肺癌を標的とするペプチドおよびその適用
本発明は、診断および治療法を含む適用に用いるための核酸、ペプチドおよび抗体を提供する。ペプチドは肺癌を標的とし、ファージディスプレイによって同定された。ターゲティングファージＰＣ５−２および合成ペプチドＳＰ５−２はどちらも肺癌患者からのヒト肺腫瘍試料を認識できた。ＮＳＣＬＣ異種移植片を有するＳＣＩＤマウスにおいて、このターゲティングファージは腫瘍塊を特異的に標的にできた。抗癌薬ビノレルビンまたはドキソルビシンを含有するリポソームにペプチドを結合したとき、ヒト肺癌異種移植片に対するこれらの薬物の効果が改善され、生存率が増加し、薬物の毒性が低減した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２００７年２月１３日に出願された米国仮出願第６０／９００，９７３号および２００７年２月１４日に出願された米国仮出願第６０／９０１，０８５号ならびに２００７年４月１３日に出願された米国特許出願第１１／７８３，９２７号（これらは全て、それらの全体が参考として援用される）への優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
肺癌は世界の癌に関係する死亡率の主因である。進行した非小細胞肺癌（ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ：ＮＳＣＬＣ）の患者に対する５年生存率は１５％未満である。大多数の癌細胞を除くために必要な薬物用量の送達が副作用によって妨げられる化学療法にとって、腫瘍特異性の欠如はなおも主要な問題である。しかし、リガンドが介在する標的療法は、化学療法をより腫瘍特異性が高く毒性が低いものにする可能性があり、癌の新規の治療法の開発に有用であり得る。
【０００３】
医薬産業においては、癌の処置に対する候補となり得る新たな細胞毒性薬物が多数発見されているが、それでもなおこの生命に関わる疾患が原因で全世界で毎年７００万人を超える死者が出ており、その数は増え続けている（Ｍａｎｔｙｈ、２００６）。ほとんどの従来の化学療法の臨床的使用は、腫瘍標的組織への治療薬物濃度の不十分な送達によって、または正常な器官への深刻かつ有害な毒性の影響によって、しばしば制限される。したがって、腫瘍を標的とする薬物送達に用いることによって運ばれる薬物の治療指数を改善できるような新規のマイクロキャリア技術を開発することが重要である。
【０００４】
ファージディスプレイとは、ペプチドまたはタンパク質がバクテリオファージのコートタンパク質との融合として発現されるような選択技術であり、その結果ビリオンの表面上に融合ペプチドまたはタンパク質が提示（ディスプレイ）される。ファージディスプレイのランダムペプチドライブラリは、Ｂ細胞エピトープ（Ｄ’Ｍｅｌｌｏら、１９９７；Ｆｕら、１９９７；ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ、１９９０；Ｗｕら、２００１；Ｗｕら、２００３）およびタンパク質−タンパク質接触（Ａｔｗｅｌｌら、１９９７；Ｂｏｔｔｇｅｒら、１９９６；Ｎｏｒｄら、１９９７；Ｓｍｉｔｈら、１９９９）をマッピングする機会、受容体（Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、１９９９；Ｌｉら、１９９５；Ｗｒｉｇｈｔｏｎら、１９９６）またはタンパク質（Ｂｏｔｔｇｅｒら、１９９６；Ｃａｓｔａｎｏら、１９９５；ＤｅＬｅｏら、１９９５；Ｋｒａｆｔら、１９９９；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら、１９９５）に結合する生理活性ペプチドを選択する機会、疾患特異的な抗原模倣（Ｆｏｌｇｏｒｉら、１９９４；Ｌｉｕら、２００４；Ｐｒｅｚｚｉら、１９９６）を探索する機会、ならびに細胞特異的ペプチド（Ｂａｒｒｙら、１９９６；非特許文献１；Ｍａｚｚｕｃｃｈｅｌｌｉら、１９９９）および器官特異的ペプチド（Ａｒａｐら、１９９８；ＥｓｓｌｅｒおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、２００２；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら、１９９５；ＰａｓｑｕａｌｉｎｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９６）を定める機会を与える。
【０００５】
リポソームは、癌化学療法における薬物担体として提案された（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓら、１９７４）。そのとき以来、リポソームに対する関心は増加し、リポソーム系は現在薬物担体として広範囲に研究されている。リポソームを特に癌組織への薬物送達に用いるために、リポソームには以下の３つの基本的要求が望まれる：（ｉ）血液循環を長くすること、（ｉｉ）十分な腫瘍蓄積、（ｉｉｉ）薬物の薬力学に適合する放出プロファイルを有しながら、制御された薬物放出および腫瘍細胞による取込みが行なわれること。
【０００６】
最初、リポソーム薬物送達系の研究は、細網内皮系（ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｓｙｓｔｅｍ：ＲＥＳ）による非常に速い血液クリアランスに苦しめられた。粒子サイズ、表面電荷（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ、１９８４）、およびリポソーム組成は、クリアランスプロファイルに対する影響が強い（例、ホスファチジルイノシトールまたはモノシアロガングリオシドの組込みによって、血液中のリポソーム循環が長くなる）ことが確認された（ＡｌｌｅｎおよびＣｈｏｎｎ、１９８７；ＧａｂｉｚｏｎおよびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ、１９８８；Ｓｅｎｉｏｒ、１９８７）。漏出性毛細血管を介して優先的に循環から出て、広範囲の新血管新生を示す腫瘍に蓄積してより高濃度となり、抗腫瘍活性を高めると予測される「ステルス」リポソームによって、この取込みは回避され得る（Ｗｕら、１９９３）。しかし、合成ポリマーポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ：ＰＥＧ）で被覆されたリポソームが血中の半減期を有意に増加させることが発見されたときには、リポソームは単に良好な薬物送達候補としてのみ認識されていた（Ａｌｌｅｎら、１９９１；ＢｌｕｍｅおよびＣｅｖｃ、１９９０；Ｋｌｉｂａｎｏｖら、１９９０；Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、１９９１；Ｓｅｎｉｏｒら、１９９１）。このペグ化リポソームは、リポソームのタンパク質吸着およびオプソニン作用を阻害する高度に水和し保護されたリポソーム表面のために、長く循環する（ＷｏｏｄｌｅおよびＬａｓｉｃ、１９９２）。速いオプソニン作用およびクリアランスの問題を解決して、血中で最大７２時間の半減期を有するリポソームを提供する（Ｄｒｕｍｍｏｎｄら、１９９９）と、次の挑戦事項は能動的ターゲティングによって腫瘍組織内にリポソームを蓄積させることだった。ターゲティングリポソームの使用によって、腫瘍標的部位における薬物放出を有意に高め、治療効果を増加できる可能性がある（非特許文献１；非特許文献２）。
【０００７】
薬物送達研究分野では、腫瘍組織内で蓄積する長く循環するリポソームの構築に成功しており、閉じ込められた薬物は、能動的なトリガが存在しない限り、次いで受動拡散によってリポソームの外に漏出する必要がある。疾患組織に特異的に薬物を放出できる部位特異的トリガの使用は、腫瘍標的部位における薬物の生物学的利用率を増加させる方法の１つである。薬物の生物学的利用率を最適化する別の方法は、能動的ターゲティングによってより高程度のリポソーム蓄積を得ることである。さらに、能動的ターゲティングと能動的トリガとの組合せによって、腫瘍標的部位における有意に高められた特異的な薬物放出をもたらし得る可能性がある（非特許文献１；非特許文献２）。
【０００８】
癌を標的とするためにモノクローナル抗体を用いる際の主要な制限の１つは、抗体分子が比較的大きく、分子量（ＭＷ）１５０，０００を有することである。この分子は、血液供給が不十分な大きな腫瘍塊の内部に達することが困難である（Ｄｖｏｒａｋら、１９９１；Ｊａｉｎ、１９９７；Ｓｈｏｃｋｌｅｙら、１９９１）。この問題を克服するために、何人かの研究者は現在、サイズがより小さいＭＷ２５，０００の抗腫瘍１本鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｖ：ｓｃＦｖ）抗体を開発中である（ＡｄａｍｓおよびＳｃｈｉｅｒ、１９９９；Ｈａｌｌら、１９９８；Ｗｏｎｇら、２００１）。モノクローナル抗体療法の別の主要な問題は、抗体分子がたとえば肝臓、脾臓および骨髄などの細網内皮系に非特異的に取込まれることである。放射標識抗体または毒素結合抗体の用量を制限する毒性は、肝臓および骨髄毒性である（Ｎｅｕｍｅｉｓｔｅｒら、２００１；Ｔｈｏｍａｓら、１９９５）。これに対し、ペプチドはモノクローナル抗体よりもかなり小さくてもよく、一般的に細網内皮系には結合しない（Ａｉｎａら、２００５）。ペプチドは化学的に安定であり、製造が比較的容易である。加えて、短い合成ペプチドの有効な組織侵入を、それらの選択的結合および癌細胞による内部移行能力と組合せることによって、これらの薬剤は、たとえば細胞毒性薬物、オリゴヌクレオチド、毒素および放射性分子などの治療の送達に対する理想的な候補となる。ウイルス性の送達ベクターおよびモノクローナル抗体とは対照的に、ペプチドは免疫系に対してほとんど不可視であり、最小限の副作用しかもたらさないか、または副作用をもたらさないことが期待されている（ＬｅｖｙおよびＨｙｍａｎ、２００５）。したがって、ターゲティングリガンドの同定およびリガンド標的リポソームの開発が非常に望ましい。
【０００９】
ＮＳＣＬＣに対する有望な新しい治療法には、より大きな腫瘍特異性およびより低い毒性を可能にする腫瘍標的アプローチが必要であると本発明者らは考える。本発明者らは本明細書にペプチドの単離および同定を記載しており、このペプチドは、いくつかのＮＳＣＬＣ細胞系および肺癌患者からのヒト生検試料に特異的に結合できるＳＰ５−２を含む。ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）またはドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）を含有するリポソームに結合されるとき、このターゲティングペプチドＳＰ５−２は、ＳＣＩＤマウスにおけるヒト肺癌異種移植片に対する薬物の治療指数を高めた。本発明者らの結果は、このターゲティングペプチドおよび本発明者らの研究において同定された他のペプチドが、肺癌の処置における薬物送達剤としての強い臨床的可能性を有することを示す。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｌｅｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２００４）６４，８００２〜８００８
【非特許文献２】Ｐａｒｋら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２００２）８，１１７２−１１８１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、特定の標的組織に対してファージディスプレイライブラリをスクリーニングすることは、薬物、遺伝子送達ベクターまたはその他の治療薬剤のターゲティングに用いられるペプチド配列の同定における直接的かつ迅速な方法となる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明はとりわけ、以下のものを単独または組合せて含む。
【００１３】
本発明は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、および配列番号１９を含むポリヌクレオチドおよびその変異体を提供する。
【００１４】
本発明は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、および配列番号２０を含むペプチドおよびその変異体を提供する。一実施形態において、ペプチドは配列番号２またはその変異体を含む。別の実施形態において、ペプチドは配列番号２を含む。別の実施形態において、ペプチドは融合タンパク質を含む。別の実施形態において、ペプチドは１つまたはそれ以上の標識を含む。標識はＦＩＴＣ、ビオチンおよび放射性同位元素を含んでもよい。別の実施形態において、ペプチドは１つまたはそれ以上の薬物に結合される。薬物はドキソルビシン、ビノレルビン、オリゴヌクレオチド、毒素、抗ＶＥＧＦアプタマー、および放射性分子を含んでもよい。
【００１５】
本発明は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、および配列番号２０を含む本発明のペプチドまたはその変異体に結合する抗体を提供する。
【００１６】
本発明は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、および配列番号２０を含むペプチドを含む本発明のペプチドの１つまたはそれ以上を含むリポソームを提供する。一実施形態において、リポソームは配列番号２またはその変異体を含むペプチドを含む。別の実施形態において、リポソームは配列番号２を含むペプチドを含む。リポソームは１つまたはそれ以上の薬物を含んでもよい。薬物はドキソルビシン、ビノレルビン、オリゴヌクレオチド、毒素、抗ＶＥＧＦアプタマー、および放射性分子を含んでもよい。一実施形態において、薬物はドキソルビシンである。別の実施形態において、薬物はビノレルビンである。ドキソルビシンは、リン脂質１μｍｏｌ当り約１１０μｇから約１３０μｇの量であってもよい。ある実施形態において、リポソームは約６５ｎｍから約７５ｎｍの直径を有する。別の実施形態において、リポソーム当りのペプチド分子の数は約３００から約５００である。リポソームは医薬的に許容できる担体を含んでもよい。
【００１７】
本発明は、１つまたはそれ以上の化学療法薬物と、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、および配列番号２０からなる群より選択されるペプチド、またはその変異体とを含むリポソームを対象に接触させる工程を含む、癌を処置する方法を提供する。化学療法薬物は、ドキソルビシン、ビノレルビン、オリゴヌクレオチド、毒素、および放射性分子からなる群より選択されてもよい。一実施形態において、化学療法薬物はドキソルビシンである。別の実施形態において、化学療法薬物はビノレルビンである。一実施形態において、癌はＮＳＣＬＣおよびＳＣＬＣからなる群より選択される肺癌である。
【００１８】
本発明は、試料中の癌細胞を検出するための方法を提供し、この方法は、前記試料の癌細胞にペプチドを結合できる条件下で請求項２に記載のペプチドを試料に接触させる工程と、請求項８に記載の抗体を用いて前記試料の前記癌細胞への前記ポリペプチドの結合を検出する工程とを含む。一実施形態において、ペプチドはエピトープを含む融合タンパク質であり、この融合タンパク質のエピトープに対する抗体を用いて融合タンパク質が検出される。別の実施形態において、ペプチドは標識されており、この標識を検出することによってペプチドが検出される。一実施形態において、標識はＦＩＴＣを含む。別の実施形態において、標識はビオチンを含む。
【００１９】
本発明は、本発明のペプチドに結合する生体分子を同定する方法を提供し、この方法は、ペプチドと標的タンパク質とを含む複合体を形成できる条件下で本発明のペプチドを細胞抽出物に接触させる工程と、その複合体を分析して標的タンパク質を同定する工程とを含む。
【００２０】
本発明は、ストリンジェントな条件下で請求項１に記載のポリヌクレオチドまたはその変異体の相補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）にハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供する。
【００２１】
本発明は、請求項１に記載のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【００２２】
本発明は、請求項１に記載のポリヌクレオチドを含むベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００２３】
本発明は、ストリンジェントな条件下で請求項１に記載のポリヌクレオチドまたはその変異体の相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】インビトロファージディスプレイを用いたＮＳＣＬＣ細胞特異的ファージの単離を示す図である。
【図２Ａ】ＮＳＣＬＣ細胞に結合する特異的ファージクローンの同定を示す図である。ＣＬ１−５およびＰＣ１３肺癌細胞におけるＰＣ５−２の結合の視覚化を示す。スケールバー：１０μｍ。
【図２Ｂ】ＮＳＣＬＣ細胞に結合する特異的ファージクローンの同定を示す図である。ＰＣ５−２はＣＬ１−５細胞への結合を示し、ＳＰ５−２合成ペプチドによって阻害される。スケールバー：１０μｍ。
【図２Ｃ】ＮＳＣＬＣ細胞に結合する特異的ファージクローンの同定を示す図である。フローサイトメトリによって測定された、ＣＬ１−５細胞の細胞表面へのＰＣ５−２の結合プロファイル。
【図３Ａ】ＮＳＣＬＣ細胞およびヒト肺癌生検試料とのターゲティングペプチドの結合活性を示す図である。ＦＩＴＣ標識されたＳＰ５−２は５つのＮＳＣＬＣ細胞系に結合するが、正常な上皮細胞（ＮＮＭ）には結合しない。スケールバー：１０μｍ。
【図３Ｂ】ＮＳＣＬＣ細胞およびヒト肺癌生検試料とのターゲティングペプチドの結合活性を示す図である。ＦＩＴＣ標識されたＳＰ５−２はＮＳＣＬＣ細胞系に結合する。
【図３Ｃ】ＮＳＣＬＣ細胞およびヒト肺癌生検試料とのターゲティングペプチドの結合活性を示す図である。ＰＣ５−２およびＳＰ５−２は、肺癌患者からの肺腺癌生検試料に結合する。スケールバー：２５μｍ。
【図４】インビボでのＰＣ５−２の腫瘍ホーミング能力の確認を示す図である。（Ａ）脳、肺および心臓に対する腫瘍におけるＰＣ５−２の回収。（Ｂ）ＰＣ５−２の腫瘍組織に対するターゲティングはＳＰ５−２によって競合的に阻害されるが、対照ペプチドには阻害されない。（Ｃ）ＣＬ１−５由来の異種移植片におけるＰＣ５−２の局在化。スケールバー：２５μｍ。
【図５】ヒト肺癌異種移植片を有するＳＣＩＤマウスの、ＳＰ５−２−Ｌｉｐｏ−ＶｉｎおよびＳＰ５−２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘによる処置を示す図である。（Ａ）ＳＰ５−２−Ｌｉｐｏ−Ｖｉｎで処置されたマウスの腫瘍サイズの変化。（Ｂ）処置されたマウスの体重の変化。（Ｃ）ＳＰ５−２−Ｌｉｐｏ−Ｖｉｎで処置されたマウスの生存曲線。（Ｄ）ＳＰ５−２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘで処置されたマウスの腫瘍サイズの変化。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
表の簡単な説明
表１は、ＮＳＣＬＣ異種移植片から選択されたファージからのファージディスプレイペプチド配列を提供する。
【００２６】
肺癌は、先進国において最も一般的な悪性腫瘍の１つであり、発展途上国においても増加している問題である（Ｂｏｙｌｅら、２０００）。肺癌には以下の２つの主要なタイプがある：小細胞肺癌（ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ：ＳＣＬＣ）および非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。症例の約８０パーセントがＮＳＣＬＣであり、約２０パーセントがＳＣＬＣである（Ｓｃｈｉｌｌｅｒ、２００１）。米国癌学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙ）によると、ＮＳＣＬＣの患者に対する５年生存率は１５％未満である。ＮＳＣＬＣは処置が特に困難であることが判明している（Ｆｒｙら、１９９９；Ｉｈｄｅ、１９９２）。肺の悪性腫瘍は全世界で１００万人を超える死者をもたらし、流行性疾患となっている（Ｊｅｍａｌら、２００２）。肺癌は診断が困難であり、有効な治療法がないことから、生命に関わる病気である。推奨される処置は手術であるが、化学療法および放射線療法は、局在的に進行した疾患を治癒するための処置戦略の一部として、または転移性腫瘍に対する緩和療法としての役割を有する（Ｔｈｏｎｇｐｒａｓｅｒｔら、１９９９）。しかし、特に高用量が投与されるときに細胞毒性薬物特異性がないことと、その結果生じる有毒の副作用とのために、この処置形式の使用はしばしば制限される。よって、悪い予後を与える分子変化を理解し、その情報を用いて診断および患者の管理を改善する必要性が高く、当該技術分野においてはより有効な癌処置が必要とされている。
【００２７】
癌治療法の主要な目的は、正常な組織を残しながら癌細胞を完全に根絶することである。この目的は、悪性の部位における癌細胞の選択的ターゲティングを必要とする。抗癌薬の選択毒性は、疾患組織に達する薬物の用量を増やすか、または正常な組織に達する薬物の用量を減らすことによって増加できるが、理想的には両方が起こる。したがって、抗癌治療のリガンド介在型ターゲティングが探索されている（Ａｌｌｅｎ、２００２）。
【００２８】
リガンド標的療法の基礎をなす基本理念は、癌細胞または癌に関連する内皮、線維芽細胞およびリンパ球への化学療法薬物の送達である。癌細胞およびその微小環境の選択的ターゲティングは、正常な組織よりも標的細胞において固有に発現されるかまたは過剰発現される抗原または受容体またはその他の分子に結合する分子に薬物を関連付けることによって高めることができる（ＡｌｌｅｎおよびＣｕｌｌｉｓ、２００４；Ａｒａｐら、１９９８；ＨｕおよびＫａｖａｎａｇｈ、２００３；ＲｏｓｅｎｋｉｌｄｅおよびＳｃｈｗａｒｔｚ、２００４）。この戦略は、癌細胞への薬物の特異的送達を可能にし、抗癌処置に対する治療効果を増加させる（ＡｌｌｅｎおよびＣｕｌｌｉｓ、２００４；Ａｒａｐら、１９９８；ＨｕおよびＫａｖａｎａｇｈ、２００３；ＲｏｓｅｎｋｉｌｄｅおよびＳｃｈｗａｒｔｚ、２００４）。
【００２９】
細胞毒性薬物、たとえばシクロホスファミド、ドキソルビシン、シスプラチン、パクリタキセル、ビノレルビン、およびその他数ダースの薬物などは、継続的な増殖を行なっている細胞において最も高い致死活性を有し、多くの一般的な腫瘍タイプの細胞は活発に分裂するため、これらの薬物は多くのタイプの癌の処置において有用であった。典型的に細胞毒性の影響に最も弱い正常な組織は、頻繁に分裂する組織、たとえば骨髄、消化管の上皮内壁、および毛包などを含む（ＨｅｒｂｓｔおよびＳａｎｄｌｅｒ、２００４）。化学療法によってＮＳＣＬＣの患者を延命できることは周知である。進行したＮＳＣＬＣに対する化学療法の最近発表された臨床試験では、１９９０年代に開発された薬物、たとえばパクリタキセル、ドセタキセル、ゲムシタビン、ビノレルビン、およびイリノテカンなどが使用された（Ｌｙｎｃｈら、２００４）。したがって、進行したＮＳＣＬＣの高齢の患者に対する現在の標準的な化学療法は、単剤化学療法に対するビノレルビンの使用である（Ｋｅｌｌｙら、２００１）。ビノレルビンは、微小管集合を妨げるビンカアルカロイドである。ビノレルビンの抗腫瘍活性は、主にチューブリンとの相互作用を通じた中期の有糸分裂の阻害によるものと考えられている（Ｒａｍａｌｉｎｇａｍ、２００５）。細胞毒性化学療法はいくつかの癌の処置に対して大きな影響を有したが、ほとんどの固形腫瘍に対するその効果は制限される（Ｐａｒｋｉｎら、２００１）。
【００３０】
本発明者らはファージディスプレイ技術を用いて、ＮＳＣＬＣ細胞系に特異的に結合できるファージクローンを同定した。ペプチドは、癌細胞にホーミングする、または癌細胞を標的とするその能力によっても記載される。「ホーミングする（ｈｏｍｅ）」、「ホーミング（ｈｏｍｉｎｇ）」、「標的（ｔａｒｇｅｔ）」および「ターゲティング（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）」という用語は相互交換可能に用いられる。バイオパニング（ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ）の第５ラウンドにおいては、選択されたファージクローンの結合活性がバイオパニングの第１ラウンドに比べて４０倍増加した。ＥＬＩＳＡによってＣＬ１−５細胞上の特異的結合ファージをスクリーニングした結果、ＰＣ５−２と呼ばれる１つのファージクローンがＣＬ１−５細胞に結合するファージのうち最大量の（選択されたファージの９０％を占めた）ものであることが明らかになった（表１）。
【００３１】
免疫組織化学的研究によって、ＰＣ５−２はＮＳＣＬＣ細胞に対する特異的な結合活性を有することがさらに確認された（図２Ａ）。ＰＣ５−２に提示されるペプチドがＮＳＣＬＣ細胞に特異的に結合できることを確かめるため、本発明者らはその同族の合成ペプチドＳＰ５−２を用いて、細胞上のＰＣ５−２と同じ結合部位を競合させた。蛍光染色およびフローサイトメトリ分析の結果から、ＳＰ５−２はＰＣ５−２のＮＳＣＬＣ細胞への結合を阻害できたことが示された（図２Ｂおよび図２Ｃ）。これらの結果から、ＰＣ５−２はファージ粒子の別の部分ではなくそれが提示するペプチドによって癌細胞と相互作用したことが示される。
【００３２】
何種類のＮＳＣＬＣ細胞系がＳＰ５−２によって認識できる標的分子を発現するかを確かめるため、本発明者らはＦＩＴＣ標識したＳＰ５−２を合成してその結合活性を特徴付けた。免疫蛍光染色およびフローサイトメトリを用いて５つの異なるタイプのＮＳＣＬＣ細胞系を分析したところ、これらの細胞系はＳＰ５−２による細胞表面結合の程度が異なっていることを本発明者らは定めた（図３Ａおよび図３Ｂ）。これら５つのＮＳＣＬＣ細胞系の細胞膜が、ＳＰ５−２によって認識され得る未知の分子を発現することは明らかである。ＳＰ５−２のＮＳＣＬＣ細胞系との結合率を測定したとき、各系のＮＳＣＬＣ細胞の２０．１％から４５．８％がＳＰ５−２によって検出できた（図３Ｂ）。
【００３３】
ＳＰ５−２がＮＳＣＬＣの診断および処置に対する薬物送達剤としての可能性を有するかどうかを確かめるため、本発明者らはビオチン標識したＰＣ５−２を合成し、これを用いて、免疫組織化学によって肺癌患者からの肺腺癌生検試料を検出した。ＰＣ５−２およびビオチン標識したＳＰ５−２はどちらもＮＳＣＬＣ生検試料を検出できた（図３Ｃ）。１０人の患者からの肺腺癌の５０パーセント（５／１０）が、このペプチドによって検出できる標的分子を発現する。
【００３４】
ＰＣ５−２の腫瘍ホーミング能力をテストするために、本発明者らはモデルとしてヒト肺癌異種移植片を有するマウスを用いた。インビボのホーミング実験から、ＰＣ５−２は腫瘍組織に対してより高い親和性を有することが示され、たとえば肺、心臓および脳などの正常な器官へのこのファージの特異的な結合は見出されなかった（図４Ａ）。ペプチド競合的阻害アッセイが行なわれたとき、ＰＣ５−２の腫瘍組織との結合活性は合成ペプチドＳＰ５−２によって阻害された（図４Ｂ）。これらの結果は、この合成ペプチドがそれぞれのファージと同じ結合部位に特異的に結合できたことを示唆するものである。
【００３５】
ホーミングファージの腫瘍塊および正常な器官における局在化を同定するために、肺癌を有するＳＣＩＤマウスにＰＣ５−２を静脈内注射し、次いで組織切片を用いて抗Ｍ１３モノクローナル抗体によってファージを局在化した。ＰＣ５−２の免疫組織化学的局在化から、このファージは腫瘍組織中には局在化したが、脳、肺および心臓組織には局在化しなかったことが示され（図４Ｃ）、ＰＣ５−２は異種移植片腫瘍細胞に特異的に結合できるが正常な組織および細胞には結合しないという本発明者らの結論がさらに支持された。本発明者らの結果から、ＰＣ５−２およびバイオパニングを通じて単離されたその他のペプチドを、リガンド標的療法のための薬物送達剤として、または肺癌もしくはその他の癌に対する診断試薬として用い得ることが示された。
【００３６】
リガンド標的療法を開発するために、本発明者らは化学療法薬物のビノレルビン（ＳＰ５−２−Ｌｉｐｏ−Ｖｉｎ）またはドキソルビシン（ＳＰ５−２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ）を有する、ＳＰ５−２に結合されたリポソームを調製した。ＳＰ５−２−Ｌｉｐｏ−Ｖｉｎは、ＮＳＣＬＣ異種移植片を有するＳＣＩＤマウスにおける治療効果の改善を示し、かつこの動物に対する特定の副作用を有さず（図５Ａおよび図５Ｂ）、臓器毒性の組織学的証拠も有さなかった。ＳＰ５−２−Ｌｉｐｏ−ＶｉｎおよびＬｉｐｏ−Ｖｉｎの腫瘍成長に対する影響を比較すると、治療法の４２日後には腫瘍サイズに顕著な差が見出された（Ｐ＜０．０５）が、Ｌｉｐｏ−Ｖｉｎ処置によっても腫瘍成長は部分的に阻害されていた（図５Ａ）。Ｌｉｐｏ−Ｖｉｎによるこの部分的な阻害は、「漏出性の」微小血管系および腫瘍範囲を支えるリンパ系の障害を通じた、腫瘍組織におけるリポソームの非特異的付加の蓄積によるものかもしれない（Ｈｕａｎｇら、１９９２；Ｊａｉｎ、１９９６；ＭａｔｓｕｍｕｒａおよびＭａｅｄａ、１９８６）。この影響はしばしば、透過性および滞留性向上効果（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ）と呼ばれる（ＭａｔｓｕｍｕｒａおよびＭａｅｄａ、１９８６）。受動的に標的にされるリポソームＬｉｐｏ−Ｖｉｎを用いても癌を処置できるが、しばしば「能動的」ターゲティングと呼ばれる、リガンド標的療法によって可能にされるより高くより選択的な抗癌活性によって、これを改善できる。抗腫瘍効果を高めることに加えて、ＳＰ５−２−Ｌｉｐｏ−ＶｉｎはＬｉｐｏ−Ｖｉｎよりも副作用を減少させた（図５Ｂ）。
【００３７】
本発明者らは、ＳＰ５−２−Ｌｉｐｏ−Ｖｉｎ、Ｌｉｐｏ−ＶｉｎおよびＰＢＳ溶液によって別々に処置した後の動物の生存率を比較し、動物を１０２日間観察した。ＳＰ５−２−Ｌｉｐｏ−Ｖｉｎ処置群の生存率は８０％だったのに対し、Ｌｉｐｏ−Ｖｉｎ処置群の生存率は４０％しかなく、ＰＢＳ処置群では腫瘍マウスの生存は示されなかった（生存率０％）（図５Ｃ）。これらの現象から、Ｌｉｐｏ−ＶｉｎをＳＰ５−２ペプチドと結合することによって腫瘍成長阻害の効果が増し、ＮＳＣＬＣ異種移植片を有するＳＣＩＤマウスの寿命が顕著に長くなることが示唆される。ＳＰ５−２ペプチドはＳＣＩＤマウスにおけるＮＳＣＬＣ異種移植片に対する薬物の効果を高めただけでなく、薬物の毒性も低減した。Ｌｉｐｏ−Ｖｉｎ処置マウスの体重変化は、ＳＰ５−２−Ｌｉｐｏ−ＶｉｎおよびＰＢＳ処置マウスに比べて６０％減少した（図５Ｂ）。ＳＰ５−２−Ｌｉｐｏ−Ｖｉｎによる治療指数の向上は、ＮＳＣＬＣを標的とする薬物送達系の重要な臨床的可能性を示す（図５）。
【００３８】
これらの結果から、本発明者らの腫瘍特異的ホーミングペプチドはターゲティング療法に対する治療薬剤として機能できるだけでなく、イメージングプローブとしてＮＳＣＬＣの腫瘍組織をターゲティングするための分子ツールとしても働き得ることが示される。この標的リガンドは、ＮＳＣＬＣの細胞膜上の標的タンパク質またはその他の分子を同定するためにも有用であり得る。
【００３９】
まとめると、本発明者らは、ファージディスプレイペプチドライブラリを用いてＮＳＣＬＣ細胞をスクリーニングすることによって、インビトロおよびインビボの両方でＮＳＣＬＣ細胞の細胞表面に特異的に結合できる、ＳＰ５−２を含む新規のペプチドを同定した。このターゲティングペプチドは、ビノレルビン、ドキソルビシンまたはその他の薬剤を含有するリポソームに結合でき、その結果全身性の副作用なしに治療効果および生存率を増加できる。ＳＰ５−２ペプチドはＮＳＣＬＣ細胞への薬物送達のための優れた薬剤であると考えられ、ＮＳＣＬＣの処置における薬物送達系として強力な臨床的可能性を有する。
【００４０】
参考文献
【００４１】
【化１】
【００４２】
【化２】
【００４３】
【化３】
【００４４】
【化４】
【００４５】
【化５】
【００４６】
【化６】
【００４７】
【化７】
【００４８】
【化８】
【００４９】
【化９】
【００５０】
【化１０】
定義
本明細書において用いられる用語は以下に示すとおりの通常の意味を有し、明細書の文脈においてさらに理解されてもよい。
【００５１】
「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「核酸」、「核酸分子」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド配列」、および「ヌクレオチド配列」という用語は本明細書において相互交換可能に用いられて、あらゆる長さのヌクレオチドの重合形をいう。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および／またはそれらの類似体もしくは誘導体を含有し得る。本明細書に示されるヌクレオチド配列は５’から３’の方向にリストされる。
【００５２】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は本明細書において相互交換可能に用いられて、あらゆる長さのアミノ酸の重合形を示し、それは天然に発生するアミノ酸、コードおよび非コードアミノ酸、化学的または生化学的に修飾、誘導されたアミノ酸またはデザイナーアミノ酸（ｄｅｓｉｇｎｅｒ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）、アミノ酸類似体、ペプチド模倣薬およびデプシペプチド、ならびに修飾された、環状の、二環状の、デプシ環状の（ｄｅｐｓｉｃｙｃｌｉｃ）またはデプシ二環状の（ｄｅｐｓｉｂｉｃｙｃｌｉｃ）ペプチドバックボーンを有するポリペプチドを含んでもよい。この用語は１本鎖タンパク質およびマルチマーを含む。この用語は、以下のものに結合されたタンパク質も含む：たとえばＦＩＴＣ、ビオチン、ならびに６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１３７Ｃｓ、１８６Ｒｅ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２２３Ｒａ、２４１Ａｍ、および２４４Ｃｍを含むがこれらに限定されない放射性同位元素などの標識；検出可能な生成物を有する酵素（たとえば、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼなど）；蛍光剤および蛍光標識、蛍光発光金属、たとえば１５２Ｅｕ、またはその他のランタニド系列、電気化学発光化合物、化学発光化合物、たとえばルミノール、イソルミノールまたはアクリジニウム塩など；特異的結合分子、たとえば磁性粒子、微小球、ナノ球体など。この用語は、治療薬剤に結合されたペプチドも含む。
【００５３】
この用語は融合タンパク質も含み、この融合タンパク質は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：ＧＳＴ）融合タンパク質、たとえばルシフェリンまたはエクオリン（緑色蛍光タンパク質）などの生物発光タンパク質などの異種アミノ酸配列を有する融合タンパク質、異種および同種リーダー配列を有する融合タンパク質、Ｎ末端メチオニン残基を有する融合タンパク質または有さない融合タンパク質、ペグ化タンパク質、ならびに免疫学的にタグ付けされたタンパク質またはｈｉｓタグ付けされたタンパク質を含むが、これらに限定されない。こうした融合タンパク質はエピトープとの融合も含む。こうした融合タンパク質は、本発明のペプチドのマルチマー、たとえばホモダイマーまたはホモマルチマー、ならびにヘテロダイマーおよびヘテロマルチマーなどを含んでもよい。この用語はペプチドアプタマーも含む。
【００５４】
本発明のペプチドは、ペプチドの生物学的に活性な変異体を含み、こうした変異体は構造が実質的に同様である。ポリペプチド配列の変異体は、対象のポリペプチドに比べて挿入、付加、欠失または置換を含んでいてもよい。ポリペプチド配列の変異体は、生物学的に活性な多形変異体を含む。
【００５５】
本発明のペプチドは、天然に発生するアミノ酸および天然に発生しないアミノ酸を含んでもよい。ペプチドはＤ−アミノ酸、Ｄ−およびＬ−アミノ酸の組合せ、およびさまざまな「デザイナー」または「合成」アミノ酸（たとえば、β−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、およびＮα−メチルアミノ酸など）を含むことによって特別な特性を有してもよい。加えて、ペプチドは環状であってもよい。ペプチドは非古典的アミノ酸を含むことによって特定の立体構造モチーフを導入してもよい。あらゆる公知の非古典的アミノ酸が用いられてもよい。以下を含むがそれらに限定されないアミノ酸類似体およびペプチド模倣薬をペプチドに組み込むことによって、特定の二次構造を誘導または有利にしてもよい：ＬＬ−Ａｃｐ（ＬＬ−３−アミノ−２−プロペニドン（ｐｒｏｐｅｎｉｄｏｎｅ）−６−カルボン酸）、β−ターンを誘導するジペプチド類似体；β−シートを誘導する類似体；β−ターンを誘導する類似体；α−へリックスを誘導する類似体；γ−ターンを誘導する類似体；Ｇｌｙ−Ａｌａターン類似体；アミド結合アイソスター；またはテトラゾール（ｔｒｅｔｒａｚｏｌ）など。
【００５６】
ペプチドの末端部にデスアミノまたはデスカルボキシ残基を組み込むことによって、末端アミノ基またはカルボキシル基をなくして、プロテアーゼに対する感受性を低下させるか、または立体構造を制限してもよい。Ｃ末端官能基は、アミド、アミド低級アルキル、アミドジ（低級アルキル）、低級アルコキシ、ヒドロキシ、およびカルボキシ、ならびにそれらの低級エステル誘導体、ならびにそれらの医薬的に許容できる塩を含む。
【００５７】
「リポソーム」という用語は、内部の水性空間を囲む外側の脂質二重層または多層の膜を含む組成物をいう。この用語は多重膜リポソームを含み、これは一般的に約１マイクロメートルから約１０マイクロメートルの範囲の直径を有し、水相の層と交互になった２から数百の同心の脂質二重層を含む。この用語は、単一脂質層からなり、一般的に約２０ナノメートルから約４００ナノメートル（ｎｍ）、約５０ｎｍから約３００ｎｍ、約３００ｎｍから約４００ｎｍ、または約１００ｎｍから約２００ｎｍの範囲の直径を有する単層膜の小胞を含む。この用語は、約６５ｎｍから約７５ｎｍの直径を有するリポソームも含む。
【００５８】
「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、特定の抗原を認識して結合できる、たとえば免疫系によって、合成によって、または組換えによって生成されるものなどのタンパク質を示す。抗体は当該技術分野において一般的に公知であり、当該技術分野において公知の方法によって調製できる。
【００５９】
「エピトープ」とは抗体が結合する分子であり、それはポリペプチド中のアミノ酸残基の隣接する配列であってもなくてもよく、他の化学構造を有する糖および／または分子を含んでもよい。
【００６０】
ポリヌクレオチドの状況における「特異的に結合する」という用語は、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションを示す。ＤＮＡ／ＤＮＡおよびＤＮＡ／ＲＮＡ両方のハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーを増大させる条件は、当該技術分野において広く公知であり公表されている。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例には、約６５〜７０℃での４×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）におけるハイブリダイゼーション、または約４２〜５０℃での４×ＳＳＣに５０％ホルムアミドを加えたものにおけるハイブリダイゼーションの後に、約６５〜７０℃での１×ＳＳＣにおける１回またはそれ以上の洗浄が行なわれるものが含まれる。
【００６１】
「リガンド」という用語は、受容体を含む、別の分子に結合する分子を示す。
【００６２】
「宿主細胞」とは、あらゆる組換えベクターまたは単離されたポリヌクレオチドのレシピエントとなり得るかまたはレシピエントであった個々の細胞または細胞培養物である。宿主細胞は単一の宿主細胞の子孫を含み、その子孫は、自然の、偶発的な、または計画的な突然変異および／または変化のために、必ずしも（形態または全体のＤＮＡ相補体が）元の親細胞と完全に同一でないことがある。宿主細胞は、インビボまたはインビトロで本発明の組換えベクターまたはポリヌクレオチドによってトランスフェクトまたは感染された細胞を含む。本発明の組換えベクターを含む宿主細胞は、「組換え宿主細胞」と呼ばれてもよい。
【００６３】
「試料」とは、患者に由来するあらゆる生体試料である；この用語は、生物学的な流体、たとえば血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液、涙、唾液、リンパ、透析液、洗浄液、精液、およびその他の液体サンプルなど、ならびに生体由来の細胞および組織を含むがそれらに限定されない。この用語は細胞またはその細胞に由来する細胞およびその子孫も含み、それは培養物中の細胞、細胞上清および細胞溶解物を含む。この用語はさらに、器官または組織培養由来の流体、組織生検サンプル、腫瘍生検サンプル、糞便サンプル、および生理学的組織から抽出された流体、ならびに固体組織から分離された細胞、組織切片、および細胞溶解物を含む。この定義は、たとえば試薬による処理、可溶化、またはポリヌクレオチドもしくはポリペプチドなどの特定の成分に対する濃縮などによって、調達後にあらゆる態様で処理されたサンプルを含む。この用語には、患者サンプルの誘導体および画分も含まれる。患者サンプルは、診断、予後またはその他のモニタリングアッセイに用いられてもよい。試料はヒトの患者またはヒト以外の哺乳動物からのものであってもよい。
【００６４】
本明細書において用いられる「処置」は、ヒトを含む哺乳動物における疾患に対する治療のあらゆる投与または適用を含み、それは、たとえば退縮をもたらすか、または機能の欠失、欠落もしくは障害を回復もしくは修復することなどによる疾患の阻害、疾患の進行の阻止、もしくは疾患の緩和；または非効率的なプロセスの刺激を含む。この用語は、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを含み、ヒトを含む哺乳動物における病理学的状態または障害のあらゆる処置を含む。その効果は、障害もしくはその症状を完全もしくは部分的に防ぐという観点から予防的であってもよく、ならびに／または、障害および／もしくはその障害に起因し得る悪影響に対する部分的もしくは完全な治癒という観点から治療的であってもよい。よって本発明は、処置および予防の両方を提供する。本発明は以下を含む：（１）障害を起こす可能性があるがまだ症状が出ていない対象において、障害の発生または再発を防ぐこと、（２）障害の進行を阻止するなど、障害を阻害すること、（３）障害または少なくともそれに伴う症状を停止または終結させることによって、宿主がもう障害またはその症状に苦しまないようにすること、たとえば、機能の欠失、欠落もしくは障害を回復もしくは修復するか、または非効率的なプロセスを刺激することなどによって、障害またはその症状の退縮をもたらすことなど、または（４）障害またはそれに伴う症状を緩和、軽減または改善すること、ここで改善とは広い意味で用いられ、少なくとも、炎症、痛みおよび／または腫瘍サイズなどのパラメータの大きさの低減を示す。
【００６５】
「医薬的に許容できる担体」とは、あらゆる従来型の非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、封入材料（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｎｇ ｍａｔｅｒｉａｌ）、調合補助剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ａｕｘｉｌｉａｒｙ）、または賦形剤を示す。医薬的に許容できる担体は、使用される用量および濃度ではレシピエントに対して非毒性であり、処方物の他の成分と適合できる。
【００６６】
本明細書における「医薬組成物」とは、当該技術分野において従来のものであって、かつ治療、診断または予防の目的のための対象への投与に適した、たとえば医薬的に許容できる担体または賦形剤などの担体を通常含有する混合物を示す。医薬組成物は、細胞または培養液中にポリペプチドまたはポリヌクレオチドが存在する細胞培養物を含んでもよい。たとえば、経口投与のための組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放性処方物、口腔リンス液、または粉末を形成してもよい。
【００６７】
「疾患」とは、医療介入を必要とするか、または医療介入を行なうことが望ましいようなあらゆる状態、感染症、障害または症候群を示す。こうした医療介入は、処置、診断および／または予防を含み得る。
【００６８】
「癌」とは、あらゆる異常な細胞または組織の成長であり、たとえば悪性、前悪性または良性の腫瘍などである。癌は、細胞の無制御の増殖を特徴とし、それは周囲の組織に侵入することもしないこともあるし、新たな身体部位に転移することもしないこともある。癌は、上皮細胞の癌である癌腫を含む；癌腫は、扁平上皮癌、腺癌、黒色腫、および肝癌を含む。癌は、間充織由来の腫瘍である肉腫も含む；肉腫は、骨原性肉種、白血病およびリンパ腫を含む。癌は、１つまたはそれ以上の新生物細胞型を含んでもよい。癌という用語は、肺癌、結腸癌、乳癌、前立腺癌、肝癌、膵癌、および口腔癌を含む。
【００６９】
細胞系
有用な細胞系は、Ａ５４９、ヒト肺扁平上皮癌系、ＣＬ１−５、高転移性ヒト肺腺癌系、Ｈ２３、ヒト肺腺癌系、Ｈ４６０、ヒト肺大細胞癌系、ＰＣ１３、ヒト肺癌系、ＮＰＣ−ＴＷ０１、ヒト上咽頭癌系、ＳＡＳ、ヒト口腔扁平上皮癌系、ＰａＣａ、ヒト膵臓癌、ＮＮＭ、ヒト正常鼻粘膜上皮、および線維芽細胞を含む。Ａ５４９、Ｈ２３、Ｈ４６０、ＰＣ１３、ＰａＣａおよびＳＡＳは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能である。ＣＬ１−５およびＮＰＣ−ＴＷ０１細胞系は、それぞれ（Ｃｈｕら、１９９７）および（Ｌｉｎら、１９９０）によって樹立された。
【００７０】
ペプチドの調製
本発明のペプチドは、当該技術分野において公知の方法を用いて発現できる。本発明のペプチドを生産するためには、細胞に基づく方法および無細胞の方法が好適である。一般的に、細胞に基づく方法は、インビトロで宿主細胞に核酸構築物を導入する工程と、発現に適した条件下で宿主細胞を培養する工程と、次いで培養液もしくは（たとえば、宿主細胞を破壊することなどによって）宿主細胞のいずれかから、またはその両方からペプチドを採取する工程とを含む。本発明は、当該技術分野において周知の無細胞インビトロ転写／翻訳方法を用いてペプチドを生成する方法も提供する。
【００７１】
好適な宿主細胞は原核細胞または真核細胞を含み、たとえば細菌、酵母、真菌、植物、昆虫および哺乳動物の細胞などを含む。
【００７２】
典型的には、異種ペプチドは、修飾されていても修飾されていなくても、上述のとおりに単独で、または融合タンパク質として発現されてもよく、分泌シグナルだけでなく分泌リーダー配列を含んでもよい。本発明の分泌リーダー配列は、特定のタンパク質をＥＲに向けてもよい。ＥＲは膜結合タンパク質をその他のタンパク質から分離する。一旦ＥＲに局在化されると、タンパク質はさらに、分泌小胞を含む小胞；細胞膜、リソソーム、およびその他の小器官への分配のためにゴルジ体に向けられてもよい。
【００７３】
加えて、ペプチドにペプチド部分および／または精製タグが加えられてもよい。こうした領域は、ポリペプチドの最終的調製の前に取除かれてもよい。ポリペプチドにペプチド部分を付加することによって、特に分泌または排出を誘発したり、安定性を改善したり、精製を容易にしたりすることは、当該技術分野においてよく知られた慣用技術である。好適な精製タグは、たとえばＶ５、ポリヒスチジン、アビジンおよびビオチンなどを含む。ペプチドをビオチンなどの化合物に結合することは、当該技術分野において周知の技術を用いて達成できる。（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ編（１９９６）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ；Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）。ペプチドは、当該技術分野において公知の技術を用いて、放射性同位元素、毒素、酵素、蛍光標識、コロイド金、核酸、ビノレルビン、およびドキソルビシンにも結合できる。（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ編（１９９６）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ；Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｓｔｅｆａｎｏら（２００６）Ａ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｏｆ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ｗｉｔｈ ｌａｃｔｏｓａｍｉｎａｔｅｄ ａｌｂｕｍｉｎ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ｄｒｕｇ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ａｌｌ ｔｈｅ ｆｏｒｍｓ ｏｆ ｒａｔ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｇｒａｄｅ．Ｌｉｖｅｒ Ｉｎｔ．２６：７２６−３３）。毒素は当該技術分野において公知のものである。ＫｒｅｉｔｍａｎおよびＰａｓｔａｎ、Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ．７：１３０１−１１（２００６）。
【００７４】
本発明における使用のために好適な融合パートナーは、たとえば、フェチュイン、ヒト血清アルブミン、Ｆｃ、および／またはそれらの断片の１つもしくはそれ以上などを含む。たとえばポリエチレングリコール結合体などの結合タンパク質も提供される。
【００７５】
本発明のペプチドは、当該技術分野において公知の技術を用いて化学的に合成することもできる（例、Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、３１０：１０５ １１１（１９８４）；Ｇｒａｎｔ編（１９９２）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａ Ｕｓｅｒｓ Ｇｕｉｄｅ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．；米国特許第６，９７４，８８４号を参照）。たとえば、ペプチド合成機の使用によって、または当該技術分野において公知の固相法の使用を通じて、ポリペプチドの断片に対応するポリペプチドを合成できる。
【００７６】
さらに、所望であれば、非古典的アミノ酸または化学的アミノ酸類似体を置換または追加としてポリペプチド配列に導入してもよい。非古典的アミノ酸は、一般的なアミノ酸のＤ異性体、２，４−ジアミノ酪酸、ａ−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、ｇ−Ａｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ｂ−アラニン、フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸、たとえばｂ−メチルアミノ酸、Ｃａ−メチルアミノ酸、Ｎａ−メチルアミノ酸など、および一般的なアミノ酸類似体を含むがそれらに限定されない。さらに、アミノ酸はＤ（右旋性（ｄｅｘｔｒｏｒｏｔａｒｙ））またはＬ（左旋性（ｌｅｖｏｒｏｔａｒｙ））であってもよい。
【００７７】
本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィ、リン酸セルロースクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、およびレクチンクロマトグラフィを含むがそれらに限定されない標準的な方法によって、化学合成および組換え細胞培養物から回収および精製されてもよい。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィ（「ＨＰＬＣ」）が精製に使用される。単離および／または精製の際にポリペプチドが変性したときは、タンパク質をリフォールディングするための周知の技術を用いて活性の立体構造を再生してもよい。
【００７８】
本発明のペプチドまたはペプチド模倣薬（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）は、さまざまな親水性ポリマーの１つまたはそれ以上で修飾するか、またはそれと共有結合させることによって、ペプチドの可溶性および循環半減期を増加させることができる。ペプチドに結合させるために好適な非タンパク質親水性ポリマーは、ポリアルキルエーテル、たとえばポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールによって例示されるものなど、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリオキシアルケン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、セルロースおよびセルロース誘導体、デキストランおよびデキストラン誘導体を含むがこれらに限定されない。一般的に、こうした親水性ポリマーの平均分子量は、約５００ダルトンから約１００，０００ダルトン、約２，０００ダルトンから約４０，０００ダルトン、または約５，０００ダルトンから約２０，０００ダルトンの範囲である。ペプチドは、以下において示される方法のいずれかを用いて、こうしたポリマーによって誘導化されるか、またはそれらに結合されてもよい（Ｚａｌｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．（１９９５）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、６：１５０−１６５；Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉ，Ｃ．ら（１９９５）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、６：６２−６９；米国特許第４，６４０，８３５号；第４，４９６，６８９号；第４，３０１，１４４号；第４，６７０，４１７号；第４，７９１，１９２号、第４，１７９，３３７号、またはＷＯ９５／３４３２６号）。
【００７９】
リポソームの調製
リポソームを調製するためのさまざまな方法が当該技術分野において公知であり、そのいくつかはＬｉｃｈｔｅｎｂｅｒｇおよびＢａｒｅｎｈｏｌｚによって、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ、第３３巻、３３７−４６２（１９８８）に記載されている。以前に記載される薄膜水和反応（ｔｈｉｎ ｆｉｌｍ ｈｙｄｒａｔｉｏｎ）と、反復押出し（ｒｅｐｅａｔｅｄ ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ）との標準的な方法の組合せによって、小単層膜リポソーム（ｓｍａｌｌ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ：ＳＵＶ、サイズ＜１００ｎｍ）を調製できる（Ｔｓｅｎｇら、１９９９）。特にリポソームによるＤＮＡの封入を含む調製法、およびリポソーム介在型トランスフェクションへの直接適用を有する方法は、ＨｕｇおよびＳｌｅｉｇｈｔら（１９９１）によって記載されている。リポソームを作成する方法は、米国特許第６，３５５，２６７号および米国特許第６，６６３，８８５号にも開示されている。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ：ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物による逆位相蒸着法によって生成できる。リポソームを定められたポアサイズのフィルタから押出すことによって、所望の直径のリポソームを得る。
【００８０】
リポソームは、たとえばＴａｉｗａｎ Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｔａｉｐｅｉ Ｔａｉｗａｎなどの供給源から商業的に入手することもできる。付加的な商業的に入手可能なリポソームは、ＴＬＣ−Ｄ９９、Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ、Ｄｏｘｉｌ、ＤａｕｎｏＸｏｍｅ、ＡｍＢｉｓｏｍｅ、ＡＢＥＬＣＥＴ、ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｃｅ（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）、ならびにＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥおよびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎを含む。
【００８１】
本発明のリポソームは、リン脂質から調製されることが最も多いが、疎水性および親水性部分の両方を有する類似の分子形および寸法のその他の分子が用いられてもよい。本発明の目的に対して、すべてのこうした好適なリポソーム形成分子は、本明細書において脂質と呼ばれる。リポソームの調製には、１つまたはそれ以上の天然に発生する脂質化合物および／または合成脂質化合物が用いられてもよい。
【００８２】
リポソームは、親水性基の選択によって、アニオン、カチオンまたは中性であってもよい。たとえば、リン酸基または硫酸基を有する化合物が用いられるときには、得られるリポソームはアニオンになる。アミノを含有する脂質が用いられるときには、リポソームは正電荷を有し、カチオンリポソームとなる。
【００８３】
本発明において有用な最初のリポソームを形成するための代表的な好適なリン脂質または脂質化合物は、リン脂質関連材料、たとえばホスファチジルコリン（レシチン）、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、ホスファチジルエタノールアミン（ケファリン）、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、リン酸ジセチル、ホスファチジルコリン、およびジパルミトイルホスファチジルグリセロールなどを含むが、これらに限定されない。付加的な非リン（ｎｏｎ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓ）脂質は、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、アセチルパルミチン酸塩、グリセロールリシノール酸塩、ヘキサデシルステアリン酸塩（ｈｅｘａｄｅｃｙｌ ｓｔｅｒａｔｅ）、イソプロピルミリステート、両性アクリルポリマー、脂肪酸、脂肪酸アミド、コレステロール、コレステロールエステル、ジアシルグリセロール、ジアシルグリセロールコハク酸塩などを含むが、これらに限定されない。
【００８４】
本発明における使用のためのリポソーム調製物は、カチオン（正に荷電した）調製物、アニオン（負に荷電した）調製物、および中性調製物を含む。
【００８５】
化合物のリポソーム内への遠隔負荷（ｒｅｍｏｔｅ ｌｏａｄｉｎｇ）には、膜貫通勾配の形成が用いられる（ＣｅｈおよびＬａｓｉｃ、１９９５）。この方法は、リポソーム内に負荷すべき化合物とボロン酸化合物とを懸濁リポソームとともにインキュベートすることによって、リポソーム内に化合物を蓄積させる工程を含む（Ｃｅｈ Ｂ．およびＬａｓｉｃ Ｄ．Ｄ．、１９９５；米国特許第６，０５１，２５１号）。
【００８６】
リン酸塩アッセイを用いてリポソーム濃度を定めてもよい。リン酸塩アッセイの１つは、モリブデン酸塩とマラカイトグリーン色素との相互作用に基づくものである。主要な原理は、無機リン酸塩とモリブデン酸塩とを反応させて無色の非還元リンモリブデン酸塩複合体を形成することを含み、この複合体は酸性条件下で還元されるときに青色の複合体に変えられる。リンモリブデン酸塩はマラカイトグリーンと複合体を形成すると２０倍から３０倍多く発色する。最終生成物である還元された緑色の可溶性複合体は、６２０ｎｍにおける吸光度によって測定され、これは溶液中の無機リン酸塩の直接的な尺度である。
【００８７】
いくつかの実施形態において、リポソームは、当該技術分野において多様なものが公知である医薬的に許容できる担体、賦形剤および希釈剤を有する処方物中に与えられる。これらの医薬的担体、賦形剤および希釈剤は、ＵＳＰ医薬賦形剤リストにリストされるものを含む。ＵＳＰ ａｎｄ ＮＦ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，Ｌｉｓｔｅｄ ｂｙ Ｃａｔｅｇｏｒｉｅｓ、ｐ．２４０４−２４０６、ＵＳＰ ２４ ＮＦ １９、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．（ＩＳＢＮ１−８８９７８８−０３−１）。医薬的に許容できる賦形剤、たとえばビヒクル、アジュバント、担体または希釈剤は、一般に容易に入手可能である。さらに、医薬的に許容できる補助的物質、たとえばｐＨ調整および緩衝剤、張度調整剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ ａｄｊｕｓｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、安定剤、湿潤剤などは、一般に容易に入手可能である。
【００８８】
好適な担体は、水、デキストロース、グリセロール、食塩水、エタノール、およびそれらの組合せを含むがこれらに限定されない。担体は、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、または処方物の効果を高めるアジュバントなどの付加的な薬剤を含有してもよい。局所的担体は、液体石油、イソプロピルパルミテート、ポリエチレングリコール、エタノール（９５％）、水中のポリオキシエチレンモノラウレート（５％）、または水中のラウリル硫酸ナトリウム（５％）を含む。必要に応じて他の材料、たとえば抗酸化剤、湿潤剤、粘性安定剤、および類似の薬剤などが加えられてもよい。たとえばＡｚｏｎｅなどの経皮浸透促進剤が含まれてもよい。
【００８９】
医薬用量の形において、本発明の組成物は医薬的に許容できる塩の形で投与されてもよく、さらに単独で用いられても、または他の医薬的に活性の化合物との適切な結合および組合せにおいて用いられてもよい。対象組成物は、可能な投与のモードに従って調合される。
【００９０】
処置の方法
治療薬を含む本発明のペプチドまたはリポソームは、全身的な注射、たとえば静脈注射などによって；または関連部位への注射または適用、たとえば腫瘍への直接注射、もしくは手術中にその部位が露出しているときにはその部位への直接適用などによって；または、たとえば皮膚に障害があるときなどには局所適用によって、処置を必要とする対象に投与されてもよい。
【００９１】
本発明のペプチドまたはリポソームは、単独療法として用いられてもよい。代替的には、本発明のペプチドまたはリポソームは、癌を処置するための標準的な化学療法または放射線療法と組合せて用いられてもよい。
【００９２】
本発明のペプチドは、処置のために抗体を癌細胞にターゲティングするために用いられてもよい。一実施形態においては、本発明のペプチドが処置を必要とする対象に投与された後に、そのペプチドに特異的に結合する抗体が投与される。ターゲティングされる抗体は、抗体依存性の細胞毒性または相補体依存性の細胞毒性を媒介してもよく、または標的分子の基礎をなす機能を変更してもよい。こうした抗体は抗体結合体の形で用いられることによって、標的組織に治療効果を有する薬剤を直接送達してもよい。こうした薬剤は、放射性核種、毒素、化学療法薬物および抗血管新生化合物を含む。
【００９３】
薬剤の投与は、経口、口腔、経鼻、直腸、非経口、腹膜内、皮内、経皮、皮下、静脈内、動脈内、心臓内、心室内、頭蓋内、気管内、および髄腔内投与などを含むさまざまな方法で、または移植もしくは吸入による別様で達成されてもよい。よって、対象組成物は固体、半固体、液体または気体の形の調製物、たとえば錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、溶液、座薬、注射薬、吸入剤、およびエアロゾルなどに処方されてもよい。以下の方法および賦形剤は単なる例示であって、いかなる態様でも限定するものではない。
【００９４】
好適な賦形剤ビヒクル媒体は、たとえば水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組合せである。加えて、所望であれば、ビヒクルは少量の補助的物質、たとえば湿潤剤または乳化剤またはｐＨ緩衝剤などを含有してもよい。こうした投薬形態を調製する実際の方法は、当業者に公知であるか、または明らかになる。いずれにせよ、投与される組成物または処方物は、処置される対象における所望の状態を達成するために適切な量の薬剤を含有する。
【００９５】
本発明のリポソームまたはペプチドは、水性溶媒または非水系溶媒、たとえば植物油またはその他の類似の油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸またはプロピレングリコールのエステルなどに；所望であれば従来の添加剤、たとえば溶解剤、等張剤、懸濁剤、乳化剤、安定剤、および保存剤などとともに、溶解、懸濁または乳化させることによって、注射のための調製物に処方されてもよい。当該技術分野における従来どおりの、経口または非経口送達のためのその他の処方物が用いられてもよい。
【００９６】
本発明のリポソームまたはペプチドは、癌の処置および血管新生の阻害に用いられてきたさまざまな薬物の１つまたはそれ以上を含んでもよく、その薬物は、ビノレルビン、シスプラチン、ゲムシタビン、パクリタキセル、エトポシド、Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（ミトキサントロン）、アクチノマイシンＤ、カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｈｅｃｉｎ）（またはその水溶性誘導体）、メトトレキサート、マイトマイシン（たとえばマイトマイシンＣなど）、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、シクロホスファミド、ならびに抗新生物性抗生物質、たとえばドキソルビシンおよびダウノマイシンなど、またはたとえばＤｅ Ｖｉｔａら、２００１などに記載されるその他のものを含むが、それらに限定されない。リポソームまたはペプチドは、細胞毒性薬物、オリゴヌクレオチド、毒素および放射性分子も含んでもよい。リポソームまたはペプチドは、（Ｎｇら、２００６）に記載される抗ＶＥＧＦアプタマーなどの化合物も含んでもよい。
【００９７】
癌療法において用いられる薬物は、癌細胞に対する細胞毒性もしくは細胞増殖抑制の効果を有してもよく、または悪性細胞の増殖を低減させてもよい。癌処置に用いられる薬物はペプチドであってもよい。本発明のリポソームまたはペプチドは、放射線療法と組合されてもよい。本発明のリポソームまたはペプチドは、（Ｄｅ Ｖｉｔａら（２００１））に記載される治療アプローチとともに付属的に用いられてもよい。本発明のリポソームまたはペプチドと第２の抗癌剤とが癌細胞に対して相乗効果を及ぼすような組合せに対しては、第２の薬剤の用量は、第２の薬剤が単独で投与されるときの標準的な用量よりも減らされてもよい。癌細胞の感受性を増加させるための方法は、本発明のリポソームまたはペプチドを、癌細胞の感受性を高めるために有効な量の化学療法の抗癌薬と共投与する（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）工程を含む。共投与は同時投与であっても、または非同時投与であってもよい。本発明のリポソームまたはペプチドは、処置療法の過程において他の治療薬剤とともに投与されてもよい。一実施形態において、本発明のリポソームまたはペプチドと、他の治療薬剤との投与は連続的である。適切な時間経過は、患者の病気の性質および患者の状態などの因子に従って医師によって選択されてもよい。
【００９８】
診断方法
疾患特異的バイオマーカの検出は、有効なスクリーニング戦略を提供する。早期の検出は早期の診断を与えるだけでなく、癌の場合には多形性をスクリーニングし、手術後の残余腫瘍細胞および潜在性の転移、すなわち腫瘍再発の初期指標を検出することを可能にできる。よって疾患特異的バイオマーカの早期検出は、診断前、処置の最中および寛解期の患者における生存性を改善できる。
【００９９】
本発明のペプチドは、疾患に対する診断または予後として用いられてもよい。ペプチドは、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、蛍光、免疫蛍光、免疫組織化学、またはオートラジオグラフィを含むがこれらに限定されないいくつかの方法で、診断として用いられてもよい。
【０１００】
本発明の抗体は、癌を検出するために本発明のペプチドと組合せて用いられてもよい。いくつかの実施形態において、そのアッセイは、癌細胞に結合した本発明のペプチドと抗体との結合を検出する結合アッセイである。対象ポリペプチドまたは抗体は固定されてもよく、対象ポリペプチドおよび／または抗体は検出可能になるよう標識されてもよい。たとえば、抗体は直接標識されても、または標識された二次抗体によって検出されてもよい。すなわち、抗体に対する好適な検出可能な標識は、目的のタンパク質に対する抗体を標識する直接標識と、目的のタンパク質に対する抗体を認識する抗体を標識する間接標識とを含む。別の実施形態において、ペプチドは標識を含み、ペプチドの組織への結合は標識の存在をアッセイすることによって検出される。
【０１０１】
スクリーニング方法
本発明は、本発明のペプチドに結合する生体リガンドを同定するための方法を提供する。
【０１０２】
方法の１つにおいて、本発明のペプチドは、２ハイブリッドアッセイまたは３ハイブリッドアッセイ（例、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓら（１９９３）Ｃｅｌｌ、７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌら（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１４：９２０−９２４；Ｉｗａｂｕｃｈｉら（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、８：１６９３−１６９６；およびＳｕｔｅｒら（２００６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、４０：６２５−４４を参照）における「ベイトタンパク質」として用いられることによって、本発明のペプチドと結合または相互作用する他のタンパク質を同定することができる。
【０１０３】
別の方法においては、本発明のペプチドが細胞抽出物とともにインキュベートされて、本発明のペプチドに結合する分子が同定される。方法の１つにおいて、本発明のペプチドはＨＰＬＣカラムなどの固体支持上に固定され、本発明のペプチドの標的分子への結合を促進する条件下で細胞抽出物が固定ペプチドに露出される。結合した分子は溶出され、質量分析法などの標準的な技術を通じて同定される。
【０１０４】
標的タンパク質のアフィニティ精製
肺癌細胞からタンパク質を溶解緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３０μｇ／ｍｌのＤＮアーゼ、１％のノニデットＰ−４０、およびプロテアーゼ阻害剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｔａｂｓ；Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））によって４℃にて３０分間抽出する。１５，０００×ｇでの２０分間の遠心分離によって、タンパク質溶解物から．残屑を取除く。溶解物を最初に対照ペプチドを含有する１ｍｌカラム上で予め清澄にし、ＳＰ５−５２またはＳＰ５−２ペプチド固定アフィニティカラムの第２の１ｍｌカラムにフロースルーを直接添加する。カラムを洗浄して溶出する。単離されたタンパク質の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８％ポリアクリルアミド）によってモニタし、銀染色によって視覚化する。所望のタンパク質バンドを、トリプシンによるインゲル（ｉｎ−ｇｅｌ）消化のためにゲルから切出す。その結果得られるポリペプチドをさらに質量分析法によって分析する。
【実施例】
【０１０５】
実施例は本発明を純粋に例示することが意図され、したがっていかなる態様でも本発明を制限すると考えられるべきでなく、さらに上記において議論した本発明の詳細な局面および実施形態をも説明するものである。
【０１０６】
実施例１．ファージディスプレイバイオパニング
Ａ５４９、ＣＬ１−５、Ｈ２３およびＨ４６０細胞を、２ｇの重炭酸塩、１リットル当り４０ｍｇのカナマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン、および１０％のウシ胎児血清を補ったＲＰＭＩ１６４０中で、９５％の空気および５％のＣＯ２（ｖ／ｖ）の加湿された環境下で３７℃にて生育した。ＮＰＣ−ＴＷ０１、ＰＣ１３、ＳＡＳ、ＰａＣａ、ＮＮＭ、および線維芽細胞を、３．７ｇの重炭酸塩、１リットル当り４０ｍｇのカナマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン、および１０％のウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ中で、９０％の空気および１０％のＣＯ２（ｖ／ｖ）の加湿された環境下で３７℃にて生育した。
【０１０７】
ＮＳＣＬＣ、ＣＬ１−５細胞を無血清ＲＰＭＩで洗浄し、次いでブロッキング緩衝液（１％ＢＳＡを含有する無血清ＲＰＭＩ）で４℃にて３０分間ブロックした。細胞をＵＶ処理した不活性対照ヘルパーファージ（挿入なしのファージ）とともに４℃にて１時間インキュベートした。非特異的結合を阻害した後、ファージディスプレイペプチドライブラリ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、ＭＡ、ＵＳＡ）を加えて４℃にて１時間インキュベートした。結合したファージを、氷上の溶解緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ ７．５、１％のＮＰ−４０、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ）によって溶出した。この溶出されたファージプールを、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＥＲ２７３８培養物（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、ＭＡ、ＵＳＡ）中で増殖させて力価測定した。回収されたファージを、その後のラウンドのパニングに対する入力として用いた。第５ラウンドの選択後の溶出ファージを、ＬＢ／ＩＰＴＧ／Ｘ−Ｇａｌプレート上で力価測定した。ファージ力価測定のために、５ｍｌのＬＢにＥＲ２７３８の単一コロニーを接種し、対数期の中間部（ＯＤ６００約０．５）まで振とうしながらインキュベートした。培養物が対数期の中間部に達したとき、２００μｌの培養物をミクロチューブに分配し、各希釈の１０μｌを各チューブに加えた後にチューブを迅速にボルテックスして、室温で５分間インキュベートした。感染した細胞を１つずつＡｇａｒｏｓｅ Ｔｏｐ（Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｏｃｋｌａｎｄ，Ｉｎｃ．、ＭＥ、ＵＳＡ）を含有する培養管に移し、迅速に混合して直ちに予め温めたＬＢ／ＩＰＴＧ／Ｘ−Ｇａｌプレートの上に注ぐ。
【０１０８】
９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｆａｌｃｏｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）に癌細胞および対照細胞を別々に播種した。細胞を無血清ＤＭＥＭで洗浄し、次いでブロッキング緩衝液でブロックした。次いで、個々のファージ粒子を細胞被覆プレートに加えて４℃にて２時間インキュベートした後、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を結合したマウス抗Ｍ１３モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｓｗｅｄｅｎ）とともにインキュベートし、次いでペルオキシダーゼ基質ｏ−フェニレンジアミン二塩化水素化物（ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ：ＯＰＤ；Ｓｉｇｍａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）とともにインキュベートした。４９０ｎｍにてマイクロプレートリーダを用いて反応を読取った。
【０１０９】
選択されたファージクローンをＤＮＡ配列決定によってさらに分析した。精製ファージのＤＮＡ配列を、自動ＤＮＡ配列決定装置（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてジデオキシヌクレオチド鎖終止法に従って決定した。配列決定は、ｐＩＩＩ遺伝子配列に対応するプライマ５’−ＣＣＣＴＣＡＴＡＧＴＴＡＧＣＧＴＡＡＣＧ−３’［配列番号２１］によって行なわれた。ファージディスプレイペプチド配列は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）プログラムを用いて翻訳およびアラインメントされた。
【０１１０】
４ラウンドのバイオパニングの後、ＮＳＣＬＣ、ＣＬ１−５細胞から溶出したファージの力価は第１ラウンドの３０倍に増加し、第５ラウンドの選択では４０倍に増加した（図１）。第３から第５バイオパニングラウンドからの濃縮ファージをランダムに選択して配列決定した。本発明者らはより高いＣＬ１−５結合活性を有するファージクローンの配列も決定した。
【０１１１】
ファージＰＣ３−１、ＰＣ４−１、ＰＣ４−５、ＰＣ５−２およびＰＣ５−４は、コンセンサスモチーフのトリプトファン（Ｗ）−スレオニン（Ｔ）／チロシン（Ｙ）−チロシン（Ｙ）（表１）を提示する。興味深いことに、ＰＣ５−２は第３（ＰＣ３−１）、第４（ＰＣ４−１）および第５（ＰＣ５−２）バイオパニングラウンドにおいても現れた。各バイオパニングラウンドにおけるＰＣ５−２の頻度は、第３サイクルの２０％（１／５）から第５サイクルの９０％（２７／３０）まで増加した（表１）。本発明者らはさらなる研究のために、ペプチドＴＤＳＩＬＲＳＹＤＷＴＹ（ＳＰ５−２）に注目した。
【０１１２】
実施例２．免疫組織化学による癌細胞に結合しているファージの同定
ＰＣ５−２がＮＳＣＬＣ細胞に特異的に結合できるかどうかを調べるために、本発明者らは免疫組織化学を用いて異なる細胞型においてファージ粒子を局在化させた。すべての癌細胞系、ＮＮＭおよび線維芽細胞をカバーガラス上に蒔いて、約８０％集密になるまで生育した。カバーガラスをブロッキング緩衝液中でインキュベートし、１％の過酸化水素に０．１％のＮａＮ３を加えたもので処理して内因性のペルオキシダーゼ活性を遮断し、次いで各選択ファージとともに４℃にて１時間インキュベートした。カバーガラスを洗浄し、ＨＲＰ標識したマウス抗Ｍ１３モノクローナル抗体とともに４℃にて１時間インキュベートした。スライドを３％のホルムアルデヒドで１０分間固定し、ペルオキシダーゼ基質に晒し、ＰＢＳ中の５０％グリセロールによって封入した。
【０１１３】
その結果、ＰＣ５−２はＣＬ１−５およびＰＣ１３を含むＮＳＣＬＣ細胞系に特異的に結合することが示された（図２Ａ、矢印）。このペプチドを提示しなかった対照ヘルパーファージはＣＬ１−５細胞に結合できなかった。ＰＣ５−２は、口腔癌（ＳＡＳ）および上咽頭癌細胞（ＮＰＣ―ＴＷ０１）などの他の癌細胞系、または鼻粘膜からの正常な上皮細胞（ＮＮＭ）にも結合できなかった（図２Ａ）。スケールバー：１０μｍ。
【０１１４】
合成ペプチドと選択されたファージクローンとが同じ結合部位に対して競合するかどうかを調べるために、免疫蛍光染色によってペプチド競合的阻害アッセイを行なった。ターゲティングペプチドＴＤＳＩＬＲＳＹＤＷＴＹ（ＳＰ５−２）［配列番号２］および対照ペプチド（ＲＬＬＤＴＮＲＰＬＬＰＹ）［配列番号２２］を合成して、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．（ＣＡ、ＵＳＡ）による逆相高速液体クロマトグラフィによって＞９５％の純度にまで精製した。同じ会社によってペプチドＮＨ２末端にＦＩＴＣまたはビオチンを付加することによって、これらのペプチドとＦＩＴＣまたはビオチンとの結合を行なった。
【０１１５】
ＣＬ１−５細胞をカバーガラス上で一晩培養し、次いでブロッキング溶液中でＵＶ処理した不活性対照ファージとともにプレインキュベートして非特異的な結合を遮断した。ファージを異なる濃度の合成ペプチドと混合し、細胞とともに４℃にて１時間インキュベートした。スライドをマウス抗Ｍ１３モノクローナル抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）とともにさらにインキュベートした後、ＦＩＴＣ標識したヤギ抗マウス抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）とともにインキュベートした。スライドを洗浄し、封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ、ＣＡ、ＵＳＡ）によって封入した。次いでＬｅｉｃａ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ顕微鏡の下でスライドを調べた。画像をＳｉｍｐｌｅＰＣＩ（Ｃ−ＩＭＡＧＩＮＧ、ＰＡ、ＵＳＡ）ソフトウェアによってマージした。
【０１１６】
その結果、ＣＬ１−５細胞とＰＣ５−２ファージとの結合活性は、ＳＰ５−２合成ペプチドによって用量依存的な態様で阻害されることが示された。２７μｇ／ｍｌのＳＰ５−２によってＰＣ５−２結合活性を完全に阻害できた（図２Ｂ）のに対し、対照ペプチドにはそうした効果はなかった。このアッセイにおいて、対照ファージはＣＬ１−５細胞に結合できず、ＰＣ５−２はＮＰＣ−ＴＷ０１に結合できなかった（図２Ｂ）。スケールバー：１０μｍ。
【０１１７】
さらに、ＣＬ１−５の細胞表面に発現された標的分子を調べるために、本発明者らはフローサイトメトリを用いてＰＣ５−２結合細胞を測定した。肺およびその他の癌細胞系を一晩培養し、次いで５０ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳに懸濁して、ブロッキング緩衝液によって４℃にて３０分間ブロックした。細胞をフロー緩衝液（１％のウシ胎児血清を含有するＰＢＳ）で２回洗浄した。細胞をファージまたはＦＩＴＣ標識ペプチドとともにインキュベートした。ペプチド競合的阻害アッセイに対しては、ファージを異なる濃度の合成ペプチドと混合し、混合物を細胞とともにインキュベートした。冷たいフロー緩衝液で２回洗浄した後、ファージ結合細胞を抗Ｍ１３モノクローナル抗体とともに４℃にて１時間インキュベートし、次いでＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体によって処理した。細胞を冷たいフロー緩衝液で２回洗浄し、次いでフローサイトメータ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に適用した。
【０１１８】
その結果、ＣＬ１−５細胞の４２．６％にＰＣ５−２が結合でき（図２Ｃ、ｃ）、結合したファージはＳＰ５−２ペプチドによって完全に阻害される（図２Ｃ、ｄ）ことが示された。ＰＣ５−２はＳＡＳおよび正常な上皮細胞（ＮＮＭ）に結合できなかった（図２Ｃ、ｅおよびｆ）。ＰＣ５−２は、このアッセイによってＮＰＣ−ＴＷ０１にも結合できなかった（図２Ｃ、ｂ）。これらの結果から、ＣＬ１−５細胞の一部はＰＣ５−２上に提示されるペプチドリガンドによって認識できる未知のタンパク質またはその他の分子を発現することが示された。
【０１１９】
実施例３．ターゲティングペプチドとＮＳＣＬＣ細胞および肺癌生検との結合
ＰＣ５−２に提示されるペプチド配列が確かにＮＳＣＬＣ細胞と相互作用したかどうかを定めるために、本発明者らは免疫蛍光染色を用いたペプチド結合アッセイに対して、ＰＣ５−２ファージの代わりにＦＩＴＣ標識したＳＰ５−２ペプチドを用いた。その結果、ＦＩＴＣ標識したＳＰ５−２はＣＬ１−５、Ｈ４６０、Ａ５４９、ＰＣ１３およびＨ２３を含む異なるＮＳＣＬＣ細胞系に特異的に結合するが、正常な上皮細胞（ＮＮＭ）には結合しないことが示された。ＦＩＴＣ標識した対照ペプチドはこうした結合活性を示さなかった（図３Ａ）。スケールバー：１０μｍ。
【０１２０】
ＦＩＴＣ標識したＳＰ５−２がこれらのＮＳＣＬＣ細胞系に結合できることをさらに確認するために、本発明者らはフローサイトメトリを用いてＳＰ５−２に結合した細胞も測定した。サンプルは実施例２と同様に調製した。フローサイトメトリヒストグラムは、各ＮＳＣＬＣ細胞系に結合しているＦＩＴＣ標識ＳＰ５−２（青）およびＦＩＴＣ標識した対照ペプチドのバックグラウンド（赤）を示す。ＣＬ１−５、Ｈ４６０、Ａ５４９、ＰＣ１３およびＨ２３に対する結合活性の比率は、それぞれ４３％、４５．８％、４４．３％、２０．１％および４４％であった（図３Ｂ）。これらの結果は、ＰＣ５−２およびＳＰ５−２がＮＳＣＬＣ細胞を標的にできることを示した。
【０１２１】
このターゲティングリガンドがヒト肺癌生検試料に対する親和性を有するかどうかをさらに識別するために、本発明者らは免疫組織化学によって肺癌患者からの肺腺癌とＰＣ５−２およびＳＰ５−２との反応性をテストした。ヒトの肺腺癌切片を調製し、スライドをブロッキング緩衝液中で３０分間インキュベートし、次いでメタノール中の３％の過酸化水素と０．１％のＮａＮ３とで処理して内因性のペルオキシダーゼ活性を遮断し、ファージクローンまたはビオチン標識したペプチドとともにインキュベートした。慣用的な免疫組織化学染色を用いて、ＨＲＰに結合した抗Ｍ１３抗体を用いてＰＣ５−２を検出した。
【０１２２】
その結果、ＰＣ５−２およびビオチン標識したＳＰ５−２はどちらもＮＳＣＬＣ生検試料中の腫瘍細胞を認識できたことが示された（図３Ｃ、ａおよびｂ、矢印）。しかし、対照ファージおよびビオチン標識した対照ペプチドはＮＳＣＬＣ生検試料に結合できなかった（図３Ｃ、ｃおよびｄ）。これらのデータは、ＳＰ５−２がＮＳＣＬＣ細胞系および肺癌患者からの癌細胞において発現される未知の分子を認識したことを示す。スケールバー：２５μｍ。
【０１２３】
実施例４．インビボでのＰＣ５−２の腫瘍ホーミング能力の確認。
【０１２４】
インビボでのＰＣ５−２のターゲティング能力を調べるために、ＣＬ１−５由来の腫瘍を有するマウスの尾静脈にファージを注射し、灌流後に回収した。ＳＣＩＤマウスの背外側の側腹部に１×１０７個の癌細胞を皮下注射した。サイズを合せた肺癌由来の腫瘍（腫瘍サイズ約５００ｍｍ３）を有するマウスの尾静脈を通じて、ターゲティングファージまたは対照ファージを注射した。注射の８分後にマウスをジエチルエーテルで処置してマウスを深い麻酔に導いた。次いでマウスに５０ｍｌのＰＢＳを灌流させて未結合ファージを洗浄した。対照器官（脳、心臓および肺）および腫瘍塊を取出して重量測定し、冷たいＰＢＳ−ＰＩ（プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤；Ｒｏｃｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で３回洗浄した。器官および腫瘍サンプルをホモジナイズした。次いで、０．５ｍｌのＥＲ２７３８細菌を３７℃にて３０分間加えることによって、腫瘍塊または対照器官に結合したファージを回収した。溶出されたファージ粒子は、１ｍｇ／ＬのＩＰＴＧ／Ｘ−Ｇａｌの存在下で寒天プレート上で力価測定した。ペプチド競合的阻害実験においては、ファージを１００μｇの合成ペプチドと同時注入した。本発明者らは対照ペプチドも用いた。器官および腫瘍塊をブアン固定液中で２時間固定した。固定の後、サンプルをパラフィンブロックに埋め込んだ。パラフィン切片を脱パラフィンし、再水和して、前述のとおりＭ１３モノクローナル抗体を用いた免疫染色に供した。
【０１２５】
本発明者らは、腫瘍塊および正常な対照器官（脳、肺および心臓）におけるファージの力価を定めた。ＰＣ５−２は、脳、心臓および肺を含む対照器官よりも４倍から１３倍高い濃度で腫瘍塊への特異的ホーミングを示した（図４Ａ）。対照ヘルパーファージは腫瘍組織に対する特異的ターゲティングをまったく示さなかった（図４Ａ）。ＰＣ５−２の腫瘍ホーミング能力は、ペプチド競合的阻害実験によってさらに確認され、この実験においては合成ペプチドＳＰ５−２をＰＣ５−２と同時注入することによって、腫瘍塊からのファージの回収が顕著に阻害された（図４Ｂ）。１００マイクログラムのＳＰ５−２は、腫瘍塊へのＰＣ５−２結合の９２％を阻害したが、同濃度の対照ペプチド（ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｅｐｔｉｄｅ：Ｃｏｎ−Ｐ）にはそうした阻害的効果はなかった（図４Ｂ）。
【０１２６】
免疫染色によってＰＣ５−２の組織分布も研究した。ＮＳＣＬＣ異種移植片を有するＳＣＩＤマウスにＰＣ５−２を静脈内注射し、異種移植片および対照器官を取出して、ファージ結合部位の局在化のために固定した。その結果、ＰＣ５−２は腫瘍組織中に局在することが示された（図４Ｃ、ｄ）。より高倍率では、抗ファージの免疫反応性は細胞膜上で見られ、腫瘍細胞の周囲の細胞質にいくらかの拡散が見られた（図４Ｃ、ｅ）。脳、心臓および肺組織などの正常な器官（図４Ｃ、ａ−ｃ）または対照ファージで処置された腫瘍組織（図４Ｃ、ｉ）には反応生成物はなかった。インビボのホーミング実験において、ＮＳＣＬＣ異種移植片とのＰＣ５−２の特異的ターゲティング能力は、合成ペプチドＳＰ５−２によって阻害された（図４Ｃ、ｊ）。スケールバー：２５μｍ。
【０１２７】
実施例５．ヒト肺癌異種移植片を有するＳＣＩＤマウスの、ＳＰ５−２−Ｌｉｐｏ−ＶｉｎおよびＳＰ５−２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘによる処置。
【０１２８】
進行したＮＳＣＬＣの高齢患者に対する現在の標準的な化学療法は、単剤化学療法のためのビノレルビンの使用である（Ｋｅｌｌｙら、２００１）。肺癌ホーミングペプチドであるＳＰ５−２を癌処置の化学療法の効果を改善するために用いることができるかどうかを定めるために、本発明者らはこのペプチドをビノレルビンを含有するリポソームに結合した（ＳＰ５−２−Ｌｉｐｏ−Ｖｉｎ）。ペプチドをＮＨＳ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ［Ｎ−ヒドロキシスクシニミド−カルボキシル−ポリエチレングリコール（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｏ−ｃａｒｂｏｘｙｌ−ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）（ＰＥＧ；平均分子量、３０００）由来のジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）（ＮＯＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）］に１：１．５のモル比で結合した。この結合は、ペプチジル−ＰＥＧ−ＤＳＰＥを生成するためのペプチドのＮ末端の固有の遊離アミン基を用いて行なった。この反応は完了し、残りのアミノ基の定量化によって確認された。アミノ基はＴＮＢＳ（トリニトロベンゼンスルホネート（Ｔｒｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ））試薬によって測定された（Ｈａｂｅｅｂ ＡＦＳＡ、１９６６）。ＤＳＰＣ（ジステアロイルホスファチジルコリン（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ））、コレステロール、ＰＥＧ−ＤＳＰＥからなるリポソームを硫酸アンモニウム溶液（２５０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ＝５．０、５３０ｍＯｓ）中で５５℃にて水和し、６０℃にて高圧押出し装置（Ｌｉｐｅｘ Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ、Ｃａｎａｄａ）を用いて０．１μｍおよび０．０５μｍのポアサイズのポリカーボネート膜フィルタ（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）から押出した；抗癌薬のビノレルビンまたはドキソルビシンを、１０μｍｏｌのリン脂質当り１ｍｇの薬物の濃度で、遠隔負荷法によってリポソームに封入した。リン酸塩アッセイによってリポソームの最終濃度を定めた。０．２ｍｌの希釈薬物負荷リポソームに１ｍｌの酸性イソプロパノール（８１ｍＭのＨＣｌ）を加えた後、励起波長として４７０ｎｍを用い、放出波長として５８２ｎｍを用いる分光蛍光光度計（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｆ−４５００、Ｈｉｔａｃｈｉ，Ｌｔｄ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）によって、リポソームの内側に閉じ込められたドキソルビシンの量を定めた。サブミクロン粒子分析計（モデルＮ４プラス；Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、Ｈｉａｌｅａｈ、ＦＬ、ＵＳＡ）による動的レーザ散乱によって、小胞サイズを測定した。脂質二重層の遷移温度を超える温度でともにインキュベートした後に、ペプチジル−ＰＥＧ−ＤＳＰＥを予め形成されたリポソームに移した（Ｚａｌｉｐｓｋｙら、１９９７）。以前に記載されたとおりに算出したところ（Ｋｉｒｐｏｔｉｎら、１９９７）、リポソーム当り３００〜５００個のペプチド分子があった。
【０１２９】
４〜６週齢のマウスの背外側の側腹部に、ヒトＮＳＣＬＣ癌細胞を皮下注射した。サイズを合せた腫瘍（腫瘍サイズ約５０〜１００ｍｍ３）を有するマウスを異なる処置群にランダムに割当てて、尾静脈を通じて、ビノレルビン（ＳＰ５−２−Ｌｉｐｏ−Ｖｉｎ）またはドキソルビシン（ＳＰ５−２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ）を含有するＳＰ５−２結合リポソーム、およびＬｉｐｏ−ＶｉｎまたはＬｉｐｏ−Ｄｏｘによって処置した。マウスをこの薬物で８回処置した（１ｍｇ／ｋｇ、週２回）。マウスの体重および腫瘍サイズをノギスで週２回測定した。腫瘍体積は次の式を用いて算出した：長さ×（幅）２×０．５２。平均腫瘍体積の差をＡＮＯＶＡによって評価した。
【０１３０】
サイズを合せたＮＳＣＬＣ異種移植片（約１００ｍｍ３）を有するＳＣＩＤマウス群を、静脈内注射によってＳＰ５−２−Ｌｉｐｏ−Ｖｉｎ、Ｌｉｐｏ−ＶｉｎおよびＰＢＳで別々に処置し、合計ビノレルビン用量を４８ｍｇ／ｋｇ（１２回、２ｍｇ／ｋｇを週２回）とした。
【０１３１】
ＳＰ５−２−Ｌｉｐｏ−Ｖｉｎを受けた腫瘍マウスの群（図５Ａ、群ａ）は、Ｌｉｐｏ−ＶｉｎおよびＰＢＳの群よりも有意に小さいサイズの腫瘍を有することが見出された（Ｐ＜０．００５）（図５Ａ、群ｂおよび群ｃ）。Ｌｉｐｏ−Ｖｉｎ（ＬＶ）群の腫瘍は、ＳＰ５−２−Ｌｉｐｏ−Ｖｉｎ（ＳＰ５−２−ＬＶ）群の腫瘍よりもサイズが６．７５倍大きくなったことが見出された。対照ＰＢＳ群のマウスの腫瘍は、ＳＰ５−２−Ｌｉｐｏ−Ｖｉｎ群の腫瘍よりもサイズが２５倍大きくなったことが見出された（ｎ＝６；＊Ｐ＜０．０１）（図５Ａ）。
【０１３２】
化学療法薬物によってもたらされる可能性のある副作用を評価するために、マウスを週２回体重測定した。そのデータから、ＳＰ５−２−Ｌｉｐｏ−Ｖｉｎ処置群の体重変化（１．３７ｇ増加）は、ＰＢＳ群の体重変化（１．３３ｇ増加）と同様であったことが明らかになった。これに対し、Ｌｉｐｏ−Ｖｉｎ処置群の示した体重増加は少なかった（０．５８ｇしか増加しなかった）（ｎ＝６；＊Ｐ＜０．０５）（図５Ｂ）。
【０１３３】
ターゲティングリポソームの治療効果をさらに特徴付けるために、本発明者らは１０２日間にわたり、ＳＰ５−２−Ｌｉｐｏ−Ｖｉｎ、Ｌｉｐｏ−ＶｉｎまたはＰＢＳによって別々に処置された後の動物の生存率を比較した。ＰＢＳ処置群ではすべての動物が死んだ（生存率０％）。Ｌｉｐｏ−Ｖｉｎ処置群では３匹の動物が死んだ（生存率４０％）が、ＳＰ５−２−Ｌｉｐｏ−Ｖｉｎ処置群は１０２日後に実験が終了したときに８０％という有意に増加した生存率を示した（ｎ＝５；図５Ｃ）。
【０１３４】
ＳＰ５−２は肺癌に対する治療効果を増加できるのかどうかをさらにテストするために、本発明者らはこのターゲティングリガンドを別の抗癌薬であるドキソルビシンにつないで（ＳＰ５−２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ）、別のＮＳＣＬＣであるＨ４６０を処置した。ドキソルビシンは最もよく用いられる抗癌薬の１つである。この化学療法薬剤は、癌細胞に対する細胞毒性効果に加えて、抗血管新生活性を有することが公知である（Ａｒａｐら、１９９８）。そのデータから、ＳＰ５−２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ（ＳＰ５−２−ＬＤ）もＬｉｐｏ−Ｄｏｘ（ＬＤ）よりも高い治療効果を有することが示された（ｎ＝６ ＊Ｐ＜０．０５）（図５Ｄ）。ターゲティングリポソームＳＰ５−２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘは、ＰＢＳで処置したマウスに比べてＨ４６０由来の腫瘍成長を顕著に阻害した（図５Ｄ）。これらの結果から、Ｌｉｐｏ−ＶｉｎまたはＬｉｐｏ−ＤｏｘをターゲティングリガンドＳＰ５−２に結合することによって、動物モデルにおけるヒト肺癌異種移植片を阻害する薬物の効果が高められることが示された。
【０１３５】
表１．ＮＳＣＬＣ細胞によって選択されるファージディスプレイペプチド配列のアラインメント
【０１３６】
【表１】
ａファージディスプレイされるコンセンサスアミノ酸配列を太字体で示す。
【０１３７】
ＰＣ３−１、ＰＣ４−１およびＰＣ５−２は同じアミノ酸配列を提示する。
【０１３８】
ＰＣ４−５およびＰＣ５−４は同じアミノ酸配列を提示する。
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２００７年２月１３日に出願された米国仮出願第６０／９００，９７３号および２００７年２月１４日に出願された米国仮出願第６０／９０１，０８５号ならびに２００７年４月１３日に出願された米国特許出願第１１／７８３，９２７号（これらは全て、それらの全体が参考として援用される）への優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
肺癌は世界の癌に関係する死亡率の主因である。進行した非小細胞肺癌（ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ：ＮＳＣＬＣ）の患者に対する５年生存率は１５％未満である。大多数の癌細胞を除くために必要な薬物用量の送達が副作用によって妨げられる化学療法にとって、腫瘍特異性の欠如はなおも主要な問題である。しかし、リガンドが介在する標的療法は、化学療法をより腫瘍特異性が高く毒性が低いものにする可能性があり、癌の新規の治療法の開発に有用であり得る。
【０００３】
医薬産業においては、癌の処置に対する候補となり得る新たな細胞毒性薬物が多数発見されているが、それでもなおこの生命に関わる疾患が原因で全世界で毎年７００万人を超える死者が出ており、その数は増え続けている（Ｍａｎｔｙｈ、２００６）。ほとんどの従来の化学療法の臨床的使用は、腫瘍標的組織への治療薬物濃度の不十分な送達によって、または正常な器官への深刻かつ有害な毒性の影響によって、しばしば制限される。したがって、腫瘍を標的とする薬物送達に用いることによって運ばれる薬物の治療指数を改善できるような新規のマイクロキャリア技術を開発することが重要である。
【０００４】
ファージディスプレイとは、ペプチドまたはタンパク質がバクテリオファージのコートタンパク質との融合として発現されるような選択技術であり、その結果ビリオンの表面上に融合ペプチドまたはタンパク質が提示（ディスプレイ）される。ファージディスプレイのランダムペプチドライブラリは、Ｂ細胞エピトープ（Ｄ’Ｍｅｌｌｏら、１９９７；Ｆｕら、１９９７；ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ、１９９０；Ｗｕら、２００１；Ｗｕら、２００３）およびタンパク質−タンパク質接触（Ａｔｗｅｌｌら、１９９７；Ｂｏｔｔｇｅｒら、１９９６；Ｎｏｒｄら、１９９７；Ｓｍｉｔｈら、１９９９）をマッピングする機会、受容体（Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、１９９９；Ｌｉら、１９９５；Ｗｒｉｇｈｔｏｎら、１９９６）またはタンパク質（Ｂｏｔｔｇｅｒら、１９９６；Ｃａｓｔａｎｏら、１９９５；ＤｅＬｅｏら、１９９５；Ｋｒａｆｔら、１９９９；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら、１９９５）に結合する生理活性ペプチドを選択する機会、疾患特異的な抗原模倣（Ｆｏｌｇｏｒｉら、１９９４；Ｌｉｕら、２００４；Ｐｒｅｚｚｉら、１９９６）を探索する機会、ならびに細胞特異的ペプチド（Ｂａｒｒｙら、１９９６；非特許文献１；Ｍａｚｚｕｃｃｈｅｌｌｉら、１９９９）および器官特異的ペプチド（Ａｒａｐら、１９９８；ＥｓｓｌｅｒおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、２００２；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら、１９９５；ＰａｓｑｕａｌｉｎｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９６）を定める機会を与える。
【０００５】
リポソームは、癌化学療法における薬物担体として提案された（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓら、１９７４）。そのとき以来、リポソームに対する関心は増加し、リポソーム系は現在薬物担体として広範囲に研究されている。リポソームを特に癌組織への薬物送達に用いるために、リポソームには以下の３つの基本的要求が望まれる：（ｉ）血液循環を長くすること、（ｉｉ）十分な腫瘍蓄積、（ｉｉｉ）薬物の薬力学に適合する放出プロファイルを有しながら、制御された薬物放出および腫瘍細胞による取込みが行なわれること。
【０００６】
最初、リポソーム薬物送達系の研究は、細網内皮系（ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｓｙｓｔｅｍ：ＲＥＳ）による非常に速い血液クリアランスに苦しめられた。粒子サイズ、表面電荷（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ、１９８４）、およびリポソーム組成は、クリアランスプロファイルに対する影響が強い（例、ホスファチジルイノシトールまたはモノシアロガングリオシドの組込みによって、血液中のリポソーム循環が長くなる）ことが確認された（ＡｌｌｅｎおよびＣｈｏｎｎ、１９８７；ＧａｂｉｚｏｎおよびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ、１９８８；Ｓｅｎｉｏｒ、１９８７）。漏出性毛細血管を介して優先的に循環から出て、広範囲の新血管新生を示す腫瘍に蓄積してより高濃度となり、抗腫瘍活性を高めると予測される「ステルス」リポソームによって、この取込みは回避され得る（Ｗｕら、１９９３）。しかし、合成ポリマーポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ：ＰＥＧ）で被覆されたリポソームが血中の半減期を有意に増加させることが発見されたときには、リポソームは単に良好な薬物送達候補としてのみ認識されていた（Ａｌｌｅｎら、１９９１；ＢｌｕｍｅおよびＣｅｖｃ、１９９０；Ｋｌｉｂａｎｏｖら、１９９０；Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、１９９１；Ｓｅｎｉｏｒら、１９９１）。このペグ化リポソームは、リポソームのタンパク質吸着およびオプソニン作用を阻害する高度に水和し保護されたリポソーム表面のために、長く循環する（ＷｏｏｄｌｅおよびＬａｓｉｃ、１９９２）。速いオプソニン作用およびクリアランスの問題を解決して、血中で最大７２時間の半減期を有するリポソームを提供する（Ｄｒｕｍｍｏｎｄら、１９９９）と、次の挑戦事項は能動的ターゲティングによって腫瘍組織内にリポソームを蓄積させることだった。ターゲティングリポソームの使用によって、腫瘍標的部位における薬物放出を有意に高め、治療効果を増加できる可能性がある（非特許文献１；非特許文献２）。
【０００７】
薬物送達研究分野では、腫瘍組織内で蓄積する長く循環するリポソームの構築に成功しており、閉じ込められた薬物は、能動的なトリガが存在しない限り、次いで受動拡散によってリポソームの外に漏出する必要がある。疾患組織に特異的に薬物を放出できる部位特異的トリガの使用は、腫瘍標的部位における薬物の生物学的利用率を増加させる方法の１つである。薬物の生物学的利用率を最適化する別の方法は、能動的ターゲティングによってより高程度のリポソーム蓄積を得ることである。さらに、能動的ターゲティングと能動的トリガとの組合せによって、腫瘍標的部位における有意に高められた特異的な薬物放出をもたらし得る可能性がある（非特許文献１；非特許文献２）。
【０００８】
癌を標的とするためにモノクローナル抗体を用いる際の主要な制限の１つは、抗体分子が比較的大きく、分子量（ＭＷ）１５０，０００を有することである。この分子は、血液供給が不十分な大きな腫瘍塊の内部に達することが困難である（Ｄｖｏｒａｋら、１９９１；Ｊａｉｎ、１９９７；Ｓｈｏｃｋｌｅｙら、１９９１）。この問題を克服するために、何人かの研究者は現在、サイズがより小さいＭＷ２５，０００の抗腫瘍１本鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｖ：ｓｃＦｖ）抗体を開発中である（ＡｄａｍｓおよびＳｃｈｉｅｒ、１９９９；Ｈａｌｌら、１９９８；Ｗｏｎｇら、２００１）。モノクローナル抗体療法の別の主要な問題は、抗体分子がたとえば肝臓、脾臓および骨髄などの細網内皮系に非特異的に取込まれることである。放射標識抗体または毒素結合抗体の用量を制限する毒性は、肝臓および骨髄毒性である（Ｎｅｕｍｅｉｓｔｅｒら、２００１；Ｔｈｏｍａｓら、１９９５）。これに対し、ペプチドはモノクローナル抗体よりもかなり小さくてもよく、一般的に細網内皮系には結合しない（Ａｉｎａら、２００５）。ペプチドは化学的に安定であり、製造が比較的容易である。加えて、短い合成ペプチドの有効な組織侵入を、それらの選択的結合および癌細胞による内部移行能力と組合せることによって、これらの薬剤は、たとえば細胞毒性薬物、オリゴヌクレオチド、毒素および放射性分子などの治療の送達に対する理想的な候補となる。ウイルス性の送達ベクターおよびモノクローナル抗体とは対照的に、ペプチドは免疫系に対してほとんど不可視であり、最小限の副作用しかもたらさないか、または副作用をもたらさないことが期待されている（ＬｅｖｙおよびＨｙｍａｎ、２００５）。したがって、ターゲティングリガンドの同定およびリガンド標的リポソームの開発が非常に望ましい。
【０００９】
ＮＳＣＬＣに対する有望な新しい治療法には、より大きな腫瘍特異性およびより低い毒性を可能にする腫瘍標的アプローチが必要であると本発明者らは考える。本発明者らは本明細書にペプチドの単離および同定を記載しており、このペプチドは、いくつかのＮＳＣＬＣ細胞系および肺癌患者からのヒト生検試料に特異的に結合できるＳＰ５−２を含む。ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）またはドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）を含有するリポソームに結合されるとき、このターゲティングペプチドＳＰ５−２は、ＳＣＩＤマウスにおけるヒト肺癌異種移植片に対する薬物の治療指数を高めた。本発明者らの結果は、このターゲティングペプチドおよび本発明者らの研究において同定された他のペプチドが、肺癌の処置における薬物送達剤としての強い臨床的可能性を有することを示す。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｌｅｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２００４）６４，８００２〜８００８
【非特許文献２】Ｐａｒｋら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２００２）８，１１７２−１１８１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、特定の標的組織に対してファージディスプレイライブラリをスクリーニングすることは、薬物、遺伝子送達ベクターまたはその他の治療薬剤のターゲティングに用いられるペプチド配列の同定における直接的かつ迅速な方法となる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明はとりわけ、以下のものを単独または組合せて含む。
【００１３】
本発明は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、および配列番号１９を含むポリヌクレオチドおよびその変異体を提供する。
【００１４】
本発明は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、および配列番号２０を含むペプチドおよびその変異体を提供する。一実施形態において、ペプチドは配列番号２またはその変異体を含む。別の実施形態において、ペプチドは配列番号２を含む。別の実施形態において、ペプチドは融合タンパク質を含む。別の実施形態において、ペプチドは１つまたはそれ以上の標識を含む。標識はＦＩＴＣ、ビオチンおよび放射性同位元素を含んでもよい。別の実施形態において、ペプチドは１つまたはそれ以上の薬物に結合される。薬物はドキソルビシン、ビノレルビン、オリゴヌクレオチド、毒素、抗ＶＥＧＦアプタマー、および放射性分子を含んでもよい。
【００１５】
本発明は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、および配列番号２０を含む本発明のペプチドまたはその変異体に結合する抗体を提供する。
【００１６】
本発明は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、および配列番号２０を含むペプチドを含む本発明のペプチドの１つまたはそれ以上を含むリポソームを提供する。一実施形態において、リポソームは配列番号２またはその変異体を含むペプチドを含む。別の実施形態において、リポソームは配列番号２を含むペプチドを含む。リポソームは１つまたはそれ以上の薬物を含んでもよい。薬物はドキソルビシン、ビノレルビン、オリゴヌクレオチド、毒素、抗ＶＥＧＦアプタマー、および放射性分子を含んでもよい。一実施形態において、薬物はドキソルビシンである。別の実施形態において、薬物はビノレルビンである。ドキソルビシンは、リン脂質１μｍｏｌ当り約１１０μｇから約１３０μｇの量であってもよい。ある実施形態において、リポソームは約６５ｎｍから約７５ｎｍの直径を有する。別の実施形態において、リポソーム当りのペプチド分子の数は約３００から約５００である。リポソームは医薬的に許容できる担体を含んでもよい。
【００１７】
本発明は、１つまたはそれ以上の化学療法薬物と、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、および配列番号２０からなる群より選択されるペプチド、またはその変異体とを含むリポソームを対象に接触させる工程を含む、癌を処置する方法を提供する。化学療法薬物は、ドキソルビシン、ビノレルビン、オリゴヌクレオチド、毒素、および放射性分子からなる群より選択されてもよい。一実施形態において、化学療法薬物はドキソルビシンである。別の実施形態において、化学療法薬物はビノレルビンである。一実施形態において、癌はＮＳＣＬＣおよびＳＣＬＣからなる群より選択される肺癌である。
【００１８】
本発明は、試料中の癌細胞を検出するための方法を提供し、この方法は、前記試料の癌細胞にペプチドを結合できる条件下で請求項２に記載のペプチドを試料に接触させる工程と、請求項８に記載の抗体を用いて前記試料の前記癌細胞への前記ポリペプチドの結合を検出する工程とを含む。一実施形態において、ペプチドはエピトープを含む融合タンパク質であり、この融合タンパク質のエピトープに対する抗体を用いて融合タンパク質が検出される。別の実施形態において、ペプチドは標識されており、この標識を検出することによってペプチドが検出される。一実施形態において、標識はＦＩＴＣを含む。別の実施形態において、標識はビオチンを含む。
【００１９】
本発明は、本発明のペプチドに結合する生体分子を同定する方法を提供し、この方法は、ペプチドと標的タンパク質とを含む複合体を形成できる条件下で本発明のペプチドを細胞抽出物に接触させる工程と、その複合体を分析して標的タンパク質を同定する工程とを含む。
【００２０】
本発明は、ストリンジェントな条件下で請求項１に記載のポリヌクレオチドまたはその変異体の相補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）にハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供する。
【００２１】
本発明は、請求項１に記載のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【００２２】
本発明は、請求項１に記載のポリヌクレオチドを含むベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００２３】
本発明は、ストリンジェントな条件下で請求項１に記載のポリヌクレオチドまたはその変異体の相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】インビトロファージディスプレイを用いたＮＳＣＬＣ細胞特異的ファージの単離を示す図である。
【図２Ａ】ＮＳＣＬＣ細胞に結合する特異的ファージクローンの同定を示す図である。ＣＬ１−５およびＰＣ１３肺癌細胞におけるＰＣ５−２の結合の視覚化を示す。スケールバー：１０μｍ。
【図２Ｂ】ＮＳＣＬＣ細胞に結合する特異的ファージクローンの同定を示す図である。ＰＣ５−２はＣＬ１−５細胞への結合を示し、ＳＰ５−２合成ペプチドによって阻害される。スケールバー：１０μｍ。
【図２Ｃ】ＮＳＣＬＣ細胞に結合する特異的ファージクローンの同定を示す図である。フローサイトメトリによって測定された、ＣＬ１−５細胞の細胞表面へのＰＣ５−２の結合プロファイル。
【図３Ａ】ＮＳＣＬＣ細胞およびヒト肺癌生検試料とのターゲティングペプチドの結合活性を示す図である。ＦＩＴＣ標識されたＳＰ５−２は５つのＮＳＣＬＣ細胞系に結合するが、正常な上皮細胞（ＮＮＭ）には結合しない。スケールバー：１０μｍ。
【図３Ｂ】ＮＳＣＬＣ細胞およびヒト肺癌生検試料とのターゲティングペプチドの結合活性を示す図である。ＦＩＴＣ標識されたＳＰ５−２はＮＳＣＬＣ細胞系に結合する。
【図３Ｃ】ＮＳＣＬＣ細胞およびヒト肺癌生検試料とのターゲティングペプチドの結合活性を示す図である。ＰＣ５−２およびＳＰ５−２は、肺癌患者からの肺腺癌生検試料に結合する。スケールバー：２５μｍ。
【図４】インビボでのＰＣ５−２の腫瘍ホーミング能力の確認を示す図である。（Ａ）脳、肺および心臓に対する腫瘍におけるＰＣ５−２の回収。（Ｂ）ＰＣ５−２の腫瘍組織に対するターゲティングはＳＰ５−２によって競合的に阻害されるが、対照ペプチドには阻害されない。（Ｃ）ＣＬ１−５由来の異種移植片におけるＰＣ５−２の局在化。スケールバー：２５μｍ。
【図５】ヒト肺癌異種移植片を有するＳＣＩＤマウスの、ＳＰ５−２−Ｌｉｐｏ−ＶｉｎおよびＳＰ５−２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘによる処置を示す図である。（Ａ）ＳＰ５−２−Ｌｉｐｏ−Ｖｉｎで処置されたマウスの腫瘍サイズの変化。（Ｂ）処置されたマウスの体重の変化。（Ｃ）ＳＰ５−２−Ｌｉｐｏ−Ｖｉｎで処置されたマウスの生存曲線。（Ｄ）ＳＰ５−２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘで処置されたマウスの腫瘍サイズの変化。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
表の簡単な説明
表１は、ＮＳＣＬＣ異種移植片から選択されたファージからのファージディスプレイペプチド配列を提供する。
【００２６】
肺癌は、先進国において最も一般的な悪性腫瘍の１つであり、発展途上国においても増加している問題である（Ｂｏｙｌｅら、２０００）。肺癌には以下の２つの主要なタイプがある：小細胞肺癌（ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ：ＳＣＬＣ）および非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。症例の約８０パーセントがＮＳＣＬＣであり、約２０パーセントがＳＣＬＣである（Ｓｃｈｉｌｌｅｒ、２００１）。米国癌学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙ）によると、ＮＳＣＬＣの患者に対する５年生存率は１５％未満である。ＮＳＣＬＣは処置が特に困難であることが判明している（Ｆｒｙら、１９９９；Ｉｈｄｅ、１９９２）。肺の悪性腫瘍は全世界で１００万人を超える死者をもたらし、流行性疾患となっている（Ｊｅｍａｌら、２００２）。肺癌は診断が困難であり、有効な治療法がないことから、生命に関わる病気である。推奨される処置は手術であるが、化学療法および放射線療法は、局在的に進行した疾患を治癒するための処置戦略の一部として、または転移性腫瘍に対する緩和療法としての役割を有する（Ｔｈｏｎｇｐｒａｓｅｒｔら、１９９９）。しかし、特に高用量が投与されるときに細胞毒性薬物特異性がないことと、その結果生じる有毒の副作用とのために、この処置形式の使用はしばしば制限される。よって、悪い予後を与える分子変化を理解し、その情報を用いて診断および患者の管理を改善する必要性が高く、当該技術分野においてはより有効な癌処置が必要とされている。
【００２７】
癌治療法の主要な目的は、正常な組織を残しながら癌細胞を完全に根絶することである。この目的は、悪性の部位における癌細胞の選択的ターゲティングを必要とする。抗癌薬の選択毒性は、疾患組織に達する薬物の用量を増やすか、または正常な組織に達する薬物の用量を減らすことによって増加できるが、理想的には両方が起こる。したがって、抗癌治療のリガンド介在型ターゲティングが探索されている（Ａｌｌｅｎ、２００２）。
【００２８】
リガンド標的療法の基礎をなす基本理念は、癌細胞または癌に関連する内皮、線維芽細胞およびリンパ球への化学療法薬物の送達である。癌細胞およびその微小環境の選択的ターゲティングは、正常な組織よりも標的細胞において固有に発現されるかまたは過剰発現される抗原または受容体またはその他の分子に結合する分子に薬物を関連付けることによって高めることができる（ＡｌｌｅｎおよびＣｕｌｌｉｓ、２００４；Ａｒａｐら、１９９８；ＨｕおよびＫａｖａｎａｇｈ、２００３；ＲｏｓｅｎｋｉｌｄｅおよびＳｃｈｗａｒｔｚ、２００４）。この戦略は、癌細胞への薬物の特異的送達を可能にし、抗癌処置に対する治療効果を増加させる（ＡｌｌｅｎおよびＣｕｌｌｉｓ、２００４；Ａｒａｐら、１９９８；ＨｕおよびＫａｖａｎａｇｈ、２００３；ＲｏｓｅｎｋｉｌｄｅおよびＳｃｈｗａｒｔｚ、２００４）。
【００２９】
細胞毒性薬物、たとえばシクロホスファミド、ドキソルビシン、シスプラチン、パクリタキセル、ビノレルビン、およびその他数ダースの薬物などは、継続的な増殖を行なっている細胞において最も高い致死活性を有し、多くの一般的な腫瘍タイプの細胞は活発に分裂するため、これらの薬物は多くのタイプの癌の処置において有用であった。典型的に細胞毒性の影響に最も弱い正常な組織は、頻繁に分裂する組織、たとえば骨髄、消化管の上皮内壁、および毛包などを含む（ＨｅｒｂｓｔおよびＳａｎｄｌｅｒ、２００４）。化学療法によってＮＳＣＬＣの患者を延命できることは周知である。進行したＮＳＣＬＣに対する化学療法の最近発表された臨床試験では、１９９０年代に開発された薬物、たとえばパクリタキセル、ドセタキセル、ゲムシタビン、ビノレルビン、およびイリノテカンなどが使用された（Ｌｙｎｃｈら、２００４）。したがって、進行したＮＳＣＬＣの高齢の患者に対する現在の標準的な化学療法は、単剤化学療法に対するビノレルビンの使用である（Ｋｅｌｌｙら、２００１）。ビノレルビンは、微小管集合を妨げるビンカアルカロイドである。ビノレルビンの抗腫瘍活性は、主にチューブリンとの相互作用を通じた中期の有糸分裂の阻害によるものと考えられている（Ｒａｍａｌｉｎｇａｍ、２００５）。細胞毒性化学療法はいくつかの癌の処置に対して大きな影響を有したが、ほとんどの固形腫瘍に対するその効果は制限される（Ｐａｒｋｉｎら、２００１）。
【００３０】
本発明者らはファージディスプレイ技術を用いて、ＮＳＣＬＣ細胞系に特異的に結合できるファージクローンを同定した。ペプチドは、癌細胞にホーミングする、または癌細胞を標的とするその能力によっても記載される。「ホーミングする（ｈｏｍｅ）」、「ホーミング（ｈｏｍｉｎｇ）」、「標的（ｔａｒｇｅｔ）」および「ターゲティング（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）」という用語は相互交換可能に用いられる。バイオパニング（ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ）の第５ラウンドにおいては、選択されたファージクローンの結合活性がバイオパニングの第１ラウンドに比べて４０倍増加した。ＥＬＩＳＡによってＣＬ１−５細胞上の特異的結合ファージをスクリーニングした結果、ＰＣ５−２と呼ばれる１つのファージクローンがＣＬ１−５細胞に結合するファージのうち最大量の（選択されたファージの９０％を占めた）ものであることが明らかになった（表１）。
【００３１】
免疫組織化学的研究によって、ＰＣ５−２はＮＳＣＬＣ細胞に対する特異的な結合活性を有することがさらに確認された（図２Ａ）。ＰＣ５−２に提示されるペプチドがＮＳＣＬＣ細胞に特異的に結合できることを確かめるため、本発明者らはその同族の合成ペプチドＳＰ５−２を用いて、細胞上のＰＣ５−２と同じ結合部位を競合させた。蛍光染色およびフローサイトメトリ分析の結果から、ＳＰ５−２はＰＣ５−２のＮＳＣＬＣ細胞への結合を阻害できたことが示された（図２Ｂおよび図２Ｃ）。これらの結果から、ＰＣ５−２はファージ粒子の別の部分ではなくそれが提示するペプチドによって癌細胞と相互作用したことが示される。
【００３２】
何種類のＮＳＣＬＣ細胞系がＳＰ５−２によって認識できる標的分子を発現するかを確かめるため、本発明者らはＦＩＴＣ標識したＳＰ５−２を合成してその結合活性を特徴付けた。免疫蛍光染色およびフローサイトメトリを用いて５つの異なるタイプのＮＳＣＬＣ細胞系を分析したところ、これらの細胞系はＳＰ５−２による細胞表面結合の程度が異なっていることを本発明者らは定めた（図３Ａおよび図３Ｂ）。これら５つのＮＳＣＬＣ細胞系の細胞膜が、ＳＰ５−２によって認識され得る未知の分子を発現することは明らかである。ＳＰ５−２のＮＳＣＬＣ細胞系との結合率を測定したとき、各系のＮＳＣＬＣ細胞の２０．１％から４５．８％がＳＰ５−２によって検出できた（図３Ｂ）。
【００３３】
ＳＰ５−２がＮＳＣＬＣの診断および処置に対する薬物送達剤としての可能性を有するかどうかを確かめるため、本発明者らはビオチン標識したＰＣ５−２を合成し、これを用いて、免疫組織化学によって肺癌患者からの肺腺癌生検試料を検出した。ＰＣ５−２およびビオチン標識したＳＰ５−２はどちらもＮＳＣＬＣ生検試料を検出できた（図３Ｃ）。１０人の患者からの肺腺癌の５０パーセント（５／１０）が、このペプチドによって検出できる標的分子を発現する。
【００３４】
ＰＣ５−２の腫瘍ホーミング能力をテストするために、本発明者らはモデルとしてヒト肺癌異種移植片を有するマウスを用いた。インビボのホーミング実験から、ＰＣ５−２は腫瘍組織に対してより高い親和性を有することが示され、たとえば肺、心臓および脳などの正常な器官へのこのファージの特異的な結合は見出されなかった（図４Ａ）。ペプチド競合的阻害アッセイが行なわれたとき、ＰＣ５−２の腫瘍組織との結合活性は合成ペプチドＳＰ５−２によって阻害された（図４Ｂ）。これらの結果は、この合成ペプチドがそれぞれのファージと同じ結合部位に特異的に結合できたことを示唆するものである。
【００３５】
ホーミングファージの腫瘍塊および正常な器官における局在化を同定するために、肺癌を有するＳＣＩＤマウスにＰＣ５−２を静脈内注射し、次いで組織切片を用いて抗Ｍ１３モノクローナル抗体によってファージを局在化した。ＰＣ５−２の免疫組織化学的局在化から、このファージは腫瘍組織中には局在化したが、脳、肺および心臓組織には局在化しなかったことが示され（図４Ｃ）、ＰＣ５−２は異種移植片腫瘍細胞に特異的に結合できるが正常な組織および細胞には結合しないという本発明者らの結論がさらに支持された。本発明者らの結果から、ＰＣ５−２およびバイオパニングを通じて単離されたその他のペプチドを、リガンド標的療法のための薬物送達剤として、または肺癌もしくはその他の癌に対する診断試薬として用い得ることが示された。
【００３６】
リガンド標的療法を開発するために、本発明者らは化学療法薬物のビノレルビン（ＳＰ５−２−Ｌｉｐｏ−Ｖｉｎ）またはドキソルビシン（ＳＰ５−２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ）を有する、ＳＰ５−２に結合されたリポソームを調製した。ＳＰ５−２−Ｌｉｐｏ−Ｖｉｎは、ＮＳＣＬＣ異種移植片を有するＳＣＩＤマウスにおける治療効果の改善を示し、かつこの動物に対する特定の副作用を有さず（図５Ａおよび図５Ｂ）、臓器毒性の組織学的証拠も有さなかった。ＳＰ５−２−Ｌｉｐｏ−ＶｉｎおよびＬｉｐｏ−Ｖｉｎの腫瘍成長に対する影響を比較すると、治療法の４２日後には腫瘍サイズに顕著な差が見出された（Ｐ＜０．０５）が、Ｌｉｐｏ−Ｖｉｎ処置によっても腫瘍成長は部分的に阻害されていた（図５Ａ）。Ｌｉｐｏ−Ｖｉｎによるこの部分的な阻害は、「漏出性の」微小血管系および腫瘍範囲を支えるリンパ系の障害を通じた、腫瘍組織におけるリポソームの非特異的付加の蓄積によるものかもしれない（Ｈｕａｎｇら、１９９２；Ｊａｉｎ、１９９６；ＭａｔｓｕｍｕｒａおよびＭａｅｄａ、１９８６）。この影響はしばしば、透過性および滞留性向上効果（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ）と呼ばれる（ＭａｔｓｕｍｕｒａおよびＭａｅｄａ、１９８６）。受動的に標的にされるリポソームＬｉｐｏ−Ｖｉｎを用いても癌を処置できるが、しばしば「能動的」ターゲティングと呼ばれる、リガンド標的療法によって可能にされるより高くより選択的な抗癌活性によって、これを改善できる。抗腫瘍効果を高めることに加えて、ＳＰ５−２−Ｌｉｐｏ−ＶｉｎはＬｉｐｏ−Ｖｉｎよりも副作用を減少させた（図５Ｂ）。
【００３７】
本発明者らは、ＳＰ５−２−Ｌｉｐｏ−Ｖｉｎ、Ｌｉｐｏ−ＶｉｎおよびＰＢＳ溶液によって別々に処置した後の動物の生存率を比較し、動物を１０２日間観察した。ＳＰ５−２−Ｌｉｐｏ−Ｖｉｎ処置群の生存率は８０％だったのに対し、Ｌｉｐｏ−Ｖｉｎ処置群の生存率は４０％しかなく、ＰＢＳ処置群では腫瘍マウスの生存は示されなかった（生存率０％）（図５Ｃ）。これらの現象から、Ｌｉｐｏ−ＶｉｎをＳＰ５−２ペプチドと結合することによって腫瘍成長阻害の効果が増し、ＮＳＣＬＣ異種移植片を有するＳＣＩＤマウスの寿命が顕著に長くなることが示唆される。ＳＰ５−２ペプチドはＳＣＩＤマウスにおけるＮＳＣＬＣ異種移植片に対する薬物の効果を高めただけでなく、薬物の毒性も低減した。Ｌｉｐｏ−Ｖｉｎ処置マウスの体重変化は、ＳＰ５−２−Ｌｉｐｏ−ＶｉｎおよびＰＢＳ処置マウスに比べて６０％減少した（図５Ｂ）。ＳＰ５−２−Ｌｉｐｏ−Ｖｉｎによる治療指数の向上は、ＮＳＣＬＣを標的とする薬物送達系の重要な臨床的可能性を示す（図５）。
【００３８】
これらの結果から、本発明者らの腫瘍特異的ホーミングペプチドはターゲティング療法に対する治療薬剤として機能できるだけでなく、イメージングプローブとしてＮＳＣＬＣの腫瘍組織をターゲティングするための分子ツールとしても働き得ることが示される。この標的リガンドは、ＮＳＣＬＣの細胞膜上の標的タンパク質またはその他の分子を同定するためにも有用であり得る。
【００３９】
まとめると、本発明者らは、ファージディスプレイペプチドライブラリを用いてＮＳＣＬＣ細胞をスクリーニングすることによって、インビトロおよびインビボの両方でＮＳＣＬＣ細胞の細胞表面に特異的に結合できる、ＳＰ５−２を含む新規のペプチドを同定した。このターゲティングペプチドは、ビノレルビン、ドキソルビシンまたはその他の薬剤を含有するリポソームに結合でき、その結果全身性の副作用なしに治療効果および生存率を増加できる。ＳＰ５−２ペプチドはＮＳＣＬＣ細胞への薬物送達のための優れた薬剤であると考えられ、ＮＳＣＬＣの処置における薬物送達系として強力な臨床的可能性を有する。
【００４０】
参考文献
【００４１】
【化１】
【００４２】
【化２】
【００４３】
【化３】
【００４４】
【化４】
【００４５】
【化５】
【００４６】
【化６】
【００４７】
【化７】
【００４８】
【化８】
【００４９】
【化９】
【００５０】
【化１０】
定義
本明細書において用いられる用語は以下に示すとおりの通常の意味を有し、明細書の文脈においてさらに理解されてもよい。
【００５１】
「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「核酸」、「核酸分子」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド配列」、および「ヌクレオチド配列」という用語は本明細書において相互交換可能に用いられて、あらゆる長さのヌクレオチドの重合形をいう。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および／またはそれらの類似体もしくは誘導体を含有し得る。本明細書に示されるヌクレオチド配列は５’から３’の方向にリストされる。
【００５２】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は本明細書において相互交換可能に用いられて、あらゆる長さのアミノ酸の重合形を示し、それは天然に発生するアミノ酸、コードおよび非コードアミノ酸、化学的または生化学的に修飾、誘導されたアミノ酸またはデザイナーアミノ酸（ｄｅｓｉｇｎｅｒ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）、アミノ酸類似体、ペプチド模倣薬およびデプシペプチド、ならびに修飾された、環状の、二環状の、デプシ環状の（ｄｅｐｓｉｃｙｃｌｉｃ）またはデプシ二環状の（ｄｅｐｓｉｂｉｃｙｃｌｉｃ）ペプチドバックボーンを有するポリペプチドを含んでもよい。この用語は１本鎖タンパク質およびマルチマーを含む。この用語は、以下のものに結合されたタンパク質も含む：たとえばＦＩＴＣ、ビオチン、ならびに６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１３７Ｃｓ、１８６Ｒｅ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２２３Ｒａ、２４１Ａｍ、および２４４Ｃｍを含むがこれらに限定されない放射性同位元素などの標識；検出可能な生成物を有する酵素（たとえば、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼなど）；蛍光剤および蛍光標識、蛍光発光金属、たとえば１５２Ｅｕ、またはその他のランタニド系列、電気化学発光化合物、化学発光化合物、たとえばルミノール、イソルミノールまたはアクリジニウム塩など；特異的結合分子、たとえば磁性粒子、微小球、ナノ球体など。この用語は、治療薬剤に結合されたペプチドも含む。
【００５３】
この用語は融合タンパク質も含み、この融合タンパク質は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：ＧＳＴ）融合タンパク質、たとえばルシフェリンまたはエクオリン（緑色蛍光タンパク質）などの生物発光タンパク質などの異種アミノ酸配列を有する融合タンパク質、異種および同種リーダー配列を有する融合タンパク質、Ｎ末端メチオニン残基を有する融合タンパク質または有さない融合タンパク質、ペグ化タンパク質、ならびに免疫学的にタグ付けされたタンパク質またはｈｉｓタグ付けされたタンパク質を含むが、これらに限定されない。こうした融合タンパク質はエピトープとの融合も含む。こうした融合タンパク質は、本発明のペプチドのマルチマー、たとえばホモダイマーまたはホモマルチマー、ならびにヘテロダイマーおよびヘテロマルチマーなどを含んでもよい。この用語はペプチドアプタマーも含む。
【００５４】
本発明のペプチドは、ペプチドの生物学的に活性な変異体を含み、こうした変異体は構造が実質的に同様である。ポリペプチド配列の変異体は、対象のポリペプチドに比べて挿入、付加、欠失または置換を含んでいてもよい。ポリペプチド配列の変異体は、生物学的に活性な多形変異体を含む。
【００５５】
本発明のペプチドは、天然に発生するアミノ酸および天然に発生しないアミノ酸を含んでもよい。ペプチドはＤ−アミノ酸、Ｄ−およびＬ−アミノ酸の組合せ、およびさまざまな「デザイナー」または「合成」アミノ酸（たとえば、β−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、およびＮα−メチルアミノ酸など）を含むことによって特別な特性を有してもよい。加えて、ペプチドは環状であってもよい。ペプチドは非古典的アミノ酸を含むことによって特定の立体構造モチーフを導入してもよい。あらゆる公知の非古典的アミノ酸が用いられてもよい。以下を含むがそれらに限定されないアミノ酸類似体およびペプチド模倣薬をペプチドに組み込むことによって、特定の二次構造を誘導または有利にしてもよい：ＬＬ−Ａｃｐ（ＬＬ−３−アミノ−２−プロペニドン（ｐｒｏｐｅｎｉｄｏｎｅ）−６−カルボン酸）、β−ターンを誘導するジペプチド類似体；β−シートを誘導する類似体；β−ターンを誘導する類似体；α−へリックスを誘導する類似体；γ−ターンを誘導する類似体；Ｇｌｙ−Ａｌａターン類似体；アミド結合アイソスター；またはテトラゾール（ｔｒｅｔｒａｚｏｌ）など。
【００５６】
ペプチドの末端部にデスアミノまたはデスカルボキシ残基を組み込むことによって、末端アミノ基またはカルボキシル基をなくして、プロテアーゼに対する感受性を低下させるか、または立体構造を制限してもよい。Ｃ末端官能基は、アミド、アミド低級アルキル、アミドジ（低級アルキル）、低級アルコキシ、ヒドロキシ、およびカルボキシ、ならびにそれらの低級エステル誘導体、ならびにそれらの医薬的に許容できる塩を含む。
【００５７】
「リポソーム」という用語は、内部の水性空間を囲む外側の脂質二重層または多層の膜を含む組成物をいう。この用語は多重膜リポソームを含み、これは一般的に約１マイクロメートルから約１０マイクロメートルの範囲の直径を有し、水相の層と交互になった２から数百の同心の脂質二重層を含む。この用語は、単一脂質層からなり、一般的に約２０ナノメートルから約４００ナノメートル（ｎｍ）、約５０ｎｍから約３００ｎｍ、約３００ｎｍから約４００ｎｍ、または約１００ｎｍから約２００ｎｍの範囲の直径を有する単層膜の小胞を含む。この用語は、約６５ｎｍから約７５ｎｍの直径を有するリポソームも含む。
【００５８】
「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、特定の抗原を認識して結合できる、たとえば免疫系によって、合成によって、または組換えによって生成されるものなどのタンパク質を示す。抗体は当該技術分野において一般的に公知であり、当該技術分野において公知の方法によって調製できる。
【００５９】
「エピトープ」とは抗体が結合する分子であり、それはポリペプチド中のアミノ酸残基の隣接する配列であってもなくてもよく、他の化学構造を有する糖および／または分子を含んでもよい。
【００６０】
ポリヌクレオチドの状況における「特異的に結合する」という用語は、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションを示す。ＤＮＡ／ＤＮＡおよびＤＮＡ／ＲＮＡ両方のハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーを増大させる条件は、当該技術分野において広く公知であり公表されている。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例には、約６５〜７０℃での４×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）におけるハイブリダイゼーション、または約４２〜５０℃での４×ＳＳＣに５０％ホルムアミドを加えたものにおけるハイブリダイゼーションの後に、約６５〜７０℃での１×ＳＳＣにおける１回またはそれ以上の洗浄が行なわれるものが含まれる。
【００６１】
「リガンド」という用語は、受容体を含む、別の分子に結合する分子を示す。
【００６２】
「宿主細胞」とは、あらゆる組換えベクターまたは単離されたポリヌクレオチドのレシピエントとなり得るかまたはレシピエントであった個々の細胞または細胞培養物である。宿主細胞は単一の宿主細胞の子孫を含み、その子孫は、自然の、偶発的な、または計画的な突然変異および／または変化のために、必ずしも（形態または全体のＤＮＡ相補体が）元の親細胞と完全に同一でないことがある。宿主細胞は、インビボまたはインビトロで本発明の組換えベクターまたはポリヌクレオチドによってトランスフェクトまたは感染された細胞を含む。本発明の組換えベクターを含む宿主細胞は、「組換え宿主細胞」と呼ばれてもよい。
【００６３】
「試料」とは、患者に由来するあらゆる生体試料である；この用語は、生物学的な流体、たとえば血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液、涙、唾液、リンパ、透析液、洗浄液、精液、およびその他の液体サンプルなど、ならびに生体由来の細胞および組織を含むがそれらに限定されない。この用語は細胞またはその細胞に由来する細胞およびその子孫も含み、それは培養物中の細胞、細胞上清および細胞溶解物を含む。この用語はさらに、器官または組織培養由来の流体、組織生検サンプル、腫瘍生検サンプル、糞便サンプル、および生理学的組織から抽出された流体、ならびに固体組織から分離された細胞、組織切片、および細胞溶解物を含む。この定義は、たとえば試薬による処理、可溶化、またはポリヌクレオチドもしくはポリペプチドなどの特定の成分に対する濃縮などによって、調達後にあらゆる態様で処理されたサンプルを含む。この用語には、患者サンプルの誘導体および画分も含まれる。患者サンプルは、診断、予後またはその他のモニタリングアッセイに用いられてもよい。試料はヒトの患者またはヒト以外の哺乳動物からのものであってもよい。
【００６４】
本明細書において用いられる「処置」は、ヒトを含む哺乳動物における疾患に対する治療のあらゆる投与または適用を含み、それは、たとえば退縮をもたらすか、または機能の欠失、欠落もしくは障害を回復もしくは修復することなどによる疾患の阻害、疾患の進行の阻止、もしくは疾患の緩和；または非効率的なプロセスの刺激を含む。この用語は、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを含み、ヒトを含む哺乳動物における病理学的状態または障害のあらゆる処置を含む。その効果は、障害もしくはその症状を完全もしくは部分的に防ぐという観点から予防的であってもよく、ならびに／または、障害および／もしくはその障害に起因し得る悪影響に対する部分的もしくは完全な治癒という観点から治療的であってもよい。よって本発明は、処置および予防の両方を提供する。本発明は以下を含む：（１）障害を起こす可能性があるがまだ症状が出ていない対象において、障害の発生または再発を防ぐこと、（２）障害の進行を阻止するなど、障害を阻害すること、（３）障害または少なくともそれに伴う症状を停止または終結させることによって、宿主がもう障害またはその症状に苦しまないようにすること、たとえば、機能の欠失、欠落もしくは障害を回復もしくは修復するか、または非効率的なプロセスを刺激することなどによって、障害またはその症状の退縮をもたらすことなど、または（４）障害またはそれに伴う症状を緩和、軽減または改善すること、ここで改善とは広い意味で用いられ、少なくとも、炎症、痛みおよび／または腫瘍サイズなどのパラメータの大きさの低減を示す。
【００６５】
「医薬的に許容できる担体」とは、あらゆる従来型の非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、封入材料（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｎｇ ｍａｔｅｒｉａｌ）、調合補助剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ａｕｘｉｌｉａｒｙ）、または賦形剤を示す。医薬的に許容できる担体は、使用される用量および濃度ではレシピエントに対して非毒性であり、処方物の他の成分と適合できる。
【００６６】
本明細書における「医薬組成物」とは、当該技術分野において従来のものであって、かつ治療、診断または予防の目的のための対象への投与に適した、たとえば医薬的に許容できる担体または賦形剤などの担体を通常含有する混合物を示す。医薬組成物は、細胞または培養液中にポリペプチドまたはポリヌクレオチドが存在する細胞培養物を含んでもよい。たとえば、経口投与のための組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放性処方物、口腔リンス液、または粉末を形成してもよい。
【００６７】
「疾患」とは、医療介入を必要とするか、または医療介入を行なうことが望ましいようなあらゆる状態、感染症、障害または症候群を示す。こうした医療介入は、処置、診断および／または予防を含み得る。
【００６８】
「癌」とは、あらゆる異常な細胞または組織の成長であり、たとえば悪性、前悪性または良性の腫瘍などである。癌は、細胞の無制御の増殖を特徴とし、それは周囲の組織に侵入することもしないこともあるし、新たな身体部位に転移することもしないこともある。癌は、上皮細胞の癌である癌腫を含む；癌腫は、扁平上皮癌、腺癌、黒色腫、および肝癌を含む。癌は、間充織由来の腫瘍である肉腫も含む；肉腫は、骨原性肉種、白血病およびリンパ腫を含む。癌は、１つまたはそれ以上の新生物細胞型を含んでもよい。癌という用語は、肺癌、結腸癌、乳癌、前立腺癌、肝癌、膵癌、および口腔癌を含む。
【００６９】
細胞系
有用な細胞系は、Ａ５４９、ヒト肺扁平上皮癌系、ＣＬ１−５、高転移性ヒト肺腺癌系、Ｈ２３、ヒト肺腺癌系、Ｈ４６０、ヒト肺大細胞癌系、ＰＣ１３、ヒト肺癌系、ＮＰＣ−ＴＷ０１、ヒト上咽頭癌系、ＳＡＳ、ヒト口腔扁平上皮癌系、ＰａＣａ、ヒト膵臓癌、ＮＮＭ、ヒト正常鼻粘膜上皮、および線維芽細胞を含む。Ａ５４９、Ｈ２３、Ｈ４６０、ＰＣ１３、ＰａＣａおよびＳＡＳは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能である。ＣＬ１−５およびＮＰＣ−ＴＷ０１細胞系は、それぞれ（Ｃｈｕら、１９９７）および（Ｌｉｎら、１９９０）によって樹立された。
【００７０】
ペプチドの調製
本発明のペプチドは、当該技術分野において公知の方法を用いて発現できる。本発明のペプチドを生産するためには、細胞に基づく方法および無細胞の方法が好適である。一般的に、細胞に基づく方法は、インビトロで宿主細胞に核酸構築物を導入する工程と、発現に適した条件下で宿主細胞を培養する工程と、次いで培養液もしくは（たとえば、宿主細胞を破壊することなどによって）宿主細胞のいずれかから、またはその両方からペプチドを採取する工程とを含む。本発明は、当該技術分野において周知の無細胞インビトロ転写／翻訳方法を用いてペプチドを生成する方法も提供する。
【００７１】
好適な宿主細胞は原核細胞または真核細胞を含み、たとえば細菌、酵母、真菌、植物、昆虫および哺乳動物の細胞などを含む。
【００７２】
典型的には、異種ペプチドは、修飾されていても修飾されていなくても、上述のとおりに単独で、または融合タンパク質として発現されてもよく、分泌シグナルだけでなく分泌リーダー配列を含んでもよい。本発明の分泌リーダー配列は、特定のタンパク質をＥＲに向けてもよい。ＥＲは膜結合タンパク質をその他のタンパク質から分離する。一旦ＥＲに局在化されると、タンパク質はさらに、分泌小胞を含む小胞；細胞膜、リソソーム、およびその他の小器官への分配のためにゴルジ体に向けられてもよい。
【００７３】
加えて、ペプチドにペプチド部分および／または精製タグが加えられてもよい。こうした領域は、ポリペプチドの最終的調製の前に取除かれてもよい。ポリペプチドにペプチド部分を付加することによって、特に分泌または排出を誘発したり、安定性を改善したり、精製を容易にしたりすることは、当該技術分野においてよく知られた慣用技術である。好適な精製タグは、たとえばＶ５、ポリヒスチジン、アビジンおよびビオチンなどを含む。ペプチドをビオチンなどの化合物に結合することは、当該技術分野において周知の技術を用いて達成できる。（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ編（１９９６）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ；Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）。ペプチドは、当該技術分野において公知の技術を用いて、放射性同位元素、毒素、酵素、蛍光標識、コロイド金、核酸、ビノレルビン、およびドキソルビシンにも結合できる。（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ編（１９９６）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ；Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｓｔｅｆａｎｏら（２００６）Ａ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｏｆ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ｗｉｔｈ ｌａｃｔｏｓａｍｉｎａｔｅｄ ａｌｂｕｍｉｎ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ｄｒｕｇ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ａｌｌ ｔｈｅ ｆｏｒｍｓ ｏｆ ｒａｔ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｇｒａｄｅ．Ｌｉｖｅｒ Ｉｎｔ．２６：７２６−３３）。毒素は当該技術分野において公知のものである。ＫｒｅｉｔｍａｎおよびＰａｓｔａｎ、Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ．７：１３０１−１１（２００６）。
【００７４】
本発明における使用のために好適な融合パートナーは、たとえば、フェチュイン、ヒト血清アルブミン、Ｆｃ、および／またはそれらの断片の１つもしくはそれ以上などを含む。たとえばポリエチレングリコール結合体などの結合タンパク質も提供される。
【００７５】
本発明のペプチドは、当該技術分野において公知の技術を用いて化学的に合成することもできる（例、Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、３１０：１０５ １１１（１９８４）；Ｇｒａｎｔ編（１９９２）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａ Ｕｓｅｒｓ Ｇｕｉｄｅ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．；米国特許第６，９７４，８８４号を参照）。たとえば、ペプチド合成機の使用によって、または当該技術分野において公知の固相法の使用を通じて、ポリペプチドの断片に対応するポリペプチドを合成できる。
【００７６】
さらに、所望であれば、非古典的アミノ酸または化学的アミノ酸類似体を置換または追加としてポリペプチド配列に導入してもよい。非古典的アミノ酸は、一般的なアミノ酸のＤ異性体、２，４−ジアミノ酪酸、ａ−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、ｇ−Ａｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ｂ−アラニン、フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸、たとえばｂ−メチルアミノ酸、Ｃａ−メチルアミノ酸、Ｎａ−メチルアミノ酸など、および一般的なアミノ酸類似体を含むがそれらに限定されない。さらに、アミノ酸はＤ（右旋性（ｄｅｘｔｒｏｒｏｔａｒｙ））またはＬ（左旋性（ｌｅｖｏｒｏｔａｒｙ））であってもよい。
【００７７】
本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィ、リン酸セルロースクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、およびレクチンクロマトグラフィを含むがそれらに限定されない標準的な方法によって、化学合成および組換え細胞培養物から回収および精製されてもよい。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィ（「ＨＰＬＣ」）が精製に使用される。単離および／または精製の際にポリペプチドが変性したときは、タンパク質をリフォールディングするための周知の技術を用いて活性の立体構造を再生してもよい。
【００７８】
本発明のペプチドまたはペプチド模倣薬（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）は、さまざまな親水性ポリマーの１つまたはそれ以上で修飾するか、またはそれと共有結合させることによって、ペプチドの可溶性および循環半減期を増加させることができる。ペプチドに結合させるために好適な非タンパク質親水性ポリマーは、ポリアルキルエーテル、たとえばポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールによって例示されるものなど、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリオキシアルケン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、セルロースおよびセルロース誘導体、デキストランおよびデキストラン誘導体を含むがこれらに限定されない。一般的に、こうした親水性ポリマーの平均分子量は、約５００ダルトンから約１００，０００ダルトン、約２，０００ダルトンから約４０，０００ダルトン、または約５，０００ダルトンから約２０，０００ダルトンの範囲である。ペプチドは、以下において示される方法のいずれかを用いて、こうしたポリマーによって誘導化されるか、またはそれらに結合されてもよい（Ｚａｌｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．（１９９５）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、６：１５０−１６５；Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉ，Ｃ．ら（１９９５）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、６：６２−６９；米国特許第４，６４０，８３５号；第４，４９６，６８９号；第４，３０１，１４４号；第４，６７０，４１７号；第４，７９１，１９２号、第４，１７９，３３７号、またはＷＯ９５／３４３２６号）。
【００７９】
リポソームの調製
リポソームを調製するためのさまざまな方法が当該技術分野において公知であり、そのいくつかはＬｉｃｈｔｅｎｂｅｒｇおよびＢａｒｅｎｈｏｌｚによって、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ、第３３巻、３３７−４６２（１９８８）に記載されている。以前に記載される薄膜水和反応（ｔｈｉｎ ｆｉｌｍ ｈｙｄｒａｔｉｏｎ）と、反復押出し（ｒｅｐｅａｔｅｄ ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ）との標準的な方法の組合せによって、小単層膜リポソーム（ｓｍａｌｌ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ：ＳＵＶ、サイズ＜１００ｎｍ）を調製できる（Ｔｓｅｎｇら、１９９９）。特にリポソームによるＤＮＡの封入を含む調製法、およびリポソーム介在型トランスフェクションへの直接適用を有する方法は、ＨｕｇおよびＳｌｅｉｇｈｔら（１９９１）によって記載されている。リポソームを作成する方法は、米国特許第６，３５５，２６７号および米国特許第６，６６３，８８５号にも開示されている。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ：ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物による逆位相蒸着法によって生成できる。リポソームを定められたポアサイズのフィルタから押出すことによって、所望の直径のリポソームを得る。
【００８０】
リポソームは、たとえばＴａｉｗａｎ Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｔａｉｐｅｉ Ｔａｉｗａｎなどの供給源から商業的に入手することもできる。付加的な商業的に入手可能なリポソームは、ＴＬＣ−Ｄ９９、Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ、Ｄｏｘｉｌ、ＤａｕｎｏＸｏｍｅ、ＡｍＢｉｓｏｍｅ、ＡＢＥＬＣＥＴ、ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｃｅ（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）、ならびにＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥおよびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎを含む。
【００８１】
本発明のリポソームは、リン脂質から調製されることが最も多いが、疎水性および親水性部分の両方を有する類似の分子形および寸法のその他の分子が用いられてもよい。本発明の目的に対して、すべてのこうした好適なリポソーム形成分子は、本明細書において脂質と呼ばれる。リポソームの調製には、１つまたはそれ以上の天然に発生する脂質化合物および／または合成脂質化合物が用いられてもよい。
【００８２】
リポソームは、親水性基の選択によって、アニオン、カチオンまたは中性であってもよい。たとえば、リン酸基または硫酸基を有する化合物が用いられるときには、得られるリポソームはアニオンになる。アミノを含有する脂質が用いられるときには、リポソームは正電荷を有し、カチオンリポソームとなる。
【００８３】
本発明において有用な最初のリポソームを形成するための代表的な好適なリン脂質または脂質化合物は、リン脂質関連材料、たとえばホスファチジルコリン（レシチン）、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、ホスファチジルエタノールアミン（ケファリン）、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、リン酸ジセチル、ホスファチジルコリン、およびジパルミトイルホスファチジルグリセロールなどを含むが、これらに限定されない。付加的な非リン（ｎｏｎ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓ）脂質は、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、アセチルパルミチン酸塩、グリセロールリシノール酸塩、ヘキサデシルステアリン酸塩（ｈｅｘａｄｅｃｙｌ ｓｔｅｒａｔｅ）、イソプロピルミリステート、両性アクリルポリマー、脂肪酸、脂肪酸アミド、コレステロール、コレステロールエステル、ジアシルグリセロール、ジアシルグリセロールコハク酸塩などを含むが、これらに限定されない。
【００８４】
本発明における使用のためのリポソーム調製物は、カチオン（正に荷電した）調製物、アニオン（負に荷電した）調製物、および中性調製物を含む。
【００８５】
化合物のリポソーム内への遠隔負荷（ｒｅｍｏｔｅ ｌｏａｄｉｎｇ）には、膜貫通勾配の形成が用いられる（ＣｅｈおよびＬａｓｉｃ、１９９５）。この方法は、リポソーム内に負荷すべき化合物とボロン酸化合物とを懸濁リポソームとともにインキュベートすることによって、リポソーム内に化合物を蓄積させる工程を含む（Ｃｅｈ Ｂ．およびＬａｓｉｃ Ｄ．Ｄ．、１９９５；米国特許第６，０５１，２５１号）。
【００８６】
リン酸塩アッセイを用いてリポソーム濃度を定めてもよい。リン酸塩アッセイの１つは、モリブデン酸塩とマラカイトグリーン色素との相互作用に基づくものである。主要な原理は、無機リン酸塩とモリブデン酸塩とを反応させて無色の非還元リンモリブデン酸塩複合体を形成することを含み、この複合体は酸性条件下で還元されるときに青色の複合体に変えられる。リンモリブデン酸塩はマラカイトグリーンと複合体を形成すると２０倍から３０倍多く発色する。最終生成物である還元された緑色の可溶性複合体は、６２０ｎｍにおける吸光度によって測定され、これは溶液中の無機リン酸塩の直接的な尺度である。
【００８７】
いくつかの実施形態において、リポソームは、当該技術分野において多様なものが公知である医薬的に許容できる担体、賦形剤および希釈剤を有する処方物中に与えられる。これらの医薬的担体、賦形剤および希釈剤は、ＵＳＰ医薬賦形剤リストにリストされるものを含む。ＵＳＰ ａｎｄ ＮＦ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，Ｌｉｓｔｅｄ ｂｙ Ｃａｔｅｇｏｒｉｅｓ、ｐ．２４０４−２４０６、ＵＳＰ ２４ ＮＦ １９、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．（ＩＳＢＮ１−８８９７８８−０３−１）。医薬的に許容できる賦形剤、たとえばビヒクル、アジュバント、担体または希釈剤は、一般に容易に入手可能である。さらに、医薬的に許容できる補助的物質、たとえばｐＨ調整および緩衝剤、張度調整剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ ａｄｊｕｓｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、安定剤、湿潤剤などは、一般に容易に入手可能である。
【００８８】
好適な担体は、水、デキストロース、グリセロール、食塩水、エタノール、およびそれらの組合せを含むがこれらに限定されない。担体は、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、または処方物の効果を高めるアジュバントなどの付加的な薬剤を含有してもよい。局所的担体は、液体石油、イソプロピルパルミテート、ポリエチレングリコール、エタノール（９５％）、水中のポリオキシエチレンモノラウレート（５％）、または水中のラウリル硫酸ナトリウム（５％）を含む。必要に応じて他の材料、たとえば抗酸化剤、湿潤剤、粘性安定剤、および類似の薬剤などが加えられてもよい。たとえばＡｚｏｎｅなどの経皮浸透促進剤が含まれてもよい。
【００８９】
医薬用量の形において、本発明の組成物は医薬的に許容できる塩の形で投与されてもよく、さらに単独で用いられても、または他の医薬的に活性の化合物との適切な結合および組合せにおいて用いられてもよい。対象組成物は、可能な投与のモードに従って調合される。
【００９０】
処置の方法
治療薬を含む本発明のペプチドまたはリポソームは、全身的な注射、たとえば静脈注射などによって；または関連部位への注射または適用、たとえば腫瘍への直接注射、もしくは手術中にその部位が露出しているときにはその部位への直接適用などによって；または、たとえば皮膚に障害があるときなどには局所適用によって、処置を必要とする対象に投与されてもよい。
【００９１】
本発明のペプチドまたはリポソームは、単独療法として用いられてもよい。代替的には、本発明のペプチドまたはリポソームは、癌を処置するための標準的な化学療法または放射線療法と組合せて用いられてもよい。
【００９２】
本発明のペプチドは、処置のために抗体を癌細胞にターゲティングするために用いられてもよい。一実施形態においては、本発明のペプチドが処置を必要とする対象に投与された後に、そのペプチドに特異的に結合する抗体が投与される。ターゲティングされる抗体は、抗体依存性の細胞毒性または相補体依存性の細胞毒性を媒介してもよく、または標的分子の基礎をなす機能を変更してもよい。こうした抗体は抗体結合体の形で用いられることによって、標的組織に治療効果を有する薬剤を直接送達してもよい。こうした薬剤は、放射性核種、毒素、化学療法薬物および抗血管新生化合物を含む。
【００９３】
薬剤の投与は、経口、口腔、経鼻、直腸、非経口、腹膜内、皮内、経皮、皮下、静脈内、動脈内、心臓内、心室内、頭蓋内、気管内、および髄腔内投与などを含むさまざまな方法で、または移植もしくは吸入による別様で達成されてもよい。よって、対象組成物は固体、半固体、液体または気体の形の調製物、たとえば錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、溶液、座薬、注射薬、吸入剤、およびエアロゾルなどに処方されてもよい。以下の方法および賦形剤は単なる例示であって、いかなる態様でも限定するものではない。
【００９４】
好適な賦形剤ビヒクル媒体は、たとえば水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組合せである。加えて、所望であれば、ビヒクルは少量の補助的物質、たとえば湿潤剤または乳化剤またはｐＨ緩衝剤などを含有してもよい。こうした投薬形態を調製する実際の方法は、当業者に公知であるか、または明らかになる。いずれにせよ、投与される組成物または処方物は、処置される対象における所望の状態を達成するために適切な量の薬剤を含有する。
【００９５】
本発明のリポソームまたはペプチドは、水性溶媒または非水系溶媒、たとえば植物油またはその他の類似の油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸またはプロピレングリコールのエステルなどに；所望であれば従来の添加剤、たとえば溶解剤、等張剤、懸濁剤、乳化剤、安定剤、および保存剤などとともに、溶解、懸濁または乳化させることによって、注射のための調製物に処方されてもよい。当該技術分野における従来どおりの、経口または非経口送達のためのその他の処方物が用いられてもよい。
【００９６】
本発明のリポソームまたはペプチドは、癌の処置および血管新生の阻害に用いられてきたさまざまな薬物の１つまたはそれ以上を含んでもよく、その薬物は、ビノレルビン、シスプラチン、ゲムシタビン、パクリタキセル、エトポシド、Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（ミトキサントロン）、アクチノマイシンＤ、カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｈｅｃｉｎ）（またはその水溶性誘導体）、メトトレキサート、マイトマイシン（たとえばマイトマイシンＣなど）、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、シクロホスファミド、ならびに抗新生物性抗生物質、たとえばドキソルビシンおよびダウノマイシンなど、またはたとえばＤｅ Ｖｉｔａら、２００１などに記載されるその他のものを含むが、それらに限定されない。リポソームまたはペプチドは、細胞毒性薬物、オリゴヌクレオチド、毒素および放射性分子も含んでもよい。リポソームまたはペプチドは、（Ｎｇら、２００６）に記載される抗ＶＥＧＦアプタマーなどの化合物も含んでもよい。
【００９７】
癌療法において用いられる薬物は、癌細胞に対する細胞毒性もしくは細胞増殖抑制の効果を有してもよく、または悪性細胞の増殖を低減させてもよい。癌処置に用いられる薬物はペプチドであってもよい。本発明のリポソームまたはペプチドは、放射線療法と組合されてもよい。本発明のリポソームまたはペプチドは、（Ｄｅ Ｖｉｔａら（２００１））に記載される治療アプローチとともに付属的に用いられてもよい。本発明のリポソームまたはペプチドと第２の抗癌剤とが癌細胞に対して相乗効果を及ぼすような組合せに対しては、第２の薬剤の用量は、第２の薬剤が単独で投与されるときの標準的な用量よりも減らされてもよい。癌細胞の感受性を増加させるための方法は、本発明のリポソームまたはペプチドを、癌細胞の感受性を高めるために有効な量の化学療法の抗癌薬と共投与する（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）工程を含む。共投与は同時投与であっても、または非同時投与であってもよい。本発明のリポソームまたはペプチドは、処置療法の過程において他の治療薬剤とともに投与されてもよい。一実施形態において、本発明のリポソームまたはペプチドと、他の治療薬剤との投与は連続的である。適切な時間経過は、患者の病気の性質および患者の状態などの因子に従って医師によって選択されてもよい。
【００９８】
診断方法
疾患特異的バイオマーカの検出は、有効なスクリーニング戦略を提供する。早期の検出は早期の診断を与えるだけでなく、癌の場合には多形性をスクリーニングし、手術後の残余腫瘍細胞および潜在性の転移、すなわち腫瘍再発の初期指標を検出することを可能にできる。よって疾患特異的バイオマーカの早期検出は、診断前、処置の最中および寛解期の患者における生存性を改善できる。
【００９９】
本発明のペプチドは、疾患に対する診断または予後として用いられてもよい。ペプチドは、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、蛍光、免疫蛍光、免疫組織化学、またはオートラジオグラフィを含むがこれらに限定されないいくつかの方法で、診断として用いられてもよい。
【０１００】
本発明の抗体は、癌を検出するために本発明のペプチドと組合せて用いられてもよい。いくつかの実施形態において、そのアッセイは、癌細胞に結合した本発明のペプチドと抗体との結合を検出する結合アッセイである。対象ポリペプチドまたは抗体は固定されてもよく、対象ポリペプチドおよび／または抗体は検出可能になるよう標識されてもよい。たとえば、抗体は直接標識されても、または標識された二次抗体によって検出されてもよい。すなわち、抗体に対する好適な検出可能な標識は、目的のタンパク質に対する抗体を標識する直接標識と、目的のタンパク質に対する抗体を認識する抗体を標識する間接標識とを含む。別の実施形態において、ペプチドは標識を含み、ペプチドの組織への結合は標識の存在をアッセイすることによって検出される。
【０１０１】
スクリーニング方法
本発明は、本発明のペプチドに結合する生体リガンドを同定するための方法を提供する。
【０１０２】
方法の１つにおいて、本発明のペプチドは、２ハイブリッドアッセイまたは３ハイブリッドアッセイ（例、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓら（１９９３）Ｃｅｌｌ、７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌら（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１４：９２０−９２４；Ｉｗａｂｕｃｈｉら（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、８：１６９３−１６９６；およびＳｕｔｅｒら（２００６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、４０：６２５−４４を参照）における「ベイトタンパク質」として用いられることによって、本発明のペプチドと結合または相互作用する他のタンパク質を同定することができる。
【０１０３】
別の方法においては、本発明のペプチドが細胞抽出物とともにインキュベートされて、本発明のペプチドに結合する分子が同定される。方法の１つにおいて、本発明のペプチドはＨＰＬＣカラムなどの固体支持上に固定され、本発明のペプチドの標的分子への結合を促進する条件下で細胞抽出物が固定ペプチドに露出される。結合した分子は溶出され、質量分析法などの標準的な技術を通じて同定される。
【０１０４】
標的タンパク質のアフィニティ精製
肺癌細胞からタンパク質を溶解緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３０μｇ／ｍｌのＤＮアーゼ、１％のノニデットＰ−４０、およびプロテアーゼ阻害剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｔａｂｓ；Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））によって４℃にて３０分間抽出する。１５，０００×ｇでの２０分間の遠心分離によって、タンパク質溶解物から．残屑を取除く。溶解物を最初に対照ペプチドを含有する１ｍｌカラム上で予め清澄にし、ＳＰ５−５２またはＳＰ５−２ペプチド固定アフィニティカラムの第２の１ｍｌカラムにフロースルーを直接添加する。カラムを洗浄して溶出する。単離されたタンパク質の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８％ポリアクリルアミド）によってモニタし、銀染色によって視覚化する。所望のタンパク質バンドを、トリプシンによるインゲル（ｉｎ−ｇｅｌ）消化のためにゲルから切出す。その結果得られるポリペプチドをさらに質量分析法によって分析する。
【実施例】
【０１０５】
実施例は本発明を純粋に例示することが意図され、したがっていかなる態様でも本発明を制限すると考えられるべきでなく、さらに上記において議論した本発明の詳細な局面および実施形態をも説明するものである。
【０１０６】
実施例１．ファージディスプレイバイオパニング
Ａ５４９、ＣＬ１−５、Ｈ２３およびＨ４６０細胞を、２ｇの重炭酸塩、１リットル当り４０ｍｇのカナマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン、および１０％のウシ胎児血清を補ったＲＰＭＩ１６４０中で、９５％の空気および５％のＣＯ２（ｖ／ｖ）の加湿された環境下で３７℃にて生育した。ＮＰＣ−ＴＷ０１、ＰＣ１３、ＳＡＳ、ＰａＣａ、ＮＮＭ、および線維芽細胞を、３．７ｇの重炭酸塩、１リットル当り４０ｍｇのカナマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン、および１０％のウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ中で、９０％の空気および１０％のＣＯ２（ｖ／ｖ）の加湿された環境下で３７℃にて生育した。
【０１０７】
ＮＳＣＬＣ、ＣＬ１−５細胞を無血清ＲＰＭＩで洗浄し、次いでブロッキング緩衝液（１％ＢＳＡを含有する無血清ＲＰＭＩ）で４℃にて３０分間ブロックした。細胞をＵＶ処理した不活性対照ヘルパーファージ（挿入なしのファージ）とともに４℃にて１時間インキュベートした。非特異的結合を阻害した後、ファージディスプレイペプチドライブラリ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、ＭＡ、ＵＳＡ）を加えて４℃にて１時間インキュベートした。結合したファージを、氷上の溶解緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ ７．５、１％のＮＰ−４０、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ）によって溶出した。この溶出されたファージプールを、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＥＲ２７３８培養物（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、ＭＡ、ＵＳＡ）中で増殖させて力価測定した。回収されたファージを、その後のラウンドのパニングに対する入力として用いた。第５ラウンドの選択後の溶出ファージを、ＬＢ／ＩＰＴＧ／Ｘ−Ｇａｌプレート上で力価測定した。ファージ力価測定のために、５ｍｌのＬＢにＥＲ２７３８の単一コロニーを接種し、対数期の中間部（ＯＤ６００約０．５）まで振とうしながらインキュベートした。培養物が対数期の中間部に達したとき、２００μｌの培養物をミクロチューブに分配し、各希釈の１０μｌを各チューブに加えた後にチューブを迅速にボルテックスして、室温で５分間インキュベートした。感染した細胞を１つずつＡｇａｒｏｓｅ Ｔｏｐ（Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｏｃｋｌａｎｄ，Ｉｎｃ．、ＭＥ、ＵＳＡ）を含有する培養管に移し、迅速に混合して直ちに予め温めたＬＢ／ＩＰＴＧ／Ｘ−Ｇａｌプレートの上に注ぐ。
【０１０８】
９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｆａｌｃｏｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）に癌細胞および対照細胞を別々に播種した。細胞を無血清ＤＭＥＭで洗浄し、次いでブロッキング緩衝液でブロックした。次いで、個々のファージ粒子を細胞被覆プレートに加えて４℃にて２時間インキュベートした後、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を結合したマウス抗Ｍ１３モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｓｗｅｄｅｎ）とともにインキュベートし、次いでペルオキシダーゼ基質ｏ−フェニレンジアミン二塩化水素化物（ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ：ＯＰＤ；Ｓｉｇｍａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）とともにインキュベートした。４９０ｎｍにてマイクロプレートリーダを用いて反応を読取った。
【０１０９】
選択されたファージクローンをＤＮＡ配列決定によってさらに分析した。精製ファージのＤＮＡ配列を、自動ＤＮＡ配列決定装置（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてジデオキシヌクレオチド鎖終止法に従って決定した。配列決定は、ｐＩＩＩ遺伝子配列に対応するプライマ５’−ＣＣＣＴＣＡＴＡＧＴＴＡＧＣＧＴＡＡＣＧ−３’［配列番号２１］によって行なわれた。ファージディスプレイペプチド配列は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）プログラムを用いて翻訳およびアラインメントされた。
【０１１０】
４ラウンドのバイオパニングの後、ＮＳＣＬＣ、ＣＬ１−５細胞から溶出したファージの力価は第１ラウンドの３０倍に増加し、第５ラウンドの選択では４０倍に増加した（図１）。第３から第５バイオパニングラウンドからの濃縮ファージをランダムに選択して配列決定した。本発明者らはより高いＣＬ１−５結合活性を有するファージクローンの配列も決定した。
【０１１１】
ファージＰＣ３−１、ＰＣ４−１、ＰＣ４−５、ＰＣ５−２およびＰＣ５−４は、コンセンサスモチーフのトリプトファン（Ｗ）−スレオニン（Ｔ）／チロシン（Ｙ）−チロシン（Ｙ）（表１）を提示する。興味深いことに、ＰＣ５−２は第３（ＰＣ３−１）、第４（ＰＣ４−１）および第５（ＰＣ５−２）バイオパニングラウンドにおいても現れた。各バイオパニングラウンドにおけるＰＣ５−２の頻度は、第３サイクルの２０％（１／５）から第５サイクルの９０％（２７／３０）まで増加した（表１）。本発明者らはさらなる研究のために、ペプチドＴＤＳＩＬＲＳＹＤＷＴＹ（ＳＰ５−２）に注目した。
【０１１２】
実施例２．免疫組織化学による癌細胞に結合しているファージの同定
ＰＣ５−２がＮＳＣＬＣ細胞に特異的に結合できるかどうかを調べるために、本発明者らは免疫組織化学を用いて異なる細胞型においてファージ粒子を局在化させた。すべての癌細胞系、ＮＮＭおよび線維芽細胞をカバーガラス上に蒔いて、約８０％集密になるまで生育した。カバーガラスをブロッキング緩衝液中でインキュベートし、１％の過酸化水素に０．１％のＮａＮ３を加えたもので処理して内因性のペルオキシダーゼ活性を遮断し、次いで各選択ファージとともに４℃にて１時間インキュベートした。カバーガラスを洗浄し、ＨＲＰ標識したマウス抗Ｍ１３モノクローナル抗体とともに４℃にて１時間インキュベートした。スライドを３％のホルムアルデヒドで１０分間固定し、ペルオキシダーゼ基質に晒し、ＰＢＳ中の５０％グリセロールによって封入した。
【０１１３】
その結果、ＰＣ５−２はＣＬ１−５およびＰＣ１３を含むＮＳＣＬＣ細胞系に特異的に結合することが示された（図２Ａ、矢印）。このペプチドを提示しなかった対照ヘルパーファージはＣＬ１−５細胞に結合できなかった。ＰＣ５−２は、口腔癌（ＳＡＳ）および上咽頭癌細胞（ＮＰＣ―ＴＷ０１）などの他の癌細胞系、または鼻粘膜からの正常な上皮細胞（ＮＮＭ）にも結合できなかった（図２Ａ）。スケールバー：１０μｍ。
【０１１４】
合成ペプチドと選択されたファージクローンとが同じ結合部位に対して競合するかどうかを調べるために、免疫蛍光染色によってペプチド競合的阻害アッセイを行なった。ターゲティングペプチドＴＤＳＩＬＲＳＹＤＷＴＹ（ＳＰ５−２）［配列番号２］および対照ペプチド（ＲＬＬＤＴＮＲＰＬＬＰＹ）［配列番号２２］を合成して、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．（ＣＡ、ＵＳＡ）による逆相高速液体クロマトグラフィによって＞９５％の純度にまで精製した。同じ会社によってペプチドＮＨ２末端にＦＩＴＣまたはビオチンを付加することによって、これらのペプチドとＦＩＴＣまたはビオチンとの結合を行なった。
【０１１５】
ＣＬ１−５細胞をカバーガラス上で一晩培養し、次いでブロッキング溶液中でＵＶ処理した不活性対照ファージとともにプレインキュベートして非特異的な結合を遮断した。ファージを異なる濃度の合成ペプチドと混合し、細胞とともに４℃にて１時間インキュベートした。スライドをマウス抗Ｍ１３モノクローナル抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）とともにさらにインキュベートした後、ＦＩＴＣ標識したヤギ抗マウス抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）とともにインキュベートした。スライドを洗浄し、封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ、ＣＡ、ＵＳＡ）によって封入した。次いでＬｅｉｃａ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ顕微鏡の下でスライドを調べた。画像をＳｉｍｐｌｅＰＣＩ（Ｃ−ＩＭＡＧＩＮＧ、ＰＡ、ＵＳＡ）ソフトウェアによってマージした。
【０１１６】
その結果、ＣＬ１−５細胞とＰＣ５−２ファージとの結合活性は、ＳＰ５−２合成ペプチドによって用量依存的な態様で阻害されることが示された。２７μｇ／ｍｌのＳＰ５−２によってＰＣ５−２結合活性を完全に阻害できた（図２Ｂ）のに対し、対照ペプチドにはそうした効果はなかった。このアッセイにおいて、対照ファージはＣＬ１−５細胞に結合できず、ＰＣ５−２はＮＰＣ−ＴＷ０１に結合できなかった（図２Ｂ）。スケールバー：１０μｍ。
【０１１７】
さらに、ＣＬ１−５の細胞表面に発現された標的分子を調べるために、本発明者らはフローサイトメトリを用いてＰＣ５−２結合細胞を測定した。肺およびその他の癌細胞系を一晩培養し、次いで５０ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳに懸濁して、ブロッキング緩衝液によって４℃にて３０分間ブロックした。細胞をフロー緩衝液（１％のウシ胎児血清を含有するＰＢＳ）で２回洗浄した。細胞をファージまたはＦＩＴＣ標識ペプチドとともにインキュベートした。ペプチド競合的阻害アッセイに対しては、ファージを異なる濃度の合成ペプチドと混合し、混合物を細胞とともにインキュベートした。冷たいフロー緩衝液で２回洗浄した後、ファージ結合細胞を抗Ｍ１３モノクローナル抗体とともに４℃にて１時間インキュベートし、次いでＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体によって処理した。細胞を冷たいフロー緩衝液で２回洗浄し、次いでフローサイトメータ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に適用した。
【０１１８】
その結果、ＣＬ１−５細胞の４２．６％にＰＣ５−２が結合でき（図２Ｃ、ｃ）、結合したファージはＳＰ５−２ペプチドによって完全に阻害される（図２Ｃ、ｄ）ことが示された。ＰＣ５−２はＳＡＳおよび正常な上皮細胞（ＮＮＭ）に結合できなかった（図２Ｃ、ｅおよびｆ）。ＰＣ５−２は、このアッセイによってＮＰＣ−ＴＷ０１にも結合できなかった（図２Ｃ、ｂ）。これらの結果から、ＣＬ１−５細胞の一部はＰＣ５−２上に提示されるペプチドリガンドによって認識できる未知のタンパク質またはその他の分子を発現することが示された。
【０１１９】
実施例３．ターゲティングペプチドとＮＳＣＬＣ細胞および肺癌生検との結合
ＰＣ５−２に提示されるペプチド配列が確かにＮＳＣＬＣ細胞と相互作用したかどうかを定めるために、本発明者らは免疫蛍光染色を用いたペプチド結合アッセイに対して、ＰＣ５−２ファージの代わりにＦＩＴＣ標識したＳＰ５−２ペプチドを用いた。その結果、ＦＩＴＣ標識したＳＰ５−２はＣＬ１−５、Ｈ４６０、Ａ５４９、ＰＣ１３およびＨ２３を含む異なるＮＳＣＬＣ細胞系に特異的に結合するが、正常な上皮細胞（ＮＮＭ）には結合しないことが示された。ＦＩＴＣ標識した対照ペプチドはこうした結合活性を示さなかった（図３Ａ）。スケールバー：１０μｍ。
【０１２０】
ＦＩＴＣ標識したＳＰ５−２がこれらのＮＳＣＬＣ細胞系に結合できることをさらに確認するために、本発明者らはフローサイトメトリを用いてＳＰ５−２に結合した細胞も測定した。サンプルは実施例２と同様に調製した。フローサイトメトリヒストグラムは、各ＮＳＣＬＣ細胞系に結合しているＦＩＴＣ標識ＳＰ５−２（青）およびＦＩＴＣ標識した対照ペプチドのバックグラウンド（赤）を示す。ＣＬ１−５、Ｈ４６０、Ａ５４９、ＰＣ１３およびＨ２３に対する結合活性の比率は、それぞれ４３％、４５．８％、４４．３％、２０．１％および４４％であった（図３Ｂ）。これらの結果は、ＰＣ５−２およびＳＰ５−２がＮＳＣＬＣ細胞を標的にできることを示した。
【０１２１】
このターゲティングリガンドがヒト肺癌生検試料に対する親和性を有するかどうかをさらに識別するために、本発明者らは免疫組織化学によって肺癌患者からの肺腺癌とＰＣ５−２およびＳＰ５−２との反応性をテストした。ヒトの肺腺癌切片を調製し、スライドをブロッキング緩衝液中で３０分間インキュベートし、次いでメタノール中の３％の過酸化水素と０．１％のＮａＮ３とで処理して内因性のペルオキシダーゼ活性を遮断し、ファージクローンまたはビオチン標識したペプチドとともにインキュベートした。慣用的な免疫組織化学染色を用いて、ＨＲＰに結合した抗Ｍ１３抗体を用いてＰＣ５−２を検出した。
【０１２２】
その結果、ＰＣ５−２およびビオチン標識したＳＰ５−２はどちらもＮＳＣＬＣ生検試料中の腫瘍細胞を認識できたことが示された（図３Ｃ、ａおよびｂ、矢印）。しかし、対照ファージおよびビオチン標識した対照ペプチドはＮＳＣＬＣ生検試料に結合できなかった（図３Ｃ、ｃおよびｄ）。これらのデータは、ＳＰ５−２がＮＳＣＬＣ細胞系および肺癌患者からの癌細胞において発現される未知の分子を認識したことを示す。スケールバー：２５μｍ。
【０１２３】
実施例４．インビボでのＰＣ５−２の腫瘍ホーミング能力の確認。
【０１２４】
インビボでのＰＣ５−２のターゲティング能力を調べるために、ＣＬ１−５由来の腫瘍を有するマウスの尾静脈にファージを注射し、灌流後に回収した。ＳＣＩＤマウスの背外側の側腹部に１×１０７個の癌細胞を皮下注射した。サイズを合せた肺癌由来の腫瘍（腫瘍サイズ約５００ｍｍ３）を有するマウスの尾静脈を通じて、ターゲティングファージまたは対照ファージを注射した。注射の８分後にマウスをジエチルエーテルで処置してマウスを深い麻酔に導いた。次いでマウスに５０ｍｌのＰＢＳを灌流させて未結合ファージを洗浄した。対照器官（脳、心臓および肺）および腫瘍塊を取出して重量測定し、冷たいＰＢＳ−ＰＩ（プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤；Ｒｏｃｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で３回洗浄した。器官および腫瘍サンプルをホモジナイズした。次いで、０．５ｍｌのＥＲ２７３８細菌を３７℃にて３０分間加えることによって、腫瘍塊または対照器官に結合したファージを回収した。溶出されたファージ粒子は、１ｍｇ／ＬのＩＰＴＧ／Ｘ−Ｇａｌの存在下で寒天プレート上で力価測定した。ペプチド競合的阻害実験においては、ファージを１００μｇの合成ペプチドと同時注入した。本発明者らは対照ペプチドも用いた。器官および腫瘍塊をブアン固定液中で２時間固定した。固定の後、サンプルをパラフィンブロックに埋め込んだ。パラフィン切片を脱パラフィンし、再水和して、前述のとおりＭ１３モノクローナル抗体を用いた免疫染色に供した。
【０１２５】
本発明者らは、腫瘍塊および正常な対照器官（脳、肺および心臓）におけるファージの力価を定めた。ＰＣ５−２は、脳、心臓および肺を含む対照器官よりも４倍から１３倍高い濃度で腫瘍塊への特異的ホーミングを示した（図４Ａ）。対照ヘルパーファージは腫瘍組織に対する特異的ターゲティングをまったく示さなかった（図４Ａ）。ＰＣ５−２の腫瘍ホーミング能力は、ペプチド競合的阻害実験によってさらに確認され、この実験においては合成ペプチドＳＰ５−２をＰＣ５−２と同時注入することによって、腫瘍塊からのファージの回収が顕著に阻害された（図４Ｂ）。１００マイクログラムのＳＰ５−２は、腫瘍塊へのＰＣ５−２結合の９２％を阻害したが、同濃度の対照ペプチド（ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｅｐｔｉｄｅ：Ｃｏｎ−Ｐ）にはそうした阻害的効果はなかった（図４Ｂ）。
【０１２６】
免疫染色によってＰＣ５−２の組織分布も研究した。ＮＳＣＬＣ異種移植片を有するＳＣＩＤマウスにＰＣ５−２を静脈内注射し、異種移植片および対照器官を取出して、ファージ結合部位の局在化のために固定した。その結果、ＰＣ５−２は腫瘍組織中に局在することが示された（図４Ｃ、ｄ）。より高倍率では、抗ファージの免疫反応性は細胞膜上で見られ、腫瘍細胞の周囲の細胞質にいくらかの拡散が見られた（図４Ｃ、ｅ）。脳、心臓および肺組織などの正常な器官（図４Ｃ、ａ−ｃ）または対照ファージで処置された腫瘍組織（図４Ｃ、ｉ）には反応生成物はなかった。インビボのホーミング実験において、ＮＳＣＬＣ異種移植片とのＰＣ５−２の特異的ターゲティング能力は、合成ペプチドＳＰ５−２によって阻害された（図４Ｃ、ｊ）。スケールバー：２５μｍ。
【０１２７】
実施例５．ヒト肺癌異種移植片を有するＳＣＩＤマウスの、ＳＰ５−２−Ｌｉｐｏ−ＶｉｎおよびＳＰ５−２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘによる処置。
【０１２８】
進行したＮＳＣＬＣの高齢患者に対する現在の標準的な化学療法は、単剤化学療法のためのビノレルビンの使用である（Ｋｅｌｌｙら、２００１）。肺癌ホーミングペプチドであるＳＰ５−２を癌処置の化学療法の効果を改善するために用いることができるかどうかを定めるために、本発明者らはこのペプチドをビノレルビンを含有するリポソームに結合した（ＳＰ５−２−Ｌｉｐｏ−Ｖｉｎ）。ペプチドをＮＨＳ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ［Ｎ−ヒドロキシスクシニミド−カルボキシル−ポリエチレングリコール（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｏ−ｃａｒｂｏｘｙｌ−ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）（ＰＥＧ；平均分子量、３０００）由来のジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）（ＮＯＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）］に１：１．５のモル比で結合した。この結合は、ペプチジル−ＰＥＧ−ＤＳＰＥを生成するためのペプチドのＮ末端の固有の遊離アミン基を用いて行なった。この反応は完了し、残りのアミノ基の定量化によって確認された。アミノ基はＴＮＢＳ（トリニトロベンゼンスルホネート（Ｔｒｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ））試薬によって測定された（Ｈａｂｅｅｂ ＡＦＳＡ、１９６６）。ＤＳＰＣ（ジステアロイルホスファチジルコリン（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ））、コレステロール、ＰＥＧ−ＤＳＰＥからなるリポソームを硫酸アンモニウム溶液（２５０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ＝５．０、５３０ｍＯｓ）中で５５℃にて水和し、６０℃にて高圧押出し装置（Ｌｉｐｅｘ Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ、Ｃａｎａｄａ）を用いて０．１μｍおよび０．０５μｍのポアサイズのポリカーボネート膜フィルタ（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）から押出した；抗癌薬のビノレルビンまたはドキソルビシンを、１０μｍｏｌのリン脂質当り１ｍｇの薬物の濃度で、遠隔負荷法によってリポソームに封入した。リン酸塩アッセイによってリポソームの最終濃度を定めた。０．２ｍｌの希釈薬物負荷リポソームに１ｍｌの酸性イソプロパノール（８１ｍＭのＨＣｌ）を加えた後、励起波長として４７０ｎｍを用い、放出波長として５８２ｎｍを用いる分光蛍光光度計（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｆ−４５００、Ｈｉｔａｃｈｉ，Ｌｔｄ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）によって、リポソームの内側に閉じ込められたドキソルビシンの量を定めた。サブミクロン粒子分析計（モデルＮ４プラス；Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、Ｈｉａｌｅａｈ、ＦＬ、ＵＳＡ）による動的レーザ散乱によって、小胞サイズを測定した。脂質二重層の遷移温度を超える温度でともにインキュベートした後に、ペプチジル−ＰＥＧ−ＤＳＰＥを予め形成されたリポソームに移した（Ｚａｌｉｐｓｋｙら、１９９７）。以前に記載されたとおりに算出したところ（Ｋｉｒｐｏｔｉｎら、１９９７）、リポソーム当り３００〜５００個のペプチド分子があった。
【０１２９】
４〜６週齢のマウスの背外側の側腹部に、ヒトＮＳＣＬＣ癌細胞を皮下注射した。サイズを合せた腫瘍（腫瘍サイズ約５０〜１００ｍｍ３）を有するマウスを異なる処置群にランダムに割当てて、尾静脈を通じて、ビノレルビン（ＳＰ５−２−Ｌｉｐｏ−Ｖｉｎ）またはドキソルビシン（ＳＰ５−２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ）を含有するＳＰ５−２結合リポソーム、およびＬｉｐｏ−ＶｉｎまたはＬｉｐｏ−Ｄｏｘによって処置した。マウスをこの薬物で８回処置した（１ｍｇ／ｋｇ、週２回）。マウスの体重および腫瘍サイズをノギスで週２回測定した。腫瘍体積は次の式を用いて算出した：長さ×（幅）２×０．５２。平均腫瘍体積の差をＡＮＯＶＡによって評価した。
【０１３０】
サイズを合せたＮＳＣＬＣ異種移植片（約１００ｍｍ３）を有するＳＣＩＤマウス群を、静脈内注射によってＳＰ５−２−Ｌｉｐｏ−Ｖｉｎ、Ｌｉｐｏ−ＶｉｎおよびＰＢＳで別々に処置し、合計ビノレルビン用量を４８ｍｇ／ｋｇ（１２回、２ｍｇ／ｋｇを週２回）とした。
【０１３１】
ＳＰ５−２−Ｌｉｐｏ−Ｖｉｎを受けた腫瘍マウスの群（図５Ａ、群ａ）は、Ｌｉｐｏ−ＶｉｎおよびＰＢＳの群よりも有意に小さいサイズの腫瘍を有することが見出された（Ｐ＜０．００５）（図５Ａ、群ｂおよび群ｃ）。Ｌｉｐｏ−Ｖｉｎ（ＬＶ）群の腫瘍は、ＳＰ５−２−Ｌｉｐｏ−Ｖｉｎ（ＳＰ５−２−ＬＶ）群の腫瘍よりもサイズが６．７５倍大きくなったことが見出された。対照ＰＢＳ群のマウスの腫瘍は、ＳＰ５−２−Ｌｉｐｏ−Ｖｉｎ群の腫瘍よりもサイズが２５倍大きくなったことが見出された（ｎ＝６；＊Ｐ＜０．０１）（図５Ａ）。
【０１３２】
化学療法薬物によってもたらされる可能性のある副作用を評価するために、マウスを週２回体重測定した。そのデータから、ＳＰ５−２−Ｌｉｐｏ−Ｖｉｎ処置群の体重変化（１．３７ｇ増加）は、ＰＢＳ群の体重変化（１．３３ｇ増加）と同様であったことが明らかになった。これに対し、Ｌｉｐｏ−Ｖｉｎ処置群の示した体重増加は少なかった（０．５８ｇしか増加しなかった）（ｎ＝６；＊Ｐ＜０．０５）（図５Ｂ）。
【０１３３】
ターゲティングリポソームの治療効果をさらに特徴付けるために、本発明者らは１０２日間にわたり、ＳＰ５−２−Ｌｉｐｏ−Ｖｉｎ、Ｌｉｐｏ−ＶｉｎまたはＰＢＳによって別々に処置された後の動物の生存率を比較した。ＰＢＳ処置群ではすべての動物が死んだ（生存率０％）。Ｌｉｐｏ−Ｖｉｎ処置群では３匹の動物が死んだ（生存率４０％）が、ＳＰ５−２−Ｌｉｐｏ−Ｖｉｎ処置群は１０２日後に実験が終了したときに８０％という有意に増加した生存率を示した（ｎ＝５；図５Ｃ）。
【０１３４】
ＳＰ５−２は肺癌に対する治療効果を増加できるのかどうかをさらにテストするために、本発明者らはこのターゲティングリガンドを別の抗癌薬であるドキソルビシンにつないで（ＳＰ５−２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ）、別のＮＳＣＬＣであるＨ４６０を処置した。ドキソルビシンは最もよく用いられる抗癌薬の１つである。この化学療法薬剤は、癌細胞に対する細胞毒性効果に加えて、抗血管新生活性を有することが公知である（Ａｒａｐら、１９９８）。そのデータから、ＳＰ５−２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ（ＳＰ５−２−ＬＤ）もＬｉｐｏ−Ｄｏｘ（ＬＤ）よりも高い治療効果を有することが示された（ｎ＝６ ＊Ｐ＜０．０５）（図５Ｄ）。ターゲティングリポソームＳＰ５−２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘは、ＰＢＳで処置したマウスに比べてＨ４６０由来の腫瘍成長を顕著に阻害した（図５Ｄ）。これらの結果から、Ｌｉｐｏ−ＶｉｎまたはＬｉｐｏ−ＤｏｘをターゲティングリガンドＳＰ５−２に結合することによって、動物モデルにおけるヒト肺癌異種移植片を阻害する薬物の効果が高められることが示された。
【０１３５】
表１．ＮＳＣＬＣ細胞によって選択されるファージディスプレイペプチド配列のアラインメント
【０１３６】
【表１】
ａファージディスプレイされるコンセンサスアミノ酸配列を太字体で示す。
【０１３７】
ＰＣ３−１、ＰＣ４−１およびＰＣ５−２は同じアミノ酸配列を提示する。
【０１３８】
ＰＣ４−５およびＰＣ５−４は同じアミノ酸配列を提示する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、および配列番号１９からなる群より選択される、ポリヌクレオチドまたはその変異体。
【請求項２】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、および配列番号２０からなる群より選択される、ペプチドまたはその変異体。
【請求項３】
前記ペプチドは配列番号２またはその変異体を含む、請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
前記ペプチドは配列番号２を含む、請求項３に記載のペプチド。
【請求項５】
第２のペプチドに融合された第１のペプチドを含む融合ペプチドであって、前記第１のペプチドは請求項２に記載のペプチドを含む、融合ペプチド。
【請求項６】
前記第２のペプチドはエピトープを含む、請求項３に記載の融合ペプチド。
【請求項７】
前記ペプチドはより多くまたはそれ以上の標識を含む、請求項２に記載のペプチド。
【請求項８】
前記標識は、ＦＩＴＣ、ビオチンおよび放射性同位元素からなる群より選択される、請求項７に記載のペプチド。
【請求項９】
前記ペプチドは、ドキソルビシン、ビノレルビン、オリゴヌクレオチド、毒素、抗ＶＥＧＦアプタマー、および放射性分子からなる群より選択される１つまたはそれ以上の薬物に結合される、請求項２に記載のペプチド。
【請求項１０】
請求項２に記載のペプチドに結合する抗体。
【請求項１１】
請求項２に記載のペプチドを少なくとも１つ含むリポソーム。
【請求項１２】
前記ペプチドは配列番号２またはその変異体を含む、請求項１１に記載のリポソーム。
【請求項１３】
前記ペプチドは配列番号２を含む、請求項１２に記載のリポソーム。
【請求項１４】
前記リポソームは、ドキソルビシン、ビノレルビン、オリゴヌクレオチド、毒素、抗ＶＥＧＦアプタマー、および放射性分子からなる群より選択される少なくとも１つの薬物をさらに含む、請求項１１に記載のリポソーム。
【請求項１５】
前記薬物はドキソルビシンを含む、請求項１４に記載のリポソーム。
【請求項１６】
前記薬物はビノレルビンを含む、請求項１４に記載のリポソーム。
【請求項１７】
前記リポソームは医薬的に許容できる担体を含む、請求項１４に記載のリポソーム。
【請求項１８】
哺乳動物の疾患を処置する方法であって、処置を必要とする哺乳動物に請求項９に記載のペプチドの有効量を投与する工程を含む、方法。
【請求項１９】
前記哺乳動物はヒトである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
哺乳動物の癌を処置する方法であって、処置を必要とする哺乳動物に、１つまたはそれ以上の化学療法薬物と、
請求項２に記載のペプチドを含む１つもしくはそれ以上のポリペプチドまたはその変異体とを含むリポソームを投与する工程を含む、方法。
【請求項２１】
前記哺乳動物はヒトである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ペプチドは配列番号２またはその変異体を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記ペプチドは配列番号２を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記化学療法薬物は、ドキソルビシン、ビノレルビン、オリゴヌクレオチド、毒素、および抗ＶＥＧＦアプタマー、および放射性分子からなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記化学療法薬物はドキソルビシンである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記化学療法薬物はビノレルビンである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記癌は、ＮＳＣＬＣおよびＳＣＬＣからなる群より選択される肺癌である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
試料中の癌細胞を検出するための方法であって、
ａ）前記試料を請求項２に記載のペプチドに、前記試料の前記癌細胞に前記ペプチドが結合できる条件下で接触させる工程と、
ｂ）請求項１０に記載の抗体を用いて、前記試料の前記癌細胞への前記ポリペプチドの結合を検出する工程と
を含む、方法。
【請求項３０】
試料中の癌を検出するための方法であって、
ａ）前記試料を請求項６に記載の融合ペプチドに、前記試料の前記癌細胞に前記ペプチドが結合できる条件下で接触させる工程と、
ｂ）前記融合タンパク質のエピトープに特異的な抗体を用いて、前記試料への前記融合ペプチドの結合を検出する工程と
を含む、方法。
【請求項３１】
試料中の癌細胞を検出するための方法であって、
ａ）前記試料を請求項７に記載のペプチドに、前記試料の前記癌細胞に前記ペプチドが結合できる条件下で接触させる工程と、
ｂ）前記ペプチドの標識を検出する工程と
を含む、方法。
【請求項３２】
請求項２に記載のペプチドに結合する生体分子を同定する方法であって、
ａ）細胞抽出物を請求項２に記載のペプチドに、前記ペプチドおよびリガンドを含む複合体を形成できる条件下で接触させる工程と、
ｂ）前記複合体を分析して前記リガンドを同定する工程と
を含む、方法。
【請求項３３】
ストリンジェントな条件下で請求項１に記載のポリヌクレオチドまたはその変異体の相補体にハイブリダイズする、ポリヌクレオチド。
【請求項３４】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項３５】
請求項３４に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３６】
請求項３３に記載のポリヌクレオチドによってコードされるペプチド。
【請求項１】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、および配列番号１９からなる群より選択される、ポリヌクレオチドまたはその変異体。
【請求項２】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、および配列番号２０からなる群より選択される、ペプチドまたはその変異体。
【請求項３】
前記ペプチドは配列番号２またはその変異体を含む、請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
前記ペプチドは配列番号２を含む、請求項３に記載のペプチド。
【請求項５】
第２のペプチドに融合された第１のペプチドを含む融合ペプチドであって、前記第１のペプチドは請求項２に記載のペプチドを含む、融合ペプチド。
【請求項６】
前記第２のペプチドはエピトープを含む、請求項３に記載の融合ペプチド。
【請求項７】
前記ペプチドはより多くまたはそれ以上の標識を含む、請求項２に記載のペプチド。
【請求項８】
前記標識は、ＦＩＴＣ、ビオチンおよび放射性同位元素からなる群より選択される、請求項７に記載のペプチド。
【請求項９】
前記ペプチドは、ドキソルビシン、ビノレルビン、オリゴヌクレオチド、毒素、抗ＶＥＧＦアプタマー、および放射性分子からなる群より選択される１つまたはそれ以上の薬物に結合される、請求項２に記載のペプチド。
【請求項１０】
請求項２に記載のペプチドに結合する抗体。
【請求項１１】
請求項２に記載のペプチドを少なくとも１つ含むリポソーム。
【請求項１２】
前記ペプチドは配列番号２またはその変異体を含む、請求項１１に記載のリポソーム。
【請求項１３】
前記ペプチドは配列番号２を含む、請求項１２に記載のリポソーム。
【請求項１４】
前記リポソームは、ドキソルビシン、ビノレルビン、オリゴヌクレオチド、毒素、抗ＶＥＧＦアプタマー、および放射性分子からなる群より選択される少なくとも１つの薬物をさらに含む、請求項１１に記載のリポソーム。
【請求項１５】
前記薬物はドキソルビシンを含む、請求項１４に記載のリポソーム。
【請求項１６】
前記薬物はビノレルビンを含む、請求項１４に記載のリポソーム。
【請求項１７】
前記リポソームは医薬的に許容できる担体を含む、請求項１４に記載のリポソーム。
【請求項１８】
哺乳動物の疾患を処置する方法であって、処置を必要とする哺乳動物に請求項９に記載のペプチドの有効量を投与する工程を含む、方法。
【請求項１９】
前記哺乳動物はヒトである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
哺乳動物の癌を処置する方法であって、処置を必要とする哺乳動物に、１つまたはそれ以上の化学療法薬物と、
請求項２に記載のペプチドを含む１つもしくはそれ以上のポリペプチドまたはその変異体とを含むリポソームを投与する工程を含む、方法。
【請求項２１】
前記哺乳動物はヒトである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ペプチドは配列番号２またはその変異体を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記ペプチドは配列番号２を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記化学療法薬物は、ドキソルビシン、ビノレルビン、オリゴヌクレオチド、毒素、および抗ＶＥＧＦアプタマー、および放射性分子からなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記化学療法薬物はドキソルビシンである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記化学療法薬物はビノレルビンである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記癌は、ＮＳＣＬＣおよびＳＣＬＣからなる群より選択される肺癌である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
試料中の癌細胞を検出するための方法であって、
ａ）前記試料を請求項２に記載のペプチドに、前記試料の前記癌細胞に前記ペプチドが結合できる条件下で接触させる工程と、
ｂ）請求項１０に記載の抗体を用いて、前記試料の前記癌細胞への前記ポリペプチドの結合を検出する工程と
を含む、方法。
【請求項３０】
試料中の癌を検出するための方法であって、
ａ）前記試料を請求項６に記載の融合ペプチドに、前記試料の前記癌細胞に前記ペプチドが結合できる条件下で接触させる工程と、
ｂ）前記融合タンパク質のエピトープに特異的な抗体を用いて、前記試料への前記融合ペプチドの結合を検出する工程と
を含む、方法。
【請求項３１】
試料中の癌細胞を検出するための方法であって、
ａ）前記試料を請求項７に記載のペプチドに、前記試料の前記癌細胞に前記ペプチドが結合できる条件下で接触させる工程と、
ｂ）前記ペプチドの標識を検出する工程と
を含む、方法。
【請求項３２】
請求項２に記載のペプチドに結合する生体分子を同定する方法であって、
ａ）細胞抽出物を請求項２に記載のペプチドに、前記ペプチドおよびリガンドを含む複合体を形成できる条件下で接触させる工程と、
ｂ）前記複合体を分析して前記リガンドを同定する工程と
を含む、方法。
【請求項３３】
ストリンジェントな条件下で請求項１に記載のポリヌクレオチドまたはその変異体の相補体にハイブリダイズする、ポリヌクレオチド。
【請求項３４】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項３５】
請求項３４に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３６】
請求項３３に記載のポリヌクレオチドによってコードされるペプチド。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４】
【図５】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１０−５１７５７５（Ｐ２０１０−５１７５７５Ａ）
【公表日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４９１３５（Ｐ２００９−５４９１３５）
【出願日】平成２０年２月１２日（２００８．２．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００１８０９
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１００４８１
【国際公開日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【出願人】（５９６１１８４９３）アカデミア シニカ (33)
【氏名又は名称原語表記】ＡＣＡＤＥＭＩＡ ＳＩＮＩＣＡ
【出願人】（５０３２０９３４２）ナショナル タイワン ユニバーシティ (9)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月１２日（２００８．２．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００１８０９
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１００４８１
【国際公開日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【出願人】（５９６１１８４９３）アカデミア シニカ (33)
【氏名又は名称原語表記】ＡＣＡＤＥＭＩＡ ＳＩＮＩＣＡ
【出願人】（５０３２０９３４２）ナショナル タイワン ユニバーシティ (9)
【Ｆターム（参考）】
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