新規抗腫瘍物質アルキルクマリン類とその用途
【課題】がん細胞を選択的に攻撃する新規化合物及びその製造方法、並びに該化合物を有効成分として含有する抗腫瘍剤を提供する。
【解決手段】下記式：
等で表わされるKayea assamicaから抽出することを特徴とする化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する抗腫瘍剤。
【解決手段】下記式：
等で表わされるKayea assamicaから抽出することを特徴とする化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する抗腫瘍剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規化合物及び該化合物を有効成分とする医薬および抗腫瘍剤に関する。さらに、本発明は、該化合物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の抗腫瘍剤（抗癌剤）の多くは、ＤＮＡに直接作用するか、分裂時に作用する化合物が多く、生体の中でも骨髄細胞や毛根細胞など、増殖の盛んな正常細胞に対する副作用が問題であった。しかしながら最近では、細胞増殖のメカニズムが分子レベルで解明されてきたので、癌遺伝子の発現や癌遺伝子産物の機能を阻害する選択的な抗腫瘍剤の開発が可能になりつつある。従って、抗腫瘍剤の分野では、新しい作用機序を有し、特異性及び有効性に優れた抗腫瘍剤の開発が望まれている。
【０００３】
このような状況の中、本発明者らは、新規な作用メカニズムによりがん細胞を選択的に攻撃する化合物をスクリーニングする方法を開発した（特許文献１）。より具体的には、血清、グルコース、アミノ酸などの栄養成分の一以上を除去した動物細胞用培地（例えば、DMEM培地などの栄養飢餓培地）に候補物質を添加し、この培地でがん細胞を２４時間程度培養し、細胞の生存数を測定する。候補物質が抗腫瘍活性を有する場合には、がん細胞の生存数を有意に減少させ得る。したがって、がん細胞の生存数を指標にして、抗腫瘍活性を有する化合物をスクリーニングすることが可能である。
【０００４】
当該スクリーニング方法により得られた抗腫瘍活性を有する化合物は、がん細胞の有する栄養飢餓耐性を阻害することによってがん細胞を攻撃するために、従来の抗腫瘍剤に用いられている化合物と比べて、副作用が少ないと考えられる。実際に、本願発明者らは、当該スクリーニング方法を用いてがん細胞を選択的に攻撃する化合物をシシウド（Angelica pubescens）よりスクリーニングしている（特許文献２）。
【０００５】
近年、いわゆる伝統薬として用いられる草木より、その有効成分を抽出、精製することが注目されている。例えば、Kayea assamicaは、果実、樹皮、花粉などが魚毒として、さらに疼痛、潰瘍、発熱、マラリア病などの治療に使用し得ることが知られている植物である。従来的に、Kayea assamicaの果実や樹皮より様々な化合物が単離されており、その中にはヒトがん細胞に対して細胞毒性を有する化合物も見出されている（非特許文献１、非特許文献２）。また、有用な薬草として知られているイヌトウキと同属の植物であるヒュウガトウキ（Angelica furcijuga Kitagawa）からは、新規クマリン系化合物である新規テレビンタシン化合物が単離され、この化合物が抗腫瘍効果を有することが示されている（特許文献３）。
【０００６】
【特許文献１】特開２００２−０６５２９８号公報
【特許文献２】特開２００７−０３１４１２号公報
【特許文献３】特開平１１−３１０５８４号公報
【非特許文献１】M. Bordoloiら、Phytochemistry, Vol. 44, No.5, pp.939-942, 1997
【非特許文献２】K.-H. Leeら、Phytochemistry, Vol. 64, pp.535-541, 2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、がん細胞を選択的に攻撃する、特にがん細胞の栄養飢餓耐性を阻害してがん細胞を選択的に攻撃する、新規化合物及びその製造方法、並びに該化合物を有効成分として含有する抗腫瘍剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、Kayea assamicaから採取される新規な化合物が、栄養飢餓状態下にあるがん細胞に対して、優れた抗癌作用を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、本願発明は以下のとおりである。
［１］ 下記式：
【化１】
（式中、Ｒ１はＣ４−Ｃ５アシル基またはゲラニル基であり、Ｒ２はゲラニル基、Ｃ４アシル基またはイソプレニル基であり、ただしＲ１がＣ４−Ｃ５アシル基である場合Ｒ２はＣ４アシル基ではなく、Ｒ１がゲラニル基である場合Ｒ２はＣ４アシル基である）
で表される化合物、又は下記式：
【００１０】
【化２】
【００１１】
もしくは
【化３】
で表される化合物、あるいはその薬学的に許容される塩。
【００１２】
［２］ 下記式：
【化４】
で表される、［１］の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【００１３】
［３］ ［１］および［２］の化合物ならびに下記の構造式で表される化合物からなる群より選択される化合物を有効成分として含有する医薬：
【００１４】
【化５】
【００１５】
［４］ ［１］および［２］の化合物ならびに下記の構造式で表される化合物からなる群より選択される化合物を有効成分として含有する抗腫瘍剤：
【００１６】
【化６】
【００１７】
［５］ Kayea assamicaから抽出することを特徴とする、［１］または［２］の化合物又はその薬学的に許容される塩の製造方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の化合物はがん細胞に対して選択的に細胞毒性を示す。本発明の化合物は、がん細胞の栄養飢餓耐性を阻害することによって、がん細胞に対して選択的に細胞毒性を付与するために、従来的に用いられているようなＤＮＡに直接作用するか、分裂時に作用する抗腫瘍化合物と比較して副作用が少なくあり得る。また、本発明の化合物は、Kayea assamicaから抽出することにより容易に製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の化合物は以下の構造を有する：
【化７】
（式中、Ｒ１はＣ４−Ｃ５アシル基またはゲラニル基であり、Ｒ２はゲラニル基、Ｃ４アシル基またはイソプレニル基であり、ただしＲ１がＣ４−Ｃ５アシル基である場合Ｒ２はＣ４アシル基ではなく、Ｒ１がゲラニル基である場合Ｒ２はＣ４アシル基である）。
【００２０】
より詳細には、本発明の化合物は以下の構造を有する：
【化８】
【００２１】
また、本発明の化合物は以下の構造を有する：
【化９】
【００２２】
本発明の化合物としては、上記化合物のみならず、その薬学的に許容される塩も包含される。
【００２３】
薬学的に許容される塩としては、例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、トリフルオロ酢酸、酒石酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、コハク酸、シュウ酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の有機酸、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸等の無機酸等との塩が挙げられる。
【００２４】
１または複数の本発明の化合物を有効成分として医薬に用いることができる。当該医薬は、予防又は治療目的に応じて各種の投与形態を採用することができ、該形態としては、例えば、経口剤、注射剤、坐剤、軟膏剤、貼付剤等のいずれでも良く、これらの投与形態は、各々当業者に公知慣用の製剤方法により製造できる。
【００２５】
経口用固形製剤を調製する場合は、本発明の化合物に賦形剤、必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味・矯臭剤等を加えた後、常法により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等を製造することができる。そのような添加剤としては、当該分野で一般的に使用されるものでよく、例えば、賦形剤としては、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸等を、結合剤としては、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドン等を、崩壊剤としては乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖等を、滑沢剤としては精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコール等を、着色剤としては、酸化チタン、酸化鉄等を、矯味・矯臭剤としては白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等を例示できる。
【００２６】
経口用液体製剤を調製する場合は、本発明の化合物に矯味剤、緩衡剤、安定化剤、矯臭剤等を加えて常法により内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等を製造することができる。この場合矯味・矯臭剤としては上記に挙げられたもので良く、緩衡剤としてはクエン酸ナトリウム等が、安定化剤としてはトラガント、アラビアゴム、ゼラチン等が挙げられる。
【００２７】
注射剤を調製する場合は、本発明の化合物にｐＨ調節剤、緩衡剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下、筋肉内及び静脈内用注射剤を製造することができる。この場合のｐＨ調節剤及び緩衡剤としてはクエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等が挙げられる。安定化剤としてはピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸等が挙げられる。局所麻酔剤としては塩酸プロカイン、塩酸リドカイン等が挙げられる。等張化剤としては、塩化ナトリウム、ブドウ糖等が例示できる。
【００２８】
坐剤を調製する場合は、本発明の化合物に当業界において公知の製剤用担体、例えば、ポリエチレングリコール、ラノリン、カカオ脂、脂肪酸トリグリセライド等を、さらに必要に応じてツイーン（登録商標）のような界面活性剤等を加えた後、常法により製造することができる。
【００２９】
軟膏剤を調製する場合は、本発明の化合物に通常使用される基剤、安定剤、湿潤剤、保存剤等が必要に応じて配合され、常法により混合、製剤化される。基剤としては、流動パラフィン、白色ワセリン、サラシミツロウ、オクチルドデシルアルコール、パラフィン等が挙げられる。保存剤としては、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル等が挙げられる。
【００３０】
貼付剤を製造する場合は、通常の支持体に前記軟膏、クリーム、ゲル、ペースト等を常法により塗布すれば良い。支持体としては、綿、スフ、化学繊維からなる織布、不織布や軟質塩化ビニル、ポリエチレン、ポリウレタン等のフィルムあるいは発泡体シートが適当である。
【００３１】
上記の各投与単位形態中に配合されるべき本発明の化合物の量は、これを適用すべき患者の症状によりあるいはその剤型等により一定ではないが、一般に投与単位形態あたり経口剤では約０．０１〜１０００ｍｇ、注射剤では約０．０１〜５００ｍｇ、坐剤では約０．０１〜１０００ｍｇとするのが望ましい。また、上記投与形態を有する薬剤の１日あたりの投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり一概には決定できないが、通常成人１日あたり約０．０１〜５０００ｍｇ、好ましくは約０．０１〜１０００ｍｇとすれば良く、これを１日１回又は２〜４回程度に分けて投与するのが好ましい。
【００３２】
本発明の化合物は、がん細胞が栄養状態や、酸素の供給状態が悪い条件下で生き延びるという性質を利用して、特開２００２−０６５２９８号公報に記載のスクリーニング方法により見出されたものである。このようにして得られた本発明の化合物は、がん細胞の栄養飢餓耐性を阻害することによってがん細胞を選択的に攻撃することが可能であり、従来の抗腫瘍剤とは異なる作用メカニズムによりがん細胞を選択的に攻撃する。
【００３３】
本発明の化合物を含有する抗腫瘍剤を投与することにより治療できる癌・悪性腫瘍としては、特に制限はなく、例えば頭頸部癌、食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、胆のう・胆管癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、睾丸腫瘍、骨・軟部肉腫、悪性リンパ腫、白血病、子宮頸癌、皮膚癌、脳腫瘍等が挙げられる。特に膵臓癌が好ましい。
【００３４】
上記医薬および抗腫瘍剤には有効成分として、本発明の化合物に代えて、または加えて下記の構造式で表される化合物からなる群より選択される化合物を含めることができる（図中の番号は化合物の番号を示す）：
【化１０】
【００３５】
これらの化合物には、上に定義されるような、その薬学的に許容される塩も包含される。
【００３６】
次に本発明の化合物および上記有効成分として利用し得る化合物の製造方法について説明する。
【００３７】
これらの化合物は化学合成により製造することもできるが、例えば、以下のようにしてKayea assamicaから抽出することにより得ることもできる。
【００３８】
Kayea assamicaの花をアルコール（例えば、メタノール、エタノール、プロパノール又はそれらと水との混合物）に浸し、これを超音波処理した後、１時間〜数日間放置する。次いで、抽出液にクロロホルムを加えて超音波処理する。クロロホルムに不溶性の物質を除去し、クロロホルム溶液を濃縮して、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィにかける。溶離液としては、例えば、EtOAc-ヘキサン、MeCN-H2O、C6H6-MeCO等の系が挙げられる。本発明の化合物を含む画分を集め、溶媒を留去して本発明の化合物を得る。各成分の分離が不十分な場合は、異なる溶離液を組み合わせてクロマトグラフィを複数回行ってもよいし、或いは、他の分離精製手段、例えば濃縮、溶媒抽出、濾過、再結晶、各種クロマトグラフィ等を用いることにより精製するとよい。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４０】
本実施例で使用した主な装置、分析機器等は以下のとおりである。
旋光度：
日本分光DIP-140デジタル旋光計
核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル：
日本電子JNM-LA400分光計（内部標準としてテトラメチルシラン(TMS）を使用し、化学シフトをδ値として表示)
高分解能電子イオン化質量分析（High resolution electron ionization mass spectrometry, HREIMS）：
日本電子JMS-700T分析計
カラムクロマトグラフィ：
シリカゲル60N（球状、中性、40-50μｍ、関東化学株式会社）
分取および分析薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）：
シリカゲル60F254（厚さ0.25 mm若しくは0.5 mm、Merck）、又はRP-18F254（厚さ0.25 mm，Merck）のプレコートプレート
高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）：
SUPELCO Discovery C-18カラム(25 cm ×10 mm, 5μｍ、SUPELCO)
UV-8000 検出器（TOYO SODA）
【００４１】
実施例１：Kayea assamicaからの化合物１および化合物２の抽出
Kayea assamica King & Prainの花 (1 kg) を70% EtOHで室温下超音波抽出（2 L, 1 h, 2回）し、そして溶媒を減圧下にて蒸発しEtOHエキス（40 g）を得た。さらに、EtOHエキスをクロロホルムを用いて超音波処理し（100 mL, 90分×３回）、クロロホルム可溶部（14 g）と不溶部(25 g)に分画した。このクロロホルム可溶部は、栄養飢餓培地中のPANC-1細胞に対して細胞毒性活性が認められた（データ示さず）。クロロホルム可溶部（14 g）をシリカゲルカラムクロマトグラフィに付し、溶媒にEtOAcとヘキサンを用いて分離を行い、以下のフラクション1〜7を得た。
フラクション1: EtOAc−ヘキサン (20:80) 溶出部, 4.88 g
フラクション2: EtOAc−ヘキサン (30:70) 溶出部, 2.87 g
フラクション3: EtOAc−ヘキサン (40:60) 溶出部, 2.34 g
フラクション4: EtOAc−ヘキサン (50:50) 溶出部, 0.49 g
フラクション5: EtOAc−ヘキサン (60:40) 溶出部, 0.63 g
フラクション6: EtOAc−ヘキサン (80:20) 溶出部, 0.26 g
フラクション7: EtOAc 溶出部, 2.16 g
また、フラクション1(4.88 g) にMeOHを加えると化合物10が結晶として析出した。
【００４２】
次に、フラクション2 (2.87 g) をジクロロメタン、ヘキサン、MeOHを溶媒として用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィを行い、以下のサブフラクション2-1〜2-3を得た。
サブフラクション2-1: ジクロロメタン−ヘキサン (2:1) 溶出部, 671 mg
サブフラクション2-2: ジクロロメタン溶出部, 187.7 mg
サブフラクション2-3: ジクロロメタン−MeOH (40:1)、溶出部 1.17 g
【００４３】
次に、サブフラクション2-1をヘキサン−アセトンを溶媒として用いてシリカゲルカラムクロマトを行い、以下のサブフラクション2-1-1〜2-1-4を得た。
サブフラクション2-1-1: ヘキサン−アセトン (25:1) 溶出部, 125 mg
サブフラクション2-1-2: ヘキサン−アセトン (15:1) 溶出部, 120 mg
サブフラクション2-1-3: ヘキサン−アセトン (7:1) 溶出部, 54 mg
サブフラクション2-1-4: ヘキサン−アセトン (3:1) 溶出部, 225 mg
【００４４】
さらに、サブフラクション2-1-1は、ベンゼン−アセトン (40:1) を溶媒として用いて順相のpreparative TLCを行い、化合物11 (46 mg)と化合物12 (22 mg)を得た。次に、サブフラクション2-1-2と2-1-3は、それぞれベンゼン−アセトン(20:1) を溶媒として用いて、順相のpreparative TLCを行い、化合物13 (60 mg)と化合物14 (40 mg) を得た(図１Ａ参照)。
【００４５】
次に、フラクション3（2.34 g）を、MeCN-H2Oを溶媒として用いた逆相カラムで再クロマトグラフィを行い、以下のサブフラクション3-1〜3-3を得た。
サブフラクション3-1: MeCN-H2O (7:3) 溶出部, 524 mg
サブフラクション3-2: MeCN-H2O (4:1) 溶出部, 270 mg
サブフラクション3-3: MeCN, 687 mg
【００４６】
次に、サブフラクション3-1をヘキサン−アセトンを溶媒として用いてシリカゲルカラムクロマトを行い、以下のサブフラクション3-1-1〜3-1-2を得た。
サブフラクション3-1-1: ヘキサン−アセトン (20:1) 溶出部, 306 mg
サブフラクション3-1-2: ヘキサン−アセトン(20:1) 溶出部, 180 mg
【００４７】
さらに、サブフラクション3-1-1は、ベンゼン−アセトン（4:1)の溶媒系の順相 preparative TLCとアセトン−H2O (3:1)の溶媒で逆相preparative TLCを組み合わせて分離、精製を行い、化合物 5 (2 mg), 化合物 15と16の1:1 の混合物（2 mg), 化合物17 (2 mg)および化合物18 (2 mg)を得た。また、サブフラクション3 -1-2は、溶媒としてMeCN-H2O(7:3)を用いて、逆相preparative TLCを行い、サブフラクション3-1-2-1 (78 mg) と化合物１(26 mg)を得た。次に、このサブフラクション3-1-2-1 (78 mg) は、MeCN-H2O(7:3)を溶媒として、semipreparative HPLCを行い、化合物 6 (15.3 mg)と化合物 7 (3 mg) を得た。
【００４８】
さらに、サブフラクション3-2は、溶媒としてC6H6-アセトン (5:1)およびヘキサン−EtOAc (2:1)をそれぞれ用いた順相と逆相のpreparative TLCを組み合わせて繰り返し分離精製を行い、化合物 2（10.6 mg), 化合物 8 (3.7 mg), 化合物 9 (25.2 mg)を得た。また、サブフラクション3-3は、溶媒としてMeCN-H2O (7:3)を用いたsemipreparative HPLC（流速: 5 mL/min）によって分離精製し、化合物 2（90 > mg）と化合物 3 (9.6 mg) ならびに化合物 4 (2 mg)を得た(図１Ｂ参照)。
【００４９】
実施例２：化合物１〜９の同定
実施例１で得られた化合物について解析を行った。
【００５０】
【００５１】
【００５２】
【００５３】
【００５４】
【００５５】
【００５６】
【００５７】
【００５８】
また、化合物1および化合物2のＮＭＲスペクトルの結果を図２Ａ〜３Ｂに示す。
上記の物理データより化合物1〜９は、以下の化学構造を有する化合物であることが確認された(図中の番号は化合物の番号を示す)。
【００５９】
【化１１】
【００６０】
これらの化合物は、上記先行文献において開示されたアルキルクマリン類とは異なっており、また過去に報告例がなく、新規化合物であると判断される。
【００６１】
実施例３：化合物１および化合物２の細胞毒性の評価
膵臓がん細胞株PANC-1を96穴プレートに播種し、通常栄養状態のDMEM培地中で37℃，5% CO2/95% Airで24時間前培養した。細胞をPBSで洗浄した後、化合物１又は化合物２それぞれを添加した、通常栄養状態のDMEM培地または栄養飢餓培地であるNDM培地(DMEMの電解質だけを含んでいる培地)を各ウェルに加えて24時間インキュベーションした。細胞を再びPBSで洗浄し、10% WST-8を含むDMEM培地 100μLを加えて2時間反応させた。その後、マイクロプレートリーダーで450 nmの吸光度を測定し、細胞の生存状態を評価した。検討の結果、化合物1および2は、図４に示すごとく、栄養飢餓培地中の膵臓がん細胞株に対して、いずれも顕著な選択的細胞毒性を示すことが明らかになった。同様の効果は、PSN-1, CAPAN-1といった他の膵臓がん細胞株においても得られた。
【００６２】
次に、化合物１−１８の選択的細胞毒性活性の比較を行った。上記と同じ条件下で培養した膵臓がん細胞株PANC-1に化合物１−１８のいずれかを添加した栄養飢餓培地を加えて24時間インキュベーションした。細胞を再びPBSで洗浄し、10% WST-8を含むDMEM培地 100μLを加えて2時間反応させた。その後、マイクロプレートリーダーで450 nmの吸光度を測定した。培養した全てのがん細胞に対して選択的細胞毒性活性を付与することが可能な化合物の濃度を以下の表に示す。
【００６３】
【表１】
【００６４】
本発明の化合物１および２において示されるように、置換基がゲラニル基の場合には、上記化合物の一般式中アシル基の置換位置は６位であっても８位であっても、その細胞毒性活性には大きく影響しない。一方、本発明の化合物５および６、ならびに化合物１５および１６において示されるように、置換基がイソプロペニル基の場合には、上記化合物の一般式中アシル基の置換位置が６位であるか８位であるかによって、その細胞毒性活性に大きく影響する。
【００６５】
また、テレビタシン化合物（特開平１１−３１０５８４号公報）と類縁の化合物でイソプレニル基が酸素を介して環状になった化合物は、化合物１または２の選択的細胞毒性活性と比べて３２倍以上弱い活性を示した（データ示さず）。さらに、化合物１、２、１５、１６を同じ濃度（1μＭ）で上記同様細胞に与えたところ、化合物１または２を与えた細胞では６〜９時間以内に全ての細胞において細胞死が観察されたのに対して、化合物１５または１６を与えた細胞では２４時間後に初めて細胞死が観察され、時間依存性が認められた（データ示さず）。
【００６６】
実施例４：腫瘍モデル動物における化合物１および化合物２の抗腫瘍性の評価
腫瘍モデル動物は、ドナーとなるヌードマウス（BALB-cAJ nu/nu; 日本クレア）の背皮下にヒト膵臓がん細胞株CAPAN-1またはPSN-1を播種し、得られたドナーマウスの腫瘍塊をレシピエントマウスの背皮下に移植することによって作製した。化合物１および２は、DMSOに10 mg/mlの濃度で溶解したものを生理食塩水で希釈し、マウス1匹あたり50 μgを1週間に5回、腹腔内投与した。抗腫瘍性は、背皮下の腫瘍塊のサイズを経時的に計測することによって評価した。
【００６７】
投与開始後ひと月で、PSN-1およびCAPAN-1の移植マウスの固形腫瘍において、コントロール群に比べて化合物の投与群では、増殖抑制の効果があることが明らかになった（図５）。
【００６８】
以上より、本発明の新規化合物はがん細胞に対して選択的細胞毒性を示すことが明らかとなった。本発明の新規化合物は、上記先行文献にて開示されているクマリン系化合物よりも有意に高い効果を有するものであった（上記実施例３参照）。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明の化合物はがん細胞に対して選択的に細胞毒性を示し、またがん細胞の有する栄養飢餓耐性を阻害することによってがん細胞を攻撃するために、副作用の少ない抗腫瘍剤の有効な新たな活性成分として利用されることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１Ａ】図１Ａは、Kayea assamicaより本発明の化合物を抽出する工程を示す図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、Kayea assamicaより本発明の化合物を抽出する工程を示す図である。
【図２Ａ】図２Ａは、化合物１の1Ｈ ＮＭＲスペクトルの解析結果を示す図である。
【図２Ｂ】図２Ａは、化合物１の13Ｃ ＮＭＲスペクトルの解析結果を示す図である。
【図３Ａ】図３Ａは、化合物２の1Ｈ ＮＭＲスペクトルの解析結果を示す図である。
【図３Ｂ】図３Ａは、化合物２の13Ｃ ＮＭＲスペクトルの解析結果を示す図である。
【図４】図４は、膵臓がん細胞株に対する本発明の化合物の効果を示す図である。
【図５】図５は、膵臓がんモデルマウスにおける本発明の化合物の抗腫瘍性の評価結果を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規化合物及び該化合物を有効成分とする医薬および抗腫瘍剤に関する。さらに、本発明は、該化合物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の抗腫瘍剤（抗癌剤）の多くは、ＤＮＡに直接作用するか、分裂時に作用する化合物が多く、生体の中でも骨髄細胞や毛根細胞など、増殖の盛んな正常細胞に対する副作用が問題であった。しかしながら最近では、細胞増殖のメカニズムが分子レベルで解明されてきたので、癌遺伝子の発現や癌遺伝子産物の機能を阻害する選択的な抗腫瘍剤の開発が可能になりつつある。従って、抗腫瘍剤の分野では、新しい作用機序を有し、特異性及び有効性に優れた抗腫瘍剤の開発が望まれている。
【０００３】
このような状況の中、本発明者らは、新規な作用メカニズムによりがん細胞を選択的に攻撃する化合物をスクリーニングする方法を開発した（特許文献１）。より具体的には、血清、グルコース、アミノ酸などの栄養成分の一以上を除去した動物細胞用培地（例えば、DMEM培地などの栄養飢餓培地）に候補物質を添加し、この培地でがん細胞を２４時間程度培養し、細胞の生存数を測定する。候補物質が抗腫瘍活性を有する場合には、がん細胞の生存数を有意に減少させ得る。したがって、がん細胞の生存数を指標にして、抗腫瘍活性を有する化合物をスクリーニングすることが可能である。
【０００４】
当該スクリーニング方法により得られた抗腫瘍活性を有する化合物は、がん細胞の有する栄養飢餓耐性を阻害することによってがん細胞を攻撃するために、従来の抗腫瘍剤に用いられている化合物と比べて、副作用が少ないと考えられる。実際に、本願発明者らは、当該スクリーニング方法を用いてがん細胞を選択的に攻撃する化合物をシシウド（Angelica pubescens）よりスクリーニングしている（特許文献２）。
【０００５】
近年、いわゆる伝統薬として用いられる草木より、その有効成分を抽出、精製することが注目されている。例えば、Kayea assamicaは、果実、樹皮、花粉などが魚毒として、さらに疼痛、潰瘍、発熱、マラリア病などの治療に使用し得ることが知られている植物である。従来的に、Kayea assamicaの果実や樹皮より様々な化合物が単離されており、その中にはヒトがん細胞に対して細胞毒性を有する化合物も見出されている（非特許文献１、非特許文献２）。また、有用な薬草として知られているイヌトウキと同属の植物であるヒュウガトウキ（Angelica furcijuga Kitagawa）からは、新規クマリン系化合物である新規テレビンタシン化合物が単離され、この化合物が抗腫瘍効果を有することが示されている（特許文献３）。
【０００６】
【特許文献１】特開２００２−０６５２９８号公報
【特許文献２】特開２００７−０３１４１２号公報
【特許文献３】特開平１１−３１０５８４号公報
【非特許文献１】M. Bordoloiら、Phytochemistry, Vol. 44, No.5, pp.939-942, 1997
【非特許文献２】K.-H. Leeら、Phytochemistry, Vol. 64, pp.535-541, 2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、がん細胞を選択的に攻撃する、特にがん細胞の栄養飢餓耐性を阻害してがん細胞を選択的に攻撃する、新規化合物及びその製造方法、並びに該化合物を有効成分として含有する抗腫瘍剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、Kayea assamicaから採取される新規な化合物が、栄養飢餓状態下にあるがん細胞に対して、優れた抗癌作用を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、本願発明は以下のとおりである。
［１］ 下記式：
【化１】
（式中、Ｒ１はＣ４−Ｃ５アシル基またはゲラニル基であり、Ｒ２はゲラニル基、Ｃ４アシル基またはイソプレニル基であり、ただしＲ１がＣ４−Ｃ５アシル基である場合Ｒ２はＣ４アシル基ではなく、Ｒ１がゲラニル基である場合Ｒ２はＣ４アシル基である）
で表される化合物、又は下記式：
【００１０】
【化２】
【００１１】
もしくは
【化３】
で表される化合物、あるいはその薬学的に許容される塩。
【００１２】
［２］ 下記式：
【化４】
で表される、［１］の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【００１３】
［３］ ［１］および［２］の化合物ならびに下記の構造式で表される化合物からなる群より選択される化合物を有効成分として含有する医薬：
【００１４】
【化５】
【００１５】
［４］ ［１］および［２］の化合物ならびに下記の構造式で表される化合物からなる群より選択される化合物を有効成分として含有する抗腫瘍剤：
【００１６】
【化６】
【００１７】
［５］ Kayea assamicaから抽出することを特徴とする、［１］または［２］の化合物又はその薬学的に許容される塩の製造方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の化合物はがん細胞に対して選択的に細胞毒性を示す。本発明の化合物は、がん細胞の栄養飢餓耐性を阻害することによって、がん細胞に対して選択的に細胞毒性を付与するために、従来的に用いられているようなＤＮＡに直接作用するか、分裂時に作用する抗腫瘍化合物と比較して副作用が少なくあり得る。また、本発明の化合物は、Kayea assamicaから抽出することにより容易に製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の化合物は以下の構造を有する：
【化７】
（式中、Ｒ１はＣ４−Ｃ５アシル基またはゲラニル基であり、Ｒ２はゲラニル基、Ｃ４アシル基またはイソプレニル基であり、ただしＲ１がＣ４−Ｃ５アシル基である場合Ｒ２はＣ４アシル基ではなく、Ｒ１がゲラニル基である場合Ｒ２はＣ４アシル基である）。
【００２０】
より詳細には、本発明の化合物は以下の構造を有する：
【化８】
【００２１】
また、本発明の化合物は以下の構造を有する：
【化９】
【００２２】
本発明の化合物としては、上記化合物のみならず、その薬学的に許容される塩も包含される。
【００２３】
薬学的に許容される塩としては、例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、トリフルオロ酢酸、酒石酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、コハク酸、シュウ酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の有機酸、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸等の無機酸等との塩が挙げられる。
【００２４】
１または複数の本発明の化合物を有効成分として医薬に用いることができる。当該医薬は、予防又は治療目的に応じて各種の投与形態を採用することができ、該形態としては、例えば、経口剤、注射剤、坐剤、軟膏剤、貼付剤等のいずれでも良く、これらの投与形態は、各々当業者に公知慣用の製剤方法により製造できる。
【００２５】
経口用固形製剤を調製する場合は、本発明の化合物に賦形剤、必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味・矯臭剤等を加えた後、常法により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等を製造することができる。そのような添加剤としては、当該分野で一般的に使用されるものでよく、例えば、賦形剤としては、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸等を、結合剤としては、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドン等を、崩壊剤としては乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖等を、滑沢剤としては精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコール等を、着色剤としては、酸化チタン、酸化鉄等を、矯味・矯臭剤としては白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等を例示できる。
【００２６】
経口用液体製剤を調製する場合は、本発明の化合物に矯味剤、緩衡剤、安定化剤、矯臭剤等を加えて常法により内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等を製造することができる。この場合矯味・矯臭剤としては上記に挙げられたもので良く、緩衡剤としてはクエン酸ナトリウム等が、安定化剤としてはトラガント、アラビアゴム、ゼラチン等が挙げられる。
【００２７】
注射剤を調製する場合は、本発明の化合物にｐＨ調節剤、緩衡剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下、筋肉内及び静脈内用注射剤を製造することができる。この場合のｐＨ調節剤及び緩衡剤としてはクエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等が挙げられる。安定化剤としてはピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸等が挙げられる。局所麻酔剤としては塩酸プロカイン、塩酸リドカイン等が挙げられる。等張化剤としては、塩化ナトリウム、ブドウ糖等が例示できる。
【００２８】
坐剤を調製する場合は、本発明の化合物に当業界において公知の製剤用担体、例えば、ポリエチレングリコール、ラノリン、カカオ脂、脂肪酸トリグリセライド等を、さらに必要に応じてツイーン（登録商標）のような界面活性剤等を加えた後、常法により製造することができる。
【００２９】
軟膏剤を調製する場合は、本発明の化合物に通常使用される基剤、安定剤、湿潤剤、保存剤等が必要に応じて配合され、常法により混合、製剤化される。基剤としては、流動パラフィン、白色ワセリン、サラシミツロウ、オクチルドデシルアルコール、パラフィン等が挙げられる。保存剤としては、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル等が挙げられる。
【００３０】
貼付剤を製造する場合は、通常の支持体に前記軟膏、クリーム、ゲル、ペースト等を常法により塗布すれば良い。支持体としては、綿、スフ、化学繊維からなる織布、不織布や軟質塩化ビニル、ポリエチレン、ポリウレタン等のフィルムあるいは発泡体シートが適当である。
【００３１】
上記の各投与単位形態中に配合されるべき本発明の化合物の量は、これを適用すべき患者の症状によりあるいはその剤型等により一定ではないが、一般に投与単位形態あたり経口剤では約０．０１〜１０００ｍｇ、注射剤では約０．０１〜５００ｍｇ、坐剤では約０．０１〜１０００ｍｇとするのが望ましい。また、上記投与形態を有する薬剤の１日あたりの投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり一概には決定できないが、通常成人１日あたり約０．０１〜５０００ｍｇ、好ましくは約０．０１〜１０００ｍｇとすれば良く、これを１日１回又は２〜４回程度に分けて投与するのが好ましい。
【００３２】
本発明の化合物は、がん細胞が栄養状態や、酸素の供給状態が悪い条件下で生き延びるという性質を利用して、特開２００２−０６５２９８号公報に記載のスクリーニング方法により見出されたものである。このようにして得られた本発明の化合物は、がん細胞の栄養飢餓耐性を阻害することによってがん細胞を選択的に攻撃することが可能であり、従来の抗腫瘍剤とは異なる作用メカニズムによりがん細胞を選択的に攻撃する。
【００３３】
本発明の化合物を含有する抗腫瘍剤を投与することにより治療できる癌・悪性腫瘍としては、特に制限はなく、例えば頭頸部癌、食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、胆のう・胆管癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、睾丸腫瘍、骨・軟部肉腫、悪性リンパ腫、白血病、子宮頸癌、皮膚癌、脳腫瘍等が挙げられる。特に膵臓癌が好ましい。
【００３４】
上記医薬および抗腫瘍剤には有効成分として、本発明の化合物に代えて、または加えて下記の構造式で表される化合物からなる群より選択される化合物を含めることができる（図中の番号は化合物の番号を示す）：
【化１０】
【００３５】
これらの化合物には、上に定義されるような、その薬学的に許容される塩も包含される。
【００３６】
次に本発明の化合物および上記有効成分として利用し得る化合物の製造方法について説明する。
【００３７】
これらの化合物は化学合成により製造することもできるが、例えば、以下のようにしてKayea assamicaから抽出することにより得ることもできる。
【００３８】
Kayea assamicaの花をアルコール（例えば、メタノール、エタノール、プロパノール又はそれらと水との混合物）に浸し、これを超音波処理した後、１時間〜数日間放置する。次いで、抽出液にクロロホルムを加えて超音波処理する。クロロホルムに不溶性の物質を除去し、クロロホルム溶液を濃縮して、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィにかける。溶離液としては、例えば、EtOAc-ヘキサン、MeCN-H2O、C6H6-MeCO等の系が挙げられる。本発明の化合物を含む画分を集め、溶媒を留去して本発明の化合物を得る。各成分の分離が不十分な場合は、異なる溶離液を組み合わせてクロマトグラフィを複数回行ってもよいし、或いは、他の分離精製手段、例えば濃縮、溶媒抽出、濾過、再結晶、各種クロマトグラフィ等を用いることにより精製するとよい。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４０】
本実施例で使用した主な装置、分析機器等は以下のとおりである。
旋光度：
日本分光DIP-140デジタル旋光計
核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル：
日本電子JNM-LA400分光計（内部標準としてテトラメチルシラン(TMS）を使用し、化学シフトをδ値として表示)
高分解能電子イオン化質量分析（High resolution electron ionization mass spectrometry, HREIMS）：
日本電子JMS-700T分析計
カラムクロマトグラフィ：
シリカゲル60N（球状、中性、40-50μｍ、関東化学株式会社）
分取および分析薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）：
シリカゲル60F254（厚さ0.25 mm若しくは0.5 mm、Merck）、又はRP-18F254（厚さ0.25 mm，Merck）のプレコートプレート
高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）：
SUPELCO Discovery C-18カラム(25 cm ×10 mm, 5μｍ、SUPELCO)
UV-8000 検出器（TOYO SODA）
【００４１】
実施例１：Kayea assamicaからの化合物１および化合物２の抽出
Kayea assamica King & Prainの花 (1 kg) を70% EtOHで室温下超音波抽出（2 L, 1 h, 2回）し、そして溶媒を減圧下にて蒸発しEtOHエキス（40 g）を得た。さらに、EtOHエキスをクロロホルムを用いて超音波処理し（100 mL, 90分×３回）、クロロホルム可溶部（14 g）と不溶部(25 g)に分画した。このクロロホルム可溶部は、栄養飢餓培地中のPANC-1細胞に対して細胞毒性活性が認められた（データ示さず）。クロロホルム可溶部（14 g）をシリカゲルカラムクロマトグラフィに付し、溶媒にEtOAcとヘキサンを用いて分離を行い、以下のフラクション1〜7を得た。
フラクション1: EtOAc−ヘキサン (20:80) 溶出部, 4.88 g
フラクション2: EtOAc−ヘキサン (30:70) 溶出部, 2.87 g
フラクション3: EtOAc−ヘキサン (40:60) 溶出部, 2.34 g
フラクション4: EtOAc−ヘキサン (50:50) 溶出部, 0.49 g
フラクション5: EtOAc−ヘキサン (60:40) 溶出部, 0.63 g
フラクション6: EtOAc−ヘキサン (80:20) 溶出部, 0.26 g
フラクション7: EtOAc 溶出部, 2.16 g
また、フラクション1(4.88 g) にMeOHを加えると化合物10が結晶として析出した。
【００４２】
次に、フラクション2 (2.87 g) をジクロロメタン、ヘキサン、MeOHを溶媒として用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィを行い、以下のサブフラクション2-1〜2-3を得た。
サブフラクション2-1: ジクロロメタン−ヘキサン (2:1) 溶出部, 671 mg
サブフラクション2-2: ジクロロメタン溶出部, 187.7 mg
サブフラクション2-3: ジクロロメタン−MeOH (40:1)、溶出部 1.17 g
【００４３】
次に、サブフラクション2-1をヘキサン−アセトンを溶媒として用いてシリカゲルカラムクロマトを行い、以下のサブフラクション2-1-1〜2-1-4を得た。
サブフラクション2-1-1: ヘキサン−アセトン (25:1) 溶出部, 125 mg
サブフラクション2-1-2: ヘキサン−アセトン (15:1) 溶出部, 120 mg
サブフラクション2-1-3: ヘキサン−アセトン (7:1) 溶出部, 54 mg
サブフラクション2-1-4: ヘキサン−アセトン (3:1) 溶出部, 225 mg
【００４４】
さらに、サブフラクション2-1-1は、ベンゼン−アセトン (40:1) を溶媒として用いて順相のpreparative TLCを行い、化合物11 (46 mg)と化合物12 (22 mg)を得た。次に、サブフラクション2-1-2と2-1-3は、それぞれベンゼン−アセトン(20:1) を溶媒として用いて、順相のpreparative TLCを行い、化合物13 (60 mg)と化合物14 (40 mg) を得た(図１Ａ参照)。
【００４５】
次に、フラクション3（2.34 g）を、MeCN-H2Oを溶媒として用いた逆相カラムで再クロマトグラフィを行い、以下のサブフラクション3-1〜3-3を得た。
サブフラクション3-1: MeCN-H2O (7:3) 溶出部, 524 mg
サブフラクション3-2: MeCN-H2O (4:1) 溶出部, 270 mg
サブフラクション3-3: MeCN, 687 mg
【００４６】
次に、サブフラクション3-1をヘキサン−アセトンを溶媒として用いてシリカゲルカラムクロマトを行い、以下のサブフラクション3-1-1〜3-1-2を得た。
サブフラクション3-1-1: ヘキサン−アセトン (20:1) 溶出部, 306 mg
サブフラクション3-1-2: ヘキサン−アセトン(20:1) 溶出部, 180 mg
【００４７】
さらに、サブフラクション3-1-1は、ベンゼン−アセトン（4:1)の溶媒系の順相 preparative TLCとアセトン−H2O (3:1)の溶媒で逆相preparative TLCを組み合わせて分離、精製を行い、化合物 5 (2 mg), 化合物 15と16の1:1 の混合物（2 mg), 化合物17 (2 mg)および化合物18 (2 mg)を得た。また、サブフラクション3 -1-2は、溶媒としてMeCN-H2O(7:3)を用いて、逆相preparative TLCを行い、サブフラクション3-1-2-1 (78 mg) と化合物１(26 mg)を得た。次に、このサブフラクション3-1-2-1 (78 mg) は、MeCN-H2O(7:3)を溶媒として、semipreparative HPLCを行い、化合物 6 (15.3 mg)と化合物 7 (3 mg) を得た。
【００４８】
さらに、サブフラクション3-2は、溶媒としてC6H6-アセトン (5:1)およびヘキサン−EtOAc (2:1)をそれぞれ用いた順相と逆相のpreparative TLCを組み合わせて繰り返し分離精製を行い、化合物 2（10.6 mg), 化合物 8 (3.7 mg), 化合物 9 (25.2 mg)を得た。また、サブフラクション3-3は、溶媒としてMeCN-H2O (7:3)を用いたsemipreparative HPLC（流速: 5 mL/min）によって分離精製し、化合物 2（90 > mg）と化合物 3 (9.6 mg) ならびに化合物 4 (2 mg)を得た(図１Ｂ参照)。
【００４９】
実施例２：化合物１〜９の同定
実施例１で得られた化合物について解析を行った。
【００５０】
【００５１】
【００５２】
【００５３】
【００５４】
【００５５】
【００５６】
【００５７】
【００５８】
また、化合物1および化合物2のＮＭＲスペクトルの結果を図２Ａ〜３Ｂに示す。
上記の物理データより化合物1〜９は、以下の化学構造を有する化合物であることが確認された(図中の番号は化合物の番号を示す)。
【００５９】
【化１１】
【００６０】
これらの化合物は、上記先行文献において開示されたアルキルクマリン類とは異なっており、また過去に報告例がなく、新規化合物であると判断される。
【００６１】
実施例３：化合物１および化合物２の細胞毒性の評価
膵臓がん細胞株PANC-1を96穴プレートに播種し、通常栄養状態のDMEM培地中で37℃，5% CO2/95% Airで24時間前培養した。細胞をPBSで洗浄した後、化合物１又は化合物２それぞれを添加した、通常栄養状態のDMEM培地または栄養飢餓培地であるNDM培地(DMEMの電解質だけを含んでいる培地)を各ウェルに加えて24時間インキュベーションした。細胞を再びPBSで洗浄し、10% WST-8を含むDMEM培地 100μLを加えて2時間反応させた。その後、マイクロプレートリーダーで450 nmの吸光度を測定し、細胞の生存状態を評価した。検討の結果、化合物1および2は、図４に示すごとく、栄養飢餓培地中の膵臓がん細胞株に対して、いずれも顕著な選択的細胞毒性を示すことが明らかになった。同様の効果は、PSN-1, CAPAN-1といった他の膵臓がん細胞株においても得られた。
【００６２】
次に、化合物１−１８の選択的細胞毒性活性の比較を行った。上記と同じ条件下で培養した膵臓がん細胞株PANC-1に化合物１−１８のいずれかを添加した栄養飢餓培地を加えて24時間インキュベーションした。細胞を再びPBSで洗浄し、10% WST-8を含むDMEM培地 100μLを加えて2時間反応させた。その後、マイクロプレートリーダーで450 nmの吸光度を測定した。培養した全てのがん細胞に対して選択的細胞毒性活性を付与することが可能な化合物の濃度を以下の表に示す。
【００６３】
【表１】
【００６４】
本発明の化合物１および２において示されるように、置換基がゲラニル基の場合には、上記化合物の一般式中アシル基の置換位置は６位であっても８位であっても、その細胞毒性活性には大きく影響しない。一方、本発明の化合物５および６、ならびに化合物１５および１６において示されるように、置換基がイソプロペニル基の場合には、上記化合物の一般式中アシル基の置換位置が６位であるか８位であるかによって、その細胞毒性活性に大きく影響する。
【００６５】
また、テレビタシン化合物（特開平１１−３１０５８４号公報）と類縁の化合物でイソプレニル基が酸素を介して環状になった化合物は、化合物１または２の選択的細胞毒性活性と比べて３２倍以上弱い活性を示した（データ示さず）。さらに、化合物１、２、１５、１６を同じ濃度（1μＭ）で上記同様細胞に与えたところ、化合物１または２を与えた細胞では６〜９時間以内に全ての細胞において細胞死が観察されたのに対して、化合物１５または１６を与えた細胞では２４時間後に初めて細胞死が観察され、時間依存性が認められた（データ示さず）。
【００６６】
実施例４：腫瘍モデル動物における化合物１および化合物２の抗腫瘍性の評価
腫瘍モデル動物は、ドナーとなるヌードマウス（BALB-cAJ nu/nu; 日本クレア）の背皮下にヒト膵臓がん細胞株CAPAN-1またはPSN-1を播種し、得られたドナーマウスの腫瘍塊をレシピエントマウスの背皮下に移植することによって作製した。化合物１および２は、DMSOに10 mg/mlの濃度で溶解したものを生理食塩水で希釈し、マウス1匹あたり50 μgを1週間に5回、腹腔内投与した。抗腫瘍性は、背皮下の腫瘍塊のサイズを経時的に計測することによって評価した。
【００６７】
投与開始後ひと月で、PSN-1およびCAPAN-1の移植マウスの固形腫瘍において、コントロール群に比べて化合物の投与群では、増殖抑制の効果があることが明らかになった（図５）。
【００６８】
以上より、本発明の新規化合物はがん細胞に対して選択的細胞毒性を示すことが明らかとなった。本発明の新規化合物は、上記先行文献にて開示されているクマリン系化合物よりも有意に高い効果を有するものであった（上記実施例３参照）。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明の化合物はがん細胞に対して選択的に細胞毒性を示し、またがん細胞の有する栄養飢餓耐性を阻害することによってがん細胞を攻撃するために、副作用の少ない抗腫瘍剤の有効な新たな活性成分として利用されることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１Ａ】図１Ａは、Kayea assamicaより本発明の化合物を抽出する工程を示す図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、Kayea assamicaより本発明の化合物を抽出する工程を示す図である。
【図２Ａ】図２Ａは、化合物１の1Ｈ ＮＭＲスペクトルの解析結果を示す図である。
【図２Ｂ】図２Ａは、化合物１の13Ｃ ＮＭＲスペクトルの解析結果を示す図である。
【図３Ａ】図３Ａは、化合物２の1Ｈ ＮＭＲスペクトルの解析結果を示す図である。
【図３Ｂ】図３Ａは、化合物２の13Ｃ ＮＭＲスペクトルの解析結果を示す図である。
【図４】図４は、膵臓がん細胞株に対する本発明の化合物の効果を示す図である。
【図５】図５は、膵臓がんモデルマウスにおける本発明の化合物の抗腫瘍性の評価結果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式：
【化１】
（式中、Ｒ１はＣ４−Ｃ５アシル基またはゲラニル基であり、Ｒ２はゲラニル基、Ｃ４アシル基またはイソプレニル基であり、ただしＲ１がＣ４−Ｃ５アシル基である場合Ｒ２はＣ４アシル基ではなく、Ｒ１がゲラニル基である場合Ｒ２はＣ４アシル基である）
で表される化合物、又は下記式：
【化２】
もしくは
【化３】
で表される化合物、あるいはその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
下記式：
【化４】
で表される、請求項１記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項３】
請求項１および２記載の化合物ならびに下記の構造式で表される化合物からなる群より選択される化合物を有効成分として含有する医薬：
【化５】
【請求項４】
請求項１および２記載の化合物ならびに下記の構造式で表される化合物からなる群より選択される化合物を有効成分として含有する抗腫瘍剤：
【化６】
【請求項５】
Kayea assamicaから抽出することを特徴とする、請求項１または２記載の化合物又はその薬学的に許容される塩の製造方法。
【請求項１】
下記式：
【化１】
（式中、Ｒ１はＣ４−Ｃ５アシル基またはゲラニル基であり、Ｒ２はゲラニル基、Ｃ４アシル基またはイソプレニル基であり、ただしＲ１がＣ４−Ｃ５アシル基である場合Ｒ２はＣ４アシル基ではなく、Ｒ１がゲラニル基である場合Ｒ２はＣ４アシル基である）
で表される化合物、又は下記式：
【化２】
もしくは
【化３】
で表される化合物、あるいはその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
下記式：
【化４】
で表される、請求項１記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項３】
請求項１および２記載の化合物ならびに下記の構造式で表される化合物からなる群より選択される化合物を有効成分として含有する医薬：
【化５】
【請求項４】
請求項１および２記載の化合物ならびに下記の構造式で表される化合物からなる群より選択される化合物を有効成分として含有する抗腫瘍剤：
【化６】
【請求項５】
Kayea assamicaから抽出することを特徴とする、請求項１または２記載の化合物又はその薬学的に許容される塩の製造方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００９−２８６７０５（Ｐ２００９−２８６７０５Ａ）
【公開日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１３８５５５（Ｐ２００８−１３８５５５）
【出願日】平成２０年５月２７日（２００８．５．２７）
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月２７日（２００８．５．２７）
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]