生物材料およびその使用
【課題】細胞のサイトカイン産生を刺激する方法の提供。
【解決手段】喘息、鼻炎／枯草熱、湿疹およびアナフィラキシーなどの病態であって潜在的なＴｈ２細胞過剰反応性に関係するアレルギー性疾患またはガン病態の予防および治療において、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に由来する１０ｋＤａポリペプチドまたは機能的に等価な分子、またはそのフラグメントの使用に関係するもので、免疫応答メディエーター、たとえばサイトカインのインビトロまたはインビボでの産生を刺激する方法。
【解決手段】喘息、鼻炎／枯草熱、湿疹およびアナフィラキシーなどの病態であって潜在的なＴｈ２細胞過剰反応性に関係するアレルギー性疾患またはガン病態の予防および治療において、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に由来する１０ｋＤａポリペプチドまたは機能的に等価な分子、またはそのフラグメントの使用に関係するもので、免疫応答メディエーター、たとえばサイトカインのインビトロまたはインビボでの産生を刺激する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ガン、アレルギー性疾患または免疫亢進病態、とりわけ喘息、および／またはＴヘルパー リンパ球２（Ｔｈ２）−型免疫応答に代表される病態、および／または好
酸球増加症（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉａ）に関係する病態の治療において、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）または関係する原核細胞に由来す
るおよそ１０ｋＤａ ポリペプチド（またはそれをコードする核酸分子） または機能的に等価な分子またはそのフラグメントの使用、ならびに免疫応答メディエーター、たとえばサイトカインのインビトロまたはインビボでの産生を刺激する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
自己免疫は、「自己」寛容の喪失を反映し、正常細胞または組織の不適切な破壊に至る。多数の病態で自己抗体が見出されるが、疾患の原因というよりも効果を反映するかも知れない。しかしながら、ある疾患では自己抗体が、最初の主要かつ唯一の検出可能な異常であろう。このことに関係している分子の一つの集団は、高度に免疫原性であるシャペロニン（ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎ）である。シャペロニンは、分子シャペロン（ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ）と呼ばれるタン白質のグループに属する。分子シャペロンは、ネイティブでないタン白質に結合し、このタン白質がＡＴＰ−依存性の触媒プロセスで、機能的タン白質に要求される正確な３次元形態に折りたたまれるように、補助する。
【０００３】
シャペロニンは単球（ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ）、マクロファージ、線維芽細胞様の細胞、おそらく他のタイプの細胞およびＴ細胞を含め、多くのレベルで免疫（器官）系を同時に刺激すると信じられている。哺乳類における免疫防御は、「自然」および「適応」の防御に分けられる。ファゴサイト（ｐｈａｇｏｃｙｔｅｓ）、ナチュラルキラー細胞および補体といった既に適所にある細胞は、自然免疫であると見なされる。抗原投与（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）の際には、適応免疫がＢおよび Ｔリンパ球の形態で活性化される。シャペロ
ニンは、自然防御メカニズム、具体的にはファゴサイトに直接的に作用することが知られている。シャペロニンは、強力な適応免疫の応答を刺激する。すなわち抗体産生、ならびにある場合には防御的であるＴリンパ球の刺激である。特にシャペロニンは、宿主防御に重要と考えられているサイトカイン分泌を誘導する。しかし、ある場合にはシャペロニンの存在が宿主に損害を与えるとも信じられている。
【０００４】
Ｒａｇｎｏら（１９９６） Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ １０３：３８４−３９０は、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に由来する１０
−ｋＤヒートショックタン白質（ｈｓｐ１０）の水溶液が、ラットにおけるアジュバント誘導の関節炎（ＡＡ）の発病および重篤化を遅延することを示した。ＡＡは、自己免疫疾患のモデルであり、Ｔｈ−１細胞の潜在的な過剰反応性に関係している。ｈｓｐ１０が、自己免疫疾患（Ｔｈ１過剰反応）とは対照的に、Ｔｈ−２細胞の潜在的な過剰反応性に結びついたアレルギー性疾患、例えば喘息、鼻炎／枯草熱、湿疹、アナフィラキシーなどの治療において有用性があることは何ら示唆されていない。
【０００５】
自己免疫疾患におけるシャペロニンの役割は、議論が分れるところである。シャペロニンを含有する生物での感染／免疫は、普遍的であり、健康な人々は、 自己シャペロニン
に対してＴ細胞応答を示すが、シャペロニン特異的抗体の産生を含め、古典的な自己免疫疾患は、極めて稀である。シャペロニンに対する免疫反応の存在は、偶発的であり重要ではないかも知れない。
【０００６】
しかしながら分子的模倣の理論は、自己免疫疾患におけるシャペロニンの関わりを示唆
し、微生物および哺乳類起源のシャペロニン間で、アミノ酸配列の高いレベルの保存性に依拠する。この理論は、広範囲の微生物との感染の間に、微生物および哺乳類との間で共有されるシャペロニンエピトープは、Ｔ リンパ球を刺激することを提案する。 この理論によれば、共有されたシャペロニンエピトープによる高レベルのシャペロニン提示が、自己シャペロニンに対する寛容を破壊しおよび自己免疫疾患が発症する。
【０００７】
腫瘍から得られるシャペロニンは、これらの腫瘍に対する壊死的効果となることが判った。これは、腫瘍の抗原が免疫認識を増強することにより起こることが示唆されているが、その機構は知られていない。よって、シャペロニンは、細菌感染およびガンに対し防御的な適応免疫を誘導するようである。
【０００８】
アレルギー反応、たとえば喘息では、均衡的に不適切である免疫応答か、または対象を誤った免疫応答が関係する。たとえば喘息の蔓延は増大しているが、あらゆるケースを治療する有効な治療法はまだ見出されていない。現在の治療は、往々に免疫抑制のグルココルチコステロイド（ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄｓ）、ベータ・アゴニスト、クロモグリケート（ｃｒｏｍｏｇｌｙｃａｔｅ）、ロイコトリエン調節物質（ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅ ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ）など、多数の副作用を有するものを使用する。
【０００９】
そのようなアレルギー反応においては、ＩｇＥ レベルが高くなり、またＴ ヘルパー
リンパ球−２ （Ｔｈ２） 免疫応答が Ｔｈｌ応答を圧倒し、結果的に炎症性の応答とな
る。Ｔｈｌ 応答は、主に微生物感染に対する防御であると考えられ、サイトカイン、具
体的にはインターロイキン−１２ （ＩＬ１２）、ＩＬ−２ および インターフェロン−
γによって促進される。対照的に、Ｔｈ２応答は、適当な遺伝的基盤においてアレルギー性の有害な組織損傷に関係している。
【００１０】
しかしながら、自己免疫疾患、たとえば アジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ） 関節炎といった他の病態では、過剰 Ｔｈｌ応答が、疾患の原因であることが示唆されている。し
たがってＴｈｌ応答のＴｈ２への転換またはＴｈ２応答のＴｈｌへの転換は、上記疾患を治療する上で有用性がある。
【００１１】
Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ 、Ｍ． ｂｏｖｉｓ および結核菌といった細菌は、Ｔｈ２応答を Ｔｈｌ応答に転換することができることが知られているが、この転換を担
う分子は同定されていない。
【００１２】
しかしながら、当業界における示唆は、Ｔｈｌ応答を誘導できる Ｍ． ｌｅｐｒａｅ
からのヒートショックタン白質、 ｈｓｐ６５を意味している （Ｌｏｗｒｉｅ ら、 １９９９、 Ｎａｔｕｒｅ、４００、ｐ２６９−２７１； Ｂｏｎａｔｏら、１９９８、Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６６、Ｐ１６９−１７５）。
【００１３】
結核菌に由来する相同体（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓ）、 ｈｓｐ６５は、前炎症性サイト
カインを産生するようにヒト単球を刺激し、ならびに単球およびヒトの血管系の血管内皮細胞を活性化する能力を有する（Ｆｒｉｅｄｌａｎｄ ら、１９９３、Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９１、 ｐ５８６２； Ｐｅｅｔｅｒｍａｎｓら、１９９５、 Ｉｎｆ
ｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６３、ｐ３４５４−３４５８； Ｖｅｒｄｅｇａａｌら、１９９６
、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７、ｐ３６９−３７６）。
【発明の開示】
【００１４】
驚くことに、別のタン白質も一個体の免疫に影響を及ぼすことができ、しかもそれはガン、アレルギー性疾患、とりわけ喘息、および／またはＴｈ２−型免疫応答に代表される病態、および／または好酸球増加症に関係する病態といった疾患を治療しまたは予防する
ために用い得ることが今やわかっている。
【００１５】
この結核菌に由来するタン白質は、驚くべきことに前述した病態の治療において、有利な特性を有していることが発見された。この１０ｋＤａ分子は、結核菌シャペロニン１０
（Ｍｔｃｐｎ１０）と命名される。
【００１６】
シャペロニンであり、ヒートショックタン白質であるＣｐｎ１０は、ｃｐｎ６０．１および６０．２分子に対し、独立した転写制御の下にある。
【００１７】
よって、本発明は、ガン、アレルギー反応いった様々な病態および／またはＴｈ２−型免疫応答に代表される病態および／または好酸球増加症に関係する病態を治療しまたは予防することにおいて、増強された性質を持つＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｐｎ １０といった分子を提供する。治療および／または予防的応用は、以下に詳細に説明を加えるように核酸分子またはペプチド／タン白質を用いることにより達成することができる。
【００１８】
かくして 本発明は、最初の面として核酸分子を含む医薬組成物を提供し、 このものは、
（ｉ） 図１のヌクレオチド配列、または
（ｉｉ） （ｉ）の配列に対して６６％を超える、たとえば ７０％もしくは７５％、好ましくは ８０％ を超える、具体的には９０％を超える または ９５％の 同一性（後記の
テストによる）を有する配列、あるいは ２ ｘ ＳＳＣ、６５°Ｃ （ここで ＳＳＣ ＝
０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）の条件下で、（ｉ）の配列とハイブリダイズし、図 １のヌクレオチド配列によりコードされる配列に機
能的に等価なタン白質をコードする配列、あるいは
（ｉｉｉ）機能的に等価なタン白質フラグメントをコードする（ｉ）または（ｉｉ）配列のいずれかのフラグメント
を含む核酸分子、さらに製剤的に許容される賦型剤、希釈剤または担体を含有する。
【００１９】
上述のように、治療および／または予防的効果は、核酸分子またはペプチド／タン白質を用いることにより達成することができる。よって、本発明は、次の局面としてポリペプチドを含む医薬組成物を提供し、このものは、
（ｉ） 図 １のアミノ酸配列 、または
（ｉｉ） （ｉ）の配列に対して６０％を超える、たとえば６５％もしくは７０％ 、好ましくは ８０％ を超える、具体的には９０％を超える、または９５％の同一性（後記のテストによる）を有して、機能的に等価なタン白質を与える配列、あるいは
（ｉｉｉ） （ｉ）または（ｉｉ）のいずれかの配列と機能的に等価なフラグメント
を含むポリペプチド、ならびに製剤的に許容される賦型剤、希釈剤または担体を含有する。
【００２０】
本発明による「核酸分子」は、１本鎖または２本鎖のＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、好ましくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。機能的に等価なポリペプチドをコードすることができるヌクレオチド配列の誘導体は、技術上、周知である通常の方法を用いて得ることができる。
【００２１】
本発明に使用される核酸分子は、図 １に由来する配列（または関連する機能的に等価
な配列）だけからなるものであってもよく、あるいは構造上もしくは機能上の配列、具体的には転写および／または発現（特に哺乳類細胞において）を制御する配列、あるいは、たとえば分泌シグナルとして作用する特異的性質を有する融合タン白質を形成する付加的なタン白質部分のための配列を含む、追加の配列などを包含することができる。かくして、たとえば、上記配列は本明細書で記載した核酸分子を含むベクターの形態にあってもよ
い。好適なベクターとして、プラスミドおよび ウィルスがある。
【００２２】
本明細書でいう「ポリペプチド」には、完全長のタン白質とともに、より短い鎖長のペプチド配列、たとえば本明細書で記載するタン白質フラグメントのいずれも含まれる。そうしたポリペプチドは、任意の便利な手段により調製することができる。たとえば原核生物起源からの単離により、あるいは発現制御配列を作動的に結合させた適当な核酸分子を宿主細胞で発現させるか、またはそのような組換えＤＮＡ分子を含む組換えＤＮＡクローニングベヒクルもしくはベクターを発現させる組換え手段により、あるいは化学的または生化学的な合成 （細胞外）により調製することができる。
【００２３】
ヌクレオチド配列に関連して本明細書でいう「配列同一性」は、クラスタルＷ（ＣｌｕｓｔａｌＷ）を用いて、以下のパラメーターとともに評価を行なったときに得られる値をいう（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９４、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２、ｐ４６７３− ４６８０）：
ペア方式アライメント・パラメータ−方法：ａｃｃｕｒａｔｅ
マトリックス： ＩＵＢ、 Ｇａｐ ｏｐｅｎ ｐｅｎａｌｔｙ： １５．００、 Ｇａｐ ｅ
ｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ： ６．６６；
多重アライメント・パラメーター−マトリックス： ＩＵＢ、 Ｇａｐ ｏｐｅｎ ｐｅｎａｌｔｙ： １５．００、 ％ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｆｏｒ ｄｅｌａｙ： ３０、 Ｎｅｇａｔ
ｉｖｅ マトリックス： ｎｏ、 Ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ： ６．６６、 ＤＮＡ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ： ０．５．
アミノ酸配列に関連して、「配列同一性」は、クラスタルＷ（ＣｌｕｓｔａｌＷ）を用いて、以下のパラメーターとともに評価を行なったときに得られる値をいう Ｔｈｏｍｐｓ
ｏｎら、１９９４、上掲）：
ペア方式アライメント・パラメーター−方法： ａｃｃｕｒａｔｅ
マトリックス： ＰＡＭ、Ｇａｐ ｏｐｅｎ ｐｅｎａｌｔｙ： １０．００、Ｇａｐ ｅｘ
ｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ： ０．１０； 多重アライメント・パラメーター−マト
リックス： ＰＡＭ、Ｇａｐ ｏｐｅｎ ｐｅｎａｌｔｙ： １０．００、％ ｉｄｅｎｔｉ
ｔｙ ｆｏｒ ｄｅｌａｙ： ３０、 Ｐｅｎａｌｉｚｅ ｅｎｄ ｇａｐｓ： ｏｎ、 Ｇａｐ
ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｄｉｓｔａｎｃｅ： ０、Ｎｅｇａｔｉｖｅ マトリックス： ｎ
ｏ、Ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ： ０．２０、Ｒｅｓｉｄｕｅ−ｓｐｅ
ｃｉｆｉｃ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ： ｏｎ、Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ｇａｐ ｐｅ
ｎａｌｔｉｅｓ： ｏｎ、親水性残基： ＧＰＳＮＤＱＥＫＲ。特定残基における配列同一性は、簡単に誘導された同一残基を含むようにされている。
【００２４】
「機能的に等価な」タン白質またはタン白質フラグメントとは、図１のアミノ酸配列に関係するか、またはそれから誘導されるものであり、そのアミノ酸配列は、単一もしくは複数のアミノ酸 （具体的には １〜５０、たとえば１０〜３０、 好ましくは１〜５塩基
）の置換、付加および／または欠失により修飾されているが、それにもかかわらず該アミノ酸配列は機能的活性を保持している。たとえば、オボアルブミン誘導好酸球増加症（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉａ）を抑制し、具体的には
１０ ％を超える、好ましくは２５％を超える、とくに好ましくは ５０％を超える程度まで 好酸球数を減少させ、および／または特定のサイトカイン、具体的にはインターロイ
キン−１β （ＩＬ−１β）、ＩＬ−２、ＩＬ− ６、ＩＬ−８、 ＩＬ−１０、ＩＬ−１
２、ＩＬ−１２レセプター、腫瘍壊死因子ａ（ＴＮＦα）、インターフェロン−γおよび
顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ− ＣＳＦ）の産生を増加させ、たとえば正常レベルの１０倍を超える、好ましくは１００倍を超える増加であり、および／またはＴｈ１応答の刺激である。
【００２５】
アミノおよび／またはカルボキシル末端融合タン白質またはポリペプチドは、「付加」
変異体の意味の中に含まれ、ポリペプチド配列に融合した、付加的なタン白質またはポリペプチドを含む。
【００２６】
とりわけ好ましいのは、生物変異体といった自然界に生じる等価体であり、たとえばアレルの、地理上のまたはアロタイプの変異体および公知の技術を用いて調製される誘導体である。たとえば、機能的に等価なタン白質またはフラグメントは、化学的ペプチド合成、部位特異的突然変異、ランダム突然変異または酵素的開裂および／または核酸の連結といった公知の技術を用いる組換え体の形態のうち、いずれかの方法で調製できる。
【００２７】
本発明は、異なる原核生物からの等価体および関係する分子に向けられる。たとえば細菌の属、種または株から、とりわけＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、具体的には 結核菌
、Ｍ． ｂｏｖｉｓおよび Ｍ． ａｆｒｉｃａｎｕｍを含む結核菌複合体からの等価体で
ある。そうした配列自体も修飾されていてもよく、特に機能を保持して提供される誘導体化であってよい。
【００２８】
タン白質の誘導体は、合成／単離後の修飾あるいはたとえば修飾残基を用いる合成中の修飾、あるいは適切であれば修飾核酸分子の発現により調製できる。
【００２９】
本発明の機能的に等価なフラグメントは、切り詰めによるもの（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）であってもよく、たとえばＮおよび／またはＣ末端からのペプチドの除去、あるいは適切な活性のあるドメイン領域、たとえば機能を保持しているエピトープ領域の選択による。そのようなフラグメントは、図 １の配列から誘導されてもよく、あるいは図 １に開示されたものと機能的に等価なタン白質から誘導されてもよい。
【００３０】
機能的フラグメントが選択される場合、それらのフラグメントは、元の分子に帰される機能を必ずしも示す必要はないことは理解されるであろう。したがって、機能的に等価なタン白質またはフラグメントは、関係のある機能的特性を保持するものであり、そのためフラグメントは、本発明による有用性、具体的には上記のように、好酸球増加症の抑制、特定サイトカイン産生の増加および／またはＴｈｌ免疫応答の刺激を保持する。好ましくは、上記フラグメントは、鎖長６〜９９残基、具体的には１５〜９９残基、好ましくは６〜３０、１０〜２５、１５〜５０または１５〜３０残基である。図１に示す配列のとくに好ましいフラグメントは以下の残基に由来するか、または以下の残基からなる：
１−２５
１−５８
２５−９９
５１−９９
７５−９９。
【００３１】
図 １に掲げられた配列に対し、機能的に等価な核酸の配列／フラグメントは、本発明
の組成物にも使用される。これらの配列は、コードする（上記に定義したように）機能的に等価なタン白質／ペプチドに関して明確にされる。
【００３２】
本明細書で使用する「ハイブリダイゼーション」は、非ストリンジェント条件 （６ ｘ
ＳＳＣ／５０％ ホルムアミド、室温） で結合し、ならびに高ストリンジェンシーな条
件、すなわち ２ ｘ ＳＳＣ、 ６５°Ｃ （ＳＳＣ ＝ ０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０． ０１
５Ｍクエン酸ナトリウム、 ｐＨ７．２）で洗浄される配列である。
【００３３】
本明細書で述べる「製剤的に許容される」は、生理学的に許容される賦形剤のみならず、組成物の他の成分と共存できる成分について言う。
【００３４】
本発明に基づく医薬組成物は、容易に入手できる成分を用いて、従来の方式で処方することができる。したがって活性のある成分（すなわち、核酸分子またはタン白質／ペプチド）を、必要に応じて他の活性物質ならびに１つ以上の通常使用される担体、希釈剤および／または賦形剤と一緒に含有して、錠剤、ピル、 散剤、トローチ剤、小袋剤、カシェ
剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤、溶液剤、 シロップ剤、エアゾル剤 （固体としてまたは液体媒体中に）、軟膏剤、軟および硬ゼラチンカプセル、座薬、無菌注射溶液、無菌包装散剤などといった通常のガレヌス（ｇａｌｅｎｉｃ）製剤を形成することができる。
【００３５】
上記のような組成物には前記の核酸分子、ポリペプチドの作用を支援するか、または増強する分子を追加して含んでいてもよい。たとえばサリドマイド（ｔｈａｌｉｄｏｍｉｄｅ）（およびその類縁体）、低用量のシクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、 ＬＰＳ、 サイトカイン、 ケモカイン（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ） ＣｐＧ オ
リゴデオキシヌクレオチドおよび他の免疫調節薬および／または抗炎症性剤、たとえばサイトカイン・アンタゴニストまたはグルココルチコステロイドである。
【００３６】
したがってたとえば上記組成物は、特別の免疫治療のために活性のある成分と一緒に、たとえばガン・ワクチン中で、使用してもよい。本明細書で記載した核酸分子／ポリペプチドを含む、適当な免疫治療用の処置剤／ワクチン製剤には、サブユニット・ワクチンあるいは腫瘍特異的抗原、腫瘍に関係した抗原もしくは抗体または抗イディオタイプ・抗体に基づく処置剤、または治療またはワクチン接種用の細胞全体の調製物が挙げられる。治療またはワクチン接種に使用される場合、本明細書で記載した核酸分子またはポリペプチドは、抗原に対する特定の免疫応答をもたらす該抗原を提供する（またはコードする）ことができ、および／または一般的で非特異的な免疫応答となるかも知れない。後者の場合、他の活性成分を含む組成物を用いる際、本明細書で記載した核酸分子／ポリペプチドは、アジュバントとして作用し、したがってこの目的に使用できる。
【００３７】
予防用または治療用製剤は、１つ以上の製剤学的に許容される担体または希釈剤の存在下で１つ以上の好適なアジュバント、たとえば不完全フロインドアジュバント、ＢＣＧ、モンタニド（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）、水酸化アルミニウム、サポニン、ｑｕｉｌ Ａ 、またはそれらのさらに精製された形態、ムラミルジペプチド、鉱油または植物油、ノバソーム（Ｎｏｖａｓｏｍｅ）または非イオン性のブロックコポリマーまたは ＤＥＡＥ デキストランを含むように処方してもよい。好適な担体には、生理食塩水溶液といった液体媒体が含まれる。
【００３８】
好適な担体、賦形剤および希釈剤の例として、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアガム、 リン酸カルシウム、アグ
リネート（ａｇｌｉｎａｔｅｓ）、トラガカント（ｔｒａｇａｃａｎｔｈ）、ゼラチン、珪酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、 セルロース、 水シロップ、 水、 水／エタノール、 水／グリコール、 水／ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、メチルセルロース、 メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシ
ベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、鉱油または脂肪物質、たとえば硬性脂質またはそれらの適当な混合物などが挙げられる。上記組成物は、付加的に、潤滑剤、保湿剤、乳化剤、 懸濁化剤、 保存剤、 甘味剤、 香味剤などを含んでもよい。本発明の組成物は、患者に投与した後、活性成分の迅速な、持続する、または遅延した放出を与えるように公知の手順を使用することにより処方することができる。
【００３９】
上記組成物は、適切な投与形態、たとえば、エマルジョン、またはリポソーム、ニオソーム（ｎｉｏｓｏｍｅｓ）、マイクロスフェア（ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）、ナノパーティクル（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）などとすることができる。
【００４０】
必要なら上記組成物は、活性成分に結合したターゲティング部分を含んでもよい。たとえばリンパ球、単球、マクロファージ、血管内皮細胞、 上皮細胞、血液細胞、 赤血球、血小板、好酸球、好中球、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、脳細胞、心臓細胞、肺細胞、島細胞、腎臓細胞、ガン細胞、ホルモン分泌腺細胞、皮膚、骨、関節、骨髄、胃腸粘膜、リンパ節、パイエル板、大網および他の免疫組織などへのターゲティングといった特定の細胞型または位置へのターゲティングを可能とする、内因性レセプターに特異的かつ選択的に結合するリガンドである。
【００４１】
上記組成物は、ガン、アレルギー反応および／またはＴｈ２−型免疫応答に代表される病態、および／または好酸球増加症に関係する病態の治療または予防には有用性がある。
【００４２】
よって、本発明の別の面として、たとえば、ガン、アレルギー反応および／またはＴｈ２−型免疫応答に代表される病態および／または好酸球増加症に関係する病態を治療または予防する際に使用される医薬品として、好ましくは免疫抑制剤として、本明細書で記載される医薬組成物が提供される。
【００４３】
別の局面から本発明は、前記の医薬組成物を投与された患者において、ガン、アレルギー性応答および／またはＴｈ２−型免疫応答に代表される病態、および／または好酸球増加症に関係する病態を治療するかまたは予防する方法を提供する。
【００４４】
さらに、本発明は、ガン、アレルギー疾患および／またはＴｈ２−型免疫応答に代表される病態、および／または好酸球増加症に関係する病態を治療するかまたは予防するための医薬品の調製において、
（ｉ） 図 １のヌクレオチド配列 、 または
（ｉｉ） （ｉ）の配列に対して６６％を超える、たとえば ７０％ もしくは ７５％、
好ましくは ８０％ を超える、具体的には９０％を超える、または９５％の 同一性（前
記のテストによる）を有する配列、あるいは ２ ｘ ＳＳＣ、６５°Ｃ （ここで ＳＳＣ ＝ ０．１５Ｍ ＮａＣｌ、 ０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、 ｐＨ ７．２）の条件下で、（ｉ）の配列とハイブリダイズし、図 １のヌクレオチド配列によりコードされる配
列に対し機能的に等価なタン白質をコードする配列、あるいは
（ｉｉｉ）機能的に等価なタン白質フラグメントをコードする（ｉ）または（ｉｉ）配列のフラグメント；
を含む核酸分子の使用、あるいは
（ｉ） 図 １のアミノ酸配列、または
（ｉｉ） （ｉ）の配列に対して６０％を超える、たとえば６５％もしくは７０％ 、好ましくは ８０％ を超える、具体的には９０％を超える、または９５％の 同一性（前記の
テストによる）を有して、機能的に等価なタン白質を与える配列、あるいは
（ｉｉｉ） （ｉ）または（ｉｉ）の配列と機能的に等価なフラグメント
を含むポリペプチドの使用を提供する。
【００４５】
本明細書では、「治療」とは治療前の症状に対して、治療対象である１以上の病態症状を低減させ、軽減させ、または除去することをいう。たとえば、罹患する症状には、好酸球増加症、特定のサイトカイン分泌減少、Ｔｈ２に偏倚した免疫応答、腫瘍サイズ（具体的には、増殖を休止させる、分化を引き起こす、抗腫瘍性免疫応答を増強または誘導する、あるいは何らかの細胞の死滅を引き起こすことによる）アレルギー応答、自己抗体の存在などが挙げられ、これらは機能的に等価なポリペプチドの機能特性について特に規定されたような効果を達成するように治療される。
【００４６】
病態の「予防」とは、前記病態の１以上の症状の発現または程度によって評価されるが、病態の発生を遅らせるか、または予防すること、あるいはその過酷さを軽減することを
いう。
【００４７】
治療されるまた予防されるべきガンは、悪性および前悪性のまたは良性の腫瘍が挙げられ、さらには癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ）、肉腫（ｓａｒｃｏｍａｓ）、神経膠腫（ｇｌｉｏｍａ）、黒色腫（ｍｅｌａｎｏｍａ）およびホジキン病が挙げられ、膀胱、腎臓、膵臓、脳、頭部、頸部、乳房、腸、前立腺、肺および卵巣のガンおよび白血病さらにリンパ腫を含む。
【００４８】
治療されるまたは予防されるべきアレルギー病態には、湿疹（ｅｃｚｅｍａ）、 皮膚
炎（ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、アレルギー性鼻炎（ａｌｌｅｒｇｉｃ ｒｈｉｎｉｔｉｓ
）、アレルギー性結膜炎（ａｌｌｅｒｇｉｃ ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖｉｔｉｓ）、アレル
ギー性気道疾患（ａｌｌｅｒｇｉｃ ａｉｒｗａｙ ｄｉｓｅａｓｅｓ）、過好酸球性症候群（ｈｙｐｅｒ−ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、接触性皮膚炎（ｃｏ
ｎｔａｃｔ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、食物アレルギーならびに好酸球気道炎症（ｅｏｓ
ｉｎｏｐｈｉｌｉｃ ａｉｒｗａｙ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）および気道過敏症（ａｉｒｗａｙ ｈｙｐｅｒｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ）に代表される呼吸疾患、これには
、たとえばアレルギー性喘息（ａｌｌｅｒｇｉｃ ａｓｔｈｍａ）、内因性喘息（ｉｎｔ
ｒｉｎｓｉｃ ａｓｔｈｍａ）、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症（ａｌｌｅｒｇ
ｉｃ ｂｒｏｎｃｈｏｐｕｌｍｏｎａｒｙ ａｓｐｅｒｇｉｌｌｏｓｉｓ）、好酸球性肺炎（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、アレルギー性気管支炎、気管支拡
張症（ａｌｌｅｒｇｉｃ ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ ｂｒｏｎｃｈｉｅｃｔａｓｉｓ）、職業性喘息（ｏｃｃｕｐａｔｉｏｎａｌ ａｓｔｈｍａ）、反応性気道疾患症候群（ｒｅａｃ
ｔｉｖｅ ａｉｒｗａｙ ｄｉｓｅａｓｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、間質性肺疾患（ｉｎｔｅ
ｒｓｔｉｔｉａｌ ｌｕｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ）、過好酸球性症候群（ｈｙｐｅｒｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、寄生虫性肺疾患（ｐａｒａｓｉｔｉｃ ｌｕｎｇ
ｄｉｓｅａｓｅ）などが挙げられる。しかしながら上記組成物は、喘息の治療に好まし
く使用される。さらに好ましい態様において、該組成物は好酸球増加症がある役割を演じている病態、たとえばアレルギー（上記のように、とりわけ喘息）、アトピー性疾患および肺好酸球増加症を治療するために使用される。
【００４９】
治療される患者として、限定するものでないが哺乳類、とりわけ霊長類、飼育動物および家畜が含まれる。よって、特に好ましい治療の動物として、マウス、ネズミ、モルモット、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマが挙げられ、 とりわけ好ましくは、ヒトで
ある。
【００５０】
すでに述べたように、本発明による方法では核酸分子またはポリペプチドのいずれかが使用される。核酸分子を使用する場合、核酸分子は患者内で発現させる形態で便利に使用され、よって遺伝子治療の形態となる。したがって本明細書で記載された、核酸分子を含む医薬組成物は、遺伝子治療方法において使用することができる。
【００５１】
上記核酸分子は、たとえばリポソーム、ミセルまたは関心が向けられた細胞へのターゲティングを可能とするターゲティング部分を含む、他の適当な搬送ベヒクルで提供されてもよい。
【００５２】
あるいは、上記分子は、ウィルス、プラスミドまたは 細胞 （とりわけトランスフェクトされた種に適合する細胞）などの他の「ベヒクル」に包含されてもよい。これらは、そうした駐在分子の発現をもたらす目的のために当該技術分野ではいずれも周知である。
【００５３】
トランスフェクションのための適切な技術はよく知られており、これには、エレクトロポーレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏ
ｎ）、吸着、ウィルス・トランスフェクションおよびプロトプラスト融合などが挙げられる。
【００５４】
本発明の組成物の投与は、従来的な任意の経路で行なわれてもよく、具体的には、吸入によるか、経鼻的に、経口的に、経直腸的にあるいは筋肉内、皮下、腹腔内または静脈内の注射といった非経口的による。皮膚に組成物、たとえば軟膏を局所投与することによる治療または予防も可能である。投与は、必要に応じた間隔をおいて行なわれ、たとえば２回またはそれ以上の適用、具体的には毎時間、毎日、週ごとまたは月ごとの間隔で２−４回の適用あるいは１日、３−５日ごとに、または ２週間ごとに、毎月または季ごとの間
隔で数回の適用である。
【００５５】
関係する分子ｃｐｎ６０．２について行なわれた研究において、投与経路は生起する免疫応答に影響を及ぼすことが観察されている。たとえば、Ｍｔｃｐｎ ６０．２が鼻腔内
に投与されると、Ｔｈ２からＴｈｌへのシフトが刺激され、腹腔内に投与されると反対の効果が観察された。このため投与経路は、治療または予防する疾患を考慮に入れるべきである。たとえば自己免疫疾患を治療する際は、腹腔内投与が適切であり、他方、特定のアレルギー性疾患の治療または予防には、たとえば鼻腔内投与が適切である。
【００５６】
本発明の予防方法において、投与 （好都合には経口的に、または吸入、あるいは皮下
もしくは筋肉内注射）は、好ましくはもっと長い間隔、具体的には２−１２週の間隔で実施される。治療目的には、投与（好都合には経口的に、または吸入、あるいは静脈内注射） １日にまたは２日にわたって１−４回行なわれる。
【００５７】
本発明の組成物中の活性成分は、処方物重量の約０．０１重量％ 〜約９９重量％含有
される。 好ましくは約０．１〜約５０％、たとえば１０％である。該組成物は好ましく
は投与形態単位で処方され、具体的には各投与単位には約０．０１ｍｇ〜約１ｇの活性成分を含有する。たとえば、ヒトに対して０．０５ｍｇ〜０．５ｇで、好ましくは１〜１００ｍｇである。
【００５８】
投与される活性化合物の正確な投与量ならびに治療期間の長さは、たとえば患者の年齢および体重および治療に求められる特別の条件、その重篤度、および投与経路を含む多数の要因にもちろん依存する。しかしながら一般的には、有効用量は、投与する動物、投与形態に応じて、単一の投与として約０．１μｇ／ｋｇ 〜約１４ｍｇ／ｋｇの範囲内にあ
り、好ましくは ０．１ 〜１ｍｇ／ｋｇ、たとえば１日あたり、約１ｍｇ〜１ｇのポリペプチドである。よってたとえば、成人の１日あたりの適切な用量は、７μｇ〜１ｇ、たとえば１０ｍｇ〜ｌｇ／日、あるいは２５〜５００ｍｇ／日のポリペプチドである。
【００５９】
本明細書に記載された核酸分子を使用するときは、類似のまたはより少ない用量が用いられてもよく、具体的には約０．２ｎｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇ （たとえば 約０．２ｎｇ／ｋｇ〜約２ｎｇ／ｋｇまたは約１．５ｎｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇ）、成人には約１４ｎｇ〜約１７５ｍｇである。しかし、核酸分子が細胞またはベクターに包含される場合には、非ｃｐｎ コードＤＮＡの規模ならびに発現レベルに影響を及ぼす配列に
よっては、より多いかまたはより低い量が相応に必要となるかも知れない。具体的には５− または １０倍多い量である。たとえばベクターに包含された本明細書に記載の核酸分子では、約１．Ｏｎｇ／ｋｇ〜約１２．５ｍｇ／ｋｇで使用することができる。
【００６０】
上述のように本明細書で規定したポリペプチドのファミリーおよびそれらをコードする核酸分子は、サイトカイン群の産生を刺激する。それゆえこのことは、治療／予防の状況においてそれが生起するか否かにかかわらず、これらのサイトカイン産生を刺激する発現目的のためにこれらの化合物の使用を許容する。
【００６１】
よってさらなる面において、本発明は細胞のサイトカイン産生を刺激する方法を提供する。その方法は、
（ｉ） 図 １のヌクレオチド配列、または
（ｉｉ） （ｉ）の配列に対して６６％を超える、たとえば ７０％もしくは７５％、好ましくは ８０％ を超える、具体的には９０％を超える、または９５％の 同一性（前記の
テストによる）を有する配列、あるいは ２ ｘ ＳＳＣ、６５°Ｃ （ここで ＳＳＣ ＝
０．１５Ｍ ＮａＣｌ、 ０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）の条件下で、
（ｉ）の配列とハイブリダイズし、図 １のヌクレオチド配列によりコードされる配列に
機能的に等価なタン白質をコードする配列、あるいは
（ｉｉｉ）機能的に等価なタン白質フラグメントをコードする、（ｉ）または（ｉｉ）配列のフラグメント；
を含む核酸分子、あるいは
（ｉ） 図 １のアミノ酸配列、または
（ｉｉ） （ｉ）の配列に対して６０％を超える、たとえば６５％もしくは７０％ 、好ましくは ８０％ を超える、具体的には９０％を超える、または９５％の同一性（前記のテストによる）を有して、機能的に等価なタン白質を与える配列、あるいは
（ｉｉｉ） （ｉ）または（ｉｉ）の配列と機能的に等価なフラグメント
を含むポリペプチド
の上記細胞に対する投与を含む。
【００６２】
そのような方法は、インビトロで、すなわち生体外の細胞、組織または器官について実施することができる。具体的にはこの方法論は、本発明の分子、たとえばｃｐｎ１０ レ
セプター分子と反応するか、それに結合するか、あるいはそれにより活性化される分子もしくは分子群を同定するための研究方法において使用することができる。このような方法に対する１つの帰結として、サイトカイン産生の刺激は、本発明分子の存在を測定するために用いることができる。
【００６３】
したがって、別の面から本発明は、 サンプル中に本発明のポリペプチドまたはペプチ
ドの存在または濃度を評価する方法を提供する。その方法では、上記サンプルが細胞に適用されて、１つ以上のサイトカイン産生が測定され、対照サンプルにおけるそ（れら）のサイトカイン産生のレベルと比較される。ここで対照レベルを超える上昇は、当該サンプルにおいて上記ポリペプチドまたはペプチドの存在または濃度との関係を与える。
【００６４】
本明細書で用いる「対照」とは、本発明の分子または測定されるサイトカイン（類）の産生を増大させる部分を含まないサンプルを言及するものである。適切であれば、本発明の分子を用いて標準曲線を作成してもよく、これにより該分子の存在または濃度について、定性的評価も可能であるが、定量的評価をなすことを可能とする。この方法は、本発明の分子を同定するためにさらに使用することができる。
【００６５】
しかしながら代わりに、特定サイトカインの産生を増強すべく、インビボでサイトカイン産生を刺激する方法が実施されてもよい。このことは治療上または予防上の効果に利点を有するものである。この場合において本発明は、特定のサイトカインを増加させることにより軽減され、克服されるかまたは防止される病態を治療するために使用される上記の核酸分子およびポリペプチドならびにその目的用の医薬製剤の調製のため、そうした分子の使用に拡張される。
【００６６】
正常レベルより１０倍を超えて、または１００倍を超えて増大させるサイトカインは、好ましくは ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、Ｔ
ＮＦα、インターフェロン−γおよびＧＭ−ＣＳＦからなる群より選択される。
定義
「自己免疫疾患」
本用語は、自己免疫のプロセスがある疾患の病因に関与することが示され得る場合をカバーすることを意図している。典型的にはそのような病気はＴ ヘルパー リンパ球−１ （
Ｔｈ−１） 型免疫応答に関係している。
「アレルギー病態」
本用語は、Ｔ ヘルパー リンパ球−２ （Ｔｈ−２） 型免疫応答に関係する病態をカバーすることを意図している。アレルギー反応において、高いＩｇＥレベルが生起し、Ｔｈ−２ 免疫応答がＴｈ−１応答よりも優勢となり、その結果、炎症性の応答となる。アレル
ギー病態の例として、喘息、鼻炎／枯草熱、（ｒｈｉｎｉｔｉｓ／ｈａｙ ｆｅｖｅｒ）
、湿疹（ｅｃｚｅｍａ）およびアナフィラキシー（ａｎａｐｈｙｌａｘｉｓ）が挙げられる。
「アジュバント」
この用語は、抗原と一緒に取り込まれるか、あるいは同時に投与されると免疫応答が増強される物質をいずれもカバーする意図で用いられている。
【００６７】
「Ｍｔｃｐｎ１０」、「ｃｐｎ１０」、「ｈｓｐ１０」、「Ｐｅｐ１０」は、図１に示されたアミノ酸配列を言及するため、本明細書中では互いに交換できるように使用される。
【００６８】
［実施例］
以下、本発明を下記実施例によって詳細に説明する。本発明はそれらの実施例に限定されるものではない。
物質
シャペロニン１０タン白質の発現および精製
Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｃｐｎ１０は、Ｍ． Ｓｉｎｇｈ教授 （ＷＨＯ Ｃｏ
ｌｌａｂｏｒａｔｉｎｇ Ｃｅｎｔｒｅ、ドイツ）により、通常のクロマトグラフィーを
用いて下記のようにして調製された。
組換え体ｃｐｎ１０の精製
１０ｋＤａ抗原は、組換えＥ． ｃｏｌｉ株（ＩＰＴＧ−誘導）において、商業的に入
手可能なｐＭＡＬ−ｃベクター（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、マルトース結合タン白質（ＭＢＰ）との融合タン白質として、発現された。その初期の精製はアミロースアフィニティカラム上で行われた。その後、当該融合タン白質は、因子Ｘａ
で開裂され、１０ｋＤａ抗原はさらにアニオン交換クロマトグラフィーで精製され、１
０ｍＭ重炭酸アンモニウム溶液に対し透析が行なわれ、小分けされ、および凍結乾燥された。
【００６９】
タン白質各バッチのＬＰＳ汚染については、Ｌｉｍｕｌｕｓアッセイ（Ｔａｂｏｎａ
ら、 １９９８、 Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６１、ｐ１４１４−１４２１）を用いてチ
ェックすることにより、充分な注意を払った。もしＬＰＳ汚染が検出されたならば、ポリミキシンＢ（ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ Ｂ）アフィニティカラム上でそれを除去し、ＬＰＳレ
ベルを再びアッセイした。
【００７０】
組換え体の低ＬＰＳ−シャペロニンは、さらにＲｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ カラム上で、汚染するタン白質および ペプチドを除去して精製した（Ｔａｂｏｎａ ら、１９９８、上記）。
【００７１】
ヒトＰＢＭＣにおいて、ｃｐｎ １０による、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ
−１０、ＩＬ−１２、ＴＮＦαおよび ＧＭ−ＣＳＦの産生へのインビトロ効果を、Ｔａ
ｂｏｎａら、１９９８、上記、に記載されたように２−サイトＥＬＩＳＡを用いて決定し
た。
【実施例１】
【００７２】
マウスにおいてＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｃｐｎ １０は
喘息を抑制する
本実施例では、アレルギー性炎症のげっ歯類モデルにおいてＭ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏ
ｓｉｓ ｃｐｎ １０ タン白質が、免疫したマウスの気道への好酸球の動員を阻害したこ
とを初めて示す。これらのデータは、Ｍｔｃｐｎ１０がマウスの気道炎症を変調させ、これにより、アレルギー疾患の治療および予防について重要な示唆を有することを示す。
方法
炎症のげっ歯類モデル
抗原投与に引き続き、気道における好酸球およびＴ リンパ球動員の定量を可能とする
アレルギー性炎症のげっ歯類モデルが開発された。さらに現技術水準の肺モニタリングシステムが使用され、これは気管支収縮剤アゴニストに対する肺の機能における変化をインビボで測定することを可能とする。
免疫化プルトコル
Ｃ５７Ｂ１／６ 野生型 （地域の供給者）、６−８ 週齢マウスは、０日目に、オボア
ルブミンを用いて免疫され （１０μｇ 腹腔内注射； １ ｍｇ 水酸化アルミニウム）、
７日後に繰り返した。１４、１５および１６日目にマウスは、プレキシガラス（ｐｌｅｘｉｇｌａｓｓ）容器（１２ Ｌ）に収容して、霧状にしたオボアルブミン溶液（１０ ｍｇ／ｍｌ； Ｄｅ Ｖｉｌｉｂｉｓｓ Ｕｌｔｒａｎｅｂ ９０）に曝した。シャム免疫の野生型マウスは、０および７日目に水酸化アルミニウム１ｍｇ を注射し、１４−１６日目に
オボアルブミンで抗原投与した。エアゾール暴露は、毎日３回１時間の間隔で２０分間暴露させて行ない、気管支肺胞洗浄、免疫組織化学のため肺の採取および肺力学（ｌｕｎｇ
ｍｅｃｈａｎｉｃｓ）は、最後のエアゾール投与の後、２４時間して行なった。
【００７３】
オボアルブミンは、喘息患者によく見られる呼吸性アレルゲンではないが、炎症げっ歯類モデルで観察されるＴｈ２応答は、ハウスダストのダニで免疫した後に見られるものに類似している。これら２つのアレルゲンにより生起されるＴｈ２ サイトカイン・プロフ
ィールは、類似している。このオボアルブミンを用いる利点は、それが容易に入手でき、このアレルゲンの特異的な活性は、バッチ間で変動せず、そこで我々はバッチ間で抗原投与量をコントロールできることである。
ＢＣＧ処置
オボアルブミン（１０μｇ）で免疫してから６日目に、マウスに経静脈的に ＢＣＧ （ｌｏｇ（ＢＣＧ ｖｉａｂｌｅ）単位：−４、−５ および−６）を注入した。 ７日目、
マウス は、オボアルブミン（１０μｇ）のブースター（ｂｏｏｓｔｅｒ）注射を受けた
。１３日目、マウス は６日目と同じ投与量で、同一の投与経路にて２度目のＢＣＧ投与
を受けた。１４日目、マウスは、プレキシガラス容器に収容し、霧状にしたオボアルブミン溶液（１％ 溶液）への３０分間暴露を１時間間隔で３回行なった。この操作を１５お
よび１６日目にも繰返した。最後のオボアルブミン暴露の２４時間後、マウスを麻酔にかけ好酸球を数えるために気管支肺胞洗浄を行なった。
Ｃｐｎ １０ 処置
動物の同じバッチからのマウスをオボアルブミンで免疫し、Ｍｔｃｐｎ １０ （１０μｇ／動物）を気管に直接点滴することにより処置した。マウスはＭｔｃｐｎ １０で、 ６日目 および１３日目、次いで１４、１５、および１６ 日目の抗原投与（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）プロトコルの開始の３０分前にも処置した（総数５ 処置）。
結果
結果が図２に示されている。オボアルブミン投与後、気道への好酸球動員の有意な抑制があった。このことは、喘息におけるＭｔｃｐｎ１０（「Ｐｅｐ１０」）に対する保護効果を示唆する。
サイトカイン測定
我々は、最後の抗原投与後、２４時間して集められた血清および洗浄物中のサイトカイン産生に対するｃｐｎ１０の効果を調べた。我々は、１０μｇのｃｐｎ１０および５６μｇの６０．１で（両方とも治療の５用量スキームで投与される）で処置されたマウスの群から集められたサンプル中のＩＬ−４， ＩＬ−５ および ＩＮＦ−γ レベルの測定を行った。
【００７４】
最後の抗原投与後２４時間した血清中のサイトカインレベルを検出することはできず、ならびにＩＬ５は、この時点でいずれのサンプルでも検出されなかった。ＢＡＬ中で検出されたＩＬ−４および ＩＮＦ−γのレベルを、図３および図４に示す。
【００７５】
ｃｐｎ１０の重要な利点は、それが、急性症状を治療するのに使用される剤とは異なる予防剤を提供することが可能である。換言すれば、ｃｐｎ１０治療は、喘息のようなアレルギー病態を、発生から予防することが可能である。
【００７６】
喘息の予防および治療におけるｃｐｎ１０の使用は、この実施例に記載されている。当業者は、ここで得られた結果が、鼻炎／枯草熱、湿疹、アナフィラキシーなどの他のアレルギー病態に関係することを理解するであろう。これはすべてのアレルギー病態が共通の機作を有している（Ｔｈ−２細胞の過剰反応性）ためである。本明細書では、ｃｐｎ１０が喘息を抑制可能であれば、それはまた、他のアレルギー性病態をも抑制できるはずである。
【００７７】
これらのデータは、喘息のげっ歯類モデルにおいて、Ｍｔｃｐｎ１０が好酸球性炎症を抑制できることを初めて提示する。これは、このタン白質がマウスの気道炎症を変調させる能力を有しているということを示すものである。このことは、アレルギー性疾患、自己免疫疾患およびガンの治療および予防に対し重要な手がかりとなるものである。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】図１は結核菌（Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）からのｃｐｎ １０のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列を示す。
【図２】図２は、オボアルブミン（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）で誘導した肺好酸球増加症のマウスにおいてＭｔｃｐｎ １０（「Ｐｅｐ１０」）を５用量、投与した後の好酸球レベルの減少を示す。
【図３】図３は、ＢＡＬで検出されたＩＬ４のレベルを示す。
【図４】図４は、ＢＡＬで検出されたＩＮＦ−γのレベルを示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ガン、アレルギー性疾患または免疫亢進病態、とりわけ喘息、および／またはＴヘルパー リンパ球２（Ｔｈ２）−型免疫応答に代表される病態、および／または好
酸球増加症（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉａ）に関係する病態の治療において、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）または関係する原核細胞に由来す
るおよそ１０ｋＤａ ポリペプチド（またはそれをコードする核酸分子） または機能的に等価な分子またはそのフラグメントの使用、ならびに免疫応答メディエーター、たとえばサイトカインのインビトロまたはインビボでの産生を刺激する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
自己免疫は、「自己」寛容の喪失を反映し、正常細胞または組織の不適切な破壊に至る。多数の病態で自己抗体が見出されるが、疾患の原因というよりも効果を反映するかも知れない。しかしながら、ある疾患では自己抗体が、最初の主要かつ唯一の検出可能な異常であろう。このことに関係している分子の一つの集団は、高度に免疫原性であるシャペロニン（ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎ）である。シャペロニンは、分子シャペロン（ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ）と呼ばれるタン白質のグループに属する。分子シャペロンは、ネイティブでないタン白質に結合し、このタン白質がＡＴＰ−依存性の触媒プロセスで、機能的タン白質に要求される正確な３次元形態に折りたたまれるように、補助する。
【０００３】
シャペロニンは単球（ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ）、マクロファージ、線維芽細胞様の細胞、おそらく他のタイプの細胞およびＴ細胞を含め、多くのレベルで免疫（器官）系を同時に刺激すると信じられている。哺乳類における免疫防御は、「自然」および「適応」の防御に分けられる。ファゴサイト（ｐｈａｇｏｃｙｔｅｓ）、ナチュラルキラー細胞および補体といった既に適所にある細胞は、自然免疫であると見なされる。抗原投与（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）の際には、適応免疫がＢおよび Ｔリンパ球の形態で活性化される。シャペロ
ニンは、自然防御メカニズム、具体的にはファゴサイトに直接的に作用することが知られている。シャペロニンは、強力な適応免疫の応答を刺激する。すなわち抗体産生、ならびにある場合には防御的であるＴリンパ球の刺激である。特にシャペロニンは、宿主防御に重要と考えられているサイトカイン分泌を誘導する。しかし、ある場合にはシャペロニンの存在が宿主に損害を与えるとも信じられている。
【０００４】
Ｒａｇｎｏら（１９９６） Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ １０３：３８４−３９０は、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に由来する１０
−ｋＤヒートショックタン白質（ｈｓｐ１０）の水溶液が、ラットにおけるアジュバント誘導の関節炎（ＡＡ）の発病および重篤化を遅延することを示した。ＡＡは、自己免疫疾患のモデルであり、Ｔｈ−１細胞の潜在的な過剰反応性に関係している。ｈｓｐ１０が、自己免疫疾患（Ｔｈ１過剰反応）とは対照的に、Ｔｈ−２細胞の潜在的な過剰反応性に結びついたアレルギー性疾患、例えば喘息、鼻炎／枯草熱、湿疹、アナフィラキシーなどの治療において有用性があることは何ら示唆されていない。
【０００５】
自己免疫疾患におけるシャペロニンの役割は、議論が分れるところである。シャペロニンを含有する生物での感染／免疫は、普遍的であり、健康な人々は、 自己シャペロニン
に対してＴ細胞応答を示すが、シャペロニン特異的抗体の産生を含め、古典的な自己免疫疾患は、極めて稀である。シャペロニンに対する免疫反応の存在は、偶発的であり重要ではないかも知れない。
【０００６】
しかしながら分子的模倣の理論は、自己免疫疾患におけるシャペロニンの関わりを示唆
し、微生物および哺乳類起源のシャペロニン間で、アミノ酸配列の高いレベルの保存性に依拠する。この理論は、広範囲の微生物との感染の間に、微生物および哺乳類との間で共有されるシャペロニンエピトープは、Ｔ リンパ球を刺激することを提案する。 この理論によれば、共有されたシャペロニンエピトープによる高レベルのシャペロニン提示が、自己シャペロニンに対する寛容を破壊しおよび自己免疫疾患が発症する。
【０００７】
腫瘍から得られるシャペロニンは、これらの腫瘍に対する壊死的効果となることが判った。これは、腫瘍の抗原が免疫認識を増強することにより起こることが示唆されているが、その機構は知られていない。よって、シャペロニンは、細菌感染およびガンに対し防御的な適応免疫を誘導するようである。
【０００８】
アレルギー反応、たとえば喘息では、均衡的に不適切である免疫応答か、または対象を誤った免疫応答が関係する。たとえば喘息の蔓延は増大しているが、あらゆるケースを治療する有効な治療法はまだ見出されていない。現在の治療は、往々に免疫抑制のグルココルチコステロイド（ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄｓ）、ベータ・アゴニスト、クロモグリケート（ｃｒｏｍｏｇｌｙｃａｔｅ）、ロイコトリエン調節物質（ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅ ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ）など、多数の副作用を有するものを使用する。
【０００９】
そのようなアレルギー反応においては、ＩｇＥ レベルが高くなり、またＴ ヘルパー
リンパ球−２ （Ｔｈ２） 免疫応答が Ｔｈｌ応答を圧倒し、結果的に炎症性の応答とな
る。Ｔｈｌ 応答は、主に微生物感染に対する防御であると考えられ、サイトカイン、具
体的にはインターロイキン−１２ （ＩＬ１２）、ＩＬ−２ および インターフェロン−
γによって促進される。対照的に、Ｔｈ２応答は、適当な遺伝的基盤においてアレルギー性の有害な組織損傷に関係している。
【００１０】
しかしながら、自己免疫疾患、たとえば アジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ） 関節炎といった他の病態では、過剰 Ｔｈｌ応答が、疾患の原因であることが示唆されている。し
たがってＴｈｌ応答のＴｈ２への転換またはＴｈ２応答のＴｈｌへの転換は、上記疾患を治療する上で有用性がある。
【００１１】
Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ 、Ｍ． ｂｏｖｉｓ および結核菌といった細菌は、Ｔｈ２応答を Ｔｈｌ応答に転換することができることが知られているが、この転換を担
う分子は同定されていない。
【００１２】
しかしながら、当業界における示唆は、Ｔｈｌ応答を誘導できる Ｍ． ｌｅｐｒａｅ
からのヒートショックタン白質、 ｈｓｐ６５を意味している （Ｌｏｗｒｉｅ ら、 １９９９、 Ｎａｔｕｒｅ、４００、ｐ２６９−２７１； Ｂｏｎａｔｏら、１９９８、Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６６、Ｐ１６９−１７５）。
【００１３】
結核菌に由来する相同体（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓ）、 ｈｓｐ６５は、前炎症性サイト
カインを産生するようにヒト単球を刺激し、ならびに単球およびヒトの血管系の血管内皮細胞を活性化する能力を有する（Ｆｒｉｅｄｌａｎｄ ら、１９９３、Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９１、 ｐ５８６２； Ｐｅｅｔｅｒｍａｎｓら、１９９５、 Ｉｎｆ
ｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６３、ｐ３４５４−３４５８； Ｖｅｒｄｅｇａａｌら、１９９６
、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７、ｐ３６９−３７６）。
【発明の開示】
【００１４】
驚くことに、別のタン白質も一個体の免疫に影響を及ぼすことができ、しかもそれはガン、アレルギー性疾患、とりわけ喘息、および／またはＴｈ２−型免疫応答に代表される病態、および／または好酸球増加症に関係する病態といった疾患を治療しまたは予防する
ために用い得ることが今やわかっている。
【００１５】
この結核菌に由来するタン白質は、驚くべきことに前述した病態の治療において、有利な特性を有していることが発見された。この１０ｋＤａ分子は、結核菌シャペロニン１０
（Ｍｔｃｐｎ１０）と命名される。
【００１６】
シャペロニンであり、ヒートショックタン白質であるＣｐｎ１０は、ｃｐｎ６０．１および６０．２分子に対し、独立した転写制御の下にある。
【００１７】
よって、本発明は、ガン、アレルギー反応いった様々な病態および／またはＴｈ２−型免疫応答に代表される病態および／または好酸球増加症に関係する病態を治療しまたは予防することにおいて、増強された性質を持つＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｐｎ １０といった分子を提供する。治療および／または予防的応用は、以下に詳細に説明を加えるように核酸分子またはペプチド／タン白質を用いることにより達成することができる。
【００１８】
かくして 本発明は、最初の面として核酸分子を含む医薬組成物を提供し、 このものは、
（ｉ） 図１のヌクレオチド配列、または
（ｉｉ） （ｉ）の配列に対して６６％を超える、たとえば ７０％もしくは７５％、好ましくは ８０％ を超える、具体的には９０％を超える または ９５％の 同一性（後記の
テストによる）を有する配列、あるいは ２ ｘ ＳＳＣ、６５°Ｃ （ここで ＳＳＣ ＝
０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）の条件下で、（ｉ）の配列とハイブリダイズし、図 １のヌクレオチド配列によりコードされる配列に機
能的に等価なタン白質をコードする配列、あるいは
（ｉｉｉ）機能的に等価なタン白質フラグメントをコードする（ｉ）または（ｉｉ）配列のいずれかのフラグメント
を含む核酸分子、さらに製剤的に許容される賦型剤、希釈剤または担体を含有する。
【００１９】
上述のように、治療および／または予防的効果は、核酸分子またはペプチド／タン白質を用いることにより達成することができる。よって、本発明は、次の局面としてポリペプチドを含む医薬組成物を提供し、このものは、
（ｉ） 図 １のアミノ酸配列 、または
（ｉｉ） （ｉ）の配列に対して６０％を超える、たとえば６５％もしくは７０％ 、好ましくは ８０％ を超える、具体的には９０％を超える、または９５％の同一性（後記のテストによる）を有して、機能的に等価なタン白質を与える配列、あるいは
（ｉｉｉ） （ｉ）または（ｉｉ）のいずれかの配列と機能的に等価なフラグメント
を含むポリペプチド、ならびに製剤的に許容される賦型剤、希釈剤または担体を含有する。
【００２０】
本発明による「核酸分子」は、１本鎖または２本鎖のＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、好ましくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。機能的に等価なポリペプチドをコードすることができるヌクレオチド配列の誘導体は、技術上、周知である通常の方法を用いて得ることができる。
【００２１】
本発明に使用される核酸分子は、図 １に由来する配列（または関連する機能的に等価
な配列）だけからなるものであってもよく、あるいは構造上もしくは機能上の配列、具体的には転写および／または発現（特に哺乳類細胞において）を制御する配列、あるいは、たとえば分泌シグナルとして作用する特異的性質を有する融合タン白質を形成する付加的なタン白質部分のための配列を含む、追加の配列などを包含することができる。かくして、たとえば、上記配列は本明細書で記載した核酸分子を含むベクターの形態にあってもよ
い。好適なベクターとして、プラスミドおよび ウィルスがある。
【００２２】
本明細書でいう「ポリペプチド」には、完全長のタン白質とともに、より短い鎖長のペプチド配列、たとえば本明細書で記載するタン白質フラグメントのいずれも含まれる。そうしたポリペプチドは、任意の便利な手段により調製することができる。たとえば原核生物起源からの単離により、あるいは発現制御配列を作動的に結合させた適当な核酸分子を宿主細胞で発現させるか、またはそのような組換えＤＮＡ分子を含む組換えＤＮＡクローニングベヒクルもしくはベクターを発現させる組換え手段により、あるいは化学的または生化学的な合成 （細胞外）により調製することができる。
【００２３】
ヌクレオチド配列に関連して本明細書でいう「配列同一性」は、クラスタルＷ（ＣｌｕｓｔａｌＷ）を用いて、以下のパラメーターとともに評価を行なったときに得られる値をいう（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９４、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２、ｐ４６７３− ４６８０）：
ペア方式アライメント・パラメータ−方法：ａｃｃｕｒａｔｅ
マトリックス： ＩＵＢ、 Ｇａｐ ｏｐｅｎ ｐｅｎａｌｔｙ： １５．００、 Ｇａｐ ｅ
ｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ： ６．６６；
多重アライメント・パラメーター−マトリックス： ＩＵＢ、 Ｇａｐ ｏｐｅｎ ｐｅｎａｌｔｙ： １５．００、 ％ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｆｏｒ ｄｅｌａｙ： ３０、 Ｎｅｇａｔ
ｉｖｅ マトリックス： ｎｏ、 Ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ： ６．６６、 ＤＮＡ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ： ０．５．
アミノ酸配列に関連して、「配列同一性」は、クラスタルＷ（ＣｌｕｓｔａｌＷ）を用いて、以下のパラメーターとともに評価を行なったときに得られる値をいう Ｔｈｏｍｐｓ
ｏｎら、１９９４、上掲）：
ペア方式アライメント・パラメーター−方法： ａｃｃｕｒａｔｅ
マトリックス： ＰＡＭ、Ｇａｐ ｏｐｅｎ ｐｅｎａｌｔｙ： １０．００、Ｇａｐ ｅｘ
ｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ： ０．１０； 多重アライメント・パラメーター−マト
リックス： ＰＡＭ、Ｇａｐ ｏｐｅｎ ｐｅｎａｌｔｙ： １０．００、％ ｉｄｅｎｔｉ
ｔｙ ｆｏｒ ｄｅｌａｙ： ３０、 Ｐｅｎａｌｉｚｅ ｅｎｄ ｇａｐｓ： ｏｎ、 Ｇａｐ
ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｄｉｓｔａｎｃｅ： ０、Ｎｅｇａｔｉｖｅ マトリックス： ｎ
ｏ、Ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ： ０．２０、Ｒｅｓｉｄｕｅ−ｓｐｅ
ｃｉｆｉｃ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ： ｏｎ、Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ｇａｐ ｐｅ
ｎａｌｔｉｅｓ： ｏｎ、親水性残基： ＧＰＳＮＤＱＥＫＲ。特定残基における配列同一性は、簡単に誘導された同一残基を含むようにされている。
【００２４】
「機能的に等価な」タン白質またはタン白質フラグメントとは、図１のアミノ酸配列に関係するか、またはそれから誘導されるものであり、そのアミノ酸配列は、単一もしくは複数のアミノ酸 （具体的には １〜５０、たとえば１０〜３０、 好ましくは１〜５塩基
）の置換、付加および／または欠失により修飾されているが、それにもかかわらず該アミノ酸配列は機能的活性を保持している。たとえば、オボアルブミン誘導好酸球増加症（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉａ）を抑制し、具体的には
１０ ％を超える、好ましくは２５％を超える、とくに好ましくは ５０％を超える程度まで 好酸球数を減少させ、および／または特定のサイトカイン、具体的にはインターロイ
キン−１β （ＩＬ−１β）、ＩＬ−２、ＩＬ− ６、ＩＬ−８、 ＩＬ−１０、ＩＬ−１
２、ＩＬ−１２レセプター、腫瘍壊死因子ａ（ＴＮＦα）、インターフェロン−γおよび
顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ− ＣＳＦ）の産生を増加させ、たとえば正常レベルの１０倍を超える、好ましくは１００倍を超える増加であり、および／またはＴｈ１応答の刺激である。
【００２５】
アミノおよび／またはカルボキシル末端融合タン白質またはポリペプチドは、「付加」
変異体の意味の中に含まれ、ポリペプチド配列に融合した、付加的なタン白質またはポリペプチドを含む。
【００２６】
とりわけ好ましいのは、生物変異体といった自然界に生じる等価体であり、たとえばアレルの、地理上のまたはアロタイプの変異体および公知の技術を用いて調製される誘導体である。たとえば、機能的に等価なタン白質またはフラグメントは、化学的ペプチド合成、部位特異的突然変異、ランダム突然変異または酵素的開裂および／または核酸の連結といった公知の技術を用いる組換え体の形態のうち、いずれかの方法で調製できる。
【００２７】
本発明は、異なる原核生物からの等価体および関係する分子に向けられる。たとえば細菌の属、種または株から、とりわけＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、具体的には 結核菌
、Ｍ． ｂｏｖｉｓおよび Ｍ． ａｆｒｉｃａｎｕｍを含む結核菌複合体からの等価体で
ある。そうした配列自体も修飾されていてもよく、特に機能を保持して提供される誘導体化であってよい。
【００２８】
タン白質の誘導体は、合成／単離後の修飾あるいはたとえば修飾残基を用いる合成中の修飾、あるいは適切であれば修飾核酸分子の発現により調製できる。
【００２９】
本発明の機能的に等価なフラグメントは、切り詰めによるもの（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）であってもよく、たとえばＮおよび／またはＣ末端からのペプチドの除去、あるいは適切な活性のあるドメイン領域、たとえば機能を保持しているエピトープ領域の選択による。そのようなフラグメントは、図 １の配列から誘導されてもよく、あるいは図 １に開示されたものと機能的に等価なタン白質から誘導されてもよい。
【００３０】
機能的フラグメントが選択される場合、それらのフラグメントは、元の分子に帰される機能を必ずしも示す必要はないことは理解されるであろう。したがって、機能的に等価なタン白質またはフラグメントは、関係のある機能的特性を保持するものであり、そのためフラグメントは、本発明による有用性、具体的には上記のように、好酸球増加症の抑制、特定サイトカイン産生の増加および／またはＴｈｌ免疫応答の刺激を保持する。好ましくは、上記フラグメントは、鎖長６〜９９残基、具体的には１５〜９９残基、好ましくは６〜３０、１０〜２５、１５〜５０または１５〜３０残基である。図１に示す配列のとくに好ましいフラグメントは以下の残基に由来するか、または以下の残基からなる：
１−２５
１−５８
２５−９９
５１−９９
７５−９９。
【００３１】
図 １に掲げられた配列に対し、機能的に等価な核酸の配列／フラグメントは、本発明
の組成物にも使用される。これらの配列は、コードする（上記に定義したように）機能的に等価なタン白質／ペプチドに関して明確にされる。
【００３２】
本明細書で使用する「ハイブリダイゼーション」は、非ストリンジェント条件 （６ ｘ
ＳＳＣ／５０％ ホルムアミド、室温） で結合し、ならびに高ストリンジェンシーな条
件、すなわち ２ ｘ ＳＳＣ、 ６５°Ｃ （ＳＳＣ ＝ ０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０． ０１
５Ｍクエン酸ナトリウム、 ｐＨ７．２）で洗浄される配列である。
【００３３】
本明細書で述べる「製剤的に許容される」は、生理学的に許容される賦形剤のみならず、組成物の他の成分と共存できる成分について言う。
【００３４】
本発明に基づく医薬組成物は、容易に入手できる成分を用いて、従来の方式で処方することができる。したがって活性のある成分（すなわち、核酸分子またはタン白質／ペプチド）を、必要に応じて他の活性物質ならびに１つ以上の通常使用される担体、希釈剤および／または賦形剤と一緒に含有して、錠剤、ピル、 散剤、トローチ剤、小袋剤、カシェ
剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤、溶液剤、 シロップ剤、エアゾル剤 （固体としてまたは液体媒体中に）、軟膏剤、軟および硬ゼラチンカプセル、座薬、無菌注射溶液、無菌包装散剤などといった通常のガレヌス（ｇａｌｅｎｉｃ）製剤を形成することができる。
【００３５】
上記のような組成物には前記の核酸分子、ポリペプチドの作用を支援するか、または増強する分子を追加して含んでいてもよい。たとえばサリドマイド（ｔｈａｌｉｄｏｍｉｄｅ）（およびその類縁体）、低用量のシクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、 ＬＰＳ、 サイトカイン、 ケモカイン（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ） ＣｐＧ オ
リゴデオキシヌクレオチドおよび他の免疫調節薬および／または抗炎症性剤、たとえばサイトカイン・アンタゴニストまたはグルココルチコステロイドである。
【００３６】
したがってたとえば上記組成物は、特別の免疫治療のために活性のある成分と一緒に、たとえばガン・ワクチン中で、使用してもよい。本明細書で記載した核酸分子／ポリペプチドを含む、適当な免疫治療用の処置剤／ワクチン製剤には、サブユニット・ワクチンあるいは腫瘍特異的抗原、腫瘍に関係した抗原もしくは抗体または抗イディオタイプ・抗体に基づく処置剤、または治療またはワクチン接種用の細胞全体の調製物が挙げられる。治療またはワクチン接種に使用される場合、本明細書で記載した核酸分子またはポリペプチドは、抗原に対する特定の免疫応答をもたらす該抗原を提供する（またはコードする）ことができ、および／または一般的で非特異的な免疫応答となるかも知れない。後者の場合、他の活性成分を含む組成物を用いる際、本明細書で記載した核酸分子／ポリペプチドは、アジュバントとして作用し、したがってこの目的に使用できる。
【００３７】
予防用または治療用製剤は、１つ以上の製剤学的に許容される担体または希釈剤の存在下で１つ以上の好適なアジュバント、たとえば不完全フロインドアジュバント、ＢＣＧ、モンタニド（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）、水酸化アルミニウム、サポニン、ｑｕｉｌ Ａ 、またはそれらのさらに精製された形態、ムラミルジペプチド、鉱油または植物油、ノバソーム（Ｎｏｖａｓｏｍｅ）または非イオン性のブロックコポリマーまたは ＤＥＡＥ デキストランを含むように処方してもよい。好適な担体には、生理食塩水溶液といった液体媒体が含まれる。
【００３８】
好適な担体、賦形剤および希釈剤の例として、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアガム、 リン酸カルシウム、アグ
リネート（ａｇｌｉｎａｔｅｓ）、トラガカント（ｔｒａｇａｃａｎｔｈ）、ゼラチン、珪酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、 セルロース、 水シロップ、 水、 水／エタノール、 水／グリコール、 水／ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、メチルセルロース、 メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシ
ベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、鉱油または脂肪物質、たとえば硬性脂質またはそれらの適当な混合物などが挙げられる。上記組成物は、付加的に、潤滑剤、保湿剤、乳化剤、 懸濁化剤、 保存剤、 甘味剤、 香味剤などを含んでもよい。本発明の組成物は、患者に投与した後、活性成分の迅速な、持続する、または遅延した放出を与えるように公知の手順を使用することにより処方することができる。
【００３９】
上記組成物は、適切な投与形態、たとえば、エマルジョン、またはリポソーム、ニオソーム（ｎｉｏｓｏｍｅｓ）、マイクロスフェア（ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）、ナノパーティクル（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）などとすることができる。
【００４０】
必要なら上記組成物は、活性成分に結合したターゲティング部分を含んでもよい。たとえばリンパ球、単球、マクロファージ、血管内皮細胞、 上皮細胞、血液細胞、 赤血球、血小板、好酸球、好中球、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、脳細胞、心臓細胞、肺細胞、島細胞、腎臓細胞、ガン細胞、ホルモン分泌腺細胞、皮膚、骨、関節、骨髄、胃腸粘膜、リンパ節、パイエル板、大網および他の免疫組織などへのターゲティングといった特定の細胞型または位置へのターゲティングを可能とする、内因性レセプターに特異的かつ選択的に結合するリガンドである。
【００４１】
上記組成物は、ガン、アレルギー反応および／またはＴｈ２−型免疫応答に代表される病態、および／または好酸球増加症に関係する病態の治療または予防には有用性がある。
【００４２】
よって、本発明の別の面として、たとえば、ガン、アレルギー反応および／またはＴｈ２−型免疫応答に代表される病態および／または好酸球増加症に関係する病態を治療または予防する際に使用される医薬品として、好ましくは免疫抑制剤として、本明細書で記載される医薬組成物が提供される。
【００４３】
別の局面から本発明は、前記の医薬組成物を投与された患者において、ガン、アレルギー性応答および／またはＴｈ２−型免疫応答に代表される病態、および／または好酸球増加症に関係する病態を治療するかまたは予防する方法を提供する。
【００４４】
さらに、本発明は、ガン、アレルギー疾患および／またはＴｈ２−型免疫応答に代表される病態、および／または好酸球増加症に関係する病態を治療するかまたは予防するための医薬品の調製において、
（ｉ） 図 １のヌクレオチド配列 、 または
（ｉｉ） （ｉ）の配列に対して６６％を超える、たとえば ７０％ もしくは ７５％、
好ましくは ８０％ を超える、具体的には９０％を超える、または９５％の 同一性（前
記のテストによる）を有する配列、あるいは ２ ｘ ＳＳＣ、６５°Ｃ （ここで ＳＳＣ ＝ ０．１５Ｍ ＮａＣｌ、 ０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、 ｐＨ ７．２）の条件下で、（ｉ）の配列とハイブリダイズし、図 １のヌクレオチド配列によりコードされる配
列に対し機能的に等価なタン白質をコードする配列、あるいは
（ｉｉｉ）機能的に等価なタン白質フラグメントをコードする（ｉ）または（ｉｉ）配列のフラグメント；
を含む核酸分子の使用、あるいは
（ｉ） 図 １のアミノ酸配列、または
（ｉｉ） （ｉ）の配列に対して６０％を超える、たとえば６５％もしくは７０％ 、好ましくは ８０％ を超える、具体的には９０％を超える、または９５％の 同一性（前記の
テストによる）を有して、機能的に等価なタン白質を与える配列、あるいは
（ｉｉｉ） （ｉ）または（ｉｉ）の配列と機能的に等価なフラグメント
を含むポリペプチドの使用を提供する。
【００４５】
本明細書では、「治療」とは治療前の症状に対して、治療対象である１以上の病態症状を低減させ、軽減させ、または除去することをいう。たとえば、罹患する症状には、好酸球増加症、特定のサイトカイン分泌減少、Ｔｈ２に偏倚した免疫応答、腫瘍サイズ（具体的には、増殖を休止させる、分化を引き起こす、抗腫瘍性免疫応答を増強または誘導する、あるいは何らかの細胞の死滅を引き起こすことによる）アレルギー応答、自己抗体の存在などが挙げられ、これらは機能的に等価なポリペプチドの機能特性について特に規定されたような効果を達成するように治療される。
【００４６】
病態の「予防」とは、前記病態の１以上の症状の発現または程度によって評価されるが、病態の発生を遅らせるか、または予防すること、あるいはその過酷さを軽減することを
いう。
【００４７】
治療されるまた予防されるべきガンは、悪性および前悪性のまたは良性の腫瘍が挙げられ、さらには癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ）、肉腫（ｓａｒｃｏｍａｓ）、神経膠腫（ｇｌｉｏｍａ）、黒色腫（ｍｅｌａｎｏｍａ）およびホジキン病が挙げられ、膀胱、腎臓、膵臓、脳、頭部、頸部、乳房、腸、前立腺、肺および卵巣のガンおよび白血病さらにリンパ腫を含む。
【００４８】
治療されるまたは予防されるべきアレルギー病態には、湿疹（ｅｃｚｅｍａ）、 皮膚
炎（ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、アレルギー性鼻炎（ａｌｌｅｒｇｉｃ ｒｈｉｎｉｔｉｓ
）、アレルギー性結膜炎（ａｌｌｅｒｇｉｃ ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖｉｔｉｓ）、アレル
ギー性気道疾患（ａｌｌｅｒｇｉｃ ａｉｒｗａｙ ｄｉｓｅａｓｅｓ）、過好酸球性症候群（ｈｙｐｅｒ−ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、接触性皮膚炎（ｃｏ
ｎｔａｃｔ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、食物アレルギーならびに好酸球気道炎症（ｅｏｓ
ｉｎｏｐｈｉｌｉｃ ａｉｒｗａｙ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）および気道過敏症（ａｉｒｗａｙ ｈｙｐｅｒｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ）に代表される呼吸疾患、これには
、たとえばアレルギー性喘息（ａｌｌｅｒｇｉｃ ａｓｔｈｍａ）、内因性喘息（ｉｎｔ
ｒｉｎｓｉｃ ａｓｔｈｍａ）、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症（ａｌｌｅｒｇ
ｉｃ ｂｒｏｎｃｈｏｐｕｌｍｏｎａｒｙ ａｓｐｅｒｇｉｌｌｏｓｉｓ）、好酸球性肺炎（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、アレルギー性気管支炎、気管支拡
張症（ａｌｌｅｒｇｉｃ ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ ｂｒｏｎｃｈｉｅｃｔａｓｉｓ）、職業性喘息（ｏｃｃｕｐａｔｉｏｎａｌ ａｓｔｈｍａ）、反応性気道疾患症候群（ｒｅａｃ
ｔｉｖｅ ａｉｒｗａｙ ｄｉｓｅａｓｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、間質性肺疾患（ｉｎｔｅ
ｒｓｔｉｔｉａｌ ｌｕｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ）、過好酸球性症候群（ｈｙｐｅｒｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、寄生虫性肺疾患（ｐａｒａｓｉｔｉｃ ｌｕｎｇ
ｄｉｓｅａｓｅ）などが挙げられる。しかしながら上記組成物は、喘息の治療に好まし
く使用される。さらに好ましい態様において、該組成物は好酸球増加症がある役割を演じている病態、たとえばアレルギー（上記のように、とりわけ喘息）、アトピー性疾患および肺好酸球増加症を治療するために使用される。
【００４９】
治療される患者として、限定するものでないが哺乳類、とりわけ霊長類、飼育動物および家畜が含まれる。よって、特に好ましい治療の動物として、マウス、ネズミ、モルモット、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマが挙げられ、 とりわけ好ましくは、ヒトで
ある。
【００５０】
すでに述べたように、本発明による方法では核酸分子またはポリペプチドのいずれかが使用される。核酸分子を使用する場合、核酸分子は患者内で発現させる形態で便利に使用され、よって遺伝子治療の形態となる。したがって本明細書で記載された、核酸分子を含む医薬組成物は、遺伝子治療方法において使用することができる。
【００５１】
上記核酸分子は、たとえばリポソーム、ミセルまたは関心が向けられた細胞へのターゲティングを可能とするターゲティング部分を含む、他の適当な搬送ベヒクルで提供されてもよい。
【００５２】
あるいは、上記分子は、ウィルス、プラスミドまたは 細胞 （とりわけトランスフェクトされた種に適合する細胞）などの他の「ベヒクル」に包含されてもよい。これらは、そうした駐在分子の発現をもたらす目的のために当該技術分野ではいずれも周知である。
【００５３】
トランスフェクションのための適切な技術はよく知られており、これには、エレクトロポーレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏ
ｎ）、吸着、ウィルス・トランスフェクションおよびプロトプラスト融合などが挙げられる。
【００５４】
本発明の組成物の投与は、従来的な任意の経路で行なわれてもよく、具体的には、吸入によるか、経鼻的に、経口的に、経直腸的にあるいは筋肉内、皮下、腹腔内または静脈内の注射といった非経口的による。皮膚に組成物、たとえば軟膏を局所投与することによる治療または予防も可能である。投与は、必要に応じた間隔をおいて行なわれ、たとえば２回またはそれ以上の適用、具体的には毎時間、毎日、週ごとまたは月ごとの間隔で２−４回の適用あるいは１日、３−５日ごとに、または ２週間ごとに、毎月または季ごとの間
隔で数回の適用である。
【００５５】
関係する分子ｃｐｎ６０．２について行なわれた研究において、投与経路は生起する免疫応答に影響を及ぼすことが観察されている。たとえば、Ｍｔｃｐｎ ６０．２が鼻腔内
に投与されると、Ｔｈ２からＴｈｌへのシフトが刺激され、腹腔内に投与されると反対の効果が観察された。このため投与経路は、治療または予防する疾患を考慮に入れるべきである。たとえば自己免疫疾患を治療する際は、腹腔内投与が適切であり、他方、特定のアレルギー性疾患の治療または予防には、たとえば鼻腔内投与が適切である。
【００５６】
本発明の予防方法において、投与 （好都合には経口的に、または吸入、あるいは皮下
もしくは筋肉内注射）は、好ましくはもっと長い間隔、具体的には２−１２週の間隔で実施される。治療目的には、投与（好都合には経口的に、または吸入、あるいは静脈内注射） １日にまたは２日にわたって１−４回行なわれる。
【００５７】
本発明の組成物中の活性成分は、処方物重量の約０．０１重量％ 〜約９９重量％含有
される。 好ましくは約０．１〜約５０％、たとえば１０％である。該組成物は好ましく
は投与形態単位で処方され、具体的には各投与単位には約０．０１ｍｇ〜約１ｇの活性成分を含有する。たとえば、ヒトに対して０．０５ｍｇ〜０．５ｇで、好ましくは１〜１００ｍｇである。
【００５８】
投与される活性化合物の正確な投与量ならびに治療期間の長さは、たとえば患者の年齢および体重および治療に求められる特別の条件、その重篤度、および投与経路を含む多数の要因にもちろん依存する。しかしながら一般的には、有効用量は、投与する動物、投与形態に応じて、単一の投与として約０．１μｇ／ｋｇ 〜約１４ｍｇ／ｋｇの範囲内にあ
り、好ましくは ０．１ 〜１ｍｇ／ｋｇ、たとえば１日あたり、約１ｍｇ〜１ｇのポリペプチドである。よってたとえば、成人の１日あたりの適切な用量は、７μｇ〜１ｇ、たとえば１０ｍｇ〜ｌｇ／日、あるいは２５〜５００ｍｇ／日のポリペプチドである。
【００５９】
本明細書に記載された核酸分子を使用するときは、類似のまたはより少ない用量が用いられてもよく、具体的には約０．２ｎｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇ （たとえば 約０．２ｎｇ／ｋｇ〜約２ｎｇ／ｋｇまたは約１．５ｎｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇ）、成人には約１４ｎｇ〜約１７５ｍｇである。しかし、核酸分子が細胞またはベクターに包含される場合には、非ｃｐｎ コードＤＮＡの規模ならびに発現レベルに影響を及ぼす配列に
よっては、より多いかまたはより低い量が相応に必要となるかも知れない。具体的には５− または １０倍多い量である。たとえばベクターに包含された本明細書に記載の核酸分子では、約１．Ｏｎｇ／ｋｇ〜約１２．５ｍｇ／ｋｇで使用することができる。
【００６０】
上述のように本明細書で規定したポリペプチドのファミリーおよびそれらをコードする核酸分子は、サイトカイン群の産生を刺激する。それゆえこのことは、治療／予防の状況においてそれが生起するか否かにかかわらず、これらのサイトカイン産生を刺激する発現目的のためにこれらの化合物の使用を許容する。
【００６１】
よってさらなる面において、本発明は細胞のサイトカイン産生を刺激する方法を提供する。その方法は、
（ｉ） 図 １のヌクレオチド配列、または
（ｉｉ） （ｉ）の配列に対して６６％を超える、たとえば ７０％もしくは７５％、好ましくは ８０％ を超える、具体的には９０％を超える、または９５％の 同一性（前記の
テストによる）を有する配列、あるいは ２ ｘ ＳＳＣ、６５°Ｃ （ここで ＳＳＣ ＝
０．１５Ｍ ＮａＣｌ、 ０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）の条件下で、
（ｉ）の配列とハイブリダイズし、図 １のヌクレオチド配列によりコードされる配列に
機能的に等価なタン白質をコードする配列、あるいは
（ｉｉｉ）機能的に等価なタン白質フラグメントをコードする、（ｉ）または（ｉｉ）配列のフラグメント；
を含む核酸分子、あるいは
（ｉ） 図 １のアミノ酸配列、または
（ｉｉ） （ｉ）の配列に対して６０％を超える、たとえば６５％もしくは７０％ 、好ましくは ８０％ を超える、具体的には９０％を超える、または９５％の同一性（前記のテストによる）を有して、機能的に等価なタン白質を与える配列、あるいは
（ｉｉｉ） （ｉ）または（ｉｉ）の配列と機能的に等価なフラグメント
を含むポリペプチド
の上記細胞に対する投与を含む。
【００６２】
そのような方法は、インビトロで、すなわち生体外の細胞、組織または器官について実施することができる。具体的にはこの方法論は、本発明の分子、たとえばｃｐｎ１０ レ
セプター分子と反応するか、それに結合するか、あるいはそれにより活性化される分子もしくは分子群を同定するための研究方法において使用することができる。このような方法に対する１つの帰結として、サイトカイン産生の刺激は、本発明分子の存在を測定するために用いることができる。
【００６３】
したがって、別の面から本発明は、 サンプル中に本発明のポリペプチドまたはペプチ
ドの存在または濃度を評価する方法を提供する。その方法では、上記サンプルが細胞に適用されて、１つ以上のサイトカイン産生が測定され、対照サンプルにおけるそ（れら）のサイトカイン産生のレベルと比較される。ここで対照レベルを超える上昇は、当該サンプルにおいて上記ポリペプチドまたはペプチドの存在または濃度との関係を与える。
【００６４】
本明細書で用いる「対照」とは、本発明の分子または測定されるサイトカイン（類）の産生を増大させる部分を含まないサンプルを言及するものである。適切であれば、本発明の分子を用いて標準曲線を作成してもよく、これにより該分子の存在または濃度について、定性的評価も可能であるが、定量的評価をなすことを可能とする。この方法は、本発明の分子を同定するためにさらに使用することができる。
【００６５】
しかしながら代わりに、特定サイトカインの産生を増強すべく、インビボでサイトカイン産生を刺激する方法が実施されてもよい。このことは治療上または予防上の効果に利点を有するものである。この場合において本発明は、特定のサイトカインを増加させることにより軽減され、克服されるかまたは防止される病態を治療するために使用される上記の核酸分子およびポリペプチドならびにその目的用の医薬製剤の調製のため、そうした分子の使用に拡張される。
【００６６】
正常レベルより１０倍を超えて、または１００倍を超えて増大させるサイトカインは、好ましくは ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、Ｔ
ＮＦα、インターフェロン−γおよびＧＭ−ＣＳＦからなる群より選択される。
定義
「自己免疫疾患」
本用語は、自己免疫のプロセスがある疾患の病因に関与することが示され得る場合をカバーすることを意図している。典型的にはそのような病気はＴ ヘルパー リンパ球−１ （
Ｔｈ−１） 型免疫応答に関係している。
「アレルギー病態」
本用語は、Ｔ ヘルパー リンパ球−２ （Ｔｈ−２） 型免疫応答に関係する病態をカバーすることを意図している。アレルギー反応において、高いＩｇＥレベルが生起し、Ｔｈ−２ 免疫応答がＴｈ−１応答よりも優勢となり、その結果、炎症性の応答となる。アレル
ギー病態の例として、喘息、鼻炎／枯草熱、（ｒｈｉｎｉｔｉｓ／ｈａｙ ｆｅｖｅｒ）
、湿疹（ｅｃｚｅｍａ）およびアナフィラキシー（ａｎａｐｈｙｌａｘｉｓ）が挙げられる。
「アジュバント」
この用語は、抗原と一緒に取り込まれるか、あるいは同時に投与されると免疫応答が増強される物質をいずれもカバーする意図で用いられている。
【００６７】
「Ｍｔｃｐｎ１０」、「ｃｐｎ１０」、「ｈｓｐ１０」、「Ｐｅｐ１０」は、図１に示されたアミノ酸配列を言及するため、本明細書中では互いに交換できるように使用される。
【００６８】
［実施例］
以下、本発明を下記実施例によって詳細に説明する。本発明はそれらの実施例に限定されるものではない。
物質
シャペロニン１０タン白質の発現および精製
Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｃｐｎ１０は、Ｍ． Ｓｉｎｇｈ教授 （ＷＨＯ Ｃｏ
ｌｌａｂｏｒａｔｉｎｇ Ｃｅｎｔｒｅ、ドイツ）により、通常のクロマトグラフィーを
用いて下記のようにして調製された。
組換え体ｃｐｎ１０の精製
１０ｋＤａ抗原は、組換えＥ． ｃｏｌｉ株（ＩＰＴＧ−誘導）において、商業的に入
手可能なｐＭＡＬ−ｃベクター（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、マルトース結合タン白質（ＭＢＰ）との融合タン白質として、発現された。その初期の精製はアミロースアフィニティカラム上で行われた。その後、当該融合タン白質は、因子Ｘａ
で開裂され、１０ｋＤａ抗原はさらにアニオン交換クロマトグラフィーで精製され、１
０ｍＭ重炭酸アンモニウム溶液に対し透析が行なわれ、小分けされ、および凍結乾燥された。
【００６９】
タン白質各バッチのＬＰＳ汚染については、Ｌｉｍｕｌｕｓアッセイ（Ｔａｂｏｎａ
ら、 １９９８、 Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６１、ｐ１４１４−１４２１）を用いてチ
ェックすることにより、充分な注意を払った。もしＬＰＳ汚染が検出されたならば、ポリミキシンＢ（ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ Ｂ）アフィニティカラム上でそれを除去し、ＬＰＳレ
ベルを再びアッセイした。
【００７０】
組換え体の低ＬＰＳ−シャペロニンは、さらにＲｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ カラム上で、汚染するタン白質および ペプチドを除去して精製した（Ｔａｂｏｎａ ら、１９９８、上記）。
【００７１】
ヒトＰＢＭＣにおいて、ｃｐｎ １０による、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ
−１０、ＩＬ−１２、ＴＮＦαおよび ＧＭ−ＣＳＦの産生へのインビトロ効果を、Ｔａ
ｂｏｎａら、１９９８、上記、に記載されたように２−サイトＥＬＩＳＡを用いて決定し
た。
【実施例１】
【００７２】
マウスにおいてＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｃｐｎ １０は
喘息を抑制する
本実施例では、アレルギー性炎症のげっ歯類モデルにおいてＭ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏ
ｓｉｓ ｃｐｎ １０ タン白質が、免疫したマウスの気道への好酸球の動員を阻害したこ
とを初めて示す。これらのデータは、Ｍｔｃｐｎ１０がマウスの気道炎症を変調させ、これにより、アレルギー疾患の治療および予防について重要な示唆を有することを示す。
方法
炎症のげっ歯類モデル
抗原投与に引き続き、気道における好酸球およびＴ リンパ球動員の定量を可能とする
アレルギー性炎症のげっ歯類モデルが開発された。さらに現技術水準の肺モニタリングシステムが使用され、これは気管支収縮剤アゴニストに対する肺の機能における変化をインビボで測定することを可能とする。
免疫化プルトコル
Ｃ５７Ｂ１／６ 野生型 （地域の供給者）、６−８ 週齢マウスは、０日目に、オボア
ルブミンを用いて免疫され （１０μｇ 腹腔内注射； １ ｍｇ 水酸化アルミニウム）、
７日後に繰り返した。１４、１５および１６日目にマウスは、プレキシガラス（ｐｌｅｘｉｇｌａｓｓ）容器（１２ Ｌ）に収容して、霧状にしたオボアルブミン溶液（１０ ｍｇ／ｍｌ； Ｄｅ Ｖｉｌｉｂｉｓｓ Ｕｌｔｒａｎｅｂ ９０）に曝した。シャム免疫の野生型マウスは、０および７日目に水酸化アルミニウム１ｍｇ を注射し、１４−１６日目に
オボアルブミンで抗原投与した。エアゾール暴露は、毎日３回１時間の間隔で２０分間暴露させて行ない、気管支肺胞洗浄、免疫組織化学のため肺の採取および肺力学（ｌｕｎｇ
ｍｅｃｈａｎｉｃｓ）は、最後のエアゾール投与の後、２４時間して行なった。
【００７３】
オボアルブミンは、喘息患者によく見られる呼吸性アレルゲンではないが、炎症げっ歯類モデルで観察されるＴｈ２応答は、ハウスダストのダニで免疫した後に見られるものに類似している。これら２つのアレルゲンにより生起されるＴｈ２ サイトカイン・プロフ
ィールは、類似している。このオボアルブミンを用いる利点は、それが容易に入手でき、このアレルゲンの特異的な活性は、バッチ間で変動せず、そこで我々はバッチ間で抗原投与量をコントロールできることである。
ＢＣＧ処置
オボアルブミン（１０μｇ）で免疫してから６日目に、マウスに経静脈的に ＢＣＧ （ｌｏｇ（ＢＣＧ ｖｉａｂｌｅ）単位：−４、−５ および−６）を注入した。 ７日目、
マウス は、オボアルブミン（１０μｇ）のブースター（ｂｏｏｓｔｅｒ）注射を受けた
。１３日目、マウス は６日目と同じ投与量で、同一の投与経路にて２度目のＢＣＧ投与
を受けた。１４日目、マウスは、プレキシガラス容器に収容し、霧状にしたオボアルブミン溶液（１％ 溶液）への３０分間暴露を１時間間隔で３回行なった。この操作を１５お
よび１６日目にも繰返した。最後のオボアルブミン暴露の２４時間後、マウスを麻酔にかけ好酸球を数えるために気管支肺胞洗浄を行なった。
Ｃｐｎ １０ 処置
動物の同じバッチからのマウスをオボアルブミンで免疫し、Ｍｔｃｐｎ １０ （１０μｇ／動物）を気管に直接点滴することにより処置した。マウスはＭｔｃｐｎ １０で、 ６日目 および１３日目、次いで１４、１５、および１６ 日目の抗原投与（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）プロトコルの開始の３０分前にも処置した（総数５ 処置）。
結果
結果が図２に示されている。オボアルブミン投与後、気道への好酸球動員の有意な抑制があった。このことは、喘息におけるＭｔｃｐｎ１０（「Ｐｅｐ１０」）に対する保護効果を示唆する。
サイトカイン測定
我々は、最後の抗原投与後、２４時間して集められた血清および洗浄物中のサイトカイン産生に対するｃｐｎ１０の効果を調べた。我々は、１０μｇのｃｐｎ１０および５６μｇの６０．１で（両方とも治療の５用量スキームで投与される）で処置されたマウスの群から集められたサンプル中のＩＬ−４， ＩＬ−５ および ＩＮＦ−γ レベルの測定を行った。
【００７４】
最後の抗原投与後２４時間した血清中のサイトカインレベルを検出することはできず、ならびにＩＬ５は、この時点でいずれのサンプルでも検出されなかった。ＢＡＬ中で検出されたＩＬ−４および ＩＮＦ−γのレベルを、図３および図４に示す。
【００７５】
ｃｐｎ１０の重要な利点は、それが、急性症状を治療するのに使用される剤とは異なる予防剤を提供することが可能である。換言すれば、ｃｐｎ１０治療は、喘息のようなアレルギー病態を、発生から予防することが可能である。
【００７６】
喘息の予防および治療におけるｃｐｎ１０の使用は、この実施例に記載されている。当業者は、ここで得られた結果が、鼻炎／枯草熱、湿疹、アナフィラキシーなどの他のアレルギー病態に関係することを理解するであろう。これはすべてのアレルギー病態が共通の機作を有している（Ｔｈ−２細胞の過剰反応性）ためである。本明細書では、ｃｐｎ１０が喘息を抑制可能であれば、それはまた、他のアレルギー性病態をも抑制できるはずである。
【００７７】
これらのデータは、喘息のげっ歯類モデルにおいて、Ｍｔｃｐｎ１０が好酸球性炎症を抑制できることを初めて提示する。これは、このタン白質がマウスの気道炎症を変調させる能力を有しているということを示すものである。このことは、アレルギー性疾患、自己免疫疾患およびガンの治療および予防に対し重要な手がかりとなるものである。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】図１は結核菌（Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）からのｃｐｎ １０のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列を示す。
【図２】図２は、オボアルブミン（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）で誘導した肺好酸球増加症のマウスにおいてＭｔｃｐｎ １０（「Ｐｅｐ１０」）を５用量、投与した後の好酸球レベルの減少を示す。
【図３】図３は、ＢＡＬで検出されたＩＬ４のレベルを示す。
【図４】図４は、ＢＡＬで検出されたＩＮＦ−γのレベルを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞におけるサイトカイン産生を刺激する方法が、該細胞に対し
（ｉ） 図 １のヌクレオチド配列、または
（ｉｉ） （ｉ）の配列に対して６６％を超える同一性を有する配列、あるいは２ｘＳＳ
Ｃ、６５°Ｃ（ここで ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウ
ム、ｐＨ７．２）の条件下で、（ｉ）の配列とハイブリダイズし、図 １のヌクレオチド
配列によりコードされる配列に機能的に等価なタン白質をコードする配列、あるいは
（ｉｉｉ）機能的に等価なタン白質フラグメントをコードする（ｉ）または（ｉｉ）配列のフラグメント；
を含む核酸分子、あるいは
（ｉ） 図 １のアミノ酸配列、または
（ｉｉ） （ｉ）の配列に対して６０％を超える同一性を有して、機能的に等価なタン白
質を与える配列、あるいは
（ｉｉｉ） （ｉ）または（ｉｉ）の配列と機能的に等価なフラグメント
を含むポリペプチド
の投与を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記サイトカインの産生が、正常レベルに対し、少なくとも１０倍増加することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記サイトカインが、ＩＬ−１β、 ＩＬ−２、ＩＬ−６、 ＩＬ−８、 ＩＬ−１０、 ＩＬ−１２、 ＴＮＦα、インターフェロン−γおよび ＧＭ−ＣＳＦよりなる群の少なくとも１つから選択されることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
サンプル中に、請求項１〜３のいずれかに規定されるポリペプチドまたはペプチドの存在または濃度を評価する方法であって、該サンプルが細胞に適用され、１つ以上のサイトカインの産生が測定され、対照サンプルにおけるそ（れら）のサイトカイン産生のレベルと比較され、ここで対照レベルを超える上昇は、該サンプルにおいて上記ポリペプチドまたはペプチドの存在または濃度との関係を与えることを特徴とする方法。
【請求項１】
細胞におけるサイトカイン産生を刺激する方法が、該細胞に対し
（ｉ） 図 １のヌクレオチド配列、または
（ｉｉ） （ｉ）の配列に対して６６％を超える同一性を有する配列、あるいは２ｘＳＳ
Ｃ、６５°Ｃ（ここで ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウ
ム、ｐＨ７．２）の条件下で、（ｉ）の配列とハイブリダイズし、図 １のヌクレオチド
配列によりコードされる配列に機能的に等価なタン白質をコードする配列、あるいは
（ｉｉｉ）機能的に等価なタン白質フラグメントをコードする（ｉ）または（ｉｉ）配列のフラグメント；
を含む核酸分子、あるいは
（ｉ） 図 １のアミノ酸配列、または
（ｉｉ） （ｉ）の配列に対して６０％を超える同一性を有して、機能的に等価なタン白
質を与える配列、あるいは
（ｉｉｉ） （ｉ）または（ｉｉ）の配列と機能的に等価なフラグメント
を含むポリペプチド
の投与を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記サイトカインの産生が、正常レベルに対し、少なくとも１０倍増加することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記サイトカインが、ＩＬ−１β、 ＩＬ−２、ＩＬ−６、 ＩＬ−８、 ＩＬ−１０、 ＩＬ−１２、 ＴＮＦα、インターフェロン−γおよび ＧＭ−ＣＳＦよりなる群の少なくとも１つから選択されることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
サンプル中に、請求項１〜３のいずれかに規定されるポリペプチドまたはペプチドの存在または濃度を評価する方法であって、該サンプルが細胞に適用され、１つ以上のサイトカインの産生が測定され、対照サンプルにおけるそ（れら）のサイトカイン産生のレベルと比較され、ここで対照レベルを超える上昇は、該サンプルにおいて上記ポリペプチドまたはペプチドの存在または濃度との関係を与えることを特徴とする方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００８−２１４３４７（Ｐ２００８−２１４３４７Ａ）
【公開日】平成２０年９月１８日（２００８．９．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３７５５０（Ｐ２００８−３７５５０）
【出願日】平成２０年２月１９日（２００８．２．１９）
【分割の表示】特願２００２−５４２４１０（Ｐ２００２−５４２４１０）の分割
【原出願日】平成１３年１１月１６日（２００１．１１．１６）
【出願人】（５０３１７９１７１）ヘルパーバイ セラピューティクス リミテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年９月１８日（２００８．９．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月１９日（２００８．２．１９）
【分割の表示】特願２００２−５４２４１０（Ｐ２００２−５４２４１０）の分割
【原出願日】平成１３年１１月１６日（２００１．１１．１６）
【出願人】（５０３１７９１７１）ヘルパーバイ セラピューティクス リミテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
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