治療剤
【課題】天然物由来のアポトーシス誘発作用等の生理機能を有する安全性の高い物質、その製造方法およびその用途を提供すること。
【解決手段】式（Ｉ）
（式中、ＸおよびＹは、ＨまたはＣＨ２ＯＨ、ただし、ＸがＣＨ２ＯＨのとき、ＹはＨ、ＸがＨのとき、ＹはＣＨ２ＯＨである。）で表される化合物、及びその塩から選択される化合物を有効成分として含有するアポトーシス誘発を要する疾患等の治療剤または予防剤、飲食品、抗酸化剤、鮮度保持剤、化粧料、及び３，６−アンヒドロガラクトース類からの製造方法。
【解決手段】式（Ｉ）
（式中、ＸおよびＹは、ＨまたはＣＨ２ＯＨ、ただし、ＸがＣＨ２ＯＨのとき、ＹはＨ、ＸがＨのとき、ＹはＣＨ２ＯＨである。）で表される化合物、及びその塩から選択される化合物を有効成分として含有するアポトーシス誘発を要する疾患等の治療剤または予防剤、飲食品、抗酸化剤、鮮度保持剤、化粧料、及び３，６−アンヒドロガラクトース類からの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、天然物由来の生理活性物質の利用に関し、さらに詳しくは該生理活性物質、その製造方法、該生理活性物質を有効成分とする医薬、食品または飲料、抗酸化剤、鮮度保持剤および化粧料に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、細胞組織の死に関し、アポトーシス（apoptosis：アポプトーシスともいう。自爆死あるいは細胞自滅）という様式が注目されている。
【０００３】
このアポトーシスは、病理的細胞死である壊死と異なり、細胞自身の遺伝子に最初から組込まれている死である。すなわち何らかの外部的または内部的要因が引き金となってアポトーシスをプログラムする遺伝子が活性化されることにより、プログラム死タンパク質が生合成され、またある場合には不活性型として細胞内に存在するプログラム死タンパク質が活性化される。こうして生成した活性型プログラム死タンパク質により細胞自体が分解され、死に至ると考えられている。
【０００４】
このようなアポトーシスを所望の組織、細胞で発現せしめることができれば、不要もしくは有害な細胞を自然の形で生体から排除することが可能となり、極めて意義深いものである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、天然物由来のアポトーシス誘発作用等の生理機能を有する安全性の高い物質、その製造方法およびその用途を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明を概説すれば、本発明の第１の態様は、式（Ｉ）：
【化１】
（Ｉ）
（式中、ＸおよびＹは、ＨまたはＣＨ２ＯＨ、ただし、ＸがＣＨ２ＯＨのとき、ＹはＨ、ＸがＨのとき、ＹはＣＨ２ＯＨである）
で表される化合物、
式（ＩＩ）：
【化２】
（ＩＩ）
（式中、ＲはＳＨ基含有化合物からＳＨ基を除いた残基である）
で表される化合物、
及びそれらの塩から選択される化合物を有効成分として含有するアポトーシス誘発を要する疾患、がん性疾患、活性酸素産生抑制を要する疾患、一酸化窒素産生抑制を要する疾患、プロスタグランジン合成抑制を要する疾患、滑膜細胞増殖抑制を要する疾患、熱ショックタンパク産生誘導を要する疾患、またはα−グリコシダーゼ阻害を要する疾患の治療剤または予防剤に関する。
【０００７】
本発明の第２の態様は、３，６−アンヒドロガラクトースおよび／または還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを有する化合物を中性からアルカリの条件下で処理することを特徴とする式（Ｉ）で表される化合物の製造方法に関する。
【０００８】
本発明の第３の態様は、式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩に関する。
【０００９】
本発明の第４の態様は、式（Ｉ）で表される化合物とＳＨ基含有化合物とを反応させることを特徴とする式（ＩＩ）で表される化合物の製造方法に関する。
【００１０】
本発明の第５の態様は、式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物及びそれらの塩から選択される化合物を含有、希釈および／または添加してなる食品または飲料に関する。
【００１１】
本発明の第６の態様は、３，６−アンヒドロガラクトースおよび／または還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを有する化合物を、中性からアルカリの条件下で処理することにより得られる式（Ｉ）で表される化合物を含有、希釈および／または添加してなる食品または飲料に関する。
【００１２】
本発明の第７の態様は、式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物及びそれらの塩から選択される化合物を有効成分として含有することを特徴とする抗酸化剤に関する。
【００１３】
本発明の第８の態様は、本発明の第７の態様の抗酸化剤を含有することを特徴とする食品または飲料に関する。
【００１４】
本発明の第９の態様は、式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表される抗酸化用化合物に関する。当該抗酸化用化合物の使用に特に限定はないが、例えば活性酸素産生抑制用の化合物として使用することができる。
【００１５】
本発明の第１０の態様は、式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物及びそれらの塩から選択される化合物を有効成分として含有する鮮度保持剤に関する。
【００１６】
本発明の第１１の態様は、式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物及びそれらの塩から選択される化合物を有効成分として含有する化粧料に関する。
【００１７】
本発明の第１２の態様は、式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物及びそれらの塩から選択される化合物を有効成分として含有するα−グリコシダーゼ阻害剤に関する。
【００１８】
本発明の第１３の態様は、３，６−アンヒドロガラクトースおよび／または還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを有する化合物を、中性からアルカリの条件下で処理することにより生成するアポトーシス誘発性物質に関する。
【００１９】
本発明の第１４の態様は、３，６−アンヒドロガラクトースおよび／または還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを有する化合物を、中性からアルカリの条件下で処理することにより生成するアポトーシス誘発性物質を含有、希釈および／または添加してなる食品または飲料に関する。
【発明の効果】
【００２０】
天然物由来のアポトーシス誘発作用等の生理機能を有する安全性の高い物質、その製造方法およびその用途が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本明細書における、３，６−アンヒドロガラクトースとは、式（ＩＩＩ）：
【化３】
(ＩＩＩ)
で表される３，６−アンヒドロガラクトピラノース、式（ＩＶ）：
【化４】
（ＩＶ）
で表されるそのアルデヒド体、また式（Ｖ）：
【化５】
（Ｖ）
で表されるその抱水体を意味する。またこれらの硫酸化体、メチル化体も包含する。式（ＩＩＩ）〜（Ｖ）で表される化合物の構造は、他の表現で表すことも可能であるが、それらも含め、また、可能なそれらの互換異性体も含め、式（ＩＩＩ）〜（Ｖ）で表すこととする。また、式（ＩＩＩ）〜（Ｖ）における立体配置は、所望の活性が得られる限り、特に限定するものではなくＤ−型、Ｌ−型またはそれらの混合物であってもよい。
【００２２】
本発明において、還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを含有する化合物とは、特に限定はなく、例えば、３，６−アンヒドロガラクトース含有物のｐＨ７未満の酸性下での加水分解および／または酵素分解で得ることができ、また、化学合成法によっても得ることができる。
【００２３】
本発明において好適に使用される３，６−アンヒドロガラクトースを含有する化合物とは、例えば、その非還元末端がＬ−ガラクトース−６−硫酸以外の糖である可溶性の糖化合物であり、例えば、アガロビオース、κ−カラビオースならびに３，６−アンヒドロガラクトースを還元末端に有する、アガロビオースおよびκ−カラビオース以外のオリゴ糖であり、非還元末端がＬ−ガラクトースである糖化合物、すなわちアガロオリゴ糖はプロドラグとして最適である。
【００２４】
また、本発明において３，６−アンヒドロガラクトース含有物は、特に限定するものではなく、例えば、寒天、アガロース、アガロペクチン、フノラン、ポルフィラン、カラゲナン、フルセララン、ヒプネアン等の紅藻の粘質多糖［共立出版（株）発行、多糖生化学１−化学編−、第３１４頁（１９６９）］が例示される。またこれらの多糖の含有物も本発明で使用する３，６−アンヒドロガラクトース含有物に包含される。
【００２５】
例えば、アガロース、アガロペクチンの原料としてはテングサ科のマクサ、オニグサ、オオブサ、ヒラクサ、オバクサ、ユイキリ等、オゴノリ科のオゴノリ、オオオゴノリ等、イギス科のイギス、エゴノリ等、その他の紅藻類が用いられ、通常、数種類の藻類を配合して原料とする。原料藻類を熱水抽出の後、冷却することによってところてんが得られる。このところてんから凍結脱水または圧搾脱水によって水分を除き、乾燥させることによって寒天が得られる。通常、寒天は約７０％のアガロースと約３０％のアガロペクチンを含んでいるが、精製を進めてさらに高純度のアガロースを調製することが可能である。
【００２６】
本発明で使用する３，６−アンヒドロガラクトース含有物は、上記の寒天の原料藻類、ところてん、寒天、精製アガロース、精製アガロペクチン、これらの製造工程で得られる中間産物あるいは副産物を包含する。
【００２７】
原料藻類は通常天日に干して乾燥させたものを用いるが、本発明においては生の藻類および乾燥した藻類が使用できる。また、乾燥時に散水しながら漂白したいわゆるさらし原藻も使用できる。寒天はその起源となる藻類を問わず、また、棒状、帯状、板状、糸状、粉末状等の種々の形態のものを使用できる。精製アガロースは精製度の低いものから高いものまで、様々なアガロース含量のものを使用できる。
【００２８】
アガロースは交互に結合したＤ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを主構造とする多糖であり、Ｄ−ガラクトースの１位と３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの４位がβ−グリコシド結合で、また、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの１位とＤ−ガラクトースの３位がα−グリコシド結合で結合している。α−１，３結合は希酸による温和な加水分解やα−アガラーゼによって［カーボハイドレート・リサーチ（Carbohydr. Res.）、第６６巻、第２０７頁（１９７８）］、また、β−1,４結合はβ−アガラーゼによって選択的に加水分解される。
【００２９】
また、カラゲナンはスギノリ科、ミリン科、イバラノリ科等の紅藻類に含まれる多糖であり、κ−カラゲナン、λ−カラゲナン、η−カラゲナンが知られている。κ−カラゲナンは、Ｄ−ガラクトース−４−硫酸の１位と３，６−アンヒドロ−Ｄ−ガラクトースの４位がβ−グリコシド結合で、また、３，６−アンヒドロ−Ｄ−ガラクトースの１位とＤ−ガラクトース−４−硫酸の３位がα−グリコシド結合で交互に繰り返された基本構造を持つ。λ−カラゲナンはＤ−ガラクトースの１位とＤ−ガラクトース−２，６−二硫酸の４位がβ−グリコシド結合で、また、Ｄ−ガラクトース−２，６−二硫酸の１位とＤ−ガラクトースの３位がα−グリコシド結合で交互に繰り返された基本構造を持つ。カラゲナンは食品のゲル化剤として利用されている。
【００３０】
３，６−アンヒドロガラクトース含有物を化学的、物理的および／または酵素的方法で部分分解したものも、３，６−アンヒドロガラクトース含有物として本発明で使用できる。また、３，６−アンヒドロガラクトース含有物を化学的、物理的および／または酵素的方法で部分分解することにより、還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを含有する化合物を調製することができる。
【００３１】
本発明においては、還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを含有する化合物の精製物および部分精製物あるいは還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを含有する化合物の未精製含有物を目的に応じ使用すればよい。
【００３２】
３，６−アンヒドロガラクトース含有物の化学的分解方法の例としては、ｐＨ７未満での酸性下での加水分解、物理的分解方法の例としては、電磁波や超音波の照射、酵素的分解方法の例としては加水分解酵素、例えば、アガラーゼ、カラギナーゼ等による加水分解が挙げられる。
【００３３】
３，６−アンヒドロガラクトース含有物のｐＨ７未満の酸性下での分解条件は還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを有する化合物、例えば、アガロビオース、κ−カラビオースならびに３，６−アンヒドロガラクトースを還元末端に有する、アガロビオースおよびκ−カラビオース以外の化合物が生成する条件であれば特に限定はない。
【００３４】
例えば、３，６−アンヒドロガラクトース含有物を０．０００１〜５規定の酸に溶解または懸濁し、数秒から数日間反応させることにより還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを有する化合物が生成する。また、反応時に加熱することにより還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを有する化合物の生成に必要な反応時間は短縮される。
【００３５】
３，６−アンヒドロガラクトース含有物を溶解または懸濁する酸の種類に特に限定はないが、塩酸、硫酸、硝酸等の無機酸、クエン酸、ギ酸、酢酸、乳酸、アスコルビン酸等の有機酸が使用可能である。酸の濃度も特に限定はないが、０．０００１〜５規定、好ましくは０.００１〜１規定の濃度で使用可能である。また、反応温度も特に限定はないが、０〜２００℃、好ましくは２０〜１３０℃に設定すればよい。また反応時間も特に限定は無いが、数秒〜数日に設定すればよい。酸の種類と濃度、反応温度および反応時間は原料となる３，６−アンヒドロガラクトース含有物、例えば、アガロース、カラゲナン等の種類および目的とする還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを含有する化合物、例えば、アガロビオース、κ−カラビオースや、還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを有する、アガロビオースおよびκ−カラビオース以外の化合物の生成量、目的とする還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを有する、アガロビオースやκ−カラビオース以外の化合物の重合度により適宜選択すればよい。一般に、弱酸よりも強酸、低濃度の酸よりも高濃度の酸、低温よりも高温を選択することにより酸分解反応は速やかに進行する。
【００３６】
例えば、寒天を０．１Ｎ ＨＣｌに１０重量％に懸濁し、１００℃で１３分間加熱溶解して得られる酸分解物は、冷却しても、その氷結点においても、もはやゲル化しなくなる。この液に含まれる糖類をゲルろ過ＨＰＬＣ、順相ＨＰＬＣ等の方法で分析すると高分子の糖類はほとんど見られず、大部分が可溶性の１０糖以下まで分解されている。
【００３７】
本発明で使用する３，６−アンヒドロガラクトースを還元末端に有する、アガロビオースおよびκ−カラビオース以外の化合物とは、例えば、３，６−アンヒドロガラクトースの１位以外の水酸基に糖が結合したものであり、特に限定はない。例えば、アガロースの酸分解物やα−アガラーゼ分解物であるアガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース、アガロオクタオース、アガロデカオース等が挙げられる。また、カラゲナンの酸分解物やカラギナーゼ分解物が挙げられる。さらに、グルコース、マンノース、ガラクトース等のヘキソース、キシロース、アラビノース、リボース等のペントース、グルクロン酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸、グルロン酸等のウロン酸、グルコサミン、ガラクトサミン等のアミノ糖、Ｎ−アセチルノイラミン酸等のシアル酸、フコース等のデオキシ糖、およびこれらのエステル、アミドおよび／またはラクトンが１個または複数個、３，６−アンヒドロガラクトースの１位以外の水酸基に結合したものも本発明で使用する３，６−アンヒドロガラクトースを還元末端に有する、アガロビオース、κ−カラビオース以外の化合物に含まれる。さらに、上記アガロビオース、κ−カラビオース、３，６−アンヒドロガラクトースを還元末端に有するアガロビオースおよび３，６−アンヒドロガラクトースを還元末端に有するκ−カラビオース以外の化合物に、ピルビン酸および／または硫酸基を結合したもの、また該化合物の水酸基がメチル化されたものも、本発明で使用する３，６−アンヒドロガラクトースを還元末端に有する、アガロビオース、κ−カラビオース以外の化合物と定義される。
【００３８】
還元末端の３，６−アンヒドロガラクトースの１位はアノマー炭素であるので３，６−アンヒドロガラクトースを還元末端に有する化合物にはα型とβ型が存在するが、いずれも３，６−アンヒドロガラクトースを還元末端に有する化合物として本発明で使用できる。また、還元末端の３，６−アンヒドロガラクトースの１位がアルデヒド型のものも３，６−アンヒドロガラクトースを還元末端に有する化合物として使用できる。さらに、３，６−アンヒドロガラクトースがＤ−型であるかＬ−型であるかは問わない。また、上記α型、β型、アルデヒド型の混合物およびＤ−型、Ｌ−型の混合物も使用できる。
【００３９】
本発明のアポトーシス誘発性物質は、還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを有する化合物、例えば、アガロビオース、κ−カラビオースならびに３，６−アンヒドロガラクトースを還元末端に有する、アガロビオースおよびκ−カラビオース以外の化合物を中性からアルカリの条件下で処理することにより得ることができる。また、３，６−アンヒドロガラクトース含有物のｐＨ７未満での酸加水分解および／または酵素分解を行い、ついで得られた酸分解物および／または酵素分解物を中性からアルカリの条件下で処理することにより得ることができる。
【００４０】
還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを含有する化合物、例えば、アガロビオース、κ−カラビオースならびに３，６−アンヒドロガラクトースを還元末端に有する、アガロビオースおよびκ−カラビオース以外の化合物のｐＨ７超のアルカリ処理において、これらの化合物から選択される少なくとも１以上の化合物を溶解または懸濁するアルカリの種類に特に限定はないが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、アンモニア等の無機塩基、トリス、エチルアミン、トリエチルアミン等の有機塩基が使用可能である。アルカリの濃度も特に限定はないが、０．０００１〜５規定、好ましくは、０．００１〜１規定の濃度で使用可能である。また、反応温度も特に限定はないが、０〜２００℃、好ましくは２０〜１３０℃に設定すればよい。また反応時間も特に限定は無いが、数秒〜数日に設定すればよい。アルカリの種類と濃度、反応温度および反応時間は原料となる上記化合物の種類および目的とするアポトーシス誘発性物質の生成量により適宜選択すればよい。一般に、ｐＨ７超であれば良いが、低濃度のアルカリよりも高濃度のアルカリ、低温よりも高温を選択することにより本発明のアポトーシス誘発性物質の生成は速やかに進行する。
【００４１】
例えば、アガロビオースまたはκ−カラビオースのｐＨ１１．５の溶液を調製し、３７℃で５分間保持することにより、本発明のアポトーシス誘発性物質が生成する。
【００４２】
生成した本発明のアポトーシス誘発性物質を含有するアルカリ液は、目的に応じ中和して用いても良く、またｐＨ７未満の酸性溶液として使用しても良い。
【００４３】
本発明のアポトーシス誘発性物質のアポトーシス誘発活性は、例えば、がん細胞への増殖抑制作用を指標として測定することができる。本発明のアポトーシス誘発性物質は、該活性を指標とし精製することができる。精製手段としては、化学的方法、物理的方法等の公知の精製手段を用いればよく、ゲルろ過法、分子量分画膜による分画法、溶媒抽出法、イオン交換樹脂等を用いた各種クロマトグラフィー等の精製方法を組合せ精製すればよい。
【００４４】
本発明のアポトーシス誘発性物質の精製物としては上記の式（Ｉ）で表される化合物が例示される。
【００４５】
例えば、アガロビオースの中性からアルカリの条件下での処理物より式（Ｉ）で表される化合物のＸがＣＨ２ＯＨ、ＹがＨである化合物が精製され、κ−カラビオースの中性からアルカリでの条件下での処理物より、式（Ｉ）で表される化合物のＸがＨ、ＹがＣＨ２ＯＨである化合物が精製される。
【００４６】
本発明において使用する式（Ｉ）で表される化合物は上記のように３，６−アンヒドロガラクトースまたは還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを含有する化合物、例えば、アガロビオース、κ−カラビオースならびに３，６−アンヒドロガラクトースを還元末端に有する、アガロビオースおよびκ−カラビオース以外の化合物の中性からアルカリでの条件下での処理において生成し、本発明において使用する式（Ｉ）で表される化合物、その生理作用の発現を目的とする３，６−アンヒドロガラクトースおよび／または還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを含有する化合物の使用は、いずれも本発明に包含されるものである。
【００４７】
本発明の式（Ｉ）で表される化合物の生体内での発現を目的としたプロドラグの使用も本発明に包含される。プロドラグとしては、臓器親和性、組織親和性を有するリガンドを有する３，６−アンヒドロガラクトースが好ましく、当該プロドラグは細胞内に取り込まれた後、その生理的条件下で、式（Ｉ）で表される化合物となり、種々の生理機能を示す。リガンドとしては、ガラクトースが例示され、リガンドがガラクトースである場合は特に肝組織へのターゲッティングが効率よく行われる。当該リガンドを有する化合物としては非還元末端にガラクトースを有するアガロビオース、アガロヘキサオース、アガロオクタオース等のアガロオリゴ糖があり、これらのアガロオリゴ糖はプロドラグとして有用である。
【００４８】
非還元末端にガラクトースを有するアガロオリゴ糖はこれまでにも人類は長い間食してきた。このアガロオリゴ糖は中性あるいはアルカリ性で還元末端の３，６−アンヒドロガラクトースが外れることにより、３，６−アンヒドロガラクトースが式（Ｉ）で表される化合物に変化し、生理活性が発現する。すなわちプロドラグとして生体内に吸収されたアガロオリゴ糖が式（Ｉ）で表される化合物に変化し、生理機能を発現する。このアガロオリゴ糖は吸収されやすい適度な分子量であるので、消化管で吸収されやすく、更に、非還元末端にガラクトースがあるので、肝臓で積極的に吸収され肝臓を介した血流にも乗りやすい。吸収後、非還元末端のガラクトースに親和性のある組織局所で式（Ｉ）で表される化合物に変化し生理活性を発現する。すなわち、プロドラグとしてのアガロオリゴ糖を投与することによって、安定性に優れ、取り込み効率の良く、局所で濃縮された状態で式（Ｉ）で表される化合物に変化し、その生理活性を発現することができる。
【００４９】
式（Ｉ）で表される化合物の塩としては、医薬として許容される塩があり、公知の方法にて変換することができる。
【００５０】
本発明において使用する式（ＩＩ）で表される化合物は、式（Ｉ）で表される化合物とＳＨ基含有化合物とを反応させることにより、反応液中に生成する。
【００５１】
使用するＳＨ基含有化合物は何ら限定はなく、例としてはメタンチオール、ブタンチオール、メルカプトエタノール、ＳＨ基含有アミノ酸、ＳＨ基含有アミノ酸誘導体等が挙げられる。ＳＨ基含有アミノ酸の例としては、システイン、ホモシステイン等が挙げられる。
【００５２】
ＳＨ基含有アミノ酸誘導体としては、上記アミノ酸の誘導体、例えばシステイン誘導体、システイン含有ペプチド、システイン誘導体含有ペプチドが例示される。システイン含有ペプチドとしてはペプチド中にシステインが構成成分となっていれば良く、特に限定はない。本発明のシステイン含有ペプチドとしては、オリゴペプチド、例えばグルタチオンのような低分子物からタンパク質のような高分子物までを包含する。またシスチン又はホモシスチンを含有するペプチドも反応中にシステイン又はホモシステイン含有ペプチドとなる条件下、例えば還元処理を組合せることにより、本発明のシステイン又はホモシステイン含有ペプチドとして使用することができる。なおシステイン含有ペプチドとしては、糖質、脂質等を含有するシステイン含有ペプチドも包含される。また、上記した各種の物の塩、酸無水物、エステル等であってもよい。
【００５３】
式（ＩＩ）で表される化合物を製造する際の式（Ｉ）で表される化合物とＳＨ基含有化合物との反応は、公知の反応条件で行えばよく、ＳＨ基含有化合物のＳＨ基が反応性を有する条件であれば、特に限定はない。
【００５４】
式（Ｉ）で表される化合物とＳＨ基含有化合物、例えばＳＨ基含有化合物、又はその誘導体とが反応し、生成した式（ＩＩ）で表される化合物の精製、単離手段としては、化学的方法、物理的方法等の公知の精製手段を用い、当該化合物を精製することができる。
【００５５】
式（Ｉ）で表される化合物は生体内で、例えばＳＨ基含有化合物（例えばシステイン、グルタチオン等）と反応し、医薬として有用な式（ＩＩ）で表される代謝誘導体を生成する。従って、この代謝誘導体が示す薬効は、式（Ｉ）で表される化合物を投与した場合においても得られ、式（ＩＩ）で表される化合物の生体内での生成を目的とした、式（Ｉ）で表される化合物の使用も本発明に包含される。
【００５６】
式（ＩＩ）で表される化合物の塩としては、医薬として許容される塩があり、公知の方法にて変換することができる。
【００５７】
本発明に使用する式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩はアポトーシス誘発活性、制がん活性、活性酸素産生抑制活性、過酸化脂質ラジカル産生抑制活性、一酸化窒素産生抑制活性等の抗酸化活性、抗病原微生物活性、抗変異原活性、α−グリコシダーゼ阻害活性、免疫調節作用、プロスタグランジン合成抑制作用、抗炎症作用、抗アレルギー作用、サイトカイン産生調節作用、抗リウマチ作用、抗糖尿病作用、滑膜細胞増殖抑制活性、熱ショックタンパク産生誘導作用等の生理活性を有する。これらの活性により、式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩から選択される化合物を有効成分とし、アポトーシス誘発を要する疾患、がん性疾患、活性酸素産生抑制を要する疾患、過酸化脂質ラジカル産生抑制を要する疾患、一酸化窒素産生抑制を要する疾患、病原微生物による疾患、変異原により誘発される疾患、α−グリコシダーゼ阻害を要する疾患、免疫調節を要する疾患、プロスタグランジン合成抑制を要する疾患、炎症抑制を要する疾患、アレルギー抑制を要する疾患、サイトカイン産生調節を要する疾患、リウマチ、糖尿病、滑膜細胞増殖抑制を要する疾患、熱ショックタンパク産生誘導を要する疾患等の治療剤または予防剤、すなわちアポトーシス誘発剤、制がん剤、活性酸素産生抑制剤、過酸化脂質ラジカル産生抑制剤、一酸化窒素産生抑制剤等の抗酸化剤等、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗変異原剤、血糖上昇抑制剤、抗高脂質剤、免疫調節剤、プロスタグランジン合成抑制剤、抗炎症剤、抗アレルギー剤、サイトカイン産生調節剤、滑膜細胞増殖抑制剤、抗リウマチ剤、抗糖尿病剤、熱ショックタンパク産生誘導剤等を製造することができる。
【００５８】
また、式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩から選択される化合物を有効成分として含有する本発明のアポトーシス誘発剤は、自己免疫疾患患者の自己反応性リンパ球、がん細胞、ウイルス感染細胞等を排除するのに有効であり、アポトーシスを所望の組織、細胞で発現させることにより、不要もしくは有害な細胞を自然の形で生体から排除することができる。本発明のアポトーシス誘発剤が有効な疾患としては、例えば、全身性エリテマトーデス、免疫介在性糸球体腎炎、多発性硬化症、膠原病等の自己免疫疾患、リウマチ等である。
【００５９】
本発明のアポトーシス誘発剤はアポトーシス誘発方法に使用することができ、該方法はアポトーシス誘発機構の解明、アポトーシス誘発剤、アポトーシス誘発阻害剤のスクリーニング等に有用である。
【００６０】
なお、本発明のアポトーシス誘発剤によるアポトーシス誘発作用は、キャスパーゼ（Caspase）の阻害剤、例えば、ＩＬ−１βコンバーティング・エンザイム・インヒビターＶ〔Ｚ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＤＬ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−フルオロメチルケトン：宝酒造社製〕により阻害されるので、キャスパーゼに依存するアポトーシスによる細胞死である。
【００６１】
このキャスパーゼは、種々の細胞死の際に先行して上昇すること、その過剰発現により細胞死が誘導されること、ペプチド阻害剤や阻害タンパク質であるＣｒｍＡ、ｐ３５によりアポトーシスが抑制されること、キャスパーゼ−１、キャスパーゼ−３のノックアウトマウスでは正常に見られるアポトーシスの一部が抑制されることから、アポトーシスの重要なメディエーターとして機能していることが明らかにされている［生化学、第７０巻、第１４〜２１頁（１９９８）］。すなわち、アポトーシスの過程ではシステインプロテアーゼであるキャスパーゼが活性化され、核や細胞質のタンパク質を分解する。キャスパーゼは、まず前駆体として合成され、スプライシングにより活性化型となる。このキャスパーゼの活性化経路の制御が細胞の生死を決める。哺乳類では１０種類以上のキャスパーゼが存在し、上位のキャスパーゼが下位のキャスパーゼをスプライシングすることで細胞内タンパク質分解活性は雪崩式に増幅される［細胞工学、第１７巻、第８７５〜８８０頁（１９９８）］。反対に、システインプロテアーゼであるキャスパーゼの阻害剤でそのスプライシング活性を阻害すれば、キャスパーゼ依存型のアポトーシスによる細胞死を止めることができる。
【００６２】
本発明に使用する式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩は酸化物質、例えば、活性酸素の産生抑制に有用であり、該化合物を有効成分とする活性酸素産生抑制剤等の抗酸化剤は活性酸素の産生および／または過剰が起因となる疾病の治療または予防に有用である。
【００６３】
活性酸素は、大きくラジカルと非ラジカルの活性酸素に分類することができる。ラジカル系活性酸素には、ヒドロキシラジカル、ヒドロキシペルオキシラジカル、ペルオキシラジカル、アルコキシラジカル、二酸化窒素、一酸化窒素（以下、ＮＯと略す）、チイルラジカル、スーパーオキシドがある。一方、非ラジカル系活性酸素には、一重項酸素、過酸化水素、脂質ヒドロペルオキシド、次亜塩素酸、オゾン、ペルオキシ亜硝酸がある。いずれも多くの病態、すなわち、各種の炎症性疾患、糖尿病、がん、動脈硬化、神経疾患、虚血再潅流障害などと関わりがある。
【００６４】
生体内では絶えずいくつかの経路で低濃度の活性酸素が生成している。これは生理的にミトコンドリアなどの電子伝達系から漏出するスーパーオキシドや過酸化水素、銅や鉄などの遷移金属が触媒することによるヒドロキシラジカル、好中球や単球などによって生成される感染防御のための次亜塩素酸、アルギニンの分解により生成するＮＯなど、いずれも避けることのできないものである。これらの活性酸素生成に対して、生体は活性酸素消去系としての酵素、低分子化合物をもち、生成と消去のバランスを保っている。しかし、生成系がなんらかの原因で活性化されたり、逆に消去系が不活性化されて、活性酸素生成系が消去系に対して優位に立った場合、生体は酸化的障害を受けることになる。このような状態を酸化ストレスという。さらに、生体内のバランスがずれた場合だけでなく、大気や食品などの生体外のものからも、生体は常に酸化ストレスにさらされており、日常生活を送る上で酸化ストレスは避けることができない。
【００６５】
すなわち、酸化ストレスは上記したように、様々な疾患と関わりがあり、生体は、常に酸化ストレスによる疾患、あるいは、疾病の悪化につながる状況にさらされている。したがって、このような酸化ストレスが引き起こす疾病の予防、治療あるいは悪化防止にも、本発明の抗酸化剤、例えば、活性酸素産生抑制剤は有用である。
【００６６】
また、酸化ストレスに必ずつきまとうのが脂質過酸化反応であり、この反応は過酸化脂質ラジカルができると一挙に進む反応である。そこで生成される４−ヒドロキシ−２−ノネナール（ＨＮＥ）はグルタチオンやタンパク質を特異的な標的とする毒性アルデヒドである。そのＨＮＥとタンパク質との反応生成物が、様々な病態組織において検出されており、酸化ストレスの関わる疾患病態の誘発因子ではないかと考えられている。そのため、過酸化脂質ラジカルの生成を抑えることのできる本発明に使用される抗酸化物質、すなわち、式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩から選択される化合物を有効成分として含有する抗酸化剤は酸化ストレスによる生活習慣病疾患の予防および治療に有用である。
【００６７】
ＮＯは内皮細胞由来血管平滑筋弛緩因子（ＥＤＲＦ）の本体である［ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３２７巻、第５２４〜５２６頁（１９８７）］。本発明によりＮＯ産生の抑制を必要とする疾病治療剤または予防剤が提供される。
【００６８】
本発明において、ＮＯ産生の抑制を必要とする疾病とは、特に限定はないが、例えば、毒性ショックやある種のサイトカインによる治療等による全身性血圧低下、血圧応答低下、糖尿病、血管機能不全、病因性血管拡張、組織損傷、心臓血管系虚血、痛感過敏症、脳虚血、血管新生を伴う疾病、がん等の疾病を含むものである。
【００６９】
Ｌ―アルギニンと酸素からＬ―シトルリンとＮＯを生産する一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）には、常に発現しているｃＮＯＳと誘導型のｉＮＯＳがある。マクロファージ等において、ｉＮＯＳは、細胞毒素やサイトカイン（ＬＰＳ、ＩＮＦ−γ等）の刺激により誘導され、ＮＯを生産する。ｉＮＯＳ自体は生体系の維持においてなくてはならない存在である。しかし、一方で、種々の要因により必要以上に過剰発現し過剰なＮＯを産生することにより、種々の疾病を引き起こすことも明らかになっている。
【００７０】
本発明者らは式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩がこのｉＮＯＳの発現を抑制することを、ウエスタンブロティングよりタンパク質レベルで、ＲＴ−ＰＣＲによりメッセンジャーＲＮＡレベルで確認した。つまり、本発明で使用する式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩から選択される化合物は、種々の要因により過剰に発現し過剰なＮＯを生産するｉＮＯＳの発現を抑制することにより、ＮＯ産生抑制を必要とする疾病の治療および予防に有効である。
【００７１】
かくして、本発明で使用する式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩はマクロファージのＮＯ産生を抑制し、マクロファージのＮＯ産生に起因する疾病、発がん等の治療、予防に有用である。また、本発明に使用する化合物のＮＯ産生抑制はＮＯ産生誘起物質であるＬＰＳや、ＩＮＦ−γに対する拮抗阻害ではない。また、本発明に使用する化合物を予め加えておくことによって、ＮＯ産生抑制効果の増強が見られ、本発明に使用する式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩から選択される化合物は抗酸化物質の産生の予防剤の有効成分として極めて有用である。
【００７２】
また、本発明のＮＯ産生抑制剤はＮＯ産生機構研究、ＮＯ作用機作研究に有用であり、また、ＮＯ産生機構に関与する物質のスクリーニングに使用することもできる。
【００７３】
固形がんの増大に血管新生は必須であるが、血管内皮増殖因子／血管透過性亢進因子（ＶＥＧＦ）はこの過程に重要な役割を演じている。様々ながん細胞においてＶＥＧＦがＮＯによって誘導される。本発明のＮＯ産生抑制剤はＮＯ産生を抑制することによってがん細胞のＶＥＧＦ産生も抑制し、その結果、がん組織周辺での血管新生が阻害される。がん細胞を皮下に移植して固形腫瘍を形成させたマウスに本発明のＮＯ産生抑制剤を投与するとがん組織の周辺の血管の形成が不十分となり、がんは脱落する。
【００７４】
ニトロソアミンは２級アミンにニトロソ基が付加した一群の化合物で数百種類が知られており、その多くがＤＮＡに損傷を加えることにより動物に対して発がん性を示す。ニトロソアミンはヒトの発がんにも深く関わっているとされており、通常、胃の中で亜硝酸塩とアミンが反応することによって生成する。ＮＯはｐＨ中性の生理的条件下でもアミンと反応してニトロソアミンを生成する。また、疫学的にがんとの関係が高い肝吸虫感染患者や肝硬変患者においてＮＯ産生は亢進している。したがって、本発明のＮＯ産生抑制剤を投与してＮＯ産生の亢進を防ぐことによって特にハイリスクグループの発がんを予防することができる。以上のように、本発明のＮＯ産生抑制剤は発がんの抑制とがん組織における血管新生阻害という２段階で制がん作用を示す。
【００７５】
さらに、本発明において使用する化合物は、アポトーシスを誘導し、がん細胞を死滅させる直接効果と、がん細胞が出しているＮＯを抑制することにより、ＮＯにより誘導されるＶＥＧＦによる血管新生を阻害することによりがん細胞を死に追いやる間接的効果の２つの作用の相乗効果でも制がん作用を発揮する。
【００７６】
ＮＯはまた、炎症性病変に特徴的に認められる浮腫、すなわち血管透過性亢進作用を誘発し［マエダ（Maeda）ら、ジャパニーズ・ジャーナル・オブ・カンサー・リサーチ（Japanese Journal of Cancer Research）、第８５巻、第３３１〜３３４頁（１９９４）］、また、炎症性メディエーターであるプロスタグランジン類の生合成を亢進させる［サルベミニ（Salvemini）ら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ＵＳＡ（Proceedings of National Academy of Sciences, USA）、第９０巻、第７２４０〜７２４４頁（１９９３）］。一方、ＮＯはスーパーオキシドラジカルと速やかに反応してペルオキシ亜硝酸イオンを生じ、ペルオキシ亜硝酸イオンが炎症性の細胞、組織障害を引き起こすとも考えられている。
【００７７】
活性化された免疫細胞が臓器に入り込みサイトカインを放出するとＮＯの産生が誘導される。インスリン依存型糖尿病は膵島β細胞が特異的に破壊されることによって引き起こされる疾患であり、ＮＯによる破壊であるとされている。また、慢性関節性リウマチ、変形性関節リウマチ、痛風性関節炎、ベーチェット病に伴う関節炎の患者の病変部の関節液には同患者の正常な関節や健常人の関節の関節液に比べて高濃度のＮＯが含まれている。これらの患者に本発明のＮＯ産生抑制剤を投与すると病変部におけるＮＯ産生を抑制し、症状が改善する。
【００７８】
脳虚血中および再潅流後にはＮＯ産生が増大し、それに伴って脳組織が損傷を受ける。脳虚血時に患者に本発明のＮＯ産生抑制剤を投与することにより脳組織の損傷が軽減され、予後が改善される。
【００７９】
組織の炎症および疼痛の惹起にはアラキドン酸代謝が大きく関与している。細胞膜リン脂質由来のアラキドン酸は、体内でシクロオキシゲナーゼの作用によりプロスタグランジン、プロスタサイクリン、トロンボキサンチンの三者に代謝される。このうちプロスタグランジンは血管拡張作用とそれに伴う臓器への血流増加作用を有するが、特に炎症部位においてはプロスタグランジンＥ２とＩ２がその血流増加作用により、浮腫と白血球浸潤を増加させる。すなわち、本発明のプロスタグランジンＥ２合成抑制剤を投与することにより、プロスタグランジンの生合成を抑制すると、鎮痛、抗炎症作用を発現させることができる。さらに、炎症部分に浸潤した白血球は活性酸素を生産し、酸化ストレス状態を引き起こすため、プロスタグランジンの生合成を抑制する本発明のプロスタグランジンＥ２合成抑制剤は、酸化ストレスによる先に述べたような様々な疾患、疾病の予防、治療あるいは悪化防止にも有用である。
【００８０】
また、上記のように、ＮＯは、炎症性病変に特徴的に認められる浮腫、すなわち、血管透過性亢進作用を誘発し、炎症性メディエーターであるプロスタグランジン類の生合成を亢進させることより、本発明のＮＯ産生抑制効果とプロスタグランジンＥ２合成抑制効果は相乗的に作用し、鎮痛、抗炎症作用と酸化ストレスによる様々な疾患、疾病の予防、治療あるいは悪化防止に相乗効果を発現する。 本発明の免疫調節剤はリンパ球幼若化反応抑制作用、混合リンパ球反応抑制等の免疫調節作用を有し、本発明の免疫調節剤はこれらの免疫系、免疫因子の異常が起因となる疾病の治療剤または予防剤として有用である。
【００８１】
なお、リンパ球幼若化反応とは、マイトジェンがリンパ球表面の受容体に結合し、リンパ球を活性化させ、その分裂、増殖を促す反応である。混合リンパ球反応とは、同種異系の動物より得られたリンパ球を混合培養することにより、主要組織適合抗原の不一致によるリンパ球の活性化が誘導され、リンパ球の分裂、増殖が促進される反応である。本発明の免疫調節剤はこれらの反応を抑制し、リンパ球の異常亢進が起因となる自己免疫性疾患、例えば慢性腎炎、慢性大腸炎、Ｉ型糖尿病、慢性関節リウマチ等の慢性の疾患の治療または予防に特に有用であり、また移植片拒絶反応の抑制においても有用である。
【００８２】
式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩は７０ｋダルトン（ＨＳＰ７０）等の熱ショックタンパク産生誘導活性を有し、肝炎ウイルス、エイズウイルス、インフルエンザウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ヘルペスウイルス等のＲＮＡウイルス、ＤＮＡウイルスに対する抗ウイルス作用を有する。また熱ショックタンパクはがん免疫にも関与しており、これらの化合物はがん免疫にも有効である。更に抗炎症等の生体防御作用にも関与している。従って、式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩を摂取することによって、インフルエンザウイルスによる風邪疾患等のウイルス性疾患が予防、治療できる。
【００８３】
本発明のアポトーシス誘発剤としては、式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩から選択される化合物を有効成分とし、これを公知の医薬用担体と組合せ製剤化すればよい。一般的には、当該組成物を薬学的に許容できる液状または固体状の担体と配合し、かつ必要に応じて溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を加えて、錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、カプセル剤等の固形剤、通常液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤とすることができる。またこれを使用前に適当な担体の添加によって液状となし得る乾燥品とすることができる。
【００８４】
本発明のアポトーシス誘発剤は、経口剤や、注射剤、点滴用剤等の非経口剤のいずれによっても投与することができる。
【００８５】
医薬用担体は、上記投与形態および剤型に応じて選択することができ、経口剤の場合は、例えばデンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩等が利用される。また、経口剤の調製に当っては、さらに、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、潤沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を配合することもできる。
【００８６】
一方、非経口剤の場合は、常法に従い本発明の有効成分である式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩から選択される化合物を希釈剤としての注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、落花生油、大豆油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等に溶解ないし懸濁させ、必要に応じ、殺菌剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤等を加えることにより調製される。
【００８７】
本発明のアポトーシス誘発剤は、製剤形態に応じた適当な投与経路で投与される。投与方法も特に限定はなく、内用、外用および注射によることができる。注射剤は、例えば静脈内、筋肉内、皮下、皮内等に投与することができ、外用剤には座剤等も包含される。
【００８８】
本発明のアポトーシス誘発剤の投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的およびこれに適用される患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され、一定ではないが一般には製剤中に含有される有効成分の量が成人１日当り１０μｇ〜２００ｍｇ／ｋｇである。もちろん投与量は、種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。本発明の薬剤はそのまま経口投与するほか、任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることもできる。
【００８９】
本発明の制がん剤としては、式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩から選択される化合物を有効成分とし、これを公知の医薬用担体と組合せ製剤化すれば制がん剤を製造することができる。制がん剤の製造は上記アポトーシス誘発剤の製造方法に準じ行うことができる。
【００９０】
制がん剤としては、製剤形態に応じた適当な投与経路で投与される。投与方法も特に限定はなく、内用、外用および注射によることができる。注射剤は、例えば静脈内、筋肉内、皮下、皮内等に投与することができ、外用剤には座剤等も包含される。
【００９１】
制がん剤としての投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的およびこれに適用される患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され、一定ではないが一般には製剤中に含有される有効成分の量が成人１日当り１０μｇ〜２００ｍｇ／ｋｇである。もちろん投与量は、種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。本発明の薬剤はそのまま経口投与するほか、任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることもできる。
【００９２】
リウマチは骨膜細胞や軟骨細胞に障害が起こる自己免疫疾患である。式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩は滑膜細胞へのアポトーシス誘発作用を有する。したがって、式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩から選択される化合物を有効成分として抗リウマチ剤を製造することができる。すなわち、式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩から選択される化合物を有効成分とし、これを公知の医薬用担体と組合せ製剤化すれば抗リウマチ剤を製造することができる。抗リウマチ剤の製造は上記方法に準じ行うことができる。
【００９３】
抗リウマチ剤としては、経口剤や、注射剤、点滴用剤等の非経口剤のいずれによっても投与することができる。
【００９４】
医薬用担体は、上記投与形態および剤型に応じて選択することができ、上記アポトーシス誘発剤に準じ使用すれば良い。
【００９５】
抗リウマチ剤としては、製剤形態に応じた適当な投与経路で投与される。投与方法も特に限定はなく、内用、外用および注射によることができる。注射剤は、例えば静脈内、筋肉内、皮下、皮内等に投与し得、外用剤には座剤等も包含される。
【００９６】
式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩から選択される化合物を有効成分として含有する抗リウマチ剤の投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的およびこれに適用される患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され、一定ではないが一般には製剤中に含有される有効成分の量が成人１日当り０．０１〜５０ｍｇ、好ましくは０．１〜１０ｍｇである。もちろん投与量は種々の条件によって変動するので上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。本発明の薬剤はそのまま経口投与するほか、任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることもできる。
【００９７】
また、式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩から選択される化合物を有効成分とする抗酸化剤、活性酸素産生抑制剤、過酸化脂質ラジカル産生抑制剤、ＮＯ産生抑制剤、抗病原微生物剤、抗変異原剤、プロスタグランジン合成抑制剤、滑膜細胞増殖抑制剤、熱ショックタンパク産生誘導剤、抗ウイルス剤は上記アポトーシス誘発剤に準じ製造することができ、用量、用法はその症状に応じ、上記アポトーシス誘発剤に準じて、使用すればよい。
【００９８】
さらに式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩は種々のα−グリコシダーゼ、例えば、シュークラーゼ、マルターゼ等に阻害活性を示し、式（Ｉ）で表される化合物を有効成分とする血糖上昇抑制剤、抗高脂血症剤、抗肥満剤、抗糖尿病剤等を製造することができる。これらの医薬は上記アポトーシス誘発剤に準じ製造することができ、用量、用法はその症状に応じ、上記アポトーシス誘発剤に準じて、使用すれば良い。また式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩から選択される化合物を有効成分としてα−グリコシダーゼ阻害剤を常法に従い製造することができる。該α−グリコシダーゼ阻害剤を使用し、α−グリコシダーゼの阻害方法を行うことができる。
【００９９】
本発明により、式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩から選択される化合物を含有、希釈および／または添加してなる食品および飲料が提供される。本発明の食品および飲料は、そのアポトーシス誘発作用、制がん作用、抗酸化作用、抗病原微生物活性、抗変異原活性、プロスタグランジン合成抑制活性、熱ショックタンパク産生誘導作用、抗ウイルス作用、α−グリコシダーゼ阻害活性等により、式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩から選択される化合物に感受性を示す疾患、例えば、アポトーシス誘発を要する疾患、がん性疾患、活性酸素産生抑制を要する疾患、ＮＯ産生抑制を要する疾患、病原微生物による疾患、変異原、プロスタグランジン合成等により惹起される疾患、熱ショックタンパク産生誘導を要する疾患、ウイルス性疾患、α−グリコシダーゼの調節を必要とする疾患等の症状改善、予防に極めて有用である。
【０１００】
本発明の食品または飲料の製造法は、特に限定はないが、調理、加工および一般に用いられている食品または飲料の製造法による製造を挙げることができ、製造された食品または飲料に式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩から選択される化合物が有効成分として含有、添加および／または希釈されていればよい。
【０１０１】
例えば、式（Ｉ）で表される化合物は、食品または飲料の製造工程において、３，６−アンヒドロガラクトースおよび／または還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを有する化合物を、中性からアルカリの条件下で処理することにより得られる。また、３，６−アンヒドロガラクトースおよび／または還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを有する化合物は、３，６−アンヒドロガラクトース含有物の酸性下での加水分解または酵素分解により得られる。
【０１０２】
３，６−アンヒドロガラクトース含有物としては、例えば、寒天、アガロースおよび／またはカラゲナンを使用することができる。還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを有する化合物としては、アガロビオース、κ−カラビオースならびに還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを有する、アガロビオースおよびκ−カラビオース以外の化合物から選択される少なくとも１以上の化合物を使用することができる。
【０１０３】
また式（Ｉ）で表される化合物が食品又は飲料の製造工程中に、ＳＨ基含有化合物と反応して生成する式（ＩＩ）で表される化合物を含有、希釈及び／又は添加してなる食品又は飲料も本発明の食品又は飲料に包含される。
【０１０４】
本発明の食品または飲料とは、特に限定はないが、例えば、穀物加工品（小麦粉加工品、デンプン類加工品、プレミックス加工品、麺類、マカロニ類、パン類、あん類、そば類、麩、ビーフン、はるさめ、包装餅等）、油脂加工品（可塑性油脂、てんぷら油、サラダ油、マヨネーズ類、ドレッシング等）、大豆加工品（豆腐類、味噌、納豆等）、食肉加工品（ハム、ベーコン、プレスハム、ソーセージ等）、水産製品（冷凍すりみ、かまぼこ、ちくわ、はんぺん、さつま揚げ、つみれ、すじ、魚肉ハム、ソーセージ、かつお節、魚卵加工品、水産缶詰、つくだ煮等）、乳製品（原料乳、クリーム、ヨーグルト、バター、チーズ、練乳、粉乳、アイスクリーム等）、野菜・果実加工品（ペースト類、ジャム類、漬け物類、果実飲料、野菜飲料、ミックス飲料等）、菓子類（チョコレート、ビスケット類、菓子パン類、ケーキ、餅菓子、米菓類等）、アルコール飲料（日本酒、中国酒、ワイン、ウイスキー、焼酎、ウオッカ、ブランデー、ジン、ラム酒、ビール、清涼アルコール飲料、果実酒、リキュール等）、嗜好飲料（緑茶、紅茶、ウーロン茶、コーヒー、清涼飲料、乳酸飲料等）、調味料（しょうゆ、ソース、酢、みりん等）、缶詰・瓶詰め・袋詰め食品（牛飯、釜飯、赤飯、カレー、その他の各種調理済み食品）、半乾燥または濃縮食品（レバーペースト、その他のスプレッド、そば・うどんの汁、濃縮スープ類）、乾燥食品（即席麺類、即席カレー、インスタントコーヒー、粉末ジュース、粉末スープ、即席味噌汁、調理済み食品、調理済み飲料、調理済みスープ等）、冷凍食品（すき焼き、茶碗蒸し、うなぎかば焼き、ハンバーグステーキ、シュウマイ、餃子、各種スティック、フルーツカクテル等）、固形食品、液体食品（スープ等）、香辛料類等の農産・林産加工品、畜産加工品、水産加工品等が挙げられる。
【０１０５】
本発明の食品または飲料としては、式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩から選択される化合物が含有、希釈および／または添加されており、その生理機能を発現するための必要量が含有されていれば特にその形状に限定は無く、タブレット状、顆粒状、カプセル状等の形状の経口的に摂取可能な形状物も包含する。
【０１０６】
本発明の食品または飲料は生理活性を有する式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩から選択される化合物を含有し、これらのアポトーシス誘発作用、制がん作用等の生理機能によって、これらを摂取することにより発がん予防、がん抑制効果等の式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩に感受性を示す疾患の症状改善作用または予防作用を示す健康食品または飲料であり、特に胃腸健康保持に有用な食品または飲料である。
【０１０７】
また、そのα−グリコシダーゼ阻害活性により、式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩から選択される化合物を含有、希釈および／または添加してなる食品は血糖上昇抑制作用を示す食品または飲料として、抗糖尿病用食品または抗糖尿病用飲料、抗肥満用食品または抗肥満用飲料、抗高脂血症用食品または抗高脂血症用飲料等として有用である。
【０１０８】
また、式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩は、活性酸素産生抑制作用、過酸化脂質ラジカル産生抑制作用等の抗酸化活性を有し、抗酸化用食品用の抗酸化剤または抗酸化用飲料用の抗酸化剤、例えば活性酸素産生抑制剤、過酸化脂質ラジカル産生抑制剤、ＮＯ産生抑制剤等として抗酸化用食品または抗酸化用飲料の製造に使用することができる。
【０１０９】
上記化合物から選択される少なくとも一つの化合物を有効成分とする本発明の抗酸化剤の剤型は特に限定されるものではなく、添加対象となる食品または飲料の種類によって常法に従って、粉末状、ペースト状、乳化物等の適宜な剤型にすることができ、本発明に使用する化合物を有効成分として含有する食品または飲料は本発明の抗酸化剤を使用することにより簡便に製造することができる。
【０１１０】
また、本発明において式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表される抗酸化用化合物が提供される。
【０１１１】
式（Ｉ）で表される抗酸化用化合物は、例えば、３，６−アンヒドロガラクトース含有物のｐＨ７未満の酸性下での酸分解物および／または酵素分解物を中性からアルカリの条件下で処理を行うことにより得ることができる。またその精製物、部分精製物等を使用することができる。
【０１１２】
またその３，６−アンヒドロガラクトース含有物としては、例えば、紅藻類由来の３，６−アンヒドロガラクトース含有物、例えば、寒天、アガロースおよび／またはカラゲナンが使用できる。
【０１１３】
式（ＩＩ）で表される抗酸化用化合物は、式（Ｉ）で表される化合物とＳＨ基含有化合物を反応させることにより得ることができ、精製物、部分精製物等を使用することができる。
【０１１４】
本発明の抗酸化用化合物は生体内の酸化物質、例えば活性酸素の除去や産生抑制に有用であり、該抗酸化糖化合物は活性酸素の産生および／または過剰が起因となる疾病の症状改善または予防に有用である。
【０１１５】
上記のように、生体内において活性酸素生成系が消去系に対して優位に立った場合、生体は酸化的障害を受けることにより生じる酸化ストレスは様々な疾患と関わり、生体は、常に酸化ストレスによる疾患、あるいは、疾病の悪化につながる状況にさらされている。したがって、このような酸化ストレスが引き起こす疾病の予防、治療あるいは悪化防止には、毎日、適度の抗酸化物質を摂取することが望ましい。毎日適度の量を摂取するには、食品および／または飲料から摂取するのが望ましく、本発明の抗酸化用化合物を含有、希釈および／または添加してなる食品または飲料は抗酸化用食品または抗酸化用飲料として、また抗酸化ストレス食品または抗酸化ストレス飲料として極めて有用である。
【０１１６】
本発明に使用する化合物は保水性も合せ有し、本発明に使用する化合物を有効成分とし抗便秘剤を製造することができる。抗便秘用食品、抗便秘用飲料を製造することができる。
【０１１７】
本発明によれば、さらに、式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩から選択される化合物を有効成分とする化粧料が提供される。
【０１１８】
化粧料としては、上記糖化合物を有効成分とし、クリーム、乳液、ローション、洗顔料、パック等の基礎化粧料、口紅、ファンデーション等のメイクアップ化粧料、ボディソープ、石鹸等の形態に調製することができる。また、頭髪に対しても有効であり、ヘアートニック、ヘアーリキッド、ヘアーセットローション、ヘアーブロー剤、ヘアークリーム、ヘアーコート等のヘアー製品やシャンプー、リンス、ヘアートリートメント等の頭髪用トイレタリー等のヘアーケアー製品の形態にすることができる。化粧料への配合量はその美白作用、保湿作用、抗酸化作用等により、適宜決定すればよい。化粧料の他の成分は通常化粧料に配合されるものが使用できる。なお美白作用、保湿作用は常法にて測定すればよく、例えば特開平８−３１０９３７号公報記載の方法で測定することができる。
【０１１９】
本発明の化粧料は皮膚への美白作用、保湿作用、抗酸化作用、活性酸素産生抑制作用、抗酸化ストレス作用、毛髪への保湿作用、抗酸化作用、活性酸素産生抑制作用、抗酸化ストレス作用等により優れた性質を示す。
【０１２０】
本発明において式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩から選択される化合物を有効成分とする鮮度保持剤が提供される。 式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩は抗酸化作用、鮮度保持作用、チロシナーゼ活性阻害作用、抗病原微生物活性、抗変異原活性を有し、式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩から選択される化合物を有効成分として、公知の製剤化方法により、食品の変色、腐敗、酸化等を効果的に防止する食品の鮮度保持剤を製造することができる。本発明の鮮度保持剤は種々の食品、生鮮食品、加工食品等の味や鮮度の保持に極めて有用である。
【０１２１】
本発明によれば、３，６−アンヒドロガラクトースおよび／または還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを有する化合物を、中性からアルカリの条件下で処理することにより生成するアポトーシス誘発性物質（以下、単に本発明のアポトーシス誘発性物質と称する）を有効成分とし、アポトーシス誘発剤を製造することができる。アポトーシス誘発剤としては、上記のアポトーシス誘発剤に準じ製造すればよい。
【０１２２】
本発明のアポトーシス誘発性物質を有効成分とするアポトーシス誘発剤の投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的およびこれに適用される患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され、一定ではないが一般には製剤中に含有される有効成分の量が成人１日当り１０μｇ〜２００ｍｇ／ｋｇである。もちろん投与量は、種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。本発明の薬剤はそのまま経口投与するほか、任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることもできる。
【０１２３】
本発明のアポトーシス誘発性物質を有効成分とするアポトーシス誘発性物質はがん細胞の増殖抑制活性を有し、本発明のアポトーシス誘発性物質を有効成分として制がん剤を製造することができる。
【０１２４】
本発明のアポトーシス誘発性物質を有効成分とする制がん剤の製造方法、用量、用法は上記アポトーシス誘発剤に準じて、製造、使用すればよい。
【０１２５】
本発明のアポトーシス誘発性物質はがん疾患等の治療薬として用いることができる。また、本発明のアポトーシス誘発性物質で表される化合物を有効成分として使用するアポトーシス誘発方法は生体防御機構、がん疾患等の研究、アポトーシス誘発阻害剤の開発等に有用である。
【０１２６】
本発明のアポトーシス誘発性物質を含有、希釈および／または添加してなる食品または飲料中には、本発明のアポトーシス誘発性物質の生理作用を発現するための有効量が含有されておればよい。本発明の食品または飲料、例えば、アポトーシス誘発用食品またはアポトーシス誘発用飲料、制がん用食品または制がん用飲料のそれぞれの製造方法には特に限定はないが、調理、加工および一般に用いられている食品または飲料の製造方法を挙げることができ、製造された食品または飲料にアポトーシス誘発作用または制がん作用を示す本発明のアポトーシス誘発性物質の有効量が含有されておればよい。３，６−アンヒドロガラクトースおよび／または還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを含有する原料を、食品または飲料の製造過程において、ｐＨ７超のアルカリで処理することにより、生成する本発明のアポトーシス誘発性物質を含有、希釈および／または添加してなる食品または飲料も本発明の食品または飲料に包含される。
【０１２７】
本発明の食品または飲料としては、本発明のアポトーシス誘発性物質が含有、添加および／または希釈されていれば特にその形状に限定は無く、タブレット状、顆粒状、カプセル状等の形状の経口的に摂取可能な形状物も包含する。
【０１２８】
本発明の食品または飲料は、そのアポトーシス誘発作用、制がん作用により、消化器系がん等の症状改善、予防に極めて有用である。
【０１２９】
式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、それらの塩、本発明のアポトーシス誘発性物質のいずれかを１００ｍｇ／ｋｇでマウスに単回経口投与しても死亡例は認められない。
【０１３０】
以上記載したように、式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、それらの塩、及び本発明のアポトーシス誘発性物質はその種々の生理的機能によって、医薬、食品、飲料等の広い分野において極めて有用な化合物である。
【０１３１】
また３，６−アンヒドロガラクトースおよび／または還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを含有する原料を、食品または飲料の製造過程において、ｐＨ７超のアルカリで処理することにより生成し、人為的に生成された式（Ｉ）で表される化合物及び／又は本発明のアポトーシス誘発物質の使用も本発明に包含されるものである。
【０１３２】
また式（Ｉ）で表される化合物とＳＨ基含有化合物、例えばＳＨ基含有アミノ酸、又はその誘導体、例えばシステイン、システイン含有アミノ酸誘導体、例えばグルタチオンとの反応物として、食品、飲料中でも生成し、人為的に生成された式（ＩＩ）で表される化合物の使用も本発明に包含されるものである。
【０１３３】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【０１３４】
実施例１ Ｌ−グリセロ−１，５−エポキシ−１αβ，６−ジヒドロキシ−シス−ヘキサ−３−エン−２−オン（ＤＧＥ）およびＤ−グリセロ−１，５−エポキシ−１αβ，６−ジヒドロキシ−シス−ヘキサ−３−エン−２−オン（κ−ＤＧＥ）の調製
（１）市販の寒天（Agar Noble、ＤＩＦＣＯ社製）２．５ｇを５０ｍｌの０．１Ｎ ＨＣｌに懸濁し、１００℃で１３分間加熱して溶解した。室温まで冷却してＮａＯＨでｐＨ中性付近に調整した後、コスモナイスフィルターでろ過し、以下の順相ＨＰＬＣで分離した。
【０１３５】
カラム：ＴＳＫｇｅｌ Ａｍｉｄｅ−８０（２１．５ｍｍ×３００ｍｍ、東ソー社製）
溶媒Ａ：９０％アセトニトリル水溶液
溶媒Ｂ：５０％アセトニトリル水溶液
流速：５ｍｌ／分
溶出：溶媒Ａから溶媒Ｂへの直線濃度勾配（８０分間）→溶媒Ｂ（２０分間）
検出：１９５ｎｍにおける吸光度
試料アプライ量：２ｍｌ
【０１３６】
保持時間６６．７分、７８．５分および８５．５分のピークを分取して質量分析を行ったところ、これらの物質は各々アガロビオース、アガロテトラオースおよびアガロヘキサオースであった。上記のＨＰＬＣによる分離を８回繰り返して減圧下乾固し、１２２ｍｇのアガロビオース、１１１ｍｇのアガロテトラオースおよび５５ｍｇのアガロヘキサオースを得た。
【０１３７】
（２）実施例１−（１）で得たアガロビオースの１００ｍＭ水溶液（試料１）６００μｌに１Ｎ ＮａＯＨ １２μｌを加えてｐＨ１１．５に調整し、３７℃で５分間保温した。次に１Ｎ ＨＣｌ １２μｌを加えてｐＨ５付近に調整し（試料２）、その内５０μｌには１Ｎ ＨＣｌ １μｌをさらに加えてｐＨ２付近に調整した（試料３）。
【０１３８】
試料１〜３のアポトーシス誘発活性として、以下の方法でそのがん細胞増殖抑制活性を測定した。その結果、各試料はほぼ同等のがん細胞増殖抑制活性を有していた。
【０１３９】
試料１〜３をそれぞれろ過滅菌して滅菌水で適宜希釈し、その１０μｌずつを９６ウェルマイクロタイタープレートに入れた。そこに５０００個のＨＬ−６０細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４０）を含む５６℃、３０分間処理した１０％ウシ胎児血清（ギブコ社製）含有ＲＰＭＩ１６４０培地（ニッスイ社製）９０μｌを加え、５％炭酸ガス存在下、３７℃で４８時間培養した。光学顕微鏡で細胞の形態を観察した後、５ｍｇ／ｍｌの３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（シグマ社製）リン酸緩衝食塩水溶液１０μｌを加えてさらに４時間培養を続け、０．０４Ｎ ＨＣｌ含有２−プロパノール１００μｌを加えてよく撹拌し、５９０ｎｍにおける吸光度を測定してこれを細胞増殖度とした。
【０１４０】
（３）実施例１−（２）記載の試料１〜３をシリカゲルシート６０Ｆ254（メルク社製）にスポットし、エタノール：１−ブタノール：水＝５：５：１を展開溶媒に用いて展開した後、オルシノール−硫酸試薬を噴霧して検出した。その結果、試料２および試料３にはアガロビオースのスポットは観察されず、数個の新たなスポットが観察された。
【０１４１】
試料１および２、各々１０μｌを以下の順相ＨＰＬＣで分離した。
【０１４２】
カラム：ＰＡＬＰＡＫ ＴｙｐｅＳ（４．６×２５０ｍｍ、宝酒造社製）
移動相Ａ：９０％アセトニトリル水溶液
Ｂ：５０％アセトニトリル水溶液
流速：１ｍｌ／分
溶出：移動相Ａ（１０分間）→移動相Ａから移動相Ｂへの直線濃度勾配
（４０分間）→移動相Ｂ（１０分間）
検出：１９５ｎｍにおける吸光度
カラム温度：４０℃
【０１４３】
この結果、試料１に見られるアガロビオースのピークは試料２には見られず、新たに複数のピークが見られた。試料２の各ピークを分取し、減圧下乾固して水に溶解し、上記方法で各画分のがん細胞増殖抑制活性を測定した。その結果、活性は保持時間４．０５分〜４．１６分の画分に存在した。
【０１４４】
以上の結果を図１に示す。すなわち図１は試料２の順相ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す図であり、図１において横軸は保持時間（分）、縦軸は吸光度を示す。
【０１４５】
（４）実施例１−（１）で調製したアガロテトラオース、アガロヘキサオースおよびκ−カラゲナンの０．１Ｎ塩酸分解物より調製したκ−カラビオースを実施例１−（２）記載の方法に準じ、アルカリ処理物を調製し、実施例１−（２）記載の方法に準じそのがん細胞増殖抑制活性を測定した。その結果、各アルカリ処理物にがん細胞増殖抑制活性が認められた。
【０１４６】
なお、κ−カラビオースは下記のように調製した。
【０１４７】
κ−カラゲナン（シグマ社製、Ｃ−１２６３）２．５ｇを５０ｍｌの０．１Ｎ ＨＣｌに懸濁し、１００℃で１６分間加熱して溶解した。室温まで冷却してＮａＯＨでｐＨ中性付近まで中和した後、コスモナイスフィルターでろ過し、実施例１−（３）記載の順相ＨＰＬＣで分離し、溶出時間２７．８分のκ−カラビオースを集めて減圧下乾固し、κ−カラビオースを調製した。
【０１４８】
（５）市販の寒天（Agar Noble）２．５ｇを５０ｍｌの０．１Ｎ ＨＣｌに懸濁し、１００℃で１３分間加熱して溶解した。室温まで冷却してＮａＯＨでｐＨ１２に調整し、次いで中和処理を行った。
【０１４９】
中和処理物を実施例１−（３）記載の順相ＨＰＬＣを行い、各ピークを分取し、減圧下乾固して水に溶解し、上記方法で各画分のがん細胞増殖抑制活性を測定し、保持時間４．０５分〜４．１６分の画分の細胞増殖抑制活性を確認した。またアポトーシス小体の形成を確認した。
【０１５０】
次に、この保持時間４．０５分〜４．１６分の画分を大量に分取し、構造解析用試料を作製した。
【０１５１】
次に、高速原子衝撃質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ）を、ＤＸ３０２質量分析計（日本電子社製）を用いて行った。また、試料を重ジメチルスルホキシドに溶解し、核磁気共鳴法（ＮＭＲ）によってその構造を解析した。その結果を以下に示す。
【０１５２】
また、保持時間４．０５分〜４．１６分の画分のマススペクトルを表す図を図２に、保持時間４．０５分〜４．１６分の画分の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを表す図を図３に示す。図２において横軸はｍ／ｚ、縦軸は相対強度（％）を示す。また図３において横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）、縦軸はシグナルの強度を示す。
【０１５３】
ＦＡＢ−ＭＳ： ｍ／ｚ １４５［Ｍ＋Ｈ］+
【０１５４】
試料をジメチルスルホキシドに溶解し、マトリックスとしてグリセロールを用いて測定した。
【０１５５】
1Ｈ−ＮＭＲ：
δ３．５０（１Ｈ，ｍ，６−Ｈ），３．５９（１Ｈ，ｍ，６−Ｈ），４．５２（１Ｈ，ｍ，５−Ｈ），４．９５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，１−Ｈ），５．０２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，６−ＯＨのＨ），６．０５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．５，１０．５Ｈｚ，３−Ｈ），７．２０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．５，１０．５Ｈｚ，４−Ｈ），７．３５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，１−ＯＨのＨ）
【０１５６】
ただし、重ジメチルスルホキシドの残留プロトンの化学シフト値を２．４９ｐｐｍとして表した。
【０１５７】
なお、1Ｈ−ＮＭＲにおけるシグナルの帰属の番号は下記式のとおりである。
【化６】
【０１５８】
以上より、保持時間４．０５分〜４．１６分の画分はＬ−グリセロ−１，５−エポキシ−１αβ，６−ジヒドロキシ−シス−ヘキサ−３−エン−２−オン（L−glycero-1,5-epoxy-1αβ,6-dihydroxy-cis-hex-3-en-2-one）（以下、単にＤＧＥと称す）であることが明らかになった。
【０１５９】
同様にしてκ−カラビオースのアルカリ処理を上記実施例に準じ行い、そのアルカリ処理から上記実施例に準じ、アポトーシス誘発活性物質であるＤ−グリセロ−１，５−エポキシ−１αβ，６−ジヒドロキシ−シス−ヘキサ−３−エン−２−オン（以下、κ−ＤＧＥと称す）を精製した。
【０１６０】
（６）寒天粉末（ナカライ社製）４５ｇを蒸留水４００ｍｌに懸濁し、さらに、１１Ｎ ＨＣｌ４．１ｍｌを加え、４５０ｍｌに蒸留水でフィルアップした。この酸性懸濁液を９０℃で３５分加熱した。その後、酸性加熱物を１０Ｎ ＮａＯＨで中和し、さらに、１Ｎ ＮａＯＨを２．７ｍｌ添加して、アルカリ性で３７℃で１５分間加熱した。このアルカリ加熱物を１Ｎ ＨＣｌで中和後、エバポレーターで１５０ｍｌまで濃縮した。この濃縮液を等量の酢酸エチルで抽出を１０回行い、１０回分の酢酸エチル層を集め、エバポレーターで２ｍｌまで濃縮した後、２０ｍｌのクロロホルム：メタノール＝９：１溶液に溶解した。この溶液をカラム容量：２５０ｍｌ、流圧：０．２Ｋｇｆ／ｃｍ２、移動相溶媒：クロロホルム：メタノール＝９：１、画分容量：８ｍｌの条件のシリカカラムクロマトグラフィーで分離した。その後、各画分の一部を薄層クロマトグラフィー（展開溶媒、クロロホルム：メタノール＝９：１）で分析し、Ｒｆ値が０．２５付近のスポットだけを含む画分５２〜７８をＤＧＥ画分として集め、エバポレーターで２ｍｌまで濃縮した。この濃縮液を再度、上記方法と同様の方法でシリカカラムクロマトグラフィーを行い、画分６４〜９６をＤＧＥ画分として集め、エバポレーターで濃縮した後、８ｍｌの蒸留水に溶解した。このＤＧＥ水溶液を凍結乾燥し、ＤＧＥ標品１１３ｍｇを得た。
【０１６１】
実施例２ アポトーシス誘発試験
（１）５６℃、３０分間処理したウシ胎児血清（ＪＲＨ社製）を１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＢＩＯ ＷＨＩＴＴＡＫＥＲ社製）にて３７℃で培養したＨＬ−６０細胞をＲＰＭＩ１６４０培地にて２．５×１０５細胞／４．５ｍｌとなるように懸濁した。
【０１６２】
この懸濁液４．５ｍｌに対し、１２５μＭ、２５０μＭ、５００μＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、４ｍＭのＤＧＥ水溶液を５００μｌ添加し、３７℃、５％炭酸ガス存在下で、２４時間培養した。
【０１６３】
培養細胞を光学顕微鏡下で観察し、最終濃度５０μＭ以上のＤＧＥ添加培養細胞に核の凝縮、細胞の縮小、アポトーシス小体の形成をそれぞれ確認した。なお、対照の生理食塩水５００μｌ添加培養細胞においてはこれらの現象は認められなかった。
【０１６４】
次いで、上記と同様の方法で２４時間と４８時間培養した細胞を用い、細胞工学別冊実験プロトコールシリーズアポトーシス実験プロトコール（秀潤社）第１２９〜１３０頁記載の方法でＦＡＣＳｃａｎを用いたアポトーシス細胞の測定、イオマニュアルＵＰシリーズ 最新アポトーシス実験法（羊土社）第６１〜６３頁記載の方法でＤＮＡの断片化の解析を行った。その結果、最終濃度５０μＭ以上のＤＧＥ添加培養細胞にアポトーシス細胞を、５０、１００μＭのＤＧＥ添加培養細胞にＤＮＡの断片化を確認した。なお、対照の生理食塩水５００μｌ添加培養細胞においてはこれらの現象は認められなかった。
【０１６５】
（２）実施例２−（１）と同様の方法で２４時間培養した細胞を一部サンプリングし、０．４％トリパンブルーで染色後、光学顕微鏡で観察し、染色されていない生細胞と青く染色された死細胞の細胞数の測定を行い、生残率が５０％になるＤＧＥの濃度［生残率５０（μＭ）］をもとめた。その結果、８１．７μＭであった。以上のとおり、ＤＧＥはアポトーシス誘発作用によるがん細胞増殖抑制活性を示した。また、κ−ＤＧＥも同様の活性を示した。
【０１６６】
実施例３ 過酸化脂質ラジカル産生抑制試験
スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）３Ａ（ナショナル・コレクション・オブ・タイプ・カルチャー、ＮＣＴＣ ８３１９）を５ｍｌのブレインハートインフュージョン培地（ディフコ社製、００３７−１７−８）に接種し、３７℃で１晩培養した。遠心によって菌体を集め、リン酸緩衝食塩水で３回洗浄した後、１×１０７コロニー形成単位／ｍｌになるようにリン酸緩衝食塩水に懸濁した。１００μｌの上記菌懸濁液、１００μｌの１０、１００ｍＭのＤＧＥ水溶液、１００μｌの１ｍｇ／ｍｌメトヘモグロビン（シグマ社製、Ｍ９２５０）水溶液および６００μｌのリン酸緩衝食塩水および１００μｌの５０ｍＭ ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド（片山化学社製、０３−４ ９９０）水溶液を混合して３７℃で３０分間反応させた。１ｍｌの２×ＮＭＰ培地［８ｇのニュートリエントブロス（ディフコ社製、０００３−０１−６）、５ｇのトリプトン（ディフコ社製、０１２３−１７−３）、５ｇのＮａＣｌ、１０ｇのマンニトール（ナカライテスク社製、２１３−０３）、０．０３５ｇのフェノールレッド（ナカライテスク社製、２６８−０７）を蒸留水に溶解して５００ｍｌとし、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整後、ろ過滅菌したもの］を加えて反応を停止し、ＮＭＰ培地（２×ＮＭＰ培地を滅菌水で２倍希釈したもの）で３倍ずつ１２段階希釈したもの各１６０μｌを９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルに入れ、３７℃で１晩培養した。培地の色を肉眼で観察し、菌が生育して培地が赤色から黄色に変化したウェルが見られた試料を過酸化脂質ラジカル産生抑制活性を持つものとした。
【０１６７】
その結果を表１に示す。表１において、＋は菌の生育したウェルが見られた試料を、−は菌の生育したウェルが見られなかった試料を示す。また、表の最上列に示した濃度はｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシドおよび菌体と３７℃で３０分間反応させた反応液中のＤＧＥの濃度である。
【０１６８】
【表１】
【０１６９】
以上の結果、ＤＧＥには過酸化脂質ラジカル産生抑制活性が見られた。また、κ−ＤＧＥ、後出のＤＧＥ−ＧＳＨも同様の活性を示した。
【０１７０】
実施例４ ＮＯ産生抑制試験
（１）１０％ウシ胎児血清（ギブコ社製）含有、フェノールレッド不含、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（ライフテックオリエンタル社製、２５０３０−１４９）含有ダルベッコ改良イーグル培地（バイオウィタカー社製、１２−９１７Ｆ）にＲＡＷ２６４．７細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ ７１）を３×１０５細胞／ｍｌになるように懸濁し、４８ウェルマイクロタイタープレートのウェルに５００μｌずつ加えて５％炭酸ガス存在下、３７℃で１２時間培養した。各ウェルに１０μｌの２５μｇ／ｍｌリポポリサッカライド（ＬＰＳ、シグマ社製、Ｌ−２０１２）、５００Ｕ／ｍｌインターフェロンγ（ＩＮＦ−γ、コスモバイオ社販売 ＧＺＭ−ＭＧ−ＩＦＮ）水溶液と１０μｌの２５０、５００μＭ ＤＧＥ水溶液を添加してさらに１２時間培養した後、ＮＯが培地中で酸化されることによって生ずるＮＯ２−濃度の測定を行った。なお、対照としてＬＰＳとＩＮＦ−γを加えない区分およびＤＧＥを加えない区分を設定した。
【０１７１】
上記培養後、１００μｌの培地に１００μｌの４％グリース試薬（シグマ社製、Ｇ４４１０）を加え、室温で１５分間放置した後、４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。上記培地に溶解した既知の濃度のＮａＮＯ２で作製した検量線から培地中のＮＯ２−濃度を計算した。測定はすべて３連で行った。
【０１７２】
この結果、ＤＧＥは濃度依存的にＬＰＳとＩＮＦ−γによるＮＯ産生誘導を抑制した。その結果を図４に示す。すなわち、図４はＤＧＥを添加して各培養条件で培養した時の培地中のＮＯ２−濃度を示す図である。図４において横軸は培養条件を、縦軸はＮＯ２−濃度（μＭ）を示す。
【０１７３】
また、上記と同様の培養条件で、４、６、８時間培養したＲＡＷ２６４．７細胞よりＲＮＡを調製し、該ＲＮＡ中に含有されるｉＮＯＳ［inducible NO synthase、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション（Biochem. Biophys. Res. Commun.) 第215巻、第148-153頁（1995)］をコードするｍＲＮＡ量をＲＴ−ＰＣＲ法により調べた。その結果、ＤＧＥ水溶液を加えない対照ではｉＮＯＳ ｍＲＮＡ由来のＤＮＡ断片の増幅が認められたが、ＤＧＥ水溶液を添加したものではこの断片の増幅が見られなかった。このことより、ＤＧＥによるＮＯ産生抑制はｉＮＯＳの転写抑制を介して起こっていることが示唆された。
【０１７４】
（２）１０％ウシ胎児血清含有、フェノールレッド不含、２ｍＭ Ｌ−グルタミン含有ダルベッコ改良イーグル培地にＲＡＷ２６４．７細胞を３×１０５細胞／ｍｌになるように懸濁し、４８ウェルマイクロタイタープレートのウェルに５００μｌずつ加えて５％炭酸ガス存在下、３７℃で６時間培養した。ＤＧＥを０．５ｍＭとなるように水に溶解し、ろ過滅菌した水溶液を、各ウェルに１０μlずつそれぞれ添加し、さらに、０．５時間あるいは５時間培養した。その後、各ウェルに１０μlの５μｇ／ｍｌ ＬＰＳ、２０００Ｕ／ｍｌ ＩＮＦ−γ水溶液を添加して、１２時間培養した後、ＮＯが培地中で酸化されることによって生ずるＮＯ２−濃度の測定を行った。なお、対照としてＬＰＳ、ＩＦＮ−γを加えない区分およびＤＧＥを加えない区分を設定した。
【０１７５】
上記培養後、１００μｌの培養上清に１００μｌの４％グリース試薬を加え、室温で１５分間放置した後、４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。上記培地に溶解した既知の濃度のＮａＮＯ２で作製した検量線から培地中のＮＯ２−濃度を計算した。
【０１７６】
測定は全て３連で行った。
【０１７７】
この結果、ＬＰＳ、ＩＦＮγ添加前、ＤＧＥ存在下０．５時間培養した区分より、５時間培養した区分で、より強いＮＯ産生抑制が認められた。
【０１７８】
その結果を、図５に示す。すなわち、図５は前培養においてＤＧＥを添加した場合の、各培養条件下で培養した時の培地中のＮＯ２−濃度を示す図である。図５において横軸は培養条件を、縦軸はＮＯ２−濃度（μＭ)を示す。
【０１７９】
以上、ＤＧＥはＮＯ産生抑制作用を示した。また、κ−ＤＧＥも同様の活性を示した。
【０１８０】
実施例５ 抗菌試験
ＤＧＥのエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｗ３１１０（菌１）、サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium)ＬＴ２（菌２）、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis)ＩＦＯ３０２１（菌３）、シュードモナス・アエルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa)ＩＦＯ３０８０（菌４）およびストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans)ＧＳ５（菌５）に対する抗菌作用を以下の方法で検討した。
【０１８１】
菌１から４はＬ−ブロスで一晩種培養し、その培養液の濁度を測定して菌数が約２×１０５細胞／１８０μｌとなるように感受性ブイヨン培地（ニッスイ社製）に希釈した。一方、菌５は、ブレインハートインフュージョン培地で一晩種培養し、その培養液の濁度を測定して菌数が約２×１０５細胞／１８０μｌとなるようにブレインハートインフュージョン培地に希釈した。これらの菌希釈液を９６ウェルのマイクロタイタープレートの各ウェルに１８０μｌずつ入れた。一方で、菌希釈液をさらに希釈してからＬ−ブロスあるいはブレインハートインフュージョン培地のプレートに塗布し、３７℃で一晩培養し、コロニー数を計測して、初発の生菌数を測定した。
【０１８２】
１４．４ｍｇ／ｍｌのＤＧＥを２倍ずつ希釈した一連の希釈液を作製し、菌希釈液を入れた各ウェルに２０μｌずつ入れ、２４時間３７℃で静置培養した。培養後、それぞれの培養液の濁度を測定し、生理食塩水を添加したコントロールより濁度が低いウェルの試料濃度を最小増殖阻害濃度とした。
【０１８３】
さらに、菌の生育が見られなかったウェルの培養液をプレートに塗布し、３７℃で一晩培養した後、コロニー数を計測して、生菌数を測定した。試料を添加してから２４時間静置培養した培養液の生菌数が、あらかじめ測定しておいた初発の生菌数より低い培養液の試料濃度を最小殺菌濃度とした。その結果、菌１から菌５に対するＤＧＥの最小増殖阻害濃度と最小殺菌濃度は、表２に示すようになった。
【０１８４】
【表２】
【０１８５】
以上、ＤＧＥは抗菌作用を示した。また、κ−ＤＧＥ、後出のＤＧＥ−ＧＳＨも同様の活性を示した。
【０１８６】
実施例６ 抗変異原性試験
抗変異原性試験を、変異の強さをβ−ガラクトシダーゼの活性で判定できるｕｍｕテストによる環境変異原の検出法［ミューテーション・リサーチ（Mutation reseach）、第１４７巻、第２１９頁（１９８５）］に準じた方法で行った。すなわち、５０μｌの各濃度（１．０、５．０、１０、１５ｍＭ）に調製したＤＧＥに２５μｌの変異原物質［マイトマイシンＣ（ＤＮＡ架橋剤）１０μｇ／ｍｌ、４−ニトロキノリン−１−オキシド（ＮＱＯ、ＤＮＡメチル化剤）７μｇ／ｍｌ］を添加した。この混合液にあらかじめＴＧＡ培地中でＯＤ６００で０．１２まで培養しておいたSalmonella typhimulium ＴＡ１５３５／ｐＳＫ１００２を最終容量１．５ｍｌになるように加えて、３７℃で２時間振とう培養を行った。この培養液２００μｌを使用してミラー（Miller）の方法〔エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティクス（Experiments in molecular genetics)、第３５２頁（１９７２）］に従ってβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。その結果を表３に示す。
【０１８７】
【表３】
【０１８８】
この表から明らかな様に、ＤＧＥはＤＮＡ架橋剤であるマイトマイシンＣに対して最終濃度０．５ｍＭで３７％、メチル化剤であるＮＱＯについては３６％の抗変異原活性を表した。また、κ−ＤＧＥ、後出のＤＧＥ−ＧＳＨも同様の活性を示した。
【０１８９】
実施例７ 制がん活性試験
（１）寒天粉末（和光純薬社製）を終濃度３％となるように５０ｍＭクエン酸溶液に入れ、９５℃、１６０分の加熱処理を行い、用時ｐＨ１２のアルカリ処理を行い、中和後、制がん試験用の被検液とした。
【０１９０】
日本チャールスリバー社より４週令、雄性のヌードマウス（ＳＰＦ／ＶＡＦＢａｌｂ／ｃＡｎＮＣｒｊ−ｎｕ）を購入し、１週間予備飼育した。このマウスにヒト大腸がん細胞株ＨＣＴ１１６（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４７）を１．５× １０６細胞／マウスとなるように皮下移植した。
【０１９１】
大腸がん細胞株移植２週間目から、上記制がん試験用被検液を使用直前にｐＨ６．５に調整したものを週に５日、飲料水として自由に摂取させた。マウス１匹当り１日平均３．５ｍｌ摂取していた。また飼育用餌としてオリエンタル酵母社製のＭＦを自由に摂取させた。
【０１９２】
被検液投与開始後４週間目に被検液投与群の各マウスの固形がんを摘出し、その重量を、通常の飲料水を摂取させた対照群の固形がん重量と比較した。なお、本試験は各群１０匹で行った。
【０１９３】
その結果、制がん試験用被検液の経口投与群において有意のがん増殖抑制が認められた。
【０１９４】
（２）５週齢の雌性ｄｄＹ系マウス（体重約２５ｇ）１８匹を用い、エーリッヒ癌を腹腔内投与（１．２×１０６細胞／マウス）し、３０日間観察し、平均生存日数、延命率および３０日間生存数を算定した。１群６匹でコントロール群、ＤＧＥ２ｍｇ／ｋｇ投与群およびＤＧＥ２０ｍｇ／ｋｇ投与群の３群を設定した。ＤＧＥは、癌投与の翌日より４日間腹腔内投与した。
【０１９５】
結果を表４に示す。すなわち、コントロール群では平均生存日数が１４．３日であったのに対し、ＤＧＥ２ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇ投与群では３０日間生存例をそれぞれ１および３例出現させ、平均生存日数２３．７日および２８．０日で延命率はそれぞれ１４１％以上および１９５％以上と、顕著な延命効果が認められた。
【０１９６】
【表４】
【０１９７】
以上、ＤＧＥは制がん活性を示した。またκ−ＤＧＥ、後出のＤＧＥ−ＧＳＨも同様の活性を示した。
【０１９８】
実施例８ メラニン産生抑制試験
６ウェルプレートに５×１０４細胞／ウェル／２ｍｌ培地となるように１０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁したマウスメラノーマ細胞Ｂ１６ＢＬ６を分注し、３７℃でインキュベートした。２日目に、１００μｌのＤＧＥ溶液（２ｍｇ／ｍｌ〜０．２ｍｇ／ｍｌ）を添加し、７日目に培地を交換し、同時に１００μｌのＤＧＥ溶液（２ｍｇ／ｍｌ〜０．２ｍｇ／ｍｌ）を添加した。８日目に細胞を回収し、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質を分解処理した後、４００ｎｍの吸光度を測定し、メラニン産生抑制作用を検定した。
【０１９９】
すなわち、培地を吸引除去した後、２０ｍＭ ＥＤＴＡ溶液に溶解した０．２５％トリプシンを１ウェル当り０．３ｍｌ添加し、３７℃で１０分インキュベートした。つぎに、２ｍｌの新しい培地を添加し、細胞を懸濁して試験管に回収した。ついで、培地を遠心除去した後、２ｍｌのＰＢＳで細胞を懸濁し、再度遠心分離した。上清を除去した後、細胞に３０μｌの５ｍＭ塩化マンガンを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）と１μｌの７００００Ｕ／ｍｌのＤＮａｓｅＩ（宝酒造社製）を加えて良く混合した後、３７℃で２時間インキュベートして、ＤＮＡを分解した。そして１０ｍｇ／ｍｌのリボヌクレアーゼＡ（シグマ社製）を１μｌ加え、５０℃で１時間インキュベートしてＲＮＡを分解した。最後に１００μｇ／ｍｌのプロテイネースＫ（シグマ社製）、０．１％トリトンＸおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む１００ｍＭトリス−塩酸バッファー（ｐＨ７．８）を細胞数２×１０６に対して液の総量が２００μｌとなるように加え、３７℃で１６時間インキュベートした後、４００ｎｍの吸光度を測定した。
【０２００】
その結果、ＤＧＥにメラニン産生阻害活性が認められ、その美白効果が確認された。また、κ−ＤＧＥ、後出のＤＧＥ−ＧＳＨも同様の活性を示した。
【０２０１】
実施例９ α−グルコシダーゼ阻害試験
（１）α-グルコシダーゼ発色基質であるｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−グルコピラノシドに酵母由来α−グルコシダーゼを作用させ、加水分解して遊離する４−ニトロフェノールを比色法で定量することにより、ＤＧＥのα-グルコシダーゼ阻害活性を測定した。すなわち、１０μｌのα−グルコシダーゼ溶液［４０ｍＵ／ｍｌ、S. cerevisiae由来、シグマ社製、１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．２（３７℃）に溶解］に１０μｌの検体を含む溶液［１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．２（３７℃）に溶解］を混合した後、１．５ｍｇ／ｍｌの基質溶液［シグマ社製、１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．２（３７℃）に溶解］を８０μl添加して反応を開始した。３７℃で４０分間反応後、４１０ｎｍ（島津ｕｖ２２００）における吸光度を測定した。その結果を表５に示す。なお、この場合の残存活性は検体を添加していないものを１００％として算出した。
【０２０２】
【表５】
【０２０３】
上記の結果より、ＤＧＥはα−グルコシダーゼ阻害活性を示し、ＤＧＥがα−グルコシダーゼ活性を５０％阻害する濃度（ＩＣ５０）は５００μＭであった。
【０２０４】
（２）ラット小腸粘膜より得たα-グルコシダーゼ粗酵素標品［Arne Dahlqvist, Anal. Biochem,７，１８−２５（１９６４）の方法により調製］を用いたＤＧＥのα-グルコシダーゼ阻害活性測定は以下の方法で行なった。
【０２０５】
酵素反応は１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０で適宜希釈した被験物質溶液１０μlに、８０μlの基質としてのシュークロース、マルトース、トレハロースおよび可溶性デンプンの同緩衝液溶液を最終濃度１００ｍＭ（可溶性デンプンについては０．５％）になるように加え、１０μlのラット小腸より調製した粗酵素液を添加し、３７℃で２０分間反応させた。
【０２０６】
酵素反応量は上記反応液に含まれるグルコース量として、グルコース測定用試薬（和光純薬社製）を３ｍｌ加え、３７℃で５分間反応させた後５０５ｎｍの吸光度を測定することにより求めた。
【０２０７】
α−グリコシダーゼによる各基質の分解に対するＤＧＥの阻害活性を、４種の異なったＤＧＥ濃度について上記方法により測定した。α−グリコシダーゼ阻害活性は、ＤＧＥ無添加の対照を１００％とした相対活性（％）として表した。
【０２０８】
結果を表６に示す。
【０２０９】
【表６】
【０２１０】
ＤＧＥのシュークロースに対する阻害物質定数（Ｋｉ）をＤｉｘｏｎ ｐｌｏｔより求めたところ、６．０ｍＭであった。
【０２１１】
さらに、ＤＧＥはシュークロースを基質とした際に、マルトース等を基質とした時より強いα−グリコシダーゼ阻害作用を示した。また、κ−ＤＧＥ、後出のＤＧＥ−ＧＳＨも同様のα−グリコシダーゼ阻害活性を示した。
【０２１２】
実施例１０ 抗リウマチ試験
ヒト慢性リウマチ患者の滑膜から樹立された繊維芽細胞株であるＤＳＥＫ細胞（in vitroでのリウマチモデルとして、埼玉医科大学総合医療センター第二内科保有）を１０％ＦＢＳ（バイオウイタッカー社製）を含むＩｓｃｏｖ−ＭＥＭ培地（ＩＭＤＭ：ギブコＢＲＬ社製）にて、５％ＣＯ２存在下、３７℃で細胞が培養器に飽和になるまで培養し、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（バイオウイタッカー社製）で細胞を３×１０４細胞／ｍｌとなるように上記培地に懸濁し、９６ウェルマイクロタイタ−プレ−ト（ＦＡＬＣＯＮ社製）の各ウエルに２００μｌずつ分注した。培養５〜７日後、ほぼ細胞が８０％飽和になった時で培地を交換し、２５、５０、７５、１００、２００、もしくは４００μＭのＤＧＥを含有する２００μｌの上記培地を加えた。
【０２１３】
２４時間、７２時間経過時に１０μｌのプレミックスＷＳＴ−１（宝酒造社製、ＭＫ４００）を加えて３７℃で３．５時間反応させ、４５０ｎｍにおける吸光度（Ａ４５０）から６５０ｎｍにおける吸光度（Ａ６５０）を差し引いた値を細胞増殖度とした。
【０２１４】
その結果を表７に示す。
【０２１５】
【表７】
【０２１６】
またＡ４５０−６５０のデータによって求められた半数細胞増殖抑制濃度(ＩＣ５０)は２４時間で２０７μＭ、７２時間で１１２μＭであった。
以上、イン ビトロ（in vitro）でのリウマチモデル−ＤＳＥＫ細胞において、ＤＧＥを添加した場合、ＰＢＳ添加の対照区と比べて各化合物添加区はリウマチ細胞の増殖が強く抑制された。また、経時的な観察において、これらの化合物は増殖抑制活性を継続するのみならず、経時的に活性を増強する傾向が認められた。
【０２１７】
以上の結果によって、ＤＧＥは強い抗リウマチ活性があり、慢性リウマチに対する有用な治療薬と健康食品として開発されることが期待される。また、κ−ＤＧＥ、後出のＤＧＥ−ＧＳＨも同様の活性を示した。
【０２１８】
また、ＤＳＥＫ細胞培養において、２４時間、７２時間経過時に１５０μｌ／ウエルの培養上清を回収し、この細胞由来のサイトカン（ヒトＴＧＦ−β、ヒトＦＧＦ−β、ヒトＩＬ−１αおよびヒトＩＬ−１０）産生（発現の影響）に対する、ＤＧＥの影響を、それぞれのサイトカインに特異的なＥＬＩＳＡ−Ｋｉｔ（ヒトＦＧＦ−βとヒトＩＬ−１０、INTERGEN社製；ヒトＩＬ−１αとヒトＴＧＦ−β、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて測定した。
【０２１９】
その結果、ＤＧＥはヒトＩＬ−１αの産生抑制作用、ヒトＩＬ−１０の産生増強作用、ヒトＦＧＦ−βの産生抑制作用、およびヒトＴＧＦ−βの産生増強作用を示した。
【０２２０】
実施例１１ プロスタグランジンＥ２産生抑制試験
１０％ウシ胎児血清含有ダルベッコ改良イーグル培地にＲＡＷ２６４．７細胞を３×１０５細胞／ｍｌになるように懸濁し、４８ウェルマイクロタイタープレートのウェルに５００μlずつ加えて５％炭酸ガス存在下、３７℃で６時間培養した。ＤＧＥを０．５ｍＭとなるように水に溶解し、ろ過滅菌した水溶液を、各ウェルに１０μlずつ添加し、さらに、０．５時間あるいは５時間培養した。その後、各ウェルに５０μg／ｍｌ ＬＰＳ水溶液１０μlを添加して、１２時間培養した後、プロスタグランジンＥ２の量を測定した。なお、対照としてＬＰＳを加えない区分およびＤＧＥを加えない区分を設定した。
【０２２１】
上記培養後、培養上清中のプロスタグランジンＥ２量をプロスタグランジン Ｅ２ ＥＬＩＳＡ ＫＩＴ（ネオジェン社製、Code．404110）を用い測定した。測定は全て３連で行った。
【０２２２】
その結果を、図６に示す。すなわち、図６は前培養においてＤＧＥを添加した場合の、各培養条件下で培養した時の培地中のプロスタグランジンＥ２濃度を示す図である。図６において横軸は培養条件を、縦軸はプロスタグランジンＥ２濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。
【０２２３】
この結果、ＤＧＥはＬＰＳによるプロスタグランジンＥ２産生誘導を抑制した。また、ＬＰＳ添加前、ＤＧＥ存在下０．５時間培養した区分より、５時間培養した区分で、より強いプロスタグランジンＥ２産生抑制が認められた。
【０２２４】
実施例１２ 熱ショックタンパク質の誘導試験
２×１０５細胞／ｍｌのＨＬ−６０細胞を含む１０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地５ｍｌを６ウェルプレートの各ウエルに入れ、３７℃ ５％ＣＯ２存在下で２４時間培養した後、最終濃度が、０、６．２５、１２．５、２５、５０、１００μＭになるようにＤＧＥを添加し、更に６時間培養を続けた。
【０２２５】
培養終了後、細胞数を計測した後、細胞を遠心分離で回収し、ＰＢＳで洗浄して、ＤＧＥ処理細胞を調製した。また、４５℃１０分間熱処理を行った後、同様に培養した細胞も調製した。
【０２２６】
これらの処理細胞を用い、モレキュラー クローニング（Molecular Cloning)〔コールド スプリング ハーバー ラボラトリー プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press)（ 1989 ）〕記載の方法に従ってSDS-PAGEを行った。処理細胞を、２．５×１０６細胞／ｍｌになるようにSDS-PAGE Sample bufferに懸濁し、この細胞懸濁液を１００℃で１０分間処理した後、５μｌずつを２枚のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（５％スタッキングゲル、１０％セパレーションゲル）にアプライし、電気泳動を行った。一方のゲルは、クマシー染色し、他方のゲルは、ポリビニリデンジフルオライドトランスファー膜（Polyvinylidene difluoride transfer membrane）〔ImmobilonTM ：ミリポア（MILLIPORE）社製 Cat.# IPVH000-10 〕にブロッティングした。この膜をBlock Ace （大日本製薬株式会社 Cat.# UK-B25 ）で４℃にて一晩ブロッキングした。
【０２２７】
このブロッキングしたメンブレンに熱誘導される７０ｋＤａの熱ショックタンパクと特異的に反応するモノクローナル抗体ＨＳＰ７２／７３（Ａｂ−１）（オンコジーン リサーチ プロダクツ（Oncogene Research Products）社製 Cat.# HSP01）を反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳで洗浄し、更に、ＴＢＳで洗浄した。次いで、ペルオキシダーゼ複合二次抗体ＨＲＴ−ウサギ抗マウスＩｇＧ (H+L)（ZYMED ラボラトリース社（ZYMED Laboratolies, Inc.）製 Cat.# 61-6520）を反応させ、先の操作と同様に洗浄した。このように一次抗体、二次抗体と反応させたメンブレンに、ケミルミノール試薬 ルネッサンスTM （デュポン NEN (Dupont NEN ）社製 Cat.# NEL-100)を反応させた後、Ｘ−線フィルムを感光して７０ｋＤａの熱ショックタンパクの誘導を確認した。
【０２２８】
その結果、ＤＧＥの７０ｋＤａの熱ショックタンパクの誘導が確認された。その誘導の強弱を表８に示す。なお表１中、＋は誘導の強さを表し、＋が多いほど誘導が強いことを意味する。また−は誘導が認められなかったことを意味する。
【０２２９】
また、κ−ＤＧＥ、後出のＤＧＥ−ＧＳＨも同様の熱ショックタンパク誘導活性を示した。
【０２３０】
【表８】
【０２３１】
実施例１３ ５−Ｌ−グルタチオン−Ｓ−イル−２−ヒドロキシ−３，７−ジオキサビシクロ[２．２．２]オクタン−１−オール（ＤＧＥ−ＧＳＨ）の調製
（１）ＤＧＥと還元型グルタチオン（ＧＳＨ：ナカライテスク社製）をそれぞれ２０ｍＭになるようにＰＢＳに溶解し、３７℃で一晩反応させた。この反応液１００μlを順相カラムPAL-PAK TypeSにて分画した。流速１ｍｌ／分、０〜１０分間は０．１％ＴＦＡ含有９０％アセトニトリル水溶液、１０〜５０分間は０．１％ＴＦＡ含有９０％アセトニトリル水溶液から０．１％ＴＦＡ含有５０％アセトニトリル水溶液への直線勾配、検出１９５ｎｍの条件でクロマトグラフィーを行い、１．５分ごとに画分を集めた。各画分を濃縮乾固し、５０μｌの蒸留水に再溶解し、ＨＬ−６０細胞を用いて実施例１−（２）と同様の方法でがん細胞増殖抑制活性を測定した。その結果、３０〜４０付近の画分を添加した区分において、アポトーシス小体が観察され、対照の水添加区分に比べて５９０ｎｍにおける吸光度が低く、細胞増殖が阻害されていた。そこで、上記方法と同様の方法で調製した活性画分５０μlを逆相クロマトグラフィー（TSKgel ODS-80Ts(５μｍ)、東ソー社製、４．６×２５０ｍｍ）で分画した。流速１ｍｌ／分、０〜１５分間は０．１％ＴＦＡ含有蒸留水、１５〜３０分間は０．１％ＴＦＡ含有蒸留水から０．１％ＴＦＡ含有５０％アセトニトリル水溶液への直線勾配、３０〜４５分間は０．１％ＴＦＡ含有５０％アセトニトリル水溶液、検出２１５ｎｍの条件でクロマトグラフィーを行い、１．５分ごとに画分を集めた。各画分を濃縮乾固し、５０μｌの蒸留水に再溶解し、ＨＬ−６０細胞を用いて実施例１−（２）と同様の方法でがん細胞増殖抑制活性を測定した。その結果、４〜９分付近の画分を添加した区分において、アポトーシス小体が観察され、対照の水添加区分に比べて５９０ｎｍにおける吸光度が低く、細胞増殖が阻害され、アポトーシス誘発活性が示された。
【０２３２】
そこで前出の順相クロマトグラフィーを１０回繰り返し、当該アポトーシス誘発活性画分を分取し、濃縮乾固後、１ｍｌの蒸留水に再溶解し順相クロマトグラフィーによる精製画分を調製した。次にこの順相クロマトグラフィーによる精製画分を前出の逆相クロマトグラフィーにかけ、アポトーシス誘発活性画分を分取し、濃縮乾固した。その結果、２０ｍＭＤＧＥと２０ｍＭグルタチオンの反応液１ｍｌから５ｍｇのアポトーシス誘発活性化合物が得られた。この化合物を用い構造決定を行った。
【０２３３】
（２）実施例１３−（１）で得られたアポトーシス誘発性物質、すなわちＤＧＥとグルタチオンの反応物の質量分析をＤＸ３０２質量分析計を用いて行った。また、試料を重水に溶解し、核磁気共鳴法（ＮＭＲ）によってその構造を解析した。その結果を以下に示す。
【０２３４】
また、実施例１３−（１）で得られたアポトーシス誘発性物質のマススペクトルを表す図を図７に、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを表す図を図８に、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを表す図を図９示す。図７において横軸はｍ／ｚ、縦軸は相対強度（％）を示す。また、図８、９において横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）、縦軸はシグナルの強度を示す。
【０２３５】
ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ ４５２［Ｍ＋Ｈ］＋
４７４［Ｍ＋Ｎａ］＋
５４４［Ｍ＋グリセロール＋Ｈ］＋
５６６［Ｍ＋グリセロール＋Ｎａ］＋
マトリックスとしてグリセロールを用いた。
【０２３６】
１Ｈ−ＮＭＲ：
δ１．６２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１３．５Ｈｚ，６−Ｈ）、１．９６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．０，１３．５Ｈｚ，６−Ｈ）、２．０７（２Ｈ，ｍ，５'−Ｈ）、２．４２（２Ｈ，ｍ，４'−Ｈ）、２．８５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．５，１３．５Ｈｚ，１'−Ｈ）、２．９０（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝４．０，１０．５，１３．５Ｈｚ，５−Ｈ）、３．０６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．０，１３．５Ｈｚ，１'−Ｈ）、３．４４（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝５．０，１０．５Ｈｚ，４−Ｈ）、３．５２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ，Ｈ−８）、３．６６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．０，１０．５Ｈｚ，Ｈ−８）、３．８２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，６'−Ｈ）、３．８８（２Ｈ，Ｓ，９'−Ｈ）、４．４７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．０，８．５Ｈｚ，２'−Ｈ）、４．６５（１Ｈ，Ｓ，２−Ｈ）
但し、１Ｈ−ＮＭＲの化学シフト値はＨＯＤの化学シフト値を４．６５ｐｐｍとして表した。
【０２３７】
１３Ｃ−ＮＭＲ：
δ２６．６（５'−Ｃ）、３１．９（４'−Ｃ）、３２．７（１'−Ｃ）、３５．６（６−Ｃ）、４２．０（９'−Ｃ）、４５．２（５−Ｃ）、５３．９（６'−Ｃ）、５４．４（２'−Ｃ）、６４．７（８−Ｃ）、７０．４（４−Ｃ）、９２．１（２−Ｃ）、９７．２（１−Ｃ）、１７３．４（７'−Ｃ）、１７３．５（８'−Ｃ）、１７３．８（１０'−Ｃ）、１７５．４（３'−Ｃ）
但し、１３Ｃ−ＮＭＲの化学シフト値はジオキサンの化学シフト値を６７．４ｐｐｍとして表した。
【０２３８】
なお、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲのピークの帰属の番号は下記式のとおりである。
【化７】
【０２３９】
以上より、実施例１３−（１）で得られたアポトーシス誘発性物質は、５−Ｌ−グルタチオン−Ｓ−イル−２−ヒドロキシ−３，７−ジオキサビシクロ[２．２．２]オクタン−１−オール（5-L-glutathion-S-yl-2-hydroxy-3,7-dioxabicyclo[2.2.2]octane-1-ol（以下、単にＤＧＥ−ＧＳＨと称す）であることが明らかになった。
【０２４０】
実施例１４ アポトーシス誘発試験
実施例１３−（１）で得たＤＧＥ−ＧＳＨの１０ｍｇ／ｍｌ水溶液をろ過滅菌し、滅菌水で２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１２８倍、２５６倍及び５１２倍希釈した。実施例１−（２）記載の方法でこれらの希釈液のＨＬ−６０細胞に対する増殖抑制活性を測定した。その結果、ＤＧＥ−ＧＳＨを添加した区分において、アポトーシス小体が観察され、対照の水添加区分に比べて５９０ｎｍにおける吸光度が低く、細胞増殖が阻害されていた。この結果をもとに５９０ｎｍにおける吸光度が水添加の対照に比べて２分の１となる５０％増殖阻害濃度を算出しＧＩ５０として表すと、ＧＩ５０は約４８．７μｇ／ｍｌとなった。
【０２４１】
実施例１５ ＮＯ産生抑制試験
１０％ウシ胎児血清含有、フェノールレッド不含、２ｍＭ Ｌ−グルタミン含有ダルベッコ改良イーグル培地にＲＡＷ２６４．７細胞を３×１０５細胞／ｍｌになるように懸濁し、４８ウェルマイクロタイタープレートのウェルに５００μｌずつ加えて５％炭酸ガス存在下、３７℃で１２時間培養した。各ウェルに１０μｌの５０μｇ／ｍｌリポポリサッカライド、５０００Ｕ／ｍｌインターフェロンγ水溶液と実施例１３−（１）で調製したＤＧＥ−ＧＳＨを１ｍＭとなるように水に溶解しろ過滅菌した水溶液１０μｌを添加して更に１６時間培養した後、ＮＯが培地中で酸化されることによって生ずるＮＯ２−濃度の測定を行った。なお、対照としてＬＰＳとＩＦＮγを加えない区分及びＤＧＥ−ＧＳＨを加えない区分を設定した。
【０２４２】
上記培養後、１００μlの培地に１００μlの４％グリース試薬（シグマ社製、Ｇ４４１０）を加え、室温で１５分間放置した後、４９０ｎmにおける吸光度を測定した。上記培地に溶解した既知の濃度のＮａＮＯ２で作製した検量線から培地中のＮＯ２−濃度を計算した。
【０２４３】
その結果、全く何も添加しなかった培地中のＮＯ２−濃度が４．６μＭであり、ＬＰＳとＩＦＮγを添加し、ＤＧＥ−ＧＳＨを添加しなかったコントロールの培養液中のＮＯ２−濃度が１２．１μＭであったのに対し、ＤＧＥ−ＧＳＨを添加した培養液中のＮＯ２−濃度は、９．４μＭと低く、ＤＧＥ−ＧＳＨは、ＬＰＳとＩＦＮγによるＮＯ産生誘導を抑制した。
【０２４４】
実施例１６ プロスタグランジンＥ２産生抑制試験
１０％ウシ胎児血清含有、フェノールレッド不含、２ｍＭ Ｌ−グルタミン含有ダルベッコ改良イーグル培地にＲＡＷ２６４．７細胞を３×１０５細胞／ｍｌになるように懸濁し、４８ウェルマイクロタイタープレートのウェルに５００μｌずつ加えて５％炭酸ガス存在下、３７℃で１２時間培養した。各ウェルに１０μｌの５０μｇ／ｍｌリポポリサッカライド水溶液と実施例１３−（１）で調製したＤＧＥ−ＧＳＨを１ｍＭとなるように水に溶解し、ろ過滅菌した水溶液１０μｌを添加して更に１６時間培養した後、プロスタグランジンＥ２の量を測定した。なお、対照としてＬＰＳを加えない区分及びＤＧＥ−ＧＳＨを加えない区分を設定した。
【０２４５】
上記培養後、培養上清中のプロスタグランジンＥ２量をプロスタグランジン Ｅ２ ＥＬＩＳＡ ＫＩＴ（ネオジェン社製、Code．404110）を用い測定した。
【０２４６】
その結果、全く何も添加しなかった培地中のプロスタグランジンＥ２濃度が５０．３ｎｇ／ｍｌであり、ＬＰＳを添加し、ＤＧＥ−ＧＳＨを添加しなかったコントロールの培養液中のプロスタグランジンＥ２濃度が６３．４ｎｇ／ｍｌであったのに対し、ＤＧＥ−ＧＳＨを添加した培養液中のプロスタグランジンＥ２濃度は、５０．７ｎｇ／ｍｌと低く、ＤＧＥ−ＧＳＨは、ＬＰＳによるプロスタグランジンＥ２産生誘導を抑制した。
【０２４７】
実施例１７ リンパ球活性化阻害試験
ｄｄＹマウス（雌、７週齢、体重約２５ｇ）は日本ＳＬＣより購入し、１週間の予備飼育の後、実験に用いた。マウスより脾臓を摘出し、細かく粉砕して１０％牛胎児血清（ハイクローン社製）を含んだＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁して単細胞液を得た。接着性細胞をプラスチックシャーレに接着させて除き、非接着性細胞を脾臓リンパ球として用いた。脾臓リンパ球は１０％牛胎児血清を含んだＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁して２×１０６細胞／ｍｌに調整し、２００μｌ／ウェルで９６ウェルマイクロタイタープレートに播種し、対照群以外の各ウェルに各濃度のＤＧＥを添加し、さらにすべてのウェルに５μｇのＣｏｎＡ（ナカライテスク社製）を添加し３７℃、５％炭酸ガス培養器で２日間培養した。培養終了１日前に３７ｋＢｑの３Ｈ−チミジン（第一化学薬品製）を各ウェルに加えてパルスラベルを行い、培養後、細胞をガラスフィルターに回収して放射活性を測定した。
【０２４８】
結果を図１０に示す。マイトジェン刺激により活性化されたリンパ球の増殖に対しＤＧＥは用量依存的な抑制を示し、０．３μｇ／ｍｌの濃度でほぼ完全に抑え、リンパ球の活性化に対する抑制作用が示された。
【産業上の利用可能性】
【０２４９】
以上記載したごとく、本発明によれば、アポトーシス誘発剤、制がん剤、活性酸素産生抑制剤、過酸化脂質ラジカル産生抑制剤、ＮＯ産生抑制剤等の抗酸化剤、プロスタグランジン合成抑制剤、抗病原微生物剤、鮮度保持剤、抗変異原剤、血糖上昇抑制剤、抗高脂血症剤、熱ショックタンパク産生誘導剤、抗ウイルス剤、α−グリコシダーゼ阻害剤の有効成分として有用な、式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、それらの塩、および本発明のアポトーシス誘発性物質が提供される。
【０２５０】
これらの物質を含有、希釈および／または添加してなる食品または飲料はアポトーシス誘発作用、制がん作用、活性酸素産生抑制作用、ＮＯ産生抑制作用等の抗酸化作用、プロスタグランジン合成抑制作用、抗病原微物抑制作用、抗変異原作用、血糖上昇抑制作用、抗肥満作用等、熱ショックタンパク産生誘導作用、抗ウイルス作用を有する機能性食品または飲料として有用であり、がん患者やウイルス性疾患患者の病変細胞にアポトーシスを誘発し、これらの疾患の予防、症状改善に有効な食品または飲料が提供される。とりわけ大腸がん、胃がん等消化器系のがんの場合、本発明の上記化合物を食品、飲料として経口的に摂取することによりがん細胞にアポトーシスを起こすことができるため、本発明の食品または飲料は消化器系がんの予防、症状改善に優れた効果を有している。さらに、その活性酸素産生抑制作用等の抗酸化作用により上記の食品または飲料は抗酸化ストレス用食品または飲料としても優れている。
【０２５１】
また、式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表される化合物は、活性酸素産生抑制用の抗酸化用化合物として有用であり、本発明の抗酸化用化合物を含有、希釈および／または添加してなる食品または飲料は、活性酸素等の生体内酸化物質が起因となる疾病の症状改善用食品または飲料として有用である。さらに、本発明の食品または飲料は便秘改善または予防に効果を有する。
【０２５２】
本発明により提供される式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩は食品または飲料に活性酸素産生抑制作用等の抗酸化性を付与する新機能性化合物として有用である。
【０２５３】
また、当該化合物は鮮度保持効果を有し、食品、生鮮物の味や鮮度の保持に極めて有用である。
【０２５４】
さらに、当該化合物を含有する化粧料は美白用、保湿用化粧料として有用である。
【図面の簡単な説明】
【０２５５】
【図１】試料２の順相ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す図である。
【図２】保持時間４．０５分〜４．１６分の画分のマススペクトルを表す図である。
【図３】保持時間４．０５分〜４．１６分の画分の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを表す図である。
【図４】ＤＧＥを添加して各培養条件で培養した時の培地中のＮＯ２−濃度を示す図である。
【図５】前培養においてＤＧＥを添加した場合の、各培養条件下で培養した時の培地中のＮＯ２−濃度を示す図である。
【図６】前培養においてＤＧＥを添加した場合の、各培養条件下で培養した時の培地中のプロスタグランジンＥ２濃度を示す図である。
【図７】ＤＧＥとＧＳＨとの反応物のマススペクトルを表す図である。
【図８】ＤＧＥとＧＳＨとの反応物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを表す図である。
【図９】ＤＧＥとＧＳＨとの反応物の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを表す図である。
【図１０】ＤＧＥを添加して培養した場合の３Ｈ−チミジン取り込み量を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、天然物由来の生理活性物質の利用に関し、さらに詳しくは該生理活性物質、その製造方法、該生理活性物質を有効成分とする医薬、食品または飲料、抗酸化剤、鮮度保持剤および化粧料に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、細胞組織の死に関し、アポトーシス（apoptosis：アポプトーシスともいう。自爆死あるいは細胞自滅）という様式が注目されている。
【０００３】
このアポトーシスは、病理的細胞死である壊死と異なり、細胞自身の遺伝子に最初から組込まれている死である。すなわち何らかの外部的または内部的要因が引き金となってアポトーシスをプログラムする遺伝子が活性化されることにより、プログラム死タンパク質が生合成され、またある場合には不活性型として細胞内に存在するプログラム死タンパク質が活性化される。こうして生成した活性型プログラム死タンパク質により細胞自体が分解され、死に至ると考えられている。
【０００４】
このようなアポトーシスを所望の組織、細胞で発現せしめることができれば、不要もしくは有害な細胞を自然の形で生体から排除することが可能となり、極めて意義深いものである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、天然物由来のアポトーシス誘発作用等の生理機能を有する安全性の高い物質、その製造方法およびその用途を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明を概説すれば、本発明の第１の態様は、式（Ｉ）：
【化１】
（Ｉ）
（式中、ＸおよびＹは、ＨまたはＣＨ２ＯＨ、ただし、ＸがＣＨ２ＯＨのとき、ＹはＨ、ＸがＨのとき、ＹはＣＨ２ＯＨである）
で表される化合物、
式（ＩＩ）：
【化２】
（ＩＩ）
（式中、ＲはＳＨ基含有化合物からＳＨ基を除いた残基である）
で表される化合物、
及びそれらの塩から選択される化合物を有効成分として含有するアポトーシス誘発を要する疾患、がん性疾患、活性酸素産生抑制を要する疾患、一酸化窒素産生抑制を要する疾患、プロスタグランジン合成抑制を要する疾患、滑膜細胞増殖抑制を要する疾患、熱ショックタンパク産生誘導を要する疾患、またはα−グリコシダーゼ阻害を要する疾患の治療剤または予防剤に関する。
【０００７】
本発明の第２の態様は、３，６−アンヒドロガラクトースおよび／または還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを有する化合物を中性からアルカリの条件下で処理することを特徴とする式（Ｉ）で表される化合物の製造方法に関する。
【０００８】
本発明の第３の態様は、式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩に関する。
【０００９】
本発明の第４の態様は、式（Ｉ）で表される化合物とＳＨ基含有化合物とを反応させることを特徴とする式（ＩＩ）で表される化合物の製造方法に関する。
【００１０】
本発明の第５の態様は、式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物及びそれらの塩から選択される化合物を含有、希釈および／または添加してなる食品または飲料に関する。
【００１１】
本発明の第６の態様は、３，６−アンヒドロガラクトースおよび／または還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを有する化合物を、中性からアルカリの条件下で処理することにより得られる式（Ｉ）で表される化合物を含有、希釈および／または添加してなる食品または飲料に関する。
【００１２】
本発明の第７の態様は、式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物及びそれらの塩から選択される化合物を有効成分として含有することを特徴とする抗酸化剤に関する。
【００１３】
本発明の第８の態様は、本発明の第７の態様の抗酸化剤を含有することを特徴とする食品または飲料に関する。
【００１４】
本発明の第９の態様は、式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表される抗酸化用化合物に関する。当該抗酸化用化合物の使用に特に限定はないが、例えば活性酸素産生抑制用の化合物として使用することができる。
【００１５】
本発明の第１０の態様は、式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物及びそれらの塩から選択される化合物を有効成分として含有する鮮度保持剤に関する。
【００１６】
本発明の第１１の態様は、式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物及びそれらの塩から選択される化合物を有効成分として含有する化粧料に関する。
【００１７】
本発明の第１２の態様は、式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物及びそれらの塩から選択される化合物を有効成分として含有するα−グリコシダーゼ阻害剤に関する。
【００１８】
本発明の第１３の態様は、３，６−アンヒドロガラクトースおよび／または還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを有する化合物を、中性からアルカリの条件下で処理することにより生成するアポトーシス誘発性物質に関する。
【００１９】
本発明の第１４の態様は、３，６−アンヒドロガラクトースおよび／または還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを有する化合物を、中性からアルカリの条件下で処理することにより生成するアポトーシス誘発性物質を含有、希釈および／または添加してなる食品または飲料に関する。
【発明の効果】
【００２０】
天然物由来のアポトーシス誘発作用等の生理機能を有する安全性の高い物質、その製造方法およびその用途が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本明細書における、３，６−アンヒドロガラクトースとは、式（ＩＩＩ）：
【化３】
(ＩＩＩ)
で表される３，６−アンヒドロガラクトピラノース、式（ＩＶ）：
【化４】
（ＩＶ）
で表されるそのアルデヒド体、また式（Ｖ）：
【化５】
（Ｖ）
で表されるその抱水体を意味する。またこれらの硫酸化体、メチル化体も包含する。式（ＩＩＩ）〜（Ｖ）で表される化合物の構造は、他の表現で表すことも可能であるが、それらも含め、また、可能なそれらの互換異性体も含め、式（ＩＩＩ）〜（Ｖ）で表すこととする。また、式（ＩＩＩ）〜（Ｖ）における立体配置は、所望の活性が得られる限り、特に限定するものではなくＤ−型、Ｌ−型またはそれらの混合物であってもよい。
【００２２】
本発明において、還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを含有する化合物とは、特に限定はなく、例えば、３，６−アンヒドロガラクトース含有物のｐＨ７未満の酸性下での加水分解および／または酵素分解で得ることができ、また、化学合成法によっても得ることができる。
【００２３】
本発明において好適に使用される３，６−アンヒドロガラクトースを含有する化合物とは、例えば、その非還元末端がＬ−ガラクトース−６−硫酸以外の糖である可溶性の糖化合物であり、例えば、アガロビオース、κ−カラビオースならびに３，６−アンヒドロガラクトースを還元末端に有する、アガロビオースおよびκ−カラビオース以外のオリゴ糖であり、非還元末端がＬ−ガラクトースである糖化合物、すなわちアガロオリゴ糖はプロドラグとして最適である。
【００２４】
また、本発明において３，６−アンヒドロガラクトース含有物は、特に限定するものではなく、例えば、寒天、アガロース、アガロペクチン、フノラン、ポルフィラン、カラゲナン、フルセララン、ヒプネアン等の紅藻の粘質多糖［共立出版（株）発行、多糖生化学１−化学編−、第３１４頁（１９６９）］が例示される。またこれらの多糖の含有物も本発明で使用する３，６−アンヒドロガラクトース含有物に包含される。
【００２５】
例えば、アガロース、アガロペクチンの原料としてはテングサ科のマクサ、オニグサ、オオブサ、ヒラクサ、オバクサ、ユイキリ等、オゴノリ科のオゴノリ、オオオゴノリ等、イギス科のイギス、エゴノリ等、その他の紅藻類が用いられ、通常、数種類の藻類を配合して原料とする。原料藻類を熱水抽出の後、冷却することによってところてんが得られる。このところてんから凍結脱水または圧搾脱水によって水分を除き、乾燥させることによって寒天が得られる。通常、寒天は約７０％のアガロースと約３０％のアガロペクチンを含んでいるが、精製を進めてさらに高純度のアガロースを調製することが可能である。
【００２６】
本発明で使用する３，６−アンヒドロガラクトース含有物は、上記の寒天の原料藻類、ところてん、寒天、精製アガロース、精製アガロペクチン、これらの製造工程で得られる中間産物あるいは副産物を包含する。
【００２７】
原料藻類は通常天日に干して乾燥させたものを用いるが、本発明においては生の藻類および乾燥した藻類が使用できる。また、乾燥時に散水しながら漂白したいわゆるさらし原藻も使用できる。寒天はその起源となる藻類を問わず、また、棒状、帯状、板状、糸状、粉末状等の種々の形態のものを使用できる。精製アガロースは精製度の低いものから高いものまで、様々なアガロース含量のものを使用できる。
【００２８】
アガロースは交互に結合したＤ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを主構造とする多糖であり、Ｄ−ガラクトースの１位と３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの４位がβ−グリコシド結合で、また、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの１位とＤ−ガラクトースの３位がα−グリコシド結合で結合している。α−１，３結合は希酸による温和な加水分解やα−アガラーゼによって［カーボハイドレート・リサーチ（Carbohydr. Res.）、第６６巻、第２０７頁（１９７８）］、また、β−1,４結合はβ−アガラーゼによって選択的に加水分解される。
【００２９】
また、カラゲナンはスギノリ科、ミリン科、イバラノリ科等の紅藻類に含まれる多糖であり、κ−カラゲナン、λ−カラゲナン、η−カラゲナンが知られている。κ−カラゲナンは、Ｄ−ガラクトース−４−硫酸の１位と３，６−アンヒドロ−Ｄ−ガラクトースの４位がβ−グリコシド結合で、また、３，６−アンヒドロ−Ｄ−ガラクトースの１位とＤ−ガラクトース−４−硫酸の３位がα−グリコシド結合で交互に繰り返された基本構造を持つ。λ−カラゲナンはＤ−ガラクトースの１位とＤ−ガラクトース−２，６−二硫酸の４位がβ−グリコシド結合で、また、Ｄ−ガラクトース−２，６−二硫酸の１位とＤ−ガラクトースの３位がα−グリコシド結合で交互に繰り返された基本構造を持つ。カラゲナンは食品のゲル化剤として利用されている。
【００３０】
３，６−アンヒドロガラクトース含有物を化学的、物理的および／または酵素的方法で部分分解したものも、３，６−アンヒドロガラクトース含有物として本発明で使用できる。また、３，６−アンヒドロガラクトース含有物を化学的、物理的および／または酵素的方法で部分分解することにより、還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを含有する化合物を調製することができる。
【００３１】
本発明においては、還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを含有する化合物の精製物および部分精製物あるいは還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを含有する化合物の未精製含有物を目的に応じ使用すればよい。
【００３２】
３，６−アンヒドロガラクトース含有物の化学的分解方法の例としては、ｐＨ７未満での酸性下での加水分解、物理的分解方法の例としては、電磁波や超音波の照射、酵素的分解方法の例としては加水分解酵素、例えば、アガラーゼ、カラギナーゼ等による加水分解が挙げられる。
【００３３】
３，６−アンヒドロガラクトース含有物のｐＨ７未満の酸性下での分解条件は還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを有する化合物、例えば、アガロビオース、κ−カラビオースならびに３，６−アンヒドロガラクトースを還元末端に有する、アガロビオースおよびκ−カラビオース以外の化合物が生成する条件であれば特に限定はない。
【００３４】
例えば、３，６−アンヒドロガラクトース含有物を０．０００１〜５規定の酸に溶解または懸濁し、数秒から数日間反応させることにより還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを有する化合物が生成する。また、反応時に加熱することにより還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを有する化合物の生成に必要な反応時間は短縮される。
【００３５】
３，６−アンヒドロガラクトース含有物を溶解または懸濁する酸の種類に特に限定はないが、塩酸、硫酸、硝酸等の無機酸、クエン酸、ギ酸、酢酸、乳酸、アスコルビン酸等の有機酸が使用可能である。酸の濃度も特に限定はないが、０．０００１〜５規定、好ましくは０.００１〜１規定の濃度で使用可能である。また、反応温度も特に限定はないが、０〜２００℃、好ましくは２０〜１３０℃に設定すればよい。また反応時間も特に限定は無いが、数秒〜数日に設定すればよい。酸の種類と濃度、反応温度および反応時間は原料となる３，６−アンヒドロガラクトース含有物、例えば、アガロース、カラゲナン等の種類および目的とする還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを含有する化合物、例えば、アガロビオース、κ−カラビオースや、還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを有する、アガロビオースおよびκ−カラビオース以外の化合物の生成量、目的とする還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを有する、アガロビオースやκ−カラビオース以外の化合物の重合度により適宜選択すればよい。一般に、弱酸よりも強酸、低濃度の酸よりも高濃度の酸、低温よりも高温を選択することにより酸分解反応は速やかに進行する。
【００３６】
例えば、寒天を０．１Ｎ ＨＣｌに１０重量％に懸濁し、１００℃で１３分間加熱溶解して得られる酸分解物は、冷却しても、その氷結点においても、もはやゲル化しなくなる。この液に含まれる糖類をゲルろ過ＨＰＬＣ、順相ＨＰＬＣ等の方法で分析すると高分子の糖類はほとんど見られず、大部分が可溶性の１０糖以下まで分解されている。
【００３７】
本発明で使用する３，６−アンヒドロガラクトースを還元末端に有する、アガロビオースおよびκ−カラビオース以外の化合物とは、例えば、３，６−アンヒドロガラクトースの１位以外の水酸基に糖が結合したものであり、特に限定はない。例えば、アガロースの酸分解物やα−アガラーゼ分解物であるアガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース、アガロオクタオース、アガロデカオース等が挙げられる。また、カラゲナンの酸分解物やカラギナーゼ分解物が挙げられる。さらに、グルコース、マンノース、ガラクトース等のヘキソース、キシロース、アラビノース、リボース等のペントース、グルクロン酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸、グルロン酸等のウロン酸、グルコサミン、ガラクトサミン等のアミノ糖、Ｎ−アセチルノイラミン酸等のシアル酸、フコース等のデオキシ糖、およびこれらのエステル、アミドおよび／またはラクトンが１個または複数個、３，６−アンヒドロガラクトースの１位以外の水酸基に結合したものも本発明で使用する３，６−アンヒドロガラクトースを還元末端に有する、アガロビオース、κ−カラビオース以外の化合物に含まれる。さらに、上記アガロビオース、κ−カラビオース、３，６−アンヒドロガラクトースを還元末端に有するアガロビオースおよび３，６−アンヒドロガラクトースを還元末端に有するκ−カラビオース以外の化合物に、ピルビン酸および／または硫酸基を結合したもの、また該化合物の水酸基がメチル化されたものも、本発明で使用する３，６−アンヒドロガラクトースを還元末端に有する、アガロビオース、κ−カラビオース以外の化合物と定義される。
【００３８】
還元末端の３，６−アンヒドロガラクトースの１位はアノマー炭素であるので３，６−アンヒドロガラクトースを還元末端に有する化合物にはα型とβ型が存在するが、いずれも３，６−アンヒドロガラクトースを還元末端に有する化合物として本発明で使用できる。また、還元末端の３，６−アンヒドロガラクトースの１位がアルデヒド型のものも３，６−アンヒドロガラクトースを還元末端に有する化合物として使用できる。さらに、３，６−アンヒドロガラクトースがＤ−型であるかＬ−型であるかは問わない。また、上記α型、β型、アルデヒド型の混合物およびＤ−型、Ｌ−型の混合物も使用できる。
【００３９】
本発明のアポトーシス誘発性物質は、還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを有する化合物、例えば、アガロビオース、κ−カラビオースならびに３，６−アンヒドロガラクトースを還元末端に有する、アガロビオースおよびκ−カラビオース以外の化合物を中性からアルカリの条件下で処理することにより得ることができる。また、３，６−アンヒドロガラクトース含有物のｐＨ７未満での酸加水分解および／または酵素分解を行い、ついで得られた酸分解物および／または酵素分解物を中性からアルカリの条件下で処理することにより得ることができる。
【００４０】
還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを含有する化合物、例えば、アガロビオース、κ−カラビオースならびに３，６−アンヒドロガラクトースを還元末端に有する、アガロビオースおよびκ−カラビオース以外の化合物のｐＨ７超のアルカリ処理において、これらの化合物から選択される少なくとも１以上の化合物を溶解または懸濁するアルカリの種類に特に限定はないが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、アンモニア等の無機塩基、トリス、エチルアミン、トリエチルアミン等の有機塩基が使用可能である。アルカリの濃度も特に限定はないが、０．０００１〜５規定、好ましくは、０．００１〜１規定の濃度で使用可能である。また、反応温度も特に限定はないが、０〜２００℃、好ましくは２０〜１３０℃に設定すればよい。また反応時間も特に限定は無いが、数秒〜数日に設定すればよい。アルカリの種類と濃度、反応温度および反応時間は原料となる上記化合物の種類および目的とするアポトーシス誘発性物質の生成量により適宜選択すればよい。一般に、ｐＨ７超であれば良いが、低濃度のアルカリよりも高濃度のアルカリ、低温よりも高温を選択することにより本発明のアポトーシス誘発性物質の生成は速やかに進行する。
【００４１】
例えば、アガロビオースまたはκ−カラビオースのｐＨ１１．５の溶液を調製し、３７℃で５分間保持することにより、本発明のアポトーシス誘発性物質が生成する。
【００４２】
生成した本発明のアポトーシス誘発性物質を含有するアルカリ液は、目的に応じ中和して用いても良く、またｐＨ７未満の酸性溶液として使用しても良い。
【００４３】
本発明のアポトーシス誘発性物質のアポトーシス誘発活性は、例えば、がん細胞への増殖抑制作用を指標として測定することができる。本発明のアポトーシス誘発性物質は、該活性を指標とし精製することができる。精製手段としては、化学的方法、物理的方法等の公知の精製手段を用いればよく、ゲルろ過法、分子量分画膜による分画法、溶媒抽出法、イオン交換樹脂等を用いた各種クロマトグラフィー等の精製方法を組合せ精製すればよい。
【００４４】
本発明のアポトーシス誘発性物質の精製物としては上記の式（Ｉ）で表される化合物が例示される。
【００４５】
例えば、アガロビオースの中性からアルカリの条件下での処理物より式（Ｉ）で表される化合物のＸがＣＨ２ＯＨ、ＹがＨである化合物が精製され、κ−カラビオースの中性からアルカリでの条件下での処理物より、式（Ｉ）で表される化合物のＸがＨ、ＹがＣＨ２ＯＨである化合物が精製される。
【００４６】
本発明において使用する式（Ｉ）で表される化合物は上記のように３，６−アンヒドロガラクトースまたは還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを含有する化合物、例えば、アガロビオース、κ−カラビオースならびに３，６−アンヒドロガラクトースを還元末端に有する、アガロビオースおよびκ−カラビオース以外の化合物の中性からアルカリでの条件下での処理において生成し、本発明において使用する式（Ｉ）で表される化合物、その生理作用の発現を目的とする３，６−アンヒドロガラクトースおよび／または還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを含有する化合物の使用は、いずれも本発明に包含されるものである。
【００４７】
本発明の式（Ｉ）で表される化合物の生体内での発現を目的としたプロドラグの使用も本発明に包含される。プロドラグとしては、臓器親和性、組織親和性を有するリガンドを有する３，６−アンヒドロガラクトースが好ましく、当該プロドラグは細胞内に取り込まれた後、その生理的条件下で、式（Ｉ）で表される化合物となり、種々の生理機能を示す。リガンドとしては、ガラクトースが例示され、リガンドがガラクトースである場合は特に肝組織へのターゲッティングが効率よく行われる。当該リガンドを有する化合物としては非還元末端にガラクトースを有するアガロビオース、アガロヘキサオース、アガロオクタオース等のアガロオリゴ糖があり、これらのアガロオリゴ糖はプロドラグとして有用である。
【００４８】
非還元末端にガラクトースを有するアガロオリゴ糖はこれまでにも人類は長い間食してきた。このアガロオリゴ糖は中性あるいはアルカリ性で還元末端の３，６−アンヒドロガラクトースが外れることにより、３，６−アンヒドロガラクトースが式（Ｉ）で表される化合物に変化し、生理活性が発現する。すなわちプロドラグとして生体内に吸収されたアガロオリゴ糖が式（Ｉ）で表される化合物に変化し、生理機能を発現する。このアガロオリゴ糖は吸収されやすい適度な分子量であるので、消化管で吸収されやすく、更に、非還元末端にガラクトースがあるので、肝臓で積極的に吸収され肝臓を介した血流にも乗りやすい。吸収後、非還元末端のガラクトースに親和性のある組織局所で式（Ｉ）で表される化合物に変化し生理活性を発現する。すなわち、プロドラグとしてのアガロオリゴ糖を投与することによって、安定性に優れ、取り込み効率の良く、局所で濃縮された状態で式（Ｉ）で表される化合物に変化し、その生理活性を発現することができる。
【００４９】
式（Ｉ）で表される化合物の塩としては、医薬として許容される塩があり、公知の方法にて変換することができる。
【００５０】
本発明において使用する式（ＩＩ）で表される化合物は、式（Ｉ）で表される化合物とＳＨ基含有化合物とを反応させることにより、反応液中に生成する。
【００５１】
使用するＳＨ基含有化合物は何ら限定はなく、例としてはメタンチオール、ブタンチオール、メルカプトエタノール、ＳＨ基含有アミノ酸、ＳＨ基含有アミノ酸誘導体等が挙げられる。ＳＨ基含有アミノ酸の例としては、システイン、ホモシステイン等が挙げられる。
【００５２】
ＳＨ基含有アミノ酸誘導体としては、上記アミノ酸の誘導体、例えばシステイン誘導体、システイン含有ペプチド、システイン誘導体含有ペプチドが例示される。システイン含有ペプチドとしてはペプチド中にシステインが構成成分となっていれば良く、特に限定はない。本発明のシステイン含有ペプチドとしては、オリゴペプチド、例えばグルタチオンのような低分子物からタンパク質のような高分子物までを包含する。またシスチン又はホモシスチンを含有するペプチドも反応中にシステイン又はホモシステイン含有ペプチドとなる条件下、例えば還元処理を組合せることにより、本発明のシステイン又はホモシステイン含有ペプチドとして使用することができる。なおシステイン含有ペプチドとしては、糖質、脂質等を含有するシステイン含有ペプチドも包含される。また、上記した各種の物の塩、酸無水物、エステル等であってもよい。
【００５３】
式（ＩＩ）で表される化合物を製造する際の式（Ｉ）で表される化合物とＳＨ基含有化合物との反応は、公知の反応条件で行えばよく、ＳＨ基含有化合物のＳＨ基が反応性を有する条件であれば、特に限定はない。
【００５４】
式（Ｉ）で表される化合物とＳＨ基含有化合物、例えばＳＨ基含有化合物、又はその誘導体とが反応し、生成した式（ＩＩ）で表される化合物の精製、単離手段としては、化学的方法、物理的方法等の公知の精製手段を用い、当該化合物を精製することができる。
【００５５】
式（Ｉ）で表される化合物は生体内で、例えばＳＨ基含有化合物（例えばシステイン、グルタチオン等）と反応し、医薬として有用な式（ＩＩ）で表される代謝誘導体を生成する。従って、この代謝誘導体が示す薬効は、式（Ｉ）で表される化合物を投与した場合においても得られ、式（ＩＩ）で表される化合物の生体内での生成を目的とした、式（Ｉ）で表される化合物の使用も本発明に包含される。
【００５６】
式（ＩＩ）で表される化合物の塩としては、医薬として許容される塩があり、公知の方法にて変換することができる。
【００５７】
本発明に使用する式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩はアポトーシス誘発活性、制がん活性、活性酸素産生抑制活性、過酸化脂質ラジカル産生抑制活性、一酸化窒素産生抑制活性等の抗酸化活性、抗病原微生物活性、抗変異原活性、α−グリコシダーゼ阻害活性、免疫調節作用、プロスタグランジン合成抑制作用、抗炎症作用、抗アレルギー作用、サイトカイン産生調節作用、抗リウマチ作用、抗糖尿病作用、滑膜細胞増殖抑制活性、熱ショックタンパク産生誘導作用等の生理活性を有する。これらの活性により、式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩から選択される化合物を有効成分とし、アポトーシス誘発を要する疾患、がん性疾患、活性酸素産生抑制を要する疾患、過酸化脂質ラジカル産生抑制を要する疾患、一酸化窒素産生抑制を要する疾患、病原微生物による疾患、変異原により誘発される疾患、α−グリコシダーゼ阻害を要する疾患、免疫調節を要する疾患、プロスタグランジン合成抑制を要する疾患、炎症抑制を要する疾患、アレルギー抑制を要する疾患、サイトカイン産生調節を要する疾患、リウマチ、糖尿病、滑膜細胞増殖抑制を要する疾患、熱ショックタンパク産生誘導を要する疾患等の治療剤または予防剤、すなわちアポトーシス誘発剤、制がん剤、活性酸素産生抑制剤、過酸化脂質ラジカル産生抑制剤、一酸化窒素産生抑制剤等の抗酸化剤等、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗変異原剤、血糖上昇抑制剤、抗高脂質剤、免疫調節剤、プロスタグランジン合成抑制剤、抗炎症剤、抗アレルギー剤、サイトカイン産生調節剤、滑膜細胞増殖抑制剤、抗リウマチ剤、抗糖尿病剤、熱ショックタンパク産生誘導剤等を製造することができる。
【００５８】
また、式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩から選択される化合物を有効成分として含有する本発明のアポトーシス誘発剤は、自己免疫疾患患者の自己反応性リンパ球、がん細胞、ウイルス感染細胞等を排除するのに有効であり、アポトーシスを所望の組織、細胞で発現させることにより、不要もしくは有害な細胞を自然の形で生体から排除することができる。本発明のアポトーシス誘発剤が有効な疾患としては、例えば、全身性エリテマトーデス、免疫介在性糸球体腎炎、多発性硬化症、膠原病等の自己免疫疾患、リウマチ等である。
【００５９】
本発明のアポトーシス誘発剤はアポトーシス誘発方法に使用することができ、該方法はアポトーシス誘発機構の解明、アポトーシス誘発剤、アポトーシス誘発阻害剤のスクリーニング等に有用である。
【００６０】
なお、本発明のアポトーシス誘発剤によるアポトーシス誘発作用は、キャスパーゼ（Caspase）の阻害剤、例えば、ＩＬ−１βコンバーティング・エンザイム・インヒビターＶ〔Ｚ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＤＬ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−フルオロメチルケトン：宝酒造社製〕により阻害されるので、キャスパーゼに依存するアポトーシスによる細胞死である。
【００６１】
このキャスパーゼは、種々の細胞死の際に先行して上昇すること、その過剰発現により細胞死が誘導されること、ペプチド阻害剤や阻害タンパク質であるＣｒｍＡ、ｐ３５によりアポトーシスが抑制されること、キャスパーゼ−１、キャスパーゼ−３のノックアウトマウスでは正常に見られるアポトーシスの一部が抑制されることから、アポトーシスの重要なメディエーターとして機能していることが明らかにされている［生化学、第７０巻、第１４〜２１頁（１９９８）］。すなわち、アポトーシスの過程ではシステインプロテアーゼであるキャスパーゼが活性化され、核や細胞質のタンパク質を分解する。キャスパーゼは、まず前駆体として合成され、スプライシングにより活性化型となる。このキャスパーゼの活性化経路の制御が細胞の生死を決める。哺乳類では１０種類以上のキャスパーゼが存在し、上位のキャスパーゼが下位のキャスパーゼをスプライシングすることで細胞内タンパク質分解活性は雪崩式に増幅される［細胞工学、第１７巻、第８７５〜８８０頁（１９９８）］。反対に、システインプロテアーゼであるキャスパーゼの阻害剤でそのスプライシング活性を阻害すれば、キャスパーゼ依存型のアポトーシスによる細胞死を止めることができる。
【００６２】
本発明に使用する式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩は酸化物質、例えば、活性酸素の産生抑制に有用であり、該化合物を有効成分とする活性酸素産生抑制剤等の抗酸化剤は活性酸素の産生および／または過剰が起因となる疾病の治療または予防に有用である。
【００６３】
活性酸素は、大きくラジカルと非ラジカルの活性酸素に分類することができる。ラジカル系活性酸素には、ヒドロキシラジカル、ヒドロキシペルオキシラジカル、ペルオキシラジカル、アルコキシラジカル、二酸化窒素、一酸化窒素（以下、ＮＯと略す）、チイルラジカル、スーパーオキシドがある。一方、非ラジカル系活性酸素には、一重項酸素、過酸化水素、脂質ヒドロペルオキシド、次亜塩素酸、オゾン、ペルオキシ亜硝酸がある。いずれも多くの病態、すなわち、各種の炎症性疾患、糖尿病、がん、動脈硬化、神経疾患、虚血再潅流障害などと関わりがある。
【００６４】
生体内では絶えずいくつかの経路で低濃度の活性酸素が生成している。これは生理的にミトコンドリアなどの電子伝達系から漏出するスーパーオキシドや過酸化水素、銅や鉄などの遷移金属が触媒することによるヒドロキシラジカル、好中球や単球などによって生成される感染防御のための次亜塩素酸、アルギニンの分解により生成するＮＯなど、いずれも避けることのできないものである。これらの活性酸素生成に対して、生体は活性酸素消去系としての酵素、低分子化合物をもち、生成と消去のバランスを保っている。しかし、生成系がなんらかの原因で活性化されたり、逆に消去系が不活性化されて、活性酸素生成系が消去系に対して優位に立った場合、生体は酸化的障害を受けることになる。このような状態を酸化ストレスという。さらに、生体内のバランスがずれた場合だけでなく、大気や食品などの生体外のものからも、生体は常に酸化ストレスにさらされており、日常生活を送る上で酸化ストレスは避けることができない。
【００６５】
すなわち、酸化ストレスは上記したように、様々な疾患と関わりがあり、生体は、常に酸化ストレスによる疾患、あるいは、疾病の悪化につながる状況にさらされている。したがって、このような酸化ストレスが引き起こす疾病の予防、治療あるいは悪化防止にも、本発明の抗酸化剤、例えば、活性酸素産生抑制剤は有用である。
【００６６】
また、酸化ストレスに必ずつきまとうのが脂質過酸化反応であり、この反応は過酸化脂質ラジカルができると一挙に進む反応である。そこで生成される４−ヒドロキシ−２−ノネナール（ＨＮＥ）はグルタチオンやタンパク質を特異的な標的とする毒性アルデヒドである。そのＨＮＥとタンパク質との反応生成物が、様々な病態組織において検出されており、酸化ストレスの関わる疾患病態の誘発因子ではないかと考えられている。そのため、過酸化脂質ラジカルの生成を抑えることのできる本発明に使用される抗酸化物質、すなわち、式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩から選択される化合物を有効成分として含有する抗酸化剤は酸化ストレスによる生活習慣病疾患の予防および治療に有用である。
【００６７】
ＮＯは内皮細胞由来血管平滑筋弛緩因子（ＥＤＲＦ）の本体である［ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３２７巻、第５２４〜５２６頁（１９８７）］。本発明によりＮＯ産生の抑制を必要とする疾病治療剤または予防剤が提供される。
【００６８】
本発明において、ＮＯ産生の抑制を必要とする疾病とは、特に限定はないが、例えば、毒性ショックやある種のサイトカインによる治療等による全身性血圧低下、血圧応答低下、糖尿病、血管機能不全、病因性血管拡張、組織損傷、心臓血管系虚血、痛感過敏症、脳虚血、血管新生を伴う疾病、がん等の疾病を含むものである。
【００６９】
Ｌ―アルギニンと酸素からＬ―シトルリンとＮＯを生産する一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）には、常に発現しているｃＮＯＳと誘導型のｉＮＯＳがある。マクロファージ等において、ｉＮＯＳは、細胞毒素やサイトカイン（ＬＰＳ、ＩＮＦ−γ等）の刺激により誘導され、ＮＯを生産する。ｉＮＯＳ自体は生体系の維持においてなくてはならない存在である。しかし、一方で、種々の要因により必要以上に過剰発現し過剰なＮＯを産生することにより、種々の疾病を引き起こすことも明らかになっている。
【００７０】
本発明者らは式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩がこのｉＮＯＳの発現を抑制することを、ウエスタンブロティングよりタンパク質レベルで、ＲＴ−ＰＣＲによりメッセンジャーＲＮＡレベルで確認した。つまり、本発明で使用する式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩から選択される化合物は、種々の要因により過剰に発現し過剰なＮＯを生産するｉＮＯＳの発現を抑制することにより、ＮＯ産生抑制を必要とする疾病の治療および予防に有効である。
【００７１】
かくして、本発明で使用する式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩はマクロファージのＮＯ産生を抑制し、マクロファージのＮＯ産生に起因する疾病、発がん等の治療、予防に有用である。また、本発明に使用する化合物のＮＯ産生抑制はＮＯ産生誘起物質であるＬＰＳや、ＩＮＦ−γに対する拮抗阻害ではない。また、本発明に使用する化合物を予め加えておくことによって、ＮＯ産生抑制効果の増強が見られ、本発明に使用する式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩から選択される化合物は抗酸化物質の産生の予防剤の有効成分として極めて有用である。
【００７２】
また、本発明のＮＯ産生抑制剤はＮＯ産生機構研究、ＮＯ作用機作研究に有用であり、また、ＮＯ産生機構に関与する物質のスクリーニングに使用することもできる。
【００７３】
固形がんの増大に血管新生は必須であるが、血管内皮増殖因子／血管透過性亢進因子（ＶＥＧＦ）はこの過程に重要な役割を演じている。様々ながん細胞においてＶＥＧＦがＮＯによって誘導される。本発明のＮＯ産生抑制剤はＮＯ産生を抑制することによってがん細胞のＶＥＧＦ産生も抑制し、その結果、がん組織周辺での血管新生が阻害される。がん細胞を皮下に移植して固形腫瘍を形成させたマウスに本発明のＮＯ産生抑制剤を投与するとがん組織の周辺の血管の形成が不十分となり、がんは脱落する。
【００７４】
ニトロソアミンは２級アミンにニトロソ基が付加した一群の化合物で数百種類が知られており、その多くがＤＮＡに損傷を加えることにより動物に対して発がん性を示す。ニトロソアミンはヒトの発がんにも深く関わっているとされており、通常、胃の中で亜硝酸塩とアミンが反応することによって生成する。ＮＯはｐＨ中性の生理的条件下でもアミンと反応してニトロソアミンを生成する。また、疫学的にがんとの関係が高い肝吸虫感染患者や肝硬変患者においてＮＯ産生は亢進している。したがって、本発明のＮＯ産生抑制剤を投与してＮＯ産生の亢進を防ぐことによって特にハイリスクグループの発がんを予防することができる。以上のように、本発明のＮＯ産生抑制剤は発がんの抑制とがん組織における血管新生阻害という２段階で制がん作用を示す。
【００７５】
さらに、本発明において使用する化合物は、アポトーシスを誘導し、がん細胞を死滅させる直接効果と、がん細胞が出しているＮＯを抑制することにより、ＮＯにより誘導されるＶＥＧＦによる血管新生を阻害することによりがん細胞を死に追いやる間接的効果の２つの作用の相乗効果でも制がん作用を発揮する。
【００７６】
ＮＯはまた、炎症性病変に特徴的に認められる浮腫、すなわち血管透過性亢進作用を誘発し［マエダ（Maeda）ら、ジャパニーズ・ジャーナル・オブ・カンサー・リサーチ（Japanese Journal of Cancer Research）、第８５巻、第３３１〜３３４頁（１９９４）］、また、炎症性メディエーターであるプロスタグランジン類の生合成を亢進させる［サルベミニ（Salvemini）ら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ＵＳＡ（Proceedings of National Academy of Sciences, USA）、第９０巻、第７２４０〜７２４４頁（１９９３）］。一方、ＮＯはスーパーオキシドラジカルと速やかに反応してペルオキシ亜硝酸イオンを生じ、ペルオキシ亜硝酸イオンが炎症性の細胞、組織障害を引き起こすとも考えられている。
【００７７】
活性化された免疫細胞が臓器に入り込みサイトカインを放出するとＮＯの産生が誘導される。インスリン依存型糖尿病は膵島β細胞が特異的に破壊されることによって引き起こされる疾患であり、ＮＯによる破壊であるとされている。また、慢性関節性リウマチ、変形性関節リウマチ、痛風性関節炎、ベーチェット病に伴う関節炎の患者の病変部の関節液には同患者の正常な関節や健常人の関節の関節液に比べて高濃度のＮＯが含まれている。これらの患者に本発明のＮＯ産生抑制剤を投与すると病変部におけるＮＯ産生を抑制し、症状が改善する。
【００７８】
脳虚血中および再潅流後にはＮＯ産生が増大し、それに伴って脳組織が損傷を受ける。脳虚血時に患者に本発明のＮＯ産生抑制剤を投与することにより脳組織の損傷が軽減され、予後が改善される。
【００７９】
組織の炎症および疼痛の惹起にはアラキドン酸代謝が大きく関与している。細胞膜リン脂質由来のアラキドン酸は、体内でシクロオキシゲナーゼの作用によりプロスタグランジン、プロスタサイクリン、トロンボキサンチンの三者に代謝される。このうちプロスタグランジンは血管拡張作用とそれに伴う臓器への血流増加作用を有するが、特に炎症部位においてはプロスタグランジンＥ２とＩ２がその血流増加作用により、浮腫と白血球浸潤を増加させる。すなわち、本発明のプロスタグランジンＥ２合成抑制剤を投与することにより、プロスタグランジンの生合成を抑制すると、鎮痛、抗炎症作用を発現させることができる。さらに、炎症部分に浸潤した白血球は活性酸素を生産し、酸化ストレス状態を引き起こすため、プロスタグランジンの生合成を抑制する本発明のプロスタグランジンＥ２合成抑制剤は、酸化ストレスによる先に述べたような様々な疾患、疾病の予防、治療あるいは悪化防止にも有用である。
【００８０】
また、上記のように、ＮＯは、炎症性病変に特徴的に認められる浮腫、すなわち、血管透過性亢進作用を誘発し、炎症性メディエーターであるプロスタグランジン類の生合成を亢進させることより、本発明のＮＯ産生抑制効果とプロスタグランジンＥ２合成抑制効果は相乗的に作用し、鎮痛、抗炎症作用と酸化ストレスによる様々な疾患、疾病の予防、治療あるいは悪化防止に相乗効果を発現する。 本発明の免疫調節剤はリンパ球幼若化反応抑制作用、混合リンパ球反応抑制等の免疫調節作用を有し、本発明の免疫調節剤はこれらの免疫系、免疫因子の異常が起因となる疾病の治療剤または予防剤として有用である。
【００８１】
なお、リンパ球幼若化反応とは、マイトジェンがリンパ球表面の受容体に結合し、リンパ球を活性化させ、その分裂、増殖を促す反応である。混合リンパ球反応とは、同種異系の動物より得られたリンパ球を混合培養することにより、主要組織適合抗原の不一致によるリンパ球の活性化が誘導され、リンパ球の分裂、増殖が促進される反応である。本発明の免疫調節剤はこれらの反応を抑制し、リンパ球の異常亢進が起因となる自己免疫性疾患、例えば慢性腎炎、慢性大腸炎、Ｉ型糖尿病、慢性関節リウマチ等の慢性の疾患の治療または予防に特に有用であり、また移植片拒絶反応の抑制においても有用である。
【００８２】
式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩は７０ｋダルトン（ＨＳＰ７０）等の熱ショックタンパク産生誘導活性を有し、肝炎ウイルス、エイズウイルス、インフルエンザウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ヘルペスウイルス等のＲＮＡウイルス、ＤＮＡウイルスに対する抗ウイルス作用を有する。また熱ショックタンパクはがん免疫にも関与しており、これらの化合物はがん免疫にも有効である。更に抗炎症等の生体防御作用にも関与している。従って、式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩を摂取することによって、インフルエンザウイルスによる風邪疾患等のウイルス性疾患が予防、治療できる。
【００８３】
本発明のアポトーシス誘発剤としては、式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩から選択される化合物を有効成分とし、これを公知の医薬用担体と組合せ製剤化すればよい。一般的には、当該組成物を薬学的に許容できる液状または固体状の担体と配合し、かつ必要に応じて溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を加えて、錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、カプセル剤等の固形剤、通常液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤とすることができる。またこれを使用前に適当な担体の添加によって液状となし得る乾燥品とすることができる。
【００８４】
本発明のアポトーシス誘発剤は、経口剤や、注射剤、点滴用剤等の非経口剤のいずれによっても投与することができる。
【００８５】
医薬用担体は、上記投与形態および剤型に応じて選択することができ、経口剤の場合は、例えばデンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩等が利用される。また、経口剤の調製に当っては、さらに、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、潤沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を配合することもできる。
【００８６】
一方、非経口剤の場合は、常法に従い本発明の有効成分である式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩から選択される化合物を希釈剤としての注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、落花生油、大豆油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等に溶解ないし懸濁させ、必要に応じ、殺菌剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤等を加えることにより調製される。
【００８７】
本発明のアポトーシス誘発剤は、製剤形態に応じた適当な投与経路で投与される。投与方法も特に限定はなく、内用、外用および注射によることができる。注射剤は、例えば静脈内、筋肉内、皮下、皮内等に投与することができ、外用剤には座剤等も包含される。
【００８８】
本発明のアポトーシス誘発剤の投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的およびこれに適用される患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され、一定ではないが一般には製剤中に含有される有効成分の量が成人１日当り１０μｇ〜２００ｍｇ／ｋｇである。もちろん投与量は、種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。本発明の薬剤はそのまま経口投与するほか、任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることもできる。
【００８９】
本発明の制がん剤としては、式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩から選択される化合物を有効成分とし、これを公知の医薬用担体と組合せ製剤化すれば制がん剤を製造することができる。制がん剤の製造は上記アポトーシス誘発剤の製造方法に準じ行うことができる。
【００９０】
制がん剤としては、製剤形態に応じた適当な投与経路で投与される。投与方法も特に限定はなく、内用、外用および注射によることができる。注射剤は、例えば静脈内、筋肉内、皮下、皮内等に投与することができ、外用剤には座剤等も包含される。
【００９１】
制がん剤としての投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的およびこれに適用される患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され、一定ではないが一般には製剤中に含有される有効成分の量が成人１日当り１０μｇ〜２００ｍｇ／ｋｇである。もちろん投与量は、種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。本発明の薬剤はそのまま経口投与するほか、任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることもできる。
【００９２】
リウマチは骨膜細胞や軟骨細胞に障害が起こる自己免疫疾患である。式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩は滑膜細胞へのアポトーシス誘発作用を有する。したがって、式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩から選択される化合物を有効成分として抗リウマチ剤を製造することができる。すなわち、式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩から選択される化合物を有効成分とし、これを公知の医薬用担体と組合せ製剤化すれば抗リウマチ剤を製造することができる。抗リウマチ剤の製造は上記方法に準じ行うことができる。
【００９３】
抗リウマチ剤としては、経口剤や、注射剤、点滴用剤等の非経口剤のいずれによっても投与することができる。
【００９４】
医薬用担体は、上記投与形態および剤型に応じて選択することができ、上記アポトーシス誘発剤に準じ使用すれば良い。
【００９５】
抗リウマチ剤としては、製剤形態に応じた適当な投与経路で投与される。投与方法も特に限定はなく、内用、外用および注射によることができる。注射剤は、例えば静脈内、筋肉内、皮下、皮内等に投与し得、外用剤には座剤等も包含される。
【００９６】
式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩から選択される化合物を有効成分として含有する抗リウマチ剤の投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的およびこれに適用される患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され、一定ではないが一般には製剤中に含有される有効成分の量が成人１日当り０．０１〜５０ｍｇ、好ましくは０．１〜１０ｍｇである。もちろん投与量は種々の条件によって変動するので上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。本発明の薬剤はそのまま経口投与するほか、任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることもできる。
【００９７】
また、式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩から選択される化合物を有効成分とする抗酸化剤、活性酸素産生抑制剤、過酸化脂質ラジカル産生抑制剤、ＮＯ産生抑制剤、抗病原微生物剤、抗変異原剤、プロスタグランジン合成抑制剤、滑膜細胞増殖抑制剤、熱ショックタンパク産生誘導剤、抗ウイルス剤は上記アポトーシス誘発剤に準じ製造することができ、用量、用法はその症状に応じ、上記アポトーシス誘発剤に準じて、使用すればよい。
【００９８】
さらに式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩は種々のα−グリコシダーゼ、例えば、シュークラーゼ、マルターゼ等に阻害活性を示し、式（Ｉ）で表される化合物を有効成分とする血糖上昇抑制剤、抗高脂血症剤、抗肥満剤、抗糖尿病剤等を製造することができる。これらの医薬は上記アポトーシス誘発剤に準じ製造することができ、用量、用法はその症状に応じ、上記アポトーシス誘発剤に準じて、使用すれば良い。また式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩から選択される化合物を有効成分としてα−グリコシダーゼ阻害剤を常法に従い製造することができる。該α−グリコシダーゼ阻害剤を使用し、α−グリコシダーゼの阻害方法を行うことができる。
【００９９】
本発明により、式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩から選択される化合物を含有、希釈および／または添加してなる食品および飲料が提供される。本発明の食品および飲料は、そのアポトーシス誘発作用、制がん作用、抗酸化作用、抗病原微生物活性、抗変異原活性、プロスタグランジン合成抑制活性、熱ショックタンパク産生誘導作用、抗ウイルス作用、α−グリコシダーゼ阻害活性等により、式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩から選択される化合物に感受性を示す疾患、例えば、アポトーシス誘発を要する疾患、がん性疾患、活性酸素産生抑制を要する疾患、ＮＯ産生抑制を要する疾患、病原微生物による疾患、変異原、プロスタグランジン合成等により惹起される疾患、熱ショックタンパク産生誘導を要する疾患、ウイルス性疾患、α−グリコシダーゼの調節を必要とする疾患等の症状改善、予防に極めて有用である。
【０１００】
本発明の食品または飲料の製造法は、特に限定はないが、調理、加工および一般に用いられている食品または飲料の製造法による製造を挙げることができ、製造された食品または飲料に式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩から選択される化合物が有効成分として含有、添加および／または希釈されていればよい。
【０１０１】
例えば、式（Ｉ）で表される化合物は、食品または飲料の製造工程において、３，６−アンヒドロガラクトースおよび／または還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを有する化合物を、中性からアルカリの条件下で処理することにより得られる。また、３，６−アンヒドロガラクトースおよび／または還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを有する化合物は、３，６−アンヒドロガラクトース含有物の酸性下での加水分解または酵素分解により得られる。
【０１０２】
３，６−アンヒドロガラクトース含有物としては、例えば、寒天、アガロースおよび／またはカラゲナンを使用することができる。還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを有する化合物としては、アガロビオース、κ−カラビオースならびに還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを有する、アガロビオースおよびκ−カラビオース以外の化合物から選択される少なくとも１以上の化合物を使用することができる。
【０１０３】
また式（Ｉ）で表される化合物が食品又は飲料の製造工程中に、ＳＨ基含有化合物と反応して生成する式（ＩＩ）で表される化合物を含有、希釈及び／又は添加してなる食品又は飲料も本発明の食品又は飲料に包含される。
【０１０４】
本発明の食品または飲料とは、特に限定はないが、例えば、穀物加工品（小麦粉加工品、デンプン類加工品、プレミックス加工品、麺類、マカロニ類、パン類、あん類、そば類、麩、ビーフン、はるさめ、包装餅等）、油脂加工品（可塑性油脂、てんぷら油、サラダ油、マヨネーズ類、ドレッシング等）、大豆加工品（豆腐類、味噌、納豆等）、食肉加工品（ハム、ベーコン、プレスハム、ソーセージ等）、水産製品（冷凍すりみ、かまぼこ、ちくわ、はんぺん、さつま揚げ、つみれ、すじ、魚肉ハム、ソーセージ、かつお節、魚卵加工品、水産缶詰、つくだ煮等）、乳製品（原料乳、クリーム、ヨーグルト、バター、チーズ、練乳、粉乳、アイスクリーム等）、野菜・果実加工品（ペースト類、ジャム類、漬け物類、果実飲料、野菜飲料、ミックス飲料等）、菓子類（チョコレート、ビスケット類、菓子パン類、ケーキ、餅菓子、米菓類等）、アルコール飲料（日本酒、中国酒、ワイン、ウイスキー、焼酎、ウオッカ、ブランデー、ジン、ラム酒、ビール、清涼アルコール飲料、果実酒、リキュール等）、嗜好飲料（緑茶、紅茶、ウーロン茶、コーヒー、清涼飲料、乳酸飲料等）、調味料（しょうゆ、ソース、酢、みりん等）、缶詰・瓶詰め・袋詰め食品（牛飯、釜飯、赤飯、カレー、その他の各種調理済み食品）、半乾燥または濃縮食品（レバーペースト、その他のスプレッド、そば・うどんの汁、濃縮スープ類）、乾燥食品（即席麺類、即席カレー、インスタントコーヒー、粉末ジュース、粉末スープ、即席味噌汁、調理済み食品、調理済み飲料、調理済みスープ等）、冷凍食品（すき焼き、茶碗蒸し、うなぎかば焼き、ハンバーグステーキ、シュウマイ、餃子、各種スティック、フルーツカクテル等）、固形食品、液体食品（スープ等）、香辛料類等の農産・林産加工品、畜産加工品、水産加工品等が挙げられる。
【０１０５】
本発明の食品または飲料としては、式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩から選択される化合物が含有、希釈および／または添加されており、その生理機能を発現するための必要量が含有されていれば特にその形状に限定は無く、タブレット状、顆粒状、カプセル状等の形状の経口的に摂取可能な形状物も包含する。
【０１０６】
本発明の食品または飲料は生理活性を有する式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩から選択される化合物を含有し、これらのアポトーシス誘発作用、制がん作用等の生理機能によって、これらを摂取することにより発がん予防、がん抑制効果等の式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩に感受性を示す疾患の症状改善作用または予防作用を示す健康食品または飲料であり、特に胃腸健康保持に有用な食品または飲料である。
【０１０７】
また、そのα−グリコシダーゼ阻害活性により、式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩から選択される化合物を含有、希釈および／または添加してなる食品は血糖上昇抑制作用を示す食品または飲料として、抗糖尿病用食品または抗糖尿病用飲料、抗肥満用食品または抗肥満用飲料、抗高脂血症用食品または抗高脂血症用飲料等として有用である。
【０１０８】
また、式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩は、活性酸素産生抑制作用、過酸化脂質ラジカル産生抑制作用等の抗酸化活性を有し、抗酸化用食品用の抗酸化剤または抗酸化用飲料用の抗酸化剤、例えば活性酸素産生抑制剤、過酸化脂質ラジカル産生抑制剤、ＮＯ産生抑制剤等として抗酸化用食品または抗酸化用飲料の製造に使用することができる。
【０１０９】
上記化合物から選択される少なくとも一つの化合物を有効成分とする本発明の抗酸化剤の剤型は特に限定されるものではなく、添加対象となる食品または飲料の種類によって常法に従って、粉末状、ペースト状、乳化物等の適宜な剤型にすることができ、本発明に使用する化合物を有効成分として含有する食品または飲料は本発明の抗酸化剤を使用することにより簡便に製造することができる。
【０１１０】
また、本発明において式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表される抗酸化用化合物が提供される。
【０１１１】
式（Ｉ）で表される抗酸化用化合物は、例えば、３，６−アンヒドロガラクトース含有物のｐＨ７未満の酸性下での酸分解物および／または酵素分解物を中性からアルカリの条件下で処理を行うことにより得ることができる。またその精製物、部分精製物等を使用することができる。
【０１１２】
またその３，６−アンヒドロガラクトース含有物としては、例えば、紅藻類由来の３，６−アンヒドロガラクトース含有物、例えば、寒天、アガロースおよび／またはカラゲナンが使用できる。
【０１１３】
式（ＩＩ）で表される抗酸化用化合物は、式（Ｉ）で表される化合物とＳＨ基含有化合物を反応させることにより得ることができ、精製物、部分精製物等を使用することができる。
【０１１４】
本発明の抗酸化用化合物は生体内の酸化物質、例えば活性酸素の除去や産生抑制に有用であり、該抗酸化糖化合物は活性酸素の産生および／または過剰が起因となる疾病の症状改善または予防に有用である。
【０１１５】
上記のように、生体内において活性酸素生成系が消去系に対して優位に立った場合、生体は酸化的障害を受けることにより生じる酸化ストレスは様々な疾患と関わり、生体は、常に酸化ストレスによる疾患、あるいは、疾病の悪化につながる状況にさらされている。したがって、このような酸化ストレスが引き起こす疾病の予防、治療あるいは悪化防止には、毎日、適度の抗酸化物質を摂取することが望ましい。毎日適度の量を摂取するには、食品および／または飲料から摂取するのが望ましく、本発明の抗酸化用化合物を含有、希釈および／または添加してなる食品または飲料は抗酸化用食品または抗酸化用飲料として、また抗酸化ストレス食品または抗酸化ストレス飲料として極めて有用である。
【０１１６】
本発明に使用する化合物は保水性も合せ有し、本発明に使用する化合物を有効成分とし抗便秘剤を製造することができる。抗便秘用食品、抗便秘用飲料を製造することができる。
【０１１７】
本発明によれば、さらに、式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩から選択される化合物を有効成分とする化粧料が提供される。
【０１１８】
化粧料としては、上記糖化合物を有効成分とし、クリーム、乳液、ローション、洗顔料、パック等の基礎化粧料、口紅、ファンデーション等のメイクアップ化粧料、ボディソープ、石鹸等の形態に調製することができる。また、頭髪に対しても有効であり、ヘアートニック、ヘアーリキッド、ヘアーセットローション、ヘアーブロー剤、ヘアークリーム、ヘアーコート等のヘアー製品やシャンプー、リンス、ヘアートリートメント等の頭髪用トイレタリー等のヘアーケアー製品の形態にすることができる。化粧料への配合量はその美白作用、保湿作用、抗酸化作用等により、適宜決定すればよい。化粧料の他の成分は通常化粧料に配合されるものが使用できる。なお美白作用、保湿作用は常法にて測定すればよく、例えば特開平８−３１０９３７号公報記載の方法で測定することができる。
【０１１９】
本発明の化粧料は皮膚への美白作用、保湿作用、抗酸化作用、活性酸素産生抑制作用、抗酸化ストレス作用、毛髪への保湿作用、抗酸化作用、活性酸素産生抑制作用、抗酸化ストレス作用等により優れた性質を示す。
【０１２０】
本発明において式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩から選択される化合物を有効成分とする鮮度保持剤が提供される。 式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩は抗酸化作用、鮮度保持作用、チロシナーゼ活性阻害作用、抗病原微生物活性、抗変異原活性を有し、式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩から選択される化合物を有効成分として、公知の製剤化方法により、食品の変色、腐敗、酸化等を効果的に防止する食品の鮮度保持剤を製造することができる。本発明の鮮度保持剤は種々の食品、生鮮食品、加工食品等の味や鮮度の保持に極めて有用である。
【０１２１】
本発明によれば、３，６−アンヒドロガラクトースおよび／または還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを有する化合物を、中性からアルカリの条件下で処理することにより生成するアポトーシス誘発性物質（以下、単に本発明のアポトーシス誘発性物質と称する）を有効成分とし、アポトーシス誘発剤を製造することができる。アポトーシス誘発剤としては、上記のアポトーシス誘発剤に準じ製造すればよい。
【０１２２】
本発明のアポトーシス誘発性物質を有効成分とするアポトーシス誘発剤の投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的およびこれに適用される患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され、一定ではないが一般には製剤中に含有される有効成分の量が成人１日当り１０μｇ〜２００ｍｇ／ｋｇである。もちろん投与量は、種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。本発明の薬剤はそのまま経口投与するほか、任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることもできる。
【０１２３】
本発明のアポトーシス誘発性物質を有効成分とするアポトーシス誘発性物質はがん細胞の増殖抑制活性を有し、本発明のアポトーシス誘発性物質を有効成分として制がん剤を製造することができる。
【０１２４】
本発明のアポトーシス誘発性物質を有効成分とする制がん剤の製造方法、用量、用法は上記アポトーシス誘発剤に準じて、製造、使用すればよい。
【０１２５】
本発明のアポトーシス誘発性物質はがん疾患等の治療薬として用いることができる。また、本発明のアポトーシス誘発性物質で表される化合物を有効成分として使用するアポトーシス誘発方法は生体防御機構、がん疾患等の研究、アポトーシス誘発阻害剤の開発等に有用である。
【０１２６】
本発明のアポトーシス誘発性物質を含有、希釈および／または添加してなる食品または飲料中には、本発明のアポトーシス誘発性物質の生理作用を発現するための有効量が含有されておればよい。本発明の食品または飲料、例えば、アポトーシス誘発用食品またはアポトーシス誘発用飲料、制がん用食品または制がん用飲料のそれぞれの製造方法には特に限定はないが、調理、加工および一般に用いられている食品または飲料の製造方法を挙げることができ、製造された食品または飲料にアポトーシス誘発作用または制がん作用を示す本発明のアポトーシス誘発性物質の有効量が含有されておればよい。３，６−アンヒドロガラクトースおよび／または還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを含有する原料を、食品または飲料の製造過程において、ｐＨ７超のアルカリで処理することにより、生成する本発明のアポトーシス誘発性物質を含有、希釈および／または添加してなる食品または飲料も本発明の食品または飲料に包含される。
【０１２７】
本発明の食品または飲料としては、本発明のアポトーシス誘発性物質が含有、添加および／または希釈されていれば特にその形状に限定は無く、タブレット状、顆粒状、カプセル状等の形状の経口的に摂取可能な形状物も包含する。
【０１２８】
本発明の食品または飲料は、そのアポトーシス誘発作用、制がん作用により、消化器系がん等の症状改善、予防に極めて有用である。
【０１２９】
式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、それらの塩、本発明のアポトーシス誘発性物質のいずれかを１００ｍｇ／ｋｇでマウスに単回経口投与しても死亡例は認められない。
【０１３０】
以上記載したように、式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、それらの塩、及び本発明のアポトーシス誘発性物質はその種々の生理的機能によって、医薬、食品、飲料等の広い分野において極めて有用な化合物である。
【０１３１】
また３，６−アンヒドロガラクトースおよび／または還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを含有する原料を、食品または飲料の製造過程において、ｐＨ７超のアルカリで処理することにより生成し、人為的に生成された式（Ｉ）で表される化合物及び／又は本発明のアポトーシス誘発物質の使用も本発明に包含されるものである。
【０１３２】
また式（Ｉ）で表される化合物とＳＨ基含有化合物、例えばＳＨ基含有アミノ酸、又はその誘導体、例えばシステイン、システイン含有アミノ酸誘導体、例えばグルタチオンとの反応物として、食品、飲料中でも生成し、人為的に生成された式（ＩＩ）で表される化合物の使用も本発明に包含されるものである。
【０１３３】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【０１３４】
実施例１ Ｌ−グリセロ−１，５−エポキシ−１αβ，６−ジヒドロキシ−シス−ヘキサ−３−エン−２−オン（ＤＧＥ）およびＤ−グリセロ−１，５−エポキシ−１αβ，６−ジヒドロキシ−シス−ヘキサ−３−エン−２−オン（κ−ＤＧＥ）の調製
（１）市販の寒天（Agar Noble、ＤＩＦＣＯ社製）２．５ｇを５０ｍｌの０．１Ｎ ＨＣｌに懸濁し、１００℃で１３分間加熱して溶解した。室温まで冷却してＮａＯＨでｐＨ中性付近に調整した後、コスモナイスフィルターでろ過し、以下の順相ＨＰＬＣで分離した。
【０１３５】
カラム：ＴＳＫｇｅｌ Ａｍｉｄｅ−８０（２１．５ｍｍ×３００ｍｍ、東ソー社製）
溶媒Ａ：９０％アセトニトリル水溶液
溶媒Ｂ：５０％アセトニトリル水溶液
流速：５ｍｌ／分
溶出：溶媒Ａから溶媒Ｂへの直線濃度勾配（８０分間）→溶媒Ｂ（２０分間）
検出：１９５ｎｍにおける吸光度
試料アプライ量：２ｍｌ
【０１３６】
保持時間６６．７分、７８．５分および８５．５分のピークを分取して質量分析を行ったところ、これらの物質は各々アガロビオース、アガロテトラオースおよびアガロヘキサオースであった。上記のＨＰＬＣによる分離を８回繰り返して減圧下乾固し、１２２ｍｇのアガロビオース、１１１ｍｇのアガロテトラオースおよび５５ｍｇのアガロヘキサオースを得た。
【０１３７】
（２）実施例１−（１）で得たアガロビオースの１００ｍＭ水溶液（試料１）６００μｌに１Ｎ ＮａＯＨ １２μｌを加えてｐＨ１１．５に調整し、３７℃で５分間保温した。次に１Ｎ ＨＣｌ １２μｌを加えてｐＨ５付近に調整し（試料２）、その内５０μｌには１Ｎ ＨＣｌ １μｌをさらに加えてｐＨ２付近に調整した（試料３）。
【０１３８】
試料１〜３のアポトーシス誘発活性として、以下の方法でそのがん細胞増殖抑制活性を測定した。その結果、各試料はほぼ同等のがん細胞増殖抑制活性を有していた。
【０１３９】
試料１〜３をそれぞれろ過滅菌して滅菌水で適宜希釈し、その１０μｌずつを９６ウェルマイクロタイタープレートに入れた。そこに５０００個のＨＬ−６０細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４０）を含む５６℃、３０分間処理した１０％ウシ胎児血清（ギブコ社製）含有ＲＰＭＩ１６４０培地（ニッスイ社製）９０μｌを加え、５％炭酸ガス存在下、３７℃で４８時間培養した。光学顕微鏡で細胞の形態を観察した後、５ｍｇ／ｍｌの３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（シグマ社製）リン酸緩衝食塩水溶液１０μｌを加えてさらに４時間培養を続け、０．０４Ｎ ＨＣｌ含有２−プロパノール１００μｌを加えてよく撹拌し、５９０ｎｍにおける吸光度を測定してこれを細胞増殖度とした。
【０１４０】
（３）実施例１−（２）記載の試料１〜３をシリカゲルシート６０Ｆ254（メルク社製）にスポットし、エタノール：１−ブタノール：水＝５：５：１を展開溶媒に用いて展開した後、オルシノール−硫酸試薬を噴霧して検出した。その結果、試料２および試料３にはアガロビオースのスポットは観察されず、数個の新たなスポットが観察された。
【０１４１】
試料１および２、各々１０μｌを以下の順相ＨＰＬＣで分離した。
【０１４２】
カラム：ＰＡＬＰＡＫ ＴｙｐｅＳ（４．６×２５０ｍｍ、宝酒造社製）
移動相Ａ：９０％アセトニトリル水溶液
Ｂ：５０％アセトニトリル水溶液
流速：１ｍｌ／分
溶出：移動相Ａ（１０分間）→移動相Ａから移動相Ｂへの直線濃度勾配
（４０分間）→移動相Ｂ（１０分間）
検出：１９５ｎｍにおける吸光度
カラム温度：４０℃
【０１４３】
この結果、試料１に見られるアガロビオースのピークは試料２には見られず、新たに複数のピークが見られた。試料２の各ピークを分取し、減圧下乾固して水に溶解し、上記方法で各画分のがん細胞増殖抑制活性を測定した。その結果、活性は保持時間４．０５分〜４．１６分の画分に存在した。
【０１４４】
以上の結果を図１に示す。すなわち図１は試料２の順相ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す図であり、図１において横軸は保持時間（分）、縦軸は吸光度を示す。
【０１４５】
（４）実施例１−（１）で調製したアガロテトラオース、アガロヘキサオースおよびκ−カラゲナンの０．１Ｎ塩酸分解物より調製したκ−カラビオースを実施例１−（２）記載の方法に準じ、アルカリ処理物を調製し、実施例１−（２）記載の方法に準じそのがん細胞増殖抑制活性を測定した。その結果、各アルカリ処理物にがん細胞増殖抑制活性が認められた。
【０１４６】
なお、κ−カラビオースは下記のように調製した。
【０１４７】
κ−カラゲナン（シグマ社製、Ｃ−１２６３）２．５ｇを５０ｍｌの０．１Ｎ ＨＣｌに懸濁し、１００℃で１６分間加熱して溶解した。室温まで冷却してＮａＯＨでｐＨ中性付近まで中和した後、コスモナイスフィルターでろ過し、実施例１−（３）記載の順相ＨＰＬＣで分離し、溶出時間２７．８分のκ−カラビオースを集めて減圧下乾固し、κ−カラビオースを調製した。
【０１４８】
（５）市販の寒天（Agar Noble）２．５ｇを５０ｍｌの０．１Ｎ ＨＣｌに懸濁し、１００℃で１３分間加熱して溶解した。室温まで冷却してＮａＯＨでｐＨ１２に調整し、次いで中和処理を行った。
【０１４９】
中和処理物を実施例１−（３）記載の順相ＨＰＬＣを行い、各ピークを分取し、減圧下乾固して水に溶解し、上記方法で各画分のがん細胞増殖抑制活性を測定し、保持時間４．０５分〜４．１６分の画分の細胞増殖抑制活性を確認した。またアポトーシス小体の形成を確認した。
【０１５０】
次に、この保持時間４．０５分〜４．１６分の画分を大量に分取し、構造解析用試料を作製した。
【０１５１】
次に、高速原子衝撃質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ）を、ＤＸ３０２質量分析計（日本電子社製）を用いて行った。また、試料を重ジメチルスルホキシドに溶解し、核磁気共鳴法（ＮＭＲ）によってその構造を解析した。その結果を以下に示す。
【０１５２】
また、保持時間４．０５分〜４．１６分の画分のマススペクトルを表す図を図２に、保持時間４．０５分〜４．１６分の画分の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを表す図を図３に示す。図２において横軸はｍ／ｚ、縦軸は相対強度（％）を示す。また図３において横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）、縦軸はシグナルの強度を示す。
【０１５３】
ＦＡＢ−ＭＳ： ｍ／ｚ １４５［Ｍ＋Ｈ］+
【０１５４】
試料をジメチルスルホキシドに溶解し、マトリックスとしてグリセロールを用いて測定した。
【０１５５】
1Ｈ−ＮＭＲ：
δ３．５０（１Ｈ，ｍ，６−Ｈ），３．５９（１Ｈ，ｍ，６−Ｈ），４．５２（１Ｈ，ｍ，５−Ｈ），４．９５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，１−Ｈ），５．０２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，６−ＯＨのＨ），６．０５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．５，１０．５Ｈｚ，３−Ｈ），７．２０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．５，１０．５Ｈｚ，４−Ｈ），７．３５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，１−ＯＨのＨ）
【０１５６】
ただし、重ジメチルスルホキシドの残留プロトンの化学シフト値を２．４９ｐｐｍとして表した。
【０１５７】
なお、1Ｈ−ＮＭＲにおけるシグナルの帰属の番号は下記式のとおりである。
【化６】
【０１５８】
以上より、保持時間４．０５分〜４．１６分の画分はＬ−グリセロ−１，５−エポキシ−１αβ，６−ジヒドロキシ−シス−ヘキサ−３−エン−２−オン（L−glycero-1,5-epoxy-1αβ,6-dihydroxy-cis-hex-3-en-2-one）（以下、単にＤＧＥと称す）であることが明らかになった。
【０１５９】
同様にしてκ−カラビオースのアルカリ処理を上記実施例に準じ行い、そのアルカリ処理から上記実施例に準じ、アポトーシス誘発活性物質であるＤ−グリセロ−１，５−エポキシ−１αβ，６−ジヒドロキシ−シス−ヘキサ−３−エン−２−オン（以下、κ−ＤＧＥと称す）を精製した。
【０１６０】
（６）寒天粉末（ナカライ社製）４５ｇを蒸留水４００ｍｌに懸濁し、さらに、１１Ｎ ＨＣｌ４．１ｍｌを加え、４５０ｍｌに蒸留水でフィルアップした。この酸性懸濁液を９０℃で３５分加熱した。その後、酸性加熱物を１０Ｎ ＮａＯＨで中和し、さらに、１Ｎ ＮａＯＨを２．７ｍｌ添加して、アルカリ性で３７℃で１５分間加熱した。このアルカリ加熱物を１Ｎ ＨＣｌで中和後、エバポレーターで１５０ｍｌまで濃縮した。この濃縮液を等量の酢酸エチルで抽出を１０回行い、１０回分の酢酸エチル層を集め、エバポレーターで２ｍｌまで濃縮した後、２０ｍｌのクロロホルム：メタノール＝９：１溶液に溶解した。この溶液をカラム容量：２５０ｍｌ、流圧：０．２Ｋｇｆ／ｃｍ２、移動相溶媒：クロロホルム：メタノール＝９：１、画分容量：８ｍｌの条件のシリカカラムクロマトグラフィーで分離した。その後、各画分の一部を薄層クロマトグラフィー（展開溶媒、クロロホルム：メタノール＝９：１）で分析し、Ｒｆ値が０．２５付近のスポットだけを含む画分５２〜７８をＤＧＥ画分として集め、エバポレーターで２ｍｌまで濃縮した。この濃縮液を再度、上記方法と同様の方法でシリカカラムクロマトグラフィーを行い、画分６４〜９６をＤＧＥ画分として集め、エバポレーターで濃縮した後、８ｍｌの蒸留水に溶解した。このＤＧＥ水溶液を凍結乾燥し、ＤＧＥ標品１１３ｍｇを得た。
【０１６１】
実施例２ アポトーシス誘発試験
（１）５６℃、３０分間処理したウシ胎児血清（ＪＲＨ社製）を１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＢＩＯ ＷＨＩＴＴＡＫＥＲ社製）にて３７℃で培養したＨＬ−６０細胞をＲＰＭＩ１６４０培地にて２．５×１０５細胞／４．５ｍｌとなるように懸濁した。
【０１６２】
この懸濁液４．５ｍｌに対し、１２５μＭ、２５０μＭ、５００μＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、４ｍＭのＤＧＥ水溶液を５００μｌ添加し、３７℃、５％炭酸ガス存在下で、２４時間培養した。
【０１６３】
培養細胞を光学顕微鏡下で観察し、最終濃度５０μＭ以上のＤＧＥ添加培養細胞に核の凝縮、細胞の縮小、アポトーシス小体の形成をそれぞれ確認した。なお、対照の生理食塩水５００μｌ添加培養細胞においてはこれらの現象は認められなかった。
【０１６４】
次いで、上記と同様の方法で２４時間と４８時間培養した細胞を用い、細胞工学別冊実験プロトコールシリーズアポトーシス実験プロトコール（秀潤社）第１２９〜１３０頁記載の方法でＦＡＣＳｃａｎを用いたアポトーシス細胞の測定、イオマニュアルＵＰシリーズ 最新アポトーシス実験法（羊土社）第６１〜６３頁記載の方法でＤＮＡの断片化の解析を行った。その結果、最終濃度５０μＭ以上のＤＧＥ添加培養細胞にアポトーシス細胞を、５０、１００μＭのＤＧＥ添加培養細胞にＤＮＡの断片化を確認した。なお、対照の生理食塩水５００μｌ添加培養細胞においてはこれらの現象は認められなかった。
【０１６５】
（２）実施例２−（１）と同様の方法で２４時間培養した細胞を一部サンプリングし、０．４％トリパンブルーで染色後、光学顕微鏡で観察し、染色されていない生細胞と青く染色された死細胞の細胞数の測定を行い、生残率が５０％になるＤＧＥの濃度［生残率５０（μＭ）］をもとめた。その結果、８１．７μＭであった。以上のとおり、ＤＧＥはアポトーシス誘発作用によるがん細胞増殖抑制活性を示した。また、κ−ＤＧＥも同様の活性を示した。
【０１６６】
実施例３ 過酸化脂質ラジカル産生抑制試験
スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）３Ａ（ナショナル・コレクション・オブ・タイプ・カルチャー、ＮＣＴＣ ８３１９）を５ｍｌのブレインハートインフュージョン培地（ディフコ社製、００３７−１７−８）に接種し、３７℃で１晩培養した。遠心によって菌体を集め、リン酸緩衝食塩水で３回洗浄した後、１×１０７コロニー形成単位／ｍｌになるようにリン酸緩衝食塩水に懸濁した。１００μｌの上記菌懸濁液、１００μｌの１０、１００ｍＭのＤＧＥ水溶液、１００μｌの１ｍｇ／ｍｌメトヘモグロビン（シグマ社製、Ｍ９２５０）水溶液および６００μｌのリン酸緩衝食塩水および１００μｌの５０ｍＭ ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド（片山化学社製、０３−４ ９９０）水溶液を混合して３７℃で３０分間反応させた。１ｍｌの２×ＮＭＰ培地［８ｇのニュートリエントブロス（ディフコ社製、０００３−０１−６）、５ｇのトリプトン（ディフコ社製、０１２３−１７−３）、５ｇのＮａＣｌ、１０ｇのマンニトール（ナカライテスク社製、２１３−０３）、０．０３５ｇのフェノールレッド（ナカライテスク社製、２６８−０７）を蒸留水に溶解して５００ｍｌとし、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整後、ろ過滅菌したもの］を加えて反応を停止し、ＮＭＰ培地（２×ＮＭＰ培地を滅菌水で２倍希釈したもの）で３倍ずつ１２段階希釈したもの各１６０μｌを９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルに入れ、３７℃で１晩培養した。培地の色を肉眼で観察し、菌が生育して培地が赤色から黄色に変化したウェルが見られた試料を過酸化脂質ラジカル産生抑制活性を持つものとした。
【０１６７】
その結果を表１に示す。表１において、＋は菌の生育したウェルが見られた試料を、−は菌の生育したウェルが見られなかった試料を示す。また、表の最上列に示した濃度はｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシドおよび菌体と３７℃で３０分間反応させた反応液中のＤＧＥの濃度である。
【０１６８】
【表１】
【０１６９】
以上の結果、ＤＧＥには過酸化脂質ラジカル産生抑制活性が見られた。また、κ−ＤＧＥ、後出のＤＧＥ−ＧＳＨも同様の活性を示した。
【０１７０】
実施例４ ＮＯ産生抑制試験
（１）１０％ウシ胎児血清（ギブコ社製）含有、フェノールレッド不含、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（ライフテックオリエンタル社製、２５０３０−１４９）含有ダルベッコ改良イーグル培地（バイオウィタカー社製、１２−９１７Ｆ）にＲＡＷ２６４．７細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ ７１）を３×１０５細胞／ｍｌになるように懸濁し、４８ウェルマイクロタイタープレートのウェルに５００μｌずつ加えて５％炭酸ガス存在下、３７℃で１２時間培養した。各ウェルに１０μｌの２５μｇ／ｍｌリポポリサッカライド（ＬＰＳ、シグマ社製、Ｌ−２０１２）、５００Ｕ／ｍｌインターフェロンγ（ＩＮＦ−γ、コスモバイオ社販売 ＧＺＭ−ＭＧ−ＩＦＮ）水溶液と１０μｌの２５０、５００μＭ ＤＧＥ水溶液を添加してさらに１２時間培養した後、ＮＯが培地中で酸化されることによって生ずるＮＯ２−濃度の測定を行った。なお、対照としてＬＰＳとＩＮＦ−γを加えない区分およびＤＧＥを加えない区分を設定した。
【０１７１】
上記培養後、１００μｌの培地に１００μｌの４％グリース試薬（シグマ社製、Ｇ４４１０）を加え、室温で１５分間放置した後、４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。上記培地に溶解した既知の濃度のＮａＮＯ２で作製した検量線から培地中のＮＯ２−濃度を計算した。測定はすべて３連で行った。
【０１７２】
この結果、ＤＧＥは濃度依存的にＬＰＳとＩＮＦ−γによるＮＯ産生誘導を抑制した。その結果を図４に示す。すなわち、図４はＤＧＥを添加して各培養条件で培養した時の培地中のＮＯ２−濃度を示す図である。図４において横軸は培養条件を、縦軸はＮＯ２−濃度（μＭ）を示す。
【０１７３】
また、上記と同様の培養条件で、４、６、８時間培養したＲＡＷ２６４．７細胞よりＲＮＡを調製し、該ＲＮＡ中に含有されるｉＮＯＳ［inducible NO synthase、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション（Biochem. Biophys. Res. Commun.) 第215巻、第148-153頁（1995)］をコードするｍＲＮＡ量をＲＴ−ＰＣＲ法により調べた。その結果、ＤＧＥ水溶液を加えない対照ではｉＮＯＳ ｍＲＮＡ由来のＤＮＡ断片の増幅が認められたが、ＤＧＥ水溶液を添加したものではこの断片の増幅が見られなかった。このことより、ＤＧＥによるＮＯ産生抑制はｉＮＯＳの転写抑制を介して起こっていることが示唆された。
【０１７４】
（２）１０％ウシ胎児血清含有、フェノールレッド不含、２ｍＭ Ｌ−グルタミン含有ダルベッコ改良イーグル培地にＲＡＷ２６４．７細胞を３×１０５細胞／ｍｌになるように懸濁し、４８ウェルマイクロタイタープレートのウェルに５００μｌずつ加えて５％炭酸ガス存在下、３７℃で６時間培養した。ＤＧＥを０．５ｍＭとなるように水に溶解し、ろ過滅菌した水溶液を、各ウェルに１０μlずつそれぞれ添加し、さらに、０．５時間あるいは５時間培養した。その後、各ウェルに１０μlの５μｇ／ｍｌ ＬＰＳ、２０００Ｕ／ｍｌ ＩＮＦ−γ水溶液を添加して、１２時間培養した後、ＮＯが培地中で酸化されることによって生ずるＮＯ２−濃度の測定を行った。なお、対照としてＬＰＳ、ＩＦＮ−γを加えない区分およびＤＧＥを加えない区分を設定した。
【０１７５】
上記培養後、１００μｌの培養上清に１００μｌの４％グリース試薬を加え、室温で１５分間放置した後、４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。上記培地に溶解した既知の濃度のＮａＮＯ２で作製した検量線から培地中のＮＯ２−濃度を計算した。
【０１７６】
測定は全て３連で行った。
【０１７７】
この結果、ＬＰＳ、ＩＦＮγ添加前、ＤＧＥ存在下０．５時間培養した区分より、５時間培養した区分で、より強いＮＯ産生抑制が認められた。
【０１７８】
その結果を、図５に示す。すなわち、図５は前培養においてＤＧＥを添加した場合の、各培養条件下で培養した時の培地中のＮＯ２−濃度を示す図である。図５において横軸は培養条件を、縦軸はＮＯ２−濃度（μＭ)を示す。
【０１７９】
以上、ＤＧＥはＮＯ産生抑制作用を示した。また、κ−ＤＧＥも同様の活性を示した。
【０１８０】
実施例５ 抗菌試験
ＤＧＥのエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｗ３１１０（菌１）、サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium)ＬＴ２（菌２）、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis)ＩＦＯ３０２１（菌３）、シュードモナス・アエルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa)ＩＦＯ３０８０（菌４）およびストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans)ＧＳ５（菌５）に対する抗菌作用を以下の方法で検討した。
【０１８１】
菌１から４はＬ−ブロスで一晩種培養し、その培養液の濁度を測定して菌数が約２×１０５細胞／１８０μｌとなるように感受性ブイヨン培地（ニッスイ社製）に希釈した。一方、菌５は、ブレインハートインフュージョン培地で一晩種培養し、その培養液の濁度を測定して菌数が約２×１０５細胞／１８０μｌとなるようにブレインハートインフュージョン培地に希釈した。これらの菌希釈液を９６ウェルのマイクロタイタープレートの各ウェルに１８０μｌずつ入れた。一方で、菌希釈液をさらに希釈してからＬ−ブロスあるいはブレインハートインフュージョン培地のプレートに塗布し、３７℃で一晩培養し、コロニー数を計測して、初発の生菌数を測定した。
【０１８２】
１４．４ｍｇ／ｍｌのＤＧＥを２倍ずつ希釈した一連の希釈液を作製し、菌希釈液を入れた各ウェルに２０μｌずつ入れ、２４時間３７℃で静置培養した。培養後、それぞれの培養液の濁度を測定し、生理食塩水を添加したコントロールより濁度が低いウェルの試料濃度を最小増殖阻害濃度とした。
【０１８３】
さらに、菌の生育が見られなかったウェルの培養液をプレートに塗布し、３７℃で一晩培養した後、コロニー数を計測して、生菌数を測定した。試料を添加してから２４時間静置培養した培養液の生菌数が、あらかじめ測定しておいた初発の生菌数より低い培養液の試料濃度を最小殺菌濃度とした。その結果、菌１から菌５に対するＤＧＥの最小増殖阻害濃度と最小殺菌濃度は、表２に示すようになった。
【０１８４】
【表２】
【０１８５】
以上、ＤＧＥは抗菌作用を示した。また、κ−ＤＧＥ、後出のＤＧＥ−ＧＳＨも同様の活性を示した。
【０１８６】
実施例６ 抗変異原性試験
抗変異原性試験を、変異の強さをβ−ガラクトシダーゼの活性で判定できるｕｍｕテストによる環境変異原の検出法［ミューテーション・リサーチ（Mutation reseach）、第１４７巻、第２１９頁（１９８５）］に準じた方法で行った。すなわち、５０μｌの各濃度（１．０、５．０、１０、１５ｍＭ）に調製したＤＧＥに２５μｌの変異原物質［マイトマイシンＣ（ＤＮＡ架橋剤）１０μｇ／ｍｌ、４−ニトロキノリン−１−オキシド（ＮＱＯ、ＤＮＡメチル化剤）７μｇ／ｍｌ］を添加した。この混合液にあらかじめＴＧＡ培地中でＯＤ６００で０．１２まで培養しておいたSalmonella typhimulium ＴＡ１５３５／ｐＳＫ１００２を最終容量１．５ｍｌになるように加えて、３７℃で２時間振とう培養を行った。この培養液２００μｌを使用してミラー（Miller）の方法〔エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティクス（Experiments in molecular genetics)、第３５２頁（１９７２）］に従ってβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。その結果を表３に示す。
【０１８７】
【表３】
【０１８８】
この表から明らかな様に、ＤＧＥはＤＮＡ架橋剤であるマイトマイシンＣに対して最終濃度０．５ｍＭで３７％、メチル化剤であるＮＱＯについては３６％の抗変異原活性を表した。また、κ−ＤＧＥ、後出のＤＧＥ−ＧＳＨも同様の活性を示した。
【０１８９】
実施例７ 制がん活性試験
（１）寒天粉末（和光純薬社製）を終濃度３％となるように５０ｍＭクエン酸溶液に入れ、９５℃、１６０分の加熱処理を行い、用時ｐＨ１２のアルカリ処理を行い、中和後、制がん試験用の被検液とした。
【０１９０】
日本チャールスリバー社より４週令、雄性のヌードマウス（ＳＰＦ／ＶＡＦＢａｌｂ／ｃＡｎＮＣｒｊ−ｎｕ）を購入し、１週間予備飼育した。このマウスにヒト大腸がん細胞株ＨＣＴ１１６（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４７）を１．５× １０６細胞／マウスとなるように皮下移植した。
【０１９１】
大腸がん細胞株移植２週間目から、上記制がん試験用被検液を使用直前にｐＨ６．５に調整したものを週に５日、飲料水として自由に摂取させた。マウス１匹当り１日平均３．５ｍｌ摂取していた。また飼育用餌としてオリエンタル酵母社製のＭＦを自由に摂取させた。
【０１９２】
被検液投与開始後４週間目に被検液投与群の各マウスの固形がんを摘出し、その重量を、通常の飲料水を摂取させた対照群の固形がん重量と比較した。なお、本試験は各群１０匹で行った。
【０１９３】
その結果、制がん試験用被検液の経口投与群において有意のがん増殖抑制が認められた。
【０１９４】
（２）５週齢の雌性ｄｄＹ系マウス（体重約２５ｇ）１８匹を用い、エーリッヒ癌を腹腔内投与（１．２×１０６細胞／マウス）し、３０日間観察し、平均生存日数、延命率および３０日間生存数を算定した。１群６匹でコントロール群、ＤＧＥ２ｍｇ／ｋｇ投与群およびＤＧＥ２０ｍｇ／ｋｇ投与群の３群を設定した。ＤＧＥは、癌投与の翌日より４日間腹腔内投与した。
【０１９５】
結果を表４に示す。すなわち、コントロール群では平均生存日数が１４．３日であったのに対し、ＤＧＥ２ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇ投与群では３０日間生存例をそれぞれ１および３例出現させ、平均生存日数２３．７日および２８．０日で延命率はそれぞれ１４１％以上および１９５％以上と、顕著な延命効果が認められた。
【０１９６】
【表４】
【０１９７】
以上、ＤＧＥは制がん活性を示した。またκ−ＤＧＥ、後出のＤＧＥ−ＧＳＨも同様の活性を示した。
【０１９８】
実施例８ メラニン産生抑制試験
６ウェルプレートに５×１０４細胞／ウェル／２ｍｌ培地となるように１０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁したマウスメラノーマ細胞Ｂ１６ＢＬ６を分注し、３７℃でインキュベートした。２日目に、１００μｌのＤＧＥ溶液（２ｍｇ／ｍｌ〜０．２ｍｇ／ｍｌ）を添加し、７日目に培地を交換し、同時に１００μｌのＤＧＥ溶液（２ｍｇ／ｍｌ〜０．２ｍｇ／ｍｌ）を添加した。８日目に細胞を回収し、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質を分解処理した後、４００ｎｍの吸光度を測定し、メラニン産生抑制作用を検定した。
【０１９９】
すなわち、培地を吸引除去した後、２０ｍＭ ＥＤＴＡ溶液に溶解した０．２５％トリプシンを１ウェル当り０．３ｍｌ添加し、３７℃で１０分インキュベートした。つぎに、２ｍｌの新しい培地を添加し、細胞を懸濁して試験管に回収した。ついで、培地を遠心除去した後、２ｍｌのＰＢＳで細胞を懸濁し、再度遠心分離した。上清を除去した後、細胞に３０μｌの５ｍＭ塩化マンガンを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）と１μｌの７００００Ｕ／ｍｌのＤＮａｓｅＩ（宝酒造社製）を加えて良く混合した後、３７℃で２時間インキュベートして、ＤＮＡを分解した。そして１０ｍｇ／ｍｌのリボヌクレアーゼＡ（シグマ社製）を１μｌ加え、５０℃で１時間インキュベートしてＲＮＡを分解した。最後に１００μｇ／ｍｌのプロテイネースＫ（シグマ社製）、０．１％トリトンＸおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む１００ｍＭトリス−塩酸バッファー（ｐＨ７．８）を細胞数２×１０６に対して液の総量が２００μｌとなるように加え、３７℃で１６時間インキュベートした後、４００ｎｍの吸光度を測定した。
【０２００】
その結果、ＤＧＥにメラニン産生阻害活性が認められ、その美白効果が確認された。また、κ−ＤＧＥ、後出のＤＧＥ−ＧＳＨも同様の活性を示した。
【０２０１】
実施例９ α−グルコシダーゼ阻害試験
（１）α-グルコシダーゼ発色基質であるｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−グルコピラノシドに酵母由来α−グルコシダーゼを作用させ、加水分解して遊離する４−ニトロフェノールを比色法で定量することにより、ＤＧＥのα-グルコシダーゼ阻害活性を測定した。すなわち、１０μｌのα−グルコシダーゼ溶液［４０ｍＵ／ｍｌ、S. cerevisiae由来、シグマ社製、１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．２（３７℃）に溶解］に１０μｌの検体を含む溶液［１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．２（３７℃）に溶解］を混合した後、１．５ｍｇ／ｍｌの基質溶液［シグマ社製、１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．２（３７℃）に溶解］を８０μl添加して反応を開始した。３７℃で４０分間反応後、４１０ｎｍ（島津ｕｖ２２００）における吸光度を測定した。その結果を表５に示す。なお、この場合の残存活性は検体を添加していないものを１００％として算出した。
【０２０２】
【表５】
【０２０３】
上記の結果より、ＤＧＥはα−グルコシダーゼ阻害活性を示し、ＤＧＥがα−グルコシダーゼ活性を５０％阻害する濃度（ＩＣ５０）は５００μＭであった。
【０２０４】
（２）ラット小腸粘膜より得たα-グルコシダーゼ粗酵素標品［Arne Dahlqvist, Anal. Biochem,７，１８−２５（１９６４）の方法により調製］を用いたＤＧＥのα-グルコシダーゼ阻害活性測定は以下の方法で行なった。
【０２０５】
酵素反応は１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０で適宜希釈した被験物質溶液１０μlに、８０μlの基質としてのシュークロース、マルトース、トレハロースおよび可溶性デンプンの同緩衝液溶液を最終濃度１００ｍＭ（可溶性デンプンについては０．５％）になるように加え、１０μlのラット小腸より調製した粗酵素液を添加し、３７℃で２０分間反応させた。
【０２０６】
酵素反応量は上記反応液に含まれるグルコース量として、グルコース測定用試薬（和光純薬社製）を３ｍｌ加え、３７℃で５分間反応させた後５０５ｎｍの吸光度を測定することにより求めた。
【０２０７】
α−グリコシダーゼによる各基質の分解に対するＤＧＥの阻害活性を、４種の異なったＤＧＥ濃度について上記方法により測定した。α−グリコシダーゼ阻害活性は、ＤＧＥ無添加の対照を１００％とした相対活性（％）として表した。
【０２０８】
結果を表６に示す。
【０２０９】
【表６】
【０２１０】
ＤＧＥのシュークロースに対する阻害物質定数（Ｋｉ）をＤｉｘｏｎ ｐｌｏｔより求めたところ、６．０ｍＭであった。
【０２１１】
さらに、ＤＧＥはシュークロースを基質とした際に、マルトース等を基質とした時より強いα−グリコシダーゼ阻害作用を示した。また、κ−ＤＧＥ、後出のＤＧＥ−ＧＳＨも同様のα−グリコシダーゼ阻害活性を示した。
【０２１２】
実施例１０ 抗リウマチ試験
ヒト慢性リウマチ患者の滑膜から樹立された繊維芽細胞株であるＤＳＥＫ細胞（in vitroでのリウマチモデルとして、埼玉医科大学総合医療センター第二内科保有）を１０％ＦＢＳ（バイオウイタッカー社製）を含むＩｓｃｏｖ−ＭＥＭ培地（ＩＭＤＭ：ギブコＢＲＬ社製）にて、５％ＣＯ２存在下、３７℃で細胞が培養器に飽和になるまで培養し、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（バイオウイタッカー社製）で細胞を３×１０４細胞／ｍｌとなるように上記培地に懸濁し、９６ウェルマイクロタイタ−プレ−ト（ＦＡＬＣＯＮ社製）の各ウエルに２００μｌずつ分注した。培養５〜７日後、ほぼ細胞が８０％飽和になった時で培地を交換し、２５、５０、７５、１００、２００、もしくは４００μＭのＤＧＥを含有する２００μｌの上記培地を加えた。
【０２１３】
２４時間、７２時間経過時に１０μｌのプレミックスＷＳＴ−１（宝酒造社製、ＭＫ４００）を加えて３７℃で３．５時間反応させ、４５０ｎｍにおける吸光度（Ａ４５０）から６５０ｎｍにおける吸光度（Ａ６５０）を差し引いた値を細胞増殖度とした。
【０２１４】
その結果を表７に示す。
【０２１５】
【表７】
【０２１６】
またＡ４５０−６５０のデータによって求められた半数細胞増殖抑制濃度(ＩＣ５０)は２４時間で２０７μＭ、７２時間で１１２μＭであった。
以上、イン ビトロ（in vitro）でのリウマチモデル−ＤＳＥＫ細胞において、ＤＧＥを添加した場合、ＰＢＳ添加の対照区と比べて各化合物添加区はリウマチ細胞の増殖が強く抑制された。また、経時的な観察において、これらの化合物は増殖抑制活性を継続するのみならず、経時的に活性を増強する傾向が認められた。
【０２１７】
以上の結果によって、ＤＧＥは強い抗リウマチ活性があり、慢性リウマチに対する有用な治療薬と健康食品として開発されることが期待される。また、κ−ＤＧＥ、後出のＤＧＥ−ＧＳＨも同様の活性を示した。
【０２１８】
また、ＤＳＥＫ細胞培養において、２４時間、７２時間経過時に１５０μｌ／ウエルの培養上清を回収し、この細胞由来のサイトカン（ヒトＴＧＦ−β、ヒトＦＧＦ−β、ヒトＩＬ−１αおよびヒトＩＬ−１０）産生（発現の影響）に対する、ＤＧＥの影響を、それぞれのサイトカインに特異的なＥＬＩＳＡ−Ｋｉｔ（ヒトＦＧＦ−βとヒトＩＬ−１０、INTERGEN社製；ヒトＩＬ−１αとヒトＴＧＦ−β、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて測定した。
【０２１９】
その結果、ＤＧＥはヒトＩＬ−１αの産生抑制作用、ヒトＩＬ−１０の産生増強作用、ヒトＦＧＦ−βの産生抑制作用、およびヒトＴＧＦ−βの産生増強作用を示した。
【０２２０】
実施例１１ プロスタグランジンＥ２産生抑制試験
１０％ウシ胎児血清含有ダルベッコ改良イーグル培地にＲＡＷ２６４．７細胞を３×１０５細胞／ｍｌになるように懸濁し、４８ウェルマイクロタイタープレートのウェルに５００μlずつ加えて５％炭酸ガス存在下、３７℃で６時間培養した。ＤＧＥを０．５ｍＭとなるように水に溶解し、ろ過滅菌した水溶液を、各ウェルに１０μlずつ添加し、さらに、０．５時間あるいは５時間培養した。その後、各ウェルに５０μg／ｍｌ ＬＰＳ水溶液１０μlを添加して、１２時間培養した後、プロスタグランジンＥ２の量を測定した。なお、対照としてＬＰＳを加えない区分およびＤＧＥを加えない区分を設定した。
【０２２１】
上記培養後、培養上清中のプロスタグランジンＥ２量をプロスタグランジン Ｅ２ ＥＬＩＳＡ ＫＩＴ（ネオジェン社製、Code．404110）を用い測定した。測定は全て３連で行った。
【０２２２】
その結果を、図６に示す。すなわち、図６は前培養においてＤＧＥを添加した場合の、各培養条件下で培養した時の培地中のプロスタグランジンＥ２濃度を示す図である。図６において横軸は培養条件を、縦軸はプロスタグランジンＥ２濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。
【０２２３】
この結果、ＤＧＥはＬＰＳによるプロスタグランジンＥ２産生誘導を抑制した。また、ＬＰＳ添加前、ＤＧＥ存在下０．５時間培養した区分より、５時間培養した区分で、より強いプロスタグランジンＥ２産生抑制が認められた。
【０２２４】
実施例１２ 熱ショックタンパク質の誘導試験
２×１０５細胞／ｍｌのＨＬ−６０細胞を含む１０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地５ｍｌを６ウェルプレートの各ウエルに入れ、３７℃ ５％ＣＯ２存在下で２４時間培養した後、最終濃度が、０、６．２５、１２．５、２５、５０、１００μＭになるようにＤＧＥを添加し、更に６時間培養を続けた。
【０２２５】
培養終了後、細胞数を計測した後、細胞を遠心分離で回収し、ＰＢＳで洗浄して、ＤＧＥ処理細胞を調製した。また、４５℃１０分間熱処理を行った後、同様に培養した細胞も調製した。
【０２２６】
これらの処理細胞を用い、モレキュラー クローニング（Molecular Cloning)〔コールド スプリング ハーバー ラボラトリー プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press)（ 1989 ）〕記載の方法に従ってSDS-PAGEを行った。処理細胞を、２．５×１０６細胞／ｍｌになるようにSDS-PAGE Sample bufferに懸濁し、この細胞懸濁液を１００℃で１０分間処理した後、５μｌずつを２枚のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（５％スタッキングゲル、１０％セパレーションゲル）にアプライし、電気泳動を行った。一方のゲルは、クマシー染色し、他方のゲルは、ポリビニリデンジフルオライドトランスファー膜（Polyvinylidene difluoride transfer membrane）〔ImmobilonTM ：ミリポア（MILLIPORE）社製 Cat.# IPVH000-10 〕にブロッティングした。この膜をBlock Ace （大日本製薬株式会社 Cat.# UK-B25 ）で４℃にて一晩ブロッキングした。
【０２２７】
このブロッキングしたメンブレンに熱誘導される７０ｋＤａの熱ショックタンパクと特異的に反応するモノクローナル抗体ＨＳＰ７２／７３（Ａｂ−１）（オンコジーン リサーチ プロダクツ（Oncogene Research Products）社製 Cat.# HSP01）を反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳで洗浄し、更に、ＴＢＳで洗浄した。次いで、ペルオキシダーゼ複合二次抗体ＨＲＴ−ウサギ抗マウスＩｇＧ (H+L)（ZYMED ラボラトリース社（ZYMED Laboratolies, Inc.）製 Cat.# 61-6520）を反応させ、先の操作と同様に洗浄した。このように一次抗体、二次抗体と反応させたメンブレンに、ケミルミノール試薬 ルネッサンスTM （デュポン NEN (Dupont NEN ）社製 Cat.# NEL-100)を反応させた後、Ｘ−線フィルムを感光して７０ｋＤａの熱ショックタンパクの誘導を確認した。
【０２２８】
その結果、ＤＧＥの７０ｋＤａの熱ショックタンパクの誘導が確認された。その誘導の強弱を表８に示す。なお表１中、＋は誘導の強さを表し、＋が多いほど誘導が強いことを意味する。また−は誘導が認められなかったことを意味する。
【０２２９】
また、κ−ＤＧＥ、後出のＤＧＥ−ＧＳＨも同様の熱ショックタンパク誘導活性を示した。
【０２３０】
【表８】
【０２３１】
実施例１３ ５−Ｌ−グルタチオン−Ｓ−イル−２−ヒドロキシ−３，７−ジオキサビシクロ[２．２．２]オクタン−１−オール（ＤＧＥ−ＧＳＨ）の調製
（１）ＤＧＥと還元型グルタチオン（ＧＳＨ：ナカライテスク社製）をそれぞれ２０ｍＭになるようにＰＢＳに溶解し、３７℃で一晩反応させた。この反応液１００μlを順相カラムPAL-PAK TypeSにて分画した。流速１ｍｌ／分、０〜１０分間は０．１％ＴＦＡ含有９０％アセトニトリル水溶液、１０〜５０分間は０．１％ＴＦＡ含有９０％アセトニトリル水溶液から０．１％ＴＦＡ含有５０％アセトニトリル水溶液への直線勾配、検出１９５ｎｍの条件でクロマトグラフィーを行い、１．５分ごとに画分を集めた。各画分を濃縮乾固し、５０μｌの蒸留水に再溶解し、ＨＬ−６０細胞を用いて実施例１−（２）と同様の方法でがん細胞増殖抑制活性を測定した。その結果、３０〜４０付近の画分を添加した区分において、アポトーシス小体が観察され、対照の水添加区分に比べて５９０ｎｍにおける吸光度が低く、細胞増殖が阻害されていた。そこで、上記方法と同様の方法で調製した活性画分５０μlを逆相クロマトグラフィー（TSKgel ODS-80Ts(５μｍ)、東ソー社製、４．６×２５０ｍｍ）で分画した。流速１ｍｌ／分、０〜１５分間は０．１％ＴＦＡ含有蒸留水、１５〜３０分間は０．１％ＴＦＡ含有蒸留水から０．１％ＴＦＡ含有５０％アセトニトリル水溶液への直線勾配、３０〜４５分間は０．１％ＴＦＡ含有５０％アセトニトリル水溶液、検出２１５ｎｍの条件でクロマトグラフィーを行い、１．５分ごとに画分を集めた。各画分を濃縮乾固し、５０μｌの蒸留水に再溶解し、ＨＬ−６０細胞を用いて実施例１−（２）と同様の方法でがん細胞増殖抑制活性を測定した。その結果、４〜９分付近の画分を添加した区分において、アポトーシス小体が観察され、対照の水添加区分に比べて５９０ｎｍにおける吸光度が低く、細胞増殖が阻害され、アポトーシス誘発活性が示された。
【０２３２】
そこで前出の順相クロマトグラフィーを１０回繰り返し、当該アポトーシス誘発活性画分を分取し、濃縮乾固後、１ｍｌの蒸留水に再溶解し順相クロマトグラフィーによる精製画分を調製した。次にこの順相クロマトグラフィーによる精製画分を前出の逆相クロマトグラフィーにかけ、アポトーシス誘発活性画分を分取し、濃縮乾固した。その結果、２０ｍＭＤＧＥと２０ｍＭグルタチオンの反応液１ｍｌから５ｍｇのアポトーシス誘発活性化合物が得られた。この化合物を用い構造決定を行った。
【０２３３】
（２）実施例１３−（１）で得られたアポトーシス誘発性物質、すなわちＤＧＥとグルタチオンの反応物の質量分析をＤＸ３０２質量分析計を用いて行った。また、試料を重水に溶解し、核磁気共鳴法（ＮＭＲ）によってその構造を解析した。その結果を以下に示す。
【０２３４】
また、実施例１３−（１）で得られたアポトーシス誘発性物質のマススペクトルを表す図を図７に、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを表す図を図８に、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを表す図を図９示す。図７において横軸はｍ／ｚ、縦軸は相対強度（％）を示す。また、図８、９において横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）、縦軸はシグナルの強度を示す。
【０２３５】
ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ ４５２［Ｍ＋Ｈ］＋
４７４［Ｍ＋Ｎａ］＋
５４４［Ｍ＋グリセロール＋Ｈ］＋
５６６［Ｍ＋グリセロール＋Ｎａ］＋
マトリックスとしてグリセロールを用いた。
【０２３６】
１Ｈ−ＮＭＲ：
δ１．６２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１３．５Ｈｚ，６−Ｈ）、１．９６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．０，１３．５Ｈｚ，６−Ｈ）、２．０７（２Ｈ，ｍ，５'−Ｈ）、２．４２（２Ｈ，ｍ，４'−Ｈ）、２．８５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．５，１３．５Ｈｚ，１'−Ｈ）、２．９０（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝４．０，１０．５，１３．５Ｈｚ，５−Ｈ）、３．０６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．０，１３．５Ｈｚ，１'−Ｈ）、３．４４（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝５．０，１０．５Ｈｚ，４−Ｈ）、３．５２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ，Ｈ−８）、３．６６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．０，１０．５Ｈｚ，Ｈ−８）、３．８２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，６'−Ｈ）、３．８８（２Ｈ，Ｓ，９'−Ｈ）、４．４７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．０，８．５Ｈｚ，２'−Ｈ）、４．６５（１Ｈ，Ｓ，２−Ｈ）
但し、１Ｈ−ＮＭＲの化学シフト値はＨＯＤの化学シフト値を４．６５ｐｐｍとして表した。
【０２３７】
１３Ｃ−ＮＭＲ：
δ２６．６（５'−Ｃ）、３１．９（４'−Ｃ）、３２．７（１'−Ｃ）、３５．６（６−Ｃ）、４２．０（９'−Ｃ）、４５．２（５−Ｃ）、５３．９（６'−Ｃ）、５４．４（２'−Ｃ）、６４．７（８−Ｃ）、７０．４（４−Ｃ）、９２．１（２−Ｃ）、９７．２（１−Ｃ）、１７３．４（７'−Ｃ）、１７３．５（８'−Ｃ）、１７３．８（１０'−Ｃ）、１７５．４（３'−Ｃ）
但し、１３Ｃ−ＮＭＲの化学シフト値はジオキサンの化学シフト値を６７．４ｐｐｍとして表した。
【０２３８】
なお、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲのピークの帰属の番号は下記式のとおりである。
【化７】
【０２３９】
以上より、実施例１３−（１）で得られたアポトーシス誘発性物質は、５−Ｌ−グルタチオン−Ｓ−イル−２−ヒドロキシ−３，７−ジオキサビシクロ[２．２．２]オクタン−１−オール（5-L-glutathion-S-yl-2-hydroxy-3,7-dioxabicyclo[2.2.2]octane-1-ol（以下、単にＤＧＥ−ＧＳＨと称す）であることが明らかになった。
【０２４０】
実施例１４ アポトーシス誘発試験
実施例１３−（１）で得たＤＧＥ−ＧＳＨの１０ｍｇ／ｍｌ水溶液をろ過滅菌し、滅菌水で２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１２８倍、２５６倍及び５１２倍希釈した。実施例１−（２）記載の方法でこれらの希釈液のＨＬ−６０細胞に対する増殖抑制活性を測定した。その結果、ＤＧＥ−ＧＳＨを添加した区分において、アポトーシス小体が観察され、対照の水添加区分に比べて５９０ｎｍにおける吸光度が低く、細胞増殖が阻害されていた。この結果をもとに５９０ｎｍにおける吸光度が水添加の対照に比べて２分の１となる５０％増殖阻害濃度を算出しＧＩ５０として表すと、ＧＩ５０は約４８．７μｇ／ｍｌとなった。
【０２４１】
実施例１５ ＮＯ産生抑制試験
１０％ウシ胎児血清含有、フェノールレッド不含、２ｍＭ Ｌ−グルタミン含有ダルベッコ改良イーグル培地にＲＡＷ２６４．７細胞を３×１０５細胞／ｍｌになるように懸濁し、４８ウェルマイクロタイタープレートのウェルに５００μｌずつ加えて５％炭酸ガス存在下、３７℃で１２時間培養した。各ウェルに１０μｌの５０μｇ／ｍｌリポポリサッカライド、５０００Ｕ／ｍｌインターフェロンγ水溶液と実施例１３−（１）で調製したＤＧＥ−ＧＳＨを１ｍＭとなるように水に溶解しろ過滅菌した水溶液１０μｌを添加して更に１６時間培養した後、ＮＯが培地中で酸化されることによって生ずるＮＯ２−濃度の測定を行った。なお、対照としてＬＰＳとＩＦＮγを加えない区分及びＤＧＥ−ＧＳＨを加えない区分を設定した。
【０２４２】
上記培養後、１００μlの培地に１００μlの４％グリース試薬（シグマ社製、Ｇ４４１０）を加え、室温で１５分間放置した後、４９０ｎmにおける吸光度を測定した。上記培地に溶解した既知の濃度のＮａＮＯ２で作製した検量線から培地中のＮＯ２−濃度を計算した。
【０２４３】
その結果、全く何も添加しなかった培地中のＮＯ２−濃度が４．６μＭであり、ＬＰＳとＩＦＮγを添加し、ＤＧＥ−ＧＳＨを添加しなかったコントロールの培養液中のＮＯ２−濃度が１２．１μＭであったのに対し、ＤＧＥ−ＧＳＨを添加した培養液中のＮＯ２−濃度は、９．４μＭと低く、ＤＧＥ−ＧＳＨは、ＬＰＳとＩＦＮγによるＮＯ産生誘導を抑制した。
【０２４４】
実施例１６ プロスタグランジンＥ２産生抑制試験
１０％ウシ胎児血清含有、フェノールレッド不含、２ｍＭ Ｌ−グルタミン含有ダルベッコ改良イーグル培地にＲＡＷ２６４．７細胞を３×１０５細胞／ｍｌになるように懸濁し、４８ウェルマイクロタイタープレートのウェルに５００μｌずつ加えて５％炭酸ガス存在下、３７℃で１２時間培養した。各ウェルに１０μｌの５０μｇ／ｍｌリポポリサッカライド水溶液と実施例１３−（１）で調製したＤＧＥ−ＧＳＨを１ｍＭとなるように水に溶解し、ろ過滅菌した水溶液１０μｌを添加して更に１６時間培養した後、プロスタグランジンＥ２の量を測定した。なお、対照としてＬＰＳを加えない区分及びＤＧＥ−ＧＳＨを加えない区分を設定した。
【０２４５】
上記培養後、培養上清中のプロスタグランジンＥ２量をプロスタグランジン Ｅ２ ＥＬＩＳＡ ＫＩＴ（ネオジェン社製、Code．404110）を用い測定した。
【０２４６】
その結果、全く何も添加しなかった培地中のプロスタグランジンＥ２濃度が５０．３ｎｇ／ｍｌであり、ＬＰＳを添加し、ＤＧＥ−ＧＳＨを添加しなかったコントロールの培養液中のプロスタグランジンＥ２濃度が６３．４ｎｇ／ｍｌであったのに対し、ＤＧＥ−ＧＳＨを添加した培養液中のプロスタグランジンＥ２濃度は、５０．７ｎｇ／ｍｌと低く、ＤＧＥ−ＧＳＨは、ＬＰＳによるプロスタグランジンＥ２産生誘導を抑制した。
【０２４７】
実施例１７ リンパ球活性化阻害試験
ｄｄＹマウス（雌、７週齢、体重約２５ｇ）は日本ＳＬＣより購入し、１週間の予備飼育の後、実験に用いた。マウスより脾臓を摘出し、細かく粉砕して１０％牛胎児血清（ハイクローン社製）を含んだＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁して単細胞液を得た。接着性細胞をプラスチックシャーレに接着させて除き、非接着性細胞を脾臓リンパ球として用いた。脾臓リンパ球は１０％牛胎児血清を含んだＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁して２×１０６細胞／ｍｌに調整し、２００μｌ／ウェルで９６ウェルマイクロタイタープレートに播種し、対照群以外の各ウェルに各濃度のＤＧＥを添加し、さらにすべてのウェルに５μｇのＣｏｎＡ（ナカライテスク社製）を添加し３７℃、５％炭酸ガス培養器で２日間培養した。培養終了１日前に３７ｋＢｑの３Ｈ−チミジン（第一化学薬品製）を各ウェルに加えてパルスラベルを行い、培養後、細胞をガラスフィルターに回収して放射活性を測定した。
【０２４８】
結果を図１０に示す。マイトジェン刺激により活性化されたリンパ球の増殖に対しＤＧＥは用量依存的な抑制を示し、０．３μｇ／ｍｌの濃度でほぼ完全に抑え、リンパ球の活性化に対する抑制作用が示された。
【産業上の利用可能性】
【０２４９】
以上記載したごとく、本発明によれば、アポトーシス誘発剤、制がん剤、活性酸素産生抑制剤、過酸化脂質ラジカル産生抑制剤、ＮＯ産生抑制剤等の抗酸化剤、プロスタグランジン合成抑制剤、抗病原微生物剤、鮮度保持剤、抗変異原剤、血糖上昇抑制剤、抗高脂血症剤、熱ショックタンパク産生誘導剤、抗ウイルス剤、α−グリコシダーゼ阻害剤の有効成分として有用な、式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、それらの塩、および本発明のアポトーシス誘発性物質が提供される。
【０２５０】
これらの物質を含有、希釈および／または添加してなる食品または飲料はアポトーシス誘発作用、制がん作用、活性酸素産生抑制作用、ＮＯ産生抑制作用等の抗酸化作用、プロスタグランジン合成抑制作用、抗病原微物抑制作用、抗変異原作用、血糖上昇抑制作用、抗肥満作用等、熱ショックタンパク産生誘導作用、抗ウイルス作用を有する機能性食品または飲料として有用であり、がん患者やウイルス性疾患患者の病変細胞にアポトーシスを誘発し、これらの疾患の予防、症状改善に有効な食品または飲料が提供される。とりわけ大腸がん、胃がん等消化器系のがんの場合、本発明の上記化合物を食品、飲料として経口的に摂取することによりがん細胞にアポトーシスを起こすことができるため、本発明の食品または飲料は消化器系がんの予防、症状改善に優れた効果を有している。さらに、その活性酸素産生抑制作用等の抗酸化作用により上記の食品または飲料は抗酸化ストレス用食品または飲料としても優れている。
【０２５１】
また、式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表される化合物は、活性酸素産生抑制用の抗酸化用化合物として有用であり、本発明の抗酸化用化合物を含有、希釈および／または添加してなる食品または飲料は、活性酸素等の生体内酸化物質が起因となる疾病の症状改善用食品または飲料として有用である。さらに、本発明の食品または飲料は便秘改善または予防に効果を有する。
【０２５２】
本発明により提供される式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、及びそれらの塩は食品または飲料に活性酸素産生抑制作用等の抗酸化性を付与する新機能性化合物として有用である。
【０２５３】
また、当該化合物は鮮度保持効果を有し、食品、生鮮物の味や鮮度の保持に極めて有用である。
【０２５４】
さらに、当該化合物を含有する化粧料は美白用、保湿用化粧料として有用である。
【図面の簡単な説明】
【０２５５】
【図１】試料２の順相ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す図である。
【図２】保持時間４．０５分〜４．１６分の画分のマススペクトルを表す図である。
【図３】保持時間４．０５分〜４．１６分の画分の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを表す図である。
【図４】ＤＧＥを添加して各培養条件で培養した時の培地中のＮＯ２−濃度を示す図である。
【図５】前培養においてＤＧＥを添加した場合の、各培養条件下で培養した時の培地中のＮＯ２−濃度を示す図である。
【図６】前培養においてＤＧＥを添加した場合の、各培養条件下で培養した時の培地中のプロスタグランジンＥ２濃度を示す図である。
【図７】ＤＧＥとＧＳＨとの反応物のマススペクトルを表す図である。
【図８】ＤＧＥとＧＳＨとの反応物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを表す図である。
【図９】ＤＧＥとＧＳＨとの反応物の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを表す図である。
【図１０】ＤＧＥを添加して培養した場合の３Ｈ−チミジン取り込み量を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
（Ｉ）
（式中、ＸおよびＹは、ＨまたはＣＨ２ＯＨ、ただし、ＸがＣＨ２ＯＨのとき、ＹはＨ、ＸがＨのとき、ＹはＣＨ２ＯＨである）
で表される化合物、及びその塩から選択される化合物を有効成分として含有するアポトーシス誘発を要する疾患、がん性疾患、活性酸素産生抑制を要する疾患、一酸化窒素産生抑制を要する疾患、プロスタグランジン合成抑制を要する疾患、滑膜細胞増殖抑制を要する疾患、熱ショックタンパク産生誘導を要する疾患、またはα−グリコシダーゼ阻害を要する疾患の治療剤または予防剤。
【請求項２】
３，６−アンヒドロガラクトースおよび／または還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを有する化合物を中性からアルカリの条件下で処理することを特徴とする請求項１記載の式（Ｉ）で表される化合物の製造方法。
【請求項３】
３，６−アンヒドロガラクトースおよび／または還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを有する化合物が、３，６−アンヒドロガラクトース含有物の酸性下での加水分解または酵素分解により得られるものである請求項２記載の製造方法。
【請求項４】
還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを有する化合物が、アガロビオース、κ−カラビオースならびに還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを有する、アガロビオースおよびκ−カラビオース以外の化合物から選択される少なくとも１つ以上の化合物である請求項３記載の製造方法。
【請求項５】
３，６−アンヒドロガラクトース含有物が、寒天、アガロースおよび／またはカラゲナンである請求項３記載の製造方法。
【請求項６】
請求項１記載の式（Ｉ）で表される化合物及びその塩から選択される化合物を含有、希釈および／または添加してなる食品または飲料。
【請求項７】
３，６−アンヒドロガラクトースおよび／または還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを有する化合物を、中性からアルカリの条件下で処理することにより得られる請求項１記載の式（Ｉ）で表される化合物を含有、希釈および／または添加してなる食品または飲料。
【請求項８】
３，６−アンヒドロガラクトースおよび／または還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを有する化合物が、３，６−アンヒドロガラクトース含有物の酸性下での加水分解または酵素分解により得られるものである請求項７記載の食品または飲料。
【請求項９】
還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを有する化合物が、アガロビオース、κ−カラビオースならびに還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを有する、アガロビオースおよびκ−カラビオース以外の化合物から選択される少なくとも１つ以上の化合物である請求項８記載の食品または飲料。
【請求項１０】
３，６−アンヒドロガラクトース含有物が、寒天、アガロースおよび／またはカラゲナンである請求項８記載の食品または飲料。
【請求項１１】
請求項１記載の式（Ｉ）で表される化合物及びその塩から選択される化合物を有効成分として含有することを特徴とする抗酸化剤。
【請求項１２】
抗酸化剤が、活性酸素産生抑制剤である請求項１１に記載の抗酸化剤。
【請求項１３】
請求項１１または１２記載の抗酸化剤を含有することを特徴とする食品または飲料。
【請求項１４】
請求項１記載の式（Ｉ）で表される化合物及びその塩から選択される化合物を有効成分として含有する鮮度保持剤。
【請求項１５】
請求項１記載の式（Ｉ）で表される化合物及びその塩から選択される化合物を有効成分として含有する化粧料。
【請求項１６】
請求項１記載の式（Ｉ）で表される化合物及びその塩から選択される化合物を有効成分として含有するα−グリコシダーゼ阻害剤。
【請求項１７】
３，６−アンヒドロガラクトースおよび／または還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを有する化合物を、中性からアルカリの条件下で処理することにより生成するアポトーシス誘発性物質。
【請求項１８】
還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを有する化合物が、アガロビオース、κ−カラビオースならびに還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを有する、アガロビオースおよびκ−カラビオース以外の化合物から選択される少なくとも１つ以上の化合物である請求項１７記載のアポトーシス誘発性物質。
【請求項１９】
３，６−アンヒドロガラクトースおよび／または還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを有する化合物を、中性からアルカリの条件下で処理することにより生成するアポトーシス誘発性物質を含有、希釈および／または添加してなる食品または飲料。
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
（Ｉ）
（式中、ＸおよびＹは、ＨまたはＣＨ２ＯＨ、ただし、ＸがＣＨ２ＯＨのとき、ＹはＨ、ＸがＨのとき、ＹはＣＨ２ＯＨである）
で表される化合物、及びその塩から選択される化合物を有効成分として含有するアポトーシス誘発を要する疾患、がん性疾患、活性酸素産生抑制を要する疾患、一酸化窒素産生抑制を要する疾患、プロスタグランジン合成抑制を要する疾患、滑膜細胞増殖抑制を要する疾患、熱ショックタンパク産生誘導を要する疾患、またはα−グリコシダーゼ阻害を要する疾患の治療剤または予防剤。
【請求項２】
３，６−アンヒドロガラクトースおよび／または還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを有する化合物を中性からアルカリの条件下で処理することを特徴とする請求項１記載の式（Ｉ）で表される化合物の製造方法。
【請求項３】
３，６−アンヒドロガラクトースおよび／または還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを有する化合物が、３，６−アンヒドロガラクトース含有物の酸性下での加水分解または酵素分解により得られるものである請求項２記載の製造方法。
【請求項４】
還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを有する化合物が、アガロビオース、κ−カラビオースならびに還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを有する、アガロビオースおよびκ−カラビオース以外の化合物から選択される少なくとも１つ以上の化合物である請求項３記載の製造方法。
【請求項５】
３，６−アンヒドロガラクトース含有物が、寒天、アガロースおよび／またはカラゲナンである請求項３記載の製造方法。
【請求項６】
請求項１記載の式（Ｉ）で表される化合物及びその塩から選択される化合物を含有、希釈および／または添加してなる食品または飲料。
【請求項７】
３，６−アンヒドロガラクトースおよび／または還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを有する化合物を、中性からアルカリの条件下で処理することにより得られる請求項１記載の式（Ｉ）で表される化合物を含有、希釈および／または添加してなる食品または飲料。
【請求項８】
３，６−アンヒドロガラクトースおよび／または還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを有する化合物が、３，６−アンヒドロガラクトース含有物の酸性下での加水分解または酵素分解により得られるものである請求項７記載の食品または飲料。
【請求項９】
還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを有する化合物が、アガロビオース、κ−カラビオースならびに還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを有する、アガロビオースおよびκ−カラビオース以外の化合物から選択される少なくとも１つ以上の化合物である請求項８記載の食品または飲料。
【請求項１０】
３，６−アンヒドロガラクトース含有物が、寒天、アガロースおよび／またはカラゲナンである請求項８記載の食品または飲料。
【請求項１１】
請求項１記載の式（Ｉ）で表される化合物及びその塩から選択される化合物を有効成分として含有することを特徴とする抗酸化剤。
【請求項１２】
抗酸化剤が、活性酸素産生抑制剤である請求項１１に記載の抗酸化剤。
【請求項１３】
請求項１１または１２記載の抗酸化剤を含有することを特徴とする食品または飲料。
【請求項１４】
請求項１記載の式（Ｉ）で表される化合物及びその塩から選択される化合物を有効成分として含有する鮮度保持剤。
【請求項１５】
請求項１記載の式（Ｉ）で表される化合物及びその塩から選択される化合物を有効成分として含有する化粧料。
【請求項１６】
請求項１記載の式（Ｉ）で表される化合物及びその塩から選択される化合物を有効成分として含有するα−グリコシダーゼ阻害剤。
【請求項１７】
３，６−アンヒドロガラクトースおよび／または還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを有する化合物を、中性からアルカリの条件下で処理することにより生成するアポトーシス誘発性物質。
【請求項１８】
還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを有する化合物が、アガロビオース、κ−カラビオースならびに還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを有する、アガロビオースおよびκ−カラビオース以外の化合物から選択される少なくとも１つ以上の化合物である請求項１７記載のアポトーシス誘発性物質。
【請求項１９】
３，６−アンヒドロガラクトースおよび／または還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを有する化合物を、中性からアルカリの条件下で処理することにより生成するアポトーシス誘発性物質を含有、希釈および／または添加してなる食品または飲料。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２００６−１１７６６２（Ｐ２００６−１１７６６２Ａ）
【公開日】平成１８年５月１１日（２００６．５．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２９５２７１（Ｐ２００５−２９５２７１）
【出願日】平成１７年１０月７日（２００５．１０．７）
【分割の表示】特願２０００−５５３４３３（Ｐ２０００−５５３４３３）の分割
【原出願日】平成１１年６月８日（１９９９．６．８）
【出願人】（３０２０１９２４５）タカラバイオ株式会社 (115)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年５月１１日（２００６．５．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１０月７日（２００５．１０．７）
【分割の表示】特願２０００−５５３４３３（Ｐ２０００−５５３４３３）の分割
【原出願日】平成１１年６月８日（１９９９．６．８）
【出願人】（３０２０１９２４５）タカラバイオ株式会社 (115)
【Ｆターム（参考）】
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