抗酸化活性を有する組成物の製造方法
【課題】
ササ及び／又はタケの葉を原料にして優れた抗酸化活性を有する組成物を製造する方法を提供する。
【解決手段】
ササ及び／又はタケの葉の低級脂肪族アルコール抽出液から、該アルコールを蒸発するとともに水に置換し、石油エーテル及び／又はジエチルエーテルで液・液分配を行わせ、水層の液を取り出し、該水層の液に酢酸エチルを添加して液・液分配を行い、酢酸エチル層の液と水層を採取し、各水層や酢酸エチル層、ジエチルエーテル層からルテオリン６−Ｃ−グルコシド、ルテオリン６−Ｃ−アラビノシド等の抗酸化活性を有するルテオリン配糖体やトリシン等を含む抗酸化性組成物を得る。
ササ及び／又はタケの葉を原料にして優れた抗酸化活性を有する組成物を製造する方法を提供する。
【解決手段】
ササ及び／又はタケの葉の低級脂肪族アルコール抽出液から、該アルコールを蒸発するとともに水に置換し、石油エーテル及び／又はジエチルエーテルで液・液分配を行わせ、水層の液を取り出し、該水層の液に酢酸エチルを添加して液・液分配を行い、酢酸エチル層の液と水層を採取し、各水層や酢酸エチル層、ジエチルエーテル層からルテオリン６−Ｃ−グルコシド、ルテオリン６−Ｃ−アラビノシド等の抗酸化活性を有するルテオリン配糖体やトリシン等を含む抗酸化性組成物を得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ササ及び／又はタケの葉を原料として、優れた抗酸化活性を有する組成物を製造する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
人は酸素を利用して生きている。ところが、酸素をエネルギーとして利用している限り、一部の酸素は過酸化水素（Ｈ２Ｏ２），スーパーオキサイドラジカル（・Ｏ２−），ヒドロキシラジカル（・ＯＨ−）等の活性酸素となって、この活性酸素は種々の疾病や老化の原因になることが知られている。
このため、化粧品や食品等の分野において、酸素の弊害を除去するための抗酸化剤の開発が行われている。
【０００３】
例えば、ハイビスカス，アロエ，ダイオウ，黄精，ウワウルシ，延命草，楊梅皮，葛根，センキュウ，ソウジュツ，薄荷葉，甘草，シャクヤク，ヨクイニン，辛夷，桂皮，十薬，黄連，牡丹皮，ゲンチアナ，五倍子，センブリ，ゲンノショウコ，黄柏，乾姜，オウゴン，猪苓，ガーリック，セイジ，オレガノ，ローズマリー，ローレル，セロリ，タイム，タラゴン，ナッツメグ，メース，クローブ，わさび，サボリ，バジル，唐辛子，豆茶，紅茶，緑茶，柿の葉，コーヒー，すぎな，ハチク，よもぎ，アマチャズル，クマササ，クコ，ヤブソテツ，シイタケ，ひじき，わかめ，いぎす，こんぶ，あらめ，オニワカメ，青のりからなる各植物より水若しくは低級アルコール又は低級アルコール水溶液により抽出された各種植物抽出物群から選択された１種又は２種以上を有効成分として含有することを特徴とする抗酸化剤が、下記の特許文献１に提案されている。
【０００４】
【特許文献１】 特開平６−２４９３７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、単に低級アルコール又は低級アルコール水溶液により抽出された各種植物抽出物は抗酸化活性が十分とはいえない。そこで、本発明は、卓越した抗酸化活性を有する組成物を製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、前記の植物としてタケ類及びササ類に注目した。タケ・ササの仲間は、マダケ属、ナリヒラダケ属、トウチク属、オカメザサ属、ササ属、アズマザサ属、ヤダケ属、メダケ属、カンチク属、ホウライチク属の１０属から成っている。中でもササ類は温帯や亜寒帯に広く分布する植物で、ササ属は日本を分布の中心とし、全国に種類、量ともに広く分布する。
従来の市販笹エキスには、抗菌作用、フリーラジカル消去活性、アルコール性脂肪肝、糖尿病、食欲増進作用、抗腫瘍作用等の機能性が知られているものの有効成分が特定されているものは少ない。
【０００７】
一般に植物にはフラボノイド類が含まれており、抗酸化能が期待される。しかし、タケ・ササの仲間、特にササ属植物、のフラボノイドに関する知見は少ない。本発明者らは、これらの葉に含まれているフラボノイド成分に着目し、抗酸化活性成分を抽出して活性の優れた組成物を製造する本発明の方法を完成したものである。
【０００８】
かくして、本発明によれば、以下のような方法が提供される。
（１）ササ及び／又はタケの葉の低級脂肪族アルコール、アセトン、アセトニトリル、熱水又は希酸溶液による抽出液から、当該溶液を蒸発するとともに水に置換又は加水し、濾過後又は濾過をせず、石油エーテル、ジクロロメタン、ベンゼン及び／又はジエチルエーテルで液・液分配を行わせて水層の液を取り出すことでクロロフィルを除去した後、該水層の液に酢酸エチルを添加して液・液分配を行い、酢酸エチル層の液並びに水層、ジエチルエーテル層を採取しササ及び／又はタケの葉由来のフラボノイド成分、特にルテオリン６−Ｃ−グルコシド及び／又はルテオリン６−Ｃ−アラビノシド等のルテオリン配糖体やトリシンを含む組成物を得ることを特徴とする抗酸化性組成物の製造方法。
【０００９】
（２）ササ葉及び／又はタケの葉の低級脂肪族アルコール抽出液から、該アルコールを蒸発するとともに水に置換し、石油エーテル及び／又はジエチルエーテルで液・液分配して水層の液を採取し、該水層の液に酢酸エチルを配合して液・液分配を行い、酢酸エチル層の液を採取し、ササ葉及び／又はタケの葉由来のフラボノイド、特にルテオリン６−Ｃ−グルコシド、ルテオリン６−Ｃ−アラビノシド等のルテオリン配糖体及び／又はトリシンを含む組成物を得る、抗酸化性組成物の製造方法。
【００１０】
（３）ササ葉及び／又はタケの葉の低級脂肪族アルコール抽出液から、該アルコールを蒸発するとともに水に置換し、石油エーテル及び／又はジエチルエーテルで液・液分配を行わせて水層の液を採取し、該水層の液に酢酸エチルを添加して液・液分配を行い、ジエチルエーテル層と酢酸エチルの２層からトリシンを含む液を採取することを特徴とする上記（１）の抗酸化性組成物の製造方法。
【００１１】
（４）前記低級脂肪族アルコール抽出液を濃縮し、水に置換又は加水し濾過後クロロフィルを濾去、水層にジエチルエーテルを添加し液・液分配を行い、得られる水層にさらに酢酸エチルを加え液・液分配を行い、これらの操作を複数回繰り返し、ジエチルエーテル層、酢酸エチル層からトリシンを、水層及び酢酸エチル層から６−Ｃ−グルコシド、ルテオリン６−Ｃ−アラビノシド等のルテオリン配糖体を含む液を採取することを特徴とする上記（２）の抗酸化性組成物の製造方法。
【００１２】
（５）前記低級脂肪族アルコール抽出液を濃縮し、水に置換又は加水し濾過後クロロフィルを濾去、水層にジエチルエーテルを添加し液・液分配を行い、得られる水層からルテオリン６−Ｃ−グルコシド、ルテオリン６−Ｃ−アラビノシド等のルテオリン配糖体を含む液又はトリシンを含む液を採取することを特徴とする抗酸化性組成物の製造方法。
（６）ササ葉又はタケの葉の抽出液を直接又は分画後に加水分解することにより、ルテオリン６Ｃ−グルコシド、ルテオリン６−Ｃ−アラビノシド、トリシンの含有率を高めることを特徴とする上記（１）〜（５）の抗酸化性組成物の製造方法。
【００１３】
本発明の方法により得られる抗酸化性組成物には、ササ葉及び／又はタケの葉由来のフラボノイドとして、それ自体新規な化合物であるルテオリン６−Ｃ−アラビノシドを含むことがある。この新規化合物は、本発明者らによって発見された従来未知のルテオリン配糖体であって、下記の化学式（１）で表される構造を有する。この新規化合物は、後述する実施例に示す測定データ等から明らかなごとく、良好なＤＰＰＨラジカル消去活性、ＳＯＤ様活性を有するのに加えて、脂質過酸化抑制活性に優れている。しかも、この新規化合物（ルテオリン６−Ｃ−アラビノシド）は、褐変酵素ポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ）の阻害活性も非常に大きいという、種々の利点を有する。
【００１４】
【化１】
（ただし、上記式中、Ｈｅｑはｅｑｕａｔｏｒｉａｌ Ｈを示し、Ｈａｘはａｘｉａｌ Ｈを示す。糖の同じ炭素に付いたプロトンのどちらかを明記するために用いた記号）
【００１５】
上記化合物の１Ｈ−ＮＭＲの値は、δ＝３．６０（ｄｄ，Ｊ＝２．８，９．６Ｈｚ，１Ｈ，３”−Ｈ），３．７２（ｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ，１Ｈ，５”−Ｈｅｑ），３．９５（ｍ，１Ｈ，４”−Ｈ），３．９９（ｄｄ，Ｊ＝２．４，１２．０Ｈｚ，１Ｈ，５”−Ｈａｘ），４．２４（ｄｄ，Ｊ＝９．６，９．６Ｈｚ，１Ｈ，２”−Ｈ），４．７９（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，１Ｈ，１”−Ｈ），６．５０（ｓ，１Ｈ，８−Ｈ），６．５５（ｓ，１Ｈ，３−Ｈ），６．８９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ，５’−Ｈ），７．３６（ｂｒ．ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ，２’−Ｈ），７．３７（ｄｄ，Ｊ＝２．０，８．４Ｈｚ，１Ｈ，６’−Ｈ）である。
【００１６】
また、本発明の方法による抗酸化性組成物は、ササ葉及び／又はタケの葉由来のフラボノイドとして、下記の化学式（２）で表されるルテオリン６−Ｃ−グルコシドを含むことがある。ルテオリン６−Ｃ−グルコシド自体は、下記の化学式で表される既知の化合物ではあるが、後述する実施例に示すとおり、良好なＤＰＰＨラジカル消去活性、ＳＯＤ様活性を有するのに加えて、脂質過酸化抑制活性にも優れているだけでなく、驚くべきことに、極めて優れた褐変酵素ポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ）の阻害活性を有する。しかも、その活性は、一般に知られているＰＰＯ阻害剤、他のフラボノイド類とは比較にならないほどに優れたものである。
ササ葉やタケの葉由来のルテオリン６−Ｃ−グルコシドがこのような優れた特性を有することは、従来全く知見がなく、誰もが予想し得ないところであった。
【００１７】
【化２】
【００１８】
上記化合物の１Ｈ−ＮＭＲの値は、δ＝３．４１（ｍ，１Ｈ，５”−Ｈ），３．４４−３．４９（ｍ，２Ｈ，３”，４”−Ｈ），３．７２（ｄｄ，Ｊ＝５．６，１２．４Ｈｚ，１Ｈ，６”−ＣＨＨ），３．８６（ｄｄ，Ｊ＝２．８，１２．４Ｈｚ，１Ｈ，６”−ＣＨＨ），４．１６（ｄｄｄ，Ｊ＝２．８，９．６，９．６Ｈｚ，１Ｈ，２”−Ｈ），４．９０（ｍ，１Ｈ，１”−Ｈ），６．４９（ｓ，１Ｈ，８−Ｈ），６．５６（ｓ，１Ｈ，３−Ｈ），６．８９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ，５’−Ｈ），７．３６（ｂｒ．ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ，２’−Ｈ），７．３７（ｄｄ，Ｊ＝２．０，８．４Ｈｚ，１Ｈ，６’−Ｈ）である。
【００１９】
また、本発明では得られる組成物に含まれる抗酸化性成分が、下記の化学式（３）で表されるトリシン化合物であってもよく、上記の各化合物（ルテオリン６−Ｃ−グルコシド、ルテオリン６−Ｃ−アラビノシド、トリシン等）が２種以上混在していてもよい。
【００２０】
【化３】
【００２１】
上記化合物の１Ｈ−ＮＭＲの値は、δ＝３．１−３．６（ｂｒ．ｓ，２Ｈ，７，４’−Ｈ−Ｏ），３．８７（ｓ，６Ｈ，２×Ｍｅ−Ｏ），６．１７（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ，６−Ｈ），６．５３（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ，８−Ｈ），６．９６（ｓ，１Ｈ，３−Ｈ），７．３１（ｓ，２Ｈ，２’，６’−Ｈ），１３．０（ｓ，１Ｈ，５−Ｈ−Ｏ）である。
【００２２】
上記のトリシン化合物は、後述の実施例に示すとおり、抗酸化活性のうちの１つである、脂質過酸化抑制活性に特に優れている。
【００２３】
以下、本発明の製造方法に関し、原料及び各工程並びに得られる抗酸化性組成物について、以下に順次詳述する。
【００２４】
（原料）
原料となるササは、クマイザサ、チマキザサ、クマザサ、チシマザサ、ミヤコザサ、ヤクシマダケ、スズタケ等その種類は問わない。また、タケも、モウソウチク、インヨウチク、マダケ、オオバヤダケ、メダケ、ホウライチク等が使用可能である、これらのササあるいはタケの葉の部分を、水洗した後、必要に応じて適当な大きさに細断し乾燥（水分除去）して使用する。ササ又はタケの葉は、粉末にしてもよく、枯れさせてもよい。
【００２５】
この原料を用いて、図１に例示するようなフローで抽出及び液・液分配を行う。各工程の具体例は、以下のとおりである。
（第１工程：アルコール抽出・蒸発乾固・粗抽出液の調製）
ササ葉１ｇに対して１０倍容のメタノールで抽出する。抽出は暗所で２４時間放置し、２４時間後濾過する。この操作を４回繰り返し、得られた濾液をあわせ、ロータリーエバポレーターで濃縮乾固し、試料重量の２倍容の純水に溶解する。このようにして得られた溶液を粗抽出液とする。
【００２６】
（第２工程：石油エーテルによる液・液分配）
上記の粗抽出液に対して同量の石油エーテルを加え、分液ロートにて水・石油エーテル溶媒の液・液分配を行う。この操作を２〜３回繰り返し行い、石油エーテル層と水層とを得る。石油エーテル層にはクロロフィルが含まれるので廃棄する。
【００２７】
（第３工程：ジエチルエーテルによる液・液分配）
次に、得られた水層に該水層と同量のジエチルエーテルを添加し、分液ロートにて水・ジエチルエーテル溶媒の液・液分配を行う。この操作を２〜３回繰り返し行い、ジエチルエーテル層、水層を得る。ジエチルエーテル層をロータリーエバポレーターで乾固する。
【００２８】
（第４工程：酢酸エチルによる液・液分配）
第３工程で得られた水層に、該水層と同量の酢酸エチルを加え、分液ロートにて、水・酢酸エチル溶媒の液・液分配を行う。この操作を２〜３回繰り返し行い、酢酸エチル層、水層を得る。各層をロータリーエバポレーターで濃縮乾固し、メタノールに置換する。
【００２９】
（組成物に含まれる有効成分）
上述のようにして得たジエチルエーテル層には、主にトリシンが含まれ、酢酸エチル層には、ルテオリン６−Ｃ−アラビノシド、ルテオリン６−Ｃ−グルコシド並びにトリシンが主に含まれる。一方、水層には、ルテオリン６−Ｃ−グルコシドが主に含まれる。すでに述べたように、これらは抗酸化活性を有する化合物であり、これらの少なくとも１種の化合物を含む組成物もまた抗酸化活性を有する。
【００３０】
（新規化合物の単離・精製及び同定）
酢酸エチル層に抗酸化成分として含まれるルテオリン６−Ｃ−アラビノシドは、それ自体、従来未知の新規化合物である。以下、ルテオリン６−Ｃ−アラビノシド及びその他の有効成分の単離・精製及び同定について詳細に説明する。
【００３１】
（単離・精製方法）
メタノールに置換した酢酸エチル層２ｍｌを、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ＬＨ−２０をガラス管（内径２ｃｍ、高さ９０ｃｍ）に充填したカラムクロマトグラフィーにアプライする。溶離液に６０％メタノールを用い、フラクションコレクターで８ｍｌずつ分画する。それぞれのフラクションについて波長３５０、３３０及び２５０ｎｍにおける吸光度に従い分画し、ピークを得たら、該当ピークを濃縮しフォトダイオードアレイ検出器を用いたＨＰＬＣによる分取を行う。ＨＰＬＣの条件は下記のとおりである。
カラム：ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０Ｔｓ（２１．５ｍｍＩ．Ｄ．×３００ｍｍ）
移動相：水／アセトニトリル／メタノール＝７／２／１（ｖ／ｖ／ｖ）
流速：６．０ｍｌ／ｍｉｎ
オーブン温度：４０℃
【００３２】
（物質の同定）
本発明で得られる抗酸化性組成物に含まれる有効成分の化合物は、吸収スペクトル分析、質量分析及びＮＭＲ分析等により同定することが出来る。以下、本発明者らが実施した同定法について詳述する。
＜吸収スペクトル法＞
精製物をメタノールに溶解し、４５０〜２３０ｎｍにおけるＵＶ・ＶＩＳ吸収スペクトルを測定した。すなわち、試料のメタノール溶液を測定した後、ナトリウムメチラート（ＮａＯＭｅ）、塩化アルミニウム（ＡｌＣｌ３）、１２％塩酸（１２％ＨＣｌ）、酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）、ホウ酸（Ｈ３ＢＯ３）の各種試薬を添加し吸収スペクトルを測定した。その結果は、下記の表１に示すとおりである。
【００３３】
【表１】
【００３４】
ルテオリン６−Ｃ−アラビノシド（Ｌｕｔｅｏｌｉｎ６−Ｃ−ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ）
ＮａＯＭｅ添加によってＢｄ．Ｉが４５〜６５ｎｍの深色移動することから、３位の遊離水酸基の欠如又は酸素化（ＯＲ）が示唆される。また、Ｂｄ．Ｉの極大吸収が増大することより４′位に遊離水酸基が存在することがわかる。
ＡｌＣｌ３添加によってＢｄ．Ｉが深色移動することより、３位又は５位又はその両方に遊離水酸基ないしは隣接する遊離水酸基が存在する。
ＡｌＣｌ３＋ＨＣｌ添加によってＡｌＣｌ３のＢｄ．Ｉより浅色移動するが元のＢｄ．Ｉに戻りきらないことより、３位又は５位又はその両方に遊離水酸基が存在し、さらにＢ環中に隣接する遊離水酸基の存在することがわかる。
ＮａＯＡｃ添加によりＢｄ．ＩＩが５〜２０ｎｍの深色移動することから７位に遊離水酸基が存在する。
ＮａＯＡｃ＋Ｈ３ＢＯ３添加により、Ｂｄ．Ｉが１２〜３６ｎｍの深色移動することから３′，４′位に遊離水酸基が存在する。
なお、Ｂｄ．Ｉとは、波長３３０〜４２０ｎｍ付近の極大吸収を示し、Ｂｄ．ＩＩとは２３０〜２９０ｎｍ付近の極大吸収を示す。また、深色移動は長波長側、浅色移動は短波長側にシフトすることを示す。
以上の事より、３′，４′，５，７位に遊離水酸基が存在するフラボン骨格のルテオリンであることが、また、Ｂｄ．ＩＩに２つの極大が見られることから６位又は８位に結合糖が存在することがわかる。
【００３５】
ルテオリン６−Ｃ−グルコシド（Ｌｕｔｅｏｌｉｎ６−Ｃ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）
ＮａＯＭｅ添加によってＢｄ．Ｉが４５〜６５ｎｍの深色移動することから、３位の遊離水酸基の欠如又は酸素化（ＯＲ）が示唆された。また、Ｂｄ．Ｉの極大吸収が増大することより４′位に遊離水酸基が存在することがわかる。
ＡｌＣｌ３添加によってＢｄ．Ｉが深色移動することより、３位又は５位又はその両方に遊離水酸基ないしは隣接する遊離水酸基が存在する。
ＡｌＣｌ３＋ＨＣｌ添加によってＡｌＣｌ３のＢｄ．Ｉより浅色移動するが元のＢｄ．Ｉに戻りきらないことより、３位又は５位又はその両方に遊離水酸基が存在し、さらにＢ環中に隣接する遊離水酸基が存在することがわかる。
ＮａＯＡｃ添加によりＢｄ．ＩＩが５〜２０ｎｍの深色移動することから７位に遊離水酸基が存在する。
ＮａＯＡｃ＋Ｈ３ＢＯ３添加によってＢｄ．Ｉから１２〜３６ｎｍの深色移動することより、３′，４′位に遊離水酸基が存在する。
以上の事より、３′，４′，５，７位に遊離水酸基が存在するフラボン骨格のルテオリンであることが、そして、Ｂｄ．ＩＩに２つの極大が見られることから６位又は８位に結合糖が存在することがわかる。
【００３６】
トリシン（Ｔｒｉｃｉｎ）
ＮａＯＭｅ添加によりＢｄ．Ｉが４５〜６５ｎｍの深色移動することより、３位の遊離水酸基の欠如又は酸素化（ＯＲ）がわかる。また、Ｂｄ．Ｉの極大吸収が増大することより、４′位に遊離水酸基が存在する。
ＡｌＣｌ３添加によりＢｄ．Ｉが深色移動することから、３位又は５位又はその両方に遊離水酸基ないしは隣接する遊離水酸基が存在する。
ＡｌＣｌ３＋ＨＣｌ添加によりＡｌＣｌ３のＢｄ．Ｉと比較し浅色移動しないことより、３位又は５位又はその両方に遊離水酸基が存在するが、Ｂ環中に隣接する遊離水酸基がないことがわかる。
ＮａＯＡｃ添加によりＢｄ．ＩＩが５〜２０ｎｍの深色移動することから、７位に遊離水酸基が存在する。
ＮａＯＡｃ＋Ｈ３ＢＯ３の添加によりメタノール溶液のＢｄ．Ｉと比べて深色移動がないことより、隣接する遊離水酸基がないことがわかる。
以上の事より、４′，５，７位に遊離水酸基が存在するフラボン骨格を持つ色素であることがわかる。
【００３７】
＜質量分析＞
精製した試料について、パーセプティブ社製質量分析計Ｍａｒｉｎｅｒを用い、分子量を正イオンモード（ＰＯＳ）で測定した。条件は下記の表２に示すとおりである。
［質量分析条件］
内部標準：４−ａｃｅｔａｍｉｄｏｐｈｅｎｏｌ（ｍ／ｚ１５２．０７），ｒｅｓｅｒｐｉｎｅ（ｍ／ｚ６０９．２８）
インターフェイス：Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ（ＥＳＩ）
温度：室温（２５℃）
【００３８】
【表２】
【００３９】
ルテオリン６−Ｃ−アラビノシド（Ｌｕｔｅｏｌｉｎ６−Ｃ−ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ）
吸収スペクトルで糖の結合が示唆されるが、ルテオリン骨格であることを考慮するとｍ／ｚから結合糖はペントース１つであることがわかる。また、イオン化の際に断片化を生じていないことから、糖との結合はＣ結合であることがわかる。
【００４０】
ルテオリン６−Ｃ−グルコシド（Ｌｕｔｅｏｌｉｎ６−Ｃ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）
吸収スペクトルで糖の結合が示唆されたが、ルテオリン骨格であることを考慮するとｍ／ｚから結合糖はヘキソース１つであることがわかる。またイオン化の際に断片化を生じていないことから、糖とアグリコンの結合はＣ結合であることがわかる。
【００４１】
一般に、ルテオリン配糖体には、抗酸化の他に、抗炎症、ガン予防、抗不整脈作用等が報告されており、上記の２種の化合物にも、本発明者らが確認した抗酸化活性のほかに、抗炎症、ガン予防、抗不整脈作用等も期待される。
【００４２】
トリシン（Ｔｒｉｃｉｎ）
吸収スペクトルからフラボン類であることがわかるが、ｍ／ｚから結合糖は存在しないアグリコンであることがわかった。また、ｍ／ｚから構造の２カ所がメトキシル化されていることが推測される。
トリシンには、抗腫瘍活性、抗白血病活性があること、脂質の過酸化を抑制することが知られている。また、防虫効果もある。
【００４３】
＜ＮＭＲ分析＞
それぞれ、十分に乾燥したサンプルを２〜１０ｍｇ計量採取し、ＮＭＲ測定管に移して重メタノールもしくは重ジメチルスルホキシド０．７ｍｌに溶解して、１Ｈ−ＮＭＲをＪｅｏｌＪＮＭ−Ａ４００（４００ＭＨｚ）にて測定する。（内部標準：ＣＤ３ＯＤ，３．３０，ＤＭＳＯ−ｄ６，２．４９）
【００４４】
ルテオリン６−Ｃ−アラビノシド（Ｌｕｔｅｏｌｉｎ６−Ｃ−ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ）
δ＝３．６０（ｄｄ，Ｊ＝２．８，９．６Ｈｚ，１Ｈ，３”−Ｈ），３．７２（ｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ，１Ｈ，５”−Ｈｅｑ），３．９５（ｍ，１Ｈ，４”−Ｈ），３．９９（ｄｄ，Ｊ＝２．４，１２．０Ｈｚ，１Ｈ，５”−Ｈａｘ），４．２４（ｄｄ，Ｊ＝９．６，９．６Ｈｚ，１Ｈ，２”−Ｈ），４．７９（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，１Ｈ，１”−Ｈ），６．５０（ｓ，１Ｈ，８−Ｈ），６．５５（ｓ，１Ｈ，３−Ｈ），６．８９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ，５’−Ｈ），７．３６（ｂｒ．ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ，２’−Ｈ），７．３７（ｄｄ，Ｊ＝２．０，８．４Ｈｚ，１Ｈ，６’−Ｈ）．
【００４５】
１Ｈ−ＮＭＲでは測定溶媒として重メタノールが用いられる。芳香族由来と思われるシグナルが５種類それぞれ１Ｈ観測される。そのうちδ＝６．８９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．３６（ｂｒ．ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），７．３７（ｄｄ，Ｊ＝２．０，８．４Ｈｚ）の３種のシグナルの結合定数から、３置換ベンゼンの存在が推定され、置換位置は、オルト及びパラであると考えられる。また、その他２種の芳香族プロトンδ＝６．５０（ｓ），６．５５（ｓ）は一重線であったが、その化学シフトと前述の３種の化学シフトを既知化合物であるルテオリンと比較すると比較的よい一致を示すので、アグリコン部はルテオリンであると推定される。ただし、ルテオリンの６位に相当するシグナルは観測されないので、６位に何らかの置換基の存在が示唆され、吸収スペクトルの結果によく一致する。
次に、δ＝３．６０（ｄｄ，Ｊ＝２．８，９．６Ｈｚ），３．７２（ｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ），３．９５（ｍ），３．９９（ｄｄ，Ｊ＝２．４，１２．０Ｈｚ），４．２４（ｄｄ，Ｊ＝９．６，９．６Ｈｚ），４．７９（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ）のシグナルにより、糖の存在が示唆される。アノマー位（１”位）のプロトン４．７９（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ）の結合定数から、アノマー位の隣接プロトンとはアキシアル−アキシアルの関係にある、即ち糖部分はβ結合にてアグリコンに結合していると決定される。またその化学シフトがＯ−グルコシドよりも高磁場シフトしていることから、糖部分はＣ−グリコシル化しているものと考えられ質量分析の結果に整合した。糖部分のシグナルの化学シフトと結合定数はアラビノースのものとよい対応を示すことから糖部分はアラビノースであると推定される。
以上、アグリコン部、糖部を総合し、先の吸収スペクトルと質量分析結果ををあわせて考慮した結果、この化合物はルテオリン６−Ｃ−アラビノシドと決定することができる。
【００４６】
ルテオリン６−Ｃ−グルコシド（Ｌｕｔｅｏｌｉｎ６−Ｃ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）
δ＝３．４１（ｍ，１Ｈ，５”−Ｈ），３．４４−３．４９（ｍ，２Ｈ，３”，４”−Ｈ），３．７２（ｄｄ，Ｊ＝５．６，１２．４Ｈｚ，１Ｈ，６”−ＣＨＨ），３．８６（ｄｄ，Ｊ＝２．８，１２．４Ｈｚ，１Ｈ，６”−ＣＨＨ），４．１６（ｄｄｄ，Ｊ＝２．８，９．６，９．６Ｈｚ，１Ｈ，２”−Ｈ），４．９０（ｍ，１Ｈ，１”−Ｈ），６．４９（ｓ，１Ｈ，８−Ｈ），６．５６（ｓ，１Ｈ，３−Ｈ），６．８９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ，５’−Ｈ），７．３６（ｂｒ．ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ，２’−Ｈ），７．３７（ｄｄ，Ｊ＝２．０，８．４Ｈｚ，１Ｈ，６’−Ｈ）．
【００４７】
１Ｈ−ＮＭＲでは測定溶媒として重メタノールを用いられる。芳香族由来と思われるシグナルが５種類それぞれ１Ｈ観測される。そのうちδ＝６．８９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．３６（ｂｒ．ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），７．３７（ｄｄ，Ｊ＝２．０，８．４Ｈｚ）の３種のシグナルの結合定数から、３置換ベンゼンの存在が推定され、置換位置は、オルト及びパラであると考えられる。また、その他２種の芳香族プロトンδ＝６．４９（ｓ），６．５６（ｓ）は一重線であったが、その化学シフトと前述の３種の化学シフトを既知化合物であるルテオリンと比較すると、かなりよい一致を示すことから、アグリコン部はルテオリンであると推定される。ただし、ルテオリンの６位に相当するシグナルは観測されなかったので、６位に何らかの置換基の存在が示唆され先の吸収スペクトルの結果によく一致する。
次に、δ＝３．４１（ｍ，１Ｈ），３．４４−３．４９（ｍ，２Ｈ），３．７２（ｄｄ，Ｊ＝５．６，１２．４Ｈｚ，１Ｈ），３．８６（ｄｄ，Ｊ＝２．８，１２．４Ｈｚ，１Ｈ），４．１６（ｄｄｄ，Ｊ＝２．８，９．６，９．６Ｈｚ，１Ｈ），４．９０（ｍ，１Ｈ）のシグナルにより、糖の存在が示唆される。アノマー位（１”位）のプロトン４．９０（ｍ）に隣接していると考えられるプロトン４．１６（ｄｄｄ，Ｊ＝２．８，９．６，９．６Ｈｚ）の結合定数より、２”位は二つの隣接するプロトンとアキシアルーアキシアルーアキシアルの関係にあると考えられる。すなわち、糖部分はβ結合にてアグリコン部に結合していると推定される。また、その化学シフトがＯ−グルコシドよりも高磁場シフトしていることから、Ｃ−グリコシル化しているものと考えられ、先の質量分析の結果と一致する。糖部分のシグナルの化学シフトと結合定数はグルコースのものとよい対応を示すことから糖部分はグルコースであると推定される。
以上、アグリコン部、糖部を総合し、先の吸収スペクトルと質量分析結果とをあわせて考慮した結果、この化合物はルテオリン６−Ｃ−グルコシドと決定することができる。
【００４８】
トリシン（Ｔｒｉｃｉｎ）
δ＝３．１−３．６（ｂｒ．ｓ，２Ｈ，７，４’−Ｈ−Ｏ），３．８７（ｓ，６Ｈ，２×Ｍｅ−Ｏ），６．１７（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ，６−Ｈ），６．５３（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ，８−Ｈ），６．９６（ｓ，１Ｈ，３−Ｈ），７．３１（ｓ，２Ｈ，２’，６’−Ｈ），１３．０（ｓ，１Ｈ，５−Ｈ−Ｏ）．
【００４９】
１Ｈ−ＮＭＲでは測定溶媒として重ジメチルスルホキシドが用いられる。δ＝６．１７（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ，６−Ｈ），６．５３（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ，８−Ｈ），６．９６（ｓ，１Ｈ，３−Ｈ），７．３１（ｓ，２Ｈ，２’，６’−Ｈ）に４種の芳香族プロトンが観測される。このうち、δ＝６．１７（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），６．５３（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ）に相関が観測され、その結合定数よりこの二つのプロトンはメタの関係にあると推定される。δ＝７．３１（ｓ）のシグナルが積分比として２プロトン分あること、メトキシ基と考えられるδ＝３．８７（ｓ）のシグナルが積分比として６プロトン分あること等から、対象性を有する４置換ベンゼンの存在が示唆される。また、δ＝３．１−３．６（ｂｒ．ｓ，２Ｈ）に水酸基由来のプロトンが２プロトン、及びδ＝１３．０（ｓ，１Ｈ）の低磁場に水素結合をしていると考えられる水酸基のプロトンが観測されることから、水酸基が３種あると推定される。
以上、先の吸収スペクトル、質量分析結果とをあわせた結果、この化合物はトリシンと決定することができる。
【００５０】
なお、後述の実施例２、３で詳述するように、本発明者らの研究によれば、ルテオリン６−Ｃ−グルコシド、ルテオリン６−Ｃ−アラビノシド、トリシンの３種のフラボノイド成分の収量を上げる方法として、（１）ササ葉抽出液の酸加水分解による方法、及び、（２）分画後ピークの酸加水分解による方法、の２つの方法があることが見出された。また、加水分解は酸を用いるほか、アミラーゼ等の糖鎖切断酵素によっても可能である。
これらの方法によれば、より高い収率で上記３種のフラボノイド化合物を得ることができるので、工業的に特に有利である。
【発明の効果】
【００５１】
本発明方法により得られる液状組成物は、抗酸化活性に優れたものであり、従来のササエキス等に比べて、抗酸化活性に優れ、かつ耐熱性、耐光性も良好な組成物が得られる、という利点を有する。具体的に説明すると、ルテオリン６−Ｃ−アラビノシド、ルテオリン６−Ｃ−グルコシド等のルテオリン配糖体を含む組成物は、ＤＰＰＨラジカル消去活性、スーパーオキシドアニオンラジカル消去活性（ＳＯＤ様活性）、脂質過酸化抑制効果等に優れており、しかも、褐変酵素ポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ）の阻害効果が極めて大きいという利点を有する。また、トリシンを含む組成物は、脂質過酸化抑制効果に優れている。
したがって、本発明による抗酸化性の組成物は、化粧品、食品、医薬品等の広い分野で有用である。
さらに、本発明の組成物は、優れた消臭作用を有するため、例えば魚介類等を用いた食品加工時や調理ごみ、畜産廃棄物処理時等に発生する臭気を、該組成物を添加することにより有効に抑制することができるという効果も期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５２】
以下に、本発明方法の実施例及び比較例を詳述する。ただし、本発明はこれらの実施例によってその範囲が限定されるものではない。なお、例中の％は特に断らない限り重量％を意味する。なお、抗酸化活性の測定は次のように実施した。
【００５３】
１．ＤＰＰＨラジカル消去活性
安定なラジカルであるＤＰＰＨラジカルに対するラジカル消去活性について検討した。
０．５ｍＭのＤＰＰＨラジカル・エタノール溶液１００μｌ、試料１００μｌの順に小ワッセルマンに採取し混合した。すばやく攪拌し、偏平セルに吸い上げてキャビティに挿入し、一定時間後（４５秒）にＥＳＲ装置（ＪｅｏｌＪＥＳ−ＦＲ３０）に装填し測定を開始した。ブランクには超純水又はアセトニトリルを用いた。下記条件のＥＳＲに供した。なお、ラジカルの消去率を（１−サンプル値／ブランク値）×１００として求めた。
Ｆｉｅｌｄ：３３５±５ｍＴ
Ｐｏｗｅｒ：４ｍＷ
Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ Ｗｉｄｔｈ：４０μＴ
Ｓｗｅｅｐ Ｔｉｍｅ：２ｍｉｎ
Ｔｉｍｅ ｃｏｎｓｔ：０．１ｓｅｃ
Ａｍｐ：２５０
【００５４】
２．スーパーオキシドアニオンラジカル消去活性（ＳＯＤ様活性）
ヒポキサンチンを基質とし、キサンチンオキシターゼ（ＸＯＤ）の反応によるスーパーオキシドアニオンラジカル発生系を用い、ＳＯＤ様活性を測定した。
原液ＤＭＰＯ（ラボテックＮＨ−６８７）１５μｌ、５ｍＭのＨｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ（ＳＩＧＭＡ Ｈ−９３７７）５０μｌ、５．５ｍＭのＤＴＰＡ（同仁化学３４７−０１１４１）３５μｌ、試料５０μｌ、０．４Ｕ／ｍｌのＸＯＤ（ＳＩＧＭＡ Ｘ−４３７６）５０μｌの順に小ワッセルマンに採取し混合した。すばやく攪拌し、偏平セルに吸い上げてキャビティに挿入し、一定時間後（４５秒）にＥＳＲ装置（ＪｅｏｌＪＥＳ−ＦＲ３０）に装填し測定を開始した。ブランクには超純水又はアセトニトリルを用いた。下記条件のＥＳＲに供した。スーパーオキシドアニオンラジカルの消去率を（１−サンプル値／ブランク値）×１００として求めた。
Ｆｉｅｌｄ：３３５±５ｍＴ
Ｐｏｗｅｒ：４ｍＷ
Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ Ｗｉｄｔｈ：０．０７９ｍＴ
Ｓｗｅｅｐ Ｔｉｍｅ：２ｍｉｎ
Ｔｉｍｅ ｃｏｎｓｔ：０．１ｓｅｃ
Ａｍｐ：２５０
【００５５】
３．脂質過酸化抑制効果
４％リノール酸メチル・メタノール溶液１０ｍｌ、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）１０ｍｌを遠沈管に採取し、サンプル１ｍｌ加え、オーブンで５５℃、４８時間加熱処理し、過酸化脂質を生成させた。サンプルはササ葉１ｇ／１００ｍｌの濃度になるように調製した。ブランクとしてメタノール、対象として２０ｐｐｍトコフェロールをサンプルの代わりに加え、同様にオーブンで５５℃、４８時間加熱処理し、過酸化脂質を生成させた。
生じた過酸化脂質の過酸化物価（ＰＯＶ）を常法にしたがい測定し、抗酸化剤が無い状態のコントロールのＰＯＶを０％とし、試料の脂質過酸化抑制率を求めた。
【実施例１】
【００５６】
（１）組成物の調製
原料のササ葉として北海道に自生しているクマイザサ（Ｓａｓａ ｓｅｎａｎｅｎｓｉｓ）の葉（採取地：網走市葉八坂）を用い、これを図１に示すような手順で、以下のように処理し、液状の組成物を得た。
まず、水洗したササ葉１ｇを５倍容のメタノールに浸漬・抽出した。暗所で２４時間放置して抽出した後、濾過した。次いで濾液をロータリーエバポレーターで濃縮乾固し、ササ葉重量の２倍容の純水に溶解した。得られた水溶液を粗抽出液とした。
上記の粗抽出液に対して、等量の石油エーテルを加え、水・石油エーテル溶媒の液・液分配を行った。この操作を２〜３回繰り返し行い、石油エーテル層及び水層を得た。得られた水層を用い、水・ジエチルエーテル溶媒の液・液分配を行った。この操作を２〜３回繰り返し行い、ジエチルエーテル層と水層とを得た。得られた水層を採取してこれに酢酸エチルを加え、水・酢酸エチルの液・液分配を行った。この操作を２〜３回繰り返し行い、酢酸エチル層及び水層を得た。
得られた各層を採取し、ササ葉重量に対して等量の液量になるようにロータリーエバポレーターで濃縮・乾固し、これをメタノールに置換して抗酸化性組成物を得た。水層については、ＸＡＤカラムにより遊離の糖を取り除いて抗酸化性組成物を得た。
置換した各層の液状組成物を用い、それぞれフェノール物質の定量及び抗酸化活性の測定を行った。
【００５７】
（２）得られた各層組成物のフェノール物質含量の測定
フォリン試薬を用いるＳｗａｉｎらの方法を一部改良した方法により組成物のフェノール物質含量を測定した。すなわち、試料０．５ｍｌに１Ｎフェノール試薬を１ｍｌ加え混合し、１Ｎ水酸化ナトリウムを含む１０％炭酸ナトリウム２．５ｍｌを加え混合した。混合後、室温で３０分間放置した。濁ったサンプルについては遠心分離（１０００ｒｐｍ、１０分間）を行い、波長６５０ｎｍにおける吸光度を測定した。また、０．５ｍＭ没食子酸を用いて検量線を作成し、検量線より各層中のフェノール含量及び、ササ葉１ｇ中のフェノール含量を没食子酸換算で求めた。その結果を、図２に示す。
【００５８】
（３）得られた各層組成物の抗酸化活性の測定
各層組成物の抗酸化活性を評価するため、安定なラジカルであるＤＰＰＨラジカルに対するラジカル消去活性及びＳＯＤ様活性（Ｏ２−・［スーパーオキシドアニオンラジカル］消去活性）について検討した。
まず、ＤＰＰＨラジカル消去活性を測定するため、０．５ｍＭＤＰＰＨラジカル・エタノール溶液１００μｌ、試料１００μｌの順に小ワッセルマンに採取し混合した。すばやく攪拌し、偏平セルに吸い上げてキャビティに挿入し、一定時間後（４５秒）にＥＳＲ測定を開始した。ブランクには超純水又はアセトニトリルを用いた。上記の条件のＥＳＲに供した。消去率を（１−サンプル値／ブランク値）×１００として求めた。得られた消去率より消去率が５０％になる濃度（ＩＣ５０）を求めた。
【００５９】
次に、ＳＯＤ様活性を測定するため、ヒポキサンチンを基質とし、キサンチンオキシターゼ（ＸＯＤ）の反応によるスーパーオキシドアニオンラジカル発生系を用い、ＳＯＤ様活性を測定した。
原液ＤＭＰＯ（ラボテックＮＨ−６８７）１５μｌ、５ｍＭ Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ５０μｌ、５．５ｍＭ ＤＴＰＡ３５μｌ、試料５０μｌ、０．４Ｕ／ｍｌ ＸＯＤ５０μｌの順に小ワッセルマンに採取し混合した。すばやく攪拌し、偏平セルに吸い上げてキャビティに挿入し、一定時間後（４５秒）にＥＳＲ測定を開始した。ブランクには超純水又はアセトニトリルを用いた。上記と同様の条件でＥＳＲに供した。
消去率を（１−サンプル値／ブランク値）×１００として求めた。得られた消去率より消去率が５０％になる濃度（ＩＣ５０）を求めた。
【００６０】
それらの結果を図３に示す。図３に示す結果から、本発明による液状組成物は良好な抗酸化活性を有することがわかる。
【００６１】
（分画）
そこで、酢酸エチル層及び水層について、それぞれ、セファデックスＬＨ−２０吸着カラムクロマトグラフィーによる分画を行った。
酢酸エチル層、水層のＬＨ−２０カラムによる吸着分画の結果、図４及び図５に示すように、酢酸エチル層が８個、水層が７個のピークが観察された。酢酸エチル層のそれぞれのピークをＥＡ＃１からＥＡ＃８とし、水層のそれぞれのピークをＷ＃１からＷ＃７とした。この得られたピークの各部分を濃縮・乾固し、メタノールに置換した。
【００６２】
次に、酢酸エチル層のＥＡ＃１からＥＡ＃８のピーク部分のフェノール物質の定量を行った。フェノール含量は没食子酸換算で算出した。その結果、ＥＡ＃３のフェノール物質含有量が０．１２ｍｇ／ｇと最も高く、次にＥＡ＃７＝０．１１ｍｇ／ｇ、ＥＡ＃６＝０．０９ｍｇ／ｇ，ＥＡ＃５＝０．０７ｍｇ／ｇであった。
【００６３】
＜抗酸化活性＞
また、抗酸化活性を測定した結果、図６に示すごとく、ＤＰＰＨラジカル消去活性では、ＥＡ＃３，ＥＡ＃５，ＥＡ＃６，ＥＡ＃７の消去率が高く、それぞれ、６０．０９％、５２．０３％、７３．７４％、７９．７３％の消去率であった。ＳＯＤ様活性（スーパーオキシドアニオンラジカル消去活性）では、ＥＡ＃５，ＥＡ＃６，ＥＡ＃７が高く、それぞれ、３９．９７％、４２．３５％、５３．８０％の消去率を示した。
【００６４】
一方、酢酸エチルによる液・液分配の結果得られた水層側の液体組成物は、図７に示すように、Ｗ＃１、Ｗ＃５〜Ｗ＃７で、抗酸化活性を有するものであった。
【００６５】
また、各分画ピークのフェノール含量と抗酸化活性で相関を調べた。図８に示すように、フェノール含量とＤＰＰＨラジカル活性では、Ｒ２＝０．８７４、フェノール含量とＳＯＤ様活性ではＲ２＝０．７７０７と、ともに高い比例関係がみられた。このことより、ササ葉の抗酸化活性はフラボノイドに代表されるフェノール成分が関与していると言える。
【００６６】
また、図９に見られるように、ＤＰＰＨラジカル消去能とＳＯＤ様活性との関係にも比例関係が見られた。ササ葉の抗酸化成分はＤＰＰＨラジカル消去活性、ＳＯＤ様活性では同じ成分が寄与していると言える。
【００６７】
ササ葉から抽出し同定したルテオリン６−Ｃ−グルコシドの安定性を調べるため、耐熱性及び耐光性の試験を行った。耐熱性試験は１００℃の条件で行い、耐光性試験は紫外線照射により行った。それぞれの試験において、比較試料としてルテオリン７−Ｏ−グルコシドを用いた。
耐熱性試験の結果を図１０、図１２に、耐光性試験の結果を図１１、図１３に示す。
【００６８】
その結果、図１０及び図１２に示すように、１００℃における耐熱性では、各サンプルで時間経過と共に残存率及びＤＰＰＨラジカル消去活性に減少傾向がみられたが、ルテオリン６−Ｃ−グルコシドはルテオリン７−Ｏ−グルコシドに比べても安定性が高く、抗酸化活性の大幅な低下も見られなかった。また、耐光性についても、図１１及び図１３に示すように、紫外線照射による大きな変化は認められなかった。
この結果より、ササ葉の抗酸化成分であるルテオリン６−Ｃ−グルコシドは１００℃では壊れにくく、実用上十分な熱安定性を有すること、紫外線に対する安定性が高く耐光性にも優れていることがわかった。
【００６９】
下記の表３に、本発明の組成物に含まれる上記各化合物（ルテオリン６−Ｃ−アラビノシド、ルテオリン６−Ｃ−グルコシド及びトリシン）精製品の抗酸化活性をまとめて示す。
【００７０】
【表３】
【００７１】
なお、表３中の油脂過酸化抑制率の測定は次のように行った。
＜油脂過酸化抑制率の測定＞
（１）試料油脂の調整
４％リノール酸メチル・メタノール溶液１０ｍｌ、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）１０ｍｌを遠沈管に採取し、サンプル１ｍｌ加え、オーブンで５５℃、４８時間加熱処理し、過酸化脂質を生成させた。サンプルはササ葉１ｇ／１００ｍｌの濃度になるように調製した。ブランクとしてメタノール、対象として２０ｐｐｍトコフェロールをサンプルの代わりに加え、同様にオーブンで５５℃、４８時間加熱処理し、過酸化脂質を生成させた。
【００７２】
（２）ＰＯＶ検定
ＰＯＶ検定は、日本油脂学会による酸化油脂中の過酸化物価の測定法に従い、過酸化脂質（ヒドロペルオキシド）が酸性条件下で還元される反応に基づき、遊離されるヨウ素をチオ硫酸ナトリウムで滴定する方法で行った。
重クロム酸カリウムを純水に溶解し、０．０１Ｎ重クロム酸カリウム溶液を作成する。このとき、重クロム酸カリウム溶液のファクター（ｆ＝採取量／理論値）を求めておく。ヨウ化カリウム１ｇを純水５ｍｌに溶解させる。そこに０．０１Ｎ重クロム酸カリウム溶液２０ｍｌ、塩酸５ｍｌを加え、撹拌後栓をして５分間暗所に放置した。５分後、純水３００ｍｌを加え、遊離ヨウ素を０．０１Ｎチオ硫酸ナトリウム溶液で滴定した。褐色が消えかかったら、１％澱粉指示薬を加え、青色が完全に消失するまで滴定した。滴定値がＶｍｌのとき、０．０１Ｎチオ硫酸ナトリウム溶液のファクターは、Ｆ＝２０×ｆ／Ｖで求め、滴定を行った。
上述のように調製した試料油脂１ｇを採取し、クロロホルム−氷酢酸混液（３：２）２５ｍｌ、飽和ヨウ化カリウム溶液１ｍｌ加え、すぐに撹拌し、１分間暗所に放置した。反応を止めるために純水７５ｍｌを加えた。２層に分かれる上層の赤紫色の消失を終点とし、遊離ヨウ素を０．０１Ｎチオ硫酸ナトリウム溶液で滴定した。空試験には純水１ｇを用いて行った。ここで、過酸化物価（ＰＯＶ）は、以下の数式で算出される。
【００７３】
【数１】
【００７４】
表３に示す結果から、本発明者らの発明に係る新規物質であるルテオリン６−Ｃ−アラビノシドは、ＤＰＰＨラジカル消去活性、ＳＯＤ様活性において特に優れていること、また、ルテオリン６−Ｃ−グルコシドは、良好なＤＰＰＨラジカル消去活性、ＳＯＤ様活性を有するのに加えて、脂質過酸化抑制活性に優れていること、一方、トリシンは、ＤＰＰＨラジカル消去活性、ＳＯＤ様活性は見られないが、脂質過酸化抑制活性に優れていることがわかった。
【００７５】
次に、ササの葉由来のフラボン類について、褐変酵素ポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ）の阻害効果を調べるため、一般に知られているＰＰＯ活性阻害剤、他のフラボノイド類との比較測定を行った。その測定方法は以下のとおりであり、測定結果は下掲の表４に示すとおりである。
【００７６】
＜ＰＰＯ（褐変酵素ポリフェノールオキシダーゼ）阻害活性の測定＞
０．０５Ｍクロロゲン酸を基質とし酵素液としてタマネギ鱗茎より抽出・部分精製を行った酵素液を用いた。すなわち、１．３ｍｌの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に１ｍＭ濃度、２ｍＭ濃度、１０ｍＭ濃度に調製した阻害剤を０．１ｍｌ、酵素液を０．１ｍｌ添加し混合、３０℃に１０分間予備加温後、０．０５Ｍクロロゲン酸基質溶液を０．１ｍｌ加え混合し３０℃、３０分間加温後の波長４２０ｎｍにおける褐変度を求めた。阻害剤添加の代わりに１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加えたものをコントロールとし、活性を１００％として阻害効果を相対活性で示した。
【００７７】
この結果、ササの葉由来のフラボン類（ルテオリン６−Ｃ−アラビノシド及びルテオリン６−Ｃ−グルコシド）は、一般のＰＰＯ活性阻害剤や他のフラボノイド類と比べて卓越したＰＰＯ阻害活性を有し、少量の使用でも褐変を防止できることがわかった。
したがって、これらのササの葉由来のフラボン類は、例えば、食品類の褐変防止剤として有効に利用することができる。
【００７８】
【表４】
【００７９】
さらに、採取した水層、酢酸エチル層の液状組成物等について、ヒト白血病細胞の増殖抑制を調べた。すなわち、対数増殖期にあるＵ−９３７細胞を５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度に調製し、２４ウェルマイクロプレートに０．５ｍｌずつ播種後、インキュベーター内（３７℃、９５％Ａｉｒ−５％ＣＯ２，湿度９０％以上）で２４時間前培養後、試料を０．２５ｍｌずつ加え、インキュベーター内で２４時間培養し、トリパンブルー染色法を用い、生細胞数を測定した。陰性対象であるＰＢＳ（−）の生細胞数を１００とし、試料の増殖抑制率を算出した。
細胞増殖抑制率の測定結果を図１４に示す。また、各層のクロマチン凝縮について測定した結果を図１５に示す。
これらの図から明らかなように、本発明の抗酸化性組成物のうち、特に水層、水（メタノール可溶性）、酢酸エチル層は、ヒト腫瘍細胞（白血病）の増殖抑制効果も有し、水層、水（メタノール可溶性）、酢酸エチル層、ジエチルエーテル層はクロマチン凝縮活性を有することがわかった。
【００８０】
さらに、前記ササの葉から抽出単離したルテオリン６−Ｃ−グルコシド、ルテオリン、ルテオリン７−Ｏ−グルコシドについても、同様の方法でヒト白血病細胞の増殖抑制効果を測定した。その結果は図１６に示すとおりであり、ササの葉由来のルテオリン６−Ｃ−グルコシドは、卓越した高い増殖抑制効果を有することが確認された。
【実施例２】
【００８１】
本実施例では、クマイザサのササ葉抽出液を加水分解した場合について説明する。
すなわち、クマイザサ抽出液の酸加水分解とは、クマイザサ抽出液（メタノール溶液）に塩酸（最終濃度が０．２〜０．７Ｎ）を加え（抽出液と塩酸の比率は１：１になるようにする）、混合後、１００℃のウォーターバスで３０分間加熱し、３０分後、氷中で冷却した。
各加水分解物（無処理を含む）は、ＸＡＤカラムに吸着させ、加水分解物から酸を洗い流し、メタノールに溶媒置換後、ＬＨ−２０カラムに供し、精製後ＨＰＬＣで定量分析した。
【００８２】
まず、図１７にササ葉抽出液の非加水分解物のＬＨ−２０溶出パターンを示す。そして、ササ葉抽出液を０．２Ｎ塩酸中、１００℃、３０分間、加水分解した後のＬＨ−２０溶出パターンを図１８に、０．７Ｎ塩酸中、１００℃、３０分間加水分解した後のＬＨ−２０溶出パターンを図１９に示す。
図１７において、ＢＩＩはルテオリン６−Ｃ−グルコシド（Ｌｕｔｅｏｌｉｎ６−Ｃ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）の溶出ピーク、ＢＩＩＩはルテオリン６−Ｃ−アラビノシド（Ｌｕｔｅｏｌｉｎ６−Ｃ−ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ）のピークであり、トリシンアグリコンは図１８では２ＨＩＩＩのピークである。それぞれの処理によって得られる各フラボンの結果を、それぞれ図２０、図２１及び図２２に示す。なお、ＨＰＬＣやＸＡＤカラム、ＬＨ−２０カラムの条件はすでに述べた条件と同じである。
図１７、図１８、図１９から、加水分解によって図１７のＢＩピークが減少し、図１８の２ＨＩＩＩ及び図１９の７ＨＩＩＩが新たに検出することが確認できる。図１７のＢＩＩピーク、図１８の２ＨＩピーク及び図１９の７ＨＩピークは溶出位置から同じ成分であることがわかる。このピークは以前に同定したルテオリン６−Ｃ−グルコシドである。図１７のＢＩＩＩピーク、図１８の２ＨＩＩピーク及び図１９の７ＨＩＩピークは溶出位置から同じ成分であることがわかる。このピークは、以前に同定したルテオリン６−Ｃ−アラビノシドである。
【００８３】
また、図２０より酸加水分解処理を行うことでルテオリン６−Ｃ−グルコシドの含量が約１．７倍多くなったことがわかる。したがって、最終濃度０．２〜０．７Ｎの塩酸で１００℃、３０分間加熱処理することでルテオリン６−Ｃ−グルコシドの収量を上げることが出来る。また、図２１より同様の酸加水分解処理を行うことでルテオリン６−Ｃ−アラビノシドの含量が約３．３倍多くなったことがわかる。したがって、最終濃度０．２〜０．７Ｎの塩酸で１００℃、３０分間加熱処理することで、その収量を大幅に上げることが出来る。さらに、図２２に示すように、酸加水分解処理を行うことで、トリシンアグリコンを含んでいないサンプルでも、最終濃度０．２〜０．７Ｎの塩酸で１００℃、３０分間加熱処理することでトリシンを得ることが出来る。
【実施例３】
【００８４】
本実施例では、ササ葉抽出液をＬＨ−２０カラムで分画し、配糖体を含むフラクションを加水分解し、各加水分解物（無処理を含む）はＸＡＤカラムに吸着させ加水分解物から酸を洗い流しメタノールに溶媒置換し、ＨＰＬＣ分析した。すなわち、クマイザサ抽出液のＬＨ−２０カラム分画液（メタノール溶液）に塩酸（最終濃度が０．２〜０．７Ｎ）を加える（分画液と塩酸の比率は１：１になるようにする）。混合後、１００℃のウォーターバスで３０分間加熱し、３０分後、氷中で冷却した。
【００８５】
図２３、図２４及び図２５に、図１７の無処理ササ葉抽出液のＬＨ−２０カラム分画分で、配糖体が含まれていると考えられるフラクション（ＢＩ）を加水分解して得られる各フラボン量の定量結果を示す。これらの図２３、図２４及び図２５から明らかなように、ササ葉抽出液をセファデックスＬＨ−２０カラムで分画した後でも、酸加水分解処理を行うことにより、ルテオリン６−Ｃグルコシド、ルテオリン６−Ｃアラビノシド、トリシンを高収率で得ることが出来ることが確認された。
【００８６】
以上より、ルテオリン６−Ｃ−グルコシド、ルテオリン６−Ｃ−アラビノシド、トリシンの３種のフラボノイド成分の収量を上げる方法として、（１）ザサ葉抽出液の酸加水分解による方法、及び（２）分画後ピークの酸加水分解による方法、の２つの方法があることが確認された。
【実施例４】
【００８７】
トリシンアグリコンを含むササ葉検体（採取地：北海道興部町）を試料として、実施例１と同様にジエチルエーテルによる液・液分配して得られた水層を採取し、セファデックスＬＨ−２０カラムによる分画を行った。そのチャートを図２６に示す。この図２６より、波長３５０ｎｍでは液中にルテオリン６−Ｃ−グルコシド、ルテオリン６−Ｃ−アラビノシド、トリシンが多く含有することが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】 本発明の方法の工程概略図
【図２】 各層のフェノール物質含有量を示すグラフ
【図３】 各層の抗酸化活性の測定結果を示すグラフ
【図４】 酢酸エチル層の分画を示すチャート
【図５】 水層の分画を示すチャート
【図６】 酢酸エチル層の各ピークの抗酸化活性の測定結果を示すグラフ
【図７】 水層の各ピークの抗酸化活性の測定結果を示すグラフ
【図８】 フェノール含量と抗酸化活性との相関を示すグラフ
【図９】 Ｏ２消去率とＤＰＰＨラジカル消去率の相関を示すグラフ
【図１０】 ルテオリン６−Ｃ−グルコシドとルテオリン７−Ｏ−グルコシドの耐熱性測定結果を示すグラフ
【図１１】 ルテオリン６−Ｃグルコシドとルテオリン７−Ｏ−グルコシドの耐光性測定結果を示すグラフ
【図１２】 ルテオリン６−Ｃ−グルコシドとルテオリン７−Ｏ−グルコシドの耐熱試験における時間経過によるＤＰＰＨラジカル消去活性の変化を示すグラフ
【図１３】 ルテオリン６−Ｃ−グルコシドとルテオリン７−Ｏ−グルコシドの耐光試験における時間経過によるＤＰＰＨラジカル消去活性の変化を示すグラフ
【図１４】 各層のヒト白血病細胞の増殖抑制を測定した結果を示すグラフ
【図１５】 各層のクロマチン凝縮を測定した結果を示すグラフ
【図１６】 ルテオリン６−Ｃ−グルコシド、ルテオリン及びルテオリン７−Ｏ−グルコシドについてヒト白血病細胞の増殖抑制を測定した結果を示すグラフ
【図１７】 クマイザサ抽出液のセファデックスＬＨ−２０カラムによる分画を示すチャート（ＬＨ−２０カラム条件＝カラム径：２Ｉ．Ｄ．×８０ｃｍ、移動相：６０％メタノール流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、分画サイズ：８ｍｌ、ＢＩ：Ｆｒａｃ．Ｎｏ．６６〜９４、ＢＩＩ：Ｆｒａｃ．Ｎｏ．９５〜１１５、ＢＩＩＩ：Ｆｒａｃ．Ｎｏ．１１６〜１４３に分画）
【図１８】 クマイザサ抽出液を加水分解（最終濃度０．２Ｎ塩酸、１００℃、３０分間加熱）処理した液のセファデックスＬＨ−２０カラムによる分画を示すチャート（ＬＨ−２０カラム条件＝カラム径：２Ｉ．Ｄ．×８０ｃｍ、移動相：６０％メタノール、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、分画サイズ：８ｍｌ、２ＨＩ：Ｆｒａｃ．Ｎｏ．９１〜１１２．２ＨＩＩ：Ｆｒａｃ．Ｎｏ．１１３〜１３２、２ＨＩＩＩ：Ｆｒａｃ．Ｎｏ．１９９〜２２０に分画）
【図１９】 クマイザサ抽出液を加水分解（最終濃度０．７Ｎ塩酸、１００℃、３０分間加熱）処理した液のセファデックスＬＨ−２０カラムによる分画を示すチャート（ＬＨ−２０カラム条件＝カラム径：２Ｉ．Ｄ．×８０ｃｍ、移動相：６０％メタノール、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、分画サイズ：８ｍｌ、７ＨＩ：Ｆｒａｃ．Ｎｏ．８８〜１０８、７ＨＩＩ：Ｆｒａｃ．Ｎｏ．１０９〜１３２、２ＨＩＩＩ：Ｆｒａｃ．Ｎｏ．１８９〜２１２に分画）
【図２０】 ルテオリン６−Ｃ−グルコシド含量を示すグラフであって、図１７のＢＩＩピーク、図１８の２ＨＩピーク及び図１９の７ＨＩピークの各ピークに含まれるルテオリン６−Ｃ−グルコシドを定量したときの結果を示すデータ（ＢＩＩピークを未処理、２ＨＩピークを０．２Ｎ ＨＣｌ処理、７ＨＩピークを０．７ＮＨＣｌ処理としてそれぞれＸ軸表記）
【図２１】 ルテオリン６−Ｃ−アラビノシドの含量を示すグラフであって、図１７のＢＩＩＩピーク、図１８の２ＨＩＩピーク及び図１９の７ＨＩＩピークの各ピークに含まれるルテオリン６−Ｃ−アラビノシドを定量したときの結果を示すデータ（ＢＩＩＩピークを未処理、２ＨＩＩピークを０．２Ｎ ＨＣｌ処理、７ＨＩＩピークを０．７ＮＨＣｌ処理としてそれぞれＸ軸表記）
【図２２】 トリシン（アグリコン）の含量を示すグラフであって、図１８の２ＨＩＩＩピーク及び図１９の７ＨＩＩＩピークを使用したときのデータ（クマイザサ抽出液のセファデックスＬＨ−２０カラムの溶出結果からトリシンのピークが検出されなかったため、未処理は０として算出し，２ＨＩＩＩピークを０．２ＮＨＣｌ処理、７ＨＩＩＩピークを０．７ＮＨＣｌ処理とそれぞれＸ軸表記）
【図２３】 ＢＩピークの酸加水分解によるルテオリン６−Ｃ−グルコシド含量の変化を示すグラフであって、図１７のＢＩピークに加水分解［最終濃度０．２Ｎ塩酸、１００℃、３０分間加熱処理］を施したときのデータ（酸加水分解処理前のものを水解前、酸加水分解処理したものを水解後とＸ軸に表記）
【図２４】 ＢＩピークの酸加水分解（水解）によるルテオリン６−Ｃ−アラビノシド含量の変化を示すグラフであって、図１７のＢＩピークを最終濃度０．２Ｎ塩酸、１００℃、３０分間加熱処理を行った場合のデータ（酸加水分解処理前のものを水解前、酸加水分解処理したものを水解後とＸ軸に表記）
【図２５】 ＢＩピークの酸加水分解（水解）によるトリシン（アグリコン）含量の変化を示すグラフであって、図１７のＢＩピークを最終濃度０．２Ｎ塩酸、１００℃、３０分間加熱処理を行ったときのデータ（酸加水分解前のものを水解前、酸加水分解処理したものを水解後とそれぞれＸ軸に表記）
【図２６】 ジエチルエーテルによる液・液分配で得られる水層のセファデックスＬＨ−２０カラムによる分画を示すチャート（試料葉採取地：北海道興部町）
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ササ及び／又はタケの葉を原料として、優れた抗酸化活性を有する組成物を製造する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
人は酸素を利用して生きている。ところが、酸素をエネルギーとして利用している限り、一部の酸素は過酸化水素（Ｈ２Ｏ２），スーパーオキサイドラジカル（・Ｏ２−），ヒドロキシラジカル（・ＯＨ−）等の活性酸素となって、この活性酸素は種々の疾病や老化の原因になることが知られている。
このため、化粧品や食品等の分野において、酸素の弊害を除去するための抗酸化剤の開発が行われている。
【０００３】
例えば、ハイビスカス，アロエ，ダイオウ，黄精，ウワウルシ，延命草，楊梅皮，葛根，センキュウ，ソウジュツ，薄荷葉，甘草，シャクヤク，ヨクイニン，辛夷，桂皮，十薬，黄連，牡丹皮，ゲンチアナ，五倍子，センブリ，ゲンノショウコ，黄柏，乾姜，オウゴン，猪苓，ガーリック，セイジ，オレガノ，ローズマリー，ローレル，セロリ，タイム，タラゴン，ナッツメグ，メース，クローブ，わさび，サボリ，バジル，唐辛子，豆茶，紅茶，緑茶，柿の葉，コーヒー，すぎな，ハチク，よもぎ，アマチャズル，クマササ，クコ，ヤブソテツ，シイタケ，ひじき，わかめ，いぎす，こんぶ，あらめ，オニワカメ，青のりからなる各植物より水若しくは低級アルコール又は低級アルコール水溶液により抽出された各種植物抽出物群から選択された１種又は２種以上を有効成分として含有することを特徴とする抗酸化剤が、下記の特許文献１に提案されている。
【０００４】
【特許文献１】 特開平６−２４９３７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、単に低級アルコール又は低級アルコール水溶液により抽出された各種植物抽出物は抗酸化活性が十分とはいえない。そこで、本発明は、卓越した抗酸化活性を有する組成物を製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、前記の植物としてタケ類及びササ類に注目した。タケ・ササの仲間は、マダケ属、ナリヒラダケ属、トウチク属、オカメザサ属、ササ属、アズマザサ属、ヤダケ属、メダケ属、カンチク属、ホウライチク属の１０属から成っている。中でもササ類は温帯や亜寒帯に広く分布する植物で、ササ属は日本を分布の中心とし、全国に種類、量ともに広く分布する。
従来の市販笹エキスには、抗菌作用、フリーラジカル消去活性、アルコール性脂肪肝、糖尿病、食欲増進作用、抗腫瘍作用等の機能性が知られているものの有効成分が特定されているものは少ない。
【０００７】
一般に植物にはフラボノイド類が含まれており、抗酸化能が期待される。しかし、タケ・ササの仲間、特にササ属植物、のフラボノイドに関する知見は少ない。本発明者らは、これらの葉に含まれているフラボノイド成分に着目し、抗酸化活性成分を抽出して活性の優れた組成物を製造する本発明の方法を完成したものである。
【０００８】
かくして、本発明によれば、以下のような方法が提供される。
（１）ササ及び／又はタケの葉の低級脂肪族アルコール、アセトン、アセトニトリル、熱水又は希酸溶液による抽出液から、当該溶液を蒸発するとともに水に置換又は加水し、濾過後又は濾過をせず、石油エーテル、ジクロロメタン、ベンゼン及び／又はジエチルエーテルで液・液分配を行わせて水層の液を取り出すことでクロロフィルを除去した後、該水層の液に酢酸エチルを添加して液・液分配を行い、酢酸エチル層の液並びに水層、ジエチルエーテル層を採取しササ及び／又はタケの葉由来のフラボノイド成分、特にルテオリン６−Ｃ−グルコシド及び／又はルテオリン６−Ｃ−アラビノシド等のルテオリン配糖体やトリシンを含む組成物を得ることを特徴とする抗酸化性組成物の製造方法。
【０００９】
（２）ササ葉及び／又はタケの葉の低級脂肪族アルコール抽出液から、該アルコールを蒸発するとともに水に置換し、石油エーテル及び／又はジエチルエーテルで液・液分配して水層の液を採取し、該水層の液に酢酸エチルを配合して液・液分配を行い、酢酸エチル層の液を採取し、ササ葉及び／又はタケの葉由来のフラボノイド、特にルテオリン６−Ｃ−グルコシド、ルテオリン６−Ｃ−アラビノシド等のルテオリン配糖体及び／又はトリシンを含む組成物を得る、抗酸化性組成物の製造方法。
【００１０】
（３）ササ葉及び／又はタケの葉の低級脂肪族アルコール抽出液から、該アルコールを蒸発するとともに水に置換し、石油エーテル及び／又はジエチルエーテルで液・液分配を行わせて水層の液を採取し、該水層の液に酢酸エチルを添加して液・液分配を行い、ジエチルエーテル層と酢酸エチルの２層からトリシンを含む液を採取することを特徴とする上記（１）の抗酸化性組成物の製造方法。
【００１１】
（４）前記低級脂肪族アルコール抽出液を濃縮し、水に置換又は加水し濾過後クロロフィルを濾去、水層にジエチルエーテルを添加し液・液分配を行い、得られる水層にさらに酢酸エチルを加え液・液分配を行い、これらの操作を複数回繰り返し、ジエチルエーテル層、酢酸エチル層からトリシンを、水層及び酢酸エチル層から６−Ｃ−グルコシド、ルテオリン６−Ｃ−アラビノシド等のルテオリン配糖体を含む液を採取することを特徴とする上記（２）の抗酸化性組成物の製造方法。
【００１２】
（５）前記低級脂肪族アルコール抽出液を濃縮し、水に置換又は加水し濾過後クロロフィルを濾去、水層にジエチルエーテルを添加し液・液分配を行い、得られる水層からルテオリン６−Ｃ−グルコシド、ルテオリン６−Ｃ−アラビノシド等のルテオリン配糖体を含む液又はトリシンを含む液を採取することを特徴とする抗酸化性組成物の製造方法。
（６）ササ葉又はタケの葉の抽出液を直接又は分画後に加水分解することにより、ルテオリン６Ｃ−グルコシド、ルテオリン６−Ｃ−アラビノシド、トリシンの含有率を高めることを特徴とする上記（１）〜（５）の抗酸化性組成物の製造方法。
【００１３】
本発明の方法により得られる抗酸化性組成物には、ササ葉及び／又はタケの葉由来のフラボノイドとして、それ自体新規な化合物であるルテオリン６−Ｃ−アラビノシドを含むことがある。この新規化合物は、本発明者らによって発見された従来未知のルテオリン配糖体であって、下記の化学式（１）で表される構造を有する。この新規化合物は、後述する実施例に示す測定データ等から明らかなごとく、良好なＤＰＰＨラジカル消去活性、ＳＯＤ様活性を有するのに加えて、脂質過酸化抑制活性に優れている。しかも、この新規化合物（ルテオリン６−Ｃ−アラビノシド）は、褐変酵素ポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ）の阻害活性も非常に大きいという、種々の利点を有する。
【００１４】
【化１】
（ただし、上記式中、Ｈｅｑはｅｑｕａｔｏｒｉａｌ Ｈを示し、Ｈａｘはａｘｉａｌ Ｈを示す。糖の同じ炭素に付いたプロトンのどちらかを明記するために用いた記号）
【００１５】
上記化合物の１Ｈ−ＮＭＲの値は、δ＝３．６０（ｄｄ，Ｊ＝２．８，９．６Ｈｚ，１Ｈ，３”−Ｈ），３．７２（ｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ，１Ｈ，５”−Ｈｅｑ），３．９５（ｍ，１Ｈ，４”−Ｈ），３．９９（ｄｄ，Ｊ＝２．４，１２．０Ｈｚ，１Ｈ，５”−Ｈａｘ），４．２４（ｄｄ，Ｊ＝９．６，９．６Ｈｚ，１Ｈ，２”−Ｈ），４．７９（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，１Ｈ，１”−Ｈ），６．５０（ｓ，１Ｈ，８−Ｈ），６．５５（ｓ，１Ｈ，３−Ｈ），６．８９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ，５’−Ｈ），７．３６（ｂｒ．ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ，２’−Ｈ），７．３７（ｄｄ，Ｊ＝２．０，８．４Ｈｚ，１Ｈ，６’−Ｈ）である。
【００１６】
また、本発明の方法による抗酸化性組成物は、ササ葉及び／又はタケの葉由来のフラボノイドとして、下記の化学式（２）で表されるルテオリン６−Ｃ−グルコシドを含むことがある。ルテオリン６−Ｃ−グルコシド自体は、下記の化学式で表される既知の化合物ではあるが、後述する実施例に示すとおり、良好なＤＰＰＨラジカル消去活性、ＳＯＤ様活性を有するのに加えて、脂質過酸化抑制活性にも優れているだけでなく、驚くべきことに、極めて優れた褐変酵素ポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ）の阻害活性を有する。しかも、その活性は、一般に知られているＰＰＯ阻害剤、他のフラボノイド類とは比較にならないほどに優れたものである。
ササ葉やタケの葉由来のルテオリン６−Ｃ−グルコシドがこのような優れた特性を有することは、従来全く知見がなく、誰もが予想し得ないところであった。
【００１７】
【化２】
【００１８】
上記化合物の１Ｈ−ＮＭＲの値は、δ＝３．４１（ｍ，１Ｈ，５”−Ｈ），３．４４−３．４９（ｍ，２Ｈ，３”，４”−Ｈ），３．７２（ｄｄ，Ｊ＝５．６，１２．４Ｈｚ，１Ｈ，６”−ＣＨＨ），３．８６（ｄｄ，Ｊ＝２．８，１２．４Ｈｚ，１Ｈ，６”−ＣＨＨ），４．１６（ｄｄｄ，Ｊ＝２．８，９．６，９．６Ｈｚ，１Ｈ，２”−Ｈ），４．９０（ｍ，１Ｈ，１”−Ｈ），６．４９（ｓ，１Ｈ，８−Ｈ），６．５６（ｓ，１Ｈ，３−Ｈ），６．８９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ，５’−Ｈ），７．３６（ｂｒ．ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ，２’−Ｈ），７．３７（ｄｄ，Ｊ＝２．０，８．４Ｈｚ，１Ｈ，６’−Ｈ）である。
【００１９】
また、本発明では得られる組成物に含まれる抗酸化性成分が、下記の化学式（３）で表されるトリシン化合物であってもよく、上記の各化合物（ルテオリン６−Ｃ−グルコシド、ルテオリン６−Ｃ−アラビノシド、トリシン等）が２種以上混在していてもよい。
【００２０】
【化３】
【００２１】
上記化合物の１Ｈ−ＮＭＲの値は、δ＝３．１−３．６（ｂｒ．ｓ，２Ｈ，７，４’−Ｈ−Ｏ），３．８７（ｓ，６Ｈ，２×Ｍｅ−Ｏ），６．１７（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ，６−Ｈ），６．５３（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ，８−Ｈ），６．９６（ｓ，１Ｈ，３−Ｈ），７．３１（ｓ，２Ｈ，２’，６’−Ｈ），１３．０（ｓ，１Ｈ，５−Ｈ−Ｏ）である。
【００２２】
上記のトリシン化合物は、後述の実施例に示すとおり、抗酸化活性のうちの１つである、脂質過酸化抑制活性に特に優れている。
【００２３】
以下、本発明の製造方法に関し、原料及び各工程並びに得られる抗酸化性組成物について、以下に順次詳述する。
【００２４】
（原料）
原料となるササは、クマイザサ、チマキザサ、クマザサ、チシマザサ、ミヤコザサ、ヤクシマダケ、スズタケ等その種類は問わない。また、タケも、モウソウチク、インヨウチク、マダケ、オオバヤダケ、メダケ、ホウライチク等が使用可能である、これらのササあるいはタケの葉の部分を、水洗した後、必要に応じて適当な大きさに細断し乾燥（水分除去）して使用する。ササ又はタケの葉は、粉末にしてもよく、枯れさせてもよい。
【００２５】
この原料を用いて、図１に例示するようなフローで抽出及び液・液分配を行う。各工程の具体例は、以下のとおりである。
（第１工程：アルコール抽出・蒸発乾固・粗抽出液の調製）
ササ葉１ｇに対して１０倍容のメタノールで抽出する。抽出は暗所で２４時間放置し、２４時間後濾過する。この操作を４回繰り返し、得られた濾液をあわせ、ロータリーエバポレーターで濃縮乾固し、試料重量の２倍容の純水に溶解する。このようにして得られた溶液を粗抽出液とする。
【００２６】
（第２工程：石油エーテルによる液・液分配）
上記の粗抽出液に対して同量の石油エーテルを加え、分液ロートにて水・石油エーテル溶媒の液・液分配を行う。この操作を２〜３回繰り返し行い、石油エーテル層と水層とを得る。石油エーテル層にはクロロフィルが含まれるので廃棄する。
【００２７】
（第３工程：ジエチルエーテルによる液・液分配）
次に、得られた水層に該水層と同量のジエチルエーテルを添加し、分液ロートにて水・ジエチルエーテル溶媒の液・液分配を行う。この操作を２〜３回繰り返し行い、ジエチルエーテル層、水層を得る。ジエチルエーテル層をロータリーエバポレーターで乾固する。
【００２８】
（第４工程：酢酸エチルによる液・液分配）
第３工程で得られた水層に、該水層と同量の酢酸エチルを加え、分液ロートにて、水・酢酸エチル溶媒の液・液分配を行う。この操作を２〜３回繰り返し行い、酢酸エチル層、水層を得る。各層をロータリーエバポレーターで濃縮乾固し、メタノールに置換する。
【００２９】
（組成物に含まれる有効成分）
上述のようにして得たジエチルエーテル層には、主にトリシンが含まれ、酢酸エチル層には、ルテオリン６−Ｃ−アラビノシド、ルテオリン６−Ｃ−グルコシド並びにトリシンが主に含まれる。一方、水層には、ルテオリン６−Ｃ−グルコシドが主に含まれる。すでに述べたように、これらは抗酸化活性を有する化合物であり、これらの少なくとも１種の化合物を含む組成物もまた抗酸化活性を有する。
【００３０】
（新規化合物の単離・精製及び同定）
酢酸エチル層に抗酸化成分として含まれるルテオリン６−Ｃ−アラビノシドは、それ自体、従来未知の新規化合物である。以下、ルテオリン６−Ｃ−アラビノシド及びその他の有効成分の単離・精製及び同定について詳細に説明する。
【００３１】
（単離・精製方法）
メタノールに置換した酢酸エチル層２ｍｌを、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ＬＨ−２０をガラス管（内径２ｃｍ、高さ９０ｃｍ）に充填したカラムクロマトグラフィーにアプライする。溶離液に６０％メタノールを用い、フラクションコレクターで８ｍｌずつ分画する。それぞれのフラクションについて波長３５０、３３０及び２５０ｎｍにおける吸光度に従い分画し、ピークを得たら、該当ピークを濃縮しフォトダイオードアレイ検出器を用いたＨＰＬＣによる分取を行う。ＨＰＬＣの条件は下記のとおりである。
カラム：ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０Ｔｓ（２１．５ｍｍＩ．Ｄ．×３００ｍｍ）
移動相：水／アセトニトリル／メタノール＝７／２／１（ｖ／ｖ／ｖ）
流速：６．０ｍｌ／ｍｉｎ
オーブン温度：４０℃
【００３２】
（物質の同定）
本発明で得られる抗酸化性組成物に含まれる有効成分の化合物は、吸収スペクトル分析、質量分析及びＮＭＲ分析等により同定することが出来る。以下、本発明者らが実施した同定法について詳述する。
＜吸収スペクトル法＞
精製物をメタノールに溶解し、４５０〜２３０ｎｍにおけるＵＶ・ＶＩＳ吸収スペクトルを測定した。すなわち、試料のメタノール溶液を測定した後、ナトリウムメチラート（ＮａＯＭｅ）、塩化アルミニウム（ＡｌＣｌ３）、１２％塩酸（１２％ＨＣｌ）、酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）、ホウ酸（Ｈ３ＢＯ３）の各種試薬を添加し吸収スペクトルを測定した。その結果は、下記の表１に示すとおりである。
【００３３】
【表１】
【００３４】
ルテオリン６−Ｃ−アラビノシド（Ｌｕｔｅｏｌｉｎ６−Ｃ−ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ）
ＮａＯＭｅ添加によってＢｄ．Ｉが４５〜６５ｎｍの深色移動することから、３位の遊離水酸基の欠如又は酸素化（ＯＲ）が示唆される。また、Ｂｄ．Ｉの極大吸収が増大することより４′位に遊離水酸基が存在することがわかる。
ＡｌＣｌ３添加によってＢｄ．Ｉが深色移動することより、３位又は５位又はその両方に遊離水酸基ないしは隣接する遊離水酸基が存在する。
ＡｌＣｌ３＋ＨＣｌ添加によってＡｌＣｌ３のＢｄ．Ｉより浅色移動するが元のＢｄ．Ｉに戻りきらないことより、３位又は５位又はその両方に遊離水酸基が存在し、さらにＢ環中に隣接する遊離水酸基の存在することがわかる。
ＮａＯＡｃ添加によりＢｄ．ＩＩが５〜２０ｎｍの深色移動することから７位に遊離水酸基が存在する。
ＮａＯＡｃ＋Ｈ３ＢＯ３添加により、Ｂｄ．Ｉが１２〜３６ｎｍの深色移動することから３′，４′位に遊離水酸基が存在する。
なお、Ｂｄ．Ｉとは、波長３３０〜４２０ｎｍ付近の極大吸収を示し、Ｂｄ．ＩＩとは２３０〜２９０ｎｍ付近の極大吸収を示す。また、深色移動は長波長側、浅色移動は短波長側にシフトすることを示す。
以上の事より、３′，４′，５，７位に遊離水酸基が存在するフラボン骨格のルテオリンであることが、また、Ｂｄ．ＩＩに２つの極大が見られることから６位又は８位に結合糖が存在することがわかる。
【００３５】
ルテオリン６−Ｃ−グルコシド（Ｌｕｔｅｏｌｉｎ６−Ｃ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）
ＮａＯＭｅ添加によってＢｄ．Ｉが４５〜６５ｎｍの深色移動することから、３位の遊離水酸基の欠如又は酸素化（ＯＲ）が示唆された。また、Ｂｄ．Ｉの極大吸収が増大することより４′位に遊離水酸基が存在することがわかる。
ＡｌＣｌ３添加によってＢｄ．Ｉが深色移動することより、３位又は５位又はその両方に遊離水酸基ないしは隣接する遊離水酸基が存在する。
ＡｌＣｌ３＋ＨＣｌ添加によってＡｌＣｌ３のＢｄ．Ｉより浅色移動するが元のＢｄ．Ｉに戻りきらないことより、３位又は５位又はその両方に遊離水酸基が存在し、さらにＢ環中に隣接する遊離水酸基が存在することがわかる。
ＮａＯＡｃ添加によりＢｄ．ＩＩが５〜２０ｎｍの深色移動することから７位に遊離水酸基が存在する。
ＮａＯＡｃ＋Ｈ３ＢＯ３添加によってＢｄ．Ｉから１２〜３６ｎｍの深色移動することより、３′，４′位に遊離水酸基が存在する。
以上の事より、３′，４′，５，７位に遊離水酸基が存在するフラボン骨格のルテオリンであることが、そして、Ｂｄ．ＩＩに２つの極大が見られることから６位又は８位に結合糖が存在することがわかる。
【００３６】
トリシン（Ｔｒｉｃｉｎ）
ＮａＯＭｅ添加によりＢｄ．Ｉが４５〜６５ｎｍの深色移動することより、３位の遊離水酸基の欠如又は酸素化（ＯＲ）がわかる。また、Ｂｄ．Ｉの極大吸収が増大することより、４′位に遊離水酸基が存在する。
ＡｌＣｌ３添加によりＢｄ．Ｉが深色移動することから、３位又は５位又はその両方に遊離水酸基ないしは隣接する遊離水酸基が存在する。
ＡｌＣｌ３＋ＨＣｌ添加によりＡｌＣｌ３のＢｄ．Ｉと比較し浅色移動しないことより、３位又は５位又はその両方に遊離水酸基が存在するが、Ｂ環中に隣接する遊離水酸基がないことがわかる。
ＮａＯＡｃ添加によりＢｄ．ＩＩが５〜２０ｎｍの深色移動することから、７位に遊離水酸基が存在する。
ＮａＯＡｃ＋Ｈ３ＢＯ３の添加によりメタノール溶液のＢｄ．Ｉと比べて深色移動がないことより、隣接する遊離水酸基がないことがわかる。
以上の事より、４′，５，７位に遊離水酸基が存在するフラボン骨格を持つ色素であることがわかる。
【００３７】
＜質量分析＞
精製した試料について、パーセプティブ社製質量分析計Ｍａｒｉｎｅｒを用い、分子量を正イオンモード（ＰＯＳ）で測定した。条件は下記の表２に示すとおりである。
［質量分析条件］
内部標準：４−ａｃｅｔａｍｉｄｏｐｈｅｎｏｌ（ｍ／ｚ１５２．０７），ｒｅｓｅｒｐｉｎｅ（ｍ／ｚ６０９．２８）
インターフェイス：Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ（ＥＳＩ）
温度：室温（２５℃）
【００３８】
【表２】
【００３９】
ルテオリン６−Ｃ−アラビノシド（Ｌｕｔｅｏｌｉｎ６−Ｃ−ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ）
吸収スペクトルで糖の結合が示唆されるが、ルテオリン骨格であることを考慮するとｍ／ｚから結合糖はペントース１つであることがわかる。また、イオン化の際に断片化を生じていないことから、糖との結合はＣ結合であることがわかる。
【００４０】
ルテオリン６−Ｃ−グルコシド（Ｌｕｔｅｏｌｉｎ６−Ｃ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）
吸収スペクトルで糖の結合が示唆されたが、ルテオリン骨格であることを考慮するとｍ／ｚから結合糖はヘキソース１つであることがわかる。またイオン化の際に断片化を生じていないことから、糖とアグリコンの結合はＣ結合であることがわかる。
【００４１】
一般に、ルテオリン配糖体には、抗酸化の他に、抗炎症、ガン予防、抗不整脈作用等が報告されており、上記の２種の化合物にも、本発明者らが確認した抗酸化活性のほかに、抗炎症、ガン予防、抗不整脈作用等も期待される。
【００４２】
トリシン（Ｔｒｉｃｉｎ）
吸収スペクトルからフラボン類であることがわかるが、ｍ／ｚから結合糖は存在しないアグリコンであることがわかった。また、ｍ／ｚから構造の２カ所がメトキシル化されていることが推測される。
トリシンには、抗腫瘍活性、抗白血病活性があること、脂質の過酸化を抑制することが知られている。また、防虫効果もある。
【００４３】
＜ＮＭＲ分析＞
それぞれ、十分に乾燥したサンプルを２〜１０ｍｇ計量採取し、ＮＭＲ測定管に移して重メタノールもしくは重ジメチルスルホキシド０．７ｍｌに溶解して、１Ｈ−ＮＭＲをＪｅｏｌＪＮＭ−Ａ４００（４００ＭＨｚ）にて測定する。（内部標準：ＣＤ３ＯＤ，３．３０，ＤＭＳＯ−ｄ６，２．４９）
【００４４】
ルテオリン６−Ｃ−アラビノシド（Ｌｕｔｅｏｌｉｎ６−Ｃ−ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ）
δ＝３．６０（ｄｄ，Ｊ＝２．８，９．６Ｈｚ，１Ｈ，３”−Ｈ），３．７２（ｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ，１Ｈ，５”−Ｈｅｑ），３．９５（ｍ，１Ｈ，４”−Ｈ），３．９９（ｄｄ，Ｊ＝２．４，１２．０Ｈｚ，１Ｈ，５”−Ｈａｘ），４．２４（ｄｄ，Ｊ＝９．６，９．６Ｈｚ，１Ｈ，２”−Ｈ），４．７９（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，１Ｈ，１”−Ｈ），６．５０（ｓ，１Ｈ，８−Ｈ），６．５５（ｓ，１Ｈ，３−Ｈ），６．８９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ，５’−Ｈ），７．３６（ｂｒ．ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ，２’−Ｈ），７．３７（ｄｄ，Ｊ＝２．０，８．４Ｈｚ，１Ｈ，６’−Ｈ）．
【００４５】
１Ｈ−ＮＭＲでは測定溶媒として重メタノールが用いられる。芳香族由来と思われるシグナルが５種類それぞれ１Ｈ観測される。そのうちδ＝６．８９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．３６（ｂｒ．ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），７．３７（ｄｄ，Ｊ＝２．０，８．４Ｈｚ）の３種のシグナルの結合定数から、３置換ベンゼンの存在が推定され、置換位置は、オルト及びパラであると考えられる。また、その他２種の芳香族プロトンδ＝６．５０（ｓ），６．５５（ｓ）は一重線であったが、その化学シフトと前述の３種の化学シフトを既知化合物であるルテオリンと比較すると比較的よい一致を示すので、アグリコン部はルテオリンであると推定される。ただし、ルテオリンの６位に相当するシグナルは観測されないので、６位に何らかの置換基の存在が示唆され、吸収スペクトルの結果によく一致する。
次に、δ＝３．６０（ｄｄ，Ｊ＝２．８，９．６Ｈｚ），３．７２（ｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ），３．９５（ｍ），３．９９（ｄｄ，Ｊ＝２．４，１２．０Ｈｚ），４．２４（ｄｄ，Ｊ＝９．６，９．６Ｈｚ），４．７９（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ）のシグナルにより、糖の存在が示唆される。アノマー位（１”位）のプロトン４．７９（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ）の結合定数から、アノマー位の隣接プロトンとはアキシアル−アキシアルの関係にある、即ち糖部分はβ結合にてアグリコンに結合していると決定される。またその化学シフトがＯ−グルコシドよりも高磁場シフトしていることから、糖部分はＣ−グリコシル化しているものと考えられ質量分析の結果に整合した。糖部分のシグナルの化学シフトと結合定数はアラビノースのものとよい対応を示すことから糖部分はアラビノースであると推定される。
以上、アグリコン部、糖部を総合し、先の吸収スペクトルと質量分析結果ををあわせて考慮した結果、この化合物はルテオリン６−Ｃ−アラビノシドと決定することができる。
【００４６】
ルテオリン６−Ｃ−グルコシド（Ｌｕｔｅｏｌｉｎ６−Ｃ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）
δ＝３．４１（ｍ，１Ｈ，５”−Ｈ），３．４４−３．４９（ｍ，２Ｈ，３”，４”−Ｈ），３．７２（ｄｄ，Ｊ＝５．６，１２．４Ｈｚ，１Ｈ，６”−ＣＨＨ），３．８６（ｄｄ，Ｊ＝２．８，１２．４Ｈｚ，１Ｈ，６”−ＣＨＨ），４．１６（ｄｄｄ，Ｊ＝２．８，９．６，９．６Ｈｚ，１Ｈ，２”−Ｈ），４．９０（ｍ，１Ｈ，１”−Ｈ），６．４９（ｓ，１Ｈ，８−Ｈ），６．５６（ｓ，１Ｈ，３−Ｈ），６．８９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ，５’−Ｈ），７．３６（ｂｒ．ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ，２’−Ｈ），７．３７（ｄｄ，Ｊ＝２．０，８．４Ｈｚ，１Ｈ，６’−Ｈ）．
【００４７】
１Ｈ−ＮＭＲでは測定溶媒として重メタノールを用いられる。芳香族由来と思われるシグナルが５種類それぞれ１Ｈ観測される。そのうちδ＝６．８９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．３６（ｂｒ．ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），７．３７（ｄｄ，Ｊ＝２．０，８．４Ｈｚ）の３種のシグナルの結合定数から、３置換ベンゼンの存在が推定され、置換位置は、オルト及びパラであると考えられる。また、その他２種の芳香族プロトンδ＝６．４９（ｓ），６．５６（ｓ）は一重線であったが、その化学シフトと前述の３種の化学シフトを既知化合物であるルテオリンと比較すると、かなりよい一致を示すことから、アグリコン部はルテオリンであると推定される。ただし、ルテオリンの６位に相当するシグナルは観測されなかったので、６位に何らかの置換基の存在が示唆され先の吸収スペクトルの結果によく一致する。
次に、δ＝３．４１（ｍ，１Ｈ），３．４４−３．４９（ｍ，２Ｈ），３．７２（ｄｄ，Ｊ＝５．６，１２．４Ｈｚ，１Ｈ），３．８６（ｄｄ，Ｊ＝２．８，１２．４Ｈｚ，１Ｈ），４．１６（ｄｄｄ，Ｊ＝２．８，９．６，９．６Ｈｚ，１Ｈ），４．９０（ｍ，１Ｈ）のシグナルにより、糖の存在が示唆される。アノマー位（１”位）のプロトン４．９０（ｍ）に隣接していると考えられるプロトン４．１６（ｄｄｄ，Ｊ＝２．８，９．６，９．６Ｈｚ）の結合定数より、２”位は二つの隣接するプロトンとアキシアルーアキシアルーアキシアルの関係にあると考えられる。すなわち、糖部分はβ結合にてアグリコン部に結合していると推定される。また、その化学シフトがＯ−グルコシドよりも高磁場シフトしていることから、Ｃ−グリコシル化しているものと考えられ、先の質量分析の結果と一致する。糖部分のシグナルの化学シフトと結合定数はグルコースのものとよい対応を示すことから糖部分はグルコースであると推定される。
以上、アグリコン部、糖部を総合し、先の吸収スペクトルと質量分析結果とをあわせて考慮した結果、この化合物はルテオリン６−Ｃ−グルコシドと決定することができる。
【００４８】
トリシン（Ｔｒｉｃｉｎ）
δ＝３．１−３．６（ｂｒ．ｓ，２Ｈ，７，４’−Ｈ−Ｏ），３．８７（ｓ，６Ｈ，２×Ｍｅ−Ｏ），６．１７（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ，６−Ｈ），６．５３（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ，８−Ｈ），６．９６（ｓ，１Ｈ，３−Ｈ），７．３１（ｓ，２Ｈ，２’，６’−Ｈ），１３．０（ｓ，１Ｈ，５−Ｈ−Ｏ）．
【００４９】
１Ｈ−ＮＭＲでは測定溶媒として重ジメチルスルホキシドが用いられる。δ＝６．１７（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ，６−Ｈ），６．５３（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ，８−Ｈ），６．９６（ｓ，１Ｈ，３−Ｈ），７．３１（ｓ，２Ｈ，２’，６’−Ｈ）に４種の芳香族プロトンが観測される。このうち、δ＝６．１７（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），６．５３（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ）に相関が観測され、その結合定数よりこの二つのプロトンはメタの関係にあると推定される。δ＝７．３１（ｓ）のシグナルが積分比として２プロトン分あること、メトキシ基と考えられるδ＝３．８７（ｓ）のシグナルが積分比として６プロトン分あること等から、対象性を有する４置換ベンゼンの存在が示唆される。また、δ＝３．１−３．６（ｂｒ．ｓ，２Ｈ）に水酸基由来のプロトンが２プロトン、及びδ＝１３．０（ｓ，１Ｈ）の低磁場に水素結合をしていると考えられる水酸基のプロトンが観測されることから、水酸基が３種あると推定される。
以上、先の吸収スペクトル、質量分析結果とをあわせた結果、この化合物はトリシンと決定することができる。
【００５０】
なお、後述の実施例２、３で詳述するように、本発明者らの研究によれば、ルテオリン６−Ｃ−グルコシド、ルテオリン６−Ｃ−アラビノシド、トリシンの３種のフラボノイド成分の収量を上げる方法として、（１）ササ葉抽出液の酸加水分解による方法、及び、（２）分画後ピークの酸加水分解による方法、の２つの方法があることが見出された。また、加水分解は酸を用いるほか、アミラーゼ等の糖鎖切断酵素によっても可能である。
これらの方法によれば、より高い収率で上記３種のフラボノイド化合物を得ることができるので、工業的に特に有利である。
【発明の効果】
【００５１】
本発明方法により得られる液状組成物は、抗酸化活性に優れたものであり、従来のササエキス等に比べて、抗酸化活性に優れ、かつ耐熱性、耐光性も良好な組成物が得られる、という利点を有する。具体的に説明すると、ルテオリン６−Ｃ−アラビノシド、ルテオリン６−Ｃ−グルコシド等のルテオリン配糖体を含む組成物は、ＤＰＰＨラジカル消去活性、スーパーオキシドアニオンラジカル消去活性（ＳＯＤ様活性）、脂質過酸化抑制効果等に優れており、しかも、褐変酵素ポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ）の阻害効果が極めて大きいという利点を有する。また、トリシンを含む組成物は、脂質過酸化抑制効果に優れている。
したがって、本発明による抗酸化性の組成物は、化粧品、食品、医薬品等の広い分野で有用である。
さらに、本発明の組成物は、優れた消臭作用を有するため、例えば魚介類等を用いた食品加工時や調理ごみ、畜産廃棄物処理時等に発生する臭気を、該組成物を添加することにより有効に抑制することができるという効果も期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５２】
以下に、本発明方法の実施例及び比較例を詳述する。ただし、本発明はこれらの実施例によってその範囲が限定されるものではない。なお、例中の％は特に断らない限り重量％を意味する。なお、抗酸化活性の測定は次のように実施した。
【００５３】
１．ＤＰＰＨラジカル消去活性
安定なラジカルであるＤＰＰＨラジカルに対するラジカル消去活性について検討した。
０．５ｍＭのＤＰＰＨラジカル・エタノール溶液１００μｌ、試料１００μｌの順に小ワッセルマンに採取し混合した。すばやく攪拌し、偏平セルに吸い上げてキャビティに挿入し、一定時間後（４５秒）にＥＳＲ装置（ＪｅｏｌＪＥＳ−ＦＲ３０）に装填し測定を開始した。ブランクには超純水又はアセトニトリルを用いた。下記条件のＥＳＲに供した。なお、ラジカルの消去率を（１−サンプル値／ブランク値）×１００として求めた。
Ｆｉｅｌｄ：３３５±５ｍＴ
Ｐｏｗｅｒ：４ｍＷ
Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ Ｗｉｄｔｈ：４０μＴ
Ｓｗｅｅｐ Ｔｉｍｅ：２ｍｉｎ
Ｔｉｍｅ ｃｏｎｓｔ：０．１ｓｅｃ
Ａｍｐ：２５０
【００５４】
２．スーパーオキシドアニオンラジカル消去活性（ＳＯＤ様活性）
ヒポキサンチンを基質とし、キサンチンオキシターゼ（ＸＯＤ）の反応によるスーパーオキシドアニオンラジカル発生系を用い、ＳＯＤ様活性を測定した。
原液ＤＭＰＯ（ラボテックＮＨ−６８７）１５μｌ、５ｍＭのＨｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ（ＳＩＧＭＡ Ｈ−９３７７）５０μｌ、５．５ｍＭのＤＴＰＡ（同仁化学３４７−０１１４１）３５μｌ、試料５０μｌ、０．４Ｕ／ｍｌのＸＯＤ（ＳＩＧＭＡ Ｘ−４３７６）５０μｌの順に小ワッセルマンに採取し混合した。すばやく攪拌し、偏平セルに吸い上げてキャビティに挿入し、一定時間後（４５秒）にＥＳＲ装置（ＪｅｏｌＪＥＳ−ＦＲ３０）に装填し測定を開始した。ブランクには超純水又はアセトニトリルを用いた。下記条件のＥＳＲに供した。スーパーオキシドアニオンラジカルの消去率を（１−サンプル値／ブランク値）×１００として求めた。
Ｆｉｅｌｄ：３３５±５ｍＴ
Ｐｏｗｅｒ：４ｍＷ
Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ Ｗｉｄｔｈ：０．０７９ｍＴ
Ｓｗｅｅｐ Ｔｉｍｅ：２ｍｉｎ
Ｔｉｍｅ ｃｏｎｓｔ：０．１ｓｅｃ
Ａｍｐ：２５０
【００５５】
３．脂質過酸化抑制効果
４％リノール酸メチル・メタノール溶液１０ｍｌ、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）１０ｍｌを遠沈管に採取し、サンプル１ｍｌ加え、オーブンで５５℃、４８時間加熱処理し、過酸化脂質を生成させた。サンプルはササ葉１ｇ／１００ｍｌの濃度になるように調製した。ブランクとしてメタノール、対象として２０ｐｐｍトコフェロールをサンプルの代わりに加え、同様にオーブンで５５℃、４８時間加熱処理し、過酸化脂質を生成させた。
生じた過酸化脂質の過酸化物価（ＰＯＶ）を常法にしたがい測定し、抗酸化剤が無い状態のコントロールのＰＯＶを０％とし、試料の脂質過酸化抑制率を求めた。
【実施例１】
【００５６】
（１）組成物の調製
原料のササ葉として北海道に自生しているクマイザサ（Ｓａｓａ ｓｅｎａｎｅｎｓｉｓ）の葉（採取地：網走市葉八坂）を用い、これを図１に示すような手順で、以下のように処理し、液状の組成物を得た。
まず、水洗したササ葉１ｇを５倍容のメタノールに浸漬・抽出した。暗所で２４時間放置して抽出した後、濾過した。次いで濾液をロータリーエバポレーターで濃縮乾固し、ササ葉重量の２倍容の純水に溶解した。得られた水溶液を粗抽出液とした。
上記の粗抽出液に対して、等量の石油エーテルを加え、水・石油エーテル溶媒の液・液分配を行った。この操作を２〜３回繰り返し行い、石油エーテル層及び水層を得た。得られた水層を用い、水・ジエチルエーテル溶媒の液・液分配を行った。この操作を２〜３回繰り返し行い、ジエチルエーテル層と水層とを得た。得られた水層を採取してこれに酢酸エチルを加え、水・酢酸エチルの液・液分配を行った。この操作を２〜３回繰り返し行い、酢酸エチル層及び水層を得た。
得られた各層を採取し、ササ葉重量に対して等量の液量になるようにロータリーエバポレーターで濃縮・乾固し、これをメタノールに置換して抗酸化性組成物を得た。水層については、ＸＡＤカラムにより遊離の糖を取り除いて抗酸化性組成物を得た。
置換した各層の液状組成物を用い、それぞれフェノール物質の定量及び抗酸化活性の測定を行った。
【００５７】
（２）得られた各層組成物のフェノール物質含量の測定
フォリン試薬を用いるＳｗａｉｎらの方法を一部改良した方法により組成物のフェノール物質含量を測定した。すなわち、試料０．５ｍｌに１Ｎフェノール試薬を１ｍｌ加え混合し、１Ｎ水酸化ナトリウムを含む１０％炭酸ナトリウム２．５ｍｌを加え混合した。混合後、室温で３０分間放置した。濁ったサンプルについては遠心分離（１０００ｒｐｍ、１０分間）を行い、波長６５０ｎｍにおける吸光度を測定した。また、０．５ｍＭ没食子酸を用いて検量線を作成し、検量線より各層中のフェノール含量及び、ササ葉１ｇ中のフェノール含量を没食子酸換算で求めた。その結果を、図２に示す。
【００５８】
（３）得られた各層組成物の抗酸化活性の測定
各層組成物の抗酸化活性を評価するため、安定なラジカルであるＤＰＰＨラジカルに対するラジカル消去活性及びＳＯＤ様活性（Ｏ２−・［スーパーオキシドアニオンラジカル］消去活性）について検討した。
まず、ＤＰＰＨラジカル消去活性を測定するため、０．５ｍＭＤＰＰＨラジカル・エタノール溶液１００μｌ、試料１００μｌの順に小ワッセルマンに採取し混合した。すばやく攪拌し、偏平セルに吸い上げてキャビティに挿入し、一定時間後（４５秒）にＥＳＲ測定を開始した。ブランクには超純水又はアセトニトリルを用いた。上記の条件のＥＳＲに供した。消去率を（１−サンプル値／ブランク値）×１００として求めた。得られた消去率より消去率が５０％になる濃度（ＩＣ５０）を求めた。
【００５９】
次に、ＳＯＤ様活性を測定するため、ヒポキサンチンを基質とし、キサンチンオキシターゼ（ＸＯＤ）の反応によるスーパーオキシドアニオンラジカル発生系を用い、ＳＯＤ様活性を測定した。
原液ＤＭＰＯ（ラボテックＮＨ−６８７）１５μｌ、５ｍＭ Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ５０μｌ、５．５ｍＭ ＤＴＰＡ３５μｌ、試料５０μｌ、０．４Ｕ／ｍｌ ＸＯＤ５０μｌの順に小ワッセルマンに採取し混合した。すばやく攪拌し、偏平セルに吸い上げてキャビティに挿入し、一定時間後（４５秒）にＥＳＲ測定を開始した。ブランクには超純水又はアセトニトリルを用いた。上記と同様の条件でＥＳＲに供した。
消去率を（１−サンプル値／ブランク値）×１００として求めた。得られた消去率より消去率が５０％になる濃度（ＩＣ５０）を求めた。
【００６０】
それらの結果を図３に示す。図３に示す結果から、本発明による液状組成物は良好な抗酸化活性を有することがわかる。
【００６１】
（分画）
そこで、酢酸エチル層及び水層について、それぞれ、セファデックスＬＨ−２０吸着カラムクロマトグラフィーによる分画を行った。
酢酸エチル層、水層のＬＨ−２０カラムによる吸着分画の結果、図４及び図５に示すように、酢酸エチル層が８個、水層が７個のピークが観察された。酢酸エチル層のそれぞれのピークをＥＡ＃１からＥＡ＃８とし、水層のそれぞれのピークをＷ＃１からＷ＃７とした。この得られたピークの各部分を濃縮・乾固し、メタノールに置換した。
【００６２】
次に、酢酸エチル層のＥＡ＃１からＥＡ＃８のピーク部分のフェノール物質の定量を行った。フェノール含量は没食子酸換算で算出した。その結果、ＥＡ＃３のフェノール物質含有量が０．１２ｍｇ／ｇと最も高く、次にＥＡ＃７＝０．１１ｍｇ／ｇ、ＥＡ＃６＝０．０９ｍｇ／ｇ，ＥＡ＃５＝０．０７ｍｇ／ｇであった。
【００６３】
＜抗酸化活性＞
また、抗酸化活性を測定した結果、図６に示すごとく、ＤＰＰＨラジカル消去活性では、ＥＡ＃３，ＥＡ＃５，ＥＡ＃６，ＥＡ＃７の消去率が高く、それぞれ、６０．０９％、５２．０３％、７３．７４％、７９．７３％の消去率であった。ＳＯＤ様活性（スーパーオキシドアニオンラジカル消去活性）では、ＥＡ＃５，ＥＡ＃６，ＥＡ＃７が高く、それぞれ、３９．９７％、４２．３５％、５３．８０％の消去率を示した。
【００６４】
一方、酢酸エチルによる液・液分配の結果得られた水層側の液体組成物は、図７に示すように、Ｗ＃１、Ｗ＃５〜Ｗ＃７で、抗酸化活性を有するものであった。
【００６５】
また、各分画ピークのフェノール含量と抗酸化活性で相関を調べた。図８に示すように、フェノール含量とＤＰＰＨラジカル活性では、Ｒ２＝０．８７４、フェノール含量とＳＯＤ様活性ではＲ２＝０．７７０７と、ともに高い比例関係がみられた。このことより、ササ葉の抗酸化活性はフラボノイドに代表されるフェノール成分が関与していると言える。
【００６６】
また、図９に見られるように、ＤＰＰＨラジカル消去能とＳＯＤ様活性との関係にも比例関係が見られた。ササ葉の抗酸化成分はＤＰＰＨラジカル消去活性、ＳＯＤ様活性では同じ成分が寄与していると言える。
【００６７】
ササ葉から抽出し同定したルテオリン６−Ｃ−グルコシドの安定性を調べるため、耐熱性及び耐光性の試験を行った。耐熱性試験は１００℃の条件で行い、耐光性試験は紫外線照射により行った。それぞれの試験において、比較試料としてルテオリン７−Ｏ−グルコシドを用いた。
耐熱性試験の結果を図１０、図１２に、耐光性試験の結果を図１１、図１３に示す。
【００６８】
その結果、図１０及び図１２に示すように、１００℃における耐熱性では、各サンプルで時間経過と共に残存率及びＤＰＰＨラジカル消去活性に減少傾向がみられたが、ルテオリン６−Ｃ−グルコシドはルテオリン７−Ｏ−グルコシドに比べても安定性が高く、抗酸化活性の大幅な低下も見られなかった。また、耐光性についても、図１１及び図１３に示すように、紫外線照射による大きな変化は認められなかった。
この結果より、ササ葉の抗酸化成分であるルテオリン６−Ｃ−グルコシドは１００℃では壊れにくく、実用上十分な熱安定性を有すること、紫外線に対する安定性が高く耐光性にも優れていることがわかった。
【００６９】
下記の表３に、本発明の組成物に含まれる上記各化合物（ルテオリン６−Ｃ−アラビノシド、ルテオリン６−Ｃ−グルコシド及びトリシン）精製品の抗酸化活性をまとめて示す。
【００７０】
【表３】
【００７１】
なお、表３中の油脂過酸化抑制率の測定は次のように行った。
＜油脂過酸化抑制率の測定＞
（１）試料油脂の調整
４％リノール酸メチル・メタノール溶液１０ｍｌ、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）１０ｍｌを遠沈管に採取し、サンプル１ｍｌ加え、オーブンで５５℃、４８時間加熱処理し、過酸化脂質を生成させた。サンプルはササ葉１ｇ／１００ｍｌの濃度になるように調製した。ブランクとしてメタノール、対象として２０ｐｐｍトコフェロールをサンプルの代わりに加え、同様にオーブンで５５℃、４８時間加熱処理し、過酸化脂質を生成させた。
【００７２】
（２）ＰＯＶ検定
ＰＯＶ検定は、日本油脂学会による酸化油脂中の過酸化物価の測定法に従い、過酸化脂質（ヒドロペルオキシド）が酸性条件下で還元される反応に基づき、遊離されるヨウ素をチオ硫酸ナトリウムで滴定する方法で行った。
重クロム酸カリウムを純水に溶解し、０．０１Ｎ重クロム酸カリウム溶液を作成する。このとき、重クロム酸カリウム溶液のファクター（ｆ＝採取量／理論値）を求めておく。ヨウ化カリウム１ｇを純水５ｍｌに溶解させる。そこに０．０１Ｎ重クロム酸カリウム溶液２０ｍｌ、塩酸５ｍｌを加え、撹拌後栓をして５分間暗所に放置した。５分後、純水３００ｍｌを加え、遊離ヨウ素を０．０１Ｎチオ硫酸ナトリウム溶液で滴定した。褐色が消えかかったら、１％澱粉指示薬を加え、青色が完全に消失するまで滴定した。滴定値がＶｍｌのとき、０．０１Ｎチオ硫酸ナトリウム溶液のファクターは、Ｆ＝２０×ｆ／Ｖで求め、滴定を行った。
上述のように調製した試料油脂１ｇを採取し、クロロホルム−氷酢酸混液（３：２）２５ｍｌ、飽和ヨウ化カリウム溶液１ｍｌ加え、すぐに撹拌し、１分間暗所に放置した。反応を止めるために純水７５ｍｌを加えた。２層に分かれる上層の赤紫色の消失を終点とし、遊離ヨウ素を０．０１Ｎチオ硫酸ナトリウム溶液で滴定した。空試験には純水１ｇを用いて行った。ここで、過酸化物価（ＰＯＶ）は、以下の数式で算出される。
【００７３】
【数１】
【００７４】
表３に示す結果から、本発明者らの発明に係る新規物質であるルテオリン６−Ｃ−アラビノシドは、ＤＰＰＨラジカル消去活性、ＳＯＤ様活性において特に優れていること、また、ルテオリン６−Ｃ−グルコシドは、良好なＤＰＰＨラジカル消去活性、ＳＯＤ様活性を有するのに加えて、脂質過酸化抑制活性に優れていること、一方、トリシンは、ＤＰＰＨラジカル消去活性、ＳＯＤ様活性は見られないが、脂質過酸化抑制活性に優れていることがわかった。
【００７５】
次に、ササの葉由来のフラボン類について、褐変酵素ポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ）の阻害効果を調べるため、一般に知られているＰＰＯ活性阻害剤、他のフラボノイド類との比較測定を行った。その測定方法は以下のとおりであり、測定結果は下掲の表４に示すとおりである。
【００７６】
＜ＰＰＯ（褐変酵素ポリフェノールオキシダーゼ）阻害活性の測定＞
０．０５Ｍクロロゲン酸を基質とし酵素液としてタマネギ鱗茎より抽出・部分精製を行った酵素液を用いた。すなわち、１．３ｍｌの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に１ｍＭ濃度、２ｍＭ濃度、１０ｍＭ濃度に調製した阻害剤を０．１ｍｌ、酵素液を０．１ｍｌ添加し混合、３０℃に１０分間予備加温後、０．０５Ｍクロロゲン酸基質溶液を０．１ｍｌ加え混合し３０℃、３０分間加温後の波長４２０ｎｍにおける褐変度を求めた。阻害剤添加の代わりに１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加えたものをコントロールとし、活性を１００％として阻害効果を相対活性で示した。
【００７７】
この結果、ササの葉由来のフラボン類（ルテオリン６−Ｃ−アラビノシド及びルテオリン６−Ｃ−グルコシド）は、一般のＰＰＯ活性阻害剤や他のフラボノイド類と比べて卓越したＰＰＯ阻害活性を有し、少量の使用でも褐変を防止できることがわかった。
したがって、これらのササの葉由来のフラボン類は、例えば、食品類の褐変防止剤として有効に利用することができる。
【００７８】
【表４】
【００７９】
さらに、採取した水層、酢酸エチル層の液状組成物等について、ヒト白血病細胞の増殖抑制を調べた。すなわち、対数増殖期にあるＵ−９３７細胞を５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度に調製し、２４ウェルマイクロプレートに０．５ｍｌずつ播種後、インキュベーター内（３７℃、９５％Ａｉｒ−５％ＣＯ２，湿度９０％以上）で２４時間前培養後、試料を０．２５ｍｌずつ加え、インキュベーター内で２４時間培養し、トリパンブルー染色法を用い、生細胞数を測定した。陰性対象であるＰＢＳ（−）の生細胞数を１００とし、試料の増殖抑制率を算出した。
細胞増殖抑制率の測定結果を図１４に示す。また、各層のクロマチン凝縮について測定した結果を図１５に示す。
これらの図から明らかなように、本発明の抗酸化性組成物のうち、特に水層、水（メタノール可溶性）、酢酸エチル層は、ヒト腫瘍細胞（白血病）の増殖抑制効果も有し、水層、水（メタノール可溶性）、酢酸エチル層、ジエチルエーテル層はクロマチン凝縮活性を有することがわかった。
【００８０】
さらに、前記ササの葉から抽出単離したルテオリン６−Ｃ−グルコシド、ルテオリン、ルテオリン７−Ｏ−グルコシドについても、同様の方法でヒト白血病細胞の増殖抑制効果を測定した。その結果は図１６に示すとおりであり、ササの葉由来のルテオリン６−Ｃ−グルコシドは、卓越した高い増殖抑制効果を有することが確認された。
【実施例２】
【００８１】
本実施例では、クマイザサのササ葉抽出液を加水分解した場合について説明する。
すなわち、クマイザサ抽出液の酸加水分解とは、クマイザサ抽出液（メタノール溶液）に塩酸（最終濃度が０．２〜０．７Ｎ）を加え（抽出液と塩酸の比率は１：１になるようにする）、混合後、１００℃のウォーターバスで３０分間加熱し、３０分後、氷中で冷却した。
各加水分解物（無処理を含む）は、ＸＡＤカラムに吸着させ、加水分解物から酸を洗い流し、メタノールに溶媒置換後、ＬＨ−２０カラムに供し、精製後ＨＰＬＣで定量分析した。
【００８２】
まず、図１７にササ葉抽出液の非加水分解物のＬＨ−２０溶出パターンを示す。そして、ササ葉抽出液を０．２Ｎ塩酸中、１００℃、３０分間、加水分解した後のＬＨ−２０溶出パターンを図１８に、０．７Ｎ塩酸中、１００℃、３０分間加水分解した後のＬＨ−２０溶出パターンを図１９に示す。
図１７において、ＢＩＩはルテオリン６−Ｃ−グルコシド（Ｌｕｔｅｏｌｉｎ６−Ｃ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）の溶出ピーク、ＢＩＩＩはルテオリン６−Ｃ−アラビノシド（Ｌｕｔｅｏｌｉｎ６−Ｃ−ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ）のピークであり、トリシンアグリコンは図１８では２ＨＩＩＩのピークである。それぞれの処理によって得られる各フラボンの結果を、それぞれ図２０、図２１及び図２２に示す。なお、ＨＰＬＣやＸＡＤカラム、ＬＨ−２０カラムの条件はすでに述べた条件と同じである。
図１７、図１８、図１９から、加水分解によって図１７のＢＩピークが減少し、図１８の２ＨＩＩＩ及び図１９の７ＨＩＩＩが新たに検出することが確認できる。図１７のＢＩＩピーク、図１８の２ＨＩピーク及び図１９の７ＨＩピークは溶出位置から同じ成分であることがわかる。このピークは以前に同定したルテオリン６−Ｃ−グルコシドである。図１７のＢＩＩＩピーク、図１８の２ＨＩＩピーク及び図１９の７ＨＩＩピークは溶出位置から同じ成分であることがわかる。このピークは、以前に同定したルテオリン６−Ｃ−アラビノシドである。
【００８３】
また、図２０より酸加水分解処理を行うことでルテオリン６−Ｃ−グルコシドの含量が約１．７倍多くなったことがわかる。したがって、最終濃度０．２〜０．７Ｎの塩酸で１００℃、３０分間加熱処理することでルテオリン６−Ｃ−グルコシドの収量を上げることが出来る。また、図２１より同様の酸加水分解処理を行うことでルテオリン６−Ｃ−アラビノシドの含量が約３．３倍多くなったことがわかる。したがって、最終濃度０．２〜０．７Ｎの塩酸で１００℃、３０分間加熱処理することで、その収量を大幅に上げることが出来る。さらに、図２２に示すように、酸加水分解処理を行うことで、トリシンアグリコンを含んでいないサンプルでも、最終濃度０．２〜０．７Ｎの塩酸で１００℃、３０分間加熱処理することでトリシンを得ることが出来る。
【実施例３】
【００８４】
本実施例では、ササ葉抽出液をＬＨ−２０カラムで分画し、配糖体を含むフラクションを加水分解し、各加水分解物（無処理を含む）はＸＡＤカラムに吸着させ加水分解物から酸を洗い流しメタノールに溶媒置換し、ＨＰＬＣ分析した。すなわち、クマイザサ抽出液のＬＨ−２０カラム分画液（メタノール溶液）に塩酸（最終濃度が０．２〜０．７Ｎ）を加える（分画液と塩酸の比率は１：１になるようにする）。混合後、１００℃のウォーターバスで３０分間加熱し、３０分後、氷中で冷却した。
【００８５】
図２３、図２４及び図２５に、図１７の無処理ササ葉抽出液のＬＨ−２０カラム分画分で、配糖体が含まれていると考えられるフラクション（ＢＩ）を加水分解して得られる各フラボン量の定量結果を示す。これらの図２３、図２４及び図２５から明らかなように、ササ葉抽出液をセファデックスＬＨ−２０カラムで分画した後でも、酸加水分解処理を行うことにより、ルテオリン６−Ｃグルコシド、ルテオリン６−Ｃアラビノシド、トリシンを高収率で得ることが出来ることが確認された。
【００８６】
以上より、ルテオリン６−Ｃ−グルコシド、ルテオリン６−Ｃ−アラビノシド、トリシンの３種のフラボノイド成分の収量を上げる方法として、（１）ザサ葉抽出液の酸加水分解による方法、及び（２）分画後ピークの酸加水分解による方法、の２つの方法があることが確認された。
【実施例４】
【００８７】
トリシンアグリコンを含むササ葉検体（採取地：北海道興部町）を試料として、実施例１と同様にジエチルエーテルによる液・液分配して得られた水層を採取し、セファデックスＬＨ−２０カラムによる分画を行った。そのチャートを図２６に示す。この図２６より、波長３５０ｎｍでは液中にルテオリン６−Ｃ−グルコシド、ルテオリン６−Ｃ−アラビノシド、トリシンが多く含有することが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】 本発明の方法の工程概略図
【図２】 各層のフェノール物質含有量を示すグラフ
【図３】 各層の抗酸化活性の測定結果を示すグラフ
【図４】 酢酸エチル層の分画を示すチャート
【図５】 水層の分画を示すチャート
【図６】 酢酸エチル層の各ピークの抗酸化活性の測定結果を示すグラフ
【図７】 水層の各ピークの抗酸化活性の測定結果を示すグラフ
【図８】 フェノール含量と抗酸化活性との相関を示すグラフ
【図９】 Ｏ２消去率とＤＰＰＨラジカル消去率の相関を示すグラフ
【図１０】 ルテオリン６−Ｃ−グルコシドとルテオリン７−Ｏ−グルコシドの耐熱性測定結果を示すグラフ
【図１１】 ルテオリン６−Ｃグルコシドとルテオリン７−Ｏ−グルコシドの耐光性測定結果を示すグラフ
【図１２】 ルテオリン６−Ｃ−グルコシドとルテオリン７−Ｏ−グルコシドの耐熱試験における時間経過によるＤＰＰＨラジカル消去活性の変化を示すグラフ
【図１３】 ルテオリン６−Ｃ−グルコシドとルテオリン７−Ｏ−グルコシドの耐光試験における時間経過によるＤＰＰＨラジカル消去活性の変化を示すグラフ
【図１４】 各層のヒト白血病細胞の増殖抑制を測定した結果を示すグラフ
【図１５】 各層のクロマチン凝縮を測定した結果を示すグラフ
【図１６】 ルテオリン６−Ｃ−グルコシド、ルテオリン及びルテオリン７−Ｏ−グルコシドについてヒト白血病細胞の増殖抑制を測定した結果を示すグラフ
【図１７】 クマイザサ抽出液のセファデックスＬＨ−２０カラムによる分画を示すチャート（ＬＨ−２０カラム条件＝カラム径：２Ｉ．Ｄ．×８０ｃｍ、移動相：６０％メタノール流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、分画サイズ：８ｍｌ、ＢＩ：Ｆｒａｃ．Ｎｏ．６６〜９４、ＢＩＩ：Ｆｒａｃ．Ｎｏ．９５〜１１５、ＢＩＩＩ：Ｆｒａｃ．Ｎｏ．１１６〜１４３に分画）
【図１８】 クマイザサ抽出液を加水分解（最終濃度０．２Ｎ塩酸、１００℃、３０分間加熱）処理した液のセファデックスＬＨ−２０カラムによる分画を示すチャート（ＬＨ−２０カラム条件＝カラム径：２Ｉ．Ｄ．×８０ｃｍ、移動相：６０％メタノール、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、分画サイズ：８ｍｌ、２ＨＩ：Ｆｒａｃ．Ｎｏ．９１〜１１２．２ＨＩＩ：Ｆｒａｃ．Ｎｏ．１１３〜１３２、２ＨＩＩＩ：Ｆｒａｃ．Ｎｏ．１９９〜２２０に分画）
【図１９】 クマイザサ抽出液を加水分解（最終濃度０．７Ｎ塩酸、１００℃、３０分間加熱）処理した液のセファデックスＬＨ−２０カラムによる分画を示すチャート（ＬＨ−２０カラム条件＝カラム径：２Ｉ．Ｄ．×８０ｃｍ、移動相：６０％メタノール、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、分画サイズ：８ｍｌ、７ＨＩ：Ｆｒａｃ．Ｎｏ．８８〜１０８、７ＨＩＩ：Ｆｒａｃ．Ｎｏ．１０９〜１３２、２ＨＩＩＩ：Ｆｒａｃ．Ｎｏ．１８９〜２１２に分画）
【図２０】 ルテオリン６−Ｃ−グルコシド含量を示すグラフであって、図１７のＢＩＩピーク、図１８の２ＨＩピーク及び図１９の７ＨＩピークの各ピークに含まれるルテオリン６−Ｃ−グルコシドを定量したときの結果を示すデータ（ＢＩＩピークを未処理、２ＨＩピークを０．２Ｎ ＨＣｌ処理、７ＨＩピークを０．７ＮＨＣｌ処理としてそれぞれＸ軸表記）
【図２１】 ルテオリン６−Ｃ−アラビノシドの含量を示すグラフであって、図１７のＢＩＩＩピーク、図１８の２ＨＩＩピーク及び図１９の７ＨＩＩピークの各ピークに含まれるルテオリン６−Ｃ−アラビノシドを定量したときの結果を示すデータ（ＢＩＩＩピークを未処理、２ＨＩＩピークを０．２Ｎ ＨＣｌ処理、７ＨＩＩピークを０．７ＮＨＣｌ処理としてそれぞれＸ軸表記）
【図２２】 トリシン（アグリコン）の含量を示すグラフであって、図１８の２ＨＩＩＩピーク及び図１９の７ＨＩＩＩピークを使用したときのデータ（クマイザサ抽出液のセファデックスＬＨ−２０カラムの溶出結果からトリシンのピークが検出されなかったため、未処理は０として算出し，２ＨＩＩＩピークを０．２ＮＨＣｌ処理、７ＨＩＩＩピークを０．７ＮＨＣｌ処理とそれぞれＸ軸表記）
【図２３】 ＢＩピークの酸加水分解によるルテオリン６−Ｃ−グルコシド含量の変化を示すグラフであって、図１７のＢＩピークに加水分解［最終濃度０．２Ｎ塩酸、１００℃、３０分間加熱処理］を施したときのデータ（酸加水分解処理前のものを水解前、酸加水分解処理したものを水解後とＸ軸に表記）
【図２４】 ＢＩピークの酸加水分解（水解）によるルテオリン６−Ｃ−アラビノシド含量の変化を示すグラフであって、図１７のＢＩピークを最終濃度０．２Ｎ塩酸、１００℃、３０分間加熱処理を行った場合のデータ（酸加水分解処理前のものを水解前、酸加水分解処理したものを水解後とＸ軸に表記）
【図２５】 ＢＩピークの酸加水分解（水解）によるトリシン（アグリコン）含量の変化を示すグラフであって、図１７のＢＩピークを最終濃度０．２Ｎ塩酸、１００℃、３０分間加熱処理を行ったときのデータ（酸加水分解前のものを水解前、酸加水分解処理したものを水解後とそれぞれＸ軸に表記）
【図２６】 ジエチルエーテルによる液・液分配で得られる水層のセファデックスＬＨ−２０カラムによる分画を示すチャート（試料葉採取地：北海道興部町）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ササ及び／又はタケの葉の低級脂肪族アルコール、アセトン、アセトニトリル、熱水又は希酸溶液による抽出液から、当該溶液を蒸発するとともに水に置換又は加水し、濾過後又は濾過をせず、石油エーテル、ジクロロメタン、ベンゼン及び／又はジエチルエーテルで液・液分配を行わせて水層の液を採取し、該水層の液に酢酸エチルを添加して液・液分配を行い、酢酸エチル層、水層及び／又はジエチルエーテル層の液を採取し、ササ及び／又はタケの葉由来のフラボノイド成分を含む組成物を得ることを特徴とする抗酸化性組成物の製造方法。
【請求項２】
ササ葉及び／又はタケの葉の低級脂肪族アルコール抽出液から、該アルコールを蒸発するとともに水に置換し、石油エーテル及び／又はジエチルエーテルで液・液分配して水層の液を採取し、該水層の液に酢酸エチルを配合して液・液分配を行い、酢酸エチル層の液を採取し、該液及び各水層、ジエチルエーテル層からササ葉及び／又はタケの葉由来のフラボノイド、特にルテオリン６−Ｃ−グルコシド、ルテオリン６−Ｃ−アラビノシド等のルテオリン配糖体及び／又はトリシンを含む組成物を得ることを特徴とする請求項１に記載の抗酸化性組成物の製造方法。
【請求項３】
ササ葉及び／又はタケの葉の低級脂肪族アルコール抽出液から、該アルコールを蒸発するとともに水に置換し、石油エーテル及び／又はジエチルエーテルで液・液分配を行わせて水層の液を採取し、該水層の液に酢酸エチルを添加して液・液分配を行い、ジエチルエーテル層と酢酸エチルの２層からトリシンを含む組成物を得ることを特徴とする請求項１に記載の抗酸化性組成物の製造方法。
【請求項４】
前記低級脂肪族アルコール抽出液を濃縮し、水に置換又は加水し濾過後クロロフィルを濾去、水層にジエチルエーテルを添加し液・液分配を行い、得られる水層にさらに酢酸エチルを加え液・液分配を行い、これらの操作を複数回繰り返し、ジエチルエーテル層、酢酸エチル層からトリシンを含む液を、水層及び酢酸エチル層からルテオリン６−Ｃ−グルコシド、ルテオリン６−Ｃ−アラビノシド等のルテオリン配糖体を含む組成物をそれぞれ採取することを特徴とする請求項２記載の抗酸化性組成物の製造方法。
【請求項５】
前記低級脂肪族アルコール抽出液を濃縮し、水に置換又は加水し濾過後クロロフィルを濾去、水層にジエチルエーテルを添加し液・液分配を行い、得られる水層からルテオリン６−Ｃ−グルコシド、ルテオリン６−Ｃ−アラビノシド等のルテオリン配糖体を含む液又はトリシンを含む液を採取することを特徴とする抗酸化性組成物の製造方法。
【請求項６】
ササ葉又はタケの葉の抽出液を直接又は分画後に加水分解することにより、ルテオリン６−Ｃ−グルコシド、ルテオリン６−Ｃ−アラビノシド、トリシンの含有率を高めることを特徴とする請求項１〜請求項５のいずれかに記載の抗酸化性組成物の製造方法。
【請求項１】
ササ及び／又はタケの葉の低級脂肪族アルコール、アセトン、アセトニトリル、熱水又は希酸溶液による抽出液から、当該溶液を蒸発するとともに水に置換又は加水し、濾過後又は濾過をせず、石油エーテル、ジクロロメタン、ベンゼン及び／又はジエチルエーテルで液・液分配を行わせて水層の液を採取し、該水層の液に酢酸エチルを添加して液・液分配を行い、酢酸エチル層、水層及び／又はジエチルエーテル層の液を採取し、ササ及び／又はタケの葉由来のフラボノイド成分を含む組成物を得ることを特徴とする抗酸化性組成物の製造方法。
【請求項２】
ササ葉及び／又はタケの葉の低級脂肪族アルコール抽出液から、該アルコールを蒸発するとともに水に置換し、石油エーテル及び／又はジエチルエーテルで液・液分配して水層の液を採取し、該水層の液に酢酸エチルを配合して液・液分配を行い、酢酸エチル層の液を採取し、該液及び各水層、ジエチルエーテル層からササ葉及び／又はタケの葉由来のフラボノイド、特にルテオリン６−Ｃ−グルコシド、ルテオリン６−Ｃ−アラビノシド等のルテオリン配糖体及び／又はトリシンを含む組成物を得ることを特徴とする請求項１に記載の抗酸化性組成物の製造方法。
【請求項３】
ササ葉及び／又はタケの葉の低級脂肪族アルコール抽出液から、該アルコールを蒸発するとともに水に置換し、石油エーテル及び／又はジエチルエーテルで液・液分配を行わせて水層の液を採取し、該水層の液に酢酸エチルを添加して液・液分配を行い、ジエチルエーテル層と酢酸エチルの２層からトリシンを含む組成物を得ることを特徴とする請求項１に記載の抗酸化性組成物の製造方法。
【請求項４】
前記低級脂肪族アルコール抽出液を濃縮し、水に置換又は加水し濾過後クロロフィルを濾去、水層にジエチルエーテルを添加し液・液分配を行い、得られる水層にさらに酢酸エチルを加え液・液分配を行い、これらの操作を複数回繰り返し、ジエチルエーテル層、酢酸エチル層からトリシンを含む液を、水層及び酢酸エチル層からルテオリン６−Ｃ−グルコシド、ルテオリン６−Ｃ−アラビノシド等のルテオリン配糖体を含む組成物をそれぞれ採取することを特徴とする請求項２記載の抗酸化性組成物の製造方法。
【請求項５】
前記低級脂肪族アルコール抽出液を濃縮し、水に置換又は加水し濾過後クロロフィルを濾去、水層にジエチルエーテルを添加し液・液分配を行い、得られる水層からルテオリン６−Ｃ−グルコシド、ルテオリン６−Ｃ−アラビノシド等のルテオリン配糖体を含む液又はトリシンを含む液を採取することを特徴とする抗酸化性組成物の製造方法。
【請求項６】
ササ葉又はタケの葉の抽出液を直接又は分画後に加水分解することにより、ルテオリン６−Ｃ−グルコシド、ルテオリン６−Ｃ−アラビノシド、トリシンの含有率を高めることを特徴とする請求項１〜請求項５のいずれかに記載の抗酸化性組成物の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
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【図１０】
【図１１】
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【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【公開番号】特開２００６−２６５２４７（Ｐ２００６−２６５２４７Ａ）
【公開日】平成１８年１０月５日（２００６．１０．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−７５５７１（Ｐ２００６−７５５７１）
【出願日】平成１８年２月２１日（２００６．２．２１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００４年９月１日 日本食品科学工学会第５１回大会事務局発行の「日本食品科学工学会 第５１回大会講演集」に発表
【出願人】（５９８０９６９９１）学校法人東京農業大学 (85)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１０月５日（２００６．１０．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年２月２１日（２００６．２．２１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００４年９月１日 日本食品科学工学会第５１回大会事務局発行の「日本食品科学工学会 第５１回大会講演集」に発表
【出願人】（５９８０９６９９１）学校法人東京農業大学 (85)
【Ｆターム（参考）】
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