ＤＮＡメチル化、およびメチル化の阻害に関与する化合物、結晶構造、データ表現、使用方法および同定方法を開示する。実施形態では、ＤＮＡメチル化はＤＮＡ−アデニンメチルトランスフェラーゼ（Ｄａｍ）によって行われる。一実施形態では、化合物は、病原性生物の感染の疑いがある宿主を治療するために使用される。一実施形態では、病原性細菌のビルレンスは、細菌性Ｄａｍ酵素を阻害可能な薬剤を用いた治療によって改変される。一実施形態では、Ｄａｍ阻害剤に関する化合物および方法を開示する。

【発明の詳細な説明】
【政府支援の研究開発に関する記述】
【０００１】
[0001] 本発明は、米国国立衛生研究所によって付与された政府支援ＧＭ４９２４５の下で行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【発明の背景】
【０００２】
[0002] 病原性細菌は、ヒトにおいて様々な疾患を引き起こし、軽度から重度までの一連の症状を表し、死をもたらし得る。世界規模の感染性疾患は死の主要原因である。強い多剤耐性が出現し、耐性遺伝子が水平移動する場合、病原性細菌は特に懸念される。抗生物質に対する細菌耐性が出現することは、現在益々問題となっている。新たな種類の抗生物質、特に、細菌による耐性の発生によって効果が失われる可能性が少ない抗生物質が常に必要とされている。本発明は、ＤＮＡアデニンメチラーゼ（「Ｄａｍ」）を阻害することによってＤＮＡメチル化を妨害する新たな種類の抗生物質を提供する。Ｄａｍは様々な細菌のビルレンスに必要とされるので、Ｄａｍを阻害すればビルレンスが減少する。Ｄａｍの阻害剤は哺乳類細胞のＤＮＡ−ＭＴアーゼには影響を及ぼさず、そのため、宿主生物に対する毒性は最小限なので、抗生物質として特に有効である。さらに、細菌のビルレンスのみを減少させるので、細菌がＤａｍ阻害剤に対する耐性を持つ機会も減少させる。
【０００３】
[0003] ＤＮＡメチル化とは、メチル基をＤＮＡに付加し、遺伝子発現制御機構を提供するプロセスである。したがって、ＤＮＡメチル化は、数多くの、多種多様な生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たす。ほとんどの原核生物および真核生物のＤＮＡは、メチル化された塩基、４−メチルシトシン（Ｎ４ｍＣ）、５−メチルシトシン（５ｍＣ）および６−メチルアデニン（Ｎ６ｍＡ）を含有する。メチル化による修飾は、ＤＮＡ複製後ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（「ＭＴアーゼ」）によって導入される。ＤＮＡ ＭＴアーゼは、供与体Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（「ＡｄｏＭｅｔ」）からのメチル基転移を触媒し、Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン（ＡｄｏＨｃｙ）およびメチル化ＤＮＡを生成する（図１）。一般的に、ＭＴアーゼは、特異的配列を認識し、「塩基のフリッピング（ｂａｓｅ ｆｌｉｐｐｉｎｇ）」機構（Ｋｌｉｍａｓａｕｓｋａｓ他、１９９４）を利用して、その配列内の標的塩基をＤＮＡらせんからＭＴアーゼ活性部位ポケットに回転させる。
【０００４】
[0004] ほとんどの原核細胞ＤＮＡ ＭＴアーゼは、制限修飾系の構成成分であり、ファージ防御機構の一部として機能を果たすが、いくつかのＭＴアーゼはコグネイト（ｃｏｇｎａｔｅ）制限酵素、例えば、ＧＡＴＣ配列内のアデノシンの環外アミノ窒素（Ｎ６）をメチル化する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡアデニンＭＴアーゼ（Ｄａｍ）とは関係がない（図１）（Ｈａｔｔｍａｎ他、１９７８、Ｌａｃｓ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ、１９７７）。Ｄａｍ ＭＴアーゼ遺伝子オルソログは、大腸菌およびそれらのバクテリオファージの中で広範囲に及ぶ（Ｈａｔｔｍａｎ ＆ Ｍａｌｙｇｉｎ、２００４の総説参照）。
【０００５】
[0005] Ｄａｍメチル化は、原核生物のＤＮＡ複製において重要である。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の複製開始点の近くにはＧＡＴＣ部位の集団があり、それら全てが２つの種の間で保存されている。いくつかの細胞機能のタイミングおよび標的化を調節するのは、ＤＮＡ複製直後に生成されるヘミメチル化ＧＡＴＣ部位である（Ｍｅｓｓｅｒ ＆ Ｎｏｙｅｒ−Ｗｅｉｄｎｅｒ、１９８８）。例えば、ＳｅｑＡはこれらのヘミメチル化ＧＡＴＣ部位に特異的に結合し、完全なメチル化の遅延を引き起こし（Ｇｕａｒｎｅ他、２００２、Ｋａｎｇ他、１９９９、Ｌｕ他、１９９４）、一部ではＤＮＡ複製を調節する。
【０００６】
[0006] 特定のＧＡＴＣ部位のＤＮＡ−アデニンメチル化は、細菌の遺伝子発現、ＤＮＡ複製、ミスマッチ修復に中心的な役割を果たし、多くのグラム陰性菌の細菌ビルレンスに必須である。Ｄａｍメチル化は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のある種の遺伝子の発現を調節し（Ｏｓｈｉｍａ他、２００２、Ｌｏｂｎｅｒ−Ｏｌｅｓｅｎ他、２００３）、エルシニア・シュードツベルクローシス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）においては、非許容条件下でＹｏｐ病原タンパク質の発現および分泌を調節する（Ｊｕｌｉｏ他、２００２）。尿路疾患性大腸菌における腎盂腎炎惹起性線毛（Ｐａｐ）の発現は、グローバル制御因子Ｌｒｐのヘミメチル化ＧＡＴＣ部位への結合によって後成的に制御される（Ｈｅｒｎｄａｙ他、２００３）。さらに、Ｄａｍメチル化は、ＭｕｔＳＩおよびＭｕｔＨによって形成された大腸菌ミスマッチ修復系において重要である（Ｍｏｄｒｉｃｈ、１９８９、Ｙａｎｇ、２０００）。対照的に、ＤＮＡ−アデニンメチル化は、ヒトまたはその他の高等真核生物では認められていない。
【０００７】
[0007] ＥｃｏＤａｍ酵素によるＤＮＡメチル化および塩基フリッピングの機構は、詳細に研究されている。ＥｃｏＤａｍは、連続的な反応でＤＮＡをメチル化し、ＤＮＡ分子を分離せずに５５個までのメチル基を転移させる（Ｕｒｉｇ他、２００２）。このような作用機序では、ＥｃｏＤａｍは、ＤＮＡ２本鎖に結合したままＡｄｏＨｃｙをＡｄｏＭｅｔと交換し、これによりＤＮＡの連続的メチル化が引き起こされる（Ｂｅｒｄｉｓ他、１９９８、Ｒｅｎｂａｕｍ ａｎｄ Ｒａｚｉｎ、１９９２）。この機構は、その他の孤立性ＭＴアーゼ（すなわち、非コグネイト制限酵素）でも同様に見られる。対照的に、制限修飾系に属するＭＴアーゼは、（ＤＮＡの連続的メチル化は制限修飾系の生物学的機能を妨害するので）離散的機構を示すことが多い（Ｊｅｌｔｓｃｈ、２００２）。高い連続性は、複製後に完全なメチル化を迅速に回復するために必須である。
【０００８】
[0008] ＤＮＡアデニンメチル化は、細菌のビルレンスに不可欠な役割を果たす（Ｈｅｉｔｈｏｆｆ他、１９９９、Ｇａｒｃｉａ−Ｄｅｌ Ｐｏｒｔｉｌｌｏ他、１９９９）。したがって、本発明は、Ｄａｍメチル化を阻害することによってビルレンスを阻害する。ビルレンス因子としてのＤａｍの関与は、サルモネラ・エンテリカ・血清型チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）に関して最初に記載され、ｄａｍ変異体は、マウスにおける致死的感染の確立においては野生型に劣っているが、以前にｄａｍ変異体に感染したマウスは、野生型に重複感染してもあまり感受性を示さなかった（Ｌｏｗ他、２００１）。サルモネラは、米国において最も一般的な腸管内（腸内）感染菌の１つである。いくつかの州（例えば、ジョージア州、メリーランド州）では、最も一般的であり、全体的に見ると２番目に一般的な食物起因疾患である（通常、カンピロバクター感染よりも若干頻度が少ない）。ＣＤＣによれば、米国では毎年１０００人に約５００人、または食物関連死の３１％がサルモネラ感染に起因している。サルモネラは、腸チフス熱および腸由来のその他多くの感染を引き起こす細菌種である。米国では希な腸チフス熱は、サルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）と呼ばれる特定種によって引き起こされる。しかし、「サルモネラ症」と呼ばれるその他のサルモネラ種による病気は、米国において一般的である。現在、この細菌の知られている株（技術的には「セロタイプ」または「血清型（ｓｅｒｏｖａｒ）」と称される。）の数は、総計２３００種を上回る（ＣＤＣウェブサイトから）。哺乳類の免疫防御をすり抜ける分子装置の細菌による使用がＤａｍメチル化により調節されることは、サルモネラ・チフィムリウムにおいて初めて示された。Ｄａｍ⁻変異細菌は正常に増殖するようであるが、この変異体はＬＤ_５０がＤａｍ^＋細菌の１０，０００倍であり、マウスに対して非病原性である。さらに、ｄａｍ⁻変異細胞でマウスを感染させると、野生型ｄａｍ^＋のさらなる感染に対する防御が与えられる。したがって、Ｄａｍは、薬剤設計の魅力的な標的である（Ｈｅｉｔｈｏｆｆ他、１９９９、Ｌｏｗ他、２００１）。
【０００９】
[0009] エルシニアＤａｍ：エルシニア・ペスティス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）は、伝染病、すなわち、急速に死に至らしめ、ヨーロッパおよびアジアにおいて過去２０００年間いくつかの主な流行病の原因となった感染病を引き起こす細菌種である。最も良く知られている伝染病の１つは、皮膚を黒くしてしまうために黒死病と呼ばれた。１４世紀に流行したこの伝染病は、２、３年のうちにヨーロッパの人口の３分の１以上を死に至らしめた。いくつかの都市では、人口の７５パーセントまでが発熱および皮膚に潰瘍性の腫脹を伴って数日のうちに死んだ。合衆国において流行した最後の都市型伝染病は、１９２５年ロサンゼルスで発生した。それ以来、毎年平均１３例の流行が主として南西部で確認され、約８０パーセントはニューメキシコ州、アリゾナ州またはコロラド州の砂漠地方で発生し、約９パーセントがカリフォルニア州で発生した。世界的には、毎年３０００例に及ぶ伝染病が世界保健機構に報告されている。伝染病は、細菌戦争の最も危険な因子の１つと考えられ、肺炎型（ＣＤＣによって潜在的な生物テロ薬とされている。）はテロに利用される可能性がある。
【００１０】
[0010] 大腸菌Ｄａｍ：大腸菌は大腸における主要な通性居住生物であるが、胆嚢炎、菌血症、胆管炎、尿路感染症および旅行者下痢症を含む多くの通常の細菌感染のいくつか、および新生児髄膜炎、肺炎などのその他の臨床的感染の最もよくある原因菌の１つである。このような細菌種は数百ある。１種、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７は、食物由来疾患の新たに出現した原因菌である。これは、腸の表面に重篤な損傷をもたらす１種または複数の関連性のある強力な毒素を大量に産生する。これらの毒素（ベロ毒素（ＶＴ）、志賀毒素様毒素）は、密接に関連しており、志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）によって産生される毒素と同一である。大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７感染は、血性下痢、場合によっては腎不全を引き起こすことが多い。
【００１１】
[0011] クレブシエラＤａｍ：クレブシエラの増殖およびビルレンスにおけるＤａｍメチル化の役割は、当分野では確立されていないが、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感染は病院内では一般的であり、肺炎（血痰の排出が特徴である。）およびカテーテルを挿入された患者の尿路感染の原因となる。クレブシエラ感染は、免疫系が弱った人に生じる傾向がある。実際に、Ｋ．ニューモニエは、尿路病原体としては、大腸菌に次いで２番目である。クレブシエラ感染は、以前よりも現在かなり頻繁に、特に新生児集中治療室で発生している。これは、おそらく細菌の抗生物質耐性特性によるためであろう。クレブシエラ種は、アンピシリン、カルベニシリンおよびペニシリンのような抗生物質に対する耐性を与える耐性プラスミド（Ｒ−プラスミド）を有することができる。しばしば、２種以上の強力な抗生物質がクレブシエラ感染を除去するために使用される。さらに悪いことに、Ｒ−プラスミドは必ずしも同種でなくてもその他の腸内細菌に移動することができる。したがって、クレブシエラＤａｍを阻害し、それによってこれらの院内日和見感染を効果的に治療する新種の化合物が必要とされる。
【００１２】
[0012] さらに、Ｄａｍ ＭＴアーゼの不活性化は、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ビルレンスを弱める（Ｗａｔｓｏｎ他、２００４）。Ｄａｍは、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、エルシニア・シュードツベルクローシス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）およびエルシニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）を含み、増え続けている細菌病原体群のビルレンス因子と関係がある（Ｌｏｗ他、２００１、および表１）。Ｄａｍメチル化は、多くの生物の生存能力に必須ではないが、ｄａｍは、試験した増殖条件下ではビブリオ・コレラおよびエルシニア・シュードツベルクローシスの必須の遺伝子である（Ｊｕｌｉｏ他、２００１）。エルシニア・シュードツベルクローシスにおいてＤａｍが過剰生産されると、その効果は、ヘミメチル化されたＧＡＴＣ部位に結合しているＳｅｑＡの阻害による間接的なものであるが（Ｌｏｂｎｅｒ−Ｏｌｅｓｅｎ他、２００５）、ビルレンス、いくつかの外部タンパク質（Ｙｏｐ）の分泌、および高い免疫性が弱められる（Ｊｕｌｉｏ他、２００２）。同様の原理が、ウシ呼吸器疾患の原因となるパスツレラ・ムルトシダにおけるビルレンスのｄａｍプラスミドによる弱毒化に当てはまる（Ｃｈｅｎ他、２００３）。今日まで調べられてきたＤａｍ分子の中では、シゲラ・フレキシネル（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉｉ）ｄａｍ変異体のビルレンスに対する効果が最も小さい（Ｈｏｎｍａ他、２００４）。
【００１３】
[0013] Ｄａｍ阻害剤は、いくつかの病原性細菌に関連したビルレンスを減少および／または抑制するのに有用である。例えば、腸管病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）は、特に発展途上国における重要な公衆衛生問題であり、上水道を汚染し、幼児下痢を引き起こし（Ｇｉｌｌ ａｎｄ Ｈａｍｅｒ、２００１、Ｇｏｏｓｎｅｙ他、２０００、Ｋｎｕｔｔｏｎ他、１９９８９、Ｌｅｂｉｎｅ ａｎｄ Ｅｄｅｌｍａｎ、１９８４）、一年に２００万人の幼児の死亡をもたらす。ＥＰＥＣは、下痢、ならびに溶血性尿毒症症候群（Ｒｉｌｅｙ他、１９８３）および死を引き起こし得る出血性大腸炎、の原因となる腸管出血性大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７（ＥＨＥＣ）に密接に関連している。西洋諸国では、ＥＨＥＣはウシで大流行し（Ｍｅａｄ他、１９９９）、牛挽肉の主要な汚染源となってきた（ＵＳＤＡ、２００２）。ＥＨＥＣは、米国だけでも１年に約６０人の人を死に至らしめ、約７４０００人に感染している（Ｍｅａｄ他、１９９９）。現在、ＥＨＥＣ感染に対して、抗生物質は、菌が溶解して、志賀毒素を放出し、腎不全および死をもたらすので、禁忌である。ビルレンス因子の発現を阻害する薬剤の開発が、ＥＨＥＣ感染を治療する手段となる。
【００１４】
[0014] 本発明は、病原性細菌のビルレンスを抑制する、Ｄａｍの特異的阻害剤の合理的な設計方法、および同定のためのスクリーニング方法を提供する。これらの特異的阻害剤は、ヒト、および検出可能なＤＮＡ−アデニンメチル化が起こらないその他の高等真核生物を治療するために使用することができる（Ｊｅｌｔｓｃｈ、２００２）。特異的ＧＡＴＣメチル化阻害剤は、宿主機能に影響を及ぼさない広範な抗微生物作用を有する可能性がある。例えば、必須酵素よりもビルレンスに影響を及ぼす因子を標的とすることにはいくつかの利点があり、（１）非病原性細菌に毒性を与えず、非病原性細菌よりも病原性細菌を選択すること、（２）即時型毒性の欠如により、薬剤耐性の迅速な出現の危険性が減少すること、および（３）病原体の初期増殖の継続により、宿主の安定した免疫応答の上昇が可能になることが含まれる。サルモネラのＤａｍ欠失変異体は、交差保護免疫を与える弱毒化生ワクチンとして使用することができる（Ｄｕｅｇｅｒ他、２００１、２００３、Ｈｅｉｔｈｏｆｆ他、１９９９）。しかし、ｄａｍ変異体は、ミスマッチＤＮＡ修復が不十分であり、そのため、自然突然変異の割合が高く、生ワクチン種に望ましい形質ではない。増殖に影響を及ぼさずにビルレンスに影響を及ぼす能力を有する化合物は、従来の抗生物質と比較して耐性を惹起する可能性が少ない。抗生物質耐性は、人類が直面している公衆衛生上の最大の難問の１つであり、様々な病原体のビルレンスに影響を及ぼす化合物を開発することは、感染疾患の治療に重大で肯定的な影響を与える。Ｄａｍ阻害剤は、多くのヒト病原性細菌の生存能力に影響を及ぼすことができるので、生物テロが懸念される時代において実用性が広まってきた。小分子阻害剤によるＤａｍの阻害は、広範な抗菌作用を有する新種の抗生物質の同定および開発の基礎となる。我々は、ＤＮＡと複合した２種のＤａｍ ＭＴアーゼ、バクテリオファージＴ４ Ｄａｍ ＭＴアーゼおよび大腸菌Ｄａｍ ＭＴアーゼの三次元構造を決定した。これらの高分解能構造を用いて、特異的Ｄａｍ ＭＴアーゼ阻害剤を同定し、合理的に設計する。これらの阻害剤は、病原性細菌に感染した宿主の治療に有用である。
【発明の概要】
【００１５】
[0015] 本発明は、宿主の病原性生物を治療するための化合物および方法に関する。特に、本発明は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの活性を修飾することが可能な化合物を同定する方法であって、病原性細菌由来のＡｄｏＭｅｔ依存性ＭＴアーゼの活性を修飾することを含む方法を提供する。ＡｄｏＭｅｔ依存性ＭＴアーゼおよび関連するタンパク質には、Ｈｈａｌ ＤＮＡ ＭＴアーゼ、Ｈｈａｌ ＭＴアーゼ−ＤＮＡ複合体、Ｐｖｕｌｌエンドヌクレアーゼ−ＤＮＡ複合体、Ｐｖｕｌｌ ＤＮＡ ＭＴアーゼ、タンパク質アルギニンＭＴアーゼＰＲＭＴ３およびＰＲＭＴ１、小分子ヒスタミンＭＴアーゼおよび阻害剤との複合体、Ｄｎｍｔ３ｂ ＰＷＷＰドメイン、ＭＢＤ４グリコシラーゼドメイン、ヒストンＨ３ Ｌｙｓ９ ＭＴアーゼ ＤＩＭ−５および基質Ｈ３ペプチドとの複合体、ファージＴ４ ＤａｍおよびＤＮＡとの特異的および非特異的複合体、タンパク質グルタミン−Ｎ５ ＭＴアーゼＨｅｍＫ、ヌクレオソーム依存性ヒストンＨ３リシン７９ ＭＴアーゼＤｏｔ１ｐ、およびＨｉｎＰ１Ｉエンドヌクレアーゼ、大腸菌Ｄａｍおよびその他の病原性細菌由来のＤａｍが含まれる。一実施形態では、ＤａｍまたはＤｉｍ−５酵素活性が修飾される。一実施形態では、Ｄａｍ酵素活性が修飾される。Ｄａｍ酵素活性は、増加させるか、または減少させることができる。好ましい実施形態では、Ｄａｍ酵素活性は阻害される。
【００１６】
[0016] 同定方法は、Ｄａｍ酵素またはＤａｍ酵素複合体の三次元構造を提供することによって実施することができる。Ｄａｍ酵素は、完全なタンパク質であってもよい。あるいは、Ｄａｍ酵素は完全なタンパク質の一部であってもよく、その部分は１個または複数のＡｄｏＭｅｔ結合ポケット、ポケット内外のチャンネル、触媒ドメインとＤＮＡ結合ドメインとの間のヒンジ領域、ＤＮＡ結合表面、特有の表面ポケット、またはＤａｍ酵素活性に影響を及ぼすことが可能ないかなるその他の領域をも含む。その構造は、１個または複数のメチル供与体（例えば、ＡｄｏＭｅｔ）およびＤＮＡと複合体化したＤａｍ酵素から得ることができる。修飾剤候補構造が作製され、相互作用エネルギー値は、この候補構造およびＤａｍ酵素の、シミュレートされたドッキング相互作用から計算される。相互作用エネルギー値を評価することによって、Ｄａｍ酵素活性を修飾可能な候補構造が同定される。この評価は、基準値または「カットオフ値」と比較して実施することができる。
【００１７】
[0017] 一実施形態では、Ｄａｍ酵素構造は、バクテリオファージまたは細菌から得られた構造である。一実施形態では、Ｄａｍ酵素構造は、大腸菌から得られた構造である。シミュレートされたドッキング相互作用から意味のある相互作用エネルギー値が得られる程度に十分な分解能を有する限り、この構造はいかなる原料から得てもよい。好ましい構造はＸ線結晶学から得られ、例えば、タンパク質データバンクに登録されている結晶構造（表８にまとめて示す。）が挙げられる。
【００１８】
[0018] ドッキング相互作用は、好ましくはドッキング部位に生じる。Ｄａｍのドッキング部位には、メチル供与体がＤＮＡ塩基にメチル基を供与する活性部位、および／または触媒ドメインとＤＮＡ結合ドメインとの間に形成されたポケット、および／またはメチル供与体結合部位が含まれる。ドッキング部位には、ＡｄｏＭｅｔ結合ポケット、ポケット内外のチャンネル、触媒ドメインとＤＮＡ結合ドメインとの間のヒンジ領域、ＤＮＡ結合表面、特有の表面ポケット、およびＤａｍ酵素活性に特異的に影響を及ぼすことが可能なその他の部位が含まれる。
【００１９】
[0019] 本発明の方法には、酵素の三次元構造をベースにして、作製された構造と酵素構造との間の相互作用エネルギー値を計算することによって阻害剤候補構造を作製するコンピューター支援薬剤設計が含まれる。この酵素は、Ｄａｍ酵素であってもよく、Ｄａｍ酵素構造は、病原性細菌を含めた任意の生物から得ることができる。Ｄａｍ酵素構造は、大腸菌Ｄａｍから得ることができる。
【００２０】
[0020] これらの方法のいずれかによって同定された化合物についてはさらに、生化学アッセイ（例えば、非細胞ベース）、細胞ベース、および動物全体の研究を含む、公知のｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏアッセイを用いて、Ｄａｍ酵素活性を修飾する能力を評価することができる。
【００２１】
[0021] 細菌におけるＤＮＡメチル化は、本発明によって同定された化合物を提供すること、および細菌と、細菌におけるＤＮＡメチル化を阻害するのに十分な量の当該化合物と、を接触させることによって阻害することができる。一実施形態では、細菌はメチラーゼ、好ましくはＤａｍメチラーゼおよび／または細胞周期調節ＤＮＡアデニンメチラーゼを有する。細菌は、メチラーゼを有してもよく、具体的な実施形態では、メチラーゼはＧＡＴＣまたはＧＡＮＴＣ部位においてアデニンメチル化を行う。
【００２２】
[0022] 化合物は、スクリーニング法によって同定され、生化学アッセイおよび全細胞アッセイによってＤＮＡメチル化を阻害することが確認された。これらの化合物は、生物を化合物と接触させることによって、生物におけるＤａｍによるＤＮＡメチル化を阻害するために使用することができる。一実施形態では、この化合物はＤａｍ−ｉＺ１であり、Ｄａｍ−ｉＺ１は下式の構造を有する。
【００２３】
【化１】

【００２４】
[0023] 式中、Ａは、非芳香族５もしくは６員環であり、Ａの環構成原子の１個または複数はＣ、Ｎ、ＯまたはＳであり、Ａは場合によって置換されていてよい。Ａの好ましい構造の例は、
【化２】


（Ｙ_２に対する結合位置を^＊で示した）
である。
【００２５】
Ｘ_１〜Ｘ_５は各々独立して、Ｈ、ハライド、ＯＨ、ＯＣＨ_３、アルキルおよびアルキルハライドから成る群より選択される。Ｙ_１はＮＨまたはＣＨ_２である。Ｙ_２はＮまたはＣＨである。Ｙ_２に対する波線の２重結合は、この結合が１重または２重であることを示す。具体的な実施形態では、Ｙ_２は所定の部位でＡに結合する。
【００２６】
[0024] 化合物Ｄａｍ−ｉＺ１は下記ＮＣＩ６５９３９０であってもよい。
【化３】

【００２７】
[0025] 化合物Ｄａｍ−ｉＺ１は下記ＮＣＩ６５８３４３であってもよい。
【化４】

【００２８】
[0026] 化合物Ｄａｍ−ｉＺ１は下記ＮＣＩ６５７５８９であってもよい。
【化５】

【００２９】
[0027] 「アリール」という用語は、単環（例えば、フェニル）、１個または複数の環（例えば、ビフェニル）または複数の縮合（融合）環を有し、少なくとも１個の環が芳香族（例えば、ナフチル、ジヒドロフェナントレニル、フルオレニルまたはアントリル）である炭素原子６〜２２個の不飽和芳香族炭素環基を有する基のことである。アリールはフェニル、ナフチルなどを含む。アリール基は、不飽和芳香族環に加えて、アルキル、アルケニルまたはアルキニル部分を含有してよい。「アルカリール」という用語は、アルキル部分を含有するアリール基、すなわち、−アルキレン−アリールおよび置換アルキレン−アリールのことである。このようなアルカリール基は、ベンジル、フェネチルなどによって例示される。
【００３０】
[0028] アルキル、アルケニル、アルキニルおよびアリール基は、本明細書で説明したように、場合によって置換され、基の中の炭素原子数および基の不飽和の程度に応じて１〜８個の非水素置換基を有していてもよい。
【００３１】
[0029] 「ヘテロアリール」という用語は、（複数の環があるならば）少なくとも１個の環内に酸素、窒素および硫黄から選択された１〜４個のヘテロ原子を有する炭素原子２〜２２個の芳香族基のことである。ヘテロアリール基は、場合によって置換されていてよい。
【００３２】
[0030] １個または複数の置換基を有する前記基のいずれかに関して、このような基は立体的に実現不可能な、および／または合成的に実行不可能な置換または置換パターンを含まないことを理解されたい。本発明の化合物は、開示した化合物の置換から生じる新規立体化学異性体全てを含む。
【００３３】
[0031] 化合物Ｄａｍ−ｉＺ１、ＮＣＩ−ＤＴＰ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｅｔ化合物番号６５９３９０、６５８３４３および６５７５８９のいずれか、ならびに本発明の方法によって同定された任意の化合物は、生物と、任意の１種または複数のこれらの化合物と、を接触させることによって、生物におけるＤａｍによるＤＮＡメチル化を阻害するために使用することができる。一実施形態では、この生物は、大腸菌を含む細菌である。一実施形態では、ＤＮＡメチル化は、Ｄａｍメチラーゼを阻害することによって阻害される。一実施形態では、Ｄａｍを阻害するための化合物濃度は約１０〜４００μＭである。一実施形態では、Ｄａｍを阻害するための濃度は約２０〜２００μＭである。一実施形態では、Ｄａｍを阻害するための濃度は約２０μＭである。
【００３４】
[0032] 本発明は、病原性細菌の感染の疑いがある宿主を治療する方法であって、Ｄａｍ−ｉＺ１並びにＮＣＩ−ＤＴＰ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｅｔ化合物番号６５９３９０、６５８３４３および６５７５８９、から成る群より選択される化合物を含む、本発明の方法のいずれかによって同定された化合物を宿主に投与することを含む方法を包含する。一実施形態では、病原性細菌の感染の疑いがある宿主の治療方法は、細菌のビルレンスパラメーターを減少させる。本明細書では、ビルレンスパラメーターは、例えば、複製、宿主への付着、コロニー形成、運動性、遺伝子発現、代謝、熱ショック応答、およびビルレンスに関連するその他の測定可能なパラメーターを意味するために広く使用される。
【００３５】
[0033] 一実施形態では、本発明は、病原性細菌の感染の疑いがある宿主を治療する方法であって、メチラーゼを阻害することによって病原性を改変することが可能な化合物を宿主に投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、このメチラーゼはＤａｍメチラーゼである。一実施形態では、病原性の改変がビルレンスの改変を含む。一実施形態では、ビルレンスの改変は、細菌の細胞分裂に実質的な影響を与えない。
【００３６】
[0034] 一実施形態では、本発明は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｄａｍの結晶を提供する。一実施形態では、本発明は大腸菌Ｄａｍ複合体の結晶を提供する。一実施形態では、この複合体は大腸菌Ｄａｍおよびコグネイト（ｃｏｇｎａｔｅ）ＤＮＡを含む。一実施形態では、この複合体は大腸菌Ｄａｍおよび非コグネイト（ｎｏｎｃｏｇｎａｔｅ）ＤＮＡを含む。一実施形態では、この複合体はさらに補因子または補因子アナログを含む。一実施形態では、この補因子または補因子アナログは、ＡｄｏＭｅｔ、ＡｄｏＨｃｙおよびシネフンギンから成る群より選択される。具体的な実施形態では、この結晶は図３７の一組の原子構造座標を有する。一実施形態では、本発明は、本明細書に記載の１種または複数の結晶のデータ表現を提供する。
【発明の詳細な説明】
【００３７】
[0072] 本発明は、以下の非制限的実施例によってさらに理解することができる。本明細書で引用した文献は全て、本明細書の開示と矛盾しない限り、参照として本明細書に援用される。本明細書の説明は多くの限定を含むが、これらは本発明の範囲を制限するものではなく、単に本発明の現在好ましい実施形態のいくつかの例を提供するものである。例えば、このような本発明の範囲は、例示した実施例によってではなく、添付の特許請求の範囲およびその同等物によって規定される。一般的に、本明細書で使用した用語および表現は、当分野で認識されている意味を有し、このような意味は、標準的参考書、雑誌文献および当業者に公知の状況を参考にして見いだすことができる。以下の定義は、本発明の状況での具体的な用法を明らかにするために挙げられる。
【００３８】
[0073] 略語のリスト：Ａ／Ｅ（ａｔｔａｃｈｉｎｇ ａｎｄ ｅｆｆａｃｉｎｇ）（付着性および微絨毛消滅性）、ＡＴＣＣ（アメリカ培養細胞系統保存機関）、Ｄａｍ（ＤＮＡ−アデニンＭＴアーゼ）、ＡｄｏＨｃｙ（Ｓ−アデノシル−ホモシステイン）、ＡｄｏＭｅｔ（Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン）、ＥｃｏＤａｍ（大腸菌Ｄａｍ）、ＥＨＥＣ（腸管出血性大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７）、ＥＰＥＣ（腸管病原性大腸菌）、ＨＴＡ（ハイスループットアッセイ）、ＩＳＳ（インシリコスクリーニング）、ＭＴアーゼ（メチルトランスフェラーゼ）、ＮＣＩ（米国国立癌研究所）、ＰＤＢ（タンパク質データバンク）。
【００３９】
[0074] 一般的な結晶化および構造決定技術。Ｄａｍ酵素学およびアッセイの発展を調べた。例えば、Ｒｏｔｈ ＆ Ｊｅｌｔｓｈ（２０００）、Ｕｒｉｇ他、（２００２）、Ｈｕｍｅｎｙ他（２００３）、Ｌｉｅｂｅｒｔ他、（２００４）、Ｈｏｒｔｏｎ他（２００４）参照。タンパク質精製、結晶化および構造決定の標準的方法を使用して、多くのＡｄｏＭｅｔ−依存性ＭＴアーゼおよび関連するタンパク質、ＨｈａＩ ＤＮＡ ＭＴアーゼ、ＨｈａＩ ＭＴアーゼ−ＤＮＡ複合体、ＰｖｕＩＩエンドヌクレアーゼ−ＤＮＡ複合体、ＰｖｕＩＩ ＤＮＡ ＭＴアーゼ、タンパク質アルギニンＭＴアーゼＰＲＭＴ３およびＰＲＭＴ１、小分子ヒスタミンＭＴアーゼおよび阻害剤との複合体、Ｄｎｍｔ３ｂ ＰＷＷＰドメイン、ＭＢＤ４グリコシラーゼドメイン、ヒストンＨ３ Ｌｙｓ９ ＭＴアーゼ ＤＩＭ−５および基質Ｈ３ペプチドとの複合体、Ｔ４ファージＤａｍおよびＤＮＡとの特異的および非特異的複合体、タンパク質グルタミン−Ｎ５ ＭＴアーゼＨｅｍＫ、ヌクレオソーム依存性ヒストンＨ３リシン７９ＭＴアーゼＤｏｔ１ｐならびにＨｉｎＰ１Ｉエンドヌクレアーゼの新規構造を解析した。
【００４０】
[0075] 一旦酵素を精製し、約１０ｍｇ／ｍＬまで濃縮したら、研究室で現在利用できる３種のスクリーニング（３００条件）を使用して結晶化条件を検索する。さらにスクリーニングが必要ならば、様々な沈殿剤、緩衝液などを含む、数千の条件の市販のその他のスクリーニングを使用することができる。結晶化を３種の方法で並行してスクリーニングする。第１に、アポ酵素のために、第２に、ＭＴアーゼ−ＡｄｏＭｅｔまたはＡｄｏＨｃｙ複合体のような２要素複合体のために、補因子を精製の最終カラム（通常ゲル濾過カラム）に、また、濃縮ステップで添加し、第３に、ＭＴアーゼ−ＡｄｏＨｃｙ−ＤＮＡのような３要素複合体のために、タンパク質／ＤＮＡ比ならびにＤＮＡの長さおよび配列を変化させる。さらに、ヘミメチル化されたＧＡＴＣ（鎖の１本のＮ６−メチル−Ａｄｅ）は、ＤＮＡ複製直後に存在する天然の基質なので、結晶化に使用する。
【００４１】
[0076] Ｘ線回折品質の結晶が得られたとき、ＥｃｏＤａｍおよびその他のＤａｍ分子の構造を解析するために３種の方法、（１）分子置換法、（２）セレノ−Ｍｅｔの多波長または１波長異常分散法（ＭＡＤまたはＳＡＤ）、および（３）重原子誘導体の多重同形置換法（ＭＩＲ）を使用する。
【００４２】
[0077] 分子置換法： ＥｃｏＤａｍ構造決定のために（図１３参照）、回転機能検索および翻訳機能検索の開始モデルとしてＴ４Ｄａｍ座標を使用する。大腸菌およびＴ４Ｄａｍタンパク質は、配列同一性が２５％で、相同性が４６％である。非保存性側鎖をアラニンに置換し、いくつかの小さなループ領域を除去することによってＴ４Ｄａｍモデルを変更した。このモデルを３個の厳密な群（触媒ドメイン、ＤＮＡ結合ドメインおよびＤＮＡ自体）に分類し、ＣＮＳプログラムを用いて、分子置換検索を完全に遂行する。（Ｂｒｕｎｇｅｒ他、１９９８）
【００４３】
[0078] 結晶が利用可能な場合は、サルモネラおよびＨ．インフルエンザのＤａｍ構造を解析するために同様の方法を使用する。さらに、分子置換解析はまた、ＭＡＤまたはＭＩＲデータにおいて異常分散差フーリエマップによりＳｅまたは水銀部位の位置を突き止めるために使用することができる（下記）。分子置換および実験相を組み合わせると、電子密度地図の品質を非常に高めることができ、構造の解釈に適するようになる。ＨｅｍＫの構造を解析するために同様の方法を使用した（Ｙａｎｇ他、２００４）。
【００４４】
[0079] セレノ−Ｍｅｔの多波長または単波長異常分散法（ＭＡＤまたはＳＡＤ）： ＥｃｏＤａｍは３個のメチオニンを有する。Ｓｅ−Ｍｅｔを供給する培地中でタンパク質を過剰発現することによって、タンパク質中のメチオニンをＳｅ−Ｍｅｔに置換した。予備的なＸ線データは、Ｓｅ吸収端近辺の２波長で、分解能約２．３ÅのＡＰＳ ＳＥＲＣＡＴビームラインによって収集した。しかし、分子置換法によって構造を解析していた（前記）ので、これらのデータは必要なかった。
【００４５】
[0080] 重原子誘導体の多重同形置換法（ＭＩＲ）： 必要に応じて、重原子を含有する様々な試薬に結晶を浸漬することによって、同形重原子誘導体が得られる。最初に、水銀化合物に注目する。水銀原子は、システインの硫黄原子と反応し、ＥｃｏＤａｍは５個のシステイン残基を有する。最初のＴ４Ｄａｍ構造は、水銀誘導体によって解析された（Ｙａｎｇ他、２００３）。
【００４６】
[0081] 病原性細菌の様々なＤａｍ分子のいずれか１つを結晶化して、Ｘ線結晶学によって高分解能三次元構造を得ることができる。例えば、Ｄａｍ分子は、サルモネラ・エンテリカ・血清型チフィムリウム、エルシニア・ペスティスおよびクレブシエラ・ニューモニエから得ることができる。３種の酵素（それぞれ２７８、２７１および２７５残基）は、大きさが大腸菌Ｄａｍ（２７８残基）と同じである。Ｋｐｎ Ｄａｍは、大腸菌で発現し、精製された。さらに、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉｉ）およびサルモネラ・シュードツベルクローシスのｄａｍ遺伝子はクローニングされ、そのタンパク質は大腸菌で発現し、触媒活性を有していた（データは示さず）。精製されたＤａｍタンパク質は、当分野で公知の結晶学的方法により結晶構造を得るために使用される。
【００４７】
[0082] ＫｐｎゲノムＤＮＡは、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手した。Ｄａｍ遺伝子は、ＰＣＲを用いてゲノムＤＮＡから得た（Ｄａｍ配列は公に使用できるデータベースから入手できる。例えば、ＥｃｏＤａｍおよびＴ４Ｄａｍのアミノ酸配列については図３６参照）。ｐＥＴプラスミドを使用して、ＧＳＴ−ＫｐｎＤａｍ（ＧＳＴの後にトロンビン部位を有する。）および（Ｈｉｓ）６タグＫｐｎＤａｍの両方を発現させた。いずれも大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株で発現した。精製のために、文献（Ｋｏｓｓｙｋ他、１９９５、Ｙａｎｇ他、２００３）に記載のＴ４Ｄａｍプロトコールを実施することができる。さらに、大腸菌Ｄａｍは、ｐＥＴ系で発現する。サルモネラおよびエルシニアＤａｍ発現構造物が使用可能である（Ｍｉｃｈａｅｌ Ｍａｈａｎ博士）。その他のＤａｍ分子は、ＡＴＣＣを含む公に使用できる供給源から対応する細菌ゲノムを入手することによって同様に得ることができ、例えばＰＣＲを用いて、ゲノムからＤａｍ遺伝子を抽出することができる。
【実施例】
【００４８】
[0083]〔実施例１：Ｔ４ＤＡＭおよびＴ４ＤＡＭ−ＤＮＡ複合体のＸ線結晶学〕
[0084] Ｔ４Ｄａｍ構造は、Ｘ線結晶学によって解析した。いずれもＴ４Ｄａｍの結晶学的方法、データおよび構造解析の参考として援用したＹａｎｇ他、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ４ ＤＮＡ ａｄｅｎｉｎｅ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：８４９〜５５（２００３）およびＨｏｒｔｏｎ他、「Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｏ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＤＮＡ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｌｏｎｇ ｔｈｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ ｏｆ Ｄａｍ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ」Ｃｅｌｌ １２１：３４９〜６１（２００５）を参照のこと。Ｔ４Ｄａｍの２次および３次構造の座標は、タンパク質データバンクに登録されている（ＰＤＢおよびＰＤＢ ＩＤ番号と共に登録された構造の概要については表８を参照のこと）。
【００４９】
[0085] バクテリオファージＴ４Ｄａｍは２個のドメイン、すなわち（ｉ）ＡｄｏＨｃｙの結合部位を有する７本鎖触媒ドメイン、および（ｉｉ）５本のヘリックスの束およびＧＡＴＣ関連ＭＴアーゼオルソログのファミリー（図２Ｃ）に保存されているβヘアピンループ（図２Ａ〜Ｂ）から成るＤＮＡ結合ドメイン、を含有する。
【００５０】
[0086] 非特異的Ｔ４Ｄａｍ−ＤＮＡ−ＡｄｏＨｃｙ複合体の構造：ＡｄｏＨｃｙおよび合成１２塩基対ＤＮＡ（ＡＣＡＧＧＡＴＣＣＴＧＴ）（Ｔ４Ｄａｍの最小基質）の両方を有するＴ４Ｄａｍの３要素複合体を結晶化した（Ｈａｔｔｍａｎ ａｎｄ Ｍａｌｙｇｉｎ、２００４）。結晶において、ＤＮＡ２本鎖は逆向きに重なり、疑似連続ＤＮＡ２本鎖を形成する。図３Ａ。驚くべきことに、配列特異的Ｔ４ＤａｍはＧＡＴＣ部位には結合しない。図３Ａ〜Ｃ。むしろ、それは、合成２本鎖当たり２個のＤａｍ単量体を含有するＤＮＡに、非特異的な「緩い」様式で結合する。図３Ａ〜Ｂ。
【００５１】
[0087] Ｔ４ＤａｍとＤＮＡとの非特異的結合については、Ｔ４Ｄａｍは複数のＧＡＴＣ部位を有するＤＮＡを連続的な方法でメチル化する、すなわち、結合したＤａｍ単量体当たり複数のメチル基を転移することができる、と説明することができる。三次元結晶構造において、Ｔ４Ｄａｍ−ＡｄｏＨｃｙ複合体は、メチル転移後の段階に対応する様式で２本鎖上に存在する。すなわち、ＧＡＴＣ標的部位とは接触せず、むしろホスホジエステル主鎖と接触し、拡散、および／またはＡｄｏＨｃｙのＡｄｏＭｅｔとの交換を行う準備を整えている。この３次構造は、ＤＮＡに沿って直線的に拡散する準備が整った酵素の希なスナップ写真である。
【００５２】
[0088] 半特異的複合体の構造：ＡｄｅおよびＴｈｙが結合部で塩基対になるように、平滑末端ＧＡＴＣ含有１２塩基ＤＮＡに加えて、１本の鎖（ＡＣＣＡＴＧＡＴＣＴＧＡＣ）に５’オーバーハングＡｄｅを有し、他方の鎖（ＴＧＴＣＡＧＡＴＣＡＴＧＧ）に５’−オーバーハングＴｈｙを有する１３塩基特異的ＤＮＡを使用した。２個のＤＮＡ分子のらせん軸が互いに約１２Åずれていること以外は、非特異的結合と同様に、２個のＤａｍ分子は１個のＤＮＡ２本鎖に結合する（図４Ａ）。Ｔ４ＤａｍはＤＮＡ結合部に結合し、３位のＧ：Ｃ塩基対でＲ１１６を介してＧｕａと水素結合相互作用を形成する（図４Ｂ〜Ｃ）。驚くべきことに、次の２位のＧ：Ｃ対および１位のオーバーハングＡｄｅは（ＤＮＡの溶解を通じて）開かれている（図４Ｂ）。隣のＤＮＡ分子のオーバーハングＴｈｙが接近し、らせんからはみ出て、Ｇ：Ｃ対のＣｙｔと重なり、他方、Ｆ１１１のフェニル環は別の側に重なる（図４Ｂ）。Ｔｈｙのメチル基は、Ｐ１２６とのファンデルワールス力で接触し、他方、Ｏ４原子はＭ１１４と接触する（図４Ｃ）。相互作用に関与する残基（Ｒ１１６、Ｆ１１１、Ｐ１２６およびＭ１１４）は、ＧＡＴＣ ＭＴアーゼのファミリーで高度に保存されたアミノ酸である（図２Ｃ参照）。特定の理論に結びつけることは望まないが、この分子は認識配列の一部を結合部の配列に模倣させていると考えられる。
【００５３】
[0089] 半特異的接触および特異的接触の両方を含む３要素複合体の構造：１２塩基および１３塩基に加えて、認識配列の一部を模倣している末端配列を有する１５塩基オリゴ（ＴＣＡＣＡＧＧＡＴＣＣＴＧＴＧ）を構築した。さらに、ＤＮＡに対するタンパク質の割合も減少させた。以下のことが観察された。（１）隣接したＤＮＡ分子の間の結合部はいずれもＤａｍ分子（図５Ａの分子Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ）によって占有される。２個のＤＮＡ分子の重なりはＦ１１１を介して媒介され、Ｆ１１１は、２個の隣接するＤＮＡ分子の５’Ｔｈｙ塩基と重なる（図５Ｂ）。（２）より特異的な相互作用はオリゴヌクレオチドの結合部に認められ、Ｒ１１６、Ｐ１２６およびＭ１１４は半分の部位と相互作用し、Ｓ１１２およびＲ１３０はもう半分の部位と相互作用する（図５Ｃ）。（３）ＤＮＡに対するタンパク質の比が減少するので、分子１個のみ（図５Ａの分子Ｆ）がオリゴの中央の特異的ＧＡＴＣ部位に結合し、２本鎖ＤＮＡからフリッピングした標的Ａｄｅと特異的に相互作用する（示さず）。表２および３に、様々なＴ４Ｄａｍ−ＤＮＡ−ＡｄｏＨｃｙ結晶の特性の概要を示す。
【００５４】
[0090] これらの所見は、Ｄａｍ酵素が、損傷を受けたＤＮＡまたは修飾された認識部位を模倣する２個のＤＮＡ分子の結合部に優先的に結合することを示している。このことは驚くべきことであるが、生化学データと合致しており、ＤＮＡ ＭＴアーゼの結合特異性は、標的ヌクレオチドに隣接するヌクレオチドによって決定され、ＤＮＡ ＭＴアーゼが、標的塩基にミスマッチを含有する基質により堅く結合することを示唆している（Ｃｈｅｎｇ ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔｓ、２００１）。言い換えると、ＤＮＡ ＭＴアーゼは、結合特異性については、フリッピング可能な標的塩基に左右されない。Ｄａｍについては、５’Ｇ：Ｃ塩基対が回文構造の両端に存在するならば、１本の鎖に認識部位の半分があるだけで安定な複合体形成に十分であると考えられる（Ｈａｔｔｍａｎ ａｎｄ Ｍａｌｙｇｉｎ、２００４）。これは、１５塩基２本鎖ＤＮＡによって形成された結合部について観察されたことである。
【００５５】
[0091] 全部位認識には、タンパク質側鎖挿入が関与する。１個のＴ４Ｄａｍ（分子Ｅ）のみがＧＡＴＣ部位（オレンジ色のＤＮＡ）を占有する（図６Ａ）。βヘアピンは、３／４部位に認められるのとほとんど同様に、主溝のＤＮＡ塩基と特異的に相互作用する。Ｆ１１１およびＳ１２２はいずれも、主溝側からＤＮＡにその側鎖を挿入する（図６Ａ）。標的Ａｄｅは２本鎖からフリッピングするが、その電子密度は活性部位ではあまり規則正しくない（以下の活性部位相互作用の説明を参照）。Ｓ１１２の側鎖は、フリッピングしたＡｄｅによって残された空間を占有し、３／４部位複合体に見られるのと同様に、「オーファン」Ｔｈｙと２個の水素結合を形成する。このＳ１１２相互作用は、オーファンＴｈｙの極性端に対する水素結合を回復し、隣接する塩基対に対する重なりと置換する（図６Ａ）。Ｔｈｙ−Ｓ１１２相互作用は、ＤＮＡ−シトシンＭＴアーゼ ＨｈａＩのＧｕａ−Ｑ２３７（Ｋｌｉｍａｓａｕｓｋａｓ他、１９９４）、ヒト３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼのＴｈｙ−Ｙ１６２（Ｌａｕ他、１９９８）およびヒト８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼのＣｙｔ−Ｎ１４９（Ｂｒｕｎｅｒ他、２０００）のようなその他のタンパク質側鎖−オーファン塩基相互作用と同様である。
【００５６】
[0092] Ｆ１１１のフェニル環は、ＤＮＡらせんに挿入され、隣接するＡ：Ｔ塩基対とＴｈｙ：Ｓ１１２「塩基−アミノ酸」対との間に重なり、らせん上昇部において局部的な重なりを生じる（図６Ａ）。主溝側からのＤＮＡ塩基対間へのアミノ酸の挿入は、いくつかのタンパク質−ＤＮＡ複合体に関して記載されている。Ｍ．ＨａｅＩＩＩ−ＤＮＡ複合体では、Ｉｌｅ２２１が重なった塩基の間に入り、オーファンＧｕａが隣接するＣｙｔと対合するようにＤＮＡにギャップを開く（Ｒｅｉｎｉｓｃｈ他、１９９５）。非常に短いパッチ修復エンドヌクレアーゼ−ＤＮＡ複合体では、３個の芳香族残基がＴＧミスマッチの隣のＤＮＡに挿入される（Ｔｓｕｔａｋａｗａ他、１９９９）。ＨｉｎｃＩＩ制限エンドヌクレアーゼ−ＤＮＡ複合体では、Ｇｌｎ側鎖が認識部位のいずれかの側の２個の塩基対の間に挿入される（Ｈｏｒｔｏｎ他、２００２）。さらに、Ｆ１１１−Ｍ７５残基対がＡ：Ｔ塩基対と塩基−アミノ酸対Ｃｙｔ：Ｒ１０９との間に重なる、修復酵素ホルムアミド−ピリミジン−ＤＮＡグリコシラーゼによる挿入は、ＤＮＡの副溝側から観察された（Ｓｅｒｒｅ他、２００２）。
【００５７】
[0093] 非標準的部位との相互作用。中央のＡＴ重なりへの分子ＥによるＦ１１１の挿入は、オレンジ色で示されたＤＮＡ分子の１塩基対延長を効果的に引き起こす（図７ＡおよびＢ）。この延長は、ＤＮＡ分子の１端に伝わり、隣接した２本鎖（赤紫）の２個の不規則なヌクレオチドを生じる。赤紫ＤＮＡの５’−オーバーハングＴｈｙが突出して、外見上不規則になり、次の塩基対のＣｙｔがＤａｍ分子ＤのＦ１１１と重なることになる。一部にはＮ４アミノ窒素（ＮＨ２）と主鎖アミド窒素（ＮＨ）との間の反発力によって、Ｓ１１２の側鎖は、側鎖ヒドロキシル酸素およびＣｙｔの環外アミノ窒素Ｎ４とでＣｙｔ塩基にファンデルワールス力の距離まで接近する（図７Ｃ）。Ｓ１１２とＣｙｔとの間の相互作用は、相補的Ｇｕａを置換して、これを不規則にするのに十分である。Ｒ１３０の側鎖は、隣のＡ：Ｔ塩基対を飛び越し、近隣の下流Ｇ：Ｃ塩基対のＧｕａと相互作用する（図７Ｃ）。ＧＡＴＣ（または改変ＴＡＴＣ）部位の下流のＧｕａの存在は触媒性を支持しないので（データは示さず）、この複合体は、ＤＮＡメチル化を引き起こさない、ＤＮＡ中の隔離されたＴＣジヌクレオチド部位とＴ４Ｄａｍとの相互作用の例証である。
【００５８】
[0094] シネフンギンの存在下でのフリッピングアデニンの安定化。今まで、メチル化反応生成物ＡｄｏＨｃｙを使用して３要素複合体を調製してきた。各５量体のタンパク質−ＡｄｏＨｃｙ相互作用は、Ｔ４Ｄａｍ−ＡｄｏＨｃｙ２要素複合体で説明したものとほとんど同一である（Ｙａｎｇ他、２００３）。Ｄａｍ分子Ｅとオレンジ色のＤＮＡとの全部位認識複合体において（図６Ａ）、標的Ａｄｅはフリッピングするが、活性部位では完全には規則正しくない。生成物ＡｄｏＨｃｙは、次のメチル転移の前にＡｄｏＭｅｔと交換するために、標的部位から遊離するように酵素に合図を送ることができると推測した。したがって、活性部位ポケットのフリッピングしたＡｄｅの安定な結合には、ＥｃｏＤａｍで示唆されたように（Ｌｉｅｂｅｒｔ他、２００４）、おそらくＡｄｏＭｅｔが必要であろう。したがって、アミノ基上で形式的な正電荷を帯びていることから、ＡｄｏＭｅｔアナログシネフンギン（アデノシルオルニチン）を、新たな３要素複合体を調製するために使用する。
【００５９】
[0095] 新たな結晶は、２個のＴ４Ｄａｍ分子を含有し（示さず）、１個は図５ＢのＤａｍＣ分子と同様に２個のＤＮＡ２本鎖の結合部に結合し、他方は図６ＡのＤａｍＥ分子と同様に１個の２本鎖の中央の特異的ＧＡＴＣ部位に結合する。フリッピングしたＡｄｅは、保存された触媒性Ｄ１７１−Ｐ−Ｐ−Ｙ１７４モチーフ（Ｍａｌｏｎｅ他、１９９５）、Ｙ１８１、Ｋ１１およびシネフンギンに属するアミノ酸によって（水素結合、πスタッキングおよび疎水性相互作用を介して）囲まれている（図６Ｃ）。メチル化されるＡｄｅＮ６−アミノ基は１対の水素結合を形成し、１個はＤ１７１の側鎖に、もう１個は２個のプロリン残基Ｐ１７２およびＰ１７３の間の主鎖カルボニル酸素に結合する。標的アミノ窒素は、シネフンギンアミノ基から３Å未満の距離だけ離れており、束縛されたＡｄｅ塩基の平面から突出している。この構造配置は、Ｔａｑ１ ＤＮＡアデニンＭＴアーゼで示唆されたように、標的窒素の孤立電子対が脱共役し、直線方向へのメチル基転移のための位置を取ることを示唆している（Ｇｏｅｄｅｃｋｅ他、２００１）。シネフンギンのアミノ基は、Ｙ１８１のヒドロキシルと水素結合を形成し、次にＴ８の主鎖カルボニルと相互作用する。フリッピングしたＡｄｅの反対面は、Ｙ１７４の芳香族環と向かい合ってπスタッキングする。
【００６０】
[0096] ＥｃｏＤａｍ変異体の生化学分析。ＥｃｏＤａｍは、Ｔ４Ｄａｍとかなりの程度の配列類似性があるが（同一性２５％）（Ｈａｔｔｍａｎ他、１９８５）、病原性細菌のＤａｍ酵素とは非常に高い配列保存性を有する。例えば、大腸菌およびＳ．チフィムリウムＤａｍタンパク質は、同一性が９２％で（２７８残基のうち２２残基のみが異なる）、配列にギャップがない。Ｄａｍファミリーは生物学的に重要なので、Ｔ４Ｄａｍ構造がこれらのオルソログの機能の理解に寄与するかどうかを調べた。このために、標的ＧＡＴＣ部位とのＴ４Ｄａｍ特異的相互作用に関与する残基に対応するＥｃｏＤａｍの残基をＡｌａに置換する効果を研究した（図８Ａ）。これには、Ｙ１１９（Ｔ４ＤａｍのＦ１１１）、Ｎ１２０（Ｔ４ＤａｍのＳ１１２）、Ｌ１２２（Ｔ４ＤａｍのＭ１１４）、Ｒ１２４（Ｔ４ＤａｍのＲ１１６）およびＰ１３４（Ｔ４ＤａｍのＰ１２６）が含まれる。これらの残基はいずれも、Ｄａｍオルソログの中で高度に保存されている。さらに、残基Ｒ１３７、Ｙ１３８およびＫ１３９はＴ４Ｄａｍ Ａｒｇ１３０の機能を引き継ぐことができるので、これらを変異させた（図８Ａ）。
【００６１】
[0097] Ｒ１２４ＡおよびＹ１１９Ａ変異体は、Ａｌａ置換によって最も強く影響を受け、それらの触媒活性の減少は１００倍を上回った（図８Ｂ、ならびに図５ＢのＴ４Ｄａｍ Ｒ１１６およびＦ１１１参照）。Ｎ１２０Ａ、Ｎ１２０ＳおよびＬ１２２Ａは、わずかに影響を受けたのみであった。Ｒ１２４Ａ変異体によるＤＮＡ結合の減少は、１０倍であった（触媒活性減少の１０分の１を占めるにすぎない）が、Ｙ１１９Ａ、Ｐ１３４Ａ、Ｐ１３４ＧおよびＫ１３９Ａによる結合の減少は２〜３倍であった（図８Ｃ）。その他の変異体（Ｎ１２０Ａ、Ｎ１２０Ｓ、Ｌ１２２Ａ、Ｒ１３７Ａ、Ｙ１３８ＡおよびＫ１３９Ａ）は、野生型と比較してＤＮＡ結合に関してそれほど違いを示さなかった。
【００６２】
[0098] ＤＮＡ認識の過程をさらに調べるために、野生型および変異酵素によるＤＮＡメチル化速度は、１個のヘミメチル化標的を含有する２本鎖を使用して測定した（下鎖のＮ６−メチル−Ａｄｅ、図８Ａの３番目の塩基対）。これによって、ＤＮＡの１本鎖のみがメチル化を受けることが確かめられた（すなわち、上鎖のＡｄｅ、図８Ａの２番目の塩基対）。これらの２本鎖は、標準的ＧＡＴＣ部位、または標的配列の１番目、３番目または４番目いずれかの塩基対に１個の塩基置換を有する変異部位を含有し（図８Ａ参照）、これらの変異部位を本明細書では「ニアコグネイト（ｎｅａｒ−ｃｏｇｎａｔｅ）」部位（全部で９個）と称する。このように、野生型酵素およびその変異体の特異性プロファイルが得られた（図９）。野生型ＥｃｏＤａｍは、ニアコグネイト部位がコグネイト部位よりも１００〜１０００倍遅く改変されるので、非常に特異的な酵素である（図９Ａ）。ＧＡＴＣ配列の第１の位置は、以前の発見（Ｌｅｉｂｅｒｔ他、２００４）と合致して、第３および第４の塩基ほど正確には認識されない。Ｔ４ＤａｍのＲ１３０によるこの塩基への接触は、Ｄａｍファミリーのその他の構成メンバーではあまりよく保存されておらず（例えば、ＥｃｏＤａｍのＹによる置換、図８Ａ参照）、Ｒ１３０−Ｇｕａ１接触は１／４部位複合体では形成されない（図４および図５の比較）ことは興味深い。第１の塩基対（Ｒ１３７Ａ、Ｙ１３８ＡおよびＫ１３９Ａ）の認識に関与し得る残基で改変されたＥｃｏＤａｍ変異体は、メチル化活性または特異性においてあまり強い変化を示さなかった（図１２）。
【００６３】
[0099] 第１の位置とは対照的に、ＧＡＴＣの第３および第４の塩基は、より正確に認識される。両方の位置で、トランジション（Ｔｈｙ３からＣｙｔ、またはＣｙｔ４からＴｈｙ）はトンランスバージョンよりも害が少なく、保存的交換はより許容可能であることを示唆している。Ｔ４ＤａｍＲ１１６とＧｕａ４との間の接触（図５Ｃ）は、Ｄａｍ ＭＴアーゼ中で保存されている（例えば、図８Ａ）。対応するＥｃｏＤａｍＲ１２４Ａ変異体の特異性プロファイルを決定した（図９Ｂ）。Ｔ４Ｄａｍ構造と合致して、ＧＡＴＧおよびＧＡＴＴ部位は、標準ＧＡＴＣ部位よりも速くＲ１２４Ａによってメチル化された。対照的に、これらの２個のニアコグネイト部位の野生型ＥｃｏＤａｍメチル化は、ＧＡＴＣのメチル化よりも３桁遅かった。したがって、Ｒ１２４Ａは、野生型ＥｃｏＤａｍに対してＧＡＴＣ部位のＤＮＡメチル化の速度が１００倍減少しているが、ＧＡＴＧおよびＧＡＴＴ部位をＧＡＴＣよりも２〜３倍速く、ｗｔ酵素修飾ＧＡＴＧまたはＧＡＴＴよりも３０〜４０倍速くメチル化する。したがって、Ｒ１２４Ａは、ＧＡＴＣの４番目の位置のＣ：Ｇ塩基対の差別的な必要性を失っている。この情報をより定量的に分析するために、全てのニアコグネイト部位における相対的なメチル化活性を統合することによって特異性因子を定義した（実験方法）。位置４（Ｓ４）を認識するための特異性因子を比較すると、Ｒ１２４Ａ変異体では、４番目の位置で改変されたニアコグネイト部位のメチル化に対する相対的選択性が８０００倍変化していることが明らかになった（図９Ｆ）。Ｓ４においてこのような強い変化を示した変異体は他になかった。さらに、Ｒ１２４Ａ変異体は、塩基対特異的変化であるので、ＧＡＴＣの１番目および３番目の位置に対する特異性を維持（または増加さえ）していた（図９Ｂ）。
【００６４】
[00100] ＧＡＴＣの第３の位置のＴ：Ａ塩基対を認識する、Ｔ４Ｄａｍ残基Ｐ１２６およびＭ１１４に関連した特異性の同様の塩基対特異的欠如を発見した（図８Ａ）。標準ＧＡＴＣ部位に加えてＧＡＣＣ部位を効果的に改変する天然に生じる変異ファージ酵素（Ｔ２ＤａｍｈおよびＴ４Ｄａｍｈ）（Ｂｒｏｏｋｓ ａｎｄ Ｈａｔｔｍａｎ、１９７８）は、Ｐ１２６Ｓ置換を含有する（Ｍｉｎｅｒ他、１９８９）。さらに、Ｐ１２６Ｇ、−Ａまたは−Ｃ置換は、Ｄａｍｈの様に機能する（Ｍｉｎｅｒ他、１９８９）。これに関して、ＥｃｏＤａｍＰ１３４ＡおよびＰ１３４Ｇ変異体がＧＡＴＣ部位で通常の触媒活性を有することはおそらく驚くべきことではない（図８Ｂ）。しかし、Ｐ１３４Ａは、ＧＡＡＣおよびＧＡＣＣ基質のメチル化速度において著しい増加を示し、ＧＡＣＣは標準ＧＡＴＣとほとんど同じ速度で改変された（図９Ｃ）。選択性のこの変化は、野生型ＥｃｏＤａｍと比較すると、第３の塩基における１００倍を上回る配列識別能力の低下に対応する。Ｐ１３４の側鎖をグリシンにさらに短くすると、ＧＡＡＣおよびＧＡＣＣの間の区別がなくなり、ＧＡＴＣの約１０倍遅い速度でメチル化された（図９Ｄ）。第３塩基対のＰ１３４ＡおよびＰ１３４Ｇ認識の変化は、図９Ｇに示されており、ここでは第３の塩基（Ｓ３）を認識するための特異性因子を全変異体について比較している。この比は、野生型ＥｃｏＤａｍと比較して１２００〜１５００倍に変化している。しかし、これらの変化によって、第３の位置での特異性の単純な低下は引き起こされなかった。ＧＡＴＣ部位はまだＧＡ（Ａ／Ｃ）Ｃに対して約１０倍選択性があり、他方、ＧＡＧＣ部位は少なくとも１０００倍遅くメチル化される。
【００６５】
[00101] ＥｃｏＤａｍのＬ１２２Ａ変異体（Ｔ４ＤａｍのＭ１１４、図５ＢおよびＣ）の活性は、あまり減少していない（図８Ｂ）。しかし、興味深いことに、ニアコグネイト部位のいずれについてもメチル化活性は検出されなかった（図９Ｅ）。このことは、Ｌ１２２Ａ変異体の特異性が著しく高いことを示している（図９Ｈ）。これは、Ｌ１２２の側鎖が完全なタンパク質−ＤＮＡ接触の安定化に必要であると考えることによって理論的に説明可能である。Ｌ１２２Ａ変化単独では通常のＧＡＴＣ基質の触媒活性をあまり減少させないが、Ｌ１２２Ａを認識部の塩基対のいずれかの変化と組み合わせるとタンパク質−ＤＮＡ接触を相乗的に妨害することができ、これによって活性の完全な欠如を説明することができた。
【００６６】
[00102] 塩基特異的に接触させる残基に加えて、ＤＮＡに挿入する芳香族残基（ＥｃｏＤａｍのＹ１１９、Ｔ４ＤａｍのＦ１１１、図６Ａ）、およびオーファンＴｈｙに接触する近傍の親水性残基（ＥｃｏＤａｍのＮ１２０、Ｔ４ＤａｍのＳ１１２、図６Ａ）について研究した。図８Ｂに示したように、Ｙ１１９Ａは２番目に最も影響を受ける変異体であった。これは、ＤＮＡへの芳香族環の挿入は酵素触媒の重要なステップであり、塩基フリッピングの開始または安定化におそらく関与することを示唆している。対照的に、特異的Ｔ４Ｄａｍ−ＤＮＡ複合体の構造は塩基フリッピングにおけるこのアミノ酸の重要な役割を示唆しているが、Ｎ１２０の側鎖（Ｎ１２０Ａ）を除去してもメチル化速度にはほんの少ししか影響を及ぼさなかった。この発見は、塩基フリッピングは速く、ＥｃｏＤａｍおよびその他のＤＮＡ ＭＴアーゼの触媒を制限しないと考えられる事実と合致する（Ａｌｌａｎ他、１９９９、Ｂｅｃｋ ａｎｄ Ｊｅｌｔｓｃｈ、２００２およびＬｉｅｂｅｒｔ他、２００４）。
【００６７】
[00103] タンパク質によるＤＮＡ認識は、いかなる生物においても遺伝子の特異的発現に不可欠である。タンパク質が主溝での接触によってＤＮＡ配列を認識するという原則は数十年前から知られているが（Ｓｅｅｍａｎ他、１９７６）、標的ＤＮＡ配列からのアミノ酸モチーフの推定を可能にする一般的基準はない。注目すべき例外はＣ２Ｈ２型亜鉛フィンガーであり、このタンパク質ファミリーのＤＮＡ認識基準を規定可能な程度に十分にＤＮＡ認識過程が理解されている（Ｐａｄｏ他、２００１）。したがって、ＤＮＡと相互作用する酵素だけでなく、非触媒性タンパク質についても、合理的な設計はまだ初期の段階にある。
【００６８】
[00104] 本明細書では、基質認識経路に沿った特有の６種のＴ４Ｄａｍ−ＤＮＡ相互作用を説明する（図１０）。驚くべきことに、タンパク質およびＤＮＡ成分の両方は、結合時に受ける全体的な立体変化が非常に少ない。非特異的、半特異的および特異的複合体のタンパク質構造は、２要素Ｔ４Ｄａｍ−ＡｄｏＨｃｙ複合体（ＰＤＢコード１Ｑ０Ｓ）の構造との標準偏差が０．４〜０．８Å以内で挿入され得る。Ｆ１１１挿入、および標的ヌクレオシドのＤＮＡらせんから特異的複合体の酵素触媒ポケットの中へのフリッピングによって引き起こされる１塩基対延長以外は、ＤＮＡ成分は主にＢ型である。しかし、ＤＮＡらせん軸に対するＴ４Ｄａｍの３つの顕著な配向が認められた。ヘアピンを形成するβ鎖に平行に軸が規定されるβヘアピンループは、非特異的複合体中においてＤＮＡ軸に対してほとんど垂直（約８０°）に位置し（図１０Ａ）、Ｒ１３０は１リン酸接触を形成する。非特異的相互作用はまたＤＮＡ副溝に生じ（図１０Ｂ）、このタンパク質はＤＮＡに対して約４５°傾いており、ヘアピンループの第２のＡｒｇ（Ｒ１１６）はリン酸相互作用の１つを形成する。塩基との直接相互作用はＤＮＡ主溝にのみ生じ（図１０Ｃ〜Ｆ）、βヘアピンおよびＤＮＡの軸間の角度は１／２部位複合体では約３０°であり、３／４部位および全部位複合体では約２５°である。これらの結果は、Ｔ４ＤａｍがＤＮＡに沿って移動し、ＤＮＡに対して剛体としてあちこちで回転することを示唆している。
【００６９】
[00105] 興味深いことに、特異的複合体（またはＲ１１６−Ｇｕａ４相互作用が関与する任意の複合体、図１０Ｃ〜Ｆ）においてＧｕａ４の５’の第１および第２のリン酸と水素結合するリン酸相互作用残基Ｒ９５およびＮ１１８は、非特異的複合体においてはどんなＤＮＡ相互作用にも関与しない（図１０Ａ〜Ｂ）。２個の異なる残基対（Ｑ１２およびＳ１３、ならびにＲ１３０およびＮ１３３）は、非特異的複合体においてＧＡＴＣ回文構造の各Ｇｕａに対応する２個のリン酸５’と相互作用する（図４Ｂ参照）。対照的に、２個のＡｒｇ残基（Ｒ１３０およびＲ１１６）は、非特異的複合体におけるＤＮＡリン酸との純粋に静電的な相互作用（図１０Ａ〜Ｂ）から、特異的または半特異的複合体の塩基対との非常に特異的な結合様式（図１０Ｃ〜Ｆ）へ、役割を変えることができる。ＤＮＡとの相互作用の同様の変化は、大腸菌ｌａｃ抑制因子の残基Ｒ２２で観察された（Ｋａｌｏｄｉｍｏｓ他、２００４）。この変化は、Ｔ４Ｄａｍを効果的に再配向させ、それによってフリッピングした標的塩基を収容するように酵素の活性部位ポケットを配置させる。触媒後、酵素は標的部位から離れ、垂直方向に逆回転し、活性部位を溶媒に露出させ、ＡｄｏＨｃｙとＡｄｏＭｅｔとの交換を可能にする。この機構によって、塩基フリッピングおよびメチル転移がコグネイトＧＡＴＣ部位との複合体で特異的に生じ、ＤＮＡから分離することなく各回転後にＡｄｏＨｃｙ／ＡｄｏＭｅｔ交換が起こることになる。
【００７０】
[00106] これらのデータは、ＤＮＡに沿ってＴ４Ｄａｍが１方向に滑るように進む間に特異的接触が一時的な順番で形成されることを示唆している。ＧＡＴＣ部位の４番目の塩基対に対するＲ１１６の接触は、１／４および３／４部位認識複合体において認められる。次に、第３の塩基対に対してＰ１２６およびＭ１１４の接触が形成される。これらの残基はいずれも、ＤａｍＭＴアーゼファミリーの中で厳密に保存されている。Ｔ４Ｄａｍに特異的なＧｕａ１に対するＲ１３０の接触がその後形成される。この結果は、Ｍ．ＥｃｏＲＶ変異体での迅速な反応速度論的実験から引き出された同様の結論と合致する（Ｂｅｃｋ ａｎｄ Ｊｅｌｔｓｃｈ、２００２）。この酵素では、酵素ファミリーで保存されているアミノ酸の置換（例えば、Ｎ１３６Ａ）は、初期段階での特異的複合体形成を妨害し、他方、ＥｃｏＲＶに特有のアミノ酸の置換（例えば、Ｒ１４５Ａ）は、後期段階での複合体形成を妨害した。この発見は、分子進化中のタンパク質および酵素のＤＮＡ特異性の変化の一般的経路を示すことを可能にする。ヒトＤＮＡ修復タンパク質Ｏ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）に関する最近の研究によって、ＤＮＡの同一領域に対する複数のＡＧＴ分子の動員が、方向的偏りのプロセスによるＤＮＡ損傷の検索に役立ち得ることが示唆された（Ｄａｎｉｅｌｓ他、２００４）。しかし、このような方向的偏りは、ＡＧＴによる１本鎖ＤＮＡの修復にのみ観察され、２本鎖ＤＮＡには観察されない。Ｔ４ＤａｍおよびＥｃｏＤａｍは２本鎖ＤＮＡに沿って移動するが（図５Ａ）、ＡＧＴはポリマーを形成するので、この系をＤａｍＭＴアーゼと直接比較することはできない。
【００７１】
[00107] ２重変異サイクル（Ｆｅｒｓｈｔ他、１９９２）で前述した接触の変更の生化学的効果を分析した。これには、それぞれのアミノ酸側鎖の短縮、およびニアコグネイト部位を有するＤＮＡ基質の使用が関与していた。認識部位の特異的１塩基対をもはや認識しないＭＴアーゼ変異体を予想通りに設計できることを発見した。ＥｃｏＤａｍＲ１２４Ａ変異体は、ニアコグネイト部位に著しく高い触媒活性を有し、特異性の変化を示した。さらに、ＥｃｏＤａｍＰ１３４Ａ変異体（Ｔ４Ｄａｍｈ ＭＴアーゼのアナログ）は、野生型ＥｃｏＤａｍ修飾標準部位とほとんど同様の速度でニアコグネイト部位をメチル化したが、これは特異性が広いことを示している（図９）。
【００７２】
[00108] 図１１は、（Ａ）３／４部位、（Ｂ）非標準部位および（Ｃ）特異的全部位に対するタンパク質−ＤＮＡ接触の概略を示す図である。図１２は、メチル化速度に対する様々なＥｃｏＤａｍ変異の効果の概略を示している。
【００７３】
[00109] ２種類のタンパク質ＤＮＡ接触、区別的接触および反区別的接触を確認した。区別的接触は、酵素触媒の遷移状態を安定化し、コグネイト部位との反応を特異的に促進する接触である。Ｔ４ＤａｍのＲ１１６（ＥｃｏＤａｍのＲ１２４）とＧｕａ４との間の接触が、区別的接触の一例である。アミノ酸側鎖を除去することによって接触を分断すると、酵素変異体の活性の強い減少が引き起こされた。非区別的接触、例えば、Ｔ４ＤａｍのＰ１２６（ＥｃｏＤａｍのＰ１３４）と認識部位の第３塩基対との間の接触は、間違ったＤＮＡ配列が結合すると立体的衝突が生じるので、コグネイト部位との反応をあまり促進せず、ニアコグネイト部位での活性を嫌う接触である。これは、ほとんどの非標準ＤＮＡ配列のメチル化を強く妨害し、非標的部位のメチル化に対する効果的な対抗選択を引き起こす。これは、ＥｃｏＤａｍ変異体Ｐ１３４ＡおよびＰ１３４Ｇの高い活性および広い特異性によって例示される。
【００７４】
[00110] 制限修飾ＭＴアーゼＭ．ＤｐｎＩＩとの比較。Ｔ４ＤａｍおよびＭＴアーゼＭ．Ｄｐｎｉｉ（Ｔｒａｎ他、１９９８）は、いずれも同じＧＡＴＣ配列を認識してメチル化し、非常に類似した構造を有するが、連続性はかなり異なっている。Ｔ４Ｄａｍのような連続的酵素は基質をよりしっかりと取り囲む傾向があることが示唆された。Ｂｒｅｙｅｒ ａｎｄ Ｍａｔｔｈｅｗｓ（２００１）。しかし、Ｍ．ＤｐｎＩＩ−ＤＮＡ複合体構造は現在分かっていないので、Ｔ４Ｄａｍと直接構造比較することはできない。
【００７５】
[00111] 今までに調べたＴ４Ｄａｍの全構造における補因子（例えば、ＡｄｏＨｃｙ）結合部位は、閉じた酸性ポケット中にある。対照的に、開いた立体構造は、２要素Ｍ．ＤｐｎＩＩ−ＡｄｏＭｅｔ構造に認められ、ＡｄｏＭｅｔはほとんど視覚的に認識することができ、ポケットは開いている（Ｔｒａｎ他、１９９８）。この違いは、ＡｄｏＨｃｙとＡｄｏＭｅｔとの交換、Ｔ４Ｄａｍメチル化過程全体における律速段階（Ｍａｌｙｇｉｎ他、２０００）が、タンパク質の立体構造変化を必要とすることを示唆している。Ｔｒｐ１８５を含むＴ４Ｄａｍのこの立体構造変化は、ＡｄｏＨｃｙおよびＡｄｏＭｅｔのいずれかに結合するＴ４Ｄａｍから生じる固有のトリプトファン蛍光の消失によって示される（Ｔｕｚｉｋｏｖ他、１９９７）。
【００７６】
[00112] Ｄａｍメチルトランスフェラーゼの基質認識経路に沿った、非特異的から特異的ＤＮＡ相互作用への転換。ＤＮＡメチルトランスフェラーゼは、特異的ヌクレオチド配列内の標的塩基をメチル化する。部分的に、または完全に特異的なＤＮＡおよびメチル供与体アナログとの３要素複合体のバクテリオファージＴ４ＤＮＡ−アデニンメチルトランスフェラーゼ（Ｔ４Ｄａｍ）について３種の構造が記載されている。関連する大腸菌ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＥｃｏＤａｍ）における置換、すなわちＴ４Ｄａｍの標準ＧＡＴＣ標的配列との特異的相互作用に関連した残基に対応する残基の変更、の効果を報告する。２種のタンパク質−ＤＮＡ相互作用、すなわち、遷移状態を安定化し、コグネイト部位のメチル化を促進する区別的接触、およびコグネイト部位のメチル化にあまり影響を及ぼさず、非コグネイト部位での活性を嫌う非区別的接触を確認した。これらの構造は、非特異的作用から特異的相互作用への酵素−ＤＮＡ相互作用の遷移を示しており、特異的接触の形成には一時的な順番があることを示唆している。
【００７７】
[00113] 基質認識経路に沿った構造スナップ写真。Ｔ４Ｄａｍの研究では（図１０）、（複数のＤａｍ分子をＤＮＡの１つに結合させるために）異なる長さのオリゴヌクレオチドを、（ＧＡＴＣ標的配列の一部を表すために）ＤＮＡ２本鎖の異なる末端配列を、（非特異的結合を減少させるために）ＤＮＡに対するタンパク質の異なる比を、また、（活性部位ポケットにおいてフリッピングした標的Ａｄｅを安定化させるために）メチル供与体アナログシネフンギンを使用することによって、基質認識経路に沿った多くのＤＮＡ相互作用のスナップ写真を撮影した。Ｔ４Ｄａｍのこれらの多くのスナップ写真を撮影する機会は、ＧＡＴＣ関連ＭＴアーゼオルソログ全体ならびにその他の連続的ＤＮＡ結合酵素を理解する際に重要である。しかし、Ｔ４ＤａｍおよびＥｃｏＤａｍの配列同一性は２５％しかなく、同一性のない残基のほとんどが表面上に位置しているので、Ｔ４Ｄａｍのリードに続いてＥｃｏＤａｍ−ＤＮＡ相互作用の多くの接触を同定することが必要である。ＥｃｏＤａｍの構造研究を通じて、ＥｃｏＤａｍに特有なタンパク質−ＤＮＡ接触を詳述し、それらをインシリコスクリーニング（ＩＳＳ）の標的とする。同様に、ＡｄｏＭｅｔ結合ポケットの特異的部分およびＥｃｏＤａｍ表面の特有のくぼみをＩＳＳのために使用する。
【００７８】
[00114] ある種の立体的状態に選択的な阻害剤の設計が可能であるので、ＤＮＡとの複合体における酵素の様々な構造に関する情報、およびＤＮＡメチル化過程の機構的理解は、ＩＳＳプロセスに、またそれ故、リード候補の同定に影響を及ぼす。非特異的および特異的ＤＮＡ相互作用に関与するタンパク質表面領域の測定は、ＩＳＳにおけるこれらの領域を個々に標的化することを助ける。特異的ＤＮＡ結合を妨害する阻害剤は、非特異的から特異的ＤＮＡ相互作用への遷移を妨害するか、あるいは、ＤＮＡに沿って酵素が滑って移動することを妨害することができる。ＡｄｏＭｅｔ交換を遮断する阻害剤は連続的に影響を与えることができる。
【００７９】
[00115]〔実施例２：大腸菌ＤＡＭのＸ線結晶学〕
[00116] ＤＮＡ複製によって生じたヘミメチル化ＧＡＴＣ部位におけるアデニンメチル化は、遺伝子発現、ミスマッチ修復、および多くのグラム陰性菌におけるビルレンス、を含む細菌細胞機能を調節する。γ−プロテオバクテリアにおける広範な、かつ保存された酵素ＤＮＡアデニンメチルトランスフェラーゼ（Ｄａｍ）は、ゲノムを移動しながらスキャンすることによってＧＡＴＣ部位をメチル化する。大腸菌Ｄａｍ（ＥｃｏＤａｍ）の構造は解析されており、補因子アナログの存在下でコグネイトおよび非コグネイト部位と相互作用する。非コグネイト複合体は、多くのＤａｍ調節（Ｄａｍ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ）プロモーターにおいてＧＡＴＣ部位のすぐ側にある潜在的ＤＮＡ結合エレメント、ＴＡ（Ｇ／Ａ）ＡＣの同定を可能にした。生化学的研究に伴って、この構造は、特異的酵素−ＤＮＡ相互作用形成の発生順を明らかにする。ＧＡＴＣ部位の後半（３’）における非標的鎖との接触は認識経路の早期に確立され、まず第４塩基対に、次いで第３塩基対に接触する。その後、特異的タンパク質側鎖の、ＤＮＡらせん第２塩基対および第３塩基対の間への挿入は、標的Ａｄｅのフリッピングと同時に生じる。ＧＡＴＣの最初のＧｕａに対する接触は、その後確立される。フリッピングした標的Ａｄｅが他の塩基結合部位に結合することは、塩基フリッピング経路における後半中間体候補を示唆している。オーファンＴｈｙは、らせん内またはらせん外の位置を取ることができる。
【００８０】
[00117] 補因子アナログの存在下でコグネイトまたは非コグネイトＤＮＡに結合したＥｃｏＤａｍの２種の結晶構造を報告する。非コグネイトＤＮＡ複合体は、多くのＤａｍ調節プロモーターにおいてＧＡＴＣ部位のすぐ側にある潜在的ＤＮＡ結合エレメント、ＴＡ（Ｇ／Ａ）ＡＣの同定を可能にしたが、このことは細菌ＤＮＡにおけるｄａｍメチル化の調節機構を示唆している。並行した生化学的研究と考え合わせて、構造の予測が正しいことを証明し、ＤＮＡ結合の部位特異的変異、標的配列特異性および塩基フリッピングの効果と合致させた。構造データおよび速度論的データを一緒にすることによって、酵素とＤＮＡとの間の特異的接触の形成および塩基フリッピングの順番も決定した。フリッピングした標的Ａｄｅが他の塩基結合部位に結合することは、塩基フリッピング経路における後半中間体候補を示唆している。「オーファン」Ｔｈｙは、らせん内またはらせん外の位置を取ることができる。
【００８１】
[00118] Ｈｉｓタグ−ＥｃｏＤａｍは、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）細胞で発現し、Ｎｉ^２＋アフィニティ、ＵｎｏＳ、およびＳ７５セファロースサイズ分画カラムを用いて精製される。０．５リットル誘導培養によって精製Ｈｉｓタグ−ＥｃｏＤａｍ 約７ｍｇが生じる。最後の精製ステップおよび濃縮中に、補因子アナログＡｄｏＨｃｙまたはシネフンギンはタンパク質に約２：１のモル比で添加される。濃縮した２要素複合体を、タンパク質対ＤＮＡ比約２：１でオリゴヌクレオチド２本鎖（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃによって合成された。）と混合し、結晶化前に少なくとも２時間氷上に静置した。結晶化のための最終タンパク質濃度は約１５ｍｇ／ｍＬである。ＡｄｏＨｃｙを用いた懸垂液滴結晶化では、３要素複合体結晶が、ＫＣｌ１００ｍＭ、ＭｇＳＯ_４１０ｍＭ、ＰＥＧ４００ ５〜１５％および緩衝液１００ｍＭ（ＭＥＳまたはＨＥＰＥＳ）ｐＨ６．６〜７．４の低塩条件下で出現した（表４のコグネイト結晶型）。シネフンギンを用いた結晶化試験では、３要素複合体結晶は同様の低塩条件下で成長したが、様々な格子定数を生じた（表４の非コグネイト結晶型）。
【００８２】
[00119] コグネイト３要素複合体の構造決定は、ＤｐｎＭ単量体構造（ＰＤＢ ２ＤＰＭ）（Ｔｒａｎ他、１９９８）のタンパク質座標を使用したＲＥＰＬＡＣＥプログラム（Ｔｏｎｇ ａｎｄ Ｒｏｓｓｍａｎｎ、１９９７）による分子置換法によって実施した。ＤｐｎＭモデルは、ＤｐｎＭを有するＥｃｏＤａｍのペアワイズ配列アラインメントに基づいて改変され、ＤｐｎＭ中の異なるアミノ酸は、ＥｃｏＤａｍ中のアミノ酸に変更され、プログラムＯ（Ｊｏｎｅｓ他、１９９１）を使用して最良の回転異性体が視覚的に与えられ、いくつかのアミノ酸がループ領域から除去された。ＤＮＡ分子は、種々の密度の異なる地図に手動で組み込まれた。精密化は、ＣＮＳプログラム（Ｂｒｕｎｇｅｒ他、１９９８）により実施された。非コグネイト３要素複合体の構造は、検索モデルとして精密化されたコグネイト複合体構造からタンパク質単量体を使用して決定された。
【００８３】
[00120] 部位特異的変異誘発は、文献（Ｊｅｌｔｓｃｈ ａｎｄ Ｌａｎｉｏ、２００２）に記載のように実施した。ＥｃｏＤａｍ野生型およびその変異体は、文献（Ｈｏｒｔｏｎ他、２００５）に記載のように精製した。ＤＮＡ結合は、ＢｉａＣｏｒｅＸ装置で表面プラズモン共鳴を使用して、文献（Ｈｏｒｔｏｎ他、２００５）に記載のように分析した。オリゴヌクレオチド基質（精製型をＴｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ、Ｄｒｅｉｅｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙから購入）のメチル化は、文献（Ｈｏｒｔｏｎ他、２００５）に記載のように実施した。メチル化実験は、［メチル−^３Ｈ］ＡｄｏＭｅｔ（ＮＥＮ）０．７６μｍを含有するＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）５０ｍＭ、ＮａＣｌ ５０ｍＭ、ＥＤＴＡ １ｍＭ、ＤＴＴ ０．５ｍＭ、ＢＳＡ ０．２μｇ／μｌ中で、３７℃で、文献（Ｒｏｔｈ ａｎｄ Ｊｅｌｔｓｃｈ、２０００）に記載のように行い、特異性分析のためにオリゴヌクレオチド基質０．５μＭおよび酵素０．６μＭを（図１５Ｂ〜Ｃ）、また、ヘミメチル化ＤＮＡとの相互作用の研究のために酵素０．２５μＭを（図１８）用いて、シングルターンオーバー条件下で実施した。２０塩基オリゴヌクレオチド基質の配列は、ＭがＮ６−メチル−Ａｄｅである５’−ＧＣＧＡＣＡＧＴＧＡＴＣＧＧＣＣＴＧＴＣ−３’および５’−ＧＡＣＡＧＧＣＣＧＭＴＣＡＣＴＧＴＣＧＣ−３’の２本鎖であった。さらに、第１、第３また第４の位置のＧＡＴＣとは１塩基対異なる、ニアコグネイト部位を備えた９種の基質を使用した。様々な変異体による標的配列の第１の位置の認識を比較するために、特異性因子は、その他の位置で改変された全てのニアコグネイト部位のメチル化速度と第１の位置で改変された基質のメチル化速度との比、すなわち、
[00121]
【数１】


と定義した。
【００８４】
[00122] 平衡状態の塩基フリッピングを測定するために、２ＡＰを含有するオリゴヌクレオチドの蛍光変化を、ＥｃｏＤａｍの非存在下および存在下で、ＡｄｏＨｃｙ １００μＭを含有するＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）５０ｍＭ、ＮａＣｌ ５０ｍＭ中で酵素２μＭおよびＤＮＡ ０．５μＭを用いて、周囲温度で検出した（図１７）。２ＡＰ蛍光は、Ｆ２８１０分光蛍光計（Ｈｉｔａｃｈｉ）で、３１３ｎｍで励起させた。放射スペクトルは、３２０〜５００ｎｍで記録した。放射および励起スリットは２．５ｎｍに設定し、データは、緩衝液試料単独による背景シグナルを差し引いた後の蛍光ピークを積分することによって分析した。塩基フリッピングの反応速度論は、ＳＦ−３ストップトフロー装置（ＢｉｏＬｏｇｉｃ、Ｃｌａｉｘ、Ｆｒａｎｃｅ）で、酵素およびＤＮＡを同濃度（３５０ｎＭ）で使用して、周囲温度で、文献（Ｌｉｅｂｅｒｔ他、２００４）に記載のように実施したストップトフロー実験で検討した。Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）５０ｍＭ、ＮａＣｌ ５０ｍＭおよびＡｄｏＭｅｔ １０μＭを含有する緩衝液中でこの酵素を予めインキュベートして、同緩衝液中でＤＮＡと迅速に混合した（図１７Ｃ）。２ＡＰ蛍光は３１３ｎｍで励起させ、放射は３４０ｎｍカットオフフィルターを使用して観察した。この実験の不感時間は３．１ｍｓであった。
【００８５】
[00123] ＥｃｏＤａｍ、ＡｄｏＨｃｙ、および中央に位置するＧＡＴＣ標的部位を１個含有する１２塩基オリゴデオキシヌクレオチド２本鎖を含有する３要素複合体を結晶化した（図１３）。２本鎖の末端配列は、ＤＮＡ２本鎖が逆向きに重なっているならば、２分子の結合部の配列がＧＡＴＣ標的部位を模倣するように選択された（図１４Ａ）。平滑末端オリゴヌクレオチドの設計は、Ｔ４Ｄａｍが２個の２本鎖の結合部に選択的に結合するという所見（Ｈｏｒｔｏｎ他、２００５）に基づいて行った。得られた結晶は、分解能１．８９ÅまでＸ線回折した（表５のコグネイト結晶型）。
【００８６】
[00124] 大腸菌Ｄａｍ結晶を生成することは困難で、特にＤＮＡ無しでは困難である。うまく結晶化したＴ４Ｄａｍから得られた知識を利用して、以下の特性、（１）結晶充填格子におけるＤＮＡ媒介タンパク質−タンパク質接触を最大化するのに最適な長さ、および（２）２個のＤＮＡ２本鎖が逆向きに重なる場合にＧＡＴＣ部位を模倣するオリゴヌクレオチドの２個の末端配列を有するオリゴヌクレオチドを設計した。したがって、１２塩基ＤＮＡ５’−ＴＣＴＡＧＡＴＣＴＡＧＡ−３’を使用する。さらに、隣接するＤＮＡ２本鎖の間の結合部全てと、中央ＧＡＴＣ部位とがＤａｍ分子によって占められるように、タンパク質対ＤＮＡ比（＞２：１）を変化させる。これらの特性によって、ＤＮＡおよびＡｄｏＨｃｙと複合体になったＥｃｏＤａｍをうまく結晶化させた。この結晶は、高い分解能でＸ線を回折した。特に、ａ＝４４．８Å、ｂ＝７０．２Å、ｃ＝９６．５Åの単位セルを有する斜方晶形態（空間群Ｐ２_１２_１２_１）は、ＰＥＧ４００ ５〜１５％、ＫＣｌ １００ｍＭ、ＭｇＳＯ_４ １０ｍＭおよび緩衝液（ＭＥＳまたはＨＥＰＥＳ）１００ｍＭ ｐＨ６．６〜７．４で成長した。分解能１．８９Åまで回折したデータセットを表５に示す。この構造を、初期検索モデルとしてＴ４Ｄａｍを使用して分子置換法によって解析し、このモデルをＲ因子０．１８６およびＲ−ｆｒｅｅ０．２１５まで精密に調べた（図１３）。
【００８７】
[00125] 同じ１２塩基対ＤＮＡによる異なる六方晶形結晶型（空間群Ｐ３_{（１、２）}２１）も、Ｌｉ（ＳＯ_４）_２ １．５Ｍ、ＭｇＳＯ_４ ５０ｍＭ、緩衝液（ＭＥＳまたはＨＥＰＥＳ）１００ｍＭ ｐＨ６．８〜７．２の条件下で観察した（単位セルａ＝ｂ＝１５９．５Å、ｃ＝９３．７Å）。
【００８８】
[00126] ＥｃｏＤａｍの全体構造：２個のＥｃｏＤａｍモノマー（分子ＡおよびＢ）および１個のＤＮＡ２本鎖は、結晶学的に対称な単位に含まれる。ＥｃｏＤｍａ分子Ａは、主として１個のＤＮＡ２本鎖に結合し、他方、ＥｃｏＤａｍ分子Ｂは、２個のＤＮＡ２本鎖の間の結合部に結合する（図１４Ｂ）。Ｔ４Ｄａｍ（Ｙａｎｇ他、２００３）のようなＥｃｏＤａｍは、２個のドメイン、すなわち、ＡｄｏＨｃｙの結合部位を有する７本鎖触媒ドメイン、および５個のヘリックス束およびＧＡＴＣ関連ＭＴアーゼオルソログのファミリーに保存されている（残基１１８〜１３９、図１４Ｂおよび１４Ｃの赤）β−ヘアピンループから成るＤＮＡ結合ドメイン、を含有する（Ｙａｎｇ他、２００３）。２個のタンパク質分子は、Ｃα原子の２４１対と比較して非常に類似しており、標準偏差は０．０７Åである。２個の領域、すなわち、活性部位Ｄ１８１−Ｐ−Ｐ−Ｙ１８４モチーフ（β４鎖の後ろ）直後の残基１８８〜１９７、およびβ６とβ７鎖の間の残基２４７〜２５９、が両分子中で不規則になっている（図１４Ｃおよび１４Ｄ）。
【００８９】
[00127] ＥｃｏＤａｍ−ＤＮＡリン酸相互作用：ＥｃｏＤａｍ分子は、１個のＤＮＡ２本鎖からにせよ（ＥｃｏＤａｍ分子Ａ）、２個の１２塩基ＤＮＡ２本鎖の間の結合部からにせよ（ＥｃｏＤａｍ分子Ｂ）、１０個の塩基対、フリッピングした標的Ａｄｅの５’側の４塩基対および３’側の５塩基対に及ぶ（図１４Ｅ）。両鎖のＡｄｅ残基に対する５’の５個のリン酸基は、１個のＥｃｏＤａｍ分子と接触する。非標的鎖とのリン酸相互作用は、標的鎖との相互作用よりも重要であると考えられる。これは、リン酸基と直接相互作用をする側鎖の中には４個の保存された残基（Ｒ９５、Ｎ１２６、Ｎ１３２およびＲ１３７）があり、いずれも、非標的鎖の４番目のＧＡＴＣ塩基対のＧｕａに隣接した３個の連続したリン酸基と相互作用する（図１４Ｅ）。
【００９０】
[00128] ＥｃｏＤａｍ−ＤＮＡ塩基相互作用：メチル化標的、ＧＡＴＣの２番目の塩基対のＡｄｅ（Ａｄｅ２）は、ＤＮＡらせんからフリッピングする（図１５Ａ）。この部位の残りの塩基との特異的な相互作用は、ＤＮＡの主溝で起こる。Ｔ４Ｄａｍのように、βヘアピンのアミノ酸残基（図１５Ｂの赤）は塩基特異的相互作用の大部分を占めるが、Ｎ末端ループのＫ９も塩基接触を形成する（図１４Ｃの青緑色）。２つの領域−βヘアピンおよびＮ末端ループ−は、主鎖アミド窒素およびＫ９のカルボニル酸素と、Ｎ１１５側鎖カルボニルおよびアミドとの、各々の水素結合を含む多くの分子内相互作用によって互いに固く結合している（示さず）。以下の項で、第１、第３および第４塩基対のＥｃｏＤａｍ認識、ならびにタンパク質側鎖挿入およびＤＮＡ塩基フリッピングを含む標的塩基対との相互作用を説明する。
【００９１】
[00129] Ｎ−末端Ｋ９による第１塩基対の認識：第１の塩基対の認識は、Ｔ４ＤａｍとＥｃｏＤａｍとの間の最も興味深い変動の１つである。Ｔ４Ｄａｍ構造において、ＧＡＴＣ部位の第１のＧｕａは、Ｇｕａ１のＮ７およびＯ６原子に対する分岐した水素結合でＲ１３０と接触する（Ｈｏｒｔｏｎ他、２００５）。Ｒ１３０はβヘアピンの末端に位置するが、Ｄａｍ関連ＭＴアーゼ中では保存されていない（図１６Ａ）。以前に、第１の塩基対の認識における役割について、ＥｃｏＤａｍ Ｙ１３８（アラインメントに基づいて、Ｔ４ＤａｍのＲ１３０に直接対応する。図１６Ａ）、および隣接する２個の残基−Ｒ１３７およびＫ１３９−の関連を調べたが、これらの残基をＡｌａに変化させてもＥｃｏＤａｍのＤＮＡ認識に強い影響を及ぼさなかった（Ｈｏｒｔｏｎ他、２００５）。ＥｃｏＤａｍ構造は、Ｇｕａ１が、それぞれＮ７およびＯ６原子によって、２個の側鎖、Ｋ９およびＹ１３８と相互作用することを示している（図１５Ｃ）。ＥｃｏＤａｍＫ９に対応する位置で、Ｔ４Ｄａｍは、β炭素がＤＮＡの方を向くが、ＤＮＡと接触しないＡｌａを有する（図１６Ａ）。ＥｃｏＤａｍＫ９Ａ変異体では、触媒活性（野生型の約６０％）（図１６Ｂおよび１６Ｃの水色の棒を比較する。）およびＤＮＡ結合（約７０％）が少し減少している（データは示さず）。
【００９２】
[00130] ＥｃｏＤａｍによるＤＮＡ認識をさらに調べるために、標準２本鎖のＤＮＡメチル化速度を変異２本鎖と比較した（図１６Ｂ）。いずれも１個のヘミメチル化標的を含有し、ＤＮＡの１本鎖のみがメチル化を受けるようにしている。これらの変異２本鎖は、標的配列の１番目、３番目または４番目いずれかの塩基対に１個の塩基の置換を含有し、これらの変異部位を本明細書では「ニアコグネイト」部位（全部で９個）と称する（図１６Ｂ）。結果は、ＧＡＴＣと比較して、第１の位置に塩基対置換を有するニアコグネイト基質のメチル化は、野生型ＥｃｏＤａｍにより、１００〜１０００倍遅い速度でメチル化されたことを示している（図１６Ｂ）。対照的に、Ｋ９Ａ変異体は、第１の塩基対において特異性の欠如を示した。これは、ＧＡＴＣと比較して、ＣＡＴＣのメチル化速度は４倍しか減少せず、ＡＡＴＣおよびＴＡＴＣメチル化は１０倍しか減少しなかったことによる（図１６Ｃ）。さらに、Ｋ９Ａ変異体は、３番目または４番目の塩基対に置換を有するニアコグネイト部位のいずれもメチル化することができず、これらの位置の区別の増強が示された。これはおそらく、触媒に必要ないくつかの他のタンパク質−ＤＮＡ接触の（ＤＮＡ配列の変異による）阻害によるものであろう。
【００９３】
[00131] Ｇｕａ１を認識するための特異性因子（Ｓ１）は、Ｋ９Ａについて計算されており、第１の塩基対に改変を有するニアコグネイト基質全てのメチル化速度の平均を、その他のニアコグネイト基質全てのメチル化速度の平均で除することによって得られる。Ｓ１に基づくと、野生型ＥｃｏＤａｍと比較して、Ｋ９Ａでは第１塩基対の認識が少なくとも８００倍減少していたが（図１６Ｄ）、その他の変異体は全てほんの僅かな効果を示した。これらの結果は、（Ｎ７原子を介した）ＥｃｏＤａｍ Ｋ９−Ｇｕａ１接触が、ＧＡＴＣにおける第１塩基対の認識に重要であることを示唆している。Ｙ１３８Ａ（Ｇｕａ１のＯ６原子との相互作用が欠如している。図１５Ｃ）およびＮ１２０Ａ（Ｇｕａ１とのπスタッキングを欠如している。図１５Ｂ）はまた、特異性因子Ｓ１の小さな変化を示したが、これは、Ｓ１がＧｕａ１近傍の３個の側鎖全てを正確に識別したことを示唆している。
【００９４】
[00132] 標的Ａｄｅと塩基フリッピングとの相互作用：合成オリゴデオキシヌクレオチド２本鎖へのヌクレオチドアナログ２−アミノプリン（２ＡＰ）の組み込みは、２ＡＰ蛍光が、２重らせんＤＮＡの重なった環境から除去されると劇的に増加する（Ｗａｒｄ他、１９６９）ことから、塩基フリッピングなどの立体構造変化を詳しく調べるために広く使用されている（Ａｌｌａｎ他、１９９８、Ａｌｌａｎ ａｎｄ Ｒｅｉｃｈ、１９９６、Ｈｏｌｚ他、１９９８、Ｓｔｉｖｅｒｓ、１９９８）。標的Ａｄｅの位置に２ＡＰを有するヘミメチル化Ｇ−２ＡＰ−ＴＣ基質の蛍光変化は、ＥｃｏＤａｍによる塩基フリッピングと関連していた（Ｌｉｅｂｅｒｔ他、２００４）。ＥｃｏＤａｍによる塩基フリッピングには、（ｉ）ＤＮＡらせんの外に標的塩基がフリッピングするステップ、および（ｉｉ）フリッピングした塩基が（Ｄ１８１−Ｐ−Ｐ−Ｙ１８４モチーフによって形成された）酵素の活性部位ポケットに結合するステップ、の２つのステップが含まれる。標的塩基のフリッピングによって、蛍光の強い増加を引き起こす、隣接塩基とＡｄｅとの重なり相互作用の完全な消失がもたらされる。フリッピングした塩基が活性部位ポケットに結合する間に、芳香族残基に重なり、それによってこの捕捉ステップの間に２ＡＰ蛍光の減少が引き起こされる（Ｌｉｅｂｅｒｔ他、２００４）。ヘミメチル化Ｇ−２ＡＰ−ＴＣ基質による迅速な反応速度論的測定によって、ＡｄｏＭｅｔの存在下では、ＥｃｏＤａｍによる塩基フリッピングは２相性のプロセスであることが示された（図１７Ｃ）。最初のフリッピングは非常に速かったが、フリッピングした塩基の活性部位ポケットへの挿入は遅かった。しかし、補酵素ＡｄｏＭｅｔの非存在下、またはＡｄｏＨＣｙの存在下では、ゆっくりした蛍光減少は認められなかった。このことは、フリッピングした標的塩基の活性部位ポケットへの結合は、ＡｄｏＭｅｔがこの酵素に結合しなければ起こらないことを示唆している（Ｌｉｅｂｅｒｔ他、２００４）。
【００９５】
[00133] これらの所見と合致して、ＡｄｏＨｃｙの存在下で形成される一般的な構造では、フリッピングした標的Ａｄｅは、活性部位ポケットの外側のタンパク質表面（Ｙ１８４およびＨ２２２の側鎖）に対向した位置を取る（図１５Ａ、左図）。Ｈ２２２のイミダゾール環は、Ａｄｅ環と共に陽イオンπ相互作用を形成する。さらに、環窒素原子Ｎ１およびＡｄｅの環外アミノ窒素Ｎ６原子はそれぞれ、主鎖アミド窒素およびＶ２６１のカルボニル酸素と水素結合を形成する。Ｔ４Ｄａｍ複合体とＤＮＡ立体構造とを比較する（Ｈｏｒｔｏｎ他、２００５）と、たった３個の２面結合の周りの単純だが大きな回転（＞１２０°）が、フリッピングしたＡｄｅの活性部位ポケットへの挿入を促進することが明らかとなる（図１５Ａ、右図）。
【００９６】
[00134] フリッピングしたＡｄｅが活性部位に結合しない構造が存在することによって、一連の中間体によって塩基のフリッピングが生じることが示唆される（Ｂａｎｅｒｊｅｅ他、２００５、Ｈｏｒｔｏｎ他、２００４、Ｌｅｉｂｅｒｔ他、２００４）。ここで観察されたＥｃｏＤａｍ複合体におけるＡｄｅ結合様式によれば、Ａｄｅフリッピング経路の後半の中間体、すなわち、活性部位ポケットに塩基が挿入される直前の中間体を模倣することができる。あるいは、この立体構造は、活性部位ポケットから遊離した直後に形成された中間体と考えることができる。したがって、生成物ＡｄｏＨｃｙは、フリッピングしたＡｄｅが活性部位ポケットに結合する前に、ＡｄｏＭｅｔと交換するために、酵素に合図を送ることができると推論した。この結合は、活性部位近傍のループの動的立体構造によって媒介されることができ（図１４Ｄ）、Ｔ４Ｄａｍ中の対応するループは、結合した補因子といくつかの芳香族残基と接触する（Ｙａｎｇ他、２００３）。このループは、このＥｃｏＤａｍモデルにおいては構造化されてないが、ＡｄｏＭｅｔ結合後に安定した構造を取ることができ、これはフリッピングしたＡｄｅの活性部位ポケットへの挿入の引き金となり得る。
【００９７】
[00135] オーファンＴｈｙとの相互作用：２重塩基フリッピング：オーファンＴｈｙ（フリッピングしたＡｄｅに対向する。）の立体構造は、分子Ａと分子Ｂとでは、形成されたＥｃｏＤａｍ−ＤＮＡ複合体が大きく異なることを示す。意外なことに、分子Ａでは、中心のオーファンＴｈｙもＤＮＡらせんの外にフリッピングし、Ｒ１３７のグアニジノ基とのπ重なり相互作用によって安定化される（図１５Ｄ）。対照的に、分子ＢのオーファンＴｈｙはＮ１２０のアミド側鎖と水素結合する（図１５Ｇ）。ここで、Ｎ１２０は、フリッピングしたＡｄｅによって形成されたらせん空間にその側鎖を挿入する。これらの結果は、オーファンＴｈｙが少なくとも２個の異なる立体構造を取ることができることを示している。そこで、Ｔｈｙ−フリッピングが溶液中で起こるかどうかを調べた。このために、オーファンとなるべきＴｈｙの代わりに置換された２ＡＰを有する基質を使用した。ＡｄｏＨｃｙが存在する平衡結合条件下では６倍の蛍光増加が認められ（図１７Ａ）、これは、Ｔｈｙ重なり相互作用の著しい減少を示している。（分子Ｂが結合した）ＤＮＡ結合部のらせん内立体構造では、Ｔｈｙの重なり相互作用の明瞭な変化がなく、ＤＮＡ立体構造の変化（折れ曲がりまたは巻き戻し）もないので、タンパク質誘導性の蛍光強度変化は、Ｔｈｙフリッピングが溶液中でも起こることを示唆している。高速反応速度実験は、ＡｄｏＭｅｔ存在下でもＴｈｙフリッピングが起こることを示している。Ｔｈｙフリッピングは、標的Ａｄｅフリッピングよりも遅いので、２つの事象は結合していないことが示唆される（図４Ｃ）。Ｔｈｙフリッピングはまた、Ｒ１３７Ａ変異体で認められる（データは示さず）が、このことは、フリッピングしたＴｈｙのＲ１３７へのドッキング（図１５Ｄ）はフリッピングに必要でなく、フリッピングしたＴｈｙには他の代替らせん外立体構造が存在し得ることを示している。
【００９８】
[00136] Ｙ１１９挿入は、塩基フリッピングに必要である：Ｙ１１９芳香族環はＤＮＡ２本鎖に挿入され、ＧＡＴＣの３番目の塩基対と、結合部のＴｈｙ：Ｎ１２０「塩基性アミノ酸」対（図１５Ｈ）または中心のＮ１２０の側鎖（図１５Ｂ）と、の間に重なり、らせん上昇部において局所的な重なりを生じる。ＤＮＡ２本鎖の中央および末端におけるらせん延長は、ＤＮＡの長さを効果的に延長し、その結果、１４塩基対に相当することになり、約４６Åの長さで結晶ａ軸と一致する。以前に、Ｙ１１９のＡｌａによる置換は、触媒活性の強い減少をもたらすことが示されている（Ｈｏｒｔｏｎ他、２００５）。蛍光研究によって、ＡｄｏＨｃｙ（図１７Ｂ）およびＡｄｏＭｅｔ（データは示さず）のいずれかが存在すると検出可能な塩基フリッピングがほとんど完全に消失すること、Ｙ１１９Ａが、塩基フリッピングの（Ｒ１２４に次いで）２番目に重要な残基であることが明らかになった（図１７Ｂ）。したがって、Ｙ１１９のＤＮＡへの挿入は、塩基フリッピングに必要な現象である。Ｎ１２０のＤＮＡらせんへの侵入はあまり重要ではない。Ａｌａで置換されると、触媒活性（Ｈｏｒｔｏｎ他、２００５）およびＡｄｅフリッピングは約２〜３倍減少するにすぎない（図１７Ｂ）（Ｈｏｒｔｏｎ他、２００５）。
【００９９】
[00137] 第３の塩基対の認識：非メチル化およびヘミメチル化ＤＮＡの区別。ＧＡＴＣの第３の塩基対は、Ｌ１２２およびＰ１３４の２個の疎水性側鎖とファンデルワールス接触を形成する（図１５Ｅ）。ＤＮＡ複製中に生じたヘミメチル化ＧＡＴＣ部位は、Ｄａｍ ＭＴアーゼの天然のｉｎ ｖｉｖｏ基質である。メチル基を、Ａｄｅ３の環外アミノ窒素Ｎ６原子に合わせた（図１５Ｅ）。メチル基は、Ｌ１２２およびＰ１３４の側鎖間に位置するが、Ｌ１２２−ＣＨ_３接触距離（約３．６Å）は、Ｐ１３４−ＣＨ_３の接触距離（約４．９Å）よりもずっと短い。そこで、ＥｃｏＤａｍのヘミメチル化ＤＮＡ２本鎖との相互作用に対する残基Ｌ１２２の影響について検討した。図１８Ａに示すように、非メチル化基質でのメチル転移速度は、ヘミメチル化基質での速度のほぼ２倍であった。この発見は、非メチル化基質の標的部位の数はヘミメチル化基質の２倍なので、予測通りである。最初のＥｃｏＤａｍ結合が２本鎖に関して無作為ならば、非メチル化基質への各々の結合現象は増殖的で、メチル化を誘導する。対照的に、ヘミメチル化基質への結合現象が５０％であれば、ＥｃｏＤａｍはメチル化Ａｄｅが標的位置に存在するように配置されるので、非増殖的である。しかし、Ｌ１２２Ａ変異体は劇的な作用の変化を示した（図１８Ｂ）。すなわち、非メチル化ＤＮＡにはほとんど活性が無いが、ヘミメチル化基質を野生型ＥｃｏＤａｍと同様の速度で改変した。
【０１００】
[00138] Ｌ１２２Ａの触媒特性のこの著しい変化の機構は、明らかではない。特定の理論に結びつけることは望まないが、１２２位のＡｌａはメチル化Ａｄｅ３のメチル基と相互作用し、Ｌ１２２とＴｈｙ３との間の接触の欠如を補うものと仮定する（図１５Ｅ参照）。興味深いことには、脂肪族炭水化物側鎖の大きさを減少させる点突然変異（Ｌ１２２Ａ）は、ＥｃｏＤａｍを、ヘミメチル化ＤＮＡへの著しい選択性を有し、確実に維持されるＭＴアーゼに変換するのに十分である。哺乳類が保持するＭＴアーゼ、Ｄｎｍｔ１は、非メチル化ＣｐＧ部位よりもヘミメチル化ＣｐＧ部位に高い選択性を有し（Ｆａｔｅｍｉ他、２００１、Ｈｅｒｍａｎｎ他、２００４）、哺乳類におけるＣｐＧメチル化パターンの伝播に中心的な役割を果たす（Ｇｒａｃｅ Ｇｏｌｌ ａｎｄ Ｂｅｓｔｏｒ、２００５）。Ｄｎｍｔ１のこの選択性の基礎となる機構は知られていないが、ヘミメチル化ＣｐＧ部位にメチル基が１個存在することによる酵素の選択的活性化がベースとなるに違いない。我々の結果は、このような１個のメチル基の認識の一例となる。
【０１０１】
[00139] 第４塩基対の認識：特異的ＤＮＡ相互作用の第１ステップ：ＧＡＴＣの第４塩基対のＧｕａは、分岐した水素結合パターンでＯ６およびＮ７原子を介してＲ１２４のグアニジノ基と相互作用する（図１５Ｆ）。Ｒ１２４−Ｇｕａ４相互作用は、Ｔ４Ｄａｍで認められるものと同一で、Ｒ１２４はＥｃｏＤａｍによるＤＮＡ認識に重要な役割を果たすことを既に示した（Ｈｏｒｔｏｎ他、２００５）。Ｒ１２４Ａ変異体は、触媒活性が全体的に減少しているが、２個のニアコグネイト基質（ＧＡＴＴおよびＧＡＴＧ）を標準ＧＡＴＣよりも速くメチル化し、Ｒ１２４とＧｕａ４との相互作用（「区別型接触」）が酵素の触媒性を活性化するために必要であることを示している（Ｈｏｒｔｏｎ他、２００５）。
【０１０２】
[00140] 図１７Ｄに示したように、野生型ＥｃｏＤａｍは、第３または第４塩基対に配列変化を含有する基質では２ＡＰ蛍光に検出可能な変化を示さないが（図１７Ｄの緑または赤の線）、塩基フリッピングは、第１の塩基対に塩基置換を含有する基質で生じる。逆に、触媒活性の著しい減少と相関する塩基フリッピングシグナルは、Ｒ１２４Ａ変異体では検出されなかった（図１７Ｅ）。
【０１０３】
[00141] これらの発見は、ＤＮＡ認識とＥｃｏＤａｍによる塩基フリッピングの間につながりがあることを示している。βヘアピンループと認識配列の後半（第３および第４塩基対）との間の接触は、標的配列に対する酵素の配置に必要である。特に、Ｇｕａ４塩基はＲ１２４によって接触し、その隣接するリン酸は保存された残基（前記参照）によって接触し、塩基フリッピング（Ｙ１１９など）およびＤＮＡ認識（Ｌ１２２およびＰ１３４など）に関与するその他の残基がＤＮＡに接近し、塩基フリッピングを誘導するように、ＥｃｏＤａｍをＤＮＡ２本鎖に配置すると仮定する。この知識はさらに、次の構造によって支持される。
【０１０４】
[00142] 非標準部位との相互作用：ｐａｐ発現調節への関与：第２の結晶型は、ＡｄｏＭｅｔアナログシネフンギン（アデノシルオルニチン）の存在下で生じ（表４）、結晶化では同様の１２塩基対平滑末端オリゴデオキシヌクレオチド２本鎖である。予想外のことが少なくとも３つ認められた。第１に、ＥｃｏＤａｍ分子（図１４に示したＡおよびＢ分子と区別するために分子Ｃと称する）は、隣接するＤＮＡ２本鎖の間の結合部に結合し、ＥｃｏＤａｍ分子は２本鎖の中央の特異的ＧＡＴＣ部位には結合しなかった（図１９Ａ）。第２に、各ＤＮＡ２本鎖は、結晶ａ軸にそって逆向きに重なった塩基対を１２個ではなく１１個だけ形成し、その長さは約３６Åであった（塩基対当たりの平均らせん上昇約３．３Å）。この短さのために残された空間は、第２のＥｃｏＤａｍ分子がＤＮＡ２本鎖の中央に結合するには不十分であった。第３に、その電子密度地図は、各ＤＮＡ２本鎖の末端の２個の３’Ａｄｅ塩基がフリッピングし（１個は不規則になり、もう１個は安定化する）、２個の５’Ｔｈｙ塩基が２本のＤＮＡ分子の結合部でＴ：Ｔミスマッチを形成することを示している（図１９Ｂ）。両Ａｄｅがらせん外になる原因が何かははっきりしない。
【０１０５】
[00143] 結合部の５個の塩基対、緑色のＤＮＡの３個、Ｔ：Ｔミス対合および青色のＤＮＡの１個（非標準部位と称する）は、分子Ｃと接触する（図１９Ｃ）。５’Ｇｕａ（青色のＤＮＡ）とＲ１２４との相互作用（図１９Ｃ）およびその５’リン酸の相互作用は、分子ＡおよびＢの相互作用と同一である。Ａｄｅ３を置換するＴ：Ｔ対合ミスの１Ｔｈｙは、Ｌ１２２およびＰ１３４とファンデルワールス相互作用する（図１９Ｄ）。挿入（Ｙ１１９）、塩基−アミノ酸対（Ｎ１２０）および第１の塩基対認識（Ｋ９およびＹ１３８）に関与することが既に確認されているその他の残基は、緑色のＤＮＡの主溝に位置する。それらは、まるでＤＮＡに侵入するように位置しているが、その役割はリン酸接触（Ｙ１１９およびＫ９）、塩基接触（Ｎ１２０）または水媒介ＤＮＡ相互作用（Ｙ１３８）に替わった（図１９Ｅ〜Ｈ）。他の塩基接触は、緑色のＤＮＡの側溝においてＲ２４９によって形成され（図１９Ｇ）、分子ＡおよびＢのβ６およびβ７鎖の間の不規則なループの一部となる。これらを考え合わせると、このような部位を設計する意図はなかったが、これらの相互作用は、ＥｃｏＤａｍが５’−ＴＡＧＴＣ−３’または５’−ＧＴＣＴＡ−３’の非標準配列に結合できること（図１９Ｉ）を示唆している。
【０１０６】
[00144] Ｐａｐレギュロンは、２個のＧＡＴＣ部位を含有する（図１９Ｊ）。大腸菌ゲノムのほとんどのＧＡＴＣ部位とは対照的に、これらの部位はＤＮＡ複製後に常に完全にメチル化されるのではなく、それらのメチル化状態は、ＤＮＡ配列変化なしに生じる線毛形成の相変異を部分的に決定する（Ｈｅｒｎｄａｙ他、２００３）。したがって、これらの部位のメチル化が不十分なのは、ＥｃｏＤａｍの接近を遮断する調節タンパク質の結合か（Ｈｅｒｎｄａｙ他、２００３）、またはＤＮＡの特定の配列によるこれらの部位での酵素活性の固有の欠如によるものであり得る。興味深いことに、最近の研究で、これらの２個の部位のメチル化は、任意の調節因子がなくては非連続的であることが示され、このことは、これらのＧＡＴＣ部位に隣接する配列はＥｃｏＤａｍの連続性を妨害することができることを示唆している（Ｍａｓｈｈｏｏｄ他、２００４）。これは、ＥｃｏＤａｍが特定のＧＡＴＣをメチル化する能力はすぐ隣りのＤＮＡ配列に左右されるという以前の所見を連想させる（Ｂｅｒｇｅｒａｔ他、１９８９）。Ｐａｐ ＧＡＴＣ隣接配列を調べた後（図１９Ｊ）、非標準ＴＡＧＴＣ部位と類似性が高い配列エレメント（ＴＡＧＡＣまたはＴＡＡＡＣ）がＧＡＴＣ部位のすぐ隣りに存在することが発見されたことは驚くべきことであった（図１９ＩおよびＪ）。２個のＴＡ（Ｇ／Ａ）ＡＣエレメントは、方向が反対で、第３の塩基対とは異なり、非標準複合体の構造では直接塩基接触をしない（図１９Ｅ）。これらの潜在的ＤＮＡ結合エレメントの同定に励まされて、ＥｃｏＤａｍ調節プロモーターに関する文献を検索し、このエレメント（ＴＡＮＡＣ）が多くの場合に存在することを発見した（表６）。これらのデータによって、ＧＡＴＣ部位に結合する前、またはＧＡＴＣ部位から離れた後に、ＴＡＮＡＣエレメントはＥｃｏＤａｍを捕捉できる可能性が生じる。このエレメントはｐａｐｌ応答エレメントと重複するので（Ｈｅｒｎｄａｙ他、２００３）、捕捉されたＥｃｏＤａｍは、Ｌｒｐ−ｐａｐｌ結合を妨害し、Ｐａｐ発現の調節に寄与することができた。
【０１０７】
[00145] 塩基フリッピングとＤＮＡ認識のつながり：ＤＮＡメチル化の最大の謎は、ＤＮＡ ＭＴアーゼが認識配列内の標的塩基のフリッピングを引き起こす機構に関する。コグネイトおよび非コグネイト複合体のこの構造は、このプロセスにいくらかの光を投げかけてくれる。（分子Ｃが結合した）非標準部位におけるＤＮＡ立体構造と（分子ＡまたはＢが結合した）標準部位における立体構造とを比較すると、ＤＮＡ認識の初期段階および塩基フリッピングの最終段階で起こる詳細な立体的変化が明らかとなる。図２０Ａは、重なりを測定するためだけにＲ１２４：Ｇｕａ４対を使用して、２個のＥｃｏＤａｍ（分子ＡおよびＣ）の最小二乗による重なりを示す。タンパク質成分は、非コグネイト複合体からコグネイト複合体へのＤＮＡに対する固いヒンジの動きを示し、ＤＮＡ接触面のＮ末端ループは約４Å動き、ＤＮＡから離れた外面の残基は約８〜９Å動いた（２個のタンパク質成分の間の全体標準偏差約０．３Åを比較する）。２個のＤＮＡ２本鎖は、第４の塩基対を含む右半分の相互作用パターンにおいて高い一致を示し（図２０Ｂの右側）、非標的鎖の主鎖は、Ｒ９５との静電的相互作用、Ｎ１２６、Ｎ１３７の側鎖との水素結合相互作用、Ｌ１２７の主鎖および保存的Ｇｕａ４−Ｒ１２４相互作用によって定位置に保持されている。その一方で、左半分のらせん構造（図２０Ｂの左側）は、２つの構造で著しく異なっている。主鎖立体構造を調べると、らせん軸に沿って（Ｙ１１９挿入による）非標準２本鎖の左側部は移動し、らせん軸の周りに約３０°回転すると標準複合体の立体構造が生じることが明らかである（図２０Ｃ）。このプロセスにおいて、タンパク質成分は目立った立体的変化を必要とせず、（図２０Ｂに示したＹ１１９などの）極めて重要な側鎖のほとんど全ては、両複合体のＤＮＡ主溝に並ぶ。Ｙ１１９およびＫ９の役割は、非標準複合体中ではＤＮＡリン酸との相互作用であるが、標準複合体中では特異性の高い結合様式に換わる。（ＤＮＡらせんに深く貫通する）Ｙ１１９による挿入は、両鎖にらせんがつながるのを遮断し、ＤＮＡ分子の一塩基対延長を促すのに欠かせないステップで、Ｇ：Ｃ塩基対とＫ９およびＹ１３８の側鎖との間の妥当な接触ならびに第２の塩基対における基質Ａｄｅの塩基フリッピングを引き起こす。興味深いことには、非コグネイト複合体における５−塩基対認識の長さは、コグネイト複合体における４−塩基対および１挿入ステップと同様である。
【０１０８】
[00146] 塩基フリッピングとＤＮＡ認識のつながりを研究するために、（第３の塩基対における区別の減少を示す）Ｐ１３４ＧおよびＰ１３４Ａならびに（第１の塩基対の認識を緩和する）Ｋ９Ａによる特異性改変を伴ったＥｃｏＤａｍ変異体による塩基フリッピングを調べた。高い触媒活性と合致して、Ｐ１３４Ｇ（図１７Ｆ）およびＰ１３４Ａ（データは示さず）では、蛍光変化の大きさには少しだけ減少が見られたが、塩基フリッピングの反応速度論における変化は検出されなかった。しかし、両変異体は、第３の塩基対において配列が改変した基質の塩基フリッピングを誘導したが（図１７Ｆの緑色の線）、これは野生型ＥｃｏＤａｍ（図１７Ｄの緑色の線）では生じなかった。Ｋ９Ａは同様の挙動を示した。標的部位の最初の位置に塩基対置換を有する基質の塩基フリッピングは、野生型ＥｃｏＤａｍよりも効果的であった（図１７Ｇおよび図１７Ｄにおける青緑色の線と比較）。これらの変異体の特異性の変化は、ニアコグネイト部位においてフリッピングしたＡｄｅの変化に基づくものと結論する。
【０１０９】
[00147] 図２０に示した構造比較および前述の考察に基づいて、右側のＤＮＡ−Ｒ１２４−Ｇｕａ４の非標的鎖に対する接触およびその５’リン酸相互作用は、おそらく標的塩基Ａｄｅ２が実際にフリッピングする前に、認識経路の初期に確立される。ＤＮＡに対して酵素が密接に接近するには、次に第３の位置におけるＴ：Ａ塩基対が必要である。次いで、Ｙ１１９およびＮ１２０はＤＮＡに挿入することができ、塩基フリッピングが生じる。第１の塩基対に対する接触は、その後確立される。したがって、ＥｃｏＤａｍの特異的複合体の形成は、第４の塩基対から第１の塩基対までジッパーが閉じるのに似ている。左側の相互作用は、固くかみ合っており、フリッピングしたＡｄｅは、活性部の外側の端に位置しており（図１５Ａ、左図）、らせん外ヌクレオチドにおいてＤＮＡ主鎖の周りに結合が単純回転することによって、標的Ａｄｅが活性部位に入る。この動きは、活性部位直後の非構造ループが規則正しくなり、閉じた活性部位の形成を可能にする場合のＡｄｏＭｅｔ結合後にのみ生じる。オーファンＴｈｙの柔軟な立体構造が、塩基フリッピングプロセスの動力学において役割を果たし得る。これらの現象が起こった後でのみ、標的Ａｄｅは活性部位に入り、ＡｄｏＭｅｔからのメチル輸送の触媒が生じる（図１５Ａ、右図）。３’末端におけるＲ１２４−Ｇｕａ相互作用も必要な非コグネイトエレメント、ＴＡ（Ｇ／Ａ）ＡＣへの結合は、Ｄａｍ調節プロモーターにＥｃｏＤａｍを捕捉し、ＥｃｏＤａｍ連続性に影響を及ぼし、遺伝子発現の調節に寄与する。
【０１１０】
[00148] インシリコスクリーニング（ＩＳＳ）（実施例３参照）によって同定された化合物は、Ｄａｍとの共結晶化することによってさらに構造的に研究することができる。これらの共結晶から得られた構造情報は、より望ましい特性を備えた化合物ライブラリーの合成によって、同一のコア化学構造に関する誘導体を生じる構造的変動部位を同定するために、使用することができる。
【０１１１】
[00149] ＤＮＡメチル化の連続性を解決するための変異Ｄａｍまたはｐａｐ関連ＧＡＴＣ基質の結晶化：ＥｃｏＤａｍは、高い連続的反応でＤＮＡをメチル化する（Ｕｒｉｇ他、２００２）。各メチル化現象の後で、補酵素生成物ＡｄｅＨｃｙは次の反応の前にＡｄｏＭｅｔと交換しなければならない。連続的メチル化には、酵素がＤＮＡに結合している間にこの交換が起こることが必要である。ＤＮＡに沿って酵素が滑るように動くのを妨げ、および／またはＡｄｏＨｃｙ／ＡｄｏＭｅｔ交換を遮断する阻害剤は連続性に影響を及ぼし、それによってメチル化を阻害することができる。
【０１１２】
[00150] Ｔ４Ｄａｍ構造において、チャンネルは補酵素結合部位および溶媒に連結する（示さず）。ＤＮＡから酵素を遊離せずに補酵素の交換を可能にすることができるので、このチャンネルは、Ｄａｍによる連続的メチル化に重要である。本発明の状況において、このチャンネルはＤａｍに特有の他のドッキング部位を形成し、より特異的な阻害剤が発見される可能性がある。これらの阻害剤は、ＡｄｏＨｃｙ／ＡｄｏＭｅｔ交換を妨害するか、ＡｄｏＭｅｔ結合ポケット内に広がって立体的にＡｄｏＭｅｔ結合を妨害することができる。これらの可能性のある作用様式は、ＡｄｏＭｅｔ結合およびＤＮＡメチル化の連続性に対する阻害剤の効果を比較することによって区別することができる。Ｉｌｅ５１は、Ｔ４Ｄａｍにおいてチャンネルの１つの壁を形成する。チャンネルを遮断し、連続性を妨害しようと、ＴｒｐおよびＡｒｇに対応する残基（ＥｃｏＤａｍのＩｌｅ５５）を変化させた。最初の結果は、Ｉ５５Ｗ置換によるチャンネルの遮断が活性を強く損なわせることを示す。Ｉ５５Ｒ変異体は、短いオリゴヌクレオチド基質に対して野生型酵素と同じ活性である。Ｉ５５Ｒ変異体の連続性は、Ｕｒｉｇ他（２００２）に記載されたアッセイを使用して調べられ、両変異体に対するＡｄｏＭｅｔ結合のＫ_ｄを測定する。補酵素とこれらの変異体の共結晶構造は、これらの置換が補酵素相互作用に影響を及ぼすかどうか、どのように影響を及ぼすかを示す。このチャンネルが本当に補酵素結合／交換に影響を及ぼすならば、他のＤａｍ阻害剤を同定するためにこの部位のＩＳＳを実行することができる。
【０１１３】
[00151] Ｐａｐレギュロンは、１０３ｂｐ離れた２個のＧＡＴＣ部位を含有する（図２１）。これら２個のＧＡＴＣ部位のメチル化状態は、ＤＮＡ配列変化がなくても生じる繊毛形成の相変異を部分的に決定する（Ｈｅｒｎｄａｙ他、２００３）。Ｈｅｒｎｄａｙ他（２００３）に基づいて、ＥｃｏＤａｍがこの部位の１つのみをメチル化する理由は、調節タンパク質ＬｒｐおよびＰａｐＩ結合およびＤａｍ接近の遮断による。しかし、最近の研究で、これらの２個の部位のメチル化は、ＬｒｐまたはＰａｐＩがなくては非連続的であることが示され、このことは、これらのＧＡＴＣ部位に隣接する配列はＥｃｏＤａｍの連続性を妨害することができることを示唆している（Ｍａｓｈｈｏｏｎ他、２００４）。この発見を再現し、その機構を調査することができる。１つの可能性は、両ＧＡＴＣ部位に隣接する保存配列は酵素との他のＤＮＡ相互作用を形成し、最初の結合または生成物の遊離を妨害することで、両方とも連続性に影響を及ぼす。あるいは、（１０３ｂｐ離れた）２個のＰａｐ部位の間の配列は、酵素の効果的な滑りを妨害し、それによって連続的メチル化を妨害することができた。これら２つのモデルの間を区別するために、Ｐａｐ基質の２種のキメラ基質および通常のＤＮＡ配列を作製することができる（図２１Ｃ）。１基質は、正常なＤＮＡ配列に連結した５隣接塩基対を有する２個のＰａｐＧＡＴＣ部位を含有し、他方、その他はｐａｐ中間体配列によって分離された２個の正常なＤａｍ部位を含有する。ＥｃｏＤａｍは、これらの基質の少なくとも１種を非連続的に改変するだろう。隣接配列が連続性に寄与するならば、隣接配列を有するＰａｐ関連ＧＡＴＣ部位に対するＥｃｏＤａｍの構造を決定することができる。他のタンパク質−ＤＮＡ相互作用を観察するならば、標的化された変異タンパク質を作製し、その連続性および配列特異性を調べることができる。
【０１１４】
[00152] 細菌において、ＭＴアーゼ標的部位は通常全てメチル化されている。しかし、ＭＴアーゼが遺伝子の発現を制御する能力は、メチル化パターンの存在に非常に左右され、このことはある種の部位は構成的メチル化に対して保護されなければならないことを意味する。ｐａｐ−部位の配列状況において、いくつかのシグナルがこの保護に寄与し、ｐａｐ部位のメチル化におけるＥｃｏＤａｍの連続性の欠如が１効果となり得そうである。連続的メチル化を防ぐこれらのシグナルの同定は、個別にメチル化され、その発現がＤａｍメチル化によって改変され得るその他の細菌性遺伝子の発見の一助となる。この取り組みは、ｄａｍメチル化が細菌の病原性をどのように調節するかを理解するのに役立つ。
【０１１５】
[00153]〔実施例３：インシリコスクリーニング〕
[00154] ２通りの異なる経路、ＩＳＳを使用する経路、およびハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）を使用する経路（Ｓａｗｙｅｒ他、２００３、Ｓｉｎｇｈ他、２００３）、によってＴＧＦ−β受容体キナーゼの同様の阻害剤の同定に最近成功したことを考えると、適切に手順を踏んだＩＳＳ法がＨＴＳと同様にうまくいくことは明らかである（Ｌｉｕ他、２００４）（Ｗａｓｚｋｏｗｙｃｚ、２００２）。さらに、分子ドッキングはあまり労力を必要としない。例えば、メルク化学コレクション（Ｍｅｒｃｋ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（Ｐａｉｖａ他、２００１）に対して結核菌標的ジヒドロジピコリン酸レダクターゼをスクリーニングするＨＴＳの＜０．２％と比較して、そのヒット率は６％である。
【０１１６】
[00155] ＩＳＳ中は、２種類の主要な目的を考えなければならない。第１に、Ｄａｍメチル化を効果的に阻害する化合物を同定することが必要である。第２に、その他のＭＴアーゼに対して細菌性Ｄａｍ分子に特異的な化合物が必要である。第１の考察に関しては、ＥｃｏＤａｍのいくつかの潜在的結合部位を標的とする。結晶学的構造から、非結合性ポケットから標的までＩＳＳを介してＤａｍ分子の多くのスナップ写真を撮影する予定である。潜在的部位は、ＡｄｏＭｅｔ結合ポケット、ポケット内外のチャンネル、触媒ドメインとＤＮＡ結合ドメインとの間のヒンジ領域、ＤＮＡ結合表面（特異的および非特異的）、および特有の表面ポケットを含む。特に、ＡｄｏＭｅｔ／ＡｄｏＨｃｙまたはＤＮＡまたはフリッピングした標的Ａｄｅ存在下での立体構造変化は、大きさまたは形または特定のくぼみに影響を及ぼすことができ、これらの特性は、結晶学によって特徴付けられたＤａｍの様々な形態の構造的比較によって調べられる。さらに、補因子結合Ｄａｍ構造を標的とすることによって、高レベルのＡｄｏＭｅｔの存在下でも活性のある阻害剤を同定することができる（このような高レベルは細胞内に存在し得るので）。結合部位の最終選択には、広域性抗体を得る目的による相同性の考慮、ならびに化合物の結合部位の特性が含まれる。後者は、ドッキングスコアおよび幾何に基づいて測定された各部位の特性によって、予測部位に対する予備ドッキングを実施することによって測定される。
【０１１７】
[00156] その他のＭＴアーゼに対するＤａｍ阻害剤の選択性は、抗生物質として成功するための非常に重要な基準である。Ｄａｍに選択的な化合物は、その他のＤａｍタンパク質に対して高い結合率を有さなければならないが、非ＤａｍＭＴアーゼに対する結合率は低くなければならない。後者のために、最初のスクリーニング（化合物５００００個、以下参照）から選択された化合物をまた、以下の非ＤａｍＭＴアーゼ、ＰＲＭＴ１−タンパク質アルギニンＭＴアーゼ（Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｃｈｅｎｇ、２００３）、およびＤＩＭ−５−ヒストンＨ３ Ｌｙｓ９ ＭＴアーゼ（Ｚｈａｎｇ他、２００２）（Ｚｈａｎｇ他、２００３）に対してスクリーニングし、これらのタンパク質との結合エネルギーは次の項で説明した選択性スコアに組み込む。選択性の欠如の可能性は、タンパク質の機能的に類似した領域で最高であるので、このような選択性スクリーニングは、補因子結合領域を標的とする阻害剤に特に重要である。大腸菌およびサルモネラのＤａｍ両方に有利なスコアを与え、その他の非ＤａｍＭＴアーゼには与えない化合物が生物学的試験で優先的に選択されるように、サルモネラＤａｍに対する化合物もスクリーニングする。現在、サルモネラＤａｍの３Ｄ構造はないので、Ｍｏｄｅｌｌｅｒプログラム（Ｓａｌｉ ａｎｄ Ｂｌｕｎｄｅｌｌ、１９９３）を使用して、大腸菌Ｄａｍをベースにした相同性モデルを作製する。モデル形成の精度は、大腸菌とサルモネラＤａｍの間にほんの２２残基の違いがあり（同一性９２％）、アミノ酸の数はほとんど同数（２７８対２７７）で、それらの間にギャップがないという事実が助けとなる。サルモネラＤａｍの結晶学的構造が一旦得られたら、その構造をＴ４および大腸菌のＤａｍと同等の方法でドッキングに使用することができる。
【０１１８】
[00157] これらのスクリーニング研究の標的は、Ｄａｍ−ＡｄｏＨｃｙ複合体である。最初に、Ｔ４ Ｄａｍ−ＡｄｏＨｃｙ複合体の結晶構造を標的として使用する。インシリコスクリーニング（「ＩＳＳ」）は、化合物および標的の構造に基づいたコンピューター計算によって、ライブラリーの化合物の標的に結合する能力を評価する。インシリコスクリーニングは、ハイスループットスクリーニングよりも有利で、ハイスループットスクリーニングに関する実験上の時間と労力を必要とせずに、いかなる数の化合物も容易にスクリーニングすることができる。例えば、比較的「小さい」ライブラリー、特に、米国国立癌研究所（ＮＣＩ）「Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｅｔ」ライブラリーを使用した。このＮＣＩ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｓｅｔは、約１４００００個の化合物の大きなライブラリーから選択された約２０００個の化合物のサブセットである（図２６参照）。このサブセットは、１４００００個の化合物の大きなライブラリーにおいて、三次元的化学物質多様性を最大限に表すように企図されている。このＮＣＩ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｅｔは、公に使用可能で、ＨＩＶ-１ヌクレオカプシドのいくつかの潜在的阻害剤（Ｓｔｅｐｈｅｎ他、２００２）を含む様々な標的分子の阻害剤の同定にうまく使用されてきており、このｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｓｅｔはＮＣＩ開発途上治療プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｄｔｐ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から公に使用可能である。図２２に、本発明のＩＳＳ方法の流れ図をまとめて挙げる。
【０１１９】
[00158] ＩＳＳは、標的化合物の同定に有用で、例えば、Ｐａｎ他（２００３）、Ｈｕａｎｇ他（２００４）によって検討されている。ＴＧＦ−βの同様の阻害剤は、ＩＳＳおよびハイスループットスクリーニング（Ｓａｗｙｅｒ他、２００３、Ｓｉｎｇｈｅ他、２００３）の両方によって同定された。
【０１２０】
[00159] 本明細書で使用する場合、データを表す用語は、分子または分子複合体の化学的および／または構造的情報を含むことができる。例えば、データの表現は、所与の分子、分子複合体、またはそれらの部分の一連の構造座標、三次元図、二次元図、化学式、またはその他の情報であってもよい。
【０１２１】
[00160] 本明細書で使用するとき、構造座標という用語は、当業者によって理解され、酵素または酵素複合体の原子（散乱中心）によるＸ線単色ビームの回折で得られたパターンに関連した計算式から得られた数学的座量を意味することができる。例えば、酵素複合体には、メチラーゼ、ＤＮＡ基質、およびメチル供与体を含めることができる。回折データは、結晶の反復単位の電子密度地図を計算するために使用される。電子密度地図は、結晶の単一セル内の個々の原子の位置を確立するために使用される。Ｘ線結晶構造解析によって決定された一連の構造座標では、当業者は標準誤差のない座標データはないことを理解するだろう。本発明の実施形態では、骨格原子を使用して参照構造座標に重ね合わせたとき、タンパク質骨格原子（例えば、Ｎ、アルファ−Ｃ、ＣおよびＯ）の標準偏差が０．７５Å未満である構造座標はいずれも同一と見なされる。
【０１２２】
[00161] 一実施形態では、小分子および／または小分子データ塩基は、本明細書で説明したような酵素または酵素複合体に、全体または一部が結合できる治療薬または化合物についてコンピューターによってスクリーニングされる。スクリーニングの具体的な実施形態では、このような治療薬または化合物の関心のある結合部位への合致の特性は、形状相補性または推定相互作用エネルギーのいずれかによって評価することができる。Ｍｅｎｇ、Ｅ．Ｃ．他、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．、１３、ｐｐ．５０５〜５２４（１９９２）を参照のこと。
【０１２３】
[00162] 本発明は、スクリーニングを実施するための特定の方法の使用に限定されない。本発明は、任意のドッキングソフトウェアアルゴリズムおよび当分野で公知の任意の評価アルゴリズムを利用することができる。米国特許出願第２００５／０１７０３７９号（Ｋｉｔａ他）は、（表面関係、幾何ハッシング、ポーズクラスタリング、グラフパターン一致のいずれかをベースにした）剛体パターン一致アルゴリズム、（段階的構成法または「プレイスアンドジョイン（ｐｌａｃｅ ａｎｄ ｊｏｉｎ」オペレーターを含む）断片をベースにした方法、（モンテカルロ、模擬アニーリング、遺伝的（またはミーム的（ｍｅｍｅｔｉｃ））アルゴリズムを含む確率的最適化法、分子動態シミュレーション、および／またはこれらの技術の１つまたは複数の複合を含むドッキングシミュレーションを実施するのに適した様々な技術を概説している。数多くのドッキングプログラムが使用可能で、アルゴリズムおよび効率に関して開発が続けられている。プログラムＤＯＣＫ（Ｅｗｉｎｇ他、２００１）が配布無料なので阻害剤スクリーニング研究に使用する。このプログラムは、以下のコンピューター処理、第１に、ドッキングの基礎的なプロセスである選択部位またはポケットにおける小分子の方向検索、第２に、標的部位に合致させるのに最適な立体構造の同定をもたらす分子の立体構造検索を実施する。より重要なのは、ドッキング試験のために化合物のデータベースを使用することができ、仮想スクリーニングの基本的な必要性を満たす。
【０１２４】
[00163] ＤＯＣＫをベースにしたスクリーニングでは、球体中心を関心のある結合部位およびデータベースの化合物のコノリー面に基づいて作製し、次に球体中心を化合物原子と合致させることによって結合部位にドッキングさせる。ドッキング部位の選択は、一般的に、相同性情報を含む生物学的データ、ならびに結合阻害剤の部位の特性に基づく。このような結合能力は、実験的に測定されたＡｄｏＨｃｙの結合様式を再現する能力などの、公知のリガンドの結合構造を再現するドッキングアルゴリズムの能力をベースにして確認できることが理想的である（図２３参照）。戦略は、タンパク質間およびタンパク質ＤＮＡ間相互作用の両方を遮断する推定阻害剤結合ポケットを選択するために有用で（Ｃｈｅｎ他、２０００、Ｈａｎｃｏｃｋ他、２００５、Ｈｕａｎｇ他、２００３、Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ他、２００４）、本研究における部位選択を容易にする。
【０１２５】
[00164] 予備的な分子ドッキングは、ＡｄｏＨｃｙ結合部位（暗色）および２個のドメインの間のくぼみ（暗色および灰色、図２４Ａ）を標的として実施した。このくぼみの位置は、グリセロール分子を結合するのに十分大きく（Ｔ４Ｄａｍ構造の１つに見られるように、示さず）、小分子が２個のドメインの間のヒンジの動きを遮断できることを示唆している。２個のドメインの見かけ上のヒンジの動きは、反応サイクル中の機能的重要性を反映することができる。興味深いことに、ＤｐｎＩＩ−関連ＧＡＴＣ制限修飾関連酵素−の構造において、対応する位置は（図２４Ｂの黒い矢印で示した）表面上の「くぼみ」を示すが、小分子が結合できるくぼみほど深くない。この所見から、このくぼみは、阻害の選択性のために標的とすることができるＴ４Ｄａｍの固有特性であるという興味深い可能性をもたらす。
【０１２６】
[00165] 一実施形態では、ドッキング部位は、実験的に結合させたＡｄｏＨｃｙおよび活性部位をベースにして特定される。リガンドの周り８Å以内の領域が考えられる。相互作用エネルギー、グリッドをコンピューター計算するためにドッキング研究全てにおいて０．３Åのグリッドを使用する。エネルギースコアリンググリッドは、結合原子モデル、距離依存性誘電関数（ε＝４ｒ）および６〜１２レナードジョーンズファンデルワールスポテンシャルを使用することによって得られる。フレキシブルリガンドドッキングは、最小アンカー断片の大きさ７原子、立体構造をサンプリング数２５個のアンカーファースト（Ａｎｃｈｏｒ−Ｆｉｒｓｔ）機構を使用して実施する。方向は、ドッキング中アンカー断片１個当たり最大５０００に設定する。
【０１２７】
[00166] グリッドをベースにした剛体単純アルゴリズムを使用してエネルギー最小化を実施する。１００個の単純な最小化段階の１サイクルを、化合物方向および立体構造を調節するために適用し、近接局所エネルギー最小値を０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌに収束させるために適用する。この最小化は、ＤＯＣＫプログラムの転送時に計算され、最終エネルギースコアのみが記録される。
【０１２８】
[00167] リード化合物にいくらか化学的類似性のある関連化合物（例えば、化合物＃７８（ＮＣＩ６５９３９０）を使用してさらに調査を実施する。関連化合物は、ＳＭＩＬＥＳストリングベースパターン認識（図２６参照）を使用して同一の、または類似のコア断片構造を有する化合物について確認する。このｓｒｉｎｇベースパターン認識に基づく化合物＃７８（ＮＣＩ６５９３９０）に関連した化合物については、図２９を参照のこと。
【０１２９】
[00168] スコアリング：データベース中の全化合物２０００個をヒンジ領域の補因子結合部位または推定結合くぼみにドッキングさせた後、ＤＯＣＫプログラムを適用してリガンド−タンパク質相互作用エネルギーを計算し、ドッキングしたリガンドの順位を付けた（図２８参照）。エネルギースコアは、ファンデルワールスおよび静電的相互作用エネルギー成分をベースとしている。ドッキング方法の最終段階として、リガンドの方向は、最終エネルギースコアを得る前に他のエネルギー最小化に与えられた。次に、最良のＤＯＣＫエネルギースコアに対応する最高の結果を分類し、保存した。現在、補因子結合部位１８個およびくぼみ２２個を選択しているので、例を図２４に示す。興味深いことに、補因子結合部位の上位３０個の中で、１０個の化合物がアミノ酸様化学構造を有していた（図２４Ｃの補因子のメチオニン部分と重なる）。これは、化合物２０００個のライブラリーにおけるこのような化合物４０個から約２０倍に濃縮されている。
【０１３０】
[00169] その他の構造的に特徴付けられた非Ｄａｍ ＭＴアーゼに対する特異性：同様の取り組みにしたがって、この２０００個の化合物をアカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）ＤＩＭ−５−ヒストンＨ３ Ｌｙｓ９ ＭＴアーゼの３次構造の補因子部位およびペプチド結合部位（図２５）にドッキングさせた（Ｚｈａｎｇ他、２００２）（Ｚｈａｎｇ他、２００３）。Ｄｉｍ−５およびＴ４Ｄａｍは、構造的折り畳みが異なり、補因子立体構造も異なるＡｄｏＭｅｔ依存性ＭＴアーゼの２つの異なる種類に属する（Ｓｃｈｕｂｅｒｔ他、２００３）（図２３参照）。「ｆｒｅｑｕｅｎｔ ｈｉｔｔｅｒｓ」を除外するために、内部対照として、Ｄｉｍ−５表面の不可逆的推定部位も使用した。潜在的ｆｒｅｑｕｅｎｔ ｈｉｔｔｅｒｓの迅速な自動的同定のために開発された３層神経ネットワークをベースとした方法を使用した（Ｒｏｃｈｅ他、２００２）。これらの研究から、補因子結合部位２０個、基質Ｌｙｓ結合部位１１個および亜鉛結合部位９個（示さず）を選択し、例を図２５に示す。
【０１３１】
[00170] Ｄｉｍ−５およびＴ４Ｄａｍの補因子部位から同定された化合物の大部分は異なっており、特異性はドッキングによって実現され得ることが示されることに留意すべきである。Ｒｏｃｈｅ他（２００２）が、データベース中のｆｒｅｑｕｅｎｔ ｈｉｔｔｅｒｓの高い割合が実際の薬剤から成り、そのため、ｆｒｅｑｕｅｎｔ ｈｉｔｔｅｒｓを除去すると実際に市販可能な薬剤が排除されることを予測したことにも注意されたい。ドッキングの目標は、結合ポケットに相補的な化合物を同定することなので、生化学アッセイにおいて、上位であるが、頻繁であるヒットのいくつかを評価する。
【０１３２】
[00171] ＤＯＣＫ結果の概要：最近、８２個の化合物（ＤＩＭ−５で同定された３６個、Ｔ４Ｄａｍで同定された４０個およびヒスタミンＭＴアーゼの阻害剤として公知の６個、小分子ＭＴアーゼ１個（Ｈｏｒｔｏｎ他、２００１））を同定した（図２７）。エネルギースコアによって格付けされた上位１００個の化合物を示す図２８にＤＯＣＫ分析の結果をまとめて示す。これらの中で、化合物９個がｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで中程度の阻害を示し、そのうちの１個（ＮＣＩ６５９３９０）が細胞をベースとしたビルレンス阻害においてアクチン台座形成を阻害することが発見された（表７参照）。リード化合物構造をベースにして、リード化合物構造に関連するその他の構造をスクリーニングすることができる。例えば、表７の化合物７８（ＮＳＣ６５９３９０）の構造を使用して化合物１４００００個のライブラリーからその他の関連化合物を同定した（図２９）。
【０１３３】
[00172] 興味深いことには、他の機能的コア構造は、表７で同定された９個の化合物のうち２個（化合物５５番および５８番）によって定義される。類似の分析によってその他の機能的コア構造を同定することができる。化合物Ｄａｍ−ｉＺ１に加えて、化合物Ｄａｍ−ｉＺ２はＤａｍ阻害剤：
【化６】


として機能することができる。
【０１３４】
[00173] Ｍはアリールまたはヘテロアリールであることができ、アリールは１個または複数の環、好ましくは各環が場合によって独立して置換されている１個または２個の芳香族環である。ヘテロアリールは、１個または２個のヘテロ原子を含有する芳香族環である。一実施形態では、Ｍは、
【化７】


である。一実施形態では、「^＊」は窒素原子に対するＭの結合位置を示す。
【０１３５】
[00174] コンピューター支援薬剤設計（ＣＡＤＤ）は、データベーススクリーニングによる同定をもたらす。Ｄａｍに結合する能力を有する新規リード化合物の同定は、仮想ＮＣＩ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｅｔおよび市販されている化合物３００万個を上回る３Ｄ化学構造データベースのデータベース検索によって実施される。メリーランド大学ＣＡＤＤセンター（所長ＭａｃＫｅｒｅｌｌ博士）において、３００万個の化合物のデータベースが蓄積され、２Ｄ構造から３Ｄ構造へ変換された（Ｈｕａｎｇ他、２００４、Ｐａｎ他、２００３）。データベース中の化合物の大部分は最近、薬剤様特性を有することが示された（Ｓｉｒｏｉｓ他、２００５）。最初のデータベース検索の標的は、ＥｃｏＤａｍの触媒部位であり、その後の検索は、推薦された結晶学的研究によって決定された新規結合部位を標的とする。データベース検索は、リガンド柔軟性を明らかにするアンカーをベースにした検索方法を使用したＤｏｃｋプログラム（Ｋｕｎｔｚ他、１９８２）を使用して実施する（ＤｅｓＪａｒｌａｉｓ他、１９８６、Ｅｗｉｎｇ ａｎｄ Ｋｕｎｔｚ、１９９７）。１０個以下の回転可能な結合および１０〜４０個の間の非水素原子を含有する選択化合物に対して予備スクリーニングを実施し、エネルギースコアリングはＤｏｃｋで実施したＧＲＩＤ（Ｇｏｏｄｆｏｒｄ、１９８４）法に基づく。最初のドッキングから、上位５００００個の化合物は、正規化したファンデルワールス（ｖｄＷ）引力による双方向性エネルギーをベースにして選択される。全エネルギーまたは静電的エネルギーに対してｖｄＷ引力によるエネルギーを使用することによって、立体的に結合部位を補足する構造を有する化合物を選択するためにこの方法を推進する（Ｈｕａｎｇ他、２００４）。標準化方法は、選択した化合物の分子量（ＭＷ）を制御するために設計され（Ｐａｎ他、２００３）、Ｎが化合物中の非水素原子の数であるＮ^１／２標準化を使用することによって、平均ＭＷが３２０ダルトンである化合物を選択する。このような化合物は、Ｗｏｒｌｄ Ｄｒｕｇ Ｉｎｄｅｘをベースにした薬剤として活性のある化合物の平均ＭＷよりも小さい。小さいＭＷ化合物は、この計画の後半の段階の改変でより影響を受けやすいので、薬剤設計計画のこの段階に望ましい（Ｏｐｒｅａ他、２００１）。
【０１３６】
[00175] 最初のスクリーニングから選択された上位５００００個の化合物の第２の仮想検索には、反復蓄積法中のアンカーの同時エネルギー最小化が含まれる（Ｃｈｅｎ他、２０００、Ｈｕａｎｇ他、２００４）。第２のスクリーニングは、化合物選択に特異性を含めるために、非Ｄａｍ ＭＴアーゼ、ＤｐｎＩＩ（Ｔｒａｎ他、１９９８）、ＰＲＭＴ１（Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｃｈｅｎｇ、２００３）およびＤＩＭ−５（Ｚｈａｎｇ他、２００２、Ｚｈａｎｇ他、２００３）ならびにＥｃｏＤａｍに対して実施する。各化合物の最終的なスコアは、以下のように、各化合物とＥｃｏＤａｍとの全相互作用エネルギーの合計およびＥｃｏＤａｍと非Ｄａｍ ＭＴアーゼ相互作用エネルギーとの間の違いの加重和によって得られる。
【数２】

【０１３７】
[00176] Ｉ．Ｅ．が全相互作用エネルギーの場合、ｉは選択的スクリーニングに使用する非Ｄａｍ ＭＴアーゼそれぞれを表し、ｗは１／ｎと同等の重み係数であり、ｎは非Ｄａｍ ＭＴアーゼの数である。このスキームにおいて、ＥｃｏＤａｍに対する絶対的結合を非Ｄａｍ ＭＴアーゼに対するＥｃｏＤａｍの相対的結合と一緒にする。したがって、化合物がＥｃｏＤａｍおよび非Ｄａｍ ＭＴアーゼに非常に都合よく結合するならば、その全体スコアは比較的低く、他方、非Ｄａｍ ＭＴアーゼにあまり都合よく結合しないが、ｏｎ−Ｄａｍ ＭＴアーゼにもあまり都合よく結合しない化合物のスコアは高い。もし必要と思われるならば、非Ｄａｍ ＭＴアーゼに対するＥｃｏＤａｍ相互作用エネルギーの重みは調節することができる。例えば、特異性の問題が非Ｄａｍ ＭＴアーゼの１つに関して特に問題であるならば、その重みをその他のものに対して増加させて、最終スコアにより大きな影響を与えるためにそれに関する選択性を引き起こすことができる。最初の方法１スクリーニングで使用したｖｄＷ相互作用エネルギーに対して全相互作用エネルギーを使用すると、このスクリーニング方法の第２段階中に静電的関与およびｖｄＷ的関与の両方を考慮することが可能である。これは、非特異的静電性によってその結合が優性になる化合物を最初のスクリーニングで排除するので、適切である。方法２選択性スクリーニングから、上位１０００個の化合物を化学類似性分析（Ｂｕｔｉｎａ、１９９９）、スクリーニングで当たる率を改善することが示された（Ｈｕａｎｇ他、２００４）生物学的アッセイで選択された最終化合物の化学的多様性を最大限にするステップで選択される。この方法で、化学的類似性は、化学的に類似な化合物のクラスター約１００個を生じるＴａｎｉｍｏｔｏ指数と組み合わせて化学的フィンガープリントをベースにして定量する。１個または２個の化合物が生物学的アッセイのために各クラスターから選択された。最終選択方法は、安定性、潜在的毒性、および溶解性（すなわち、Ｌｉｐｉｎｓｋｉルールの５（Ｌｉｐｎｓｋｉ、２０００）を考慮し、溶解性はＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ（ＭＯＥ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ）を使用してログＰ値を計算することによって概算される。選択した化合物は、適切な業者から購入した。
【０１３８】
[00177] リード同定にあり得る落とし穴および代替物。データベース検索によるＩＳＳは、コンピューターの必要性を最小限に抑えるためにいくつかの簡便化を行い、３００万個の化合物のデータベースの検索を可能にしている。これらの簡便化で最も重要な２点は、（１）タンパク質における立体的柔軟性の欠如（Ｃａｒｌｓｏｎ、２００２）および（２）簡便なスコアリング機能である。もし、これらの仮定のいずれかが、方法２で同定された少数の活性化合物によって問題であることが示されたならば、以下のステップを採用する。
【０１３９】
[00178] タンパク質の柔軟性を考慮するために、複数の構造を方法２のドッキングに使用する。最終ランキングに使用する各化合物が最も好ましいスコアで５００００個の化合物のそれぞれが各立体構造に対してスクリーニングされるように、ＥｃｏＤａｍの他の立体構造（一般的に５個）は、分子動力学的（ＭＤ）シミュレーションから得られ、方法２の検索に含まれる。他の立体構造は、分子モデリングプログラムＣＨＡＲＭＭ（Ｂｒｏｏｋｓ他、１９８３、ＭａｃＫｅｒｅｌｌ他、１９９８ｂ）を使用して、標的とするタンパク質の領域の分子動力学的（ＭＤ）シミュレーションによって作製される。これらのシミュレーションは、タンパク質骨格の処理に最新修正を含む（ＭａｃＫｅｒｅｌｌ他、２００４）ＣＨＡＲＭＭ２２タンパク質力場を使用して（ＭａｃＫｅｒｅｌｌ他、１９９８ａ）、明示的溶媒中において５ｎｓで、既に記載されたように（Ｈｕａｎｇ他、２００３）実施する。
【０１４０】
[00179] 得点率（すなわち、選択された活性化合物の数）が不適切と思われる場合、他のスコアリング方法を試みる。他の１取り組みは、コンセンサススコアリング（Ｃｈａｒｉｆｓｏｎ他、１９９９）、化合物をランク付けするために複数のスコアリング機能を適用する方法である。この取り組みには、リガンドの正確な方向の選択に改善をもたらすことが示され、救済効果の特定の面を内在するという利点を有する知識ベースのスコアリング方法を含む。さらに他の取り組みには、一般化線形応答法（Ａｑｖｉｓｔ他、１９９４、Ｌａｍｂ他、１９９９）および、最近ＤＯＣＫプログラムに装備されたＧＢバージョン（Ｋａｎｇ他、２００４、Ｚｏｕ他、１９９９）を含む一般化Ｂｏｒｎ（ＧＢ）モデル（Ｆｅｉｇ ａｎｄ Ｂｒｏｏｋｓ、２００４）をベースにした溶媒和自由エネルギーが含まれる。
【０１４１】
[00180] 図２２（流れ図）は、新規Ｄａｍ阻害剤の開発に適したリード候補を同定し、特徴付けるための全体的戦略をまとめて示したものである。ＥｃｏＤａｍ（および認識経路に沿ったＤＮＡとの多くの複合体−具体的目的１）の高分解能構造の利用性は、構造をベースとした仮想スクリーニングを可能にする。ＩＳＳは、ＮＣＩデータベースおよび市販の化合物３００００００個の大きなデータベースにおける主要な化学物質型を代表した小さな化学的「多様性」ライブラリーに対して実施される。仮想スクリーニングを使用して同定された化合物は、化学物質型にグループ分けされ、３種のアッセイ、ＩＣ_５０値を測定するｉｎ ｖｉｔｒｏメチル化アッセイ、細菌をベースとしたｉｎ ｖｉｖｏメチル化阻害アッセイ、および細胞をベースとしたビルレンス阻害アッセイによって並行して確認する。阻害機構および非ＤＡＭ ＭＴアーゼ（哺乳類ＤＮＡシトシンＭＴアーゼ、ヒストンリシンＭＴアーゼおよびタンパク質アルギニンＭＴアーゼ）に対するそれらの選択性を決定するために最良の候補を分析する。
【０１４２】
[00181] ＩＳＳによって同定された各リード化合物は、（リード様分子の最も望ましい特性のＬｉｐｉｎｓｋｉパラメーターによって誘導され）化学的に最適化された能力について評価される。毒性は、最初に細胞で、次に虫で（Ａｎｙａｎｆｕｌ他、２００５）、その後マウスで測定される。ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおける効率は、マウスモデルを使用して、病原性大腸菌およびサルモネラのような特定の感染病原体によって引き起こされる疾患を予防および治療する能力によって評価される。最適化の一次基準は、標的酵素（Ｄａｍ）に対する能力、哺乳類ＭＴアーゼに対する負の選択性、宿主毒性がないか、低いことである。最後に、リード阻害剤を有するＤａｍの共結晶構造を測定し、より望ましい特性を有するコア構造に関する誘導体アナログを設計するために繰り返し取り組む。
【０１４３】
[00182]〔実施例４：阻害剤の活性試験〕
[00183] 活性試験は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおける生化学アッセイを包含する。これらのアッセイは、ＩＳＳおよび／またはコンピューター支援薬剤設計によって同定されたＤａｍ阻害剤を試験するのに使用できる。例えば、このアッセイは、生化学系におけるＤＮＡメチル化、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける細胞全体での、またはｉｎ ｖｉｖｏにおける病原性大腸菌疾患モデルとしてのマウス病原体シトロバクターロデンティウムでの台座形成を評価することができる。例えば、Ｓｗｉｍｍ他（２００４）、Ｗｅｉ他（２００５）を参照のこと。
【０１４４】
[00184] 数百〜数千の化合物のスクリーニングを可能にするハイスループットアッセイ（ＨＴＡ）を使用する。特に、２種のＨＴＡアッセイ、（１）マイクロプレート形式によるｉｎ ｖｉｔｒｏＨＴＡ、および（２）細胞をベースとしたハイスループットビルレンス阻害アッセイを使用する。
【０１４５】
[00185] マイクロプレート形式によるｉｎ ｖｉｔｒｏハイスループットアッセイ：ＤＮＡメチル化を分析するために、ＤＮＡメチル化分析用のビオチン化オリゴヌクレオチド基質を使用するマイクロプレートアッセイを使用する（Ｒｏｔｈ ２０００）。このアッセイは、標識した［メチル−^３Ｈ］−ＡｄｏＭｅｔを使用する。メチル化反応後、オリゴヌクレオチドはアビジンでコーティングされたマイクロプレートに固定される。ＤＮＡへの［３Ｈ］の取り込みは、結合緩衝液に非標識ＡｄｏＭｅｔを添加することによって停止させる。非反応性ＡｄｏＭｅｔおよび酵素を洗浄によって除去する。ＤＮＡに取り込まれた放射活性を放出させるために、ウェルを非特異的エンドヌクレアーゼと共にインキュベートして、放射活性を液体シンチレーションカウンティングによって測定した。例として、図８Ｂおよび９に示したＥｃｏＤａｍによってＤＮＡのメチル化を研究した。ビオチン−アビジンアッセイは安価、便利、定量的、迅速で、９６個の試料を並行して処理するのによく適している。このアッセイの精度は、高く、結果の再現性は＋／−１０％以内である。１点メチル化アッセイは、ＭＴアーゼ反応の阻害能を引き起こす化合物の初期スクリーニングのために使用する。初期スクリーニングで正のスコアを付けた各化合物のＩＣ５０を測定するために、定常状態の反応速度論を次に実施する。
【０１４６】
[00186] Ｄａｍを阻害する能力について評価するためのマイクロプレートアッセイで、８２個の化合物を化合物濃度２００μＭでスクリーニングした。（２倍以上の阻害を有する）陽性のみを使用して、この試験を繰り返した。陽性化合物９個（表８）全てを、ＤＯＣＫによってＤａｍの潜在的阻害剤として「同定」した。これによって、ＩＳＳが十分に確認される。このマイクロプレートアッセイは、標識した「メチル−３Ｈ］−ＡｄｏＭｅｔを使用する。メチル化反応後、オリゴヌクレオチドはアビジンでコーティングされたマイクロプレートに固定される。ＤＮＡへの［３Ｈ］の取り込みは、結合緩衝液に非標識ＡｄｏＭｅｔを添加することによって停止させる。非反応性ＡｄｏＭｅｔおよび酵素を洗浄によって除去する。ＤＮＡに取り込まれた放射活性を放出させるために、ウェルを非特異的エンドヌクレアーゼと共にインキュベートして、放射活性を液体シンチレーションカウンティングによって測定した。化合物＃７８（例えば、ＮＣＩ６５９３９０）はまた、細胞をベースとしたビルレンス阻害アッセイでアクチン台座形成を阻害することが発見された（図３１参照）。
【０１４７】
[00187] 病原性大腸菌感染の細胞および動物モデル：腸管出血性大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７（ＥＨＥＣ）に密接に関連し、マウス病原体シトロバクターロデンティウムに密接に関連している腸管病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）は、いずれも付着性および微絨毛消滅性（Ａ／Ｅ）病変を引き起こし、腸の微絨毛を平らにすること、上皮細胞への細菌の付着、および宿主アクチン細胞骨格の再構成が特徴で、アクチン充填膜突出または各細菌の下の「台形構造」の形成を引き起こす（Ｇｏｏｓｎｅｙ他、２０００、Ｋｎｕｔｔｏｎ他、１９８９）。台座構造形成は、ＥＰＥＣに曝露された培養繊維芽細胞（図３０参照）で容易に検出され、次に、アクチンを認識するファロイジン（図１０の赤）と一緒に、細菌の外膜タンパク質を認識する抗体（図３０の緑）、または細菌および細胞のＤＮＡを認識するＤＡＰＩ（図３０の青）で染色される。台座構造は、細菌に密着した強いアクチン染色として認められる。
【０１４８】
[00188] ＥＰＥＣによるアクチン台座構造の形成がビルレンスを阻害する薬剤のスクリーニングに使用できるかどうかを決定するために、８２個の化合物それぞれを試験した。３Ｔ３細胞を９６ウェル光学ディッシュに接種した。この「原理の証明」実験では、化合物８２個のそれぞれをウェルに２０μＭで添加し、細胞にＥＰＥＣを６時間感染させた。上清の光学密度（ＯＤ_６００）を、細菌増殖に対する効果を判断するために評価し、細胞を固定し、細菌（および細胞核）を認識するＤＡＰＩおよび繊維状アクチンを認識するＦＩＴＣ−ファロイジンで染色した。アクチン台座構造の阻害は、強いアクチン染色の欠如として容易に確認することができる（Ｋａｌｍａｎ他、１９９９、Ｓｗｉｍｍ他、２００４ａ）。次に、このプレートを、２０×対物レンズを備えたＺｅｉｓｓ ２００Ｍ倒置蛍光顕微鏡で視覚的に調べた。ディッシュのウェル全てを５分間隔で調べた（ハイスループット様式）。低出力では、アクチン台座構造は細菌群に隣接した強い蛍光として認められる（図３１Ｂ、矢印）。非感染細胞では、このような明白な染色は無かった。ＯＤ_６００によって測定される細菌細胞増殖および台座構造形成（示さず）を遮断する１化合物、Ｂ１１（ウェルの位置、化合物＃２３）を同定した。Ｂ１１は、抗生物質マイトマイシンの誘導体であることが判明した。アクチン台座構造を阻害すると思われるが、細菌増殖には影響を及ぼさない第２の化合物、Ｇ６（化合物＃７８）を同定した（図３１Ｃ）。この化合物は、Ｔ４Ｄａｍに対してＤＯＣＫによって同定され、より詳細に分析するために選択された。いくつかの時点でＯＤ_６００を測定することによって、Ｇ６は細菌増殖に影響を及ぼさないことが示された（赤線、図３２）。さらに、高倍率でも付着した細菌の近隣には台座構造は全く見られず（６３×、図３３ｊ）、Ｇ６は３Ｔ３細胞にそれほど大きな細胞病理学的効果を有さなかった。
【０１４９】
[00189] 台座構造形成は、下痢の発症と強く相関しているが、疾患の開始との関係は十分には理解されていない。ここで重要なことは、台座構造形成は病原性大腸菌のビルレンスの指標であり、ハイスループット薬剤スクリーニングプロトコルで容易に扱いやすいことである。台座構造を形成するために、ＥＰＥＣは最初に上皮細胞に緩く付着し、次いでそのＩＩＩ型分泌系を宿主細胞原形質膜に挿入し、宿主細胞質および膜に、転位インティミン（ｉｎｔｉｍｉｎ）受容体（Ｔｉｒ）（Ｋｅｎｎｅｙ他、１９９９）を含むいくつかのビルレンス因子を分泌する（Ｇｏｏｓｎｅｙ他、２０００）。化合物Ｇ６の細菌ビルレンス因子Ｔｉｒの発現に対する効果も評価した。図３３ｇに示したように、Ｔｉｒ染色は、感染細胞のアクチン台座構造で明らかであった。しかし、化合物Ｇ６で処理された細胞では、Ｔｉｒ染色は付着した細菌の近隣には全く見られなかった（図３３ｋ）。これらのデータは、化合物Ｇ６がＴｉｒの発現または分泌を直接的または間接的に阻害したことを示し、増殖に影響を及ぼさずに細菌ビルレンスを阻害する化合物のスクリーニングにアクチン台座構造を使用できるという「原理の証明」をもたらす。したがって、培養繊維芽細胞における台座構造形成は、細菌のビルレンス因子発現の指標であり、動物モデルにおける疾患の発症と強く相関している。したがって、台座構造形成は、Ｄａｍ ＭＴアーゼ阻害剤機能を評価するための適切なアッセイである。
【０１５０】
[00190] 図３１〜３３に示したように、（ＥＰＥＣ）によるアクチン台座構造の形成は、ビルレンスを阻害する薬剤のスクリーニングに使用できる。対照として、Ｄａｍ ＭＴアーゼをコードする遺伝子が非極性的に欠如したＥＰＥＣ株による台座構造形成を評価する。これを実施するために大腸菌遺伝子を不活性化する非常に効果的な手段である、Ｄａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒの方法を使用する。この方法は、ｔｎａＡに非極性的欠失を起こさせるために使用された。簡単に説明すると、この方法は、ＰＣＲおよびバクテリオファージλ Ｒｅｄ組換え系を利用しており、プラスミドベクターで遺伝子破壊を行うのに労力を要するプロセスを回避している。Ｒｅｄ系は、３種の遺伝子生成物、Ｇａｍ、ＢｅｔおよびＥｘｏをコードする。Ｇａｍは、ＢｅｔおよびＥｘｏが線状ＤＮＡ末端に接近して組換えを促進することができように、宿主ＲｅｃＢＣＤエキソヌクレアーゼＶを阻害する。クロラムフェニコール（Ｃｍ）耐性遺伝子を取り囲む２個のＦＲＴ（ＦＬＰ認識標的）部位に隣接したＤａｍ近傍配列を含有する線状ＤＮＡを作製するためにＰＣＲを使用する。この生成物を（メチル化（非増幅）鋳型ＤＮＡを除去するために）ＤｐｎＩで処理し、再精製し、次にＲｅｄヘルパープラスミドｐＫＤ４６を含有するＥＰＥＣ株にエレクトロポレーションする。Ｒｅｄ遺伝子を誘導するために、変異体をクロラムフェニコールおよびアンピシリンおよびＬ−アラビノース１ｍＭを含有するＬＢ寒天で選択する。変異体を非選択的培地で継代し、（Ａｍｐ^ｓをそれらにもたらす）Ｒｅｄヘルパープラスミドを分離的に除去させる。欠失した遺伝子の再組換えによる挿入は、適切なプライマーを使用したＰＣＲ分析によって確認される。ｃａｔ^Ｒの除去は、４３℃で増殖させることによって回復可能なＦＬＰレコンビナーゼをコードするヘルパープラスミドを使用して実施する。この領域から作製したＰＣＲ生成物を、欠失を確認するために配列決定する。Ｄａｍ⁻表現型は、ＤｐｎＩ消化に対する耐性およびＤｐｎＩＩ消化に対する感受性によって示される。欠失株の補足アッセイは、適切なプラスミドからＤａｍタンパク質を発現することによって実施される。Ｄａｍ欠失株は、アクチン台座構造アッセイおよびマウスビルレンスアッセイの対照として使用する。
【０１５１】
[00191] ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで阻害が同定された化合物が、細胞をベースとしたアッセイではアクチン台座構造形成に影響を及ぼさない理由は、おそらく化合物が細菌に入ることができないからである。このようなことが起こっているのならば、当分野で知られているように、化合物が細菌に入れるように最適化することができる。これらの化合物が細菌増殖およびメチル化に影響を及ぼすかどうかを試験するために、ｐＵＣ１９プラスミドを有する大腸菌培養物を様々な濃度の阻害剤の存在下で増殖させる。メチル化状態を分析するために、このプラスミドを単離し、制限酵素ＤｐｎＩ（メチル化ＤＮＡのみを切断する）およびＫｐｎＩＩ（非メチル化ＤＮＡのみを切断する）で消化する。このアッセイにおけるメチル化のいかなる欠如も、阻害剤が細菌細胞に入り、Ｄａｍ活性を阻害することができることを示す。（Ｔ４ＤａｍについてＤＯＣＫによって同定された）４０個のＮＣＩ化合物を５０μＭで測定したところ、いくつかの化合物が少し不完全なＤｐｎＩ消化を示した（図３４ＡのＩ５６）。
【０１５２】
[00192] 細菌においてメチル化活性の大部分を阻害する必要性から、より感度のよいアッセイが必要ならば、その他の細菌をベースとしたアッセイを使用することができる。このようなアッセイの１つを図３４Ｂに概略する。ＤｐｎＩＩ制限酵素を発現するプラスミドをＤＨ５αに導入する。（ＤｐｎＩＩ過剰発現プラスミドの利用性によって示されたように）ＤＨ５αのゲノムは通常メチル化されるので、非メチル化ＤＮＡのみを切断するＤｐｎＩＩの遺伝子には十分耐性であるだろう。細菌性Ｄａｍ活性を阻害剤によって遮断すると、非メチル化ＤＮＡが生じ、ＤｐｎＩＩによって切断されて、細胞死が引き起こされ得る。ＤｐｎＩＩプラスミドを有する、および有さないＤＨ５αをマイクロタイタープレートで潜在的阻害剤の存在下で増殖させ、その増殖速度をモニターする。ＤｐｎＩＩを含有する培養物の増殖のみに影響を及ぼす阻害剤がＤａｍ ＭＴアーゼの阻害剤になりそうである。
【０１５３】
[00193] マウスにおけるリードＤａｍ ＭＴアーゼ阻害化合物のスクリーニング。マウス病原体シトロバクターロデンティウムは、病原性大腸菌疾患のモデルである。Ｃ．ロデンティウムは結腸でコロニーを形成し、Ａ／Ｅ病変、結腸過形成およびヒトにおけるＥＰＥＣ効果を示唆する炎症を引き起こす。マウスのサルモネラ感染のために開発された取り組みを使用して、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＥＰＥＣを感染させた。Ｂａｒｔｈｅｌ他、２００３。この取り組みは、腸内細菌叢を除去しないが、減少させる短期ストレプトマイシン処理を利用する。ストレプトマイシンで処理したマウスにＥＰＥＣ（Ｓｔｒ^ｒ）を感染させると、結腸がコロニー形成し、感染後（＝ｐｉ）７日で上皮過形成が生じ、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）レベルによって測定されるように好中球動員が増加した（図３５）。このＥＰＥＣ病理発生のｉｎ ｖｉｖｏモデルは、抗菌剤としてのリードＤａｍ ＭＴアーゼ阻害剤の効果を確立するために使用される。
【０１５４】
[00194] 付着性および微絨毛消滅性（Ａ／Ｅ）病変は、ＥＰＥＣおよびＣ．ロデンティウムが結腸にコロニー形成するために必須である。したがって、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＡ／Ｅ病変を遮断するＤａｍ ＭＴアーゼ阻害剤が（予備結果を参照）ｉｎ ｖｉｖｏにおいて細菌負荷を減少させることを期待する。ＥＰＥＣまたはＣ．ロデンティウムを経口摂取すると、ｐｉ１０日までに結腸組織１グラム当たり１０^９〜１０^１０コロニー形成単位（ＣＦＵ）を生じる。一般的に、この病原体は正常な成体マウスではｐｉ６週間までに除去される。最初の実験で非感染マウスにおける化合物の安全性および生体利用効率を決定する。皮下に設置したＡｌｚｅｔ浸透圧ポンプによってこの化合物を送達させる（Ｒｅｅｖｅｓ他、２００５）。これらのポンプは、薬剤を継続的に送達する能力を備え、そのため、生体利用効率に対する薬剤半減期の効果は最小限に抑えられる。血清中の薬剤レベルは、液体クロマトグラフィー質量分析によって測定する。血中酵素レベルの徹底的な検査を実施し、剖検によって病理学的なその他の証拠を探す。
【０１５５】
[00195] 次に、ＥＰＥＣまたはＣ．ロデンティウム感染マウスで細菌レベルに対するリード化合物の効果を測定する。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）２００μＬに溶かした２．５×１０^８ＣＦＵを経口感染させた。このマウスを薬剤または担体で１０日間処理した。ｐｉ１０日に、マウスを殺処分し、結腸を採取し、機械的にホモゲナイズして、連続的に希釈した。生きた細菌の数を、グラム陰性生物を選択するＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天に接種することによって測定する。Ｃ．ロデンティウムコロニーは、中心がピンク色で縁が白いので容易に識別される（Ｗｅｉ他、２００５）。次に、薬剤が感染マウスにおける細菌関連病変を減じるかどうかを測定する。マウスにおけるＣ．ロデンティウムまたはＥＰＥＣ感染は体重減少、活力減退、下痢、毛並みの乱れおよび猫背を引き起こす（データは示さず）。免疫適格性マウスは、ｐｉ６週目に感染から治癒し、正常な外観および活動を回復することができる。回復前に殺処分されたマウスでは、結腸の組織化学的分析によって塊（過形成）の明らかな増加、腸陰窩高、リンパ球および顆粒球の浸潤が明らかである（Ｗｅｉ他、２００５）。
【０１５６】
[00196] Ａ／Ｅ病変形成を防ぐ薬剤は、感染したマウスのＥＰＥＣまたはＣ．ロデンティウム関連疾患パラメーターを減少させる。マウスを経口的に感染させ、薬剤または担体で処理する。現実的な臨床設定に近づけるために、第２群のマウスに疾患の徴候が表れたとき（一般的にｐｉ１０日）、薬剤または担体で処理する。マウスの体重を毎日測定し、身体的苦痛の徴候（倦怠感、猫背、肛門周辺染色）を視覚的に確認する。ｐｉ１４日および２４日にマウスを殺処分し、結腸の疾患の徴候を組織学的に調べる（３μｍの切片に切断し、ヘマトキシリンおよびエオジンで染色する）。腸陰窩高をマイクロメーターで測定し、処置群を知らされていない観察者がマウスの外観の等級付けを行う。それぞれの状態、倦怠感、毛並みの乱れ、直腸脱、肛門周辺染色に１点を割り当てる（最高点＝４、最低点（健康）＝０）。腸陰窩高および体重の結果を平均値＋／−１標準誤差として表す。処理群には、少なくとも１０匹のマウスを含める。統計学的分析は、マンホイットニーｔ検定によって計算し、ｐ＜０．０１は有意と見なした。薬剤処理群の病変スコアが減少すれば、薬剤治療はＣ．ロデンティウム疾患の予後に肯定的な影響を及ぼすものと結論付けることができる。
【０１５７】
[00197] マウスにおける薬剤送達の方法。薬剤送達および検出系を一緒にした感染モデルを使用することができる。例えば、ポックスウイルスビルレンスにおけるＡｂｌファミリーチロシンキナーゼの役割（Ｒｅｅｖｅｓ他、２００５）は、マウスにおけるウイルス拡散および生存率に対するＡｂｌキナーゼ阻害剤（例えば、Ｇｌｅｅｖｅｃ ａｎｄ ＰＤ−１６６３２６）の効果を調べることによって確立された。液体クロマトグラフィー質量分析を使用してマウス血清中におけるこれらの化合物を検出し、マウスにおけるこれらの化合物の半減期を測定するための方法を開発した（Ｗｏｌｆｆ他、２００５）。これらの技術は、血清試料中のＤＡＭ ＭＴアーゼ阻害化合物の検出に容易に適用できる。いくつかの化合物は、口腔洗浄によって送達できるが、その他のものはマウスで測定された半減期は短く（約４時間）、感染前後に皮下に設置した連続放出Ａｚｌｅｔ浸透圧ポンプによって送達する必要がある。化合物の可溶化、またはそれとは別に生体利用効率の増加といったその他の方法を使用することができる。これらの方法を組み合わせて、マウスにおける病原性微生物によって引き起こされる感染をうまく治療することを可能にした。
【０１５８】
[00198] 阻害機構の研究。阻害機構、ＡｄｏＭｅｔまたはＤＮＡと競合、反競合、または非競合の機構を明らかにするために、３種のリード化合物の作用機構を反応速度論的に分析する。阻害剤が補酵素結合、特異的ＤＮＡ結合または構造的変化を妨害するかどうかに関する情報は、ドッキング研究に基づいた予測と比較することができる。最終的に、Ｄａｍ阻害剤複合体の共結晶化を実施する。Ｄａｍ阻害剤複合体構造から得られた情報は、より望ましい薬理学的特性を備えた化合物ライブラリーの合成によって、同一の機能的コア構造に関する誘導体を生じる構造的変動部位を同定するために使用する。
【０１５９】
[00199] 反応速度論的研究は、補酵素およびＤＮＡ結合をさらに研究するために様々な他の確立されたアッセイによって補足することができる。
【０１６０】
[00200] ＤＮＡ結合研究。ＥｃｏＤａｍおよびその他のＭＴアーゼによるＤＮＡ結合は、ニトロセルロールフィルター結合および表面プラズモン共鳴（ＢｉａＣｏｒｅ）を使用して研究することができる。これらのアッセイによって、平衡結合定数および結合平衡に対する阻害剤の効果の迅速で信頼できる測定が可能である。ＳＰＲ ＢｉａＣｏｒｅはまた、ＤＮＡ結合および遊離の速度定数の測定を可能にする。
【０１６１】
[00201] ＡｄｏＭｅｔ結合研究。ＥｃｏＤａｍに対するＡｄｏＭｅｔ結合の反応速度論は、Ｔｒｐ１０に対する固有蛍光の変化によって直接モニターすることができる（Ｌｉｅｂｅｒｔ ａｎｄ Ｊｅｌｔｓｃｈ、未公表）。蛍光効果は、２要素および３要素複合体で検出することができる。したがって、このアッセイによって、ＡｄｏＭｅｔ結合に対する阻害剤のいかなる効果も直接高い感度で測定することが可能である。
【０１６２】
[00202] 標的塩基フリッピング（２ＡＰをベースにしたアッセイ）。本発明の目的は、特異的ＧＡＴＣ部位に対するＤａｍ酵素の結合および立体構造変化を特異的に妨害する阻害剤を開発することである。メチル化より先に生じる酵素−ＤＮＡ複合体の最も印象深い構造変化は、ＤＮＡらせんの外への標的塩基のフリッピングである。塩基フリッピングの機構は、２−アミノプリンを含有する基質を使用したストップトフロー反応速度論によって研究されてきた。この塩基アナログは、ＤＮＡ屈曲および塩基フリッピングの後に強い蛍光シグナルを生じ、ＥｃｏＤａｍ中の２−アミノプリンシグナルは塩基フリッピングに相関する（Ｌｉｅｂｅｒｔ他、２００４）。この測定の結果は、塩基フリッピングおよびＤＮＡ認識が強くつながり絡み合ったプロセスであることを示している。塩基フリッピングは２相様式で生じ、第１に標的塩基は非常に速い反応でＤＮＡの外側に回転し、その後、この標的塩基は酵素と緊密に接触して、活性部位ポケット内に配置する（Ｌｉｅｂｅｒｔ他、２００４）。標的塩基の結合ポケットに結合する阻害剤は、塩基フリッピングを特異的に妨害することができる。平衡化した２−アミノプリン蛍光にしたがって、迅速な反応速度論的方法を使用することによって、この立体構造変化に対するＭＴアーゼ阻害剤の潜在的な影響を調べることができる。
【０１６３】
[00203] 図３６（Ｙａｎｇ他、Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１０：８４９〜８５５）は、選択したＤａｍ ＭＴアーゼオルソログの配列データをまとめて示す。ＳＷＩＳＳＰＲＯＴデータベースアクセション番号は、バクテリオファージＴ４（Ｔ４ｄａｍ−Ｐ０４３９２）、大腸菌（ＥｃｏＤａｍ−Ｐ００４７５）、制限−修飾ＭＴアーゼ（ＥｃｏＲＶ−Ｐ０４３９３）およびＤｐｎＩＩＡ（Ｐ０４０４３）である。Ｔ４Ｄａｍの２次構造を、配列の上に示す（円柱はらせん、矢印は鎖）。図３７は、Ｘ線回折によって得られたＥｃｏＤａｍ−ＡｄｏＭｅｔ−ＤＮＡ３要素複合体の三次元構造である。
【０１６４】
[00204] 置換基の群を本明細書で開示するとき、群構成メンバーの任意の異性体および鏡像異性体を含む群および下位群全部の個々の構成メンバー全て、ならびに置換基を使用して形成され得る化合物種は別々に開示されることを理解されたい。１化合物を特許請求するとき、本明細書で開示した参考文献で開示されている化合物を含む当分野で公知の化合物は含まれないものとすることを理解されたい。マルクーシュ（Ｍａｒｋｕｓｈ）群またはその他の群分けを本明細書で使用するとき、その群の個々の構成メンバー全てならびに群の可能性のある全組み合わせおよび下位組み合わせは個々に開示に含まれるものとする。
【０１６５】
[00205] 説明した、または例示した成分の全製剤または組み合わせは、特記しない限り本発明を実施するために使用することができる。当業者が同一の化合物を様々に呼ぶことができることが知られているので、化合物の特定の名称は例示のためとする。例えば、式または化学名で、化合物の特定の異性体または鏡像異性体を明記しないように１化合物を本明細書で記載するときは、その記載は、個々に、または組み合わせて記載した化合物のそれぞれの異性体または鏡像異性体を含むものとする。当業者は、具体的に例示されたもの以外の方法、装置要素、開始物質、合成方法、構造、ライブラリーおよびアッセイは、不適切な実験に頼らずに本発明の実施で使用できることを理解するだろう。このような方法、装置要素、開始物質、合成方法、構造、ライブラリーおよびアッセイの当分野で公知の機能的同等物は全て、本発明に含まれるものとする。明細書において範囲、例えば、温度範囲、時間範囲、または組成物範囲が与えられるときはいつでも、中間の範囲および小範囲全て、ならびに与えられた範囲に含まれる個々の値は、この開示に含まれるものとする。
【０１６６】
[00206] 本明細書では、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」または「特徴とする（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｂｙ）」と同義で、包括的または制限がなく、他の引用していない要素または方法ステップを除外しない。本明細書では、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、特許請求項で明記していない要素、ステップまたは成分を除外する。本明細書では、「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、特許請求の範囲の基礎的で新しい特徴に著しく影響を及ぼさない物質またはステップは除外しない。特に、組成物の成分の説明または装置の要素の説明における「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語の本明細書での説明は、引用した成分または要素から本質的になる組成物および方法を包含するものと理解される。本明細書で適切に例示して説明された本発明は、本明細書で具体的に開示されていない要素、制限等がなくても実施することができる。
【０１６７】
[00207] 正確な製剤、投与経路および用量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択することができる（例えば、Ｆｉｎｇｌ他、「Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、１９７５、Ｃｈ．１．ｐ．１参照）。
【０１６８】
[00208] 主治医は、毒性、または器官不全が原因で、投与をどのように、いつ終了、中断または調節するかを承知していることに注意されたい。反対に、主治医はまた、臨床反応が不適切な場合（毒性を除いて）、処置をより高レベルに調節することを承知している。関心のある障害の管理において、投与量を治療する状態の重症度および投与経路によって変化させる。状態の重症度は、例えば、部分的には、標準的予後評価法によって評価することができる。さらに、用量およびおそらく投与頻度はまた、個々の患者の年齢、体重および応答によって変化するだろう。前記で考察したものと同等のプログラムはまた、獣医薬で使用することができる。
【０１６９】
[00209] 治療する特定の状態および選択された標的化方法に応じて、このような薬剤は製剤され、全身的または局所的に投与することができる。製剤化および投与の技術は、Ａｌｆｏｎｓｏ ａｎｄ Ｇｅｎｎａｒｏ（１９９５）に見いだすことができる。適切な経路は、例えば、経口、経直腸、経皮、経膣、粘膜内、または腸内投与、筋肉内、皮下、または脊髄注射、およびクモ膜下腔内、静脈内、または腹腔内注射を含む非経口的送達を含むことができる。
【０１７０】
[00210] 注射用には、本発明の薬剤は、水性溶液、好ましくはハンクス溶液、リンゲル液、または生理食塩水緩衝液などの生理学的に適合した緩衝液で製剤化してよい。経粘膜投与用には、浸透すべきバリアーに適した浸透剤を製剤中に使用する。このような浸透剤は、当分野では一般的に知られている。
【０１７１】
[00211] 本発明を実施するために本明細書で開示した化合物の製剤化するために、薬剤として許容される担体を全身投与に適した投与薬剤に使用することは、本発明の範囲内である。担体を適切に選択し、適切に製造を実施して、本発明の組成物を、特に溶液として製剤化された組成物を非経口的に、静脈注射などによって投与することができる。適切な化合物は、経口投与に適した投与薬剤に当分野で周知の薬剤として許容される担体を使用して、容易に製剤化することができる。このような担体は、本発明の化合物を、治療する患者によって経口摂取されるように、錠剤、丸剤、カプセル、液剤、ジェル、シロップ、スラリー、懸濁物などとして製剤化することができる。
【０１７２】
[00212] 細胞内に投与するように企図された薬剤は、当業者に周知の技術を使用して投与することができる。例えば、このような薬剤は、リポソームに封入することができ、次に前述のように投与することができる。リポソームは、水性内部を有する球状の脂質二重層である。リポソーム形成のときに水性溶液中に存在する分子は全て、水性内部に取り込まれる。リポソーム内容物は、外部微小環境から保護されると同時に、リポソームは細胞膜と融合しているので、細胞質に効果的に輸送される。さらに、疎水性であることによって、有機小分子は、直接細胞内に投与されてもよい。
【０１７３】
[00213] 本発明での使用に適した医薬組成物には、活性成分が企図する目的を実現するのに有効な量で含有される組成物が含まれる。有効量の決定は、特に、本明細書で提供した詳細な開示を踏まえて、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１７４】
[00214] 活性成分に加えて、これらの医薬組成物は、賦形剤および、活性化合物の薬剤として使用できる調製物への加工を容易にする補助剤を含む適切な薬剤として許容される担体を含有することができる。経口投与用に製剤化された調製物は、遅延放出するため、または薬剤が小腸または大腸に到達したときにのみ放出されるために製剤化されたものを含む、錠剤、ドラジェ、カプセルまたは溶液の形態であってよい。
【０１７５】
[00215] 本発明の医薬組成物は、従来の混合、溶解、顆粒化、ドラジェ生成、浮揚、乳化、カプセルへの密封、封入、または凍結乾燥方法によって、それ自体公知の方法で製造することができる。
【０１７６】
[00216] 非経口投与用医薬製剤には、水溶性形態の活性化合物の水性溶液が含まれる。さらに、活性化合物の懸濁物は、適切な油状注射懸濁物として調製することができる。適切な親脂質性溶媒または媒体には、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームが含まれる。水性注射懸濁物は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランなどの懸濁物の粘度を増加させる物質を含有することができる。場合によって、この懸濁物はまた、適切な安定化剤または高濃度溶液の調製を可能にする化合物の溶解度を増加させる薬剤を含有することができる。
【０１７７】
[00217] 経口使用のための医薬品調製物は、活性化合物を固形賦形剤と一緒にして、場合によって得られた混合物を粉砕して、所望するならば、錠剤またはドラジェコアを得るために、適切な補助剤を添加した後、顆粒混合物を加工して得ることができる。適切な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖などの注入剤、例えば、トウモロコシ澱粉、コムギ澱粉、コメ澱粉、馬鈴薯澱粉、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などのセルロース調製物である。所望するならば、架橋結合ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸またはアルギン酸ナトリウムなどのそれらの塩などの崩壊剤を添加することができる。
【０１７８】
[00218] ドラジェコアには、適切なコーティングを施す。この目的のために、場合によってアラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコールおよび／または２酸化チタン、ラッカー溶液および適切な有機溶媒または溶媒混合物を含有することができる濃縮糖溶液を使用することができる。染料または顔料は、同定のために、または活性化合物投与の様々な組み合わせを特徴付けるために錠剤またはドラジェコーティングに添加することができる。
【０１７９】
[00219] 経口に使用できる医薬品調製物には、ゼラチンでできている押し込み型カプセル、ならびに、ゼラチンおよびグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤でできている密封式軟カプセルが含まれる。押し込み型カプセルは、ラクトースなどの注入剤、澱粉などの結合剤、および／またはタルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの光沢剤、場合によって安定化剤と混合して活性成分を含有することができる。軟カプセルでは、活性化合物は、脂肪油、液体パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどの適切な液体に溶解または懸濁することができる。さらに、安定化剤を添加することができる。
【０１８０】
[00220] 本願明細書を通して、文献を挙げた表９を含む参考文献、例えば、交付された、または登録された特許または同等物を含む特許文書、特許出願公報および非特許文献文書またはその他の情報源材料は全て、まるで、個々が参考として援用されるように、各参考文献が本願明細書の開示と少なくとも部分的に不一致ではない範囲まで、参考として本明細書に援用される（例えば、部分的に不一致な参考文献は、参考文献の部分的な不一致な部分を除外して参考として援用される）。
【０１８１】
【表１】

【０１８２】
【表２】

【０１８３】
【表３】

【０１８４】
【表４】

【０１８５】
【表５】

【０１８６】
【表６】

【０１８７】
【表７】

【０１８８】
【表８】

【０１８９】
【表９−１】

【０１９０】
【表９−２】

【０１９１】
【表９−３】

【０１９２】
【表９−４】

【０１９３】
【表９−５】

【０１９４】
【表９−６】

【０１９５】
【表９−７】

【０１９６】
【表９−８】

【図面の簡単な説明】
【０１９７】
【図１】ＤａｍによるＤＮＡアデニンメチル化を示す図である。Ｄａｍは、ＧＡＴＣ配列のアデニン残基において、ＡｄｏＭｅｔからＮ６原子へのメチル基の転移を触媒する。
【図２】Ｔ４Ｄａｍ−ＡｄｏＨｃｙ構造を示す図である。Ａ．ＡｄｏＨｃｙと複合体を形成しているＴ４Ｄａｍの２次構造をリボンで表した図である（ボールスティックモデル）。Ｂ．ヘアピンループは、ＤＮＡ（配列特異的および非特異的）相互作用に関連する保存された残基を有する。Ｃ．選択されたＤａｍ ＭＴアーゼオルソログのヘアピンループの配列アラインメント。Ｓｔｙ：サルモネラ・チフィムリウム、Ｓｍａ：セラチア・マルセッセンス、Ｙｐｅ：エルシニア・ペスティス、Ｖｃｈ：ビブリオ・コレラ。
【図３】Ｔ４Ｄａｍ−ＡｄｏＨｃｙ−１２塩基ＤＮＡ構造を示す図である。Ｄａｍ複合体の１２塩基ＤＮＡへの非特異的結合の２つの直交投影図。Ａ．分子Ａは、１個のＤＮＡ分子に結合し、分子Ｂは２個のＤＮＡ分子の結合部に結合する。Ｂ．ＤＮＡのらせん軸の下視図である。Ｃ．分子Ｂのヘアピンループは、ＤＮＡ結合部の近くにあるが、ＤＮＡとは特異的な接触を行わない。
【図４】Ｔ４Ｄａｍ−ＡｄｏＨｃｙ−１３塩基ＤＮＡの３次構造を示す図である。この構造は登録されている（ＰＤＢ １ＹＦ３）。Ａ．２個のＤＮＡ分子（右側に示す。らせん軸はページから突き出ている。）は、互いに相手のＤＮＡ軸に対して垂直にずれている。Ｂ．非特異的複合体（分子Ａ）および１／４−部位認識複合体（分子Ｂ）におけるタンパク質−ＤＮＡ接触の概略を示す図である。Ｃ．結合部に結合したＤａｍ（分子Ｂ）のヘアピンループのＦ１１１は５’Ｔｈｙに重なる。Ｄ．Ｒ１１６−Ｇｕａ、Ｐ１２６−ＴｈｙおよびＭ１１４−Ｔｈｙでは、特異的相互反応が認められる。
【図５】Ｔ４Ｄａｍ−ＡｄｏＨｃｙ−１５塩基ＤＮＡの構造を示す図である。この構造は登録されている（ＰＤＢ １ＹＦＪ）。Ａ．２個のＤＮＡ２本鎖の間の結合部は全て、ＣまたはＤとして示されたＤａｍ分子によって占有され、他方、１個の特異的ＧＡＴＣ部位のみが分子Ｅと結合する。Ｂ．Ｄａｍ分子ＣのヘアピンループのＦ１１１は、２個の５’Ｔｈｙに重なる。Ｃ．Ｒ１１６、Ｐ１２６、Ｍ１１４、Ｓ１１２、Ｇ１２８およびＲ１３０によって特異的相互作用が媒介される。
【図６】Ｔ４ＤａｍＦ１１１の挿入を示す図である。（Ａ）分子Ｅと標準ＧＡＴＣ部位との間の相互作用。水色の破線の円は、フリッピングしたＡｄｅを示す。Ｔ４ＤａｍのＤＮＡへの挿入領域は、濃青色の破線の円で示し、右図に拡大して示す。分子ＥのＦ１１１はＡＴ塩基対とＴｈｙ：Ｓ１１２「塩基−アミノ酸」対の間に挿入する。（Ｂ）ＡｄｏＭｅｔ、ＡｄｏＨｃｙおよびシネフンギンの化学構造。（Ｃ）シネフンギン存在下での活性部位の立体構造（ＰＤＢコード１ＹＦＬ）。変化しないＮ末端残基Ｋ１１は、Ｄ１７１およびＹ１７４の側鎖ならびにＧ９の主鎖カルボニル酸素と相互作用し、同様のＤ１７１−Ｋ１１−Ｙ１７４相互作用は、Ｔ４Ｄａｍ−ＡｄｏＨｃｙの２次構造においても認められた（Ｙａｎｇ他、２００３）。Ｋ１１Ｓ置換により実質的に酵素活性が消失するので、このＤ１７１−Ｋ１１−Ｙ１７４相互作用は正常な機能に必須なようである（Ｖ．Ｇ、Ｋｏｓｓｙｋｈ、Ｓ．Ｌ．Ｓｃｈｌａｇｍａｎ ａｎｄ Ｓ．Ｈ．、未公表データ）。Ｋ１１のアミノ基はまた、標的Ａｄｅの環Ｎ１原子に隣接する。Ｍ．ＥｃｏＲＶの対応するＬｙｓの変異体（Ｋ１６Ｒ）は、標的塩基に対する特異性の改変を示した（Ｒｏｔｈ ａｎｄ Ｊｅｌｔｓｃｈ、２００１）。
【図７】非標準部位との相互作用を示す図である。（Ａ）オレンジ色で示したＤＮＡ分子の中央ＡＴ重なりへの分子ＥによるＦ１１１の挿入は、１塩基対の延長を効果的に引き起こす。この延長は、隣接する２本鎖（赤紫）の２個の不規則なヌクレオチド（影付き）を生じる。（Ｂ）分子Ｄと非標準部位との間の相互作用。赤紫ＤＮＡのオーバーハングした５’−Ｔｈｙが突出して、外見上不規則になり、次の塩基対のＣｙｔがＤａｍ分子ＤのＦ１１１と重なることになる。（Ｃ）Ｒ１３０および外部Ｇ：Ｃ塩基対、並びにＳ１１２−Ｃｙｔの詳細な相互作用。
【図８】ＥｃｏＤａｍ変異体の生化学分析を示す図である。（Ａ）特定の複合体におけるタンパク質−ＤＮＡ塩基接触の概略およびＴ４Ｄａｍ（Ｇ１１０−Ｔ１３１、認識配列ＧＡＴＣ）、ＥｃｏＤａｍ（Ｇ１１８−Ｋ１３９、認識配列ＧＡＴＣ）およびＥｃｏＲＶ（Ｃ１２２−Ｐ１４３、認識配列ＧＡＴＡＴＣ）のβヘアピンループの配列アラインメント。フリッピングした標的塩基は影付きＸで示す。ＥｃｏＤａｍに生じた点突然変異を示す（残基の番号の違いに注意）。Ｔ４Ｄａｍのｉｎ ｖｉｖｏにおける通常の基質は、Ｃｙｔの代わりにグリコシル化５−ヒドロキシメチル−Ｃｙｔ（ｈｍＣｙｔ）を有するファージＤＮＡであることに注意されたい。ファージｈｍＣｙｔ含有ＤＮＡ（グリコシル化があってもなくてもよい。）は、ＥｃｏＤａｍによってメチル化されない（Ｈａｔｔｍａｎ、１９７０）。本明細書に示した構造から明らかなように、回文構造のＧＡＴＣ部位においてＣｙｔ塩基（Ｃｙｔ１またはＣｙｔ４）はいずれもＴ４Ｄａｍとは接触しない。特定の複合体では、タンパク質とこれらの塩基との間の最短距離は、Ｃｙｔ４からＶ１７８までの６．３Å、およびＣｙｔ１からＫ１２９までの７．７Åである。この点に関して、ＥｃｏＤａｍは両方の位置、すなわち、Ｖ１７８に隣接した６個の追加的残基およびＫ１２９に隣接した２個の追加的残基に挿入物を有する（Ｙａｎｇ他、２００３の図１参照）。ＥｃｏＤａｍのこれらの追加的残基は、いずれかのｈｍＣｙｔ塩基（または両方）のヒドロキシメチル基と立体的に衝突し、ＤＮＡのメチル化から酵素を防御することができる。野生型ＥｃｏＤａｍおよびその変異体のシングルターンオーバーＤＮＡメチル化速度（Ｂ）およびＤＮＡ結合親和性（Ｃ）。ＥｃｏＤａｍ変異体はクローニングされ、大腸菌で発現し、均一に精製された。
【図９】ＥｃｏＤａｍの特異性プロファイルを示す図である。（Ａ〜Ｅ）野生型および変異体のシングルターンオーバーメチル化速度を、コグネイトＧＡＴＣ（水色の棒）およびニアコグネイト基質９種全てについて示す。水平軸上には、変異したＧＡＴＣ部位の３個の位置を示す（Ｇ＝ＧＡＴＣ、Ｔ＝ＧＡＴＣ、Ｃ＝ＧＡＴＣ）。右の軸には、各位置に導入された新たな塩基を明記する（一例については図１２参照）。酵素および基質の各々の対のメチル化速度を垂直軸に示す。（Ａ）野生型、（Ｂ）Ｒ１２４Ａ、（Ｃ）Ｐ１３４Ａ、（Ｄ）Ｐ１３４Ｇおよび（Ｅ）Ｌ１２２Ａ。（Ｆ〜Ｈ）ＧＡＴＣ配列の４番目（Ｓ４）（Ｆ）および３番目（Ｓ３）の位置の認識に関するＥｃｏＤａｍ変異体の特異性因子および全特異性因子（Ｈ）。値は全て、野生型に対する相対的変化で示す。野生型ＥｃｏＤａｍの特異性因子は５４０であり、この値はＬ１２２Ａ変異体の場合少なくとも３０倍に増加した。Ｌ１２２Ａ変異体ではニアコグネイト部位で活性が検出されなかったので、ここに挙げた特異性因子が下限であり、矢印で示してある。Ｒ１２４Ａ、Ｐ１３４ＡおよびＰ１３４Ｇ変異体の特異性は劇的に減少した。その他の変異体全ての特異性因子は、野生型酵素と比較して大きな変動を示さなかった。
【図１０】ＤＮＡ軸に対するタンパク質ヘアピンループの向きによって示されたＴ４Ｄａｍ−ＤＮＡ複合体構造のスナップ写真を示す図である。（Ａ）リン酸接触に関与するＲ１３０との非特異的複合体。（Ｂ）リン酸接触に関与するＲ１１６との非特異的複合体。（Ｃ）塩基特異的接触に関与するＲ１１６、リン酸接触におけるＮ１１８およびＲ１３０との１／４部位複合体。（Ｄ）塩基特異的接触に関与するＲ１１６およびＲ１３０、リン酸接触におけるＮ１１８との３／４部位複合体。（Ｅ）非標準部位との相互作用、および（Ｆ）全部位複合体。
【図１１】（Ａ）３／４部位複合体、（Ｂ）非標準部位および（Ｃ）特異的全部位におけるタンパク質−ＤＮＡ接触の概略を示す図である。
【図１２】ＥｃｏＤａｍ変異体の特異性プロファイルを示す図である。ＷＴ ＥｃｏＤａｍおよびＹ１１９Ａ、Ｎ１２０ＡおよびＳ、Ｒ１３７Ａ、Ｙ１３８ＡおよびＫ１３９Ａ変異体の特異性プロファイルを示す。この図では、野生型および変異体のシングルターンオーバーメチル化速度を、コグネイトＧＡＴＣ（水色の棒）およびニアコグネイト基質９種全てについて示す。水平軸上には、変異したＧＡＴＣ部位の３個の位置を示す（Ｇ＝ＧＡＴＣ、Ｔ＝ＧＡＴＣ、Ｃ＝ＧＡＴＣ）。右の軸には、各位置に導入された新たな塩基を明記する。酵素および基質の各々の対のメチル化速度を垂直軸に示す。
【図１３】ＥｃｏＤａｍ−ＡｄｏＨｃｙ−１２塩基ＤＮＡの構造を示す図である。明確化のために、第２のＤＮＡ分子は示していない。（Ｂ）はＤＮＡ分子のらせん軸の下視図である。
【図１４】ＥｃｏＤａｍ−ＡｄｏＨｃｙ−１２塩基ＤＮＡの構造を示す図である。２個のＤＮＡ２本鎖（太字のものおよび太字でないもの）は逆向きに重なり合い、１個のＧＡＴＣ部位は各２本鎖の中央にあり、もう１個は２個の２本鎖の結合部位にある。らせん外の位置のヌクレオチドは、青丸の中に影をつけてある。（Ｂ）分子Ａは、各ＤＮＡ２本鎖の中央のＧＡＴＣ部位に結合し、他方、ＥｃｏＤａｍ分子Ｂは２個のＤＮＡ２本鎖の結合部に結合する。（Ｃ）ＥｃｏＤａｍは２個のドメイン、すなわちＡｄｏＨｃｙの結合部位（スティックモデルで表す。）を備えた７本鎖触媒ドメイン、ならびに５本のヘリックスの束、およびＧＡＴＣ関連ＭＴアーゼオルソログのファミリーで保存されているβヘアピンループから成るＤＮＡ結合ドメインを含有する。青緑色のＮ末端残基７〜１０はまた、ＤＮＡと相互作用する（Ｅ参照）。（Ｄ）ＥｃｏＤａｍおよびＴ４Ｄａｍの比較。Ｔ４Ｄａｍでは、残基６個分短い活性部位ループが弁の閉じた（ｃｌｏｓｅｄ−ｆｌａｐ）補因子結合部位の形成に関与し（Ｙａｎｇ他、２００３）、他方、β６鎖とβ７鎖との間の残基は不規則であり（Ｙａｎｇ他、２００３）、結晶充填接触に関与するときにのみ規則正しくなる（Ｈｏｒｔｏｎ他、２００５）。（Ｅ）分子Ａ（赤）および分子Ｂ（灰色）のタンパク質−ＤＮＡ接触の概要。相互作用を媒介する主鎖は、主鎖アミン（Ｎ）またはカルボニル（Ｏ）で示されている。簡単にするために、相互作用を媒介する水（ｗ）を１個のみ示す。１組のＤＮＡ２本鎖（青）に注目すると、２２個のリン酸基のうち２０個は３個のＥｃｏＤａｍ分子（Ａ、Ｂ、および対称性を有する分子Ｂ）と相互作用する。したがって、最適な結晶化のために使用したオリゴヌクレオチドの選択された長さ（１２塩基対）および末端配列は、充填の結晶格子におけるＤＮＡ−タンパク質相互作用およびＤＮＡ媒介タンパク質−タンパク質相互作用を最大化した。ＥｃｏＤａｍ相互作用に関与しないリン酸基は２個だけであり、これは中央ＧＡＴＣ部位の２個のＴｈｙの５’リン酸であり、これらは結合部のＧＡＴＣ部位において失われたリン酸である。オーファンＴｈｙのすぐ側のリン酸基は、Ｓ１９８（高い熱Ｂ因子を有する）、すなわち構造化されていないループ（残基１８８〜１９７）の後ろの最初の規則正しい残基と全く相互作用しない（５’リン酸）か、または弱く相互作用する（３’リン酸）のみである。束縛の少ない立体構造によって、オーファン部位のＤＮＡ主鎖の周りの結合回転が可能であり、Ｔｈｙはらせん外の位置に移動し、Ｔｈｙ−Ｎ１２０相互作用を妨害する。
【図１５】ＥｃｏＤａｍ−ＤＮＡ塩基相互作用を示す図である。（Ａ）標的Ａｄｅは、ＤＰＰＹモチーフにより形成された活性部位ポケットの外側の端で、選択的ヌクレオチド結合部位に結合している（左図）。この標的Ａｄｅは、平均を３．５σ上回る輪郭を描いた電子密度地図略図（塩基およびリボースを省く。）と重なる（中図）。ＤＮＡ主鎖の３個の結合の周りが大きく回転することによって、Ａｄｅは活性部位に挿入される（右図）。Ｍ．Ｔａｑｌ−ＤＮＡ複合体で示されたように（Ｇｏｅｄｅｃｋｅ他、２００１）、ＡｄｏＨｃｙの硫黄原子上に付けられた転移可能なメチル基は、Ａｄｅ塩基の平面の外に横たわり、標的窒素原子の脱共役孤立電子対と符合し、直線方向へのメチル基転移（矢印で示した。）のための位置を取る。（Ｂ）中央ＧＡＴＣ部位を有する青ＤＮＡ２本鎖の主溝中の分子Ａ（赤）のヘアピンループ。（Ｃ）ＧＡＴＣの第１塩基対（Ｇ：Ｃ）との相互作用。点線は水素結合を表す。（Ｄ）平均を３．５σ上回る輪郭を描いた電子密度地図略図と重なり、Ｒ１３７の側鎖と重なったフリッピングオーファンＴｈｙ。オーファン塩基の局所的立体構造変化はまた、Ｍ．ＨａｅＩＩＩ−ＤＮＡ（塩基修復）（Ｇｏｅｄｅｃｋｅ他、２００１、Ｒｅｉｎｉｓｃｈ他、１９９５）およびＭ．ＴａｑＩ−ＤＮＡ構造（らせんの中央への塩基移動）（Ｇｏｅｄｅｃｋｅ他、２００１、Ｒｅｉｎｉｓｃｈ他、１９９５）において認められた。２個の塩基フリッピングは、ＤＮＡ修復酵素エンドヌクレアーゼＩＶおよびそのＤＮＡ基質の構造（Ｈｏｓｆｉｅｌｄ他、１９９９）ならびに２ＡＰ−含有ＤＮＡを使用したＭｕｔＹアデニンＤＮＡグリコシラーゼによるストップトフロー蛍光研究（Ｂｅｒｎａｒｄｓ他、２００２）において既に認められている。しかし、ＭｕｔＹ−ＤＮＡ損傷含有複合体の構造において、ｏｘｏＧ損傷は完全にＤＮＡ複合体中にあり、他方、Ａｄｅはフリッピングした（Ｆｒｏｍｍｅ他、２００４）。これらのことを考えると、これらの研究は、ＥｃｏＤａｍに結合したオーファンＴｈｙのように、ｏｘｏＧはらせん内部またはらせん外部のいずれかに位置することができることを示唆している。（Ｅ）ＧＡＴＣの第３塩基対（Ｔ：Ａ）との相互作用。メチル基はＡｄｅの環外アミノ窒素Ｎ６原子上に付けられている。両矢印はファンデルワールス接触を示す。（Ｆ）ＧＡＴＣの第４塩基対（Ｃ：Ｇ）との相互作用。（Ｇ）２個のＤＮＡ２本鎖の結合部におけるオーファンＴｈｙ−Ｎ１２０の相互作用。このＴｈｙ−Ｎ１２０相互作用は、Ｔ４ＤａｍのＴｈｙ−Ｓ１１２（Ｈｏｒｔｏｎ他、２００５）、Ｍ．ＨｈａＩのＧｕａ−Ｑ２３７（Ｋｌｉｍａｓａｕｓｋａｓ他、１９９４）など、塩基フリッピング酵素のタンパク質側鎖−オーファン塩基相互作用と同様である。（Ｈ）２本のＤＮＡ分子（緑および青）の結合部における分子Ｂ（赤）のヘアピンループ。第１、第３および第４塩基対の相互作用は、分子Ａ（図Ｂ参照）のものと同一である。
【図１６】Ｎ末端Ｋ９による第１塩基対の認識を示す図である。（Ａ）２つの領域、βヘアピンループおよびＮ末端ループにおけるＥｃｏＤａｍおよびＴ４Ｄａｍのペアワイズ配列アラインメント。赤色の残基は、部位特異的変異誘発の標的である。（Ｂ〜Ｃ）ＥｃｏＤａｍ野生型（Ｂ）およびＫ９Ａ変異体（Ｃ）の特異性プロファイル。野生型およびＫ９Ａ変異体のシングルターンオーバーメチル化速度を、コグネイトのヘミメチル化ＧＡＴＣ基質（水色の棒）およびニアコグネイトヘミメチル化基質９種全てについて示す。水平軸上には、変異したＧＡＴＣ部位の３個の位置を示す（Ｇ＝ＧＡＴＣ、Ｔ＝ＧＡＴＣ、Ｃ＝ＧＡＴＣ、Ｍ＝Ｎ６ｍＡ）。右の軸には、各位置に導入された新たな塩基を明記する。酵素および基質の各々の対のメチル化速度を垂直軸に示す（対数目盛に注意）。（Ｄ）ＧＡＴＣ配列の最初の位置（Ｓ１）の認識に関するＥｃｏＤａｍ変異体の特異性因子（実験方法で定義した）。この値は、野生型に対する相対的変化で示す。ＧＡＴＣの第３または第４塩基対がＫ９Ａ変異体で改変されたニアコグネイト部位では活性が検出されなかったので、ここに挙げたＳ１因子が下限であり、矢印で示した。野生型ＥｃｏＤａｍおよびＫ９Ａの特異性因子は、図ＢおよびＣに挙げたデータを用いて計算し、その他の全変異体のデータはＨｏｒｔｏｎ他、２００５から得た。
【図１７】ＥｃｏＤａｍおよびその変異体の塩基フリッピングを示す図である。（Ａ）ＥｃｏＤａｍ存在下でのいくつかのＤＮＡ基質の蛍光強度。この図は、標的Ａｄｅ（青色の曲線）、オーファンＴｈｙ（オレンジ色の曲線）、最初の対のＧｕａ１位置（緑色の曲線）およびＧＡＴＣのすぐ隣の５’位（赤色の曲線）の位置の２ＡＰの蛍光を示す。ピンク色の曲線は、対照のフリーなＤＮＡ（ヘミメチル化Ｇ−２ＡＰ−ＴＣ）を示し、黒色の曲線はフリーな酵素を示す。（Ｂ）ＥｃｏＤａｍおよびその変異体の結合中のヘミメチル化Ｇ−２ＡＰ−ＴＣの相対的蛍光変化。（Ｃ）標的Ａｄｅ（青色の曲線）およびオーファンＴｈｙ（オレンジ色の曲線）の位置に２ＡＰプローブを含有する基質を使用した塩基フリッピングのストップトフロー研究。この青色の曲線は、最初の１００ｍｓｅｃの間に蛍光が増加し、続いて１秒後に蛍光が減少する２相性反応を示す。（Ｄ）標的位置に２ＡＰを含有する基質（青色の曲線）、および認識部位の第１（ピンク色の曲線）、第３（緑色の曲線）または第４（赤色の曲線）の塩基対に１個の塩基対置換を有する３種のニアコグネイト基質を使用した塩基フリッピングのストップトフロー研究。（Ｅ〜Ｇ）様々な基質：（Ｅ）Ｒ１２４Ａ、（Ｆ）Ｐ１３４Ｇおよび（Ｇ）Ｋ９ＡによるＥｃｏＤａｍ変異体の塩基フリッピングのストップトフロー研究。
【図１８】非メチル化とヘミメチル化ＤＮＡとの間の区別を示す図である。非メチル化（四角）およびヘミメチル化（菱形）オリゴヌクレオチド基質の（Ａ）ＥｃｏＤａｍ（ＷＴ）および（Ｂ）Ｌ１２２Ａ変異体によるメチル化。
【図１９】非標準複合体の構造を示す図である。（Ａ）ＥｃｏＤａｍ分子Ｃは、改変された認識部位を模倣した２個のＤＮＡ２本鎖の結合部に優先的に結合し、Ｔ４Ｄａｍの構造データ（Ｈｏｒｔｏｎ他、２００５）およびその他のＤＮＡ ＭＴアーゼの生化学データ（Ｃｈｅｎｇ ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔｓ、２００１、Ｋｌｉｍａｓａｕｓｋａｓ ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔｓ、１９９５）と合致する。ここでは、部分的認識部位（特に、５’Ｇ：Ｃ塩基対）が存在すれば、ＥｃｏＤａｍによる安定な複合体形成に十分である。青色の円は不規則なＡｄｅを示す。（Ｂ）タンパク質−ＤＮＡ接触の概要。２個のＤＮＡ２本鎖（緑および青）は逆向きに重なり合い、２個の２本鎖の結合部に１個のＴ：Ｔ誤対合がある。相互作用を媒介する主鎖は、主鎖アミン（Ｎ）またはカルボニル（Ｏ）で示される。（Ｃ〜Ｈ）ＥｃｏＤａｍ分子ＣとのＤＮＡ相互作用の詳細。（Ｉ）非標準部位およびＰａｐ ＧＡＴＣ隣接配列のＤＮＡ配列比較。（Ｊ）ｐａｐ調節配列の構成。数字（１〜６）は、６個のロイシン応答調節タンパク質（Ｌｒｐ）結合部位を示す（Ｈｅｒｎｄａｙ他、２００３）。６個のＬｒｐ結合部位の中で、部位２および５はＧＡＴＣ配列を含有する（上図）。それぞれの標的Ａｄｅ（赤または緑の影付き）をメチル化するためにＤＮＡに沿って移動するＤａｍ分子（赤または緑の円）のモデルは、非コグネイト部位（赤または緑の箱）の１つで捉えられる。
【図２０】標準および非標準複合体の構造比較を示す図である。（Ａ）標準複合体（灰色の分子Ａおよび青色のＤＮＡ）と非標準複合体（分子Ｃ）を重ね合わせ、４個の塩基対およびＲ１２４との相互作用を示す。Ｇ：Ｃ対の塩基原子およびＲ１２４の側鎖原子のみが重ね合わせに使用された。（Ｂ）標準複合体のＤＮＡ主鎖は青色で、非標準複合体は赤紫色である。Ｒ１２４−Ｇｕａ４相互作用は、右側のＤＮＡで生じる。Ｙ１１９による挿入によって、非標準複合体の左側のＤＮＡはらせん軸に沿って１塩基対長くなるように移動する（矢印で示した）。（Ｃ）２個の複合体におけるＤＮＡの比較（重ね合わせのために右側部分を使用）。左側の部分の非標準２本鎖は、らせん軸の周りに約３０°回転する。
【図２１】（Ａ）ｐａｐ調節配列の構成。６個のＬｒｐ結合部位は、分岐ｐａｐＢＡピリンおよびｐａｐｌプロモーターの間に位置する（Ｈｅｒｎｄａｙ他、２００３から改作）。（Ｂ）６個のｐａｐ部位の中で、部位２および５はＧＡＴＣ配列を含有する（囲いの中）。（Ｃ）ｐａｐ部位のメチル化における連続性の欠如に基づいた分子研究のための実験設計。
【図２２】構造をベースにしたインシリコスクリーニングの概略を示す流れ図である。
【図２３】補因子ＡｄｏＨｃｙ結合を示す図である。Ｔ４ＤａｍおよびＤＩＭ−５において実験的に決定されたＡｄｏＨｃｙ立体構造の重ね合わせ。Ｔ４ＤａｍにおけるＡｄｏＨｃｙは、ＤＮＡ ＭＴアーゼなどの広範囲に及ぶＩ型ＭＴアーゼにおいて最も頻繁に認められる伸長型立体構造である（Ｓｃｈｕｂｅｒｔ他、２００３）。しかし、この伸長型立体構造は、ＤＩＭ−５などのヒストンＬｙｓ ＭＴアーゼ（ＨＫＭＴ）のＳＥＴドメインで認められる折り畳み立体構造とは著しく異なる。補因子のこのように異なる立体構造は、Ｖ型（ＳＥＴ ＨＫＭＴ）ＭＴアーゼに対してＩ型（Ｔ４Ｄａｍ、ＤＮＭＴおよびＰＲＭＴ）に選択的な阻害剤を設計するためのよい標的となる。補因子から生じた球体の中心は、（Ｂ）ＤＩＭ−５（左）およびＴ４Ｄａｍ（右）におけるＡｄｏＨｃｙの実験的に決定された結合様式を再現することができる。
【図２４】（Ａ）Ｔ４Ｄａｍの２個のドメイン構造：触媒ドメイン（濃い）およびＤＮＡ結合ドメイン（薄い）。２個のドメインの間には深いくぼみがある（点によって表された球体中心によって示される）。予備ＤＯＣＫスクリーニングによって、ＡｄｏＨｃｙ結合ポケット（上）または２個のドメインの間のくぼみ（下）のいずれかに結合できる特有の小分子（ＮＳＣ４８６９３およびＮＳＣ１５９１６５）が明らかになった。（Ｂ）Ｔ４Ｄａｍ−ＡｄｏＨｃｙ（上）およびＭ．ＤｐｎＩＩ−ＡｄｏＭｅｔ（下）の間の小さいが、重要な構造の違い。（Ｃ）補因子アナログＡｄｏＨｃｙ上への補因子結合部位の上位３０ヒットの重ね合わせ。
【図２５】ＤＩＭ−５のＤＯＣＫ結果を示す図である。（Ａ）ＡｄｏＨｃｙ結合部位、（Ｂ）ＡｄｏＨｃｙ結合部位にドッキングした小分子ＮＳＣ１０６２２１、（Ｃ）標的Ｌｙｓ含有ペプチド結合部位、（Ｄ）Ｌｙｓ結合チャンネルにドッキングした小分子ＮＳＣ３２２９２１。
【図２６】最初のＩＳＳで使用したＮＣＩ「Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｅｔ」の約２０００個の化合物の概要を示す図である。各項（ｅｎｔｒｙ）は、ＮＳＣ識別子、ならびに原子結合および結合の種類の情報を含有するＳＭＩＬＥＳ列（ｓｔｒｉｎｇ）を有する１化合物に対応する。
【図２７】ＩＳＳによって同定され、より詳細に調べられた８２個の化合物の概要を示す図である。各項は、ＮＳＣ識別子、分子量および化学構造図を有する１化合物に対応する。ＤＩＭ−５阻害化合物は１〜３６番に対応し、Ｄａｍ阻害候補は４１〜８０番に対応する。ヒスタミンメチルトランスフェラーゼ阻害剤は３７〜４０番および８１〜８２番である（示さず）。
【図２８】ＩＳＳから得られた、上位１００個の化合物のエネルギースコア順位。各項には、ＮＳＣ識別子およびエネルギースコアが記載されている。（Ａ）および（Ｂ）はＤＩＭ−５阻害剤のスコア、（Ｃ）および（Ｄ）はＤａｍ阻害剤のスコアである。
【図２９】リード化合物ＮＳＣ６５９３９０との構造類似性について選択された他の化合物のリストを示す図である。
【図３０】ＥＰＥＣは、宿主上皮細胞表面のアクチンで満たされた膜の突出の形成原因となる。蛍光顕微鏡下では、ＥＰＥＣは緑色に標識され、アクチンはオレンジ色に、ＤＮＡ（細菌および核の両方）は青色に標識される。縮尺の長さは１０ミクロンである。
【図３１】（Ａ）非感染３Ｔ３細胞および（Ｂ〜Ｃ）感染３Ｔ３細胞の顕微鏡画像。（Ｃ）の細胞をＧ６（化合物＃７８−ＮＳＣ６５９３９０）２０μＭで処理し、アクチンをＦＩＴＣファロイジンで染色して標識し（中央列およびマージの緑）、３Ｔ３および細菌の核をＤＡＰＩで染色して標識した（左列およびマージの青）。アクチン台座構造は、明るいアクチン染色部として認められる（例えば、矢印）。アクチンの台座構造は、Ｇ６では認められない。縮尺の長さは２０μｍである。
【図３２】Ｇ６化合物２０μＭを添加した、もしくは添加しない、またはＢ１１（化合物＃２３−抗生物質）２０μＭを添加したＥＰＥＣの増殖曲線。Ｇ６は、抗生物質と比較して細菌増殖に全く影響を与えなかった。
【図３３】ＥＰＥＣビルレンスに対するＧ６の効果を示す図である。（ａ〜ｄ）は非感染３Ｔ３細胞、（ｅ〜ｈ）はＥＰＥＣに感染した３Ｔ３細胞、（ｉ〜ｌ）は、ＥＰＥＣに感染し、また、Ｇ６ ２０μＭで処理した３Ｔ３細胞である。細胞は、アクチンをＦＩＴＣファロイジンで染色し、細菌をＤＡＰＩで染色して標識し、細菌ビルレンス因子Ｔｉｒ（宿主細胞に分泌される。）をα−Ｔｉｒ ｐＡｂ−Ｃｙ３で染色して標識した。Ｔｉｒ染色（ｇの矢印参照、蛍光顕微鏡下で赤色に認められる。）は、アクチン台座構造の先端にはっきりと現れている（ｆの矢印、蛍光顕微鏡下では緑色に認められる）。Ｇ６で処理すると、台座構造（ｊ）もＴｉｒ染色（ｋ）も、付着した細菌の側には認められない（（ｉ）の矢印）。縮尺、１０μｍ。
【図３４】（Ａ）化合物で処理した細菌から単離されたｐＵＣ１９ＤＮＡのメチル化感受性消化。（Ｂ）より感受性が高いハイスループットの細菌をベースにしたアッセイの設計。
【図３５】Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＥＰＥＣまたはＣ．ロデンティウムを感染させた。結腸組織の細菌負荷は、感染後（ｐｉ）７日目に、結腸片を破砕し、ＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天に載せ、結腸組織１グラム当たりのコロニー数（コロニー形成単位（ＣＦＵ）を計測することによって測定する。ＥＯＥＣもＣ．ロデンティウムも非感染マウスでは検出されなかった。（Ｂ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスをストレプトマイシン２０ｍｇで予備処理した後、Ｃ．ロデンティウムまたはＥＰＥＣを感染させた。結腸組織をｐｉ７日目のマウスから採集し、Ｈ＆Ｅ染色によって分析した（縮尺線＝２００μｍ）。（Ｃ）ＥＰＥＣまたはＣ．ロデンティウムに感染したマウスの結腸（１４日目）を採取し、ミエロペルオキシダーゼ活性、結腸の好中球動員の指標を分析した。^＊非感染結腸と比較してｐ＜０．０５。
【図３６】選択されたＤａｍ ＭＴアーゼオルソログ（Ｙａｎｇ他、Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０：８４９〜８５５、２００３の図１より）、バクテリオファージＴ４（Ｔ４Ｄａｍ）、大腸菌（ＥｃｏＤａｍ）、制限−修飾ＭＴアーゼＥｃｏＲＶ、およびＤｐｎＩＩＡの配列データを示す図である。不変の残基および保存された残基はそれぞれ、強調された白色文字および太文字で示す。Ｔ４Ｄａｍの２次構造は、配列の上に示す（円柱はヘリックス、矢印は鎖）。
【図３７】ＥｃｏＤａｍの三次元座標構造を示す図である。この図は、実施例に記載のように、ＥｃｏＤａｍ３要素（ＥｃｏＤａｍ−ＡｄｏＭｅｔ−１２塩基ＤＮＡ）複合体のＸ線座標を示し、Ｄａｍ阻害剤候補を同定するＩＳＳに使用される。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｄａｍ酵素活性を修飾可能な化合物を同定する方法であって、
ａ．Ｄａｍ酵素またはＤａｍ酵素複合体の三次元構造を提供するステップと、
ｂ．修飾剤候補構造を提供するステップと、
ｃ．前記修飾剤候補構造および前記Ｄａｍ酵素構造もしくはＤａｍ酵素複合体構造が関与する、シミュレートされたドッキング相互作用から相互作用エネルギー値を測定するステップと、
ｄ．前記相互作用エネルギー値を評価するステップと、
を含み、それによってＤａｍ酵素活性を修飾可能な化合物を同定する方法。
【請求項２】
前記修飾がＤａｍ酵素活性の阻害を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｅ．測定した前記エネルギー値を基準値と比較するステップ、をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｄａｍ酵素がバクテリオファージＴ４または細菌に由来する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｄａｍ酵素が大腸菌に由来する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｄａｍ酵素複合体の三次元構造が図３７の原子構造座標によって与えられる、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
ステップｃの、シミュレートされたドッキング相互作用が特定のドッキング部位で生じる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ドッキング部位が、触媒ドメインとＤＮＡ結合ドメインとの間のポケット、および／またはメチル供与体結合部位に制限される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ポケットが、残基Ｔｒｐ１０−Ａｌａ１１およびＬｅｕ１２２−Ｃｙｓ１２３が結合したグリセロール結合部位によって規定される、前記触媒ドメインおよび前記ＤＮＡ結合ドメインの間に位置する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記活性部位がＡｄｏＨｃｙ結合部位のＡｓｐ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒモチーフを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
Ｄａｍ酵素を阻害可能な化合物を同定する方法であって、
ａ．Ｄａｍ酵素がポケット部位および活性部位を有するＤａｍ酵素複合体の三次元構造を提供するステップと、
ｂ．Ｄａｍ酵素の阻害剤候補を、当該阻害剤候補と、前記Ｄａｍ酵素複合体の前記ポケット部位および／または前記活性部位と、が関与する、シミュレートされたドッキング相互作用の相互作用エネルギー値を計算することによって、コンピューターで選択するステップと、
を含み、それによってＤａｍ酵素を阻害可能な化合物を同定する方法。
【請求項１２】
前記Ｄａｍ酵素が大腸菌に由来する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
細菌におけるＤＮＡメチル化を阻害する方法であって、
ａ．請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法によって同定された化合物を提供するステップと、
ｂ．ＤＮＡメチル化を阻害するために、細菌と、ステップａで提供された化合物と、を接触させるステップと、
を含み、それによって前記細菌におけるＤＮＡメチル化を阻害する方法。
【請求項１４】
前記細菌がＤａｍメチラーゼを有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
生物におけるＤａｍによるＤＮＡメチル化を阻害する方法であって、
生物を、
ＮＣＩ−ＤＴＰ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｅｔ化合物番号６５９３９０：
【化１】


化合物番号６５８３４３：
【化２】


化合物番号６５７５８９：
【化３】


および下記構造式の化合物Ｄａｍ−ｉＺ１：
【化４】


（式中、Ａは非芳香族５または６員環であり、Ａの環構成原子の１個または複数個がＣ、Ｎ、ＯまたはＳであってもよく、
Ｘ_１〜Ｘ_５は各々独立して、Ｈ、ハライド、ＯＨ、ＯＣＨ_３、アルキルおよびアルキルハライドから成る群から選択され、Ｙ_１はＮＨ、ＣＨまたはＣＨ_２であり、Ｙ_２はＮ、ＮＨ、ＣＨまたはＣＨ_２である。）
から成る群より選択される化合物と接触させることを含む方法。
【請求項１６】
前記生物が細菌である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記細菌が大腸菌である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＤＮＡメチル化が、Ｄａｍメチラーゼを阻害することによって阻害される、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記化合物が、ＮＣＩ−ＤＴＰ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｅｔ化合物番号６５９３９０、６５８３４３および６５７５８９から成る群より選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
病原性細菌の感染の疑いがある宿主を治療する方法であって、
宿主に、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法によって同定された化合物、ＮＣＩ−ＤＴＰ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｅｔ化合物番号６５９３９０、６５８３４３、６５７５８９、Ｄａｍ−ｉＺ１およびＤａｍ ｉＺ２、から成る群より選択される化合物を、細菌内でＤＮＡのメチル化を阻害するのに十分な量、投与することを含む方法。
【請求項２１】
治療が前記細菌のビルレンスパラメーターを減少させる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記宿主が哺乳類である、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記宿主がヒトでない、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記宿主がヒトである、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記病原性細菌が、大腸菌、腸管病原性大腸菌、サルモネラ・チフィムリウム、髄膜炎菌、エルシニア・シュードツベルクローシス、ビブリオ・コレラ、パスツレラ・ムルトシダ、ヘモフィルス・インフルエンザおよびエルシニア・エンテロコリチカから成る群より選択される、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記化合物がさらに医薬製剤を構成する、請求項２０〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
病原性細菌の感染の疑いがある宿主を治療する方法であって、
宿主に、Ｄａｍメチラーゼを阻害可能な化合物を投与することを含む方法。
【請求項２８】
前記細菌がグラム陰性細菌である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
化合物Ｄａｍ−ｉＺ１を含有する組成物。
【請求項３０】
ＮＣＩ−ＤＴＰ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｅｔ化合物番号６５９３９０、６５８３４３および６５７５８９を含有しない、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
細菌のビルレンスパラメーターを減少させる方法であって、
細菌と、Ｄａｍメチラーゼを阻害可能な化合物と、を接触させることを含む方法。
【請求項３２】
前記Ｄａｍ酵素活性を修飾可能な化合物のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ活性を測定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性の測定が生化学アッセイまたは細菌アッセイを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
病原性細菌の感染の疑いがある宿主を治療する方法であって、
宿主に、メチラーゼを阻害することによって病原性を改変することが可能な化合物を投与することを含む方法。
【請求項３５】
前記メチラーゼがＤａｍメチラーゼである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
病原性の改変がビルレンスの改変を含む、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
ビルレンスの改変が細菌の細胞分裂に実質的な影響を与えない、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
大腸菌Ｄａｍの結晶。
【請求項３９】
大腸菌Ｄａｍ複合体の結晶。
【請求項４０】
前記複合体が大腸菌ＤａｍおよびコグネイトＤＮＡを含有する、請求項３９に記載の結晶。
【請求項４１】
前記複合体が大腸菌Ｄａｍおよび非コグネイトＤＮＡを含有する、請求項３９に記載の結晶。
【請求項４２】
前記複合体がさらに補因子または補因子アナログを含有する、請求項３９〜４１のいずれか一項に記載の結晶。
【請求項４３】
前記補因子または補因子アナログが、ＡｄｏＭｅｔ、ＡｄｏＨｃｙおよびシネフンギンから成る群より選択される、請求項４２に記載の結晶。
【請求項４４】
図３７の一組の原子構造座標を有する、請求項４３に記載の結晶。
【請求項４５】
請求項３８〜４４のいずれか一項に記載の結晶のデータ表現。

【図２】

【図３】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２６】

【図２６】

【図２６】

【図２６】

【図２６】

【図２６】

【図２６】

【図２６】

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【図２６】

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【図２６】

【図２６】

【図２６】

【図２６】

【図２６】

【図２６】

【図２６】

【図２８Ａ】

【図２８Ｂ】

【図２８Ｃ】

【図２８Ｄ】

【図２９−１】

【図２９−２】

【図２９−３】

【図２９−４】

【図２９−５】

【図２９−６】

【図２９−７】

【図２９−８】

【図２９−９】

【図２９−１０】

【図３７】

【図３７】

【図３７】

【図３７】

【図３７】

【図３７】

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【図３７】

【図３７】

【図３７】

【図３７】

【図３７】

【図３７】

【図３７】

【図３７】

【図３７】

【図３７】

【図３７】

【図１】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０−１】

【図１０−２】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４−１】

【図１４−２】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２７−１】

【図２７−２】

【図２７−３】

【図２７−４】

【図２７−５】

【図２７−６】

【図２７−７】

【図２７−８】

【図２７−９】

【図２７−１０】

【図２７−１１】

【図２７−１２】

【図２７−１３】

【図２７−１４】

【図２７−１５】

【図２７−１６】

【図３０】

【図３１】

【図３２】

【図３３】

【図３４】

【図３５】

【図３６】

【公表番号】特表２００８−５２２６１９（Ｐ２００８−５２２６１９Ａ）
【公表日】平成２０年７月３日（２００８．７．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５４５５９０（Ｐ２００７−５４５５９０）
【出願日】平成１７年１２月６日（２００５．１２．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４４２７７
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０６３０５８
【国際公開日】平成１８年６月１５日（２００６．６．１５）
【出願人】（５０７１８７２４８）エモリー　ユニヴァーシティ (5)
【Ｆターム（参考）】