
３１ 透過線
３２ コントローラ
４１ 画像記憶部
４２ 処理部
４６ 第１の計算モデル
４７ 第２の計算モデル
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変形運動計測装置及び変形運動計測方法に関する。特に、本発明は、ナノオーダーでの生体試料の変形及び運動の計測に適した装置及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明者は、１００万枚／秒での高速撮影を実現可能な高速ビデオカメラを既に提案している（特許文献１参照）。一方、現在の顕微鏡下での微小な生体試料の撮影速度は３０〜６０枚／秒程度が一般的である。しかし、このような低速の撮影速度では変形や運動を到底計測できないナノオーダーでの現象がある。この種の現象としては、蛋白質の細胞内での急激な構造変化、イオンチャンネルのイオン放出時の瞬間的開閉機構、レーザ穿孔、バイオ分子モータ等がある。
【０００３】
微小試料の高速撮影には、可視光顕微鏡よりも透過型電子顕微鏡（TEM: Transmission Electron Scope）や反射型電子顕微鏡（SEM）のような電子顕微鏡が適している。しかし、透過型電子顕微鏡は生きたまま微生物や生体内部の動きを観察することは困難である。その理由は２つある。第１に透過型電子顕微鏡の内部は高真空であるが、生体は真空中では死滅するので容器中で生かしておく必要がある。第２に、透過型電子顕微鏡の内部において仮に厚さの薄い溶液中で生体を生かしておくことができたとしても、必要な透過電子像が得られるような大量の電子を浴びれば、生体は直ちに死滅する。一方、反射型電子顕微鏡では、微生物や生体の表面の状態は観察できても内部は観察できない。
【０００４】
【特許文献１】特開２００１−３４５４４１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ナノオーダーでの生物現象を含む微小試料の変形や運動を高時間分解能で計測することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書において、「容器」という語は、その内部に被観察物を保持することができ、かつ被観察物の変形及び運動によりその表面の形状が変化するものをいう。特に、容器という語は、被観察物である生体試料をその内部に保持するための電子顕微鏡用試料セルであるバイオセルを含む。
【０００７】
また、本明細書において、「計測線」という語は、容器や被観察物の計測に使用される粒子又はエネルギの流れをいい、電子、イオン、及び正孔のような荷電粒子の流れ、紫外線、可視光線、及び赤外線等の光を含む電磁波、並びにＸ線に加えα線、γ線、β線、及び中性子線を含む放射線を包含する。
【０００８】
本発明の第１の態様は、容器内に保持された被観察物の変形及び運動を計測するための計測装置であって、前記被観察物は第１の時間から第２の時間の間変形及び運動を行い、かつ前記被観察物の変形及び運動が前記容器の表面を変形させるものにおいて、前記容器の表面に計測線を照射する照射部と、前記容器の表面で反射及び散乱された計測線の二次元強度分布を検出する検出部とを有し、前記第１の時刻から前記第２の時刻までの時間間隔を隔てた個々の撮影時刻における前記二次元強度分布である連続画像を撮影する第１の撮影部と、前記容器に計測線を照射する照射部と、前記容器及び被観察物を透過した計測線を検出する検出部とを有し、前記第２の時刻に静止した前記容器の表面の三次元形状である容器表面静止画像と、前記第２の時刻に静止した前記被観察物の三次元形状である被観察物静止画像とを撮影する第２の撮影部と、前記連続画像、前記容器表面静止画像、及び前記被観察物静止画像に基づいて、前記第１の時刻から前記第２の時刻までの個々の前記撮影時刻における前記被観察物の変形及び運動を算出する解析部とを備えることを特徴とする変形運動計測装置を提供する。
【０００９】
具体的には、前記解析部は、前記撮影時刻の一つにおける前記被観察物の変形及び運動を、その撮影時刻の直前の撮影時刻における前記被観察物の変形及び運動に基づいて仮定し、この仮定した前記被観察物の変形及び運動に基づいて算出した前記第反射及び散乱された計測線の二次元強度分布が、前記第１の撮影部で実際に撮影された前記撮影時刻の二次元強度分布と適合すれば、前記仮定した前記被観察物の変形及び運動を前記撮影時刻の被観察物の変形及び運動として決定する。
【００１０】
被観察物が変形及び運動を継続している第１の時刻から第２の時刻の間は、第１の撮影部からの計測線は容器の表面によって反射及び散乱されるだけで、容器及び被観察物を透過しない。第２の時刻に被観察物が変形及び運動を停止して静止した後に、第２の撮影部の計測線が容器及び被観察物を透過する。例えば、容器がバイオセルで被観察物が生体試料である場合、生体試料が変形及び運動を継続している間は、計測線はバイオセル及び生体試料を透過しない。従って、計測線として電子線を採用し、バイオセル内の生体試料を死滅させることなく、高時間分解能での生体試料の変形及び運動の計測が可能である。詳細には、第１の撮影部として１００万枚／秒程度の撮影速度を有する反射型電子顕微鏡を採用し、第２の撮影部として透過型電子顕微鏡を採用して３次元電子線トモグラフィにより詳細な３次元形状を得ることで１００万枚／秒程度の高時間分解能を実現することができる。
【００１１】
本発明の第２の態様は、容器内に保持された被観察物の変形及び運動を計測するための計測方法であって、前記被観察物は第１の時間から第２の時間の間変形及び運動を行い、かつ前記被観察物の変形及び運動が前記容器の表面を変形させるものにおいて、前記第１の時間から前記第２の時間の間、時間間隔を隔てた個々の撮影時刻毎に、前記容器の表面に計測線を照射して前記容器の表面で反射及び散乱された計測線の二次元強度分布を撮影し、前記第２の時刻以降に前記容器に計測線を照射し、前記容器及び前記被観察物を透過した計測線により、前記第２の時刻に静止した前記容器の表面の三次元形状である容器表面静止画像と、前記第２の時刻に静止した前記被観察物の三次元形状である被観察物静止画像とを取得し、前記連続画像、前記容器表面静止画像、及び前記被観察物静止画像に基づいて、前記第１の時刻から前記第２の時刻までの個々の前記撮影時刻における前記被観察物の変形及び運動を算出することを特徴とする、変形運動計測方法を提供する。
【００１２】
具体的には、前記撮影時刻の一つにおける前記被観察物の三次元形状及び運動を、その撮影時刻の直前の撮影時刻における前記被観察物の変形及び運動に基づいて仮定し、前記仮定した前記被観察物の形状及び運動に基づいて前記計測線の反射及び散乱の二次元強度分布を算出し、前記仮定した前記被観察物の形状及び運動に基づいて算出した二次元強度分布と、前記第１の撮影部で実際に撮影された前記撮影時刻の二次元強度分布と比較し、前記仮定した前記被観察物の三次元形状及び運動に基づいて算出した二次元強度分布が、前記第１の撮影部で実際に撮影された前記撮影時刻の二次元強度分布と適合すれば、前記仮定した前記被観察物の形状及び運動を前記撮影時刻の被観察物の形状及び運動に決定する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の装置及び方法によれば、被観察物が変形及び運動を継続している間は容器及び被観察物に計測線を透過させることなく、被観察物の変形及び運動を計測することできる。従って、容器がバイオセルで被観察物が生体試料である場合であっても、バイオセル内の生体試料を死滅せることなく、高時間分解能での生体試料の変形及び運動の計測が可能であり、蛋白質の細胞内での急激な構造変化、イオンチャンネルのイオン放出時の瞬間的開閉機構、レーザ穿孔、バイオ分子モータ等のようなナノオーダーの現象の計測を実現できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
次に、添付図面を参照して本発明の実施形態を詳細に説明する。
【００１５】
図１を参照すると、本発明の実施形態に係る変形運動計測装置（以下、単に「計測装置」という。）１は、撮影装置２と解析装置３を備える。
【００１６】
撮影装置２は、反射型電子顕微鏡（第１の撮影部）４と透過型電子顕微鏡（透過型電子顕微鏡）５とを組み合わせたもので、共通のチャンバ６を有する。このチャンバ６は正面視で十字状を呈し、その中央には試料８を保持する試料台９が配設されている。試料台９の姿勢は、符号１０で概略的に示す駆動装置により調整することができる。
【００１７】
図２を併せて参照すると、試料８は被観察物である生体試料１１をバイオセル１２内に保持したものである。生体試料１１は変形及び運動を行うものであればよい。生体試料１１には、例えば蛋白質、細胞膜のチャンネル、バイオ分子モータ等がある。バイオセル１２の表面１２ａは、反射型電子顕微鏡４からの入射線１５を反射及び散乱させるが、透過はさせない。また、バイオセル１２の表面１２ａは、生体試料１１の変形及び運動を追従して変形する。なお、生体試料１１の３次元の運動をすべて考慮する場合、図２において破線の矢印で概念的に示すように、生体試料１１の運動の自由度は６度である。
【００１８】
チャンバ６の図において左向きに延びる部分６ａには、反射型電子顕微鏡４の電子銃１６、絞り１７、及び電磁レンズ１８が配設されている。電子銃１６からの入射線１５は、絞り１７及び電磁レンズ１８を介して試料８に向けて照射される。
【００１９】
また、チャンバ６の図において右向きに延びる部分６ｂには、反射型電子顕微鏡４のセンサ１９と電磁レンズ２０が配設されている。センサ１９は、例えばＣＣＤ型撮像素子等のような電子の二次元強度分布を検出ないしは撮影でき、かつ１００万枚／秒程度の撮影速度を有するものである。試料８で反射及び散乱された電子線（反射散乱線２１）は、電磁レンズ２０を介してセンサ１９に入射し、反射散乱線２１の二次元強度分布がセンサ１９で検出ないしは撮影される。
【００２０】
図１にのみ概略的に示す反射型電子顕微鏡４のコントローラ２３は、電子銃１６、センサ１９、及び駆動装置１０の動作を制御する。また、コントローラ２３は、センサ１９により検出された反射散乱線２１の二次元強度分布を取得し、解析装置３に送る。コントローラ２３は、電子銃１６に試料８に対して連続的に入射線１５を照射させ、センサ１９には一定の時間間隔Δｔ（図３参照）で連続的に反射散乱線２１を検出ないしは撮影させる。この時間間隔Δｔは生体試料１１の変形及び運動の計測の時間分解能を決定するので、より短いことが好ましい。例えば、センサ１９の撮影速度は１００万枚／秒程度であることが好ましい。
【００２１】
図２を参照すると、反射型電子顕微鏡４の電子銃１６からの入射線１５は並行線である。入射線１５はバイオセル１２の表面１２ａに対して浅い角度で照射され、入射線１５のバイオセル１２の表面１２ａに対する角度θは鋭角である。入射線１５の角度θは、駆動装置１０で試料８の姿勢を変えることで調整することができる。また、入射線１５の二次元強度分布は正規分布である。一方、バイオセル１２の表面１２ａで反射及び散乱された反射散乱線２１の二次元強度分布は、バイオセル１２の表面１２ａの形状と相関を有する。また、前述のようにバイオセル１２の表面１２ａは生体試料１１の変形及び運動に追従して変形する。従って、センサ１９で撮影される個々の撮影時刻における反射散乱線２１の二次元強度分布は、バイオセル１２内の生体試料１１の三次元形状、変形、及び運動と相関を有する。
【００２２】
再度図１を参照すると、チャンバ６の図において上向きに延びる部分６ｃには、透過型電子顕微鏡５の電子銃２５、絞り２６、及び電磁レンズ２５が配設されている。電子銃２５が発する電子線（入射線２８）は、絞り２６及び電磁レンズ２７を介して試料８に向けて照射される。
【００２３】
また、チャンバ６の図において下向きに延びる部分６ｄには、透過型電子顕微鏡５のセンサ２９と磁気レンズ３０が配設されている。センサ２９は、例えばＣＣＤ型撮像素子等からなる。試料８（バイオセル１２及び生体試料１１）を透過した電子線（透過線３１）は、電磁レンズ３０を介してセンサ２９に入射する。
【００２４】
図１にのみ概略的に示す透過型電子顕微鏡５のコントローラ３２は、電子銃２５とセンサ２９の動作を制御する。また、コントローラ３２は、反射型電子顕微鏡４による撮影が時刻ｔ２に終了した後に（生体試料１１が変形及び運動を停止後）に、電子銃２５に試料８に対して入射線２８を照射させ、センサ２９に透過線３１を検出ないしは撮影させる。前述のように反射型電子顕微鏡４が連続的な撮影を行うのに対し、透過型電子顕微鏡５による撮影は単発的に行われる。コントローラ３２は、３次元電子線トモグラフィにより、静止した生体試料１１の三次元形状と静止したバイオセル１２の表面１２ａの形状とを撮影する。コントローラ３２は、これら静止した生体試料１１の三次元形状（被観察物静止画像）と、静止したバイオセル１２の表面１２ａの形状（容器表面静止画像）とを解析装置３に送る。
【００２５】
解析装置３は、画像記憶部４１と処理部４２とを備える。画像記憶部４１には反射型電子顕微鏡４から受信した連続画像（符号４３で概念的に示す。）を記憶する。また、画像記憶部４１は透過型電子顕微鏡５から受信した静止した生体試料１１の三次元形状（符号４４で概念的に示す。）を記憶する。さらに、画像記憶部４１は透過型電子顕微鏡５から受信した静止したバイオセル１２の表面１２ａの形状（符号４５で概念的に示す。）を記憶する。さらにまた、画像記憶部４１は、個々の撮影時刻における生体試料１１の変形及び運動を含む処理部４２の処理結果を記憶する。
【００２６】
処理部４２は、反射型電子顕微鏡４の連続画像、静止した生体試料１１の三次元形状、及び静止したバイオセル１２の表面１２ａの形状に基づいて、反射型電子顕微鏡４の撮影開始（図３の時刻ｔ１）から撮影終了（図３の時刻ｔ２）までの間の個々の撮影時刻（時間間隔Δｔ）における生体試料１１の変形及び運動を計算する。処理部４２には、この計算を実行するための２つのアルゴリズムないしは計算モデルが記憶ないしは格納されている。第１の計算モデル４６は、生体試料１１の形及び運動とそれに対応するバイオセル１２の表面１２ａの形状を関連づけるものである。換言すれば、ある時刻における生体試料１１の変形及び運動が与えられれば、第１の計算モデル４６によってその時刻におけるバイオセル１２の表面１２ａの形状を計算することができる。第２の計算モデル４７は、バイオセル１２の表面１２ａの形状と反射型電子顕微鏡４のセンサ２９で検出される電子像の二次元強度分布を関連づけるものである。換言すれば、ある時刻におけるバイオセル１２の表面１２ａの形状が与えられれば、第２の計算モデル４７によってその時刻におけるセンサ２９で検出される電子像の二次元強度分布を計算することができる。
【００２７】
次に、図４のフローチャートを参照して、計測装置１による生体試料１１の変形及び運動の計測を説明する。
【００２８】
まず、ステップＳ４−１において、反射型電子顕微鏡４による連続撮影を行う。図３を併せて参照すると、撮影開始時刻ｔ１から撮影終了時刻ｔ２までの間、反射型電子顕微鏡４の電子銃１６から試料８に入射線１５を照射し、バイオセル１２の表面１２ａで反射及び散乱された反射散乱線２１を、一定の時間間隔Δｔをあけた撮影時刻毎にセンサ１９により検出ないしは撮影する。撮影終了時刻ｔ２に生体試料１１が死滅し、撮影終了時刻ｔ２以降の生体試料１１は変形及び運動を行わず静止している。また、それに伴って、撮影終了時刻ｔ２以降は、バイオセル１２の表面１２ａが静止している。反射端電子顕微鏡４によって撮影された各撮影時刻毎の反射散乱線２１の二次元強度分布は、解析装置３の画像記憶部４１に記憶される（図１の符号４３参照）。
【００２９】
前述のように反射型電子顕微鏡４の入射線１５は、バイオセル１２の表面１２ａで反射され、生体試料１１及びバイオセル１２を透過しない。従って、ステップＳ４−１の反射型電子顕微鏡４による撮影（撮影開始時刻ｔ１から撮影終了時刻ｔ２）までの間、生体試料１１を死滅させることなく、撮影（反射散乱線２１の電子像の二次元強度分布の撮影）を行うことができる。
【００３０】
次に、ステップＳ４−２において、透過型電子顕微鏡５による撮影を行う。図３に示すように、この透過型電子顕微鏡５による撮影は、反射型電子顕微鏡４の撮影終了時刻ｔ２以降、すなわち生体試料１１及びバイオセル１２の表面１２ａが静止後に実行される。透過型電子顕微鏡５の電子銃２５から試料８に照射された入射線２８は、バイオセル１２及び生体試料１１を透過し、透過線３１がセンサ２９により検出ないしは撮影される。透過型電子顕微鏡５のコントローラ３２は、撮影した透過線３１に基づいて３次元電子線トモグラフィにより、静止した生体試料１１の三次元形状、及び静止したバイオセル１２の表面１２ａの形状を得る。これらの三次元形状は解析装置３の画像記憶部４１に記憶される（図１の符号４４，４５参照）。
【００３１】
ステップＳ４−３〜Ｓ４−１１では、反射端電子顕微鏡４によって撮影された各撮影時刻毎の反射散乱線２１の二次元強度分布、透過型電子顕微鏡５により撮影された静止した静止した生体試料１１の三次元形状、及び透過型電子顕微鏡５により撮影された静止したバイオセル１２の表面１２ａの形状に基づいて、解析装置３の処理部４２が各撮影時刻における生体試料１１の変形及び運動を算出する。
【００３２】
前述のように、反射型電子顕微鏡４の撮影終了時刻ｔ２については、反射散乱線２１の二次元強度分布、生体試料１１の三次元形状、及びバイオセル１２の表面１２ａの形状が測定されている。図３において矢印αで概念的に示すように、解析装置３の処理部４６は、まず撮影終了時刻ｔ２における既知の情報から撮影終了時刻ｔ２の直前の撮影時刻ｔ２−Δｔにおける生体試料１１の変形及び運動を算出する。次に、処理部４６は、算出した撮影時刻ｔ２−Δｔにおける生体試料１１の変形及び運動に基づいて、撮影時刻ｔ２−Δｔの直前の撮影時刻ｔ２−２・Δｔにおける生体試料１１の変形及び運動を算出する。このように処理部４６は、反射型電子顕微鏡４の撮影終了時刻ｔ２から撮影開始時刻ｔ１まで、時間間隔Δｔ毎の撮影時刻を遡りつつ、生体試料１１の変形及び運動を算出する。
【００３３】
ステップＳ４−３では、自然数である変数ｎを初期値である１に設定する。変数ｎの最大値ｎｍａｘは、反射型電子顕微鏡４の撮影開始時刻ｔ１から撮影終了時刻ｔ２までに撮影された連続画像の枚数に対応する。換言すれば、ｔ１＝ｔ２−（ｎｍａｘ−１）・Δｔである。
【００３４】
ステップＳ４−４では、撮影時刻ｔ２−ｎ・Δｔの生体試料１１の変形及び運動を仮定する。この生体試料１１の変形及び運動には、直後の撮影時刻、すなわち撮影時刻ｔ２−（ｎ−１）・Δｔにおける生体試料１１の変形及び運動等が使用される。今、ｎは初期値「１」であるので、反射型電子顕微鏡４で検出された撮影終了時刻ｔ２における反射散乱線２１の二次元強度分布、透過型電子顕微鏡５で検出された撮影終了時刻ｔ２における生体試料１１の三次元形状、及び透過型電子顕微鏡５で検出された撮影終了時刻ｔ２におけるバイオセル１２の表面１２ａの形状に基づいて、撮影終了時刻ｔ２の直前の撮影時刻ｔ２−Δｔにおける生体試料１１の変形及び運動が仮定される。
【００３５】
次に、ステップＳ４−５では、時刻ｔ２−ｎ・Δｔにおけるバイオセル１２の表面１２ａの形状を算出する。このバイオセル１２の表面１２ａの形状の算出は、ステップＳ４−４で仮定した撮影時刻ｔ２−ｎ・Δｔの生体試料１１の変形及び運動に第１の計算モデル（図１の符号４６参照）を適用することでなされる。今、ｎは初期値「１」であるので、仮定した撮影時刻ｔ２−Δｔにおける生体試料１１の変形及び運動に第１の計算モデルを適用することで、バイオセル１２の表面１２ａの形状を算出する。
【００３６】
次に、ステップＳ４−６では、撮影時刻ｔ２−ｎ・Δｔにおける反射散乱光２１の電子像の二次元強度分布を算出する。この二次元強度分布の算出は、ステップＳ４−５で算出した時刻ｔ２−ｎ・Δｔにおけるバイオセル１２の表面１２ａの形状に第２の計算モデル（図１の符号４７参照）を適用することでなされる。今、ｎは初期値「１」であるので、算出した撮影時刻ｔ２−Δｔにおけるバイオセル１２の表面１２ａの形状に第２の計算モデルを適用することで、反射散乱光２１の二次元強度分布を算出する。
【００３７】
次に、ステップＳ４−７において、ステップＳ４−６で算出した撮影時刻ｔ２−ｎ・Δｔにおける反射散乱光２１の電子像の二次元強度分布と、実際に反射型電子顕微鏡４で撮影された撮影時刻ｔ２−ｎ・Δｔにおける反射散乱光２１の電子像の二次元強度分布を比較する。ステップＳ４−８において、両者が適合、すなわち一致しているかその差が予め定められた許容範囲内である場合は、ステップＳ４−４における生体試料１１の変形及び運動の仮定が正しいないしは妥当であるので、仮定した生体試料１１の変形及び運動をその撮影時刻ｔ２−ｎ・Δｔにおける生体試料１１の変形及び運動に決定する。この場合、ステップＳ４−９に移行する。一方、ステップＳ４−８において両者が適合しない場合には、ステップＳ４−４に戻り、撮影時刻ｔ２−ｎ・Δｔの生体試料１１の変形及び運動を仮定を修正し、ステップＳ４−５〜Ｓ４−８の処理を繰り返す。今、ｎは初期値「１」であるので、算出した撮影時刻ｔ２−Δｔにおける反射散乱光２１の電子像の二次元強度分布と、実際に反射型電子顕微鏡４で撮影された撮影時刻ｔ２−Δｔにおける反射散乱光２１の電子像の二次元強度分布を比較する。ステップＳ４−８で両者が適合していればステップＳ４−９に移行し、適合していなければステップＳ４−４に戻り再度撮影時刻ｔ２−Δｔにおける生体試料１１の変形及び運動の仮定を修正する。
【００３８】
ステップＳ４−９では、ステップＳ４−４において仮定した時刻ｔ２−ｎ・Δｔにおける生体試料１１の変形及び運動を、画像記憶部４１に記憶する。続いて、ステップＳ４−１０において変数ｎに「１」を加算する。さらに、ステップＳ４−１１においてｔ１≦ｔ２−ｎ・Δｔでない場合、すなわち撮影開始時刻ｔ１まで生体試料１１の変形及び運動の算出が終了していない場合には、ステップＳ４−４に戻る。
【００３９】
今、変数ｎは初期値「１」であるので、ステップＳ４−９で加算されて「２」となり、ステップＳ４−１１を介してステップＳ４−４に戻る。ステップＳ４−４〜Ｓ４−８で、時刻ｔ２−２・Δｔにおける生体試料１１の変形及び運動の計算が実行される。この際、ステップＳ４−４における生体試料１１の変形及び運動の仮定には、既に算出されている時刻ｔ２−Δｔにおける生体試料１１の変形及び運動が使用される。同様の処理が、ステップＳ４−１１においてｔ１≦ｔ２−ｎ・Δｔが成立するまで繰り返される。
【００４０】
以上の処理により、撮影開始時刻ｔ１から撮影終了時刻ｔ２までの各撮影時刻（時間間隔Δｔ）における生体試料１１の変形及び運動が算出され、画像記憶部４１に記憶される。時間間隔Δｔは反射型電子顕微鏡４の撮影速度で決まり、それに応じた時間分解能で生体試料１１の変形及び運動を計測することができる。例えば、前述のように反射型電子顕微鏡４の撮影速度が１００万枚／秒であれば、この時間分解能での生体試料１１の変形及び運動を計測することができる。
【００４１】
本発明は前記実施形態に限定されず、種々の変形が可能である。例えば、試料は、バイオセル以外の容器に生体試料以外の他の被観察物を封入したものでもよい。ただし、被観察物の変形及び運動に伴って、容器の表面が変形する必要がある。また、試料に照射する計測線は電子線に限定されず、イオン、及び正孔のような電子線以外の荷電粒子の流れ、紫外線、可視光線、及び赤外線等の光を含む電磁波、並びにＸ線に加えα線、γ線、β線、及び中性子線を含む放射線等であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】本発明の実施形態に係る変形運動計測装置を示す概略構成図。
【図２】反射型電子顕微鏡の入射線及び反射散乱線の二次元強度分布と、バイオセル内の生体試料の関係を説明するための概略図。
【図３】反射型電子顕微鏡による連続撮影を説明するための概略的なタイムチャート。
【図４】変形運動計測装置の動作を説明するためのフローチャート。
【符号の説明】
【００４３】
１ 変形運動計測装置
２ 撮影装置
３ 解析装置
４ 反射型電子顕微鏡
５ 透過型電子顕微鏡
６ チャンバ
８ 試料
９ 試料台
１０ 駆動装置
１１ 生体試料
１２ バイオセル
１５ 入射線
１６ 電子銃
１７ 絞り
１８ 電磁レンズ
１９ センサ
２０ 電磁レンズ
２１ 反射散乱線
２３ コントローラ
２５ 電子銃
２６ 絞り
２７ 電磁レンズ
２８ 入射線
２９ センサ
３０ 電磁レンズ
３１ 透過線
３２ コントローラ
４１ 画像記憶部
４２ 処理部
４６ 第１の計算モデル
４７ 第２の計算モデル
【特許請求の範囲】
【請求項１】
容器内に保持された被観察物の変形及び運動を計測するための計測装置であって、前記被観察物は第１の時間から第２の時間の間変形及び運動を行い、かつ前記被観察物の変形及び運動が前記容器の表面を変形させるものにおいて、
前記容器の表面に計測線を照射する照射部と、前記容器の表面で反射及び散乱された計測線の二次元強度分布を検出する検出部とを有し、前記第１の時刻から前記第２の時刻までの時間間隔を隔てた個々の撮影時刻における前記二次元強度分布である連続画像を撮影する第１の撮影部と、
前記容器に計測線を照射する照射部と、前記容器及び被観察物を透過した計測線を検出する検出部とを有し、前記第２の時刻に静止した前記容器の表面の三次元形状である容器表面静止画像と、前記第２の時刻に静止した前記被観察物の三次元形状である被観察物静止画像とを撮影する第２の撮影部と、
前記連続画像、前記容器表面静止画像、及び前記被観察物静止画像に基づいて、前記第１の時刻から前記第２の時刻までの個々の前記撮影時刻における前記被観察物の変形及び運動を算出する解析部と
を備えることを特徴とする変形運動計測装置。
【請求項２】
前記解析部は、前記撮影時刻の一つにおける前記被観察物の変形及び運動を、その撮影時刻の直前の撮影時刻における前記被観察物の変形及び運動に基づいて仮定し、この仮定した前記被観察物の変形及び運動に基づいて算出した前記第反射及び散乱された計測線の二次元強度分布が、前記第１の撮影部で実際に撮影された前記撮影時刻の二次元強度分布と適合すれば、前記仮定した前記被観察物の変形及び運動を前記撮影時刻の被観察物の変形及び運動として決定することを特徴とする、請求項１に記載の変形運動計測装置。
【請求項３】
容器内に保持された被観察物の変形及び運動を計測するための計測方法であって、前記被観察物は第１の時間から第２の時間の間変形及び運動を行い、かつ前記被観察物の変形及び運動が前記容器の表面を変形させるものにおいて、
前記第１の時間から前記第２の時間の間、時間間隔を隔てた個々の撮影時刻毎に、前記容器の表面に計測線を照射して前記容器の表面で反射及び散乱された計測線の二次元強度分布を撮影し、
前記第２の時刻以降に前記容器に計測線を照射し、前記容器及び前記被観察物を透過した計測線により、前記第２の時刻に静止した前記容器の表面の三次元形状である容器表面静止画像と、前記第２の時刻に静止した前記被観察物の三次元形状である被観察物静止画像とを取得し、
前記連続画像、前記容器表面静止画像、及び前記被観察物静止画像に基づいて、前記第１の時刻から前記第２の時刻までの個々の前記撮影時刻における前記被観察物の変形及び運動を算出することを特徴とする、変形運動計測方法。
【請求項４】
前記撮影時刻の一つにおける前記被観察物の三次元形状及び運動を、その撮影時刻の直前の撮影時刻における前記被観察物の変形及び運動に基づいて仮定し、
前記仮定した前記被観察物の形状及び運動に基づいて前記計測線の反射及び散乱の二次元強度分布を算出し、
前記仮定した前記被観察物の形状及び運動に基づいて算出した二次元強度分布と、前記第１の撮影部で実際に撮影された前記撮影時刻の二次元強度分布と比較し、
前記仮定した前記被観察物の三次元形状及び運動に基づいて算出した二次元強度分布が、前記第１の撮影部で実際に撮影された前記撮影時刻の二次元強度分布と適合すれば、前記仮定した前記被観察物の形状及び運動を前記撮影時刻の被観察物の形状及び運動に決定することを特徴とする、請求項３に記載の変形運動計測方法。
【請求項１】
容器内に保持された被観察物の変形及び運動を計測するための計測装置であって、前記被観察物は第１の時間から第２の時間の間変形及び運動を行い、かつ前記被観察物の変形及び運動が前記容器の表面を変形させるものにおいて、
前記容器の表面に計測線を照射する照射部と、前記容器の表面で反射及び散乱された計測線の二次元強度分布を検出する検出部とを有し、前記第１の時刻から前記第２の時刻までの時間間隔を隔てた個々の撮影時刻における前記二次元強度分布である連続画像を撮影する第１の撮影部と、
前記容器に計測線を照射する照射部と、前記容器及び被観察物を透過した計測線を検出する検出部とを有し、前記第２の時刻に静止した前記容器の表面の三次元形状である容器表面静止画像と、前記第２の時刻に静止した前記被観察物の三次元形状である被観察物静止画像とを撮影する第２の撮影部と、
前記連続画像、前記容器表面静止画像、及び前記被観察物静止画像に基づいて、前記第１の時刻から前記第２の時刻までの個々の前記撮影時刻における前記被観察物の変形及び運動を算出する解析部と
を備えることを特徴とする変形運動計測装置。
【請求項２】
前記解析部は、前記撮影時刻の一つにおける前記被観察物の変形及び運動を、その撮影時刻の直前の撮影時刻における前記被観察物の変形及び運動に基づいて仮定し、この仮定した前記被観察物の変形及び運動に基づいて算出した前記第反射及び散乱された計測線の二次元強度分布が、前記第１の撮影部で実際に撮影された前記撮影時刻の二次元強度分布と適合すれば、前記仮定した前記被観察物の変形及び運動を前記撮影時刻の被観察物の変形及び運動として決定することを特徴とする、請求項１に記載の変形運動計測装置。
【請求項３】
容器内に保持された被観察物の変形及び運動を計測するための計測方法であって、前記被観察物は第１の時間から第２の時間の間変形及び運動を行い、かつ前記被観察物の変形及び運動が前記容器の表面を変形させるものにおいて、
前記第１の時間から前記第２の時間の間、時間間隔を隔てた個々の撮影時刻毎に、前記容器の表面に計測線を照射して前記容器の表面で反射及び散乱された計測線の二次元強度分布を撮影し、
前記第２の時刻以降に前記容器に計測線を照射し、前記容器及び前記被観察物を透過した計測線により、前記第２の時刻に静止した前記容器の表面の三次元形状である容器表面静止画像と、前記第２の時刻に静止した前記被観察物の三次元形状である被観察物静止画像とを取得し、
前記連続画像、前記容器表面静止画像、及び前記被観察物静止画像に基づいて、前記第１の時刻から前記第２の時刻までの個々の前記撮影時刻における前記被観察物の変形及び運動を算出することを特徴とする、変形運動計測方法。
【請求項４】
前記撮影時刻の一つにおける前記被観察物の三次元形状及び運動を、その撮影時刻の直前の撮影時刻における前記被観察物の変形及び運動に基づいて仮定し、
前記仮定した前記被観察物の形状及び運動に基づいて前記計測線の反射及び散乱の二次元強度分布を算出し、
前記仮定した前記被観察物の形状及び運動に基づいて算出した二次元強度分布と、前記第１の撮影部で実際に撮影された前記撮影時刻の二次元強度分布と比較し、
前記仮定した前記被観察物の三次元形状及び運動に基づいて算出した二次元強度分布が、前記第１の撮影部で実際に撮影された前記撮影時刻の二次元強度分布と適合すれば、前記仮定した前記被観察物の形状及び運動を前記撮影時刻の被観察物の形状及び運動に決定することを特徴とする、請求項３に記載の変形運動計測方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００６−１７３００２（Ｐ２００６−１７３００２Ａ）
【公開日】平成１８年６月２９日（２００６．６．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−３６６２６３（Ｐ２００４−３６６２６３）
【出願日】平成１６年１２月１７日（２００４．１２．１７）
【出願人】（０００１２５３４７）学校法人近畿大学 (389)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年６月２９日（２００６．６．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１２月１７日（２００４．１２．１７）
【出願人】（０００１２５３４７）学校法人近畿大学 (389)
【Ｆターム（参考）】
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