石灰化調節剤及びそのスクリーニング法
【課題】ＦＧＦ２３の血管および骨石灰化調節機構を解明するとともに、血管、骨あるいは歯の石灰化を調節する予防・治療剤を提供することを課題とする。また、ＦＧＦ２３受容体、ＦＧＦ２３特異的シグナル分子と相互作用する物質のスクリーニング方法を提供することをも課題とする。
【解決手段】繊維芽細胞増殖因子２３（ＦＧＦ２３）、ＦＧＦ２３特異的受容体、特異的シグナル分子あるいはその特異的情報伝達機構を標的とする石灰化調節剤とした。
【解決手段】繊維芽細胞増殖因子２３（ＦＧＦ２３）、ＦＧＦ２３特異的受容体、特異的シグナル分子あるいはその特異的情報伝達機構を標的とする石灰化調節剤とした。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変形性関節症、異所性骨化症、動脈硬化症あるいは骨粗鬆症、くる病、骨軟化症の予防・治療剤及び歯周病に伴う歯槽骨の吸収抑制剤、歯（象牙質、セメント質）の再生治療剤に関する。さらには、それら予防・治療剤のスクリーニング法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管の石灰化は骨の石灰化と多くの共通点を持ち、血管の石灰化が糖尿病、慢性腎不全、動脈硬化発症などの病態に強く関与している。また、異所石灰化には炎症、腫瘍と関連した軟組織の骨化症等も挙げられる。さらに、骨化が問題となる疾患として、軟骨の一部が骨化することで痛みを引き起こす変形性関節症が知られている。これら疾患の治療薬として、スタチン系薬剤とビスフォスフォネートなどが候補として挙げられる。前者は多様な活性の中、例えば無機リン酸の産生に預かるアルカリホスファターゼ活性を阻害し、骨化を抑制することで効果を示すと考えられる。後者はカルシウム・リンの高い親和性により石灰化沈着を阻害する。しかし、これまで、臨床的にとりわけ重要と思われる血管循環系の石灰化を直接標的とした有効な予防・治療剤はない。
【０００３】
石灰化病巣の平滑筋細胞では、骨芽細胞分化に必須の転写因子Ｒｕｎｘ２の発現が誘導され、骨芽細胞のマーカー、ナトリウム依存性リン酸輸送担体（ＮＰＴ）など骨芽細胞と共通の様々なタンパク質が作られるようになる。しかし、骨・血管の石灰化の分子機構は現在も多くが不明である。加齢・閉経に伴うカルシウム/リン代謝ホルモンの変動の中で、骨粗鬆症と血管石灰化の間には負の相関が生まれる。ここ数年、血管と骨の間の関連性が注目され、これまで骨の石灰化に直接あるいは間接的正/負因子として、タイプＩＩＩＮＰＴのＰｉｔ-１およびその調節因子等(スタニオカルシン) (特許文献１)が公知である。
【０００４】
線維芽細胞増殖因子２３(ＦＧＦ２３)は２５−３６％ホモロジーを有する２２の構造類似体のＦＧＦファミリーに属する（非特許文献１、非特許文献２）。ＦＧＦ２３は遺伝性・腫瘍性低リン血症性くる病・骨軟化症の責任因子として発見された（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）。ＦＧＦ２３は、タイプＩＩＮＰＴに属するＮｐｔ２ａ及びＮｐｔ２ｂの発現抑制を介して、腎尿細管及び腸管におけるＰｉの吸収を阻害する重要な因子である（非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８）。これらの低リン血症性くる病・骨軟化症では、血中ＦＧＦ２３が上昇し、腎臓でのＰｉの再吸収、ビタミンＤの活性化が抑制され、低リン血症を誘導して骨組織の石灰化障害をもたらす。しかし、ビタミンＤ抵抗性のＸ連鎖性低リン血症性くる病でもＦＧＦ２３の血中レベルは高値となるため（非特許文献９）、実際にＦＧＦ２３の機能が十分に理解されているとは言い難い。一方、これら疾患のみならずＦＧＦ２３は生理的なリン酸代謝に重要な働きを持つと推測されているが、血中ＰｉレベルとＦＧＦ２３レベルが相関しないケースもあり（非特許文献１０）。その生理的意義、あるいは骨への影響などの実態はほとんど明らかにされていない。
【０００５】
ＦＧＦに対する生物学的応答は特異的な細胞表面受容体のチロシンキナーゼ型受容体（ＦＧＦＲ）への結合を介して行われる。ＦＧＦＲは６つのファミリーからなり、組織での発現量、リガンドへの結合性、シグナル伝達経路の多様性から、多様な生物学的作用を発揮する。ＦＧＦ２３は、現在のところこの６つのＦＧＦＲのうち、ＦＧＦＲ１から３のｃスプライスフォームおよびＦＧＦＲ４に結合することが確認されている（非特許文献１１）。
【０００６】
また、ＦＧＦ２３とＦＧＦＲｓとの結合には老化抑制遺伝子産物Ｋｌｏｔｈｏが関与し、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）のｐ４２/４４ＭＡＰＫ（ＥＲＫ１/２）を活性化する（非特許文献１２）。これらのＦＧＦ２３のシグナル伝達機構が実際にＦＧＦ２３のリン酸代謝調節作用とどのように関連するかはまだ明らかにされていない。
【０００７】
健常時においてもＦＧＦ２３の発現は血管内皮細胞を含む多様な組織で確認されているが、中でも骨組織での発現量は他の組織のおおよそ１０倍以上である（非特許文献１３）。例えば、骨芽細胞は，ＦＧＦ２３の主要な産生細胞である（非特許文献１４）。したがって、血中ＦＧＦ２３レベルは骨組織のとりわけ骨芽細胞などでの発現調節に強く影響されると予想される。血中ＦＧＦ２３レベル、培養骨芽細胞のＦＧＦ２３の産生は活性型ビタミンＤにより正に制御されることが報告されている（非特許文献１５）。
【０００８】
しかし、血管および骨石灰化に及ぼすＦＧＦ２３及びその生物学的応答の詳細な機構に関しては、これまで不明である。
【特許文献１】特開２００５−２８１１８９
【非特許文献１】Ｍａｒｔｉｎ，Ｇ．Ｒ． Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ． １２：１５７１−１５８６（１９９８）
【非特許文献２】Ｏｒｎｉｔｚ， Ｄ． Ｍ． ａｎｄ Ｐ． Ｊ． Ｍａｒｉｅ． Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ． １６： １４４６−１４６５（２００２）
【非特許文献３】ＡＤＨＲ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ． Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． ２６：３４５−３４８．（２０００）
【非特許文献４】Ｊｏｎｓｓｏｎ， Ｋ．Ｂ．， ｅｔ ａｌ． Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：１６５６−１６６３（２００３）
【非特許文献５】Ｗｈｉｔｅ， Ｋ．ｅｔ ａｌ． Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ． ６０：２０７９−２０８６（２００１）
【非特許文献６】Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ. ２７７：２８２６５−２８２７０（２００２）
【非特許文献７】Ｙａｎ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ１０：４８９−５０２（２００５）
【非特許文献８】Ｍｉｙａｍｏｔｏ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅｒ. Ａｐｈｅｒ．Ｄｉａｌ．９：３３１−３３５（２００５）
【非特許文献９】Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８７：４９５７−４９６０（２００２）
【非特許文献１０】Ｗｅｂｅｒ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１８：１２２７−１２３４（２００３）
【非特許文献１１】Ｙｕ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１３０：３０６３−３０７４（２００３）
【非特許文献１２】Ｋｕｒｏｓｕ，Ｈ．ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１：６１２０−６１２３（２００６）
【非特許文献１３】Ｍｉｒａｍｓ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｂｏｎｅ３５：１１９２−１１９９（２００４）
【非特許文献１４】Ｍｉｒａｍｓ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｂｏｎｅ３５：１１９２−１１９９（２００４）
【非特許文献１５】Ｋｏｌｅｋ，Ｏ．Ｉ．ｅｔ ａｌ．Ａｍ. Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８９：Ｇ１０３６−１０４２（２００５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで、本発明者らは、ＦＧＦ２３の血管および骨石灰化調節機構を解明するとともに、血管、骨あるいは歯の石灰化を調節する予防・治療剤を提供することを課題とする。
【００１０】
また、ＦＧＦ２３受容体、ＦＧＦ２３特異的シグナル分子と相互作用する物質のスクリーニング方法を提供することをも課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的を達成すべく、本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、以下の成果を見出すに到った。
（１）胎仔ラット頭蓋冠由来（ＲＣ）細胞を用いた培養骨形成モデルに置いて、アデノウイルス発現ベクターを用いたヒトＦＧＦ２３の過剰発現は、骨結節の数を著しく減少させた。
（２）ＲＣ細胞におけるヒトＦＧＦ２３の過剰発現は、同細胞のＦＧＦＲとＭＡＰＫのリン酸化を促進した。
（３）ＲＣ細胞におけるヒトＦＧＦ２３の過剰発現は、同細胞のＮＰＴ活性を抑制した。
（４）ＲＣ細胞におけるヒトＦＧＦ２３の過剰発現は、骨芽細胞分化マーカーおよびリン酸代謝調節因子のｍＲＮＡの発現に影響した。
（５）ＦＧＦＲのチロシン残基リン酸化の特異的阻害剤ＳＵ５４０２はＲＣ細胞におけるヒトＦＧＦ２３の過剰発現の影響を阻害した。
（６）ラット大動脈由来平滑筋細胞のＰｉ負荷による石灰化モデルにおいて、ＦＧＦ２３
の過剰発現は石灰化を抑制した。
（７）ＦＧＦ２３の高発現部位は骨芽細胞の他、セメント芽細胞、象牙芽細胞など歯牙硬組織においても確認された。
【００１２】
本発明者は、これらの成果により、ＦＧＦ２３は硬組織の生理的石灰化，あるいは血管の石灰化等の病態と関連した石灰化を調節している局所因子であり、ＦＧＦ２３を正にあるいは負に制御することで石灰化を抑制あるいは促進できることを見出し、本発明を完成させるに到った。
【発明の効果】
【００１３】
上記発明により、ＦＧＦ２３が石灰化を調節することが明らかとなった。このＦＧＦ２３発現量の上昇あるいはその情報伝達系の活性化は、石灰化を抑制するため、変形性関節症、異所性石灰化症、動脈硬化症の予防・治療剤を開発する上で重要な手段を与える。一方、ＦＧＦ２３発現量の低下あるいはその情報伝達系の阻害は、石灰化を促進することから骨粗鬆症、くる病、骨軟化症の予防・治療剤及び歯周病に伴う歯槽骨の吸収抑制剤、歯（象牙質、セメント質）の再生治療剤を開発する上で重要な手段を与える。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明はＦＧＦ２３の石灰化の調節剤を提供する。ここで「調節」の例として、正に制御する「促進」または「活性化」の他、負に制御する「阻害」あるいは「抑制」などを含めることができる。「正」に制御する例として、ＦＧＦ２３発現量の増大あるいはＦＧＦ２３特異的情報伝達機構の活性化による石灰化の抑制を示す事ができる。また「負」に制御する例として、ＦＧＦ２３の発現低下、ＦＧＦ２３の特異的受容体への結合阻害あるいはその情報伝達系の阻害による石灰化の促進の例を示す事ができる。
【００１５】
すなわち、ＦＧＦ２３の発現上昇あるいはＦＧＦ２３特異的情報伝達機構の活性化剤は、石灰化の抑制に利用でき、石灰化が促進されている疾患・状態として変形性関節症、異所性石灰化、動脈硬化症の予防・治療に利用できる。
【００１６】
また、ＦＧＦ２３あるいはＦＧＦ２３特異的情報伝達機構の阻害剤は石灰化の促進に利用でき、石灰化が阻害又は抑制されている疾患・状態として、骨粗鬆症、くる病、骨軟化症の予防・治療剤として利用できる。さらに、ＦＧＦ２３は歯牙組織（セメント芽細胞、象牙芽細胞）においても高いレベルで発現を認めたことにより、歯周病等の歯科領域疾患や再生医療等の分野でも利用できる。
【００１７】
本発明による石灰化調節剤の具体例として、ＦＧＦ２３を挙げることができる。ＦＧＦ２３は配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるが、本発明はこれに限定されず、ＦＧＦ２３の特異的情報伝達体を調節し得る機能を有するもので、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、若しくは付加されたアミノ酸配列と類似の配列からなるＦＧＦ２３変異体であればいずれでも良い。
【００１８】
本発明のタンパク質の中で自然界に存在するものは、抽出、精製等の操作を経ることにより、天然のタンパク質として調製することができる。例えば、配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質は、ヒトの細胞、体液（血液、尿等）等から調製することができる。ここでの細胞としては、本発明のタンパク質を産生ないし発現しているものであれば特に限定されず、例えば、脾臓細胞、免疫系細胞等を用いることができる。
【００１９】
また本発明は、ＦＧＦ２３またはその変異体をコードしたＤＮＡを提供する。ヒトＦＧＦ２３をコードしたＤＮＡは、例えば、配列番号１に記載のＤＮＡを挙げることができる。また、ＦＧＦ２３変異体をコードした配列は、例えば、配列番号１に記載のヒトＦＧＦ２３をコードしたＤＮＡを改変して作製することができる。
【００２０】
ＦＧＦ２３ｃＤＮＡは、当業者により公知の方法により調製することができる。本発明のＤＮＡは、適当なゲノムＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーから調製することができる。この場合には、本発明のタンパク質の一部をコードするＤＮＡ断片からなるプローブを用意し、これを用いて周知のハイブリダイゼーション法により本発明のＤＮＡをスクリーニングする。また、本発明のＤＮＡは、適当なゲノムＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として適当なプライマーを用いたＰＣＲ法等により調製することが可能である。プライマーは、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を基に、所望のＤＮＡ断片を特異的に増幅するように設計された任意のものを用いることができる。本発明のＤＮＡを調製するために用いるゲノムＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーは、本発明のＤＮＡを含むものであればどのようなものでもよく、例えば、市販のＤＮＡライブラリーを利用することができる。また、適当な細胞からｍＲＮＡを抽出し、これを鋳型として周知の方法により作製したｃＤＮＡライブラリーを用いることもできる。
【００２１】
ＦＧＦ２３ｃＤＮＡはそのまま使用できるが、ベクターに担持させて用いることもできる。
【００２２】
本発明の更に他の局面は、本発明のＤＮＡを保持するベクターに関する。換言すれば、本発明のＤＮＡを適当なベクターに挿入して使用することができる。本発明のＤＮＡを挿入し得るものであれば、いかなるベクターを使用することも可能であるが、使用目的（クローニング、タンパク質の発現）に応じて、また、宿主細胞の種類を考慮して適当なベクターを選択して用いることが好ましい。ベクターの例としては、大腸菌を宿主とする場合、Ｍ１３ベクター、ｐＵＣ系ベクター、ｐＴ７ベクターなどが挙げられる。本発明のＤＮＡのベクターへの挿入は、制限酵素及びＤＮＡリガーゼを用いた周知の方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， １．８４， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）により行うことができる。
【００２３】
本発明の更に他の局面は、本発明のＤＮＡを保持する形質転換体に関する。即ち、本発明のＤＮＡで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体に関する。例えば、本発明のＤＮＡを、リン酸カルシウム法、エレクトロポーレーション(Ｐｏｔｔｅｒ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ ８１，７１６１−７１６５ （１９８４）)、リポフェクション(Ｆｅｌｇｎｅｒ， Ｐ．Ｌ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ ８４，７４１３−７４１７ （１９８４）)、マイクロインジェクション(Ｇｒａｅｓｓｍａｎｎ，Ｍ．& Ｇｒａｅｓｓｍａｎｎ，Ａ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ ７３，３６６−３７０ （１９７６）)等の公知の遺伝子導入方法により宿主細胞に導入して形質転換させることができる。また、上記本発明のベクターで宿主細胞を形質転換して本発明の形質転換体を得ることもできる。目的に応じて種々の宿主細胞を用いることが可能であり、例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、昆虫細胞、酵母等を用いることができる。また、真核細胞に限らず、大腸菌等の原核細胞を用いることも可能である。本発明の形質転換体を適当な条件で培養することにより、本発明のＤＮＡの発現産物（タンパク質）を大量に生産することが可能である。
【００２４】
本発明のタンパク質を適用する方法としては、例えば、直接患者に投与することが挙げられる。また、本発明のタンパク質を有効成分とする組成物を構成し、これを患者に投与することもできる。投与方法としては、経口又は静脈内、動脈内、若しくは皮下注射等の公知の方法を用いることができる。また、注射等により特定の部位（例えば、骨が減少または過剰形成している部位）に直接投与することもできる。また、本発明のＤＮＡを細胞に導入し、生体内で本発明のタンパク質を発現させることもできる。ＤＮＡの導入方法は特に限定されず、例えば、ＤＮＡ導入用プラスミド又はウイルスベクターを用いた方法、エレクトロポーレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション等の公知の方法により行うことができる。
【００２５】
本発明はまた、ＦＧＦ２３遺伝子の転写領域、プロモーター領域を含む、任意の部位を標的とするアンチセンスヌクレオチド、二本鎖ＲＮＡ、リボザイムなどの機能性核酸、及びかかる機能性核酸を有効成分として含む石灰化調節剤を提供する。このような機能性核酸は、ｓｉＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、または、修飾されたＲＮＡ鎖を少なくとも片方の鎖に含むｓｉＲＮＡまたは二本鎖ＲＮＡのいずれであってもよい。上記の機能性核酸は、静脈注射、皮下注射、経口送達、リポソーム送達または鼻腔内送達により患者へ投与され、患者の標的全身、器官、組織または細胞型に蓄積しうる。
【００２６】
他に定義しない限り、本明細書中で用いるすべての技術及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中に記載されるものと同様の又は等しい方法及び材料を本発明の実施又は試験に用いることができるが、好適な方法及び材料を以下に記載する。本明細書中に言及するすべての公開物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照として全体が組み入れられる。相反の場合、定義を含む本明細書が優先する。さらに、材料、方法、及び具体例は単に例示的なものであり、限定することを意図していない。
【００２７】
実施例
「実施例１」ＦＧＦ２３はラット胎仔頭蓋冠由来（ＲＣ）細胞培養における骨芽細胞分化と基質石灰化を抑制する
実験は、以下の方法により実施した。
１）ヒトＦＧＦ遺伝子を持つアデノウイルスベクターの構築
全長ヒトＦＧＦ２３ｃＤＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲを用いてヒト心臓のトータルＲＮＡから合成し、ｐＴＲＥ−ｓｈｕｔｔｌｅｒ２ベクター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＰａｌｏＡｌｔｏ， ＣＡ）のクローニング部位のＥｃｏＲ１及びＢａｍＨ１部位間に挿入した。Ｉ-Ｃｅｕ１及びＰＩ-Ｓｃｅ１により、Ｔｅｔ-ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅを単離し、Ａｄｅｎｏ−Ｘ ｖｉｒａｌ ＤＮＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に導入した。組換えＡｄｅｎｏ−Ｘ ＦＧＦ２３ ＤＮＡ（Ａｄ−ＦＧＦ２３）は、ＰａｃＩ消化し、直鎖状の組換えＡｄ−ＦＧＦ２３ ＤＮＡを常法に従ってＨＥＫ ２９３細胞にトランスフェクションすることによって作製した。発現調節用のアデノウイルスベクター（Ａｄ−Ｔｅｔ−ｏｆｆ）及び対照のアデノウイルスベクター（Ａｄ−βｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ；ＡＤ−βｇａｌ）は、添付資料に従って作製した。培養上清に産生されたアデノウイルス粒子はＢＤ−Ａｄｅｎｏ−Ｘ ｖｉｒｕｓ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ （ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて精製し、濃縮したアデノウイルス粒子はＨＥＫ細胞を用いてプラークフォーミングユニット（ｐｆｕ）を算出した。
２）胎仔ラット頭蓋冠由来（ＲＣ）細胞培養およびアデノウイルス感染
胎仔ラットからＲＣ細胞を分離し（Ｙｏｓｈｉｋｏ Ｙ， ｅｔ ａｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ． １４４： ４１３４−４１４３． （２００３））、０．３Ｘ１０４／ｃｍ２の細胞密度で５％胎仔血清（ＦＣＳ）、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸、抗生物質を含むα―ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ（α―ＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ-ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ, Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ, ＭＤ）を用い，７０％コンフルエンスになるまで培養した。この時点で（ｄ４）、Ａｄ−ＦＧＦ２３またはＡｄ-βｇａｌをＡｄ−Ｔｅｔ−ｏｆｆとともに２０ｐｆｕ／ｃｅｌｌの力価で感染させた。ＦＧＦ２３の過剰発現は，分化が開始される２日後が見込まれた。感染の４時間後、新鮮培地を追加し、さらに翌日新鮮培地に交換した。一方、成熟期（ｄ１４）のＲＣ細胞にも同様に２０ｐｆｕ／ｃｅｌｌの条件で感染させた。ノジュールの石灰化を誘導するために、５０ｍＭ β―グリセロリン酸（βＧＰ）を培養終了前２日前（ｄ１５）に添加した。培養は、５％ＣＯ２存在下３7℃で一般的に２日ないし３日おきに培地を交換した。
３）ウェスタンブロット
Ａｄ−ＦＧＦ２３あるいはＡｄ−βｇａｌの感染細胞は４８時間後に細胞溶解液（１００ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．５％ Ｎｏｎｉｄｅｎｔ Ｐ―４０，１ｍＭ ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌｆｌｕｏｒｉｄｅ、ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｒｏｓｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｐｅｎｚｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で可溶化した。
同様に感染させたＲＣ細胞の培養上清を回収し、一部は酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ，後述）に供した。残りは−２０℃にてアセトン沈殿を行い、沈殿物は細胞溶解液に溶解した。
【００２８】
試料はＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動の後、ニトロセルロース膜に転写し、抗ＦＧＦ２３抗体（×５００，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ, ＳａｎｔａＣｒｕｚ, ＣＡ）と４℃で一晩反応させた後、ペルオキシダーゼ標識二次抗体（×２，０００，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）で室温，１時間インキュベートした。引き続き、ＥＣＬウェスタンブロッティング検出試薬（Ｌｕｍｉ−ＬｉｇｈｔＰＬＵＳ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用い、化学発光を検出した。
４）ＥＬＩＳＡ
培養液中に分泌されたＦＧＦ２３はカイノス社ＥＬＩＳＡキット（東京）によりに定量した。
５）石灰化ノジュールの同定
ＲＣ細胞は培養終了後、１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、結節(ノジュール)をアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）染色および石灰化をフォン・コッサ染色によって同定した。
６）細胞増殖
細胞増殖速度は、３（４，５−ｄｉｍ４ｔｈｙｌ−ｔｈｉａｚｏｙａｌ−２ｙｌ）２．５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｇｒｏｍｉｄｅ ｔｈｉａｚｏｌｙｌ ｂｌｕｅ 比色法により測定した(ＭＴＴアッセイ)。
【００２９】
ＲＣ細胞を用いた培養骨形成モデル及び実験プロトコールを図１Ａに示した。未分化ＲＣ細胞は増殖、６日でコンフルエンスに達する。コンフルエンスと同時に類骨に相当する有機基質からなるノジュールの形成を伴って細胞は前骨芽細胞へと分化する。培養１４日目には骨芽細胞として成熟し、この時β―グリセロリン酸（βＧＰ）を添加すると、類骨様のノジュールは２日以内に石灰化する。アデノウイルスーヒトＦＧＦ２３ベクター（Ａｄ−ｈＦＧＦ２３）のコンストラクトは図１Ｂに示した。感染２日後に、Ａｄ−ｈＦＧＦ２３とＡｄ−βｇａｌ感染細胞で、ＦＧＦ２３の発現、培養上清のＦＧＦ２３のレベルをウェスタンブロットとＥＬＩＳＡで比較したところ、Ａｄ−ｈＦＧＦ２３感染細胞に著しい発現と分泌増加が確認された(図２Ａ、Ｂ)。また、Ａｄ−ｈＦＧＦ２３感染細胞の培養上清にはインタクトな分子サイズ（約３２ｋＤａ）と、弱いながら分解産物と思われる２つのバンド(約２６ｋＤａと約１６ｋＤａ)を認めた（図２Ｃ）。
【００３０】
Ａｄ−ｈＦＧＦ２３あるいはＡｄ−βｇａｌをｄ４及びｄ１４の成熟期のＲＣ細胞に感染させ，培養終了後（ｄ１７）の染色像の一例を図３Ａに示した。得られた染色像の計測値から、ＲＣ細胞におけるＦＧＦ２３の過剰発現はノジュールの形成と石灰化のいずれも抑制することが明らかとなった（図３Ａ，Ｂ）。
【００３１】
Ａｄ−ｈＦＧＦ２３あるいはＡｄ−βｇａｌで感染させたＲＣ細胞を２日後に低密度で継代培養し、経時的にＭＴＴアッセイを用いて細胞増殖曲線を比較したところ、両者に有意な差は認められなかった（図３Ｃ）。
【００３２】
「実施例２」ＦＧＦ２３は頭頂骨器官培養において骨形成を抑制する。
【００３３】
実験は、以下の方法により実施した。
１）ラット頭頂骨器官培養
２１日目の胎仔ラットの頭頂骨を器官培養に用いた。頭頂骨は矢状縫合に沿って半分にカットし、さらにそれを２等分した。一片の頭頂骨片をコラゲナーゼで消化し、全細胞数を計測した。Ａｄ−ＦＧＦ２３またはＡｄ−βｇａｌを２０ ｐｆｕ／ｃｅｌｌになるように頭頂骨片に４時間感染させた後、セルカルチャーインサート（ｐｏｒｅ ｓｉｚｅ ０．４−μｍ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＮＪ）に静置した。培地は２０％ＦＣＳ加ＢＧｊｂ培地を用いた。骨形成量を確認するために、カルセイン（１ μｇ/ｍｌ）を翌日に添加した。培地交換は毎日行い、さらに３日間培養した後、４％ＰＦＡで４℃，２時間固定し、７μｍの凍結切片とし、組織学的に解析した。
２）免疫染色
抗ＦＧＦ２３抗体（×１００，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を４℃で一晩反応させ、洗浄後ペルオキシダーゼ標識二次抗体及びＡＢＣ試薬（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ, Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ, ＣＡ）を説明書に準じて反応させた。切片はヘマトキシリンでカウンター染色した。陰性対象は特異的ブロッキングペプチド（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を処方に従って使用した（図省略）。
【００３４】
Ａｄ−ｈＦＧＦ２３感染させた場合，Ａｄ−βｇａｌと比較して骨表面の細胞群に強いＦＧＦ２３のシグナルが確認された（図４Ａ，Ｂ）。Ａｄ−ｈＦＧＦ２３の感染により，トルイジンブルー染色で同定される類骨層の拡大が確認された（図４Ｃ，Ｄ）。また，蓄積したカルセインの蛍光面積は減少した(図４Ｅ，Ｆ)。それらの定量値を図４Ｇに示した。
【００３５】
「実施例３」ＲＣ細胞におけるＦＧＦ２３とＦＧＦＲの共発現
実験は、以下の方法により実施した。
１）半定量的ＲＴ−ＰＣＲ及びリアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析
ＲＣ細胞のトータルＲＮＡを経時的にＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ,Ｃａｒｌａｂａｄ,ＣＡ）を用いて回収した。ｃＤＮＡはＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（東洋紡，東京）を用いて、２μｇのトータルＲＮＡから５０℃で合成した。ＰＣＲ（Ｑｉａｇｅｎ, Ｈｉｌｄｅｎ, Ｇｅｒｍａｎｙ）は標的遺伝子に最適な条件で実施した。リボゾームタンパクＬ３２を内部コントロールとして用いた。リアルタイム定量ＰＣＲは１ｘＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ （東洋紡）を用い、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Ｒｏｓｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）により実施した。オステオポンチン（ＯＰＮ）、ＡＬＰ，骨シアロプロテイン（ＢＳＰ）、オステオカルシン（ＯＣＮ）、ＦＧＦ２３、ＦＧＦＲ１（Ｒ１）、ＦＧＦＲ２（Ｒ２）、ＦＧＦＲ３（Ｒ３）の２つのスプライスフォーム(ｂとｃ)、ＦＧＦＲ４（Ｒ４）（Ｙａｎ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ．１０：４８９−５０２.（２００５））及びＬ３２プライマー配列を表１に示す。
【００３６】
ＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマーセット
【００３７】
【表１】
【００３８】
ＲＣ細胞において、Ｒ１ｃ、Ｒ２IIIc、Ｒ３ｃ ｍＲＮＡの発現を確認したが、その他のサブタイプの ｍＲＮＡは確認されなかった（図５Ａ）。定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析において、ＯＰＮ、ＡＬＰ、ＢＳＰ、ＯＣＮの連続的な発現レベルの増加は，ＲＣ細胞が期待通り未分化な骨原性細胞から前骨芽細胞を経て成熟骨芽細胞に分化したことを示している(図５Ｂ)。Ｒ１ｃ、ＲIIIｃレベルは前骨芽細胞期にピーク値を示したのに対し、Ｒ３ｃは骨芽細胞の成熟期に強い特異性を示した。
【００３９】
「実施例４」ＦＧＦ２３はＦＧＦＲのリン酸化を促進する。
【００４０】
実験は、以下の方法により実施した。
【００４１】
Ａｄ−ｈＦＧＦ２３及びＡｄ−βｇａｌを〔実施例１〕に従って感染させたＲＣ細胞を５日間培養した上清を回収（ＥＬＩＳＡでＦＧＦ２３の過剰発現を確認済み）し，α−ＭＥＭにて１０倍希釈した。成熟期（ｄ１４）ＲＣ細胞をガラススライド上に継代培養して１日放置後、血清濃度を０．１％に下げてさらに１日培養した。これに上述の希釈した培養上清を添加し，１５分後直ちに冷アセトンで５分間固定した。細胞をブロッキング後、一次抗体（抗Ｒｕｎｘ２抗体，抗リン酸化ＦＧＦＲ抗体，×１００，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を４℃で一晩反応させた。二次抗体は，フルオレッセインイソチアシアネート（ＦＩＴＣ）標識（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ, Ｉｎｃ），Ｃｙ３（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）標識したものを用いた。
【００４２】
Ａｄ−ｈＦＧＦ２３及びＡｄ−βｇａｌ感染ＲＣ細胞において、抗リン酸化ＦＧＦＲ抗体（ａｎｔｉ−ｐＦＧＦＲｓ）に対する反応性は、Ａｄ−ＦＧＦ２３感染細胞が明らかに強陽性であったのに対し、Ａｄ−βｇａｌ感染細胞はほとんど染色されなかった（図６Ａ）。また、これらの細胞はＦＧＦ２３及びＦＧＦＲ１〜ＦＧＦＲ３陽性であった（図６Ｂ）。
【００４３】
「実施例５」ＦＧＦ２３はＲＣ細胞のＦＧＦＲを介して石灰化を抑制する
実験は、以下の方法により実施した。リン酸化ＦＧＦＲ阻害剤はＳＵ５４０２（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）を使用した。
【００４４】
Ａｄ−ｈＦＧＦ２３及びＡｄ−βｇａｌを〔実施例１〕のように成熟期（ｄ１４）に感染させた。感染翌日から培地交換と共に上記のインヒビター（１０μＭ）。培養終了（ｄ１７）後、〔実施例１〕記載のようにＡＬＰ／フォン・コッサ染色を施し、ノジュールと石灰化を計測した。
【００４５】
ＦＧＦＲのリン酸化阻害剤はＦＧＦ２３によるノジュールの石灰化抑制を部分的に回復させた（図７）。
【００４６】
「実施例６」ＦＧＦ２３は、骨芽細胞分化マーカーおよびリン酸代謝調節因子のｍＲＮＡの発現を調節する。
【００４７】
実験は、以下の方法により実施した。
【００４８】
Ａｄ−ｈＦＧＦ２３またはＡｄ−βｇａｌを〔実施例１〕に従って、７０％コンフルエンス（ｄ４）及び成熟期（ｄ１４）のＲＣ細胞に感染させ、培養終了後〔実施例３〕にしたがってトータルＲＮＡを回収し、定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲに供した。〔実施例３〕の表１の骨芽細胞マーカーに加え、リン酸代謝調節因子として、ｍａｔｒｉｘ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＥＰＥ）（Ｇｏｗｅｎ， Ｌ． Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２７８：１９９８−２００７． （２００３）），ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｆｒｅｚｚｌｅｄ−ｒｅｌａｒｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ (ｓＦＲＰ)―４（Ｂｅｒｎｄｔ Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１２： ７８５-７９４， （２００３）），スタニオカルシン（ＳＴＣ）１（Ｙｏｓｈｉｋｏ， Ｙ． ｅｔ ａｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ． １４４： ４１３４−４１４３． （２００３））の分泌タンパク及びＰｉｔ−１，Ｐｉｔ−２， ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｇｅｎｅ ｗｉｔｈ ｈｏｍｏｌｏｇｉｅｓ ｔｏ ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ ｏｎ Ｘ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ（Ｐｈｅｘ）（Ｄｒｅｚｎｅｒ，Ｍ．Ｋ． Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．５７：９−１８（２０００））の膜タンパクを解析した。それぞれのプライマー配列を表２に示す。
【００４９】
ＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマーセット
【００５０】
【表２】
【００５１】
Ａｄ−ｈＦＧＦ２３をｄ４に感染した場合、Ａｄ−βｇａｌに比較して、ＯＣＮ、Ｐｈｅｘ、ＭＥＰＥのｍＲＮＡレベルは著しく低下し、ＡＬＰ、ＳＴＣ１、Ｐｉｔ−１ ｍＲＮＡのレベルも低下した。一方、ＢＳＰ、ｓＦＲＰ−４ ｍＲＮＡレベルは増加し、ＯＰＮは不変であった（図８Ａ）。一方、Ａｄ−ｈＦＧＦ２３をｄ１４に感染した場合、ＡＬＰ、Ｐｉｔ−１、Ｐｉｔ−２、ＭＥＰＥ、ＳＴＣ１ ｍＲＮＡレベルの増加、Ｐｈｅｘ及びＯＣＮ ｍＲＮＡレベルの減少を認めた。しかし、ＯＰＮ、ＢＳＰ、ｓＦＲＰ−４ ｍＲＮＡレベルは不変であった（図８Ｂ）。
【００５２】
「実施例７」ＦＧＦ２３は培養血管平滑筋のＰｉ誘導石灰化を抑制する。
【００５３】
実験は、以下の方法により実施した。
【００５４】
ラット大動脈由来平滑筋細胞（継代１５代以内）を１０％ＦＣＳ加Ｄ―ＭＥＭを用い、０．５〜０．８×１０４／ｃｍ２でプレーティングした。細胞がコンフルエンスに達した時、１．５ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）を負荷（石灰化培地）すると同時にＡｄ−ｈＦＧＦ２３またはＡｄ−βｇａｌを２０ｐｆｕ／ｃｅｌｌとなるように感染させた。感染の基本的手順は〔実施例１〕に従った。２日〜３日ごとに新鮮な石灰化培地に交換した。
感染後１０日目に細胞を洗浄後、トリス緩衝液にて洗浄後、０．６Ｎ塩酸処理し、石灰化をカルシウムＣテスト−ワコー（和光純薬工業，東京）にて測定した。
【００５５】
Ａｄ−ｈＦＧＦ２３感染平滑筋ではＡｄ−βｇａｌ感染平滑筋に比較して、リン酸負荷による石灰化を有意に抑制した（図９）。
【００５６】
「実施例８」 ＦＧＦ２３は象牙質，セメント質でも産生される。
【００５７】
成獣雄（８週齢）及び胎仔（胎生２１日）ラットの組織から〔実施例３〕に従ってトータルＲＮＡを回収し、ＦＧＦ２３の発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲで確認した。また、同ラットの歯牙組織におけるＦＧＦ２３の免疫染色をＡＢＣ法（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）により実施した。成獣雄ラットの下顎を４％パラフォルムアルデヒドにより４℃で一晩固定後、クエン酸・蟻酸溶液またはＥＤＴＡで脱灰し、パラフィン標本とした。５〜６μｍの切片を作製し、抗ＦＧＦ２３抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）は４℃で一晩反応させた。リアルタイムＰＣＲの結果、骨組織以外では歯牙組織で高い発現が確認された（図１０）。免疫染色では象牙芽細胞、セメント芽細胞がＦＧＦ２３陽性となった（図１１）。このことから、ＦＧＦ２３は硬組織の基質形成に預かる細胞（エナメル芽細胞は除く）で産生されることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
上記発明により明らかにされたＦＧＦ２３が石灰化を調節する機構、具体的にはＦＧＦ２３の発現上昇あるいはその情報伝達系の活性化は、石灰化を抑制することから変形性関節症、異所性石灰化症、動脈硬化症の予防・治療剤として利用することができる。一方、ＦＧＦ２３の発現低下あるいはその情報伝達系の阻害は、石灰化を促進することから骨粗鬆症、くる病、骨軟化症の予防・治療剤のほか、歯周病等の歯科領域疾患あるいは歯科における再生医療等にも利用できる。さらに、それら疾患の予防・治療剤をスクリーニングする方法として利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】（Ａ）：ＲＣ細胞を用いた培養骨形成モデル及び実験プロトコール。（Ｂ）：ｈＦＧＦ２３組換えアデノイウルスベクターの構造。ＩＴＲ，逆向き反復配列末端（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔｓ）。ｈＣＭＶ−１，テトラサイクリン応答配列付加サイトメガロウイルスプロモーター（ｍｉｎｉｍｕｍ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｏｆ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）。
【図２】ＲＣ細胞におけるｈＦＧＦ２３過剰発現の確認。（Ａ）：細胞におけるｈＦＧＦ２３の遺伝子とタンパクの発現。（Ｂ）：ＥＬＩＳＡによる培養上清中のｈＦＧＦ２３の定量。（Ｃ）：培養上清中のｈＦＧＦ２３タンパクの性状。
【図３】ＲＣ細胞培養の培養骨形成モデルにおけるｈＦＧＦ２３過剰発現の影響。 ｄ４（Ａ）及びｄ１４（Ｂ）ＲＣ細胞にウイルスベクターを感染させ，ｄ１７でサンプリングした。（Ａ）：ＡＬＰ及びフォン・コッサ染色。（Ｂ）：（Ａ）の染色によるＡＬＰ陽性ノジュール及び石灰化ノジュールの数。数値は平均±ＳＤ。（Ａ）のグラフ及び（Ｂ）下段のグラフは、いずれもＡｄ−βｇａｌと比較して有意差あり（（１）Ｐ＜０．０５、（２）Ｐ＜０．０１）。ｎ＝４。（Ｃ）：ｄ４ＲＣ細胞にウイルスベクターを感染後，継代培養した細胞のＭＴＴアッセイによる増殖曲線。数値は平均±ＳＤ。同日の２者間で有意差なし。ｎ＝４。
【図４】頭頂骨器官培養におけるＦＧＦ２３過剰発現の影響。（Ａ）：免疫染色によるＦＧＦ２３の過剰発現。（Ｂ）：カルセインの蛍光像。（Ｃ）：（Ｂ）のカルセイン蛍光量の定量。数値は平均±ＳＤ。いずれもＡｄ―βｇａｌとの比較で有意差あり（Ｐ＜０．０５）。ｎ＝８。
【図５】ＲＣ細胞におけるＦＧＦ２３及びＦＧＦＲｓの共発現。(Ａ)： ＲＴ−ＰＣＲによるＲＣ細胞におけるＦＧＦＲサブタイプｍＲＮＡの発現。（Ｂ）：リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲによる骨芽細胞分化に伴う骨芽細胞分化マーカー，ＦＧＦ２３及びＦＧＦＲのｍＲＮＡレベル。数値は平均±ＳＤ。ｎ＝３。
【図６】ＲＣ細胞におけるｈＦＧＦ２３の過剰発現によるＦＧＦＲの活性化。（Ａ）：抗ＦＧＦＲリン酸化抗体（ａｎｔｉ−ｐＦＧＦＲｓ）による蛍光免疫染色。（Ｂ）：抗ＦＧＦ２３抗体と抗ＦＧＦＲ１〜３抗体による染色。
【図７】ＲＣ細胞におけるｈＦＧＦ２３過剰発現による石灰化抑制に対するＦＧＦＲリン酸化阻害剤。数値は平均±ＳＤ。Ａｄ―βｇａｌとの比較で有意差あり（Ｐ＜０．０５）。ｎ＝４。
【図８】ＲＣ細胞の骨芽細胞マーカー及びＰｉ代謝関連因子ｍＲＮＡレベルにおけるＦＧＦ２３過剰発現の影響。ｄ４（Ａ）及びｄ１４（Ｂ）ＲＣ細胞にウイルスベクターを感染させ，ｄ１７でサンプリングした。数値は平均±ＳＤ。ｎ＝３。
【図９】ラット大動脈平滑筋細胞のＰｉ誘導石灰化におけるＦＧＦ２３過剰発現の影響。数値は平均±ＳＤ。Ａｄ―βｇａｌとの比較で有意差あり（Ｐ＜０．０５）。ｎ＝４。
【図１０】ＦＧＦ２３ ｍＲＮＡ発現レベル。数値は平均±ＳＤ。いずれも胎仔との比較で有意差あり（＊Ｐ＜０．０５，＊＊P＜０．０１）。ｎ＝３。Ｆｅｍｕｒ（大腿骨）、Ｃａｌｖａｒｉａ（頭頂骨）、Ｉｎｃｉｓｏｒ（切歯）、Ｂｒａｉｎ（脳）、Ｔｈｙｍｕｓ（胸腺）、Ｓｐｌｅｅｎ（脾臓）、Ｋｉｄｎｅｙ（腎臓）、Ｌｉｖｅｒ（肝臓）、Ｈｅａｒｔ（心臓）、Ｓ．ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ（小腸）。
【図１１】成獣雄ラット歯牙・歯周組織におけるＦＧＦ２３の局在。メチルグリーンは対比染色。 パネルａは切歯（ｉｒ）と臼歯（ｍｏ）、歯槽骨（ａｂ）を含む下顎矢状断。Ｐｄｌ、ｄｅ、 ｃｅ ｐｕはそれぞれ歯根膜、象牙質、セメント質、歯髄を示す。パネルｂ〜ｄはパネルａのＢ〜Ｄの強拡大。円柱状の象牙芽細胞(§)、セメント芽細胞 (Θ）、歯槽骨の骨芽細胞(＊) はｐｄｌやｐｕの細胞に比較して強い染色性を示す。歯槽骨骨細胞（矢頭）と同様基質に埋没したセメント細胞(∞) の一部も陽性。パネルｅはネガティブコントロール。パネルａのＣの領域に相当。バーは５０μｍ。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変形性関節症、異所性骨化症、動脈硬化症あるいは骨粗鬆症、くる病、骨軟化症の予防・治療剤及び歯周病に伴う歯槽骨の吸収抑制剤、歯（象牙質、セメント質）の再生治療剤に関する。さらには、それら予防・治療剤のスクリーニング法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管の石灰化は骨の石灰化と多くの共通点を持ち、血管の石灰化が糖尿病、慢性腎不全、動脈硬化発症などの病態に強く関与している。また、異所石灰化には炎症、腫瘍と関連した軟組織の骨化症等も挙げられる。さらに、骨化が問題となる疾患として、軟骨の一部が骨化することで痛みを引き起こす変形性関節症が知られている。これら疾患の治療薬として、スタチン系薬剤とビスフォスフォネートなどが候補として挙げられる。前者は多様な活性の中、例えば無機リン酸の産生に預かるアルカリホスファターゼ活性を阻害し、骨化を抑制することで効果を示すと考えられる。後者はカルシウム・リンの高い親和性により石灰化沈着を阻害する。しかし、これまで、臨床的にとりわけ重要と思われる血管循環系の石灰化を直接標的とした有効な予防・治療剤はない。
【０００３】
石灰化病巣の平滑筋細胞では、骨芽細胞分化に必須の転写因子Ｒｕｎｘ２の発現が誘導され、骨芽細胞のマーカー、ナトリウム依存性リン酸輸送担体（ＮＰＴ）など骨芽細胞と共通の様々なタンパク質が作られるようになる。しかし、骨・血管の石灰化の分子機構は現在も多くが不明である。加齢・閉経に伴うカルシウム/リン代謝ホルモンの変動の中で、骨粗鬆症と血管石灰化の間には負の相関が生まれる。ここ数年、血管と骨の間の関連性が注目され、これまで骨の石灰化に直接あるいは間接的正/負因子として、タイプＩＩＩＮＰＴのＰｉｔ-１およびその調節因子等(スタニオカルシン) (特許文献１)が公知である。
【０００４】
線維芽細胞増殖因子２３(ＦＧＦ２３)は２５−３６％ホモロジーを有する２２の構造類似体のＦＧＦファミリーに属する（非特許文献１、非特許文献２）。ＦＧＦ２３は遺伝性・腫瘍性低リン血症性くる病・骨軟化症の責任因子として発見された（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）。ＦＧＦ２３は、タイプＩＩＮＰＴに属するＮｐｔ２ａ及びＮｐｔ２ｂの発現抑制を介して、腎尿細管及び腸管におけるＰｉの吸収を阻害する重要な因子である（非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８）。これらの低リン血症性くる病・骨軟化症では、血中ＦＧＦ２３が上昇し、腎臓でのＰｉの再吸収、ビタミンＤの活性化が抑制され、低リン血症を誘導して骨組織の石灰化障害をもたらす。しかし、ビタミンＤ抵抗性のＸ連鎖性低リン血症性くる病でもＦＧＦ２３の血中レベルは高値となるため（非特許文献９）、実際にＦＧＦ２３の機能が十分に理解されているとは言い難い。一方、これら疾患のみならずＦＧＦ２３は生理的なリン酸代謝に重要な働きを持つと推測されているが、血中ＰｉレベルとＦＧＦ２３レベルが相関しないケースもあり（非特許文献１０）。その生理的意義、あるいは骨への影響などの実態はほとんど明らかにされていない。
【０００５】
ＦＧＦに対する生物学的応答は特異的な細胞表面受容体のチロシンキナーゼ型受容体（ＦＧＦＲ）への結合を介して行われる。ＦＧＦＲは６つのファミリーからなり、組織での発現量、リガンドへの結合性、シグナル伝達経路の多様性から、多様な生物学的作用を発揮する。ＦＧＦ２３は、現在のところこの６つのＦＧＦＲのうち、ＦＧＦＲ１から３のｃスプライスフォームおよびＦＧＦＲ４に結合することが確認されている（非特許文献１１）。
【０００６】
また、ＦＧＦ２３とＦＧＦＲｓとの結合には老化抑制遺伝子産物Ｋｌｏｔｈｏが関与し、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）のｐ４２/４４ＭＡＰＫ（ＥＲＫ１/２）を活性化する（非特許文献１２）。これらのＦＧＦ２３のシグナル伝達機構が実際にＦＧＦ２３のリン酸代謝調節作用とどのように関連するかはまだ明らかにされていない。
【０００７】
健常時においてもＦＧＦ２３の発現は血管内皮細胞を含む多様な組織で確認されているが、中でも骨組織での発現量は他の組織のおおよそ１０倍以上である（非特許文献１３）。例えば、骨芽細胞は，ＦＧＦ２３の主要な産生細胞である（非特許文献１４）。したがって、血中ＦＧＦ２３レベルは骨組織のとりわけ骨芽細胞などでの発現調節に強く影響されると予想される。血中ＦＧＦ２３レベル、培養骨芽細胞のＦＧＦ２３の産生は活性型ビタミンＤにより正に制御されることが報告されている（非特許文献１５）。
【０００８】
しかし、血管および骨石灰化に及ぼすＦＧＦ２３及びその生物学的応答の詳細な機構に関しては、これまで不明である。
【特許文献１】特開２００５−２８１１８９
【非特許文献１】Ｍａｒｔｉｎ，Ｇ．Ｒ． Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ． １２：１５７１−１５８６（１９９８）
【非特許文献２】Ｏｒｎｉｔｚ， Ｄ． Ｍ． ａｎｄ Ｐ． Ｊ． Ｍａｒｉｅ． Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ． １６： １４４６−１４６５（２００２）
【非特許文献３】ＡＤＨＲ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ． Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． ２６：３４５−３４８．（２０００）
【非特許文献４】Ｊｏｎｓｓｏｎ， Ｋ．Ｂ．， ｅｔ ａｌ． Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：１６５６−１６６３（２００３）
【非特許文献５】Ｗｈｉｔｅ， Ｋ．ｅｔ ａｌ． Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ． ６０：２０７９−２０８６（２００１）
【非特許文献６】Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ. ２７７：２８２６５−２８２７０（２００２）
【非特許文献７】Ｙａｎ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ１０：４８９−５０２（２００５）
【非特許文献８】Ｍｉｙａｍｏｔｏ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅｒ. Ａｐｈｅｒ．Ｄｉａｌ．９：３３１−３３５（２００５）
【非特許文献９】Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８７：４９５７−４９６０（２００２）
【非特許文献１０】Ｗｅｂｅｒ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１８：１２２７−１２３４（２００３）
【非特許文献１１】Ｙｕ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１３０：３０６３−３０７４（２００３）
【非特許文献１２】Ｋｕｒｏｓｕ，Ｈ．ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１：６１２０−６１２３（２００６）
【非特許文献１３】Ｍｉｒａｍｓ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｂｏｎｅ３５：１１９２−１１９９（２００４）
【非特許文献１４】Ｍｉｒａｍｓ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｂｏｎｅ３５：１１９２−１１９９（２００４）
【非特許文献１５】Ｋｏｌｅｋ，Ｏ．Ｉ．ｅｔ ａｌ．Ａｍ. Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８９：Ｇ１０３６−１０４２（２００５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで、本発明者らは、ＦＧＦ２３の血管および骨石灰化調節機構を解明するとともに、血管、骨あるいは歯の石灰化を調節する予防・治療剤を提供することを課題とする。
【００１０】
また、ＦＧＦ２３受容体、ＦＧＦ２３特異的シグナル分子と相互作用する物質のスクリーニング方法を提供することをも課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的を達成すべく、本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、以下の成果を見出すに到った。
（１）胎仔ラット頭蓋冠由来（ＲＣ）細胞を用いた培養骨形成モデルに置いて、アデノウイルス発現ベクターを用いたヒトＦＧＦ２３の過剰発現は、骨結節の数を著しく減少させた。
（２）ＲＣ細胞におけるヒトＦＧＦ２３の過剰発現は、同細胞のＦＧＦＲとＭＡＰＫのリン酸化を促進した。
（３）ＲＣ細胞におけるヒトＦＧＦ２３の過剰発現は、同細胞のＮＰＴ活性を抑制した。
（４）ＲＣ細胞におけるヒトＦＧＦ２３の過剰発現は、骨芽細胞分化マーカーおよびリン酸代謝調節因子のｍＲＮＡの発現に影響した。
（５）ＦＧＦＲのチロシン残基リン酸化の特異的阻害剤ＳＵ５４０２はＲＣ細胞におけるヒトＦＧＦ２３の過剰発現の影響を阻害した。
（６）ラット大動脈由来平滑筋細胞のＰｉ負荷による石灰化モデルにおいて、ＦＧＦ２３
の過剰発現は石灰化を抑制した。
（７）ＦＧＦ２３の高発現部位は骨芽細胞の他、セメント芽細胞、象牙芽細胞など歯牙硬組織においても確認された。
【００１２】
本発明者は、これらの成果により、ＦＧＦ２３は硬組織の生理的石灰化，あるいは血管の石灰化等の病態と関連した石灰化を調節している局所因子であり、ＦＧＦ２３を正にあるいは負に制御することで石灰化を抑制あるいは促進できることを見出し、本発明を完成させるに到った。
【発明の効果】
【００１３】
上記発明により、ＦＧＦ２３が石灰化を調節することが明らかとなった。このＦＧＦ２３発現量の上昇あるいはその情報伝達系の活性化は、石灰化を抑制するため、変形性関節症、異所性石灰化症、動脈硬化症の予防・治療剤を開発する上で重要な手段を与える。一方、ＦＧＦ２３発現量の低下あるいはその情報伝達系の阻害は、石灰化を促進することから骨粗鬆症、くる病、骨軟化症の予防・治療剤及び歯周病に伴う歯槽骨の吸収抑制剤、歯（象牙質、セメント質）の再生治療剤を開発する上で重要な手段を与える。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明はＦＧＦ２３の石灰化の調節剤を提供する。ここで「調節」の例として、正に制御する「促進」または「活性化」の他、負に制御する「阻害」あるいは「抑制」などを含めることができる。「正」に制御する例として、ＦＧＦ２３発現量の増大あるいはＦＧＦ２３特異的情報伝達機構の活性化による石灰化の抑制を示す事ができる。また「負」に制御する例として、ＦＧＦ２３の発現低下、ＦＧＦ２３の特異的受容体への結合阻害あるいはその情報伝達系の阻害による石灰化の促進の例を示す事ができる。
【００１５】
すなわち、ＦＧＦ２３の発現上昇あるいはＦＧＦ２３特異的情報伝達機構の活性化剤は、石灰化の抑制に利用でき、石灰化が促進されている疾患・状態として変形性関節症、異所性石灰化、動脈硬化症の予防・治療に利用できる。
【００１６】
また、ＦＧＦ２３あるいはＦＧＦ２３特異的情報伝達機構の阻害剤は石灰化の促進に利用でき、石灰化が阻害又は抑制されている疾患・状態として、骨粗鬆症、くる病、骨軟化症の予防・治療剤として利用できる。さらに、ＦＧＦ２３は歯牙組織（セメント芽細胞、象牙芽細胞）においても高いレベルで発現を認めたことにより、歯周病等の歯科領域疾患や再生医療等の分野でも利用できる。
【００１７】
本発明による石灰化調節剤の具体例として、ＦＧＦ２３を挙げることができる。ＦＧＦ２３は配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるが、本発明はこれに限定されず、ＦＧＦ２３の特異的情報伝達体を調節し得る機能を有するもので、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、若しくは付加されたアミノ酸配列と類似の配列からなるＦＧＦ２３変異体であればいずれでも良い。
【００１８】
本発明のタンパク質の中で自然界に存在するものは、抽出、精製等の操作を経ることにより、天然のタンパク質として調製することができる。例えば、配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質は、ヒトの細胞、体液（血液、尿等）等から調製することができる。ここでの細胞としては、本発明のタンパク質を産生ないし発現しているものであれば特に限定されず、例えば、脾臓細胞、免疫系細胞等を用いることができる。
【００１９】
また本発明は、ＦＧＦ２３またはその変異体をコードしたＤＮＡを提供する。ヒトＦＧＦ２３をコードしたＤＮＡは、例えば、配列番号１に記載のＤＮＡを挙げることができる。また、ＦＧＦ２３変異体をコードした配列は、例えば、配列番号１に記載のヒトＦＧＦ２３をコードしたＤＮＡを改変して作製することができる。
【００２０】
ＦＧＦ２３ｃＤＮＡは、当業者により公知の方法により調製することができる。本発明のＤＮＡは、適当なゲノムＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーから調製することができる。この場合には、本発明のタンパク質の一部をコードするＤＮＡ断片からなるプローブを用意し、これを用いて周知のハイブリダイゼーション法により本発明のＤＮＡをスクリーニングする。また、本発明のＤＮＡは、適当なゲノムＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として適当なプライマーを用いたＰＣＲ法等により調製することが可能である。プライマーは、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を基に、所望のＤＮＡ断片を特異的に増幅するように設計された任意のものを用いることができる。本発明のＤＮＡを調製するために用いるゲノムＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーは、本発明のＤＮＡを含むものであればどのようなものでもよく、例えば、市販のＤＮＡライブラリーを利用することができる。また、適当な細胞からｍＲＮＡを抽出し、これを鋳型として周知の方法により作製したｃＤＮＡライブラリーを用いることもできる。
【００２１】
ＦＧＦ２３ｃＤＮＡはそのまま使用できるが、ベクターに担持させて用いることもできる。
【００２２】
本発明の更に他の局面は、本発明のＤＮＡを保持するベクターに関する。換言すれば、本発明のＤＮＡを適当なベクターに挿入して使用することができる。本発明のＤＮＡを挿入し得るものであれば、いかなるベクターを使用することも可能であるが、使用目的（クローニング、タンパク質の発現）に応じて、また、宿主細胞の種類を考慮して適当なベクターを選択して用いることが好ましい。ベクターの例としては、大腸菌を宿主とする場合、Ｍ１３ベクター、ｐＵＣ系ベクター、ｐＴ７ベクターなどが挙げられる。本発明のＤＮＡのベクターへの挿入は、制限酵素及びＤＮＡリガーゼを用いた周知の方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， １．８４， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）により行うことができる。
【００２３】
本発明の更に他の局面は、本発明のＤＮＡを保持する形質転換体に関する。即ち、本発明のＤＮＡで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体に関する。例えば、本発明のＤＮＡを、リン酸カルシウム法、エレクトロポーレーション(Ｐｏｔｔｅｒ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ ８１，７１６１−７１６５ （１９８４）)、リポフェクション(Ｆｅｌｇｎｅｒ， Ｐ．Ｌ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ ８４，７４１３−７４１７ （１９８４）)、マイクロインジェクション(Ｇｒａｅｓｓｍａｎｎ，Ｍ．& Ｇｒａｅｓｓｍａｎｎ，Ａ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ ７３，３６６−３７０ （１９７６）)等の公知の遺伝子導入方法により宿主細胞に導入して形質転換させることができる。また、上記本発明のベクターで宿主細胞を形質転換して本発明の形質転換体を得ることもできる。目的に応じて種々の宿主細胞を用いることが可能であり、例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、昆虫細胞、酵母等を用いることができる。また、真核細胞に限らず、大腸菌等の原核細胞を用いることも可能である。本発明の形質転換体を適当な条件で培養することにより、本発明のＤＮＡの発現産物（タンパク質）を大量に生産することが可能である。
【００２４】
本発明のタンパク質を適用する方法としては、例えば、直接患者に投与することが挙げられる。また、本発明のタンパク質を有効成分とする組成物を構成し、これを患者に投与することもできる。投与方法としては、経口又は静脈内、動脈内、若しくは皮下注射等の公知の方法を用いることができる。また、注射等により特定の部位（例えば、骨が減少または過剰形成している部位）に直接投与することもできる。また、本発明のＤＮＡを細胞に導入し、生体内で本発明のタンパク質を発現させることもできる。ＤＮＡの導入方法は特に限定されず、例えば、ＤＮＡ導入用プラスミド又はウイルスベクターを用いた方法、エレクトロポーレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション等の公知の方法により行うことができる。
【００２５】
本発明はまた、ＦＧＦ２３遺伝子の転写領域、プロモーター領域を含む、任意の部位を標的とするアンチセンスヌクレオチド、二本鎖ＲＮＡ、リボザイムなどの機能性核酸、及びかかる機能性核酸を有効成分として含む石灰化調節剤を提供する。このような機能性核酸は、ｓｉＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、または、修飾されたＲＮＡ鎖を少なくとも片方の鎖に含むｓｉＲＮＡまたは二本鎖ＲＮＡのいずれであってもよい。上記の機能性核酸は、静脈注射、皮下注射、経口送達、リポソーム送達または鼻腔内送達により患者へ投与され、患者の標的全身、器官、組織または細胞型に蓄積しうる。
【００２６】
他に定義しない限り、本明細書中で用いるすべての技術及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中に記載されるものと同様の又は等しい方法及び材料を本発明の実施又は試験に用いることができるが、好適な方法及び材料を以下に記載する。本明細書中に言及するすべての公開物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照として全体が組み入れられる。相反の場合、定義を含む本明細書が優先する。さらに、材料、方法、及び具体例は単に例示的なものであり、限定することを意図していない。
【００２７】
実施例
「実施例１」ＦＧＦ２３はラット胎仔頭蓋冠由来（ＲＣ）細胞培養における骨芽細胞分化と基質石灰化を抑制する
実験は、以下の方法により実施した。
１）ヒトＦＧＦ遺伝子を持つアデノウイルスベクターの構築
全長ヒトＦＧＦ２３ｃＤＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲを用いてヒト心臓のトータルＲＮＡから合成し、ｐＴＲＥ−ｓｈｕｔｔｌｅｒ２ベクター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＰａｌｏＡｌｔｏ， ＣＡ）のクローニング部位のＥｃｏＲ１及びＢａｍＨ１部位間に挿入した。Ｉ-Ｃｅｕ１及びＰＩ-Ｓｃｅ１により、Ｔｅｔ-ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅを単離し、Ａｄｅｎｏ−Ｘ ｖｉｒａｌ ＤＮＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に導入した。組換えＡｄｅｎｏ−Ｘ ＦＧＦ２３ ＤＮＡ（Ａｄ−ＦＧＦ２３）は、ＰａｃＩ消化し、直鎖状の組換えＡｄ−ＦＧＦ２３ ＤＮＡを常法に従ってＨＥＫ ２９３細胞にトランスフェクションすることによって作製した。発現調節用のアデノウイルスベクター（Ａｄ−Ｔｅｔ−ｏｆｆ）及び対照のアデノウイルスベクター（Ａｄ−βｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ；ＡＤ−βｇａｌ）は、添付資料に従って作製した。培養上清に産生されたアデノウイルス粒子はＢＤ−Ａｄｅｎｏ−Ｘ ｖｉｒｕｓ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ （ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて精製し、濃縮したアデノウイルス粒子はＨＥＫ細胞を用いてプラークフォーミングユニット（ｐｆｕ）を算出した。
２）胎仔ラット頭蓋冠由来（ＲＣ）細胞培養およびアデノウイルス感染
胎仔ラットからＲＣ細胞を分離し（Ｙｏｓｈｉｋｏ Ｙ， ｅｔ ａｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ． １４４： ４１３４−４１４３． （２００３））、０．３Ｘ１０４／ｃｍ２の細胞密度で５％胎仔血清（ＦＣＳ）、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸、抗生物質を含むα―ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ（α―ＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ-ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ, Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ, ＭＤ）を用い，７０％コンフルエンスになるまで培養した。この時点で（ｄ４）、Ａｄ−ＦＧＦ２３またはＡｄ-βｇａｌをＡｄ−Ｔｅｔ−ｏｆｆとともに２０ｐｆｕ／ｃｅｌｌの力価で感染させた。ＦＧＦ２３の過剰発現は，分化が開始される２日後が見込まれた。感染の４時間後、新鮮培地を追加し、さらに翌日新鮮培地に交換した。一方、成熟期（ｄ１４）のＲＣ細胞にも同様に２０ｐｆｕ／ｃｅｌｌの条件で感染させた。ノジュールの石灰化を誘導するために、５０ｍＭ β―グリセロリン酸（βＧＰ）を培養終了前２日前（ｄ１５）に添加した。培養は、５％ＣＯ２存在下３7℃で一般的に２日ないし３日おきに培地を交換した。
３）ウェスタンブロット
Ａｄ−ＦＧＦ２３あるいはＡｄ−βｇａｌの感染細胞は４８時間後に細胞溶解液（１００ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．５％ Ｎｏｎｉｄｅｎｔ Ｐ―４０，１ｍＭ ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌｆｌｕｏｒｉｄｅ、ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｒｏｓｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｐｅｎｚｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で可溶化した。
同様に感染させたＲＣ細胞の培養上清を回収し、一部は酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ，後述）に供した。残りは−２０℃にてアセトン沈殿を行い、沈殿物は細胞溶解液に溶解した。
【００２８】
試料はＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動の後、ニトロセルロース膜に転写し、抗ＦＧＦ２３抗体（×５００，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ, ＳａｎｔａＣｒｕｚ, ＣＡ）と４℃で一晩反応させた後、ペルオキシダーゼ標識二次抗体（×２，０００，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）で室温，１時間インキュベートした。引き続き、ＥＣＬウェスタンブロッティング検出試薬（Ｌｕｍｉ−ＬｉｇｈｔＰＬＵＳ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用い、化学発光を検出した。
４）ＥＬＩＳＡ
培養液中に分泌されたＦＧＦ２３はカイノス社ＥＬＩＳＡキット（東京）によりに定量した。
５）石灰化ノジュールの同定
ＲＣ細胞は培養終了後、１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、結節(ノジュール)をアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）染色および石灰化をフォン・コッサ染色によって同定した。
６）細胞増殖
細胞増殖速度は、３（４，５−ｄｉｍ４ｔｈｙｌ−ｔｈｉａｚｏｙａｌ−２ｙｌ）２．５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｇｒｏｍｉｄｅ ｔｈｉａｚｏｌｙｌ ｂｌｕｅ 比色法により測定した(ＭＴＴアッセイ)。
【００２９】
ＲＣ細胞を用いた培養骨形成モデル及び実験プロトコールを図１Ａに示した。未分化ＲＣ細胞は増殖、６日でコンフルエンスに達する。コンフルエンスと同時に類骨に相当する有機基質からなるノジュールの形成を伴って細胞は前骨芽細胞へと分化する。培養１４日目には骨芽細胞として成熟し、この時β―グリセロリン酸（βＧＰ）を添加すると、類骨様のノジュールは２日以内に石灰化する。アデノウイルスーヒトＦＧＦ２３ベクター（Ａｄ−ｈＦＧＦ２３）のコンストラクトは図１Ｂに示した。感染２日後に、Ａｄ−ｈＦＧＦ２３とＡｄ−βｇａｌ感染細胞で、ＦＧＦ２３の発現、培養上清のＦＧＦ２３のレベルをウェスタンブロットとＥＬＩＳＡで比較したところ、Ａｄ−ｈＦＧＦ２３感染細胞に著しい発現と分泌増加が確認された(図２Ａ、Ｂ)。また、Ａｄ−ｈＦＧＦ２３感染細胞の培養上清にはインタクトな分子サイズ（約３２ｋＤａ）と、弱いながら分解産物と思われる２つのバンド(約２６ｋＤａと約１６ｋＤａ)を認めた（図２Ｃ）。
【００３０】
Ａｄ−ｈＦＧＦ２３あるいはＡｄ−βｇａｌをｄ４及びｄ１４の成熟期のＲＣ細胞に感染させ，培養終了後（ｄ１７）の染色像の一例を図３Ａに示した。得られた染色像の計測値から、ＲＣ細胞におけるＦＧＦ２３の過剰発現はノジュールの形成と石灰化のいずれも抑制することが明らかとなった（図３Ａ，Ｂ）。
【００３１】
Ａｄ−ｈＦＧＦ２３あるいはＡｄ−βｇａｌで感染させたＲＣ細胞を２日後に低密度で継代培養し、経時的にＭＴＴアッセイを用いて細胞増殖曲線を比較したところ、両者に有意な差は認められなかった（図３Ｃ）。
【００３２】
「実施例２」ＦＧＦ２３は頭頂骨器官培養において骨形成を抑制する。
【００３３】
実験は、以下の方法により実施した。
１）ラット頭頂骨器官培養
２１日目の胎仔ラットの頭頂骨を器官培養に用いた。頭頂骨は矢状縫合に沿って半分にカットし、さらにそれを２等分した。一片の頭頂骨片をコラゲナーゼで消化し、全細胞数を計測した。Ａｄ−ＦＧＦ２３またはＡｄ−βｇａｌを２０ ｐｆｕ／ｃｅｌｌになるように頭頂骨片に４時間感染させた後、セルカルチャーインサート（ｐｏｒｅ ｓｉｚｅ ０．４−μｍ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＮＪ）に静置した。培地は２０％ＦＣＳ加ＢＧｊｂ培地を用いた。骨形成量を確認するために、カルセイン（１ μｇ/ｍｌ）を翌日に添加した。培地交換は毎日行い、さらに３日間培養した後、４％ＰＦＡで４℃，２時間固定し、７μｍの凍結切片とし、組織学的に解析した。
２）免疫染色
抗ＦＧＦ２３抗体（×１００，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を４℃で一晩反応させ、洗浄後ペルオキシダーゼ標識二次抗体及びＡＢＣ試薬（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ, Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ, ＣＡ）を説明書に準じて反応させた。切片はヘマトキシリンでカウンター染色した。陰性対象は特異的ブロッキングペプチド（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を処方に従って使用した（図省略）。
【００３４】
Ａｄ−ｈＦＧＦ２３感染させた場合，Ａｄ−βｇａｌと比較して骨表面の細胞群に強いＦＧＦ２３のシグナルが確認された（図４Ａ，Ｂ）。Ａｄ−ｈＦＧＦ２３の感染により，トルイジンブルー染色で同定される類骨層の拡大が確認された（図４Ｃ，Ｄ）。また，蓄積したカルセインの蛍光面積は減少した(図４Ｅ，Ｆ)。それらの定量値を図４Ｇに示した。
【００３５】
「実施例３」ＲＣ細胞におけるＦＧＦ２３とＦＧＦＲの共発現
実験は、以下の方法により実施した。
１）半定量的ＲＴ−ＰＣＲ及びリアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析
ＲＣ細胞のトータルＲＮＡを経時的にＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ,Ｃａｒｌａｂａｄ,ＣＡ）を用いて回収した。ｃＤＮＡはＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（東洋紡，東京）を用いて、２μｇのトータルＲＮＡから５０℃で合成した。ＰＣＲ（Ｑｉａｇｅｎ, Ｈｉｌｄｅｎ, Ｇｅｒｍａｎｙ）は標的遺伝子に最適な条件で実施した。リボゾームタンパクＬ３２を内部コントロールとして用いた。リアルタイム定量ＰＣＲは１ｘＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ （東洋紡）を用い、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Ｒｏｓｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）により実施した。オステオポンチン（ＯＰＮ）、ＡＬＰ，骨シアロプロテイン（ＢＳＰ）、オステオカルシン（ＯＣＮ）、ＦＧＦ２３、ＦＧＦＲ１（Ｒ１）、ＦＧＦＲ２（Ｒ２）、ＦＧＦＲ３（Ｒ３）の２つのスプライスフォーム(ｂとｃ)、ＦＧＦＲ４（Ｒ４）（Ｙａｎ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ．１０：４８９−５０２.（２００５））及びＬ３２プライマー配列を表１に示す。
【００３６】
ＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマーセット
【００３７】
【表１】
【００３８】
ＲＣ細胞において、Ｒ１ｃ、Ｒ２IIIc、Ｒ３ｃ ｍＲＮＡの発現を確認したが、その他のサブタイプの ｍＲＮＡは確認されなかった（図５Ａ）。定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析において、ＯＰＮ、ＡＬＰ、ＢＳＰ、ＯＣＮの連続的な発現レベルの増加は，ＲＣ細胞が期待通り未分化な骨原性細胞から前骨芽細胞を経て成熟骨芽細胞に分化したことを示している(図５Ｂ)。Ｒ１ｃ、ＲIIIｃレベルは前骨芽細胞期にピーク値を示したのに対し、Ｒ３ｃは骨芽細胞の成熟期に強い特異性を示した。
【００３９】
「実施例４」ＦＧＦ２３はＦＧＦＲのリン酸化を促進する。
【００４０】
実験は、以下の方法により実施した。
【００４１】
Ａｄ−ｈＦＧＦ２３及びＡｄ−βｇａｌを〔実施例１〕に従って感染させたＲＣ細胞を５日間培養した上清を回収（ＥＬＩＳＡでＦＧＦ２３の過剰発現を確認済み）し，α−ＭＥＭにて１０倍希釈した。成熟期（ｄ１４）ＲＣ細胞をガラススライド上に継代培養して１日放置後、血清濃度を０．１％に下げてさらに１日培養した。これに上述の希釈した培養上清を添加し，１５分後直ちに冷アセトンで５分間固定した。細胞をブロッキング後、一次抗体（抗Ｒｕｎｘ２抗体，抗リン酸化ＦＧＦＲ抗体，×１００，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を４℃で一晩反応させた。二次抗体は，フルオレッセインイソチアシアネート（ＦＩＴＣ）標識（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ, Ｉｎｃ），Ｃｙ３（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）標識したものを用いた。
【００４２】
Ａｄ−ｈＦＧＦ２３及びＡｄ−βｇａｌ感染ＲＣ細胞において、抗リン酸化ＦＧＦＲ抗体（ａｎｔｉ−ｐＦＧＦＲｓ）に対する反応性は、Ａｄ−ＦＧＦ２３感染細胞が明らかに強陽性であったのに対し、Ａｄ−βｇａｌ感染細胞はほとんど染色されなかった（図６Ａ）。また、これらの細胞はＦＧＦ２３及びＦＧＦＲ１〜ＦＧＦＲ３陽性であった（図６Ｂ）。
【００４３】
「実施例５」ＦＧＦ２３はＲＣ細胞のＦＧＦＲを介して石灰化を抑制する
実験は、以下の方法により実施した。リン酸化ＦＧＦＲ阻害剤はＳＵ５４０２（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）を使用した。
【００４４】
Ａｄ−ｈＦＧＦ２３及びＡｄ−βｇａｌを〔実施例１〕のように成熟期（ｄ１４）に感染させた。感染翌日から培地交換と共に上記のインヒビター（１０μＭ）。培養終了（ｄ１７）後、〔実施例１〕記載のようにＡＬＰ／フォン・コッサ染色を施し、ノジュールと石灰化を計測した。
【００４５】
ＦＧＦＲのリン酸化阻害剤はＦＧＦ２３によるノジュールの石灰化抑制を部分的に回復させた（図７）。
【００４６】
「実施例６」ＦＧＦ２３は、骨芽細胞分化マーカーおよびリン酸代謝調節因子のｍＲＮＡの発現を調節する。
【００４７】
実験は、以下の方法により実施した。
【００４８】
Ａｄ−ｈＦＧＦ２３またはＡｄ−βｇａｌを〔実施例１〕に従って、７０％コンフルエンス（ｄ４）及び成熟期（ｄ１４）のＲＣ細胞に感染させ、培養終了後〔実施例３〕にしたがってトータルＲＮＡを回収し、定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲに供した。〔実施例３〕の表１の骨芽細胞マーカーに加え、リン酸代謝調節因子として、ｍａｔｒｉｘ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＥＰＥ）（Ｇｏｗｅｎ， Ｌ． Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２７８：１９９８−２００７． （２００３）），ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｆｒｅｚｚｌｅｄ−ｒｅｌａｒｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ (ｓＦＲＰ)―４（Ｂｅｒｎｄｔ Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１２： ７８５-７９４， （２００３）），スタニオカルシン（ＳＴＣ）１（Ｙｏｓｈｉｋｏ， Ｙ． ｅｔ ａｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ． １４４： ４１３４−４１４３． （２００３））の分泌タンパク及びＰｉｔ−１，Ｐｉｔ−２， ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｇｅｎｅ ｗｉｔｈ ｈｏｍｏｌｏｇｉｅｓ ｔｏ ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ ｏｎ Ｘ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ（Ｐｈｅｘ）（Ｄｒｅｚｎｅｒ，Ｍ．Ｋ． Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．５７：９−１８（２０００））の膜タンパクを解析した。それぞれのプライマー配列を表２に示す。
【００４９】
ＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマーセット
【００５０】
【表２】
【００５１】
Ａｄ−ｈＦＧＦ２３をｄ４に感染した場合、Ａｄ−βｇａｌに比較して、ＯＣＮ、Ｐｈｅｘ、ＭＥＰＥのｍＲＮＡレベルは著しく低下し、ＡＬＰ、ＳＴＣ１、Ｐｉｔ−１ ｍＲＮＡのレベルも低下した。一方、ＢＳＰ、ｓＦＲＰ−４ ｍＲＮＡレベルは増加し、ＯＰＮは不変であった（図８Ａ）。一方、Ａｄ−ｈＦＧＦ２３をｄ１４に感染した場合、ＡＬＰ、Ｐｉｔ−１、Ｐｉｔ−２、ＭＥＰＥ、ＳＴＣ１ ｍＲＮＡレベルの増加、Ｐｈｅｘ及びＯＣＮ ｍＲＮＡレベルの減少を認めた。しかし、ＯＰＮ、ＢＳＰ、ｓＦＲＰ−４ ｍＲＮＡレベルは不変であった（図８Ｂ）。
【００５２】
「実施例７」ＦＧＦ２３は培養血管平滑筋のＰｉ誘導石灰化を抑制する。
【００５３】
実験は、以下の方法により実施した。
【００５４】
ラット大動脈由来平滑筋細胞（継代１５代以内）を１０％ＦＣＳ加Ｄ―ＭＥＭを用い、０．５〜０．８×１０４／ｃｍ２でプレーティングした。細胞がコンフルエンスに達した時、１．５ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）を負荷（石灰化培地）すると同時にＡｄ−ｈＦＧＦ２３またはＡｄ−βｇａｌを２０ｐｆｕ／ｃｅｌｌとなるように感染させた。感染の基本的手順は〔実施例１〕に従った。２日〜３日ごとに新鮮な石灰化培地に交換した。
感染後１０日目に細胞を洗浄後、トリス緩衝液にて洗浄後、０．６Ｎ塩酸処理し、石灰化をカルシウムＣテスト−ワコー（和光純薬工業，東京）にて測定した。
【００５５】
Ａｄ−ｈＦＧＦ２３感染平滑筋ではＡｄ−βｇａｌ感染平滑筋に比較して、リン酸負荷による石灰化を有意に抑制した（図９）。
【００５６】
「実施例８」 ＦＧＦ２３は象牙質，セメント質でも産生される。
【００５７】
成獣雄（８週齢）及び胎仔（胎生２１日）ラットの組織から〔実施例３〕に従ってトータルＲＮＡを回収し、ＦＧＦ２３の発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲで確認した。また、同ラットの歯牙組織におけるＦＧＦ２３の免疫染色をＡＢＣ法（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）により実施した。成獣雄ラットの下顎を４％パラフォルムアルデヒドにより４℃で一晩固定後、クエン酸・蟻酸溶液またはＥＤＴＡで脱灰し、パラフィン標本とした。５〜６μｍの切片を作製し、抗ＦＧＦ２３抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）は４℃で一晩反応させた。リアルタイムＰＣＲの結果、骨組織以外では歯牙組織で高い発現が確認された（図１０）。免疫染色では象牙芽細胞、セメント芽細胞がＦＧＦ２３陽性となった（図１１）。このことから、ＦＧＦ２３は硬組織の基質形成に預かる細胞（エナメル芽細胞は除く）で産生されることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
上記発明により明らかにされたＦＧＦ２３が石灰化を調節する機構、具体的にはＦＧＦ２３の発現上昇あるいはその情報伝達系の活性化は、石灰化を抑制することから変形性関節症、異所性石灰化症、動脈硬化症の予防・治療剤として利用することができる。一方、ＦＧＦ２３の発現低下あるいはその情報伝達系の阻害は、石灰化を促進することから骨粗鬆症、くる病、骨軟化症の予防・治療剤のほか、歯周病等の歯科領域疾患あるいは歯科における再生医療等にも利用できる。さらに、それら疾患の予防・治療剤をスクリーニングする方法として利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】（Ａ）：ＲＣ細胞を用いた培養骨形成モデル及び実験プロトコール。（Ｂ）：ｈＦＧＦ２３組換えアデノイウルスベクターの構造。ＩＴＲ，逆向き反復配列末端（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔｓ）。ｈＣＭＶ−１，テトラサイクリン応答配列付加サイトメガロウイルスプロモーター（ｍｉｎｉｍｕｍ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｏｆ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）。
【図２】ＲＣ細胞におけるｈＦＧＦ２３過剰発現の確認。（Ａ）：細胞におけるｈＦＧＦ２３の遺伝子とタンパクの発現。（Ｂ）：ＥＬＩＳＡによる培養上清中のｈＦＧＦ２３の定量。（Ｃ）：培養上清中のｈＦＧＦ２３タンパクの性状。
【図３】ＲＣ細胞培養の培養骨形成モデルにおけるｈＦＧＦ２３過剰発現の影響。 ｄ４（Ａ）及びｄ１４（Ｂ）ＲＣ細胞にウイルスベクターを感染させ，ｄ１７でサンプリングした。（Ａ）：ＡＬＰ及びフォン・コッサ染色。（Ｂ）：（Ａ）の染色によるＡＬＰ陽性ノジュール及び石灰化ノジュールの数。数値は平均±ＳＤ。（Ａ）のグラフ及び（Ｂ）下段のグラフは、いずれもＡｄ−βｇａｌと比較して有意差あり（（１）Ｐ＜０．０５、（２）Ｐ＜０．０１）。ｎ＝４。（Ｃ）：ｄ４ＲＣ細胞にウイルスベクターを感染後，継代培養した細胞のＭＴＴアッセイによる増殖曲線。数値は平均±ＳＤ。同日の２者間で有意差なし。ｎ＝４。
【図４】頭頂骨器官培養におけるＦＧＦ２３過剰発現の影響。（Ａ）：免疫染色によるＦＧＦ２３の過剰発現。（Ｂ）：カルセインの蛍光像。（Ｃ）：（Ｂ）のカルセイン蛍光量の定量。数値は平均±ＳＤ。いずれもＡｄ―βｇａｌとの比較で有意差あり（Ｐ＜０．０５）。ｎ＝８。
【図５】ＲＣ細胞におけるＦＧＦ２３及びＦＧＦＲｓの共発現。(Ａ)： ＲＴ−ＰＣＲによるＲＣ細胞におけるＦＧＦＲサブタイプｍＲＮＡの発現。（Ｂ）：リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲによる骨芽細胞分化に伴う骨芽細胞分化マーカー，ＦＧＦ２３及びＦＧＦＲのｍＲＮＡレベル。数値は平均±ＳＤ。ｎ＝３。
【図６】ＲＣ細胞におけるｈＦＧＦ２３の過剰発現によるＦＧＦＲの活性化。（Ａ）：抗ＦＧＦＲリン酸化抗体（ａｎｔｉ−ｐＦＧＦＲｓ）による蛍光免疫染色。（Ｂ）：抗ＦＧＦ２３抗体と抗ＦＧＦＲ１〜３抗体による染色。
【図７】ＲＣ細胞におけるｈＦＧＦ２３過剰発現による石灰化抑制に対するＦＧＦＲリン酸化阻害剤。数値は平均±ＳＤ。Ａｄ―βｇａｌとの比較で有意差あり（Ｐ＜０．０５）。ｎ＝４。
【図８】ＲＣ細胞の骨芽細胞マーカー及びＰｉ代謝関連因子ｍＲＮＡレベルにおけるＦＧＦ２３過剰発現の影響。ｄ４（Ａ）及びｄ１４（Ｂ）ＲＣ細胞にウイルスベクターを感染させ，ｄ１７でサンプリングした。数値は平均±ＳＤ。ｎ＝３。
【図９】ラット大動脈平滑筋細胞のＰｉ誘導石灰化におけるＦＧＦ２３過剰発現の影響。数値は平均±ＳＤ。Ａｄ―βｇａｌとの比較で有意差あり（Ｐ＜０．０５）。ｎ＝４。
【図１０】ＦＧＦ２３ ｍＲＮＡ発現レベル。数値は平均±ＳＤ。いずれも胎仔との比較で有意差あり（＊Ｐ＜０．０５，＊＊P＜０．０１）。ｎ＝３。Ｆｅｍｕｒ（大腿骨）、Ｃａｌｖａｒｉａ（頭頂骨）、Ｉｎｃｉｓｏｒ（切歯）、Ｂｒａｉｎ（脳）、Ｔｈｙｍｕｓ（胸腺）、Ｓｐｌｅｅｎ（脾臓）、Ｋｉｄｎｅｙ（腎臓）、Ｌｉｖｅｒ（肝臓）、Ｈｅａｒｔ（心臓）、Ｓ．ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ（小腸）。
【図１１】成獣雄ラット歯牙・歯周組織におけるＦＧＦ２３の局在。メチルグリーンは対比染色。 パネルａは切歯（ｉｒ）と臼歯（ｍｏ）、歯槽骨（ａｂ）を含む下顎矢状断。Ｐｄｌ、ｄｅ、 ｃｅ ｐｕはそれぞれ歯根膜、象牙質、セメント質、歯髄を示す。パネルｂ〜ｄはパネルａのＢ〜Ｄの強拡大。円柱状の象牙芽細胞(§)、セメント芽細胞 (Θ）、歯槽骨の骨芽細胞(＊) はｐｄｌやｐｕの細胞に比較して強い染色性を示す。歯槽骨骨細胞（矢頭）と同様基質に埋没したセメント細胞(∞) の一部も陽性。パネルｅはネガティブコントロール。パネルａのＣの領域に相当。バーは５０μｍ。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
線維芽細胞増殖因子２３(ＦＧＦ２３)、ＦＧＦ２３特異的受容体、特異的シグナル分子あるいはその特異的情報伝達機構を標的とする石灰化調節剤。
【請求項２】
ＦＧＦ２３を有効成分とする変形性関節症、異所性石灰化症、動脈硬化症の石灰化阻害剤。
【請求項３】
請求項２記載の有効成分が配列番号１記載の塩基配列を備えたＤＮＡ（Ｆｇｆ２３）あるいは配列番号２記載のアミノ酸配列を備えたタンパク質（ＦＧＦ２３）。
【請求項４】
ＤＮＡがベクターに担持された、請求項２及び３記載の変形性関節症、異所性石灰化症、動脈硬化症の石灰化阻害剤。
【請求項５】
タンパク質が組換体である請求項２及び３記載の変形性関節症、異所性石灰化症、動脈硬化症の石灰化阻害剤。
【請求項６】
ＦＧＦ２３特異的受容体の下流にある少なくともＪＮＫを含むマイトジェン活性化プロテインキナーゼ等のＦＧＦ２３特異的シグナル分子あるいはその特異的情報伝達機構を活性化する化合物を有効成分とする請求項２至５記載の変形性関節症、異所性石灰化症、動脈硬化症の石灰化阻害剤。
【請求項７】
ＦＧＦ２３の阻害剤を有効成分とする骨粗鬆症、くる病、骨軟化症における石灰化促進剤及び歯周病に伴う歯槽骨の吸収抑制剤、歯（象牙質、セメント質）の再生治療剤。
【請求項８】
阻害剤がＦＧＦ２３特異的なアンチセンス、ＲＮＡｉなどの核酸、中和抗体、受容体拮抗剤、特異的シグナル分子あるいはその特異的情報伝達機構を阻害する化合物を特徴とする請求項７記載の骨粗鬆症、くる病、骨軟化症における石灰化促進剤及び歯周病に伴う歯槽骨の吸収抑制剤、歯（象牙質、セメント質）の再生治療剤。
【請求項９】
骨、軟骨、血管、筋肉、歯などの疾患部位を標的組織とするＦＧＦ２３に関する請求項１記載の石灰化調節剤。
【請求項１０】
請求項１至９記載の治療剤のためのドラッグデリバリーシステム。
【請求項１１】
ＦＧＦ２３、ＦＧＦ２３受容体あるいはＦＧＦ２３特異的シグナル分子と相互作用する石灰化調節剤のスクリーニング方法。
【請求項１】
線維芽細胞増殖因子２３(ＦＧＦ２３)、ＦＧＦ２３特異的受容体、特異的シグナル分子あるいはその特異的情報伝達機構を標的とする石灰化調節剤。
【請求項２】
ＦＧＦ２３を有効成分とする変形性関節症、異所性石灰化症、動脈硬化症の石灰化阻害剤。
【請求項３】
請求項２記載の有効成分が配列番号１記載の塩基配列を備えたＤＮＡ（Ｆｇｆ２３）あるいは配列番号２記載のアミノ酸配列を備えたタンパク質（ＦＧＦ２３）。
【請求項４】
ＤＮＡがベクターに担持された、請求項２及び３記載の変形性関節症、異所性石灰化症、動脈硬化症の石灰化阻害剤。
【請求項５】
タンパク質が組換体である請求項２及び３記載の変形性関節症、異所性石灰化症、動脈硬化症の石灰化阻害剤。
【請求項６】
ＦＧＦ２３特異的受容体の下流にある少なくともＪＮＫを含むマイトジェン活性化プロテインキナーゼ等のＦＧＦ２３特異的シグナル分子あるいはその特異的情報伝達機構を活性化する化合物を有効成分とする請求項２至５記載の変形性関節症、異所性石灰化症、動脈硬化症の石灰化阻害剤。
【請求項７】
ＦＧＦ２３の阻害剤を有効成分とする骨粗鬆症、くる病、骨軟化症における石灰化促進剤及び歯周病に伴う歯槽骨の吸収抑制剤、歯（象牙質、セメント質）の再生治療剤。
【請求項８】
阻害剤がＦＧＦ２３特異的なアンチセンス、ＲＮＡｉなどの核酸、中和抗体、受容体拮抗剤、特異的シグナル分子あるいはその特異的情報伝達機構を阻害する化合物を特徴とする請求項７記載の骨粗鬆症、くる病、骨軟化症における石灰化促進剤及び歯周病に伴う歯槽骨の吸収抑制剤、歯（象牙質、セメント質）の再生治療剤。
【請求項９】
骨、軟骨、血管、筋肉、歯などの疾患部位を標的組織とするＦＧＦ２３に関する請求項１記載の石灰化調節剤。
【請求項１０】
請求項１至９記載の治療剤のためのドラッグデリバリーシステム。
【請求項１１】
ＦＧＦ２３、ＦＧＦ２３受容体あるいはＦＧＦ２３特異的シグナル分子と相互作用する石灰化調節剤のスクリーニング方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２００８−１７７９０（Ｐ２００８−１７７９０Ａ）
【公開日】平成２０年１月３１日（２００８．１．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１９４０７８（Ｐ２００６−１９４０７８）
【出願日】平成１８年７月１４日（２００６．７．１４）
【出願人】（５０４１３６５６８）国立大学法人広島大学 (924)
【出願人】（５０２３１０４１６）株式会社ラフィーネインターナショナル (8)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１月３１日（２００８．１．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年７月１４日（２００６．７．１４）
【出願人】（５０４１３６５６８）国立大学法人広島大学 (924)
【出願人】（５０２３１０４１６）株式会社ラフィーネインターナショナル (8)
【Ｆターム（参考）】
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