本発明は、組換え乳酸桿菌、その使用および組換え乳酸桿菌を含む医薬組成物に関する。組換え乳酸桿菌は、異種核酸配列を含む。異種核酸配列は、ダニアレルゲンＤｅｒ ｐ １、Ｄｅｒ ｐ ２またはＢｌｏ ｔ ５の少なくとも免疫原性フラグメント、またはその免疫原性ホモログをコードする。Ｄｅｒ ｐ １のそれぞれのフラグメントは、ダニアレルゲンのアミノ酸配列の少なくとも８％を含む。哺乳動物においてアレルゲンに対する免疫応答を調節する方法ならびに医薬組成物およびキットも開示される。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換え乳酸桿菌およびその使用方法に関する。組換え乳酸桿菌は、ダニアレルゲンの少なくとも免疫原性フラグメントまたはその免疫原性ホモログをコードする異種核酸配列を含む。本発明はまた、哺乳動物においてアレルゲンに対する免疫応答を調節する方法ならびに医薬組成物およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
先進国では人口の２５〜４０％がアレルギー疾患に罹患していると考えられ、米国の人口の半数以上が１つまたはそれ以上のアレルゲンに感作している。アレルギーの割合は、特に小児の間で、急速に増加しており、英国では年間約５％の割合で増えつつある。アレルギー性鼻炎（枯草熱）、喘息およびじんま疹などのアレルギー反応は、免疫系応答の過敏性、すなわちそれぞれのアレルゲンに対する免疫系の病的応答である。敏感な人においては、花粉または塵埃などの通常は無害な物質が免疫応答の過剰反応を導くため、アレルゲンであるそれぞれの物質が脅威として認識され、攻撃される。ダニ、特に塵ダニのアレルゲンに対する感受性は、アレルギー性喘息、鼻炎およびアトピー性皮膚炎の発症に寄与する最も重要な因子の１つである。ダニアレルゲンに対するアレルギー反応はまた、くしゃみ、鼻水、眼のかゆみおよび流涙などの枯草熱の症状を引き起こし得る。ダニアレルギーは、衛生上および経済的な影響を伴う複雑な世界的問題となっている。米国における若年者の少なくとも４５％およびドイツの一般人口の１５％が塵ダニアレルゲンに対してアレルギー性であるが、ダニアレルギーはヒトの「室内」環境に限定されない。感作を誘導し得るはるかに多くのダニ種が見出されており、それらの症状は職業環境において認められる。
【０００３】
アレルギー疾患は、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）として知られる抗体型を産生するＢリンパ球の能力上昇を特徴とする。ＩｇＥが、たとえば喘息において主要な役割を果たすことを示唆する証拠がある。たとえば、ＩｇＧおよびＩｇＧ４免疫グロブリンのレベルは上昇するがＩｇＥのレベルは上昇しないという、変化した形態で応答する小児または成人は、喘息の危険度が高くない。ＩｇＥの合成は、Ｔヘルパー細胞のサブセットであるＣＤ４^＋とＢ細胞の間の共作用の結果である。たとえばアトピー性皮膚炎における極めて重要な役割がＴ細胞によって担われており、２型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２）によって合成されるサイトカインは疾患の病因に有意に寄与する。「アレルギー促進性」Ｔｈ２細胞と「感染抵抗性」Ｔｈ１細胞の間のバランスのシフトがアレルギーの発症に関与し得ると主張されてきた。Ｔｈ１細胞は、インターフェロン（ＩＦ）−γ、インターロイキン（ＩＬ）−２および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−βを生成し、一方Ｔｈ２細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３を生成する。アレルギーに対するワクチン設計の現在の治療的および予防的戦略は、Ｔｈ２エフェクター相を下方調節することができるＴｈ１またはＴ調節（Ｔｒ）細胞の発現を促進することによる免疫調節の回復を対象としている。
【０００４】
アレルギーを起こしやすい個人が初めてアレルゲンに曝露されたとき、個人の免疫系は大量の対応ＩｇＥ抗体を産生する。これらのＩｇＥ分子は、マスト細胞（組織中）または好塩基球（循環中）の表面で高親和性Ｆｃ受容体（ＦｃεＲＩ）に結合する。その後のアレルゲンへの曝露は、これらのＩｇＥ分子へのアレルゲンの結合と架橋を引き起こし、それぞれの、たとえばマスト細胞の刺激を生じさせる。これは、中でも特に、ヒスタミン、およびプロスタグランジンやロイコトリエンなどの新たに形成されたメディエイターの迅速な放出を引き起こす。
【０００５】
ヨーロッパとオーストラリアの両方で、ならびに世界中で、室内アレルゲンの供給源として最も重要なダニ種は、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ（Ｄｅｒ ｐ）である。この種の主要アレルゲンは、Ｄｅｒ ｐ １およびＤｅｒ ｐ ２タンパク質である。熱帯および亜熱帯地域では、最も関係のあるダニ種はＢｌｏｍｉａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ（Ｂｔ）である。これらの後者の地域では、Ｄｅｒ ｐ １、Ｄｅｒ ｐ ２およびＢｌｏ ｔ ５に対するダニ多重感作が高度に蔓延している。現在の治療は、症状軽減のためのステロイドの使用と粗ダニ抽出物を使用する免疫療法を含み、どちらも効果とコンプライアンスに関して問題がある。そのようなわけで、改善された有効な治療戦略が一貫して求められている。
【０００６】
現在、ダニアレルギーの管理における最も重要な局面は、ダニへの曝露の低減である。これは、家庭内の温度および湿度レベルの低下、高度ろ過掃除機の使用、寝具類の頻繁な洗濯、壁掛け、カーペット、本等のような粉塵を集める傾向のあるものを避けることを含む。現在の治療は、ヒスタミンＨ受容体拮抗物質、うっ血除去薬、またはそれらの組合せの使用を含む。ヒスタミンＨ受容体、特にＨ_１受容体の拮抗薬および逆作動薬、いわゆる「抗ヒスタミン薬」は、ひとたびアレルゲンがマスト細胞および好塩基球の表面ＩｇＥに結合すると、マスト細胞および好塩基球から放出されるヒスタミンの作用を妨げる。しかし、抗ヒスタミン薬は、アレルゲン誘発の前に投与された場合にのみ有効である。
【０００７】
うっ血除去薬は、鼻粘膜内層に供給する血管を狭くすることによって鼻粘膜の腫脹を軽減する。それらは、それゆえ、アレルギー反応の基礎となる機構には対処せずに、アレルギー（および風邪）に関連する症状の１つである鼻づまりを緩和する。局所鼻用ステロイドおよびクロモリンナトリウムなどの鼻スプレーも、アレルギー症状を治療するために使用できる。免疫療法（減感作法またはアレルギー注射法としても知られる）は、少量であるが漸増量のアレルゲンの規則正しい間隔での適用である。これは、それぞれのアレルゲンに対する免疫系の寛容性を高めると考えられている。免疫療法は様々な程度に有効と認められた。その有用性は、しかしながら、有害作用、特にアナフィラキシーの潜在的可能性、および入手可能なアレルゲン抽出物の比較的粗な性質によって制限されてきた。これらの問題を克服する試みにおいて、植物および樹木からの天然に生じるアイソフォームのアレルゲンは、アミノ酸の置換または欠失の結果としてＩｇＥによって結合される能力が低いことが示された。
【０００８】
加えて、アルルギーの発現に対する乳酸産生細菌の抑制作用が報告された。熱死滅Ｌ． ｐａｒａｃａｓｉ ３３およびアシドフィルス菌（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）は、アレルギー性鼻炎の症状を軽減することが認められた（Ｐｅｎｇ，Ｇ−Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，（２００５），１６、４３３−４３８；Ｉｓｈｉｄａ，Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．（２００５），８８，５２７−５３３）。Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ ＧＭ−０８０の投与は、精製Ｄｅｒ ｐ ５を吸入したマウスにおいてＩｇＥレベルを低下させることが報告された（特許文献１）。Ｌ．ｃａｓｅｉ ｃａｓｅｉとデキストランの併用適用は、花粉特異的ＩｇＥ、活性化調節ケモカイン（ＴＡＲＣ）およびインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）レベルの上昇を予防し得るが、Ｌ ｃａｓｅｉ ｃａｓｅｉ単独では予防しないことが示唆された（Ｏｇａｗａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００６），ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．ｌ５７４−６９５Ｘ．２００６．０００４６．ｘ）。ムロオカらは、Ｌ．ｃａｓｅｉ Ｋ９５−５およびＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＮＣＬ２１を、アレルゲンＤｅｒ ｆ １およびＤｅｒ ｆ ７をコードするベクターで形質転換した（特許文献２）。Ｋｒｕｉｓｓｅｌｂｒｉｎｋら（Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．［２００１］，１２６−１２８）は、Ｄｅｒ ｐ １の免疫優性Ｔ細胞エピトープを発現する組換えＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ２５６のＣ５７ＢＬ／６マウスへの鼻内投与の作用をさらに検討した。処置マウスにおいて、Ｔｈ２サイトカインＩＬ−５の減少に加えて、ある程度のＴｈ１特性を有するペプチド特異的Ｔ細胞増殖の誘導が認められた。
【特許文献１】米国特許第６９９４８４８号明細書
【特許文献２】特開２００２−２８１９６６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ダニアレルギーの現在の治療は、それゆえ満足できるものではなく、疾患の予防は不可能である。そこで、改善された有効な治療および予防戦略が一貫して求められている。
従って、ダニアレルギーにおいて免疫応答を調節するための適切な手段を提供することが本発明の１つの目的である。この目的は、添付の独立請求項の主題によって解決される。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
１つの態様では、本発明は組換え乳酸桿菌を提供する。組換え乳酸桿菌は、異種核酸配列を含む。この核酸配列は、Ｄｅｒ ｐ １、Ｄｅｒ ｐ ２およびＢｌｏ ｔ ５のいずれかのダニアレルゲンの少なくとも免疫原性フラグメント、またはその免疫原性ホモログをコードする。核酸配列は、それゆえ、ダニアレルゲン全体、またはそのそれぞれの免疫原性ホモログをコードし得る。組換え乳酸桿菌はまた、治療における使用のために提供される。
【００１１】
さらなる態様では、本発明は医薬組成物を提供する。医薬組成物は、上述した組換え乳酸桿菌および医薬的に許容される担体または希釈剤を含む。
もう１つの態様では、本発明は医薬キットを提供する。医薬キットは、上述した組成物を含む。医薬キットは、アレルゲンまたはその免疫原性フラグメントをさらに含む。
【００１２】
さらなる態様では、本発明は、哺乳動物においてアレルゲンに対する免疫応答を調節する方法を提供する。前記方法は、上述した組成物を投与することを含む。
さらなる態様では、本発明は、医薬組成物およびアレルゲンに対する免疫応答を調節するための医薬キットの製造における、上述した組換え乳酸桿菌の使用方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、非限定的な実施例および以下のような添付の図面と合わせて考慮するとき、詳細な説明を参照してよりよく理解される。
本発明は組換え乳酸桿菌を提供する。乳酸桿菌は周知のグラム陽性細菌であって、長く細い桿状体から短い球桿菌まで形態的に異なり、しばしば鎖を形成する。本発明の組換え乳酸桿菌はいかなる乳酸桿菌でもよい。現在９１種の乳酸桿菌属が知られている。それぞれの乳酸桿菌の例は、いくつか例を挙げると、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｎｔｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｉｌｇａｒｄｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｉｓｈｍａｎｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｅｎｓｅｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｕｃａｓｉｃｕｓ、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓを含むが、これらに限定されない。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓなどの多くの乳酸桿菌は、胃腸管でコロニー形成することができ、すなわち「移植可能」であるが、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓおよびＬ．ｌａｃｔｉｓなどの一部の乳酸桿菌は、一過性で、非移植性細菌叢とみなされている。本発明は、移植可能であるか否かに関わらず、本発明の乳酸桿菌のいずれの菌株にも適用される。使用の都合上（下記参照）、一部の実施形態では移植できる菌株を選択することが望ましい場合がある。
【００１４】
それぞれの乳酸桿菌のいかなる亜種および菌株も使用され得る。説明例として、Ｌ．ｃａｓｅｉ亜種ｃａｓｅｉ、Ｌ．ｃａｓｅｉ亜種ｐａｒａｃａｓｅｉなどの、Ｌ．ｃａｓｅｉのいくつかの公知の亜種がある。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉの菌株の例は、Ｌ．ｃａｓｅｉ ＫＥ９９株、Ｌ．ｃａｓｅｉ ＣＲＬ ４３１株、Ｌ．ｃａｓｅｉ ＢＬ１５５株、Ｌ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａ株、およびＬ．ｃａｓｅｉ Ｎ１９を含む。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓの菌株の例は、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ ＭＴＣＣ １４０８株、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ ＨＮ００１株、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ Ｌｃｒ３５株およびＬ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ ＧＧ株を含むが、これらに限定されない。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ＧＧ（Ｇｏｒｂａｃｈｉ ＆ Ｇｏｌｄｉｎｉ）としても知られるＬ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ ＧＧは、最初はＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓに分類された。Ｌ．ｃａｓｅｉの菌株として分類することが示唆されてきたが、ユニーク種Ｌ．ｚｅａｅとして再分類することも提案されている。以下では、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ ＧＧと称する。
【００１５】
前記組換え乳酸桿菌は、ダニアレルゲンの少なくとも免疫原性フラグメントまたはその免疫原性ホモログをコードする異種核酸配列を含む。従って、それぞれの核酸配列はポリペプチドのアミノ酸配列に対応する。それゆえ、異種核酸配列によってコードされるダニアレルゲンの少なくとも免疫原性フラグメントは、ポリペプチドを含むか、またはポリペプチドである。アレルゲンに関して「フラグメント」とは、それぞれのアレルゲンのポリペプチド内に存在する何らかのアミノ酸配列を意味する。一部の実施形態では、「フラグメント」という用語は、それぞれの天然に生じるアレルゲン中に存在する糖または糖鎖などの翻訳後修飾の不在を指す。そのような実施形態では、それぞれのアレルゲンフラグメントのアミノ酸配列は、アレルゲンの、変異体を含む何らかの天然に生じる形態の全長であるかまたは完全長配列の一部であるかに関わらず、いかなる長さであってもよい。他の実施形態では、「フラグメント」という用語は、アレルゲンの天然に生じる形態の完全長配列よりも短い、それぞれのアレルゲンのポリペプチド中に存在する何らかのアミノ酸配列を指す。それぞれのアレルゲンの天然に生じる形態は、典型的には前駆体タンパク質から誘導される成熟完全長タンパク質であると理解される。アレルゲンＤｅｒ ｐ １の説明例として、ＤＥＲＰ１＿ＤＥＲＰＴと称されるプレプロ酵素はインビボで存在することが知られており、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ０８１７６（第二次アクセッション番号Ｑ２４６１６）およびＮＣＢＩアクセッション番号ＡＡＢ６０２１５の前駆体である。この前駆体は３２０アミノ酸であるが、ＮＣＢＩアクセッション番号２ＡＳ８＿Ａおよび２ＡＳ８＿Ｂの成熟・完全活性アレルゲンＤｅｒ ｐ １は２２２アミノ酸である。ＡＬＬ２＿ＤＥＲＰＴと称されるＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ４９２７８のアレルゲンＤｅｒ ｐ ２前駆体（Ｄｅｒ ｐ ＩＩ）（ＤＰＸ）のような、同様の前駆体は他のダニアレルゲンについても公知である。そのような実施形態では、それぞれの天然に生じるアレルゲン中で認められる翻訳後修飾が、あらゆる程度でフラグメント内に存在し得る。
【００１６】
一部の実施形態では、本発明の乳酸桿菌に含まれる核酸配列は、それぞれのダニアレルゲンの天然に生じる形態、すなわち成熟完全長タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも８％を含むダニアレルゲンフラグメントをコードする。説明例として、組換え乳酸桿菌は、ダニアレルゲンＤｅｒ ｐ １の少なくとも免疫原性フラグメント（または、そのそれぞれの免疫原性ホモログ）をコードする異種核酸配列を含み得る。フラグメントは、この場合、Ｄｅｒ ｐ １のアミノ酸配列の少なくとも８％を含み得る。これらの実施形態の一部では、そのようなフラグメントは、それゆえ、天然に存在するダニアレルゲンの全長アミノ酸配列の８〜１００％、たとえば１０〜１００％、たとえば１５〜１００％、たとえば２５〜１００％に相当するアミノ酸配列のあらゆる一つまたは複数の部分を含み得る。一部の実施形態では、そのようなフラグメントは、それゆえ、天然に存在するダニアレルゲンのアミノ酸配列のそれぞれの部分の免疫原性ホモログ（下記参照）である部分を含み得る。
【００１７】
「異種」という用語は、核酸配列または分子に関して使用される場合、その中に核酸分子が導入されている（または導入されつつある）それぞれの桿菌または細胞において、天然では生じない核酸配列を意味する。異種核酸配列は、それゆえそれぞれの桿菌または細胞以外の供給源に由来し、天然または非天然に生じ得る。それぞれの異種核酸配列は、たとえば乳酸桿菌の染色体に、またはベクター（同じく下記参照）またはＲＮＡ分子などの、乳酸桿菌中に存在する何らかの他の核酸分子に組み込まれ得る。
【００１８】
ダニアレルゲンは、それらの生化学的組成物、配列相同性および分子量に基づいて特定の群に分類される。特性決定されたアレルゲンについての表示は、属の最初の３文字、種名の最初の文字、および最後の数字である。最後の数字は、アレルゲンが単離された順序または相同な他の既に特性決定されたアレルゲンについての数を表わす。本発明の乳酸桿菌に含まれる異種核酸配列により、ダニアレルゲンのフラグメントとして、またはそれぞれの免疫原性ホモログの形態で完全にコードされるダニアレルゲンは、典型的にはＤｅｒ ｐ １、Ｄｅｒ ｐ ２およびＢｌｏ ｔ ５である。説明例として、組換え乳酸桿菌はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉであり得、その中に含まれる異種核酸配列は、ダニアレルゲンＤｅｒ ｐ ２をコードし得る。
【００１９】
既に上述したように、本発明の組換え乳酸桿菌に含まれる異種核酸配列は、ダニアレルゲンの少なくとも免疫原性フラグメント、またはその免疫原性ホモログをコードする。ここで使用する「アレルゲン」という用語は、個人または動物においてアレルギーを誘発することができる分子を指す。既に上述したように、アレルゲンは、免疫応答を誘導するため、すなわち抗体を産生するためまたはアレルゲンを直接攻撃するために、リンパ球を刺激することができる。従って、アレルゲンは免疫系によって認識される抗原であり、アレルギー反応を引き起こし得る。そのようなアレルギー反応は、摂取、たとえば摂食または飲用のようなアレルゲンとの何らかの形態の直接接触、吸入、またはたとえば皮膚を通しての直接接触によって引き起こされ得る。典型的には、アレルゲンを含む抗原は、タンパク質などのポリペプチドまたは多糖である。本発明に関して、抗原という用語は、糖または脂質などのあらゆる修飾を含み得る、あらゆるポリペプチドを指す。また、ハプテンとして知られる短いペプチドを指し、ハプテンは、一般的にハプテンより大きなサイズの担体分子、たとえばタンパク質、または細胞に結合している。
【００２０】
ここで使用する「免疫原性」という用語は、免疫応答を惹起する物質の能力、すなわち免疫学的に活性であることを指す。従って、アレルゲンのフラグメントに関して使用されるとき、それぞれのフラグメントは、一部の実施形態では、たとえば個人または動物に投与されたとき、それ自体で免疫応答を生じさせ得る。しかし、アレルゲンの免疫原性フラグメントは、それ自体で免疫応答を惹起する能力を有している必要はないことに留意すべきである。免疫学的に活性であるその能力は、一部の実施形態では、むしろフラグメントが付加的な物質に結合していることに依存し得る。一部の実施形態では、付加的な物質へのこの結合は、たとえばインビボで、たとえばタンパク質に結合することによって起こり得る。それゆえ一部の実施形態では、アレルゲンの免疫原性フラグメントはハプテンを含んでいるか、またはハプテンであり、その免疫原性特性を発揮するために担体分子または細胞に結合することを必要とする。アレルゲンの免疫原性フラグメントが異種核酸配列内に含まれる場合は、それゆえ、得られる（インビトロ、エクスビボまたはインビボで転写され、翻訳された）ペプチドが、それ自体でまたは付加的な物質に結合したとき、免疫応答を惹起することができる限り、いかなる配列長または大きさであってもよい。典型的な実施形態では、ダニアレルゲンまたはそのフラグメントは、少なくとも１つのＩｇＥ抗体に結合することができる。それぞれの抗体は、たとえば塵ダニなどのダニに対してアレルギー性または敏感である個人または動物の抗体であり得る。一般に、アレルゲンのそれぞれのフラグメントは少なくとも１つのエピトープを含む。しかしながら、一部の実施形態では、アレルゲンの２つまたはそれ以上のフラグメントが、たとえば同じ担体分子に結合したとき、それぞれのエピトープを得るために結合される必要があるかもしれない。抗原決定基とも称されるエピトープは、抗体の抗原結合部位またはＴ細胞受容体によって認識され、結合され得る抗原分子（この場合はアレルゲン分子）の一部である。種々の抗体およびＴ細胞受容体は、抗原の種々のエピトープに結合する。たとえばＤｅｒ ｐ ２の２つのエピトープについて、アレルギー性鼻炎を有する日本人患者からのＴ細胞がそれらに結合できることが知られており、２つのさらなるエピトープは、同じ患者からのＴヘルパー細胞によって結合されることが知られている。
【００２１】
ここで使用する「免疫原性ホモログ」という用語は、ダニアレルゲンまたはその免疫原性フラグメントに関して使用するとき、それぞれの天然に存在するダニ抗原と高い相同性を有し、対応する天然に存在するダニ抗原に対して活性である少なくとも１つの抗体またはＴ細胞受容体によって特異的に認識され、結合され得るポリペプチドを意味する。典型的な実施形態では、そのようなフラグメントは、天然に存在するダニ抗原（その免疫原性フラグメントを含む）の対応するアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有し得る。一部の実施形態では、それぞれのフラグメントは、天然に存在するダニ抗原の対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、たとえば少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を有する。「配列同一性」とは、配列の類似性または関連性を測る配列の性質を意味する。この用語は、あるアミノ酸配列または核酸配列の公知のダニ抗原について、それぞれ当該アミノ酸配列または核酸配列のホモロジーアラインメント後に得られるペアワイズ同一残基のパーセンテージを指し、パーセンテージの数字は２つの配列のうち長い方の配列内の残基の数を表わす。
【００２２】
また、上記核酸配列に実質的に相補的な核酸配列も本発明に包含される。ここで使用する「実質的に相補的な」とは、所定の核酸配列が、もう別の核酸配列に対して少なくとも９０％、たとえば少なくとも９５％、一部の実施形態では１００％相補的であるという事実を指す。「相補的な」または「相補体」という用語は、互いに多数の好ましい相互作用を形成し得る２つのヌクレオチドを指す。そのような好ましい相互作用は、ワトソン−クリックの塩基対合を含む。あるヌクレオチド配列は、第１の配列のヌクレオチド全部が第２の配列のヌクレオチド全部に相補的である場合、別のヌクレオチド配列の相補体である。
【００２３】
一部の実施形態では、組換え乳酸桿菌はさらに、ダニアレルゲンの少なくとも免疫原性フラグメントまたはそのそれぞれの免疫原性ホモログを発現することができる。そのような実施形態では、アレルゲン、そのフラグメントまたは免疫原性ホモログをコードするそれぞれの配列は、宿主細胞において転写を開始させるのに有効なプロモーターに、作動可能に連結され得る。組換え核酸はまた、細胞において機能性の転写開始領域、キナーゼポリペプチドをコードするＲＮＡ配列に相補的な配列および細胞において機能性の転写終結領域を含み得る。１つの実施形態では、組換え乳酸桿菌は、ダニアレルゲン、そのフラグメントまたはそれぞれの免疫原性ホモログを発現する。
【００２４】
組換え乳酸桿菌は、天然に生じる乳酸桿菌に異種核酸配列を導入することにより、天然に生じる乳酸桿菌から得られる。説明例として、ダニアレルゲンの少なくとも免疫原性フラグメントまたはその免疫原性ホモログをコードする配列が、異種ポリヌクレオチドなどの異種核酸分子内に含まれてもよい。本発明のアレルゲンをコードする核酸分子および作動可能に連結されたプロモーターは、非複製性ＤＮＡまたはＲＮＡ分子として乳酸桿菌に導入されてもよく、それらは線状分子または閉じた共有結合環状分子のいずれかであり得る。説明例として、ＤＮＡ分子は乳酸桿菌の染色体に安定に組み込まれ得る。所望の遺伝子配列を乳酸桿菌染色体に組み込むことができるベクターを使用してもよい。説明例として、Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼの遺伝子を、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼの遺伝子を置換することによって、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉの染色体に組み込むためのプラスミドｐＡＭβ１の使用が米国特許第５７４７３１０号明細書に開示されている。所望の場合、導入されたＤＮＡをその染色体内に安定に組み込んだ乳酸桿菌は、発現ベクターを含む宿主細胞の選択を可能にする１つまたはそれ以上のマーカーをさらに導入することによって選択され得る。
【００２５】
ここで使用する「核酸分子」という用語は、一本鎖、二本鎖またはそれらの組合せなどの、何らかの可能な立体配置の何らかの核酸を指す。核酸は、たとえばＤＮＡ分子（たとえばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（たとえばｍＲＮＡ）、ヌクレオチド類似体を使用してまたは核酸化学を使用して生成されるＤＮＡまたはＲＮＡの類似体、およびＰＮＡ（タンパク質核酸）を含む。ＤＮＡまたはＲＮＡは、ゲノム起源または合成起源であり得、一本鎖または二本鎖であり得る。本発明において、必ずしも必要ではないが、ＲＮＡまたはＤＮＡ分子は概ね組換え乳酸桿菌内に含まれる。そのような核酸分子は、たとえばｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、合成ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ合成ＤＮＡ、ＤＮＡ及びＲＮＡのコポリマー、オリゴヌクレオチド等であり得る。それぞれの核酸分子はさらに、非天然ヌクレオチド類似体を含み得、かつ／またはアフィニティータグまたは標識に連結され得る（上記参照）。
【００２６】
多くのヌクレオチド類似体が公知であり、本発明の乳酸桿菌に含まれる核酸配列内に存在し得る。ヌクレオチド類似体は、たとえば塩基、糖またはリン酸部分に修飾を含むヌクレオチドである。説明例として、２’Ｆ、２’Ｏ−Ｍｅまたは２’Ｈ残基によるｓｉＲＮＡの２’ＯＨ残基の置換は、それぞれのＲＮＡのインビボでの安定性を改善することが知られている。塩基部分の修飾は、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ／Ｕの天然および合成修飾、ウラシル−５−イル、ヒポキサンチン−９−イルおよび２−アミノアデニン−９−イルなどの種々のプリンまたはピリミジン塩基、ならびに非プリンまたは非ピリミジンヌクレオチド塩基を含む。他のヌクレオチド類似体はユニバーサル塩基として働く。ユニバーサル塩基は、３−ニトロピロールおよび５−ニトロインドールを含む。ユニバーサル塩基は、いかなる他の塩基とも塩基対を形成することができる。塩基修飾はしばしば、たとえば二本鎖の高い安定性などの独自の性質を達成するために、たとえば２’−Ｏ−メトキシエチルなどの糖修飾と組み合わされ得る。
【００２７】
一部の実施形態では、異種核酸は、乳酸桿菌染色体に組み込まれない異種核酸分子、たとえばプラスミドまたはベクターに含まれ得る。従って、この場合組換え乳酸桿菌は、その染色体に加えて異種核酸分子を含む。それぞれのベクターは、プロモーター、エンハンサー、サイレンサーまたはターミネーター配列などの、１つまたはそれ以上の調節配列を含み得る。そのような調節配列は、ベクターの複製またはコードされる配列の転写および／または翻訳を促進するなどの制御を行い得る。それぞれのベクターの説明例は、発現ベクターである。一部の実施形態では、アレルゲンは誘導的プロモーターの制御下にあり得る。説明例として、抗菌ペプチド、ナイシンによって制御される発現系がＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍにおいて使用された（Ｐａｖａｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２０００）６６，４４２７−４４３２）。他の実施形態では、アレルゲンは構成的に活性な方法で発現され得る。説明例として、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉにおける、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｅｉ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓのＰｒｔＢプロモーターの制御下でのプロテイナーゼＰｒｔＢと破傷風毒素ミモトープの融合タンパク質の構成的発現が、Ｓｃｈｅｐｐｌｅｒら（Ｖａｃｃｉｎｅ［２００２］２０，２９１３−２９２０）によって開示された。
【００２８】
「ベクター」という用語は、細胞に導入されて、たとえばトランスフェクションされて、細胞ゲノム内でまたは細胞ゲノムとは独立して複製され得る一本鎖または二本鎖環状核酸分子に関する。環状二本鎖核酸分子は、制限酵素での処理後に切断され、それによって線形化され得る。各種の核酸ベクター、制限酵素、および制限酵素によって切断されるヌクレオチド配列の知識は、当業者に容易に入手可能である。アレルゲンまたはそのフラグメントをコードする核酸分子は、ベクターを制限酵素で切断し、２つの断片を連結することによってベクターに挿入され得る。数多くのベクターが、たとえば乳酸産生細菌に由来する潜在プラスミドに基づいて開発された（概説についてはＳｈａｒｅｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００４），２４， １５５−２０８参照）。潜在プラスミドは、それらの複製機能以外には、見かけ上の機能を持たない、すなわち認識できる表現型をコードしない染色体外ＤＮＡエレメントである。σ複製およびθ複製プラスミドは、乳酸産生細菌における最も一般的なプラスミドである。
【００２９】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍに由来する潜在プラスミドの例は、ｐｃａＴ、ｐＡｌ、ｐＬＰ１、ｐ ８０１４−１、ｐＣ３０ｉｌ、ｐＬＢ４、ｐＬＰ２０００、ｐＬＰ９０００、ｐＬＫＬ、ｐＬＫＳおよびｐＭＤ５０５７を含むが、これらに限定されない。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍに由来するベクターの例は、ｐＬＹ２、ｐＬＹ４、ｐＬＥＭ３、ｐＬＦ１３１１およびｐＫＣ５ｂを含むが、これらに限定されない。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓに由来する潜在プラスミドの例は、ｐ１、ｐ３、ｐＰＭ４、ｐＬＡ１０３、ｐＬＡ１０５およびｐＬＪ１０６を含むが、これらに限定されない。他の乳酸桿菌属種からの数多くのさらなる潜在プラスミドが当技術分野において公知である（たとえば、上記Ｓｈａｒｅｃｋ ｅｔ ａｌ．を参照）。上記プラスミドのいずれもが、本発明による乳酸桿菌を得るための、発現ベクターを含むベクターを作製するために使用され得る。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍに由来する潜在プラスミドの例は、ほんの数例を挙げると、ｐｃａＴ、ｐＡ１、ｐＵＬＰ８、ｐＵＬＰ９、ｐＬＰ８２５、ｐＬＰ８２Ｈ、ｐＬＰＣ３７、ｐＰＳＣ１、ｐＰＳＣ１１、ｐＰＳＣ２２、ｐＬＰＶ１０６、ｐＬＰＩＩＩ、ｐＬＥＭ５、ｐＬＥＭ７およびｐＬＦＶＭ２を含むが、これらに限定されない。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍに由来する潜在プラスミドの例は、ｐＬＹ２、ｐＬＹ４、ｐＬＥＭ５、ｐＬＥＭ７、ｐＬＦＶＭ２およびｐＳＰ１を含むが、これらに限定されない。
【００３０】
たとえば上記例の１つのような潜在プラスミドは、たとえば本発明の組換え乳酸桿菌を得るために使用できるシャトルベクターの構築に役立ち得る。説明例として、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉから単離される潜在プラスミドｐＬＣ４９４は、単離プラスミドｐＬＣ４９４と単離Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ／大腸菌プラスミドｐＪＩＲ４１８を使用する遺伝子操作技術によって乳酸桿菌／大腸菌シャトルベクター（ｐＪＬＥ４９４１）を構築するために使用された（Ａｎ，Ｈ−Ｙ，Ｍｉｙａｍｏｔｏ，Ｔ．，Ｐｌａｓｍｉｄ（２００６）５５，１２８−１３４）。それぞれのシャトルベクターは、それぞれの宿主種、すなわち大腸菌と乳酸桿菌の両方で複製し得る。乳酸桿菌／大腸菌シャトルベクターのもう１つの説明例は、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓプラスミドｐＬＢ１０と大腸菌プラスミドｐＢＲ３２８から構築されるプラスミドｐＬＥ１６である。潜在プラスミドに由来する発現ベクターの２つのさらなる説明例は、２つのさらなる乳酸桿菌／大腸菌シャトルベクター、ｐＬＰ４００およびｐＬＰ５００である。さらにもう１つの例として、大腸菌発現ベクターｐＬＦ２２は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍからの潜在プラスミドｐＬＦ１３１１のレプリコンを含めることによって乳酸桿菌における使用方法に適合された。
【００３１】
本発明による組換え乳酸桿菌を得ることの説明例として、ダニアレルゲン遺伝子Ｄｅｒ ｐ ２を遺伝子操作して、ｐＬ５００乳酸桿菌／大腸菌シャトルベクター（図１および以下の実施例参照）または対応するベクターｐＬ４００にクローニングすることができる。ｐＬＰ４００およびｐＬＰ５００シャトルベクターは乳酸桿菌ＤＮＡ配列に由来する発現シグナルおよび複製エレメントを含む。Ｄｅｒ ｐ ２遺伝子を担持するこれらの組換えベクターｐＬＰ４００およびｐＬＰ５００を乳酸桿菌に導入することができる。形質転換、トランスフェクション、注入または電気穿孔法などの、核酸を桿菌に導入する様々な方法が当業者に公知である。それぞれのベクターを、たとえば、Ｌ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａ（Ｌｃ）またはＬ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ ｇｇ（Ｌ．ｇｇ）などの乳酸桿菌に電気穿孔し得る。図５は、ウエスタン免疫ブロット法による、電気穿孔後のこれらの２つの菌株におけるＤｅｒ ｐ ２の細胞内発現の検出を示す（図５）。
【００３２】
もう１つの説明例として、プラスミドｐＳＩＰ３００から得られるベクターである乳酸桿菌発現ベクターｐＳＩＰ３０８、またはプラスミドｐＳＩＰ４０１から得られるベクターである乳酸桿菌発現ベクターｐＳＩＰ４１２を同様に遺伝子操作して、乳酸桿菌に導入し得る（図３および図４参照）。Ｓφｒｖｉｇら（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００５）１５１，２４３９−２４４９）は、最近、これらおよび他の関連発現ベクターの作製ならびにＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍおよびＬ．ｓａｋｅｉにおけるそれらの使用を開示した。当業者は、たとえばＬ．ｃａｓｅｉまたはＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍなどの他の乳酸桿菌に関してこれらのベクターを使用するためには多少の修飾が必要であり得るという事実を認識する。
【００３３】
典型的には、ダニアレルゲンはＤｅｒ ｐ １、Ｄｅｒ ｐ ２またはＢｌｏ ｔ ５ である（下記も参照）。アレルゲンＤｅｒ ｐ １は、たとえばＮＣＢＩアクセッション番号Ｕ１１６９５の１０９９塩基対配列によってコードされ得る。また、ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＹ９４７５３６の６５０塩基対配列またはＮＣＢＩアクセッション番号ＡＦ２７６２３９の５９１塩基対配列であるか、またはそれらを含む配列によってもコードされ得る。
【００３４】
ダニアレルゲンがＤｅｒ ｐ ２である一部の実施形態では、このアレルゲンは配列番号１（図３５参照）の配列によってコードされる。ダニアレルゲンがＢｌｏ ｔ ５である一部の実施形態では、このアレルゲンは、ＮＣＢＩアクセッション番号Ｕ５９１０２の５３７塩基対配列であるかまたはそれを含む配列によってコードされる。ダニアレルゲンがＢｌｏ ｔ ５である一部の実施形態では、ダニアレルゲンの少なくとも免疫原性フラグメントは、配列番号２（図３４参照）の配列によってコードされる。配列番号２の配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｏ９６８７０（第二次アクセッション番号Ｑ１７２８３；ＮＣＢＩアクセッション番号Ｏ９６８７０およびＡＡＤ１０８５０に対応する）の１３４アミノ酸配列のうちの１１７アミノ酸のＣ末端フラグメントをコードする。１つの個別の実施形態では、異種核酸は、それぞれ配列番号１または配列番号２の配列を含む。他の実施形態では、異種核酸は、配列番号１または配列番号２の機能的等価物を含む。遺伝暗号の縮重は、同じアミノ酸を規定する他のコドンによる一定のコドンの置換を許容し、それゆえ同じタンパク質を生じさせる。メチオニンおよびトリプトファンを除き、公知のアミノ酸は２以上のコドンによってコードされ得るので、核酸配列は実質的に異なり得る。それゆえ、配列番号１または配列番号２の核酸配列から得られる部分または全長アミノ酸配列は、配列番号１または配列番号２に示されるものとはかなり異なる核酸配列によって転写され得る。それにもかかわらず、そのコードされるアミノ酸配列は保存される。
【００３５】
加えて、核酸配列は、配列番号１および配列番号２の核酸配列の５’末端および／または３’末端への少なくとも１個のヌクレオチドの付加、欠失または置換から生じるヌクレオチド配列、またはその誘導体を含み得る。この点において、いかなるヌクレオチドまたはポリヌクレオチドも、その付加、欠失または置換がそれぞれの転写されたポリペプチドの免疫原性を排除しないことを条件に使用され得る。説明例として、ダニアレルゲンの少なくとも免疫原性フラグメントまたはその免疫原性ホモログをコードする核酸分子は、必要に応じて、その５’末端および／または３’末端に付加された制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有し得る。
【００３６】
一部の実施形態では、ダニアレルゲンはＤｅｒ ｐ ２であり、異種核酸配列はＤｅｒ ｐ ２の免疫原性ホモログをコードする。この異種核酸配列は、たとえば配列番号１の核酸配列（上記参照）に少なくとも８０％同一の核酸配列を有し得る。これらの実施形態の一部では、異種核酸配列は、配列番号１の核酸配列に少なくとも９０％同一の、たとえば少なくとも９５％同一の核酸配列を有し得る。同様に、一部の実施形態では、ダニアレルゲンはＢｌｏ ｔ ５であり、異種核酸配列はＢｌｏ ｔ ５の免疫原性ホモログをコードする。この異種核酸配列は、たとえば配列番号２の核酸配列に少なくとも８０％同一の核酸配列を有し得る。これらの実施形態の一部では、異種核酸配列は、配列番号２の核酸配列に少なくとも９０％同一の、たとえば少なくとも９５％同一の核酸配列を有し得る。
【００３７】
本発明はまた、治療における使用のための上述した組換え乳酸桿菌を特徴とする。それぞれの治療の説明例は、以下で詳述するようなアレルゲンに対する免疫応答の調節である。治療における使用のための実施形態では、組換え乳酸桿菌は、生物、たとえばヒトなどの哺乳動物に投与されるのに適した形態で提供される。説明例として、組換え乳酸桿菌は食品に含まれて提供され得る。組換え乳酸桿菌を含む食品のそれぞれの形態の例は、ヨーグルト、ザワークラウト、ピクルス、キムチ、チーズ、バターミルクサワードウパンおよび貯蔵牧草を含むが、これらに限定されない。
【００３８】
投与に適する各形態のさらなる例は医薬組成物である。本発明による医薬組成物は、上述した組換え乳酸桿菌を含む。組換え乳酸桿菌はいかなる活性状態であってもよい。組換え乳酸桿菌は、たとえば生菌であり、完全に活性で代謝性および複製性であり得る（図２５および図２６参照）。さらなる例として、組換え乳酸桿菌は、たとえば熱処理によって、少なくともある程度まで、不活性化されていてもよい。熱不活性化は、たとえば非耐熱性補体タンパク質を破壊するために望ましいと考えられる。一部の実施形態では、組換え乳酸桿菌は死菌であり得る。これらの実施形態の一部では、組換え乳酸桿菌は、生菌であるか死菌であるかにかかわらず、無傷であり得る。他の実施形態では、組換え乳酸桿菌は崩壊しつつあるかまたは崩壊していてもよい。組換え乳酸桿菌の構造は、たとえば、あらゆる程度の細胞デブリの存在を含めて、部分的にまたは完全に崩壊していてもよい。
【００３９】
一部の実施形態では、医薬組成物は組換え乳酸桿菌の治療有効量を含有する。ここで使用するとき、「治療有効量」という語句は、必要な用量および期間で、所望の治療結果を達成する組換え乳酸桿菌の量を指す。治療有効量は、たとえば、投与されたときに、治療中のアレルギー状態の症状の１またはそれ以上を完全にまたは少なくともある程度まで軽減または緩和し得る。組換え乳酸桿菌の正確な治療有効量は、治療される被験者の疾患状態、年齢、性別および体重、それぞれのアレルゲンに対する被験者の敏感度、およびアレルギーの重症度、製剤の性質、および投与経路を含むがこれらに限定されない多くの因子に依存し、最終的には主治医または獣医の裁量である。用量レジメンは、最適治療応答を与えるように調節され得る。典型的には、組換え乳酸桿菌は、約１０^９〜約１０^１１ＣＦＵ（コロニー形成単位）／受容者（動物）／日の範囲内、たとえば約５×１０^１０ＣＦＵ／日の範囲内で治療のために投与される。許容される１日用量は、たとえば約１０^９ＣＦＵ〜約１０^１１ＣＦＵ／受容者（動物）／日、特に約５×１０^１０ＣＦＵ〜約５×１０^１１ＣＦＵ／日であり得る。種々の量の医薬組成物が投与の有効量を達成するために投与され得ること、または適合された相対量の乳酸桿菌を含む医薬組成物が投与のために使用され得ることが理解される。説明例として、医薬組成物は、投与されたとき治療有効量として組換え乳酸桿菌の約５×１０^１０ＣＦＵ〜約５×１０^１１ＣＦＵの１日用量を達成するために適切な範囲内の量を含有し得る。
【００４０】
一部の実施形態では、医薬組成物は組換え乳酸桿菌の予防有効量を含有する。ここで使用するとき、「予防有効量」という語句は、必要な用量と期間で、投与されたときに、治療中のアレルギー状態の症状の１つまたはそれ以上を完全にまたは少なくともある程度まで予防するなどの、所望予防結果を達成する組換え乳酸桿菌の量を指す。予防有効量は、治療有効量に関して上述したように決定され得る。特定被験者に関して、詳細な用量レジメンは、個別の必要性および組成物を投与するまたは投与を監視する人の専門的判断に従って経時的に調節され得る。予防のために、組換え乳酸桿菌は、たとえば約１０^９〜約１０^１０ＣＦＵ／受容者（動物）／日の範囲内、たとえば５×１０^９ＣＦＵ／日の範囲内で投与され得る。説明例として、医薬組成物は、投与されたとき、予防有効量として組換え乳酸桿菌の約１０^９ＣＦＵ〜約１０^１０ＣＦＵの１日用量を達成するために適切な範囲内の量を含有し得る。
【００４１】
医薬組成物は、医薬的に許容される担体、希釈剤または賦形剤をさらに含有する。組換え乳酸桿菌の免疫調節活性を排除しないいかなる担体または希釈剤も使用され得る。所望の場合は、組換え乳酸桿菌の免疫調節活性に全く影響を及ぼさない担体または希釈剤を選択し得る。担体は、たとえば水（たとえば生理食塩水、カルボキシメチルセルロースナトリウム水溶液またはポリビニルピロリドン水溶液など）、エタノール、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなどのポリオル、それらの適切な混合物および植物油を含む溶媒または分散媒質であり得る。適切な担体の説明例はリポソームである。適切な賦形剤の例は、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップおよびメチルセルロースを含むが、これらに限定されない。医薬組成物は、たとえば潤滑剤（滑石、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱物油など）、湿潤剤、乳化および懸濁化剤、安息香酸メチルおよびヒドロキシ安息香酸プロピルなどの防腐剤、甘味料および香味料を付加的に含み得る。安定剤も医薬組成物に含まれ得る。適切な安定剤の例は、アルカリ金属リン酸水素塩、グルタミン酸塩、血清アルブミン、ゼラチンまたはカゼインを含むが、これらに限定されない。アジュバント、たとえばヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、オクタデシルアミノ酸エステル、リゾレシチン、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、メトキシヘキサデシルグリセロール、およびプルロニックポリオル、ピランなどのポリアミン、デキストラン硫酸、ポリＩＣ、カルボポールなどの界面活性物質；ムラミルジペプチドなどのペプチド、ジメチルグリシン、タフトシン、油性乳剤、および水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムなどの無機ゲルも、医薬組成物に含まれ得る。アジュバントは、たとえばミョウバンまたは植物油、モノオレイン酸イソマンニドおよびモノステアリン酸アルミニウムを含む組成物であり得る。アジュバントのさらなる例は、生体適合性マトリックス材料の微粒子またはビーズを含む。医薬組成物は、抗菌薬および抗真菌薬、たとえばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸またはチメロサールなどの防腐剤をさらに含有し得る。
【００４２】
医薬組成物は、たとえば錠剤または丸剤などの固体形態または液体形態であり得る。液体形態の説明例として、経口または注射による投与のための組換え乳酸桿菌を含む組成物は、水溶液、適切に風味づけられたシロップ、水性または油性懸濁液、もしくはゴマ油、ヤシ油、綿実油または落花生油などの食用油による着香乳剤、またはエリキシルであり得る。
【００４３】
一部の実施形態では、医薬組成物は、コルチコステロイド、抗ヒスタミン薬、ロイコトリエン修飾剤、マスト細胞脱顆粒阻害剤（マスト細胞安定剤）、うっ血除去薬およびβ２アドレナリン受容体作動薬の少なくとも１つをさらに含む。
【００４４】
コルチコステロイドは、一般にアレルギー性炎症を軽減または除去することができる。本発明の医薬組成物中にコルチコステロイドを含めることは、たとえば喘息における気道リモデリングの予防および正常な肺機能の達成を目標とし得る。適切なコルチコステロイドの例は、コルチソル、ヒドロコルチゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、コルチコステロン、デキサメタゾン、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、クロベタゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニカルベート、フルメタゾン、フルオシノロン、モメタゾン、ベタメタゾン、フルオコルトロン、フルオシノロン、アムシノイド、フルオシノイド、ハルシノイド、フルチカゾンおよびトリアムシノロンを含むが、これらに限定されない。
【００４５】
Ｈ_１−抗ヒスタミン薬、Ｈ_２−抗ヒスタミン薬またはＨ_４−抗ヒスタミン薬などの抗ヒスタミン薬は、ヒスタミン受容体に結合することによってヒスタミンの作用をブロックすることができる分子である。典型的には、ヒスタミンは、免疫応答の間に、たとえばマスト細胞から放出される。たとえばＨ_２−抗ヒスタミン薬、シメチジンおよびチオチジンなどの一部の分子は、逆作動薬（Ｈ_２受容体において）であることが認められた。しかし大部分の抗ヒスタミン薬は、現在のところ受容体拮抗物質であると考えられている。Ｈ_１−抗ヒスタミン薬の例は、メピラミン（ピリラミン）またはアンタゾリンなどのエチレンジアミン、ジフェンヒドラミン、カルビノキサミン、ドキシラミン、クレマスチンまたはジメンヒドリネートなどのエタノールアミン、フェニラミン、クロルフェナミン（クロルフェニラミン）、デクスクロルフェナミン、ブロムフェニラミンまたはトリプロリジンなどのアルキルアミン、シクリジン、ヒドロキシジンまたはメクリジンなどのピペラジン、およびプロメタジン、アリメマジン（トリメプラジン）、シプロヘプタジン、アザタジンまたはロラタジンなどの三環式Ｈ_１−抗ヒスタミン薬を含むが、これらに限定されない。Ｈ_１−抗ヒスタミン薬のさらなる例は、ジメチンデン、アクリバスチン、アステミゾール、セチリジン、レボセチリジン、ロラタジン、ミゾラスチン、テルフェナジン、ロラタジン、デスロラタジン、フェキソフェナジン、アゼラスチン、レボカバスチンおよびオロパタジンを含むが、これらに限定されない。
【００４６】
Ｈ_２−抗ヒスタミン薬の例は、シメチジン、チオチジン、ラフチジン、ファモチジンおよびラニチジンを含む。Ｈ_４受容体拮抗物質と考えられるＨ_４−抗ヒスタミン薬の説明例は、チオペラミドである。
【００４７】
ロイコトリエンは、アレルギー反応および炎症刺激物質に応答する組織中の血液炎症細胞によって放出される分子である。ロイコトリエン修飾剤（抗ロイコトリエン薬とも呼ばれる）は、それらの生合成またはそれぞれの受容体に干渉することによってロイコトリエンの作用を軽減する。ロイコトリエン修飾剤は気管支拡張作用および抗炎症作用を有する。適切なロイコトリエン受容体拮抗物質の例は、モンテルカストおよびザフィルルカストを含むが、これらに限定されない。ロイコトリエン生合成に干渉するロイコトリエン修飾剤の説明例は、リポキシゲナーゼ阻害剤、ジロイトンである。
【００４８】
マスト細胞脱顆粒阻害剤は、マスト細胞からのヒスタミンおよび他のメディエイターの放出をブロックする。適切なマスト細胞阻害剤の２つの説明例は、クロモリンおよびネドクロミルである。
【００４９】
うっ血除去薬（前出）の説明例は、たとえばカフェイン、テオフィリン、テオブロミン、アミノフィリン、ドキソフィリン、ペントキシフィリンなどのメチルキサンチン誘導体である。さらなる２つの説明例は、エフェドリンと偽エフェドリンである。
【００５０】
β２アドレナリン受容体作動薬は強力な気管支拡張薬である。それらは喘息の治療において特に有用である。β２アドレナリン受容体作動薬の例は、テルブタリン、オルシプレナリン、ソプレナリン、フェノテロール、サルブタモールおよびホルモテロールを含むが、これらに限定されない。
【００５１】
一部の実施形態では、医薬組成物は、以下でさらに詳述するように、アレルゲン、各々の免疫原性ホモログを含む、アレルゲンの免疫原性フラグメントをさらに含有する。それぞれのアレルゲンは、たとえば昆虫アレルゲン、ダニアレルゲン（貯蔵庫ダニアレルゲンを含む塵ダニアレルゲンなど）、植物アレルゲン、またはヒトを含む哺乳動物においてアレルギー反応を引き起こす何らかの他の化合物であり得る。一部の実施形態では、アレルゲンは、組換え乳酸桿菌の異種核酸配列によってコードされるダニアレルゲンと交差反応性である。典型的には、そのような交差反応性アレルゲンは、たとえば乳酸桿菌によって発現される、組換え乳酸桿菌に含まれるそれぞれの配列によってコードされるダニアレルゲンの少なくとも免疫原性フラグメントまたはその免疫原性ホモログと共通の少なくとも１つのエピトープを含む（下記も参照）。説明例として、ゴキブリアレルゲン、セイヨウシミ（Ｌｅｐｉｓｍａ ｓａｃｃｈａｒｉｎａ）およびユスリカアレルゲン、エビアレルゲンおよびカタツムリアレルゲンなどの、他の無脊椎動物の多くのアレルゲンがダニアレルゲンと交差反応性であることが知られている。
【００５２】
本発明はさらに、上述した医薬組成物を含む医薬キットを特徴とする。本発明の組換え乳酸桿菌を含有する医薬組成物に加えて、医薬キットは、アレルゲンの少なくとも免疫原性フラグメントまたはその免疫原性ホモログを含む。典型的には、それぞれのアレルゲンまたはその免疫原性フラグメント（それぞれの免疫原性ホモログを含む）は、医薬キットに含まれるとき、医薬組成物中に含有される。アレルゲンまたはアレルゲンフラグメント（その免疫原性フラグメントを含む）および乳酸桿菌は、いかなる組合せで医薬キットに含まれてもよい。それらは、たとえば同じ医薬組成物の部分または同じ医薬キット内に含まれる２つの別々の医薬組成物の部分であり得る。
【００５３】
アレルゲンは、医薬組成物の部分であるかまたは別途に医薬キット中に含まれ得る。医薬キットは、たとえば、アレルゲンまたはアレルゲンフラグメント（それぞれの免疫原性ホモログを含む）が医薬組成物（本発明に従った組換え乳酸桿菌を含み得る）とは別に保持される、複数部分の医薬パックであり得る。アレルゲンまたはアレルゲンフラグメントは、その後、投与前に混合されてもよく、または医薬組成物とは別途に投与されるものであってもよい。アレルゲンは、アレルゲン性を有する何らかの物質、典型的にはタンパク質、ポリペプチドまたは多糖であり得る。通常、アレルゲンは、アレルギー疾患に関与するアレルゲンである。アレルギー疾患は、何らかの形態の免疫系の過敏性であり得る。アレルギー疾患は、かゆみ、皮膚発疹またはじんま疹、湿疹、皮膚炎（アトピー性皮膚炎または接触皮膚炎）、鼻または眼からの排液、洞圧、咽喉炎、ぜん鳴、咳、息切れ、口、唇または咽喉の腫脹、または消化障害などの症状として発現し得る。たとえば皮膚アレルギーまたは喘息などの呼吸器系アレルギーであり得る。アレルギー疾患は何らかの特異的アレルゲンに対する応答であり得る。一部の実施形態では、アレルギー疾患は、たとえば室内塵ダニアレルギーを含む、塵ダニアレルギーなどのダニアレルギーである。
【００５４】
一部の実施形態では、医薬キットまたは上述した医薬組成物に含まれるアレルゲンは、治療有効量または予防有効量で含有される。組換え乳酸桿菌と同様に、組換え乳酸桿菌の正確な治療的または予防的に有効な量は、たとえばアレルゲンの種類および上記で示したような多くの因子に依存する。典型的には、アレルゲンの量は約１〜１０００μｇの範囲内である。一部の実施形態ではアレルゲンは週１回投与され、一部の実施形態では月１回投与されることが理解される。さらなる実施形態では、アレルゲンは、治療の開始時には週１回投与され、その後その投与は、維持のための月１回の投与まで漸減される。従って、アレルゲンの用量は送達の種類と様式に依存する。説明例として、注射に関しては、１日用量は約０．１〜約１０μｇの範囲内であり得る。舌下または経口送達については、１日用量は、たとえば約１０〜約１００μｇ／送達の範囲内であり得る。医薬キットは、たとえば、有効量として約１μｇ〜約１００μｇのアレルゲンの用量を達成するために適切な範囲内の用量を含有する医薬組成物を含み得る。
【００５５】
一部の実施形態では、医薬キットに含まれるアレルゲンはダニアレルゲンである。一部の実施形態では、このダニアレルゲンは、室内ダニのアレルゲンである。一部の実施形態では、核酸配列は、たとえば室内塵ダニアレルゲンまたは貯蔵庫ダニアレルゲンなどの、塵ダニアレルゲンをコードする。ここで使用する「塵ダニ」という用語は、塵埃中に存在するダニを指す。従って、「室内塵ダニ」という用語は、室内塵埃中に存在するダニを指すと理解される。室内塵ダニは、それゆえ、コナダニ亜目（Ａｓｔｉｇｍａｔａ）およびチリダニ科（Ｐｙｒｏｇｌｙｐｈｉｄａｅ）を含むが、これらに限定されない。１３のダニ種がこれまでに室内塵において同定されている。既に一部を上記で示したように、これらのうちの３つ、コナヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｆａｒｉｎａｅ）、ヤケヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）およびユーログリファス・マイネイ（Ｅｕｒｏｇｌｙｐｈｕｓ ｍａｙｎｅｉ）は、すべての温帯気候で認められ、世界中の家庭で一般的であり、ダニアレルゲンの主要な供給源である。熱帯気候における室内塵ダニの説明例は、貯蔵庫ダニ（Ｂｌｏｍｉａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）（Ｅｃｈｙｍｙｏｐｏｄｉｄａｅ科）である。数多くの他の貯蔵庫ダニが家庭で認められ、アレルゲンの強力な供給源である。さらなる種の例は、ニクダニ科（Ｇｌｙｃｙｐｈａｇｉｄａｅ）（Ｇｌｙｃｙｐｈａｇｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓおよびＬｅｐｉｄｏｇｌｙｐｈｕｓ ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ）、コナダニ科（Ａｃａｒｉｄａｅ）（Ｔｙｒｏｐｈａｇｕｓ ｐｕｔｒｅｓｃｅｎｔｉａｅおよびＡｃａｒｕｓ ｓｉｒｏ）およびマルニクダニ科（Ｃｈｏｒｔｏｇｌｙｐｈｉｄａｅ）（Ｃｈｏｒｔｏｇｌｙｐｈｕｓ ａｎｃｕｔａｔｕｓ）に含まれるが、これらに限定されない。サヤアシニクダニ（Ｌｅｐｉｄｏｇｌｙｐｈｕｓ ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ）は、たとえば、スウェーデンのゴットランド島の農場の塵埃（干し草塵および室内塵）において、最も重要なアレルゲンであると認められた。家庭内の塵埃中に存在し得るダニのさらなる例は、ツメダニ（ｐｒｅｄａｃｅｏｕｓ ｍｉｔｅｓ）（たとえばＣｈｅｙｌｅｔｕｓ）および、ナミハダニ（２−ｓｐｏｔｔｅｄ ｓｐｉｄｅｒ ｍｉｔｅｓ）を含む植物の寄生性太平洋ハダニ（ｐａｒａｓｉｔｉｃ ｐａｃｉｆｉｃ ｓｐｉｄｅｒ ｍｉｔｅｓ）（ＴｅｔｒａｎｙｃｈｉｄａｅおよびＴａｒｓｏｎｅｍｉｄａｅ）を含む。
【００５６】
他の実施形態では、ダニは、たとえばほんの数例を挙げると、Ｈｙｄｒａｃｈｎｉｄｉａｅなどのミズダニ、ミミダニ（Ｏｔｏｄｅｃｔｅｓ ｃｙｎｏｔｉｓ）、イヌのニキビダニ（Ｄｅｍｏｄｅｘ ｃａｎｉｓ）、ミカンハダニ（Ｐａｎｏｎｙｃｈｕｓ ｃｉｔｒｉ）、ハツカネズミダニ（ｈｏｕｓｅ ｍｏｕｓｅ ｍｉｔｅ）（Ｌｉｐｏｎｙｓｓｏｉｄｅｓ ｓａｎｕｉｎｅｕｓ）、イエダニ（Ｏｒｎｉｔｈｏｎｙｓｓｕｓ ｂａｃｏｔｉ）、ミナミトリサシダニ（Ｏｒｎｉｔｈｏｎｙｓｓｕｓ ｂｕｒｓａ）、ニワトリダニ（Ｄｅｒｍａｎｙｓｓｕｓ ｇａｌｌｉｎａｅ）、トリサシダニ（Ｏｒｎｉｔｈｏｎｙｓｓｕｓ ｓｙｌｖｉａｒｕｍ）、ヒゼンダニ（Ｔｒｉｘａｃａｒｕｓ ｃａｖｉａｅ）、ヒツジキュウセンヒゼンダニ（Ｐｓｏｒｏｐｔｅｓ ｏｖｉｓ）、ムギシラミダニ（Ｐｙｅｍｏｔｅｓ ｔｒｉｔｉｃｉ）、カブリダニ（Ｓｔｉｇｍａｅｏｐｓｉｓ ｌｏｎｇｕｓ）、リンゴハダニ（Ｐａｎｏｎｙｃｈｕｓ ｕｌｍｉ）、チューリップサビダニ（Ａｃｅｒｉａ ｔｏｓｉｃｈｅｌｌａ）、ホモノハダニ（Ｐｅｔｒｏｂｉａ ｌａｔｅｎｓ）、バンクスグラスハダニ（Ｏｌｉｇｏｎｙｃｈｕｓ ｐｒａｔｅｎｓｉｓ）、イチゴハダニ（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉ）、クローバーハダニ（Ｂｒｙｏｂｉａ ｐｒａｅｔｉｏｓａ Ｋｏｃｈ）またはミツバチのミツバチヘギイタダニ（Ｖａｒｒｏａ ｊａｃｏｂｓｏｎｉ）であり得る。これらのダニの多くが、たとえば、室内塵埃中にも存在し得る。医薬キットに含まれるダニアレルゲンはまた、ヒツジ、ブタおよびネコなどの家畜、たとえばウシに由来するダニのアレルゲンまたはその免疫原性フラグメントであり得る。例は、Ｃｈｏｒｉｏｐｔｅｓ ｂｏｖｉｓ、Ｐｓｏｒｏｐｔｅｓ ｏｖｉｓ、Ｓａｒｃｏｐｔｅｓ ｓｕｉｓおよびＮｏｔｏｅｄｒｅｓ ｃａｔｉを含むが、これらに限定されない。ダニアレルゲンは、ダニ、特にダニの身体またはダニの糞便に由来するタンパク質またはタンパク質の部分である。Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓの第１，３，４，６，８および９群アレルゲンは、たとえば酵素であり、一方、第１０，１１および１３群アレルゲンは、それぞれトロポミオシン、パラミオシンおよび脂肪酸結合タンパク質であることが知られている。塵ダニアレルゲンを含む大部分のダニアレルゲンは、ダニの消化管に由来し、従ってダニの糞便中に高レベルで認められる。ダニアレルゲンの典型的な例は、ダニの消化管に由来する酵素である。説明例として、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓからのアレルゲンＤｅｒ ｐ ６は、ダニキモトリプシンとして基質親和性に関して特性決定された。さらなる説明例として、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓからのＤｅｒ ｐ １はシステインプロテアーゼである。ダニアレルゲンのさらなる説明例は、ある生活段階からその後の段階へのダニの変化として起こる脱皮過程に関連する酵素である。説明例として、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓからのＤｅｒ ｐ ２は、脱皮と一致して発現される蛾からのタンパク質、ｅｓｒ１６と配列的に相同であることが認められた。ダニアレルゲンのさらにもう１つの説明例は、ダニが食べる食物基質上で環境に残されるダニの唾液の成分である。
【００５７】
ダニアレルゲンの例は、Ｄｅｒ ｐ、１ ｐｒｏＤｅｒ ｐ １、Ｄｅｒ ｐ ２、Ｄｅｒ ｐ ３、Ｄｅｒ ｐ ４、Ｄｅｒ ｐ ５、Ｄｅｒ ｐ ７、Ｄｅｒ ｐ ８、Ｄｅｒ ｐ ９、Ｄｅｒ ｐ １０、Ｄｅｒ ｐ １１、Ｄｅｒ ｐ １４、Ｄｅｒ ｐ １５、Ｄｅｒ ｐ １８、Ｄｅｒ ｆ １、Ｄｅｒ ｆ ２、Ｄｅｒ ｆ ３、Ｄｅｒ ｆ ４、Ｄｅｒ ｆ ５、Ｄｅｒ ｆ ６、Ｄｅｒ ｆ ７、Ｄｅｒ ｆ １０、Ｄｅｒ ｆ １１、Ｄｅｒ ｆ １５、Ｄｅｒ ｆ １６、Ｄｅｒ ｆ １８、Ｄｅｒ ｍ １、Ｅｕｒ ｍ １、Ｅｕｒ ｍ ２、Ｈｅｒ ｆ ２、Ｂｌｏ ｔ １、Ｂｌｏ ｔ ３、Ｂｌｏ ｔ ５、Ｂｌｏ ｔ １２、Ｆｅｌ ｄ １、Ｍａｇ １、Ｍａｇ ３、Ｔｙｒ ｐ ２、Ｌｅｐ ｄ １、Ｌｅｐ ｄ ２、Ｌｅｐ ｄ ５、Ｌｅｐ ｄ ７、Ｌｅｐ ｄ １０およびＬｅｐ ｄ １３を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、医薬キットに含まれるダニアレルゲン（そのフラグメントまたはそれぞれのホモログを含む）は、組換え乳酸桿菌によって発現されるダニアレルゲン（そのフラグメントまたはそれぞれのホモログを含む）と共通の少なくとも１つのエピトープを含む（上記参照）。これに関して、一部のアレルゲンは異なるダニ種によって共有されるが、また別の抗原は選択ダニ種に固有であることに留意されたい。一例として、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｆａｒｉｎａｅは、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓおよびＴｙｒｏｐｈａｇｕｓ ｐｕｔｒｅｓｃｅｎｔｉａｅといくつかのアレルゲンを共有する。いかなるダニアレルゲンも本発明全体を通して使用し得るが、それゆえ一部の実施形態では、たとえば対象とする種以外のダニ種とは、ほとんどまたは全く共有されない抗原を選択することが望ましいと考えられる。１つの実施形態では、ダニアレルゲンは、たとえば、組換え乳酸桿菌によって発現される、アレルゲンの少なくとも免疫原性フラグメントまたはその免疫原性ホモログと交差反応性であるダニアレルゲンである。もう１つの実施形態では、医薬キットに含まれるダニアレルゲンは、組換え乳酸桿菌によって発現されるダニアレルゲン、ダニアレルゲンフラグメントまたはそれぞれのホモログである。
【００５８】
免疫原性ホモログを含むそれぞれのアレルゲンまたはそのフラグメントは、何らかの供給源から入手し得る。それは、たとえば天然供給源に由来し得るかまたは合成され得る。たとえばアレルゲンを含むことが既知であるか、または含むことが疑われる供給源から、濃縮、精製または単離され得る。塵ダニアレルゲンの場合、塵ダニ唾液またはダニ糞便は、たとえばそこからアレルゲンまたはアレルゲンフラグメントを濃縮、精製または単離するために収集され得る。アレルゲンまたはフラグメントはまた、天然にポリペプチドを生産する生物、組織または細胞から濃縮、精製または単離され得る。あるいは、アレルゲンまたはそのフラグメントは何らかの生物において、ポリペプチドとして、典型的には組換えまたはトランスジェニック形態で発現され得る。一部の実施形態では、アレルゲン（その免疫原性ホモログを含む）またはアレルゲンの免疫原性フラグメント（その免疫原性ホモログを含む）は、組換え微生物などの組換え生物から、濃縮、精製および単離のいずれかによって得られる。天然に生じるアレルゲン中に存在する翻訳後修飾を有するアレルゲンまたはフラグメントを得ることが望ましい場合、翻訳後修飾のために必要な酵素を発現する真核生物または原核生物の選択が有効であり得る。濃縮されたアレルゲンの説明例は、たとえば皮下、皮内または舌下投与用の滅菌溶液として供給されるそれぞれのアレルゲンの抽出物である。そのようなアレルゲン抽出物は市販のものが入手可能であり、たとえばＨｏｌｌｉｓｔｅｒ−Ｓｔｉｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社の「ＰＭＧ Ｍｉｔｅ Ｍｉｘ／Ｇ３３Ｇ３８０５」、Ｓｔａｌｌｅｒｇｅｎｅｓ社の「Ｓｔａｌｏｒａｌ」（舌下送達用）、Ｇｒｅｅｒ社の「Ａｌｌｅｒｇｅｎｉｃ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄ Ｍｉｔｅ」またはＡＬＫ Ａｂｅｌｌｏ社の「ＲＸ ｍｉｘ ｈｏｕｓｅ ｄｕｓｔ ｍｏｌｄ ｉｎｈａｌａｎｔ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ」が市販されている。
【００５９】
アレルゲンまたはアレルゲンフラグメントなどの分子に関して「濃縮」という用語は、特定分子が、正常細胞または疾患細胞または分子が採取された細胞におけるよりも、対象細胞または溶液中に存在するすべての分子の有意に高い分画（２〜５倍など）を構成することを意味する。有意にという用語は、ここでは上昇のレベルがそのような上昇を生じる人にとって有用であることを指示するために使用され、一般には他の物質、たとえばアミノ酸配列に比べて少なくとも約２倍、たとえば少なくとも５〜１０倍またはそれ以上の上昇を意味する。この用語はまた、他の供給源からのアレルゲンの存在を排除しない。そのようなアレルゲンの他の供給源は、たとえば環境からのアレルゲンもしくは酵母または細菌ゲノムまたはクローニングベクターによってコードされるアレルゲンを含み得る。この用語は、ヒトが所望の物質、たとえば所望のアレルゲンの割合を上昇させるために介入した状況だけを含むことを意図されていることが理解される。
【００６０】
濃縮は、たとえば、たとえば核分画、形質膜分画またはミクロソーム分画などの細胞抽出物から分画を得ることを含み得る。これは、遠心分離などの標準手法によって入手し得る。濃縮の他の手段の例はろ過または透析であり、それらは、たとえば一定分子量以下の分子の除去、または有機溶媒または硫酸アンモニウムを使用した沈殿を対象とし得る。アレルゲンなどの物質に関して「精製」という用語は、物質の元の環境と比較した相対的表示であり、それにより、たとえばアレルゲンまたはアレルゲンフラグメントが天然環境におけるよりも相対的に純粋であることの表示であると理解される。それゆえそれは、絶対純度（均一な製剤など）という意味での絶対値を表わさない。天然レベルと比較して、精製されたアレルゲンまたはアレルゲンフラグメントのレベルは少なくとも２〜５倍上回るべきである（たとえばμｇ／ｍｌで）。少なくとも一桁分、たとえば２桁または３桁分の精製が明白に考慮される。精製アレルゲンまたはアレルゲンフラグメント（またはその免疫原性ホモログ）は、典型的には重複するまたは同様の免疫原性の活性（いわゆる交差反応性など）を示す夾雑物質を基本的に含まず、たとえば９０％、９５％または９９％純粋である。
【００６１】
精製は、たとえばクロマトグラフィー手法、たとえばゲルろ過法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティー精製、疎水性相互作用クロマトグラフィーまたは疎水性電荷誘導クロマトグラフィーを含み得る。精製はまた、複数のそのような手法の組合せまたはそのような手法と他の方法の組合せを含み得る。精製のもう１つの説明例は、分取キャピラリー電気泳動などの電気泳動手法である。単離は、同様の方法の組合せを含み得る。「単離」という用語は、天然に生じる物質または天然に生じる配列がその通常の細胞（たとえば細胞内）環境から取り出されたことを指示する。それゆえ、その物質または配列は、無細胞溶液または懸濁液等の中に存在し得るか、または異なる細胞環境に置かれ得る。この用語は、その物質または配列について、唯一その物質または配列のみが存在することを意味するのではなく、基本的には天然でそれに結合している他の物質を含まないこと（通常は少なくとも約９０〜９５％純粋）を意味する。
【００６２】
アレルゲンまたはアレルゲンフラグメントは、当技術分野で周知の方法によって天然供給源から単離され得る。天然供給源は、たとえば哺乳動物（たとえばヒト）の、血液、精液または組織であり得る。一部の実施形態では、アレルゲンまたはアレルゲンフラグメントは、そのポリペプチドを発現するように変性された生物または細胞から入手し得る。当技術分野で広く確立されている遺伝子操作の技術によって、細胞または生物を、それが通常は生産しないか、または細胞が通常はより低いレベルで生産するタンパク質を生産するようにすることができる。説明例は、組換え真核または原核宿主細胞またはトランスジェニック生物である。
【００６３】
もう１つの実施形態では、ポリペプチドは、たとえばアミノ酸から出発する化学的または酵素的方法によってインビトロで合成され得る。化学的方法は当技術分野において周知であり、関与するアミノ酸ならびに伸長するペプチド鎖の反応性官能基の保護、活性化、カップリングおよび選択的脱保護の連続工程を含む。酵素的戦略は、たとえば別途に生産した合成フラグメントのプロテアーゼによるブロック状カップリング（ｂｌｏｃｋｗｉｓｅ ｃｏｕｐｌｉｎｇ）を含む。所望の場合は、市販の自動ポリペプチド合成装置を使用し得る。
【００６４】
アレルゲン（そのフラグメントまたはそれぞれのホモログを含む）は、上述したような適切な担体および／または希釈剤と共に提供され得る。アレルゲンは、たとえば適切な輸送タンパク質に化学結合され得る。さらなる例として、リポソームに組み込まれ得るか、またはワクチン製剤における使用のために多糖および／または他のポリマーに複合され得る。
【００６５】
本発明はさらに、哺乳動物においてアレルゲンに対する免疫応答の制御を含む調節方法を提供する。哺乳動物におけるアレルゲンに対する免疫応答の調節は、典型的にはアレルギー状態の症状の１つまたはそれ以上を完全にまたは少なくともある程度まで軽減または緩和するため、もしくはアレルギー状態の症状の１つまたはそれ以上を完全にまたは少なくともある程度まで予防するために実施される。哺乳動物は、たとえばマウス、ラット、ウサギ、ハムスター、イヌ、ネコ、マーモセット、類人猿、またはヒトであり得る。典型的な実施形態では、本発明の方法は、アレルギー疾患を治療する方法であるか、またはアレルギー疾患を治療する方法に含まれる。「治療する」および「治療」という用語は、ここで使用するとき、アレルギー状態の進行を少なくとも実質的にまたは一定の程度まで、緩和し、実質的に抑制し、軽減し、緩慢化し、排除しまたは逆転させること、アレルギー状態の臨床または感覚的症状を、少なくとも実質的にまたは一定の程度まで改善すること、そのような状態の臨床または感覚的症状の出現を予防すること、もしくは以前に罹患した被験者において状態の再発を、少なくともある程度まで予防しまたは遅延させることを含む。
【００６６】
本発明の方法は、上述した組成物を投与することを含む。これに関して、本発明はまた、アレルゲンに対する免疫応答の制御を含む調節を行うための、医薬キットの製造における上述した組換え乳酸桿菌の使用方法に関する。これに関して本発明は、同様に、アレルゲンに対する免疫応答の調節におけるそれぞれの乳酸桿菌の使用方法に関する。前記使用ならびに方法は、たとえばアレルギーの治療において用いられ、前記アレルギーは、塵ダニアレルギー、たとえば室内塵ダニアレルギーなどのダニアレルギーであり得る。アレルゲンは、典型的にはダニアレルゲン、たとえば塵ダニアレルゲン（例については上記参照）、たとえば室内塵ダニアレルゲンである。一部の実施形態では、それに対する応答を調節するためにそれぞれの乳酸桿菌が使用されるダニアレルゲンは、組換え乳酸桿菌によって発現されるダニアレルゲンと共通の少なくとも１つのエピトープ（上記参照）を含む。１つの実施形態では、ダニアレルゲンは、組換え乳酸桿菌によって発現されるダニアレルゲンである。それぞれのアレルギーの例は、喘息、鼻炎（枯草熱）、アトピー性皮膚炎（湿疹）およびじんま疹を含むが（症状の例については上記も参照のこと）、これらに限定されない。それぞれのアレルギーはまた、咳、くしゃみ、鼻づまり、咽頭炎、後鼻漏、顔面紅潮、および吐き気などの症状に関連し得る。
【００６７】
組換え乳酸桿菌は、その乳酸桿菌がアレルゲンに対する免疫応答を調節するために使用され得る限り、いかなる手段によって宿主に投与されてもよい。同様に、医薬キット全体がいかなる手段によって投与されてもよい。典型的には、組換え乳酸桿菌は、哺乳動物に投与されるとき、医薬組成物に含有される。これは一般に、医薬キットに含まれる場合の抗原にも当てはまる。また一般に、宿主に対して不必要に有害とならない投与形態を使用することが所望されるべきである。当業者は、それゆえ、本発明が、たとえば組換え乳酸桿菌の経口または舌下投与を許容することを認識する。一部の実施形態では、医薬キット全体が経口投与または舌下投与され得る。
【００６８】
経口投与された乳酸桿菌を追跡することができるように、一部の実施形態では前記乳酸桿菌に標識するか、または同時に投与される対応乳酸桿菌に標識することが望ましい。説明例は、アレルゲンと同じベクターにおける増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）の使用であり、アレルゲンを伴うか、または代わりの別個のベクターにおいての使用かは問わない。図６は、Ｌ．ｃａｓｅｉ ＳｈｉｒｏｔａにおけるｐＬ５００ベクター内のｅＧＦＰの発現およびマウスの胃腸管における経口投与された生組換え乳酸桿菌のモニタリングを示す。共焦点顕微鏡によって測定されるように、この例は、生組換えＬ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａ−ｅＧＦＰが、マウスに経口投与されると小腸パイアー斑のＴ細胞およびＢ細胞領域の両方に転位できることを示す（図６参照）。これは、パイアー斑の単形および多形細胞の液胞内の無傷Ｌ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａ−ｅＧＦＰを示す透過型電子顕微鏡によってさらに確認される（図７参照）。
【００６９】
予防または治療目的のための乳酸桿菌の使用（下記も参照）はいくつかの利点を有する。第一に、乳製品における乳酸桿菌の伝統的使用は、「一般に安全と認められる（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ａｓ Ｓａｆｅ）」（ＧＲＡＳ）状態である。それらは、ヨーグルト、チーズおよびバターミルクなどの指定標準食品において使用されている。乳酸桿菌の病原性の潜在的可能性は非常に低い。乳酸桿菌はまた、たとえば腸内感染を予防し、血清コレステロールレベルを低下させ、抗発癌作用を示す共生細菌である。「共生」という用語は、摂取されたとき健康に有益な作用を有する生存または不活性化生物を指す。第二に、種々の乳酸桿菌株が消費者食品キット（たとえば乳児用粉ミルク）において現在使用されており、組換え乳酸桿菌はそれ自体、安定で便利な食品グレードのキットに開発されることができる。たとえば食品グレードのワクチンキットの消費は、開発途上国における経済的で重要な多回投与および大規模／集団免疫の可能性に加えて、非経口経路（侵襲性で痛みがある）と比較したとき便利でコンプライアンスが高い。第三に、乳酸桿菌は低い内因性免疫原性を有するが、乳酸桿菌の細胞壁成分（たとえばペプチドグリカン）は、発現されたまたは細菌に結合された外来性抗原／アレルゲンにアジュバント特性を与えることができるだけでなく、免疫応答への免疫調節作用も付与することができる。乳酸桿菌などの、安全で非侵襲的な手段による小児および免疫無防備状態集団の粘膜関連リンパ系組織への抗原／アレルゲンの送達は、広く行き渡っているワクチン接種選択肢への極めて重要な改善となる。
【００７０】
一部の実施形態では、本発明の方法は、医薬組成物または医薬組成物の反復投与のための医薬キット、またはその中に含まれる医薬組成物中で、それぞれの乳酸桿菌を反復投与することを含む。同様に、一部の実施形態では、組換え乳酸桿菌は、それぞれの乳酸桿菌の反復投与のための医薬組成物または医薬キット中で使用される。一部の実施形態では、医薬組成物または医薬キット全体が反復投与用である。
【００７１】
アレルゲンに対する免疫応答の有効な制御または調節は、当技術分野で公知の何らかの手段によってモニタリングされ得る。説明例として、免疫応答に関与する因子、たとえばポリペプチドまたはタンパク質のレベル、特にアレルギー性免疫応答に関与する因子のレベルがモニタリングされ得る。添付の図面および実施例はそれぞれのモニタリング方法を例示する。たとえば図８は、Ｌ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａと共にインビトロで共培養したナイーブマウスの脾臓および腸間膜リンパ節からのＴ細胞が、調節性Ｔ細胞サイトカイン、ＴＧＦ−βの分泌を媒介することを示す。Ｄｅｒ ｐ ２特異的Ｔ細胞プライミング（下記参照）は、組換えＬ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａ／Ｄｅｒ ｐ ２（Ｌｃ／Ｄｐ２）を給餌したマウスのパイアー斑からの細胞のＤｅｒ ｐ ２特異的増殖によって示され、ＮａＨＣＯ_３を与えたマウスではこの増殖はみられない（図９参照）。それぞれの図はさらに、Ｌ．ｃａｓｅｉ／ｐＬＰ５００（Ｌｃ／Ｖ）またはＬｃ／Ｄｐ２を４日間連続して経口投与したマウスでは、ＮａＨＣＯ_３を給餌したマウスと比較して腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）におけるＣＤ３^＋ＣＤ４^＋Ｄ２５^＋Ｔ細胞のサブセットが上昇することを示す（図９Ｂ）。これは、共生細菌Ｌ．ｃａｓｅｉを給餌したマウスにおけるＴｒ細胞群の誘導を示唆する。
【００７２】
本発明の方法はさらに、何らかの天然に生じる乳酸桿菌とアレルゲン（例については上記参照）の併用投与を特徴とする。一部の実施形態では、乳酸桿菌は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｎｔｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｉｌｇａｒｄｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｉｓｈｍａｎｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｅｎｓｅｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｕｃａｓｉｃｕｓ、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓから成る群より選択される。一部の実施形態では、さらに天然に生じる乳酸桿菌が、本発明の組換え乳酸桿菌と組み合わせて投与される。これらの実施形態の一部では、天然に生じる乳酸桿菌は組換え乳酸桿菌と同じ種である。他の実施形態では、天然に生じる乳酸桿菌は、別の細菌、たとえば糞便連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、酪酸菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）またはＢａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃｕｓなどの別の共生細菌と組み合わせて投与される。一部の実施形態では、それぞれの乳酸桿菌は、それぞれのアレルゲンと同じ医薬組成物に含まれ得る。他の実施形態では、乳酸桿菌とアレルゲンは別々に提供され得る。それらは、たとえば別々の医薬組成物に含まれ得る。そのような医薬組成物は、共通の医薬キットに含まれ得る。
【００７３】
一部の実施形態では、本発明の方法は、アレルゲンまたはアレルゲンの免疫原性ホモログと本発明の組換え乳酸桿菌の併用投与（下記参照）を含む。一部の実施形態では、組換え乳酸桿菌は、アレルゲンの免疫原性フラグメントまたは免疫原性ホモログと組み合わせて投与され得る。このダニアレルゲン、その免疫原性フラグメントまたはそれぞれの免疫原性ホモログは、上記で説明したように、たとえば組換え生物からの濃縮、精製および単離のいずれかによって入手し得る。一部の実施形態では、組換え乳酸桿菌は、アレルゲンまたはそのホモログと一緒に、たとえば同時に投与され得る。説明例として、乳酸桿菌は、アレルゲンを共に含む医薬キットの製造において使用され得る。乳酸桿菌は、それゆえ、アレルゲンと共に医薬キットの一部であり得る。乳酸桿菌とアレルゲンは、たとえば医薬キットに含まれる医薬組成物の一部であり得る。他の実施形態では、乳酸桿菌は医薬組成物の一部であり、一方アレルゲンは別の成分であるか、または医薬キットの別の成分、たとえばさらなる医薬組成物中に含まれる。
【００７４】
乳酸桿菌を含む医薬キットまたは医薬組成物に含まれるそれぞれのアレルゲン、アレルゲンフラグメントまたはそれぞれのホモログは、典型的にはダニアレルゲン、たとえば室内塵ダニアレルゲンなどの塵ダニアレルゲン（例については上記参照）である。一部の実施形態では、ダニアレルゲンに対する応答を調節するためにそれぞれの乳酸桿菌が使用されるそのダニアレルゲンは、組換え乳酸桿菌によって発現されるダニアレルゲン、ダニアレルゲンフラグメントまたはそれぞれのホモログと共通の少なくとも１つのエピトープ（上記参照）を含む。ダニアレルゲン（そのフラグメントまたはそれぞれのホモログを含む）は、たとえば乳酸桿菌によって発現されるアレルゲン（そのフラグメントまたはそれぞれのホモログを含む）と交差反応性であり得る。１つの実施形態では、ダニアレルゲン、そのフラグメントまたはそれぞれのホモログは、組換え乳酸桿菌によって発現されるダニアレルゲン、そのフラグメントまたはそれぞれのホモログである。アレルゲンの適用は何らかの経路と方法によって実施され得る。アレルゲン（そのフラグメントまたはそれぞれのホモログを含む）は、たとえば舌下的、皮下的、皮内的、経皮的、経上皮的に、またはそれらのあらゆる組合せによって適用され得る。説明例として、アレルゲンまたはアレルゲンフラグメントまたはその免疫原性ホモログ（たとえば医薬組成物に含まれる）は経皮投与されてもよく、乳酸桿菌（たとえば医薬組成物に含まれる）は経口投与されてもよい。乳酸桿菌と同様に、アレルゲンまたはアレルゲンフラグメントは、１回または数回、たとえば選択された時間間隔で投与され得る。一部の実施形態では、アレルゲンまたはアレルゲンフラグメントは反復投与され得る。
【００７５】
当業者は、乳酸桿菌を使用する利点（前出）だけでなく、同じく以下の実施例で説明されるところの、乳酸桿菌とそれぞれのアレルゲンの併用投与がアレルギーの治療と予防のための相乗作用を生じさせるという、驚くべき本発明者らの所見も理解するであろう。１つの態様では、本発明は、それゆえまた、アレルギーの有効な治療および予防戦略のための二重方式アプローチを提供する。
【００７６】
乳酸桿菌とアレルゲン、アレルゲンフラグメントまたはそれぞれのホモログは、独立した用量で互いに独立して投与され得る。従って、乳酸桿菌とアレルゲン（ホモログを含む）またはそのフラグメントの適用は、たとえば同時にまたは経時的に連続して何度でも実施され得る。従って乳酸桿菌は、たとえばアレルゲンと同時に投与されたとき、免疫応答を、たとえば増強などの調節を行うことができるアジュバントとして使用され得る。一部の実施形態では、乳酸桿菌とアレルゲン、アレルゲンフラグメントまたはそれぞれのホモログは連続的に使用される。たとえば投与レジメンにおける選択された時間間隔の間、アレルゲン（そのフラグメントまたはそれぞれのホモログを含む）のみ、乳酸桿菌のみまたはアレルゲンのみが投与され得る。説明例として、乳酸桿菌が数回投与される場合、アレルゲンは、事前に、乳酸桿菌の２回の適用の間に、または乳酸桿菌の最後の適用後に投与されてもよく、逆もまた同様である。一部の実施形態では、乳酸桿菌は反復的に、たとえば１日１回投与される。アレルゲンは、その後一定期間にわたって乳酸桿菌の１回またはそれ以上の適用後に投与される。その後、乳酸桿菌だけがさらに反復投与される。そのような場合、乳酸桿菌および／またはアレルゲンの投与の形態が、たとえば図１０または図１６に示すように、変化してもよいことが理解される。一部の実施形態では、乳酸桿菌が最初に、たとえば以下で述べるように適用され得る。他の実施形態では、アレルゲンが最初に、たとえば図２２に示すように適用され得る。
【００７７】
従って、アレルゲン（そのフラグメントまたはそれぞれのホモログを含む）および乳酸桿菌の投与は、いわゆる「プライムブースト」レジメンあるいは予防的または治療的な方法などの、１つまたはそれ以上の独立した個別投与の形態で実施され得る。そのようなレジメン（または方法）において、乳酸桿菌は、たとえば「プライミング」段階で送達され、その後アレルゲンは「ブースティング」段階で送達されてもよく、逆もまた同様である。たとえば乳酸桿菌が最初に投与される場合、それは「プライマー」と称され、その後投与されるアレルゲンは「ブースター」と呼ばれることもある。「プライミング」および「ブースティング」という用語は、それらが投与される順序ではなく宿主生物への抗原および乳酸桿菌の作用を指すことが理解される。それゆえプライマーは、ブースターの前に、ブースターと同時にまたはブースターの後に投与され得る。ブースティング組成物より後の投与は、たとえばブースティング組成物が作用するのにより長い時間を要すると予想される場合に望ましいと考えられる。
【００７８】
そのような「プライムブースト」レジメンは、たとえば予防のために、すなわちアレルゲンに対する免疫応答を前もって軽減し、低下させ、または予防するために使用され得る。そのような場合、対応するアレルゲンに対する宿主の免疫系の過敏性の作用を軽減または予防することも望ましいと考えられる。そのような実施形態では、「プライミング」はまた、１回目の（たとえば抗原の）投与が、同じ抗原による２回目の（たとえば乳酸桿菌の）投与時に免疫応答の生成を許容する免疫付与であり、２回目の免疫応答は、１回目の免疫付与が提供されない場合にもたらされる免疫応答よりも大きいものであるその投与の方法を指すこともある。一部の実施形態では、それぞれの予防レジメンは、アレルゲン感作に対して動物または個人を保護するために使用され得る。
【００７９】
一部の実施形態では、哺乳動物（たとえばヒト）においてアレルゲンに対する免疫応答を制御する方法は、
（ａ）本発明による組換え乳酸桿菌または上述したような組換え乳酸桿菌を含有する医薬組成物を提供すること、
（ｂ）本発明による組換え乳酸桿菌または組換え乳酸桿菌を含有する医薬組成物を投与すること、
（ｃ）アレルゲンの少なくとも免疫原性フラグメント（またはそのそれぞれの免疫原性ホモログ）、もしくは上述したようなアレルゲンの少なくとも免疫原性フラグメント（またはそのそれぞれの免疫原性ホモログ）を含有する医薬組成物を提供すること、および、
（ｄ）アレルゲンの少なくとも免疫原性フラグメント（またはそのそれぞれの免疫原性ホモログ）、もしくはアレルゲンの少なくとも免疫原性フラグメント（またはそのそれぞれの免疫原性ホモログ）を含有する医薬組成物を投与することを含む。
【００８０】
説明例として、前記方法は、以下の工程を含んでもよい。
ａ）本発明による組換え乳酸桿菌または本発明による医薬組成物の治療有効量で哺乳動物をプライムする工程、
ｂ）任意で１日後から約１週間後までの間に、工程ａ）を１〜３回反復する工程、
ｃ）アレルゲンの治療有効量で動物をブーストする工程、および、
ｄ）任意でその後約１週間から約１ヶ月の期間の経過後に、工程ｃ）を１〜５回反復する工程。
【００８１】
上記で指摘したように、アレルゲンは、一部の実施形態では本発明による組換え乳酸桿菌によって発現されるアレルゲンであるか、またはそのアレルゲンに相当し得るものである。
【００８２】
従って、一部の実施形態では、乳酸桿菌の投与はプライミングにおいて役割を果たし、抗原（そのフラグメントまたはそれぞれのホモログを含む）の投与はブースティングにおいて役割を果たす。それぞれの例は図１０に示されている。この例では、経口投与したＤｅｒ ｐ ２を発現する組換えＬ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａを、予防レジメンでのＤｅｒ ｐ ２の皮下ブースティングと組み合わせて使用した。乳酸桿菌の代わりに効果のないＮａＨＣＯ_３を使用した場合との比較では、Ｄｅｒ ｐ ２を発現する組換えＬ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａ単独の投与が、気道抗原刺激後でもＩｇＥ生成を抑制することを示す（図１１参照）。それに対し、Ｄｅｒ ｐ ２特異的血清ＩｇＧ１のレベルは影響を受けなかった。同様に、Ｔリンパ球によるＴｈ２サイトカインおよびプロ炎症性サイトカインの生成は下方調節された（図１２）。
【００８３】
この例では、Ｄｅｒ ｐ ２を発現する組換えＬ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａの投与は、Ｔｈ２およびＤｅｒ ｐ ２ 特異的Ｔｒ細胞の混合物に対してプライミングした（下記も参照）。これらのＤｅｒ ｐ ２ 特異的Ｔｒ細胞は、ＴＧＦ−β１などの調節性サイトカインを通して既存のＴｈ２細胞に阻害または寛容原性作用を及ぼし得る。さらに、気道抗原刺激後に得られたＤｅｒ ｐ ２を発現する組換えＬ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａをあらかじめ投与しておいたマウスの血清中の循環インターロイキン１０（ＩＬ−１０）サイトカインレベルは、対照群と比較して有意に低いことが認められた。ＩＬ−１０は、Ｔｈ２細胞またはＴ調節型リンパ球によって生成される多面発現性サイトカインである。アトピー性アレルギーおよび喘息では、インターロイキン１０の発現上昇が以前から認められていた。Ｔ調節性細胞によって産生されるＩＬ−１０は抗炎症性であり、Ｔｈ１型サイトカインおよび／またはＴｈ２産生を調節することができる。Ｔｈ２サイトカインはさらに低下する。エオタキシンのレベルも低下した。エオタキシンはアレルギー炎症を調節する重要なケモカインであり、エオタキシンの血清濃度は、たとえば喘息において高いことがこれまでに認められている。トランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦ−β１）のレベルの有意な低下も認められた（図１４参照）。Ｔｒ細胞の生存と機能のための一般的に公知のサイトカイン、ＴＧＦ−β１は、肺において好酸球によって産生され、Ｔｈ２サイトカイン誘導性エオタキシン放出を調節することが知られている。ＴＧＦ−β１はまた、線維芽細胞のための増殖因子としての役割も果たし、それゆえ肺の粘膜関連リンパ系組織におけるＴＧＦ−β１の上昇は、気道リモデリングを増大または悪化させることが報告されている。
【００８４】
同時に、これらのマウスはまた、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）において低い細胞数を示し（図１５Ａ）、Ａｃ群、すなわちアレルゲンとエアロゾル抗原刺激でそれぞれ処置されただけのマウスの群と同様のレベルである。抗原に対する炎症応答の一部であり、ＩｇＥ受容体によって活性化されることが知られる好中球の数も、Ｄｅｒ ｐ ２を発現する組換えＬ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａをあらかじめ投与されていたマウスにおいて有意に低かった（図１５Ｂ）。アレルギー疾患において増加することが知られている好酸球の数は低かった。気道抗原刺激の２４時間後に採取した肺切片の組織学的分析は、陰性対照（ダニアレルゲンをコードしないベクターとＮａＨＣＯ_３または乳酸桿菌）を投与されていたマウスにおいて種々の程度（軽度から重度）の気道病変を示した。さらに、炎症性浸潤物がこれらのマウスの気管支肺胞腔を取り囲んでいた。それに対し、Ｄｅｒ ｐ ２を発現する組換えＬ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａを投与されていたマウスの肺切片は、肺炎症の実質的な低下を示し、Ａｃマウスと同様のプロフィールを有していた（図１５Ｃ参照）。この例から推測できるように、アレルゲンによるブースティングと組み合わせた組換え乳酸桿菌でのプライミングは、アレルギー応答を下方調節する上で有効である。
【００８５】
さらなる例として、アレルゲンに対するアレルギー性免疫応答の治療または予防は免疫療法であり得る。免疫療法におけるアレルゲンと免疫との併用を、たとえば治療のための乳酸桿菌の投与と組み合わせてもよい（下記の実施例参照）。そのような組合せは、効果を実質的に改善し、同時に免疫療法のために必要な期間を短縮することができる。抗原特異的ＩｇＥの血清レベルは、たとえば、有意に低下する（図１７Ａおよび図２３Ａ参照）。それぞれの抗原だけを使用する従来の免疫療法に基づいてそのような作用を達成するためには、たとえば図２５および図２６に示すように、高用量の抗原を必要とする。抗原５０μｇの皮下用量（すなわち高用量）だけがＩｇＥレベルを低下させ、抗原１０μｇの用量、すなわち低用量はＩｇＥレベルの上昇を生じさせた（図２６Ａ参照）。それゆえ、乳酸桿菌とそれぞれの抗原の組合せは、従来の免疫療法の不都合を軽減し、その治療の頻度と期間を低下させるため、アナフィラキシーの危険度を低減して効果を改善する可能性が高い。アレルギー疾患の予防と治療の両方に対する食品ベースの介入戦略の開発のための、プライムブースト法における本発明の組換え乳酸桿菌の潜在能力と効果も、付属の実施例によって明らかにされる。
【００８６】
上記から明白であるように、本発明による組換え乳酸桿菌の使用方法は、アレルギー治療およびアレルギー予防の両方のために、現在の方法と比較して有益である。さらに、たとえば免疫療法におけるそれぞれの乳酸桿菌と抗原の併用適用は、組換えアレルゲンに基づく免疫療法の効果を大きく増強する。それぞれの二重方式アプローチは、アレルギー疾患の有効な処置のための相乗作用を生み出す。これに関して、ワクチン接種によるアレルギー予防は、同様に本発明の組換え乳酸桿菌とアレルゲンの併用適用によって実施され得る。アレルゲンまたはそのフラグメントを発現する組換え乳酸桿菌は、たとえば免疫系をプライムし、その後アレルゲンタンパク質の投与からのブースティング作用を伴う食品ベースの抗原特異的予防ワクチンとして使用することができる。やはり、この二重方式アプローチは、その後のアレルギー感作の予防のための相乗作用を生じさせる。
【００８７】
本発明が容易に理解され、実施されるために、特定実施形態を以下の例示的実施形態および非限定的実施例によってここで説明する。
（例示的実施形態）
本発明の組換え乳酸桿菌、本発明の医薬キットおよびそれらの使用の例示的実施形態を添付の図面に示す。
【００８８】
図１Ａは、ダニアレルゲン（ＨＤＭ）遺伝子の発現のために使用される従来の乳酸桿菌／大腸菌シャトルベクターｐＬ５００を図式的に示す。制限酵素についての部位が指示されている。ＢａｍＨＩとＮｈｅＩ部位によって規定されるセグメントを、Ｄｅｒ ｐ ２抗原をコードする配列（下記参照）によって置換した。「ｌｄｈ」は乳酸デヒドロゲナーゼを表わし、「Ｐｌｄｈ」はＬ．ｃａｓｅｉのｌｄｈ遺伝子のプロモーター配列を表わす。「Ｔｃｂｈ」はＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍのｃｂｈ遺伝子の転写終結配列を表わす。
【００８９】
図１Ｂは、乳酸桿菌におけるＤｅｒ ｐ ２／ダニアレルゲン発現構築物の作製のために使用される中間体ｐＴＵＡＴベクターを図式的に示す。制限酵素についての部位が指示されている。
【００９０】
図１Ｃは、構成的乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈ）プロモーターの制御下のｐＬＰ５００−ＨＤＭ発現構築物を図式的に示す。「Ｐｌｄｈ」は、Ｌ．ｃａｓｅｉのｌｄｈ遺伝子のプロモーター配列を表わす。「アンカー」は、Ｌ．ｃａｓｅｉのアンカー配列である１１７アミノ酸のペプチドをコードするセグメントを表わす。
【００９１】
図２は、同様にダニアレルゲン（ＨＤＭ）遺伝子の発現のために使用されるもう１つの従来の乳酸桿菌／大腸菌シャトルベクターｐＬ４００を図式的に示す。制限酵素についての部位が指示されている。ＢａｍＨＩとＮｈｅＩ部位（下線を付している）によって規定されるセグメントが、Ｂｌｏ ｔ ５抗原をコードする配列（下記参照）によって置換された。
【００９２】
図３は、本発明の組換え乳酸桿菌に含まれ得るベクターのさらなる例である乳酸桿菌発現ベクターｐＳＩＰ３０８を図式的に示す。それぞれの制限酵素を用いてダニアレルゲンまたはそのフラグメントをコードする配列を含めるために、レポーター遺伝子が使用されてもよい。
【００９３】
図４は、本発明の組換え乳酸桿菌に含まれ得るベクターのさらにもう１つの例である乳酸桿菌発現ベクターｐＳＩＰ４１２を図式的に示す。ダニアレルゲンまたはそのフラグメントをコードする配列は、やはりレポーター遺伝子の部位に導入され得る。
【００９４】
図５は、ウエスタン免疫ブロット法による、乳酸桿菌Ｌ．ｃａｓｅｉ ＳｈｉｒｏｔａおよびＬ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ ｇｇの２つの菌株におけるＤｅｒ ｐ ２の異種発現の検出を示す。合計３×１０^９細胞が超音波処理によって溶解緩衝液１ｍＬに溶解された。細胞溶解産物（１０μＬ）は１０％トリス−トリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離され、ウエスタン免疫ブロットアッセイに供された。Ｄｅｒ ｐ ２に対するモノクローナル免疫グロブリン（１：１０，０００希釈）、ビオチニル化抗マウス免疫グロブリン（１：１０，０００希釈）、およびペルオキシダーゼ結合ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ（Ｓｉｇｍａ社、１：５，０００希釈）が用いられた。Ｓｕｐｅｒｉｇｎａｌ（登録商標）Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ化学発光基質においてシグナルを発現させた。レーンは、「Ｍ」：染色前／ビオチンタンパク質分子量マーカー（ＢｉｏＲａｄ社）、（１）Ｌ．ｇｇ／ｐＬ５００からの全溶解産物、（２）Ｌ．ｇｇ／Ｄｅｒ ｐ ２からの全溶解産物、（３）Ｌｃａｓｅｉ／ｐＬ５００からの全溶解産物、（４）Ｌ．ｃａｓｅｉ／Ｄｅｒ ｐ ２からの全溶解産物、およびレーン（５）酵母（２００ｎｇ）において産生された組換えＤｅｒ ｐ ２タンパク質である。矢印は、Ｄｅｒ ｐ ２−アンカー融合タンパク質の位置を示す。前記タンパク質は、組換えＬ．ｃａｓｅｉ ＳｈｉｒｏｔａおよびＬ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ ｇｇ中には存在するが、対照として使用した野生型には存在しない。
【００９５】
図６は、Ｌ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａ−ｅＧＦＰがパイアー斑のＴ細胞およびＢ細胞領域にどのように転位するかを示す。写真は共焦点顕微鏡下の画像を示す。連続４日間Ｌ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａ−ｅＧＦＰを給餌したマウスからのパイアー斑の（Ａ）生存Ｌ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａ−ｅＧＦＰおよび（Ｂ）クリオスタット切片が示されている。左側は、それぞれパイアー斑切片における（Ｂ）内のＬ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａ−ｅＧＦＰ細菌の位置を示す。３色全部が重ね合わさる、同じ視野のＡＰＣ結合抗マウスＴＨＹ−１．２およびＰＥ結合抗マウスＣＤ−１９（それぞれＴ細胞およびＢ細胞領域を染色する）の組合せによる免疫組織化学染色が右側に示されており、Ｔ細胞およびＢ細胞領域における細菌の位置を指示する。共焦点顕微鏡分析は、Ｔ細胞およびＢ細胞領域（右側の画像参照）、特に領域接合部におけるＬ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａ−ｅＧＦＰ（左側）の分布を示した。
【００９６】
図７は、透過型電子顕微鏡によるパイアー斑内の単形（Ａ）および多形（Ｂ）細胞の液胞への無傷Ｌ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａ−ｅＧＦＰのトランスロケーションを示す。矢印は、Ｌ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａ−ｅＧＦＰの位置を指示する。
【００９７】
図８は、Ｌ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａとインビトロで共培養したＴ細胞におけるＴＧＦ−β産生の誘導を示す。（Ａ）１：０．５の割合でＬ．ｃａｓｅｉと共培養したナイーブマウスからの全腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）細胞または脾細胞は、細胞単独の対照と比較してＴＧＦ−βサイトカイン産生の有意な上昇を示した。（Ｂ）１：０．５または１：１の割合でＬ．ｃａｓｅｉと共培養したナイーブマウスの脾臓から選別されたＣＤ３^＋Ｔ細胞も、ＴＧＦ−β産生の上方調節を誘導した。
【００９８】
図９は、組換えＬｃ／Ｄｐ２を給餌したマウスにおけるＤｅｒ ｐ ２特異的Ｔ細胞増殖および調節性ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞の増加を示す。（Ａ）Ｃ５６ＢＬ／６マウスに、１×１０^９ｃｆｕ／マウスの組換えＬｃ／Ｄｐ２または野生型Ｌ．ｃ／ＶまたはＮａＨＣＯ_３対照を１ヶ月間（１週につき連続３日間）経口投与した。給餌の終了時にマウスを屠殺し、５μｇ／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌの組換え酵母Ｄｅｒ ｐ ２の不在下または存在下でのＨ^３標識チミジンの組込みを利用した増殖アッセイのために、パイアー斑からＴ細胞を単離した。（Ｂ）Ｌｃ／Ｄｐ２（ｎ＝５）、野生型Ｌｃ／Ｖ（ｎ＝５）またはＮａＨＣＯ_３（ｎ＝６）を給餌したマウスの腸間膜リンパ節からの細胞のＦＡＣＳ分析である。示されているように、腸間膜リンパ節におけるＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋細胞のサブセットは、ＮａＨＣＯ_３群と比較してＬｃ／Ｄｐ２およびＬｃ／Ｖの両群において有意に高かった。
【００９９】
図１０は、使用した予防レジメンを示す。実験中、ＮａＨＣＯ_３緩衝液、熱死滅Ｌｃ／ＶまたはＬｃ／Ｄｐ２のいずれかを給餌したＣ５７ＢＬ／６マウス（各群につきｎ＝５）から成る、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの３つの群を設定した。給餌は、時間線の下の黒い三角「▲」によって示している。給餌は、１週につき連続３日間、１日１回実施した。１１日目と１８日目に、すべてのマウスを組換えＤｅｒ ｐ ２（５０μｇ／マウス）の皮下免疫付与によってブーストした。その後、すべてのマウスを経上皮パッチ適用によって３回感作し（２２、３６および５０日目）、Ｄｅｒ ｐ ２のエアロゾルによって２回抗原刺激した。最後の抗原刺激の約２４時間後にマウスを屠殺し、分画細胞数算定およびサイトカイン分析のために気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）を採取し、ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色のために肺を採取した。加えて、一次および二次Ｔ細胞培養およびサイトカイン分析のために、腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）および脾臓からの細胞を得た。
【０１００】
図１１は、Ｄｅｒ ｐ ２特異的免疫グロブリン応答を示す。Ｄｅｒ ｐ ２による皮下ブーストを受けたマウスについてのＤｅｒ ｐ ２特異的血清ＩｇＥの動態は、３つの群に関して有意差を示さなかったが、皮下ブーストを受けず、Ｌｃ／Ｄｐ２を給餌されたマウスは、ＮａＨＣＯ_３（ｐ＝０．０４２）およびＬｃ／Ｖ（ｐ＝０．００４）と比較してＩｇＥの有意な減少を示した。８５日目、すなわち最後のエアロゾル抗原刺激後のＩｇＥ力価（図１１の右側参照）では、ＮａＨＣＯ_３適用（▲対△参照）およびＬｃ／Ｖ適用（■対□）について、皮下ブーストを受けなかったマウスと比較して皮下ブーストを受けたマウスに関してＩｇＥレベルが有意に低いことが明らかである。Ｌｃ／Ｄｐ２給餌マウス（●対○）だけが同等のレベルを示す。この結果は、マウスへのＬｃ／Ｄｐ２の給餌が皮下ブーストの有無に関わらず、ＩｇＥ産生を低減させ得ることを示す。
【０１０１】
図１２は、脾Ｔ細胞のサイトカインプロフィールを示す。脾細胞をＤｅｒ ｐ ２（１０μｇ／ｍｌ）の存在下で３日間培養し、その後ＩＬ−２の存在下でさらに４日間培養した。培養の９日目に、Ｔ細胞をフィコール密度勾配遠心分離によって精製した。約１×１０^５細胞／ウェルを、３×１０^５ＡＰＣ／ウェルおよびＤｅｒ ｐ ２（１０μｇ／ｍｌ）の存在下で４８時間培養した。対照ウェルは、Ｄｅｒ ｐ ２不在下の細胞から成る。ＥＬＩＳＡによるサイトカインプロファイリングのために培地を収集した。Ｌｃ／Ｄｐ２給餌マウスからのＤｅｒ ｐ ２特異的脾Ｔ細胞は、ＮａＨＣＯ_３およびＬｃ／Ｖと比較すると、より低レベルのＴｈ２（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３）およびプロ炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ）を生産した。しかし、Ｌｃ／Ｄｐ２給餌マウスは、Ｌｃ／Ｖ群と比較すると、より高いレベルのＴ調節性サイトカイン（ＴＧＦ−βおよびＩＬ−１０）を生産した（図２４も参照）。
【０１０２】
図１３は、ＭＬＮ細胞のサイトカインプロフィールを示す。マウスのＭＬＮからの全細胞を、抗ＣＤ３およびＣＤ２８の存在下で９６ウェルプレート（３×１０^５細胞／ウェル）において４８時間培養した。示されているように、Ｌｃ／ＶおよびＬｃ／Ｄｐ２群は、ＮａＨＣＯ_３対照群と比較して有意に低いレベルのＩＬ−１３を生産し、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０の有意でない低下（Ａｃマウスと同様のレベル）を生じた（Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）。加えて、Ｌｃ／Ｄｐ２給餌マウスからのＭＬＮ細胞は、対照群と比較して高いレベルのＴＧＦ−βを生産した（Ｄ）。
【０１０３】
図１４は、ＢＡＬＦのサイトカインのプロフィールを示す。Ｌｃ／ＶまたはＬｃ／Ｄｅｒｐ２のいずれかを給餌されたマウスのＢＡＬＦサイトカインプロフィールは、ＮａＨＣＯ_３対照と比較すると、エフェクターＴｈ２サイトカイン（ＩＬ−１３、ＩＬ−５）、プロ炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α）、ＴＧＦ−βおよびケモカインであるエオタキシンの低下を指示した。
【０１０４】
図１５は、ＢＡＬＦ分析および肺組織学検査を示す。ＢＡＬＦと肺を、分析および組織学的Ｈ＆Ｅ染色のために、エアロゾル抗原刺激の２４時間後に採取した。ＮａＨＣＯ_３およびＬｃ／Ｖの対照群と比較すると、Ｌｃ／Ｄｐ２群は、エアロゾル抗原刺激（Ａｃ）だけを受けたマウスと同様に、ＢＡＬＦ細胞数の減少を示した（Ａ）。加えて、Ｌｃ／Ｄｐ２給餌マウスだけが好中球動員の低下を示した（Ｂ）。すべての群が、ＢＡＬＦ中のマクロファージ、単球および好酸球の同様のパーセンテージを示した。各群の２匹の代表マウスからの肺組織を示した。２匹のエアロゾル対照マウスからの肺切片のＨ＆Ｅ染色（ＧおよびＨ）は、細気管支腔内のごくわずかな炎症性浸潤物および肺実質における極微の気道炎症のバックグラウンドを示した。しかし、ＮａＨＣＯ_３（ＡとＢ）およびＬｃ／Ｖ（ＣとＤ）群からのマウスの肺組織は、気道および細気管支腔を取り囲む種々の程度（軽度から重度）の気道浸潤炎症細胞を示した。比較すると、Ｌｃ／Ｄｐ２給餌マウス（ＥとＦ）は炎症性浸潤物のより大きな減少を示し、Ａｃ群と同様のプロフィールを有していた。
【０１０５】
図１６は、治療レジメンを示す。治療レジメンでは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、０、１４および２８日目にＤｅｒ ｐ ２アレルゲンの経上皮パッチ適用によって前感作した。３３日目に、すべてのマウスについてＤｅｒｐ２特異的血清ＩｇＥおよびＩｇＧ１のレベルをＥＬＩＳＡによって測定し、その後ＩｇＥレベルに基づいてマウスを３つの群に分けた（ｎ＝６）。３５日目に、マウスにＮａＨＣＯ_３緩衝液、Ｌｃ／ＶまたはＬｃ／Ｄｐ２のいずれかを、１週につき連続３日間、１日１回５週間にわたって経口的に給餌した。５５日目と６２日目に、マウスにＤｅｒ ｐ ２（５０μｇ／マウス）の２回の皮下免疫付与を実施し、１週間後、Ｄｅｒ ｐ ２（ＰＢＳ １０ｍｌ中１ｍｇ）のエアロゾルによってマウスを２回抗原刺激した。給餌は、時間線の下の黒い三角「▲」によって示している。最後の抗原刺激の約２４時間後に、マウスを屠殺し、分画細胞数算定およびサイトカイン分析のためにＢＡＬＦを採取し、Ｈ＆Ｅ染色のために肺を採取した。加えて、一次および二次Ｔ細胞培養およびサイトカイン分析のために、腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）および脾臓からの細胞を得た。
【０１０６】
図１７は、Ｄｅｒ ｐ ２特異的免疫グロブリン応答を示す。３群すべてのマウスについてのＤｅｒ ｐ ２特異的血清ＩｇＥ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの動態は、図１７（Ａ、ＣおよびＥ）に示されるとおりである。３群すべてのマウスが、給餌開始の１週間後にＤｅｒ ｐ ２特異的ＩｇＥの低下を示した（Ａ）。ＩｇＥレベルは、対照マウスと比較すると、Ｌｃ／ＶおよびＬｃ／Ｄｐ２給餌マウスでは２回の連続的エアロゾル抗原刺激（６９日目と７７日目）の前後で有意に低下した（Ｂ）。Ｄｅｒ ｐ ２特異的血清ＩｇＧ１は、対照マウスと比較すると、これら２つの群では６２日目と６９日目に有意に上昇し、気道抗原刺激後も変化しないままであった（ＣとＤ）。
【０１０７】
図１８は、脾Ｔ細胞の選択サイトカインのプロフィールを示す。脾細胞をＤｅｒ ｐ ２（１０μｇ／ｍｌ）の存在下で３日間培養し、その後ＩＬ−２の存在下でさらに４日間培養した。培養の９日目に、Ｔ細胞をフィコール密度勾配遠心分離によって精製し、約１×１０^５細胞／ウェルを３×１０^５ＡＰＣ／ウェルおよびＤｅｒ ｐ ２アレルゲン（１０μｇ／ｍｌ）の存在下で４８時間培養した。対照ウェルは、Ｄｅｒ ｐ ２不在下の細胞から成る。ＥＬＩＳＡによるサイトカインプロファイリングのために培地を収集した。Ｌｃ／Ｄｐ２およびＬｃ／Ｖ群は、ＮａＨＣＯ_３群と比較すると、Ｔｈ２サイトカイン（ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＬ−１０）産生の有意な低下とＩＬ−４およびＴＮＦ−αの有意でない低下を示した（Ａ〜Ｅ）。ＴＧＦ−β１産生も低下した（Ｆ）。ＩＦＮ−γの産生は３つの群すべてにおいて検出されなかった。
【０１０８】
図１９は、腸間膜リンパ節細胞の選択サイトカインプロフィールを示す。腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）からの全細胞を、抗ＣＤ３およびＣＤ２８の存在下で９６ウェルプレート（３×１０^５細胞／ウェル）において４８時間培養した。Ｌｃ／Ｄｐ２およびＬｃ／Ｖの両群からのＭＬＮ細胞は、サイトカインプロフィールが示されたＮａＨＣＯ_３群と比較すると、Ｔｈ２およびプロ炎症性サイトカイン（ＩＬ−５、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−１０およびＴＮＦ−α）の有意でない低下を示した（Ａ〜Ｅ）。加えて、ＴＧＦ−β１産生は、対照群と比較すると、Ｌｃ／Ｄｐ２およびＬｃ／Ｖの両群からの細胞において高かった。
【０１０９】
図２０は、ＢＡＬＦのサイトカインプロフィールを示す。最後のエアロゾル抗原刺激の約２４時間後にマウスを屠殺し、サイトカイン分析のためにＢＡＬＦを採取した。ＮａＨＣＯ_３群と比較すると、Ｌｃ／ＶおよびＬｃ／Ｄｐ２の両群では、Ｔｈ２およびプロ炎症性サイトカイン（ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＬ−４、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β）およびケモカイン（エオタキシン）の有意でない低下が生じる。両群は、Ａｃ対照群と同様のレベルを有する。
【０１１０】
図２１は、肺における病態生理学的変化および気管支肺胞洗浄液分析を示す。ＢＡＬＦの分析は、Ｌｃ／ＶおよびＬｃ／Ｄｐ２の両方がエアロゾル対照群（Ａｃ）と同様の総浸潤細胞数を有し、ＮａＨＣＯ_３群で認められるよりも有意でなく低いことを示唆した（Ａ）。分画細胞分析は、これらの群の両方について好中球および好酸球の減少を示し、リンパ球およびマクロファージの数には変化がなかった（Ｂ）。Ｌｃ／Ｄｐ２群だけが、その他の群と比較するとＢＡＬＦ中の単球数のわずかな減少を示した。各群の２匹の代表マウスからの肺組織を示した。２匹のエアロゾル対照マウスからの肺切片のＨ＆Ｅ染色（ＧとＨ）は、細気管支腔内のごくわずかな炎症性浸潤物と肺実質における極微の気道炎症のバックグラウンドを示した。しかし、ＮａＨＣＯ_３群からのマウスの肺組織は、気道および細気管支腔を取り囲む種々の程度（軽度から重度）の気道浸潤炎症細胞を示した（ＡとＢ）。比較すると、Ｌｃ／Ｖ（ＣとＤ）およびＬｃ／Ｄｐ２（ＥとＦ）給餌マウスは、どちらも炎症性浸潤物のより大きな減少を示し、Ａｃマウスと同様のプロフィールを有していた。
【０１１１】
図２２は、生組換え乳酸桿菌を使用する治療レジメンを示す。治療レジメンでは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの２つの群を、１，１４および２８日目に経上皮パッチ適用によって組換え酵母由来Ｄｅｒ ｐ ２アレルゲンで前感作した。１４日間の休息後、ＩｇＥ応答マウスだけを治療試験のために等しく２つの群（Ｌｂ対緩衝液、ｎ＝６）に分けた。生組換えＤｅｒ ｐ ２（Ｌｃ／Ｄｒｐ２）をＬｂ群に給餌した。マウスは、４２日目から７０日目まで合計４週間にわたって毎日給餌された。８０日目に両群をＤｅｒ ｐ ２（ＰＢＳ １０ｍｌ中１ｍｇ）のエアロゾルによって抗原刺激した。気管支収縮の指標である肺気流抵抗の測定（ｐＥｎｈ）には、約２４時間を要した。一次および二次Ｔ細胞培養のため、８２日目にマウスを屠殺した。
【０１１２】
図２３は、全身的免疫グロブリン応答を示す。能動的給餌の７日後、Ｄｅｒ ｐ ２特異的血清ＩｇＥ（Ａ）の４１％の減少がＬ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａ／Ｄｐ２群で認められたのに比して、ＮａＨＣＯ_３対照群では２７％だけであった。加えて、Ｄｅｒ ｐ ２特異的血清ＩｇＧ１（Ｂ）は、能動的給餌の１４日後、Ｌ．ｃａｓｅｉ／Ｄｐ２群において有意に減少し、一方、ＮａＨＣＯ_３対照群は給餌の２１日後にＩｇＧ１の減少を示しただけであった。（Ｃ）の二次培養からの脾サイトカインのプロフィールにおいて、白い棒は５匹の対照マウスからのデータの平均値を示す。黒い棒は、６匹の給餌マウスのプール細胞から得たデータの平均値を示す。緩衝液給餌マウスおよび組換え乳酸桿菌給餌マウスのプール細胞（プール細胞は低い増殖を示し、これはＴ調節性細胞のマーカーである）からの脾Ｔ細胞のサイトカインプロフィールは、ＴＨ１（ＩＦＮγ）およびＴＨ２（ＩＬ−５およびＩＬ−１３）サイトカイン形成において差を示さなかった。しかし、Ｌ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａ／Ｄｐ２を給餌されたマウスは、Ｔ調節性サイトカイン（ＩＬ−１０およびＴＧＦ−β）産生の上昇を示した。緩衝液給餌マウス（ｎ＝６）対組換え乳酸桿菌給餌マウスのプール細胞。
【０１１３】
図２４は、治療モデル仮説を示すが、これは、いかなる意味においても本発明の方法の基礎となる作用に関し、またはその作用を拘束することを意図しないものと理解される。経上皮パッチ適用は、ＴＨ２細胞からのＩＬ−５のレベル低下を生じさせ得る。しかし、組換え乳酸桿菌は、Ｔｒ細胞のサイトカインのレベル上昇を引き起こし得る。
【０１１４】
図２５は、マウスへの皮下プライミングの作用の分析のための実験プロトコールの概要を示す。マウスを、０，４，８日目にＤｅｒ ｐ ２の低用量（ＬＤ、１０μｇ）または高用量（ＨＤ、５０μｇ）の皮下注射によってプライミングし、その後２８日目にＤｅｒ ｐ ２でブーストした。マウスを、５６，５８，６０および６２日目に３０分間、ＰＢＳ中０．１ｍｇ／ｍｌのＤｅｒ ｐ ２のエアロゾル吸入に供し、６４日目にＴ細胞サイトカイン分析のために屠殺した。対照マウスはエアロゾル吸入だけに供した。
【０１１５】
図２６は、マウスにおけるＤｅｒ ｐ ２特異的体液性応答の動態を示す。マウスをＤｅｒ ｐ ２の低用量（白い四角、１０μｇ）または高用量（黒い四角、５０μｇ）の皮下注射によってプライミングし、その後Ｄｅｒ ｐ ２の低用量およびエアロゾル吸入でブーストした。Ｄｅｒ ｐ ２の低用量または高用量でプライミングしたマウスのＤｅｒ ｐ ２特異的ＩｇＥ（Ａ）、ＩｇＧ１（Ｂ）およびＩｇＧ２ａ（Ｃ）力価をＥＬＩＳＡによって測定した。データは平均±標準誤差（ｎ＝８）として表わしている。^＊：ｐ＜０．０５、独立標本についての両側スチューデントｔ検定。
【０１１６】
図２７は、脾ＣＤ４^＋Ｔ細胞のサイトカインプロフィールに関するＲＴ−ＰＣＲ分析を示す（表１も参照のこと）。Ｄｅｒ ｐ ２の低用量（ＬＤ、図の上部参照）および高用量（ＨＤ）でプライミングしたマウスおよび対照マウス（Ｃ）を、６４日目にエアロゾル化Ｄｅｒ ｐ ２曝露に供し、屠殺した。脾細胞をＤｅｒ ｐ ２と共に１０日間培養した。Ｄｅｒ ｐ ２培養脾細胞の精製ＣＤ４^＋Ｔ細胞を抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で２４時間刺激し、全ＲＮＡをサイトカイン発現の分析のために単離した。比較のために、年齢を適合させたナイーブマウス（Ｎ）からの精製ＣＤ４^＋Ｔ細胞が含められた。各々のバンドは、８匹のマウスのプールした脾からの増幅サイトカイン一式を示す。（^＊：実施せず）
図２８は、培養下のリンパ節のサイトカインプロフィールを示す。マウスを、０，４，８日目にｒＤｅｒ ｐ ２タンパク質の低用量（ＬＤ、１０μｇ）または高用量（ＨＤ、５０μｇ）、またはＰＢＳでプライミングし、１０日目に屠殺した。リンパ節を採取し、ｒＤｅｒ ｐ ２タンパク質の存在下で３〜５日間培養した。培養上清を収集し、ＩＦＮ−γ（Ａ）、ＩＬ−４（Ｂ）、ＩＬ−９（Ｃ）、ＩＬ−１０（Ｄ）およびＴＧＦ−β（Ｅ）形成に関してＥＬＩＳＡによって分析した。示されている結果は２回の独立した実験を代表する。平均±標準誤差（ｎ＝４）。^＊ ＰＢＳとの比較、＃ ＨＤとの比較、ｐ＜０．０５、独立標本についての両側スチューデントｔ検定。
【０１１７】
図２９は、ＳＰ培養物のサイトカインプロフィールを示す。マウスを、０，４および８日目に皮下注射によってＤｅｒ ｐ ２の低用量（ＬＤ、１０μｇ）または高用量（ＨＤ、５０μｇ）、またはＰＢＳでプライミングした。ＳＰを１０日目に採取し、ｒＤｅｒ ｐ ２タンパク質１０μｇ／ｍｌと共に培養した。上清を３〜５日目に収集し、ＩＦＮ−γ（Ａ）、ＩＬ−４（Ｂ）、ＩＬ−９（Ｃ）、ＩＬ−１０（Ｄ）、ＩＬ−１３（Ｅ）およびＴＧＦ−β（Ｆ）形成に関してＥＬＩＳＡによって分析した。示されている結果は２回の独立した実験を代表し、平均±標準誤差（ｎ＝４）である。^＊ ＰＢＳとの比較でｐ＜０．０５、＃ ＨＤとの比較でｐ＜０．０５、両側スチューデントｔ検定。
【０１１８】
図３０は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋細胞と共培養したときの抗原特異的ＴＨ２細胞の増殖とサイトカイン応答を示す。抗原特異的ＴＨ２細胞は、ｒＤｅｒ ｐ ２タンパク質５０μｇをパッチ適用したマウスの脾細胞培養物から得られた。ＴＨ２細胞を、ｒＤｅｒ ｐ ２タンパク質のＬＤ（ＬＤ＋ＴＨ２）またはＨＤ（ＨＤ＋ＴＨ２）でプライミングしたマウスの脾ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞と共に、またはｒＤｅｒ ｐ ２タンパク質の存在下において単独（ＴＨ２単独）で５日間培養し、増殖応答に関して検定した。増殖率は、ＴＨ２細胞単独の指数として表わされている（ａ）。上清をｔ＝７２時間に採集し、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３産生に関して検定した（ｂ、ｃ、ｄ）。結果は３回の独立した実験の平均を示し、平均±標準誤差である。^＊ ＨＤとの比較、＃ ＴＨ２単独との比較。スチューデントｔ検定、ｐ＜０．０５。
【０１１９】
図３１は、Ｂｌｏ ｔ ５アレルゲンを発現する組換えＬ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａに関する動物試験で使用したレジメンを示す。Ｂａｌｂｃ／Ｊマウスの３つの群、ＮａＨＣＯ_３（ｎ＝４）、Ｌ．ｃａｓｅｉ／ｐＬ４００（ｎ＝４）およびＬ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａ／Ｂｌｏ ｔ ５（Ｌ．ｃａｓｅｉ／Ｂｔ ５；ｎ＝４）を検査した。１週につき連続４日間（矢印で示す）毎日１×１０^９ｃｆｕ／マウスをマウスに給餌した。各々のマウスが摂取した総食餌量は、１×１０^９ｃｆｕの２０回用量であった。マウスを７週目まで毎週１回採血し、Ｂｌｏ ｔ ５特異的血清免疫グロブリンをＥＬＩＳＡによって検定した。マウスを１９８日目に屠殺し、サイトカイン分析のために、パイアー斑および脾臓からのＴ細胞を得た。
【０１２０】
図３２は、ＥＬＩＳＡによって得られたＢｌｏ ｔ ５特異的血清免疫グロブリンのデータを示す。有意のレベルのＢｌｏ ｔ ５特異的ＩｇＧ１が検出されたが、有意のレベルのＩｇＥおよびＩｇＧ２ａは検出されなかった。
【０１２１】
図３３は、屠殺したマウスのサイトカイン分析を示す（図３４参照）。Ｌ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａ／Ｂｌｏ ｔ ５を給餌したマウスのパイアー斑からのＴ細胞においてのみ、有意のレベルの調節性サイトカインＴＧＦ−βが検出され、生組換えＬ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａ／Ｂｌｏ ｔ ５がパイアー斑中のＴ細胞によるＴ調節性サイトカインの産生を積極的に誘導したことを示している。
【０１２２】
図３４は、発現ベクターｐＬＰ４００において、本発明を説明する実施例で使用されたアレルゲンＢｌｏ ｔ ５の核酸配列（上の列）およびアミノ酸配列（下の列、１文字コード）を示す。５’末端の付加的な塩基「Ａ」（逆方向）が、ベクターの固有の開始コドンと共にインフレームで遺伝子をシフトするために導入された。
【０１２３】
図３５は、発現ベクターｐＬＰ５００において、本発明を説明する実施例で使用されたアレルゲンＤｅｒ ｐ ２の核酸配列（上の列）およびアミノ酸配列（下の列、１文字コード）を示す。５’末端の付加的な塩基「Ａ」（逆方向）が、ベクターの固有の開始コドンと共にインフレームで遺伝子をシフトするために導入された。配列は、Ｌ．ｃａｓｅｉのアンカー配列（「アンカー」）を含んだ。
【０１２４】
【表１】

表Ｉは、リアルタイムＰＣＲによる脾ＣＤ４^＋Ｔ細胞のＴＨ２サイトカインプロフィールを示す。Ｄｅｒ ｐ ２の低用量および高用量でプライミングしたマウス、および対照マウスを、６４日目にエアロゾル化Ｄｅｒ ｐ ２曝露に供し、屠殺した。脾細胞をＤｅｒ ｐ ２と共に１０日間培養した。Ｄｅｒ ｐ ２培養脾細胞の精製ＣＤ４^＋Ｔ細胞を抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で２４時間刺激し、全ＲＮＡをサイトカイン発現の分析のために単離した。比較のために、年齢を適合させたナイーブマウス（Ｎ）からの精製ＣＤ４^＋Ｔ細胞が含められた。２回の実験の代表的データが示されている。^＊：サイトカイン比率は、実験群（標本）のサイトカイン／ＨＰＲＴの値をナイーブ群（較正群）で除することによって測定された。
【０１２５】
（実施例）
以下の例示的な実施例において使用されたマウスは、シンガポール国立大学のアニマル・ホールディング・ユニットより購入した３〜４週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスであり、前記施設で飼育された。動物保護に関するＩＡＣＵＣは、本試験に使用したすべての動物プロトコールを承認した。以下の実施例において使用された野生型および組換えＬ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａ系統またはＬ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ ＧＧの株は、５０％グリセロールを含むアリコートとして保持され、−７０℃で保存された。
【０１２６】
統計比較は、スチューデントｔ検定を使用した平均値の分析によって実施された。すべての値は、平均±標準偏差（ＳＤ）として示されている。ｐ＜０．０５の値が有意とみなされた。
【実施例１】
【０１２７】
増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）を発現する組換えＬ．ｃａｓｅｉの構築
ｅＧＦＰ遺伝子を、Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社）および合成プライマーＢａｍＨＩ−ｅＧＦＰ／ｆ［５’−ＣＣＣ ＣＣＧ ＧＡＴ ＣＣＡ ｇｔｇ ａｇｃ ａａｇ ｇｇｃ ｇａｇ ｇａｇ ｃｔｇ−３’、配列番号３］およびｅＧＦＰ−ｘｈｏＳａｃ／ｒ［５’−ＣＣＣ ＣＣＣ ｃｔｃ ｇａｇ ＣＴＴ ＧＴＡ ＣＡＧ ＣＴＣ ＧＴＣ ＣＡＴ ＧＣＣ ＧＡＧ−３’、配列番号４］を使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。５’末端にＢａｍＨＩ部位および３’末端にＸｈｏＩ／ＳａｃＩ部位を含む、生じたＰＣＲキットを、その後、ｐＴＵＡＴのＢａｍＨＩおよびＳａｃＩ部位にサブクローニングした（図１参照）。ｅＧＦＰ−ｕｉｄＡ−Ｔｂｃｈを含むＢａｍＨＩ／ＮｈｅＩフラグメントを、ｐＬＰ５００の発現−分泌ベクターのＢａｍＨＩ／ＮｈｅＩフラグメントと交換した（図１参照）。
【０１２８】
次に、ｕｉｄＡ遺伝子をＸｈｏＩでの消化によって除去し、発現構築物ｐＬＰ５００−ｅＧＦＰを作製した。
【実施例２】
【０１２９】
乳酸桿菌／大腸菌シャトルベクターへのＤｅｒ ｐ ２遺伝子およびＢｌｏ ｔ ５遺伝子のクローニング
Ｄｅｒ ｐ ２ ｃＤＮＡの４４１ｂｐフラグメントを、Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社）および合成プライマー、Ｄｐ２Ｂａｍ／ｆ［５’−ＣＣＣＣＣＧＧＡＴＣＣＡＧＡＴＣＡＡＧＴＣＧＡＴＧＴＣＡＡＡＧＡＴＴＧＴＧＣ−３’、配列番号５］およびＤｐ２ｘｈｏＳａｃ／ｒ［５’−ＣＣＣＣＣＣＧＡＧＣＴＣＣＴＣＧＡＧＡＴＣＧＣＧＧＡＴＴＴＴＡＧＣＡＴＧＡＧＴＡＧＣ−３’、配列番号６］を使用してＰＣＲによって増幅した。５’末端および３’末端にそれぞれＢａｍＨＩ部位およびＸｈｏＩ／ＳａｃＩ部位を含む、生じたＤｅｒ ｐ ２遺伝子のＰＣＲキットは、配列：５’−ＧＧＡＴＣＣ Ａ ＧＡＴ ＣＡＡ ＧＴＣ ＧＡＴ ＧＴＣ ＡＡＡ ＧＡＴ ＴＧＴ ＧＣＣ ＡＡＴ ＣＡＴ ＧＡＡ ＡＴＣ ＡＡＡ ＡＡＡ ＧＴＴ ＴＴＧ ＧＴＡ ＣＣＡ ＧＧＡ ＴＧＣ ＣＡＴ ＧＧＴ ＴＣＡ ＧＡＡ ＣＣＡ ＴＧＴ ＡＴＣ ＡＴＴ ＣＡＴ ＣＧＴ ＧＧＴ ＡＡＡ ＣＣＡ ＴＴＣ ＣＡＡ ＴＴＧ ＧＡＡ ＧＣＣ ＧＴＴ ＴＴＣ ＧＡＡ ＧＣＣ ＡＡＣ ＣＡＡ ＡＡＣ ＡＣＡ ＡＡＡ ＡＣＣ ＧＣＴ ＡＡＡ ＡＴＴ ＧＡＡ ＡＴＣ ＡＡＡ ＧＣＣ ＴＣＡ ＡＴＣ ＧＡＴ ＧＧＴ ＴＴＡ ＧＡＡ ＧＴＴ ＧＡＴ ＧＴＴ ＣＣＣ ＣＧＴ ＡＴＣ ＧＡＴ ＣＣＡ ＡＡＴ ＧＣＡ ＴＧＣ ＣＡＴ ＴＡＣ ＡＴＧ ＡＡＡ ＴＧＣ ＣＣＡ ＴＴＧ ＧＴＴ ＡＡＡ ＧＧＡ ＣＡＡ ＣＡＡ ＴＡＴ ＧＡＴ ＡＴＴ ＡＡＡ ＴＡＴ ＡＣＡ ＴＧＧ ＡＡＴ ＧＴＴ ＣＣＧ ＡＡＡ ＡＴＴ ＧＣＡ ＣＣＡ ＡＡＡ ＴＣＴ ＧＡＡ ＡＡＴ ＧＴＴ ＧＴＣ ＧＴＣ ＡＣＴ ＧＴＴ ＡＡＡ ＧＴＴ ＡＴＧ ＧＧＴ ＧＡＴ ＧＡＴ ＧＧＴ ＧＴＴ ＴＴＧ ＧＣＣ ＴＧＴ ＧＣＴ ＡＴＴ ＧＣＴ ＡＣＴ ＣＡＴ ＧＣＴ ＡＡＡ ＡＴＣ ＣＧＣ ＧＡＴ ＣＴＣ ＧＡＧ（配列番号１）を有していた。ＰＣＲキットを、中間体ｐＴＵＡＴベクターのＢａｍＨＩおよびＳａｃＩ部位にサブクローニングした（図１Ｂ）。その後、Ｄｅｒ ｐ ２−ｕｉｄＡ−アンカー−Ｔｂｃｈを含むＢａｍＨＩ／ＮｈｅＩフラグメントを、乳酸桿菌／大腸菌シャトルベクターｐＬＰ５００のＢａｍＨＩ／ＮｈｅＩフラグメントと交換した（図１Ａ）。次に、ｕｉｄＡ遺伝子をＸｈｏＩでの消化によって除去し、再連結して、ｐＬＰ５００／Ｄｐ２−アンカー発現構築物を作製し、その後ヌクレオチド配列決定によって確認した。
【０１３０】
当技術分野で公知の適切な材料によって同じ遺伝子操作技術を使用した対応するアプローチを、乳酸桿菌／大腸菌シャトルベクターｐＬＰ４００を用いてＢｌｏ ｔ ５に関して実施した。１７個のＮ末端アミノ酸を欠くＢｌｏ ｔ ５タンパク質をコードするベクターｐＬＰ４００内の、Ｂｌｏ ｔ ５遺伝子のそれぞれの配列は、５’−ＧＧＡＴＣＣ Ａ ＣＡＡ ＧＡＧ ＣＡＣ ＡＡＧ ＣＣＡ ＡＡＧ ＡＡＧ ＧＡＴ ＧＡＴ ＴＴＣ ＣＧＡ ＡＡＣ ＧＡＡ ＴＴＣ ＧＡＴ ＣＡＣ ＴＴＧ ＴＴＧ ＡＴＣ ＧＡＡ ＣＡＧ ＧＣＡ ＡＡＣ ＣＡＴ ＧＣＴ ＡＴＣ ＧＡＡ ＡＡＧ ＧＧＡ ＧＡＡ ＣＡＴ ＣＡＡ ＴＴＧ ＣＴＴ ＴＡＣ ＴＴＧ ＣＡＡ ＣＡＣ ＣＡＡ ＣＴＣ ＧＡＣ ＧＡＡ ＴＴＧ ＡＡＴ ＧＡＡ ＡＡＣ ＡＡＧ ＡＧＣ ＡＡＧ ＧＡＡ ＴＴＧ ＣＡＡ ＧＡＧ ＡＡＡ ＡＴＣ ＡＴＴ ＣＧＡ ＧＡＡ ＣＴＴ ＧＡＴ ＧＴＴ ＧＴＴ ＴＧＣ ＧＣＣ ＡＴＧ ＡＴＣ ＧＡＡ ＧＧＡ ＧＣＣ ＣＡＡ ＧＧＡ ＧＣＴ ＴＴＧ ＧＡＡ ＣＧＴ ＧＡＡ ＴＴＧ ＡＡＧ ＣＧＡ ＡＣＴ ＧＡＴ ＣＴＴ ＡＡＣ ＡＴＴ ＴＴＧ ＧＡＡ ＣＧＡ ＴＴＣ ＡＡＣ ＴＡＣ ＧＡＡ ＧＡＧ ＧＣＴ ＣＡＡ ＡＣＴ ＣＴＣ ＡＧＣ ＡＡＧ ＡＴＣ ＴＴＧ ＣＴＴ ＡＡＧ ＧＡＴ ＴＴＧ ＡＡＧ ＧＡＡ ＡＣＣ ＧＡＡ ＣＡＡ ＡＡＡ ＧＴＧ ＡＡＧ ＧＡＴ ＡＴＴ ＣＡＡ ＡＣＣ ＣＡＡ ＣＴＣ ＧＡＧ（配列番号２）であった。ＰＣＲフラグメントを、中間体ｐＴＵＡＴベクターのＢａｍＨＩおよびＳａｃＩ部位にサブクローニングした（図１Ｂ）。その後、Ｂｌｏ ｔ ５−ｕｉｄＡ−Ｔｂｃｈを含むＢａｍＨＩ／ＮｈｅＩフラグメントを、乳酸桿菌／大腸菌シャトルベクターｐＬＰ４００のＢａｍＨＩ／ＮｈｅＩフラグメントと交換した（図２）。次に、ｕｉｄＡ遺伝子をＸｈｏＩでの消化によって除去し、再連結して、ｐＬＰ４００／Ｂｔ５−アンカー発現構築物を作製し、その後ヌクレオチド配列決定によって確認した。
【０１３１】
すべてのプラスミドＤＮＡおよび構築物を大腸菌宿主細胞において保持し、増殖させた。
【実施例３】
【０１３２】
Ｌ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａ−ｅＧＦＰの共焦点分析
ｐＬ５００−ｅＧＦＰ構築物を含むＬ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａ細胞（Ｌ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａ−ｅＧＦＰ）およびｐＬ５００ベクターを、３７℃の５．０％ＣＯ_２インキュベーターにおいて、５μｇ／ｍｌエリスロマイシンを含むＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｄｅｔｒｏｉｔ）でそれぞれ培養した。培養物が０．６および１．８のＯＤ_{６９０ｎｍ}に達したとき、合計０．５ｍｌを採集し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２回洗浄した。細胞をＰＢＳ１ｍｌに再懸濁し、共焦点顕微鏡下で分析した。ｐＬ５００ベクターを含むＬ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａを陰性対照として使用した。
【実施例４】
【０１３３】
マウスパイアー斑におけるＬ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａ−ｅＧＦＰのトランスロケーション
マウスにおけるＬ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａ−ｅＧＦＰのパイアー斑へのインビボでのトランスロケーションを調べるため、６週齢のＢａｌｂｃ／Ｊマウスに、各マウスにつき１×１０^９コロニー形成単位（ｃｆｕ）のＬ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａ−ＧＦＰまたはＬ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａ−ｐＬＰ５００を連続４日間経口投与した。５日目にマウスを屠殺し、免疫組織化学および透過型電子顕微鏡検査用のクリオスタット組織切片のために個々のマウスのパイアー斑組織を得た。
【０１３４】
パイアー斑をＯＣＴに包埋し、液体窒素中で急速凍結した。厚さ２μｍのクリオスタット組織切片をシラン化処理スライドガラス上に置き、４℃で１０分間、１００％アセトン（＋０．０２％Ｈ_２Ｏ_２）中で固定した。切片を空気乾燥し、その後ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）中で３回洗浄した。固定した切片を、次に、室温で５分間、Ｕｌｔｒａ Ｖ Ｂｌｏｃｋ（Ｌａｂ Ｖｉｓｉｏｎ社、米国、カリフォルニア州 フレモント）中でブロックした。ブロッキング溶液を除去し、１％ＢＳＡを含むＰＢＳＴ中で１：１００希釈したそれぞれの抗体または抗体の組合せ［ＡＰＣ結合抗マウスＴＨＹ−１．２、フィコエリトリン（ＰＥ）結合抗マウスＣＤ１９（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）］を添加して、湿室において４℃で一晩インキュベートした。翌日、切片をＰＢＳＴ中で３回洗浄した（各々５〜１０分間）。スライドガラスをＦｌｕｏｒＳａｖｅ（登録商標）試薬（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）に封入し、共焦点顕微鏡下で観察した。
【実施例５】
【０１３５】
透過型電子顕微鏡検査（ＴＥＭ）
ｅＧＦＰタンパク質ではなく、無傷Ｌ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａのトランスロケーションを示すため、経口投与したマウスからのパイアー斑組織のＴＥＭを実施した。簡単に述べると、Ｌ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａ−ｅＧＦＰを給餌（４日間にわたって４回）したマウスからのパイアー斑の組織切片を、４℃で一晩、２．５％グルタルアルデヒド中で固定した。これらの試料を室温にてカコジル酸緩衝液中の１％四酸化オスミウムで後固定し、漸増濃度のエタノール中で段階的に脱水し、その後１００％プロピレンオキシド中で最終的に脱水した。試料を、プロピレンオキシド：エポキシ樹脂が１：１の混合物中でインキュベートし、最後にエポキシ樹脂に包埋した。超薄切片を銅グリッドに固定化し、酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色して、透過型電子顕微鏡で観察した。
【実施例６】
【０１３６】
電気穿孔およびＬ．ｃａｓｅｉ ＳｈｉｒｏｔａにおけるＤｅｒ ｐ ２の異種発現
最初に、Ｌ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａを、３７℃の５．０％ＣＯ_２インキュベーターにおいて、ＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、デトロイト）で培養した。Ｌ．ｃａｓｅｉのコンピテント細胞を対数増殖中期（ＯＤ_{６９０ｎｍ}＝０．６）の細胞から調製し、あらかじめ冷却しておいた洗浄緩衝液（５０ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４−Ｋ_２ＨＰＯ_４ （ｐＨ７．４）；０．３Ｍスクロース、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２）中で洗浄して、冷却電気穿孔緩衝液（９５２ｍＭスクロース、３．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２）に再懸濁した。プラスミドＤＮＡ ｐＬＰ５００またはｐＬＰ５００／Ｄｐ２−アンカー（１μｇ）を細胞懸濁液１００μｌに添加し、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩ、ＢｉｏＲａｄ社を使用した電気穿孔のため、０．２ｃｍキュベットに移した（条件：電位２．５ｋＶ、容量２５μＦ、抵抗２００Ω）。パルス後、ＭＲＳ培地９００μｌを添加し、細胞を３時間インキュベートした後、エリスロマイシン（５μｇ／ｍｌ）を含むＭＲＳ寒天に塗布した。
【０１３７】
形質転換したＬ．ｃａｓｅｉ ＳｈｉｒｏｔａからのプラスミドＤＮＡの抽出および構成的プロモーター下でのＬ−（＋）−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のＬ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａにおける異種発現を、Ｍａａｓｓｅｎら（Ｖａｃｃｉｎｅ．（１９９９）１７，１７，２１１７−２１２８）によって以前に述べられたように実施した。合計５ｍｌの形質転換細菌培養物を採集し、ペレットをＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で１回洗浄した。細菌ペレットを、氷上にて１時間、リゾチーム（Ｓｉｇｍａ社）を含むＰＢＳ緩衝液中で消化し、その後、Ｗｉｚａｒｄ ＤＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用してＤＮＡプラスミド抽出を実施した。
【０１３８】
異種発現試験のため、Ｌｃ／Ｄｐ２またはＬｃ／Ｖの一晩培養物を用い、５０ｍｌファルコン試験管中の５μｇ／ｍｌエリスロマイシンおよび１％グルコース（ｗ／ｖ）を含むＭＲＳブロス（１：７００希釈）に接種した。培養物を一晩増殖させ、ＯＤ_{６９０ｎｍ}が１．０を超える状態で細胞を採集し、ＰＢＳ中で１回洗浄した。細胞を溶解緩衝液（１％Ｔｗｅｅｎ２０および１ｍＭ ＰＭＳＦを含むＰＢＳ）に再懸濁し、超音波処理して（１０振幅ミクロン、３０秒オン／３０秒オフ、２分間）、可溶性分画を、Ｄｅｒ ｐ ２モノクローナル抗体を使用するウエスタン免疫ブロットアッセイでの検出のためにＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。
【実施例７】
【０１３９】
野生型Ｌ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａと脾臓および腸間膜リンパ節からのマウスＴ細胞の共培養
野生型Ｌ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａと共培養した後のマウスＴ細胞に関してサイトカインプロフィールを測定した。約１×１０^３（腸間膜または脾臓からの選別されたＣＤ３^＋細胞）または３×１０^３（全脾臓）を共培養のために各々のウェルに添加した。Ｌ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａの新鮮培養物を、ＯＤ_{６９０ｎｍ}が０．６に達するまで、０．５％ＣＯ_２インキュベーター中３７℃にてＭＲＳブロス（Ｄｉｆｃｏ社）で増殖させた。培養物のアリコートをＰＢＳ中で２回、ＲＰＭＩ １６４０中で１回洗浄し、最後にＴ細胞培養培地に再懸濁した。９６ウェル培養プレートの２つずつのウェル２組において（最終容量２００μｌ／ウェルで）、１：０，１：０．５，１：１，１：２，１：５のＴ細胞：Ｌ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａ比で、共培養を実施した。共培養の１６時間後および２４時間後に培養上清を採集し、ＥＬＩＳＡを使用してＴＧＦ−βサイトカインレベルに関して検査した。
【実施例８】
【０１４０】
給餌のためのＬｃ／ＶおよびＬｃ／Ｄｐ２の調製
給餌実験全体のために必要な熱死滅Ｌｃ／ＶおよびＬｃ／Ｄｐ２のストックを調製した。Ｌｃ／ＶまたはＬｃ／Ｄｐ２の新鮮培養物を、３７℃の０．５％ＣＯ_２インキュベーターにおいてＭＲＳブロス（Ｄｉｆｃｏ社）で増殖させ、５×１０^８ｃｆｕ／ｍｌ培養物に等しい６９０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）１．０に基づき、分光光度計で定量した。必要量のＬｃ／ＶまたはＬｃ／Ｄｐ２培養物を３，５００ｒｐｍで１０〜１５分間遠心分離し、細胞ペレットをＰＢＳ（ｐＨ７．０）中で２回洗浄し、次いで０．２Ｍ ＮａＨＣＯ_３（ｐＨ８．４）中で最終洗浄した。その後細胞を０．２Ｍ ＮａＨＣＯ_３（ｐＨ８．４）緩衝液に１０９ｃｆｕ／１００μｌの最終濃度まで再懸濁し、マイクロ反応管（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社）につき４００μｌのアリコートに分けた。次に細菌をＴｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社）において９５℃で３０分間熱死滅させ、その後さらなる使用時まで−７０℃で凍結保存した。細胞の生存能力を、ＭＲＳプレートで培養することによって試験した。
【実施例９】
【０１４１】
Ｄｅｒ ｐ ２特異的免疫グロブリン応答の検出
Ｄｅｒ ｐ ２特異的ＩｇＥおよびＩｇＧ１のレベルをＥＬＩＳＡによって測定した。簡単に述べると、二組のマウス血清を、Ｄｅｒ ｐ ２（２μｇ／ｍｌ）で被覆したウェルと共に４℃で一晩インキュベートした。検出のためにビオチン結合モノクローナルラット抗マウスＩｇＥ（Ｒ１９−１５）および抗マウスＩｇＧ１（Ｇ１−１．５）を使用し、その後ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−アルカリホスファターゼを添加した。ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ）基質の添加によってシグナルを発現させた。ＥＬＩＳＡ指数単位は、同じプレートで抗マウスＩｇκを捕獲抗体として使用したサンドイッチＥＬＩＳＡ法における１ｎｇ／ｍｌの精製マウスＩｇＥまたはＩｇＧ１の測定値に相当するＯＤ_{４０５ｎｍ}測定値とした。使用したすべての抗体はＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、カリフォルニア州 サンディエゴ）より購入した。
【実施例１０】
【０１４２】
Ｔ細胞サイトカインプロファイリングおよび増殖アッセイ
Ｔ細胞培養を、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、ユタ州 ローガン）および５．５×１０^−２ｍＭ ２−メルカプトエタノール（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、ニューヨーク州 グランドアイランド）を添加したＲＰＭＩ １６４０培地で実施した。
【０１４３】
簡単に述べると、脾臓から単細胞懸濁液を調製し、赤血球溶解を実施した。脾細胞（３０×１０^６細胞／ウェル）を、１０μｇ／ｍｌのＤｅｒ ｐ ２の存在下において、添加ＲＰＭＩ １６４０ １０ｍｌを含む６ウェルプレートで３日間培養した。３日目に、各ウェルからの培地５ｍｌを、ＩＬ−２（１０Ｕ／ｍｌ）を含む新鮮培地と交換し、合計９日間の培養中２日ごとに培地を交換して、細胞をそのまま保持した。９日目に、Ｄｅｒ ｐ ２特異的Ｔ細胞をフィコールによって精製し、細胞を９６ウェル丸底プレート（Ｃｏｓｔａｒ社、ニューヨーク州 コーニング）において２回再活性化し、各々のウェルは、最終容量２００μｌ／ウェル中に１×１０^５精製Ｔ細胞、３×１０^５マイトマイシン処理ＡＰＣおよび１０μｇ／ｍｌ Ｄｅｒ ｐ ２を含んだ。培養の４８時間後、上清を収集し、−２０℃で保存した。腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）細胞を、５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３（クローン：１４５ ２Ｃ１１）および抗ＣＤ２８（クローン：３７ＡＥ５１）（どちらのクローンもＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、英国、オックスフォードより）で被覆したウェルにおいて培養した。７２時間後、上清を収集し、−２０℃で保存した。ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−１０サイトカインの存在に関して検定するため、抗体対（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）を使用してＥＬＩＳＡによってサイトカインプロファイリングを２回実施した。マウスＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＴＮＦ−αおよびＴＧＦ−β抗体に対する精製抗体を２μｇ／ｍｌで９６ウェルプレートに被覆した。それぞれのマウスＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＴＮＦ−αおよびＴＧＦ−β抗体に対するビオチニル化ポリクローナル抗体を供給者によって推奨されるように使用した。組換えマウスサイトカインをＥＬＩＳＡアッセイにおける標準品として使用した。すべての抗体および組換えサイトカインは、特に記述されない限り、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社（カリフォルニア州、サンディエゴ）からであった。
【０１４４】
Ｔ細胞増殖アッセイを、５μｇ／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌのｒＤｅｒ ｐ ２の存在下または不在下でＡＰＣ（３×１０^５細胞／ウェル）と７２時間共培養したパイアー斑細胞（１×１０^５細胞／ウェル）を使用して実施した。採集の約１８時間前に、細胞を［３Ｈ］チミジン（ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ社、マサチューセッツ州 ボストン）１μＣｉでパルスした。細胞をガラス繊維フィルター（Ｓｋａｔｒｏｎ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＡＳ社、ノルウェー国、Ｌｉｅｒ）に採集した。シンチレーション液（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）の添加後、液体シンチレーション計数器（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社、カリフォルニア州 フラトン）によって増殖を測定した。増殖指数は、ｒＤｅｒ ｐ ２の存在下での細胞によるチミジンの取り込みと不在下での取り込みの比として表わされている。
【実施例１１】
【０１４５】
ＢＡＬＦ分析と肺組織学
マウスに、１．２５ｍｇ／ｍｌミダゾラム、２．５ｍｇ／ｍｌフルアニゾンおよび０．０７９ｍｇ／ｍｌクエン酸フェンタニルを含む混合物の致死量を腹腔内注射した。気管を露出させ、気管切開術によってカニューレ挿入して（２０Ｇカニューレ）、肺を氷冷ハンクス平衡塩類溶液（カルシウムおよびマグネシウムを含まないＨＢＳＳ）０．８ｍｌで３回洗浄し、洗浄液をプールした。ＢＡＬＦの分画細胞数算定のために総細胞数算定および２回のサイトスピンを実施した。簡単に述べると、ＢＡＬ試料の容量を測定し、試料を遠心分離して（室温にて７００ｇで５分間）、１００μｌ（ＰＢＳ／１０％ＦＣＳ）中１×１０^５細胞で再懸濁し、ポリ（ｌ−リシン）被覆スライドガラス（Ｃｙｔｏｓｐｉｎ ５ Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｈａｎｄｏｎ社、ペンシルバニア州 ピッツバーグ）への集細胞遠心（ｃｙｔｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）（３００ｇで３分間）によってサイトスピンを作製した。スライドガラスを空気乾燥し、メタノールで固定して、標準手順（Ｍｅｒｃｋ社、英国）を用いて染色した。分画細胞数算定を、各々の試料からの５００細胞に対して被覆スライドガラス上で２回実施した。ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−βおよびエオタキシンのレベルをＥＬＩＳＡによって測定した。
【０１４６】
肺を切除し、ＰＢＳで洗浄して、１０％ホルマリンで固定した。肺をパラフィンに包埋し、切片（厚さ２μｍ）を、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）を使用して全般的形態および細胞浸潤に関して評価した。
【実施例１２】
【０１４７】
喘息マウスモデルにおける予防レジメン
本実施例は、予防レジメンにおける、Ｄｅｒ ｐ ２を発現する経口投与される熱死滅組換えＬ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａ（Ｌｃ／Ｄｐ２）の、Ｄｅｒ ｐ ２の皮下ブースティングと組み合わされた使用方法を説明する（図１０参照）。本実施例は、Ｄｅｒ ｐ ２の皮膚パッチ適用およびエアロゾル抗原刺激による感作を通して作製された、Ｄｅｒ ｐ ２誘発性実験的喘息マウスモデルを使用するプライム−ブースト戦略に基づく。本実施例はまた、プライム−ブースト戦略における、Ｄｅｒ ｐ ２の皮下ブースティングと組み合わせたＤｅｒ ｐ ２を発現する経口投与熱死滅組換えＬ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａの効果が、Ｄｅｒ ｐ ２誘発性喘息モデルへの予防レジメンを使用してどのように評価することができるかを説明する（図１０参照）。対照群は、ＮａＨＣＯ_３緩衝液または熱死滅Ｌｃ／Ｖのいずれかを給餌されたマウスから成る。本実施例では、乳酸桿菌調製の容易さのために、および生存遺伝子操作生物（ＧＭＯ）の使用に関する安全性必要条件を満たすために、生組換え乳酸桿菌ではなく熱死滅乳酸桿菌が使用された。しかしながら、乳酸桿菌はいかなる所望の活性であってもよいことに留意されるべきである（上記も参照のこと）。
【０１４８】
経口給餌は、加圧滅菌した強制飼養ニードル（Ｐｏｐｐｅｒ ＆ ｓｏｎｓ社、ニューヨーク州）を使用して実施した。実施例８で述べられた凍結熱死滅Ｌｃ／ＶまたはＬｃ／Ｄｐ２のアリコートを室温に解凍し、各々のマウスは、試験期間全体にわたって１週間につき連続３日間、１日につき１０９の熱死滅Ｌｃ／ＶまたはＬｃ／Ｄｐ２を含む１００μｌの１回用量またはＮａＨＣＯ_３緩衝液１００μｌを摂取した。１１日目と１８日目に、すべてのマウスをＤｅｒ ｐ ２（５０μｇ／マウス）で皮下的に免疫した。次にすべてのマウスを経上皮パッチ適用によって３回（２２，３６および５０日目）感作した。簡単に述べると、各マウスの包皮を、Ｄｅｒ ｐ ２アレルゲン５０μｇを含むガーゼの小さなパッチで経上皮的に連続３日間曝露した。３回目の感作の１ヵ月後に、マウスをＤｅｒ ｐ ２（１ｍｇ／１０ｍｌ ＰＢＳ）のエアロゾルによって２回抗原刺激した。抗原刺激の約２４時間後、分画細胞数算定およびサイトカイン分析のために気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）を採取し、組織学的分析のために肺を採取した。細胞培養のために脾臓および腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）を得た。０日目および週に１回採取した血液試料を２０００ｇで遠心分離し、血清を収集して、抗体レベルの測定のために−２０℃で保存した。
【０１４９】
Ｌｃ／Ｄｐ２給餌マウスにおけるＤｅｒ ｐ ２特異的血清ＩｇＥレベルの動態は、ＮａＨＣＯ_３およびＬｃ／Ｖ給餌マウスよりも低く、Ｌｃ／Ｄｐ２単独の給餌が気道抗原刺激後でさえもＩｇＥ産生を抑制し得ることを示している（図１１）。３つの群全てに関してＤｅｒ ｐ ２特異的血清ＩｇＧ１レベルには有意差がなかった。動物試験の場合、Ｌｃ／Ｄｐ２給餌動物、たとえばマウスにおけるＴリンパ球によるＴｈ２サイトカイン産生の同時下方調節もみられた。この目的のために、Ｄｅｒ ｐ ２または抗ＣＤ３／ＣＤ２８の存在下でのそれぞれの培養のために、脾臓および腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）細胞を得た。図１２に示すように、皮下免疫したＬｃ／Ｄｐ２給餌マウスからの脾Ｔ細胞は、対照群と比較すると、より低いレベルのＴｈ２（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３）およびプロ炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α）を産生し、ＴＧＦ−βの同時上昇およびＤｅｒ ｐ ２特異的Ｔ細胞増殖の低下を伴った。ＭＬＮ細胞の分析は、Ｌｃ／ｖおよびＬｃ／Ｄｐ２給餌マウスの両方で、ＮａＨＣＯ_３対照群と比較して、ＩＬ−１３の有意に低いレベル、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１０の有意でない低下（Ａｃ対照マウスと同様のレベル）およびＴＧＦ−βのレベル上昇が生じたことを示す（図１３参照）。
【０１５０】
Ｌｃ／Ｄｐ２の給餌は、Ｔｈ２およびＤｅｒ ｐ ２特異的Ｔｒ細胞の混合物に対してプライミングし、その後さらに２回の高用量皮下免疫によって増強されたという仮説が立てられる。これらのＤｅｒ ｐ ２特異的Ｔｒ細胞は、ＴＧＦ−β１などの調節性サイトカインを通して既存のＴｈ２細胞に阻害または寛容原性作用を及ぼし得る。本発明者らは、気道抗原刺激後に得られたＬｃ／Ｄｐ２給餌マウスの血清中のＴｈ２型循環ＩＬ−１０サイトカインレベルが対照群と比較して有意に低いことを確認した。Ｌｃ／Ｄｐ２給餌マウスからのＢＡＬＦのサイトカインプロフィールは、ＩＬ−１３、ＩＬ−５、ＴＮＦ−α、エオタキシン（好酸球についてのケモカイン）の低下およびＴＧＦ−β１の有意の低下を示した（図１４）。同時に、これらのマウスはまた、ＢＡＬＦ細胞数の減少を示し（図１５Ａ）、そのレベルはＡｃ群と同様であった。加えて、Ｌｃ／Ｄｐ２給餌マウスだけが好中球数の有意な減少を示した（図１５Ｂ参照）。Ｌｃ／Ｄｐ２給餌マウスからのＢＡＬＦにおけるリンパ球数の有意でない増加を除き、好酸球数は少なく、すべての群について同様であった。
【０１５１】
ＮａＨＣＯ_３またはＬｃ／Ｖ群からのマウスの肺組織は、種々の程度（軽度から重度）の気道病変および気管支肺胞腔を取り囲む炎症性浸潤物を示した（図１５Ｃ）。それに対し、Ｌｃ／Ｄｐ２給餌マウスからの肺切片は、肺炎症の実質的な低下を示し、Ａｃマウスと同様のプロフィールを有していた（図１５Ｃ参照）。
【０１５２】
Ｄｅｒ ｐ ２タンパク質による２回の皮下ブースティングと組み合わせたＬｃ／Ｄｐ２の経口投与によってプライミングしたマウスは、アレルギー応答の全体的下方調節を示し、それゆえ有効な予防レジメンである。このプライム−ブーストレジメンは、気道ならびにＢおよびＴ細胞レベルにおいて、寛容示し、かつ／またはＴｈ２調節因子を下方調節する抗原特異的Ｔｒ細胞のサブセットを誘導することができ、それにより、このマウスモデルにおいてアレルギー性喘息および気道リモデリングの病因を効率的にブロックし得る。ＣＤ２５^＋ＣＤ４^＋、Ｔｒ１およびＴｈ３などのマウスＴｒ細胞が、喘息およびアレルギーの下方調節において極めて重要な役割を果たすことが報告されている。Ｔｒ細胞および関与する調節性サイトカインの誘導の機構および役割をさらに説明する。
【実施例１３】
【０１５３】
喘息マウスモデルにおける治療レジメン
本実施例は、Ｄｅｒ ｐ ２誘発性喘息マウスモデルへのＤｅｒ ｐ ２タンパク質の皮下免疫による免疫療法と組み合わせた、治療レジメンにおける経口投与熱死滅組換えＬｃ／Ｄｐ２または野生型Ｌｃ／Ｖの効果を示す（図１６）。示されているデータに用いられた対照群は、ＮａＨＣＯ_３緩衝液を給餌したマウスから成る。このレジメンでは、マウスを経上皮パッチ適用によって前感作し、その後連続５週間にわたって熱死滅Ｌｃ／ＶまたはＬｃ／Ｄｐ２を給餌した。すべてのマウスが、給餌の最後の２週間に２回の皮下免疫付与を受けており、したがって免疫療法で採用される皮下免疫を模倣している。
【０１５４】
簡単に述べると、実施例１２で述べられたように、Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＤｅｒ ｐ ２（５０μｇ／マウス）の経上皮パッチ適用によって前感作した（０、１４および２８日目）。３３日目に、Ｄｅｒ ｐ ２特異的血清ＩｇＥおよびＩｇＧ１のプロフィールをＥＬＩＳＡによって測定し、ＩｇＥレベルに基づき、マウスをその後各々６匹ずつの３つの群に分けた。マウスに、ＮａＨＣＯ_３緩衝液、熱死滅Ｌ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａ／ｐＬＰ５００（Ｌｃ／Ｖ、野生型対照）またはＬ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａ／Ｄｅｒｐ２（Ｌｃ／Ｄｐ２）のいずれかを経口的に給餌した。経口給餌は、加圧滅菌した強制飼養ニードル（Ｐｏｐｐｅｒ ＆ ｓｏｎｓ社、ニューヨーク州）を使用して実施した。上述した凍結熱死滅Ｌｃ／ＶまたはＬｃ／Ｄｐ２のアリコートを室温に解凍し、各々のマウスは、３５日目から開始して１週間につき連続３日間ずつ５週間にわたって、１日につき１０９の熱死滅Ｌｃ／ＶまたはＬｃ／Ｄｐ２を含む１００μｌの１回用量またはＮａＨＣＯ_３緩衝液１００μｌを摂取した。５５日目と６２日目に、マウスをＤｅｒ ｐ ２（５０μｇ／マウス）の２回の皮下注射で免疫し、その後Ｄｅｒ ｐ ２アレルゲン（１ｍｇ／１０ｍｌ ＰＢＳ）のエアロゾルによって２回抗原刺激した。最後の抗原刺激の約２４時間後、分画細胞数算定およびサイトカイン分析のためにＢＡＬＦを採取し、組織学的試験のために肺を得た。
【０１５５】
図１７が示すように、３つの群すべてのマウスが、給餌の開始から１週間後にＤｅｒ ｐ ２特異的ＩｇＥの低下を示した。ＩｇＥレベルは、６２日目の高用量Ｄｅｒ ｐ ２アレルゲンによる１回目の皮下免疫後に上昇したが、２回の連続的エアロゾル抗原刺激（６９および７７日目）の前後に、Ｌｃ／ＶおよびＬｃ／Ｄｐ２給餌マウスについては対照マウスと比較してＩｇＥレベルが有意に低下した（図１７Ｂ参照）。これに対し、Ｄｅｒ ｐ ２特異的血清ＩｇＧ１は、皮下免疫後、対照マウスと比較すると６２および６９日目にこれら２つの群に関して有意に高く、気道抗原刺激後も不変のままであった（図１７Ｃおよび図１７Ｄ）。
【０１５６】
対照群と比較して、Ｌｃ／ＶおよびＬｃ／Ｄｐ２給餌マウスにおいてＴリンパ球によるＴｈ２サイトカイン産生の下方調節が存在するかどうかを判定するため、それぞれＤｅｒ ｐ ２または抗ＣＤ３／ＣＤ２８の存在下での培養のために脾Ｔ細胞および腸間膜リンパ節細胞を得た。Ｌｃ／Ｄｐ２およびＬｃ／Ｖ給餌マウスの両方からのＤｅｒ ｐ ２特異的脾Ｔ細胞は、ＮａＨＣＯ_３群と比較してＴｈ２サイトカイン（ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＬ−１０）の有意な低下およびＩＬ−４とＴＮＦ−αの有意でない低下を示した（図１８）。興味深いことに、ＴＧＦ−β１産生において、両群で有意でない低下が生じた。脾Ｔ細胞と同様に、Ｌｃ／Ｄｐ２およびＬｃ／Ｖの両群からの腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）細胞は、Ｔｈ２およびプロ炎症性サイトカイン（ＩＬ−５、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−１０およびＴＮＦ−α）産生において有意でない低下を示した（図１９）。これに対し、ＭＬＮ細胞におけるＴＧＦ−β１産生は、ＮａＨＣＯ_３群と比較してＬｃ／Ｄｐ２およびＬｃ／Ｖ群の両方に関して高かった（図１９Ｆ）。
【０１５７】
ＮａＨＣＯ_３群と比較すると、Ｌｃ／ＶおよびＬｃ／Ｄｐ２の両群からのＢＡＬＦのサイトカインプロフィールは、Ｔｈ２とプロ炎症性サイトカイン（ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＬ−４、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β）、および好酸球動員のためのサイトカインであるエオタキシンの両方で有意でない低下を示した。両群は、エアロゾル（Ａｃ）対照群と同様のレベルを有する（図２０参照）。Ｌｃ／ＶおよびＬｃ／Ｄｐ２の両群は、Ａｃ対照群と比較して同様の数の総浸潤細胞を示し、ＮａＨＣＯ_３群で認められたよりも有意でなく低かった（図２１参照）。分画細胞分析は、これらの群の両方について好中球および好酸球の減少を示し、一方、リンパ球およびマクロファージの数は影響を受けなかった。Ｌｃ／Ｄｐ２群だけが、他の群と比較して気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中の単球数のわずかな減少を示している。
【０１５８】
各群の６匹のうち２匹の代表的マウスからの肺組織を示した（図２１参照）。２匹のエアロゾル対照マウスからの肺切片のヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色（ＧおよびＨ）は、細気管支腔内のごくわずかな炎症性浸潤物および肺実質における極微の気道炎症のバックグラウンドを示した。しかし、ＮａＨＣＯ_３群からのマウスの肺組織は、気道および細気管支腔を取り囲む種々の程度（軽度から重度）の気道炎症浸潤細胞を示した（ＡおよびＢ）。比較すると、Ｌｃ／Ｖ（ｃ−ｄ）およびＬｃ／Ｄｐ２（Ｅ−Ｆ）給餌マウスの両方が、炎症性浸潤物のより大きな減少を示し、Ａｃマウスと同様のプロフィールを有していた。
【実施例１４】
【０１５９】
Ｄｅｒ ｐ ２で前感作したマウスへの生Ｌ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａ／Ｄｐ２の経口投与の作用
前記実施例が熱不活性化乳酸桿菌の代わりに生組換え乳酸桿菌を使用して同様に実施され得ることは理解されるが、本実施例は、Ｄｅｒ ｐ ２を発現する生組換えＬ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａの使用方法を説明する。
【０１６０】
Ｄｅｒ ｐ ２特異的ＩｇＥおよびＩｇＧ１力価を測定するために、Ｃ５７／Ｂ６マウスから週に１回採血した。すべてのアッセイはＥＬＩＳＡによって測定された（図３２参照）。マウスに、ＰＢＳ１００μｌ中の組換え酵母由来Ｄｅｒ ｐ ２アレルゲン５０μｇを経上皮的に３日間パッチ適用した。マウスに１日目、１４日目および２８日目に３回パッチ適用した。１４日間の休息後、ＩｇＥ応答マウスだけを治療試験のために等しく２つの群（Ｌｂ対緩衝液）に分けた。
【０１６１】
重炭酸緩衝液５０μｌ中約１０^９細胞の生組換えＤｅｒ ｐ ２（Ｌｃ／Ｄｒｐ２）をＬｂ群の６匹のマウスの各々に給餌した。給餌の前に細胞を重炭酸緩衝液で２回洗浄した。対照マウスには重炭酸ナトリウム緩衝液だけを与えた。給餌は毎日実施し、合計４週間継続した。
【０１６２】
最後の給餌の１０日後に両群を抗原刺激した（エアロゾル）。同じ群からのマウスを１つのチャンバーに入れた。ＰＢＳ１０ｍｌ中の組換え酵母由来Ｄｅｒ ｐ ２ １ｍｇをチャンバー内に噴霧し、３０分間マウスに吸入させた。
【０１６３】
０，１４および２８日目に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＤｅｒ ｐ ２アレルゲン（５０μｇ／マウス）の経上皮パッチ適用によって感作した。４２日目にＤｅｒ ｐ ２特異的ＩｇＥレベルを測定し、応答マウスをそれぞれのＩｇＥ力価に従って２つの群（ｎ＝６）に分けた。経口給餌を１ヶ月間毎日実施し、１つの群にはＮａＨＣＯ_３対照を給餌し、他方の群には組換えＬ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａ／Ｄｐ２の１回用量（１×１０^９ｃｆｕ）／マウスを給餌した。８０日目にマウスを１回エアロゾル抗原刺激した後、８２日目に屠殺し、Ｔ細胞培養のために脾臓を採取した（図２２参照）。
【０１６４】
２つの群のマウスの免疫応答を全身的ＩｇＧ１およびＩｇＥ産生および脾Ｔ細胞のサイトカインプロフィールに基づいて分析した。前感作したマウスは、Ｌ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａ／Ｄｐ２を給餌したとき、Ｄｅｒ ｐ ２特異的血清ＩｇＥおよびＩｇＧ１レベルを効率的に低下させることができる。図２３に示されるように、Ｌ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａ／Ｄｐ２給餌マウスは給餌後の約７日目にＤｅｒ ｐ ２特異的血清ＩｇＥの４１％の減少を示したのに比べ、ＮａＨＣＯ_３対照群はＩｇＥの２７％だけの減少を示した（図２３Ａ参照）。加えて、Ｄｅｒ ｐ ２特異的血清ＩｇＧ１は、ＮａＨＣＯ_３対照群に比べ、Ｌ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａ／Ｄｐ２給餌マウスにおいて有意に減少した（図２３Ｂ参照）。
【０１６５】
しかし、Ｌ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａ／Ｄｐ２給餌群の脾Ｔ細胞プロフィールは、ＴＨ１およびＴＨ２サイトカイン産生に関してＮａＨＣＯ_３対照群と同様であった（図２４参照）。加えて、Ｌ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａ／Ｄｐ２を給餌したマウスは、Ｔ調節性サイトカイン（ＩＬ−１０およびＴＧＦ−β）産生の上昇を示した（図２３Ｃ参照）。この治療モデルでは、これらのマウスにおける気道炎症のプロフィールは検査しなかった。
【実施例１５】
【０１６６】
高用量Ｄｅｒ ｐ ２の皮下プライミングはＤｅｒ ｐ ２で抗原刺激したマウスにおいてＩｇＥおよびＴｒ関連サイトカイン産生の減少を導いた
この実施例は、マウスにおけるアジュバントの適用なしでの抗体産生の調節におけるＤｅｒ ｐ ２アレルゲンの投与効果の測定を説明する。
【０１６７】
８匹の雌性マウス（６〜８週齢）の群に、酵母組換えＤｅｒ ｐ ２タンパク質の低用量（ＬＤ）［１０μｇ／マウス］または高用量（ＨＤ）［５０μｇ／マウス］を皮下注射によって４日の間隔で３回投与した（図１参照）。Ｄｅｒ ｐ ２のＬＤによるブーストを２８日目に免疫マウスに与えた。エアロゾル抗原刺激では、マウスを拘束せずにデシケーター室に保持し、超音波ネブライザ（ＵｌｔｒａＮＥＢ ９９型、ＤｅＶｉｌｂｉｓｓ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ社、ペンシルバニア州 サマセット）によって生成したエアロゾルＤｅｒ ｐ ２の連続流を与えた。ＰＢＳ中のＤｅｒ ｐ ２ ０．１ｍｇ／ｍｌの４回の投与を２日の間隔で３０分間実施した。対照マウスは、エアロゾルＤｅｒ ｐ ２の吸入だけに供した。血清を収集し、Ｄｅｒ ｐ ２特異的抗体に関して分析した（図２８参照）。
【０１６８】
（ａ）Ｄｅｒ ｐ ２特異的抗体に関するＥＬＩＳＡ
Ｄｅｒ ｐ ２特異的ＩｇＧ１、ＩｇＥおよびＩｇＧ２ａ抗体のレベルをＥＬＩＳＡによって測定した。ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ社、米国、ニューヨーク州 コーニング）を、被覆緩衝液（０．１Ｍ ＮａＨＣＯ_３、ｐＨ８．３）中５μｇ／ｍｌの組換えＤｅｒ ｐ ２と共に４℃で一晩インキュベートした。すべての試薬は、特に記述されない限り、５０μｌ／ウェルの用量で使用した。インキュベーション後、プレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄し、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中１％ＢＳＡ）１００μｌで、室温で１時間ブロックした。プレートを連続希釈血清と共に４℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄し、２５０μｇ／ｍｌのビオチニル化モノクローナルラット抗マウスＩｇＧ１（Ｇ１−１．５）、ＩｇＧ２ａ（Ｒ３５−９２）またはＩｇＥ（Ｒ１９−１５）（Ｓｅｒｏｔｅｃ社、英国、オックスフォード）と共に室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、アルカリホスファターゼ結合ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ 社、ミズーリ州 セントルイス）（１：２０００希釈）と共にインキュベートした。プレートを６回洗浄し、Ｓｉｇｍａ Ｆａｓｔ ｐニトロフェニルホスファターゼ基質を用いて展開した。１時間のインキュベーション後、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ Ｇ．ｍ．ｂ．Ｈ社、オーストリア国）を使用して４０５ｎｍで吸収を測定した。同様のプロトコールを、以下の変更を除いて、標準曲線を作成するために使用した。抗マウスＩｇκ軽鎖Ａｂ（１８７．１）（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、カリフォルニア州 サンディエゴ）を２つのウェルに被覆し、マウス組換えＩｇＧ１（１０７．３）、ＩｇＧ２ａ（Ｇ１５５−１７８）またはＩｇＥ（Ｃ３８．２）（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）を、５０ｎｇ／ｍｌから開始して２倍ずつ連続希釈した。抗体力価を標準品と比較した。ＥＬＩＳＡ単位（ＥＵ）は、同じプレートで抗マウスＩｇκを捕獲抗体として使用するサンドイッチＥＬＩＳＡ法における検出抗体１ｎｇ／ｍｌの測定値に相当するＯＤ_{４０５ｎｍ}測定値とした。
【０１６９】
低用量（ＬＤ）Ｄｅｒ ｐ ２アレルゲンによる反復皮下注射は、高いＩｇＥ産生（４．０±０．７ＥＵ）を刺激することが認められ、ＩｇＥ産生はブースティングの１週間後に劇的に上昇（＞４倍）した（図２６Ａ、白い四角）。ＩｇＧ１産生は、６４日目までは一貫して低いままであった（３２８０±５５０ＥＵ）が、６４日目に、おそらくエアロゾル化Ｄｅｒ ｐ ２への曝露を原因として上昇が起こった（図２６Ｂ、白い四角）。ＩｇＧ２ａレベルは低いままであった（１０４±６７ＥＵ、図２６Ｃ、白い四角）。反対に、高用量（ＨＤ）のＤｅｒ ｐ ２アレルゲンで初回抗原刺激したマウスは、低い基線ＩｇＥレベルを有していた（１．３０±０．３３ＥＵ、図２６Ａ、黒い四角）。この群のマウスは一貫してより高いＩｇＧ１産生（８１３０±１０００ＥＵ、図２６Ｂ、黒い四角）を示し、ブースティング後にＩｇＧ１産生が大きく上昇した（４４８００±４２５０ＥＵ）。それらのＩｇＧ２ａレベルも、特にブースティング後または吸入抗原刺激後に（３４０±２６０ＥＵ、図２６Ｃ、黒い四角）、ＬＤでプライミングしたマウスにおけるよりも高かった。
【０１７０】
（ｂ）脾Ｔ細胞培養
処置したマウスを６４日目に頸部脱臼によって屠殺した。脾臓をマウスから切除し、ＲＢＣ溶解緩衝液（０．５３％塩化アンモニウム）を使用することによって赤血球を除去した。細胞を、３７℃の５％ＣＯ_２インキュベーターにおいて、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）［Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、ユタ州 ローガン］、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社）、５．５×１０^−２ｍＭのβ−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、ニューヨーク州 グランドアイランド）、抗生物質（１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地中２×１０^６細胞／ｍｌで、Ｄｅｒ ｐ ２アレルゲン１０μｇ／ｍｌと共に培養した。マウス組換えＩＬ−２（Ｒ ＆ Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社、米国、ミネソタ州 ミネアポリス）は、１０Ｕ／ｍｌで３、５、７日目に添加した。１０日目にフィコール勾配遠心分離（Ｆｉｃｏｌｌ ｐａｇｕｅ ｐｌｕｓ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を使用して生育可能細胞を回収した。
【０１７１】
（ｃ）ＣＤ４^＋Ｔ細胞の濃縮と刺激
ＣＤ４^＋Ｔ細胞を、抗マウスＣＤ４ビオチン結合抗体（ＧＫｌ．５）およびストレプトアビジン結合マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）を使用し、製造者の指示に従ってＡｕｔｏＭａｃｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社、独国、ベルギッヒ グラヂバッハ）によって濃縮した。濃縮プロトコールを実施する前に、ナイーブマウスの脾細胞を５％ＦＣＳ／ＰＢＳおよび抗マウスＦｃγＩＩＩ／ＩＩ受容体（ＣＤ１６／ＣＤ３２）［２．４Ｇ２］でブロックし、抗Ｐａｎ ＮＫビオチン結合Ａｂ（ＤＸ５）、抗ＣＤ１１ｃマイクロビーズおよびストレプトアビジン結合マイクロビーズを使用することにより、ナチュラルキラー細胞および樹状細胞を除去した。細胞純度を、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリーおよびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を使用したフローサイトメトリー分析によって測定した。すべての群について、細胞の少なくとも９５％がＣＤ４^＋Ｔ細胞であった。精製ＣＤ４^＋Ｔ細胞を３×１０^５細胞／２００μｌにて９６ウェルプレートで培養し、抗マウスＣＤ３ε Ａｂ（５μｇ／ｍｌ、１４５−２Ｃ１１）および抗マウスＣＤ２８ Ａｂ（２μｇ／ｍｌ、３７．５１）で２４時間刺激した。
【０１７２】
（ｄ）ｃＤＮＡの作製、増幅およびリアルタイムＰＣＲ
細胞を溶解し、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、カリフォルニア州）を製造者の指示に従って使用して全ＲＮＡを単離した。１５量体のポリｄ（Ｔ）オリゴヌクレオチド１μｇおよびモロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＶＬ）逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ社、米国、マディソン）２０単位を推奨されるように使用して、全ＲＮＡ２μｇからｃＤＮＡを作製した。
【０１７３】
各々のＰＣＲにおいて使用したｃＤＮＡ試料の量を標準化するため、ＨＰＲＴを各試料において基準化した。ｃＤＮＡを、１０×ＰＣＲ緩衝液、サイトカインプライマー１０ｐｍｏｌ、０．５ｍＭ ｄＮＴＰおよびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ２．５単位を含む反応混合物に添加した。最終容量２５μｌの各々の試料をＤＮＡサーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００，ＰＥ ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、米国）において合計３０サイクル、インキュベートした。各サイクルは、９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間および７２℃で１分間から成る。９４℃で５分間のインキュベーションの始動および７２℃で１０分間の最終伸長を各々の反応に含めた。
【０１７４】
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒにおいてＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ技術を使用したリアルタイムＰＣＲを実施し、ｃＤＮＡ試料、陰性対照（水）および一連の希釈標準を増幅した。ナイーブマウス試料を、各サイトカインに関する適合係数ファイルを作成するための標準として使用した。反応は、Ｆａｓｔ ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、スイス国）を製造者の指示に従って使用して実施した。増幅プログラムは次の通りであった。９５℃で１０分間の変性、９５℃で５秒間、５８℃で５秒間および７２℃で１２秒間の４０サイクルの定量、５８℃で１５秒間の融解、４０℃で３０秒間の冷却。サイトカインの相対比率を、Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、独国）によって自動的に実施される非線形回帰適合に基づく効率補正によって算定した。
【０１７５】
以下のオリゴヌクレオチドをＰＣＲ分析のために使用した：
ＨＰＲＴ：センス ５’ＧＴＴＧＧＡＴＡＣＡＧＧＣＣＡＧＡＣＴＴＴＧＴＴＧ ３’（配列番号７）、
アンチセンス ５’ＧＡＧＧＧＴＡＧＧＣＴＧＧＣＣＴＡＴＧＧＧ ３’（配列番号８）、
ＩＦＮ−γ：センス ５’ＣＡＴＴＧＡＡＡＧＣＣＴＡＧＡＡＡＡＧＴＣＴＧ ３’（配列番号９）、
アンチセンス ５’ＣＴＣＡＴＧＡＡＴＧＣＡＴＣＣＴＴＴＴＴＣＧ ３’（配列番号１０）、
ＩＬ−４：センス ５’ＣＡＴＣＧＧＣＡＴＴＴＴＧＡＡＣＧＡＧＧＴＣＡ ３’（配列番号１１）、
アンチセンス ５’ＣＴＴＡＴＣＧＡＴＧＡＡＴＣＣＡＧＧＣＡＴＣＧ ３’（配列番号１２）、
ＩＬ−５：センス ５’ＧＡＡＡＧＡＧＡＣＣＴＴＧＡＣＡＣＡＧＣＴＧ ３’（配列番号１３）、
アンチセンス ５’ＧＡＡＣＴＣＴＴＧＣＡＧＧＴＡＡＴＣＣＡＧＧ ３’（配列番号１４）、
ＩＬ−９：センス ５’ＡＴＧＴＴＧＧＴＧＡＣＡＴＡＣＡＴＣＣＴＴＧＣ ３’（配列番号１５）、
アンチセンス ５’ＣＧＧＣＴＴＴＴＣＴＧＣＣＴＴＴＧＣＡＴＣＴＣ（配列番号１６）、
ＩＬ−１０：センス ５’ＣＣＡＧＴＴＴＴＡＣＣＴＧＧＴＡＧＡＡＧＴＧＡＴＧ ３’（配列番号１７）、
アンチセンス ５’ＴＧＴＣＴＡＧＧＧＴＣＣＴＧＧＡＧＴＣＣＡＧＣＡＧＡＣＴ ３’（配列番号１８）、
ＩＬ−１２：センス ５’ＡＴＧＧＣＣＡＴＧＴＧＧＧＡＧＣＴＧＧＡＧ ３’（配列番号１９）、
アンチセンス ５’ＴＴＴＧＧＴＧＣＴＴＣＡＣＡＣＴＴＣＡＧＧ ３’（配列番号２０）、
ＩＬ−１３：センス ５’ＡＴＧＧＣＣＡＴＧＴＧＧＧＡＧＣＴＧＧＡＧ ３’（配列番号２１）、
アンチセンス ５’ＴＴＴＧＧＴＧＣＴＴＣＡＣＡＣＴＴＣＡＧＧ ３’（配列番号２２）。
【０１７６】
（ｅ）ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋調節性Ｔ細胞の試験のための免疫付与レジメン
マウスを、０，４および８日目に酵母組換えＤｅｒ ｐ ２タンパク質（ｒＤｅｒ ｐ ２）の低用量（ＬＤ）［１０μｇ／マウス］または高用量（ＨＤ）［５０μｇ／マウス］の皮下注射によってプライミングした。Ｄｅｒ ｐ ２のＬＤによるブーストを２８日目に与え、Ｄｅｒ ｐ ２特異的免疫応答をＥＬＩＳＡによって検定した。もう１つの試験では、ｒＤｅｒ ｐ ２でプライミングしたマウスを２１日目に屠殺した。リンパ節および脾臓をＴ細胞培養物のサイトカインプロファイリングのために採取した。対照マウスにはＰＢＳ１００μｌを皮下注射した。ｒＤｅｒ ｐ ２を経上皮的にパッチしたマウスを上述したように作製した（Ｗａｎｇ ＬＦら、１９９６）。簡単に述べると、最初にＰＢＳ１００μｌ中のｒＤｅｒ ｐ ２ ５０μｇをパッチの１ｃｍ^２ガーゼに適用し、次にそれを毛刈りした皮膚に適用して、弾性包帯で固定した。パッチ適用は０日目と１４日目に実施した。各々のパッチを４日間適用して除去した。２１日目にマウスを屠殺し、抗原特異的ＴＨ２細胞を確立した。
【０１７７】
Ｄｅｒ ｐ ２によるエアロゾル抗原刺激だけを受けた対照マウスは、Ａｇ特異的ＴＨ２サイトカイン、特にＩＬ−５、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３の高発現レベルを示した。しかし、ＨＤでプライミングしたマウスは、ＬＤでプライミングしたマウスまたは対照群と比較すると、ＩＬ−１３、ＩＬ−５およびＩＬ−１０発現の有意な抑制を示した。加えて、ＬＤプライミングしたマウスは、ＨＤプライミングしたマウスおよび対照と比較して、もっぱらＩＬ−９の高発現を有していた。それゆえ、初期ＨＤプライミングはＴＨ２関連サイトカインの発現を抑制することによってＤｅｒ ｐ ２吸入の作用を改善した。
【０１７８】
（ｆ）ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋調節性Ｔ細胞の濃縮
ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋調節性Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社、独国、ベルギッヒ グラヂバッハ）を使用することによって脾調節性Ｔ細胞を濃縮し、ＡｕｔｏＭａｃｓ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を製造者の指示に従って使用して選別した。単離細胞の一部を、純度確認のためにＦＩＴＣ結合抗マウスＣＤ４抗体、Ｐｅｒ−ＣＰ結合抗マウスＣＤ３ε抗体、およびＰＥ結合抗マウスＣＤ２５と共にインキュベートした。細胞純度を、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリーおよびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を用いたフローサイトメトリー分析によって測定すると、単離細胞の少なくとも９５％がＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞であった。
【０１７９】
（ｇ）脾細胞培養および抗原提示細胞（ＡＰＣ）の作製
脾細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、抗生物質（１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）、５．５×１０^−２ｍＭ ２−βメルカプトエタノール（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を添加した完全ＲＰＭＩ−１６４０培地で培養し、５％ＣＯ_２インキュベーターにおいて３７℃で保持した。脾細胞を９６ウェルプレートにおいて（４×１０^５細胞／ウェル）１０μｇ／ｍｌのＤｅｒ ｐ ２タンパク質と共に３〜５日間培養し、採集した上清を−２０℃で凍結した。抗原特異的ＴＨ２細胞を、ｒＤｅｒ ｐ ２と共に６ウェルプレート（２×１０^７細胞／ウェル）で脾細胞を培養することによって経上皮パッチ適用マウスから樹立した。細胞に、３，５および７日目に１０Ｕ／ｍｌの組換えマウスＩＬ−２（ｒＩＬ−２）（Ｒ ＆ Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社）を含む新鮮培地を添加した。１０日目に、ＴＨ２細胞を採集し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｇｕｅ ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）遠心分離によって精製した。ＡＰＣは、ナイーブマウスのマイトマイシンＣ処理脾細胞に由来した。簡単に述べると、マイトマイシンＣ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ＧｍｂＨ社、独国、マンハイム）を５０μｇ／ｍｌの最終濃度で細胞に添加し、暗所にて３７℃で２０分間インキュベートした。細胞を１×ＨＢＳＳ３０ｍｌで３回洗浄し、ＲＰＭＩ−１６４０培地に懸濁した。
【０１８０】
（ｈ）サイトカインプロファイリングおよび細胞増殖アッセイ
抗原特異的ＴＨ２細胞およびＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞を、１×１０^５細胞／ウェルで、１０μｇ／ｍｌのｒＤｅｒ ｐ ２と共に、またはｒＤｅｒ ｐ ２なしで培養した。ＡＰＣは３×１０^５細胞／ウェルで使用した。上清を３日目に採集し、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３産生に関して検定した。増殖試験では、細胞を５日間インキュベートし、最後の１８時間目に［^３Ｈ］チミジン（ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ社、マサチューセッツ州 ボストン）１μＣｉでパルスした。細胞をガラス繊維フィルター（Ｓｋａｔｒｏｎ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＡＳ社、ノルウェー国、Ｌｉｅｒ）に採集した。シンチレーション液（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）の添加後、液体シンチレーション計数器（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社、カリフォルニア州 フラトン）によって増殖を測定した。増殖指数は、ＴＨ２細胞単独の比として表わされている。
【０１８１】
（ｉ）サイトカインＥＬＩＳＡ
マウスＩＦＮ−γ（ＲＡ−６Ａ２）、ＩＬ−４（ＢＶＤ４−１Ｄ１１）、ＩＬ−５（ＴＲＦＫ５）、ＩＬ−９（Ｄ８４０２Ｅ８）、ＩＬ−１０（ＪＥＳ０５２Ａ５）（Ｒ ＆ Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社、米国、ミネソタ州 ミネアポリス）、ＩＬ−１３（３８２１３）（Ｒ ＆ Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社）およびＴＧＦ−β（Ａ７５−２．１）抗体に対する精製抗体を２μｇ／ｍｌで９６ウェルプレートに被覆した。マウスＩＦＮ−γ（ＸＭＧ１．２）、ＩＬ−４ （ＢＶＤ６−２４Ｇ２）、ＩＬ−５（ＴＲＦＫ４）、ＩＬ−９（Ｄ９３０２Ｃ１２）、ＩＬ−１０（Ｒ ＆ Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社）、ＩＬ−１３（Ｒ ＆ Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社）およびＴＧＦ−β（Ａ７５−３．１）抗体に対するビオチニル化ポリクローナル抗体を推奨されているように使用した。組換えマウスサイトカインをＥＬＩＳＡアッセイにおける標準品として使用した。すべての抗体および組換えサイトカインは、特に記述されない限り、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社（カリフォルニア州、サンディエゴ）より入手した。
【０１８２】
図２７は、Ｄｅｒ ｐ ２でプライミングし、エアロゾル化Ｄｅｒ ｐ ２で抗原刺激したマウスにおけるサイトカインｍＲＮＡ発現の定量を示す。ＩＬ−１２は検出されず、マウスの群間でＩＬ−４およびＩＦＮ−γの発現レベルには差がなかった。しかし、他のＴＨ２サイトカイン、特にエフェクターサイトカインの発現には差があった。
【０１８３】
これらのサイトカインの発現レベルを、リアルタイムＰＣＲを使用してさらに評価した（リアルタイムＰＣＲによって測定した脾ＣＤ４^＋Ｔ細胞のＴＨ２サイトカインプロフィールを示す表Ｉ参照）。各々の増幅したセットの融解曲線分析は、水対照では認められなかった特徴的な鋭いピークを示した（データは示されていない）。表Ｉは、較正物質（未処置）基準化増幅サイトカインセット／ＨＰＲＴ比を示す。マウスのすべての群においてＩＬ−４発現に特徴的な相違は存在しなかった。エアロゾルＤｅｒ ｐ ２吸入に供した対照マウスは、Ａｇ特異的ＴＨ２サイトカイン、特にＩＬ−５、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３の高発現レベルを示した。ＨＤでプライミングしたマウスは、ＬＤでプライミングしたマウスまたは対照群と比較すると、ＩＬ−１３発現（少なくとも１００倍低い）、ＩＬ−５およびＩＬ−１０発現（〜７倍低い）の有意な抑制を示した。これは、初期ＨＤプライミングがＴＨ２関連サイトカインの発現を抑制することによってＤｅｒ ｐ ２吸入の作用を改善したことを示唆する。ＬＤプライミングしたマウスは、ＨＤプライミングマウスおよび対照と比較して、もっぱらＩＬ−９の高発現（＞１００倍）を有していた。従って、ＴＨ２サイトカインはアレルゲン投与免疫付与に関連する。
【０１８４】
図２７および２８は、高用量または低用量のｒＤｅｒ ｐ ２タンパク質でプライミングしたマウスからのリンパ節および脾臓のサイトカインプロフィールを示す。マウスを、０，４，８日目にｒＤｅｒ ｐ ２タンパク質の低用量（ＬＤ、１０μｇ）または高用量（ＨＤ、５０μｇ）、またはＰＢＳでプライミングし、１０日目に屠殺した（前出）。リンパ節および脾臓を採取し、ｒＤｅｒ ｐ ２タンパク質の存在下で３〜５日間培養した。低用量でプライミングしたマウスからのリンパ節および脾臓のいずれもが、高用量プライミングマウスと比較して、ＴＨ２サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−１３およびＩＬ−９）産生の上昇およびＴＨ１サイトカイン（ＩＦＮ−γ）産生の低下を示した。他方で、高用量プライミングマウスは、リンパ節および脾臓の両方においてより高いＴＧＦ−β産生を示した。
【０１８５】
図３０は、高用量のｒＤｅｒ ｐ ２タンパク質でプライミングしたマウスからのＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋調節性Ｔ細胞の抑制作用を示す。ＬＤまたはＨＤ ｒＤｅｒ ｐ ２タンパク質でプライミングしたマウスの脾ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞を、ｒＤｅｒ ｐ ２タンパク質の存在下で５日間、抗原特異的ＴＨ２細胞と共培養し、増殖とサイトカイン応答の両方を検定した。図３０（Ａ〜Ｄ）に示されるように、ＨＤ ｒＤｅｒ ｐ ２タンパク質でプライミングしたマウスからの脾ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞は、ＴＨ２細胞の増殖およびＴＨ２サイトカイン、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３の産生の両方に対して抑制作用を及ぼすことができた。ＬＤ ｒＤｅｒ ｐ ２タンパク質でプライミングしたマウスからの脾ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞は、同様の抑制作用を及ぼすことができなかった。
【実施例１６】
【０１８６】
マウスにおける組換えＬ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａ／Ｂｌｏ ｔ ５によって初回抗原刺激した免疫応答の試験
１週につき連続４日間毎日１×１０^９ｃｆｕ／マウスをマウスに給餌した（図３１）。各々のマウスが摂取した総食餌量は、１×１０^９ｃｆｕの２０回用量であった。マウスを７週目まで毎週１回採血し、Ｂｌｏ ｔ ５特異的血清免疫グロブリンをＥＬＩＳＡによって検定した。有意のレベルのＢｌｏ ｔ ５特異的ＩｇＧ１が検出されたが、有意のレベルのＩｇＥおよびＩｇＧ２ａは検出されなかった（図３２）。マウスを１９８日目に屠殺し、サイトカイン分析のためにパイアー斑および脾臓からのＴ細胞を得た。Ｌ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａ／Ｂｌｏ ｔ ５を給餌したマウスのパイアー斑からのＴ細胞においてのみ、有意のレベルの調節性サイトカインＴＧＦ−βが検出され、生組換えＬ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａ／Ｂｌｏ ｔ ５がパイアー斑中のＴ細胞によるＴ調節性サイトカインの産生を積極的に誘導したことを示している（図３３参照）。
【０１８７】
本明細書の中での、先に公開された資料の列挙および考察は、必ずしもその資料が従来技術の一部であること、または一般的知識であることの容認と解釈されるべきではない。列挙されるすべての資料は参照によりここに組み込まれる。
【０１８８】
ここで説明的に述べられた本発明は、ここで特定して開示されていない何らかの要素または限定の不在下で適切に実施され得る。それゆえ、たとえば「含む」、「包含する」、「含有する」等の用語は、広く、および限定を伴わずに読み取られるべきである。加えて、ここで使用される用語および表現は、限定ではなく説明の表現として使用されており、示されるおよび記述される特徴の何らかの等価物またはその一部を排除するそのような用語および表現の使用は意図されていないが、特許請求される本発明の範囲内で様々な変更例が可能であることが認識される。それゆえ、本発明を好ましい実施形態によって具体的に開示したが、ここで開示される本発明の変更例および変形例が当業者によって行われ得ること、およびそのような変更例および変形例が本発明の範囲内であるとみなされることが理解されるべきである。
【０１８９】
本発明は、ここで広くおよび包括的に説明された。一般的開示に含まれる、より狭い種概念および亜属の概念分類の各々も本発明の一部を形成する。これは、削除されている物質がここで明確に列挙されているか否かに関わらず、属概念から何らかの特定事項を除去する条件または消極的な限定を伴う本発明の包括的な説明を包含する。
【０１９０】
他の実施形態は本特許請求の範囲に含まれる。加えて、本発明の特徴または態様がマーカッシュ群で述べられる場合、当業者は、本発明がそれによってマーカッシュ群のあらゆる個々の構成要素または構成要素のあらゆる小群でも述べられることを認識する。
【図面の簡単な説明】
【０１９１】
【図１】塵ダニアレルゲン発現構築物を作製するために使用される乳酸桿菌／大腸菌シャトルベクター（Ａ）および中間ベクターを図式的に示す。
【図２】さらなる乳酸桿菌／大腸菌シャトルベクターを図式的に示す。
【図３】本発明の組換え乳酸桿菌に含めることができるさらなる発現ベクターを示す。
【図４】本発明の組換え乳酸桿菌に含めることができるもう１つの発現ベクターを示す。
【図５】乳酸桿菌Ｌ．ｃａｓｅｉ ＳｈｉｒｏｔａおよびＬ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ ｇｇの２つの菌株におけるＤｅｒ ｐ ２の異種発現のウエスタン免疫ブロット法による検出を示す。
【図６】パイアー斑のＴ細胞およびＢ細胞領域へのＬ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａ−ｅＧＦＰのトランスロケーションを示す。
【図７】透過型電子顕微鏡によるパイアー斑内の単形および多形細胞の液胞への無傷Ｌ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａ−ｅＧＦＰのトランスロケーションを示す。
【図８】インビトロでＬ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａと共培養したＴ細胞におけるＴＧＦ−β産生の誘導を示す。
【図９】組換えＬｃ／Ｄｐ２を給餌したマウスにおけるＤｅｒ ｐ ２特異的Ｔ細胞増殖および調節性ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞の増加を示す。
【図１０】動物試験において使用した予防レジメンを示す。
【図１１】Ｄｅｒ ｐ ２特異的免疫グロブリン応答を示す。
【図１２】脾Ｔ細胞のサイトカインプロフィールを示す。
【図１３】腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）細胞のサイトカインプロフィールを示す。
【図１４】マウスにおける気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）のサイトカインのプロフィールを示す。
【図１５】マウスにおけるＢＡＬＦ分析および肺組織学検査を示す。
【図１６】動物試験において使用した治療レジメンを示す。
【図１７】マウスにおけるＤｅｒ ｐ ２特異的免疫グロブリン応答を示す。
【図１８】脾Ｔ細胞における選択サイトカインのプロフィールを示す。
【図１９】腸間膜リンパ節細胞における選択サイトカインプロフィールを示す。
【図２０】肺における病態生理学的変化および気管支肺胞洗浄液分析を示す。
【図２１】ＢＡＬＦのサイトカインプロフィールを示す。
【図２２】Ｄｅｒ ｐ ２アレルゲンで前感作したマウスの治療モデルを示す。
【図２３】全身的免疫グロブリン応答およびＴ細胞サイトカインを示す。
【図２４】治療モデル仮説を示す。
【図２５】マウスへの皮下プライミングの作用の分析のための実験プロトコールの概要を示す（アジュバントの適用なし）。
【図２６】マウスにおけるＤｅｒ ｐ ２特異的体液性応答の動態を示す。
【図２７】脾ＣＤ４^＋Ｔ細胞のサイトカインプロフィールに関するＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。
【図２８】培養下のリンパ節のサイトカインプロフィールを示す。
【図２９】ＳＰ培養物のサイトカインプロフィールを示す。
【図３０】ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋細胞と共培養したときの抗原特異的ＴＨ２細胞の増殖とサイトカイン応答を示す。
【図３１】Ｂｌｏ ｔ ５アレルゲンを発現する組換えＬ．ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａに関する動物試験で使用したレジメンを示す。
【図３２】ＥＬＩＳＡによるＢｌｏ ｔ ５特異的血清免疫グロブリンの分析を示す（図３１も参照）。
【図３３】図３４に示すレジメンにおいて屠殺したマウスのサイトカイン分析を示す。
【図３４】発現ベクターｐＬＰ４００内のアレルゲンＢｌｏ ｔ ５の核酸配列およびアミノ酸配列を示す。
【図３５】発現ベクターｐＬＰ５００内のアレルゲンＤｅｒ ｐ ２の核酸配列およびアミノ酸配列を示す。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
ダニアレルゲンＤｅｒ ｐ ２またはＢｌｏ ｔ ５の少なくとも免疫原性フラグメント、またはその免疫原性ホモログをコードする異種核酸配列を含む組換え乳酸桿菌。
【請求項２】
ダニアレルゲンＤｅｒ ｐ １の少なくとも免疫原性フラグメントまたはその免疫原性ホモログをコードする異種核酸配列を含み、
前記フラグメントがＤｅｒ ｐ １の成熟完全長タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも８％を含む、組換え乳酸桿菌。
【請求項３】
前記乳酸桿菌が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｎｔｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｉｌｇａｒｄｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｉｓｈｍａｎｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｅｎｓｅｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｕｃａｓｉｃｕｓ、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓから成る群より選択される、請求項１または請求項２に記載の組換え乳酸桿菌。
【請求項４】
前記乳酸桿菌が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ ＧＧまたはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａである、請求項３に記載の組換え乳酸桿菌。
【請求項５】
前記異種核酸配列によってコードされる前記免疫原性ホモログが、少なくとも前記ダニアレルゲンのそれぞれの免疫原性フラグメントのアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換え乳酸桿菌。
【請求項６】
前記ダニアレルゲンがＤｅｒ ｐ ２またはＢｌｏ ｔ ５であり、前記乳酸桿菌がＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ Ｓｈｉｒｏｔａである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換え乳酸桿菌。
【請求項７】
前記ダニアレルゲンがＤｅｒ ｐ ２であり、前記ダニアレルゲンが配列番号１の配列によってコードされる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組換え乳酸桿菌。
【請求項８】
前記ダニアレルゲンがＤｅｒ ｐ ２であり、前記異種核酸配列がＤｅｒ ｐ ２の免疫原性ホモログまたはその免疫原性フラグメントをコードし、免疫原性ホモログが、配列番号１の核酸配列に少なくとも７０％同一の核酸配列を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組換え乳酸桿菌。
【請求項９】
前記ダニアレルゲンがＢｌｏ ｔ ５であり、前記ダニアレルゲンの少なくとも前記免疫原性フラグメントが配列番号２の配列によってコードされる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組換え乳酸桿菌。
【請求項１０】
前記ダニアレルゲンがＢｌｏ ｔ ５であり、前記異種核酸配列がＢｌｏ ｔ ５の免疫原性ホモログまたはその免疫原性フラグメントをコードし、免疫原性ホモログが、配列番号２の核酸配列に少なくとも７０％同一の核酸配列を有する、請求項１〜６または請求項９のいずれか一項に記載の組換え乳酸桿菌。
【請求項１１】
前記ダニアレルゲンの少なくとも免疫原性フラグメントまたはその免疫原性ホモログをコードする前記配列が異種核酸分子内に含まれる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組換え乳酸桿菌。
【請求項１２】
前記異種核酸分子が発現ベクターである、請求項１１に記載の組換え乳酸桿菌。
【請求項１３】
前記発現ベクターが、ｐＬＰ４００、ｐＬＰ５００、ｐＳＩＰ３０８およびｐＳＩＰ４１２から成る群より選択される、請求項１２に記載の組換え乳酸桿菌。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組換え乳酸桿菌を含む医薬組成物。
【請求項１５】
医薬的に許容される担体または希釈剤をさらに含む、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
コルチコステロイド、抗ヒスタミン薬、ロイコトリエン修飾剤、マスト細胞安定剤、うっ血除去薬およびβ２アドレナリン受容体作動薬の少なくとも１つをさらに含む、請求項１４または１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
アレルゲンの少なくとも免疫原性フラグメントまたはその免疫原性ホモログをさらに含む、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記アレルゲンがダニアレルゲンである、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
ダニアレルゲンが塵ダニ（ｄｕｓｔ ｍｉｔｅ）アレルゲンである、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記ダニアレルゲンが、Ｄｅｒ ｐ １、ｐｒｏＤｅｒ ｐ １、Ｄｅｒ ｐ ２、Ｄｅｒ ｐ ３、Ｄｅｒ ｐ ４、Ｄｅｒ ｐ ５、Ｄｅｒ ｐ ７、Ｄｅｒ ｐ ８、Ｄｅｒ ｐ ９、Ｄｅｒ ｐ １０、Ｄｅｒ ｐ １１、Ｄｅｒ ｐ １４、Ｄｅｒ ｐ １５、Ｄｅｒ ｐ １８、Ｄｅｒ ｆ １、Ｄｅｒ ｆ ２、Ｄｅｒ ｆ ３、Ｄｅｒ ｆ ４、Ｄｅｒ ｆ ５、Ｄｅｒ ｆ ６、Ｄｅｒ ｆ ７、Ｄｅｒ ｆ １０、Ｄｅｒ ｆ １１、Ｄｅｒ ｆ １５、Ｄｅｒ ｆ １６、Ｄｅｒ ｆ １８、Ｄｅｒ ｍ １、Ｅｕｒ ｍ １、Ｅｕｒ ｍ ２、Ｈｅｒ ｆ ２、Ｂｌｏ ｔ １、Ｂｌｏ ｔ ３、Ｂｌｏ ｔ ５、Ｂｌｏ ｔ １２、Ｆｅｌ ｄ １、Ｍａｇ １、Ｍａｇ ３、Ｔｙｒ ｐ ２、Ｌｅｐ ｄ １、Ｌｅｐ ｄ ２、Ｌｅｐ ｄ ５、Ｌｅｐ ｄ ７、Ｌｅｐ ｄ １０、およびＬｅｐ ｄ １３から成る群より選択される、請求項１８または１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記ダニアレルゲンが、前記組換え乳酸桿菌によって発現されるダニアレルゲンの少なくとも免疫原性フラグメントまたはその免疫原性ホモログと共通の少なくとも１つのエピトープを含む、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
ダニアレルゲンの少なくとも免疫原性フラグメントまたはその免疫原性ホモログが、前記組換え乳酸桿菌によって発現されるダニアレルゲンの少なくとも免疫原性フラグメントまたはその免疫原性ホモログである、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
（ａ）請求項１４〜１６のいずれか一項で定義される医薬組成物と、
（ｂ）アレルゲンの少なくとも免疫原性フラグメントまたはその免疫原性ホモログを含有する医薬組成物と、
を含む、医薬キット。
【請求項２４】
前記（ｂ）の医薬組成物に含有されるアレルゲンがダニアレルゲンである、請求項２３に記載の医薬キット。
【請求項２５】
前記（ｂ）の医薬組成物に含有されるダニアレルゲンが塵ダニアレルゲンである、請求項２４に記載の医薬キット。
【請求項２６】
前記（ｂ）の医薬組成物に含有される前記ダニアレルゲンが、Ｄｅｒ ｐ １、ｐｒｏＤｅｒ ｐ １、Ｄｅｒ ｐ ２、Ｄｅｒ ｐ ３、Ｄｅｒ ｐ ４、Ｄｅｒ ｐ ５、Ｄｅｒ ｐ ７、Ｄｅｒ ｐ ８、Ｄｅｒ ｐ ９、Ｄｅｒ ｐ １０、Ｄｅｒ ｐ １１、Ｄｅｒ ｐ １４、Ｄｅｒ ｐ １５、Ｄｅｒ ｐ １８、Ｄｅｒ ｆ １、Ｄｅｒ ｆ ２、Ｄｅｒ ｆ ３、Ｄｅｒ ｆ ４、Ｄｅｒ ｆ ５、Ｄｅｒ ｆ ６、Ｄｅｒ ｆ ７、Ｄｅｒ ｆ １０、Ｄｅｒ ｆ １１、Ｄｅｒ ｆ １５、Ｄｅｒ ｆ １６、Ｄｅｒ ｆ １８、Ｄｅｒ ｍ １、Ｅｕｒ ｍ １、Ｅｕｒ ｍ ２、Ｈｅｒ ｆ ２、Ｂｌｏ ｔ １、Ｂｌｏ ｔ ３、Ｂｌｏ ｔ ５、Ｂｌｏ ｔ １２、Ｆｅｌ ｄ １、Ｍａｇ １、Ｍａｇ ３、Ｔｙｒ ｐ ２、Ｌｅｐ ｄ １、Ｌｅｐ ｄ ２、Ｌｅｐ ｄ ５、Ｌｅｐ ｄ ７、Ｌｅｐ ｄ １０、およびＬｅｐ ｄ １３から成る群より選択される、請求項２４または２５に記載の医薬キット。
【請求項２７】
前記（ｂ）の医薬組成物に含有されるダニアレルゲンの少なくとも免疫原性フラグメントまたはその免疫原性ホモログが、前記（ａ）の医薬組成物に含有される前記組換え乳酸桿菌によって発現されるダニアレルゲンの少なくとも免疫原性フラグメントまたはその免疫原性ホモログと共通の少なくとも１つのエピトープを含む、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の医薬キット。
【請求項２８】
前記（ｂ）の医薬組成物に含有されるダニアレルゲンの少なくとも免疫原性フラグメントまたはその免疫原性ホモログが、前記（ａ）の医薬組成物に含有される前記組換え乳酸桿菌によって発現されるダニアレルゲンの少なくとも免疫原性フラグメントまたはその免疫原性ホモログである、請求項２７に記載の医薬キット。
【請求項２９】
前記（ｂ）の医薬組成物に含有されるアレルゲンの少なくとも免疫原性フラグメントまたはその免疫原性ホモログが、組換え生物からの濃縮、精製および単離のいずれかによって得られる、請求項２３〜２８のいずれか一項に記載の医薬キット。
【請求項３０】
治療における使用のための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組換え乳酸桿菌。
【請求項３１】
前記治療が、アレルゲンに対する免疫応答を調節することである、請求項３０に記載の組換え乳酸桿菌。
【請求項３２】
経口投与のための、請求項３０または３１に記載の組換え乳酸桿菌。
【請求項３３】
アレルゲンの少なくとも免疫原性フラグメントまたはその免疫原性ホモログとの併用投与のための、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の組換え乳酸桿菌。
【請求項３４】
アレルゲンの少なくとも免疫原性フラグメントまたはその免疫原性ホモログの舌下、皮下、皮内、経皮または経上皮投与のための、請求項３３に記載の組換え乳酸桿菌。
【請求項３５】
前記アレルゲンがダニアレルゲンである、請求項３３または３４に記載の組換え乳酸桿菌。
【請求項３６】
前記組換え乳酸桿菌がキットに含まれ、前記キットが、アレルゲンの少なくとも免疫原性フラグメントまたはその免疫原性ホモログをさらに含む、請求項３０〜３５のいずれか一項に記載の組換え乳酸桿菌。
【請求項３７】
組換え乳酸桿菌と、アレルゲンの少なくとも免疫原性フラグメントまたはその免疫原性ホモログの連続投与のための、請求項３３〜３６のいずれか一項に記載の組換え乳酸桿菌。
【請求項３８】
前記連続投与が、アレルゲンの少なくとも前記免疫原性フラグメントを投与する第１の工程と、前記組換え乳酸桿菌を投与する第２の工程とを含む、請求項３７に記載の組換え乳酸桿菌。
【請求項３９】
請求項１４に記載の医薬組成物を投与することからなる、哺乳動物においてアレルゲンに対する免疫応答を調節する方法。
【請求項４０】
前記哺乳動物がヒトである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記アレルゲンがダニアレルゲンである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記ダニアレルゲンが塵ダニアレルゲンである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
アレルギー疾患の治療における、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
前記アレルギー疾患がダニアレルギーである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記アレルギー疾患が、喘息、鼻炎、アトピー性皮膚炎およびじんま疹から成る群より選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
アレルギー疾患の予防における、請求項３９に記載の方法。
【請求項４７】
前記アレルギー疾患がダニアレルギーである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記アレルギー疾患が、喘息、鼻炎、アトピー性皮膚炎およびじんま疹から成る群より選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
請求項１４に記載の医薬組成物が経口的または舌下的に投与される、請求項３９に記載の方法。
【請求項５０】
組換え乳酸桿菌を含有する前記医薬組成物を反復投与することを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項５１】
前記医薬組成物が、アレルゲンの少なくとも免疫原性フラグメントまたはその免疫原性ホモログをさらに含有する、請求項３９に記載の方法。
【請求項５２】
アレルゲンの少なくとも免疫原性フラグメントまたはその免疫原性ホモログを含有する医薬組成物を投与することをさらに含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項５３】
組換え乳酸桿菌を含有する前記医薬組成物、およびアレルゲンの少なくとも前記免疫原性フラグメントまたはその免疫原性ホモログを含有する前記医薬組成物が医薬キット中に含まれる、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記アレルゲンの少なくとも免疫原性フラグメントまたはその免疫原性ホモログが前記医薬組成物中に含有され、前記アレルゲンがダニアレルゲンである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
アレルゲンの少なくとも前記免疫原性フラグメントまたはその免疫原性ホモログが、前記組換え乳酸桿菌によって発現されるアレルゲンの少なくとも免疫原性フラグメントまたはその免疫原性ホモログと共通の少なくとも１つのエピトープを含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
アレルゲンの少なくとも前記免疫原性フラグメントまたはその免疫原性ホモログが、前記組換え乳酸桿菌によって発現されるアレルゲンの少なくとも免疫原性フラグメントまたはその免疫原性ホモログである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
アレルゲンの少なくとも前記免疫原性フラグメントまたはその免疫原性ホモログが、組換え生物からの濃縮、精製および単離のいずれかによって得られる、請求項５２に記載の方法。
【請求項５８】
アレルゲンの少なくとも前記免疫原性フラグメントまたはその免疫原性ホモログを含有する前記医薬組成物が、舌下的、皮下的、皮内的、経皮的、経上皮的およびそれらのあらゆる組合せから成る群より選択される方法で投与される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５９】
アレルゲンの少なくとも免疫原性フラグメントまたはその免疫原性ホモログを含有する前記医薬組成物が皮下的に投与され、かつ請求項１４に記載の医薬組成物が経口的に投与される、請求項５２に記載の方法。
【請求項６０】
前記組換え乳酸桿菌を含有する前記医薬組成物、およびアレルゲンの少なくとも前記免疫原性フラグメントまたはその免疫原性ホモログを含有する前記医薬組成物が連続的に投与される、請求項５２に記載の方法。
【請求項６１】
（ａ）請求項１４に記載の医薬組成物を提供する工程と、
（ｂ）請求項１４に記載の前記医薬組成物を投与する工程と、
（ｃ）アレルゲンの少なくとも免疫原性フラグメントまたはその免疫原性ホモログを含有する医薬組成物を提供する工程と、
（ｄ）アレルゲンの少なくとも免疫原性フラグメントまたはその免疫原性ホモログを含有する前記医薬組成物を投与する工程と、
からなる、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
アレルゲンの少なくとも免疫原性フラグメントを含有する前記医薬組成物を最初に投与し、請求項１４に記載の医薬組成物をその後に投与する、請求項５２に記載の方法。
【請求項６３】
前記方法が免疫療法である、請求項５２に記載の方法。
【請求項６４】
アレルゲンの少なくとも前記免疫原性フラグメントまたはその免疫原性ホモログを含有する前記医薬組成物を反復投与する、請求項５２に記載の方法。
【請求項６５】
アレルゲンに対する免疫応答を調節するための医薬組成物の製造における、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組換え乳酸桿菌の使用方法。
【請求項６６】
前記アレルゲンがダニアレルゲンである、請求項６５に記載の使用方法。
【請求項６７】
前記ダニアレルゲンが塵ダニアレルゲンである、請求項６６に記載の使用方法。
【請求項６８】
アレルギーの治療または予防における、請求項６５〜６７のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項６９】
前記アレルギーがダニアレルギーである、請求項６８に記載の使用方法。
【請求項７０】
前記組換え乳酸桿菌の経口または舌下投与のための、請求項６５〜６９のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項７１】
前記組換え乳酸桿菌の反復投与のための、請求項６５〜７０のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項７２】
前記医薬組成物が、コルチコステロイド、抗ヒスタミン薬、ロイコトリエン修飾剤、マスト細胞安定剤、うっ血除去薬およびβ２アドレナリン受容体作動薬の少なくとも１つをさらに含む、請求項６５〜７１のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項７３】
アレルゲンの少なくとも免疫原性フラグメントまたはその免疫原性ホモログとの併用投与のための、請求項６５〜７２のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項７４】
前記医薬組成物が、アレルゲンの少なくとも前記免疫原性フラグメントまたはその免疫原性ホモログを含有する、請求項７３に記載の使用方法。
【請求項７５】
アレルゲンの少なくとも免疫原性フラグメントまたはその免疫原性ホモログを含有する医薬組成物をさらに含む医薬キットの製造における、請求項６５〜７３のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項７６】
前記アレルゲンがダニアレルゲンである、請求項７３〜７５のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項７７】
アレルゲンの少なくとも前記免疫原性フラグメントまたはその免疫原性ホモログが、前記組換え乳酸桿菌によって発現されるアレルゲンの少なくとも免疫原性フラグメントまたはその免疫原性ホモログと共通の少なくとも１つのエピトープを含む、請求項７３〜７６のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項７８】
アレルゲンの少なくとも前記免疫原性フラグメントまたはその免疫原性ホモログが、前記組換え乳酸桿菌によって発現されるアレルゲンの少なくとも免疫原性フラグメントまたはその免疫原性ホモログである、請求項７７に記載の使用方法。
【請求項７９】
アレルゲンの少なくとも前記免疫原性フラグメントまたはその免疫原性ホモログが、組換え生物からの濃縮、精製および単離のいずれかによって得られる、請求項７３〜７８のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項８０】
前記組換え乳酸桿菌、およびアレルゲンの少なくとも前記免疫原性フラグメントまたはその免疫原性ホモログの連続投与のための、請求項７３〜７９のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項８１】
免疫療法における、請求項８０に記載の使用方法。
【請求項８２】
アレルゲンの少なくとも前記免疫原性フラグメントを最初に投与し、アレルゲンの少なくとも免疫原性フラグメントまたはその免疫原性ホモログをその後に投与する、請求項８０または８１に記載の使用方法。
【請求項８３】
アレルゲンの少なくとも前記免疫原性フラグメントまたはその免疫原性ホモログが、舌下的、皮下的、皮内的、経皮的、経上皮的およびそれらのあらゆる組合せから成る群より選択される方法で投与される、請求項７３〜８２のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項８４】
前記組換え乳酸桿菌が経口的に投与され、アレルゲンの少なくとも免疫原性フラグメントまたはその免疫原性ホモログを含有する前記医薬組成物が皮下的に投与される、請求項８３に記載の使用方法。
【請求項８５】
アレルゲンの少なくとも前記免疫原性フラグメントまたはその免疫原性ホモログが反復投与される、請求項７３〜８４のいずれか一項に記載の使用方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８Ａ】

【図８Ｂ】

【図９Ａ】

【図９Ｂ】

【図１０】

【図１１】

【図１２Ａ】

【図１２Ｂ】

【図１２Ｃ】

【図１２Ｄ】

【図１２Ｅ】

【図１２Ｆ】

【図１３Ａ】

【図１３Ｂ】

【図１３Ｃ】

【図１３Ｄ】

【図１３Ｅ】

【図１４Ａ】

【図１４Ｂ】

【図１４Ｃ】

【図１４Ｄ】

【図１４Ｅ】

【図１５Ａ】

【図１５Ｂ】

【図１５Ｃ】

【図１６】

【図１７Ａ】

【図１７Ｂ】

【図１７Ｃ】

【図１７Ｄ】

【図１８Ａ】

【図１８Ｂ】

【図１８Ｃ】

【図１８Ｄ】

【図１８Ｅ】

【図１８Ｆ】

【図１９Ａ】

【図１９Ｂ】

【図１９Ｃ】

【図１９Ｄ】

【図１９Ｅ】

【図１９Ｆ】

【図２０Ａ】

【図２０Ｂ】

【図２０Ｃ】

【図２０Ｄ】

【図２０Ｅ】

【図２０Ｆ】

【図２０Ｇ】

【図２１Ａ】

【図２１Ｂ】

【図２１Ｃ】

【図２２】

【図２３Ａ】

【図２３Ｂ】

【図２３Ｃ】

【図２４】

【図２５】

【図２６Ａ】

【図２６Ｂ】

【図２６Ｃ】

【図２７】

【図２８Ａ】

【図２８Ｂ】

【図２８Ｃ】

【図２８Ｄ】

【図２８Ｅ】

【図２９Ａ】

【図２９Ｂ】

【図２９Ｃ】

【図２９Ｄ】

【図２９Ｅ】

【図２９Ｆ】

【図３０Ａ】

【図３０Ｂ】

【図３０Ｃ】

【図３０Ｄ】

【図３１】

【図３２】

【図３３】

【図３４】

【図３５】

【公表番号】特表２００９−５３４０２９（Ｐ２００９−５３４０２９Ａ）
【公表日】平成２１年９月２４日（２００９．９．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５０６４５２（Ｐ２００９−５０６４５２）
【出願日】平成１９年４月４日（２００７．４．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＧ２００７／００００９０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１２３４８８
【国際公開日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【出願人】（５０８３１２３６０）ナショナル　ユニバーシティ　オブ　シンガポール (2)
【氏名又は名称原語表記】ＮＡＴＩＯＮＡＬ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ　ＯＦ　ＳＩＮＧＡＰＯＲＥ
【Ｆターム（参考）】