微生物から精製した真菌類免疫調節タンパク質（ＦＩＰ）とその用途
この発明は菌類でよく発現する真菌類免疫調節タンパク質(FIP)をコードする改良された核酸分子に、核酸分子を含むベクターに、前述のベクターによってトランスフォームしたホストに、前述の発明のタンパク質を発現する方法に、前述の方法に産生したこの発明のタンパク質に、この発明のタンパク質含む前述のホストの用途およびFIPを純化する方法に関する。この発明のタンパク質は広い免疫活性がある。したがって、この発明のタンパク質はさらに化粧品または薬物組成物におけるこのタンパク質の用途に、そしてこの発明のタンパク質を含む食物または食物添加物に関する。 最後に、この発明は志望者に対してFIPまたはFIPの融合したタンパク質の口服により調節免疫活性の方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は菌類でよく発現する真菌類免疫調節タンパク質(FIP)をコードする改良された核酸分子に、核酸分子を含むベクターに、前述のベクターによりトランスフォームしたホストに、前述の発明のタンパク質を発現する方法に、前述の方法で生産した本発明のタンパク質に、この発明のタンパク質含む前述のホストの用途およびFIPを純化する方法に関する。したがって、現在の発明はさらに化粧品または薬物組成物におけるこの発明のタンパク質の用途に、およびこの発明のタンパク質を含む食物または食物添加物に関する。 最後に、この発明はFIPまたはFIPの融合したタンパク質の口服によって対象に対する調節免疫活性の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
真菌子実体または菌糸からの植物性凝集素が免疫調節と肝臓保護の効果があり、それは遊離基を取り除くことができるように示した(Lin、J. M. et al., Am J Chin Med.1993; 21(1): 59-69) 。寄生木からの(L)-ガラクトシド特有の植物性凝集素は生体外に及び生体内でサイトカインの生産を高める (Gabius、H. J. et al., Anticancer Res. 1992 5月-6月; 12(3): 669-75) 。 病気モデルとしてBalb/Cマウスを使用するテストで、植物性凝集素および組換え型の植物性凝集素は腫瘍構成を抑制することができる (Couraud P.O et al., J. Biol. Chem.1989;264: 1310-1316) 。
【０００３】
Ganodermaは漢方薬のまれで貴重なハーブである。 それは5,000年間以上「マンネンダケ」として中国で知られている。 さまざまなganodenmasがあり、G. lucidum (赤), G. applanatum (茶色), G. tsugae (赤), G. sinense (黒い), およびG. oregonense (焦茶)を含んでいる。
【０００４】
食用の真菌、たとえばGanoderma Lucidium(マンネンダケまたわサイワイダケ) 、Volvariella Volvacea(中国のサイワイダケ)、Flammulina Velutipes(金色の針のサイワイダケ)などからの数個のタンパク質は同様のアミノ酸配列と免疫調節の機能を共有する。 これらのタンパク質は真菌類免疫調節タンパク質(FIP)と命名された(Ko J.L.、Eur. J. Biochem. 1995; 228:224-249)。 漢方薬のすべての健康食品では、マンネンダケは最もよく研究された菌類である。
【０００５】
マンネンダケは抗アレルギー (Chen H.Y，他., J. Med. Mycol. 1992; 33:505-512)、肝臓保護(Lin、J. M.，et al., Am J Chin Med. 1993; 21(1): 59-69) 、抗腫瘍効果(Wasser SP(1999)、Crit Rev Immunol 19:65-96)および免疫の利点があると知られている。(Kino(1989)、Journal of Biological Chemistry 264(1): 472-8)。 しかし、マンネンダケは制限されて原料の抽出 (Horner W.E. et al., Allergy 1993; 48:110-116)または小さい分子のフォームで(Kawagishi H., et al., Phytochemistry 1993;32:239-241)使用される。
【０００６】
マンネンダケから提出した1つのFIP，LZ-8(マンネンダケ-8)が全身の過敏性( Kino K.，et al., J. Biol Chem. 1989; Jan 5; 264(1):472-8)に明白な効果を持っている。 LZ-8は、肝臓癌の治療、糖尿病を予防するのに使用された(Kino K.，et al., J. Biol Chem. 1989; Jan 5; 264(1):472-8)。LZ-8とエノキタケ（Flammulina Velutipes）から入手したもう一つの免疫調節タンパク質FIP-5が同様のアミノ酸配列と免疫グロブリンの重鎖と類似のフォールドの構造を持っている。 さらに、これらのタンパク質はLZ-8の発現をアップすることによって全身過敏性の患者に対する免疫調節活性と明白な効果を持っていることを示した(Ko J.L., Eur. J. Biochem. 1995; 228:224-249) 。
【０００７】
Bakerのイーストが伝統的な食品加工(パン、ワインなど)に広く使用される安全な微生物である。Bakerのイーストは遺伝学、生理学および分子生物学を研究するのに典型的なモデル有機体である。また、安全のためにBakerのイーストは、ヒルジン、ヘモグロビュリン、ユロキナーゼ（Urokinase）、HSA(ヒト血清アルブミン)、IGF-I(インスリン様生長因子1)、GM-CSF(顆粒細胞マクロファージ・コロニー刺激因子)、B型肝炎ワクチンなどの蛋白薬物を作り出すのに成功的に利用された (Romanos M.A，et al., Yeast 1992; 8: 423-488)。指定したタンパク質を生産するのに発現したタンパク質の発現するプロフィールによって、適切なホストイーストが選択された。例えば、食料と蛋白薬物の生産でSaccharomyces cerevisiaeを使用することができた。
【非特許文献１】Lin、J. M. et al., Am J Chin Med.1993; 21(1): 59-69
【非特許文献２】Gabius、H. J. et al., Anticancer Res. 1992 5月-6月; 12(3): 669-75
【非特許文献３】Couraud P.O et al., J. Biol. Chem.1989;264: 1310-1316
【非特許文献４】Ko J.L.、Eur. J. Biochem. 1995; 228:224-249
【非特許文献５】Chen H.Y，他., J. Med. Mycol. 1992; 33:505-512
【非特許文献６】Lin、J. M.，et al., Am J Chin Med. 1993; 21(1): 59-69
【非特許文献７】Wasser SP(1999)、Crit Rev Immunol 19:65-96
【非特許文献８】Kino(1989)、Journal of Biological Chemistry 264(1): 472-8
【非特許文献９】Horner W.E. et al., Allergy 1993; 48:110-116
【非特許文献１０】Kawagishi H., et al., Phytochemistry 1993;32:239-241
【非特許文献１１】Kino K.，et al., J. Biol Chem. 1989; Jan 5; 264(1):472-8
【非特許文献１２】Romanos M.A，et al., Yeast 1992; 8: 423-488
【特許文献１】米国Patent No.5，334，704
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
現在の段階で、LZ-8は複雑な時間のかかる精製プロトコル (たとえば抽出、米国Patent No.5,334,704) によりマンネンダケから入手できるだけである。マンネンダケの大きな需要があるが、自然なマンネンダケはまれであり、険しい山にある老い木で成長するだけである。 したがって、引き続き高品質のGanodermaの供給を提供するテクニックが必要である。 現在、LZ-8の大規模な生産のために、利用できるプロトコルが全くないのである。
【０００９】
以前の研究(米国Patent No.5，334，704)で報告されたプロトコルを采用し、抽出と純化によるマンネンダケ免疫調節タンパク質の生産は効率が低く、より高い費用を必要とする。 また、大腸菌を采用するマンネンダケ免疫調節タンパク質を作り出す他の方法には菌体内毒素汚染を持つ可能があり、純化の方法はなおより高い費用がかかる。マンネンダケ免疫調節タンパク質を作り出すのに哺乳類のセルを使用する方法は、高価な培地を必要とし、ウイルスおよび前もって汚染に会う可能性がある。
【００１０】
米国Patent No. 5,334,704では、ganodermaから分離した糖蛋白質は免疫抑制性の活性があることを掲示した。 糖蛋白質の精製はganoderma菌糸を培養し、水の溶剤で産物の菌糸を抽出し、産物の提出物からターゲットの蛋白質を純かするステップなどを含んでいる。 その特許のテクニックにおいては、真菌を育てることと真菌からターゲットの蛋白質を純かすることがより高い費用を必要とし、生体外に微生物を育てることよりもっと複雑で、産業応用を行うのは難しい。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
この発明は図1(I)に描いたように核酸配列を含む分離した核酸分子を提供する。
【００１２】
この発明は、またベクターと、ベクターによりトランスフォームしたホスト細胞を提供する。
【００１３】
この発明はさらにFIPを含むホスト細胞を精製するための方法を提供する。
【００１４】
この発明はさらに前述の方法で精製されたFIPを提供する。
【００１５】
この発明はさらに前述のFIPを含むホスト細胞の用途を提供する。
【００１６】
この発明はさらにベクターにより、トランスフォームした前述のホスト細胞からFIPの純化する方法を提供する。
【００１７】
この発明はさらに発明のFIPを含む組成物を提供する。この組成物は化粧品、製薬品、食物、および食物添加物に適用される。
【００１８】
この発明はさらに対象に対して、その免疫活性調節するためにFIPまたはFIPの融合したタンパク質の口服の方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
Bakerのイーストとマンネンダケは菌類界に属するため、マンネンダケから異種類のタンパク質を発現するとき、イーストがマンネンダケと類似するタンパク質の変更(たとえば, 糖鎖付加とジスルフィドボンドの構成など)を行うと予想される。
【００２０】
現在の発明は以下の核酸配列を含むふ一つの分離した核酸分子を提供する:
ATGTCTGATA CTGCTTTGAT TTTCAGATTG GCTTGGGATG TTAAGAAGTT GTCTTTCGAT TACACTCCAA ACTGGGGTAG AGGTAACCCA AACAACTTCA TTGATACTGT TACTTTCCCA AAGGTTTTGA CTGATAAGGC TTACACTTAC AGAGTTGCTG TTTCTGGTAG AAACTTGGGT GTTAAGCCAT CTTACGCTGT TGAATCTGAT GGTTCTCAAA AGGTTAACTT CTTGGAATAC AACTCTGGTT ACGGTATTGC TGATACTAAC ACTATTCAAG TTTTCGTTGT TGATCCAGAT ACTAACAACG ATTTCATTAT TGCTCAATGG AACTGA
【００２１】
この発明はさらに分泌のための追加シグナル配列に結紮した前述の核酸分子を提供する。したがって、ホスト細胞で発現されたFIPは、新しい結紮核酸分子により、トランスフォームされ、直接細胞外液に分泌され、ホスト細胞と低い費用で容易に切り離されるのである。
【００２２】
この発明はさらに前述の核酸分子を他の遺伝子と結紮することにより、発生できる結紮の遺伝子を提供する。 異なったタンパク質で構成された融合タンパク質は、二つの合成タンパク質の付加的なバイオ機能を提供するために発生された(Weisbart RH, Cancer Lett. 2003;195(2):211-9.)。FIPが消化系で吸収できたため、他のタンパク質と融合することにより、FIPを配送システムとして他のタンパク質を目標有機体の中に運ぶことができる。また、融合タンパク質の口服は目標有機体に対する融合遺伝子の二つの遺伝子合成物に利益を提供するべきである。
【００２３】
この発明はさらに前述の核酸分子を含むベクターを提供する。 このベクターはホスト細胞にトランスフォームされる。このベクターは異なった用途と条件により、循環できるまたはプラスミッドにインテグレートできる。
【００２４】
この発明はさらに前述のベクターのトランスフォームしたホスト細胞を提供する。 このホスト細胞は、バクテリア、真菌セルまたはイーストセルの可能である。この前述のホストセルは完全または破裂した形の可能である。
【００２５】
前述のホスト細胞の都合のよい体現として、Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Candida utilis, Candida boidinii, Candida maltosa, Kluyveromyces lactis, Yarrowia lipolytica, Schwanniomyces occidentalis, Schizosaccaromyces pombe, Torulopsis, Arxula adeninivorans, またはAspergillus (A. nidulans, A. niger, A. awamori, A. oryzae), Tricoderma (T. reesei)などが挙げられる。 また，植物からのセルはなおホスト細胞の都合のよい体現である。
【００２６】
また，この発明はFIPを持っているホスト細胞を精製するための方法を提供する。この方法は(a)改良された挿入のFIPヌクレオチド配列を持っている発現ベクターのコンストラクション； (b) ベクターによるホスト細胞のトランスフォーム; そして(c)適切な条件のもとでトランスフォームしたホスト細胞の培養を含む。この発明のタンパク質の都合のよい体現として、図3で描かれる。前述のホスト細胞のよい体現として、Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Candida utilis, Candida boidinii, Candida maltosa, Kluyveromyces lactis, Yarrowia lipolytica, Schwanniomyces occidentalis, Schizosaccaromyces pombe, Torulopsis, Arxula adeninivorans, またはAspergillus (A. nidulans, A. niger, A. awamori, A. oryzae), Tricoderma (T. reesei)などが挙げられる。 また，植物からのセルはなおホスト細胞の都合のよい体現である。ステップ(bとc)中のホスト細胞の最も都合のよい体現はSaccharomyces cerevisiaeである。ステップ(b)におけるベクターは、図4(II、III)で描くようにpYB101-FIP-イーストまたはpYB101-FIP-lzである。 菌類でよく発現したFIPコドン(図1(I))はその高いtRNA翻訳効率に基づいて選ばれた。(Sorensen MA, Pedersen S. J Mol Biol. 1991; 222(2):265-80).
【００２７】
この発明はさらにFIPを含むホスト細胞の用途を提供する。 例えば、FIPを含む完全なイーストは口服できる、しかもホストからタンパク質を精製しないで目標有機体により吸収できて、利用の費用を削減する。
【００２８】
この発明はさらに前述のベクターで前述のトランスフォームしたホスト細胞からFIPを純化する方法を提供し、この方法は(a)溶剤にホスト細胞を溶解し; (b)セルを破砕させ、(c) pH 4-5まで溶液を調整し; (d) セル抽出物から残骸を分離し; (e) 上澄みを遠心分離し; (f) pH 4-5に整備したカラムに上澄みを加え; そして(g) マンネンダケ免疫調節タンパク質を洗浄することを含む。 特に、純化する方法は(a) 5-50 mM PBS(シグマ)で発酵したイースト1:5-1:20(v/v)を溶け; (b) 破粋機でセル抽出物の中のセルを破裂させ、(c) pH 4-5まで溶液を調整し; (d) 3000gで15分間の遠心することにより、残骸を分離し; (e) 再び1分間の1,2000gで上澄みを分離し; (f) pH 4-5に調整したCM Sepharoseカラム(Amersham Biosciences)へ上澄みを加え; そして(g)20-50mMのpH 4-5酢酸を加え、マンネンダケ免疫調節タンパク質を洗浄するステップを含む。
【００２９】
また,この発明は前述の方法で精製した発明のタンパク質を提供する。
【００３０】
また,この発明はFIPまたはFIPを含むホスト細胞を通じて対象に投与されるルートに関連する。投与経路は静脈内、腹内、口服、粘膜、皮膚吸着、または他の利用可能なルートから選択される。 経口投与は都合のよいルートである。 例えば, 溶液にFIPの含むホスト細胞を浸すことができる、そしてFIPはサカナに対する彼らのエラを通じて吸収される。
【００３１】
FIPまたはFIPを含むホスト細胞が投与できる対象の都合のよい体現は哺乳動物、魚、甲殻類と家禽である。ブタとトリはそれぞれ都合のよい哺乳動物と家禽である。グルーパー、サケおよびマスは都合のよい魚である。 エビ、ロブスター、Penaeus monodon、Penaeus japonicusおよびPenaeus vannameiは都合のよい甲殻類である。
【００３２】
また,この発明は真菌免疫調節タンパク質を含む経口投与のルートによって免疫活動を調節する際に使用のための組成物に関連する。真菌免疫調節タンパク質は自然なマンネンダケまたはこの発明の方法の真菌免疫調節タンパク質から精製される。 この発明のタンパク質の機能について行われた研究によると、前述の組成物は炎症と過敏性を減少させる薬物の用途、免疫活性の調節、糖尿病の予防、喘息の改良、バクテリアそしてウイルス性の感染に対する免疫反応の調節、臓器移植に対する免疫反応の調節; 長生きさせるための食物および食物添加物、免疫活動の調節、食事変更の増加(すなわち、体重に変換された食事量の重さのレート)、そして例えばストレスによる炎症でネガティブ免疫反応の調節(Black PH, Brain Behav Immun. 2003 Oct;17(5):350-64) に適用することができた。
【００３３】
この発明はさらにFIPの経口で対象に投与によって免疫失調を調節する方法を提供する。このタンパク質は大腸菌または菌類例えばSaccharomyces cerevisiaeから精製できる。
【００３４】
この発明はさらに0050ハーブ(例えばマンネンダケ)、食物、飲料、化粧品、食物添加物またはドラッグ中のFIPの量を測定する免疫学アッセイ, 例えばウエスタン・ブロットまたは酵素結合免疫吸着検定法 (エリザ)( (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., pp: 18.60-18.75) を提供する。
【００３５】
この発明のタンパク質を含む組成物は処方のタイプに関する技術での従来の他の薬剤が含まれるのであろう。例えば、経口投与に適するそれらの処方は甘味料、増粘剤および香料薬剤が含まれる。
【００３６】
この発明のタンパク質を含む組成物における適切な成分は病気のタイプ、重さおよびステージに依頼し、異なった個人の中で変わることができるのであろう。
【００３７】
以下の例はこの発明を制限するのではなく、例証するのが意図される。
【実施例】
【００３８】
実施例1: pYB101-FIP-イーストとpYB101-FIP-lzの発現ベクターの精製
FIP-イーストとFIP-lzのコンストラクション
FIP-イーストのDNA配列は図1(I)でとFIP-lzは図1(II)でえがかれた。Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991 May 15:88(10): 4084-4088. によって、DNA配列は精製された。 Natl。 Acad。 Sci。 米国。 1991 5月15日: 88(10)、: 4084-4088.
【００３９】
FIP-イーストとFIP-lzのプライマーの精製
マンネンダケ免疫調節タンパク質 (J.Biol. Chem1991; 266(4)、2486-2493)をコードする知られているDNA配列によって、商品供給者(台湾のMission Biotech株式会社)からFIP-イーストとFIP-lzのフオーワードとリバースのプライマーを購入した。 PmlIとBamHIの制限部位は図2(I)と2(II)で描いたようにプライマーの両端に加えられた。 PCR反応は、必要なプライマーを得るために実行された。増幅されたプライマーは配列され、それらの配列は確認された。
【００４０】
発現ベクターpYB101、pYB101-FIP-イーストおよびpYB101-FIP-lzのコンストラクション
現在利用できるテクニックを使用し、栄養選択マーカーとイースト転写の起源を提供するためにガラクトースプロモーター、遺伝子Ura3、および2μoriは、それぞれpYB(Yeastern Biotech株式会社、台湾)にイントロデュースされた。 新しいベクター、図4(I)に描いたのようなpYB101はBY4741またはDY150などの知られているベイカーのイーストにトランスフォームされる。pYB101とFIP-イーストおよびFIP-lzをコードするDNA配列のベクターは制限酵素のPmlIとBamHI(New England Biolabs, Beverly, USA)によって消化された。消化された断片は、PCR Cleaning Up Purification Kit(Viogene、台湾)を使用し、精製された。図4(II)と(III)に描いたようにそれぞれpYB101-FIP-イーストとpYB101-FIP-lzの精製するためにFIP-イーストおよびFIP-lzの消化された断片の三つのモルはT4 DNA合成酵素(New England Biolabs, Beverly, USA)によって消化された断片pYB101の一つのモルに結紮された。
【００４１】
pYB101-FIP-イーストとpYB101-FIP-lzの大腸菌へのトランスフォーメーション
標準のトランスフォーメーションのテクニック(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. pp: 1.82-1.84)を使用し、pYB101-FIP-イーストとpYB101-FIP-lzによって大腸菌DH5αはトランスフォームされた。商業的に利用できるDNA抽出キット(Mini-M Plasmid DNA Extraction Kit, Viogene, 台湾)を使用し、トランスフォームされた大腸菌から多量のpYB101-FIP-イーストとpYB101-FIP-lzが入手できた。
【００４２】
実施例2: 少量のFIP-イーストとFIP-lzタンパク質の精製
pYB101-FIP-イーストとpYB101-FIP-lzのBakerのイーストへのトランスフォーメーション
Bakerのイースト(BY4741およびDY150)はイーストトランスフォーメーションキット(Yeastern Biotech株式会社、台湾)を使用し、1μgのpYB101-FIP-イーストまたはpYB101-FIP-lzによってトランスフォームされた。
【００４３】
栄養状態によってトランスフォームされたイーストの選択
上で述べたトランスフォームされたイーストは、YNBDメディア(アミノ酸(Difco、イギリス)のない0.17%のBacto Yeast Nitrogen Base、0.5%のアンモニア硫酸塩、2%のブドウ糖、2%の寒天(シグマ、米国))で広げられ、培養された。 栄養欠陥型BY4741(MAT a his3delta1 leu2delta0 met15delta0 ura3delta0)とDY150(MAT a ura3-52 leu2-3 112trp1-1 his3-11、15、ade2-1 can1-100) を使用し、0.0024%のヒスチジン、0.0072%のロイシンおよび0.0012%のメチオニン(BY4741),または0.0072%のロイシン、0.0048%のトリプトファン、0.0024%のヒスチジンおよび0.0024%のアデニン(DY150)(シグマ、米国)は 培養の前にYNBDメディアに追加された。 このメディアは30℃で2-3日間維持された。トランスフォームされたイーストを選択するためにメディアでウラシルが供給されなかった。 ベクターpYB101-FIP-イーストとpYB101-FIP-lzの両方がウラシルをコードする遺伝子を所有している。したがって、トランスフォームされたBakerのイーストは、そのようなウラシルを所有し、ウラシルをメディアに提供しないで、生き残ることができるが、トランスフォームされなかったイーストは生き残ることができない。
【００４４】
アジテーターでわずかなボリュームのトランスフォームされたイーストをテストする
【００４５】
上で述べたトランスフォームされたイーストの二つの栄養欠陥ストレインは実施例2で説明されるように必要な栄養の加えられた50mlのYNBDメディアに接種された。 培養は30℃と250rpmで3日間育てられた。イースト培養は遠心され、ブドウ糖を取り除くためにYNB培地で3回、洗われた。 そして、イースト培養は50mlの必要な栄養を持っているYNBG培地(アミノ酸のない0.17%のBacto Yeast Nitrogen Base、0.5%のアンモニア硫酸塩、2%のガラクトース)で0.1OD600nmに調整された。イースト培養は30℃と250rpmで育てられた。 イーストの濃度はOD600nmを測定するのに、分光光度計Ultrospec2100プロ(Amersham Pharmacia biotech, 米国)を使用し、毎日モニターし、そして1mlのイーストのサンプルは毎日取り入れられた。 このサンプルは、Microfuge18 Centrifug (Bechman Coulter、米国)を使用して、5分間10000 X gで遠心され、またイーストマスを得るために3回洗われた。マスは-20℃で保存された。
【００４６】
実施例3:ウエスタンブロット解析を使用して、トランスフォームされたイーストから発現したマンネンダケ免疫調節タンパク質の定量化
取り入れられたイーストマスはPBS(シグマ、米国)でOD600nm=0.5に希釈された。 希釈されたマスは、2 X SDSサンプルバッファ(シグマ、米国)の中に溶かされ、100℃で3分間加熱された。 冷却の後に、10μlの希釈されたマスはネイチャー(1970)227(680-685)で説明されたプロトコルに従って、100ボルトでSDS-ページにかけられた。
【００４７】
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., pp: 18.60-18.75内の標準のプロトコルによって、ウエスタン・ブロットは実行された: Semi-PHOR(Hoefer Scientific Instruments、サンフランシスコ)を使用し、50mAの電気泳動によって、すべてのタンパク質を移されるまでゲル上のタンパク質はPVDF膜(Hybond-P, Amersham Bioscience, 米国)に移された。 そして、膜は37℃で1時間、ブロッキングバッファの中に浸され、また4℃で夜通した。ブロッキングバッファの取り外しの後、ブロッキングバッファ内の10-3 Xのウサギ抗マンネンダケ免疫調節タンパク質血清(Advance Bio-Pharm Inc.、台湾)は加えられ、1時間37℃で膜とインキュベートされた。血清を取り除いて、洗濯バッファで膜を洗った後, 10-4 HRP標識されたマウス抗ウサギの血清(シグマ、米国)は加えられ、1時間37℃で膜とインキュベートされた。 洗濯バッファで膜を洗った後に、色のインディケータTMB(シグマ、米国)は、色を発生するように加えられた。 ウエスタン・ブロット分析を終了するために、色が水を加えることにより現れると、呈色反応は終えられた。 最終的な結果は図5で示される。
【００４８】
図5(I、II) の中に、MとSは標準のタンパク質マーカーと大腸菌から純化した標準のFIPである。グループ1-4は改良されたFIPコドンによって発現されたFIPであった。 グループ2-5はオリジナルのFIPコドンによって発現されたFIPであった。図5(I)で示されるように、グループ1-3はFIPがを明確に発現されたが、FIPはグループ5-8で検出されなかった。この結果は、イーストで改良されたFIPコドンがイーストに高く発現できることを示す。
【００４９】
実施例4: 発現ベクターpYB101s-FIPの精製
FIPのコンストラクション
FIPのテンプレート配列は描かれ、FIP-イーストの配列は図で1(I)に描かれた。 DNA配列は例3で説明されたように精製された。 イーストBY4741はトランスフォームのホストとして選定された。
【００５０】
FIPのプライマーの精製
商品供給者(Mission Biotech株式会社, 台湾)からFIP-イーストとFIP-lzのフオーワードとリバースのプライマーを購入した。PCR反応は、テンプレートとしてpYB101-FIP-イースト(図4)を使用することで実行された。PmlIとBamHIのレストリクションサイトは図6(I)と(II)で描いたようにプライマーに加えられた。PCR反応は、必要なプライマーを得るために実行された。増幅されたDNAは(Mission Biotech株式会社、台湾)に送られ、それらの配列を確認した。
【００５１】
発現ベクターのpYB-101とpYB101s-FIPのコンストラクション
現在利用できるテクニックを使用し、栄養選択マーカー、イースト転写の起源、および分泌信号を提供するためにガラクトースプロモーター、遺伝子Ura3、2μoriおよびα−ファクターリーダー・シーケンス(図7で描いたように)は、それぞれpYB(Yeastern Biotech株式会社、台湾)にイントロデュースされた。新しいベクター、図8(I)に描いたのようなpYB101はBY4741などの知られているBakerのイーストにトランスフォームされる。そして、彼らの配列は(Yeastern Biotech株式会社、台湾)確認された。
【００５２】
ベクターpYB101とFIPをコードするDNA配列は制限酵素のPmlIとXhoI (New England Biolabs, Beverly, USA)によって消化された。消化された断片は、PCR Cleaning Up Purificationキット(Viogene、台湾)を使用し、純かされた。図8(II)で描いたようにpYB101s-FIPの精製するためにFIPの消化された断片の三つのモルはT4 DNA合成酵素(New England Biolabs, Beverly, USA)により消化されたpYB101sの一つのモルに結紮された。
【００５３】
大腸菌へのpYB101s-FIPのトランスフォーメーション
実施例1で説明されたように大腸菌DH5αはpYB101s-FIPでトランスフォームされた。トランスフォームされた大腸菌からpYB101s-FIPの多量を得ることができた。
【００５４】
実施例5: FIPの少量の精製
BakerのイースBY4741へのpYB101s-FIPのトランスフォーメーション
BakerのBY4741は1μgのpYB101s-FIPで実施例2で説明されるようにトランスフォームされた。
【００５５】
栄養状態によるトランスフォームされたイーストの選択
実施例2で説明された同じプロトコルによって、上で述べたトランスフォームされたイーストはYNBD寒天(0.0024%のヒスチジン、0.0072%のロイシン、および0.0012%のメチオニン)から選択された。
【００５６】
アジテーターでわずかなボリュームのトランスフォームされたイーストをテストする
【００５７】
上で述べたトランスフォームされたイーストは実施例2で説明されるように必要な栄養の加えられた50mlのYNBDメディアに接種された。FIPタンパク質の生産はガラクトースをメディアに追加することによって、誘導され、分泌されたFIPは毎日集められた。
【００５８】
実施例6: SDS-ページを使用し、トランスフォームされたイーストから発現したFIPの定量化
サンプルFIPタンパク質は例3で説明されたようにSDS-ページによって分析された。 また、ゲルは、Coomassie brilliant blue G-250(シグマ)で30分間で染められ、タンパク質バンドが明確になるまで脱色溶液(20%のメタノール、10%の酢酸)で脱色した。染色結果は図9で示される。
【００５９】
実施例7: 50 L発酵の方法
50mlフラスコ内でのイースト接種。
マンネンダケ免疫調節タンパク質を作り出すトランスフォームされたイーストはウエスタンブロット解析によって選択され、実施例2でのように必要な栄養と共に50mlのYNBDメディアに接種された。培養は30℃と250rpmで24時間維持された。
【００６０】
2000mlフラスコでのイースト接種。
上で述べた50mlの培養は2000mlフラスコ中の450 ml同じメディアに接種された。培養は30℃と250rpmで24時間維持された。
【００６１】
50L発酵槽(Chuan Tai工場、台湾)内のイースト発酵。
上で述べた500mlの培養はブドウ糖を取り除くためにYNBメディアで二回で遠心分離され、洗われた。イースト濃度は例2のように50mlの共に必要な栄養を持っているYNBG培地(アミノ酸のない0.17%のBacto Yeast Nitrogen Base、0.5%のアンモニア硫酸塩、2%のガラクトース(シグマ、米国))で0.1OD600nmに調整された。イースト培養は25-30℃、400-500rpm、pH4.5-5.5で3日間育てられた。pH値は2MのNaOHとHCl(シグマ、米国)の必要な量を加えることによって、調整された。 発酵槽での圧力は0.2-0.4kg/cm2で維持され、40-50L/分の換気は0.2μmのフィルタで濾過された。
【００６２】
50L発酵槽でのマンネンダケ免疫調節タンパク質の定量化
実施例3で発酵培養からいくつかのサンプルを取り、サンプル内のマンネンダケ免疫調節タンパク質はウエスタンブロット解析で決定した。図10で示されたように、50L発酵槽からの製品にはマンネンダケ免疫調節タンパク質がある。
【００６３】
実施例8: トランスフォームされたイーストから発現したマンネンダケ免疫調節タンパク質の活性アッセイ
総セル抽出物の精製
取り入れられたイーストマスは、PBSと共に洗われ、3回遠心された。 イーストペレットは集められ、ペレットと同じボリュームの0.4mmのガラス玉は加えられた。混合物は4℃で20秒間旋転され、1分間氷に置かれた。このステップは5回繰り返された。5分間、4℃で1,5000rpmで遠心分離した後、上澄みは総セル抽出物として使用された。
【００６４】
サンプルは遠心され、上澄みは保有された。上澄みは、0.2μmの膜(Sartorius)によって濾過され、後の使用のために保存された。
【００６５】
人の末梢血単核細胞(PMNC)の精製
ヘパリン化末梢血が大人達から集められ、Ficoll-paque培養メディア(Amersham Biosciences)が血液サンプルに加えられた。Amershamのプロトコルによって、溶液はPMNCを切り離すために遠心された。 セルは組織培養のために24-孔のプレートの中に1 X 106セル/mlの濃度でプレートされた。各1mlの培養メディアは10%のFBS、100μg/mlのストレプトマイシン、100ユニット/mlのペニシリン、および200mM L-グルタミン酸塩のRPMI1640メディア(GIBCO、グランドアイランド(ニューヨーク)) を含む。セルは37℃で成長した後,0時間、24時間または48時間培養された。
【００６６】
サイトカインのアッセイ:
セルは加えられた異なった濃度のマンネンダケ免疫調節タンパク質を含む24-孔のプレート(Nunc, Roskilde, Denmark)の中に1 X 106セル/mlの濃度でプレートされた。セルは培養され、インターフェロンγの活性が市販のキット(R&D Systems, Minneapolis, MN)を使用することで、検査された。 結果は図11で示される。 図11では、バッチ１とバッチ2は異なった濃度のFIPの加えられたサンプルであった。 PHA(植物凝集素、Sigma)は標準の酵素結合免疫吸着検定法のテクニックを采用し、インターフェロンγの活性をテストするのに使用された (免疫学、1998年のジャーナル、161: 2114-2119) 。空白とイーストグループのインターフェロンγの活性は明確にわずかしか示さなかったが, バッチ1と2は、その中に純化したFIPがあったまたはPHAがセルに加えられ、明確なインターフェロンγの活性を示した。結果は、48時間育てられたPMNCに4μgの純化したFIPを加えると他のタンパク質を加えることより多くのインターフェロンγを誘導できることを示した。また、結果は、50L発酵方法からのサンプルがインターフェロンγの量を増加させたこと、しかもFIPの活性がイーストの結果でないことを示した。
【００６７】
実施例9: FIPの純化
発酵しているイーストは1:10 (v/v) 20mM PBS(シグマ)、pH6.0で溶かされた。セルは破砕機(Basic Z model (Constant System Ltd. UK))によって30Kpsiの下で破砕された。 この溶液のpHは1Mの酢酸を加えることにより、pH4-5に変更された。この溶液15分間の3000gで遠心。 上澄みは切り離され、1分間の1,2000gで、再び遠心分離された。この上澄みの10mLはCM Sepharoseカラム(Amersham Biosciences)の30mLに加えられた。このカラムは20-50 mM酢酸によって平衡され、pH4-5を維持した。 20-50 mM酢酸溶液、pH4-5および洗浄したマンネンダケ免疫調節タンパク質を加えた。
【００６８】
図12 (I) から,F3、F4およびF5が3番目、4番目および5番目の収集チューブからのサンプルを表す。 F3とF4には、より高いmAU値が明確にあった。また、 F3とF4は図12(II)で示されるようにSDS-PAGEによってさらに分析された。 図12(II)では、F3、F4およびF5は3番目、4番目および5番目の収集チューブであった。 STDは標準チューブを代表する(純化した大腸菌から生産したFIP)。 Mは標準の分子の重さであった。F3とF4のタンパク質はSTDと同じ分子の重さを示した。さらに、 F3とF4のタンパク質バンドは、ウエスタン・ブロットによってFIPであると確認された。 この結果は、F3とF4のFIPが非常に高い純度であることを示した。
【００６９】
実施例10: マンネンダケタンパク質の応用
食物添加物としてのマンネンダケタンパク質の応用
マンネンダケタンパク質の毒性試験
5.9gの平均重量と7.25cmの平均長さがあるグルーパーは25℃と33ppt塩度で集められた。純化したFIPは実施例9のように5、1、0.25 μg/魚/0.1mlの濃度で腹内により、若いグルーパーに投予された。PBS溶液がコントロールグループに投予された。これらの魚は14日間オリジナルの流水で成長した。魚の死亡率は毎日記録された。死亡は全く最初の2週間で観察されなかった。したがって、上の濃度でのFIPはグルーパーに少しの毒性も示さなかった。
【００７０】
FIPによる非特異免疫反応の増進
FIPでグルーパーの原腎臓セルを処理するのによる非特異免疫反応の生体外の増進
市場から600グラムのグルーパーを購入した。原腎臓セルは培養され、そして食細胞が標準の培養のテクニックを使用することで切り離された。原腎臓セルはグルーパーの非特異免疫反応に影響する主なセルである(Engelsma MY, Fish Shellfish Immunol. 2003 Nov;15(5):397-410)。これらのセルはAL-10培養溶液(L15(Gibco): AIM5(Gibco)=1:1)に混濁され、そして0.1mlは96孔プレート(コーニング)に107/mlの濃度で接種された。 このプレートは25゜Cで2時間維持された。
【００７１】
濃度2、1、0.5、0.2および0.02 μg/0.1mlのFIPは室温で2時間の原腎臓の培養に加えられた。 ニトロブルー テトラゾリウム アッセイ(NBTアッセイ、Sigma)は、非特異免疫反応のを測定するために実行された。A620nm値が高いであれば、非特異食作用の増進はより高いである。
【００７２】
原腎臓セルへのFIPの付加は食作用を機能アップする、またそれはNBT分析評価で測定された。 図13で示されるように、2、1、および0.5μg/0.1mlのFIPを加えると、原腎臓セルの食作用を明確に増加させ、それはFIPが非特異免疫反応をアップすることができるのを示す。
【００７３】
イリドウイルスに対するFIPの魚の保護
グルーパーは前の実験で言われたようにPBSまたはFIPの腹内によって投与された。 3週間の成長後、0.1mlの10,000 x TCID50のウイルスの投与量をこれらの魚の腹膜に与えた。魚の死亡率は毎日記録された。一般に、イリドウイルスの腹内による投与されたグルーパーは2週間で死んだ。 図14で示されるように、FIPの最も高い投与量、5μg FIP/魚/0.11mlで投与された魚は2週間後に70%の死亡率を示した。したがって、30%の保護率が2週間で達成された。
【００７４】
ビブリオ（Vibrio harveyi）感染に対するFIPの魚の保護
100匹のグルーパー(Epinephelus malabevicus、52.9gの平均重量)は5つのグループに分かれた。 各グループは20匹のグルーパーを含んだ:
1. PBSのコントロール;
2. 20mgのオリジナルのイースト/60g体重を食べさせたグルーパー;
3. 20mgのFIPを含むイースト/60g体重を食べさせたグルーパー;
4. 4mgのFIPを含むイースト/60g体重を食べさせたグルーパー;
5. 0.8mgのFIPを含むイースト/60g体重を食べさせたグルーパー;
【００７５】
2日間に一度各グループは与えられた。7日後に、各グループはVibrio harvey感染によって攻撃された。
【００７６】
グルーパーは準致死量(LD50) 3X106CFU /mlの10倍のVibrio harveyで攻撃された。それぞれのグループの10匹の魚からの血液サンプルが攻撃の前に集められた。 リゾチーム活性を含む非特異免疫反応は、述べた血液サンプルでテストされた。他のそれぞれのグループの10匹の魚がVibrio harveyで攻撃された。 魚の生存力、食事、および死亡率は毎日記録された。
【００７７】
図15で示されるようにVibrio harvey感染攻撃後、PBSとオリジナルのイーストグループの5日目の生存率は10-20%まで、かなり低下であったが、FIPを包括しているイーストグループは60-80 %以内であり、そのFIPの経口投与が十分に魚の免疫力を強め、魚の寿命を伸すことを示唆している。
【００７８】
実施例11: FIPまたはDer p IIの提出物によって再刺激したBalb/cネズミからのDer p II-感作した脾細胞のインターフェロンγの測定。
FIPまたはDer pの刺激
脾臓セルがDer p(イエダニDermatophagoides抗原(Der pII))の感作したBalb/cネズミの2つのグループから集められた。 FIPグループのネズミは2日間あたり2μgのFIPを飼われた。 Der pグループのネズミは、1日目と7日目にDer Pを腹内で投与され、14日目にDer pでスプレーした。 ネズミは15日目に殺され、脾臓セルは集められた。
【００７９】
ネズミから分離した脾細胞が6 X 106 cells/mlで5%のRPMI-1640メディアに培養された。また、脾細胞は10 μg/mlのDer pおよび2 μg/mlのFIPによって再刺激された。コントロールグループにおける脾細胞にPBS溶液が加えられた。培養の上澄みは48時間後に集められ、生産されたインターフェロンγの量が分析された。
【００８０】
図16では、Der pはDer p IIを指示した。 FIP-gtsはFIPを指示する。コントロールグループのBalb/cネズミとFIP(81.8pg/ml)の飼ったBalb/cネズミからの脾細胞の間に産生されたインターフェロンγの量には全く違いがなかった。さらに、FIPで飼わなかったBalb/cネズミまたはDer p刺激されたネズミからの脾細胞は、もしFIPで再刺激するとコントロールより多くのインターフェロンγ(463.8と1100.7)を産生する。この実験は、FIPが経口投与を通じて機能することができ、免疫学活性を調節することを証明し, 特に直接アナフイラキシンを抑制する。
【００８１】
この発明はそれを作り、またはそれを使用する技術を熟成している人達に対して十分詳細に説明され、例示された時,様々な代替手段、変更および改良がこの発明の精神と範囲から離れない、明らかであるべきである。
【００８２】
技術に熟練した人は、この発明が目標を実行し、終点と前の述べた利点を入手し、またそこに固有のそれらに充分適合するように容易に評価できる。それらを生産するためのプラスミッド、細胞株、用途、方法および方法は都合のよい体現の代表であり、例証であり、そしてこの発明の範囲での制限として意図されない。技術に熟練した人に対してそこに変更と他の用途は起るであろう。これらの変更は、この発明の精神の中に包括され、またはクレームの範囲によって定義される。
【００８３】
当該技術に熟達した者に対して、この発明に対する各種異なった代替と変更がここで掲示された発明の範囲と精神から離れないでできることは容易に明らかであろう。
【００８４】
仕様で述べたすべての特許と発行物が発明に関係する技術の普通の技能のもののレベルを指示している。すべての特許と発行物はそれぞれの個々の発行物が参照に従って特別と個別に指示されて取り入れられるように同一程度の参照に従って取り入れられた。
【００８５】
ここで実施例として適当に説明した発明はどんな要素または原理と制限または限度がない場合で実行できる、ここで別に明らかにされない。採用している用語と表現が叙述の用語として使用されていて、制限はなく,しかもそのような用語と表現の使用中に表したおよび述べた特徴のどんな対応の用語またはその部分を除くつもりはないが、この発明の要求の範囲の中で様々な変更が可能であると認識される。したがって、現在の発明が都合のよい体現化とオプション特徴によって明確に明らかにされ、ここで掲示された概念の変更と変化が技術に熟練した人によって再び分類されるかもしれないが、追加されたクレームで定義されるようにこの発明の範囲の中にそのような変更と変化があると考えられるのは理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】図1は、Saccharomyces cerevisiae，FIP-イーストにより発現した(I)改良したFIPコドンのヌクレオチド配列； (II) Ganoderma lucidium、FIP-lzにより発現したオリジナルFIPコドンを示す。
【図２】図2はSaccharomyces cerevisiaeの改良したコドンのフオーワードとリバースのプライマー，FIP-イーストのヌクレオチド配列と(I) レストリクションサイト; (II) Ganoderma lucidiumのオリジナルコドンのフオーワードとリバースのプライマー，FIP-lzを示す。
【図３】図3はGanoderma lucidium、Ganoderma tsugae、およびFlamnulina velutipsに発現したFIPアミノ酸配列の比較を示す。同じアミノ酸は太字で示される。
【図４】図4はプラスミッド(I)pYB101(II)pYB101-FIP-イースト(III)pYB101-FIP-lzの構造マップを証明する。
【図５】図5は(I)pYB101-FIP-イーストまたは(II)pYB101-FIP-lzを採用し、トランスフォームしたイースト(DY150またはby4741)で発現したFIPの定量化を示す。 M: 分子マス175、83、62、47.5、32.5、25、16.5、および6.5Kdを見せる標準のタンパク質。 S:トランスフォームした大腸菌から精製した標準のFIP。レーン1-2: pYB101-FIP-イーストでトランスフォームしたDy150イーストNo.1-2。 レーン3-4: pYB101-FIP-イーストでトランスフォームしたBy4741イーストNo.1-2。 レーン5-6:pYB101-FIP-lzでトランスフォームしたBy4741イーストNo.1-2。 レーン7-8: pYB101-FIP-lzでトランスフォームしたDy150イーストNo.1-2。
【図６】図6はヌクレオチド配列とFIPのフオーワード(I)とリバース(II)のプライマーのレストリクションサイトを示す。
【図７】図7は、pYB101sとpYB101s-FIPを発生させるのによく使用されるα−ファクターのリーダー配列とレストリクションサイトを示す。レストリクションサイトは太字でマークされる。α−ファクターのリーダー配列とFIPの遺伝子の始めが矢でマークされる。
【図８】図8はプラスミッド(I)pYB101s(II)pYB101s-FIPの構造マップを示す。
【図９】図9はpYB101-FIPを採用し、トランスフォームしたイーストby4741で発現したFIPの定量化を示す。M: 分子マス175、83、62、47.5、32.5、25、16.5、および6.5Kdを見せる標準のタンパク質。 S:トランスフォームした大腸菌から精製した標準のFIP。レーン1-3: pYB101s-FIP-イーストでトランスフォームしたBy4741の1日目、2日目および3日目の培養。
【図１０】図10は、FIPを含むイーストの50L発酵のサンプルのウエスタン・ブロットを示す。 M: 標準のタンパク質。 S: 大腸菌から発生させた標準FIP。
【図１１】図11は異なった手順で精製した異なった濃度のFIPとインキュベートした末梢血セル(PBL)により、発生したインターフェロンγの量を示す。 空白: PBSのコントロール。 バッチ1: 最初の50L発酵の方法から精製した破裂したイーストの上澄み。バッチ2: 2番目の50L発酵の方法から精製した破裂したイーストの上澄み。イースト: 市場から購入した破裂したイーストの上澄み。 PHA: 植物性凝集素。
【図１２】図12は(I)AKTA(登録商標)エクスプローラー 10Sシステムを使用し、タンパク質フラクションの分析を描く。 F3、F4、およびF5は3番目、4番目、および5番目の収集されたサンプルチューブである。 (II)AKTA(登録商標)エクスプローラー 10Sシステムにより、収集された純化したFIPフラクションのSDS-ページ。 M: 分子マス175、83、62、47.5、32.5、25、16.5、および6.5Kdを見せる標準のタンパク質。STD: トランスフォームした大腸菌から精製した標準のFIP。
【図１３】図13は異なった濃度の純化したFIPでグルーパーの原始腎臓セルの上にNBTアッセイの結果を示す。コントロール: PBSのコントロール。
【図１４】図14は彼らの腹に異なった濃度の純化したFIPの注射後イリドウイルス(虹彩ウイルス)の感染を使用し、攻撃したグルーパーの死亡率を示す。 PBS: 0.25、1、5ug/0.1mlのウイルスの攻撃する前に0.1mlのPBSを腹内に注入する:ウイルスの攻撃する前に腹内に0.25, 1, 5 ug/0.1mlの純化したFIPを注射する。
【図１５】図15はFIPを含むイーストがグルーパーに餌をやられた後にVibrio harveyi感染の攻撃したグルーパーの生存率を示す。 PBS: 燐酸塩バッファのコントロール。20mg, 4mg, 0.8mg: グルーパーにFIPを含む20mg, 4mg, および0.8mgのイーストで食べさせた。 コントロール: グルーパーはトランスフォームしたイーストのない餌をやられた。
【図１６】図16はDer p II-感作し、FIPまたはDer p IIの提出物を共に再刺激したBALB/Cネズミの脾細胞のインターフェロンγの発現を描く。FIP-gts: FIP. Der p:イエダニDermatophagoides抗原(DER P2)。 コントロール: PBSのコントロール。
【技術分野】
【０００１】
この発明は菌類でよく発現する真菌類免疫調節タンパク質(FIP)をコードする改良された核酸分子に、核酸分子を含むベクターに、前述のベクターによりトランスフォームしたホストに、前述の発明のタンパク質を発現する方法に、前述の方法で生産した本発明のタンパク質に、この発明のタンパク質含む前述のホストの用途およびFIPを純化する方法に関する。したがって、現在の発明はさらに化粧品または薬物組成物におけるこの発明のタンパク質の用途に、およびこの発明のタンパク質を含む食物または食物添加物に関する。 最後に、この発明はFIPまたはFIPの融合したタンパク質の口服によって対象に対する調節免疫活性の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
真菌子実体または菌糸からの植物性凝集素が免疫調節と肝臓保護の効果があり、それは遊離基を取り除くことができるように示した(Lin、J. M. et al., Am J Chin Med.1993; 21(1): 59-69) 。寄生木からの(L)-ガラクトシド特有の植物性凝集素は生体外に及び生体内でサイトカインの生産を高める (Gabius、H. J. et al., Anticancer Res. 1992 5月-6月; 12(3): 669-75) 。 病気モデルとしてBalb/Cマウスを使用するテストで、植物性凝集素および組換え型の植物性凝集素は腫瘍構成を抑制することができる (Couraud P.O et al., J. Biol. Chem.1989;264: 1310-1316) 。
【０００３】
Ganodermaは漢方薬のまれで貴重なハーブである。 それは5,000年間以上「マンネンダケ」として中国で知られている。 さまざまなganodenmasがあり、G. lucidum (赤), G. applanatum (茶色), G. tsugae (赤), G. sinense (黒い), およびG. oregonense (焦茶)を含んでいる。
【０００４】
食用の真菌、たとえばGanoderma Lucidium(マンネンダケまたわサイワイダケ) 、Volvariella Volvacea(中国のサイワイダケ)、Flammulina Velutipes(金色の針のサイワイダケ)などからの数個のタンパク質は同様のアミノ酸配列と免疫調節の機能を共有する。 これらのタンパク質は真菌類免疫調節タンパク質(FIP)と命名された(Ko J.L.、Eur. J. Biochem. 1995; 228:224-249)。 漢方薬のすべての健康食品では、マンネンダケは最もよく研究された菌類である。
【０００５】
マンネンダケは抗アレルギー (Chen H.Y，他., J. Med. Mycol. 1992; 33:505-512)、肝臓保護(Lin、J. M.，et al., Am J Chin Med. 1993; 21(1): 59-69) 、抗腫瘍効果(Wasser SP(1999)、Crit Rev Immunol 19:65-96)および免疫の利点があると知られている。(Kino(1989)、Journal of Biological Chemistry 264(1): 472-8)。 しかし、マンネンダケは制限されて原料の抽出 (Horner W.E. et al., Allergy 1993; 48:110-116)または小さい分子のフォームで(Kawagishi H., et al., Phytochemistry 1993;32:239-241)使用される。
【０００６】
マンネンダケから提出した1つのFIP，LZ-8(マンネンダケ-8)が全身の過敏性( Kino K.，et al., J. Biol Chem. 1989; Jan 5; 264(1):472-8)に明白な効果を持っている。 LZ-8は、肝臓癌の治療、糖尿病を予防するのに使用された(Kino K.，et al., J. Biol Chem. 1989; Jan 5; 264(1):472-8)。LZ-8とエノキタケ（Flammulina Velutipes）から入手したもう一つの免疫調節タンパク質FIP-5が同様のアミノ酸配列と免疫グロブリンの重鎖と類似のフォールドの構造を持っている。 さらに、これらのタンパク質はLZ-8の発現をアップすることによって全身過敏性の患者に対する免疫調節活性と明白な効果を持っていることを示した(Ko J.L., Eur. J. Biochem. 1995; 228:224-249) 。
【０００７】
Bakerのイーストが伝統的な食品加工(パン、ワインなど)に広く使用される安全な微生物である。Bakerのイーストは遺伝学、生理学および分子生物学を研究するのに典型的なモデル有機体である。また、安全のためにBakerのイーストは、ヒルジン、ヘモグロビュリン、ユロキナーゼ（Urokinase）、HSA(ヒト血清アルブミン)、IGF-I(インスリン様生長因子1)、GM-CSF(顆粒細胞マクロファージ・コロニー刺激因子)、B型肝炎ワクチンなどの蛋白薬物を作り出すのに成功的に利用された (Romanos M.A，et al., Yeast 1992; 8: 423-488)。指定したタンパク質を生産するのに発現したタンパク質の発現するプロフィールによって、適切なホストイーストが選択された。例えば、食料と蛋白薬物の生産でSaccharomyces cerevisiaeを使用することができた。
【非特許文献１】Lin、J. M. et al., Am J Chin Med.1993; 21(1): 59-69
【非特許文献２】Gabius、H. J. et al., Anticancer Res. 1992 5月-6月; 12(3): 669-75
【非特許文献３】Couraud P.O et al., J. Biol. Chem.1989;264: 1310-1316
【非特許文献４】Ko J.L.、Eur. J. Biochem. 1995; 228:224-249
【非特許文献５】Chen H.Y，他., J. Med. Mycol. 1992; 33:505-512
【非特許文献６】Lin、J. M.，et al., Am J Chin Med. 1993; 21(1): 59-69
【非特許文献７】Wasser SP(1999)、Crit Rev Immunol 19:65-96
【非特許文献８】Kino(1989)、Journal of Biological Chemistry 264(1): 472-8
【非特許文献９】Horner W.E. et al., Allergy 1993; 48:110-116
【非特許文献１０】Kawagishi H., et al., Phytochemistry 1993;32:239-241
【非特許文献１１】Kino K.，et al., J. Biol Chem. 1989; Jan 5; 264(1):472-8
【非特許文献１２】Romanos M.A，et al., Yeast 1992; 8: 423-488
【特許文献１】米国Patent No.5，334，704
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
現在の段階で、LZ-8は複雑な時間のかかる精製プロトコル (たとえば抽出、米国Patent No.5,334,704) によりマンネンダケから入手できるだけである。マンネンダケの大きな需要があるが、自然なマンネンダケはまれであり、険しい山にある老い木で成長するだけである。 したがって、引き続き高品質のGanodermaの供給を提供するテクニックが必要である。 現在、LZ-8の大規模な生産のために、利用できるプロトコルが全くないのである。
【０００９】
以前の研究(米国Patent No.5，334，704)で報告されたプロトコルを采用し、抽出と純化によるマンネンダケ免疫調節タンパク質の生産は効率が低く、より高い費用を必要とする。 また、大腸菌を采用するマンネンダケ免疫調節タンパク質を作り出す他の方法には菌体内毒素汚染を持つ可能があり、純化の方法はなおより高い費用がかかる。マンネンダケ免疫調節タンパク質を作り出すのに哺乳類のセルを使用する方法は、高価な培地を必要とし、ウイルスおよび前もって汚染に会う可能性がある。
【００１０】
米国Patent No. 5,334,704では、ganodermaから分離した糖蛋白質は免疫抑制性の活性があることを掲示した。 糖蛋白質の精製はganoderma菌糸を培養し、水の溶剤で産物の菌糸を抽出し、産物の提出物からターゲットの蛋白質を純かするステップなどを含んでいる。 その特許のテクニックにおいては、真菌を育てることと真菌からターゲットの蛋白質を純かすることがより高い費用を必要とし、生体外に微生物を育てることよりもっと複雑で、産業応用を行うのは難しい。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
この発明は図1(I)に描いたように核酸配列を含む分離した核酸分子を提供する。
【００１２】
この発明は、またベクターと、ベクターによりトランスフォームしたホスト細胞を提供する。
【００１３】
この発明はさらにFIPを含むホスト細胞を精製するための方法を提供する。
【００１４】
この発明はさらに前述の方法で精製されたFIPを提供する。
【００１５】
この発明はさらに前述のFIPを含むホスト細胞の用途を提供する。
【００１６】
この発明はさらにベクターにより、トランスフォームした前述のホスト細胞からFIPの純化する方法を提供する。
【００１７】
この発明はさらに発明のFIPを含む組成物を提供する。この組成物は化粧品、製薬品、食物、および食物添加物に適用される。
【００１８】
この発明はさらに対象に対して、その免疫活性調節するためにFIPまたはFIPの融合したタンパク質の口服の方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
Bakerのイーストとマンネンダケは菌類界に属するため、マンネンダケから異種類のタンパク質を発現するとき、イーストがマンネンダケと類似するタンパク質の変更(たとえば, 糖鎖付加とジスルフィドボンドの構成など)を行うと予想される。
【００２０】
現在の発明は以下の核酸配列を含むふ一つの分離した核酸分子を提供する:
ATGTCTGATA CTGCTTTGAT TTTCAGATTG GCTTGGGATG TTAAGAAGTT GTCTTTCGAT TACACTCCAA ACTGGGGTAG AGGTAACCCA AACAACTTCA TTGATACTGT TACTTTCCCA AAGGTTTTGA CTGATAAGGC TTACACTTAC AGAGTTGCTG TTTCTGGTAG AAACTTGGGT GTTAAGCCAT CTTACGCTGT TGAATCTGAT GGTTCTCAAA AGGTTAACTT CTTGGAATAC AACTCTGGTT ACGGTATTGC TGATACTAAC ACTATTCAAG TTTTCGTTGT TGATCCAGAT ACTAACAACG ATTTCATTAT TGCTCAATGG AACTGA
【００２１】
この発明はさらに分泌のための追加シグナル配列に結紮した前述の核酸分子を提供する。したがって、ホスト細胞で発現されたFIPは、新しい結紮核酸分子により、トランスフォームされ、直接細胞外液に分泌され、ホスト細胞と低い費用で容易に切り離されるのである。
【００２２】
この発明はさらに前述の核酸分子を他の遺伝子と結紮することにより、発生できる結紮の遺伝子を提供する。 異なったタンパク質で構成された融合タンパク質は、二つの合成タンパク質の付加的なバイオ機能を提供するために発生された(Weisbart RH, Cancer Lett. 2003;195(2):211-9.)。FIPが消化系で吸収できたため、他のタンパク質と融合することにより、FIPを配送システムとして他のタンパク質を目標有機体の中に運ぶことができる。また、融合タンパク質の口服は目標有機体に対する融合遺伝子の二つの遺伝子合成物に利益を提供するべきである。
【００２３】
この発明はさらに前述の核酸分子を含むベクターを提供する。 このベクターはホスト細胞にトランスフォームされる。このベクターは異なった用途と条件により、循環できるまたはプラスミッドにインテグレートできる。
【００２４】
この発明はさらに前述のベクターのトランスフォームしたホスト細胞を提供する。 このホスト細胞は、バクテリア、真菌セルまたはイーストセルの可能である。この前述のホストセルは完全または破裂した形の可能である。
【００２５】
前述のホスト細胞の都合のよい体現として、Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Candida utilis, Candida boidinii, Candida maltosa, Kluyveromyces lactis, Yarrowia lipolytica, Schwanniomyces occidentalis, Schizosaccaromyces pombe, Torulopsis, Arxula adeninivorans, またはAspergillus (A. nidulans, A. niger, A. awamori, A. oryzae), Tricoderma (T. reesei)などが挙げられる。 また，植物からのセルはなおホスト細胞の都合のよい体現である。
【００２６】
また，この発明はFIPを持っているホスト細胞を精製するための方法を提供する。この方法は(a)改良された挿入のFIPヌクレオチド配列を持っている発現ベクターのコンストラクション； (b) ベクターによるホスト細胞のトランスフォーム; そして(c)適切な条件のもとでトランスフォームしたホスト細胞の培養を含む。この発明のタンパク質の都合のよい体現として、図3で描かれる。前述のホスト細胞のよい体現として、Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Candida utilis, Candida boidinii, Candida maltosa, Kluyveromyces lactis, Yarrowia lipolytica, Schwanniomyces occidentalis, Schizosaccaromyces pombe, Torulopsis, Arxula adeninivorans, またはAspergillus (A. nidulans, A. niger, A. awamori, A. oryzae), Tricoderma (T. reesei)などが挙げられる。 また，植物からのセルはなおホスト細胞の都合のよい体現である。ステップ(bとc)中のホスト細胞の最も都合のよい体現はSaccharomyces cerevisiaeである。ステップ(b)におけるベクターは、図4(II、III)で描くようにpYB101-FIP-イーストまたはpYB101-FIP-lzである。 菌類でよく発現したFIPコドン(図1(I))はその高いtRNA翻訳効率に基づいて選ばれた。(Sorensen MA, Pedersen S. J Mol Biol. 1991; 222(2):265-80).
【００２７】
この発明はさらにFIPを含むホスト細胞の用途を提供する。 例えば、FIPを含む完全なイーストは口服できる、しかもホストからタンパク質を精製しないで目標有機体により吸収できて、利用の費用を削減する。
【００２８】
この発明はさらに前述のベクターで前述のトランスフォームしたホスト細胞からFIPを純化する方法を提供し、この方法は(a)溶剤にホスト細胞を溶解し; (b)セルを破砕させ、(c) pH 4-5まで溶液を調整し; (d) セル抽出物から残骸を分離し; (e) 上澄みを遠心分離し; (f) pH 4-5に整備したカラムに上澄みを加え; そして(g) マンネンダケ免疫調節タンパク質を洗浄することを含む。 特に、純化する方法は(a) 5-50 mM PBS(シグマ)で発酵したイースト1:5-1:20(v/v)を溶け; (b) 破粋機でセル抽出物の中のセルを破裂させ、(c) pH 4-5まで溶液を調整し; (d) 3000gで15分間の遠心することにより、残骸を分離し; (e) 再び1分間の1,2000gで上澄みを分離し; (f) pH 4-5に調整したCM Sepharoseカラム(Amersham Biosciences)へ上澄みを加え; そして(g)20-50mMのpH 4-5酢酸を加え、マンネンダケ免疫調節タンパク質を洗浄するステップを含む。
【００２９】
また,この発明は前述の方法で精製した発明のタンパク質を提供する。
【００３０】
また,この発明はFIPまたはFIPを含むホスト細胞を通じて対象に投与されるルートに関連する。投与経路は静脈内、腹内、口服、粘膜、皮膚吸着、または他の利用可能なルートから選択される。 経口投与は都合のよいルートである。 例えば, 溶液にFIPの含むホスト細胞を浸すことができる、そしてFIPはサカナに対する彼らのエラを通じて吸収される。
【００３１】
FIPまたはFIPを含むホスト細胞が投与できる対象の都合のよい体現は哺乳動物、魚、甲殻類と家禽である。ブタとトリはそれぞれ都合のよい哺乳動物と家禽である。グルーパー、サケおよびマスは都合のよい魚である。 エビ、ロブスター、Penaeus monodon、Penaeus japonicusおよびPenaeus vannameiは都合のよい甲殻類である。
【００３２】
また,この発明は真菌免疫調節タンパク質を含む経口投与のルートによって免疫活動を調節する際に使用のための組成物に関連する。真菌免疫調節タンパク質は自然なマンネンダケまたはこの発明の方法の真菌免疫調節タンパク質から精製される。 この発明のタンパク質の機能について行われた研究によると、前述の組成物は炎症と過敏性を減少させる薬物の用途、免疫活性の調節、糖尿病の予防、喘息の改良、バクテリアそしてウイルス性の感染に対する免疫反応の調節、臓器移植に対する免疫反応の調節; 長生きさせるための食物および食物添加物、免疫活動の調節、食事変更の増加(すなわち、体重に変換された食事量の重さのレート)、そして例えばストレスによる炎症でネガティブ免疫反応の調節(Black PH, Brain Behav Immun. 2003 Oct;17(5):350-64) に適用することができた。
【００３３】
この発明はさらにFIPの経口で対象に投与によって免疫失調を調節する方法を提供する。このタンパク質は大腸菌または菌類例えばSaccharomyces cerevisiaeから精製できる。
【００３４】
この発明はさらに0050ハーブ(例えばマンネンダケ)、食物、飲料、化粧品、食物添加物またはドラッグ中のFIPの量を測定する免疫学アッセイ, 例えばウエスタン・ブロットまたは酵素結合免疫吸着検定法 (エリザ)( (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., pp: 18.60-18.75) を提供する。
【００３５】
この発明のタンパク質を含む組成物は処方のタイプに関する技術での従来の他の薬剤が含まれるのであろう。例えば、経口投与に適するそれらの処方は甘味料、増粘剤および香料薬剤が含まれる。
【００３６】
この発明のタンパク質を含む組成物における適切な成分は病気のタイプ、重さおよびステージに依頼し、異なった個人の中で変わることができるのであろう。
【００３７】
以下の例はこの発明を制限するのではなく、例証するのが意図される。
【実施例】
【００３８】
実施例1: pYB101-FIP-イーストとpYB101-FIP-lzの発現ベクターの精製
FIP-イーストとFIP-lzのコンストラクション
FIP-イーストのDNA配列は図1(I)でとFIP-lzは図1(II)でえがかれた。Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991 May 15:88(10): 4084-4088. によって、DNA配列は精製された。 Natl。 Acad。 Sci。 米国。 1991 5月15日: 88(10)、: 4084-4088.
【００３９】
FIP-イーストとFIP-lzのプライマーの精製
マンネンダケ免疫調節タンパク質 (J.Biol. Chem1991; 266(4)、2486-2493)をコードする知られているDNA配列によって、商品供給者(台湾のMission Biotech株式会社)からFIP-イーストとFIP-lzのフオーワードとリバースのプライマーを購入した。 PmlIとBamHIの制限部位は図2(I)と2(II)で描いたようにプライマーの両端に加えられた。 PCR反応は、必要なプライマーを得るために実行された。増幅されたプライマーは配列され、それらの配列は確認された。
【００４０】
発現ベクターpYB101、pYB101-FIP-イーストおよびpYB101-FIP-lzのコンストラクション
現在利用できるテクニックを使用し、栄養選択マーカーとイースト転写の起源を提供するためにガラクトースプロモーター、遺伝子Ura3、および2μoriは、それぞれpYB(Yeastern Biotech株式会社、台湾)にイントロデュースされた。 新しいベクター、図4(I)に描いたのようなpYB101はBY4741またはDY150などの知られているベイカーのイーストにトランスフォームされる。pYB101とFIP-イーストおよびFIP-lzをコードするDNA配列のベクターは制限酵素のPmlIとBamHI(New England Biolabs, Beverly, USA)によって消化された。消化された断片は、PCR Cleaning Up Purification Kit(Viogene、台湾)を使用し、精製された。図4(II)と(III)に描いたようにそれぞれpYB101-FIP-イーストとpYB101-FIP-lzの精製するためにFIP-イーストおよびFIP-lzの消化された断片の三つのモルはT4 DNA合成酵素(New England Biolabs, Beverly, USA)によって消化された断片pYB101の一つのモルに結紮された。
【００４１】
pYB101-FIP-イーストとpYB101-FIP-lzの大腸菌へのトランスフォーメーション
標準のトランスフォーメーションのテクニック(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. pp: 1.82-1.84)を使用し、pYB101-FIP-イーストとpYB101-FIP-lzによって大腸菌DH5αはトランスフォームされた。商業的に利用できるDNA抽出キット(Mini-M Plasmid DNA Extraction Kit, Viogene, 台湾)を使用し、トランスフォームされた大腸菌から多量のpYB101-FIP-イーストとpYB101-FIP-lzが入手できた。
【００４２】
実施例2: 少量のFIP-イーストとFIP-lzタンパク質の精製
pYB101-FIP-イーストとpYB101-FIP-lzのBakerのイーストへのトランスフォーメーション
Bakerのイースト(BY4741およびDY150)はイーストトランスフォーメーションキット(Yeastern Biotech株式会社、台湾)を使用し、1μgのpYB101-FIP-イーストまたはpYB101-FIP-lzによってトランスフォームされた。
【００４３】
栄養状態によってトランスフォームされたイーストの選択
上で述べたトランスフォームされたイーストは、YNBDメディア(アミノ酸(Difco、イギリス)のない0.17%のBacto Yeast Nitrogen Base、0.5%のアンモニア硫酸塩、2%のブドウ糖、2%の寒天(シグマ、米国))で広げられ、培養された。 栄養欠陥型BY4741(MAT a his3delta1 leu2delta0 met15delta0 ura3delta0)とDY150(MAT a ura3-52 leu2-3 112trp1-1 his3-11、15、ade2-1 can1-100) を使用し、0.0024%のヒスチジン、0.0072%のロイシンおよび0.0012%のメチオニン(BY4741),または0.0072%のロイシン、0.0048%のトリプトファン、0.0024%のヒスチジンおよび0.0024%のアデニン(DY150)(シグマ、米国)は 培養の前にYNBDメディアに追加された。 このメディアは30℃で2-3日間維持された。トランスフォームされたイーストを選択するためにメディアでウラシルが供給されなかった。 ベクターpYB101-FIP-イーストとpYB101-FIP-lzの両方がウラシルをコードする遺伝子を所有している。したがって、トランスフォームされたBakerのイーストは、そのようなウラシルを所有し、ウラシルをメディアに提供しないで、生き残ることができるが、トランスフォームされなかったイーストは生き残ることができない。
【００４４】
アジテーターでわずかなボリュームのトランスフォームされたイーストをテストする
【００４５】
上で述べたトランスフォームされたイーストの二つの栄養欠陥ストレインは実施例2で説明されるように必要な栄養の加えられた50mlのYNBDメディアに接種された。 培養は30℃と250rpmで3日間育てられた。イースト培養は遠心され、ブドウ糖を取り除くためにYNB培地で3回、洗われた。 そして、イースト培養は50mlの必要な栄養を持っているYNBG培地(アミノ酸のない0.17%のBacto Yeast Nitrogen Base、0.5%のアンモニア硫酸塩、2%のガラクトース)で0.1OD600nmに調整された。イースト培養は30℃と250rpmで育てられた。 イーストの濃度はOD600nmを測定するのに、分光光度計Ultrospec2100プロ(Amersham Pharmacia biotech, 米国)を使用し、毎日モニターし、そして1mlのイーストのサンプルは毎日取り入れられた。 このサンプルは、Microfuge18 Centrifug (Bechman Coulter、米国)を使用して、5分間10000 X gで遠心され、またイーストマスを得るために3回洗われた。マスは-20℃で保存された。
【００４６】
実施例3:ウエスタンブロット解析を使用して、トランスフォームされたイーストから発現したマンネンダケ免疫調節タンパク質の定量化
取り入れられたイーストマスはPBS(シグマ、米国)でOD600nm=0.5に希釈された。 希釈されたマスは、2 X SDSサンプルバッファ(シグマ、米国)の中に溶かされ、100℃で3分間加熱された。 冷却の後に、10μlの希釈されたマスはネイチャー(1970)227(680-685)で説明されたプロトコルに従って、100ボルトでSDS-ページにかけられた。
【００４７】
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., pp: 18.60-18.75内の標準のプロトコルによって、ウエスタン・ブロットは実行された: Semi-PHOR(Hoefer Scientific Instruments、サンフランシスコ)を使用し、50mAの電気泳動によって、すべてのタンパク質を移されるまでゲル上のタンパク質はPVDF膜(Hybond-P, Amersham Bioscience, 米国)に移された。 そして、膜は37℃で1時間、ブロッキングバッファの中に浸され、また4℃で夜通した。ブロッキングバッファの取り外しの後、ブロッキングバッファ内の10-3 Xのウサギ抗マンネンダケ免疫調節タンパク質血清(Advance Bio-Pharm Inc.、台湾)は加えられ、1時間37℃で膜とインキュベートされた。血清を取り除いて、洗濯バッファで膜を洗った後, 10-4 HRP標識されたマウス抗ウサギの血清(シグマ、米国)は加えられ、1時間37℃で膜とインキュベートされた。 洗濯バッファで膜を洗った後に、色のインディケータTMB(シグマ、米国)は、色を発生するように加えられた。 ウエスタン・ブロット分析を終了するために、色が水を加えることにより現れると、呈色反応は終えられた。 最終的な結果は図5で示される。
【００４８】
図5(I、II) の中に、MとSは標準のタンパク質マーカーと大腸菌から純化した標準のFIPである。グループ1-4は改良されたFIPコドンによって発現されたFIPであった。 グループ2-5はオリジナルのFIPコドンによって発現されたFIPであった。図5(I)で示されるように、グループ1-3はFIPがを明確に発現されたが、FIPはグループ5-8で検出されなかった。この結果は、イーストで改良されたFIPコドンがイーストに高く発現できることを示す。
【００４９】
実施例4: 発現ベクターpYB101s-FIPの精製
FIPのコンストラクション
FIPのテンプレート配列は描かれ、FIP-イーストの配列は図で1(I)に描かれた。 DNA配列は例3で説明されたように精製された。 イーストBY4741はトランスフォームのホストとして選定された。
【００５０】
FIPのプライマーの精製
商品供給者(Mission Biotech株式会社, 台湾)からFIP-イーストとFIP-lzのフオーワードとリバースのプライマーを購入した。PCR反応は、テンプレートとしてpYB101-FIP-イースト(図4)を使用することで実行された。PmlIとBamHIのレストリクションサイトは図6(I)と(II)で描いたようにプライマーに加えられた。PCR反応は、必要なプライマーを得るために実行された。増幅されたDNAは(Mission Biotech株式会社、台湾)に送られ、それらの配列を確認した。
【００５１】
発現ベクターのpYB-101とpYB101s-FIPのコンストラクション
現在利用できるテクニックを使用し、栄養選択マーカー、イースト転写の起源、および分泌信号を提供するためにガラクトースプロモーター、遺伝子Ura3、2μoriおよびα−ファクターリーダー・シーケンス(図7で描いたように)は、それぞれpYB(Yeastern Biotech株式会社、台湾)にイントロデュースされた。新しいベクター、図8(I)に描いたのようなpYB101はBY4741などの知られているBakerのイーストにトランスフォームされる。そして、彼らの配列は(Yeastern Biotech株式会社、台湾)確認された。
【００５２】
ベクターpYB101とFIPをコードするDNA配列は制限酵素のPmlIとXhoI (New England Biolabs, Beverly, USA)によって消化された。消化された断片は、PCR Cleaning Up Purificationキット(Viogene、台湾)を使用し、純かされた。図8(II)で描いたようにpYB101s-FIPの精製するためにFIPの消化された断片の三つのモルはT4 DNA合成酵素(New England Biolabs, Beverly, USA)により消化されたpYB101sの一つのモルに結紮された。
【００５３】
大腸菌へのpYB101s-FIPのトランスフォーメーション
実施例1で説明されたように大腸菌DH5αはpYB101s-FIPでトランスフォームされた。トランスフォームされた大腸菌からpYB101s-FIPの多量を得ることができた。
【００５４】
実施例5: FIPの少量の精製
BakerのイースBY4741へのpYB101s-FIPのトランスフォーメーション
BakerのBY4741は1μgのpYB101s-FIPで実施例2で説明されるようにトランスフォームされた。
【００５５】
栄養状態によるトランスフォームされたイーストの選択
実施例2で説明された同じプロトコルによって、上で述べたトランスフォームされたイーストはYNBD寒天(0.0024%のヒスチジン、0.0072%のロイシン、および0.0012%のメチオニン)から選択された。
【００５６】
アジテーターでわずかなボリュームのトランスフォームされたイーストをテストする
【００５７】
上で述べたトランスフォームされたイーストは実施例2で説明されるように必要な栄養の加えられた50mlのYNBDメディアに接種された。FIPタンパク質の生産はガラクトースをメディアに追加することによって、誘導され、分泌されたFIPは毎日集められた。
【００５８】
実施例6: SDS-ページを使用し、トランスフォームされたイーストから発現したFIPの定量化
サンプルFIPタンパク質は例3で説明されたようにSDS-ページによって分析された。 また、ゲルは、Coomassie brilliant blue G-250(シグマ)で30分間で染められ、タンパク質バンドが明確になるまで脱色溶液(20%のメタノール、10%の酢酸)で脱色した。染色結果は図9で示される。
【００５９】
実施例7: 50 L発酵の方法
50mlフラスコ内でのイースト接種。
マンネンダケ免疫調節タンパク質を作り出すトランスフォームされたイーストはウエスタンブロット解析によって選択され、実施例2でのように必要な栄養と共に50mlのYNBDメディアに接種された。培養は30℃と250rpmで24時間維持された。
【００６０】
2000mlフラスコでのイースト接種。
上で述べた50mlの培養は2000mlフラスコ中の450 ml同じメディアに接種された。培養は30℃と250rpmで24時間維持された。
【００６１】
50L発酵槽(Chuan Tai工場、台湾)内のイースト発酵。
上で述べた500mlの培養はブドウ糖を取り除くためにYNBメディアで二回で遠心分離され、洗われた。イースト濃度は例2のように50mlの共に必要な栄養を持っているYNBG培地(アミノ酸のない0.17%のBacto Yeast Nitrogen Base、0.5%のアンモニア硫酸塩、2%のガラクトース(シグマ、米国))で0.1OD600nmに調整された。イースト培養は25-30℃、400-500rpm、pH4.5-5.5で3日間育てられた。pH値は2MのNaOHとHCl(シグマ、米国)の必要な量を加えることによって、調整された。 発酵槽での圧力は0.2-0.4kg/cm2で維持され、40-50L/分の換気は0.2μmのフィルタで濾過された。
【００６２】
50L発酵槽でのマンネンダケ免疫調節タンパク質の定量化
実施例3で発酵培養からいくつかのサンプルを取り、サンプル内のマンネンダケ免疫調節タンパク質はウエスタンブロット解析で決定した。図10で示されたように、50L発酵槽からの製品にはマンネンダケ免疫調節タンパク質がある。
【００６３】
実施例8: トランスフォームされたイーストから発現したマンネンダケ免疫調節タンパク質の活性アッセイ
総セル抽出物の精製
取り入れられたイーストマスは、PBSと共に洗われ、3回遠心された。 イーストペレットは集められ、ペレットと同じボリュームの0.4mmのガラス玉は加えられた。混合物は4℃で20秒間旋転され、1分間氷に置かれた。このステップは5回繰り返された。5分間、4℃で1,5000rpmで遠心分離した後、上澄みは総セル抽出物として使用された。
【００６４】
サンプルは遠心され、上澄みは保有された。上澄みは、0.2μmの膜(Sartorius)によって濾過され、後の使用のために保存された。
【００６５】
人の末梢血単核細胞(PMNC)の精製
ヘパリン化末梢血が大人達から集められ、Ficoll-paque培養メディア(Amersham Biosciences)が血液サンプルに加えられた。Amershamのプロトコルによって、溶液はPMNCを切り離すために遠心された。 セルは組織培養のために24-孔のプレートの中に1 X 106セル/mlの濃度でプレートされた。各1mlの培養メディアは10%のFBS、100μg/mlのストレプトマイシン、100ユニット/mlのペニシリン、および200mM L-グルタミン酸塩のRPMI1640メディア(GIBCO、グランドアイランド(ニューヨーク)) を含む。セルは37℃で成長した後,0時間、24時間または48時間培養された。
【００６６】
サイトカインのアッセイ:
セルは加えられた異なった濃度のマンネンダケ免疫調節タンパク質を含む24-孔のプレート(Nunc, Roskilde, Denmark)の中に1 X 106セル/mlの濃度でプレートされた。セルは培養され、インターフェロンγの活性が市販のキット(R&D Systems, Minneapolis, MN)を使用することで、検査された。 結果は図11で示される。 図11では、バッチ１とバッチ2は異なった濃度のFIPの加えられたサンプルであった。 PHA(植物凝集素、Sigma)は標準の酵素結合免疫吸着検定法のテクニックを采用し、インターフェロンγの活性をテストするのに使用された (免疫学、1998年のジャーナル、161: 2114-2119) 。空白とイーストグループのインターフェロンγの活性は明確にわずかしか示さなかったが, バッチ1と2は、その中に純化したFIPがあったまたはPHAがセルに加えられ、明確なインターフェロンγの活性を示した。結果は、48時間育てられたPMNCに4μgの純化したFIPを加えると他のタンパク質を加えることより多くのインターフェロンγを誘導できることを示した。また、結果は、50L発酵方法からのサンプルがインターフェロンγの量を増加させたこと、しかもFIPの活性がイーストの結果でないことを示した。
【００６７】
実施例9: FIPの純化
発酵しているイーストは1:10 (v/v) 20mM PBS(シグマ)、pH6.0で溶かされた。セルは破砕機(Basic Z model (Constant System Ltd. UK))によって30Kpsiの下で破砕された。 この溶液のpHは1Mの酢酸を加えることにより、pH4-5に変更された。この溶液15分間の3000gで遠心。 上澄みは切り離され、1分間の1,2000gで、再び遠心分離された。この上澄みの10mLはCM Sepharoseカラム(Amersham Biosciences)の30mLに加えられた。このカラムは20-50 mM酢酸によって平衡され、pH4-5を維持した。 20-50 mM酢酸溶液、pH4-5および洗浄したマンネンダケ免疫調節タンパク質を加えた。
【００６８】
図12 (I) から,F3、F4およびF5が3番目、4番目および5番目の収集チューブからのサンプルを表す。 F3とF4には、より高いmAU値が明確にあった。また、 F3とF4は図12(II)で示されるようにSDS-PAGEによってさらに分析された。 図12(II)では、F3、F4およびF5は3番目、4番目および5番目の収集チューブであった。 STDは標準チューブを代表する(純化した大腸菌から生産したFIP)。 Mは標準の分子の重さであった。F3とF4のタンパク質はSTDと同じ分子の重さを示した。さらに、 F3とF4のタンパク質バンドは、ウエスタン・ブロットによってFIPであると確認された。 この結果は、F3とF4のFIPが非常に高い純度であることを示した。
【００６９】
実施例10: マンネンダケタンパク質の応用
食物添加物としてのマンネンダケタンパク質の応用
マンネンダケタンパク質の毒性試験
5.9gの平均重量と7.25cmの平均長さがあるグルーパーは25℃と33ppt塩度で集められた。純化したFIPは実施例9のように5、1、0.25 μg/魚/0.1mlの濃度で腹内により、若いグルーパーに投予された。PBS溶液がコントロールグループに投予された。これらの魚は14日間オリジナルの流水で成長した。魚の死亡率は毎日記録された。死亡は全く最初の2週間で観察されなかった。したがって、上の濃度でのFIPはグルーパーに少しの毒性も示さなかった。
【００７０】
FIPによる非特異免疫反応の増進
FIPでグルーパーの原腎臓セルを処理するのによる非特異免疫反応の生体外の増進
市場から600グラムのグルーパーを購入した。原腎臓セルは培養され、そして食細胞が標準の培養のテクニックを使用することで切り離された。原腎臓セルはグルーパーの非特異免疫反応に影響する主なセルである(Engelsma MY, Fish Shellfish Immunol. 2003 Nov;15(5):397-410)。これらのセルはAL-10培養溶液(L15(Gibco): AIM5(Gibco)=1:1)に混濁され、そして0.1mlは96孔プレート(コーニング)に107/mlの濃度で接種された。 このプレートは25゜Cで2時間維持された。
【００７１】
濃度2、1、0.5、0.2および0.02 μg/0.1mlのFIPは室温で2時間の原腎臓の培養に加えられた。 ニトロブルー テトラゾリウム アッセイ(NBTアッセイ、Sigma)は、非特異免疫反応のを測定するために実行された。A620nm値が高いであれば、非特異食作用の増進はより高いである。
【００７２】
原腎臓セルへのFIPの付加は食作用を機能アップする、またそれはNBT分析評価で測定された。 図13で示されるように、2、1、および0.5μg/0.1mlのFIPを加えると、原腎臓セルの食作用を明確に増加させ、それはFIPが非特異免疫反応をアップすることができるのを示す。
【００７３】
イリドウイルスに対するFIPの魚の保護
グルーパーは前の実験で言われたようにPBSまたはFIPの腹内によって投与された。 3週間の成長後、0.1mlの10,000 x TCID50のウイルスの投与量をこれらの魚の腹膜に与えた。魚の死亡率は毎日記録された。一般に、イリドウイルスの腹内による投与されたグルーパーは2週間で死んだ。 図14で示されるように、FIPの最も高い投与量、5μg FIP/魚/0.11mlで投与された魚は2週間後に70%の死亡率を示した。したがって、30%の保護率が2週間で達成された。
【００７４】
ビブリオ（Vibrio harveyi）感染に対するFIPの魚の保護
100匹のグルーパー(Epinephelus malabevicus、52.9gの平均重量)は5つのグループに分かれた。 各グループは20匹のグルーパーを含んだ:
1. PBSのコントロール;
2. 20mgのオリジナルのイースト/60g体重を食べさせたグルーパー;
3. 20mgのFIPを含むイースト/60g体重を食べさせたグルーパー;
4. 4mgのFIPを含むイースト/60g体重を食べさせたグルーパー;
5. 0.8mgのFIPを含むイースト/60g体重を食べさせたグルーパー;
【００７５】
2日間に一度各グループは与えられた。7日後に、各グループはVibrio harvey感染によって攻撃された。
【００７６】
グルーパーは準致死量(LD50) 3X106CFU /mlの10倍のVibrio harveyで攻撃された。それぞれのグループの10匹の魚からの血液サンプルが攻撃の前に集められた。 リゾチーム活性を含む非特異免疫反応は、述べた血液サンプルでテストされた。他のそれぞれのグループの10匹の魚がVibrio harveyで攻撃された。 魚の生存力、食事、および死亡率は毎日記録された。
【００７７】
図15で示されるようにVibrio harvey感染攻撃後、PBSとオリジナルのイーストグループの5日目の生存率は10-20%まで、かなり低下であったが、FIPを包括しているイーストグループは60-80 %以内であり、そのFIPの経口投与が十分に魚の免疫力を強め、魚の寿命を伸すことを示唆している。
【００７８】
実施例11: FIPまたはDer p IIの提出物によって再刺激したBalb/cネズミからのDer p II-感作した脾細胞のインターフェロンγの測定。
FIPまたはDer pの刺激
脾臓セルがDer p(イエダニDermatophagoides抗原(Der pII))の感作したBalb/cネズミの2つのグループから集められた。 FIPグループのネズミは2日間あたり2μgのFIPを飼われた。 Der pグループのネズミは、1日目と7日目にDer Pを腹内で投与され、14日目にDer pでスプレーした。 ネズミは15日目に殺され、脾臓セルは集められた。
【００７９】
ネズミから分離した脾細胞が6 X 106 cells/mlで5%のRPMI-1640メディアに培養された。また、脾細胞は10 μg/mlのDer pおよび2 μg/mlのFIPによって再刺激された。コントロールグループにおける脾細胞にPBS溶液が加えられた。培養の上澄みは48時間後に集められ、生産されたインターフェロンγの量が分析された。
【００８０】
図16では、Der pはDer p IIを指示した。 FIP-gtsはFIPを指示する。コントロールグループのBalb/cネズミとFIP(81.8pg/ml)の飼ったBalb/cネズミからの脾細胞の間に産生されたインターフェロンγの量には全く違いがなかった。さらに、FIPで飼わなかったBalb/cネズミまたはDer p刺激されたネズミからの脾細胞は、もしFIPで再刺激するとコントロールより多くのインターフェロンγ(463.8と1100.7)を産生する。この実験は、FIPが経口投与を通じて機能することができ、免疫学活性を調節することを証明し, 特に直接アナフイラキシンを抑制する。
【００８１】
この発明はそれを作り、またはそれを使用する技術を熟成している人達に対して十分詳細に説明され、例示された時,様々な代替手段、変更および改良がこの発明の精神と範囲から離れない、明らかであるべきである。
【００８２】
技術に熟練した人は、この発明が目標を実行し、終点と前の述べた利点を入手し、またそこに固有のそれらに充分適合するように容易に評価できる。それらを生産するためのプラスミッド、細胞株、用途、方法および方法は都合のよい体現の代表であり、例証であり、そしてこの発明の範囲での制限として意図されない。技術に熟練した人に対してそこに変更と他の用途は起るであろう。これらの変更は、この発明の精神の中に包括され、またはクレームの範囲によって定義される。
【００８３】
当該技術に熟達した者に対して、この発明に対する各種異なった代替と変更がここで掲示された発明の範囲と精神から離れないでできることは容易に明らかであろう。
【００８４】
仕様で述べたすべての特許と発行物が発明に関係する技術の普通の技能のもののレベルを指示している。すべての特許と発行物はそれぞれの個々の発行物が参照に従って特別と個別に指示されて取り入れられるように同一程度の参照に従って取り入れられた。
【００８５】
ここで実施例として適当に説明した発明はどんな要素または原理と制限または限度がない場合で実行できる、ここで別に明らかにされない。採用している用語と表現が叙述の用語として使用されていて、制限はなく,しかもそのような用語と表現の使用中に表したおよび述べた特徴のどんな対応の用語またはその部分を除くつもりはないが、この発明の要求の範囲の中で様々な変更が可能であると認識される。したがって、現在の発明が都合のよい体現化とオプション特徴によって明確に明らかにされ、ここで掲示された概念の変更と変化が技術に熟練した人によって再び分類されるかもしれないが、追加されたクレームで定義されるようにこの発明の範囲の中にそのような変更と変化があると考えられるのは理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】図1は、Saccharomyces cerevisiae，FIP-イーストにより発現した(I)改良したFIPコドンのヌクレオチド配列； (II) Ganoderma lucidium、FIP-lzにより発現したオリジナルFIPコドンを示す。
【図２】図2はSaccharomyces cerevisiaeの改良したコドンのフオーワードとリバースのプライマー，FIP-イーストのヌクレオチド配列と(I) レストリクションサイト; (II) Ganoderma lucidiumのオリジナルコドンのフオーワードとリバースのプライマー，FIP-lzを示す。
【図３】図3はGanoderma lucidium、Ganoderma tsugae、およびFlamnulina velutipsに発現したFIPアミノ酸配列の比較を示す。同じアミノ酸は太字で示される。
【図４】図4はプラスミッド(I)pYB101(II)pYB101-FIP-イースト(III)pYB101-FIP-lzの構造マップを証明する。
【図５】図5は(I)pYB101-FIP-イーストまたは(II)pYB101-FIP-lzを採用し、トランスフォームしたイースト(DY150またはby4741)で発現したFIPの定量化を示す。 M: 分子マス175、83、62、47.5、32.5、25、16.5、および6.5Kdを見せる標準のタンパク質。 S:トランスフォームした大腸菌から精製した標準のFIP。レーン1-2: pYB101-FIP-イーストでトランスフォームしたDy150イーストNo.1-2。 レーン3-4: pYB101-FIP-イーストでトランスフォームしたBy4741イーストNo.1-2。 レーン5-6:pYB101-FIP-lzでトランスフォームしたBy4741イーストNo.1-2。 レーン7-8: pYB101-FIP-lzでトランスフォームしたDy150イーストNo.1-2。
【図６】図6はヌクレオチド配列とFIPのフオーワード(I)とリバース(II)のプライマーのレストリクションサイトを示す。
【図７】図7は、pYB101sとpYB101s-FIPを発生させるのによく使用されるα−ファクターのリーダー配列とレストリクションサイトを示す。レストリクションサイトは太字でマークされる。α−ファクターのリーダー配列とFIPの遺伝子の始めが矢でマークされる。
【図８】図8はプラスミッド(I)pYB101s(II)pYB101s-FIPの構造マップを示す。
【図９】図9はpYB101-FIPを採用し、トランスフォームしたイーストby4741で発現したFIPの定量化を示す。M: 分子マス175、83、62、47.5、32.5、25、16.5、および6.5Kdを見せる標準のタンパク質。 S:トランスフォームした大腸菌から精製した標準のFIP。レーン1-3: pYB101s-FIP-イーストでトランスフォームしたBy4741の1日目、2日目および3日目の培養。
【図１０】図10は、FIPを含むイーストの50L発酵のサンプルのウエスタン・ブロットを示す。 M: 標準のタンパク質。 S: 大腸菌から発生させた標準FIP。
【図１１】図11は異なった手順で精製した異なった濃度のFIPとインキュベートした末梢血セル(PBL)により、発生したインターフェロンγの量を示す。 空白: PBSのコントロール。 バッチ1: 最初の50L発酵の方法から精製した破裂したイーストの上澄み。バッチ2: 2番目の50L発酵の方法から精製した破裂したイーストの上澄み。イースト: 市場から購入した破裂したイーストの上澄み。 PHA: 植物性凝集素。
【図１２】図12は(I)AKTA(登録商標)エクスプローラー 10Sシステムを使用し、タンパク質フラクションの分析を描く。 F3、F4、およびF5は3番目、4番目、および5番目の収集されたサンプルチューブである。 (II)AKTA(登録商標)エクスプローラー 10Sシステムにより、収集された純化したFIPフラクションのSDS-ページ。 M: 分子マス175、83、62、47.5、32.5、25、16.5、および6.5Kdを見せる標準のタンパク質。STD: トランスフォームした大腸菌から精製した標準のFIP。
【図１３】図13は異なった濃度の純化したFIPでグルーパーの原始腎臓セルの上にNBTアッセイの結果を示す。コントロール: PBSのコントロール。
【図１４】図14は彼らの腹に異なった濃度の純化したFIPの注射後イリドウイルス(虹彩ウイルス)の感染を使用し、攻撃したグルーパーの死亡率を示す。 PBS: 0.25、1、5ug/0.1mlのウイルスの攻撃する前に0.1mlのPBSを腹内に注入する:ウイルスの攻撃する前に腹内に0.25, 1, 5 ug/0.1mlの純化したFIPを注射する。
【図１５】図15はFIPを含むイーストがグルーパーに餌をやられた後にVibrio harveyi感染の攻撃したグルーパーの生存率を示す。 PBS: 燐酸塩バッファのコントロール。20mg, 4mg, 0.8mg: グルーパーにFIPを含む20mg, 4mg, および0.8mgのイーストで食べさせた。 コントロール: グルーパーはトランスフォームしたイーストのない餌をやられた。
【図１６】図16はDer p II-感作し、FIPまたはDer p IIの提出物を共に再刺激したBALB/Cネズミの脾細胞のインターフェロンγの発現を描く。FIP-gts: FIP. Der p:イエダニDermatophagoides抗原(DER P2)。 コントロール: PBSのコントロール。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の核酸配列を含む真菌類免疫調節タンパク質をコードする単離した核酸分子:
ATGTCTGATA CTGCTTTGAT TTTCAGATTG GCTTGGGATG TTAAGAAGTT GTCTTTCGAT TACACTCCAA ACTGGGGTAG AGGTAACCCA AACAACTTCA TTGATACTGT TACTTTCCCA AAGGTTTTGA CTGATAAGGC TTACACTTAC AGAGTTGCTG TTTCTGGTAG AAACTTGGGT GTTAAGCCAT CTTACGCTGT TGAATCTGAT GGTTCTCAAA AGGTTAACTT CTTGGAATAC AACTCTGGTT ACGGTATTGC TGATACTAAC ACTATTCAAG TTTTCGTTGT TGATCCAGAT ACTAACAACG ATTTCATTAT TGCTCAATGG AACTGA。
【請求項２】
一つのデリバリーのシステムで発現される他の遺伝子に結紮される請求項１に記載の単離した核酸分子。
【請求項３】
請求項１に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項４】
請求項２に記載の結紮された核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項５】
請求項３または４に記載のベクターでトランスフォームしたホスト細胞。
【請求項６】
バクテリア、真菌セルまたはイーストセルである請求項５に記載のホスト細胞。
【請求項７】
Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Candida utilis, Candida boidinii, Candida maltosa, Kluyveromyces lactis, Yarrowia lipolytica, Schwanniomyces occidentalis, Schizosaccaromyces pombe, Torulopsis, Arxula adeninivorans, or Aspergillus (A. nidulans, A. niger, A. awamori, A. oryzae) or Tricoderma (T. reesei)である請求項５に記載のホスト細胞。
【請求項８】
イーストはSaccharomyces cerevisiaeである請求項５に記載のホスト細胞。
【請求項９】
完全または破砕したフォームである請求項５に記載のホスト細胞。
【請求項１０】
この発明のタンパク質を分泌することができる請求項５に記載のホスト細胞。
【請求項１１】
哺乳動物、魚、甲殻類、および家禽から成るグループから選択された対象に投与される請求項５に記載のホスト細胞。
【請求項１２】
投与が静脈内、腹内、口服、粘膜、皮膚吸着または液内の浸入を含むグループから選択されるルートによるのである請求項１１に記載のホスト細胞。
【請求項１３】
ルートは口服によるのである請求項１１に記載のホスト細胞。
【請求項１４】
哺乳動物はブタであり、家禽は鶏である請求項１１に記載のホスト細胞。
【請求項１５】
魚は、グルーパー、サケまたはマスである請求項１１に記載のホスト細胞。
【請求項１６】
甲殻類が、エビ、ロブスター、Penaeus monodon、Penaeus japonicusまたはPenaeus vannameiである請求項１１に記載のホスト細胞。
【請求項１７】
真菌類免疫調節タンパク質のあるホスト細胞の中でタンパク質を発現する方法であって、(a)ホスト細胞が好ましく挿入したFIPヌクレオチド配列を持っている発現ベクターのコンストラクション、(b) ベクターによるホスト細胞のトランスフォーム、そして(c)発現のための適切な条件のもとでホスト細胞を培養することを含む方法。
【請求項１８】
改良されたFIPヌクレオチド配列が請求項１に記載の核酸配列である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ(a)と(b)におけるホスト細胞がSaccharomyces cerevisiaeである請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
ステップ(b)におけるベクターがpYB101-FIP-イーストである請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１７に記載の方法によって精製した真菌類免疫調節タンパク質、および請求項１７に記載の方法でトランスフォームしたホスト細胞から分離した真菌類免疫調節タンパク質。
【請求項２２】
前記ベクターでトランスフォームしたホスト細胞からのFIPを純化する方法であって、以下のステップ：
(a) 溶剤の中に発酵した細胞を溶解する；
(b) セルを破砕させる；
(c) 溶液のpHを４〜５に調整する；
(d) セル抽出物内の残骸を分離する；
(e) 上澄みを遠心する；
(f) 上澄みをpH４〜５で平衡したカラムに加える；そして
(g) マンネンダケ真菌類免疫調節タンパク質を洗浄する
を含む方法。
【請求項２３】
マンネンダケ真菌類免疫調節タンパク質の洗浄はpH４〜５の20-50mM酢酸の添加による請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
真菌類免疫調節タンパク質を含む、口服ルートによる免疫活性の調節における使用ための組成物。
【請求項２５】
真菌類免疫調節タンパク質が自然なマンネンダケまたは請求項２１に記載の真菌類免疫調節タンパク質から精製したのである請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
炎症と過敏性を減少させるための化粧品用途に応用される請求項２４に記載の組成物。
【請求項２７】
炎症と過敏性の減少、免疫活性の調節、糖尿病の予防、喘息の改良、バクテリアとウイルス性の感染に対する反応の増加、臓器移植に対する免疫反応の減少するための薬物用途に応用される請求項２４に記載の組成物。
【請求項２８】
長生きさせるための食物および食物添加物、免疫活性の調節、食事変更の増加とストレスの減少のために応用される請求項２４に記載の組成物。
【請求項２９】
対象に対する真菌類免疫調節タンパク質またはFIP融合タンパク質の口服を含む免疫活性を調節する方法。
【請求項３０】
前記タンパク質が大腸菌またはSaccharomyces cerevisiaeから精製される請求項２９に記載の方法。
【請求項１】
以下の核酸配列を含む真菌類免疫調節タンパク質をコードする単離した核酸分子:
ATGTCTGATA CTGCTTTGAT TTTCAGATTG GCTTGGGATG TTAAGAAGTT GTCTTTCGAT TACACTCCAA ACTGGGGTAG AGGTAACCCA AACAACTTCA TTGATACTGT TACTTTCCCA AAGGTTTTGA CTGATAAGGC TTACACTTAC AGAGTTGCTG TTTCTGGTAG AAACTTGGGT GTTAAGCCAT CTTACGCTGT TGAATCTGAT GGTTCTCAAA AGGTTAACTT CTTGGAATAC AACTCTGGTT ACGGTATTGC TGATACTAAC ACTATTCAAG TTTTCGTTGT TGATCCAGAT ACTAACAACG ATTTCATTAT TGCTCAATGG AACTGA。
【請求項２】
一つのデリバリーのシステムで発現される他の遺伝子に結紮される請求項１に記載の単離した核酸分子。
【請求項３】
請求項１に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項４】
請求項２に記載の結紮された核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項５】
請求項３または４に記載のベクターでトランスフォームしたホスト細胞。
【請求項６】
バクテリア、真菌セルまたはイーストセルである請求項５に記載のホスト細胞。
【請求項７】
Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Candida utilis, Candida boidinii, Candida maltosa, Kluyveromyces lactis, Yarrowia lipolytica, Schwanniomyces occidentalis, Schizosaccaromyces pombe, Torulopsis, Arxula adeninivorans, or Aspergillus (A. nidulans, A. niger, A. awamori, A. oryzae) or Tricoderma (T. reesei)である請求項５に記載のホスト細胞。
【請求項８】
イーストはSaccharomyces cerevisiaeである請求項５に記載のホスト細胞。
【請求項９】
完全または破砕したフォームである請求項５に記載のホスト細胞。
【請求項１０】
この発明のタンパク質を分泌することができる請求項５に記載のホスト細胞。
【請求項１１】
哺乳動物、魚、甲殻類、および家禽から成るグループから選択された対象に投与される請求項５に記載のホスト細胞。
【請求項１２】
投与が静脈内、腹内、口服、粘膜、皮膚吸着または液内の浸入を含むグループから選択されるルートによるのである請求項１１に記載のホスト細胞。
【請求項１３】
ルートは口服によるのである請求項１１に記載のホスト細胞。
【請求項１４】
哺乳動物はブタであり、家禽は鶏である請求項１１に記載のホスト細胞。
【請求項１５】
魚は、グルーパー、サケまたはマスである請求項１１に記載のホスト細胞。
【請求項１６】
甲殻類が、エビ、ロブスター、Penaeus monodon、Penaeus japonicusまたはPenaeus vannameiである請求項１１に記載のホスト細胞。
【請求項１７】
真菌類免疫調節タンパク質のあるホスト細胞の中でタンパク質を発現する方法であって、(a)ホスト細胞が好ましく挿入したFIPヌクレオチド配列を持っている発現ベクターのコンストラクション、(b) ベクターによるホスト細胞のトランスフォーム、そして(c)発現のための適切な条件のもとでホスト細胞を培養することを含む方法。
【請求項１８】
改良されたFIPヌクレオチド配列が請求項１に記載の核酸配列である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ(a)と(b)におけるホスト細胞がSaccharomyces cerevisiaeである請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
ステップ(b)におけるベクターがpYB101-FIP-イーストである請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１７に記載の方法によって精製した真菌類免疫調節タンパク質、および請求項１７に記載の方法でトランスフォームしたホスト細胞から分離した真菌類免疫調節タンパク質。
【請求項２２】
前記ベクターでトランスフォームしたホスト細胞からのFIPを純化する方法であって、以下のステップ：
(a) 溶剤の中に発酵した細胞を溶解する；
(b) セルを破砕させる；
(c) 溶液のpHを４〜５に調整する；
(d) セル抽出物内の残骸を分離する；
(e) 上澄みを遠心する；
(f) 上澄みをpH４〜５で平衡したカラムに加える；そして
(g) マンネンダケ真菌類免疫調節タンパク質を洗浄する
を含む方法。
【請求項２３】
マンネンダケ真菌類免疫調節タンパク質の洗浄はpH４〜５の20-50mM酢酸の添加による請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
真菌類免疫調節タンパク質を含む、口服ルートによる免疫活性の調節における使用ための組成物。
【請求項２５】
真菌類免疫調節タンパク質が自然なマンネンダケまたは請求項２１に記載の真菌類免疫調節タンパク質から精製したのである請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
炎症と過敏性を減少させるための化粧品用途に応用される請求項２４に記載の組成物。
【請求項２７】
炎症と過敏性の減少、免疫活性の調節、糖尿病の予防、喘息の改良、バクテリアとウイルス性の感染に対する反応の増加、臓器移植に対する免疫反応の減少するための薬物用途に応用される請求項２４に記載の組成物。
【請求項２８】
長生きさせるための食物および食物添加物、免疫活性の調節、食事変更の増加とストレスの減少のために応用される請求項２４に記載の組成物。
【請求項２９】
対象に対する真菌類免疫調節タンパク質またはFIP融合タンパク質の口服を含む免疫活性を調節する方法。
【請求項３０】
前記タンパク質が大腸菌またはSaccharomyces cerevisiaeから精製される請求項２９に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図６】
【図７】
【図９】
【図１０】
【図１１（Ｉ）】
【図１１（ＩＩ）】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１６】
【図４】
【図５】
【図８】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図６】
【図７】
【図９】
【図１０】
【図１１（Ｉ）】
【図１１（ＩＩ）】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１６】
【図４】
【図５】
【図８】
【図１５】
【公表番号】特表２００７−５３５２９９（Ｐ２００７−５３５２９９Ａ）
【公表日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２６５０６（Ｐ２００６−５２６５０６）
【出願日】平成１６年９月１４日（２００４．９．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００４／００１０４４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０４０３７５
【国際公開日】平成１７年５月６日（２００５．５．６）
【出願人】（５０６０９０９４５）益生生抜▲開▼▲発▼股▲フン▼有限公司 (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年９月１４日（２００４．９．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００４／００１０４４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０４０３７５
【国際公開日】平成１７年５月６日（２００５．５．６）
【出願人】（５０６０９０９４５）益生生抜▲開▼▲発▼股▲フン▼有限公司 (3)
【Ｆターム（参考）】
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