定方向進化による触媒作用のために最適化されたキメラジンクフィンガーリコンビナーゼ
本発明は、キメラリコンビナーゼタンパク質が、ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインにより特異的に結合されているＤＮＡ部位で部位特異的組換えを触媒するように、ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインに作動可能に連結されたセリンリコンビナーゼを含むキメラリコンビナーゼに関する。セリンリコンビナーゼは、いくつかの天然に存在するセリンリコンビナーゼのうちの１つであり得る。また、本発明には、キメラリコンビナーゼをコードする核酸、該核酸を含むベクター、該ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞、該キメラリコンビナーゼを用いて組換えを行う方法、基質に連結されたタンパク質進化を用いて追加のキメラリコンビナーゼを作製する方法、該キメラリコンビナーゼを遺伝子治療に用いる方法、および医薬組成物が含まれる。
Notice: Undefined index: DEJ in /mnt/www/gzt_disp.php on line 298
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインに機能するように連結されたセリンリコンビナーゼを含むキメラリコンビナーゼタンパク質であって、前記キメラリコンビナーゼタンパク質は、前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインにより特異的に結合されるＤＮＡ部位で部位特異的組換えを触媒し、前記セリンリコンビナーゼは、前記キメラタンパク質の構成において組換えを効率的に触媒するように選択され、または改良される、キメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項２】
前記セリンリコンビナーゼドメインが、一般的な鎖交換機構を触媒する求核性の触媒セリン残基を含むリコンビナーゼドメインである、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項３】
前記セリンリコンビナーゼが、（ａ）Ｔｎ３（ＥｃｏＴｎ３としても公知）；Ｈｉｎ（ＳｔｙＨｉｎとしても公知）；Ｇｉｎ（ＭｕＧｉｎとしても公知）；Ｓｉｎ；Ｂｅｔａ；Ｐｉｎ；Ｍｉｎ；Ｄｉｎ；Ｃｉｎ；ＥｃｏＴｎ２１；ＳｆａＴｎ９１７；ＢｍｅＴｎ５０８３；Ｂｍｅ５３；Ｃｐｅ；ＳａｕＳＫＩ；ＳａｕＳＫ４１；ＳａｕＴｎ５５２；Ｒａｎ；Ａａｃ；Ｌｌａ；ｐＭＥＲ０５；Ｍｌｏ９２；Ｍｌｏ９０；Ｒｒｈ；Ｐｊｅ；Ｒｅｑ；ＰｐｓＴｎ５５０１；Ｐａｅ；Ｘａｎ；ＩＳＸｃ５；Ｓｐｙ；ＲｈｉｚＹ４ｃＧ；ＳａｒｐＮＬ１；ＳｓｏｌＳＣ１９０４ａ；ＳｓｏｌＳＣ１９０４ｂ；ＳｓｏｌＳＣ１９１３；Ａａｍ６０６；ＭｊａＭ００１４；Ｐａｂ；ＨｐｙｌＳ６０７；ＭｔｕｌＳ＿Ｙ３４９；ＭｔｕＲｖ２７９２ｃ；ＭｔｕＲｖ２９７９ｃ；ＭｔｕＲｖ３８２８ｃ；ＭｔｕＲｖ０９２１；ＭｃｅＲｖ０９２１；ＴｎｐＸ；ＴｎｄＸ；ＷｗＫ；ラクトコッカスファージＴＰ９０１−１セリンリコンビナーゼ；連鎖球菌ファージφ３７０．１セリンリコンビナーゼ；ファージＡ１１８セリンリコンビナーゼ；ストレプトミセス・セリカラー染色体ＳＣ３Ｃ８．２４セリンリコンビナーゼ；ストレプトミセス・セリカラー染色体ＳＣ２Ｅ１．３７セリンリコンビナーゼ；ストレプトミセス・セリカラー染色体ＳＣＤ７８．０４ｃセリンリコンビナーゼ；ストレプトミセス・セリカラー染色体ＳＣ８Ｆ４．１５ｃセリンリコンビナーゼ；ストレプトミセス・セリカラー染色体ＳＣＤ１２Ａ．２３セリンリコンビナーゼ；ストレプトミセス・セリカラー染色体ＳＣＨ１０．３８ｃセリンリコンビナーゼ；ストレプトミセス・セリカラー染色体ＳＣＣ８８．１４セリンリコンビナーゼ；ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ファージφＣ３１セリンリコンビナーゼ；ストレプトミセスファージＲ４セリンリコンビナーゼ；バチルス属菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ファージφ１０５セリンリコンビナーゼ；バチルス属菌ファージＳＰＢｃ２セリンリコンビナーゼ；バチルス属菌プロファージＳＫＩＮセリンリコンビナーゼ；黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｃｃｒＡセリンリコンビナーゼ；黄色ブドウ球菌ｃｃｒＢセリンリコンビナーゼ；結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ファージＢｘｂ１セリンリコンビナーゼ；結核菌プロファージφＲＶ１セリンリコンビナーゼ；ＹＢＣＫ＿ＥＣＯＬＩ；Ｙ４ｂＡ；Ｂｊａ；Ｓｐｎ；Ｃａｃ１９５６；およびＣａｃ１９５４；ならびに
（ｂ）（ａ）のセリンリコンビナーゼの変異タンパク質
から成る群から選択される、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項４】
前記セリンリコンビナーゼが、Ｇｉｎ、Ｈｉｎ、Ｔｎ３、Ｓｉｎ、Ｂｅｔａ、Ｐｉｎ、Ｍｉｎ、Ｄｉｎ、およびＣｉｎならびにＧｉｎの変異タンパク質、Ｈｉｎの変異タンパク質、Ｓｉｎの変異タンパク質、Ｂｅｔａの変異タンパク質、Ｐｉｎの変異タンパク質、Ｍｉｎの変異タンパク質、Ｄｉｎの変異タンパク質、Ｃｉｎの変異タンパク質、Ｔｎ３の変異タンパク質から成る群から選択される、請求項３に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項５】
前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインが、ヘキサヌクレオチドと結合する２指向性のジンクフィンガー結合ドメインである、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項６】
前記キメラリコンビナーゼタンパク質がＴｎ３ＧＡＧＧＡＧであり、かつ、６塩基対配列ＧＡＧＧＡＧ（配列番号１）と選好的に結合する２指向性のジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインとリンカーによって融合したＴｎ３由来のドメインを有する、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項７】
前記キメラリコンビナーゼタンパク質がＨｉｎＧＡＧＧＡＧであり、かつ、前記６塩基対配列ＧＡＧＧＡＧ（配列番号１）と選好的に結合する２指向性のジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインとリンカーを介して融合したＨｉｎ由来のドメインを有する、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項８】
前記キメラリコンビナーゼタンパク質がＧｉｎＧＡＧＧＡＧであり、かつ、前記６塩基対配列ＧＡＧＧＡＧ（配列番号１）と選好的に結合する２指向性のジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインとリンカーを介して融合したＧｉｎ由来のドメインを有する、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項９】
前記キメラリコンビナーゼタンパク質がＴｎ３Ｃｈ１５Ｇであり、かつ、Ｔｎ３に由来する変異セリンリコンビナーゼを有する、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項１０】
前記キメラリコンビナーゼタンパク質がＧｉｎＬ７Ｃ７Ｈ１であり、かつ、Ｇｉｎに由来する変異セリンリコンビナーゼを有する、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項１１】
前記キメラリコンビナーゼタンパク質がＧｉｎＬ７Ｃ７Ｐ２であり、かつ、Ｇｉｎに由来する変異セリンリコンビナーゼを有する、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項１２】
（１）Ｔｎ３セリンリコンビナーゼ触媒ドメイン中のＧ７０Ｓ、Ｄ１０２Ｙ、またはＥ１２４Ｑ；（２）Ｈｉｎセリンリコンビナーゼ触媒ドメイン中のＨ１０７Ｙ；（３）Ｇｉｎセリンリコンビナーゼ触媒ドメイン中のＭ７０Ｖ、Ｔ９６Ａ、またはＨ１０６Ｙ；あるいは（４）Ｔｎ３セリンリコンビナーゼ触媒ドメイン中のＩ１２Ｖ、Ｄ１３Ｇ、Ｋ６５Ｒ、Ｍ７３Ｖ、Ｉ８０Ｍ、Ｖ１０８Ａ、Ｋ５３Ｅ、またはＫ１５１Ｍの変異のうち１つまたは複数の変異が、ＨｉｎおよびＧｉｎ中の対応する相同残基の変異とともに、前記セリンリコンビナーゼに導入される、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項１３】
前記セリンリコンビナーゼが、次の変異、Ｄ１２Ｇ、Ｎ１４Ｓ、Ｎ２０Ｄ、Ｋ５０Ｅ、Ｍ７０Ｖ、Ｉ９４Ｖ、Ｙ１０９Ｈ、Ｍ１１４Ｖ、およびＫ１４８Ｍ、を全て含むＧｉｎドメインである、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼ。
【請求項１４】
前記セリンリコンビナーゼが、次の変異、Ｄ１２Ｇ、Ｎ１４Ｓ、Ｎ２０Ｄ、Ｋ５０Ｅ、Ｍ７０Ｖ、Ｉ９４Ｖ、Ｍ１１４Ｖ、およびＫ１１４８Ｍを全て含むＧｉｎドメインである、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼ。
【請求項１５】
前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインが、９塩基対に結合する３指向性のジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインである、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項１６】
前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインが、１２塩基対に結合する４指向性のジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインである、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項１７】
前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインが、１５塩基対に結合する５指向性のジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインである、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項１８】
前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインが、１８塩基対に結合する６指向性のジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインである、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項１９】
前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインが、前記９塩基対配列ＧＧＡＧＧＧＧＴＧ（配列番号３）と結合する、請求項１５に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項２０】
前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインが、前記９塩基対配列ＧＣＡＧＴＧＧＣＧ（配列番号４）と結合する、請求項１５に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項２１】
前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインに、配列番号５〜配列番号７４から成る群から選択される配列ＡＮＮのトリヌクレオチドに結合している少なくとも１つの配列が含まれる、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項２２】
前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインに、配列番号４４〜配列番号５３から成る群から選択される前記配列ＡＮＮのトリヌクレオチドに結合している少なくとも１つの配列が含まれる、請求項２１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項２３】
前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインに、配列番号７５〜配列番号１３１から成る群から選択される配列ＡＧＣのトリヌクレオチドに結合している少なくとも１つの配列が含まれる、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項２４】
前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインに、配列番号７５〜配列番号８４から成る群から選択される前記配列ＡＧＣのトリヌクレオチドに結合している少なくとも１つの配列が含まれる、請求項２３に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項２５】
前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインに、配列番号１３２〜配列番号１５６から成る群から選択される配列ＣＮＮのトリヌクレオチドに結合している少なくとも１つの配列が含まれる、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項２６】
前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインに、配列番号１５７〜配列番号２６６から成る群から選択される前記配列ＧＮＮのトリヌクレオチドに結合している少なくとも１つの配列が含まれる、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項２７】
前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインに、配列番号１５７〜配列番号１７２から成る群から選択される前記配列ＧＮＮのトリヌクレオチドに結合している少なくとも１つの配列が含まれる、請求項２６に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項２８】
前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインが、配列番号２６７〜配列番号６２３および配列番号６５３〜配列番号７０５から成る群から選択される配列ＴＮＮのトリヌクレオチドに結合している少なくとも１つの配列を含む、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項２９】
前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインが、配列番号２６７〜配列番号３１１から成る群から選択される前記配列ＴＮＮのトリヌクレオチドに結合している少なくとも１つの配列を含む、請求項２８に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項３０】
前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインが、トリプレット結合ドメイン間に位置する少なくとも１つのオリゴペプチドリンカーを含む、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項３１】
前記オリゴペプチドリンカーが、ＴＧＥＫＰ（配列番号６２４）、ＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＴＧＥＫＰ（配列番号６２５）、ＬＲＱＫＤＧＧＧＳＥＲＰ（配列番号６２６）、ＬＲＱＫＤＧＥＲＰ（配列番号６２７）、ＧＧＲＧＲＧＲＧＲＱ（配列番号６２８）、ＱＮＫＫＧＧＳＧＤＧＫＫＫＱＨＩ（配列番号６２９）、ＴＧＧＥＲＰ（配列番号６３０）、ＡＴＧＥＫＰ（配列番号６３１）、およびＧＧＧＳＧＧＧＧＥＧＰ（配列番号７０６）から成る群から選択される、請求項３０に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項３２】
前記オリゴペプチドリンカーが、ＴＧＥＫＰ（配列番号６２４）である、請求項３１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項３３】
１から５の保存的アミノ酸置換による請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質に由来するキメラリコンビナーゼタンパク質であって、前記保存的アミノ酸置換が各々、Ａｌａ／ＧｌｙまたはＳｅｒ；Ａｒｇ／Ｌｙｓ；Ａｓｎ／ＧｌｎまたはＨｉｓ；Ａｓｐ／Ｇｌｕ；Ｃｙｓ／Ｓｅｒ；Ｇｌｎ／Ａｓｎ；Ｇｌｙ／Ａｓｐ；Ｇｌｙ／ＡｌａまたはＰｒｏ；Ｈｉｓ／ＡｓｎまたはＧｌｎ；Ｉｌｅ／ＬｅｕまたはＶａｌ；Ｌｅｕ／ＩｌｅまたはＶａｌ；Ｌｙｓ／ＡｒｇまたはＧｌｎまたはＧｌｕ；Ｍｅｔ／ＬｅｕまたはＴｙｒまたはＩｌｅ；Ｐｈｅ／ＭｅｔまたはＬｅｕまたはＴｙｒ；Ｓｅｒ／Ｔｈｒ；Ｔｈｒ／Ｓｅｒ；Ｔｒｐ／Ｔｙｒ；Ｔｙｒ／ＴｒｐまたはＰｈｅ；Ｖａｌ／ＩｌｅまたはＬｅｕから選択され、前記保存的アミノ酸置換に由来する前記キメラリコンビナーゼタンパク質は、前記未変異のキメラリコンビナーゼと同じ組換えに対するＤＮＡ配列特異性を有し、その基質に対する結合親和性が、前記未変異のキメラリコンビナーゼの基質に対する結合親和性の約８０％以上であり、そのＶｍａｘが、前記未変異のキメラリコンビナーゼのＶｍａｘの約８０％以上である、キメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項３４】
前記キメラリコンビナーゼタンパク質が、少なくとも１つの追加のドメインをさらに含む、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項３５】
前記追加のドメインが、精製タグ、酵素ドメイン、リガンド結合ドメイン、および細胞透過性ドメインから成る群から選択される、請求項３４に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項３６】
前記追加のドメインが酵素ドメインであり、前記酵素ドメインが、蛍光または生物発光を介して検出できる光の生成を触媒する、請求項３５に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項３７】
請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質をコードする、単離および精製された核酸配列。
【請求項３８】
ＤＮＡである、請求項３７に記載の核酸配列。
【請求項３９】
請求項６に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質をコードする、単離および精製された核酸配列。
【請求項４０】
ＤＮＡである、請求項３９に記載の核酸配列。
【請求項４１】
請求項７に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質をコードする、単離および精製された核酸配列。
【請求項４２】
ＤＮＡである、請求項４１に記載の核酸配列。
【請求項４３】
請求項８に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質をコードする、単離および精製された核酸配列。
【請求項４４】
ＤＮＡである、請求項４３に記載の核酸配列。
【請求項４５】
（ａ）（ｉ）前記キメラリコンビナーゼタンパク質が前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインにより特異的に結合されているＤＮＡ部位で部位特異的組換えを触媒するように、ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインに作動可能に連結されたセリンリコンビナーゼ、
（ｉｉ）キメラリコンビナーゼＴｎ３ＧＡＧＧＡＧ、
（ｉｉｉ）キメラリコンビナーゼＨｉｎＧＡＧＧＡＧ、および
（ｉｖ）キメラリコンビナーゼＧｉｎＧＡＧＧＡＧ
から成る群から選択されるキメラリコンビナーゼタンパク質をコードする、単離および精製された核酸配列と
（ｂ）（ａ）の配列と少なくとも９５％同一である、単離および精製された核酸配列であって、前記核酸配列が前記配列の活性を塩基の置換が行われるまで保持しており、かつ、前記核酸配列によりコードされるタンパク質の任意の活性および核酸レベルで発現される前記核酸配列の任意の活性を含む核酸配列と
から成る群から選択される、単離および精製された核酸配列。
【請求項４６】
ＤＮＡである、請求項４５に記載の核酸配列。
【請求項４７】
請求項３８に記載のＤＮＡ配列を含むベクター。
【請求項４８】
発現ベクターである、請求項４７に記載のベクター。
【請求項４９】
請求項４０に記載のＤＮＡ配列を含むベクター。
【請求項５０】
発現ベクターである、請求項４９に記載のベクター。
【請求項５１】
請求項４２に記載のＤＮＡ配列を含むベクター。
【請求項５２】
発現ベクターである、請求項５１に記載のベクター。
【請求項５３】
請求項４４に記載のＤＮＡ配列を含むベクター。
【請求項５４】
発現ベクターである、請求項５３に記載のベクター。
【請求項５５】
請求項４６に記載のＤＮＡ配列を含むベクター。
【請求項５６】
発現ベクターである、請求項５５に記載のベクター。
【請求項５７】
請求項３７に記載の核酸配列で形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項５８】
請求項３９に記載の核酸配列で形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項５９】
請求項４１に記載の核酸配列で形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項６０】
請求項４３に記載の核酸配列で形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項６１】
請求項４５に記載の核酸配列で形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項６２】
請求項４７に記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項６３】
請求項４９に記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項６４】
請求項５１に記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項６５】
請求項５３に記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項６６】
請求項５５に記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項６７】
（ａ）少なくとも１種類の請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質に結合している、少なくとも２つの部位をその中に有するＤＮＡ配列を提供する工程であって、前記部位がスペーサーによって分離されている工程と
（ｂ）前記ＤＮＡと前記キメラリコンビナーゼとを、少なくとも一つのキメラリコンビナーゼが部位特異的組換えを触媒する条件下で反応させる工程であって、前記ＤＮＡ配列の両方の鎖が前記キメラリコンビナーゼと特異的に結合する二つの部位の間で切断され、部位特異的組換えが起こる工程と
を含む、部位特異的組換えを行う方法。
【請求項６８】
部位特異的組換え事象が反転である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
部位特異的組換え事象が組込みである、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
部位特異的組換え事象が分離である、請求項６７に記載の方法。
【請求項７１】
（ａ）第１の配列および第２の配列からなる２つのＤＮＡ配列を提供する工程であって、前記第１の配列および前記第２の配列の各々が少なくとも１種類の請求項１に記載のキメラリコンビナーゼに結合する部位をその中に有する工程と
（ｂ）前記第１の配列および第２の配列と、少なくとも一つの前記キメラリコンビナーゼとを、前記キメラリコンビナーゼが部位特異的組換えを触媒する条件において反応させる工程であって、第１の配列および第２の配列の両方の鎖が切断され、第１の配列および第２の配列が関与する部位特異的組換えが行われる工程と
を含む、部位特異的組換え事象を行う方法。
【請求項７２】
前記第１の配列および前記第２の配列を伴って行われる組換え事象が、一部のＤＮＡが失われるかまたは付加され、かつ、産物の部位が少なくとも１種類のキメラリコンビナーゼとの反応に適合する基質ではない、非保存的組換え事象である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記組換え事象が、適合する組換え部位の１つの対または両方の対のいずれかが、一方向性の組換えに適しているカセット交換である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
（ａ）第１の配列および第２の配列からなる２つのＤＮＡ配列を提供する工程であって、前記第１の配列および前記第２の配列の一方が、少なくとも１種類の請求項１に記載のキメラリコンビナーゼに結合している部位をその中に有し、かつ、前記第１の配列および前記第２の配列のもう一方が、少なくとも１種類の天然に存在するセリンリコンビナーゼに結合する部位をその中に有する工程と
（ｂ）前記第１の配列および前記第２の配列と前記少なくとも一つのキメラリコンビナーゼおよび前記天然に存在するセリンリコンビナーゼとを、前記キメラリコンビナーゼおよび前記天然に存在するセリンリコンビナーゼが部位特異的組換えを触媒する条件下で反応させる工程であって、前記第１の配列と前記第２の配列の両方の鎖が切断され、前記第１の配列および前記第２の配列が関与する部位特異的組換え事象がおこる工程と
を含む、部位特異的組換え事象を行う方法。
【請求項７５】
（ａ）組換えのための２つの部位をその中に有するＤＮＡ配列を提供する工程であって、各部位が、
（ｉ）キメラリコンビナーゼ半部位の最適な結合部位と比較して、実質的に低い親和性で前記少なくとも１種類のキメラリコンビナーゼと結合している、少なくとも１種類の請求項１に記載のキメラリコンビナーゼのための変異結合部位、および
（ｉｉ）最適に結合している少なくとも１種類のキメラリコンビナーゼ半部位のための結合部位を含み、これらの部位が、少なくとも１種類の請求項１に記載のキメラリコンビナーゼと特異的に結合し、これらの部位がスペーサーによって分離されている、工程と
（ｂ）前記ＤＮＡ配列と少なくとも１種類のキメラリコンビナーゼとを前記少なくとも１種類のキメラリコンビナーゼが部位特異的組換えを触媒する条件下で反応させる工程であって、前記ＤＮＡ配列の両方の鎖が前記キメラリコンビナーゼと特異的に結合する二つの部位の間で切断されることにより部位特異的組換えが行われ、部位特異的組換え事象が組み込みであり、組み込みの結果が安定するようにキメラリコンビナーゼ半部位のための変異結合部位のホモ二量体が組換えに対して非機能的に形成される、工程と
を含む、ＤＮＡ分子において安定な組込みを行う方法。
【請求項７６】
（ａ）少なくとも１種類の請求項１に記載の第１のキメラリコンビナーゼと反応性である、組換えのための第１の部位をその中に有する第１のＤＮＡ配列を提供する工程と
（ｂ）少なくとも１種類の請求項１に記載の第２のキメラリコンビナーゼと反応性である、組換えのための第２の部位をその中に有する第２のＤＮＡ配列を、前記第１の部位と前記第２の部位が機能的に直交するように提供する工程と
（ｃ）前記第１のＤＮＡ配列を前記少なくとも１種類の第１のキメラリコンビナーゼと反応させ、前記第２のＤＮＡ配列を前記少なくとも１種類の第２のキメラリコンビナーゼと反応させて組換えをもたらす工程と
を含む、ＤＮＡ分子において組換えを行う方法。
【請求項７７】
カセット交換を実行するために、前記組換えのための第１の部位かまたは前記組換えのための第２の部位のいずれかでの組込みに続いて、組込みに用いられていない前記第１および前記第２の部位の一方で切除が行われる、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
組換えの結果が反転となる、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
組換えの結果が分離となる、請求項７７に記載の方法。
【請求項８０】
（ａ）２つのプラスミド、
（ｉ）第１の触媒ドメインおよび第１のジンクフィンガードメインを含む、請求項１に記載の第１のキメラリコンビナーゼを発現し、かつ第１の抗生物質抵抗性遺伝子を発現する第１のプラスミド、および
（ｉｉ）第２の触媒ドメインおよび第２のジンクフィンガードメインを含む、請求項１に記載の第２のキメラリコンビナーゼを発現し、かつ第２の抗生物質抵抗性遺伝子を発現している、第２のプラスミドであって、前記第１の触媒ドメインと前記第２の触媒ドメインが異なり、前記第１のジンクフィンガードメインと前記第２のジンクフィンガードメインが異なり、かつ、前記第１および前記第２の抗生物質抵抗性遺伝子が２つの異なる抗生物質に対する抵抗性を付与する第２のプラスミド
を生成する工程と
（ｂ）第１の遺伝子のコード領域および第２の遺伝子のコード領域を、２つのキメラリコンビナーゼによるプラスミド内切除を防ぐように、請求項１に記載の第１のキメラリコンビナーゼおよび請求項１に記載の第２のキメラリコンビナーゼの１つと各々が結合している非反復ホモ二量体部位で隣接することにより２つのカセットを構築する工程と
（ｃ）各プラスミドに１つのカセットを挿入して、カセットをその中に含む２つのプラスミドを生成する工程と
（ｄ）細菌宿主に、カセットを含む前記第１のプラスミドおよびカセットを含む前記第２のプラスミドを、組換えが起こるように同時導入する工程と
を含む、カセット交換を促進する方法。
【請求項８１】
組換えが、プラスミド内カセット交換である請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
組換えが、染色体遺伝子とプラスミドの間である請求項８０に記載の方法。
【請求項８３】
組換えが、導入ＤＮＡと染色体遺伝子の間である請求項８０に記載の方法。
【請求項８４】
組換えが、カセット交換により促進される切除である請求項８０に記載の方法。
【請求項８５】
（ａ）２つのプラスミド、
（ｉ）第１の触媒ドメインおよび第１のジンクフィンガードメインを含み、請求項１に記載の第１のキメラリコンビナーゼを発現し、かつ第１の抗生物質抵抗性遺伝子を発現する第１のプラスミドであって、前記第１のキメラリコンビナーゼは変異または選択されて第１の遺伝子の内在性隣接配列と結合する、第１のプラスミド、および
（ｉｉ）第２の触媒ドメインおよび第２のジンクフィンガードメインを含み、請求項１に記載の第２のキメラリコンビナーゼを発現し、かつ第２の抗生物質抵抗性遺伝子を発現している第２のプラスミドであって、前記第２のキメラリコンビナーゼは変異または選択されて第２の遺伝子の内在性隣接配列と結合し、前記第１の触媒ドメインと前記第２の触媒ドメインが異なり、かつ前記第１のジンクフィンガードメインと前記第２のジンクフィンガードメインが異なるように、かつ、前記第１および前記第２の抗生物質抵抗性遺伝子が２つの異なる抗生物質に対する抵抗性を付与する第２のプラスミド
を生成する工程と
（ｂ）第１のカセットが第１の内在性隣接領域に隣接される第１の遺伝子を含み、第２のカセットが第２の内在性隣接領域に隣接される第２の遺伝子を含む２つのカセットを、２つのキメラリコンビナーゼによるプラスミド内切除を防ぐように、請求項１に記載の第１のキメラリコンビナーゼおよび請求項１に記載の第２のキメラリコンビナーゼの１つと各々が結合している非反復ホモ二量体部位をその中に含む前記２つの内在性隣接領域の各々により構築する工程と
（ｃ）各プラスミドに１つのカセットを挿入して、カセットをその中に含む２つのプラスミドを生成する工程と
（ｄ）細菌宿主に、カセットを含む前記第１のプラスミドおよびカセットを含む前記第２のプラスミドを、組換えが起こるように同時導入する工程と
を含む、カセット交換を促進する方法。
【請求項８６】
前記組換えが、プラスミド内カセット交換である、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記組換えが、染色体遺伝子とプラスミドの間である、請求項８５に記載の方法。
【請求項８８】
前記組換えが、導入ＤＮＡと染色体遺伝子の間である、請求項８５に記載の方法。
【請求項８９】
前記組換えが、カセット交換により促進される切除である、請求項８５に記載の方法。
【請求項９０】
（ａ）ランダム化されたヌクレオチドを含有するプライマーを用いて２つの適合するプラスミド中のジンクフィンガー結合部位を含む単一の半部位ライブラリーを生成する工程と
（ｂ）工程（ａ）で生成された前記単一の半部位ライブラリーを適当な宿主を同時導入して形質転換体を生成する工程と
（ｃ）選択用の２種類の抗生物質を用いて前記形質転換体を同時に維持する工程と
（ｄ）同時に維持された前記形質転換体からプラスミドを精製する工程と
（ｅ）前記適切な宿主を低い濃度で再形質転換する工程と
（ｆ）前記再形質転換宿主を前記２種類の抗生物質を含有する培地で増殖させる工程と
（ｇ）前記２種類の抗生物質を含有する培地で増殖するコロニーをＰＣＲにより一方向性の組込みについてスクリーニングして、シス不活性化ジンクフィンガー結合部位を特定する工程と
を含む、シス不活性化ジンクフィンガー結合部位を特定するための方法。
【請求項９１】
前記宿主が、細菌宿主、酵母細胞宿主、昆虫細胞宿主、および哺乳類細胞宿主から成る群から選択される請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記宿主が細菌宿主であり、前記細菌宿主が大腸菌である、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
（ｈ）組換え産物によってのみ発現される別のレポーター遺伝子を含める工程と
（ｉ）前記レポーター遺伝子の活性についてスクリーニングする工程と
をさらに含む、請求項９０に記載の方法。
【請求項９４】
請求項９０に記載の方法により見出される、シス不活性化ジンクフィンガー結合部位。
【請求項９５】
（ａ）ランダム化されたヌクレオチドを含有するプライマーを用いて２つの適合するプラスミド中のスペーサー配列を含む単一の半部位ライブラリーを生成する工程と
（ｂ）工程（ａ）で生成された前記単一の半部位ライブラリーに適した宿主を同時導入して形質転換体を生成する工程と
（ｃ）選択用の２種類の抗生物質を用いて前記形質転換体を同時に維持する工程と
（ｄ）前記同時に維持された前記形質転換体からプラスミドを精製する工程と
（ｅ）前記適切な宿主を低い濃度で再形質転換する工程と
（ｆ）前記再形質転換宿主を前記２種類の抗生物質を含有する培地で増殖させる工程と
（ｇ）前記２種類の抗生物質を含有する培地で増殖するコロニーをＰＣＲにより一方向性の組込みについてスクリーニングして、シス不活性化スペーサー配列を特定する工程と
を含む、シス不活性化スペーサー配列を特定するための方法。
【請求項９６】
（ａ）標的基質を生成する工程であって、前記標的基質が、２つの異なるＤＮＡ結合ドメイン認識配列、選択標的配列およびトランス活性化因子配列をその中に含む組換え部位をその中に含む、工程と
（ｂ）前記標的基質を、トランス活性化因子配列と完全に相補的である請求項１に記載の固定されたキメラリコンビナーゼの存在下、異なるＤＮＡ結合ドメインを含む請求項１に記載のキメラリコンビナーゼのライブラリーとともにインキュベートして、単一の半部位ライブラリーを生成する工程と
（ｃ）工程（ｂ）で生成された前記単一の半部位ライブラリーに適した宿主を同時導入して形質転換体を生成する工程と
（ｄ）選択用の２種類の抗生物質を用いて前記形質転換体を同時に維持する工程と
（ｅ）前記同時に維持された形質転換体からプラスミドを精製する工程と
（ｆ）前記適切な宿主を低い濃度で再形質転換する工程と
（ｇ）前記再形質転換宿主を前記２種類の抗生物質を含有する培地で増殖させる工程と
（ｈ）前記２種類の抗生物質を含有する培地で増殖するコロニーをＰＣＲにより一方向性の組込みについてスクリーニングして、シス不活性化ＤＮＡ結合ドメインを特定する工程と
を含む、シス不活性化ＤＮＡ結合ドメインを特定するための方法。
【請求項９７】
（ａ）リコンビナーゼ変異体のライブラリーを生成して、変異を誘発されたリコンビナーゼドメインを生成する工程と
（ｂ）変異を誘発されたリコンビナーゼドメインと、変異を誘発されていないＤＮＡ結合ドメインと融合させて、変異を誘発された融合タンパク質のライブラリーを生成する工程と
（ｃ）前記変異を誘発された融合タンパク質のライブラリーをプラスミドにクローニングする工程であって、前記プラスミドが、機能的選択のためのリコンビナーゼ基質を含む、工程と
（ｄ）前記リコンビナーゼの活性により修飾されるプラスミドを選択することにより、活性のある、変異を誘発された融合タンパク質を選択する工程と
を含む、既存のキメラリコンビナーゼから新規なキメラリコンビナーゼを生成するための、基質に連結されたタンパク質進化を用いる方法。
【請求項９８】
前記リコンビナーゼ変異体のライブラリーを生成する工程が、ランダム変異誘発法を通して行われる、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
ランダム変異誘発法を通してリコンビナーゼ変異体のライブラリーを作成して変異を誘発されたリコンビナーゼドメインを生成する工程が、エラープローンＰＣＲによって行われる、請求項９７に記載の方法。
【請求項１００】
前記エラープローンＰＣＲが、１つ以上のｄＮＴＰ類似体の存在下で、前記リコンビナーゼドメインの増幅により行われる、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記ｄＮＴＰ類似体が、ｄＰＴＰおよび８−オキソ−ｄＧＴＰである、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記変異を誘発されたリコンビナーゼドメインと、変異を誘発されていないＤＮＡ結合ドメインと融合させて、変異を誘発された融合タンパク質のライブラリーを生成する工程が、オーバーラップＰＣＲを用いて行われる、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０３】
工程（ｄ）の選択法が、一方がＴｎ３を用いる使用に適し、もう一方がＧｉｎを用いる使用に適している２種類の異なるスペーサー配列間の組換えを用いて、ハイブリッドスペーサー配列を含む単一の組換え部位とし、その後に前記ハイブリッドスペーサー配列と相補的であるオリゴヌクレオチドを用いる増幅が続く、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０４】
前記ハイブリッドスペーサー配列が、ＴＣＣＡＡＡＡＣＣＡＴＡＡＴＡＴＴＴＣＧ（配列番号６３３）である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記選択法が、相同組換えの可能性を排除する、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０６】
前記方法が、ＰＣＲシャフリングを用いる複数ラウンドの選択の後に前記活性変異体の組換えの工程をさらに含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０７】
前記ＰＣＲシャフリングが、３ラウンドの選択の後に行われる、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記方法が、活性のある、変異を誘発された融合タンパク質の再クローニングの工程をさらに含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記方法が、選択により作製された１つ以上の融合タンパク質の配列決定の工程をさらに含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項１１０】
前記基質がゲノムである請求項９７に記載の方法。
【請求項１１１】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインである、請求項９７に記載の方法。
【請求項１１２】
（ａ）ゲノム中に有害遺伝子を有する個体に、請求項１に記載の部位特異的リコンビナーゼをコードする核酸をその中に含む組成物を投与する工程であって、前記部位特異的リコンビナーゼは、発現されると、前記有害遺伝子をゲノムから特異的に取り除く工程と
（ｂ）発現される前記部位特異的リコンビナーゼに前記有害遺伝子をゲノムから特異的に取り除かせる工程と
を含む、有害遺伝子が組換え切除により取り除かれる遺伝子治療のための方法。
【請求項１１３】
前記有害遺伝子が、悪性腫瘍関連遺伝子；接合部型表皮水疱症に関連する欠陥遺伝子；デュシェンヌ型筋ジストロフィーに関連する欠陥遺伝子；鎌形赤血球貧血、サラセミア、およびその他の異常ヘモグロビン症から成る群から選択される異常ヘモグロビン症に関連する欠陥遺伝子；重症複合免疫不全症に関連する欠陥遺伝子；ゴーシェ病に関連する欠陥遺伝子；嚢胞性繊維症に関連する欠陥遺伝子；血友病に関連する欠陥遺伝子；ならびに家族性高コレステロール血症に関連する欠陥遺伝子から成る群から選択される、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
（ａ）ゲノム中に有害遺伝子を有する個体に、請求項１に記載の部位特異的リコンビナーゼをコードする核酸を投与する工程であって、前記部位特異的リコンビナーゼは、発現されると、前記有害遺伝子を前記ゲノムから特異的に取り除く工程と
（ｂ）前記発現される部位特異的リコンビナーゼに前記有害遺伝子を前記ゲノムから特異的に取り除かせる工程と
（ｃ）前記個体に、前記有害遺伝子のための機能性置換遺伝子をその中に含む核酸を投与する工程と
（ｄ）前記機能性置換遺伝子を前記部位特異的リコンビナーゼに触媒される組換え組込みにより前記ゲノムに挿入する工程と
を含む、有害遺伝子が組換え切除により取り除かれ、その後に組換え組込みにより置き換えられる、遺伝子治療のための方法。
【請求項１１５】
前記有害遺伝子が、悪性腫瘍関連遺伝子；接合部型表皮水疱症に関連する欠陥遺伝子；デュシェンヌ型筋ジストロフィーに関連する欠陥遺伝子；鎌形赤血球貧血、サラセミア、およびその他の異常ヘモグロビン症から成る群から選択される異常ヘモグロビン症に関連する欠陥遺伝子；重症複合免疫不全症に関連する欠陥遺伝子；ゴーシェ病に関連する欠陥遺伝子；嚢胞性繊維症に関連する欠陥遺伝子；血友病に関連する欠陥遺伝子；ならびに家族性高コレステロール血症に関連する欠陥遺伝子から成る群から選択される、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
ゲノムの中に有害遺伝子をもつ個体に、（１）改善された機能をもつ遺伝子をその中に含むＤＮＡセグメント、および（２）改善された機能をもつ遺伝子をその中に含むＤＮＡセグメントを有害遺伝子のゲノム遺伝子座に組み込むように作用する、少なくとも１種類の請求項１に記載のキメラリコンビナーゼを投与する工程を含む、治療的組込みが有害遺伝子の構造または機能を崩壊し、改善された機能をもつ遺伝子を選択されたゲノム遺伝子座の中に送達するために行われる、遺伝子治療のための方法。
【請求項１１７】
前記方法が、天然の組換え部位で作用する少なくとも１種類の天然に存在するセリンリコンビナーゼを投与する工程をさらに含む、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
（ａ）治療有効量の請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質；および
（ｂ）医薬品として許容される担体
を含む医薬組成物。
【請求項１１９】
（ａ）請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質をコードする治療有効量の核酸配列、および
（ｂ）医薬品として許容される担体
を含む医薬組成物。
【請求項１２０】
前記核酸配列がＤＮＡである、請求項１１９に記載の医薬組成物。
【請求項１２１】
前記核酸配列が遺伝子治療のための送達系に組み込まれている、請求項１１９に記載の医薬組成物。
【請求項１２２】
前記遺伝子治療のための送達系がウイルス系である、請求項１２１に記載の医薬組成物。
【請求項１２３】
前記遺伝子治療のための送達系が非ウイルス系である、請求項１２１に記載の医薬組成物。
【請求項１２４】
前記請求項１に記載のキメラリコンビナーゼに触媒される組換えの作用によって作製されるトランスジェニック生物。
【請求項１２５】
前記トランスジェニック生物が真核生物である、請求項１２４に記載のトランスジェニック生物。
【請求項１２６】
前記真核生物が哺乳類である、請求項１２５に記載のトランスジェニック生物。
【請求項１２７】
前記トランスジェニック哺乳類が、前記トランスジェニック哺乳類の属する哺乳類の種により通常産生されない産物を産生する、請求項１２６に記載のトランスジェニック哺乳類。
【請求項１２８】
前記真核生物が昆虫である、請求項１２５に記載のトランスジェニック生物。
【請求項１２９】
前記トランスジェニック昆虫が、その昆虫の繁殖性または疾病または経済的な損害を引き起こすその昆虫の能力を低下させるように改変されている、請求項１２８に記載のトランスジェニック昆虫。
【請求項１３０】
前記真核生物が植物である、請求項１２５に記載のトランスジェニック生物。
【請求項１３１】
前記トランスジェニック植物が、前記トランスジェニック植物の属する植物の種により通常産生されない産物を産生する、請求項１３０に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１３２】
前記トランスジェニック植物が、改善された生育特性、低下した栄養要求量、または改善された栄養分を有するように改変されている、請求項１３０に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１３３】
前記トランスジェニック生物が酵母である、請求項１２４に記載のトランスジェニック生物。
【請求項１３４】
前記トランスジェニック生物が細菌である、請求項１２４に記載のトランスジェニック生物。
【請求項１】
ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインに機能するように連結されたセリンリコンビナーゼを含むキメラリコンビナーゼタンパク質であって、前記キメラリコンビナーゼタンパク質は、前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインにより特異的に結合されるＤＮＡ部位で部位特異的組換えを触媒し、前記セリンリコンビナーゼは、前記キメラタンパク質の構成において組換えを効率的に触媒するように選択され、または改良される、キメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項２】
前記セリンリコンビナーゼドメインが、一般的な鎖交換機構を触媒する求核性の触媒セリン残基を含むリコンビナーゼドメインである、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項３】
前記セリンリコンビナーゼが、（ａ）Ｔｎ３（ＥｃｏＴｎ３としても公知）；Ｈｉｎ（ＳｔｙＨｉｎとしても公知）；Ｇｉｎ（ＭｕＧｉｎとしても公知）；Ｓｉｎ；Ｂｅｔａ；Ｐｉｎ；Ｍｉｎ；Ｄｉｎ；Ｃｉｎ；ＥｃｏＴｎ２１；ＳｆａＴｎ９１７；ＢｍｅＴｎ５０８３；Ｂｍｅ５３；Ｃｐｅ；ＳａｕＳＫＩ；ＳａｕＳＫ４１；ＳａｕＴｎ５５２；Ｒａｎ；Ａａｃ；Ｌｌａ；ｐＭＥＲ０５；Ｍｌｏ９２；Ｍｌｏ９０；Ｒｒｈ；Ｐｊｅ；Ｒｅｑ；ＰｐｓＴｎ５５０１；Ｐａｅ；Ｘａｎ；ＩＳＸｃ５；Ｓｐｙ；ＲｈｉｚＹ４ｃＧ；ＳａｒｐＮＬ１；ＳｓｏｌＳＣ１９０４ａ；ＳｓｏｌＳＣ１９０４ｂ；ＳｓｏｌＳＣ１９１３；Ａａｍ６０６；ＭｊａＭ００１４；Ｐａｂ；ＨｐｙｌＳ６０７；ＭｔｕｌＳ＿Ｙ３４９；ＭｔｕＲｖ２７９２ｃ；ＭｔｕＲｖ２９７９ｃ；ＭｔｕＲｖ３８２８ｃ；ＭｔｕＲｖ０９２１；ＭｃｅＲｖ０９２１；ＴｎｐＸ；ＴｎｄＸ；ＷｗＫ；ラクトコッカスファージＴＰ９０１−１セリンリコンビナーゼ；連鎖球菌ファージφ３７０．１セリンリコンビナーゼ；ファージＡ１１８セリンリコンビナーゼ；ストレプトミセス・セリカラー染色体ＳＣ３Ｃ８．２４セリンリコンビナーゼ；ストレプトミセス・セリカラー染色体ＳＣ２Ｅ１．３７セリンリコンビナーゼ；ストレプトミセス・セリカラー染色体ＳＣＤ７８．０４ｃセリンリコンビナーゼ；ストレプトミセス・セリカラー染色体ＳＣ８Ｆ４．１５ｃセリンリコンビナーゼ；ストレプトミセス・セリカラー染色体ＳＣＤ１２Ａ．２３セリンリコンビナーゼ；ストレプトミセス・セリカラー染色体ＳＣＨ１０．３８ｃセリンリコンビナーゼ；ストレプトミセス・セリカラー染色体ＳＣＣ８８．１４セリンリコンビナーゼ；ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ファージφＣ３１セリンリコンビナーゼ；ストレプトミセスファージＲ４セリンリコンビナーゼ；バチルス属菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ファージφ１０５セリンリコンビナーゼ；バチルス属菌ファージＳＰＢｃ２セリンリコンビナーゼ；バチルス属菌プロファージＳＫＩＮセリンリコンビナーゼ；黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｃｃｒＡセリンリコンビナーゼ；黄色ブドウ球菌ｃｃｒＢセリンリコンビナーゼ；結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ファージＢｘｂ１セリンリコンビナーゼ；結核菌プロファージφＲＶ１セリンリコンビナーゼ；ＹＢＣＫ＿ＥＣＯＬＩ；Ｙ４ｂＡ；Ｂｊａ；Ｓｐｎ；Ｃａｃ１９５６；およびＣａｃ１９５４；ならびに
（ｂ）（ａ）のセリンリコンビナーゼの変異タンパク質
から成る群から選択される、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項４】
前記セリンリコンビナーゼが、Ｇｉｎ、Ｈｉｎ、Ｔｎ３、Ｓｉｎ、Ｂｅｔａ、Ｐｉｎ、Ｍｉｎ、Ｄｉｎ、およびＣｉｎならびにＧｉｎの変異タンパク質、Ｈｉｎの変異タンパク質、Ｓｉｎの変異タンパク質、Ｂｅｔａの変異タンパク質、Ｐｉｎの変異タンパク質、Ｍｉｎの変異タンパク質、Ｄｉｎの変異タンパク質、Ｃｉｎの変異タンパク質、Ｔｎ３の変異タンパク質から成る群から選択される、請求項３に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項５】
前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインが、ヘキサヌクレオチドと結合する２指向性のジンクフィンガー結合ドメインである、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項６】
前記キメラリコンビナーゼタンパク質がＴｎ３ＧＡＧＧＡＧであり、かつ、６塩基対配列ＧＡＧＧＡＧ（配列番号１）と選好的に結合する２指向性のジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインとリンカーによって融合したＴｎ３由来のドメインを有する、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項７】
前記キメラリコンビナーゼタンパク質がＨｉｎＧＡＧＧＡＧであり、かつ、前記６塩基対配列ＧＡＧＧＡＧ（配列番号１）と選好的に結合する２指向性のジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインとリンカーを介して融合したＨｉｎ由来のドメインを有する、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項８】
前記キメラリコンビナーゼタンパク質がＧｉｎＧＡＧＧＡＧであり、かつ、前記６塩基対配列ＧＡＧＧＡＧ（配列番号１）と選好的に結合する２指向性のジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインとリンカーを介して融合したＧｉｎ由来のドメインを有する、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項９】
前記キメラリコンビナーゼタンパク質がＴｎ３Ｃｈ１５Ｇであり、かつ、Ｔｎ３に由来する変異セリンリコンビナーゼを有する、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項１０】
前記キメラリコンビナーゼタンパク質がＧｉｎＬ７Ｃ７Ｈ１であり、かつ、Ｇｉｎに由来する変異セリンリコンビナーゼを有する、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項１１】
前記キメラリコンビナーゼタンパク質がＧｉｎＬ７Ｃ７Ｐ２であり、かつ、Ｇｉｎに由来する変異セリンリコンビナーゼを有する、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項１２】
（１）Ｔｎ３セリンリコンビナーゼ触媒ドメイン中のＧ７０Ｓ、Ｄ１０２Ｙ、またはＥ１２４Ｑ；（２）Ｈｉｎセリンリコンビナーゼ触媒ドメイン中のＨ１０７Ｙ；（３）Ｇｉｎセリンリコンビナーゼ触媒ドメイン中のＭ７０Ｖ、Ｔ９６Ａ、またはＨ１０６Ｙ；あるいは（４）Ｔｎ３セリンリコンビナーゼ触媒ドメイン中のＩ１２Ｖ、Ｄ１３Ｇ、Ｋ６５Ｒ、Ｍ７３Ｖ、Ｉ８０Ｍ、Ｖ１０８Ａ、Ｋ５３Ｅ、またはＫ１５１Ｍの変異のうち１つまたは複数の変異が、ＨｉｎおよびＧｉｎ中の対応する相同残基の変異とともに、前記セリンリコンビナーゼに導入される、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項１３】
前記セリンリコンビナーゼが、次の変異、Ｄ１２Ｇ、Ｎ１４Ｓ、Ｎ２０Ｄ、Ｋ５０Ｅ、Ｍ７０Ｖ、Ｉ９４Ｖ、Ｙ１０９Ｈ、Ｍ１１４Ｖ、およびＫ１４８Ｍ、を全て含むＧｉｎドメインである、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼ。
【請求項１４】
前記セリンリコンビナーゼが、次の変異、Ｄ１２Ｇ、Ｎ１４Ｓ、Ｎ２０Ｄ、Ｋ５０Ｅ、Ｍ７０Ｖ、Ｉ９４Ｖ、Ｍ１１４Ｖ、およびＫ１１４８Ｍを全て含むＧｉｎドメインである、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼ。
【請求項１５】
前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインが、９塩基対に結合する３指向性のジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインである、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項１６】
前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインが、１２塩基対に結合する４指向性のジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインである、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項１７】
前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインが、１５塩基対に結合する５指向性のジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインである、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項１８】
前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインが、１８塩基対に結合する６指向性のジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインである、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項１９】
前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインが、前記９塩基対配列ＧＧＡＧＧＧＧＴＧ（配列番号３）と結合する、請求項１５に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項２０】
前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインが、前記９塩基対配列ＧＣＡＧＴＧＧＣＧ（配列番号４）と結合する、請求項１５に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項２１】
前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインに、配列番号５〜配列番号７４から成る群から選択される配列ＡＮＮのトリヌクレオチドに結合している少なくとも１つの配列が含まれる、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項２２】
前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインに、配列番号４４〜配列番号５３から成る群から選択される前記配列ＡＮＮのトリヌクレオチドに結合している少なくとも１つの配列が含まれる、請求項２１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項２３】
前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインに、配列番号７５〜配列番号１３１から成る群から選択される配列ＡＧＣのトリヌクレオチドに結合している少なくとも１つの配列が含まれる、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項２４】
前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインに、配列番号７５〜配列番号８４から成る群から選択される前記配列ＡＧＣのトリヌクレオチドに結合している少なくとも１つの配列が含まれる、請求項２３に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項２５】
前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインに、配列番号１３２〜配列番号１５６から成る群から選択される配列ＣＮＮのトリヌクレオチドに結合している少なくとも１つの配列が含まれる、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項２６】
前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインに、配列番号１５７〜配列番号２６６から成る群から選択される前記配列ＧＮＮのトリヌクレオチドに結合している少なくとも１つの配列が含まれる、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項２７】
前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインに、配列番号１５７〜配列番号１７２から成る群から選択される前記配列ＧＮＮのトリヌクレオチドに結合している少なくとも１つの配列が含まれる、請求項２６に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項２８】
前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインが、配列番号２６７〜配列番号６２３および配列番号６５３〜配列番号７０５から成る群から選択される配列ＴＮＮのトリヌクレオチドに結合している少なくとも１つの配列を含む、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項２９】
前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインが、配列番号２６７〜配列番号３１１から成る群から選択される前記配列ＴＮＮのトリヌクレオチドに結合している少なくとも１つの配列を含む、請求項２８に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項３０】
前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインが、トリプレット結合ドメイン間に位置する少なくとも１つのオリゴペプチドリンカーを含む、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項３１】
前記オリゴペプチドリンカーが、ＴＧＥＫＰ（配列番号６２４）、ＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＴＧＥＫＰ（配列番号６２５）、ＬＲＱＫＤＧＧＧＳＥＲＰ（配列番号６２６）、ＬＲＱＫＤＧＥＲＰ（配列番号６２７）、ＧＧＲＧＲＧＲＧＲＱ（配列番号６２８）、ＱＮＫＫＧＧＳＧＤＧＫＫＫＱＨＩ（配列番号６２９）、ＴＧＧＥＲＰ（配列番号６３０）、ＡＴＧＥＫＰ（配列番号６３１）、およびＧＧＧＳＧＧＧＧＥＧＰ（配列番号７０６）から成る群から選択される、請求項３０に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項３２】
前記オリゴペプチドリンカーが、ＴＧＥＫＰ（配列番号６２４）である、請求項３１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項３３】
１から５の保存的アミノ酸置換による請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質に由来するキメラリコンビナーゼタンパク質であって、前記保存的アミノ酸置換が各々、Ａｌａ／ＧｌｙまたはＳｅｒ；Ａｒｇ／Ｌｙｓ；Ａｓｎ／ＧｌｎまたはＨｉｓ；Ａｓｐ／Ｇｌｕ；Ｃｙｓ／Ｓｅｒ；Ｇｌｎ／Ａｓｎ；Ｇｌｙ／Ａｓｐ；Ｇｌｙ／ＡｌａまたはＰｒｏ；Ｈｉｓ／ＡｓｎまたはＧｌｎ；Ｉｌｅ／ＬｅｕまたはＶａｌ；Ｌｅｕ／ＩｌｅまたはＶａｌ；Ｌｙｓ／ＡｒｇまたはＧｌｎまたはＧｌｕ；Ｍｅｔ／ＬｅｕまたはＴｙｒまたはＩｌｅ；Ｐｈｅ／ＭｅｔまたはＬｅｕまたはＴｙｒ；Ｓｅｒ／Ｔｈｒ；Ｔｈｒ／Ｓｅｒ；Ｔｒｐ／Ｔｙｒ；Ｔｙｒ／ＴｒｐまたはＰｈｅ；Ｖａｌ／ＩｌｅまたはＬｅｕから選択され、前記保存的アミノ酸置換に由来する前記キメラリコンビナーゼタンパク質は、前記未変異のキメラリコンビナーゼと同じ組換えに対するＤＮＡ配列特異性を有し、その基質に対する結合親和性が、前記未変異のキメラリコンビナーゼの基質に対する結合親和性の約８０％以上であり、そのＶｍａｘが、前記未変異のキメラリコンビナーゼのＶｍａｘの約８０％以上である、キメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項３４】
前記キメラリコンビナーゼタンパク質が、少なくとも１つの追加のドメインをさらに含む、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項３５】
前記追加のドメインが、精製タグ、酵素ドメイン、リガンド結合ドメイン、および細胞透過性ドメインから成る群から選択される、請求項３４に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項３６】
前記追加のドメインが酵素ドメインであり、前記酵素ドメインが、蛍光または生物発光を介して検出できる光の生成を触媒する、請求項３５に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項３７】
請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質をコードする、単離および精製された核酸配列。
【請求項３８】
ＤＮＡである、請求項３７に記載の核酸配列。
【請求項３９】
請求項６に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質をコードする、単離および精製された核酸配列。
【請求項４０】
ＤＮＡである、請求項３９に記載の核酸配列。
【請求項４１】
請求項７に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質をコードする、単離および精製された核酸配列。
【請求項４２】
ＤＮＡである、請求項４１に記載の核酸配列。
【請求項４３】
請求項８に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質をコードする、単離および精製された核酸配列。
【請求項４４】
ＤＮＡである、請求項４３に記載の核酸配列。
【請求項４５】
（ａ）（ｉ）前記キメラリコンビナーゼタンパク質が前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインにより特異的に結合されているＤＮＡ部位で部位特異的組換えを触媒するように、ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインに作動可能に連結されたセリンリコンビナーゼ、
（ｉｉ）キメラリコンビナーゼＴｎ３ＧＡＧＧＡＧ、
（ｉｉｉ）キメラリコンビナーゼＨｉｎＧＡＧＧＡＧ、および
（ｉｖ）キメラリコンビナーゼＧｉｎＧＡＧＧＡＧ
から成る群から選択されるキメラリコンビナーゼタンパク質をコードする、単離および精製された核酸配列と
（ｂ）（ａ）の配列と少なくとも９５％同一である、単離および精製された核酸配列であって、前記核酸配列が前記配列の活性を塩基の置換が行われるまで保持しており、かつ、前記核酸配列によりコードされるタンパク質の任意の活性および核酸レベルで発現される前記核酸配列の任意の活性を含む核酸配列と
から成る群から選択される、単離および精製された核酸配列。
【請求項４６】
ＤＮＡである、請求項４５に記載の核酸配列。
【請求項４７】
請求項３８に記載のＤＮＡ配列を含むベクター。
【請求項４８】
発現ベクターである、請求項４７に記載のベクター。
【請求項４９】
請求項４０に記載のＤＮＡ配列を含むベクター。
【請求項５０】
発現ベクターである、請求項４９に記載のベクター。
【請求項５１】
請求項４２に記載のＤＮＡ配列を含むベクター。
【請求項５２】
発現ベクターである、請求項５１に記載のベクター。
【請求項５３】
請求項４４に記載のＤＮＡ配列を含むベクター。
【請求項５４】
発現ベクターである、請求項５３に記載のベクター。
【請求項５５】
請求項４６に記載のＤＮＡ配列を含むベクター。
【請求項５６】
発現ベクターである、請求項５５に記載のベクター。
【請求項５７】
請求項３７に記載の核酸配列で形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項５８】
請求項３９に記載の核酸配列で形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項５９】
請求項４１に記載の核酸配列で形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項６０】
請求項４３に記載の核酸配列で形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項６１】
請求項４５に記載の核酸配列で形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項６２】
請求項４７に記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項６３】
請求項４９に記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項６４】
請求項５１に記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項６５】
請求項５３に記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項６６】
請求項５５に記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項６７】
（ａ）少なくとも１種類の請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質に結合している、少なくとも２つの部位をその中に有するＤＮＡ配列を提供する工程であって、前記部位がスペーサーによって分離されている工程と
（ｂ）前記ＤＮＡと前記キメラリコンビナーゼとを、少なくとも一つのキメラリコンビナーゼが部位特異的組換えを触媒する条件下で反応させる工程であって、前記ＤＮＡ配列の両方の鎖が前記キメラリコンビナーゼと特異的に結合する二つの部位の間で切断され、部位特異的組換えが起こる工程と
を含む、部位特異的組換えを行う方法。
【請求項６８】
部位特異的組換え事象が反転である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
部位特異的組換え事象が組込みである、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
部位特異的組換え事象が分離である、請求項６７に記載の方法。
【請求項７１】
（ａ）第１の配列および第２の配列からなる２つのＤＮＡ配列を提供する工程であって、前記第１の配列および前記第２の配列の各々が少なくとも１種類の請求項１に記載のキメラリコンビナーゼに結合する部位をその中に有する工程と
（ｂ）前記第１の配列および第２の配列と、少なくとも一つの前記キメラリコンビナーゼとを、前記キメラリコンビナーゼが部位特異的組換えを触媒する条件において反応させる工程であって、第１の配列および第２の配列の両方の鎖が切断され、第１の配列および第２の配列が関与する部位特異的組換えが行われる工程と
を含む、部位特異的組換え事象を行う方法。
【請求項７２】
前記第１の配列および前記第２の配列を伴って行われる組換え事象が、一部のＤＮＡが失われるかまたは付加され、かつ、産物の部位が少なくとも１種類のキメラリコンビナーゼとの反応に適合する基質ではない、非保存的組換え事象である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記組換え事象が、適合する組換え部位の１つの対または両方の対のいずれかが、一方向性の組換えに適しているカセット交換である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
（ａ）第１の配列および第２の配列からなる２つのＤＮＡ配列を提供する工程であって、前記第１の配列および前記第２の配列の一方が、少なくとも１種類の請求項１に記載のキメラリコンビナーゼに結合している部位をその中に有し、かつ、前記第１の配列および前記第２の配列のもう一方が、少なくとも１種類の天然に存在するセリンリコンビナーゼに結合する部位をその中に有する工程と
（ｂ）前記第１の配列および前記第２の配列と前記少なくとも一つのキメラリコンビナーゼおよび前記天然に存在するセリンリコンビナーゼとを、前記キメラリコンビナーゼおよび前記天然に存在するセリンリコンビナーゼが部位特異的組換えを触媒する条件下で反応させる工程であって、前記第１の配列と前記第２の配列の両方の鎖が切断され、前記第１の配列および前記第２の配列が関与する部位特異的組換え事象がおこる工程と
を含む、部位特異的組換え事象を行う方法。
【請求項７５】
（ａ）組換えのための２つの部位をその中に有するＤＮＡ配列を提供する工程であって、各部位が、
（ｉ）キメラリコンビナーゼ半部位の最適な結合部位と比較して、実質的に低い親和性で前記少なくとも１種類のキメラリコンビナーゼと結合している、少なくとも１種類の請求項１に記載のキメラリコンビナーゼのための変異結合部位、および
（ｉｉ）最適に結合している少なくとも１種類のキメラリコンビナーゼ半部位のための結合部位を含み、これらの部位が、少なくとも１種類の請求項１に記載のキメラリコンビナーゼと特異的に結合し、これらの部位がスペーサーによって分離されている、工程と
（ｂ）前記ＤＮＡ配列と少なくとも１種類のキメラリコンビナーゼとを前記少なくとも１種類のキメラリコンビナーゼが部位特異的組換えを触媒する条件下で反応させる工程であって、前記ＤＮＡ配列の両方の鎖が前記キメラリコンビナーゼと特異的に結合する二つの部位の間で切断されることにより部位特異的組換えが行われ、部位特異的組換え事象が組み込みであり、組み込みの結果が安定するようにキメラリコンビナーゼ半部位のための変異結合部位のホモ二量体が組換えに対して非機能的に形成される、工程と
を含む、ＤＮＡ分子において安定な組込みを行う方法。
【請求項７６】
（ａ）少なくとも１種類の請求項１に記載の第１のキメラリコンビナーゼと反応性である、組換えのための第１の部位をその中に有する第１のＤＮＡ配列を提供する工程と
（ｂ）少なくとも１種類の請求項１に記載の第２のキメラリコンビナーゼと反応性である、組換えのための第２の部位をその中に有する第２のＤＮＡ配列を、前記第１の部位と前記第２の部位が機能的に直交するように提供する工程と
（ｃ）前記第１のＤＮＡ配列を前記少なくとも１種類の第１のキメラリコンビナーゼと反応させ、前記第２のＤＮＡ配列を前記少なくとも１種類の第２のキメラリコンビナーゼと反応させて組換えをもたらす工程と
を含む、ＤＮＡ分子において組換えを行う方法。
【請求項７７】
カセット交換を実行するために、前記組換えのための第１の部位かまたは前記組換えのための第２の部位のいずれかでの組込みに続いて、組込みに用いられていない前記第１および前記第２の部位の一方で切除が行われる、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
組換えの結果が反転となる、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
組換えの結果が分離となる、請求項７７に記載の方法。
【請求項８０】
（ａ）２つのプラスミド、
（ｉ）第１の触媒ドメインおよび第１のジンクフィンガードメインを含む、請求項１に記載の第１のキメラリコンビナーゼを発現し、かつ第１の抗生物質抵抗性遺伝子を発現する第１のプラスミド、および
（ｉｉ）第２の触媒ドメインおよび第２のジンクフィンガードメインを含む、請求項１に記載の第２のキメラリコンビナーゼを発現し、かつ第２の抗生物質抵抗性遺伝子を発現している、第２のプラスミドであって、前記第１の触媒ドメインと前記第２の触媒ドメインが異なり、前記第１のジンクフィンガードメインと前記第２のジンクフィンガードメインが異なり、かつ、前記第１および前記第２の抗生物質抵抗性遺伝子が２つの異なる抗生物質に対する抵抗性を付与する第２のプラスミド
を生成する工程と
（ｂ）第１の遺伝子のコード領域および第２の遺伝子のコード領域を、２つのキメラリコンビナーゼによるプラスミド内切除を防ぐように、請求項１に記載の第１のキメラリコンビナーゼおよび請求項１に記載の第２のキメラリコンビナーゼの１つと各々が結合している非反復ホモ二量体部位で隣接することにより２つのカセットを構築する工程と
（ｃ）各プラスミドに１つのカセットを挿入して、カセットをその中に含む２つのプラスミドを生成する工程と
（ｄ）細菌宿主に、カセットを含む前記第１のプラスミドおよびカセットを含む前記第２のプラスミドを、組換えが起こるように同時導入する工程と
を含む、カセット交換を促進する方法。
【請求項８１】
組換えが、プラスミド内カセット交換である請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
組換えが、染色体遺伝子とプラスミドの間である請求項８０に記載の方法。
【請求項８３】
組換えが、導入ＤＮＡと染色体遺伝子の間である請求項８０に記載の方法。
【請求項８４】
組換えが、カセット交換により促進される切除である請求項８０に記載の方法。
【請求項８５】
（ａ）２つのプラスミド、
（ｉ）第１の触媒ドメインおよび第１のジンクフィンガードメインを含み、請求項１に記載の第１のキメラリコンビナーゼを発現し、かつ第１の抗生物質抵抗性遺伝子を発現する第１のプラスミドであって、前記第１のキメラリコンビナーゼは変異または選択されて第１の遺伝子の内在性隣接配列と結合する、第１のプラスミド、および
（ｉｉ）第２の触媒ドメインおよび第２のジンクフィンガードメインを含み、請求項１に記載の第２のキメラリコンビナーゼを発現し、かつ第２の抗生物質抵抗性遺伝子を発現している第２のプラスミドであって、前記第２のキメラリコンビナーゼは変異または選択されて第２の遺伝子の内在性隣接配列と結合し、前記第１の触媒ドメインと前記第２の触媒ドメインが異なり、かつ前記第１のジンクフィンガードメインと前記第２のジンクフィンガードメインが異なるように、かつ、前記第１および前記第２の抗生物質抵抗性遺伝子が２つの異なる抗生物質に対する抵抗性を付与する第２のプラスミド
を生成する工程と
（ｂ）第１のカセットが第１の内在性隣接領域に隣接される第１の遺伝子を含み、第２のカセットが第２の内在性隣接領域に隣接される第２の遺伝子を含む２つのカセットを、２つのキメラリコンビナーゼによるプラスミド内切除を防ぐように、請求項１に記載の第１のキメラリコンビナーゼおよび請求項１に記載の第２のキメラリコンビナーゼの１つと各々が結合している非反復ホモ二量体部位をその中に含む前記２つの内在性隣接領域の各々により構築する工程と
（ｃ）各プラスミドに１つのカセットを挿入して、カセットをその中に含む２つのプラスミドを生成する工程と
（ｄ）細菌宿主に、カセットを含む前記第１のプラスミドおよびカセットを含む前記第２のプラスミドを、組換えが起こるように同時導入する工程と
を含む、カセット交換を促進する方法。
【請求項８６】
前記組換えが、プラスミド内カセット交換である、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記組換えが、染色体遺伝子とプラスミドの間である、請求項８５に記載の方法。
【請求項８８】
前記組換えが、導入ＤＮＡと染色体遺伝子の間である、請求項８５に記載の方法。
【請求項８９】
前記組換えが、カセット交換により促進される切除である、請求項８５に記載の方法。
【請求項９０】
（ａ）ランダム化されたヌクレオチドを含有するプライマーを用いて２つの適合するプラスミド中のジンクフィンガー結合部位を含む単一の半部位ライブラリーを生成する工程と
（ｂ）工程（ａ）で生成された前記単一の半部位ライブラリーを適当な宿主を同時導入して形質転換体を生成する工程と
（ｃ）選択用の２種類の抗生物質を用いて前記形質転換体を同時に維持する工程と
（ｄ）同時に維持された前記形質転換体からプラスミドを精製する工程と
（ｅ）前記適切な宿主を低い濃度で再形質転換する工程と
（ｆ）前記再形質転換宿主を前記２種類の抗生物質を含有する培地で増殖させる工程と
（ｇ）前記２種類の抗生物質を含有する培地で増殖するコロニーをＰＣＲにより一方向性の組込みについてスクリーニングして、シス不活性化ジンクフィンガー結合部位を特定する工程と
を含む、シス不活性化ジンクフィンガー結合部位を特定するための方法。
【請求項９１】
前記宿主が、細菌宿主、酵母細胞宿主、昆虫細胞宿主、および哺乳類細胞宿主から成る群から選択される請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記宿主が細菌宿主であり、前記細菌宿主が大腸菌である、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
（ｈ）組換え産物によってのみ発現される別のレポーター遺伝子を含める工程と
（ｉ）前記レポーター遺伝子の活性についてスクリーニングする工程と
をさらに含む、請求項９０に記載の方法。
【請求項９４】
請求項９０に記載の方法により見出される、シス不活性化ジンクフィンガー結合部位。
【請求項９５】
（ａ）ランダム化されたヌクレオチドを含有するプライマーを用いて２つの適合するプラスミド中のスペーサー配列を含む単一の半部位ライブラリーを生成する工程と
（ｂ）工程（ａ）で生成された前記単一の半部位ライブラリーに適した宿主を同時導入して形質転換体を生成する工程と
（ｃ）選択用の２種類の抗生物質を用いて前記形質転換体を同時に維持する工程と
（ｄ）前記同時に維持された前記形質転換体からプラスミドを精製する工程と
（ｅ）前記適切な宿主を低い濃度で再形質転換する工程と
（ｆ）前記再形質転換宿主を前記２種類の抗生物質を含有する培地で増殖させる工程と
（ｇ）前記２種類の抗生物質を含有する培地で増殖するコロニーをＰＣＲにより一方向性の組込みについてスクリーニングして、シス不活性化スペーサー配列を特定する工程と
を含む、シス不活性化スペーサー配列を特定するための方法。
【請求項９６】
（ａ）標的基質を生成する工程であって、前記標的基質が、２つの異なるＤＮＡ結合ドメイン認識配列、選択標的配列およびトランス活性化因子配列をその中に含む組換え部位をその中に含む、工程と
（ｂ）前記標的基質を、トランス活性化因子配列と完全に相補的である請求項１に記載の固定されたキメラリコンビナーゼの存在下、異なるＤＮＡ結合ドメインを含む請求項１に記載のキメラリコンビナーゼのライブラリーとともにインキュベートして、単一の半部位ライブラリーを生成する工程と
（ｃ）工程（ｂ）で生成された前記単一の半部位ライブラリーに適した宿主を同時導入して形質転換体を生成する工程と
（ｄ）選択用の２種類の抗生物質を用いて前記形質転換体を同時に維持する工程と
（ｅ）前記同時に維持された形質転換体からプラスミドを精製する工程と
（ｆ）前記適切な宿主を低い濃度で再形質転換する工程と
（ｇ）前記再形質転換宿主を前記２種類の抗生物質を含有する培地で増殖させる工程と
（ｈ）前記２種類の抗生物質を含有する培地で増殖するコロニーをＰＣＲにより一方向性の組込みについてスクリーニングして、シス不活性化ＤＮＡ結合ドメインを特定する工程と
を含む、シス不活性化ＤＮＡ結合ドメインを特定するための方法。
【請求項９７】
（ａ）リコンビナーゼ変異体のライブラリーを生成して、変異を誘発されたリコンビナーゼドメインを生成する工程と
（ｂ）変異を誘発されたリコンビナーゼドメインと、変異を誘発されていないＤＮＡ結合ドメインと融合させて、変異を誘発された融合タンパク質のライブラリーを生成する工程と
（ｃ）前記変異を誘発された融合タンパク質のライブラリーをプラスミドにクローニングする工程であって、前記プラスミドが、機能的選択のためのリコンビナーゼ基質を含む、工程と
（ｄ）前記リコンビナーゼの活性により修飾されるプラスミドを選択することにより、活性のある、変異を誘発された融合タンパク質を選択する工程と
を含む、既存のキメラリコンビナーゼから新規なキメラリコンビナーゼを生成するための、基質に連結されたタンパク質進化を用いる方法。
【請求項９８】
前記リコンビナーゼ変異体のライブラリーを生成する工程が、ランダム変異誘発法を通して行われる、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
ランダム変異誘発法を通してリコンビナーゼ変異体のライブラリーを作成して変異を誘発されたリコンビナーゼドメインを生成する工程が、エラープローンＰＣＲによって行われる、請求項９７に記載の方法。
【請求項１００】
前記エラープローンＰＣＲが、１つ以上のｄＮＴＰ類似体の存在下で、前記リコンビナーゼドメインの増幅により行われる、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記ｄＮＴＰ類似体が、ｄＰＴＰおよび８−オキソ−ｄＧＴＰである、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記変異を誘発されたリコンビナーゼドメインと、変異を誘発されていないＤＮＡ結合ドメインと融合させて、変異を誘発された融合タンパク質のライブラリーを生成する工程が、オーバーラップＰＣＲを用いて行われる、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０３】
工程（ｄ）の選択法が、一方がＴｎ３を用いる使用に適し、もう一方がＧｉｎを用いる使用に適している２種類の異なるスペーサー配列間の組換えを用いて、ハイブリッドスペーサー配列を含む単一の組換え部位とし、その後に前記ハイブリッドスペーサー配列と相補的であるオリゴヌクレオチドを用いる増幅が続く、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０４】
前記ハイブリッドスペーサー配列が、ＴＣＣＡＡＡＡＣＣＡＴＡＡＴＡＴＴＴＣＧ（配列番号６３３）である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記選択法が、相同組換えの可能性を排除する、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０６】
前記方法が、ＰＣＲシャフリングを用いる複数ラウンドの選択の後に前記活性変異体の組換えの工程をさらに含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０７】
前記ＰＣＲシャフリングが、３ラウンドの選択の後に行われる、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記方法が、活性のある、変異を誘発された融合タンパク質の再クローニングの工程をさらに含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記方法が、選択により作製された１つ以上の融合タンパク質の配列決定の工程をさらに含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項１１０】
前記基質がゲノムである請求項９７に記載の方法。
【請求項１１１】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインである、請求項９７に記載の方法。
【請求項１１２】
（ａ）ゲノム中に有害遺伝子を有する個体に、請求項１に記載の部位特異的リコンビナーゼをコードする核酸をその中に含む組成物を投与する工程であって、前記部位特異的リコンビナーゼは、発現されると、前記有害遺伝子をゲノムから特異的に取り除く工程と
（ｂ）発現される前記部位特異的リコンビナーゼに前記有害遺伝子をゲノムから特異的に取り除かせる工程と
を含む、有害遺伝子が組換え切除により取り除かれる遺伝子治療のための方法。
【請求項１１３】
前記有害遺伝子が、悪性腫瘍関連遺伝子；接合部型表皮水疱症に関連する欠陥遺伝子；デュシェンヌ型筋ジストロフィーに関連する欠陥遺伝子；鎌形赤血球貧血、サラセミア、およびその他の異常ヘモグロビン症から成る群から選択される異常ヘモグロビン症に関連する欠陥遺伝子；重症複合免疫不全症に関連する欠陥遺伝子；ゴーシェ病に関連する欠陥遺伝子；嚢胞性繊維症に関連する欠陥遺伝子；血友病に関連する欠陥遺伝子；ならびに家族性高コレステロール血症に関連する欠陥遺伝子から成る群から選択される、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
（ａ）ゲノム中に有害遺伝子を有する個体に、請求項１に記載の部位特異的リコンビナーゼをコードする核酸を投与する工程であって、前記部位特異的リコンビナーゼは、発現されると、前記有害遺伝子を前記ゲノムから特異的に取り除く工程と
（ｂ）前記発現される部位特異的リコンビナーゼに前記有害遺伝子を前記ゲノムから特異的に取り除かせる工程と
（ｃ）前記個体に、前記有害遺伝子のための機能性置換遺伝子をその中に含む核酸を投与する工程と
（ｄ）前記機能性置換遺伝子を前記部位特異的リコンビナーゼに触媒される組換え組込みにより前記ゲノムに挿入する工程と
を含む、有害遺伝子が組換え切除により取り除かれ、その後に組換え組込みにより置き換えられる、遺伝子治療のための方法。
【請求項１１５】
前記有害遺伝子が、悪性腫瘍関連遺伝子；接合部型表皮水疱症に関連する欠陥遺伝子；デュシェンヌ型筋ジストロフィーに関連する欠陥遺伝子；鎌形赤血球貧血、サラセミア、およびその他の異常ヘモグロビン症から成る群から選択される異常ヘモグロビン症に関連する欠陥遺伝子；重症複合免疫不全症に関連する欠陥遺伝子；ゴーシェ病に関連する欠陥遺伝子；嚢胞性繊維症に関連する欠陥遺伝子；血友病に関連する欠陥遺伝子；ならびに家族性高コレステロール血症に関連する欠陥遺伝子から成る群から選択される、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
ゲノムの中に有害遺伝子をもつ個体に、（１）改善された機能をもつ遺伝子をその中に含むＤＮＡセグメント、および（２）改善された機能をもつ遺伝子をその中に含むＤＮＡセグメントを有害遺伝子のゲノム遺伝子座に組み込むように作用する、少なくとも１種類の請求項１に記載のキメラリコンビナーゼを投与する工程を含む、治療的組込みが有害遺伝子の構造または機能を崩壊し、改善された機能をもつ遺伝子を選択されたゲノム遺伝子座の中に送達するために行われる、遺伝子治療のための方法。
【請求項１１７】
前記方法が、天然の組換え部位で作用する少なくとも１種類の天然に存在するセリンリコンビナーゼを投与する工程をさらに含む、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
（ａ）治療有効量の請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質；および
（ｂ）医薬品として許容される担体
を含む医薬組成物。
【請求項１１９】
（ａ）請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質をコードする治療有効量の核酸配列、および
（ｂ）医薬品として許容される担体
を含む医薬組成物。
【請求項１２０】
前記核酸配列がＤＮＡである、請求項１１９に記載の医薬組成物。
【請求項１２１】
前記核酸配列が遺伝子治療のための送達系に組み込まれている、請求項１１９に記載の医薬組成物。
【請求項１２２】
前記遺伝子治療のための送達系がウイルス系である、請求項１２１に記載の医薬組成物。
【請求項１２３】
前記遺伝子治療のための送達系が非ウイルス系である、請求項１２１に記載の医薬組成物。
【請求項１２４】
前記請求項１に記載のキメラリコンビナーゼに触媒される組換えの作用によって作製されるトランスジェニック生物。
【請求項１２５】
前記トランスジェニック生物が真核生物である、請求項１２４に記載のトランスジェニック生物。
【請求項１２６】
前記真核生物が哺乳類である、請求項１２５に記載のトランスジェニック生物。
【請求項１２７】
前記トランスジェニック哺乳類が、前記トランスジェニック哺乳類の属する哺乳類の種により通常産生されない産物を産生する、請求項１２６に記載のトランスジェニック哺乳類。
【請求項１２８】
前記真核生物が昆虫である、請求項１２５に記載のトランスジェニック生物。
【請求項１２９】
前記トランスジェニック昆虫が、その昆虫の繁殖性または疾病または経済的な損害を引き起こすその昆虫の能力を低下させるように改変されている、請求項１２８に記載のトランスジェニック昆虫。
【請求項１３０】
前記真核生物が植物である、請求項１２５に記載のトランスジェニック生物。
【請求項１３１】
前記トランスジェニック植物が、前記トランスジェニック植物の属する植物の種により通常産生されない産物を産生する、請求項１３０に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１３２】
前記トランスジェニック植物が、改善された生育特性、低下した栄養要求量、または改善された栄養分を有するように改変されている、請求項１３０に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１３３】
前記トランスジェニック生物が酵母である、請求項１２４に記載のトランスジェニック生物。
【請求項１３４】
前記トランスジェニック生物が細菌である、請求項１２４に記載のトランスジェニック生物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公表番号】特表２００９−５４２２２８（Ｐ２００９−５４２２２８Ａ）
【公表日】平成２１年１２月３日（２００９．１２．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５１８６３２（Ｐ２００９−５１８６３２）
【出願日】平成１９年７月５日（２００７．７．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７２８６９
【国際公開番号】ＷＯ２００８／００６０２８
【国際公開日】平成２０年１月１０日（２００８．１．１０）
【出願人】（５０１２４４２２２）ザ スクリプス リサーチ インスティテュート (33)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１２月３日（２００９．１２．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年７月５日（２００７．７．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７２８６９
【国際公開番号】ＷＯ２００８／００６０２８
【国際公開日】平成２０年１月１０日（２００８．１．１０）
【出願人】（５０１２４４２２２）ザ スクリプス リサーチ インスティテュート (33)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]