糖尿病性神経障害における末梢神経の形態機能的回復のための上皮増殖因子の使用
本発明は、ヒト用医薬品に関し、有痛性感覚運動神経障害並びに虚血性神経炎の徴候における末梢神経の形態機能的回復のための、神経節及び／又は神経幹の周辺に浸潤によって投与される医薬組成物を調製するための上皮増殖因子（ＥＧＦ）の使用に関する。本発明は、麻酔剤若しくは鎮痛剤と共に製剤され得る又はミクロスフェア中に封入され得るＥＧＦ含有組成物、並びに有痛性の感受性運動型糖尿病性神経障害及び虚血性神経炎の徴候における末梢神経の形態機能的回復のためのその使用も含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病性神経障害の任意の臨床的徴候、及び虚血性神経炎の徴候を予防する又は治すための、神経幹及び／又は神経節の周辺に浸潤によって投与することが好ましい、上皮増殖因子（ＥＧＦ）を含む医薬組成物の医学的又は実験的適用に関する。前記製剤は局所的に、四肢の末端領域に又は神経障害性疼痛を感じる切断肢に基づいて投与することもできる。
【背景技術】
【０００２】
血液中の不適当なグルコースレベル及び他の糖尿病関連因子は、身体の任意の部位で神経線維を変化させ、冒された神経に応じて特異的な特徴を有する一群の障害を生じる場合がある。これらの障害は、総じて糖尿病性神経障害と称され、少なくとも３つ主要な種類が記述されている：（１）感受性運動神経障害（最も典型的かつ頻出の形態）、（２）自律神経障害、及び（３）単神経障害（Ｓａｄｉｋｏｔ ＳＭ、Ｎｉｇａｍ Ａ、Ｄａｓ Ｓら、（２００４）．ＷＨＯ １９９９年基準を使用したインドにおける糖尿病及び糖耐性減退の要旨：インドにおける糖尿病有病率の研究（Ｔｈｅ ｂｕｒｄｅｎ ｏｆ ｄｉａｂｅｔｅｓ ａｎｄ ｉｍｐａｉｒｅｄ ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎ Ｉｎｄｉａ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＷＨＯ １９９９ ｃｒｉｔｅｒｉａ：ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｉｎ Ｉｎｄｉａ ｓｔｕｄｙ（ＰＯＤＩＳ）．Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｒｅｓ Ｃｌｉｎ Ｐｒａｃｔ，６６，３０１〜７）。
【０００３】
これらの障害の背景の正確な機序は完全には理解されていないが、神経線維が、グルコース代謝の悪化に由来する物質の蓄積によって構造的に修飾され、それにより神経線維中のミエリン鞘が喪失することは周知である。この保護鞘の喪失は、運動指令又は任意の他の種類のシグナルの感知、伝達のいずれにおいても神経インパルスを伝達する能力の遅延を意味する。この直接の機序に加えて、神経に血液を注いでいる血管が、糖尿病の他の慢性合併症に一般的である事象による閉塞を引き起こす恐れがある（Ａｓｈｏｋ Ｓ、Ｒａｍｕ Ｍ、Ｄｅｅｐａ Ｒ ら、（２００２）。南インドの糖尿病センターに通院する２型糖尿病患者における神経障害の有病率（Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ ｉｎ ｔｙｐｅ２ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｔｔｅｎｄｉｎｇ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｃｅｎｔｅｒ ｉｎ Ｓｏｕｔｈ Ｉｎｄｉａ．Ｊ Ａｓｓｏｃ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ Ｉｎｄｉａ，５０，５４６〜５０）。
【０００４】
糖尿病において一般的であるように、糖尿病性神経障害の初期段階は、一般的に、何年間も無症候性であり、今日までその潜行性の臨床経過を予期する方法は無い。医師が、感受性運動性糖尿病性神経障害を疑う場合、神経伝導の速度を評価する検査を実施することによって診断を確認できる。この検査は、選択した神経を介する少量の電流の伝達速度の決定から成る。
【０００５】
糖尿病性神経障害のさらに頻出の形態、感受性運動神経障害において、初期の症状として、感受性の喪失、触覚の不正確な認知及び特定の場合においてわずかな皮膚への接触後の鋭敏な疼痛が挙げられる。通常、これは最初、足及び手に、主に夜間に生じる。冒された神経が消化運動を司る場合、遅い消化過程又は腸の律動の変化（下痢及び／又は便秘）が起きる場合がある。時に、糖尿病性神経障害は、心臓血管系制御を冒し、患者が急に起き上がる場合に失神又は低血圧を引き起こす（Ｌｅｖｉｔｔ ＮＳ、Ｓｔａｎｓｂｅｒｒｙ ＫＢ、Ｗｙｃｈａｎｃｋ Ｓら、（１９９６））。自律神経障害の自然進行及びＩＤＤＭコホートでの自律機能検査（Ｎａｔｕｒａｌ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｕｔｏｎｏｍｉｃ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ ａｎｄ ａｕｔｏｎｏｍｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｔｅｓｔｓ ｉｎ ａ ｃｏｈｏｒｔ ｏｆ ＩＤＤＭ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ，１９，７５１〜５４）。
【０００６】
糖尿病性単神経障害は、事実上、任意の孤立した神経を冒す場合があり、顔面の片側の麻痺、眼球運動の変化、具体的な解剖学的位置の麻痺及び／又は疼痛を生じる。
【０００７】
末梢神経障害は、頭蓋神経、又は脊髄及びその分枝の神経を冒す場合があり、段階的に進行する傾向がある型の神経障害（神経病変）である。初期には、四肢、特に足に疼痛及び間欠的な刺痛があるが、さらに進行した段階では疼痛はより強く、持続的である。最終的に、無痛性神経障害を、神経の変質が強い場合に発症する（Ｏｈ ＳＪ．（１９９３）．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｌｅｃｔｒｏｍｙｏｇｒａｐｈｙ：ｎｅｒｖｅ ｃｏｎｄｕｃｔｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｉｎ：Ｎｅｒｖｅ ｃｏｎｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｐｏｌｙｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｅｓ．Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ：Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，ｐ：５７９〜９１）。
【０００８】
糖尿病性神経障害のさらに重篤な事象の１つは、時に激しく、標準的治療手順に応答しない、関連する疼痛である。薬学的及び臨床的治療が、十分に成功しないが使用されている。前者は、遮断された線維にまで到達して浸透できる鎮痛剤、非ステロイド性抗炎症剤、カルバマゼピン及びフェントラミンなどの鎮痙剤、三環系抗うつ剤及び局所麻酔剤との組合せで主に用いられている。鎮痙剤は、近年、糖尿病性神経障害に伴う疼痛を治療するために使用されている。その中で、疼痛を治療するために最近導入されたのは、ガバペンチンである。神経化学的にはガパペンチンは、ガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の生物利用能を増大し、ＧＡＴ−１担体を阻害し、結果としてＧＡＢＡの再捕捉を低減し；ノルアドレナリン、ドパミン及び５−ＯＨ−トリプタミンなどの生体アミンの合成及び放出を減少させ；疼痛調節に関与するエンセファリン型アヘンペプチドの放出を誘導する（Ｄｉｄａｎｇｅｌｏｓ ＴＰ、Ｋａｒａｍｉｔｓｏｓ ＤＴ、Ａｔｈｙｒｏｓ ＶＧら、（１９９８））。確定的な糖尿病性自律神経障害を有する患者における心臓血管反射検査についてのアルドース還元酵素阻害の効果（Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ａｌｄｏｓｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｎ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｒｅｆｌｅｘ ｔｅｓｔｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｄｅｆｉｎｉｔｅ ｄｉａｂｅｔｉｃ ａｕｔｏｎｏｍｉｃ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ．Ｊ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１２，２０１〜７）。
【０００９】
有痛性神経障害を有しかつ、治療への応答を欠いている患者において、経皮的電子的刺激が、プログラムされた、低強度の電圧を印加するなどの方法で使用されており、冒された神経を介しての疼痛の伝達が防止されている。
【００１０】
有痛性糖尿病性神経障害は、慢性及び急性の形態に分類されている。急性形態は、典型的には診断後の最初の３年間に観察され；突発的に始まり、突発的に治まる。慢性形態は、平均で８又は９年間糖尿病を罹患している患者に生じる。それは、ゆっくり始まり、複数回の再発を伴って何年も持続する。頭蓋神経障害は、視覚を冒し、眼に疼痛を生じる場合がある。
【００１１】
疾患の症状は、一般的に、嗜眠、刺痛、身体のいくつかの部分での感受性の喪失、下痢又は便秘、膀胱制御の喪失、インポテンス、顔面、眼瞼及び／又は口の下垂である。それは、視覚の変化、めまい、腫脹障害、言語の変化及び筋肉の収縮も生じる場合がある。これらの症状は、冒された１つ又は複数の神経に応じて変化し、一般に徐々に発症する。
【００１２】
糖尿病性神経障害に伴う感受性の喪失は、病変の危険性を増大させる。わずかな感染が潰瘍になるまで進行し、切断が必要になる場合がある。一方、運動神経の損傷は、運動分解及び筋肉の不均衡をもたらす場合がある。すなわち、神経障害は、恐らくこの疾患での脚及び足の切断の主な原因である。
【００１３】
糖尿病性神経障害の治療の目的は、本疾患の進行の予防及び症状の低減である。グルコースの厳しい管理が、その進行を回避するために重要である。現在、糖尿病性神経障害における神経線維の変化の予防、阻止又は回復が可能である特効的な治療法は無い。神経損傷の修復が可能であると認可されている薬剤は無いが、いくつかが、現在研究中である。複合ビタミンＢ剤は、全ての形態の神経障害のために、恐らく最も使用されている薬剤である。これらの薬剤は、いくつかの症状を軽減するが、それらは緩和剤でしかない。最近使用されている他の治療の選択肢は、抗酸化特性に基づくリポ酸の静脈経路による適用である（Ｚｉｅｇｌｅｒ Ｄ、Ｈａｎｅｆｅｌｄ Ｍ、Ｒｕｈｎａｕ ＫＪら、（１９９９）。抗酸化剤アルファ−リポ酸での症候性糖尿病性多発神経障害の治療：７ヵ月間多施設ランダム化対照試験（ＡＬＡＤＩＮ ＩＩＩ研究）、ＡＬＡＤＩＮ ＩＩＩ研究グループ、糖尿病性神経障害におけるアルファ−リポ酸（Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｐｏｌｙｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｌｐａ−ｌｉｐｏｉｃ ａｃｉｄ：ａ ７ ｍｏｎｔｈ ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒｉａｌ（ＡＬＡＤＩＮ ＩＩＩ ｓｔｕｄｙ）．ＡＬＡＤＩＮ ＩＩＩ ｓｔｕｄｙ ｇｒｏｕｐ．Ａｌｐａ−ｌｉｐｏｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ，２２，１２９６〜３０１）。他のアッセイは、細径感受性線維に個別的な影響を示す化合物、アセチルＬ−カルニチンでの経口治療を導入するために実施されている。
【００１４】
末梢糖尿病性神経障害について病因に基づいた唯一の治療手順は、アルドース還元酵素阻害剤の使用に関する。その活性は、糖尿病の生物の神経に高血糖によって誘導される構造的及び機能的代謝障害における、アルドース還元酵素の役割に基づく。現在までに、神経障害を有する糖尿病のヒトで運動伝導速度の改善に有効であるソルビニルが臨床試験で評価されたが、毒性作用のために市場から撤退した。スタチルは、動物で有望な結果を示したが、これらの結果はヒトでは認められなかった。一般に、アルドース還元酵素阻害剤は非常に毒性である。
【００１５】
考慮すべき楽観論が臨床で、神経増殖因子（ＮＧＦ）及び他の増殖因子の導入を提案した。細径線維（Ｃ線維）神経障害を有する２５０名の患者でのアッセイにおいて、疼痛解除及び熱刺激を検出する能力の増大が立証された。しかし、さらに多数の患者での続く２つのアッセイにおいて、ＮＧＦでの治療はいかなる利益も示さなかった（Ｖｉｎｉｋ ＡＩ．（１９９９）。組換えヒト神経増殖因子（ｒｈ ＮＧＦ）での糖尿病性多発神経障害（ＤＰＮ）の治療（Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｐｏｌｙｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ（ＤＰＮ） ｗｉｔｈ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ｒｈ ＮＧＦ）．Ｄｉａｂｅｔｅｓ，４８，Ａ５４〜５）。
【００１６】
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）での遺伝子治療は、動物において大規模に評価されており、神経インパルスの伝導及び神経に血液を注いでいる血管の密度の改善を示している。しかし、これ及び追加の神経親和性薬剤を用いる他の手法は、動物での先行する肯定的結果にもかかわらず、臨床試験において糖尿病性神経障害の進行を停止できていない（Ｓｃｈｒａｔｚｂｅｒｇｅｒ Ｐ、Ｗａｌｔｅｒ ＤＨ、Ｒｉｔｔｉｇ Ｋら、（２００１））。ＶＥＧＦ遺伝子導入による実験的糖尿病性神経障害の回復（Ｒｅｖｅｒｓａｌ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ ｂｙ ＶＥＧＦ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，１０７，１０８３〜９２）。症状を低減するために、カプサイシン又はアミトリプチリン、ガバペンチン及びカルバマゼピンなどの経口薬剤での局所的な治療が推奨される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
糖尿病性神経障害の病因機序は、十分に理解されていない。現在の治療は疼痛を解消し、付随する症状の一部を管理できるが、経過は一般に進行性である。最も悪いことは、この疾患に対する特効薬が近い将来に入手できそうにないことである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、有痛性の感受性運動神経障害並びに虚血性神経炎における末梢神経の形態機能的回復のための、神経幹及び／又は神経節の周辺に浸潤を介して投与される医薬組成物においてＥＧＦを使用することにより上記問題の解決に寄与する。
【００１９】
糖尿病に伴う末梢神経の変化は、複雑であり、様々な原因が恐らく関与する。２つの主な発症機序は、１）長期にわたり末梢神経に構造的変化を引き起こす一連の生化学的異常をもたらすソルビトール蓄積説、２）低酸素又は虚血によって引き起こされる神経線維の変化を生じる、神経内膜微小血管の構造的及び機能的損傷である。糖尿病性神経障害の発生の他の機序は、酵素産生の調節、補体系の活性化、鉄及び銅などの重金属に対して高い親和性を有するタンパク質の蓄積、並びに神経親和性因子の減少である。強く主張されている他の要素は、過酸化物及びニトロシル化物の蓄積である。神経内膜の酸素分圧の低減が、神経障害に罹患している糖尿病患者の神経において観察されている。これら全ての事象は、神経構造での高レベルのアポトーシス及び細胞死をもたらす。これが、糖尿病性神経障害が、ミエリン化された神経線維のレベルでの機能単位の喪失及び神経伝導速度（ＮＣＶ）の顕著な低減によって特徴付けられる理由である。末梢多発神経障害は、アルファ及びＣ線維の機能障害に関連する疼痛の存在によって特徴付けられる。
【００２０】
一般に、本発明の組成物は、当業者がＣ線維の損傷を認めた場合に、それを切断の前後の脚の末梢疼痛領域である、神経幹及び／又は神経節の近傍に配置して、局所浸潤によって適用される。本組成物により数週間治療すると、神経障害性疼痛が消失し、非自律神経障害が緩和され、圧力及び温度に対する末梢感受性が回復し得ることが示されている。
【００２１】
糖尿病の動物において医薬組成物を３回全身注射する、又は神経幹の周辺に局所浸潤した後、本発明者らは、以下のことを認めた。
１．坐骨神経のミエリン鞘の完全性の改善
２．軸索浮腫の低減
３．軸索神経フィラメントの保存
４．神経栄養血管の完全性
５．神経内膜膠原化の減少
６．運動線維の伝導速度の正常化
【００２２】
この組成物は、目的の構造の近傍に１から５ミリリットルの容積で緩徐に放出される。神経幹及び神経節への浸潤の頻度は、１週間に１回から３回の間で変えることができる。本発明に記載の組成物による治療は、アルドース還元酵素阻害剤、アミノグアニジン、経口又は非経口血糖降下剤、インスリン、インスリンに対する末梢感受性の刺激剤、グルカゴン様ペプチド、ビタミン療法、ＧＡＢＡ系の作用薬又は増幅剤、エンドルフィン前駆体、抗酸化剤、脂肪酸又はその前駆体、個々の療法又は鎮痛剤と組合せた療法、三環系抗うつ剤及び抗炎症剤を伴う場合も伴わない場合もある。患者に施される適用の回数は、患者の臨床症状の重症度によって異なる。症状が再出現する場合は、数サイクルの治療が必要である。
【００２３】
本発明の具体的な一実施形態は、感受性運動神経障害のより重大な発現により脚が冒されている場合、この神経障害における末梢神経の形態機能的回復のための、神経幹及び／又は神経節の周辺に浸潤によって投与される製剤を調製するためのＥＧＦの使用である。好ましい実施形態において、末梢神経の形態機能的回復のための、神経幹及び／又は神経節の周辺に浸潤を介して投与される医薬組成物を調製するために使用されるＥＧＦは、ヒト組換えＥＧＦである。
【００２４】
本発明の他の具体的な実施形態において、ＥＧＦ含有医薬組成物の浸潤は、坐骨神経に行われる。
【００２５】
本発明の目的は、糖尿病性神経障害における末梢神経の形態機能的回復のための、神経幹及び／又は神経節の周辺に浸潤を介して投与される、ＥＧＦと少なくとも１つの局所麻酔剤又は鎮静剤との組合せを含有する注射可能な医薬組成物である。具体的な一実施形態において、前記麻酔剤は、ＥＧＦの浸潤によって生じる疼痛の緩和に寄与するリドカインである。さらに、組成物中に存在する添加された麻酔剤は、中でもブピバカイン又はノボカインであり得る。
【００２６】
本発明の一部として、ＥＧＦが放出制御系を用いて神経幹及び／又は神経節の周辺に浸潤を介して投与される組成物もある。好ましい一実施形態において、前記放出制御系は、乳酸及びグリコール酸、又はポリ乳酸コポリマーで作製された、ＥＧＦを含むミクロスフェアである。
【００２７】
ミクロスフェアにより、いくつかの利点を享受することができ、最も一般的なものは、投与頻度の低減である。本発明は、糖尿病性神経障害の治療に特異的である利用可能な薬剤がないことに対して技術的解決を提示する。しかし、ＥＧＦ含有医薬組成物による治療は、この分子がミクロスフェアに結合しない場合、少なくとも１週間に２回、相当する用量の薬剤の適用を必要とする。この不便さを考慮しても、ＥＧＦの緩徐で持続的な放出のための製剤の使用は、製品の投与頻度を低減し、それは患者にとって有益である。ミクロスフェアに基づく製剤は、以下の利点を有する。
投与頻度が低減し、それにより患者の治療に対するアドヒアランスがより良好となる。
血清中のタンパク質レベルの変動が減少することにより、治療効果が高まる。
投与された用量の効能が高まることにより、治療に必要な総投与量が潜在的に減少する。
適用時に身体に放出されるタンパク質の量が減少することにより、有害事象が潜在的に減少する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】ＥＧＦを含むミクロスフェアの顕微鏡写真である。顕微鏡写真の下の線は、１０μｍ長を表す。
【図２】ＰＡＬミクロスフェアに封入されたＥＧＦの放出プロファイルのグラフである。Ｘ軸は、経過日数を示し、Ｙ軸は、放出されたＥＧＦの量をアッセイで使用したミクロスフェア中のＥＧＦの全量に対する百分率で表す。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００２９】
（実施例１）糖尿病性神経障害の回復における医薬組成物の予防効果
本研究の目的は、真性糖尿病の動物モデルでのＥＧＦ含有医薬組成物の神経保護効果を評価することであった。最初に、ストレプトゾトシンを投与することによるウィスターラットでの真性糖尿病誘導の方法論を確立する必要があった。
【００３０】
ウィスター雄、体重２００〜２５０グラムに、クエン酸ナトリウム緩衝液中のストレプトゾトシンを７５ｍｇ／ｋｇで皮下注射した。次いで、低血糖による死を防ぐために、続く２４時間は水を１０％ショ糖溶液に置き換えた。血液中のグルコースレベルは、注射後７２時間は毎朝モニターした。グルコース値１５ｍｍｏｌ／Ｌ以上を維持した動物だけを使用した。ラットは、１ケージ当たり４匹ずつ入れ、通常の方法で給餌した。同時に他のラット８０匹の群にストレプトゾトシンを含まないクエン酸緩衝液を与え、糖尿病群と同様のやり方で扱った。この群の７２時間の血糖の平均値は、５．８７ｍｍｏｌ／Ｌであった。
【００３１】
糖尿病性神経障害の予防におけるＥＧＦ含有医薬組成物の効果を研究するために、以下の実験設計：
・対照群 腹腔内経路によって１週間に３回、生理食塩水１ｍｌを投与される糖尿病ラットの群
・処置群１ 腹腔内経路によって１週間に１回、ＥＧＦ含有医薬組成物１ｍｌを投与される糖尿病ラットの群
・処置群４ 腹腔内経路によって１週間に３回、ＥＧＦ含有医薬組成物１ｍｌを投与される糖尿病ラットの群
を各群についてラット１０匹で使用した。
【００３２】
全ての処置は、ストレプトゾトシン注射の１週間後に開始し、８週間実施した。使用した組成物は、ヒト組換えＥＧＦを１ｍｌ当たり７５μｇ含有していた。研究中の動物についていくつかの種類の観察を実施した。
【００３３】
（１）侵害受容閾値（ＮＣＴ）の決定、疼痛試験
尾に増大する圧力を適用することによる疼痛試験を処置開始後２８日目及び５６日目に、各実験群１つ当たり動物１０匹を使用して実施した。グラム数で表すＮＣＴは、動物の尾に徐々に増大する圧力を、それらが逃避反射を示すまで適用するためにＵｇｏ Ｂａｓｉｌｅ型無痛覚計を使用することによって決定した。ヒトの糖尿病性神経障害において、侵害受容閾値は低減している。表１は、２８日目に測定したＮＣＴの結果を示す。
表１．ＮＣＴ検査の結果（２８日目）
【表１】
【００３４】
疾患進行の２８日後では、動物の侵害受容様式に変化は検出されなかった。これは、知覚過敏の臨床形態がまだ始まっていないことを示唆している。これにより、処置の効果はこの時点ではまだ判断できない。５６日目の検査の結果を表２に示す。
【００３５】
結果が示す通り、糖尿病誘導の２ヵ月後では、動物で末梢糖尿病性神経障害の影響を判断することができる。疼痛感受性閾値の低減がこの実験の時点で検出された。２ヵ月間生理食塩水を投与された糖尿病ラットの群と１週間に３回、ＥＧＦ含有組成物での処置を受けた群との間にも顕著な差異がある。
表２．ＮＣＴ検査の結果（５６日目）
【表２】
【００３６】
生理食塩水で処置した糖尿病群と、処置３を受けた群及び非糖尿病ラットの群との間に有意差が観察された（＊＊ｐ＜０．０１ ＡＮＯＶＡとボンフェローニ補正）。処置１の群と、処置３の群及び健康な動物との間にも有意差があった。処置した動物が一般に疼痛に対してより耐性を示したという発見は、ＥＧＦ含有組成物での処置が感受性線維の変質を予防したことを示唆している。
【００３７】
（２）感受性線維によるインパルスの伝導速度の決定
感受性及び運動線維でのＥＧＦ含有医薬組成物の予防効果を評価するために、電気インパルスの伝導速度を処置開始の６０日後に測定した。各実験群について動物１５匹を使用した。糖尿病性神経障害において伝導速度は、一般に低下している。
【００３８】
双極電極を使用する坐骨−脛骨経路での遠位の最大刺激を運動伝導を研究するために使用した。感受性経路での伝導速度の決定は、尾の近位点に刺激を適用し、３ｃｍ離れてそれを測定することによって実施した。６０日目でのこの研究の結果を表３に示す。
表３．６０日目の運動伝導速度（ＭＣＶ）
【表３】
【００３９】
生理食塩水で処置した糖尿病群と、処置３を受けた群及び非糖尿病ラットの群との間に有意差が観察された（＊＊ｐ＜０．０１ ＡＮＯＶＡとボンフェローニ補正）。有意差が、処置１の群と処置３の群及び健康な動物との間にもあり（＊＊ｐ＜０．０５）；処置群１と生理食塩水を投与された対照の糖尿病の動物との間にもあった。
【００４０】
組成物の、具体的には１週間に３回の適用を受けた群における、肯定的効果に注目されたい。運動線維での伝導の値は、健康な動物におけるそれに非常に類似している。非糖尿病動物の群とはまだ統計的差異があるが、処置１を受けた群のラットも伝導速度が改善した。６０日目での感受性伝導速度（ＳＣＶ）の研究結果を表４に示す。
表４．６０日目での感受性伝導速度（ＭＣＶ）
【表４】
【００４１】
生理食塩水で処置した糖尿病群と、処置３を受けた群及び非糖尿病ラットの群との間に有意差が観察された（＊＊ｐ＜０．０１ ＡＮＯＶＡとボンフェローニ補正）。処置１の群と、処置３の群及び健康な動物との間にも有意差があり（＊＊ｐ＜０．０５）；処置群１と生理食塩水を投与された対照の糖尿病の動物との間には統計的差異は検出されなかった。この研究は、１週間に３回投与した場合での、動物の機能的完全性を保存するためのＥＧＦ含有医薬組成物の効果を示している。
【００４２】
（３）末梢神経の血液灌流の完全性における組成物の影響
ラットの右坐骨神経をモデルとして使用した。各実験群１つに動物１０匹が含まれた。同様の数の非糖尿病ラットを基準値を算出するために使用した。レーザードップラー灌流画像（ＬＤＰＩ）システムを使用した。末梢組織から神経への灌流のデータをゼロ値としてプログラムした。対照動物に、測定前の２ヵ月間生理食塩水を与えた。全ての決定は、同じ麻酔条件及び環境条件下で実施した。それらを表５に示す。
表５．レーザードップラー灌流画像システムで実施した研究の結果
【表５】
【００４３】
生理食塩水で処置した糖尿病群と治療用組成物を１週間に１回投与された群、両処置とも２ヵ月間、との間に；及び治療用組成物を１週間に３回投与された群との間にも有意差が（＊＊ｐ＜０．０１ ＡＮＯＶＡとボンフェローニ補正）観察された。後者の群と健康な非糖尿病ラットからの値との間に統計的差異は検出されなかった。
【００４４】
（４）死後での決定及び特徴付け
組織形態計測的研究
処置完了後、動物を糖尿病誘導の７０日後、最後の用量を与えた１０日後で上に記載の分析が終了した後に屠殺した。動物は、過量投与の麻酔薬によって屠殺し、緩衝生理食塩水ｐＨ７．４で灌流した。実験群当たり合計１０匹の動物が組織形態計測的研究のために含まれ、同等数のラットを生化学的決定のために使用した。両方の系において、両肢由来の坐骨神経を切開し、断片を処理まで−７０℃で保存した。組織学的及び／又は組織形態計測的研究のために採取した試料をヘマトキシリン／エオシン及びトルイジンブルーで染色した。同じ神経の少なくとも５個の断片をＭＡＤＩＰプログラムを使用して定量的に研究した。断片をセロイジン及びゼラチンのブロックに包含し、これらのブロックを水平及び横断方向に薄切りにした。以下の組織学的指標：
一定倍率として１０×を使用した、神経の縦方向の切断における１０顕微鏡視野中の（神経鞘／神経周膜での）血管の総数。
脱髄線維の百分率。顕微鏡視野当たりの値を平均することによって評価した（×２０、少なくとも５視野）。
顕微鏡視野当たりの、（膨張した又は歪んだ）病変を有するミエリン又は非ミエリン線維の百分率（×２０、少なくとも５視野）。
神経内膜の膠原化の百分率（少なくとも異なる３ヵ所の切片の横断的薄片の神経内膜面積において、中等度：２５から５０％；重度：５０％超を評価した。この研究の結果を表６に示す。
表６．坐骨神経の断片で実施した形態計測的研究
【表６】
【００４５】
生理食塩水で処置した糖尿病の動物の群と健康な対照ラットの間の血管数において統計的有意差が示された（ｐ＝０．００２３）。さらに、生理食塩水群と処置１を受けた群とを比較した場合にも統計的差異が見られた（ｐ＝０．０３１）。生理食塩水群を、処置３を受けた群と比較した場合にも統計的差異があった（ｐ＝０．０１４）。結果は、ＡＮＯＶＡとボンフェローニ補正によって分析した。百分率はフィッシャー直接確率法で比較した。
【００４６】
３つのパラメーターについて処置群間に統計的有意差が見られた：脱髄線維の百分率、病変を有する線維の百分率及び膠原化面積の百分率。インスリン処置糖尿病マウスの群と処置３を受けた動物との間に統計的差異が検出された（ｐ＜０．０５）。
【００４７】
部分的結論 ＥＧＦ含有組成物での１週間に３回、２ヵ月間の処置は、脱髄過程を予防でき、坐骨神経線維の形態学的変質を顕著に低減でき、結果として神経内膜膠原化を予防できた。同様に、この組成物での持続的処置は、神経を養っている血管の委縮及び変性を顕著に回避する。これら全ての発見は、感受性及び運動刺激伝導に関して実施された機能検査、及びレーザードップラーシステムでの灌流研究と一致する。
【００４８】
（５）神経断片の生化学的特徴付け
実験群当たり１０匹の動物を、採取した坐骨神経の断片での生化学的決定を実施するために使用した。研究した生化学的パラメーターは、以下の：
酸化還元プロファイル
全スーパーオキシドジムスターゼ酵素活性（ｔＳＯＤ）
カタラーゼ酵素活性
全ヒドロペルオキシド（ＨＰＴ）の軸索内蓄積
マロニルジアルデヒド（ｍａｌｏｎｙｌｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ）（ＭＤＡ）の軸索内蓄積
である。この研究の結果を表７に示す。
表７．坐骨神経由来断片での酸化還元状態の特徴付け
【表７】
【００４９】
プラセボで処置した糖尿病の動物とＥＧＦ含有組成物で１週間に３回処置したそれとの間に有意差が観察された（＊＊ｐ＝０．０００１）。ＥＧＦ含有製剤で１週間に１回処置した群と１週間に３回処置した群との間、及び非糖尿病動物と比較した場合にも差異があった（＊ｐ＝０．００３）。健康な動物と１週間に３回処置した動物との間に両側スチューデントＴ検定によって差異は見られなかった。
【００５０】
グルコースの蓄積がいくつかの生化学的機序を介して脂質過酸化レベルの増大に、結果として終末糖化産物（ＡＧＥ）の組織内の蓄積に寄与することから、この過程に関連するマーカーを評価することは必須である。表７に示す結果によって表される通り、アッセイした医薬組成物での処置は、過酸化過程の代謝指標の蓄積を、適用の頻度に応じて顕著に低減する。同時に、処置はスーパーオキシドジムスターゼの減少を予防できる。
【００５１】
（６）坐骨神経断片でのリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）酵素活性
各動物由来の神経の断片をクレブス−リンゲル緩衝液中のヘパリン３μｇ／ｍｌと３７℃で、５０分間インキュベートした。これらの試料の一定分量を次いで、［１４Ｃ］トリオレイン−ホスファチジルコリンの存在下でインキュベートした。１４Ｃ標識脂肪酸を古典的方法によって定量した。ＬＰＬ活性は、組織１グラム当たり、１分間に放出された脂肪酸（ＲＦＡ）のナノモル数で表した。結果を表８に示す。
表８．坐骨神経におけるＬＰＬ活性
【表８】
【００５２】
生理食塩水で処置した糖尿病のラットと、処置３を受けた群並びに非糖尿病ラットの群との間に有意差が見られた（＊＊ｐ＜０．０１ ＡＮＯＶＡ及びチュ−キー法）。処置１の群と対照動物との間にも差異（＊ｐ＜０．０５）があった。処置３と非糖尿病動物との間に統計的有意差は見られなかった。
【００５３】
本分析は、ＥＧＦ含有組成物での処置が、ＬＰＬ酵素活性の保存を達成し、結果としてミエリンを合成する神経の能力を、この機能へのリン脂質の適切な寄与によって、改善することを示している。
【００５４】
（実施例２）既に罹患している糖尿病性神経障害の回復における医薬組成物の効果
本研究の目的は、医薬組成物の神経修復効果を評価することであった。体重２００〜２５０グラムの間のウィスターラット雄にクエン酸ナトリウム緩衝液中のストレプトゾトシンを７５ｍｇ／ｋｇで皮下注射し、疾患の誘導後１２０日間まで進行させた。この実験で使用した全てのラットは、１５ｍｍｏｌ／Ｌ以上に維持されたグルコースレベルを示した。動物は、既に記載の通り扱い、給餌した。同時に、動物にストレプトゾトシンの代わりに生理食塩水を与えた対照群を設定した。動物を、ストレプトゾトシン投与後３ヵ月間観察した。この期間の後に、全てのラットで電気生理学的特徴付けを行い、動物を２つの無作為の処置群に分けた：
群Ｉ．１週間に３日間、腹腔経路によって生理食塩水（１ｍｌ）を投与される動物。
群ＩＩ．１週間に３日間、腹腔経路によって１ｍｌ中にＥＧＦ１００μｇを含む医薬組成物を投与される動物。
【００５５】
同腹由来の、少なくとも１０匹の健康な非糖尿病ラットの群を、非糖尿病動物での生理学的値の基準として含めた。処置開始前の動物の神経生理学的特徴付けの結果を表９に示す。これらの調査において使用した方法は、既に記載されている。
表９．処置開始前の動物の神経生理学的特徴付け
【表９】
【００５６】
（１）侵害受容閾値（ＮＣＴ）の決定、疼痛試験
尾への徐々に増大する圧力の適用から成る疼痛試験、及び次に記載する残りの調査を１ヵ月間の治療後の糖尿病誘導後１２０日目に実施した。各実験群１つ当たり少なくとも動物１０匹を使用した。ＮＣＴ決定を、既に記載の通り実施し、結果を表１０に表す。
表１０．ＮＣＴ検査の結果
【表１０】
【００５７】
生理食塩水で処置した糖尿病ラットの群と、処置を受けたラットの群並びに非糖尿病ラットの群との間に有意差が観察された（＊＊ｐ＜０．０１ ＡＮＯＶＡ及びボンフェローニ補正）。処置群と元の動物との間にも差異があった（＊ｐ＜０．０５）。
【００５８】
結果は、糖尿病誘導の３ヵ月後では、末梢神経障害の進行の増大、健康な動物と比較して５０％を超える疼痛感受性閾値の低減があることを示している。糖尿病ラットの群と１週間に３回、１ヵ月間、医薬組成物で処置した群との間に観察された差異にも注目すべきである。
【００５９】
処置した動物は、一般に疼痛に対してより高い耐性を示し、発見は、医薬組成物での処置が感受性線維をなんらかの方法で治した又は回復させたことを示唆している。
【００６０】
（２）運動線維を介するインパルスの伝導速度の決定
感受性及び運動線維の回復についての医薬組成物の効果を検査するために、電気インパルスの伝導速度を糖尿病誘導後１２０日目、動物を医薬組成物又は生理食塩水で処置した後に測定した。実験群当たり動物１５匹を使用した。続く手順は、これまでの研究に対して既に記載されており、結果を表１１に示す。
表１１．運動線維の伝導速度の調査
【表１１】
【００６１】
生理食塩水で処置した糖尿病ラットの群と、本発明の組成物を投与されたラットの群並びに非糖尿病ラットの群との間に有意差が見られた（＊＊ｐ＜０．０１ ＡＮＯＶＡ及びボンフェローニ補正）。ＥＧＦ含有組成物で処置した群と元の非糖尿病動物との間にも差異があった（＊ｐ＜０．０５）。
【００６２】
結果は、糖尿病誘導の３ヵ月後では、末梢神経障害の進行の増大、及び運動線維に沿った刺激の伝導速度の低減が、特に健康な動物と比較する場合にあることを示している。しかし、医薬組成物での処置が、１週間に３回、１ヵ月間生理食塩水を投与された糖尿病ラットの群と比較して大きな差異を示したことを理解することは重要である。一般に、医薬組成物での処置は、運動神経線維を回復させ、その伝導能力を改善する。
【００６３】
研究した他の態様は、表１２に示す通り、感受性伝導速度（ＳＣＶ）である。
表１２．感受性伝導速度（ＳＣＶ）の研究
【表１２】
【００６４】
生理食塩水で処置した糖尿病ラットの群と、ＥＧＦ含有組成物を投与されたラットの群並びに非糖尿病ラットの群との間に有意差が見られた（＊＊ｐ＜０．０１ ＡＮＯＶＡ及びボンフェローニ補正）。本発明の組成物で処置した群と元の非糖尿病動物との間にも差異があった（＊ｐ＜０．０５）。
【００６５】
結果は、糖尿病誘導の３ヵ月後では、末梢神経障害の進行の増大、及び感受性線維に沿った刺激の伝導速度の低減が、特に健康な動物と比較する場合にあることを示している。パラメーターの悪化は５０％を超える。しかし、医薬組成物での処置が、１週間に３回、１ヵ月間生理食塩水を投与された糖尿病ラットの群と比較して大きな差異を示したことを理解することは重要である。一般に、医薬組成物での処置は、感受性神経線維を回復させ、それは、侵害受容閾値検査と一致する。
【００６６】
（３）末梢神経の血液灌流の完全性についての医薬組成物の影響
ラットの右坐骨神経を再びモデルとして使用した。各実験群１つ当たり動物１０匹を使用した。非糖尿病ラット由来の値を基準値として含めた。実験は、既に記載の通り実施したが、この場合は、動物は既に３ヵ月間糖尿病であり、実験群に応じてＥＧＦ含有組成物又は生理食塩水で１ヵ月間持続的に処置を受けていた。結果を表１３に表す。
表１３．レーザードップラー灌流画像システムで実施した研究の結果
【表１３】
【００６７】
生理食塩水で処置した糖尿病群と、ＥＧＦ含有組成物を投与された群並びに健康なラットの対照群との間に有意差が見られた（＊＊ｐ＜０．０１ ＡＮＯＶＡとボンフェローニ補正）。本発明の組成物で処置した群と元の非糖尿病動物との間にも有意差（＊ｐ＜０．０５）が見られた。
【００６８】
本発明の組成物での処置は、神経への血液灌流のレベルを明らかに改善した。値は、健康な動物の値にはまだ匹敵しないが、生理食塩水を投与された糖尿病のラットと比較するとはるかに高い。この効果の背景の分子機構は、まだ明確ではない。
【００６９】
（４）死後での決定及び特徴付け
組織形態計測的研究
ＥＧＦ含有組成物又は生理食塩水のいずれかでの処置の完了の１ヵ月後、疾患誘導の１２０日後に、動物を過量投与の麻酔薬によって屠殺し、緩衝生理食塩水ｐＨ７．４で灌流した。実験群当たり合計１０匹の動物が組織形態計測的研究のために含まれ、同等の数のラットを生化学的決定のために使用した。両方の系において、両肢由来の坐骨神経を切開した。手順は、神経障害的損傷予防のアッセイについて記載されたものと同様であった。組織学的及び組織形態計測的研究のために採取した試料をヘマトキシリン／エオシン及びトルイジンブルーで染色した。同じ神経の少なくとも５個の断片をＭＡＤＩＰプログラムを使用して定量的に研究した。断片をＯＣＴブロックに包含し、グルタルアルデヒドで後固定し、水平及び横断方向に薄切りにした。評価した組織学的指標並びに処理及び評価のために使用した手順は、既に記載されている：
一定倍率として１０×を使用した、神経の縦方向の切断における１０顕微鏡視野での（神経鞘／神経周膜での）血管の総数。
脱髄線維の百分率。顕微鏡視野当たりの値を平均することによって評価した（×２０、少なくとも５視野）。
顕微鏡視野当たりの、（膨張した又は歪んだ）病変を有するミエリン又は非ミエリン線維の百分率（×２０、少なくとも５視野）。
神経内膜の膠原化の百分率（少なくとも異なる３ヵ所の切片の横断的薄片の神経内膜面積において、中等度：２５から５０％；重度：５０％超。
【００７０】
結果を表１４に示す。糖尿病のラットの両方の群と元のラットの間の血管数において統計的有意差が示された（ｐ＜０．００１）。ＥＧＦ含有組成物で処置したラットと生理食塩水を投与された動物との間にも統計的差異が見られた（ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡとボンフェローニ補正）。
表１４．坐骨神経の断片について実施した形態計測的研究 ３０日後での評価
【表１４】
【００７１】
糖尿病の動物における脱髄した線維、病変を有する線維及び膠原化した神経内膜面積の百分率は、非糖尿病動物において観察された値と有意に異なっていた（ｐ＜０．００１）。健康な動物とＥＧＦ含有組成物で処置した動物との間に有意差が検出されたが（ｐ＜０．０５）、損傷の減弱効果は明らかである。百分率は、フィシャー直接確率法を使用して比較した。
【００７２】
部分的結論 糖尿病性神経障害確立後の、１週間に３回、１ヵ月間の本発明の組成物での処置は、坐骨神経線維の形態学的変質を顕著に低減した。本組成物での処置は、血管の委縮及び変性も低減できた。やはり、これら全ての発見は、実施された機能検査と一致する。
【００７３】
（５）神経断片の生化学的特徴付け
各群から動物１０匹を、採取した坐骨神経の断片での生化学的決定のために使用した。以下の生化学的パラメーター：
酸化還元プロファイル：
全スーパーオキシドジムスターゼ（ｔＳＯＤ）酵素総活性
カタラーゼ酵素活性
全ヒドロペルオキシド（ＴＨＰ）の軸索内蓄積
マロニルジアルデヒド（ＭＤＡ）の軸索内蓄積
を研究した。この研究の結果を表１５に示す。
表１５．坐骨神経の断片での酸化還元状態の特徴付け
【表１５】
【００７４】
プラセボ及び処置した糖尿病動物とＥＧＦ含有組成物で処置したラットの群との間に統計的有意差が見られた（ｐ＜０．０１、両側スチューデントＴ検定）。表１５に示す通り、医薬組成物での処置は、研究した神経組織において過酸化過程の代謝指標の存在を顕著に低減する。同時に、処置がスーパーオキシドジムスターゼ酵素の機能障害を減弱することが示されている。
【００７５】
（６）坐骨神経断片でのリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）酵素活性
この研究の目的は、ＥＧＦ含有組成物での１ヵ月の処置後のＬＰＬ酵素活性を、生理食塩水で処置した糖尿病の動物と比較することであった。結果を表１６に示す。生理食塩水で処置した糖尿病群と本発明の組成物で処置した群との間に有意差が観察された（＊＊ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡ及びチュ−キー法）。
表１６．坐骨神経におけるＬＰＬ活性
【表１６】
【００７６】
本分析は、ＥＧＦ含有医薬組成物での処置がＬＰＬ酵素活性を回復させ、結果としてミエリンを合成する神経の能力を改善することを示している。
【００７７】
（実施例３）糖尿病性神経障害を有する患者の治療におけるＥＧＦ含有組成物の治療効果の証明
合計５名の患者をＥＧＦ含有組成物で治療した。これらの患者は、感受性運動及び有痛性神経障害の徴候を有し、従来の治療に反応しなかった。投与されたＥＧＦの用量は、２０及び２５μｇの間であった。この活性な薬学的成分を含有する組成物の適用は、浸潤によって行われた。治療した例は以下の通り：
患者ＰＣＭ ５０歳女性患者、２０年超の１型糖尿病の診断、虚血性心臓障害の症状、高血圧及び神経障害を有する。１０年を超えて進行し、従来の治療に臨床的反応が無い、感受性運動神経障害の病歴及び有痛性神経障害の徴候。１用量当たりＥＧＦ２５μｇ及びリドカイン１００ｍｇを含有する組成物を、主な坐骨神経に浸潤させた。この手順を常に坐骨神経に１週間に２回でさらに５回、合計６回の適用について繰り返した。３回目の浸潤後に疼痛は消失した。治療開始から８週間後、感受性運動の徴候は止み、３ヵ月間の追跡調査期間を通じてそのように維持された。
【００７８】
患者ＯＺＤ 糖尿病を罹患している７２歳女性患者、重症の動脈閉塞及び安静時疼痛を有する。歩行できず、完全な下肢知覚麻痺を有する。同組成物の３回の適用を同じ解剖学的位置（主な坐骨神経）に実施した。患者は、ＥＧＦ含有組成物の投与後でも脚の知覚麻痺は止まなかったと述べたが、安静時疼痛は本組成物の３回の適用後に消失し、患者は、より速く歩行できた。
【００７９】
患者ＢＣＢ ６０歳女性患者、１０年超の１型糖尿病の診断、安静時疼痛及び肢に知覚麻痺を有する。主な坐骨神経に浸潤によって同組成物を６回適用した。３回目の適用後に疼痛は消失し、知覚異常は、低減した。最終用量の適用の３週間後に疼痛が再出現したため、新たな治療周期を実施した。
【００８０】
患者ＧＴＣ 糖尿病を罹患している５７歳男性患者、肢に知覚麻痺を有する。同組成物の６回の適用を４日間隔で同じ解剖学的位置に実施した。前述の治療の終了後、脚の知覚麻痺の症状は消失し、３ヵ月間の追跡調査期間を通じてそのように維持された。
【００８１】
患者ＳＴＬ Ｉ型糖尿病を１０年超罹患している６８歳男性患者。下肢に知覚麻痺の徴候を呈する。同組成物の６回の適用を同じ解剖学的位置に、１週間に２回適用の割合で実施した。初回周期（６用量）の治療後、下肢の知覚麻痺は、６ヵ月後に再発するまで消失した。これにより新たな治療周期を同じ手順に従って適用し、知覚麻痺の徴候は３回目の浸潤後に低下した。
【００８２】
患者の神経学的機能における実質的改善が、安静時の自発痛及び感覚異常的感覚の消失を示して一般的に観察された。
【００８３】
（実施例４）ＥＧＦを有するＰＬＧＡミクロスフェアを含有する医薬組成物の調製
ＥＧＦを含むミクロスフェアの調製及び特徴付け
５％（ｗ／ｖ）ポリ乳酸溶液（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、ＵＳＡ）をポリマー１ｇをジクロロメタン（ＤＣＭ）に溶解することによって調製した。
【００８４】
ＰＬＧＡ溶液３ミリリットルをガラス容器に入れ、ＥＧＦ３０ｍｇ／ｍｌの水性溶液１００μｌを添加した。
【００８５】
混合物をＵｌｔｒａｔｕｒｒａｘ Ｔ８ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ（ＩＫＡ Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ、Ａｌｅｍａｎｉａ）を用いて、１４０００ｒｐｍで２分間撹拌した。得られた乳剤を１％ポリビニルアルコール ３０ｍｌに注ぎ、２次乳剤（ｗ／ｏ／ｗ）をＴ８ Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ（ＩＫＡ Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用する１４０００ｒｐｍでの２相の激しい撹拌を介して得た。両面乳剤を１％ポリビニルアルコール３００００〜７００００（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、ＵＳＡ）２７０ｍｌに注ぎ、ホモジナイザー（ＩＫＡ Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で３００ｒｐｍ、１時間、ジクロロメタンを蒸発させるために撹拌した。最後にミクロスフェアをろ過によって回収し、５０ｍｌ蒸留水で５回洗浄し、凍結乾燥機（Ｅｄｗａｒｄｓ、ＵＫ）で凍結乾燥した。乾燥させたミクロスフェアは、使用まで４℃で保存した。
【００８６】
得られたＥＧＦを含むミクロスフェアは、球状であり、均一で多孔性の表面を示した（図１）。工程の回収率は、封入効率は６８から７１％の範囲で、８５％であった。ミクロスフェアの負荷は、０．８２から０．８５％の範囲であった。粒子は、３０μｍより小さかった。
【００８７】
封入されたＥＧＦのｉｎ ｖｉｔｒｏ放出
ＥＧＦを含むミクロスフェア５０ｍｇを受容体液（ＰＢＳ ｐＨ７．２中、０．００１％ Ｔｗｅｅｎ ８０及び０．１％アジ化ナトリウム）１ｍｌに懸濁した。懸濁液を穏やかに撹拌しながら３７℃でインキュベートした。試料を、１、３、７及び１４日目にＨｅｔｔｉｃｈ ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（Ｔｕｔｔｌｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で５０００ｒｐｍ、５分間遠心分離した。上清を回収し、同容積の受容体液を添加した。各試料中のＥＧＦ濃度を微量定量法（マイクロＢＣＡアッセイ）でのビシンコニン酸法によって評価した。
【００８８】
ミクロスフェアからのＥＧＦの放出プロファイルは、第１日目のバースト放出期、及び１４日目までの持続的かつ徐放的なＥＧＦ放出の第２期を示した。全タンパク質の約３０％が第１期の内に放出され、粒子内に含有されたＥＧＦの５０％までが残りの評価期間中に１日当たり約７μｇの速度で放出された（図２）。
【００８９】
（実施例５）糖尿病性神経障害を有する患者でのミクロスフェアに封入したＥＧＦ含有組成物の治療的効果の証明
次いで我々は、ミクロスフェアに封入したＥＧＦ含有組成物で治療した患者３名のいくつかの特徴及び彼らに適用した治療についての情報を要約する：
患者ＬＮＰ ４７歳女性患者、１０年超の１型糖尿病の診断を有し、感受性運動及び有痛性神経障害Ｉの徴候を有する。主な坐骨神経に１用量当たりＥＧＦ２０μｇを含有する組成物を浸潤させた。この手順を１週間に２用量の頻度で３回、合計４回の適用について繰り返した。疼痛は３回目の浸潤後に低減し、４回目の適用後に消失した。感受性運動徴候は、２週間後に消失し、３ヵ月間の追跡調査期間を通じてそのように維持された。
【００９０】
患者ＪＶＲ ６３歳女性患者、Ｉ型糖尿病を有する。安静時疼痛及び肢の知覚麻痺を呈する。１用量当たりＥＧＦ２５μｇを含有する組成物を１２日ごとに６回適用した。組成物の適用は、主な坐骨神経への浸潤によって行った。３回目の適用後に疼痛は消失し、知覚異常は、低減した。組成物の最終適用の６週間後に疼痛が再出現したため、新たな周期の治療を開始した。
【００９１】
患者ＤＧＲ ５２歳、男性患者、型糖尿病を有し、肢の知覚麻痺を罹患。徐放用にミクロスフェアに封入した前記ＥＧＦ含有組成物の５用量を、同じ解剖学的部位に、１４日の間隔を置いて投与した。ＥＧＦ治療を終了すると、脚の知覚麻痺は既に消えており、それは４ヵ月間の追跡調査期間を通じて維持された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病性神経障害の任意の臨床的徴候、及び虚血性神経炎の徴候を予防する又は治すための、神経幹及び／又は神経節の周辺に浸潤によって投与することが好ましい、上皮増殖因子（ＥＧＦ）を含む医薬組成物の医学的又は実験的適用に関する。前記製剤は局所的に、四肢の末端領域に又は神経障害性疼痛を感じる切断肢に基づいて投与することもできる。
【背景技術】
【０００２】
血液中の不適当なグルコースレベル及び他の糖尿病関連因子は、身体の任意の部位で神経線維を変化させ、冒された神経に応じて特異的な特徴を有する一群の障害を生じる場合がある。これらの障害は、総じて糖尿病性神経障害と称され、少なくとも３つ主要な種類が記述されている：（１）感受性運動神経障害（最も典型的かつ頻出の形態）、（２）自律神経障害、及び（３）単神経障害（Ｓａｄｉｋｏｔ ＳＭ、Ｎｉｇａｍ Ａ、Ｄａｓ Ｓら、（２００４）．ＷＨＯ １９９９年基準を使用したインドにおける糖尿病及び糖耐性減退の要旨：インドにおける糖尿病有病率の研究（Ｔｈｅ ｂｕｒｄｅｎ ｏｆ ｄｉａｂｅｔｅｓ ａｎｄ ｉｍｐａｉｒｅｄ ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎ Ｉｎｄｉａ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＷＨＯ １９９９ ｃｒｉｔｅｒｉａ：ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｉｎ Ｉｎｄｉａ ｓｔｕｄｙ（ＰＯＤＩＳ）．Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｒｅｓ Ｃｌｉｎ Ｐｒａｃｔ，６６，３０１〜７）。
【０００３】
これらの障害の背景の正確な機序は完全には理解されていないが、神経線維が、グルコース代謝の悪化に由来する物質の蓄積によって構造的に修飾され、それにより神経線維中のミエリン鞘が喪失することは周知である。この保護鞘の喪失は、運動指令又は任意の他の種類のシグナルの感知、伝達のいずれにおいても神経インパルスを伝達する能力の遅延を意味する。この直接の機序に加えて、神経に血液を注いでいる血管が、糖尿病の他の慢性合併症に一般的である事象による閉塞を引き起こす恐れがある（Ａｓｈｏｋ Ｓ、Ｒａｍｕ Ｍ、Ｄｅｅｐａ Ｒ ら、（２００２）。南インドの糖尿病センターに通院する２型糖尿病患者における神経障害の有病率（Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ ｉｎ ｔｙｐｅ２ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｔｔｅｎｄｉｎｇ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｃｅｎｔｅｒ ｉｎ Ｓｏｕｔｈ Ｉｎｄｉａ．Ｊ Ａｓｓｏｃ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ Ｉｎｄｉａ，５０，５４６〜５０）。
【０００４】
糖尿病において一般的であるように、糖尿病性神経障害の初期段階は、一般的に、何年間も無症候性であり、今日までその潜行性の臨床経過を予期する方法は無い。医師が、感受性運動性糖尿病性神経障害を疑う場合、神経伝導の速度を評価する検査を実施することによって診断を確認できる。この検査は、選択した神経を介する少量の電流の伝達速度の決定から成る。
【０００５】
糖尿病性神経障害のさらに頻出の形態、感受性運動神経障害において、初期の症状として、感受性の喪失、触覚の不正確な認知及び特定の場合においてわずかな皮膚への接触後の鋭敏な疼痛が挙げられる。通常、これは最初、足及び手に、主に夜間に生じる。冒された神経が消化運動を司る場合、遅い消化過程又は腸の律動の変化（下痢及び／又は便秘）が起きる場合がある。時に、糖尿病性神経障害は、心臓血管系制御を冒し、患者が急に起き上がる場合に失神又は低血圧を引き起こす（Ｌｅｖｉｔｔ ＮＳ、Ｓｔａｎｓｂｅｒｒｙ ＫＢ、Ｗｙｃｈａｎｃｋ Ｓら、（１９９６））。自律神経障害の自然進行及びＩＤＤＭコホートでの自律機能検査（Ｎａｔｕｒａｌ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｕｔｏｎｏｍｉｃ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ ａｎｄ ａｕｔｏｎｏｍｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｔｅｓｔｓ ｉｎ ａ ｃｏｈｏｒｔ ｏｆ ＩＤＤＭ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ，１９，７５１〜５４）。
【０００６】
糖尿病性単神経障害は、事実上、任意の孤立した神経を冒す場合があり、顔面の片側の麻痺、眼球運動の変化、具体的な解剖学的位置の麻痺及び／又は疼痛を生じる。
【０００７】
末梢神経障害は、頭蓋神経、又は脊髄及びその分枝の神経を冒す場合があり、段階的に進行する傾向がある型の神経障害（神経病変）である。初期には、四肢、特に足に疼痛及び間欠的な刺痛があるが、さらに進行した段階では疼痛はより強く、持続的である。最終的に、無痛性神経障害を、神経の変質が強い場合に発症する（Ｏｈ ＳＪ．（１９９３）．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｌｅｃｔｒｏｍｙｏｇｒａｐｈｙ：ｎｅｒｖｅ ｃｏｎｄｕｃｔｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｉｎ：Ｎｅｒｖｅ ｃｏｎｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｐｏｌｙｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｅｓ．Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ：Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，ｐ：５７９〜９１）。
【０００８】
糖尿病性神経障害のさらに重篤な事象の１つは、時に激しく、標準的治療手順に応答しない、関連する疼痛である。薬学的及び臨床的治療が、十分に成功しないが使用されている。前者は、遮断された線維にまで到達して浸透できる鎮痛剤、非ステロイド性抗炎症剤、カルバマゼピン及びフェントラミンなどの鎮痙剤、三環系抗うつ剤及び局所麻酔剤との組合せで主に用いられている。鎮痙剤は、近年、糖尿病性神経障害に伴う疼痛を治療するために使用されている。その中で、疼痛を治療するために最近導入されたのは、ガバペンチンである。神経化学的にはガパペンチンは、ガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の生物利用能を増大し、ＧＡＴ−１担体を阻害し、結果としてＧＡＢＡの再捕捉を低減し；ノルアドレナリン、ドパミン及び５−ＯＨ−トリプタミンなどの生体アミンの合成及び放出を減少させ；疼痛調節に関与するエンセファリン型アヘンペプチドの放出を誘導する（Ｄｉｄａｎｇｅｌｏｓ ＴＰ、Ｋａｒａｍｉｔｓｏｓ ＤＴ、Ａｔｈｙｒｏｓ ＶＧら、（１９９８））。確定的な糖尿病性自律神経障害を有する患者における心臓血管反射検査についてのアルドース還元酵素阻害の効果（Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ａｌｄｏｓｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｎ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｒｅｆｌｅｘ ｔｅｓｔｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｄｅｆｉｎｉｔｅ ｄｉａｂｅｔｉｃ ａｕｔｏｎｏｍｉｃ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ．Ｊ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１２，２０１〜７）。
【０００９】
有痛性神経障害を有しかつ、治療への応答を欠いている患者において、経皮的電子的刺激が、プログラムされた、低強度の電圧を印加するなどの方法で使用されており、冒された神経を介しての疼痛の伝達が防止されている。
【００１０】
有痛性糖尿病性神経障害は、慢性及び急性の形態に分類されている。急性形態は、典型的には診断後の最初の３年間に観察され；突発的に始まり、突発的に治まる。慢性形態は、平均で８又は９年間糖尿病を罹患している患者に生じる。それは、ゆっくり始まり、複数回の再発を伴って何年も持続する。頭蓋神経障害は、視覚を冒し、眼に疼痛を生じる場合がある。
【００１１】
疾患の症状は、一般的に、嗜眠、刺痛、身体のいくつかの部分での感受性の喪失、下痢又は便秘、膀胱制御の喪失、インポテンス、顔面、眼瞼及び／又は口の下垂である。それは、視覚の変化、めまい、腫脹障害、言語の変化及び筋肉の収縮も生じる場合がある。これらの症状は、冒された１つ又は複数の神経に応じて変化し、一般に徐々に発症する。
【００１２】
糖尿病性神経障害に伴う感受性の喪失は、病変の危険性を増大させる。わずかな感染が潰瘍になるまで進行し、切断が必要になる場合がある。一方、運動神経の損傷は、運動分解及び筋肉の不均衡をもたらす場合がある。すなわち、神経障害は、恐らくこの疾患での脚及び足の切断の主な原因である。
【００１３】
糖尿病性神経障害の治療の目的は、本疾患の進行の予防及び症状の低減である。グルコースの厳しい管理が、その進行を回避するために重要である。現在、糖尿病性神経障害における神経線維の変化の予防、阻止又は回復が可能である特効的な治療法は無い。神経損傷の修復が可能であると認可されている薬剤は無いが、いくつかが、現在研究中である。複合ビタミンＢ剤は、全ての形態の神経障害のために、恐らく最も使用されている薬剤である。これらの薬剤は、いくつかの症状を軽減するが、それらは緩和剤でしかない。最近使用されている他の治療の選択肢は、抗酸化特性に基づくリポ酸の静脈経路による適用である（Ｚｉｅｇｌｅｒ Ｄ、Ｈａｎｅｆｅｌｄ Ｍ、Ｒｕｈｎａｕ ＫＪら、（１９９９）。抗酸化剤アルファ−リポ酸での症候性糖尿病性多発神経障害の治療：７ヵ月間多施設ランダム化対照試験（ＡＬＡＤＩＮ ＩＩＩ研究）、ＡＬＡＤＩＮ ＩＩＩ研究グループ、糖尿病性神経障害におけるアルファ−リポ酸（Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｐｏｌｙｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｌｐａ−ｌｉｐｏｉｃ ａｃｉｄ：ａ ７ ｍｏｎｔｈ ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒｉａｌ（ＡＬＡＤＩＮ ＩＩＩ ｓｔｕｄｙ）．ＡＬＡＤＩＮ ＩＩＩ ｓｔｕｄｙ ｇｒｏｕｐ．Ａｌｐａ−ｌｉｐｏｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ，２２，１２９６〜３０１）。他のアッセイは、細径感受性線維に個別的な影響を示す化合物、アセチルＬ−カルニチンでの経口治療を導入するために実施されている。
【００１４】
末梢糖尿病性神経障害について病因に基づいた唯一の治療手順は、アルドース還元酵素阻害剤の使用に関する。その活性は、糖尿病の生物の神経に高血糖によって誘導される構造的及び機能的代謝障害における、アルドース還元酵素の役割に基づく。現在までに、神経障害を有する糖尿病のヒトで運動伝導速度の改善に有効であるソルビニルが臨床試験で評価されたが、毒性作用のために市場から撤退した。スタチルは、動物で有望な結果を示したが、これらの結果はヒトでは認められなかった。一般に、アルドース還元酵素阻害剤は非常に毒性である。
【００１５】
考慮すべき楽観論が臨床で、神経増殖因子（ＮＧＦ）及び他の増殖因子の導入を提案した。細径線維（Ｃ線維）神経障害を有する２５０名の患者でのアッセイにおいて、疼痛解除及び熱刺激を検出する能力の増大が立証された。しかし、さらに多数の患者での続く２つのアッセイにおいて、ＮＧＦでの治療はいかなる利益も示さなかった（Ｖｉｎｉｋ ＡＩ．（１９９９）。組換えヒト神経増殖因子（ｒｈ ＮＧＦ）での糖尿病性多発神経障害（ＤＰＮ）の治療（Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｐｏｌｙｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ（ＤＰＮ） ｗｉｔｈ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ｒｈ ＮＧＦ）．Ｄｉａｂｅｔｅｓ，４８，Ａ５４〜５）。
【００１６】
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）での遺伝子治療は、動物において大規模に評価されており、神経インパルスの伝導及び神経に血液を注いでいる血管の密度の改善を示している。しかし、これ及び追加の神経親和性薬剤を用いる他の手法は、動物での先行する肯定的結果にもかかわらず、臨床試験において糖尿病性神経障害の進行を停止できていない（Ｓｃｈｒａｔｚｂｅｒｇｅｒ Ｐ、Ｗａｌｔｅｒ ＤＨ、Ｒｉｔｔｉｇ Ｋら、（２００１））。ＶＥＧＦ遺伝子導入による実験的糖尿病性神経障害の回復（Ｒｅｖｅｒｓａｌ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ ｂｙ ＶＥＧＦ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，１０７，１０８３〜９２）。症状を低減するために、カプサイシン又はアミトリプチリン、ガバペンチン及びカルバマゼピンなどの経口薬剤での局所的な治療が推奨される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
糖尿病性神経障害の病因機序は、十分に理解されていない。現在の治療は疼痛を解消し、付随する症状の一部を管理できるが、経過は一般に進行性である。最も悪いことは、この疾患に対する特効薬が近い将来に入手できそうにないことである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、有痛性の感受性運動神経障害並びに虚血性神経炎における末梢神経の形態機能的回復のための、神経幹及び／又は神経節の周辺に浸潤を介して投与される医薬組成物においてＥＧＦを使用することにより上記問題の解決に寄与する。
【００１９】
糖尿病に伴う末梢神経の変化は、複雑であり、様々な原因が恐らく関与する。２つの主な発症機序は、１）長期にわたり末梢神経に構造的変化を引き起こす一連の生化学的異常をもたらすソルビトール蓄積説、２）低酸素又は虚血によって引き起こされる神経線維の変化を生じる、神経内膜微小血管の構造的及び機能的損傷である。糖尿病性神経障害の発生の他の機序は、酵素産生の調節、補体系の活性化、鉄及び銅などの重金属に対して高い親和性を有するタンパク質の蓄積、並びに神経親和性因子の減少である。強く主張されている他の要素は、過酸化物及びニトロシル化物の蓄積である。神経内膜の酸素分圧の低減が、神経障害に罹患している糖尿病患者の神経において観察されている。これら全ての事象は、神経構造での高レベルのアポトーシス及び細胞死をもたらす。これが、糖尿病性神経障害が、ミエリン化された神経線維のレベルでの機能単位の喪失及び神経伝導速度（ＮＣＶ）の顕著な低減によって特徴付けられる理由である。末梢多発神経障害は、アルファ及びＣ線維の機能障害に関連する疼痛の存在によって特徴付けられる。
【００２０】
一般に、本発明の組成物は、当業者がＣ線維の損傷を認めた場合に、それを切断の前後の脚の末梢疼痛領域である、神経幹及び／又は神経節の近傍に配置して、局所浸潤によって適用される。本組成物により数週間治療すると、神経障害性疼痛が消失し、非自律神経障害が緩和され、圧力及び温度に対する末梢感受性が回復し得ることが示されている。
【００２１】
糖尿病の動物において医薬組成物を３回全身注射する、又は神経幹の周辺に局所浸潤した後、本発明者らは、以下のことを認めた。
１．坐骨神経のミエリン鞘の完全性の改善
２．軸索浮腫の低減
３．軸索神経フィラメントの保存
４．神経栄養血管の完全性
５．神経内膜膠原化の減少
６．運動線維の伝導速度の正常化
【００２２】
この組成物は、目的の構造の近傍に１から５ミリリットルの容積で緩徐に放出される。神経幹及び神経節への浸潤の頻度は、１週間に１回から３回の間で変えることができる。本発明に記載の組成物による治療は、アルドース還元酵素阻害剤、アミノグアニジン、経口又は非経口血糖降下剤、インスリン、インスリンに対する末梢感受性の刺激剤、グルカゴン様ペプチド、ビタミン療法、ＧＡＢＡ系の作用薬又は増幅剤、エンドルフィン前駆体、抗酸化剤、脂肪酸又はその前駆体、個々の療法又は鎮痛剤と組合せた療法、三環系抗うつ剤及び抗炎症剤を伴う場合も伴わない場合もある。患者に施される適用の回数は、患者の臨床症状の重症度によって異なる。症状が再出現する場合は、数サイクルの治療が必要である。
【００２３】
本発明の具体的な一実施形態は、感受性運動神経障害のより重大な発現により脚が冒されている場合、この神経障害における末梢神経の形態機能的回復のための、神経幹及び／又は神経節の周辺に浸潤によって投与される製剤を調製するためのＥＧＦの使用である。好ましい実施形態において、末梢神経の形態機能的回復のための、神経幹及び／又は神経節の周辺に浸潤を介して投与される医薬組成物を調製するために使用されるＥＧＦは、ヒト組換えＥＧＦである。
【００２４】
本発明の他の具体的な実施形態において、ＥＧＦ含有医薬組成物の浸潤は、坐骨神経に行われる。
【００２５】
本発明の目的は、糖尿病性神経障害における末梢神経の形態機能的回復のための、神経幹及び／又は神経節の周辺に浸潤を介して投与される、ＥＧＦと少なくとも１つの局所麻酔剤又は鎮静剤との組合せを含有する注射可能な医薬組成物である。具体的な一実施形態において、前記麻酔剤は、ＥＧＦの浸潤によって生じる疼痛の緩和に寄与するリドカインである。さらに、組成物中に存在する添加された麻酔剤は、中でもブピバカイン又はノボカインであり得る。
【００２６】
本発明の一部として、ＥＧＦが放出制御系を用いて神経幹及び／又は神経節の周辺に浸潤を介して投与される組成物もある。好ましい一実施形態において、前記放出制御系は、乳酸及びグリコール酸、又はポリ乳酸コポリマーで作製された、ＥＧＦを含むミクロスフェアである。
【００２７】
ミクロスフェアにより、いくつかの利点を享受することができ、最も一般的なものは、投与頻度の低減である。本発明は、糖尿病性神経障害の治療に特異的である利用可能な薬剤がないことに対して技術的解決を提示する。しかし、ＥＧＦ含有医薬組成物による治療は、この分子がミクロスフェアに結合しない場合、少なくとも１週間に２回、相当する用量の薬剤の適用を必要とする。この不便さを考慮しても、ＥＧＦの緩徐で持続的な放出のための製剤の使用は、製品の投与頻度を低減し、それは患者にとって有益である。ミクロスフェアに基づく製剤は、以下の利点を有する。
投与頻度が低減し、それにより患者の治療に対するアドヒアランスがより良好となる。
血清中のタンパク質レベルの変動が減少することにより、治療効果が高まる。
投与された用量の効能が高まることにより、治療に必要な総投与量が潜在的に減少する。
適用時に身体に放出されるタンパク質の量が減少することにより、有害事象が潜在的に減少する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】ＥＧＦを含むミクロスフェアの顕微鏡写真である。顕微鏡写真の下の線は、１０μｍ長を表す。
【図２】ＰＡＬミクロスフェアに封入されたＥＧＦの放出プロファイルのグラフである。Ｘ軸は、経過日数を示し、Ｙ軸は、放出されたＥＧＦの量をアッセイで使用したミクロスフェア中のＥＧＦの全量に対する百分率で表す。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００２９】
（実施例１）糖尿病性神経障害の回復における医薬組成物の予防効果
本研究の目的は、真性糖尿病の動物モデルでのＥＧＦ含有医薬組成物の神経保護効果を評価することであった。最初に、ストレプトゾトシンを投与することによるウィスターラットでの真性糖尿病誘導の方法論を確立する必要があった。
【００３０】
ウィスター雄、体重２００〜２５０グラムに、クエン酸ナトリウム緩衝液中のストレプトゾトシンを７５ｍｇ／ｋｇで皮下注射した。次いで、低血糖による死を防ぐために、続く２４時間は水を１０％ショ糖溶液に置き換えた。血液中のグルコースレベルは、注射後７２時間は毎朝モニターした。グルコース値１５ｍｍｏｌ／Ｌ以上を維持した動物だけを使用した。ラットは、１ケージ当たり４匹ずつ入れ、通常の方法で給餌した。同時に他のラット８０匹の群にストレプトゾトシンを含まないクエン酸緩衝液を与え、糖尿病群と同様のやり方で扱った。この群の７２時間の血糖の平均値は、５．８７ｍｍｏｌ／Ｌであった。
【００３１】
糖尿病性神経障害の予防におけるＥＧＦ含有医薬組成物の効果を研究するために、以下の実験設計：
・対照群 腹腔内経路によって１週間に３回、生理食塩水１ｍｌを投与される糖尿病ラットの群
・処置群１ 腹腔内経路によって１週間に１回、ＥＧＦ含有医薬組成物１ｍｌを投与される糖尿病ラットの群
・処置群４ 腹腔内経路によって１週間に３回、ＥＧＦ含有医薬組成物１ｍｌを投与される糖尿病ラットの群
を各群についてラット１０匹で使用した。
【００３２】
全ての処置は、ストレプトゾトシン注射の１週間後に開始し、８週間実施した。使用した組成物は、ヒト組換えＥＧＦを１ｍｌ当たり７５μｇ含有していた。研究中の動物についていくつかの種類の観察を実施した。
【００３３】
（１）侵害受容閾値（ＮＣＴ）の決定、疼痛試験
尾に増大する圧力を適用することによる疼痛試験を処置開始後２８日目及び５６日目に、各実験群１つ当たり動物１０匹を使用して実施した。グラム数で表すＮＣＴは、動物の尾に徐々に増大する圧力を、それらが逃避反射を示すまで適用するためにＵｇｏ Ｂａｓｉｌｅ型無痛覚計を使用することによって決定した。ヒトの糖尿病性神経障害において、侵害受容閾値は低減している。表１は、２８日目に測定したＮＣＴの結果を示す。
表１．ＮＣＴ検査の結果（２８日目）
【表１】
【００３４】
疾患進行の２８日後では、動物の侵害受容様式に変化は検出されなかった。これは、知覚過敏の臨床形態がまだ始まっていないことを示唆している。これにより、処置の効果はこの時点ではまだ判断できない。５６日目の検査の結果を表２に示す。
【００３５】
結果が示す通り、糖尿病誘導の２ヵ月後では、動物で末梢糖尿病性神経障害の影響を判断することができる。疼痛感受性閾値の低減がこの実験の時点で検出された。２ヵ月間生理食塩水を投与された糖尿病ラットの群と１週間に３回、ＥＧＦ含有組成物での処置を受けた群との間にも顕著な差異がある。
表２．ＮＣＴ検査の結果（５６日目）
【表２】
【００３６】
生理食塩水で処置した糖尿病群と、処置３を受けた群及び非糖尿病ラットの群との間に有意差が観察された（＊＊ｐ＜０．０１ ＡＮＯＶＡとボンフェローニ補正）。処置１の群と、処置３の群及び健康な動物との間にも有意差があった。処置した動物が一般に疼痛に対してより耐性を示したという発見は、ＥＧＦ含有組成物での処置が感受性線維の変質を予防したことを示唆している。
【００３７】
（２）感受性線維によるインパルスの伝導速度の決定
感受性及び運動線維でのＥＧＦ含有医薬組成物の予防効果を評価するために、電気インパルスの伝導速度を処置開始の６０日後に測定した。各実験群について動物１５匹を使用した。糖尿病性神経障害において伝導速度は、一般に低下している。
【００３８】
双極電極を使用する坐骨−脛骨経路での遠位の最大刺激を運動伝導を研究するために使用した。感受性経路での伝導速度の決定は、尾の近位点に刺激を適用し、３ｃｍ離れてそれを測定することによって実施した。６０日目でのこの研究の結果を表３に示す。
表３．６０日目の運動伝導速度（ＭＣＶ）
【表３】
【００３９】
生理食塩水で処置した糖尿病群と、処置３を受けた群及び非糖尿病ラットの群との間に有意差が観察された（＊＊ｐ＜０．０１ ＡＮＯＶＡとボンフェローニ補正）。有意差が、処置１の群と処置３の群及び健康な動物との間にもあり（＊＊ｐ＜０．０５）；処置群１と生理食塩水を投与された対照の糖尿病の動物との間にもあった。
【００４０】
組成物の、具体的には１週間に３回の適用を受けた群における、肯定的効果に注目されたい。運動線維での伝導の値は、健康な動物におけるそれに非常に類似している。非糖尿病動物の群とはまだ統計的差異があるが、処置１を受けた群のラットも伝導速度が改善した。６０日目での感受性伝導速度（ＳＣＶ）の研究結果を表４に示す。
表４．６０日目での感受性伝導速度（ＭＣＶ）
【表４】
【００４１】
生理食塩水で処置した糖尿病群と、処置３を受けた群及び非糖尿病ラットの群との間に有意差が観察された（＊＊ｐ＜０．０１ ＡＮＯＶＡとボンフェローニ補正）。処置１の群と、処置３の群及び健康な動物との間にも有意差があり（＊＊ｐ＜０．０５）；処置群１と生理食塩水を投与された対照の糖尿病の動物との間には統計的差異は検出されなかった。この研究は、１週間に３回投与した場合での、動物の機能的完全性を保存するためのＥＧＦ含有医薬組成物の効果を示している。
【００４２】
（３）末梢神経の血液灌流の完全性における組成物の影響
ラットの右坐骨神経をモデルとして使用した。各実験群１つに動物１０匹が含まれた。同様の数の非糖尿病ラットを基準値を算出するために使用した。レーザードップラー灌流画像（ＬＤＰＩ）システムを使用した。末梢組織から神経への灌流のデータをゼロ値としてプログラムした。対照動物に、測定前の２ヵ月間生理食塩水を与えた。全ての決定は、同じ麻酔条件及び環境条件下で実施した。それらを表５に示す。
表５．レーザードップラー灌流画像システムで実施した研究の結果
【表５】
【００４３】
生理食塩水で処置した糖尿病群と治療用組成物を１週間に１回投与された群、両処置とも２ヵ月間、との間に；及び治療用組成物を１週間に３回投与された群との間にも有意差が（＊＊ｐ＜０．０１ ＡＮＯＶＡとボンフェローニ補正）観察された。後者の群と健康な非糖尿病ラットからの値との間に統計的差異は検出されなかった。
【００４４】
（４）死後での決定及び特徴付け
組織形態計測的研究
処置完了後、動物を糖尿病誘導の７０日後、最後の用量を与えた１０日後で上に記載の分析が終了した後に屠殺した。動物は、過量投与の麻酔薬によって屠殺し、緩衝生理食塩水ｐＨ７．４で灌流した。実験群当たり合計１０匹の動物が組織形態計測的研究のために含まれ、同等数のラットを生化学的決定のために使用した。両方の系において、両肢由来の坐骨神経を切開し、断片を処理まで−７０℃で保存した。組織学的及び／又は組織形態計測的研究のために採取した試料をヘマトキシリン／エオシン及びトルイジンブルーで染色した。同じ神経の少なくとも５個の断片をＭＡＤＩＰプログラムを使用して定量的に研究した。断片をセロイジン及びゼラチンのブロックに包含し、これらのブロックを水平及び横断方向に薄切りにした。以下の組織学的指標：
一定倍率として１０×を使用した、神経の縦方向の切断における１０顕微鏡視野中の（神経鞘／神経周膜での）血管の総数。
脱髄線維の百分率。顕微鏡視野当たりの値を平均することによって評価した（×２０、少なくとも５視野）。
顕微鏡視野当たりの、（膨張した又は歪んだ）病変を有するミエリン又は非ミエリン線維の百分率（×２０、少なくとも５視野）。
神経内膜の膠原化の百分率（少なくとも異なる３ヵ所の切片の横断的薄片の神経内膜面積において、中等度：２５から５０％；重度：５０％超を評価した。この研究の結果を表６に示す。
表６．坐骨神経の断片で実施した形態計測的研究
【表６】
【００４５】
生理食塩水で処置した糖尿病の動物の群と健康な対照ラットの間の血管数において統計的有意差が示された（ｐ＝０．００２３）。さらに、生理食塩水群と処置１を受けた群とを比較した場合にも統計的差異が見られた（ｐ＝０．０３１）。生理食塩水群を、処置３を受けた群と比較した場合にも統計的差異があった（ｐ＝０．０１４）。結果は、ＡＮＯＶＡとボンフェローニ補正によって分析した。百分率はフィッシャー直接確率法で比較した。
【００４６】
３つのパラメーターについて処置群間に統計的有意差が見られた：脱髄線維の百分率、病変を有する線維の百分率及び膠原化面積の百分率。インスリン処置糖尿病マウスの群と処置３を受けた動物との間に統計的差異が検出された（ｐ＜０．０５）。
【００４７】
部分的結論 ＥＧＦ含有組成物での１週間に３回、２ヵ月間の処置は、脱髄過程を予防でき、坐骨神経線維の形態学的変質を顕著に低減でき、結果として神経内膜膠原化を予防できた。同様に、この組成物での持続的処置は、神経を養っている血管の委縮及び変性を顕著に回避する。これら全ての発見は、感受性及び運動刺激伝導に関して実施された機能検査、及びレーザードップラーシステムでの灌流研究と一致する。
【００４８】
（５）神経断片の生化学的特徴付け
実験群当たり１０匹の動物を、採取した坐骨神経の断片での生化学的決定を実施するために使用した。研究した生化学的パラメーターは、以下の：
酸化還元プロファイル
全スーパーオキシドジムスターゼ酵素活性（ｔＳＯＤ）
カタラーゼ酵素活性
全ヒドロペルオキシド（ＨＰＴ）の軸索内蓄積
マロニルジアルデヒド（ｍａｌｏｎｙｌｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ）（ＭＤＡ）の軸索内蓄積
である。この研究の結果を表７に示す。
表７．坐骨神経由来断片での酸化還元状態の特徴付け
【表７】
【００４９】
プラセボで処置した糖尿病の動物とＥＧＦ含有組成物で１週間に３回処置したそれとの間に有意差が観察された（＊＊ｐ＝０．０００１）。ＥＧＦ含有製剤で１週間に１回処置した群と１週間に３回処置した群との間、及び非糖尿病動物と比較した場合にも差異があった（＊ｐ＝０．００３）。健康な動物と１週間に３回処置した動物との間に両側スチューデントＴ検定によって差異は見られなかった。
【００５０】
グルコースの蓄積がいくつかの生化学的機序を介して脂質過酸化レベルの増大に、結果として終末糖化産物（ＡＧＥ）の組織内の蓄積に寄与することから、この過程に関連するマーカーを評価することは必須である。表７に示す結果によって表される通り、アッセイした医薬組成物での処置は、過酸化過程の代謝指標の蓄積を、適用の頻度に応じて顕著に低減する。同時に、処置はスーパーオキシドジムスターゼの減少を予防できる。
【００５１】
（６）坐骨神経断片でのリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）酵素活性
各動物由来の神経の断片をクレブス−リンゲル緩衝液中のヘパリン３μｇ／ｍｌと３７℃で、５０分間インキュベートした。これらの試料の一定分量を次いで、［１４Ｃ］トリオレイン−ホスファチジルコリンの存在下でインキュベートした。１４Ｃ標識脂肪酸を古典的方法によって定量した。ＬＰＬ活性は、組織１グラム当たり、１分間に放出された脂肪酸（ＲＦＡ）のナノモル数で表した。結果を表８に示す。
表８．坐骨神経におけるＬＰＬ活性
【表８】
【００５２】
生理食塩水で処置した糖尿病のラットと、処置３を受けた群並びに非糖尿病ラットの群との間に有意差が見られた（＊＊ｐ＜０．０１ ＡＮＯＶＡ及びチュ−キー法）。処置１の群と対照動物との間にも差異（＊ｐ＜０．０５）があった。処置３と非糖尿病動物との間に統計的有意差は見られなかった。
【００５３】
本分析は、ＥＧＦ含有組成物での処置が、ＬＰＬ酵素活性の保存を達成し、結果としてミエリンを合成する神経の能力を、この機能へのリン脂質の適切な寄与によって、改善することを示している。
【００５４】
（実施例２）既に罹患している糖尿病性神経障害の回復における医薬組成物の効果
本研究の目的は、医薬組成物の神経修復効果を評価することであった。体重２００〜２５０グラムの間のウィスターラット雄にクエン酸ナトリウム緩衝液中のストレプトゾトシンを７５ｍｇ／ｋｇで皮下注射し、疾患の誘導後１２０日間まで進行させた。この実験で使用した全てのラットは、１５ｍｍｏｌ／Ｌ以上に維持されたグルコースレベルを示した。動物は、既に記載の通り扱い、給餌した。同時に、動物にストレプトゾトシンの代わりに生理食塩水を与えた対照群を設定した。動物を、ストレプトゾトシン投与後３ヵ月間観察した。この期間の後に、全てのラットで電気生理学的特徴付けを行い、動物を２つの無作為の処置群に分けた：
群Ｉ．１週間に３日間、腹腔経路によって生理食塩水（１ｍｌ）を投与される動物。
群ＩＩ．１週間に３日間、腹腔経路によって１ｍｌ中にＥＧＦ１００μｇを含む医薬組成物を投与される動物。
【００５５】
同腹由来の、少なくとも１０匹の健康な非糖尿病ラットの群を、非糖尿病動物での生理学的値の基準として含めた。処置開始前の動物の神経生理学的特徴付けの結果を表９に示す。これらの調査において使用した方法は、既に記載されている。
表９．処置開始前の動物の神経生理学的特徴付け
【表９】
【００５６】
（１）侵害受容閾値（ＮＣＴ）の決定、疼痛試験
尾への徐々に増大する圧力の適用から成る疼痛試験、及び次に記載する残りの調査を１ヵ月間の治療後の糖尿病誘導後１２０日目に実施した。各実験群１つ当たり少なくとも動物１０匹を使用した。ＮＣＴ決定を、既に記載の通り実施し、結果を表１０に表す。
表１０．ＮＣＴ検査の結果
【表１０】
【００５７】
生理食塩水で処置した糖尿病ラットの群と、処置を受けたラットの群並びに非糖尿病ラットの群との間に有意差が観察された（＊＊ｐ＜０．０１ ＡＮＯＶＡ及びボンフェローニ補正）。処置群と元の動物との間にも差異があった（＊ｐ＜０．０５）。
【００５８】
結果は、糖尿病誘導の３ヵ月後では、末梢神経障害の進行の増大、健康な動物と比較して５０％を超える疼痛感受性閾値の低減があることを示している。糖尿病ラットの群と１週間に３回、１ヵ月間、医薬組成物で処置した群との間に観察された差異にも注目すべきである。
【００５９】
処置した動物は、一般に疼痛に対してより高い耐性を示し、発見は、医薬組成物での処置が感受性線維をなんらかの方法で治した又は回復させたことを示唆している。
【００６０】
（２）運動線維を介するインパルスの伝導速度の決定
感受性及び運動線維の回復についての医薬組成物の効果を検査するために、電気インパルスの伝導速度を糖尿病誘導後１２０日目、動物を医薬組成物又は生理食塩水で処置した後に測定した。実験群当たり動物１５匹を使用した。続く手順は、これまでの研究に対して既に記載されており、結果を表１１に示す。
表１１．運動線維の伝導速度の調査
【表１１】
【００６１】
生理食塩水で処置した糖尿病ラットの群と、本発明の組成物を投与されたラットの群並びに非糖尿病ラットの群との間に有意差が見られた（＊＊ｐ＜０．０１ ＡＮＯＶＡ及びボンフェローニ補正）。ＥＧＦ含有組成物で処置した群と元の非糖尿病動物との間にも差異があった（＊ｐ＜０．０５）。
【００６２】
結果は、糖尿病誘導の３ヵ月後では、末梢神経障害の進行の増大、及び運動線維に沿った刺激の伝導速度の低減が、特に健康な動物と比較する場合にあることを示している。しかし、医薬組成物での処置が、１週間に３回、１ヵ月間生理食塩水を投与された糖尿病ラットの群と比較して大きな差異を示したことを理解することは重要である。一般に、医薬組成物での処置は、運動神経線維を回復させ、その伝導能力を改善する。
【００６３】
研究した他の態様は、表１２に示す通り、感受性伝導速度（ＳＣＶ）である。
表１２．感受性伝導速度（ＳＣＶ）の研究
【表１２】
【００６４】
生理食塩水で処置した糖尿病ラットの群と、ＥＧＦ含有組成物を投与されたラットの群並びに非糖尿病ラットの群との間に有意差が見られた（＊＊ｐ＜０．０１ ＡＮＯＶＡ及びボンフェローニ補正）。本発明の組成物で処置した群と元の非糖尿病動物との間にも差異があった（＊ｐ＜０．０５）。
【００６５】
結果は、糖尿病誘導の３ヵ月後では、末梢神経障害の進行の増大、及び感受性線維に沿った刺激の伝導速度の低減が、特に健康な動物と比較する場合にあることを示している。パラメーターの悪化は５０％を超える。しかし、医薬組成物での処置が、１週間に３回、１ヵ月間生理食塩水を投与された糖尿病ラットの群と比較して大きな差異を示したことを理解することは重要である。一般に、医薬組成物での処置は、感受性神経線維を回復させ、それは、侵害受容閾値検査と一致する。
【００６６】
（３）末梢神経の血液灌流の完全性についての医薬組成物の影響
ラットの右坐骨神経を再びモデルとして使用した。各実験群１つ当たり動物１０匹を使用した。非糖尿病ラット由来の値を基準値として含めた。実験は、既に記載の通り実施したが、この場合は、動物は既に３ヵ月間糖尿病であり、実験群に応じてＥＧＦ含有組成物又は生理食塩水で１ヵ月間持続的に処置を受けていた。結果を表１３に表す。
表１３．レーザードップラー灌流画像システムで実施した研究の結果
【表１３】
【００６７】
生理食塩水で処置した糖尿病群と、ＥＧＦ含有組成物を投与された群並びに健康なラットの対照群との間に有意差が見られた（＊＊ｐ＜０．０１ ＡＮＯＶＡとボンフェローニ補正）。本発明の組成物で処置した群と元の非糖尿病動物との間にも有意差（＊ｐ＜０．０５）が見られた。
【００６８】
本発明の組成物での処置は、神経への血液灌流のレベルを明らかに改善した。値は、健康な動物の値にはまだ匹敵しないが、生理食塩水を投与された糖尿病のラットと比較するとはるかに高い。この効果の背景の分子機構は、まだ明確ではない。
【００６９】
（４）死後での決定及び特徴付け
組織形態計測的研究
ＥＧＦ含有組成物又は生理食塩水のいずれかでの処置の完了の１ヵ月後、疾患誘導の１２０日後に、動物を過量投与の麻酔薬によって屠殺し、緩衝生理食塩水ｐＨ７．４で灌流した。実験群当たり合計１０匹の動物が組織形態計測的研究のために含まれ、同等の数のラットを生化学的決定のために使用した。両方の系において、両肢由来の坐骨神経を切開した。手順は、神経障害的損傷予防のアッセイについて記載されたものと同様であった。組織学的及び組織形態計測的研究のために採取した試料をヘマトキシリン／エオシン及びトルイジンブルーで染色した。同じ神経の少なくとも５個の断片をＭＡＤＩＰプログラムを使用して定量的に研究した。断片をＯＣＴブロックに包含し、グルタルアルデヒドで後固定し、水平及び横断方向に薄切りにした。評価した組織学的指標並びに処理及び評価のために使用した手順は、既に記載されている：
一定倍率として１０×を使用した、神経の縦方向の切断における１０顕微鏡視野での（神経鞘／神経周膜での）血管の総数。
脱髄線維の百分率。顕微鏡視野当たりの値を平均することによって評価した（×２０、少なくとも５視野）。
顕微鏡視野当たりの、（膨張した又は歪んだ）病変を有するミエリン又は非ミエリン線維の百分率（×２０、少なくとも５視野）。
神経内膜の膠原化の百分率（少なくとも異なる３ヵ所の切片の横断的薄片の神経内膜面積において、中等度：２５から５０％；重度：５０％超。
【００７０】
結果を表１４に示す。糖尿病のラットの両方の群と元のラットの間の血管数において統計的有意差が示された（ｐ＜０．００１）。ＥＧＦ含有組成物で処置したラットと生理食塩水を投与された動物との間にも統計的差異が見られた（ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡとボンフェローニ補正）。
表１４．坐骨神経の断片について実施した形態計測的研究 ３０日後での評価
【表１４】
【００７１】
糖尿病の動物における脱髄した線維、病変を有する線維及び膠原化した神経内膜面積の百分率は、非糖尿病動物において観察された値と有意に異なっていた（ｐ＜０．００１）。健康な動物とＥＧＦ含有組成物で処置した動物との間に有意差が検出されたが（ｐ＜０．０５）、損傷の減弱効果は明らかである。百分率は、フィシャー直接確率法を使用して比較した。
【００７２】
部分的結論 糖尿病性神経障害確立後の、１週間に３回、１ヵ月間の本発明の組成物での処置は、坐骨神経線維の形態学的変質を顕著に低減した。本組成物での処置は、血管の委縮及び変性も低減できた。やはり、これら全ての発見は、実施された機能検査と一致する。
【００７３】
（５）神経断片の生化学的特徴付け
各群から動物１０匹を、採取した坐骨神経の断片での生化学的決定のために使用した。以下の生化学的パラメーター：
酸化還元プロファイル：
全スーパーオキシドジムスターゼ（ｔＳＯＤ）酵素総活性
カタラーゼ酵素活性
全ヒドロペルオキシド（ＴＨＰ）の軸索内蓄積
マロニルジアルデヒド（ＭＤＡ）の軸索内蓄積
を研究した。この研究の結果を表１５に示す。
表１５．坐骨神経の断片での酸化還元状態の特徴付け
【表１５】
【００７４】
プラセボ及び処置した糖尿病動物とＥＧＦ含有組成物で処置したラットの群との間に統計的有意差が見られた（ｐ＜０．０１、両側スチューデントＴ検定）。表１５に示す通り、医薬組成物での処置は、研究した神経組織において過酸化過程の代謝指標の存在を顕著に低減する。同時に、処置がスーパーオキシドジムスターゼ酵素の機能障害を減弱することが示されている。
【００７５】
（６）坐骨神経断片でのリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）酵素活性
この研究の目的は、ＥＧＦ含有組成物での１ヵ月の処置後のＬＰＬ酵素活性を、生理食塩水で処置した糖尿病の動物と比較することであった。結果を表１６に示す。生理食塩水で処置した糖尿病群と本発明の組成物で処置した群との間に有意差が観察された（＊＊ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡ及びチュ−キー法）。
表１６．坐骨神経におけるＬＰＬ活性
【表１６】
【００７６】
本分析は、ＥＧＦ含有医薬組成物での処置がＬＰＬ酵素活性を回復させ、結果としてミエリンを合成する神経の能力を改善することを示している。
【００７７】
（実施例３）糖尿病性神経障害を有する患者の治療におけるＥＧＦ含有組成物の治療効果の証明
合計５名の患者をＥＧＦ含有組成物で治療した。これらの患者は、感受性運動及び有痛性神経障害の徴候を有し、従来の治療に反応しなかった。投与されたＥＧＦの用量は、２０及び２５μｇの間であった。この活性な薬学的成分を含有する組成物の適用は、浸潤によって行われた。治療した例は以下の通り：
患者ＰＣＭ ５０歳女性患者、２０年超の１型糖尿病の診断、虚血性心臓障害の症状、高血圧及び神経障害を有する。１０年を超えて進行し、従来の治療に臨床的反応が無い、感受性運動神経障害の病歴及び有痛性神経障害の徴候。１用量当たりＥＧＦ２５μｇ及びリドカイン１００ｍｇを含有する組成物を、主な坐骨神経に浸潤させた。この手順を常に坐骨神経に１週間に２回でさらに５回、合計６回の適用について繰り返した。３回目の浸潤後に疼痛は消失した。治療開始から８週間後、感受性運動の徴候は止み、３ヵ月間の追跡調査期間を通じてそのように維持された。
【００７８】
患者ＯＺＤ 糖尿病を罹患している７２歳女性患者、重症の動脈閉塞及び安静時疼痛を有する。歩行できず、完全な下肢知覚麻痺を有する。同組成物の３回の適用を同じ解剖学的位置（主な坐骨神経）に実施した。患者は、ＥＧＦ含有組成物の投与後でも脚の知覚麻痺は止まなかったと述べたが、安静時疼痛は本組成物の３回の適用後に消失し、患者は、より速く歩行できた。
【００７９】
患者ＢＣＢ ６０歳女性患者、１０年超の１型糖尿病の診断、安静時疼痛及び肢に知覚麻痺を有する。主な坐骨神経に浸潤によって同組成物を６回適用した。３回目の適用後に疼痛は消失し、知覚異常は、低減した。最終用量の適用の３週間後に疼痛が再出現したため、新たな治療周期を実施した。
【００８０】
患者ＧＴＣ 糖尿病を罹患している５７歳男性患者、肢に知覚麻痺を有する。同組成物の６回の適用を４日間隔で同じ解剖学的位置に実施した。前述の治療の終了後、脚の知覚麻痺の症状は消失し、３ヵ月間の追跡調査期間を通じてそのように維持された。
【００８１】
患者ＳＴＬ Ｉ型糖尿病を１０年超罹患している６８歳男性患者。下肢に知覚麻痺の徴候を呈する。同組成物の６回の適用を同じ解剖学的位置に、１週間に２回適用の割合で実施した。初回周期（６用量）の治療後、下肢の知覚麻痺は、６ヵ月後に再発するまで消失した。これにより新たな治療周期を同じ手順に従って適用し、知覚麻痺の徴候は３回目の浸潤後に低下した。
【００８２】
患者の神経学的機能における実質的改善が、安静時の自発痛及び感覚異常的感覚の消失を示して一般的に観察された。
【００８３】
（実施例４）ＥＧＦを有するＰＬＧＡミクロスフェアを含有する医薬組成物の調製
ＥＧＦを含むミクロスフェアの調製及び特徴付け
５％（ｗ／ｖ）ポリ乳酸溶液（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、ＵＳＡ）をポリマー１ｇをジクロロメタン（ＤＣＭ）に溶解することによって調製した。
【００８４】
ＰＬＧＡ溶液３ミリリットルをガラス容器に入れ、ＥＧＦ３０ｍｇ／ｍｌの水性溶液１００μｌを添加した。
【００８５】
混合物をＵｌｔｒａｔｕｒｒａｘ Ｔ８ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ（ＩＫＡ Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ、Ａｌｅｍａｎｉａ）を用いて、１４０００ｒｐｍで２分間撹拌した。得られた乳剤を１％ポリビニルアルコール ３０ｍｌに注ぎ、２次乳剤（ｗ／ｏ／ｗ）をＴ８ Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ（ＩＫＡ Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用する１４０００ｒｐｍでの２相の激しい撹拌を介して得た。両面乳剤を１％ポリビニルアルコール３００００〜７００００（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、ＵＳＡ）２７０ｍｌに注ぎ、ホモジナイザー（ＩＫＡ Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で３００ｒｐｍ、１時間、ジクロロメタンを蒸発させるために撹拌した。最後にミクロスフェアをろ過によって回収し、５０ｍｌ蒸留水で５回洗浄し、凍結乾燥機（Ｅｄｗａｒｄｓ、ＵＫ）で凍結乾燥した。乾燥させたミクロスフェアは、使用まで４℃で保存した。
【００８６】
得られたＥＧＦを含むミクロスフェアは、球状であり、均一で多孔性の表面を示した（図１）。工程の回収率は、封入効率は６８から７１％の範囲で、８５％であった。ミクロスフェアの負荷は、０．８２から０．８５％の範囲であった。粒子は、３０μｍより小さかった。
【００８７】
封入されたＥＧＦのｉｎ ｖｉｔｒｏ放出
ＥＧＦを含むミクロスフェア５０ｍｇを受容体液（ＰＢＳ ｐＨ７．２中、０．００１％ Ｔｗｅｅｎ ８０及び０．１％アジ化ナトリウム）１ｍｌに懸濁した。懸濁液を穏やかに撹拌しながら３７℃でインキュベートした。試料を、１、３、７及び１４日目にＨｅｔｔｉｃｈ ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（Ｔｕｔｔｌｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で５０００ｒｐｍ、５分間遠心分離した。上清を回収し、同容積の受容体液を添加した。各試料中のＥＧＦ濃度を微量定量法（マイクロＢＣＡアッセイ）でのビシンコニン酸法によって評価した。
【００８８】
ミクロスフェアからのＥＧＦの放出プロファイルは、第１日目のバースト放出期、及び１４日目までの持続的かつ徐放的なＥＧＦ放出の第２期を示した。全タンパク質の約３０％が第１期の内に放出され、粒子内に含有されたＥＧＦの５０％までが残りの評価期間中に１日当たり約７μｇの速度で放出された（図２）。
【００８９】
（実施例５）糖尿病性神経障害を有する患者でのミクロスフェアに封入したＥＧＦ含有組成物の治療的効果の証明
次いで我々は、ミクロスフェアに封入したＥＧＦ含有組成物で治療した患者３名のいくつかの特徴及び彼らに適用した治療についての情報を要約する：
患者ＬＮＰ ４７歳女性患者、１０年超の１型糖尿病の診断を有し、感受性運動及び有痛性神経障害Ｉの徴候を有する。主な坐骨神経に１用量当たりＥＧＦ２０μｇを含有する組成物を浸潤させた。この手順を１週間に２用量の頻度で３回、合計４回の適用について繰り返した。疼痛は３回目の浸潤後に低減し、４回目の適用後に消失した。感受性運動徴候は、２週間後に消失し、３ヵ月間の追跡調査期間を通じてそのように維持された。
【００９０】
患者ＪＶＲ ６３歳女性患者、Ｉ型糖尿病を有する。安静時疼痛及び肢の知覚麻痺を呈する。１用量当たりＥＧＦ２５μｇを含有する組成物を１２日ごとに６回適用した。組成物の適用は、主な坐骨神経への浸潤によって行った。３回目の適用後に疼痛は消失し、知覚異常は、低減した。組成物の最終適用の６週間後に疼痛が再出現したため、新たな周期の治療を開始した。
【００９１】
患者ＤＧＲ ５２歳、男性患者、型糖尿病を有し、肢の知覚麻痺を罹患。徐放用にミクロスフェアに封入した前記ＥＧＦ含有組成物の５用量を、同じ解剖学的部位に、１４日の間隔を置いて投与した。ＥＧＦ治療を終了すると、脚の知覚麻痺は既に消えており、それは４ヵ月間の追跡調査期間を通じて維持された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
感受性運動、有痛性神経障害並びに虚血性神経炎の徴候における末梢神経の形態機能的回復のための、神経幹及び／又は神経節の周辺に浸潤によって投与される医薬組成物を調製するための上皮増殖因子（ＥＧＦ）の使用。
【請求項２】
感受性運動、有痛性神経障害又は虚血性神経炎の最も顕著な徴候が下肢を冒す、請求項１に記載のＥＧＦの使用。
【請求項３】
前記増殖因子がヒト組換えＥＧＦである、請求項１に記載のＥＧＦの使用。
【請求項４】
前記ＥＦＧがミクロスフェアに封入されている、請求項１から３までに記載のＥＧＦの使用。
【請求項５】
前記ＥＧＦ含有医薬組成物が液体であるか又は使用前に再構成されるように凍結乾燥されている、請求項１から４までに記載のＥＧＦの使用。
【請求項６】
前記ＥＧＦ含有医薬組成物が、場合により緩衝されている水性組成物であるか又は水又は水性緩衝液で再構成される凍結乾燥組成物である、請求項５に記載のＥＧＦの使用。
【請求項７】
前記医薬組成物が、１ミリリットル当たり１０から１０００マイクログラムのＥＧＦを含有する、請求項１から６のいずれか一項に記載のＥＧＦの使用。
【請求項８】
前記ＥＧＦ含有医薬組成物が、リドカイン、ブピバカイン又はノボカインからなる群から選択される、１０マイクログラムから５００ミリグラムの少なくとも１種の局所麻酔剤又は鎮静剤をさらに含有する、請求項１から７のいずれか一項に記載のＥＧＦの使用。
【請求項９】
局所麻酔剤が２％リドカインである、請求項８に記載のＥＧＦの使用。
【請求項１０】
感受性運動、有痛性神経障害；及び神経幹及び／又は神経節の周辺での虚血性神経炎の徴候の治療のための、末梢神経の形態機能的回復のための医薬組成物であって、局所麻酔剤又は鎮静剤との組合せでＥＧＦを含有する医薬組成物。
【請求項１１】
ＥＧＦがミクロスフェアに封入されている、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
麻酔剤がリドカイン、ブピバカイン又はノボカインからなる群から選択される局所麻酔剤である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
ＥＧＦが１０から１０００マイクログラム／ミリリットルの範囲である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
感受性運動、有痛性の糖尿病性神経障害及び／又は虚血性神経炎の徴候における末梢神経の形態機能的回復における、請求項１０から１３に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１５】
糖尿病性神経障害に伴う任意の種類の運動線維損傷を治療するための、請求項１４に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１６】
治療が神経幹及び／又は神経節の周辺に浸潤によって適用される、請求項１４に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１７】
浸潤が坐骨神経に行われる、請求項１６に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１８】
浸潤が１週間に１から３回、３から８週間実施される、請求項１４に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１９】
治療が、強い神経痛を伴う、一方又は両方の下肢の虚血を伴う又は伴わない、損傷した又はしていない領域への局所浸潤によって実施され、前記治療が１週間に１から５回、２から６週間、組成物の局所浸潤によって実施される、請求項１４に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１】
感受性運動、有痛性神経障害並びに虚血性神経炎の徴候における末梢神経の形態機能的回復のための、神経幹及び／又は神経節の周辺に浸潤によって投与される医薬組成物を調製するための上皮増殖因子（ＥＧＦ）の使用。
【請求項２】
感受性運動、有痛性神経障害又は虚血性神経炎の最も顕著な徴候が下肢を冒す、請求項１に記載のＥＧＦの使用。
【請求項３】
前記増殖因子がヒト組換えＥＧＦである、請求項１に記載のＥＧＦの使用。
【請求項４】
前記ＥＦＧがミクロスフェアに封入されている、請求項１から３までに記載のＥＧＦの使用。
【請求項５】
前記ＥＧＦ含有医薬組成物が液体であるか又は使用前に再構成されるように凍結乾燥されている、請求項１から４までに記載のＥＧＦの使用。
【請求項６】
前記ＥＧＦ含有医薬組成物が、場合により緩衝されている水性組成物であるか又は水又は水性緩衝液で再構成される凍結乾燥組成物である、請求項５に記載のＥＧＦの使用。
【請求項７】
前記医薬組成物が、１ミリリットル当たり１０から１０００マイクログラムのＥＧＦを含有する、請求項１から６のいずれか一項に記載のＥＧＦの使用。
【請求項８】
前記ＥＧＦ含有医薬組成物が、リドカイン、ブピバカイン又はノボカインからなる群から選択される、１０マイクログラムから５００ミリグラムの少なくとも１種の局所麻酔剤又は鎮静剤をさらに含有する、請求項１から７のいずれか一項に記載のＥＧＦの使用。
【請求項９】
局所麻酔剤が２％リドカインである、請求項８に記載のＥＧＦの使用。
【請求項１０】
感受性運動、有痛性神経障害；及び神経幹及び／又は神経節の周辺での虚血性神経炎の徴候の治療のための、末梢神経の形態機能的回復のための医薬組成物であって、局所麻酔剤又は鎮静剤との組合せでＥＧＦを含有する医薬組成物。
【請求項１１】
ＥＧＦがミクロスフェアに封入されている、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
麻酔剤がリドカイン、ブピバカイン又はノボカインからなる群から選択される局所麻酔剤である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
ＥＧＦが１０から１０００マイクログラム／ミリリットルの範囲である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
感受性運動、有痛性の糖尿病性神経障害及び／又は虚血性神経炎の徴候における末梢神経の形態機能的回復における、請求項１０から１３に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１５】
糖尿病性神経障害に伴う任意の種類の運動線維損傷を治療するための、請求項１４に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１６】
治療が神経幹及び／又は神経節の周辺に浸潤によって適用される、請求項１４に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１７】
浸潤が坐骨神経に行われる、請求項１６に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１８】
浸潤が１週間に１から３回、３から８週間実施される、請求項１４に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１９】
治療が、強い神経痛を伴う、一方又は両方の下肢の虚血を伴う又は伴わない、損傷した又はしていない領域への局所浸潤によって実施され、前記治療が１週間に１から５回、２から６週間、組成物の局所浸潤によって実施される、請求項１４に記載の医薬組成物の使用。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２０１０−５０５７７３（Ｐ２０１０−５０５７７３Ａ）
【公表日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５３０７５１（Ｐ２００９−５３０７５１）
【出願日】平成１９年１０月１日（２００７．１０．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＵ２００７／００００１８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０４０２６０
【国際公開日】平成２０年４月１０日（２００８．４．１０）
【出願人】（３０４０１２８９５）セントロ デ インジエニエリア ジエネテイカ イ バイオテクノロジア (46)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１０月１日（２００７．１０．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＵ２００７／００００１８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０４０２６０
【国際公開日】平成２０年４月１０日（２００８．４．１０）
【出願人】（３０４０１２８９５）セントロ デ インジエニエリア ジエネテイカ イ バイオテクノロジア (46)
【Ｆターム（参考）】
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