癌疾患修飾抗体
ヒトの腫瘍を処置するために癌疾患修飾抗体（ＣＤＭＡＢ）７ＢＤ−３３−１１Ａの使用と、ＣＤ６３抗原性部位を発現する癌細胞を単離および同定する方法。ＣＤ６３抗原性部位に結合するモノクローナル抗体７ＢＤ−３３−１１Ａ（ＡＴＣＣに期待寄託番号ＰＴＡ−４８９０）は、抗原性部位を発現する癌細胞に対して細胞毒性を示す。このモノクローナル抗体７ＢＤ−３３−１１Ａは、ヒト腫瘍の疾患進行を遅延させることに有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に腫瘍細胞の細胞毒性の調停に、この発明は、診断とガン疾患の治療に関するものである；そして、特に癌疾患修飾抗体（ＣＤＭＡＢ）の使用に対するほとんど（任意に、細胞毒性応答を始めるための手段として、一つ以上の化学療法剤と結合する）。更なる発明は結合アッセイに関するものである。そして、それは本発明のＣＤＭＡＢを利用する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＤ６３はｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎ家族のＴｙｐｅ ＩＩＩ膜タンパク質である。そして、メンバーがそうである２０の電流は４つの膜貫通の部分の存在によって誰のものを特徴づけた。いくつかの群は、活性化血小板、顆粒球と黒色腫細胞の細胞全体の標本まで上げられる抗体を使用して、それぞれにＣＤ６３を確認した。それらの同族の糖蛋白抗原のそれぞれの相補ＤＮＡのクローニングは、異なる抗原が全く同一の分子であった認識に導いた。Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｔｙｐｉｎｇ（１９９６）のＳｉｘｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｓｈｏｐは、その後これらの抗体をＣＤ６３抗体に分類した。１９９６のＷｏｒｋｓｈｏｐの前に、ＣＤ６３は複数の名前（黒色腫１抗原、眼メラノーマ結合抗原、黒色腫関連する抗原ＭＥ４９１、リソソーム関連の膜糖タンパク質３、グラヌロフィジン、メラノーマ結合抗原ＭＬＡｌ）に知られていた。そして、それは時々、その部分性質と識別に導いた抗体に関連があった。このように、抗原ＭＥ４９１（ＭＡｂ ＭＥ４９１）、ニューロ腺抗原（ＭＡｂｓ ＬＳ５９、ＬＳ６２、ＬＳ７６、ＬＳＩ１３、ＬＳ１４０とＬＳ１５２）、Ｐｌｔｇｐ４０（ＭＡｂｓ Ｈ５Ｃ６、Ｈ４Ｆ８とＨ５Ｄ２）、ヒト骨髄間質細胞抗原（ＭＡｂ １２Ｆｌ２）、ｏｓｔｅｏｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒに特異的なマーカー（ＭＡｂ ＨＯＰ−２６）とｉｎｔｅｇｒｉｎ−がタンパク質（ＭＡｂ ６Ｈｌ）を結合したので、ＣＤ６３も示された。交差するとわかった他の抗体は、ＣＤ６３がそうであったヒトで反応する８−１Ｈ、８−２Ａ（ＭＥ４９１による交差反応性）、ＮＫＩ／Ｃ−３、そして、ＮＫＩ／ｂｌａｃｋ−１３ （Ｖａｎｎｅｇｏｏｒ ａｎｄ Ｒｕｍｋｅ， １９８６；Ｄｅｍｅｔｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， １９９２；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９２）である。
【０００３】
ＣＤ６３はまず最初に、ＭＡｂ ＭＥ４９１を使用している黒色腫ｃＤＮＡライブラリーからクローンをつくられた。そして、多数の抗体の一つがヒト黒色腫細胞の標本に対して増えた。ＭＡｂ ＭＥ４９１の反応性がヒト黒色腫生検の検査で黒色腫進行と反対に相関しているように見えることを示された。ＭＥ４９１抗体の反応性は、通常のメラノサイト（黒色腫進行（異形成母斑と肥大成長は、（ＲＧＰ）腫瘍を段階的に実行する）で、減少する初期のまたは垂直増殖相（ＶＧＰ）の、そして、転移性腫瘍のそれらのようなより進行した黒色腫腫瘍でなしでさえ高等）で低かった。
【０００４】
ＣＤ６３は、見つかりもして、５３ｋＤａ、活性化に依存する血小板膜を見つけたＭＡｂ ２．２８（活性化血小板に対して上がる）を使用しているヒト血小板でも、部分的に特徴づけられた糖蛋白。この分子は、刺激されていない血小板で内部顆粒の膜と関係してもいた。同じ検査において、ＭＡｂ ２．２８も巨核球と内皮細胞で内部顆粒にラベルをつけた。ここで、それは酵素カテプシンＤ（リソソームの区画の既知のマーカー）に抗体で共存した。抗体クラスター形成と表現クローニングで追跡調査、この抗体によって認められる抗原の識別に導いた、ＣＤ６３、そして、更に確立されたそれが区画に特異的なマーカーＬＡＭＰ−ＩとＬＡＭＰ−２で共存したリソソームの区画でその存在。この分子のクローニングは、それをＣＤ６３と確認して、テトラスパニン・ファミリーへのその加入を許した。
【０００５】
ＣＤ６３の表示は、多くの異なる組織と細胞型で発見されていた。細胞レベルで、それが原形質膜で、更に、細胞内遅いエンドソームの多孔質構造で関連するとわかった。ＣＤ６３の細胞内ストアの流動化によるさらなる表面表現に、特定のケースでは、細胞活性化はリードした。Ｂリンパ球のＭＨＣクラスＩＩで、特にエンドソームにおいて、ＭＨＣクラスＩＩ複合体を表面に輸出することに関係するｅｘｏｓｏｍｅｓで、そして、分泌された小疱で、ＣＤ６３が共存するともわかって、物理的に結びつきもする。ＣＤ６３がテトラスパニン・ファミリー、例えばＣＤ９、ＣＤ８１の他のメンバーと交流するとわかった。そして、ＣＤＩｌ（インテグリン鎖αＭ，Ｌ，ｘ）が、Ｂ−とＴ−リンパ球、好中球、乳癌と黒色腫細胞を含む種々の細胞型で、５つのＣＤ１８（インテグリン鎖β２）、ＣＤ４９ｃ（ＶＬＡ−３またはインテグリン鎖Ｏｔ３）、ＣＤ４９ｄ（インテグリン鎖α４）、ＣＤ４９ｆ（ＶＬＡ−６またはインテグリン鎖α６）とＣＤ２９（インテグリン鎖Ｐ１）であった。
【０００６】
癌のＣＤ６３の役割は、不明だった。ＣＤ６３がまず最初に多様なイベント（例えば血小板と顆粒球活性化）、ＭＨＣクラスＩＩに依存する抗原提示、インテグリンに依存する細胞接着と自動運動性に関係しているいくつかの独立群と癌の特定の種類の腫瘍発達によって発見されたにもかかわらず、その機能はまだ完全に説明されていない。現在の証拠がその役割の種々の細胞生理的イベントを支持する場合であっても、これらの機能が互いに独立しているかどうか、または、ＣＤ６３が含まれる下にある一般の細胞機序があるかどうか明らかでない。
【０００７】
いくつかの群は、ＣＤ６３の間の関係と腫瘍（特に黒色腫）の特定の種類の進行を調査した。多数の他の抗ＣＤ６３モノクローナル抗体は、Ｍａｂ ＭＥ４９１に加えて、進行のさまざまな段階で腫瘍患者から得られる癌試料の免疫組織化学的な（ＩＨＣ）染色のために開発された。減少した染色（ＣＤ６３の最も見込みのある反射している減少した表示として著者によって解釈される）が先進の進行で、そして、腫瘍の転移性の特徴で相互関係のあると述べられた。より最近の調査は、また、テトラスパニン・タンパク質ファミリー（ＣＤ６３を含む）の数人のメンバーといくつかの乳癌から派生した細胞系の生体外感染度の見た目の減少した表現レベル（メッセンジャーＲＮＡの定量化の後で）との間の有意の相関を述べた。エストロゲン剥奪を受ける洗練された乳癌細胞で、ディファレンシャルディスプレイで、もう一つの検査は、ＣＤ６３を確認した。これは、ＣＤ６３表現が調整されるステロイドホルモンでありえる、そして、変えられたＣＤ６３多量および／または機能が胸部腫瘍発達を伴いもするかもしれないことを示した。
【０００８】
対照的に、抗ＣＤ６３モノクローナル抗体ＭＡｂ嗜眠状態−５．０１による仕事は、その反応性エピトープが異なる正常組織で不定に表されることを明らかにした。この抗体がＣＤ６３を認識するとわかったにもかかわらず、それは転移性黒色腫（ＭＡｂ ＭＥ４９１と異なった）を含む初期でより多くの増悪期黒色腫を区別しなかった。そして、それはＣＤ６３抗原がこれらのより進行した腫瘍で存在した、しかし、そのエピトープの一部が異なる段階で腫瘍から細胞でマスキングされる可能性があったことを示唆した。これは中心的なＣＤ６３ポリペプチドの、または他の分子によるＣＤ６３の相互作用に対する変えられた翻訳後修飾によったかもしれない。そして、それは抗体認識と結合のために特異的なエピトープの有効性に影響を及ぼしたかもしれない。これらの結果は、抗ＣＤ６３ ＭＡｂ ＮＫＩ−Ｃ３でとても染色される、診察（ケイ素とハーシー（１９９３）によって解説される）を支持した進行（例えば原発性、放射増殖相、垂直増殖相と転移性黒色腫）の異なる段階の黒色腫からの組織切片を区別した。他の検査で‖（小足立は、ａｌ．（１９９８）である；小ホワンはａｌ．（１９９８）である）胸部からの、そして、定量的ＰＣＲ、そこの２つのテトラスパニン・ファミリー（ＣＤ９とＣＤ８２）のためのそれらの表現レベルと腫瘍発達との間の有意の相関であった現われたと患者予後によって、非小細胞肺癌からのメッセンジャーＲＮＡの分析、その表現が全ての試料の点で同様だったという点で、そのような相互関係はＣＤ６３のために発見されなかった。これら、明らかに相克、結果の結果として、癌でＣＤ６３の関連を決定的に示す、強くて一貫したデータの不足が、ある。
【０００９】
現在まで、極めて少ないインビボの研究は、ＣＤ６３の関連とこの分子の最終的な腫瘍抑制器機能を確立することを試みた。本研究のうちの１つにおいて、増加した生存期間までにと同様に減少した腫瘍サイズと転移性の可能性によって示されるように、親の非ＣＤ６３過剰発現している細胞の反応と比較してとき、ヒトのＣＤ６３過剰発現しているＨ−ラス癌遺伝子変わるＮＩＨ−３Ｔ３細胞（皮下に、そして、腹腔内に胸腺欠損のマウスに噴射される）は減少した悪質な／腫瘍化の表現型を現した。これは、悪性変換細胞のヒトＣＤ６３の存在がそれらの悪質な挙動を抑制するかもしれないことを示唆した。最近より多く（ヒトＣＤ６３を表している遺伝子導入マウス・モデルによる仕事）は、そして、ＣＤ６３に対する耐性を誘導するために開発されて、注入されたヒトＣＤ６３−ＭＨＣクラスＩ（Ｈ−２Ｋ）の腫瘍成長がネズミのメラノーマ細胞ラインを同時形質移入したことが阻害されることができることを示した、そして、ワクシニアウイルスに溶解するヒトＣＤ６３による免疫処置に応じて、生存は増加した。著者によって治療効果が従属するＴリンパ球であることを示唆された、そして、腫瘍発育阻止が動物がＣＤ６３−ＭＨＣクラスＩを注射されたときｃｏ−が細胞を形質移入して、細胞系をＣＤ６３−ｏｎｌｙなもので形質移入しなかったことを思いつくだけだった時から、その内因性抗ＣＤ６３抗体はこの保護作用に関係しているように見えなかった。この解釈は、野生型動物（浄化されたヒトＣＤ６３でプレ免疫にして、抗ヒトのＣＤ６３抗体を開発したことが示される）において、保護作用が腫瘍細胞の発達に対してなかったという事実で支えられた。仕事はＫＭ３細胞系を使用していてラドフォードその他によって（１９９５）を記載した。そして、まず最初に、有意差がさまざまな形質移入されて非形質移入の細胞系の生体外成長速度の間になかったにもかかわらず、皮内に胸腺欠損のマウスに噴射されるときラット血統（ヒトＣＤ６３で形質移入される）であることがこのタンパク質の表現度が、親の非−形質移入されたＫＭ３細胞を使用しているのを見られるそれと関連して、これらの細胞の成長とｍｅｔａｓｔａｓｔｉｃな可能性を減少させることを示唆したので、ヒト起源であると思われたが、後で特徴づけられた。これらの診察は、ＣＤ６３の潜在的効果と腫瘍細胞のインビボで生体外成長速度に影響を及ぼすために知られている他の癌抑制遺伝子のそれを区別した。さらにまた、抗ＣＤ６３モノクローナル抗体ＭＥ４９１（それが生体外分析（ラドフォードその他、１９９７）でそれらのランダムな自動運動性を減少させることによって同じ細胞の上に機能効果を持つとわかった）の追加は、それらの生体外成長速度に影響を与えなかった。
【００１０】
本研究もＣＤ６３が細胞外基質（ＥＣＭ）−由来の化学誘引物質（例えばラミニン、フィブロネクチン、コラーゲンとビトロネクチン）に反応した遊走を促進する可能性があるという、そして、この効果がβｐｔｙｐｅインテグリンの機能的な関係によって媒介となられる可能性があるという診察を記載した、しかし、インテグリンに対する抗体はこれらの結果を妨害することができなかった。しかしながら、ビトロネクチンによって媒介される情報伝達（インテグリンαｖβｓのための既知の配位子）の役割と他のＥＣＭ部品（例えばＣＤ６３トランスフェクション細胞のフィブロネクチン、ラミニンとコラーゲン）によって媒介となられる情報伝達のそれとの間の拮抗する効果であるように見えた。これは、特異的な状況の下で、ＥＣＭ成分の面前で、ＣＤ６３の表示が減少した遊走に導く可能性がある、そして、これが癒着と自動運動性の間の微細な釣合いに依存している可能性があることを示唆した。もう一つの検査において、もう一つの抗ＣＤ６３モノクローナル抗体（ＭＡｂ ２．２８）が、菌体群の非常により少ない分数だけの上で以外、類似の効果を進める間、そして、非常によりかなりの総計で加えられる場合にだけ、抗ＣＤ６３モノクローナル抗体（ＭＡｂ ７１０Ｆ）はピロメリト酸治療をうけているＨＬ−６０細胞の癒着と伝播を強化した。これらの成績は、ＣＤ６３に対する多くの抗体が開発されたにもかかわらず、それらの機能効果が全く異なることがありえることを示した。
【００１１】
テトラスパンニンは、細胞増殖に関係してもいる可能性がある。オーレンその他は（１９９０）、リンパ腫細胞系の上で、ＣＤ８１（ＴＡＰＡ−Ｉ）を認識するネズミのＭＡｂ ５Ａ６の抗増殖効果を記載した。もう一つの検査において、抗体によるヒトＴ−リンパ球のＣＤ３７の結合は、ＣＤ３７によって誘発された増殖を妨げた。最近では、ＣＤ３７（ＣＤ３７ノックアウト）の表示に欠けた動物モデルでの検査で、この動物からのＴリンパ球がコンカナバリンＡ活性化とＣＤ３／Ｔ細胞受容体約束に反応して野生型動物からそれらと比較して高増殖性であることが分かった。細胞増殖と増殖での機能的な役割がテトラスパニン・ファミリーの共通機能であるかもしれないことを従って、提案された。
【００１２】
胚芽腫と肝細胞性カルシノーマ細胞による最近の研究で、抗ＣＤ８１モノクローナル抗体によるこれらの細胞の関わりがＥｒｋ／ＭＡＰキナーゼ経路の活性化に導くことが分かった。このシグナル伝達経路は、細胞増殖と増殖イベントと関係していることが示された。平行した仕事において、ＣＤ８１が示したヒトを過剰発現している形質移入された細胞系は、ふざけて形質移入された対照細胞と関連して増殖を増加させた。従って、細胞増殖と関連するイベントでは、そして、細胞接着／自動運動性で、利用できる証拠は、一般のｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎｓの、そして、ＣＤ６３特にの役割を示していた。両者とも腫瘍発達と転移で中心的な役割を演ずるにつれて、細胞イベントのこれらの２つのタイプは現在強度の調査の標的である。
【００１３】
これまで、抗ＣＤ６３抗体または特にＣＤ６３を表している細胞を目標とした他の試薬は、報告されなくて、生体外ものの上で、そして、腫瘍細胞の、更に、腫瘍細胞の発達の動物モデルの生存期間のインビボの増殖特性の上で同時の影響を及ぼすことが示されなかった。アミノ酸配列決定と分析でテトラスパニンと他のタンパク質族の間で相同性が現れなかった、または、どんな前に特徴づけられた機能モジュールででも、そして、それはどんな前に既知の酵素活性でも提案しなかった。その結果、シグナル伝達経路の変調でこの一群のタンパク質の役割を調査することは、非常に難しかった。しかしながら、細胞生理の変化に導いた、そして、シグナル伝達経路の変調に本質的に依存していたテトラスパニン−特異試薬を使用して発生する証拠は、テトラスパニンがシグナル伝達性質を持つことを示唆する。ＣＤ６３は、物理的に、そして、機能的に、それ自身二次伝達物質信号の生成に関係するいずれの酵素でもある分子数と関連することが示されたか、物理的におよび／または機能的に、そのような酵素と関連する。
【００１４】
内皮細胞（それは炎症反応の最初のステップのうちの１つである）でヒト好中球の相互作用を制御している機構を切り裂くようになっている実験で、いくつかの抗ＣＤ６３モノクローナル抗体（ＡＨＮ−１６、ＡＨＮ−１６．１、ＡＨＮ−１６．２、ＡＨＮ−１６．３とＡＨＮ−１６−５）による好中球の前処理が培養内皮細胞層にそれらの癒着を促進することが分かった。さらに、この効果はカルシウムイオン（Ｃａ２＋）の存在に強く依存していた、多くの細胞内シグナル伝達経路の周知の調節因子、そして、細胞が刺激的な抗体にさらされた特異的な期間に制限された。抗体へのより長い暴露の後、内皮細胞に対する好中球の癒着は、Ｃａ２＋の後の追加に非感受性に、従って、力を関係させているようになって、時間的に（一過性の）イベントを調整した。加えて、ＣＤ６３が物理的にＣＤＩｌ／ＣＤ１８タンパク質複合体と相互に作用するとわかった、そして、特にこの複合体を目標とした試薬は修飾的な信号の媒介となった。ＣＤ６３が物理的に関係しているともわかった本研究において、またはパートである、酵素チロシンキナーゼＬｃｋを含んだ複合体とＨｃｋ。これらの酵素は特異的な表面受容体の活性化に応じて細胞内調節シグナルの媒介となることにおいて中心的な役割を果たすタンパク質の種類のメンバーであって、細胞に特有の生理的変化を結果として〜になるシグナル伝達経路の滝の一部である。もう一つの検査は、モノクローナル抗体によるテトラスパニン（ＣＤ６３を含む）の共同結合がコラーゲン基質にＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞の癒着によって誘発された酵素焦点性癒着キナーゼ（品目無差別で）のリン酸化反応または活性を強化することができることを示唆した。これは、インテグリンによって媒介されるチロシンキナーゼ・シグナル伝達経路の変調で、ＣＤ６３（そして、他のテトラスパニン・ファミリーの）の直接の参加を示していた。７１０Ｆ、抗ＣＤ６３モノクローナル抗体ＭＡｂによって表面ＣＤ６３の存在と結合と機能的に交わる可能性がある他のシグナル伝達経路は、酵素プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）（細胞内シグナル伝達経路のもう一つの有名な調節因子）によるリン酸化反応の変調に依存しているそれらであるように見える。この文脈において、ＰＫＣの時間的関係が決定的に示されなかったにもかかわらず、癒着の、そして、ＭＡｂによる骨髄細胞系ＨＬ−６０の形態学的変化の強化は７１０Ｆ、ホルボールミリステートアセテート（ピロメリト酸）で細胞の前処理に依存していた。しかしながら、独立群によるあと片付け工事は、分子Ｒｏ３１−８２２０（この酵素の特異的阻害剤）がピロメリト酸の結果を妨害した時から、ピロメリト酸によって誘発されたＨＬ−６０分化がＰＫＣ−活性扶養家族であったことを証明した。
【００１５】
ＣＤ６３と他のテトラスパニン・ファミリーの関連を支援している更なる証拠は、シグナル伝達経路で、チロシン・ホスファターゼ活性で、直接的にまたは超分子複合体の一部として、ＣＤ６３（更に、ＣＤ５３）分子の間の物理的な関係を記載した仕事に起因した。この研究において、抗ＣＤ６３抗体で分離される免疫沈降物複合体はチロシン・ホスファターゼ活性を伴うことが示された、しかし、ＣＤ５３（それはチロシン・ホスファターゼＣＤ４５を一体にすることが示された）のためにとは異なり、ＣＤ６３関連のホスファターゼを特定することは可能でなかった。最近では、テトラスパニン・ファミリーの数人のメンバーが、ＩＩ型ホスファチジルイノシトール４−キナーゼ（ＩＩ型歯周指数４Ｋ）（Ｂｅｒｄｉｔｃｈｅｖｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， １９９７）を伴うともわかった。それがＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ１５１とＡ１５／ＴＡＬＬＡのために確認されるだけだった時から、この相互作用は非常にはっきりしているように見えた、そして、それはＣＤ３７、ＣＤ５２、ＣＤ８２またはＮＡＧ−２で起こるのを見られなかった。加えて、各々のＰＩ−４キナーゼを含有する複合体が一つのテトラスパニン・ファミリーに限られていた時から、テトラスパニン・ファミリーとＰＩ−４Ｋの間の関係は排他的だった。ＣＤ６３−ＰＩ−４キナーゼ複合体は、特に、ほぼ完全に、脂質いかだのような領域（他のテトラスパニン・メンバーと形成されるそれらと異なった）で、細胞内区画で見つけられた。この診察はこのＣＤ６３分数（ＰＩ−４キナーゼと対話するとわかる）がホスホイノシチド生合成経路に関連があるか、従属する特異的な細胞内イベント（Ｃｌａａｓ， Ｃ， ｅｔ ａｌ．， ２００１））に関与しているかもしれなかったことを示唆した。そして、それは、二次伝達物質分子（Ｍａｒｔｉｎ， Ｔ．， １９９８）としてのそれらの機能に加えて、膜輸送（エンドサイトーシスとエキソサイトーシス）の調節へのそれらの関与で有名で細胞骨格再編成である。
【００１６】
調節装置としてまたはこれらの酵素の活性から下流の効果器分子として、ＣＤ６３がこれまで、直接伴うとわかったシグナル伝達経路の調節の全ての酵素の直接で重要な参加は、シグナル伝達経路の変調で、ＣＤ６３の関連を支援して、更なる証拠を提供した。
【００１７】
腫瘍発達に対する導出がしばしば非常に難しくて複合の努力である機構の解明は、明らかに矛盾している診察と、その結果、それによって診察がうまく効果的治療に変換するその人々に珍しいと記録した。腫瘍発達と転移で、そして、シグナル伝達機構でＣＤ６３の関連について現在知られていることを鑑みて、腫瘍細胞で、その機能が変えられる可能性があるかもしれない。
【００１８】
細胞障害能による抗原特異性の試薬の発現は腫瘍細胞の上で生じて、認められた抗原（ｓ）を表している細胞を結合して、そして、これらの試薬が正常な菌体群の上で重要な有害作用なしで腫瘍細胞の発達（進行と転移）を阻害するように、単独で、あるいは、他の分子と関連して、細胞でインビボの生理活性を持つ、治療的な可能性として非常に有益である、そして、または診断ツール。
【００１９】
先行特許：
【００２０】
ＵＳ０５２９６３４８は、細胞代謝に対する抗転写性のおよび／または反複製的な効果を内在化していて、確認しているモノクローナル抗体のために持っている癌細胞表面抗原に特有のモノクローナル抗体を選択する方法を教える。例証として、ＭＥ４９１抗体は、Ｗ９、ＷＭ３５、ＷＭ９８３黒色腫細胞とＳＷ９４８で結腸直腸カルシノーマ細胞を内在化することが示された。加えて、ＭＥ４９１抗体は、ＳＷ９４８細胞で転写と細胞増殖を減少させることが示された。特許出願ＵＳ２００３０２１１４９８Ａ１（そして、その関連したアプリケーション：ＷＯ０１７５１７７Ａ３、ＷＯ０１７５１７７Ａ２、ＡＵ０１５３１４０Ａ５）、ＣＤ６３抗原を含む群の中から選択される卵巣腫瘍標識遺伝子によってコードされる卵巣腫瘍マーカー・ポリペプチドを結合する抗体で卵巣腫瘍の増加または転移を阻害する方法を主張しなさい。卵巣癌を使用している遺伝子発現の連続分析は、候補としてＣＤ６３の識別に導く卵巣腫瘍標識遺伝子を特定するために行われた。特許出願ＷＯ０２０５５５５１Ａ１（そして、その関連したアプリケーションＣＮ１３６４８０３Ａ）は、新しいポリペプチド−ヒトＣＤ６３抗原５６．８７を主張する。特許出願ＣＮ１３２６９６２Ａは、新しいポリペプチド−ヒトＣＤ６３抗原１４．６３を主張する。特許出願ＣＮ１３２６９５１Ａは、新しいポリペプチド−ヒトＣＤ６３抗原１５．０７を主張する。特許出願ＣＮ１３５１０５４Ａは、新しいポリペプチド−ヒトＣＤ６３抗原１１．１１を主張する。これらの特許と特許出願は、ＣＤ６３抗原と抗体を特定するが、本発明の単離モノクローナル抗体または本発明の単離モノクローナル抗体の有用性を開示するのに失敗する。
【特許文献１】ＵＳ０５２９６３４８
【特許文献２】ＵＳ２００３０２１１４９８Ａ１
【特許文献３】ＷＯ０１７５１７７Ａ３
【特許文献４】ＷＯ０１７５１７７Ａ２
【特許文献５】ＡＵ０１５３１４０Ａ５
【特許文献６】ＷＯ０２０５５５５１Ａ１
【特許文献７】ＣＮ１３６４８０３Ａ
【特許文献８】ＣＮ１３２６９６２Ａ
【特許文献９】ＣＮ１３２６９５１Ａ
【発明の開示】
【００２１】
即時の発明者は以前米国特許６，１８０，３５７を与えられた。そして、個々にカスタマイズされた抗癌抗体を選択する方法に導かれる「Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｉｚｅｄ Ｐａｔｉｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」と名付けられた。そして、それは癌疾患の処置に有用である。この文献では「抗体」と「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）が同義的に使われる可能性があって、ハイブリドーマ（例えばマウスまたはヒト）によって生産される完全な免疫グロブリンを参照する可能性がある期間、のために、免疫複合体と（適当であるように）免疫グロブリンフラグメントと組換え型のタンパク質は前記免疫グロブリンから生じた（キメラでヒト化の免疫グロブリン、Ｆ（ａｂ’）およびＦ（ａｂ’）２フラグメント、単鎖の抗体、組換え型の可変部領域（Ｆｖ）、ｓ、融合タンパク質）で例えばある。それは若干のアミノ酸配列が構造またはタンパク質の機能に対する重要な効果なしでポリペプチドで多彩でありえる芸術でよく認識される。抗体の分子内転位において、主鎖領域の核のまたはアミノ酸シーケンスの変形は、通常、許容的でありえる。これらは含む、制限されるために、置換（保存的置換は好まれる）、削除または追加。さらにまた、本発明のＣＤＭＡＢで標準の化学療法（例えば放射性核種）を活用させることはこの発明の範囲の中でである。そして、それによって前記化学療法剤の使用を集中させる。ＣＤＭＡＢは毒素、細胞毒性部位、酵素（例えばビオチン複合酵素）または血液原細胞に抱合型でもありえる。そして、それによって抗体複合体を形成する。
【００２２】
『モノクローナル抗体を修正しているガン疾患のためにコードするハイブリドーマ細胞系を分離することの３５７の特許で教えられるにつれて、このアプリケーションは方法を産生性の患者の特異的な抗癌抗体のために利用する。これらの抗体は特に１つの腫瘍に作られることができて、このように癌治療の専用化を可能にすることができる。このアプリケーションの前後関係の範囲内で、細胞殺害（細胞障害能）か細胞増殖を（細胞分裂停止）性質を阻害させている抗癌抗体は、今後細胞障害能と称される。これらの抗体が癌の病期分類と診断の補助として使われることができて、腫瘍転移を処置するのに用いられることができる。
【００２３】
個別的抗癌性の処置の見込みは、患者が管理される方法の変化をもたらす。ありそうな臨床シナリオは、腫瘍試料が提示時に得られて、積み上がっているということである。この試料から、腫瘍は癌疾患修飾抗体より先に存在するパネルから型でありえる。患者は従来は、示される、しかし、利用できる抗体は更に患者を示す際に有用でありえる。患者は既存の抗体を用いたすぐ治療を受けることができるおよび／または、腫瘍に特有の抗体のパネルはこの中に概説される方法を用いてまたはこの中のスクリーニング法と同時のライブラリが開示したファージディスプレイを用いることにより生産されることができる。他の腫瘍が処置されているものと同じエピトープの一部を運ぶことができるという可能性がある時から、抗体が生成したＡＵは抗癌抗体のライブラリに加えられる。この方法によって生産される抗体は、これらの抗体と結合する癌があるどんな患者数ででもガン疾患を処置するために役立つ可能性がある。
【００２４】
実質的にＵＳ ６，１８０，３５７のプロセスを用いて、そして、Ｓ．Ｎ． １０／３４８，２３１で開示されるように、マウス・モノクローナル抗体７ＢＤ−３３−１１Ａは患者の乳房腫瘍生検から細胞でマウスの免疫化の後で得られた。７ＢＤ−３３−１アイソレーション増幅器抗原は、異なる組織起源から広範囲にわたるヒト細胞系の細胞表面の上で表された。乳癌細胞系ＭＣＦ−７と前立腺癌細胞系ＰＣ−３は、生体外で７ＢＤ−３３−１１Ａの細胞毒性に影響されやすかった。
【００２５】
胸部に対する７ＢＤ−３３−１１Ａ細胞毒性の結果と培養の前立腺癌細胞は、生体内に（Ｓ．Ｎ． １０／３４８，２３１とＳ．Ｎ． １０／６０３，００６で開示されるように）これらの癌徴候の方へその抗腫瘍活性によって更に延長された。Ｐｒｅ¬臨床異種移植腫瘍モデルは、治療有効性の有効な予言者と考えられる。
【００２６】
概説されて、Ｓ．Ｎ． １０／３４８，２８４とＳ．Ｎ． １０／６０３，００６で記載されるにつれて、７ＢＤ−３３−１アイソレーション増幅器はヒト乳癌の予防インビボのモデルで腫瘍成長と全身腫瘍組織量を予防した。モニタリングは、過去３００日後処理を続けた。７ＢＤ−３３−１アイソレーション増幅器は腫瘍を決して呈しなかった、そして、７ＢＤ−３３−１１Ａ投与群の８７．５パーセントは９ヵ月以上のポスト着床でまだ生存していた。逆に言えば、アイソタイプ対照群は、日７２（２３日後処理）までに、１００パーセントの死亡率を持った。従って、７ＢＤ−３３−１１Ａは生存を強化して、乳癌モデルで腫瘍成長（このように遅延疾患進行）を予防した。
【００２７】
また、概説されて、Ｓ．Ｎ． １０／３４８，２８４とＳ．Ｎ． １０／６０３，００６で記載されるにつれて、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器はヒト乳癌の確立したインビボのモデルで有意に腫瘍成長と減少した全身腫瘍組織量を抑制した。日８０（２３日ｐｏｓｔ−処置）までに、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器治療をうけているマウスは、アイソタイプ対照群（ｐ＝０．００１）に、割に８３パーセントの低い平均の腫瘍容積を持った。かなりの抗体有効性として生存を使用して、７ＢＤ−３３−１１Ａ投与群で死亡する危険が６０日後処理ごろアイソタイプ対照群（ｐ＝０．０００６）の約１６パーセントであると推定された。アイソタイプ対照群の１００パーセントは、５０日後処理によって死亡した。比較として、７ＢＤ−３３−１１Ａ投与群の６０パーセントは、１３０日後処理でまだ生存していた。このデータは、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置が制御処置群と比較して生存利点と還元型の全身腫瘍組織量を与えることを証明した。それが還元型の体重と臨床苦痛を含む毒性の少しの合図も誘導しなかったので、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置は安全に見えた。このように、それが腫瘍成長を遅延させて、ヒト乳癌のｗｅｌｌ−確立されたモデルで制御処置群と比較して生存を強化したので、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置は有効だった。
【００２８】
化学療法剤（シスプラチン）処置単独と比較したまたは組合せの７ＢＤ−３３−１１Ａの効果は、２つの異なる確立した乳癌異種移植モデルで決定された。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＢ−２３１）モデルにおいて、日６９（５日後療法）で、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置は、バッファ制御治療をうけている動物（ｐ＜０．００１）と関連して、腫瘍成長の７６パーセントの減少に帰着した。単独でシスプラチン処置または、７ＢＤ−３３−１と結合して、アイソレーション増幅器は制御（ｐ＜０．００１）と関連して、腫瘍サイズの７９と８６パーセントの減少に、それぞれ、帰着した。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＭＢ−４６８）のモデルにおいて、日５５（５日後療法）で単独で、そして、アイソレーション増幅器がそれぞれ腫瘍成長、９５パーセント（ｐ＝０．０２４）と９７パーセント（ｐ＝０．１７）で最も大きな減少に示した７ＢＤ−３３−１と結合するシスプラチン処置。日５５でも、バッファ制御に対する比較において、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置単独は、３７パーセント（ｐ＝０．３９５８）、腫瘍成長の減少を示した。ＭＢ−２３１ＭＢ−４６８モデルにおいて、体重で測定されるにつれて、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器による処置はシスプラチンで処置に割により大きな動物の幸福に導いた。これらの結果は、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置がＭＢ−２３１モデルで単独でシスプラチン処置に割により大きな有効性を持って、両方の乳癌モデルのシスプラチンより少しの副作用（例えば重量減少）でより忍容性が高かったことを示す。
【００２９】
さまざまな用量で７ＢＤ−３３−１１Ａ処置の有効な効果を決定するために、用量反応の実験は、予防乳癌異種移植モデルで実行された。日５５（５日後療法）で、０．２ｍｇ／ｋｇの投与群は、アイソタイプ制御処置群と関連して８５パーセント腫瘍成長を予防した。日５５でも、２つと２０ｍｇ／ｋｇの投与群は、まだ腫瘍を呈していなかった。類似の結果は日１２５（７５日後療法）過ぎに得られた。ここで、２０ｍｇ／ｋｇの投与群は腫瘍をまだ呈しなかった、そして、２ｍｇ／ｋｇの投与群は若干の最初の腫瘍成長を持った。７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器処置も、生存利点を示した。０．２ｍｇ／ｋｇの７ＢＤ−３３−１１Ａ投与群が日１９７（１４７日後療法）まで生存する間、アイソタイプ対照群のマウスのＡＵは日１０４（５４日後療法）までに死亡した。より大きな生存利点さえ、２．０と２０ｍｇ／ｋｇの７ＢＤ−３３−１１Ａ投与群で観察された；２０ｍｇ／ｋｇの投与群のいずれもまた、日２９０までに死亡しない間、２．０ｍｇ／ｋｇの投与群のわずか５０パーセントは日２９０（２４０日後療法）までに死亡した。従って、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置は重要な腫瘍成長減退を示して、最高の服用によって示されている有効性で最も大きな程度で、全３つの用量で生存を増加させた。
【００３０】
乳癌の確立したインビボの腫瘍モデルの薬効に加えて、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置も、予防インビボの前立腺癌モデル（Ｓ．Ｎ． １０／６０３，００６で概説される）で、ＰＣ−３細胞に対して抗腫瘍活性を持った。７ＢＤ−３３−１１Ａ処置は、アイソタイプ制御抗体より、治療期間の直後に腫瘍成長を抑制することに有意に効果的だった（ｐ＝０．００１）。処置相終了後、７ＢＤ−３３−１１Ａを与えられるマウスは、アイソタイプ対照群のわずか３１パーセントに増大した腫瘍が認められた。ＰＣ−３ ＳＣＩＤ異種移植モデルのために、体重が疾患進行の代わりの指標として使われることができる。日５２に、有意に７ＢＤ−３３−１１Ａ処置（ｐ＝０．００２）は、アイソタイプ制御に割に５４パーセント体重の損失を予防した。マウスは、生存後処理をモニターされた。１１日後処理で、アイソタイプとバッファ制御マウスは、１００パーセントの死亡率に達した。逆に言えば、対照群より３回長く、７ＢＤ−３３−１１Ａは日３８後処理で１００パーセントの死亡率に達した。このように、それがヒト前立腺癌の安定したモデルでアイソタイプ制御処置群と比較して両方とも腫瘍成長、予防された体重損失と拡張した生存を遅延させたので、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器処置は有効だった。
【００３１】
前立腺癌の予防的インビボの腫瘍モデルに加えて、７ＢＤ−３３−１アイソレーション増幅器は、確立したインビボの腫瘍モデル（Ｓ．Ｎ． １０／６０３，００６で概説される）で、ＰＣ−３細胞に対して抗腫瘍活性を示した。７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器による処置は、再びアイソタイプ制御と比較してあった。７ＢＤ−３３−１１Ａ投与群が処置の後でアイソタイプ制御処置群と比較して有意により少ない平均の腫瘍容積をすぐ持つ（ｐ＜０．０２４）ことを示された。７ＢＤ−３３−１１Ａ処置は、アイソタイプ対照群と比較して３６パーセント腫瘍抑制の媒介となった。７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器の抗腫瘍活性は、いくつかの異なる癌モデルで、それを魅力的な抗癌性の治療薬とする。
【００３２】
薬目標として７ＢＤ−３３−１１Ａエピトープを確認するために、正常な人体組織の７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原の表現度は、以前決定された（Ｓ．Ｎ． １０／６０３，００６）。本研究は、商業的に入手可能な抗ＣＤ６３抗体（ＲＦ ＡＣ４とＨ５Ｃ６）と比べると広げられた。組織染色からの結果は、７ＢＤ−３３−１１Ａが再びさまざまな細胞型に制限された結合を見せるが、マクロファージ、リンパ球と線維芽細胞を浸透させることに結合を持つことを示した。ＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ６抗体は、割に各々に類似の染色パターンを見せた。しかしながら、ＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ６の染色パターンは７ＢＤ−３３−１１Ａで観察されてそれとは全く異なった。具体的には、ＲＰＡＣ４とＨ５Ｃ６抗体は正常組織のより幅広い範囲と結合して、通常、７ＢＤ−３３−１１Ａが陽性でもあった組織で強度にしみをつけている高等を持って、マクロファージ、リンパ球と線維芽細胞を浸透させることにだけでなく組織で大多数の上皮にも結合した。
【００３３】
７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原で、集団（乳癌患者の間のたとえば〜など）の範囲内のその有病率が７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器の治療的な使用を評価して、効果的臨床試験を設計する際に重要であると決定している限局化。癌患者から乳房腫瘍の７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原表現について述べるために、５０人の個々の乳癌患者からの腫瘍組織試料は、以前７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原（Ｓ．Ｎ． １０／６０３，００６）の表現度のために映写された。現在の仕事は、Ｈｅｒ２抗体（ｃ−ｅｒｂＢ−２）をＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ６に、そして、ａｎｔｉ−に７ＢＤ−３３−１１Ａに染色することを比較した。本研究の成績は、前の結果と類似していて、９４と８５パーセントの胸部腫瘍組織はそれぞれＨ５Ｃ６とＲＦＡＣ４エピトープが陽性の間、３６パーセントの腫瘍組織試料が７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器抗原のために良い面を染色したことを示した。染色が悪性細胞に制限されたので、患者試料の範囲内の７ＢＤ−３３−１１Ａの表示は癌細胞に特有に見えた。加えて、Ｈ５Ｃ６とＲＦＡＣ４が正常な胸部組織の８つの試料のうちの７つにしみをつける間、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器は乳癌患者から正常組織の１０の試料のうちの０にしみをつけた。７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器抗原の乳房腫瘍表現度は悪性細胞の細胞膜と細胞質に局所化されるように見えた。そして、ＣＤ６３を治療の魅力的な目標とした。７ＢＤ−３３−１１Ａ表現はホルモン類エストロゲンとプロゲステロンのためにレセプターの乳房腫瘍表示に基づいて更に評価された。そして、それは乳房腫瘍の発現、治療と予後において重要な役割を果たす。エストロゲンまたはプロゲステロン受容体発現間のわずかな相互関係と７ＢＤ−３３−１１Ａの表示があった；受容体発現による組織は、わずかにより高い７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器表現をした。腫瘍がそれらの段階または癌が進んだ程度に基づいて分析されたとき、結果が７ＢＤ−３３−１１Ａのために高等腫瘍の病期でより大きな陽性の表現に向かう傾向を暗示して。Ｓｉｍｉｌａｒ結果は、ＲＦＡＣ４で得られた。Ｈ５Ｃ６もエストロゲンまたはプロゲステロン受容体発現で非常にわずかな相互関係を示した、しかし、見た目の相互関係が腫瘍の病期でなかった。しかしながら、全３つの抗体のために、結果は小さいサンプルサイズによって制限された。ｃ−ｅｒｂＢ−２に対する比較において、７ＢＤ−３３−１１Ａは７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器抗原が陽性だった乳房腫瘍組織標本の半分が乳癌患者のこれまでに会ったことのない目標とされた治療的な必要を示しているＨｅｒ２表現が陰性だった完全に異なる染色側面を示した。染色の強度の違いが、７ＢＤ−３３−１１ＡとＨｅｒ２が陽性だった乳房腫瘍組織切片の間にもあった。ｃ−ｅｒｂＢ−２抗体も、明らかに通常の胸部組織断片のうちの１つを染色した。
【００３４】
７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器抗原と前立腺の癌患者の範囲内のその有病率の限局化は、前立腺癌患者に７ＢＤ−３３−１１Ａ免疫療法の有益性を評価して、効果的臨床試験を設計する際に重要である。癌患者から前立腺腫瘍の７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原表現について述べるために、５１人の個々の前立腺の癌患者からの腫瘍組織試料は、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原の表現度のために映写された。本研究の成績は、８８パーセントの組織標本が７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原のために良い面を染色することを示した。７ＢＤ−３３−１１Ａが同様に通常の組織切片を高輝度でけがしたにもかかわらず、膜状の染色の高等程度が割に正常な試料に腫瘍組織試料にあった。７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原のために染色されなかった１つの胚性のｒｈａｂｄｏｍｙｏｓａｒｃｒｏｍａ組織標本が、あった。また、腫瘍の病期と７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原の存在間の直接的な相互関係でなく見えた。しかしながら、結果は小さいサンプルサイズによって制限された。
【００３５】
更に７ＢＤ−３３−１１Ａの潜在的治療的な利点を延長するために、さまざまなヒト癌組織の範囲内の抗原の頻度と限局化は、以前決定されもした（Ｓ．Ｎ． １０／６０３，００６）。いくつかの癌タイプは、胸部と前立腺癌に加えて、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原を表した。陽性のヒト癌タイプは、皮膚（１／２）、肺（３／４）、肝臓（２／３）、胃（４／５）、甲状腺（２／２）、子宮（４／４）と腎臓（３／３）を含んだ。若干の癌は、抗原を表さなかった；これらの含まれた卵巣（０／３）、精巣（０／１）、脳（０／２）とリンパ節（０／２）。ヒト胸部と前立腺の癌組織と同様に、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器の限局化は、膜の上で、そして、これらの腫瘍細胞の細胞質の範囲内で起こった。それで、生体外で癌細胞系と結合している７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器抗体に加えて、抗原がヒトで、そして、癌のかさ形の上で表されるという証拠が、ある。
【００３６】
この中に概説されるように、付加的な生化学データも７ＢＤ−３３−１１Ａによって認められる抗原がＣＤ６３であることを示す。これは、２つのモノクローナル抗体（ＲＪＦ ＡＣ４とＨ５Ｃ６）（ＣＤ６３に対して反応性）が免疫沈降によって７ＢＤ−３３−１１Ａと結合したタンパク質を特定することを示している研究で支えられる。加えて、更なる細菌表現研究は、ＣＤ６３の細胞外ループ２行きのその７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器を解明した。７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器エピトープも、従属する立体配座であることによって特徴づけられた。これらのＩＨＣと生化学結果は、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器がＣＤ６３抗原と結合することを証明する。このように、証拠の優越性は７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器がＣＤ６３の上で出席しているユニークな高次構造上のエピトープの結合を通して抗癌性の効果の媒介となることを示す。この発明の目的で、前記エピトープは、ハイブリドーマ細胞系７ＢＤ−３３−１１Ａによってコードされるモノクローナル抗体と結合するその能力、それの抗原性の結合フラグメントまたはそれの抗体複合体ｓによって特徴づけられる「ＣＤ６３抗原性部位」として定義される。
【００３７】
全体として、このデータは、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原が癌関連する抗原であって、ヒトで表されて、病理学的に関連した癌目標であることを証明する。更に、このデータも７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体の結合をヒト癌組織に示して、診断でありえる分析のために適切に使われることがありえるか、治療を予示することがありえるか、予後でありえる。加えて、この抗原の細胞膜限局化は大部分の非悪性の細胞で抗原の表現度の不足による細胞の癌状態を表す、そして、この診察によってこの抗原、その遺伝子または誘導剤、そのタンパク質またはその異型の使用が診断でありえる分析のために使われるか、治療を予示するか、予後のことができる。
【００３８】
本発明は７ＢＤ−３３−１１Ａの発現と使用を記載する。そして、特許ＵＳ ６，１８０，３５７で記載されて、同一化される過程までに開発される。そして、細胞障害性の分析で、動物モデルの非確立して確立した腫瘍成長の、そして、それらの延長している生存期間のその効果がガン疾患を患う。それが、初めて、標的分子（ＣＤ６３）の上で特に出席しているエピトープと結合して、とてもまた、悪性腫瘍細胞に対して正常細胞でなく生体外細胞障害性の性質を持つ、そして、また、ヒト癌のインビボのモデルで直接腫瘍成長の抑制と生存の強化の媒介となる試薬を記載するという点で、この発明は前進を癌治療の場所において代表する。誰も類似の性質があることが示されなかった時から、これは他のいかなる前述した抗ＣＤ６３抗体にも関する前進である。それが明らかにデモをする時から、それも前進をフィールドに示す、そして、初めて、イベントのＣＤ６３の直接の参加は腫瘍の特定の種類の生育と関連した。それには可能性がある時から、それも前進を癌治療において代表する。そして、ヒト患者で類似の抗癌性の性質を示す。追加貸付は抗癌抗体のライブラリの中のこの抗体の包含が異なる抗癌抗体の適切なコンビネーションの決定によって異なる抗原マーカーを表しているターゲッティング腫瘍の可能性を強化するということである。そして、腫瘍の生育がターゲッティングと抑制性に最も効果的であるとわかる。
【００３９】
全部で、この発明は、治療薬の目標として、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器抗原の使用を教え、その投与される、哺乳類で抗原を表している癌の全身腫瘍組織量を減らすことができて、そして、治療をうけている哺乳類の生存延長に導くこともできる。この発明もＣＤＭＡＢ（７ＢＤ−３３−１１Ａ）とその派生語の用法とそれの抗原結合フラグメントを教える。そして、哺乳類で抗原を表している癌の全身腫瘍組織量を減らして、この抗原を表す腫瘍を運んでいる哺乳類の生存を延長するためにその抗原を目標とする。さらにまた、この発明も、診断に役立つことがありえる癌細胞で７ＢＤ−３３−ＨＡ抗原を見つける効果、治療の予測とこの抗原を表す腫瘍を運んでいる哺乳類の予後を教える。
【００４０】
患者が治療の最初のコースに不応性の、または、転移が発達する場合、腫瘍に対する創成特異抗体のプロセスは再治療のために繰り返されることができる。さらにまた、抗癌抗体はその患者または互換性を持つ提供者から得られる赤血球に抱合型でありえて、転移の処置のために再注入した。転移癌のほとんど効果的治療がなかった、そして、転移は通常、死に帰着している転帰不良を予告する。しかしながら、転移癌は通常かなり血管化である、そして、赤血球による抗癌抗体の送達には腫瘍の部位で抗体に集中する効果があることができる。転移の前にさえ、大部分の癌細胞はそれらの生存のために宿主の血液供給に依存している、そして、赤血球に活用する抗癌抗体は同様に元の位置の腫瘍に対して効果的でありえる。あるいは、抗体は他の血液原細胞、例えばリンパ球、マクロファージ、単球、ナチュラルキラー細胞、その他に抱合型である可能性がある。そして、Ｔｈｅｒｅは抗体の５つのクラスである、そして、各々はそのＨ鎖によって与えられる機能と関係している。裸の抗体による癌細胞殺害が抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞障害作用（ＣＤＣ）を通して媒介となられると通常、思われる。例えば、ネズミの免疫グロブリンＭとＩｇＧ２ａ抗体は、それによって、腫瘍細胞溶解に導くことができる補体活性化の古典経路を起動させている補体系のＣＩ構成要素を結合することによって、ヒト補体を起動させることができる。ヒト抗体のために、最も効果的補体活性化抗体は、通常、免疫グロブリンＭとＩｇＧｌである。ＩｇＧ２ａとＩｇＧ３アイソタイプのマウス抗体は、単球、マクロファージ、顆粒球と特定のリンパ球によって細胞殺害に導くＦｃレセプタを持っている細胞傷害性細胞を補充することで効果的である。ＩｇＧｌとＩｇＧ３アイソタイプのヒト抗体は、ＡＤＣＣの媒介となる。
【００４１】
抗体によって媒介される癌殺害のもう一つの可能な機構が、細胞膜とその関連する糖蛋白または糖脂質で（いわゆる触媒抗体）さまざまな化学結合の加水分解に触媒作用を及ぼすために機能する抗体を用いることによりある可能性がある。
【００４２】
抗体によって媒介される癌細胞殺害のさらに２つの機構がある。そして、それはより広く受け入れられる。第一は、癌細胞にある推定上の抗原に対して免疫応答をもたらすために体を誘導するワクチンとしての抗体の使用である。その機能が効果的に失われるように、第２は成長レセプターを目標として、それらの機能に干渉するか、減少してそのレセプターを調整する抗体の使用である。
【００４３】
制癌剤の臨床有用性は、患者に許容リスク側面の下で本剤の有益性に基づく。癌治療において、生存は通常、利点の後で最も捜された、しかしながら、多数の他のｗｅｌｌ−認識された利点が生命を延長することに加えてある。これらの他の利点（処置が生存に悪影響を与えないところ）は、症状寛解、有害事象からの保護、再発または疾患のない生存に時間内の延長と進行に時間内の延長を含む。これらの判定基準は通常、受け入れられる、そして、アメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）のような調節性体はこれらの利点（１３７−１４３、小ハーシェフェルドは、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ／Ｈｅｍａｔｏｌｇｙ ４２のああという声Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓである：２００２）を発生する薬を承認する。これらの判定基準に加えて、この種の利点の前兆となる可能性がある他の終末点があるとよく認められる。一つには、アメリカ食品医薬局によって承諾される促進的な承認プロセスは、患者利点をたぶん予測する代用物があると承認する。会計年度末の（２００３）より、このプロセス中で承認される１６の薬があった、そして、これらの、４は完全な承認（すなわち研究が代わりの終末点によって予測されて直接の患者利点を示した追跡調査）に移った。固形腫瘍で薬効を決定するための１つの重要な終末点は処置に対する測定反応による全身腫瘍組織量の評価である（Ｔｈｅｒａｓｓｅその他は、国立癌研究所９２（３）ジャーナルである：２０５−２１６ ２０００）．そのような評価のための臨床判定基準（ＲＥＣＩＳＴ判定基準）は、充実性腫瘍研究グループ（癌の一団の国際的な専門家）で、応答評価基準によって広められた。全身腫瘍組織量に対する示された効果による薬は、最終的に、群が傾向がある適切な制御に対する比較で、ＲＥＣＩＳＴ判定基準に従う客観的な反応で示すように、直接の患者利点を発生する。全身腫瘍組織量が通常、より直接に評価することになっている症状発現前設定と文書で。前臨床試験が臨床設定に解釈されることができるという点で、前臨床モデルで生存延長をもたらす薬には最大の予想された臨床ユーティリティがある。臨床治療に産生性の肯定応答に類似して、症状発現前設定で全身腫瘍組織量を減らす薬は疾患に重要な直接的な影響を及ぼす可能性もある。生存の延長が制癌剤治療から臨床転帰の後、最も求められる、臨床有用性を持つ他の利点があって、そして、全身腫瘍組織量減少（それは疾患進行の遅れに相関する可能性がある）が生存または両方とも延長したことは明らかである、直接の利点に導くこともできて、そして、臨床影響を持つこともできる（Ｅｃｋｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ： Ｓｕｃｃｅｓｓｅｓ ａｎｄ Ｆａｉｌｕｒｅｓ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌ Ｄｅｓｉｇｎｓ ｏｆ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ； ＡＳＣＯ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｂｏｏｋ， ３９ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ， ２００３， ｐａｇｅｓ ２０９−２１９）。
【００４４】
したがって、ハイブリドーマ細胞系と対応の単離モノクローナル抗体を分離しなさいという命令とそれについて前記ハイブリドーマ細胞系がコードされる抗原結合フラグメントで、同時に非癌細胞に比較的無毒性間、癌細胞に関して細胞毒性である特定の個人に由来する細胞から方法を産生性の癌疾患修飾抗体のために利用することは、本発明の目的である。
【００４５】
それのＣＤＭＡＢと抗原結合フラグメントを教えることは、本発明のさらなる目的である。細胞毒性がＡＤＣＣを通して媒介となられるＣＤＭＡＢを発生することは、本発明の更なる目的である。
【００４６】
細胞毒性がＣＤＣを通して媒介となられるＣＤＭＡＢを発生することは、まだ本発明の更なる目的である。細胞毒性が細胞化学結合の加水分解に触媒作用を及ぼすそれらの能力の機能であるＣＤＭＡＢを発生することは、まだ本発明の更なる目的である。
【００４７】
本発明のなお更なる目的は、診断、予後と癌のモニタリングのために結合アッセイに役立つＣＤＭＡＢを発生することである。
【００４８】
図と例（この発明の実施形態が述べられることを確信している）のために、この発明の他の目的と長所は、そこで以下の説明から明らかになる。
【００４９】
（図面の簡単な説明）
特許または帯出者登録簿は色で仕上げられる少なくとも１つの図面を含有する。この特許のコピーまたはカラー図面（ｓ）による特許出願刊行は、要請と必要な料金の支払いに応じて局によって提供される。
図１は、ＭＤＡ−ＭＢ−まる２３１細胞可溶化物（レーン１）または膜（レーン２と３）のウエスタンブロットは、７ＢＤ−３３−１１Ａ（パネルＡ）またはアイソタイプ対照（パネルＢ）と深く探った。分子量マーカーは、左で示される。
図２は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜のウエスタンブロットは、７ＢＤ−３３−ＨＡで深く探った。レーン１：還元性の状況の下で動く膜。レーン２：膜は、非還元の状況の下で動作する。分子量マーカーは、左で示される。
図３は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜に対する７ＢＤ−３３−１１Ａの結合の脱グリコシルの効果。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜は、ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄａｓｔ Ｆで処置を受けた（ＰＮＡＧアーゼ；レーン１）、Ｏ−グリカナーゼ（レーン２）、シアリダーゼ（レーン３）、ＰＮＡＧアーゼ、Ｏ−グリカナーゼとシアリダーゼ（レーン４）の組合せ、ＰＮＡＧアーゼ、Ｏ−グリカナーゼ、シアリダーゼ、ガラクトシダーゼとグルコサミニダーゼ（レーン５）の組合せまたはバッファ制御（レーン６）。分子量マーカーは、左で示される。
図４は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（パネルＡ）、そして、膜タンパク質が７ＢＤ−３３−１１Ａで免疫沈降したＭＤＡ−ＭＢ−２３１のウエスタンブロット（パネルＢ）。レーンＡアイソタイプ制御免疫沈殿タンパク質（レーンＢ）：７ＢＤ−３３−１１Ａは、タンパク質とレーンＴＭを免疫沈降した：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜タンパク質となりなさい。角箱は、ウエスタンブロットでＳＤＳ−ＰＡＧＥとレーンＴＭでレーンＢから同じ帯域を概説する。分子量マーカーは、左で示される。
図５は、サーチ・サマリー・テーブル。
図６は、ＭＡＳＣＯＴサーチ・サマリー・テーブル。
図７ａは、タンパク質のウエスタンブロットは、７ＢＤ−３３−１１Ａ（パネルＡ）、抗ＣＤ６３（ＲＦＡＣ４のクローン作成、パネルＢ）、ＩｇＧ２ａアイソタイプ制御（パネルＣ）とＩｇＧｌアイソタイプ対照（パネルＤ）と深く探った。レーンＡ：全ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜タンパク質；レーンＢ：７ＢＤ−３３−１１Ａは、タンパク質を免疫沈降した；レーンＣ：抗ＣＤ６３（ＲＦＡＣ４）は、タンパク質（レーンＤ）を免疫沈降した：ＩｇＧ２ａアイソタイプ制御免疫沈殿タンパク質とレーンＥ：ＩｇＧｌアイソタイプ制御は、タンパク質を免疫沈降した。分子量マーカーは、左で示される。
図７ｂは、タンパク質のウエスタンブロットは、７ＢＤ−３３−１１Ａ（パネルＡ）、抗ＣＤ６３（Ｈ５Ｃ６のクローンを作成、パネル Ｂ）、ＩｇＧ２ａアイソタイプ制御（パネルＣ）とＩｇＧｌアイソタイプ対照（パネルＤ）と深く探った。レーンＡ：全ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜タンパク質；レーンＢ：７ＢＤ−３３−１１Ａは、タンパク質を免疫沈降した；レーンＣ：抗ＣＤ６３（Ｈ５Ｃ６）は、タンパク質（レーンＤ）を免疫沈降した：ＩｇＧ２ａアイソタイプ制御免疫沈殿タンパク質とレーンＥ：ＩｇＧｌアイソタイプ制御は、タンパク質を免疫沈降した。分子量マーカーは、左で示される。
図８は、タンパク質のウエスタンブロットは、７ＢＤ−３３−１１Ａ（パネルＡ）、抗ＣＤ６３（ＲＦＡＣ４のクローンを作成、パネル Ｂ）、抗ＣＤ６３（Ｈ５Ｃ６のクローンを作成、パネル Ｃ）、ＩｇＧ２ａアイソタイプ制御（パネルＤ）とＩｇＧｌアイソタイプ対照（パネルＥ）と深く探った。レーン１−５は、７ＢＤ−３３−１１Ａ免疫沈殿タンパク質とレインズ６−１０がＩｇＧ２ａアイソタイプ制御免疫沈殿タンパク質を含むことを含む。レーン１と６：ＮａＣｌでない、レインズ２と７：１５０ｎｉＭ ＮａＣｌ、レインズ３と８：５００ｍＭのＮａＣｌ、レインズ４と９：２０００ｍＭのＮａＣｌとレインズ５と１０：ＲＩＰＡバッファ。
図９は、タンパク質のウエスタンブロットは、７ＢＤ−３３−１１Ａ（パネルＡ）、抗ＣＤ６３（ＲＦＡＣ４のクローンを作成、パネル Ｂ）、抗ＣＤ６３（Ｈ５Ｃ６のクローンを作成、パネル Ｃ）、ＩｇＧ２ａアイソタイプ制御（パネルＤ）とクーマシーＣｏｌｌｏｉｄａｌ Ｂｌｕｅタンパク質染色液（パネルＥ）で深く探った。レーン１：非によって誘発されたベクター（レーン２）単独：非によって誘発された一般システムズ理論−ＥＣｌ（レーン３）：非−は、一般システムズ理論−ＥＣ２（レーン４）を誘発した：誘発されたベクター（レーン５）単独：誘発された一般システムズ理論−ＥＣｌとレーン６：誘発された一般システムズ理論−ＥＣ２。分子量マーカーは、左で示される。
図１０は、７ＢＤ−３３−１１Ａ、アイソタイプ対照と抗ＥＧＦＲの代表的なＦＡＣＳヒストグラムは、いくつかの癌細胞系と非癌細胞に対して指示した。
図１１は、正常な人体組織配列から大腸の組織部分の上で７ＢＤ−３３−１１Ａ（Ａ）、アイソタイプ負の制御（Ｂ）、抗ＣＤ６３（ＲＦ ＡＣ４）抗体または抗ＣＤ６３（Ｈ５Ｃ６）抗体（Ｄ）で得られる製本見本を示している代表的な顕微鏡写真器。７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器、ＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ６は、粘膜固有層でマクロファージとリンパ球のためにポジティブ染色法を示した。ＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ６も、粘膜のｅｐｉｔｈｅｌｉｅｕｍのために強い染色を示した。拡大は、２００Ｘである。
図１２は、ヒト乳癌組織配列から浸潤性の腺管癌の組織部分の上で７ＢＤ−３３−１１Ａ（Ａ）、アイソタイプ負の制御（Ｂ）、抗ＣＤ６３（ＲＦＡＣ４）抗体または抗ＣＤ６３（Ｈ５Ｃ６）抗体（Ｄ）で得られる製本見本を示している代表的な顕微鏡写真器。７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器は、ＲＦＡＣ４かＨ５Ｃ６抗体に割に腫瘍細胞のためにより弱いポジティブ染色法を示した。拡大は、２００Ｘである。
図１３は、ヒト乳癌組織配列から浸潤性の腺管癌の組織部分の上で７ＢＤ−３３−１１Ａ（Ａ）または抗Ｈｅｒ２（ｃ−ｅｒｂＢ−２）抗体（Ｂ）で得られる製本見本を示している代表的な顕微鏡写真器。７ＢＤ−３３−１アイソレーション増幅器は、ａｎｔｉ−に割に腫瘍細胞のためにネガティブ染色を示したＨｅｒ２抗体を染色している強い良い面を示した。拡大は、２００Ｘである。
図１４は、ヒトの前立腺癌組織配列から前立腺アデニカルシノーマ （Ａ）または通常の前立腺（Ｂ）の組織部分の上で７ＢＤ−３３−１１Ａで得られる製本見本を示している代表的な顕微鏡写真器。７ＢＤ−３３−１１Ａは、腺癌組織切片で腫瘍細胞のために強い陽性の膜状の染色を示した。７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器は、通常の前立腺の組織切片で腺上皮の膜状で細胞質の染色を示した。拡大は、２００Ｘである。
図１５は、７ＢＤ−３３−１１Ａの効果または用量反応の予防ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌モデルの腫瘍成長に関するアイソタイプ制御。破線は、抗体が投与された期間を示す。データ点は、平均の＋／−ＳＥＭを表す。
図１６は、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器による腫瘍を含んだマウス後処理または用量反応の予防的ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植検査のアイソタイプ制御抗体の残存。
図１７は、確立したＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌モデルの腫瘍成長に関する７ＢＤ−３３−１１Ａ、シスプラチン、７ＢＤ−３３−１１Ａ ＋ シスプラチンまたはバッファ制御の効果。破線は、抗体が投与された期間を示す。データ点は、平均の＋／−ＳＥＭを表す。
図１８は、確立したＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌モデルの体重の７ＢＤ−３３−１１Ａ、シスプラチン、７ＢＤ−３３−１１Ａ ＋ シスプラチンまたはバッファ制御の効果。
図１９は、確立したＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌モデルの腫瘍成長に関する７ＢＤ−３３−１１Ａ、シスプラチン、７ＢＤ−３３−１１Ａ ＋ シスプラチンまたはバッファ制御の効果。破線は、抗体／シスプラチンが投与された期間を示す。データ点は、平均の＋／−ＳＥＭを表す。
図２０は、確立したＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌モデルの体重の７ＢＤ−３３−１１Ａ、シスプラチン、７ＢＤ−３３−１１Ａ ＋ シスプラチンまたはバッファ制御の効果。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５０】
実施例１
ウエスタン免疫ブロット法による結合タンパク質の同定
抗体７ＢＤ−３３−１のアイソレーション増幅器によって認められる抗原（ｓ）を特定するために、細胞膜標本はドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に従属して、膜に移った。後者は、タンパク質がこの抗体によって見つけられるのを視覚化するために、抗体７ＢＤ−３３−１のアイソレーション増幅器で探索された。
【００５１】
１．全細胞可溶化物および全膜画分調製
１．１．全細胞可溶化物
ＦＡＣＳによる全部のＣｅｌｌ Ｌｙｓａｔｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｐｒｅｖｉｏｕｓ業績は、抗体７ＢＤ−３３−１１のＡの結合を乳癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＢ−２３１）に示した。その結果、この細胞系から得られる完全細胞膜標本と細胞全体の溶解産物が、抗原識別と特徴描写のために使われた。ＭＢ−からの全細胞可溶化物は、２３１セル、以下の通りに準備された：ペレット（１．５ｇ）がそうであったＭＢ−２３１のセルは２０ｍＭのトリス（ｐＨ ７．４）を含んでいる細胞溶解バッファを２ｍＬで再懸濁した。そして、１５０ｍＭはＮａＣｌ、１％（ｖ／ｖ）のトリトンＸ−１００、０．０２％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウム、２ｍＭのナトリウム・オルト・バナジン酸塩、５０ｍＭフッ化ナトリウムである、そして、プロテアーゼ阻害薬カクテル‖（ロシュＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ；マンハイム（ドイツ））。ペレットはガラス・ホモジナイザーで均質にされて、動くことで暖められた、なぜならば、４°Ｃ．サンプルズの１時間はそれから４°Ｃで１５分の間遠沈殿法（２０，００Ｏｇ）を受けた。そして、洗剤不溶性物質を除去した。上清は集められた、部分標本で分割された、そして、凍る−８０℃。細胞可溶化物のタンパク質濃度はベンゼンヘキサカルボン酸（双シンコニン酸酸）分析で測定された（ピアス；ロックフォード（ＩＬ）。）。
【００５２】
１．２．全細胞膜全膜画分調製
全細胞膜は、ＭＢ−２３１乳癌細胞の融合性培養組織から準備された。媒体は細胞スタックから除去された、そして、細胞はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗われた。細胞は、解離バッファで分離された（ギブコ−ＢＲＬ；グランドアイランド（ＮＹ））プラットフォーム振盪機の３７°Ｃの２０分の間。細胞は採取されて、遠心分離後、細胞ペレットがＰＢＳを中で再懸濁して洗われた４°Ｃ．の１０分の間の９０ＯｇとＰｅｌｌｅｔｓがそれから貯蔵型だった４°Ｃ．で１０分の間９０Ｏｇで再び遠心することで遠心した−必須のものまで８０℃。膜を準備するために、細胞ペレットは解凍されて、５０ｍＬの完全なプロテアーゼ阻害薬カクテルにつき１つの錠剤を含んでいる均質化バッファで再懸濁された（ロシュ；ラヴァルＱＣ）細胞のグラムにつき３ｍＬのバッファの比率で。細胞懸濁液は、細胞を溶解するために氷の上でポリ公共の秤ホモジナイザーを使用している均質化に従属した。細胞ホモジネートを１５，００Ｏｇで核微粒子を除去する４°Ｃの１０分時間遠心分離した。上清は収穫されて、管に分けられて、それから４℃で９０分の間７５，６０Ｏｇで遠心された。上清は慎重に除去された、そして、各々の膜ペレットは約５ｍＬの均質化バッファで再懸濁された。全ての管からの膜ペレットは化合して、もう１回分けられて、上清ｔが除かれて慎重にあった４°Ｃ．で９０分の間７５，６０Ｏｇで遠心された、そして、ペレットは量られた。１％のトリトンＸ−１００を含んでいる可溶化バッファは、膜ペレットのグラムにつき、３ｍＬのバッファの比率で、ペレットに加えられた。氷の１時間の間、膜は３００ｒｐｍでプラットフォーム振盪機で振盪によって可溶化された。膜懸濁液をペレット不溶性物質に対する７５，６０Ｏｇで遠心分離した。上清は、可溶化された膜タンパク質を含んで、管（タンパク質濃度のために検定される）から、慎重に除去された、そして、貯蔵型の−８０℃。
【００５３】
２．１次元のＳＤＳ−ＰＡＧＥとウエスタン免疫ブロット法
それぞれ、５と１０パーセントのスタッキングと分離ゲルの上で、完全膜画分からのタンパク質とＭＢ−２３１細胞の細胞全体の溶解産物は１次元のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＩＤ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって切り離された。タンパク質は、ＰＶＤＦ膜上にエレクトロブロッティングによって終夜、４°Ｃで、移された（ミリポア；ビルリカ（ＭＡ））。完全な転送は膜上へ前染色分子量マーカーの転送を評価することによって定量した。転写後、室温（ＲＴ）の１時間の間、膜はＴＢＳＴの５パーセント（ｗ／ｖ）の脱脂乳によるブロック状態のであった、そして、２つの反復された汚点はそれから以下の通りに探索された：１つの汚点は抗体７ＢＤ−３３−１１Ａ（５つのμｇ／ｍｌ（ＴＢＳＴの５パーセントの脱脂乳の））で探索された、そして、反復された汚点はＩｇＧ２３アイソタイプ対照（５つのμｇ／ｍｌ（ＴＢＳＴの５パーセントの脱脂乳の））と探索された。汚点はＴＢＳＴで１０分の間３回洗われて、それから、西洋わさびＨＲＰ抱合型のヤギ抗マウス免疫グロブリンＧ（結晶化可能フラグメント）で孵化した（バイオラドＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；ヘラクレス（ＣＡ））、ＲＴの１時間の間。ＴＢＳＴによるそれぞれ１０分の間３回を洗った後に、汚点はＴＭＢペルオキシダーゼ基質キットで呈された（ベクターＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；バーリンゲーム（ＣＡ））製造業者の指示に従うこと。汚点は、水できれいにされた、そして、画像はゲル・ドキュメンテーションシステム（図１と２）で後天性だった‖（バイオラド；ヘラクレス（ＣＡ））。汚点は、カメラ焦点、開口と画像獲得時間の同じ条件の下で像を造られた。図１において、７ＢＤ−３３−１アイソレーション増幅器は２０−８０ｋＤａの範囲で明らかにタンパク質と結合した、そして、その反応性は細胞全体の溶解産物と完全膜画分を含んでいるレーンで発見されていた。アイソタイプ制御はＭＢ−２３１溶解産物または膜画分で少しのタンパク質もと結合しなかった。そして、７ＢＤ−３３−１１Ａのための結合がはっきりしていたことを示した。ウエスタンブロットで、図２は７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器結合の上で、縮分の効果を示した。試料が非還元の状況（レーン２）の下で準備されたとき、この抗体の反応性は発見されているだけだった。ＤＴＴまたはβ−メルカプトエタノールのような還元剤は完全に結合（レーン１）を除去した。そして、天然蛋白のそのエピトープに対する７ＢＤ−３３−１１Ａの認識と結合がジスルフィド結合の存在次第であったことを示した。
【００５４】
決定する、分散したものは抗原の自然である、ウエスタン免疫ブロット法によって見つけられるにつれて、与えられべきものが異質な糖化にあって、完全膜画分は特異的な炭水化物群を取り出したいくつかのグリコシダーゼ（グリコペプチダーゼＦ、オルト・グリカナーゼ、シアリダーゼ、ガラクトシダーゼとグルコサミニダーゼ）で処置を受けた。処置の後、試料はＩＤ ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウエスタンブロット法に従属した。酵素の一部が一部の炭水化物を除去する場合、それが抗体７ＢＤ−３３−１１Ａによって認められる抗原（ｓ）の質量の有意な量を占めたことが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってその違いを見つけることが可能であることが、期待されるであった。図中図３は、認められた抗原（ｓ）のＭＢ−２３１細胞からの完全膜画分のグリコシダーゼ処置が質量の重要な減少に帰着したことをである。これは、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体によって認められる抗原が少なくとも１つの糖蛋白から成ることを示した。いくつかの酵素が一緒に使われたとき、抗原（ｓ）の可動性の重要な変動が起こるだけだった事実は、炭化水素部分の少なくとも一部が合成のＮにリンクされた炭水化物から成ることを示した。グリコシダーゼによる膜の処理が分子量シフトに帰着したにもかかわらず、それは結合の強度を減らさなかった。これは、抗体が主に糖蛋白のポリペプチド部分と結合することを示唆した。
【００５５】
実施例２
７ＢＤ−３３−１１Ａによる抗原結合の同定
１．ＭＢ−２３１完全膜画分からの抗原の免疫沈降
全膜抽出物（５ｍｇの総タンパク質量）は適当なＩｘ細胞溶解バッファ（５０ｍＭのトリスｐＨ ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のトリトンＸ−１００、０．０２％のアジ化ナトリウム、２ｍＭのオルトバナジウム酸ナトリウム、５０ｍＭのフッ化ナトリウムとプロテアーゼ阻害薬カクテル（ロシュＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、マンハイム、ドイツ））量で１ｍｇ／ｍｌの最終的なタンパク質集中に希釈された、そして、適当な二倍数ＲＩＰＡバッファ（５０ｍＭのトリスｐＨ ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．０％のナトリウム・コール酸塩、０．２％のＳＤＳ、１％のトリトンＸ−１００と０．０２％のアジ化ナトリウム）量で、最終的なＩｘを得るために、ＲＩＰＡは集中を緩衝する。抜粋は抜粋がそうであった４°Ｃ． Ｔｏｔａｌ膜でタンパク質Ｇ−セファロース・ビード（アマシャムＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ウプサラ、スウェーデン）で２時間の間安全を事前に確認された。そして、除かれて標準的なＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）は０．５ｍｇ／ｍｌの最終的なＢＳＡ集中に加えられた。抜粋が安全を事前に確認される間、抗体複合体ｄタンパク質Ｇ−セファロース・ビード（タンパク質Ｇセファロースの３０のμｌに化学的に架橋させられる抗体の６０のμｇ）は、４℃の潜伏によって、また、２時間のＡｆｔｅｒ遮断（ビードがＩｘ ＲＩＰＡバッファで５分、二回洗われた抗体複合体ｄ）のための１ｉｎＬの０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡによるブロック状態のであった。終わり−過度に終わり回転子の上で、４°Ｃで、抗体複合体ｄタンパク質Ｇ−セファロース・ビードは、それからＢＳＡを含有する全膜抽出物に加えられて、３時間の間孵化した。２０，００Ｏｇの遠沈殿法の後、１０秒の間、４°Ｃで、解放された断片は除去されて、廃棄された、そして、各々の洗浄ステップの１ｍＬのＲＩＰＡバッファで、ビードは５分の間３回洗われた。ビードは、それから一度、１．５ｍｌのＰＢＳできれいにされた。上述の免疫沈降（ＩＰ）は、７ＢＤ−３３ｌｌＡ複合蛋白Ｇセファロースで、タンパク質Ｇ−セファロース・ビードがＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（ビジネスデザインＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンディエゴ、ＣＡ）と化学的に架橋させられた類似のＩＰと並列に実施された。このステップは、免疫複合体にタンパク質の非特異的な結合の評価を可能にするために実行された。完全にＰＢＳを排出した後に、ビードは非還元の試料バッファの４０のμｌで煮沸された、そして、試料は一部のゲルのウエスタン免疫ブロット法とゲルの残りの部分のクーマシーＣｏｌｌｏｉｄａｌ Ｂｌｕｅによる染色が続くＩＤ ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された。４０のμｌの、分数（８つのμｌ）はウエスタンブロット法のためにＳＤＳ−ＰＡＧＥに積まれた、そして、残りの分数（３２のμｌ）はクーマシーＣｏｌｌｏｉｄａｌ Ｂｌｕｅでタンパク質染色のために同じゲルの別々のレーンに積まれた。タンパク質染色に指定されるゲルの部分は、クーマシーＣｏｌｌｏｉｄａｌ Ｂｌｕｅ染色液で、終夜暖められた。ウエスタンブロット法に指定されるゲルの部分は、３２０ｎｉＡで２時間の間ＰＶＤＦ膜に転写されて、脱イオン水できれいにされて、ＴＢＳＴで５パーセントの牛乳でＲＴで１時間の間ブロックされて、それからＴＢＳＴで５パーセントの乳で７ＢＤ−３３−１アイソレーション増幅器で４°Ｃで終夜暖められた。室温の１時間の間、汚点はＴＢＳＴで１０分の間３回洗われて、ＴＢＳＴで５パーセントの乳でＨＲＰ抱合型の結晶化可能フラグメントに特異的なヤギ抗マウス免疫グロブリンＧ（１：５０００）で暖められた。汚点はそれから１０分の間３回洗われて、ＨＲＰのためにＴＭＢ基質の標準手順によって呈された。図４で示されるにつれて、ウエスタン免疫ブロット法とクーマシーＣｏｌｌｏｉｄａｌ Ｂｌｕｅ染色されたゲルは並んだであった。そして、参照として分子量マーカーを使用した。クーマシーＣｏｌｌｏｉｄａｌ Ｂｌｕｅで染色された主帯域は、ウエスタンブロットで７ＢＤ−３３−１１Ａで反応したメイン・バンドの同盟者になった。この断面は、図４の上で強調される（長方形挿入紙）。
【００５６】
２．ペプチドマッピングと質量分析による抗原同定
上記の実験から、クーマシーＣｏｌｌｏｉｄａｌ Ｂｌｕｅの帯域は、ウエスタンブロットで最も強度の反応性による並んだがそれから切り離されて、商業的に入手可能なキット（ピアス、ロックフォード、ＩＬ）を使用しているｉｎ−ｇｅｌトリプシン性消化に従属したゲルを染色した。ダイジェストのアリコートは、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ ＰＢＳＩＩｃ読者（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｆｒｅｅｍｏｎｔ、ＣＡ）の上で、質量分析分析を受けた。手短に言うと、ダイジェストのアリコートは、Ｈ４チップ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｆｒｅｅｍｏｎｔ、ＣＡ）上へ、手動で汚された。乾燥の後で、ＣＨＣＡマトリックスのアリコート（αシアン基の４ヒドロキシｃｉｎｎａｍｉｎｉｃな酸；Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｆｒｅｅｍｏｎｔ、ＣＡ）、チップに同じ点上に加えられて、乾燥させておかれた。試料は、それからＰＢＳＩＩｃ読者の上で分析された。アイソタイプの平行した地方からの類似の大きさを設定された帯域はレーンを制御して、そして、７ＢＤ−３３−１１Ａによって免疫沈降される抗原の消化によって発生するユニークなペプチド断片の決定を可能にするために、空のゲル地域は７ＢＤ−３３−１１Ａ ＩＰからゲル・プラグで並んで謄写刷政府印刷物だった。ユニークなペプチド断片の腫瘤はＰＲＯＦＯＵＮＤ（質量スペクトルから情報を使用しているタンパク質配列データベースを検索するための公的にアクセスできるオンライン道具）を使用して検索された。７ＢＤ−３３−１１Ａ ＩＰダイジェストからの試料のユニークなペプチドは、それから、以前ＰＢＳＩＩｃ読者の上で分析された同じ試料点の分析を可能にしたインタフェースを備えているＱＳＴＡＲ（アプライドバイオシステム、フォスターシティー、ＣＡ）の上で、ＭＳ／ＭＳ分析を受けた。ＭＳ／ＭＳデータは、それから、ＭＡＳＣＯＴ（ＭＳ／ＭＳスペクトルから情報を使用しているタンパク質データベースを検索するための公的にアクセスできるオンライン道具）で分析された。図５は、ＰｒｏＦｏｕｎｄ検索から生じた表についての要約である。推定上の候補として提案された唯一のタンパク質は、重要な信頼度でＣＤ６３であった。図６は、ＭＡＳＣＯＴ検索から生じた要約したテーブルである。高度な確率と同一視された唯一のタンパク質はＣＤ６３であった。そして、前の仮の識別をペプチドマップ・フィンガープリント法で支えた。
【００５７】
３． ７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原イド確認
７ＢＤ−３３−１１Ａのための推定上の抗原のＩＤの確認は、既知の抗ヒトのＣＤ６３モノクローナル抗体（例えばＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ６）が７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器とその逆によって免疫沈降されるタンパク質（ｓ）と反応するかどうかの決定を通して行われた。更なる確認は、ヒトＣＤ６３の細胞外領域のグルタチオンＳ‐トランスフェラーゼ（一般システムズ理論）−融合構造物で変わる誘導されたおよび非−誘導されたバクテリアから、全体の溶解産物のウエスタン免疫ブロット法にもよって実行された。ＭＢ−２３１からの免疫沈降物は膜となって、モノクローナル抗体７ＢＤ−３３−ＨＡ、ＲＦＡＣ４（Ｃｙｍｂｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＬＴＤ、Ｈａｎｔｓ、英国）、Ｈ５Ｃ６（ビジネスデザインＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンディエゴ、ＣＡ）で備えた、そして、ＩｇＧ２ａとＩｇＧ１で、（ビジネスデザインＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンディエゴ、ＣＡ）アイソタイプ対照はウエスタン免疫ブロット法が続くＩＤ ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された。各々の免疫複合体試料からの等しい分数体積を反復されたゲル類上で分析した。ＰＶＤＦ膜の上のエレクトロブロッティングの後、そして、ＩｇＧ２ａとＩｇＧ１アイソタイプ対照と、反復されたゲル類からの汚点は、モノクローナル抗体７ＢＤ−３３−１１Ａ、ＲＦＡＣ４、Ｈ５Ｃ６と並列に探索された。図７ａにおいて、材料が７ＢＤ−３３−１１ＡとＲＦＡＣ４を試験モノクローナル抗体の各々によって免疫沈降したクロスＩＰ実験からの結果は、ウエスタン免疫ブロット法によって分析された。図７ｂにおいて、材料が７ＢＤ−３３−１１ＡとＨ５Ｃ６を試験モノクローナル抗体の各々によって免疫沈降したクロスＩＰ実験からの結果は、ウエスタン免疫ブロット法によって分析された。モノクローナル抗体７ＢＤ−３３−１１Ａ、ＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ５の各々は、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器によって免疫沈降される類似の抗原（ｓ）で交差反応した。加えて、７ＢＤ−３３−１１Ａ十字架は、ＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ６によって免疫沈降される類似の抗原（ｓ）で、２０−８０ｋＤａの範囲のウエスタンブロットで、反応したが、免疫複合体でアイソタイプ制御抗体で備えなかった。アイソタイプ制御抗体で探索される汚点は、完全に負だった。このデータは、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体によって認識されるエピトープがＣＤ６３抗原の範囲内で含まれることを示した。
【００５８】
交差反応性が全ての抗体によって認められている同じ分子によることがありえたかどうか、または、それが類似の腫瘤で相互に作用している分子の存在によったかどうか決定する、抗体７ＢＤ−３３−１のアイソレーション増幅器による免疫沈降は、増加性の緩衝厳しさの条件で実施された（５０ｍＭのトリスｐＨ ７．４、１％のトリトンＸ−１００とＮａＣｌの変更濃度：０、１５０、５００と２０００ｍＭ；更に、先に述べたようにＲＩＰＡバッファ、しかし、５００ｍＭのＮａＣｌを含むことで）。結果として生じる免疫複合体は、それから、モノクローナル抗体７ＢＤ−３３−１１Ａ、Ｈ５Ｃ６とＲＦＡＣ４で、そして、アイソタイプ対照ＩｇＧ２ａとＩｇＧ１でウエスタン免疫ブロット法によって徹底調査された。図８はＩＰ状況の厳しさを変えることが免疫複合体の形成に少しの検出可能な影響を及ぼさないことを示した。そして、それは抗体７ＢＤ−３３−１１Ａによって認められる分子（ｓ）が抗ＣＤ６３抗体とその逆によって認められもすることを示した。
【００５９】
７ＢＤ−３３−１１ＡがヒトＣＤ６３抗原と直接結合していたことを更に確認するために、ヒトＣＤ６３の細胞外領域（ループＥＣｌとＥＣ２）を含んでいる組換え型の融合ポリペプチドを表している大腸菌の溶解産物に対するウエスタン免疫ブロット法によって、その反応性は評価された。本研究のために、ＣＤ６３（ループ１とループ２−ＥＣｌとＥＣ２、それぞれ）の細胞外ループのＧＳＴ−融合構造物は、細菌発現ベクターＰＧＥＸ−４Ｔ−２（アマシャムＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）に適当な相補ＤＮＡフラグメントをサブクローニングすることによって発生した。ループをコードしている相補ＤＮＡフラグメントは、テンプレート（クローンＭＧＣ−８３３９、ＡＴＣＣ Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）として、全身のヒト相補ＤＮＡを使用してポリメラーゼ連鎖反応増幅（ＰＣＲ）によって得られた。ＥＣｌループをコードしている相補ＤＮＡは、以下のＰＣＲプライマーを使用して得られた：５つ』のプライマー（ＥＣ１＿５’）、５’ＧＣＣＧＴＧＧＧＡＴＣＣＧＧＧＧＣＡＣＡＧＣＴＴＧＴＣＣＴＧＳのものと３』プライマー（ＥＣ１＿３’）（５’ＧＡＴＧＡＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＣＡＧＡＧＡＧＣＣＡＧＧＧＧＴＡＧＣＳのもの）。ＥＣ２ループをコードしている相補ＤＮＡは、以下のＰＣＲプライマーを使用して得られた：５つ』のプライマー（ＥＣ２＿５’）５ ５’ＧＧＣＴＡＴＧＧＡＴＣＣＡＧＡＧＡＴＡＡＧＧＴＧＡＴＧＳのものと３』プライマー（ＥＣ２＿３’）（５’ＴＡＣＣＡＧＡＡＴＴＣＡＡＴＴＴＴＴＣＣＴＣＡＧＣＣＡＧＣＣＳのもの）。ＰＣＲ反応の条件は、以下の通りだった：５つの『プライマー（２５ｐｍｏｌ／μＬ）（３の２つのμＬ）』プライマー（２５ｐｍｏｌ／μＬ）の２つのμＬ、鋳型ＤＮＡ（ｐＯＴＢ−ＣＤ６３、０．７６ｍｇ／ｍＬ）の０．２のμＬとＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（インビトロゲン、バーリントン、ＯＮ）の４５．８のμＬ。ＰＣＲ反応は、以下の通りに実施された：３０が続く５分の間の９４°Ｃは、循環する：１分の間７２°Ｃで３０秒と拡張のために５５°Ｃで焼還して、サイクルにつき３０秒の間の９４°Ｃの融解。
【００６０】
サブクローニングの後、構造物（ＰＧＥＸ−４Ｔ−２ベクター単独で負の制御（相補ＤＮＡフラグメントは、ベクターにサブクローニングしなかった）を含む）は大腸菌（船荷証券−２１の重圧となる）に変わった。各々の変換からの一つのアンピシリン耐性コロニーは大きくなった、そして、それぞれの挿入相補ＤＮＡは配列決定された。相補ＤＮＡ配列が正しかったことを確認した後に、クローンの各々は、液体培養で大きくなった、そして、一般システムズ理論−融合構造物の表示は、１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオ・ガラクトピラノシド）の追加によって誘発された‖（ギブコ−ＢＲＬ；ロックビル博士）。２時間の潜伏の後、室温で、５分の間、バクテリア培養は、２００Ｏｇで遠心された。上清は成廃であった、そして、バクテリア・ペレットは非還元のＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料バッファで煮沸された。試料は、それからそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥ（５と１２パーセント）ポリアクリルアミド・スタッキングと分離ゲル類によって分析された）、そして、ウエスタン免疫ブロット法、前述のとおり。汚点膜は７ＢＤ−３３−１１Ａ、Ｈ５Ｃ６、ＲＦＡＣ４で探索された、または、ＩｇＧ２ａアイソタイプで、制御しなさい。図９で例示される結果は、７ＢＤ−３３−１１Ａが特にヒトＣＤ６３（７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器で探索される汚点のレーン６）のループ２（アミノ酸１０８−２０２）を認めて、ループ１（アミノ酸３４−５２）を認めないことを明らかにした。細菌溶解産物に対する抗体の特異性は２がａｎｔｉ−をｗｅｌｌ−ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄしたという診察によって更に確認された。そして、ＥＣ２融合ポリペプチドを表している誘導された大腸菌からの溶解産物だけの上で、ヒトＣＤ６３抗体（ＲＦ ＡＣ４とＨ５Ｃ６）はまた、類似のサイズ帯域を認識した。上記の結果の全ては、認識されるその７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器を示して、直接、ヒトＣＤ６３に、そして、特にアミノ酸１０８−２０２を含んでいる細胞外領域に結合した。
【００６１】
実施例３
Ｓ．Ｎ． １０／３４８，２３１で概説されるように、寄託番号ＰＴＡ−４８９０の下で、２００３年１月８日の２０１１０−２２０９ ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， １０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ ２０１１０−２２０９）、ブダペスト条約に従って、ハイブリドーマ細胞系７ＢＤ−３３−１１Ａは寄託された。３７の運賃込み条件１．８０８に従って、沈澱器は寄託資料の市民に有効性に押しつけられる全ての規制が特許を与えると、即座に、取り返しのつかないほど取り出されることを保証する。
【００６２】
抗体産生：
７ＢＤ−３３−１１Ａモノクローナル抗体は、コレクションと追いまき起こっている二度／週でハイブリドーマをＣＬ−１０００フラスコ（ビジネスデザインＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ）で培養することによって生産された。抗体は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇセファロース４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（アマシャムＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂａｉｅ ｄ’Ｕｒｆｅ、ＱＣ）で、標準の抗体精製処置によって精製された。
【００６３】
前述のとおり、Ｓ．Ｎ． １０／３４８，２３１で、７ＢＤ−３３−１１Ａは細胞毒性分析（表２）で、多数の陽性（抗ファス（ＥＯＳ９．１、免疫グロブリンＭ、カッパ、２０マイクログラム／ｍＬ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、サンディエゴ、ＣＡ）、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ＩｇＧｌ、カッパ、１０マイクログラム／ｍＬ、インテル・メディコ、マーカム、ＯＮ）、抗ＥＧＦＲ（Ｃ２２５、ＩｇＧｌ、カッパ、５マイクログラム／ｍＬ、Ｃｅｄａｒｌａｎｅ、ホーンビー、ＯＮ）、Ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ（１００マイクロモル、シグマ、Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ）、アジ化ナトリウム（０．１％、シグマ、Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ））で陰性の（１０７．３（抗喘ぎ、ＩｇＧｌ、カッパ、２０マイクログラム／ｍＬ、ビジネスデザインＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ）、Ｇ１５５−１７８（抗喘ぎ、ＩｇＧ２ａ、カッパ、２０マイクログラム／ｍＬ、ビジネスデザインＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ）、ＭＰＣ−Ｉ ｌ（抗原特異性未知数、ＩｇＧ２ｂ、カッパ、２０マイクログラム／ｍＬ）、Ｊ６０６（抗フルクトサン、ＩｇＧ３、カッパ、２０マイクログラム／ｍＬ）、免疫グロブリンＧ Ｂｕｆｆｅｒ（２％））対照と比較された。乳癌（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＢ−２３１）、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＭＢ−４６８）、ＭＣＦ−７）、大腸癌（ＨＴ−２９、ＳＷｌ１１６、ＳＷ６２０）、肺癌（ＮＣＩ Ｈ４６０）、卵巣癌（ＯＶＣＡＲ）、前立腺癌（ＰＣ−３）と非癌（２７ｓｋチャージカップルドデバイス、Ｈｓ８８８ルテチウム）細胞系は、試験された（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡからの全て）。Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ細胞毒性分析は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から得られた。分析は、下で概説される変化で、製造業者の指示に従って実行された。細胞は、予め定められた適当な密度で分析の前にメッキをされた。２日後に、精製された抗体または対照はメディアに希釈された、それから、１００マイクロリットルは細胞板に転写されるＮ Ｃ Ｃｌｔｌｔｔｇｏｓｅａｉｖｅｏｎｏｓ ａｏｎｒｒであって、５日の間５パーセントのＣＯ２インキュベーターで孵化した。プレートは、それから逆にすることによって空にされて、乾燥質で拭かれた。室温ＤＰＢＳはＭｇＣｌ２を含んでいる、そして、塩化カルシウムはマルチ・チャンネル・スクィーズボトルからよい各々に分配されて、３回軽くたたかれて、逆転によって空にされて、それから、乾燥質で拭かれた。ＤＰＢＳで希釈される蛍光カルセイン染料の５０マイクロリットルはＭｇＣｌ２を含んでいる、そして、塩化カルシウムはよい各々に加えられて、３０分の間５パーセントのＣＯ２インキュベーターで３７℃で暖められた。プレートはパーキン−エルマーＨＴＳ７０００蛍光プレート読本で読まれた、そして、データはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌで分析された、そして、結果は表１で表化された。データは、平均４つの実験が三通り１０で検証されて、質的に以下の様式に示されることを表した：４／４実験より大きい閾値細胞毒性（＋＋＋）、３／４実験より大きい閾値細胞毒性（＋＋）、２／４実験より大きい閾値細胞毒性（＋）。表１の印がない細胞は矛盾していて抗議する、または、効果が閾値細胞毒性より少ない。７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器抗体は胸部の細胞毒性と１５が選択的に線をひく前立腺の腫瘍細胞を示した、その一方で、非変わる正常細胞の上に無効を持った。７ＢＤ−３３−１アイソレーション増幅器は、前立腺癌細胞系の正の制御抗ファス抗体より大きな殺害を示した。比較のためにも含まれた多数の他の抗体が生物学的細胞０の分析の限定を与えられて予想通りに実行する間、化学細胞障害性の薬剤はそれらの期待される細胞傷害を誘発した。全体として、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体が多数の癌細胞タイプに対して細胞毒性活性を持つことを示された。全ての癌細胞タイプが影響されやすいというわけではなかった時から、抗体はその活性で選択的だった。さらにまた、それが非癌細胞型に対して細胞毒性を発生しなかった時から、抗体は機能的な特異性を示した。そして、それは治療的な状況の重要な要素である。
【００６４】
【表１】
【００６５】
癌と正常な細胞系の前述のパネルに対する、そして、以下の付加的な癌細胞系に対する７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器の結合；大腸（ＬＯＶＯ）、膵臓の（ＢｘＰＣ−３）、卵巣の（ＥＳ−２、ＯＣＣ−Ｉ）、そして、前立腺の（ＤＵ−１４５）、そして、以下の付加的な正常な細胞系（チャージカップルドデバイス−１１２）は、フローサイトメトリ（ＦＡＣＳ）によって評価された。細胞は、まず最初にＤＰＢＳ（Ｃａ＋＋とＭｇ＋＋なしで）で細胞単層を洗うことによって、ＦＡＣＳの準備ができていた。細胞解離バッファ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ、バーリントン、ＯＮ）はそれから、細胞が４°Ｃ（メディアを洗う）、ＭｇＣｌ２を含んでいるダルベッコ燐酸緩衝生理食塩水、塩化カルシウムと２または２５パーセントのウシ胎児血清（ＦＢＳ）で再懸濁された３７°Ｃ． Ａｆｔｅｒ遠沈殿法と収集で細胞をそれらの細胞培養プレートから除去するのに用いられて、適当な細胞密度に等分されて、引き伸ばした以上ペレットを細胞とみなした、そして、Ａｌｅｘａフルーア４８８抱合型の二次抗体の追加に３０分のＰｒｉｏｒのために氷の上で２０のμｇ／ｍＬで７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器または制御抗体（アイソタイプ制御または抗ＥＧＦＲ）を含んでいる染色メディア（ＤＰＢＳはＭｇＣｌ２と塩化カルシウム＋／−を含んでいる。そして、２パーセントがＦＢＳである）で再懸濁されて、細胞は洗浄メディアで一度洗われた。染色メディアの中のＡｌｅｘａフルーア４８８抱合型の抗体は、それから細胞がそれから最後の時洗われた２０〜３０分の間加えられて、１つのμｇ／ｍＬプロピジウム・ヨウ化物または１．５パーセントのパラホルムアルデヒドを含んでいる媒体を染色する際に再懸濁された。細胞の流動細胞獲得は、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（ビジネスデザインＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用しているＦＡＣＳｃａｎの上で試料を走らせることによって評価された。細胞のフォワード（国際販売会社）と側方散乱（ＳＳＣ）は電圧を調整することによってセットされた、そして、振幅は国際販売会社とＳＳＣ探知器に追い迫る。細胞が約１−５単位の蛍光強度の中央値で同一のピークを持ったように、３本の蛍光チャネル（ＦＬｌ、ＦＬ２とＦＬ３）のための探知器はＡｌｅｘａフルーア４８８抱合型の二次抗体が続く精製されたアイソタイプ制御抗体で染色される走行細胞によって調整された。有効な細胞は、国際販売会社とプロピジウム・ヨウ化物除外（使われるとき）のためにゲーティングによって後天性だった。各々の試料のために、約１０，０００の有効な細胞は、分析のために後天性だった、そして、起こられた示された表２で。表２はアイソタイプ制御より上に平均の蛍光強度折り目増加を表化して、質的に発表される：５未満（）；５〜５０の（＋）；５０〜１００（＋＋）；１００の（＋＋＋）より上に、そして、括弧において、細胞のパーセンテージは、染色された。
【００６６】
７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体の代表的なヒストグラムは、図９のために編集された。７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器は、胸部（ＭＢ−４６８）、大腸（ＬＯＶＯ）と前立腺（ＤＵ−１４５）癌細胞系のうちの１つに、類似の結合を胸部（ＭＢ−２３１ ＭＣＦ−７）、大腸（ＨＴ−２９、ＳＷｌ１１６とＳＷ５２０）、肺、卵巣、膵臓で前立腺（ＰＣ−３）起源と差動結合の癌線に表示した。７ＢＤ−３３−１アイソレーション増幅器の結合が非癌細胞にもあった、しかしながら、その結合は細胞毒性を発生しなかった。これは、結合がその同族の抗原の抗体結合の結果を必ずしも予示するというわけではなくて、非明らかな知見であったという更なる証拠であった。これは、異なる細胞の抗体結合の前後関係がちょうど抗体結合よりむしろｃｙｔｏｘｉｃｉｔｙで決定的なことを示唆した。
【００６７】
【表２】
【００６８】
実施例４
通常の人体組織染色
ＩＨＣ検査は、以前、ヒト（Ｓ．Ｎ． １０／６０３，００６）で７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原分布を特徴づけるために実行された。２つの抗体に対する現在の学業比較された７ＢＤ−３３−１１Ａは、１５からＣＤ６３（ＲＦ ＡＣ４とＨ５Ｃ６）に対して、以前に生化学方法で測定されるにつれて、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原がＣＤ６３であると指令した。２４の正常な人体組織に対する抗体の結合は、人間の正常な器官組織配列（傾斜マイク、Ｗａｔｅｒｖｌｉｅｔ、ＮＹ）を使用して実行された。ＡＵ第一抗体（７ＢＤ−３３−１１Ａ；ＲＦＡＣ４（Ｃｙｍｂｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、Ｈａｎｔｓ、英国）とＨ５Ｃ６抗ＣＤ６３（ビジネスデザインＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ）；そして、２０が制御する（ダコ、トロント、ＯＮ）マウスＩｇＧｉ否定）５つのμｇ／ｍｌ（前の最適化ステップの最適集中であることを分かる）の集中に対する抗体希釈剤バッファ（ダコ、トロント、ＯＮ）で希釈した。負の制御抗体は、製造業者によって全ての哺乳類の組織に負であることが示された。ＩＨＣのための処置は、以下の通りである。断面が１時間の間５８℃で乾燥器で乾燥してｄｅｐａｒａｆｆｉｎｉｚｅｄされて、コプリンのそれぞれ４分の間５回をキシレンに浸漬することによってｄｅｗａｘｅｄした２５のＴｉｓｓｕｅは、揺れる。一連の段階的なエタノール洗浄（１００％−７５％）を通しての処置の後で、断面は水の中で再水和された。スライドはそれからそれぞれ５分の間高くて、中間で、低い３０の推力設定で電子レンジで調理されるｐＨ ６（ダコ、トロント、オンタリオ）で１０ｍＭのクエン酸のバッファに没頭していて、最終的に冷たいＰＢＳに浸漬された。スライドはそれから６分の間３％の過酸化水素水に浸漬された。そして、それぞれ５分の間３回、ＰＢＳで洗われて、乾燥して、室温で５分のＵｎｉｖｅｒｓａｌ遮断解決（ダコ、トロント、オンタリオ）で暖められた。７ＢＤ−３３−１１Ａ、単クローン系マウス抗ＣＤ６３（Ｃｙｍｂｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、Ｈａｎｔｓ、英国またはダコ、トロント、オンタリオ）またはアイソタイプ制御抗体‖（黒色アスペルギルス・グルコースオキシダーゼ（存在しもしなく哺乳類の組織で誘導性でもない酵素）の方へ指示した；ダコ、トロント、オンタリオ）その働く集中（各々の抗体のための５つのμｇ／ｍＬ）に対する抗体希釈剤バッファ（ダコ、トロント、オンタリオ）の希釈されて、そして、室温の１時間の間、終夜孵化した。スライドをＰＢＳそれぞれ５分の間の３回で洗浄した。室温で３０分に供給される（ダコＥｎｖｉｓｉｏｎシステム、トロント、オンタリオ）につれて、主要な抗体の免疫反応性はＨＲＰ抱合型二次抗体で発見されていて／視覚化した。これがスライドに段をつけることになることをＰＢＳそれぞれ５分と室温で１０分の間免疫ペルオキシダーゼ染色のＤＡＢ（３，３’−ジアミノ・ベンジジンｔｅｔｒａｈｙｄｒａｃｈｌｏｒｉｄｅ、ダコ、トロント、オンタリオ）色原体基質解決を加えることによって開発される呈色反応のための３回で洗浄した。スライドを水道水で洗うことは、色素反応を終了した。マイヤーのＨｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ（シグマＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ）による対比染色の後で、滑り面は段階的なエタノール（７５−１００％）でｄｅｈｙｒｄａｔｅｄされて、キシレンで掃除された。マウンティング・メディア（ダコＦａｒａｍｏｕｎｔ、トロント、オンタリオ）を使用して、スライドはｃｏｖｅｒｓｌｉｐｐｅｄされた。スライドはＡｘｉｏｖｅｒｔ ２００（ツァイス・カナダ、トロント、ＯＮ）を使用して顕微鏡的に調べられた、そして、ディジタル画像はノーザンブロットのＥｃｌｉｐｓｅ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ミシソーガ、ＯＮ）を使用することを得て、保存した。結果は読み込まれて、勝ち取られて、病理学者によって解釈された。
【００６９】
表３は、７ＢＤ−３３−１１ＡとＲＦＡＣ４の結果と正常な人体組織の試験配列のＨ５Ｃ６抗ＣＤ６３染色の概要を示す。７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器による組織の染色は、以前に記載され（Ｓ．Ｎ． １０／６０３，００６）てそれと類似している。７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器がさまざまな細胞型に制限された結合を見せたが、マクロファージ、リンパ球と線維芽細胞を浸透させることに結合を持った点に再び注意されなければならない。ＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ６抗体は、割に各々に類似の染色パターンを見せた。しかしながら、ＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ６の染色パターンは７ＢＤ−３３−１１Ａで観察されてそれとは全く異なった。具体的には、抗体が正常組織のより幅広い範囲に結合したＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ６は通常、７ＢＤ−３３−１１Ａが陽性でもあってマクロファージを浸透させることだけに縛られていもしなかった組織で強度にしみをつけている高等を持った、リンパ球、そして、線維芽細胞、そして、しかし、また、大多数の上皮組織がある（図１１）。
【００７０】
７ＢＤ−３３−１１Ａが陽性だった組織は、ＲＦＡＣ４かＨ５Ｃ６抗ＣＤ６３抗体（時々より少ない強度で）が陽性でもあった。７ＢＤ−３３−１１Ａが陰性だった組織は、通常、ＲＦＡＣ４またはＨ５Ｃ６が陰性でなかった。これらの結果は７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器がＲＦＡＣ４かＨ５Ｃ６抗ＣＤ６３抗体によって認められる組織のより小さいサブセットと結合することを証明した、そして、組織の範囲内で、染色の強度は時々より少なくもあった。これらの成績は、７ＢＤ−３３−１１Ａのための抗原が正常組織の上で広く表されなかった、そして、抗体が特にヒトの限定された数の組織と結合したことを示した。一方より異なるエピトープにこれらのＩＨＣ検査のために使用されるＲＰＡＣ４かＨ５Ｃ６抗体によって認められるが、それも７ＢＤ−３３−１１ＡがＣＤ６３のエピトープに向けられたという生化学証拠を支援した。
【００７１】
【表３】
【００７２】
実施例５
ヒト胸部腫瘍組織染色
前のＩＨＣ検査は、ヒト乳癌で７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原の癌共同を決定するために行われた、そして、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体がヒト癌（Ｓ．Ｎ． １０／６０３，００６）を認識するかどうかを調べた。現在では、比較はＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ６抗ＣＤ６３とｃ−ｅｒｂＢ−２抗Ｈｅｒ２抗体を使用して行われた。乳癌組織配列は５０人の乳癌患者に由来した、そして、乳癌患者で非腫瘍性の胸部組織に由来する１０の試料が使われた（Ｉｍｇｅｎｅｘ社、サンディエゴ、ＣＡ）。以下の情報は、各々の患者に対して用意されていた：年齢（Ｃａｎｃｅｒ（ＡＪＣＣ）腫瘍の病期、リンパ節、エストロゲン受容体（ＥＲ）とｐｒｏｊｅｓｔｅｒｏｎｅレセプター（ＰＲ）状態に関する性的、アメリカのＪｏｉｎｔ委員会）。実施例４からのＩＨＣのための処置は、続かれた。ＡＵ抗体が、１．５のμｇ／ｍＬの集中が使われた抗Ｈｅｒ２抗体を除いて、５つのμｇ／ｍＬの働く集中で使われた。
【００７３】
表４、５と６と７は、乳癌組織配列の７ＢＤ−３３−１１Ａ、ＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ６抗ＣＤ６３抗体染色の概要を提供する。全体として、試験される５０人の患者の３６パーセントは、それぞれＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ６抗ＣＤ６３抗体のために８５と９４パーセントと比較して、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器抗原が陽性だった。７ＢＤ−３３−１１ＡとＲＦＡＣ４またはＨ５Ｃ６抗ＣＤ６３抗体が同じ組織を染色した症例において、試料の９７パーセントは、７ＢＤ−３３−１１Ａ（図１２）に、割にＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ６抗ＣＤ６３で高等強度染色を受けた。１０の中の７ＢＤ−３３−１１Ａ ０のために、そして、ＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ６のために、それぞれ、乳癌患者からの８つの（２つの試料は、代表的でなかった）正常な胸部組織試料からの抗ＣＤ６３抗原７は、陽性だった。エストロゲンまたはプロゲステロン受容体発現間のわずかな相互関係と７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原の表現度があった；いずれの受容体発現にもよる組織は、わずかにより高い７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原表現をした。腫瘍がそれらの段階または癌が進んだ程度に基づいて分析されたとき、結果は７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器のために高等腫瘍の病期でより大きな陽性の表現に向かう傾向を暗示した。同様の結果がＲＦＡＣ４で得られた。Ｈ５Ｃ６もエストロゲンまたはプロゲステロン受容体発現で非常にわずかな相互関係を示した、しかし、見た目の相互関係が腫瘍の病期でなかった。しかしながら、全３つの抗体のために、結果は小さいサンプルサイズによって制限された。
【００７４】
【表４】
【００７５】
【表５】
【００７６】
【表６】
【００７７】
７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器染色は、間質細胞が明らかに負だった、そして、悪性細胞のシートが陽性だった正常細胞に、割に癌細胞に特有だった。７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原で見られる細胞局在パターンは、細胞膜と細胞質に限定された。類似の膜状で細胞質の染色結果は、乳房腫瘍組織標本の上で抗ＣＤ６３抗体、ＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ６で得られた。その上、これらの抗体の両方とも、通常の胸部組織試料前文７ＢＤ−３３−１ｌＡｗａｓ否定に関して、この染色限局化パターンを示した。
【００７８】
ｃ−ｅｒｂＢ−２に対する比較において、７ＢＤ−３３−１１Ａは７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原が陽性だった１８の乳房腫瘍組織標本からの９が乳癌患者（８を表に記入しなさい、図１３）のこれまでに会ったことのない目標とされた治療的な必要を示しているＨｅｒ２表現が陰性だった完全に異なる染色側面を示した。染色の強度の違いが、７ＢＤ−３３−１１ＡとＨｅｒ２が陽性だった乳房腫瘍組織切片の間にもあった；７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原が非常に陽性だった若干の乳房腫瘍組織切片は、７ＢＤ−３３−１１Ａが乳癌患者の異なる一団を治療的に目標とすることを再び示しているＨｅｒ２とその逆が少し陽性であるだけだった。ｃ−ｅｒｂＢ−２抗体も、明らかに通常の胸部組織断片のうちの１つを染色した。
【００７９】
これらの結果は、７ＢＤ−３３−１１Ａのための抗原が乳癌患者の約３分の２によって表される可能性がある、そして、それらの半分がＨｅｒ２抗原が完全に陰性だったことを示唆した。染色パターンは患者試料で、抗体が悪性細胞に非常に特有であることを示した、そして、７ＢＤ−３３−ＨＡ抗原はそれによってそれを魅力的なｄｒｕｇａｂｌｅな目標としている細胞膜の上で存在した。類似的である‖より多くが７ＢＤ−３３−１１Ａの染色を制限して非常に対、ＫＦＡＣ４かＨ５Ｃ６抗ＣＤ６３抗体は、再び７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器エピトープの可能性を示すＣＤ６３．のより拘束性のエピトープである
【００８０】
【表７】
【００８１】
【表８】
【００８２】
実施例６
ヒト前立腺の組織染色
ＢＤ−３３−１１Ａ抗原が乳癌に加えて他のヒト癌組織の上で表されたかどうか決定する、複数のヒト腫瘍組織配列は、７ＢＤ−３３−１１Ａで探索された（Ｓ．Ｎ． １０／６０３，００６；Ｉｍｇｅｎｅｘ、サンディエゴ、ＣＡ）。それらの研究を進める際に、染色パターンｏｆ７ＢＤ−３３−ｌアイソレーション増幅器は、人間の前立腺腫瘍組織配列（Ｉｍｇｅｎｅｘ社、サンディエゴ、ＣＡ）の上で決定された。処置が使用した染色は、実施例４で概説されるものと同様だった。ＡＵ抗体が、５つのμｇ／ｍＬの働く集中で使われた。
【００８３】
表９で概説されるように、７ＢＤ−３３−１１Ａは８８パーセントのヒト前立腺癌を染色した。７ＢＤ−３３−１１Ａが同様に通常の組織切片を高輝度でけがしたにもかかわらず、膜状の染色の高等程度が割に正常な試料に腫瘍組織試料にあった。７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器抗原のために染色されなかった１つの胎児性横紋筋肉腫組織標本が、あった。また、腫瘍の病期と７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原の存在間の直接的な相互関係でなく見えた。しかしながら、結果は小さいサンプルサイズによって制限された。再び７ＢＤ−３３−１１Ａで、前立腺腫瘍組織試料の上で観察される膜状で細胞質の染色が、あった。しかしながら、膜状の染色の程度の増加が、乳房腫瘍組織標本（図１４）で見られてそれと関連してあった。通常の前立腺の組織標本のために、膜状の染色の程度のこの増加は、観察されなかった。
【００８４】
【表９】
【００８５】
従って、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器抗原が単に前立腺癌の膜の上でも乳癌の膜で以外見つかるだけではなく見えた。これらの結果は、７ＢＤ−３３−１１Ａには胸部の他に腫瘍タイプで治療薬として可能性があることを示した。
【００８６】
図中証拠の優越性は、ＣＤ６３の７ＢＤ−３３−１１Ａが異型の上で出席している高次構造上のエピトープの結合を通して抗癌効果の媒介となることをである。実施例２で、抗体が同族の抗原を２３１セルＭＤＡ−ＭＢ−のような細胞を表すことから免疫沈降させるのに用いられることができることを７ＢＤ−３３−１１Ａに明らかにされた。更に、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器抗体が特にそれに対して結合するＣＤ６３抗原性部位を表す細胞および／または組織の検出で使われることができることを示されることができた。そして、実例を示されるが、ＦＡＣＳ（細胞ＥＬＩＳＡ ｏｒＩＨＣ）に限られていない技術を利用した。
【００８７】
このように、免疫沈降された７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原がそのようなＦＡＣＳ、細胞ＥＬＩＳＡまたはＩＨＣ分析を使用しているそのような細胞または組織に７ＢＤ−３３−１１Ａの結合を阻害することができることを示されることができた。更なる（７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体で）他のａｎｔｉ−、ＣＤ６３抗体は他の型のＣＤ６３抗原を免疫沈降して、分離するのに用いられることができた、そして、抗原は分析の同一形式を使用している抗原を表す細胞または組織にそれらの抗体の結合を阻害するのに用いられることもできる。
【００８８】
実施例７
インビボのＭＤＡ−ＭＢ−２３１予防的用量反応の腫瘍実験
図１５と１６に示されるデータに関して、６〜８週間目、雌の重篤複合免疫不全マウスは、襟首で皮下に１００マイクロリットルの食塩注入されたで５００万のＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞で入れられた。マウスは、１０の４つの投与群に、ランダムに分けられた。その翌日に、着床０．２、２．０または２０ｍｇ／ｋｇの７ＢＤ−３３−１１Ａまたは２０ｍｇ／ｋｇの免疫グロブリンＧアイソタイプ制御抗体は、２．７ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭのＮａＣｌと２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４を含んだ賦形薬で、家畜濃度から希釈の後、３００マイクロリットル量で、腹腔内に投与された。同じ様式の７週の期間の間の１週当たり、抗体はそれから投与された。腫瘍成長はカリパス副木で第７の日ごと頃に測定されたか、個々の動物までＣＣＡＣエンドポイントに着いた。動物の体重は、本研究の期間の間原建築費だった。
【００８９】
処置（日５５）終了後、０．２ｍｇ／ｋｇの投与群は、アイソタイプ対照群の１５パーセントであった腫瘍成長を持った。０．２ｍｇ／ｋｇの７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器投与群の腫瘍成長の８５パーセントの減少は、対のｔ検定（ｐ＜０．０００１）で測定されるにつれて、割にアイソタイプ制御に対する有意差であると決定された。２．０と２０ｍｇ／ｋｇの投与群の両方とも、まだ処置（日５５）の終りまでに腫瘍を呈していなかった。この傾向は、治療期間を越えてよく続いた。全ての用量で、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器抗体による処置は、また、アイソタイプ制御処置群に割に生存の増加に導いた。制御処置群のマウスの全ては、日１０４（５４日後療法）までに死亡した。対照的に、０．２ｍｇ／ｋｇの群のマウスは日１９７（１４７日後療法）まで生存した、２．０ｍｇ／ｋｇの投与群のマウスの５０パーセントは日２９０（２４０日後療法）で生存している窓しきいであった、そして、２０ｍｇ／ｋｇの群の１００パーセントはまた、日２９０でまだ生存してもいた。従って、アイソタイプに対する比較の７ＢＤ−３３−１１Ａ処置、全く３つの用量、かなり還元型全身腫瘍組織量と増加した生存は、抗体を制御する。最高の服用の処置は、腫瘍成長（１００パーセント）と生存（全てのマウスは、まだ生存している）で最も大きい増加で最も大きな減少を示した。従って、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器は、人を含む他の哺乳類で治療のためにこの抗体の薬理学で製薬利点を提案している有力な抗腫瘍性の抗体である。
【００９０】
実施例８
インビボのＭＤＡ−ＭＢ−２３１確立した化学療法複合腫瘍実験
図１７と１８に関して、６〜８週間目の雌の重篤複合免疫不全マウスは、襟首で皮下に１００マイクロリットルの食塩注入されたで５００万のＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞で入れられた。腫瘍成長は、毎週、カリパス副木で測定された。大部分のコホートが４１日ポスト着床で１００のｍｍ３（範囲４８−１２２ ｍｍ３）の腫瘍容積に達したとき、８匹のマウスはランダムに４つの投与群の各々への隷下のであった。７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体、化学療法剤シスプラチン、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器とシスプラチンの組合せまたはバッファ制御は、２．７ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１３７ｎｉＭ ＮａＣｌと２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４を含んだ賦形薬で、家畜濃度から希釈の後、３００マイクロリットル量で、それぞれ１０または９ｍｇ／ｋｇの抗体またはシスプラチンで腹腔内に投与された。７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器またはバッファ制御は、それから日６４ ｐｏｓｔ−着床まで同じ様式で全体で１０の用量のために１週につき３回投与された。シスプラチンは、治療期間の日１、３と９に投与された。腫瘍成長は移植後の日１２５までカリパス副木で第７の日ごと頃に測定された、または、個々の動物がＣＣＡＣに着くまで、ｅｎｄ−は指す。動物の体重は、本研究の期間の間原建築費だった。本研究終了後、全ての動物は、ＣＣＡＣガイドラインに従って安楽死させられた。対のｔ検定を使用して、処置と関連する後処理全身腫瘍組織量減少（図１６）が、いずれの７ＢＤ−３３−１１Ａも、シスプラチンまたは２つの組合せであった。日６９（５日後処理）で、両方の７ＢＤ−３３−１１Ａ、シスプラチンと抗体−複合製剤は、バッファ制御処置と比較して平均の腫瘍容積を減少させた；７６（ｐ＜０．００１）、７９（ｐ＜０．００１）と８６パーセント（ｐ＜０．００１）それぞれ。体重が、幸福の代用物として使われた。シスプラチンと７ＢＤ−３３−１１Ａが類似の腫瘍抑制を示したにもかかわらず、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器抗体で処置にシスプラチン ｔｒｅａｔｍｅｎｔｉｎ比較で見られる重量減少の同じ程度がなかった。バッファ制御と７ＢＤ−３３−１１Ａ処置群間のほとんど差が、時点常時監視の上になかった。実際に、バッファ制御と７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器で処置される群は、治療期間の後、わずかな重量増加を示した。対照的に、シスプラチンで処置される群は、特に最終的な服用の明白な投与後であった重量減少を経験した。移植後の（シスプラチンの最終的な服用の後の４日）日５５に、シスプラチン処置群は、体重の２４−３０パーセントの損失を示した。従って、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器とシスプラチンは、ヒト乳癌疾患のよく認識されたモデルで、割にバッファ制御まで全身腫瘍組織量を降ろした。しかしながら、体重で測定されるにつれて、７ＢＤ−３３−１１Ａ治療をうけている動物はシスプラチン投与群より良好な幸福を経験した。これらの結果は薬理学で示唆する、医薬とクオリティオブライフは人を含む他の哺乳類でこの抗体ｆｏｒｔｈｅｒａｐｙの利益を得る。
【００９１】
実施例９
インビボのＭＤＡ−ＭＢ−４６８確立した化学療法複合腫瘍実験
図１９と２０に関して、６〜８週間目の雌の重篤複合免疫不全マウスは、襟首で皮下に１００マイクロリットルの食塩注入されたで２００万のＭＤＡ−ＭＢ−４６８ヒト乳癌細胞で入れられた。腫瘍成長は、毎週、カリパス副木で測定された。大部分のコホートが２７日ポスト着床で１００のｍｍ３（範囲１１−１１９ ｍｍ３）の腫瘍容積に達したとき、８匹のマウスはランダムに４つの投与群の各々への隷下のであった。７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体、化学療法剤シスプラチン、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器とシスプラチンの組合せまたはバッファ制御は、２．７ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１３７ｎｉＭ ＮａＣｌと２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４を含んだ賦形薬で、家畜濃度から希釈の後、３００マイクロリットル量で、それぞれ１０または６ｍｇ／ｋｇの抗体またはシスプラチンで腹腔内に投与された。７ＢＤ−３３−１１でＡまたはバッファ制御は、それから、移植後の日５０まで同じ様式で全体で１１の用量のために１週につき３回が続く第１の週の間、１週につき４回投与された。シスプラチンは、治療期間の日１、６、１１と１６に投与された。腫瘍成長は移植後の日６６までカリパス副木で第７の日ごと頃に測定されたか、個々の動物までＣＣＡＣエンドポイントに着いた。動物の体重は、本研究の期間の間原建築費だった。本研究終了後、全ての動物は、ＣＣＡＣガイドラインに従って安楽死させられた。
【００９２】
対のｔ検定を使用して、処置と関連する後処理全身腫瘍組織量減少（図１８）が、７ＢＤ−３３−１１Ａかシスプラチンまたは２つの組合せであった。日５５（５日後処理）で、両方の７ＢＤ−３３−１１Ａ、シスプラチンと抗体−複合製剤は、バッファ制御処置と比較して平均の腫瘍容積を減少させた；３７（ｐ＝０．３９５８）、９５（ｐ＝０．０２４）と９７パーセント（ｐ＝０．０１７）それぞれ。体重が、幸福の代用物として使われた。より大きな範囲に、７ＢＤ−３３−１１Ａとシスプラチンが腫瘍抑制を示したにもかかわらず、シスプラチンとの比較処置で７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体処置で見られる重量減少の同じ程度がなかった。バッファ制御と７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器処置群間のほとんど差が、時点常時監視の上になかった。実際に、バッファ制御と７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器で処置される群は、治療期間の間に若干のわずかな重量増加を示した。対照的に、シスプラチンで処置される群は、シスプラチンの最終的な服用が投与されたあと、特に明白だった重量減少を経験した。移植後の（シスプラチンの最終的な服用の後の４日）日４８に、シスプラチン処置群は、体重の２０パーセントの損失を示した。従って、７ＢＤ−３３−１１Ａとシスプラチンは、ヒト乳癌疾患のもう一つのよく認識されたモデルで、割にバッファ制御まで全身腫瘍組織量を降ろした。しかしながら、体重で測定されるにつれて、７ＢＤ−３３−１１Ａ治療をうけている動物はシスプラチン投与群よりあるより良好なｗｅｌｌ−を経験した。全部で、７ＢＤ−３３−１１Ａがヒト癌のマルチプル・モデルで重要な利点（改善された生存、割に処置を制御する減少した全身腫瘍組織量と割に化学療法に対するより良好な耐容性）を発生したこれらの結果は、暗示する薬理学の、製薬の、そして、良質な人を含む他の哺乳類の治療のためのこの抗体の生命利点。
【００９３】
図中証拠の優越性は、ＣＤ６３の細胞外ループ２で出席しているエピトープの７ＢＤ−３３−１１Ａが結合を通して抗癌効果の媒介となることをである。実施例２で、抗体が同族の抗原を２３１セルＭＤＡ−ＭＢ−のような細胞を表すことから免疫沈降させるのに用いられることができることを７ＢＤ−３３−１１Ａに明らかにされた。更に、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器抗体が特にそれに対して結合するＣＤ６３抗原性部位を表す細胞および／または組織の検出で使われることができることを示されることができた。そして、実例を示されるが、ＦＡＣＳ、細胞ＥＬＩＳＡまたはＩＨＣに限られていない技術を利用した。
【００９４】
このように、免疫沈降された７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原がＦＡＣＳ、細胞ＥＬＩＳＡまたはＩＨＣ分析を使用しているそのような細胞または組織に７ＢＤ−３３−１１Ａの結合を阻害することができることを示されることができた。更に、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器抗体と同様に、他の抗ＣＤ６３抗体は他の型のＣＤ６３抗原を免疫沈降して、分離するのに用いられることができた、そして、抗原は分析の同一形式を使用している抗原を表す細胞または組織にそれらの抗体の結合を阻害するのに用いられることもできる。この仕様で言及されるＡＵ特許と刊行物は、発明が関係する当業者のレベルを表す。あたかも個々の刊行が参照によって組み込まれることを特に、そして、個々に示されるかのように、全ての特許と刊行物は同じ範囲への言及によって組み込まれてこの中にある。
【００９５】
発明の特定の形状が例示される間、それが記載されてこの中の部品の特異的な形状または配置に限られていることになっていなくて、示されることになっていないと理解されることになっている。さまざまな変化が発明の範囲から出発することなくなされる可能性があることは当業者にとって明らかである、そして、発明は示されて、明細書で記述されることに限られて考慮されることになっていない。当業者は、直ちに本発明が物体を実行するのにかなり適していると認めて、その中で固有のそれらと同様に、言及される終わりと利点を得る。この中に記載されるどんなオリゴヌクレオチドでも、ペプチド、ポリペプチド、生物学的に関連した合成物、方法、処置と技術は、現在好ましい実施形態を代表して、典型的なことを目的として、範囲に対する制限を、意図しない。その中の変化と他の用途が、発明の精神の範囲内で含まれて、添付の請求項の範囲によって定義される当業者の心に浮かぶ。発明が特異的な好ましい実施形態と関連して記載された、それは理解されなければならないその発明請求する‖そのような特異的な実施形態に過度に制限しなければならない。実際、当業者にとって明らかである発明を実行するための描かれたモードのさまざまな変形は、以下の請求項の範囲内のことを目的とする。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】ＭＤＡ−ＭＢ−まる２３１細胞可溶化物（レーン１）または膜（レーン２と３）のウエスタンブロットは、７ＢＤ−３３−１１Ａ（パネルＡ）またはアイソタイプ対照（パネルＢ）と深く探った。分子量マーカーは、左で示される。
【図２】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜のウエスタンブロットは、７ＢＤ−３３−ＨＡで深く探った。レーン１：還元性の状況の下で動く膜。レーン２：膜は、非還元の状況の下で動作する。分子量マーカーは、左で示される。
【図３】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜に対する７ＢＤ−３３−１１Ａの結合の脱グリコシルの効果。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜は、ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄａｓｔ Ｆで処置を受けた（ＰＮＡＧアーゼ；レーン１）、Ｏ−グリカナーゼ（レーン２）、シアリダーゼ（レーン３）、ＰＮＡＧアーゼ、Ｏ−グリカナーゼとシアリダーゼ（レーン４）の組合せ、ＰＮＡＧアーゼ、Ｏ−グリカナーゼ、シアリダーゼ、ガラクトシダーゼとグルコサミニダーゼ（レーン５）の組合せまたはバッファ制御（レーン６）。分子量マーカーは、左で示される。
【図４】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（パネルＡ）、そして、膜タンパク質が７ＢＤ−３３−１１Ａで免疫沈降したＭＤＡ−ＭＢ−２３１のウエスタンブロット（パネルＢ）。レーンＡアイソタイプ制御免疫沈殿タンパク質（レーンＢ）：７ＢＤ−３３−１１Ａは、タンパク質とレーンＴＭを免疫沈降した：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜タンパク質となりなさい。角箱は、ウエスタンブロットでＳＤＳ−ＰＡＧＥとレーンＴＭでレーンＢから同じ帯域を概説する。分子量マーカーは、左で示される。
【図５】サーチ・サマリー・テーブル。
【図６】ＭＡＳＣＯＴサーチ・サマリー・テーブル。
【図７ａ】タンパク質のウエスタンブロットは、７ＢＤ−３３−１１Ａ（パネルＡ）、抗ＣＤ６３（ＲＦＡＣ４のクローン作成、パネルＢ）、ＩｇＧ２ａアイソタイプ制御（パネルＣ）とＩｇＧｌアイソタイプ対照（パネルＤ）と深く探った。レーンＡ：全ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜タンパク質；レーンＢ：７ＢＤ−３３−１１Ａは、タンパク質を免疫沈降した；レーンＣ：抗ＣＤ６３（ＲＦＡＣ４）は、タンパク質（レーンＤ）を免疫沈降した：ＩｇＧ２ａアイソタイプ制御免疫沈殿タンパク質とレーンＥ：ＩｇＧｌアイソタイプ制御は、タンパク質を免疫沈降した。分子量マーカーは、左で示される。
【図７ｂ】タンパク質のウエスタンブロットは、７ＢＤ−３３−１１Ａ（パネルＡ）、抗ＣＤ６３（Ｈ５Ｃ６のクローンを作成、パネル Ｂ）、ＩｇＧ２ａアイソタイプ制御（パネルＣ）とＩｇＧｌアイソタイプ対照（パネルＤ）と深く探った。レーンＡ：全ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜タンパク質；レーンＢ：７ＢＤ−３３−１１Ａは、タンパク質を免疫沈降した；レーンＣ：抗ＣＤ６３（Ｈ５Ｃ６）は、タンパク質（レーンＤ）を免疫沈降した：ＩｇＧ２ａアイソタイプ制御免疫沈殿タンパク質とレーンＥ：ＩｇＧｌアイソタイプ制御は、タンパク質を免疫沈降した。分子量マーカーは、左で示される。
【図８】タンパク質のウエスタンブロットは、７ＢＤ−３３−１１Ａ（パネルＡ）、抗ＣＤ６３（ＲＦＡＣ４のクローンを作成、パネル Ｂ）、抗ＣＤ６３（Ｈ５Ｃ６のクローンを作成、パネル Ｃ）、ＩｇＧ２ａアイソタイプ制御（パネルＤ）とＩｇＧｌアイソタイプ対照（パネルＥ）と深く探った。レーン１−５は、７ＢＤ−３３−１１Ａ免疫沈殿タンパク質とレインズ６−１０がＩｇＧ２ａアイソタイプ制御免疫沈殿タンパク質を含むことを含む。レーン１と６：ＮａＣｌでない、レインズ２と７：１５０ｎｉＭ ＮａＣｌ、レインズ３と８：５００ｍＭのＮａＣｌ、レインズ４と９：２０００ｍＭのＮａＣｌとレインズ５と１０：ＲＩＰＡバッファ。
【図９】タンパク質のウエスタンブロットは、７ＢＤ−３３−１１Ａ（パネルＡ）、抗ＣＤ６３（ＲＦＡＣ４のクローンを作成、パネル Ｂ）、抗ＣＤ６３（Ｈ５Ｃ６のクローンを作成、パネル Ｃ）、ＩｇＧ２ａアイソタイプ制御（パネルＤ）とクーマシーＣｏｌｌｏｉｄａｌ Ｂｌｕｅタンパク質染色液（パネルＥ）で深く探った。レーン１：非によって誘発されたベクター（レーン２）単独：非によって誘発された一般システムズ理論−ＥＣｌ（レーン３）：非−は、一般システムズ理論−ＥＣ２（レーン４）を誘発した：誘発されたベクター（レーン５）単独：誘発された一般システムズ理論−ＥＣｌとレーン６：誘発された一般システムズ理論−ＥＣ２。分子量マーカーは、左で示される。
【図１０】７ＢＤ−３３−１１Ａ、アイソタイプ対照と抗ＥＧＦＲの代表的なＦＡＣＳヒストグラムは、いくつかの癌細胞系と非癌細胞に対して指示した。
【図１１】正常な人体組織配列から大腸の組織部分の上で７ＢＤ−３３−１１Ａ（Ａ）、アイソタイプ負の制御（Ｂ）、抗ＣＤ６３（ＲＦ ＡＣ４）抗体または抗ＣＤ６３（Ｈ５Ｃ６）抗体（Ｄ）で得られる製本見本を示している代表的な顕微鏡写真器。７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器、ＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ６は、粘膜固有層でマクロファージとリンパ球のためにポジティブ染色法を示した。ＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ６も、粘膜のｅｐｉｔｈｅｌｉｅｕｍのために強い染色を示した。拡大は、２００Ｘである。
【図１２】ヒト乳癌組織配列から浸潤性の腺管癌の組織部分の上で７ＢＤ−３３−１１Ａ（Ａ）、アイソタイプ負の制御（Ｂ）、抗ＣＤ６３（ＲＦＡＣ４）抗体または抗ＣＤ６３（Ｈ５Ｃ６）抗体（Ｄ）で得られる製本見本を示している代表的な顕微鏡写真器。７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器は、ＲＦＡＣ４かＨ５Ｃ６抗体に割に腫瘍細胞のためにより弱いポジティブ染色法を示した。拡大は、２００Ｘである。
【図１３】ヒト乳癌組織配列から浸潤性の腺管癌の組織部分の上で７ＢＤ−３３−１１Ａ（Ａ）または抗Ｈｅｒ２（ｃ−ｅｒｂＢ−２）抗体（Ｂ）で得られる製本見本を示している代表的な顕微鏡写真器。７ＢＤ−３３−１アイソレーション増幅器は、ａｎｔｉ−に割に腫瘍細胞のためにネガティブ染色を示したＨｅｒ２抗体を染色している強い良い面を示した。拡大は、２００Ｘである。
【図１４】ヒトの前立腺癌組織配列から前立腺アデニカルシノーマ （Ａ）または通常の前立腺（Ｂ）の組織部分の上で７ＢＤ−３３−１１Ａで得られる製本見本を示している代表的な顕微鏡写真器。７ＢＤ−３３−１１Ａは、腺癌組織切片で腫瘍細胞のために強い陽性の膜状の染色を示した。７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器は、通常の前立腺の組織切片で腺上皮の膜状で細胞質の染色を示した。拡大は、２００Ｘである。
【図１５】、７ＢＤ−３３−１１Ａの効果または用量反応の予防ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌モデルの腫瘍成長に関するアイソタイプ制御。破線は、抗体が投与された期間を示す。データ点は、平均の＋／−ＳＥＭを表す。
【図１６】７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器による腫瘍を含んだマウス後処理または用量反応の予防的ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植検査のアイソタイプ制御抗体の残存。
【図１７】確立したＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌モデルの腫瘍成長に関する７ＢＤ−３３−１１Ａ、シスプラチン、７ＢＤ−３３−１１Ａ ＋ シスプラチンまたはバッファ制御の効果。破線は、抗体が投与された期間を示す。データ点は、平均の＋／−ＳＥＭを表す。
【図１８】確立したＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌モデルの体重の７ＢＤ−３３−１１Ａ、シスプラチン、７ＢＤ−３３−１１Ａ ＋ シスプラチンまたはバッファ制御の効果。
【図１９】確立したＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌モデルの腫瘍成長に関する７ＢＤ−３３−１１Ａ、シスプラチン、７ＢＤ−３３−１１Ａ ＋ シスプラチンまたはバッファ制御の効果。破線は、抗体／シスプラチンが投与された期間を示す。データ点は、平均の＋／−ＳＥＭを表す。
【図２０】確立したＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌モデルの体重の７ＢＤ−３３−１１Ａ、シスプラチン、７ＢＤ−３３−１１Ａ ＋ シスプラチンまたはバッファ制御の効果。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に腫瘍細胞の細胞毒性の調停に、この発明は、診断とガン疾患の治療に関するものである；そして、特に癌疾患修飾抗体（ＣＤＭＡＢ）の使用に対するほとんど（任意に、細胞毒性応答を始めるための手段として、一つ以上の化学療法剤と結合する）。更なる発明は結合アッセイに関するものである。そして、それは本発明のＣＤＭＡＢを利用する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＤ６３はｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎ家族のＴｙｐｅ ＩＩＩ膜タンパク質である。そして、メンバーがそうである２０の電流は４つの膜貫通の部分の存在によって誰のものを特徴づけた。いくつかの群は、活性化血小板、顆粒球と黒色腫細胞の細胞全体の標本まで上げられる抗体を使用して、それぞれにＣＤ６３を確認した。それらの同族の糖蛋白抗原のそれぞれの相補ＤＮＡのクローニングは、異なる抗原が全く同一の分子であった認識に導いた。Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｔｙｐｉｎｇ（１９９６）のＳｉｘｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｓｈｏｐは、その後これらの抗体をＣＤ６３抗体に分類した。１９９６のＷｏｒｋｓｈｏｐの前に、ＣＤ６３は複数の名前（黒色腫１抗原、眼メラノーマ結合抗原、黒色腫関連する抗原ＭＥ４９１、リソソーム関連の膜糖タンパク質３、グラヌロフィジン、メラノーマ結合抗原ＭＬＡｌ）に知られていた。そして、それは時々、その部分性質と識別に導いた抗体に関連があった。このように、抗原ＭＥ４９１（ＭＡｂ ＭＥ４９１）、ニューロ腺抗原（ＭＡｂｓ ＬＳ５９、ＬＳ６２、ＬＳ７６、ＬＳＩ１３、ＬＳ１４０とＬＳ１５２）、Ｐｌｔｇｐ４０（ＭＡｂｓ Ｈ５Ｃ６、Ｈ４Ｆ８とＨ５Ｄ２）、ヒト骨髄間質細胞抗原（ＭＡｂ １２Ｆｌ２）、ｏｓｔｅｏｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒに特異的なマーカー（ＭＡｂ ＨＯＰ−２６）とｉｎｔｅｇｒｉｎ−がタンパク質（ＭＡｂ ６Ｈｌ）を結合したので、ＣＤ６３も示された。交差するとわかった他の抗体は、ＣＤ６３がそうであったヒトで反応する８−１Ｈ、８−２Ａ（ＭＥ４９１による交差反応性）、ＮＫＩ／Ｃ−３、そして、ＮＫＩ／ｂｌａｃｋ−１３ （Ｖａｎｎｅｇｏｏｒ ａｎｄ Ｒｕｍｋｅ， １９８６；Ｄｅｍｅｔｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， １９９２；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９２）である。
【０００３】
ＣＤ６３はまず最初に、ＭＡｂ ＭＥ４９１を使用している黒色腫ｃＤＮＡライブラリーからクローンをつくられた。そして、多数の抗体の一つがヒト黒色腫細胞の標本に対して増えた。ＭＡｂ ＭＥ４９１の反応性がヒト黒色腫生検の検査で黒色腫進行と反対に相関しているように見えることを示された。ＭＥ４９１抗体の反応性は、通常のメラノサイト（黒色腫進行（異形成母斑と肥大成長は、（ＲＧＰ）腫瘍を段階的に実行する）で、減少する初期のまたは垂直増殖相（ＶＧＰ）の、そして、転移性腫瘍のそれらのようなより進行した黒色腫腫瘍でなしでさえ高等）で低かった。
【０００４】
ＣＤ６３は、見つかりもして、５３ｋＤａ、活性化に依存する血小板膜を見つけたＭＡｂ ２．２８（活性化血小板に対して上がる）を使用しているヒト血小板でも、部分的に特徴づけられた糖蛋白。この分子は、刺激されていない血小板で内部顆粒の膜と関係してもいた。同じ検査において、ＭＡｂ ２．２８も巨核球と内皮細胞で内部顆粒にラベルをつけた。ここで、それは酵素カテプシンＤ（リソソームの区画の既知のマーカー）に抗体で共存した。抗体クラスター形成と表現クローニングで追跡調査、この抗体によって認められる抗原の識別に導いた、ＣＤ６３、そして、更に確立されたそれが区画に特異的なマーカーＬＡＭＰ−ＩとＬＡＭＰ−２で共存したリソソームの区画でその存在。この分子のクローニングは、それをＣＤ６３と確認して、テトラスパニン・ファミリーへのその加入を許した。
【０００５】
ＣＤ６３の表示は、多くの異なる組織と細胞型で発見されていた。細胞レベルで、それが原形質膜で、更に、細胞内遅いエンドソームの多孔質構造で関連するとわかった。ＣＤ６３の細胞内ストアの流動化によるさらなる表面表現に、特定のケースでは、細胞活性化はリードした。Ｂリンパ球のＭＨＣクラスＩＩで、特にエンドソームにおいて、ＭＨＣクラスＩＩ複合体を表面に輸出することに関係するｅｘｏｓｏｍｅｓで、そして、分泌された小疱で、ＣＤ６３が共存するともわかって、物理的に結びつきもする。ＣＤ６３がテトラスパニン・ファミリー、例えばＣＤ９、ＣＤ８１の他のメンバーと交流するとわかった。そして、ＣＤＩｌ（インテグリン鎖αＭ，Ｌ，ｘ）が、Ｂ−とＴ−リンパ球、好中球、乳癌と黒色腫細胞を含む種々の細胞型で、５つのＣＤ１８（インテグリン鎖β２）、ＣＤ４９ｃ（ＶＬＡ−３またはインテグリン鎖Ｏｔ３）、ＣＤ４９ｄ（インテグリン鎖α４）、ＣＤ４９ｆ（ＶＬＡ−６またはインテグリン鎖α６）とＣＤ２９（インテグリン鎖Ｐ１）であった。
【０００６】
癌のＣＤ６３の役割は、不明だった。ＣＤ６３がまず最初に多様なイベント（例えば血小板と顆粒球活性化）、ＭＨＣクラスＩＩに依存する抗原提示、インテグリンに依存する細胞接着と自動運動性に関係しているいくつかの独立群と癌の特定の種類の腫瘍発達によって発見されたにもかかわらず、その機能はまだ完全に説明されていない。現在の証拠がその役割の種々の細胞生理的イベントを支持する場合であっても、これらの機能が互いに独立しているかどうか、または、ＣＤ６３が含まれる下にある一般の細胞機序があるかどうか明らかでない。
【０００７】
いくつかの群は、ＣＤ６３の間の関係と腫瘍（特に黒色腫）の特定の種類の進行を調査した。多数の他の抗ＣＤ６３モノクローナル抗体は、Ｍａｂ ＭＥ４９１に加えて、進行のさまざまな段階で腫瘍患者から得られる癌試料の免疫組織化学的な（ＩＨＣ）染色のために開発された。減少した染色（ＣＤ６３の最も見込みのある反射している減少した表示として著者によって解釈される）が先進の進行で、そして、腫瘍の転移性の特徴で相互関係のあると述べられた。より最近の調査は、また、テトラスパニン・タンパク質ファミリー（ＣＤ６３を含む）の数人のメンバーといくつかの乳癌から派生した細胞系の生体外感染度の見た目の減少した表現レベル（メッセンジャーＲＮＡの定量化の後で）との間の有意の相関を述べた。エストロゲン剥奪を受ける洗練された乳癌細胞で、ディファレンシャルディスプレイで、もう一つの検査は、ＣＤ６３を確認した。これは、ＣＤ６３表現が調整されるステロイドホルモンでありえる、そして、変えられたＣＤ６３多量および／または機能が胸部腫瘍発達を伴いもするかもしれないことを示した。
【０００８】
対照的に、抗ＣＤ６３モノクローナル抗体ＭＡｂ嗜眠状態−５．０１による仕事は、その反応性エピトープが異なる正常組織で不定に表されることを明らかにした。この抗体がＣＤ６３を認識するとわかったにもかかわらず、それは転移性黒色腫（ＭＡｂ ＭＥ４９１と異なった）を含む初期でより多くの増悪期黒色腫を区別しなかった。そして、それはＣＤ６３抗原がこれらのより進行した腫瘍で存在した、しかし、そのエピトープの一部が異なる段階で腫瘍から細胞でマスキングされる可能性があったことを示唆した。これは中心的なＣＤ６３ポリペプチドの、または他の分子によるＣＤ６３の相互作用に対する変えられた翻訳後修飾によったかもしれない。そして、それは抗体認識と結合のために特異的なエピトープの有効性に影響を及ぼしたかもしれない。これらの結果は、抗ＣＤ６３ ＭＡｂ ＮＫＩ−Ｃ３でとても染色される、診察（ケイ素とハーシー（１９９３）によって解説される）を支持した進行（例えば原発性、放射増殖相、垂直増殖相と転移性黒色腫）の異なる段階の黒色腫からの組織切片を区別した。他の検査で‖（小足立は、ａｌ．（１９９８）である；小ホワンはａｌ．（１９９８）である）胸部からの、そして、定量的ＰＣＲ、そこの２つのテトラスパニン・ファミリー（ＣＤ９とＣＤ８２）のためのそれらの表現レベルと腫瘍発達との間の有意の相関であった現われたと患者予後によって、非小細胞肺癌からのメッセンジャーＲＮＡの分析、その表現が全ての試料の点で同様だったという点で、そのような相互関係はＣＤ６３のために発見されなかった。これら、明らかに相克、結果の結果として、癌でＣＤ６３の関連を決定的に示す、強くて一貫したデータの不足が、ある。
【０００９】
現在まで、極めて少ないインビボの研究は、ＣＤ６３の関連とこの分子の最終的な腫瘍抑制器機能を確立することを試みた。本研究のうちの１つにおいて、増加した生存期間までにと同様に減少した腫瘍サイズと転移性の可能性によって示されるように、親の非ＣＤ６３過剰発現している細胞の反応と比較してとき、ヒトのＣＤ６３過剰発現しているＨ−ラス癌遺伝子変わるＮＩＨ−３Ｔ３細胞（皮下に、そして、腹腔内に胸腺欠損のマウスに噴射される）は減少した悪質な／腫瘍化の表現型を現した。これは、悪性変換細胞のヒトＣＤ６３の存在がそれらの悪質な挙動を抑制するかもしれないことを示唆した。最近より多く（ヒトＣＤ６３を表している遺伝子導入マウス・モデルによる仕事）は、そして、ＣＤ６３に対する耐性を誘導するために開発されて、注入されたヒトＣＤ６３−ＭＨＣクラスＩ（Ｈ−２Ｋ）の腫瘍成長がネズミのメラノーマ細胞ラインを同時形質移入したことが阻害されることができることを示した、そして、ワクシニアウイルスに溶解するヒトＣＤ６３による免疫処置に応じて、生存は増加した。著者によって治療効果が従属するＴリンパ球であることを示唆された、そして、腫瘍発育阻止が動物がＣＤ６３−ＭＨＣクラスＩを注射されたときｃｏ−が細胞を形質移入して、細胞系をＣＤ６３−ｏｎｌｙなもので形質移入しなかったことを思いつくだけだった時から、その内因性抗ＣＤ６３抗体はこの保護作用に関係しているように見えなかった。この解釈は、野生型動物（浄化されたヒトＣＤ６３でプレ免疫にして、抗ヒトのＣＤ６３抗体を開発したことが示される）において、保護作用が腫瘍細胞の発達に対してなかったという事実で支えられた。仕事はＫＭ３細胞系を使用していてラドフォードその他によって（１９９５）を記載した。そして、まず最初に、有意差がさまざまな形質移入されて非形質移入の細胞系の生体外成長速度の間になかったにもかかわらず、皮内に胸腺欠損のマウスに噴射されるときラット血統（ヒトＣＤ６３で形質移入される）であることがこのタンパク質の表現度が、親の非−形質移入されたＫＭ３細胞を使用しているのを見られるそれと関連して、これらの細胞の成長とｍｅｔａｓｔａｓｔｉｃな可能性を減少させることを示唆したので、ヒト起源であると思われたが、後で特徴づけられた。これらの診察は、ＣＤ６３の潜在的効果と腫瘍細胞のインビボで生体外成長速度に影響を及ぼすために知られている他の癌抑制遺伝子のそれを区別した。さらにまた、抗ＣＤ６３モノクローナル抗体ＭＥ４９１（それが生体外分析（ラドフォードその他、１９９７）でそれらのランダムな自動運動性を減少させることによって同じ細胞の上に機能効果を持つとわかった）の追加は、それらの生体外成長速度に影響を与えなかった。
【００１０】
本研究もＣＤ６３が細胞外基質（ＥＣＭ）−由来の化学誘引物質（例えばラミニン、フィブロネクチン、コラーゲンとビトロネクチン）に反応した遊走を促進する可能性があるという、そして、この効果がβｐｔｙｐｅインテグリンの機能的な関係によって媒介となられる可能性があるという診察を記載した、しかし、インテグリンに対する抗体はこれらの結果を妨害することができなかった。しかしながら、ビトロネクチンによって媒介される情報伝達（インテグリンαｖβｓのための既知の配位子）の役割と他のＥＣＭ部品（例えばＣＤ６３トランスフェクション細胞のフィブロネクチン、ラミニンとコラーゲン）によって媒介となられる情報伝達のそれとの間の拮抗する効果であるように見えた。これは、特異的な状況の下で、ＥＣＭ成分の面前で、ＣＤ６３の表示が減少した遊走に導く可能性がある、そして、これが癒着と自動運動性の間の微細な釣合いに依存している可能性があることを示唆した。もう一つの検査において、もう一つの抗ＣＤ６３モノクローナル抗体（ＭＡｂ ２．２８）が、菌体群の非常により少ない分数だけの上で以外、類似の効果を進める間、そして、非常によりかなりの総計で加えられる場合にだけ、抗ＣＤ６３モノクローナル抗体（ＭＡｂ ７１０Ｆ）はピロメリト酸治療をうけているＨＬ−６０細胞の癒着と伝播を強化した。これらの成績は、ＣＤ６３に対する多くの抗体が開発されたにもかかわらず、それらの機能効果が全く異なることがありえることを示した。
【００１１】
テトラスパンニンは、細胞増殖に関係してもいる可能性がある。オーレンその他は（１９９０）、リンパ腫細胞系の上で、ＣＤ８１（ＴＡＰＡ−Ｉ）を認識するネズミのＭＡｂ ５Ａ６の抗増殖効果を記載した。もう一つの検査において、抗体によるヒトＴ−リンパ球のＣＤ３７の結合は、ＣＤ３７によって誘発された増殖を妨げた。最近では、ＣＤ３７（ＣＤ３７ノックアウト）の表示に欠けた動物モデルでの検査で、この動物からのＴリンパ球がコンカナバリンＡ活性化とＣＤ３／Ｔ細胞受容体約束に反応して野生型動物からそれらと比較して高増殖性であることが分かった。細胞増殖と増殖での機能的な役割がテトラスパニン・ファミリーの共通機能であるかもしれないことを従って、提案された。
【００１２】
胚芽腫と肝細胞性カルシノーマ細胞による最近の研究で、抗ＣＤ８１モノクローナル抗体によるこれらの細胞の関わりがＥｒｋ／ＭＡＰキナーゼ経路の活性化に導くことが分かった。このシグナル伝達経路は、細胞増殖と増殖イベントと関係していることが示された。平行した仕事において、ＣＤ８１が示したヒトを過剰発現している形質移入された細胞系は、ふざけて形質移入された対照細胞と関連して増殖を増加させた。従って、細胞増殖と関連するイベントでは、そして、細胞接着／自動運動性で、利用できる証拠は、一般のｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎｓの、そして、ＣＤ６３特にの役割を示していた。両者とも腫瘍発達と転移で中心的な役割を演ずるにつれて、細胞イベントのこれらの２つのタイプは現在強度の調査の標的である。
【００１３】
これまで、抗ＣＤ６３抗体または特にＣＤ６３を表している細胞を目標とした他の試薬は、報告されなくて、生体外ものの上で、そして、腫瘍細胞の、更に、腫瘍細胞の発達の動物モデルの生存期間のインビボの増殖特性の上で同時の影響を及ぼすことが示されなかった。アミノ酸配列決定と分析でテトラスパニンと他のタンパク質族の間で相同性が現れなかった、または、どんな前に特徴づけられた機能モジュールででも、そして、それはどんな前に既知の酵素活性でも提案しなかった。その結果、シグナル伝達経路の変調でこの一群のタンパク質の役割を調査することは、非常に難しかった。しかしながら、細胞生理の変化に導いた、そして、シグナル伝達経路の変調に本質的に依存していたテトラスパニン−特異試薬を使用して発生する証拠は、テトラスパニンがシグナル伝達性質を持つことを示唆する。ＣＤ６３は、物理的に、そして、機能的に、それ自身二次伝達物質信号の生成に関係するいずれの酵素でもある分子数と関連することが示されたか、物理的におよび／または機能的に、そのような酵素と関連する。
【００１４】
内皮細胞（それは炎症反応の最初のステップのうちの１つである）でヒト好中球の相互作用を制御している機構を切り裂くようになっている実験で、いくつかの抗ＣＤ６３モノクローナル抗体（ＡＨＮ−１６、ＡＨＮ−１６．１、ＡＨＮ−１６．２、ＡＨＮ−１６．３とＡＨＮ−１６−５）による好中球の前処理が培養内皮細胞層にそれらの癒着を促進することが分かった。さらに、この効果はカルシウムイオン（Ｃａ２＋）の存在に強く依存していた、多くの細胞内シグナル伝達経路の周知の調節因子、そして、細胞が刺激的な抗体にさらされた特異的な期間に制限された。抗体へのより長い暴露の後、内皮細胞に対する好中球の癒着は、Ｃａ２＋の後の追加に非感受性に、従って、力を関係させているようになって、時間的に（一過性の）イベントを調整した。加えて、ＣＤ６３が物理的にＣＤＩｌ／ＣＤ１８タンパク質複合体と相互に作用するとわかった、そして、特にこの複合体を目標とした試薬は修飾的な信号の媒介となった。ＣＤ６３が物理的に関係しているともわかった本研究において、またはパートである、酵素チロシンキナーゼＬｃｋを含んだ複合体とＨｃｋ。これらの酵素は特異的な表面受容体の活性化に応じて細胞内調節シグナルの媒介となることにおいて中心的な役割を果たすタンパク質の種類のメンバーであって、細胞に特有の生理的変化を結果として〜になるシグナル伝達経路の滝の一部である。もう一つの検査は、モノクローナル抗体によるテトラスパニン（ＣＤ６３を含む）の共同結合がコラーゲン基質にＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞の癒着によって誘発された酵素焦点性癒着キナーゼ（品目無差別で）のリン酸化反応または活性を強化することができることを示唆した。これは、インテグリンによって媒介されるチロシンキナーゼ・シグナル伝達経路の変調で、ＣＤ６３（そして、他のテトラスパニン・ファミリーの）の直接の参加を示していた。７１０Ｆ、抗ＣＤ６３モノクローナル抗体ＭＡｂによって表面ＣＤ６３の存在と結合と機能的に交わる可能性がある他のシグナル伝達経路は、酵素プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）（細胞内シグナル伝達経路のもう一つの有名な調節因子）によるリン酸化反応の変調に依存しているそれらであるように見える。この文脈において、ＰＫＣの時間的関係が決定的に示されなかったにもかかわらず、癒着の、そして、ＭＡｂによる骨髄細胞系ＨＬ−６０の形態学的変化の強化は７１０Ｆ、ホルボールミリステートアセテート（ピロメリト酸）で細胞の前処理に依存していた。しかしながら、独立群によるあと片付け工事は、分子Ｒｏ３１−８２２０（この酵素の特異的阻害剤）がピロメリト酸の結果を妨害した時から、ピロメリト酸によって誘発されたＨＬ−６０分化がＰＫＣ−活性扶養家族であったことを証明した。
【００１５】
ＣＤ６３と他のテトラスパニン・ファミリーの関連を支援している更なる証拠は、シグナル伝達経路で、チロシン・ホスファターゼ活性で、直接的にまたは超分子複合体の一部として、ＣＤ６３（更に、ＣＤ５３）分子の間の物理的な関係を記載した仕事に起因した。この研究において、抗ＣＤ６３抗体で分離される免疫沈降物複合体はチロシン・ホスファターゼ活性を伴うことが示された、しかし、ＣＤ５３（それはチロシン・ホスファターゼＣＤ４５を一体にすることが示された）のためにとは異なり、ＣＤ６３関連のホスファターゼを特定することは可能でなかった。最近では、テトラスパニン・ファミリーの数人のメンバーが、ＩＩ型ホスファチジルイノシトール４−キナーゼ（ＩＩ型歯周指数４Ｋ）（Ｂｅｒｄｉｔｃｈｅｖｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， １９９７）を伴うともわかった。それがＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ１５１とＡ１５／ＴＡＬＬＡのために確認されるだけだった時から、この相互作用は非常にはっきりしているように見えた、そして、それはＣＤ３７、ＣＤ５２、ＣＤ８２またはＮＡＧ−２で起こるのを見られなかった。加えて、各々のＰＩ−４キナーゼを含有する複合体が一つのテトラスパニン・ファミリーに限られていた時から、テトラスパニン・ファミリーとＰＩ−４Ｋの間の関係は排他的だった。ＣＤ６３−ＰＩ−４キナーゼ複合体は、特に、ほぼ完全に、脂質いかだのような領域（他のテトラスパニン・メンバーと形成されるそれらと異なった）で、細胞内区画で見つけられた。この診察はこのＣＤ６３分数（ＰＩ−４キナーゼと対話するとわかる）がホスホイノシチド生合成経路に関連があるか、従属する特異的な細胞内イベント（Ｃｌａａｓ， Ｃ， ｅｔ ａｌ．， ２００１））に関与しているかもしれなかったことを示唆した。そして、それは、二次伝達物質分子（Ｍａｒｔｉｎ， Ｔ．， １９９８）としてのそれらの機能に加えて、膜輸送（エンドサイトーシスとエキソサイトーシス）の調節へのそれらの関与で有名で細胞骨格再編成である。
【００１６】
調節装置としてまたはこれらの酵素の活性から下流の効果器分子として、ＣＤ６３がこれまで、直接伴うとわかったシグナル伝達経路の調節の全ての酵素の直接で重要な参加は、シグナル伝達経路の変調で、ＣＤ６３の関連を支援して、更なる証拠を提供した。
【００１７】
腫瘍発達に対する導出がしばしば非常に難しくて複合の努力である機構の解明は、明らかに矛盾している診察と、その結果、それによって診察がうまく効果的治療に変換するその人々に珍しいと記録した。腫瘍発達と転移で、そして、シグナル伝達機構でＣＤ６３の関連について現在知られていることを鑑みて、腫瘍細胞で、その機能が変えられる可能性があるかもしれない。
【００１８】
細胞障害能による抗原特異性の試薬の発現は腫瘍細胞の上で生じて、認められた抗原（ｓ）を表している細胞を結合して、そして、これらの試薬が正常な菌体群の上で重要な有害作用なしで腫瘍細胞の発達（進行と転移）を阻害するように、単独で、あるいは、他の分子と関連して、細胞でインビボの生理活性を持つ、治療的な可能性として非常に有益である、そして、または診断ツール。
【００１９】
先行特許：
【００２０】
ＵＳ０５２９６３４８は、細胞代謝に対する抗転写性のおよび／または反複製的な効果を内在化していて、確認しているモノクローナル抗体のために持っている癌細胞表面抗原に特有のモノクローナル抗体を選択する方法を教える。例証として、ＭＥ４９１抗体は、Ｗ９、ＷＭ３５、ＷＭ９８３黒色腫細胞とＳＷ９４８で結腸直腸カルシノーマ細胞を内在化することが示された。加えて、ＭＥ４９１抗体は、ＳＷ９４８細胞で転写と細胞増殖を減少させることが示された。特許出願ＵＳ２００３０２１１４９８Ａ１（そして、その関連したアプリケーション：ＷＯ０１７５１７７Ａ３、ＷＯ０１７５１７７Ａ２、ＡＵ０１５３１４０Ａ５）、ＣＤ６３抗原を含む群の中から選択される卵巣腫瘍標識遺伝子によってコードされる卵巣腫瘍マーカー・ポリペプチドを結合する抗体で卵巣腫瘍の増加または転移を阻害する方法を主張しなさい。卵巣癌を使用している遺伝子発現の連続分析は、候補としてＣＤ６３の識別に導く卵巣腫瘍標識遺伝子を特定するために行われた。特許出願ＷＯ０２０５５５５１Ａ１（そして、その関連したアプリケーションＣＮ１３６４８０３Ａ）は、新しいポリペプチド−ヒトＣＤ６３抗原５６．８７を主張する。特許出願ＣＮ１３２６９６２Ａは、新しいポリペプチド−ヒトＣＤ６３抗原１４．６３を主張する。特許出願ＣＮ１３２６９５１Ａは、新しいポリペプチド−ヒトＣＤ６３抗原１５．０７を主張する。特許出願ＣＮ１３５１０５４Ａは、新しいポリペプチド−ヒトＣＤ６３抗原１１．１１を主張する。これらの特許と特許出願は、ＣＤ６３抗原と抗体を特定するが、本発明の単離モノクローナル抗体または本発明の単離モノクローナル抗体の有用性を開示するのに失敗する。
【特許文献１】ＵＳ０５２９６３４８
【特許文献２】ＵＳ２００３０２１１４９８Ａ１
【特許文献３】ＷＯ０１７５１７７Ａ３
【特許文献４】ＷＯ０１７５１７７Ａ２
【特許文献５】ＡＵ０１５３１４０Ａ５
【特許文献６】ＷＯ０２０５５５５１Ａ１
【特許文献７】ＣＮ１３６４８０３Ａ
【特許文献８】ＣＮ１３２６９６２Ａ
【特許文献９】ＣＮ１３２６９５１Ａ
【発明の開示】
【００２１】
即時の発明者は以前米国特許６，１８０，３５７を与えられた。そして、個々にカスタマイズされた抗癌抗体を選択する方法に導かれる「Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｉｚｅｄ Ｐａｔｉｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」と名付けられた。そして、それは癌疾患の処置に有用である。この文献では「抗体」と「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）が同義的に使われる可能性があって、ハイブリドーマ（例えばマウスまたはヒト）によって生産される完全な免疫グロブリンを参照する可能性がある期間、のために、免疫複合体と（適当であるように）免疫グロブリンフラグメントと組換え型のタンパク質は前記免疫グロブリンから生じた（キメラでヒト化の免疫グロブリン、Ｆ（ａｂ’）およびＦ（ａｂ’）２フラグメント、単鎖の抗体、組換え型の可変部領域（Ｆｖ）、ｓ、融合タンパク質）で例えばある。それは若干のアミノ酸配列が構造またはタンパク質の機能に対する重要な効果なしでポリペプチドで多彩でありえる芸術でよく認識される。抗体の分子内転位において、主鎖領域の核のまたはアミノ酸シーケンスの変形は、通常、許容的でありえる。これらは含む、制限されるために、置換（保存的置換は好まれる）、削除または追加。さらにまた、本発明のＣＤＭＡＢで標準の化学療法（例えば放射性核種）を活用させることはこの発明の範囲の中でである。そして、それによって前記化学療法剤の使用を集中させる。ＣＤＭＡＢは毒素、細胞毒性部位、酵素（例えばビオチン複合酵素）または血液原細胞に抱合型でもありえる。そして、それによって抗体複合体を形成する。
【００２２】
『モノクローナル抗体を修正しているガン疾患のためにコードするハイブリドーマ細胞系を分離することの３５７の特許で教えられるにつれて、このアプリケーションは方法を産生性の患者の特異的な抗癌抗体のために利用する。これらの抗体は特に１つの腫瘍に作られることができて、このように癌治療の専用化を可能にすることができる。このアプリケーションの前後関係の範囲内で、細胞殺害（細胞障害能）か細胞増殖を（細胞分裂停止）性質を阻害させている抗癌抗体は、今後細胞障害能と称される。これらの抗体が癌の病期分類と診断の補助として使われることができて、腫瘍転移を処置するのに用いられることができる。
【００２３】
個別的抗癌性の処置の見込みは、患者が管理される方法の変化をもたらす。ありそうな臨床シナリオは、腫瘍試料が提示時に得られて、積み上がっているということである。この試料から、腫瘍は癌疾患修飾抗体より先に存在するパネルから型でありえる。患者は従来は、示される、しかし、利用できる抗体は更に患者を示す際に有用でありえる。患者は既存の抗体を用いたすぐ治療を受けることができるおよび／または、腫瘍に特有の抗体のパネルはこの中に概説される方法を用いてまたはこの中のスクリーニング法と同時のライブラリが開示したファージディスプレイを用いることにより生産されることができる。他の腫瘍が処置されているものと同じエピトープの一部を運ぶことができるという可能性がある時から、抗体が生成したＡＵは抗癌抗体のライブラリに加えられる。この方法によって生産される抗体は、これらの抗体と結合する癌があるどんな患者数ででもガン疾患を処置するために役立つ可能性がある。
【００２４】
実質的にＵＳ ６，１８０，３５７のプロセスを用いて、そして、Ｓ．Ｎ． １０／３４８，２３１で開示されるように、マウス・モノクローナル抗体７ＢＤ−３３−１１Ａは患者の乳房腫瘍生検から細胞でマウスの免疫化の後で得られた。７ＢＤ−３３−１アイソレーション増幅器抗原は、異なる組織起源から広範囲にわたるヒト細胞系の細胞表面の上で表された。乳癌細胞系ＭＣＦ−７と前立腺癌細胞系ＰＣ−３は、生体外で７ＢＤ−３３−１１Ａの細胞毒性に影響されやすかった。
【００２５】
胸部に対する７ＢＤ−３３−１１Ａ細胞毒性の結果と培養の前立腺癌細胞は、生体内に（Ｓ．Ｎ． １０／３４８，２３１とＳ．Ｎ． １０／６０３，００６で開示されるように）これらの癌徴候の方へその抗腫瘍活性によって更に延長された。Ｐｒｅ¬臨床異種移植腫瘍モデルは、治療有効性の有効な予言者と考えられる。
【００２６】
概説されて、Ｓ．Ｎ． １０／３４８，２８４とＳ．Ｎ． １０／６０３，００６で記載されるにつれて、７ＢＤ−３３−１アイソレーション増幅器はヒト乳癌の予防インビボのモデルで腫瘍成長と全身腫瘍組織量を予防した。モニタリングは、過去３００日後処理を続けた。７ＢＤ−３３−１アイソレーション増幅器は腫瘍を決して呈しなかった、そして、７ＢＤ−３３−１１Ａ投与群の８７．５パーセントは９ヵ月以上のポスト着床でまだ生存していた。逆に言えば、アイソタイプ対照群は、日７２（２３日後処理）までに、１００パーセントの死亡率を持った。従って、７ＢＤ−３３−１１Ａは生存を強化して、乳癌モデルで腫瘍成長（このように遅延疾患進行）を予防した。
【００２７】
また、概説されて、Ｓ．Ｎ． １０／３４８，２８４とＳ．Ｎ． １０／６０３，００６で記載されるにつれて、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器はヒト乳癌の確立したインビボのモデルで有意に腫瘍成長と減少した全身腫瘍組織量を抑制した。日８０（２３日ｐｏｓｔ−処置）までに、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器治療をうけているマウスは、アイソタイプ対照群（ｐ＝０．００１）に、割に８３パーセントの低い平均の腫瘍容積を持った。かなりの抗体有効性として生存を使用して、７ＢＤ−３３−１１Ａ投与群で死亡する危険が６０日後処理ごろアイソタイプ対照群（ｐ＝０．０００６）の約１６パーセントであると推定された。アイソタイプ対照群の１００パーセントは、５０日後処理によって死亡した。比較として、７ＢＤ−３３−１１Ａ投与群の６０パーセントは、１３０日後処理でまだ生存していた。このデータは、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置が制御処置群と比較して生存利点と還元型の全身腫瘍組織量を与えることを証明した。それが還元型の体重と臨床苦痛を含む毒性の少しの合図も誘導しなかったので、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置は安全に見えた。このように、それが腫瘍成長を遅延させて、ヒト乳癌のｗｅｌｌ−確立されたモデルで制御処置群と比較して生存を強化したので、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置は有効だった。
【００２８】
化学療法剤（シスプラチン）処置単独と比較したまたは組合せの７ＢＤ−３３−１１Ａの効果は、２つの異なる確立した乳癌異種移植モデルで決定された。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＢ−２３１）モデルにおいて、日６９（５日後療法）で、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置は、バッファ制御治療をうけている動物（ｐ＜０．００１）と関連して、腫瘍成長の７６パーセントの減少に帰着した。単独でシスプラチン処置または、７ＢＤ−３３−１と結合して、アイソレーション増幅器は制御（ｐ＜０．００１）と関連して、腫瘍サイズの７９と８６パーセントの減少に、それぞれ、帰着した。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＭＢ−４６８）のモデルにおいて、日５５（５日後療法）で単独で、そして、アイソレーション増幅器がそれぞれ腫瘍成長、９５パーセント（ｐ＝０．０２４）と９７パーセント（ｐ＝０．１７）で最も大きな減少に示した７ＢＤ−３３−１と結合するシスプラチン処置。日５５でも、バッファ制御に対する比較において、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置単独は、３７パーセント（ｐ＝０．３９５８）、腫瘍成長の減少を示した。ＭＢ−２３１ＭＢ−４６８モデルにおいて、体重で測定されるにつれて、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器による処置はシスプラチンで処置に割により大きな動物の幸福に導いた。これらの結果は、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置がＭＢ−２３１モデルで単独でシスプラチン処置に割により大きな有効性を持って、両方の乳癌モデルのシスプラチンより少しの副作用（例えば重量減少）でより忍容性が高かったことを示す。
【００２９】
さまざまな用量で７ＢＤ−３３−１１Ａ処置の有効な効果を決定するために、用量反応の実験は、予防乳癌異種移植モデルで実行された。日５５（５日後療法）で、０．２ｍｇ／ｋｇの投与群は、アイソタイプ制御処置群と関連して８５パーセント腫瘍成長を予防した。日５５でも、２つと２０ｍｇ／ｋｇの投与群は、まだ腫瘍を呈していなかった。類似の結果は日１２５（７５日後療法）過ぎに得られた。ここで、２０ｍｇ／ｋｇの投与群は腫瘍をまだ呈しなかった、そして、２ｍｇ／ｋｇの投与群は若干の最初の腫瘍成長を持った。７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器処置も、生存利点を示した。０．２ｍｇ／ｋｇの７ＢＤ−３３−１１Ａ投与群が日１９７（１４７日後療法）まで生存する間、アイソタイプ対照群のマウスのＡＵは日１０４（５４日後療法）までに死亡した。より大きな生存利点さえ、２．０と２０ｍｇ／ｋｇの７ＢＤ−３３−１１Ａ投与群で観察された；２０ｍｇ／ｋｇの投与群のいずれもまた、日２９０までに死亡しない間、２．０ｍｇ／ｋｇの投与群のわずか５０パーセントは日２９０（２４０日後療法）までに死亡した。従って、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置は重要な腫瘍成長減退を示して、最高の服用によって示されている有効性で最も大きな程度で、全３つの用量で生存を増加させた。
【００３０】
乳癌の確立したインビボの腫瘍モデルの薬効に加えて、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置も、予防インビボの前立腺癌モデル（Ｓ．Ｎ． １０／６０３，００６で概説される）で、ＰＣ−３細胞に対して抗腫瘍活性を持った。７ＢＤ−３３−１１Ａ処置は、アイソタイプ制御抗体より、治療期間の直後に腫瘍成長を抑制することに有意に効果的だった（ｐ＝０．００１）。処置相終了後、７ＢＤ−３３−１１Ａを与えられるマウスは、アイソタイプ対照群のわずか３１パーセントに増大した腫瘍が認められた。ＰＣ−３ ＳＣＩＤ異種移植モデルのために、体重が疾患進行の代わりの指標として使われることができる。日５２に、有意に７ＢＤ−３３−１１Ａ処置（ｐ＝０．００２）は、アイソタイプ制御に割に５４パーセント体重の損失を予防した。マウスは、生存後処理をモニターされた。１１日後処理で、アイソタイプとバッファ制御マウスは、１００パーセントの死亡率に達した。逆に言えば、対照群より３回長く、７ＢＤ−３３−１１Ａは日３８後処理で１００パーセントの死亡率に達した。このように、それがヒト前立腺癌の安定したモデルでアイソタイプ制御処置群と比較して両方とも腫瘍成長、予防された体重損失と拡張した生存を遅延させたので、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器処置は有効だった。
【００３１】
前立腺癌の予防的インビボの腫瘍モデルに加えて、７ＢＤ−３３−１アイソレーション増幅器は、確立したインビボの腫瘍モデル（Ｓ．Ｎ． １０／６０３，００６で概説される）で、ＰＣ−３細胞に対して抗腫瘍活性を示した。７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器による処置は、再びアイソタイプ制御と比較してあった。７ＢＤ−３３−１１Ａ投与群が処置の後でアイソタイプ制御処置群と比較して有意により少ない平均の腫瘍容積をすぐ持つ（ｐ＜０．０２４）ことを示された。７ＢＤ−３３−１１Ａ処置は、アイソタイプ対照群と比較して３６パーセント腫瘍抑制の媒介となった。７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器の抗腫瘍活性は、いくつかの異なる癌モデルで、それを魅力的な抗癌性の治療薬とする。
【００３２】
薬目標として７ＢＤ−３３−１１Ａエピトープを確認するために、正常な人体組織の７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原の表現度は、以前決定された（Ｓ．Ｎ． １０／６０３，００６）。本研究は、商業的に入手可能な抗ＣＤ６３抗体（ＲＦ ＡＣ４とＨ５Ｃ６）と比べると広げられた。組織染色からの結果は、７ＢＤ−３３−１１Ａが再びさまざまな細胞型に制限された結合を見せるが、マクロファージ、リンパ球と線維芽細胞を浸透させることに結合を持つことを示した。ＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ６抗体は、割に各々に類似の染色パターンを見せた。しかしながら、ＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ６の染色パターンは７ＢＤ−３３−１１Ａで観察されてそれとは全く異なった。具体的には、ＲＰＡＣ４とＨ５Ｃ６抗体は正常組織のより幅広い範囲と結合して、通常、７ＢＤ−３３−１１Ａが陽性でもあった組織で強度にしみをつけている高等を持って、マクロファージ、リンパ球と線維芽細胞を浸透させることにだけでなく組織で大多数の上皮にも結合した。
【００３３】
７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原で、集団（乳癌患者の間のたとえば〜など）の範囲内のその有病率が７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器の治療的な使用を評価して、効果的臨床試験を設計する際に重要であると決定している限局化。癌患者から乳房腫瘍の７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原表現について述べるために、５０人の個々の乳癌患者からの腫瘍組織試料は、以前７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原（Ｓ．Ｎ． １０／６０３，００６）の表現度のために映写された。現在の仕事は、Ｈｅｒ２抗体（ｃ−ｅｒｂＢ−２）をＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ６に、そして、ａｎｔｉ−に７ＢＤ−３３−１１Ａに染色することを比較した。本研究の成績は、前の結果と類似していて、９４と８５パーセントの胸部腫瘍組織はそれぞれＨ５Ｃ６とＲＦＡＣ４エピトープが陽性の間、３６パーセントの腫瘍組織試料が７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器抗原のために良い面を染色したことを示した。染色が悪性細胞に制限されたので、患者試料の範囲内の７ＢＤ−３３−１１Ａの表示は癌細胞に特有に見えた。加えて、Ｈ５Ｃ６とＲＦＡＣ４が正常な胸部組織の８つの試料のうちの７つにしみをつける間、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器は乳癌患者から正常組織の１０の試料のうちの０にしみをつけた。７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器抗原の乳房腫瘍表現度は悪性細胞の細胞膜と細胞質に局所化されるように見えた。そして、ＣＤ６３を治療の魅力的な目標とした。７ＢＤ−３３−１１Ａ表現はホルモン類エストロゲンとプロゲステロンのためにレセプターの乳房腫瘍表示に基づいて更に評価された。そして、それは乳房腫瘍の発現、治療と予後において重要な役割を果たす。エストロゲンまたはプロゲステロン受容体発現間のわずかな相互関係と７ＢＤ−３３−１１Ａの表示があった；受容体発現による組織は、わずかにより高い７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器表現をした。腫瘍がそれらの段階または癌が進んだ程度に基づいて分析されたとき、結果が７ＢＤ−３３−１１Ａのために高等腫瘍の病期でより大きな陽性の表現に向かう傾向を暗示して。Ｓｉｍｉｌａｒ結果は、ＲＦＡＣ４で得られた。Ｈ５Ｃ６もエストロゲンまたはプロゲステロン受容体発現で非常にわずかな相互関係を示した、しかし、見た目の相互関係が腫瘍の病期でなかった。しかしながら、全３つの抗体のために、結果は小さいサンプルサイズによって制限された。ｃ−ｅｒｂＢ−２に対する比較において、７ＢＤ−３３−１１Ａは７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器抗原が陽性だった乳房腫瘍組織標本の半分が乳癌患者のこれまでに会ったことのない目標とされた治療的な必要を示しているＨｅｒ２表現が陰性だった完全に異なる染色側面を示した。染色の強度の違いが、７ＢＤ−３３−１１ＡとＨｅｒ２が陽性だった乳房腫瘍組織切片の間にもあった。ｃ−ｅｒｂＢ−２抗体も、明らかに通常の胸部組織断片のうちの１つを染色した。
【００３４】
７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器抗原と前立腺の癌患者の範囲内のその有病率の限局化は、前立腺癌患者に７ＢＤ−３３−１１Ａ免疫療法の有益性を評価して、効果的臨床試験を設計する際に重要である。癌患者から前立腺腫瘍の７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原表現について述べるために、５１人の個々の前立腺の癌患者からの腫瘍組織試料は、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原の表現度のために映写された。本研究の成績は、８８パーセントの組織標本が７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原のために良い面を染色することを示した。７ＢＤ−３３−１１Ａが同様に通常の組織切片を高輝度でけがしたにもかかわらず、膜状の染色の高等程度が割に正常な試料に腫瘍組織試料にあった。７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原のために染色されなかった１つの胚性のｒｈａｂｄｏｍｙｏｓａｒｃｒｏｍａ組織標本が、あった。また、腫瘍の病期と７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原の存在間の直接的な相互関係でなく見えた。しかしながら、結果は小さいサンプルサイズによって制限された。
【００３５】
更に７ＢＤ−３３−１１Ａの潜在的治療的な利点を延長するために、さまざまなヒト癌組織の範囲内の抗原の頻度と限局化は、以前決定されもした（Ｓ．Ｎ． １０／６０３，００６）。いくつかの癌タイプは、胸部と前立腺癌に加えて、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原を表した。陽性のヒト癌タイプは、皮膚（１／２）、肺（３／４）、肝臓（２／３）、胃（４／５）、甲状腺（２／２）、子宮（４／４）と腎臓（３／３）を含んだ。若干の癌は、抗原を表さなかった；これらの含まれた卵巣（０／３）、精巣（０／１）、脳（０／２）とリンパ節（０／２）。ヒト胸部と前立腺の癌組織と同様に、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器の限局化は、膜の上で、そして、これらの腫瘍細胞の細胞質の範囲内で起こった。それで、生体外で癌細胞系と結合している７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器抗体に加えて、抗原がヒトで、そして、癌のかさ形の上で表されるという証拠が、ある。
【００３６】
この中に概説されるように、付加的な生化学データも７ＢＤ−３３−１１Ａによって認められる抗原がＣＤ６３であることを示す。これは、２つのモノクローナル抗体（ＲＪＦ ＡＣ４とＨ５Ｃ６）（ＣＤ６３に対して反応性）が免疫沈降によって７ＢＤ−３３−１１Ａと結合したタンパク質を特定することを示している研究で支えられる。加えて、更なる細菌表現研究は、ＣＤ６３の細胞外ループ２行きのその７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器を解明した。７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器エピトープも、従属する立体配座であることによって特徴づけられた。これらのＩＨＣと生化学結果は、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器がＣＤ６３抗原と結合することを証明する。このように、証拠の優越性は７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器がＣＤ６３の上で出席しているユニークな高次構造上のエピトープの結合を通して抗癌性の効果の媒介となることを示す。この発明の目的で、前記エピトープは、ハイブリドーマ細胞系７ＢＤ−３３−１１Ａによってコードされるモノクローナル抗体と結合するその能力、それの抗原性の結合フラグメントまたはそれの抗体複合体ｓによって特徴づけられる「ＣＤ６３抗原性部位」として定義される。
【００３７】
全体として、このデータは、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原が癌関連する抗原であって、ヒトで表されて、病理学的に関連した癌目標であることを証明する。更に、このデータも７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体の結合をヒト癌組織に示して、診断でありえる分析のために適切に使われることがありえるか、治療を予示することがありえるか、予後でありえる。加えて、この抗原の細胞膜限局化は大部分の非悪性の細胞で抗原の表現度の不足による細胞の癌状態を表す、そして、この診察によってこの抗原、その遺伝子または誘導剤、そのタンパク質またはその異型の使用が診断でありえる分析のために使われるか、治療を予示するか、予後のことができる。
【００３８】
本発明は７ＢＤ−３３−１１Ａの発現と使用を記載する。そして、特許ＵＳ ６，１８０，３５７で記載されて、同一化される過程までに開発される。そして、細胞障害性の分析で、動物モデルの非確立して確立した腫瘍成長の、そして、それらの延長している生存期間のその効果がガン疾患を患う。それが、初めて、標的分子（ＣＤ６３）の上で特に出席しているエピトープと結合して、とてもまた、悪性腫瘍細胞に対して正常細胞でなく生体外細胞障害性の性質を持つ、そして、また、ヒト癌のインビボのモデルで直接腫瘍成長の抑制と生存の強化の媒介となる試薬を記載するという点で、この発明は前進を癌治療の場所において代表する。誰も類似の性質があることが示されなかった時から、これは他のいかなる前述した抗ＣＤ６３抗体にも関する前進である。それが明らかにデモをする時から、それも前進をフィールドに示す、そして、初めて、イベントのＣＤ６３の直接の参加は腫瘍の特定の種類の生育と関連した。それには可能性がある時から、それも前進を癌治療において代表する。そして、ヒト患者で類似の抗癌性の性質を示す。追加貸付は抗癌抗体のライブラリの中のこの抗体の包含が異なる抗癌抗体の適切なコンビネーションの決定によって異なる抗原マーカーを表しているターゲッティング腫瘍の可能性を強化するということである。そして、腫瘍の生育がターゲッティングと抑制性に最も効果的であるとわかる。
【００３９】
全部で、この発明は、治療薬の目標として、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器抗原の使用を教え、その投与される、哺乳類で抗原を表している癌の全身腫瘍組織量を減らすことができて、そして、治療をうけている哺乳類の生存延長に導くこともできる。この発明もＣＤＭＡＢ（７ＢＤ−３３−１１Ａ）とその派生語の用法とそれの抗原結合フラグメントを教える。そして、哺乳類で抗原を表している癌の全身腫瘍組織量を減らして、この抗原を表す腫瘍を運んでいる哺乳類の生存を延長するためにその抗原を目標とする。さらにまた、この発明も、診断に役立つことがありえる癌細胞で７ＢＤ−３３−ＨＡ抗原を見つける効果、治療の予測とこの抗原を表す腫瘍を運んでいる哺乳類の予後を教える。
【００４０】
患者が治療の最初のコースに不応性の、または、転移が発達する場合、腫瘍に対する創成特異抗体のプロセスは再治療のために繰り返されることができる。さらにまた、抗癌抗体はその患者または互換性を持つ提供者から得られる赤血球に抱合型でありえて、転移の処置のために再注入した。転移癌のほとんど効果的治療がなかった、そして、転移は通常、死に帰着している転帰不良を予告する。しかしながら、転移癌は通常かなり血管化である、そして、赤血球による抗癌抗体の送達には腫瘍の部位で抗体に集中する効果があることができる。転移の前にさえ、大部分の癌細胞はそれらの生存のために宿主の血液供給に依存している、そして、赤血球に活用する抗癌抗体は同様に元の位置の腫瘍に対して効果的でありえる。あるいは、抗体は他の血液原細胞、例えばリンパ球、マクロファージ、単球、ナチュラルキラー細胞、その他に抱合型である可能性がある。そして、Ｔｈｅｒｅは抗体の５つのクラスである、そして、各々はそのＨ鎖によって与えられる機能と関係している。裸の抗体による癌細胞殺害が抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞障害作用（ＣＤＣ）を通して媒介となられると通常、思われる。例えば、ネズミの免疫グロブリンＭとＩｇＧ２ａ抗体は、それによって、腫瘍細胞溶解に導くことができる補体活性化の古典経路を起動させている補体系のＣＩ構成要素を結合することによって、ヒト補体を起動させることができる。ヒト抗体のために、最も効果的補体活性化抗体は、通常、免疫グロブリンＭとＩｇＧｌである。ＩｇＧ２ａとＩｇＧ３アイソタイプのマウス抗体は、単球、マクロファージ、顆粒球と特定のリンパ球によって細胞殺害に導くＦｃレセプタを持っている細胞傷害性細胞を補充することで効果的である。ＩｇＧｌとＩｇＧ３アイソタイプのヒト抗体は、ＡＤＣＣの媒介となる。
【００４１】
抗体によって媒介される癌殺害のもう一つの可能な機構が、細胞膜とその関連する糖蛋白または糖脂質で（いわゆる触媒抗体）さまざまな化学結合の加水分解に触媒作用を及ぼすために機能する抗体を用いることによりある可能性がある。
【００４２】
抗体によって媒介される癌細胞殺害のさらに２つの機構がある。そして、それはより広く受け入れられる。第一は、癌細胞にある推定上の抗原に対して免疫応答をもたらすために体を誘導するワクチンとしての抗体の使用である。その機能が効果的に失われるように、第２は成長レセプターを目標として、それらの機能に干渉するか、減少してそのレセプターを調整する抗体の使用である。
【００４３】
制癌剤の臨床有用性は、患者に許容リスク側面の下で本剤の有益性に基づく。癌治療において、生存は通常、利点の後で最も捜された、しかしながら、多数の他のｗｅｌｌ−認識された利点が生命を延長することに加えてある。これらの他の利点（処置が生存に悪影響を与えないところ）は、症状寛解、有害事象からの保護、再発または疾患のない生存に時間内の延長と進行に時間内の延長を含む。これらの判定基準は通常、受け入れられる、そして、アメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）のような調節性体はこれらの利点（１３７−１４３、小ハーシェフェルドは、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ／Ｈｅｍａｔｏｌｇｙ ４２のああという声Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓである：２００２）を発生する薬を承認する。これらの判定基準に加えて、この種の利点の前兆となる可能性がある他の終末点があるとよく認められる。一つには、アメリカ食品医薬局によって承諾される促進的な承認プロセスは、患者利点をたぶん予測する代用物があると承認する。会計年度末の（２００３）より、このプロセス中で承認される１６の薬があった、そして、これらの、４は完全な承認（すなわち研究が代わりの終末点によって予測されて直接の患者利点を示した追跡調査）に移った。固形腫瘍で薬効を決定するための１つの重要な終末点は処置に対する測定反応による全身腫瘍組織量の評価である（Ｔｈｅｒａｓｓｅその他は、国立癌研究所９２（３）ジャーナルである：２０５−２１６ ２０００）．そのような評価のための臨床判定基準（ＲＥＣＩＳＴ判定基準）は、充実性腫瘍研究グループ（癌の一団の国際的な専門家）で、応答評価基準によって広められた。全身腫瘍組織量に対する示された効果による薬は、最終的に、群が傾向がある適切な制御に対する比較で、ＲＥＣＩＳＴ判定基準に従う客観的な反応で示すように、直接の患者利点を発生する。全身腫瘍組織量が通常、より直接に評価することになっている症状発現前設定と文書で。前臨床試験が臨床設定に解釈されることができるという点で、前臨床モデルで生存延長をもたらす薬には最大の予想された臨床ユーティリティがある。臨床治療に産生性の肯定応答に類似して、症状発現前設定で全身腫瘍組織量を減らす薬は疾患に重要な直接的な影響を及ぼす可能性もある。生存の延長が制癌剤治療から臨床転帰の後、最も求められる、臨床有用性を持つ他の利点があって、そして、全身腫瘍組織量減少（それは疾患進行の遅れに相関する可能性がある）が生存または両方とも延長したことは明らかである、直接の利点に導くこともできて、そして、臨床影響を持つこともできる（Ｅｃｋｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ： Ｓｕｃｃｅｓｓｅｓ ａｎｄ Ｆａｉｌｕｒｅｓ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌ Ｄｅｓｉｇｎｓ ｏｆ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ； ＡＳＣＯ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｂｏｏｋ， ３９ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ， ２００３， ｐａｇｅｓ ２０９−２１９）。
【００４４】
したがって、ハイブリドーマ細胞系と対応の単離モノクローナル抗体を分離しなさいという命令とそれについて前記ハイブリドーマ細胞系がコードされる抗原結合フラグメントで、同時に非癌細胞に比較的無毒性間、癌細胞に関して細胞毒性である特定の個人に由来する細胞から方法を産生性の癌疾患修飾抗体のために利用することは、本発明の目的である。
【００４５】
それのＣＤＭＡＢと抗原結合フラグメントを教えることは、本発明のさらなる目的である。細胞毒性がＡＤＣＣを通して媒介となられるＣＤＭＡＢを発生することは、本発明の更なる目的である。
【００４６】
細胞毒性がＣＤＣを通して媒介となられるＣＤＭＡＢを発生することは、まだ本発明の更なる目的である。細胞毒性が細胞化学結合の加水分解に触媒作用を及ぼすそれらの能力の機能であるＣＤＭＡＢを発生することは、まだ本発明の更なる目的である。
【００４７】
本発明のなお更なる目的は、診断、予後と癌のモニタリングのために結合アッセイに役立つＣＤＭＡＢを発生することである。
【００４８】
図と例（この発明の実施形態が述べられることを確信している）のために、この発明の他の目的と長所は、そこで以下の説明から明らかになる。
【００４９】
（図面の簡単な説明）
特許または帯出者登録簿は色で仕上げられる少なくとも１つの図面を含有する。この特許のコピーまたはカラー図面（ｓ）による特許出願刊行は、要請と必要な料金の支払いに応じて局によって提供される。
図１は、ＭＤＡ−ＭＢ−まる２３１細胞可溶化物（レーン１）または膜（レーン２と３）のウエスタンブロットは、７ＢＤ−３３−１１Ａ（パネルＡ）またはアイソタイプ対照（パネルＢ）と深く探った。分子量マーカーは、左で示される。
図２は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜のウエスタンブロットは、７ＢＤ−３３−ＨＡで深く探った。レーン１：還元性の状況の下で動く膜。レーン２：膜は、非還元の状況の下で動作する。分子量マーカーは、左で示される。
図３は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜に対する７ＢＤ−３３−１１Ａの結合の脱グリコシルの効果。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜は、ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄａｓｔ Ｆで処置を受けた（ＰＮＡＧアーゼ；レーン１）、Ｏ−グリカナーゼ（レーン２）、シアリダーゼ（レーン３）、ＰＮＡＧアーゼ、Ｏ−グリカナーゼとシアリダーゼ（レーン４）の組合せ、ＰＮＡＧアーゼ、Ｏ−グリカナーゼ、シアリダーゼ、ガラクトシダーゼとグルコサミニダーゼ（レーン５）の組合せまたはバッファ制御（レーン６）。分子量マーカーは、左で示される。
図４は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（パネルＡ）、そして、膜タンパク質が７ＢＤ−３３−１１Ａで免疫沈降したＭＤＡ−ＭＢ−２３１のウエスタンブロット（パネルＢ）。レーンＡアイソタイプ制御免疫沈殿タンパク質（レーンＢ）：７ＢＤ−３３−１１Ａは、タンパク質とレーンＴＭを免疫沈降した：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜タンパク質となりなさい。角箱は、ウエスタンブロットでＳＤＳ−ＰＡＧＥとレーンＴＭでレーンＢから同じ帯域を概説する。分子量マーカーは、左で示される。
図５は、サーチ・サマリー・テーブル。
図６は、ＭＡＳＣＯＴサーチ・サマリー・テーブル。
図７ａは、タンパク質のウエスタンブロットは、７ＢＤ−３３−１１Ａ（パネルＡ）、抗ＣＤ６３（ＲＦＡＣ４のクローン作成、パネルＢ）、ＩｇＧ２ａアイソタイプ制御（パネルＣ）とＩｇＧｌアイソタイプ対照（パネルＤ）と深く探った。レーンＡ：全ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜タンパク質；レーンＢ：７ＢＤ−３３−１１Ａは、タンパク質を免疫沈降した；レーンＣ：抗ＣＤ６３（ＲＦＡＣ４）は、タンパク質（レーンＤ）を免疫沈降した：ＩｇＧ２ａアイソタイプ制御免疫沈殿タンパク質とレーンＥ：ＩｇＧｌアイソタイプ制御は、タンパク質を免疫沈降した。分子量マーカーは、左で示される。
図７ｂは、タンパク質のウエスタンブロットは、７ＢＤ−３３−１１Ａ（パネルＡ）、抗ＣＤ６３（Ｈ５Ｃ６のクローンを作成、パネル Ｂ）、ＩｇＧ２ａアイソタイプ制御（パネルＣ）とＩｇＧｌアイソタイプ対照（パネルＤ）と深く探った。レーンＡ：全ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜タンパク質；レーンＢ：７ＢＤ−３３−１１Ａは、タンパク質を免疫沈降した；レーンＣ：抗ＣＤ６３（Ｈ５Ｃ６）は、タンパク質（レーンＤ）を免疫沈降した：ＩｇＧ２ａアイソタイプ制御免疫沈殿タンパク質とレーンＥ：ＩｇＧｌアイソタイプ制御は、タンパク質を免疫沈降した。分子量マーカーは、左で示される。
図８は、タンパク質のウエスタンブロットは、７ＢＤ−３３−１１Ａ（パネルＡ）、抗ＣＤ６３（ＲＦＡＣ４のクローンを作成、パネル Ｂ）、抗ＣＤ６３（Ｈ５Ｃ６のクローンを作成、パネル Ｃ）、ＩｇＧ２ａアイソタイプ制御（パネルＤ）とＩｇＧｌアイソタイプ対照（パネルＥ）と深く探った。レーン１−５は、７ＢＤ−３３−１１Ａ免疫沈殿タンパク質とレインズ６−１０がＩｇＧ２ａアイソタイプ制御免疫沈殿タンパク質を含むことを含む。レーン１と６：ＮａＣｌでない、レインズ２と７：１５０ｎｉＭ ＮａＣｌ、レインズ３と８：５００ｍＭのＮａＣｌ、レインズ４と９：２０００ｍＭのＮａＣｌとレインズ５と１０：ＲＩＰＡバッファ。
図９は、タンパク質のウエスタンブロットは、７ＢＤ−３３−１１Ａ（パネルＡ）、抗ＣＤ６３（ＲＦＡＣ４のクローンを作成、パネル Ｂ）、抗ＣＤ６３（Ｈ５Ｃ６のクローンを作成、パネル Ｃ）、ＩｇＧ２ａアイソタイプ制御（パネルＤ）とクーマシーＣｏｌｌｏｉｄａｌ Ｂｌｕｅタンパク質染色液（パネルＥ）で深く探った。レーン１：非によって誘発されたベクター（レーン２）単独：非によって誘発された一般システムズ理論−ＥＣｌ（レーン３）：非−は、一般システムズ理論−ＥＣ２（レーン４）を誘発した：誘発されたベクター（レーン５）単独：誘発された一般システムズ理論−ＥＣｌとレーン６：誘発された一般システムズ理論−ＥＣ２。分子量マーカーは、左で示される。
図１０は、７ＢＤ−３３−１１Ａ、アイソタイプ対照と抗ＥＧＦＲの代表的なＦＡＣＳヒストグラムは、いくつかの癌細胞系と非癌細胞に対して指示した。
図１１は、正常な人体組織配列から大腸の組織部分の上で７ＢＤ−３３−１１Ａ（Ａ）、アイソタイプ負の制御（Ｂ）、抗ＣＤ６３（ＲＦ ＡＣ４）抗体または抗ＣＤ６３（Ｈ５Ｃ６）抗体（Ｄ）で得られる製本見本を示している代表的な顕微鏡写真器。７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器、ＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ６は、粘膜固有層でマクロファージとリンパ球のためにポジティブ染色法を示した。ＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ６も、粘膜のｅｐｉｔｈｅｌｉｅｕｍのために強い染色を示した。拡大は、２００Ｘである。
図１２は、ヒト乳癌組織配列から浸潤性の腺管癌の組織部分の上で７ＢＤ−３３−１１Ａ（Ａ）、アイソタイプ負の制御（Ｂ）、抗ＣＤ６３（ＲＦＡＣ４）抗体または抗ＣＤ６３（Ｈ５Ｃ６）抗体（Ｄ）で得られる製本見本を示している代表的な顕微鏡写真器。７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器は、ＲＦＡＣ４かＨ５Ｃ６抗体に割に腫瘍細胞のためにより弱いポジティブ染色法を示した。拡大は、２００Ｘである。
図１３は、ヒト乳癌組織配列から浸潤性の腺管癌の組織部分の上で７ＢＤ−３３−１１Ａ（Ａ）または抗Ｈｅｒ２（ｃ−ｅｒｂＢ−２）抗体（Ｂ）で得られる製本見本を示している代表的な顕微鏡写真器。７ＢＤ−３３−１アイソレーション増幅器は、ａｎｔｉ−に割に腫瘍細胞のためにネガティブ染色を示したＨｅｒ２抗体を染色している強い良い面を示した。拡大は、２００Ｘである。
図１４は、ヒトの前立腺癌組織配列から前立腺アデニカルシノーマ （Ａ）または通常の前立腺（Ｂ）の組織部分の上で７ＢＤ−３３−１１Ａで得られる製本見本を示している代表的な顕微鏡写真器。７ＢＤ−３３−１１Ａは、腺癌組織切片で腫瘍細胞のために強い陽性の膜状の染色を示した。７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器は、通常の前立腺の組織切片で腺上皮の膜状で細胞質の染色を示した。拡大は、２００Ｘである。
図１５は、７ＢＤ−３３−１１Ａの効果または用量反応の予防ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌モデルの腫瘍成長に関するアイソタイプ制御。破線は、抗体が投与された期間を示す。データ点は、平均の＋／−ＳＥＭを表す。
図１６は、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器による腫瘍を含んだマウス後処理または用量反応の予防的ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植検査のアイソタイプ制御抗体の残存。
図１７は、確立したＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌モデルの腫瘍成長に関する７ＢＤ−３３−１１Ａ、シスプラチン、７ＢＤ−３３−１１Ａ ＋ シスプラチンまたはバッファ制御の効果。破線は、抗体が投与された期間を示す。データ点は、平均の＋／−ＳＥＭを表す。
図１８は、確立したＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌モデルの体重の７ＢＤ−３３−１１Ａ、シスプラチン、７ＢＤ−３３−１１Ａ ＋ シスプラチンまたはバッファ制御の効果。
図１９は、確立したＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌モデルの腫瘍成長に関する７ＢＤ−３３−１１Ａ、シスプラチン、７ＢＤ−３３−１１Ａ ＋ シスプラチンまたはバッファ制御の効果。破線は、抗体／シスプラチンが投与された期間を示す。データ点は、平均の＋／−ＳＥＭを表す。
図２０は、確立したＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌モデルの体重の７ＢＤ−３３−１１Ａ、シスプラチン、７ＢＤ−３３−１１Ａ ＋ シスプラチンまたはバッファ制御の効果。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５０】
実施例１
ウエスタン免疫ブロット法による結合タンパク質の同定
抗体７ＢＤ−３３−１のアイソレーション増幅器によって認められる抗原（ｓ）を特定するために、細胞膜標本はドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に従属して、膜に移った。後者は、タンパク質がこの抗体によって見つけられるのを視覚化するために、抗体７ＢＤ−３３−１のアイソレーション増幅器で探索された。
【００５１】
１．全細胞可溶化物および全膜画分調製
１．１．全細胞可溶化物
ＦＡＣＳによる全部のＣｅｌｌ Ｌｙｓａｔｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｐｒｅｖｉｏｕｓ業績は、抗体７ＢＤ−３３−１１のＡの結合を乳癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＢ−２３１）に示した。その結果、この細胞系から得られる完全細胞膜標本と細胞全体の溶解産物が、抗原識別と特徴描写のために使われた。ＭＢ−からの全細胞可溶化物は、２３１セル、以下の通りに準備された：ペレット（１．５ｇ）がそうであったＭＢ−２３１のセルは２０ｍＭのトリス（ｐＨ ７．４）を含んでいる細胞溶解バッファを２ｍＬで再懸濁した。そして、１５０ｍＭはＮａＣｌ、１％（ｖ／ｖ）のトリトンＸ−１００、０．０２％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウム、２ｍＭのナトリウム・オルト・バナジン酸塩、５０ｍＭフッ化ナトリウムである、そして、プロテアーゼ阻害薬カクテル‖（ロシュＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ；マンハイム（ドイツ））。ペレットはガラス・ホモジナイザーで均質にされて、動くことで暖められた、なぜならば、４°Ｃ．サンプルズの１時間はそれから４°Ｃで１５分の間遠沈殿法（２０，００Ｏｇ）を受けた。そして、洗剤不溶性物質を除去した。上清は集められた、部分標本で分割された、そして、凍る−８０℃。細胞可溶化物のタンパク質濃度はベンゼンヘキサカルボン酸（双シンコニン酸酸）分析で測定された（ピアス；ロックフォード（ＩＬ）。）。
【００５２】
１．２．全細胞膜全膜画分調製
全細胞膜は、ＭＢ−２３１乳癌細胞の融合性培養組織から準備された。媒体は細胞スタックから除去された、そして、細胞はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗われた。細胞は、解離バッファで分離された（ギブコ−ＢＲＬ；グランドアイランド（ＮＹ））プラットフォーム振盪機の３７°Ｃの２０分の間。細胞は採取されて、遠心分離後、細胞ペレットがＰＢＳを中で再懸濁して洗われた４°Ｃ．の１０分の間の９０ＯｇとＰｅｌｌｅｔｓがそれから貯蔵型だった４°Ｃ．で１０分の間９０Ｏｇで再び遠心することで遠心した−必須のものまで８０℃。膜を準備するために、細胞ペレットは解凍されて、５０ｍＬの完全なプロテアーゼ阻害薬カクテルにつき１つの錠剤を含んでいる均質化バッファで再懸濁された（ロシュ；ラヴァルＱＣ）細胞のグラムにつき３ｍＬのバッファの比率で。細胞懸濁液は、細胞を溶解するために氷の上でポリ公共の秤ホモジナイザーを使用している均質化に従属した。細胞ホモジネートを１５，００Ｏｇで核微粒子を除去する４°Ｃの１０分時間遠心分離した。上清は収穫されて、管に分けられて、それから４℃で９０分の間７５，６０Ｏｇで遠心された。上清は慎重に除去された、そして、各々の膜ペレットは約５ｍＬの均質化バッファで再懸濁された。全ての管からの膜ペレットは化合して、もう１回分けられて、上清ｔが除かれて慎重にあった４°Ｃ．で９０分の間７５，６０Ｏｇで遠心された、そして、ペレットは量られた。１％のトリトンＸ−１００を含んでいる可溶化バッファは、膜ペレットのグラムにつき、３ｍＬのバッファの比率で、ペレットに加えられた。氷の１時間の間、膜は３００ｒｐｍでプラットフォーム振盪機で振盪によって可溶化された。膜懸濁液をペレット不溶性物質に対する７５，６０Ｏｇで遠心分離した。上清は、可溶化された膜タンパク質を含んで、管（タンパク質濃度のために検定される）から、慎重に除去された、そして、貯蔵型の−８０℃。
【００５３】
２．１次元のＳＤＳ−ＰＡＧＥとウエスタン免疫ブロット法
それぞれ、５と１０パーセントのスタッキングと分離ゲルの上で、完全膜画分からのタンパク質とＭＢ−２３１細胞の細胞全体の溶解産物は１次元のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＩＤ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって切り離された。タンパク質は、ＰＶＤＦ膜上にエレクトロブロッティングによって終夜、４°Ｃで、移された（ミリポア；ビルリカ（ＭＡ））。完全な転送は膜上へ前染色分子量マーカーの転送を評価することによって定量した。転写後、室温（ＲＴ）の１時間の間、膜はＴＢＳＴの５パーセント（ｗ／ｖ）の脱脂乳によるブロック状態のであった、そして、２つの反復された汚点はそれから以下の通りに探索された：１つの汚点は抗体７ＢＤ−３３−１１Ａ（５つのμｇ／ｍｌ（ＴＢＳＴの５パーセントの脱脂乳の））で探索された、そして、反復された汚点はＩｇＧ２３アイソタイプ対照（５つのμｇ／ｍｌ（ＴＢＳＴの５パーセントの脱脂乳の））と探索された。汚点はＴＢＳＴで１０分の間３回洗われて、それから、西洋わさびＨＲＰ抱合型のヤギ抗マウス免疫グロブリンＧ（結晶化可能フラグメント）で孵化した（バイオラドＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；ヘラクレス（ＣＡ））、ＲＴの１時間の間。ＴＢＳＴによるそれぞれ１０分の間３回を洗った後に、汚点はＴＭＢペルオキシダーゼ基質キットで呈された（ベクターＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；バーリンゲーム（ＣＡ））製造業者の指示に従うこと。汚点は、水できれいにされた、そして、画像はゲル・ドキュメンテーションシステム（図１と２）で後天性だった‖（バイオラド；ヘラクレス（ＣＡ））。汚点は、カメラ焦点、開口と画像獲得時間の同じ条件の下で像を造られた。図１において、７ＢＤ−３３−１アイソレーション増幅器は２０−８０ｋＤａの範囲で明らかにタンパク質と結合した、そして、その反応性は細胞全体の溶解産物と完全膜画分を含んでいるレーンで発見されていた。アイソタイプ制御はＭＢ−２３１溶解産物または膜画分で少しのタンパク質もと結合しなかった。そして、７ＢＤ−３３−１１Ａのための結合がはっきりしていたことを示した。ウエスタンブロットで、図２は７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器結合の上で、縮分の効果を示した。試料が非還元の状況（レーン２）の下で準備されたとき、この抗体の反応性は発見されているだけだった。ＤＴＴまたはβ−メルカプトエタノールのような還元剤は完全に結合（レーン１）を除去した。そして、天然蛋白のそのエピトープに対する７ＢＤ−３３−１１Ａの認識と結合がジスルフィド結合の存在次第であったことを示した。
【００５４】
決定する、分散したものは抗原の自然である、ウエスタン免疫ブロット法によって見つけられるにつれて、与えられべきものが異質な糖化にあって、完全膜画分は特異的な炭水化物群を取り出したいくつかのグリコシダーゼ（グリコペプチダーゼＦ、オルト・グリカナーゼ、シアリダーゼ、ガラクトシダーゼとグルコサミニダーゼ）で処置を受けた。処置の後、試料はＩＤ ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウエスタンブロット法に従属した。酵素の一部が一部の炭水化物を除去する場合、それが抗体７ＢＤ−３３−１１Ａによって認められる抗原（ｓ）の質量の有意な量を占めたことが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってその違いを見つけることが可能であることが、期待されるであった。図中図３は、認められた抗原（ｓ）のＭＢ−２３１細胞からの完全膜画分のグリコシダーゼ処置が質量の重要な減少に帰着したことをである。これは、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体によって認められる抗原が少なくとも１つの糖蛋白から成ることを示した。いくつかの酵素が一緒に使われたとき、抗原（ｓ）の可動性の重要な変動が起こるだけだった事実は、炭化水素部分の少なくとも一部が合成のＮにリンクされた炭水化物から成ることを示した。グリコシダーゼによる膜の処理が分子量シフトに帰着したにもかかわらず、それは結合の強度を減らさなかった。これは、抗体が主に糖蛋白のポリペプチド部分と結合することを示唆した。
【００５５】
実施例２
７ＢＤ−３３−１１Ａによる抗原結合の同定
１．ＭＢ−２３１完全膜画分からの抗原の免疫沈降
全膜抽出物（５ｍｇの総タンパク質量）は適当なＩｘ細胞溶解バッファ（５０ｍＭのトリスｐＨ ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のトリトンＸ−１００、０．０２％のアジ化ナトリウム、２ｍＭのオルトバナジウム酸ナトリウム、５０ｍＭのフッ化ナトリウムとプロテアーゼ阻害薬カクテル（ロシュＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、マンハイム、ドイツ））量で１ｍｇ／ｍｌの最終的なタンパク質集中に希釈された、そして、適当な二倍数ＲＩＰＡバッファ（５０ｍＭのトリスｐＨ ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．０％のナトリウム・コール酸塩、０．２％のＳＤＳ、１％のトリトンＸ−１００と０．０２％のアジ化ナトリウム）量で、最終的なＩｘを得るために、ＲＩＰＡは集中を緩衝する。抜粋は抜粋がそうであった４°Ｃ． Ｔｏｔａｌ膜でタンパク質Ｇ−セファロース・ビード（アマシャムＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ウプサラ、スウェーデン）で２時間の間安全を事前に確認された。そして、除かれて標準的なＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）は０．５ｍｇ／ｍｌの最終的なＢＳＡ集中に加えられた。抜粋が安全を事前に確認される間、抗体複合体ｄタンパク質Ｇ−セファロース・ビード（タンパク質Ｇセファロースの３０のμｌに化学的に架橋させられる抗体の６０のμｇ）は、４℃の潜伏によって、また、２時間のＡｆｔｅｒ遮断（ビードがＩｘ ＲＩＰＡバッファで５分、二回洗われた抗体複合体ｄ）のための１ｉｎＬの０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡによるブロック状態のであった。終わり−過度に終わり回転子の上で、４°Ｃで、抗体複合体ｄタンパク質Ｇ−セファロース・ビードは、それからＢＳＡを含有する全膜抽出物に加えられて、３時間の間孵化した。２０，００Ｏｇの遠沈殿法の後、１０秒の間、４°Ｃで、解放された断片は除去されて、廃棄された、そして、各々の洗浄ステップの１ｍＬのＲＩＰＡバッファで、ビードは５分の間３回洗われた。ビードは、それから一度、１．５ｍｌのＰＢＳできれいにされた。上述の免疫沈降（ＩＰ）は、７ＢＤ−３３ｌｌＡ複合蛋白Ｇセファロースで、タンパク質Ｇ−セファロース・ビードがＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（ビジネスデザインＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンディエゴ、ＣＡ）と化学的に架橋させられた類似のＩＰと並列に実施された。このステップは、免疫複合体にタンパク質の非特異的な結合の評価を可能にするために実行された。完全にＰＢＳを排出した後に、ビードは非還元の試料バッファの４０のμｌで煮沸された、そして、試料は一部のゲルのウエスタン免疫ブロット法とゲルの残りの部分のクーマシーＣｏｌｌｏｉｄａｌ Ｂｌｕｅによる染色が続くＩＤ ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された。４０のμｌの、分数（８つのμｌ）はウエスタンブロット法のためにＳＤＳ−ＰＡＧＥに積まれた、そして、残りの分数（３２のμｌ）はクーマシーＣｏｌｌｏｉｄａｌ Ｂｌｕｅでタンパク質染色のために同じゲルの別々のレーンに積まれた。タンパク質染色に指定されるゲルの部分は、クーマシーＣｏｌｌｏｉｄａｌ Ｂｌｕｅ染色液で、終夜暖められた。ウエスタンブロット法に指定されるゲルの部分は、３２０ｎｉＡで２時間の間ＰＶＤＦ膜に転写されて、脱イオン水できれいにされて、ＴＢＳＴで５パーセントの牛乳でＲＴで１時間の間ブロックされて、それからＴＢＳＴで５パーセントの乳で７ＢＤ−３３−１アイソレーション増幅器で４°Ｃで終夜暖められた。室温の１時間の間、汚点はＴＢＳＴで１０分の間３回洗われて、ＴＢＳＴで５パーセントの乳でＨＲＰ抱合型の結晶化可能フラグメントに特異的なヤギ抗マウス免疫グロブリンＧ（１：５０００）で暖められた。汚点はそれから１０分の間３回洗われて、ＨＲＰのためにＴＭＢ基質の標準手順によって呈された。図４で示されるにつれて、ウエスタン免疫ブロット法とクーマシーＣｏｌｌｏｉｄａｌ Ｂｌｕｅ染色されたゲルは並んだであった。そして、参照として分子量マーカーを使用した。クーマシーＣｏｌｌｏｉｄａｌ Ｂｌｕｅで染色された主帯域は、ウエスタンブロットで７ＢＤ−３３−１１Ａで反応したメイン・バンドの同盟者になった。この断面は、図４の上で強調される（長方形挿入紙）。
【００５６】
２．ペプチドマッピングと質量分析による抗原同定
上記の実験から、クーマシーＣｏｌｌｏｉｄａｌ Ｂｌｕｅの帯域は、ウエスタンブロットで最も強度の反応性による並んだがそれから切り離されて、商業的に入手可能なキット（ピアス、ロックフォード、ＩＬ）を使用しているｉｎ−ｇｅｌトリプシン性消化に従属したゲルを染色した。ダイジェストのアリコートは、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ ＰＢＳＩＩｃ読者（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｆｒｅｅｍｏｎｔ、ＣＡ）の上で、質量分析分析を受けた。手短に言うと、ダイジェストのアリコートは、Ｈ４チップ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｆｒｅｅｍｏｎｔ、ＣＡ）上へ、手動で汚された。乾燥の後で、ＣＨＣＡマトリックスのアリコート（αシアン基の４ヒドロキシｃｉｎｎａｍｉｎｉｃな酸；Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｆｒｅｅｍｏｎｔ、ＣＡ）、チップに同じ点上に加えられて、乾燥させておかれた。試料は、それからＰＢＳＩＩｃ読者の上で分析された。アイソタイプの平行した地方からの類似の大きさを設定された帯域はレーンを制御して、そして、７ＢＤ−３３−１１Ａによって免疫沈降される抗原の消化によって発生するユニークなペプチド断片の決定を可能にするために、空のゲル地域は７ＢＤ−３３−１１Ａ ＩＰからゲル・プラグで並んで謄写刷政府印刷物だった。ユニークなペプチド断片の腫瘤はＰＲＯＦＯＵＮＤ（質量スペクトルから情報を使用しているタンパク質配列データベースを検索するための公的にアクセスできるオンライン道具）を使用して検索された。７ＢＤ−３３−１１Ａ ＩＰダイジェストからの試料のユニークなペプチドは、それから、以前ＰＢＳＩＩｃ読者の上で分析された同じ試料点の分析を可能にしたインタフェースを備えているＱＳＴＡＲ（アプライドバイオシステム、フォスターシティー、ＣＡ）の上で、ＭＳ／ＭＳ分析を受けた。ＭＳ／ＭＳデータは、それから、ＭＡＳＣＯＴ（ＭＳ／ＭＳスペクトルから情報を使用しているタンパク質データベースを検索するための公的にアクセスできるオンライン道具）で分析された。図５は、ＰｒｏＦｏｕｎｄ検索から生じた表についての要約である。推定上の候補として提案された唯一のタンパク質は、重要な信頼度でＣＤ６３であった。図６は、ＭＡＳＣＯＴ検索から生じた要約したテーブルである。高度な確率と同一視された唯一のタンパク質はＣＤ６３であった。そして、前の仮の識別をペプチドマップ・フィンガープリント法で支えた。
【００５７】
３． ７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原イド確認
７ＢＤ−３３−１１Ａのための推定上の抗原のＩＤの確認は、既知の抗ヒトのＣＤ６３モノクローナル抗体（例えばＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ６）が７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器とその逆によって免疫沈降されるタンパク質（ｓ）と反応するかどうかの決定を通して行われた。更なる確認は、ヒトＣＤ６３の細胞外領域のグルタチオンＳ‐トランスフェラーゼ（一般システムズ理論）−融合構造物で変わる誘導されたおよび非−誘導されたバクテリアから、全体の溶解産物のウエスタン免疫ブロット法にもよって実行された。ＭＢ−２３１からの免疫沈降物は膜となって、モノクローナル抗体７ＢＤ−３３−ＨＡ、ＲＦＡＣ４（Ｃｙｍｂｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＬＴＤ、Ｈａｎｔｓ、英国）、Ｈ５Ｃ６（ビジネスデザインＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンディエゴ、ＣＡ）で備えた、そして、ＩｇＧ２ａとＩｇＧ１で、（ビジネスデザインＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンディエゴ、ＣＡ）アイソタイプ対照はウエスタン免疫ブロット法が続くＩＤ ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された。各々の免疫複合体試料からの等しい分数体積を反復されたゲル類上で分析した。ＰＶＤＦ膜の上のエレクトロブロッティングの後、そして、ＩｇＧ２ａとＩｇＧ１アイソタイプ対照と、反復されたゲル類からの汚点は、モノクローナル抗体７ＢＤ−３３−１１Ａ、ＲＦＡＣ４、Ｈ５Ｃ６と並列に探索された。図７ａにおいて、材料が７ＢＤ−３３−１１ＡとＲＦＡＣ４を試験モノクローナル抗体の各々によって免疫沈降したクロスＩＰ実験からの結果は、ウエスタン免疫ブロット法によって分析された。図７ｂにおいて、材料が７ＢＤ−３３−１１ＡとＨ５Ｃ６を試験モノクローナル抗体の各々によって免疫沈降したクロスＩＰ実験からの結果は、ウエスタン免疫ブロット法によって分析された。モノクローナル抗体７ＢＤ−３３−１１Ａ、ＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ５の各々は、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器によって免疫沈降される類似の抗原（ｓ）で交差反応した。加えて、７ＢＤ−３３−１１Ａ十字架は、ＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ６によって免疫沈降される類似の抗原（ｓ）で、２０−８０ｋＤａの範囲のウエスタンブロットで、反応したが、免疫複合体でアイソタイプ制御抗体で備えなかった。アイソタイプ制御抗体で探索される汚点は、完全に負だった。このデータは、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体によって認識されるエピトープがＣＤ６３抗原の範囲内で含まれることを示した。
【００５８】
交差反応性が全ての抗体によって認められている同じ分子によることがありえたかどうか、または、それが類似の腫瘤で相互に作用している分子の存在によったかどうか決定する、抗体７ＢＤ−３３−１のアイソレーション増幅器による免疫沈降は、増加性の緩衝厳しさの条件で実施された（５０ｍＭのトリスｐＨ ７．４、１％のトリトンＸ−１００とＮａＣｌの変更濃度：０、１５０、５００と２０００ｍＭ；更に、先に述べたようにＲＩＰＡバッファ、しかし、５００ｍＭのＮａＣｌを含むことで）。結果として生じる免疫複合体は、それから、モノクローナル抗体７ＢＤ−３３−１１Ａ、Ｈ５Ｃ６とＲＦＡＣ４で、そして、アイソタイプ対照ＩｇＧ２ａとＩｇＧ１でウエスタン免疫ブロット法によって徹底調査された。図８はＩＰ状況の厳しさを変えることが免疫複合体の形成に少しの検出可能な影響を及ぼさないことを示した。そして、それは抗体７ＢＤ−３３−１１Ａによって認められる分子（ｓ）が抗ＣＤ６３抗体とその逆によって認められもすることを示した。
【００５９】
７ＢＤ−３３−１１ＡがヒトＣＤ６３抗原と直接結合していたことを更に確認するために、ヒトＣＤ６３の細胞外領域（ループＥＣｌとＥＣ２）を含んでいる組換え型の融合ポリペプチドを表している大腸菌の溶解産物に対するウエスタン免疫ブロット法によって、その反応性は評価された。本研究のために、ＣＤ６３（ループ１とループ２−ＥＣｌとＥＣ２、それぞれ）の細胞外ループのＧＳＴ−融合構造物は、細菌発現ベクターＰＧＥＸ−４Ｔ−２（アマシャムＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）に適当な相補ＤＮＡフラグメントをサブクローニングすることによって発生した。ループをコードしている相補ＤＮＡフラグメントは、テンプレート（クローンＭＧＣ−８３３９、ＡＴＣＣ Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）として、全身のヒト相補ＤＮＡを使用してポリメラーゼ連鎖反応増幅（ＰＣＲ）によって得られた。ＥＣｌループをコードしている相補ＤＮＡは、以下のＰＣＲプライマーを使用して得られた：５つ』のプライマー（ＥＣ１＿５’）、５’ＧＣＣＧＴＧＧＧＡＴＣＣＧＧＧＧＣＡＣＡＧＣＴＴＧＴＣＣＴＧＳのものと３』プライマー（ＥＣ１＿３’）（５’ＧＡＴＧＡＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＣＡＧＡＧＡＧＣＣＡＧＧＧＧＴＡＧＣＳのもの）。ＥＣ２ループをコードしている相補ＤＮＡは、以下のＰＣＲプライマーを使用して得られた：５つ』のプライマー（ＥＣ２＿５’）５ ５’ＧＧＣＴＡＴＧＧＡＴＣＣＡＧＡＧＡＴＡＡＧＧＴＧＡＴＧＳのものと３』プライマー（ＥＣ２＿３’）（５’ＴＡＣＣＡＧＡＡＴＴＣＡＡＴＴＴＴＴＣＣＴＣＡＧＣＣＡＧＣＣＳのもの）。ＰＣＲ反応の条件は、以下の通りだった：５つの『プライマー（２５ｐｍｏｌ／μＬ）（３の２つのμＬ）』プライマー（２５ｐｍｏｌ／μＬ）の２つのμＬ、鋳型ＤＮＡ（ｐＯＴＢ−ＣＤ６３、０．７６ｍｇ／ｍＬ）の０．２のμＬとＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（インビトロゲン、バーリントン、ＯＮ）の４５．８のμＬ。ＰＣＲ反応は、以下の通りに実施された：３０が続く５分の間の９４°Ｃは、循環する：１分の間７２°Ｃで３０秒と拡張のために５５°Ｃで焼還して、サイクルにつき３０秒の間の９４°Ｃの融解。
【００６０】
サブクローニングの後、構造物（ＰＧＥＸ−４Ｔ−２ベクター単独で負の制御（相補ＤＮＡフラグメントは、ベクターにサブクローニングしなかった）を含む）は大腸菌（船荷証券−２１の重圧となる）に変わった。各々の変換からの一つのアンピシリン耐性コロニーは大きくなった、そして、それぞれの挿入相補ＤＮＡは配列決定された。相補ＤＮＡ配列が正しかったことを確認した後に、クローンの各々は、液体培養で大きくなった、そして、一般システムズ理論−融合構造物の表示は、１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオ・ガラクトピラノシド）の追加によって誘発された‖（ギブコ−ＢＲＬ；ロックビル博士）。２時間の潜伏の後、室温で、５分の間、バクテリア培養は、２００Ｏｇで遠心された。上清は成廃であった、そして、バクテリア・ペレットは非還元のＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料バッファで煮沸された。試料は、それからそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥ（５と１２パーセント）ポリアクリルアミド・スタッキングと分離ゲル類によって分析された）、そして、ウエスタン免疫ブロット法、前述のとおり。汚点膜は７ＢＤ−３３−１１Ａ、Ｈ５Ｃ６、ＲＦＡＣ４で探索された、または、ＩｇＧ２ａアイソタイプで、制御しなさい。図９で例示される結果は、７ＢＤ−３３−１１Ａが特にヒトＣＤ６３（７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器で探索される汚点のレーン６）のループ２（アミノ酸１０８−２０２）を認めて、ループ１（アミノ酸３４−５２）を認めないことを明らかにした。細菌溶解産物に対する抗体の特異性は２がａｎｔｉ−をｗｅｌｌ−ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄしたという診察によって更に確認された。そして、ＥＣ２融合ポリペプチドを表している誘導された大腸菌からの溶解産物だけの上で、ヒトＣＤ６３抗体（ＲＦ ＡＣ４とＨ５Ｃ６）はまた、類似のサイズ帯域を認識した。上記の結果の全ては、認識されるその７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器を示して、直接、ヒトＣＤ６３に、そして、特にアミノ酸１０８−２０２を含んでいる細胞外領域に結合した。
【００６１】
実施例３
Ｓ．Ｎ． １０／３４８，２３１で概説されるように、寄託番号ＰＴＡ−４８９０の下で、２００３年１月８日の２０１１０−２２０９ ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， １０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ ２０１１０−２２０９）、ブダペスト条約に従って、ハイブリドーマ細胞系７ＢＤ−３３−１１Ａは寄託された。３７の運賃込み条件１．８０８に従って、沈澱器は寄託資料の市民に有効性に押しつけられる全ての規制が特許を与えると、即座に、取り返しのつかないほど取り出されることを保証する。
【００６２】
抗体産生：
７ＢＤ−３３−１１Ａモノクローナル抗体は、コレクションと追いまき起こっている二度／週でハイブリドーマをＣＬ−１０００フラスコ（ビジネスデザインＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ）で培養することによって生産された。抗体は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇセファロース４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（アマシャムＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂａｉｅ ｄ’Ｕｒｆｅ、ＱＣ）で、標準の抗体精製処置によって精製された。
【００６３】
前述のとおり、Ｓ．Ｎ． １０／３４８，２３１で、７ＢＤ−３３−１１Ａは細胞毒性分析（表２）で、多数の陽性（抗ファス（ＥＯＳ９．１、免疫グロブリンＭ、カッパ、２０マイクログラム／ｍＬ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、サンディエゴ、ＣＡ）、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ＩｇＧｌ、カッパ、１０マイクログラム／ｍＬ、インテル・メディコ、マーカム、ＯＮ）、抗ＥＧＦＲ（Ｃ２２５、ＩｇＧｌ、カッパ、５マイクログラム／ｍＬ、Ｃｅｄａｒｌａｎｅ、ホーンビー、ＯＮ）、Ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ（１００マイクロモル、シグマ、Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ）、アジ化ナトリウム（０．１％、シグマ、Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ））で陰性の（１０７．３（抗喘ぎ、ＩｇＧｌ、カッパ、２０マイクログラム／ｍＬ、ビジネスデザインＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ）、Ｇ１５５−１７８（抗喘ぎ、ＩｇＧ２ａ、カッパ、２０マイクログラム／ｍＬ、ビジネスデザインＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ）、ＭＰＣ−Ｉ ｌ（抗原特異性未知数、ＩｇＧ２ｂ、カッパ、２０マイクログラム／ｍＬ）、Ｊ６０６（抗フルクトサン、ＩｇＧ３、カッパ、２０マイクログラム／ｍＬ）、免疫グロブリンＧ Ｂｕｆｆｅｒ（２％））対照と比較された。乳癌（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＢ−２３１）、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＭＢ−４６８）、ＭＣＦ−７）、大腸癌（ＨＴ−２９、ＳＷｌ１１６、ＳＷ６２０）、肺癌（ＮＣＩ Ｈ４６０）、卵巣癌（ＯＶＣＡＲ）、前立腺癌（ＰＣ−３）と非癌（２７ｓｋチャージカップルドデバイス、Ｈｓ８８８ルテチウム）細胞系は、試験された（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡからの全て）。Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ細胞毒性分析は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から得られた。分析は、下で概説される変化で、製造業者の指示に従って実行された。細胞は、予め定められた適当な密度で分析の前にメッキをされた。２日後に、精製された抗体または対照はメディアに希釈された、それから、１００マイクロリットルは細胞板に転写されるＮ Ｃ Ｃｌｔｌｔｔｇｏｓｅａｉｖｅｏｎｏｓ ａｏｎｒｒであって、５日の間５パーセントのＣＯ２インキュベーターで孵化した。プレートは、それから逆にすることによって空にされて、乾燥質で拭かれた。室温ＤＰＢＳはＭｇＣｌ２を含んでいる、そして、塩化カルシウムはマルチ・チャンネル・スクィーズボトルからよい各々に分配されて、３回軽くたたかれて、逆転によって空にされて、それから、乾燥質で拭かれた。ＤＰＢＳで希釈される蛍光カルセイン染料の５０マイクロリットルはＭｇＣｌ２を含んでいる、そして、塩化カルシウムはよい各々に加えられて、３０分の間５パーセントのＣＯ２インキュベーターで３７℃で暖められた。プレートはパーキン−エルマーＨＴＳ７０００蛍光プレート読本で読まれた、そして、データはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌで分析された、そして、結果は表１で表化された。データは、平均４つの実験が三通り１０で検証されて、質的に以下の様式に示されることを表した：４／４実験より大きい閾値細胞毒性（＋＋＋）、３／４実験より大きい閾値細胞毒性（＋＋）、２／４実験より大きい閾値細胞毒性（＋）。表１の印がない細胞は矛盾していて抗議する、または、効果が閾値細胞毒性より少ない。７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器抗体は胸部の細胞毒性と１５が選択的に線をひく前立腺の腫瘍細胞を示した、その一方で、非変わる正常細胞の上に無効を持った。７ＢＤ−３３−１アイソレーション増幅器は、前立腺癌細胞系の正の制御抗ファス抗体より大きな殺害を示した。比較のためにも含まれた多数の他の抗体が生物学的細胞０の分析の限定を与えられて予想通りに実行する間、化学細胞障害性の薬剤はそれらの期待される細胞傷害を誘発した。全体として、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体が多数の癌細胞タイプに対して細胞毒性活性を持つことを示された。全ての癌細胞タイプが影響されやすいというわけではなかった時から、抗体はその活性で選択的だった。さらにまた、それが非癌細胞型に対して細胞毒性を発生しなかった時から、抗体は機能的な特異性を示した。そして、それは治療的な状況の重要な要素である。
【００６４】
【表１】
【００６５】
癌と正常な細胞系の前述のパネルに対する、そして、以下の付加的な癌細胞系に対する７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器の結合；大腸（ＬＯＶＯ）、膵臓の（ＢｘＰＣ−３）、卵巣の（ＥＳ−２、ＯＣＣ−Ｉ）、そして、前立腺の（ＤＵ−１４５）、そして、以下の付加的な正常な細胞系（チャージカップルドデバイス−１１２）は、フローサイトメトリ（ＦＡＣＳ）によって評価された。細胞は、まず最初にＤＰＢＳ（Ｃａ＋＋とＭｇ＋＋なしで）で細胞単層を洗うことによって、ＦＡＣＳの準備ができていた。細胞解離バッファ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ、バーリントン、ＯＮ）はそれから、細胞が４°Ｃ（メディアを洗う）、ＭｇＣｌ２を含んでいるダルベッコ燐酸緩衝生理食塩水、塩化カルシウムと２または２５パーセントのウシ胎児血清（ＦＢＳ）で再懸濁された３７°Ｃ． Ａｆｔｅｒ遠沈殿法と収集で細胞をそれらの細胞培養プレートから除去するのに用いられて、適当な細胞密度に等分されて、引き伸ばした以上ペレットを細胞とみなした、そして、Ａｌｅｘａフルーア４８８抱合型の二次抗体の追加に３０分のＰｒｉｏｒのために氷の上で２０のμｇ／ｍＬで７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器または制御抗体（アイソタイプ制御または抗ＥＧＦＲ）を含んでいる染色メディア（ＤＰＢＳはＭｇＣｌ２と塩化カルシウム＋／−を含んでいる。そして、２パーセントがＦＢＳである）で再懸濁されて、細胞は洗浄メディアで一度洗われた。染色メディアの中のＡｌｅｘａフルーア４８８抱合型の抗体は、それから細胞がそれから最後の時洗われた２０〜３０分の間加えられて、１つのμｇ／ｍＬプロピジウム・ヨウ化物または１．５パーセントのパラホルムアルデヒドを含んでいる媒体を染色する際に再懸濁された。細胞の流動細胞獲得は、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（ビジネスデザインＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用しているＦＡＣＳｃａｎの上で試料を走らせることによって評価された。細胞のフォワード（国際販売会社）と側方散乱（ＳＳＣ）は電圧を調整することによってセットされた、そして、振幅は国際販売会社とＳＳＣ探知器に追い迫る。細胞が約１−５単位の蛍光強度の中央値で同一のピークを持ったように、３本の蛍光チャネル（ＦＬｌ、ＦＬ２とＦＬ３）のための探知器はＡｌｅｘａフルーア４８８抱合型の二次抗体が続く精製されたアイソタイプ制御抗体で染色される走行細胞によって調整された。有効な細胞は、国際販売会社とプロピジウム・ヨウ化物除外（使われるとき）のためにゲーティングによって後天性だった。各々の試料のために、約１０，０００の有効な細胞は、分析のために後天性だった、そして、起こられた示された表２で。表２はアイソタイプ制御より上に平均の蛍光強度折り目増加を表化して、質的に発表される：５未満（）；５〜５０の（＋）；５０〜１００（＋＋）；１００の（＋＋＋）より上に、そして、括弧において、細胞のパーセンテージは、染色された。
【００６６】
７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体の代表的なヒストグラムは、図９のために編集された。７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器は、胸部（ＭＢ−４６８）、大腸（ＬＯＶＯ）と前立腺（ＤＵ−１４５）癌細胞系のうちの１つに、類似の結合を胸部（ＭＢ−２３１ ＭＣＦ−７）、大腸（ＨＴ−２９、ＳＷｌ１１６とＳＷ５２０）、肺、卵巣、膵臓で前立腺（ＰＣ−３）起源と差動結合の癌線に表示した。７ＢＤ−３３−１アイソレーション増幅器の結合が非癌細胞にもあった、しかしながら、その結合は細胞毒性を発生しなかった。これは、結合がその同族の抗原の抗体結合の結果を必ずしも予示するというわけではなくて、非明らかな知見であったという更なる証拠であった。これは、異なる細胞の抗体結合の前後関係がちょうど抗体結合よりむしろｃｙｔｏｘｉｃｉｔｙで決定的なことを示唆した。
【００６７】
【表２】
【００６８】
実施例４
通常の人体組織染色
ＩＨＣ検査は、以前、ヒト（Ｓ．Ｎ． １０／６０３，００６）で７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原分布を特徴づけるために実行された。２つの抗体に対する現在の学業比較された７ＢＤ−３３−１１Ａは、１５からＣＤ６３（ＲＦ ＡＣ４とＨ５Ｃ６）に対して、以前に生化学方法で測定されるにつれて、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原がＣＤ６３であると指令した。２４の正常な人体組織に対する抗体の結合は、人間の正常な器官組織配列（傾斜マイク、Ｗａｔｅｒｖｌｉｅｔ、ＮＹ）を使用して実行された。ＡＵ第一抗体（７ＢＤ−３３−１１Ａ；ＲＦＡＣ４（Ｃｙｍｂｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、Ｈａｎｔｓ、英国）とＨ５Ｃ６抗ＣＤ６３（ビジネスデザインＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ）；そして、２０が制御する（ダコ、トロント、ＯＮ）マウスＩｇＧｉ否定）５つのμｇ／ｍｌ（前の最適化ステップの最適集中であることを分かる）の集中に対する抗体希釈剤バッファ（ダコ、トロント、ＯＮ）で希釈した。負の制御抗体は、製造業者によって全ての哺乳類の組織に負であることが示された。ＩＨＣのための処置は、以下の通りである。断面が１時間の間５８℃で乾燥器で乾燥してｄｅｐａｒａｆｆｉｎｉｚｅｄされて、コプリンのそれぞれ４分の間５回をキシレンに浸漬することによってｄｅｗａｘｅｄした２５のＴｉｓｓｕｅは、揺れる。一連の段階的なエタノール洗浄（１００％−７５％）を通しての処置の後で、断面は水の中で再水和された。スライドはそれからそれぞれ５分の間高くて、中間で、低い３０の推力設定で電子レンジで調理されるｐＨ ６（ダコ、トロント、オンタリオ）で１０ｍＭのクエン酸のバッファに没頭していて、最終的に冷たいＰＢＳに浸漬された。スライドはそれから６分の間３％の過酸化水素水に浸漬された。そして、それぞれ５分の間３回、ＰＢＳで洗われて、乾燥して、室温で５分のＵｎｉｖｅｒｓａｌ遮断解決（ダコ、トロント、オンタリオ）で暖められた。７ＢＤ−３３−１１Ａ、単クローン系マウス抗ＣＤ６３（Ｃｙｍｂｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、Ｈａｎｔｓ、英国またはダコ、トロント、オンタリオ）またはアイソタイプ制御抗体‖（黒色アスペルギルス・グルコースオキシダーゼ（存在しもしなく哺乳類の組織で誘導性でもない酵素）の方へ指示した；ダコ、トロント、オンタリオ）その働く集中（各々の抗体のための５つのμｇ／ｍＬ）に対する抗体希釈剤バッファ（ダコ、トロント、オンタリオ）の希釈されて、そして、室温の１時間の間、終夜孵化した。スライドをＰＢＳそれぞれ５分の間の３回で洗浄した。室温で３０分に供給される（ダコＥｎｖｉｓｉｏｎシステム、トロント、オンタリオ）につれて、主要な抗体の免疫反応性はＨＲＰ抱合型二次抗体で発見されていて／視覚化した。これがスライドに段をつけることになることをＰＢＳそれぞれ５分と室温で１０分の間免疫ペルオキシダーゼ染色のＤＡＢ（３，３’−ジアミノ・ベンジジンｔｅｔｒａｈｙｄｒａｃｈｌｏｒｉｄｅ、ダコ、トロント、オンタリオ）色原体基質解決を加えることによって開発される呈色反応のための３回で洗浄した。スライドを水道水で洗うことは、色素反応を終了した。マイヤーのＨｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ（シグマＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ）による対比染色の後で、滑り面は段階的なエタノール（７５−１００％）でｄｅｈｙｒｄａｔｅｄされて、キシレンで掃除された。マウンティング・メディア（ダコＦａｒａｍｏｕｎｔ、トロント、オンタリオ）を使用して、スライドはｃｏｖｅｒｓｌｉｐｐｅｄされた。スライドはＡｘｉｏｖｅｒｔ ２００（ツァイス・カナダ、トロント、ＯＮ）を使用して顕微鏡的に調べられた、そして、ディジタル画像はノーザンブロットのＥｃｌｉｐｓｅ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ミシソーガ、ＯＮ）を使用することを得て、保存した。結果は読み込まれて、勝ち取られて、病理学者によって解釈された。
【００６９】
表３は、７ＢＤ−３３−１１ＡとＲＦＡＣ４の結果と正常な人体組織の試験配列のＨ５Ｃ６抗ＣＤ６３染色の概要を示す。７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器による組織の染色は、以前に記載され（Ｓ．Ｎ． １０／６０３，００６）てそれと類似している。７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器がさまざまな細胞型に制限された結合を見せたが、マクロファージ、リンパ球と線維芽細胞を浸透させることに結合を持った点に再び注意されなければならない。ＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ６抗体は、割に各々に類似の染色パターンを見せた。しかしながら、ＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ６の染色パターンは７ＢＤ−３３−１１Ａで観察されてそれとは全く異なった。具体的には、抗体が正常組織のより幅広い範囲に結合したＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ６は通常、７ＢＤ−３３−１１Ａが陽性でもあってマクロファージを浸透させることだけに縛られていもしなかった組織で強度にしみをつけている高等を持った、リンパ球、そして、線維芽細胞、そして、しかし、また、大多数の上皮組織がある（図１１）。
【００７０】
７ＢＤ−３３−１１Ａが陽性だった組織は、ＲＦＡＣ４かＨ５Ｃ６抗ＣＤ６３抗体（時々より少ない強度で）が陽性でもあった。７ＢＤ−３３−１１Ａが陰性だった組織は、通常、ＲＦＡＣ４またはＨ５Ｃ６が陰性でなかった。これらの結果は７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器がＲＦＡＣ４かＨ５Ｃ６抗ＣＤ６３抗体によって認められる組織のより小さいサブセットと結合することを証明した、そして、組織の範囲内で、染色の強度は時々より少なくもあった。これらの成績は、７ＢＤ−３３−１１Ａのための抗原が正常組織の上で広く表されなかった、そして、抗体が特にヒトの限定された数の組織と結合したことを示した。一方より異なるエピトープにこれらのＩＨＣ検査のために使用されるＲＰＡＣ４かＨ５Ｃ６抗体によって認められるが、それも７ＢＤ−３３−１１ＡがＣＤ６３のエピトープに向けられたという生化学証拠を支援した。
【００７１】
【表３】
【００７２】
実施例５
ヒト胸部腫瘍組織染色
前のＩＨＣ検査は、ヒト乳癌で７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原の癌共同を決定するために行われた、そして、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体がヒト癌（Ｓ．Ｎ． １０／６０３，００６）を認識するかどうかを調べた。現在では、比較はＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ６抗ＣＤ６３とｃ−ｅｒｂＢ−２抗Ｈｅｒ２抗体を使用して行われた。乳癌組織配列は５０人の乳癌患者に由来した、そして、乳癌患者で非腫瘍性の胸部組織に由来する１０の試料が使われた（Ｉｍｇｅｎｅｘ社、サンディエゴ、ＣＡ）。以下の情報は、各々の患者に対して用意されていた：年齢（Ｃａｎｃｅｒ（ＡＪＣＣ）腫瘍の病期、リンパ節、エストロゲン受容体（ＥＲ）とｐｒｏｊｅｓｔｅｒｏｎｅレセプター（ＰＲ）状態に関する性的、アメリカのＪｏｉｎｔ委員会）。実施例４からのＩＨＣのための処置は、続かれた。ＡＵ抗体が、１．５のμｇ／ｍＬの集中が使われた抗Ｈｅｒ２抗体を除いて、５つのμｇ／ｍＬの働く集中で使われた。
【００７３】
表４、５と６と７は、乳癌組織配列の７ＢＤ−３３−１１Ａ、ＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ６抗ＣＤ６３抗体染色の概要を提供する。全体として、試験される５０人の患者の３６パーセントは、それぞれＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ６抗ＣＤ６３抗体のために８５と９４パーセントと比較して、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器抗原が陽性だった。７ＢＤ−３３−１１ＡとＲＦＡＣ４またはＨ５Ｃ６抗ＣＤ６３抗体が同じ組織を染色した症例において、試料の９７パーセントは、７ＢＤ−３３−１１Ａ（図１２）に、割にＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ６抗ＣＤ６３で高等強度染色を受けた。１０の中の７ＢＤ−３３−１１Ａ ０のために、そして、ＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ６のために、それぞれ、乳癌患者からの８つの（２つの試料は、代表的でなかった）正常な胸部組織試料からの抗ＣＤ６３抗原７は、陽性だった。エストロゲンまたはプロゲステロン受容体発現間のわずかな相互関係と７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原の表現度があった；いずれの受容体発現にもよる組織は、わずかにより高い７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原表現をした。腫瘍がそれらの段階または癌が進んだ程度に基づいて分析されたとき、結果は７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器のために高等腫瘍の病期でより大きな陽性の表現に向かう傾向を暗示した。同様の結果がＲＦＡＣ４で得られた。Ｈ５Ｃ６もエストロゲンまたはプロゲステロン受容体発現で非常にわずかな相互関係を示した、しかし、見た目の相互関係が腫瘍の病期でなかった。しかしながら、全３つの抗体のために、結果は小さいサンプルサイズによって制限された。
【００７４】
【表４】
【００７５】
【表５】
【００７６】
【表６】
【００７７】
７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器染色は、間質細胞が明らかに負だった、そして、悪性細胞のシートが陽性だった正常細胞に、割に癌細胞に特有だった。７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原で見られる細胞局在パターンは、細胞膜と細胞質に限定された。類似の膜状で細胞質の染色結果は、乳房腫瘍組織標本の上で抗ＣＤ６３抗体、ＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ６で得られた。その上、これらの抗体の両方とも、通常の胸部組織試料前文７ＢＤ−３３−１ｌＡｗａｓ否定に関して、この染色限局化パターンを示した。
【００７８】
ｃ−ｅｒｂＢ−２に対する比較において、７ＢＤ−３３−１１Ａは７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原が陽性だった１８の乳房腫瘍組織標本からの９が乳癌患者（８を表に記入しなさい、図１３）のこれまでに会ったことのない目標とされた治療的な必要を示しているＨｅｒ２表現が陰性だった完全に異なる染色側面を示した。染色の強度の違いが、７ＢＤ−３３−１１ＡとＨｅｒ２が陽性だった乳房腫瘍組織切片の間にもあった；７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原が非常に陽性だった若干の乳房腫瘍組織切片は、７ＢＤ−３３−１１Ａが乳癌患者の異なる一団を治療的に目標とすることを再び示しているＨｅｒ２とその逆が少し陽性であるだけだった。ｃ−ｅｒｂＢ−２抗体も、明らかに通常の胸部組織断片のうちの１つを染色した。
【００７９】
これらの結果は、７ＢＤ−３３−１１Ａのための抗原が乳癌患者の約３分の２によって表される可能性がある、そして、それらの半分がＨｅｒ２抗原が完全に陰性だったことを示唆した。染色パターンは患者試料で、抗体が悪性細胞に非常に特有であることを示した、そして、７ＢＤ−３３−ＨＡ抗原はそれによってそれを魅力的なｄｒｕｇａｂｌｅな目標としている細胞膜の上で存在した。類似的である‖より多くが７ＢＤ−３３−１１Ａの染色を制限して非常に対、ＫＦＡＣ４かＨ５Ｃ６抗ＣＤ６３抗体は、再び７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器エピトープの可能性を示すＣＤ６３．のより拘束性のエピトープである
【００８０】
【表７】
【００８１】
【表８】
【００８２】
実施例６
ヒト前立腺の組織染色
ＢＤ−３３−１１Ａ抗原が乳癌に加えて他のヒト癌組織の上で表されたかどうか決定する、複数のヒト腫瘍組織配列は、７ＢＤ−３３−１１Ａで探索された（Ｓ．Ｎ． １０／６０３，００６；Ｉｍｇｅｎｅｘ、サンディエゴ、ＣＡ）。それらの研究を進める際に、染色パターンｏｆ７ＢＤ−３３−ｌアイソレーション増幅器は、人間の前立腺腫瘍組織配列（Ｉｍｇｅｎｅｘ社、サンディエゴ、ＣＡ）の上で決定された。処置が使用した染色は、実施例４で概説されるものと同様だった。ＡＵ抗体が、５つのμｇ／ｍＬの働く集中で使われた。
【００８３】
表９で概説されるように、７ＢＤ−３３−１１Ａは８８パーセントのヒト前立腺癌を染色した。７ＢＤ−３３−１１Ａが同様に通常の組織切片を高輝度でけがしたにもかかわらず、膜状の染色の高等程度が割に正常な試料に腫瘍組織試料にあった。７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器抗原のために染色されなかった１つの胎児性横紋筋肉腫組織標本が、あった。また、腫瘍の病期と７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原の存在間の直接的な相互関係でなく見えた。しかしながら、結果は小さいサンプルサイズによって制限された。再び７ＢＤ−３３−１１Ａで、前立腺腫瘍組織試料の上で観察される膜状で細胞質の染色が、あった。しかしながら、膜状の染色の程度の増加が、乳房腫瘍組織標本（図１４）で見られてそれと関連してあった。通常の前立腺の組織標本のために、膜状の染色の程度のこの増加は、観察されなかった。
【００８４】
【表９】
【００８５】
従って、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器抗原が単に前立腺癌の膜の上でも乳癌の膜で以外見つかるだけではなく見えた。これらの結果は、７ＢＤ−３３−１１Ａには胸部の他に腫瘍タイプで治療薬として可能性があることを示した。
【００８６】
図中証拠の優越性は、ＣＤ６３の７ＢＤ−３３−１１Ａが異型の上で出席している高次構造上のエピトープの結合を通して抗癌効果の媒介となることをである。実施例２で、抗体が同族の抗原を２３１セルＭＤＡ−ＭＢ−のような細胞を表すことから免疫沈降させるのに用いられることができることを７ＢＤ−３３−１１Ａに明らかにされた。更に、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器抗体が特にそれに対して結合するＣＤ６３抗原性部位を表す細胞および／または組織の検出で使われることができることを示されることができた。そして、実例を示されるが、ＦＡＣＳ（細胞ＥＬＩＳＡ ｏｒＩＨＣ）に限られていない技術を利用した。
【００８７】
このように、免疫沈降された７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原がそのようなＦＡＣＳ、細胞ＥＬＩＳＡまたはＩＨＣ分析を使用しているそのような細胞または組織に７ＢＤ−３３−１１Ａの結合を阻害することができることを示されることができた。更なる（７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体で）他のａｎｔｉ−、ＣＤ６３抗体は他の型のＣＤ６３抗原を免疫沈降して、分離するのに用いられることができた、そして、抗原は分析の同一形式を使用している抗原を表す細胞または組織にそれらの抗体の結合を阻害するのに用いられることもできる。
【００８８】
実施例７
インビボのＭＤＡ−ＭＢ−２３１予防的用量反応の腫瘍実験
図１５と１６に示されるデータに関して、６〜８週間目、雌の重篤複合免疫不全マウスは、襟首で皮下に１００マイクロリットルの食塩注入されたで５００万のＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞で入れられた。マウスは、１０の４つの投与群に、ランダムに分けられた。その翌日に、着床０．２、２．０または２０ｍｇ／ｋｇの７ＢＤ−３３−１１Ａまたは２０ｍｇ／ｋｇの免疫グロブリンＧアイソタイプ制御抗体は、２．７ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭのＮａＣｌと２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４を含んだ賦形薬で、家畜濃度から希釈の後、３００マイクロリットル量で、腹腔内に投与された。同じ様式の７週の期間の間の１週当たり、抗体はそれから投与された。腫瘍成長はカリパス副木で第７の日ごと頃に測定されたか、個々の動物までＣＣＡＣエンドポイントに着いた。動物の体重は、本研究の期間の間原建築費だった。
【００８９】
処置（日５５）終了後、０．２ｍｇ／ｋｇの投与群は、アイソタイプ対照群の１５パーセントであった腫瘍成長を持った。０．２ｍｇ／ｋｇの７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器投与群の腫瘍成長の８５パーセントの減少は、対のｔ検定（ｐ＜０．０００１）で測定されるにつれて、割にアイソタイプ制御に対する有意差であると決定された。２．０と２０ｍｇ／ｋｇの投与群の両方とも、まだ処置（日５５）の終りまでに腫瘍を呈していなかった。この傾向は、治療期間を越えてよく続いた。全ての用量で、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器抗体による処置は、また、アイソタイプ制御処置群に割に生存の増加に導いた。制御処置群のマウスの全ては、日１０４（５４日後療法）までに死亡した。対照的に、０．２ｍｇ／ｋｇの群のマウスは日１９７（１４７日後療法）まで生存した、２．０ｍｇ／ｋｇの投与群のマウスの５０パーセントは日２９０（２４０日後療法）で生存している窓しきいであった、そして、２０ｍｇ／ｋｇの群の１００パーセントはまた、日２９０でまだ生存してもいた。従って、アイソタイプに対する比較の７ＢＤ−３３−１１Ａ処置、全く３つの用量、かなり還元型全身腫瘍組織量と増加した生存は、抗体を制御する。最高の服用の処置は、腫瘍成長（１００パーセント）と生存（全てのマウスは、まだ生存している）で最も大きい増加で最も大きな減少を示した。従って、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器は、人を含む他の哺乳類で治療のためにこの抗体の薬理学で製薬利点を提案している有力な抗腫瘍性の抗体である。
【００９０】
実施例８
インビボのＭＤＡ−ＭＢ−２３１確立した化学療法複合腫瘍実験
図１７と１８に関して、６〜８週間目の雌の重篤複合免疫不全マウスは、襟首で皮下に１００マイクロリットルの食塩注入されたで５００万のＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞で入れられた。腫瘍成長は、毎週、カリパス副木で測定された。大部分のコホートが４１日ポスト着床で１００のｍｍ３（範囲４８−１２２ ｍｍ３）の腫瘍容積に達したとき、８匹のマウスはランダムに４つの投与群の各々への隷下のであった。７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体、化学療法剤シスプラチン、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器とシスプラチンの組合せまたはバッファ制御は、２．７ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１３７ｎｉＭ ＮａＣｌと２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４を含んだ賦形薬で、家畜濃度から希釈の後、３００マイクロリットル量で、それぞれ１０または９ｍｇ／ｋｇの抗体またはシスプラチンで腹腔内に投与された。７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器またはバッファ制御は、それから日６４ ｐｏｓｔ−着床まで同じ様式で全体で１０の用量のために１週につき３回投与された。シスプラチンは、治療期間の日１、３と９に投与された。腫瘍成長は移植後の日１２５までカリパス副木で第７の日ごと頃に測定された、または、個々の動物がＣＣＡＣに着くまで、ｅｎｄ−は指す。動物の体重は、本研究の期間の間原建築費だった。本研究終了後、全ての動物は、ＣＣＡＣガイドラインに従って安楽死させられた。対のｔ検定を使用して、処置と関連する後処理全身腫瘍組織量減少（図１６）が、いずれの７ＢＤ−３３−１１Ａも、シスプラチンまたは２つの組合せであった。日６９（５日後処理）で、両方の７ＢＤ−３３−１１Ａ、シスプラチンと抗体−複合製剤は、バッファ制御処置と比較して平均の腫瘍容積を減少させた；７６（ｐ＜０．００１）、７９（ｐ＜０．００１）と８６パーセント（ｐ＜０．００１）それぞれ。体重が、幸福の代用物として使われた。シスプラチンと７ＢＤ−３３−１１Ａが類似の腫瘍抑制を示したにもかかわらず、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器抗体で処置にシスプラチン ｔｒｅａｔｍｅｎｔｉｎ比較で見られる重量減少の同じ程度がなかった。バッファ制御と７ＢＤ−３３−１１Ａ処置群間のほとんど差が、時点常時監視の上になかった。実際に、バッファ制御と７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器で処置される群は、治療期間の後、わずかな重量増加を示した。対照的に、シスプラチンで処置される群は、特に最終的な服用の明白な投与後であった重量減少を経験した。移植後の（シスプラチンの最終的な服用の後の４日）日５５に、シスプラチン処置群は、体重の２４−３０パーセントの損失を示した。従って、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器とシスプラチンは、ヒト乳癌疾患のよく認識されたモデルで、割にバッファ制御まで全身腫瘍組織量を降ろした。しかしながら、体重で測定されるにつれて、７ＢＤ−３３−１１Ａ治療をうけている動物はシスプラチン投与群より良好な幸福を経験した。これらの結果は薬理学で示唆する、医薬とクオリティオブライフは人を含む他の哺乳類でこの抗体ｆｏｒｔｈｅｒａｐｙの利益を得る。
【００９１】
実施例９
インビボのＭＤＡ−ＭＢ−４６８確立した化学療法複合腫瘍実験
図１９と２０に関して、６〜８週間目の雌の重篤複合免疫不全マウスは、襟首で皮下に１００マイクロリットルの食塩注入されたで２００万のＭＤＡ−ＭＢ−４６８ヒト乳癌細胞で入れられた。腫瘍成長は、毎週、カリパス副木で測定された。大部分のコホートが２７日ポスト着床で１００のｍｍ３（範囲１１−１１９ ｍｍ３）の腫瘍容積に達したとき、８匹のマウスはランダムに４つの投与群の各々への隷下のであった。７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体、化学療法剤シスプラチン、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器とシスプラチンの組合せまたはバッファ制御は、２．７ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１３７ｎｉＭ ＮａＣｌと２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４を含んだ賦形薬で、家畜濃度から希釈の後、３００マイクロリットル量で、それぞれ１０または６ｍｇ／ｋｇの抗体またはシスプラチンで腹腔内に投与された。７ＢＤ−３３−１１でＡまたはバッファ制御は、それから、移植後の日５０まで同じ様式で全体で１１の用量のために１週につき３回が続く第１の週の間、１週につき４回投与された。シスプラチンは、治療期間の日１、６、１１と１６に投与された。腫瘍成長は移植後の日６６までカリパス副木で第７の日ごと頃に測定されたか、個々の動物までＣＣＡＣエンドポイントに着いた。動物の体重は、本研究の期間の間原建築費だった。本研究終了後、全ての動物は、ＣＣＡＣガイドラインに従って安楽死させられた。
【００９２】
対のｔ検定を使用して、処置と関連する後処理全身腫瘍組織量減少（図１８）が、７ＢＤ−３３−１１Ａかシスプラチンまたは２つの組合せであった。日５５（５日後処理）で、両方の７ＢＤ−３３−１１Ａ、シスプラチンと抗体−複合製剤は、バッファ制御処置と比較して平均の腫瘍容積を減少させた；３７（ｐ＝０．３９５８）、９５（ｐ＝０．０２４）と９７パーセント（ｐ＝０．０１７）それぞれ。体重が、幸福の代用物として使われた。より大きな範囲に、７ＢＤ−３３−１１Ａとシスプラチンが腫瘍抑制を示したにもかかわらず、シスプラチンとの比較処置で７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体処置で見られる重量減少の同じ程度がなかった。バッファ制御と７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器処置群間のほとんど差が、時点常時監視の上になかった。実際に、バッファ制御と７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器で処置される群は、治療期間の間に若干のわずかな重量増加を示した。対照的に、シスプラチンで処置される群は、シスプラチンの最終的な服用が投与されたあと、特に明白だった重量減少を経験した。移植後の（シスプラチンの最終的な服用の後の４日）日４８に、シスプラチン処置群は、体重の２０パーセントの損失を示した。従って、７ＢＤ−３３−１１Ａとシスプラチンは、ヒト乳癌疾患のもう一つのよく認識されたモデルで、割にバッファ制御まで全身腫瘍組織量を降ろした。しかしながら、体重で測定されるにつれて、７ＢＤ−３３−１１Ａ治療をうけている動物はシスプラチン投与群よりあるより良好なｗｅｌｌ−を経験した。全部で、７ＢＤ−３３−１１Ａがヒト癌のマルチプル・モデルで重要な利点（改善された生存、割に処置を制御する減少した全身腫瘍組織量と割に化学療法に対するより良好な耐容性）を発生したこれらの結果は、暗示する薬理学の、製薬の、そして、良質な人を含む他の哺乳類の治療のためのこの抗体の生命利点。
【００９３】
図中証拠の優越性は、ＣＤ６３の細胞外ループ２で出席しているエピトープの７ＢＤ−３３−１１Ａが結合を通して抗癌効果の媒介となることをである。実施例２で、抗体が同族の抗原を２３１セルＭＤＡ−ＭＢ−のような細胞を表すことから免疫沈降させるのに用いられることができることを７ＢＤ−３３−１１Ａに明らかにされた。更に、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器抗体が特にそれに対して結合するＣＤ６３抗原性部位を表す細胞および／または組織の検出で使われることができることを示されることができた。そして、実例を示されるが、ＦＡＣＳ、細胞ＥＬＩＳＡまたはＩＨＣに限られていない技術を利用した。
【００９４】
このように、免疫沈降された７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原がＦＡＣＳ、細胞ＥＬＩＳＡまたはＩＨＣ分析を使用しているそのような細胞または組織に７ＢＤ−３３−１１Ａの結合を阻害することができることを示されることができた。更に、７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器抗体と同様に、他の抗ＣＤ６３抗体は他の型のＣＤ６３抗原を免疫沈降して、分離するのに用いられることができた、そして、抗原は分析の同一形式を使用している抗原を表す細胞または組織にそれらの抗体の結合を阻害するのに用いられることもできる。この仕様で言及されるＡＵ特許と刊行物は、発明が関係する当業者のレベルを表す。あたかも個々の刊行が参照によって組み込まれることを特に、そして、個々に示されるかのように、全ての特許と刊行物は同じ範囲への言及によって組み込まれてこの中にある。
【００９５】
発明の特定の形状が例示される間、それが記載されてこの中の部品の特異的な形状または配置に限られていることになっていなくて、示されることになっていないと理解されることになっている。さまざまな変化が発明の範囲から出発することなくなされる可能性があることは当業者にとって明らかである、そして、発明は示されて、明細書で記述されることに限られて考慮されることになっていない。当業者は、直ちに本発明が物体を実行するのにかなり適していると認めて、その中で固有のそれらと同様に、言及される終わりと利点を得る。この中に記載されるどんなオリゴヌクレオチドでも、ペプチド、ポリペプチド、生物学的に関連した合成物、方法、処置と技術は、現在好ましい実施形態を代表して、典型的なことを目的として、範囲に対する制限を、意図しない。その中の変化と他の用途が、発明の精神の範囲内で含まれて、添付の請求項の範囲によって定義される当業者の心に浮かぶ。発明が特異的な好ましい実施形態と関連して記載された、それは理解されなければならないその発明請求する‖そのような特異的な実施形態に過度に制限しなければならない。実際、当業者にとって明らかである発明を実行するための描かれたモードのさまざまな変形は、以下の請求項の範囲内のことを目的とする。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】ＭＤＡ−ＭＢ−まる２３１細胞可溶化物（レーン１）または膜（レーン２と３）のウエスタンブロットは、７ＢＤ−３３−１１Ａ（パネルＡ）またはアイソタイプ対照（パネルＢ）と深く探った。分子量マーカーは、左で示される。
【図２】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜のウエスタンブロットは、７ＢＤ−３３−ＨＡで深く探った。レーン１：還元性の状況の下で動く膜。レーン２：膜は、非還元の状況の下で動作する。分子量マーカーは、左で示される。
【図３】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜に対する７ＢＤ−３３−１１Ａの結合の脱グリコシルの効果。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜は、ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄａｓｔ Ｆで処置を受けた（ＰＮＡＧアーゼ；レーン１）、Ｏ−グリカナーゼ（レーン２）、シアリダーゼ（レーン３）、ＰＮＡＧアーゼ、Ｏ−グリカナーゼとシアリダーゼ（レーン４）の組合せ、ＰＮＡＧアーゼ、Ｏ−グリカナーゼ、シアリダーゼ、ガラクトシダーゼとグルコサミニダーゼ（レーン５）の組合せまたはバッファ制御（レーン６）。分子量マーカーは、左で示される。
【図４】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（パネルＡ）、そして、膜タンパク質が７ＢＤ−３３−１１Ａで免疫沈降したＭＤＡ−ＭＢ−２３１のウエスタンブロット（パネルＢ）。レーンＡアイソタイプ制御免疫沈殿タンパク質（レーンＢ）：７ＢＤ−３３−１１Ａは、タンパク質とレーンＴＭを免疫沈降した：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜タンパク質となりなさい。角箱は、ウエスタンブロットでＳＤＳ−ＰＡＧＥとレーンＴＭでレーンＢから同じ帯域を概説する。分子量マーカーは、左で示される。
【図５】サーチ・サマリー・テーブル。
【図６】ＭＡＳＣＯＴサーチ・サマリー・テーブル。
【図７ａ】タンパク質のウエスタンブロットは、７ＢＤ−３３−１１Ａ（パネルＡ）、抗ＣＤ６３（ＲＦＡＣ４のクローン作成、パネルＢ）、ＩｇＧ２ａアイソタイプ制御（パネルＣ）とＩｇＧｌアイソタイプ対照（パネルＤ）と深く探った。レーンＡ：全ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜タンパク質；レーンＢ：７ＢＤ−３３−１１Ａは、タンパク質を免疫沈降した；レーンＣ：抗ＣＤ６３（ＲＦＡＣ４）は、タンパク質（レーンＤ）を免疫沈降した：ＩｇＧ２ａアイソタイプ制御免疫沈殿タンパク質とレーンＥ：ＩｇＧｌアイソタイプ制御は、タンパク質を免疫沈降した。分子量マーカーは、左で示される。
【図７ｂ】タンパク質のウエスタンブロットは、７ＢＤ−３３−１１Ａ（パネルＡ）、抗ＣＤ６３（Ｈ５Ｃ６のクローンを作成、パネル Ｂ）、ＩｇＧ２ａアイソタイプ制御（パネルＣ）とＩｇＧｌアイソタイプ対照（パネルＤ）と深く探った。レーンＡ：全ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜タンパク質；レーンＢ：７ＢＤ−３３−１１Ａは、タンパク質を免疫沈降した；レーンＣ：抗ＣＤ６３（Ｈ５Ｃ６）は、タンパク質（レーンＤ）を免疫沈降した：ＩｇＧ２ａアイソタイプ制御免疫沈殿タンパク質とレーンＥ：ＩｇＧｌアイソタイプ制御は、タンパク質を免疫沈降した。分子量マーカーは、左で示される。
【図８】タンパク質のウエスタンブロットは、７ＢＤ−３３−１１Ａ（パネルＡ）、抗ＣＤ６３（ＲＦＡＣ４のクローンを作成、パネル Ｂ）、抗ＣＤ６３（Ｈ５Ｃ６のクローンを作成、パネル Ｃ）、ＩｇＧ２ａアイソタイプ制御（パネルＤ）とＩｇＧｌアイソタイプ対照（パネルＥ）と深く探った。レーン１−５は、７ＢＤ−３３−１１Ａ免疫沈殿タンパク質とレインズ６−１０がＩｇＧ２ａアイソタイプ制御免疫沈殿タンパク質を含むことを含む。レーン１と６：ＮａＣｌでない、レインズ２と７：１５０ｎｉＭ ＮａＣｌ、レインズ３と８：５００ｍＭのＮａＣｌ、レインズ４と９：２０００ｍＭのＮａＣｌとレインズ５と１０：ＲＩＰＡバッファ。
【図９】タンパク質のウエスタンブロットは、７ＢＤ−３３−１１Ａ（パネルＡ）、抗ＣＤ６３（ＲＦＡＣ４のクローンを作成、パネル Ｂ）、抗ＣＤ６３（Ｈ５Ｃ６のクローンを作成、パネル Ｃ）、ＩｇＧ２ａアイソタイプ制御（パネルＤ）とクーマシーＣｏｌｌｏｉｄａｌ Ｂｌｕｅタンパク質染色液（パネルＥ）で深く探った。レーン１：非によって誘発されたベクター（レーン２）単独：非によって誘発された一般システムズ理論−ＥＣｌ（レーン３）：非−は、一般システムズ理論−ＥＣ２（レーン４）を誘発した：誘発されたベクター（レーン５）単独：誘発された一般システムズ理論−ＥＣｌとレーン６：誘発された一般システムズ理論−ＥＣ２。分子量マーカーは、左で示される。
【図１０】７ＢＤ−３３−１１Ａ、アイソタイプ対照と抗ＥＧＦＲの代表的なＦＡＣＳヒストグラムは、いくつかの癌細胞系と非癌細胞に対して指示した。
【図１１】正常な人体組織配列から大腸の組織部分の上で７ＢＤ−３３−１１Ａ（Ａ）、アイソタイプ負の制御（Ｂ）、抗ＣＤ６３（ＲＦ ＡＣ４）抗体または抗ＣＤ６３（Ｈ５Ｃ６）抗体（Ｄ）で得られる製本見本を示している代表的な顕微鏡写真器。７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器、ＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ６は、粘膜固有層でマクロファージとリンパ球のためにポジティブ染色法を示した。ＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ６も、粘膜のｅｐｉｔｈｅｌｉｅｕｍのために強い染色を示した。拡大は、２００Ｘである。
【図１２】ヒト乳癌組織配列から浸潤性の腺管癌の組織部分の上で７ＢＤ−３３−１１Ａ（Ａ）、アイソタイプ負の制御（Ｂ）、抗ＣＤ６３（ＲＦＡＣ４）抗体または抗ＣＤ６３（Ｈ５Ｃ６）抗体（Ｄ）で得られる製本見本を示している代表的な顕微鏡写真器。７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器は、ＲＦＡＣ４かＨ５Ｃ６抗体に割に腫瘍細胞のためにより弱いポジティブ染色法を示した。拡大は、２００Ｘである。
【図１３】ヒト乳癌組織配列から浸潤性の腺管癌の組織部分の上で７ＢＤ−３３−１１Ａ（Ａ）または抗Ｈｅｒ２（ｃ−ｅｒｂＢ−２）抗体（Ｂ）で得られる製本見本を示している代表的な顕微鏡写真器。７ＢＤ−３３−１アイソレーション増幅器は、ａｎｔｉ−に割に腫瘍細胞のためにネガティブ染色を示したＨｅｒ２抗体を染色している強い良い面を示した。拡大は、２００Ｘである。
【図１４】ヒトの前立腺癌組織配列から前立腺アデニカルシノーマ （Ａ）または通常の前立腺（Ｂ）の組織部分の上で７ＢＤ−３３−１１Ａで得られる製本見本を示している代表的な顕微鏡写真器。７ＢＤ−３３−１１Ａは、腺癌組織切片で腫瘍細胞のために強い陽性の膜状の染色を示した。７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器は、通常の前立腺の組織切片で腺上皮の膜状で細胞質の染色を示した。拡大は、２００Ｘである。
【図１５】、７ＢＤ−３３−１１Ａの効果または用量反応の予防ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌モデルの腫瘍成長に関するアイソタイプ制御。破線は、抗体が投与された期間を示す。データ点は、平均の＋／−ＳＥＭを表す。
【図１６】７ＢＤ−３３−１でアイソレーション増幅器による腫瘍を含んだマウス後処理または用量反応の予防的ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植検査のアイソタイプ制御抗体の残存。
【図１７】確立したＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌モデルの腫瘍成長に関する７ＢＤ−３３−１１Ａ、シスプラチン、７ＢＤ−３３−１１Ａ ＋ シスプラチンまたはバッファ制御の効果。破線は、抗体が投与された期間を示す。データ点は、平均の＋／−ＳＥＭを表す。
【図１８】確立したＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌モデルの体重の７ＢＤ−３３−１１Ａ、シスプラチン、７ＢＤ−３３−１１Ａ ＋ シスプラチンまたはバッファ制御の効果。
【図１９】確立したＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌モデルの腫瘍成長に関する７ＢＤ−３３−１１Ａ、シスプラチン、７ＢＤ−３３−１１Ａ ＋ シスプラチンまたはバッファ制御の効果。破線は、抗体／シスプラチンが投与された期間を示す。データ点は、平均の＋／−ＳＥＭを表す。
【図２０】確立したＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌モデルの体重の７ＢＤ−３３−１１Ａ、シスプラチン、７ＢＤ−３３−１１Ａ ＋ シスプラチンまたはバッファ制御の効果。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、前記患者に癌疾患の処置に有用（ガン組織の細胞に対して細胞毒性にしながら特徴づけられる前記抗体またはそのフラグメント）である抗癌抗体を生産するための方法に従って発生される抗癌抗体またはそのフラグメントを投与して、非癌細胞に基本的に良性であること； そこで、前記抗体またはそのフラグメントは医薬的に許容されるアジュバントで混合物に置かれて、前記癌疾患の処置を調整するのに有効な量で投与される； 前記癌組織によって発現される抗原性部位に結合する単離モノクローナル抗体またはその結合フラグメント（モノクローナル抗体の同定された特徴をＰＴＡ−４８９０としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードしておいている抗体に束縛されながら特徴づけられる前記抗原性部位）である前記抗体、を含む方法。
【請求項２】
前記抗体またはそのフラグメントがヒト化またはキメラ化である請求項１に従って癌疾患に罹った患者を処置する方法。
【請求項３】
請求項１に従って癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、毒素、酵素、放射活性化合物、および造血細胞からなる群から選択されるメンバーでそれの前記抗体または抗原結合フラグメントを活用させること；（それによって抗体複合体を形成する）、そして、前記患者に前記抗体複合体またはそれの抱合型のフラグメントを投与すること；そこで前記抗体複合体または抱合型のフラグメントは、医薬的に許容されるアジュバントで混合物に置かれて、前記癌疾患の処置を調整するのに有効な量で投与される、方法。
【請求項４】
前記抗体またはそのフラグメントがヒト化またはキメラ化である請求項３の方法。
【請求項５】
請求項１に従って癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、前記抗体またはそのフラグメントの細胞毒性は、抗体依存性細胞毒性を通して媒介となる、方法。
【請求項６】
請求項１に従って癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、前記抗体またはそのフラグメントの細胞毒性は、補体依存性細胞毒性を通して媒介となる、方法。
【請求項７】
請求項１に従って癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、前記抗体またはそのフラグメントの細胞毒性は、細胞化学結合の加水分解の触媒作用を及ぼすことを通して媒介となる、方法。
【請求項８】
請求項１に従って癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、前記抗体またはそのフラグメントの細胞毒性は、腫瘍細胞にあっている推定上の癌抗原に対して免疫応答をもたらすことを通して媒介となる、方法。
【請求項９】
請求項１に従って癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、前記抗体またはそのフラグメントの細胞毒性は、それらの機能に干渉するために、細胞膜タンパク質のターゲッティングを通して媒介となる、方法。
【請求項１０】
請求項１に従って癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、前記抗体またはそのフラグメントの細胞毒性は、細胞殺傷を開始させるシグナルを発生するために、効果的細胞のタンパク質で、構造的変化の生産を通して媒介となる、方法。
【請求項１１】
請求項１に従って癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、生産の前記方法は、特定の個人から得られるガンで非癌細胞を含んでいる組織標本を利用する、方法。
【請求項１２】
癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、癌疾患の処置に有用である抗癌抗体を生産するための方法に従って生じられて、前記患者にそれの抗体または抗原結合フラグメントを投与することは、ガン組織の細胞に対して細胞毒性で、非癌細胞に基本的に良性の抗体であり、そこで前記抗体はＰＴＡ−４８９０としてのＡＴＣＣまたはそれの抗原結合フラグメントで寄託されるクローンでコードされる単離モノクローナル抗体であって、医薬的に許容されるアジュバントで混合物に置かれて、前記癌疾患の処置を調整するのに有効な量で投与される、方法。
【請求項１３】
前記抗体またはそのフラグメントがヒト化またはキメラ化である請求項１２に従って癌疾患に罹った患者を処置する方法。
【請求項１４】
請求項１２に従って癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、抗体複合体が形成されるそれによって毒素、酵素、放射活性化合物、および造血細胞からなる群から選択されるメンバーで前記抗体またはそのフラグメントを活用させること；そして、前記患者に前記抗体複合体ｓまたはそれのフラグメントを投与することを含み、そこで前記抱合型の抗体は医薬的に許容されるアジュバントで混合物に置かれて、前記癌疾患の処置を調整するのに有効な量で投与される、方法。
【請求項１５】
請求項１４の方法、前記抗体またはそのフラグメントが前記サブセットから選択されるその点では、ヒト化またはキメラ化である、方法。
【請求項１６】
請求項１２に従って癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、前記抗体またはそのフラグメントの細胞毒性は、抗体依存性細胞毒性を通して媒介となる、方法。
【請求項１７】
請求項１２に従って癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、前記抗体またはそのフラグメントの細胞毒性は、補体依存性細胞毒性を通して媒介となる、方法。
【請求項１８】
請求項１２に従って癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、前記抗体またはそのフラグメントの細胞毒性は、細胞化学結合の加水分解の触媒作用を及ぼすことを通して媒介となる、方法。
【請求項１９】
請求項１２に従って癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、前記抗体またはそのフラグメントの細胞毒性は、腫瘍細胞にあっている推定上の癌抗原に対して免疫応答をもたらすことを通して媒介となる、方法。
【請求項２０】
請求項１２に従って癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、前記抗体またはそのフラグメントの細胞毒性は、それらの機能に干渉するために、細胞膜タンパク質のターゲッティングを通して媒介となる、方法。
【請求項２１】
そこで請求項１２に従って癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、前記抗体またはそのフラグメントの細胞毒性は、細胞殺傷を開始させるシグナルを発生するために、効果的細胞のタンパク質で、構造的変化の生産を通して媒介となる、方法。
【請求項２２】
請求項１２に従って癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、生産の前記方法は、特定の個人から得られるガンで非癌細胞を含んでいる組織標本を利用する、方法。
【請求項２３】
細胞表面の上でＣＤ６３抗原性部位を表すヒト腫瘍細胞の細胞毒性の媒介となる方法であって、結合している単離モノクローナル抗体またはその結合フラグメント、前記抗体または抗原で前記腫瘍細胞を接触させることは、それについて前記表されたＣＤ６３抗原性部位（ＰＴＡ−４８９０、それによって細胞細胞傷害が前記結合の結果として起こるのと同程度モノクローナル抗体の同定された特徴をＡＴＣＣで寄託されるクローンでコードしておいて抗体によって結合されて特徴づけられる前記抗原性部位）と結合する単離モノクローナル抗体またはその結合フラグメントであることを分解することを含む、方法。
【請求項２４】
請求項２３の方法であって、単離抗体またはその抗原結合フラグメントがヒト化またはキメラ化である、方法。
【請求項２５】
請求項２３の方法であって、前記単離抗体またはその抗原結合フラグメントが抗体複合体が形成されるそれによって細胞毒性部位、酵素、放射性化合物、および造血細胞からなる群から選択されるメンバーで抱合型である、方法。
【請求項２６】
請求項２３の方法であって、、単離抗体またはその抗原結合フラグメントがヒト化またはキメラ化である、方法。
【請求項２７】
請求項２３の方法であって、単離抗体またはその抗原結合フラグメントがマウスである、方法。
【請求項２８】
請求項２３の方法であって、ヒト腫瘍組織試料は、大腸、卵巣、肺、精巣、および乳房組織からなる群から選択される組織から生じている腫瘍から得られる、方法。
【請求項２９】
ＡＴＣＣでＰＴＡ−４８９０として寄託されるクローンでコードされる単離モノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメントと特異的に結合するＣＤ６３抗原性部位を発現する細胞の存在を決定する結合アッセイであって、細胞試料を提供すること、単離モノクローナル抗体またはその結合フラグメント、前記抗体またはそれの抗原結合フラグメントに前記表されたＣＤ６３抗原性部位と結合する単離モノクローナル抗体またはその結合フラグメントであることを提供して、モノクローナル抗体の同定された特徴をＰＴＡ−４８９０としてＡＴＣＣで寄託したクローンでコードしておいている抗体に束縛されながら特徴づけられる前記抗原性部位であり、前記単離モノクローナル抗体またはその結合フラグメント細胞試料と接触させ、さらに前記細胞試料で前記単離モノクローナル抗体またはその結合フラグメントの結合を決定すること、を含み、それによって、前記単離モノクローナル抗体またはその結合フラグメントを特異的に結合するＣＤ６３抗原性部位を表す細胞の存在は、決定される、結合アッセイ。
【請求項３０】
細胞試料が大腸、卵巣、肺、精巣、および乳房組織からなる群から選択される組織から生じている腫瘍から得られる請求項２９の結合アッセイ。
【請求項３１】
単離モノクローナル抗体またはその結合フラグメントと特異的に結合するＣＤ６３抗原性部位を表す試料の細胞のための分離またはスクリーニングするための方法であり、前記抗原性部位がモノクローナル抗体の同定された特徴を持つ抗体に結合していることを特徴とし、該モノクローナル抗体はＰＴＡ−４８９０としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされている方法であって、細胞試料を提供すること；それについて、前記表されたＣＤ６３抗原性部位（４３でありながら特徴づけられる前記抗原性部位）と結合する単離モノクローナル抗体またはその結合フラグメントである単離モノクローナル抗体またはその結合フラグメント、前記抗体または抗原結合フラグメントを提供すること、ＰＴＡ−４８９０としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードしたモノクローナル抗体の同定された特徴を持っている抗体が結合しているという特徴を持ち、前記細胞試料で前記単離モノクローナル抗体またはその結合フラグメントを接触させること、そして、前記細胞試料で前記単離モノクローナル抗体またはその結合フラグメントの結合を決定すること、ＰＴＡ−４８９０としてのＡＴＣＣに寄託されたクローンまたはそれの抗原結合フラグメントによってコードされる単離モノクローナル抗体を特異的に結合するＣＤ６３抗原性部位を表すそれによって前記細胞は前記結合によって分離され、前記細胞試料のそれらの存在は確認される、方法。
【請求項３２】
細胞試料が大腸、卵巣、肺、精巣、および乳房組織からなる群から選択される組織から生じている腫瘍から得られる請求項３１の方法。
【請求項３３】
前記腫瘍がモノクローナル抗体を特異的に結合する抗原を表す、または、前記ほ乳類の全身腫瘍組織量を減らすために効果的量、それによって進行が遅延する疾患および／または生存で前記ほ乳類に前記モノクローナル抗体を投与することを成立している寄託番号ＰＴＡ−４８９０が延長されるにつれて、モノクローナル抗体の同定された特徴をクローンでコードしておく抗原結合フラグメントがそれについてＡＴＣＣで寄託した哺乳類でヒト腫瘍を処置することによって生存および／または遅延疾患進行を延長する方法。
【請求項３４】
前記抗体が細胞毒性部位に抱合型である請求項３３の方法。
【請求項３５】
前記細胞毒性部位が放射性同位元素である請求項３３の方法。
【請求項３６】
前記抗体が補体を活性化する請求項３３の方法。
【請求項３７】
前記抗体が抗体依存性細胞障害作用の媒介となる請求項３３の方法。
【請求項３８】
前記抗体がマウス抗体である請求項３３の方法。
【請求項３９】
前記抗体がヒト化抗体である請求項３３の方法。
【請求項４０】
前記抗体がキメラ化抗体である請求項３３の方法。
【請求項１】
癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、前記患者に癌疾患の処置に有用（ガン組織の細胞に対して細胞毒性にしながら特徴づけられる前記抗体またはそのフラグメント）である抗癌抗体を生産するための方法に従って発生される抗癌抗体またはそのフラグメントを投与して、非癌細胞に基本的に良性であること； そこで、前記抗体またはそのフラグメントは医薬的に許容されるアジュバントで混合物に置かれて、前記癌疾患の処置を調整するのに有効な量で投与される； 前記癌組織によって発現される抗原性部位に結合する単離モノクローナル抗体またはその結合フラグメント（モノクローナル抗体の同定された特徴をＰＴＡ−４８９０としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードしておいている抗体に束縛されながら特徴づけられる前記抗原性部位）である前記抗体、を含む方法。
【請求項２】
前記抗体またはそのフラグメントがヒト化またはキメラ化である請求項１に従って癌疾患に罹った患者を処置する方法。
【請求項３】
請求項１に従って癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、毒素、酵素、放射活性化合物、および造血細胞からなる群から選択されるメンバーでそれの前記抗体または抗原結合フラグメントを活用させること；（それによって抗体複合体を形成する）、そして、前記患者に前記抗体複合体またはそれの抱合型のフラグメントを投与すること；そこで前記抗体複合体または抱合型のフラグメントは、医薬的に許容されるアジュバントで混合物に置かれて、前記癌疾患の処置を調整するのに有効な量で投与される、方法。
【請求項４】
前記抗体またはそのフラグメントがヒト化またはキメラ化である請求項３の方法。
【請求項５】
請求項１に従って癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、前記抗体またはそのフラグメントの細胞毒性は、抗体依存性細胞毒性を通して媒介となる、方法。
【請求項６】
請求項１に従って癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、前記抗体またはそのフラグメントの細胞毒性は、補体依存性細胞毒性を通して媒介となる、方法。
【請求項７】
請求項１に従って癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、前記抗体またはそのフラグメントの細胞毒性は、細胞化学結合の加水分解の触媒作用を及ぼすことを通して媒介となる、方法。
【請求項８】
請求項１に従って癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、前記抗体またはそのフラグメントの細胞毒性は、腫瘍細胞にあっている推定上の癌抗原に対して免疫応答をもたらすことを通して媒介となる、方法。
【請求項９】
請求項１に従って癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、前記抗体またはそのフラグメントの細胞毒性は、それらの機能に干渉するために、細胞膜タンパク質のターゲッティングを通して媒介となる、方法。
【請求項１０】
請求項１に従って癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、前記抗体またはそのフラグメントの細胞毒性は、細胞殺傷を開始させるシグナルを発生するために、効果的細胞のタンパク質で、構造的変化の生産を通して媒介となる、方法。
【請求項１１】
請求項１に従って癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、生産の前記方法は、特定の個人から得られるガンで非癌細胞を含んでいる組織標本を利用する、方法。
【請求項１２】
癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、癌疾患の処置に有用である抗癌抗体を生産するための方法に従って生じられて、前記患者にそれの抗体または抗原結合フラグメントを投与することは、ガン組織の細胞に対して細胞毒性で、非癌細胞に基本的に良性の抗体であり、そこで前記抗体はＰＴＡ−４８９０としてのＡＴＣＣまたはそれの抗原結合フラグメントで寄託されるクローンでコードされる単離モノクローナル抗体であって、医薬的に許容されるアジュバントで混合物に置かれて、前記癌疾患の処置を調整するのに有効な量で投与される、方法。
【請求項１３】
前記抗体またはそのフラグメントがヒト化またはキメラ化である請求項１２に従って癌疾患に罹った患者を処置する方法。
【請求項１４】
請求項１２に従って癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、抗体複合体が形成されるそれによって毒素、酵素、放射活性化合物、および造血細胞からなる群から選択されるメンバーで前記抗体またはそのフラグメントを活用させること；そして、前記患者に前記抗体複合体ｓまたはそれのフラグメントを投与することを含み、そこで前記抱合型の抗体は医薬的に許容されるアジュバントで混合物に置かれて、前記癌疾患の処置を調整するのに有効な量で投与される、方法。
【請求項１５】
請求項１４の方法、前記抗体またはそのフラグメントが前記サブセットから選択されるその点では、ヒト化またはキメラ化である、方法。
【請求項１６】
請求項１２に従って癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、前記抗体またはそのフラグメントの細胞毒性は、抗体依存性細胞毒性を通して媒介となる、方法。
【請求項１７】
請求項１２に従って癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、前記抗体またはそのフラグメントの細胞毒性は、補体依存性細胞毒性を通して媒介となる、方法。
【請求項１８】
請求項１２に従って癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、前記抗体またはそのフラグメントの細胞毒性は、細胞化学結合の加水分解の触媒作用を及ぼすことを通して媒介となる、方法。
【請求項１９】
請求項１２に従って癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、前記抗体またはそのフラグメントの細胞毒性は、腫瘍細胞にあっている推定上の癌抗原に対して免疫応答をもたらすことを通して媒介となる、方法。
【請求項２０】
請求項１２に従って癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、前記抗体またはそのフラグメントの細胞毒性は、それらの機能に干渉するために、細胞膜タンパク質のターゲッティングを通して媒介となる、方法。
【請求項２１】
そこで請求項１２に従って癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、前記抗体またはそのフラグメントの細胞毒性は、細胞殺傷を開始させるシグナルを発生するために、効果的細胞のタンパク質で、構造的変化の生産を通して媒介となる、方法。
【請求項２２】
請求項１２に従って癌疾患に罹った患者を処置する方法であって、生産の前記方法は、特定の個人から得られるガンで非癌細胞を含んでいる組織標本を利用する、方法。
【請求項２３】
細胞表面の上でＣＤ６３抗原性部位を表すヒト腫瘍細胞の細胞毒性の媒介となる方法であって、結合している単離モノクローナル抗体またはその結合フラグメント、前記抗体または抗原で前記腫瘍細胞を接触させることは、それについて前記表されたＣＤ６３抗原性部位（ＰＴＡ−４８９０、それによって細胞細胞傷害が前記結合の結果として起こるのと同程度モノクローナル抗体の同定された特徴をＡＴＣＣで寄託されるクローンでコードしておいて抗体によって結合されて特徴づけられる前記抗原性部位）と結合する単離モノクローナル抗体またはその結合フラグメントであることを分解することを含む、方法。
【請求項２４】
請求項２３の方法であって、単離抗体またはその抗原結合フラグメントがヒト化またはキメラ化である、方法。
【請求項２５】
請求項２３の方法であって、前記単離抗体またはその抗原結合フラグメントが抗体複合体が形成されるそれによって細胞毒性部位、酵素、放射性化合物、および造血細胞からなる群から選択されるメンバーで抱合型である、方法。
【請求項２６】
請求項２３の方法であって、、単離抗体またはその抗原結合フラグメントがヒト化またはキメラ化である、方法。
【請求項２７】
請求項２３の方法であって、単離抗体またはその抗原結合フラグメントがマウスである、方法。
【請求項２８】
請求項２３の方法であって、ヒト腫瘍組織試料は、大腸、卵巣、肺、精巣、および乳房組織からなる群から選択される組織から生じている腫瘍から得られる、方法。
【請求項２９】
ＡＴＣＣでＰＴＡ−４８９０として寄託されるクローンでコードされる単離モノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメントと特異的に結合するＣＤ６３抗原性部位を発現する細胞の存在を決定する結合アッセイであって、細胞試料を提供すること、単離モノクローナル抗体またはその結合フラグメント、前記抗体またはそれの抗原結合フラグメントに前記表されたＣＤ６３抗原性部位と結合する単離モノクローナル抗体またはその結合フラグメントであることを提供して、モノクローナル抗体の同定された特徴をＰＴＡ−４８９０としてＡＴＣＣで寄託したクローンでコードしておいている抗体に束縛されながら特徴づけられる前記抗原性部位であり、前記単離モノクローナル抗体またはその結合フラグメント細胞試料と接触させ、さらに前記細胞試料で前記単離モノクローナル抗体またはその結合フラグメントの結合を決定すること、を含み、それによって、前記単離モノクローナル抗体またはその結合フラグメントを特異的に結合するＣＤ６３抗原性部位を表す細胞の存在は、決定される、結合アッセイ。
【請求項３０】
細胞試料が大腸、卵巣、肺、精巣、および乳房組織からなる群から選択される組織から生じている腫瘍から得られる請求項２９の結合アッセイ。
【請求項３１】
単離モノクローナル抗体またはその結合フラグメントと特異的に結合するＣＤ６３抗原性部位を表す試料の細胞のための分離またはスクリーニングするための方法であり、前記抗原性部位がモノクローナル抗体の同定された特徴を持つ抗体に結合していることを特徴とし、該モノクローナル抗体はＰＴＡ−４８９０としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされている方法であって、細胞試料を提供すること；それについて、前記表されたＣＤ６３抗原性部位（４３でありながら特徴づけられる前記抗原性部位）と結合する単離モノクローナル抗体またはその結合フラグメントである単離モノクローナル抗体またはその結合フラグメント、前記抗体または抗原結合フラグメントを提供すること、ＰＴＡ−４８９０としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードしたモノクローナル抗体の同定された特徴を持っている抗体が結合しているという特徴を持ち、前記細胞試料で前記単離モノクローナル抗体またはその結合フラグメントを接触させること、そして、前記細胞試料で前記単離モノクローナル抗体またはその結合フラグメントの結合を決定すること、ＰＴＡ−４８９０としてのＡＴＣＣに寄託されたクローンまたはそれの抗原結合フラグメントによってコードされる単離モノクローナル抗体を特異的に結合するＣＤ６３抗原性部位を表すそれによって前記細胞は前記結合によって分離され、前記細胞試料のそれらの存在は確認される、方法。
【請求項３２】
細胞試料が大腸、卵巣、肺、精巣、および乳房組織からなる群から選択される組織から生じている腫瘍から得られる請求項３１の方法。
【請求項３３】
前記腫瘍がモノクローナル抗体を特異的に結合する抗原を表す、または、前記ほ乳類の全身腫瘍組織量を減らすために効果的量、それによって進行が遅延する疾患および／または生存で前記ほ乳類に前記モノクローナル抗体を投与することを成立している寄託番号ＰＴＡ−４８９０が延長されるにつれて、モノクローナル抗体の同定された特徴をクローンでコードしておく抗原結合フラグメントがそれについてＡＴＣＣで寄託した哺乳類でヒト腫瘍を処置することによって生存および／または遅延疾患進行を延長する方法。
【請求項３４】
前記抗体が細胞毒性部位に抱合型である請求項３３の方法。
【請求項３５】
前記細胞毒性部位が放射性同位元素である請求項３３の方法。
【請求項３６】
前記抗体が補体を活性化する請求項３３の方法。
【請求項３７】
前記抗体が抗体依存性細胞障害作用の媒介となる請求項３３の方法。
【請求項３８】
前記抗体がマウス抗体である請求項３３の方法。
【請求項３９】
前記抗体がヒト化抗体である請求項３３の方法。
【請求項４０】
前記抗体がキメラ化抗体である請求項３３の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７ａ】
【図７ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７ａ】
【図７ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【公表番号】特表２００７−５３０４５８（Ｐ２００７−５３０４５８Ａ）
【公表日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５０４２２７（Ｐ２００７−５０４２２７）
【出願日】平成１７年３月２３日（２００５．３．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００５／０００４４３
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０９２３７７
【国際公開日】平成１７年１０月６日（２００５．１０．６）
【出願人】（５０４２３６５９２）アリアス リサーチ、インコーポレイテッド (28)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年３月２３日（２００５．３．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００５／０００４４３
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０９２３７７
【国際公開日】平成１７年１０月６日（２００５．１０．６）
【出願人】（５０４２３６５９２）アリアス リサーチ、インコーポレイテッド (28)
【Ｆターム（参考）】
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