蛍光検出装置
【課題】偏心したプレートを使用した際でもプレートと光学ユニットとの位置ずれによる生体分子の蛍光測定感度の低下を防止できる蛍光検出装置を提供する
【解決手段】プレート上に形成された測定流路の直角方向に所定の間隔で前記検出部が前記測定流路を横断するよう移動させ、検出部から出力される蛍光値と前記位置情報との組みを制御情報としてメモリに記憶する。このメモリに記憶した制御情報に基づき測定流路の中心値を算出しプレートを回転させながら、測定流路の中心値に移動するように前記検出部移動手段の移動指令を行うコントロール部を設ける。
【解決手段】プレート上に形成された測定流路の直角方向に所定の間隔で前記検出部が前記測定流路を横断するよう移動させ、検出部から出力される蛍光値と前記位置情報との組みを制御情報としてメモリに記憶する。このメモリに記憶した制御情報に基づき測定流路の中心値を算出しプレートを回転させながら、測定流路の中心値に移動するように前記検出部移動手段の移動指令を行うコントロール部を設ける。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光物質を修飾させた核酸、タンパク質、酵素等の生体分子を緩衝液中で移動させて得られる輸送反応を検出して、生体分子を検出する蛍光検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、核酸、タンパク質、酵素等の生体分子を検出する手法として、蛍光反応を利用する蛍光検出法が採用されている。蛍光検出法は、ラジオアイソトープのような放射性物質を用いないので、安全で且つ安価に生体分子の測定が出来る。そのため、酵素免疫測定、電気泳動、共焦点走査型蛍光顕微鏡法などさまざまな生体分子の検出に用いられている。
【０００３】
蛍光検出法は、蛍光物質を修飾した生体分子に励起光を照射することで生体分子から発せられる蛍光を検出する方法である。例えばＦＩＴＣの様な蛍光物質は、波長４９５ｎｍの励起光に対して波長５２０ｎｍの蛍光を発する。従って、蛍光を発する物質を検出するためには、励起波長を有する光と蛍光波長を検出する受光部とを組み合わせることで測定が出来る。実用的な方法として、落射式と呼ばれている蛍光測定方法がある。これは生体分子上方から励起光を照射して励起光により起こる蛍光反応の変化を、励起光照射側に配置した受光素子で検出するものである。蛍光を発する物質と、それに対応した励起光と受光素子を利用することで、様々な蛍光物質や蛍光標識した生体分子が検出できる。
【０００４】
近年、蛍光検出を行う装置として、樹脂製のプレートに微細な流路を形成したものを用いてプレート上で検出を行う装置が出てきた。この装置では、プレート上の測定流路内に蛍光物質が修飾された生体分子と緩衝液を充填した後、緩衝液に所定の電位勾配をかけて生体分子を電気泳動させる。このとき、測定流路内を泳動中の生体分子に励起光を照射して蛍光の強度分布を検出することで生体分子の特性を測定する（例えば、特許文献１参照。）。
【特許文献１】特表２００５−０６４３３９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら前記従来の構成では、生体分子の電気泳動状態を測定するために装置側の光学ユニットにて励起光を照射しながらプレートを回動させて測定流路を走査するが、プレートに偏心があれば、プレートと光学ユニットとの間に相対的な位置ずれが生じることにより生体分子の蛍光測定感度が低下するという課題を有していた。
【０００６】
本発明は、前記従来の課題を解決するもので、偏心したプレートを使用した際でもプレートと光学ユニットとの位置ずれによる生体分子の蛍光測定感度の低下を防止できる蛍光検出装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題を解決するために、本発明の蛍光検出装置は、プレート上に形成された少なくとも一つの測定流路と、前記測定流路に充填された蛍光物質と、前記プレートを回転させる回転手段と、前記蛍光物質の蛍光を検出するための検出部と、前記検出部を前記測定流路と直角の方向に移動させるための検出部移動手段と、情報を蓄えるためのメモリと、前記測定流路の直角方向に所定の間隔で前記検出部が前記測定流路を横断するように前記検出部移動手段に指令し前記検出部から出力される蛍光値と前記位置情報との組みを制御情報としてメモリに記憶させ前記メモリに記憶させた前記制御情報に基づき測定流路の中心値を算出し前記回転手段に前記プレートの回転を指令した際に前記中心値に移動するように前記検出部移動手段の移動指令を行うコントロール部とから成ることを特徴としたものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の蛍光検出装置によれば、プレートに形成された測定流路に充填された蛍光物質を含む溶液に励起光を照射して得られた蛍光を利用することで、プレートと検出部との相対位置を制御できるため、常に最大の検出感度が得られるように相対位置を制御できるため、測定試料を高感度に検出できる蛍光検出装置を実現できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下に、本発明の蛍光検出装置の実施の形態を図面とともに詳細に説明する。
【００１０】
（実施の形態１）
図１は電気泳動を用いた蛍光検出装置１００のブロック図である。本実施の形態における蛍光検出装置１００は、プレート１０１内のＤＮＡサンプルやＤＮＡコンジュゲートをプレート１０１に形成された流路に遠心力により充填させるための回転装置であるステッピングモータ１０２を持つ。ステッピングモータ１０２を回転させることでプレート上の流路にＤＮＡコンジュゲートとＤＮＡサンプルが定量添加された後、その流路に電気泳動を行うための電圧印加を行う。そのための電極１０３と電極１０４とを持ち、これらの電極に電圧を印加する電源１０５を備えている。検出部１０６により、流路中を電気泳動するＤＮＡサンプルを蛍光検出によって検出する。この検出部はアクチュエータ１０７上に取り付けられており、アクチュエータ１０７はサンプルＤＮＡが電気泳動する流路に対して直角に動くように作られている。アクチュエータ１０７は、図示しないステッピングモータにより移動するように構成されている。これらステッピングモータ１０２、電源１０５、検出部１０６及びアクチュエータを制御するコントロール部１０８と、検出部の位置を記憶するためのメモリ１０９とをさらに備える。
【００１１】
次に、図２を用いて、本実施の形態におけるプレートの詳細を説明する。プレートの材料はアクリル系の樹脂であり、厚みは２ｍｍである。流路形成面には深さ５０μｍの流路やリザーバーとなる溝が掘られ、さらにその上面にアクリル製フィルムを接着することで密閉流路が形成されている。またプレートの重心にプレートを固定するための穴２０１が設けられている。本図では、８つの流路パターンが形成されている。プレートを回転させると遠心力により、これら流路に予め注入されているＤＮＡサンプルやＤＮＡコンジュゲートを充填や定量を行い、また測定流路に沿って検出部をスキャンさせることによりＤＮＡサンプルの蛍光検出を行う。
【００１２】
図３は、図２に示すプレート内に形成された一つの流路パターンの詳細形状を示した図である。流路パターンには、ＤＮＡコンジュゲートを注入するための注入部３０１と、ＤＮＡサンプルを注入する注入部３０２が形成されている。注入部３０２は流路３０３によりサンプル保持部３０４と接続されており、さらに流路３０５によりバッファ部３０６と接続されている。正電極３０７は流路３０８により注入部３０１と接続されており、さらに測定流路３０９によりサンプル保持部３０４と接続している。負電極３１０は、流路３０８により注入部３０１と接続されており、流路３１１によりサンプル保持部３０４と接続されている。
【００１３】
次に、図４を用いて、検出部の詳細を説明する。図４は、本実施の形態におけるＤＮＡサンプル判別のための蛍光検出部の構成を示すものである。図４において、光源４０１は、波蛍光物質ＦＡＭの吸収波長域であり、蛍光物質ＦＡＭを励起できる励起パワーを持つものであれば良い。本実施例では、波長４９５ｎｍのレーザーダイオードを用いた。ダイクロックミラー４０２には波長４９５ｎｍ付近の光を反射して波長５２０ｎｍ付近の光を通過する光学特性を持たせているので、光源４０１からの励起光はダイクロックミラー４０２で反射される。反射された励起光は、対物レンズ４０３により集光され、プレート４０４上の流路４０５へ照射される。このため、流路４０５中の蛍光物質は、励起光により蛍光を発生し、発生した蛍光は、対物レンズ４０３、ダイクロックミラー４０２、集光レンズ４０６を順で通過し、フォトダイオード４０７にて受光される。図３で説明した測定流路３０９中のＤＮＡサンプルを電気泳動させた際には、ステッピングモータ４０８によりプレート４０４を回転させて測定流路３０９と検出部とを相対的にスキャンをさせることで、電気泳動時の分布を測定する。
【００１４】
図５に測定流路３０９を模式的に表した流路６０２を示す。６０４は負電極であり、６０５は正電極であり、これら電極には電気泳動時にはそれぞれ電圧が印加される。緩衝液を含むＤＮＡコンジュゲート６０１を充填した流路６０２の一端にＤＮＡサンプル６０３を定量する。図示していないが、ＤＮＡコンジュゲート６０１のＤＮＡの末端に蛍光物質が修飾されており、さらにＤＮＡサンプル６０３の末端には、ＤＮＡコンジュゲートに修飾された蛍光物質から発せられる蛍光を消光する作用を持つ消光物質が修飾されている。例えば、ＤＮＡコンジュゲートに修飾された物質は蛍光物質としてＦＡＭであり、波長４９５ｎｍの励起光に対して、波長５２０ｎｍの蛍光を発する物質である。ＤＮＡサンプルに修飾された物質は消光物質としてＴＡＭＲＡであり、波長５５５ｎｍの光を吸収する。ＦＡＭの蛍光波長とＴＡＭＲＡの吸収波長が近いため、ＦＡＭの蛍光はＴＡＭＲＡに吸収され弱くなる。そしてその後、両電極６０４、６０５間に電圧を印加して、流路６００内のＤＮＡサンプルを電気泳動させる。充填されたＤＮＡコンジュゲートは励起光により、蛍光を発するが、消光物質が修飾されたＤＮＡサンプルがＤＮＡコンジュゲートと結合すると、ＤＮＡコンジュゲートの蛍光は弱くなる。蛍光強度の低下を検出することにより、ＤＮＡサンプルの泳動状況を検出する。
【００１５】
次に、本実施の形態における蛍光検出装置のＤＮＡサンプルの検出シーケンスについて図６を用いて説明する。図６（ａ）に示すように、検出シーケンスが開始されると、まず、ステッピングモータの回転による遠心力により、ＤＮＡコンジュゲートが流路内に充填される（ステップ８０１）。次に、ステッピングモータの回転による遠心力により、ＤＮＡサンプルが定量される（ステップ８０２）。その後、ステップ８０３で、プレートに対して、電圧を印加するために電極をプレートに接触させ、電圧を印加し、ＤＮＡサンプルを電気泳動させる。一定時間電気泳動を行った後、電極をプレートから離脱させ、ステップ８０４にてスキャンを行う。ステップ８０３とステップ８０４が所定回数行われた後（ステップ８０５にて判定）、検出シーケンスは終了する。
【００１６】
次に、ステップ８０４にてスキャンの動作について、図６（ｂ）を用いて詳しく説明する。スキャンが開始されると、ステップ８０６で、ステッピングモータを回転させ、プレートを初期位置（所定の角度）へ移動させる。その後、ステップ８０７で、ステッピングモータへパルスの入力を開始する。ステップ８０８で、パルスが１つ入力されるごとに、入力パルスカウントを１加算する。次に、ステップ８０９の検出部位補正にて検出部の位置を補正する。ステッピングモータが一定の角度、回転すると（ステップ８１０で判定）、検出部により、蛍光検出が行われる。ステップ８０８、ステップ８０９、ステップ８１０、ステップ８１１をプレートが１周回転するまで行う（ステップ８１２で判定）。以上のステップにより、スキャンの動作は終了する。
【００１７】
次に、ステップ８０９の検出部位補正にて行う検出部とプレート上の測定流路との位置ずれ検出方法を、図７を用いて説明する。図７（ａ）の矢印は検出部の走査方向である。コントローラ部は、蛍光物質が修飾されたコンジュゲートＤＮＡが充填された測定流路７０１を検出部に蛍光検出をさせながら、検出部が搭載されたアクチュエータを測定流路の端から端まで直角に横断するように適当な可動ステップ幅で移動させ、蛍光検出位置毎の蛍光を検出して流路の蛍光強度分布を得る。本実施例では、この蛍光検出位置を、アクチュエータ１０７を駆動するステッピングモータへ送るパルス数とそのステッピングモータの可動ステップ幅との積とした。本実施例では、測定流路幅２００μｍに対して可動ステップ幅を４μｍとしたが、この可動ステップ幅は測定流路の幅に応じて適宜きめればよい。
【００１８】
図７（ｂ）に得られた蛍光強度分布を示す。得られた全ての蛍光強度データは、その流路位置とともにメモリ１０９に格納される。蛍光強度分布が得られると、測定流路の中心位置は、次のようにして求めることが出来る。すなわち、図７（ｂ）で得られた蛍光強度分布はメモリ１０９に格納されているので、コントローラ部はメモリからその格納データを読み出し蛍光強度の最大値を求める。得られた最大値の７０％の値を計算し、その値に一番近い蛍光強度の流路位置を求める。この流路位置のうち、最大値の流路位置を中心にして両側にある蛍光検出位置を求め、それぞれ第一と第二の値とする。この第一と第二の値との中点７０４を流路の中心と定め、この中心に検出部を移動させるためにステッピングモータ１０２に指令するパルス数を決定する。
【００１９】
プレート全体の流路の中心位置を求める方法を、図７（ｃ）を用いて説明する。まず、プレートを検出部に対して、図７（ｃ）に示す初期位置７０５へ移動させ、この位置で、位置ずれを検出する。ここで得られた測定流路の中心位置を原点とし、ステッピングモータとアクチュエータは、ここを基準として動作する。その後、７０６に示すように測定流路の流速方向に等間隔に原点を含む５点の位置で位置ずれを検出し、各々の流路の中心位置を求める。この中心位置に従い、プレート回転用ステッピングモータ１０２の回転角度とアクチュエータ用ステッピングモータへの移動量とを計算する。流路中心を測定しない測定流路の中心は、次のようにして決めることができる。本実施例のように５点で中心値を求めた場合は、これらの値を通る近似円を作成し、この近似円を用いて測定しない測定流路の中心を決定すれば良い。また、このようにして求めた全ての流路の中心位置をテーブルにしてメモリ１０９に記録し、測定流路を検出部がスキャンする際にはこのテーブルを参照して検出部を制御することも出来る。
【００２０】
次に、具体的な動作の説明として、中心孔の位置ズレのあるプレートを用いた場合を例に取り、スキャン中の検出部の位置補正動作を、図８を用いて説明する。プレートの中心穴位置がずれると、プレートが偏心した状態で、スキャンが行われる。その場合のプレートから見た検出部の軌道を、図８（ａ）に示す。本図では、説明のため、測定流路を直線に置き換えている。
【００２１】
図８（ａ）の実線に示すように、測定流路中心に対して、検出部の軌道は曲線的となるので測定流路との位置ずれが発生する。このため、前述した位置ずれ検出によって記録された位置ずれ量を元に、スキャン中に逐次検出部の位置を補正する必要がある。
【００２２】
このため、図６（ｂ）のステップ８０９に示した検出部位置補正が開始される。図８（ｂ）に示すように、まず、ステップ９０１において現在のステッピングモータに対する入力パルス数が記録された対応表の検出位置と一致しているか比較する。ステップ９０２において、入力パルス数が検出位置と一致していれば対応する位置ずれ量だけアクチュエータを移動させる。これにより補正された検出部の軌道は、図８（ｃ）のように測定流路中心上付近を通ることとなる。検出位置をより多くとることにより、より正確に測定流路中心上を検出部はスキャンすることとなり、より高感度の検出感度をもって蛍光検出を行うことができる。
【産業上の利用可能性】
【００２３】
本発明にかかる蛍光検出装置は、流路を支持するプレートに充填された蛍光物質を含有した溶液を励起することにより得られた蛍光値を元に、測定流路と検出部の位置を最大の検出感度が得られる位置へ制御できるため、測定試料を高感度に検出できる蛍光検出装置を実現することができるようにするものとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明の実施例における蛍光検出装置の構成図
【図２】本発明の実施例におけるプレートの流路形成面から見た図
【図３】本発明の実施例におけるプレートに形成された流路パターンを示す図
【図４】本発明の実施例における蛍光検出部の構成図
【図５】本発明の実施例における流路内の状態を示す図
【図６】本発明の実施例における、検出シーケンス及びスキャンのフローチャート
【図７】本発明の実施例における、流路の中心位置の検出方法を示す図
【図８】本発明の実施例における、位置補正方法を示す図
【符号の説明】
【００２５】
１００ 蛍光検出装置
１０１ プレート
１０２ ステッピングモータ
１０３、１０４ 電極
１０５ 電源
１０６ 検出部
１０７ アクチュエータ
１０８ コントロール部
１０９ メモリ
２０１ 孔
３０１、３０２ 注入部
３０３、３０５、３０８、３１１ 流路
３０４ サンプル保持部
３０６ バッファ部
３０７ 正電極
３０９ 測定流路
３１０ 負電極
４０１ 光源
４０２ ダイクロックミラー
４０３ 対物レンズ
４０４ プレート
４０５ 流路
４０６ 集光レンズ
４０７ フォトダイオード
４０８ ステッピングモータ
５０１ コンジュゲートＤＮＡ
６０１ コンジュゲートＤＮＡ
６０２ 流路
６０３ サンプルＤＮＡ
６０４ 負電極
６０５ 正電極
７０１ 流路
７０２ ピーク値
７０３ ピーク値の７０％の値に最も近い可動ステップ位置
７０４ 中点
７０５ 初期位置
７０６ 検出位置
８０１〜８１２ ステップ
９０１、９０２ ステップ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光物質を修飾させた核酸、タンパク質、酵素等の生体分子を緩衝液中で移動させて得られる輸送反応を検出して、生体分子を検出する蛍光検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、核酸、タンパク質、酵素等の生体分子を検出する手法として、蛍光反応を利用する蛍光検出法が採用されている。蛍光検出法は、ラジオアイソトープのような放射性物質を用いないので、安全で且つ安価に生体分子の測定が出来る。そのため、酵素免疫測定、電気泳動、共焦点走査型蛍光顕微鏡法などさまざまな生体分子の検出に用いられている。
【０００３】
蛍光検出法は、蛍光物質を修飾した生体分子に励起光を照射することで生体分子から発せられる蛍光を検出する方法である。例えばＦＩＴＣの様な蛍光物質は、波長４９５ｎｍの励起光に対して波長５２０ｎｍの蛍光を発する。従って、蛍光を発する物質を検出するためには、励起波長を有する光と蛍光波長を検出する受光部とを組み合わせることで測定が出来る。実用的な方法として、落射式と呼ばれている蛍光測定方法がある。これは生体分子上方から励起光を照射して励起光により起こる蛍光反応の変化を、励起光照射側に配置した受光素子で検出するものである。蛍光を発する物質と、それに対応した励起光と受光素子を利用することで、様々な蛍光物質や蛍光標識した生体分子が検出できる。
【０００４】
近年、蛍光検出を行う装置として、樹脂製のプレートに微細な流路を形成したものを用いてプレート上で検出を行う装置が出てきた。この装置では、プレート上の測定流路内に蛍光物質が修飾された生体分子と緩衝液を充填した後、緩衝液に所定の電位勾配をかけて生体分子を電気泳動させる。このとき、測定流路内を泳動中の生体分子に励起光を照射して蛍光の強度分布を検出することで生体分子の特性を測定する（例えば、特許文献１参照。）。
【特許文献１】特表２００５−０６４３３９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら前記従来の構成では、生体分子の電気泳動状態を測定するために装置側の光学ユニットにて励起光を照射しながらプレートを回動させて測定流路を走査するが、プレートに偏心があれば、プレートと光学ユニットとの間に相対的な位置ずれが生じることにより生体分子の蛍光測定感度が低下するという課題を有していた。
【０００６】
本発明は、前記従来の課題を解決するもので、偏心したプレートを使用した際でもプレートと光学ユニットとの位置ずれによる生体分子の蛍光測定感度の低下を防止できる蛍光検出装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題を解決するために、本発明の蛍光検出装置は、プレート上に形成された少なくとも一つの測定流路と、前記測定流路に充填された蛍光物質と、前記プレートを回転させる回転手段と、前記蛍光物質の蛍光を検出するための検出部と、前記検出部を前記測定流路と直角の方向に移動させるための検出部移動手段と、情報を蓄えるためのメモリと、前記測定流路の直角方向に所定の間隔で前記検出部が前記測定流路を横断するように前記検出部移動手段に指令し前記検出部から出力される蛍光値と前記位置情報との組みを制御情報としてメモリに記憶させ前記メモリに記憶させた前記制御情報に基づき測定流路の中心値を算出し前記回転手段に前記プレートの回転を指令した際に前記中心値に移動するように前記検出部移動手段の移動指令を行うコントロール部とから成ることを特徴としたものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の蛍光検出装置によれば、プレートに形成された測定流路に充填された蛍光物質を含む溶液に励起光を照射して得られた蛍光を利用することで、プレートと検出部との相対位置を制御できるため、常に最大の検出感度が得られるように相対位置を制御できるため、測定試料を高感度に検出できる蛍光検出装置を実現できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下に、本発明の蛍光検出装置の実施の形態を図面とともに詳細に説明する。
【００１０】
（実施の形態１）
図１は電気泳動を用いた蛍光検出装置１００のブロック図である。本実施の形態における蛍光検出装置１００は、プレート１０１内のＤＮＡサンプルやＤＮＡコンジュゲートをプレート１０１に形成された流路に遠心力により充填させるための回転装置であるステッピングモータ１０２を持つ。ステッピングモータ１０２を回転させることでプレート上の流路にＤＮＡコンジュゲートとＤＮＡサンプルが定量添加された後、その流路に電気泳動を行うための電圧印加を行う。そのための電極１０３と電極１０４とを持ち、これらの電極に電圧を印加する電源１０５を備えている。検出部１０６により、流路中を電気泳動するＤＮＡサンプルを蛍光検出によって検出する。この検出部はアクチュエータ１０７上に取り付けられており、アクチュエータ１０７はサンプルＤＮＡが電気泳動する流路に対して直角に動くように作られている。アクチュエータ１０７は、図示しないステッピングモータにより移動するように構成されている。これらステッピングモータ１０２、電源１０５、検出部１０６及びアクチュエータを制御するコントロール部１０８と、検出部の位置を記憶するためのメモリ１０９とをさらに備える。
【００１１】
次に、図２を用いて、本実施の形態におけるプレートの詳細を説明する。プレートの材料はアクリル系の樹脂であり、厚みは２ｍｍである。流路形成面には深さ５０μｍの流路やリザーバーとなる溝が掘られ、さらにその上面にアクリル製フィルムを接着することで密閉流路が形成されている。またプレートの重心にプレートを固定するための穴２０１が設けられている。本図では、８つの流路パターンが形成されている。プレートを回転させると遠心力により、これら流路に予め注入されているＤＮＡサンプルやＤＮＡコンジュゲートを充填や定量を行い、また測定流路に沿って検出部をスキャンさせることによりＤＮＡサンプルの蛍光検出を行う。
【００１２】
図３は、図２に示すプレート内に形成された一つの流路パターンの詳細形状を示した図である。流路パターンには、ＤＮＡコンジュゲートを注入するための注入部３０１と、ＤＮＡサンプルを注入する注入部３０２が形成されている。注入部３０２は流路３０３によりサンプル保持部３０４と接続されており、さらに流路３０５によりバッファ部３０６と接続されている。正電極３０７は流路３０８により注入部３０１と接続されており、さらに測定流路３０９によりサンプル保持部３０４と接続している。負電極３１０は、流路３０８により注入部３０１と接続されており、流路３１１によりサンプル保持部３０４と接続されている。
【００１３】
次に、図４を用いて、検出部の詳細を説明する。図４は、本実施の形態におけるＤＮＡサンプル判別のための蛍光検出部の構成を示すものである。図４において、光源４０１は、波蛍光物質ＦＡＭの吸収波長域であり、蛍光物質ＦＡＭを励起できる励起パワーを持つものであれば良い。本実施例では、波長４９５ｎｍのレーザーダイオードを用いた。ダイクロックミラー４０２には波長４９５ｎｍ付近の光を反射して波長５２０ｎｍ付近の光を通過する光学特性を持たせているので、光源４０１からの励起光はダイクロックミラー４０２で反射される。反射された励起光は、対物レンズ４０３により集光され、プレート４０４上の流路４０５へ照射される。このため、流路４０５中の蛍光物質は、励起光により蛍光を発生し、発生した蛍光は、対物レンズ４０３、ダイクロックミラー４０２、集光レンズ４０６を順で通過し、フォトダイオード４０７にて受光される。図３で説明した測定流路３０９中のＤＮＡサンプルを電気泳動させた際には、ステッピングモータ４０８によりプレート４０４を回転させて測定流路３０９と検出部とを相対的にスキャンをさせることで、電気泳動時の分布を測定する。
【００１４】
図５に測定流路３０９を模式的に表した流路６０２を示す。６０４は負電極であり、６０５は正電極であり、これら電極には電気泳動時にはそれぞれ電圧が印加される。緩衝液を含むＤＮＡコンジュゲート６０１を充填した流路６０２の一端にＤＮＡサンプル６０３を定量する。図示していないが、ＤＮＡコンジュゲート６０１のＤＮＡの末端に蛍光物質が修飾されており、さらにＤＮＡサンプル６０３の末端には、ＤＮＡコンジュゲートに修飾された蛍光物質から発せられる蛍光を消光する作用を持つ消光物質が修飾されている。例えば、ＤＮＡコンジュゲートに修飾された物質は蛍光物質としてＦＡＭであり、波長４９５ｎｍの励起光に対して、波長５２０ｎｍの蛍光を発する物質である。ＤＮＡサンプルに修飾された物質は消光物質としてＴＡＭＲＡであり、波長５５５ｎｍの光を吸収する。ＦＡＭの蛍光波長とＴＡＭＲＡの吸収波長が近いため、ＦＡＭの蛍光はＴＡＭＲＡに吸収され弱くなる。そしてその後、両電極６０４、６０５間に電圧を印加して、流路６００内のＤＮＡサンプルを電気泳動させる。充填されたＤＮＡコンジュゲートは励起光により、蛍光を発するが、消光物質が修飾されたＤＮＡサンプルがＤＮＡコンジュゲートと結合すると、ＤＮＡコンジュゲートの蛍光は弱くなる。蛍光強度の低下を検出することにより、ＤＮＡサンプルの泳動状況を検出する。
【００１５】
次に、本実施の形態における蛍光検出装置のＤＮＡサンプルの検出シーケンスについて図６を用いて説明する。図６（ａ）に示すように、検出シーケンスが開始されると、まず、ステッピングモータの回転による遠心力により、ＤＮＡコンジュゲートが流路内に充填される（ステップ８０１）。次に、ステッピングモータの回転による遠心力により、ＤＮＡサンプルが定量される（ステップ８０２）。その後、ステップ８０３で、プレートに対して、電圧を印加するために電極をプレートに接触させ、電圧を印加し、ＤＮＡサンプルを電気泳動させる。一定時間電気泳動を行った後、電極をプレートから離脱させ、ステップ８０４にてスキャンを行う。ステップ８０３とステップ８０４が所定回数行われた後（ステップ８０５にて判定）、検出シーケンスは終了する。
【００１６】
次に、ステップ８０４にてスキャンの動作について、図６（ｂ）を用いて詳しく説明する。スキャンが開始されると、ステップ８０６で、ステッピングモータを回転させ、プレートを初期位置（所定の角度）へ移動させる。その後、ステップ８０７で、ステッピングモータへパルスの入力を開始する。ステップ８０８で、パルスが１つ入力されるごとに、入力パルスカウントを１加算する。次に、ステップ８０９の検出部位補正にて検出部の位置を補正する。ステッピングモータが一定の角度、回転すると（ステップ８１０で判定）、検出部により、蛍光検出が行われる。ステップ８０８、ステップ８０９、ステップ８１０、ステップ８１１をプレートが１周回転するまで行う（ステップ８１２で判定）。以上のステップにより、スキャンの動作は終了する。
【００１７】
次に、ステップ８０９の検出部位補正にて行う検出部とプレート上の測定流路との位置ずれ検出方法を、図７を用いて説明する。図７（ａ）の矢印は検出部の走査方向である。コントローラ部は、蛍光物質が修飾されたコンジュゲートＤＮＡが充填された測定流路７０１を検出部に蛍光検出をさせながら、検出部が搭載されたアクチュエータを測定流路の端から端まで直角に横断するように適当な可動ステップ幅で移動させ、蛍光検出位置毎の蛍光を検出して流路の蛍光強度分布を得る。本実施例では、この蛍光検出位置を、アクチュエータ１０７を駆動するステッピングモータへ送るパルス数とそのステッピングモータの可動ステップ幅との積とした。本実施例では、測定流路幅２００μｍに対して可動ステップ幅を４μｍとしたが、この可動ステップ幅は測定流路の幅に応じて適宜きめればよい。
【００１８】
図７（ｂ）に得られた蛍光強度分布を示す。得られた全ての蛍光強度データは、その流路位置とともにメモリ１０９に格納される。蛍光強度分布が得られると、測定流路の中心位置は、次のようにして求めることが出来る。すなわち、図７（ｂ）で得られた蛍光強度分布はメモリ１０９に格納されているので、コントローラ部はメモリからその格納データを読み出し蛍光強度の最大値を求める。得られた最大値の７０％の値を計算し、その値に一番近い蛍光強度の流路位置を求める。この流路位置のうち、最大値の流路位置を中心にして両側にある蛍光検出位置を求め、それぞれ第一と第二の値とする。この第一と第二の値との中点７０４を流路の中心と定め、この中心に検出部を移動させるためにステッピングモータ１０２に指令するパルス数を決定する。
【００１９】
プレート全体の流路の中心位置を求める方法を、図７（ｃ）を用いて説明する。まず、プレートを検出部に対して、図７（ｃ）に示す初期位置７０５へ移動させ、この位置で、位置ずれを検出する。ここで得られた測定流路の中心位置を原点とし、ステッピングモータとアクチュエータは、ここを基準として動作する。その後、７０６に示すように測定流路の流速方向に等間隔に原点を含む５点の位置で位置ずれを検出し、各々の流路の中心位置を求める。この中心位置に従い、プレート回転用ステッピングモータ１０２の回転角度とアクチュエータ用ステッピングモータへの移動量とを計算する。流路中心を測定しない測定流路の中心は、次のようにして決めることができる。本実施例のように５点で中心値を求めた場合は、これらの値を通る近似円を作成し、この近似円を用いて測定しない測定流路の中心を決定すれば良い。また、このようにして求めた全ての流路の中心位置をテーブルにしてメモリ１０９に記録し、測定流路を検出部がスキャンする際にはこのテーブルを参照して検出部を制御することも出来る。
【００２０】
次に、具体的な動作の説明として、中心孔の位置ズレのあるプレートを用いた場合を例に取り、スキャン中の検出部の位置補正動作を、図８を用いて説明する。プレートの中心穴位置がずれると、プレートが偏心した状態で、スキャンが行われる。その場合のプレートから見た検出部の軌道を、図８（ａ）に示す。本図では、説明のため、測定流路を直線に置き換えている。
【００２１】
図８（ａ）の実線に示すように、測定流路中心に対して、検出部の軌道は曲線的となるので測定流路との位置ずれが発生する。このため、前述した位置ずれ検出によって記録された位置ずれ量を元に、スキャン中に逐次検出部の位置を補正する必要がある。
【００２２】
このため、図６（ｂ）のステップ８０９に示した検出部位置補正が開始される。図８（ｂ）に示すように、まず、ステップ９０１において現在のステッピングモータに対する入力パルス数が記録された対応表の検出位置と一致しているか比較する。ステップ９０２において、入力パルス数が検出位置と一致していれば対応する位置ずれ量だけアクチュエータを移動させる。これにより補正された検出部の軌道は、図８（ｃ）のように測定流路中心上付近を通ることとなる。検出位置をより多くとることにより、より正確に測定流路中心上を検出部はスキャンすることとなり、より高感度の検出感度をもって蛍光検出を行うことができる。
【産業上の利用可能性】
【００２３】
本発明にかかる蛍光検出装置は、流路を支持するプレートに充填された蛍光物質を含有した溶液を励起することにより得られた蛍光値を元に、測定流路と検出部の位置を最大の検出感度が得られる位置へ制御できるため、測定試料を高感度に検出できる蛍光検出装置を実現することができるようにするものとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明の実施例における蛍光検出装置の構成図
【図２】本発明の実施例におけるプレートの流路形成面から見た図
【図３】本発明の実施例におけるプレートに形成された流路パターンを示す図
【図４】本発明の実施例における蛍光検出部の構成図
【図５】本発明の実施例における流路内の状態を示す図
【図６】本発明の実施例における、検出シーケンス及びスキャンのフローチャート
【図７】本発明の実施例における、流路の中心位置の検出方法を示す図
【図８】本発明の実施例における、位置補正方法を示す図
【符号の説明】
【００２５】
１００ 蛍光検出装置
１０１ プレート
１０２ ステッピングモータ
１０３、１０４ 電極
１０５ 電源
１０６ 検出部
１０７ アクチュエータ
１０８ コントロール部
１０９ メモリ
２０１ 孔
３０１、３０２ 注入部
３０３、３０５、３０８、３１１ 流路
３０４ サンプル保持部
３０６ バッファ部
３０７ 正電極
３０９ 測定流路
３１０ 負電極
４０１ 光源
４０２ ダイクロックミラー
４０３ 対物レンズ
４０４ プレート
４０５ 流路
４０６ 集光レンズ
４０７ フォトダイオード
４０８ ステッピングモータ
５０１ コンジュゲートＤＮＡ
６０１ コンジュゲートＤＮＡ
６０２ 流路
６０３ サンプルＤＮＡ
６０４ 負電極
６０５ 正電極
７０１ 流路
７０２ ピーク値
７０３ ピーク値の７０％の値に最も近い可動ステップ位置
７０４ 中点
７０５ 初期位置
７０６ 検出位置
８０１〜８１２ ステップ
９０１、９０２ ステップ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プレート上に形成された少なくとも一つの測定流路と、
前記測定流路に充填された蛍光物質と、
前記プレートを回転させる回転手段と、
前記蛍光物質の蛍光を検出するための検出部と、
前記検出部を前記測定流路と直角の方向に移動させるための検出部移動手段と、
情報を蓄えるためのメモリと、
前記測定流路の直角方向に所定の間隔で前記検出部が前記測定流路を横断するように前記検出部移動手段に指令し前記検出部から出力される蛍光値と前記位置情報との組みを制御情報としてメモリに記憶させ前記メモリに記憶させた前記制御情報に基づき測定流路の中心値を算出し前記回転手段に前記プレートの回転を指令した際に前記中心値に移動するように前記検出部移動手段の移動指令を行うコントロール部とから成る蛍光検出装置。
【請求項２】
前記コントロール部は、前記メモリに蓄えられた前記制御情報から蛍光値の最大値を抽出し、前記最大値の７０％に付近の複数の蛍光値を前記メモリから選択して前記最大値の流路位置よりも小である前記選択した複数の蛍光値を第１組と前記最大値の流路位置よりも大である前記選択した複数の蛍光値を第２組とし、前記第１組での最大の蛍光値の流路位置を第１の流路位置とし前記第２組での最大の蛍光値の流路位置を第２の流路位置とし、前記第１と第２との流路位置の平均値を前記測定流路の中心値と演算する請求項１に記載の蛍光検出装置。
【請求項３】
前記コントロール部は、前記制御情報の取得を前記プレート上の全ての測定流路について行うように前記回転手段と前記検出部移動手段に指令を行い、流路毎の制御情報を前記メモリに記憶させる請求項１に記載の蛍光検出装置。
【請求項４】
前記コントロール部は、前記流路毎の制御情報から蛍光値の最大値を抽出し、前記最大値の７０％に付近の複数の蛍光値を前記メモリから選択して前記最大値の流路位置よりも小である前記選択した複数の蛍光値を第１組と前記最大値の流路位置よりも大である前記選択した複数の蛍光値を第２組とし、前記第１組での最大の蛍光値の流路位置を第１の流路位置とし前記第２組での最大の蛍光値の流路位置を第２の流路位置とし、前記第１と第２との流路位置の平均値を前記測定流路の中心値と演算する請求項３に記載の蛍光検出装置。
【請求項１】
プレート上に形成された少なくとも一つの測定流路と、
前記測定流路に充填された蛍光物質と、
前記プレートを回転させる回転手段と、
前記蛍光物質の蛍光を検出するための検出部と、
前記検出部を前記測定流路と直角の方向に移動させるための検出部移動手段と、
情報を蓄えるためのメモリと、
前記測定流路の直角方向に所定の間隔で前記検出部が前記測定流路を横断するように前記検出部移動手段に指令し前記検出部から出力される蛍光値と前記位置情報との組みを制御情報としてメモリに記憶させ前記メモリに記憶させた前記制御情報に基づき測定流路の中心値を算出し前記回転手段に前記プレートの回転を指令した際に前記中心値に移動するように前記検出部移動手段の移動指令を行うコントロール部とから成る蛍光検出装置。
【請求項２】
前記コントロール部は、前記メモリに蓄えられた前記制御情報から蛍光値の最大値を抽出し、前記最大値の７０％に付近の複数の蛍光値を前記メモリから選択して前記最大値の流路位置よりも小である前記選択した複数の蛍光値を第１組と前記最大値の流路位置よりも大である前記選択した複数の蛍光値を第２組とし、前記第１組での最大の蛍光値の流路位置を第１の流路位置とし前記第２組での最大の蛍光値の流路位置を第２の流路位置とし、前記第１と第２との流路位置の平均値を前記測定流路の中心値と演算する請求項１に記載の蛍光検出装置。
【請求項３】
前記コントロール部は、前記制御情報の取得を前記プレート上の全ての測定流路について行うように前記回転手段と前記検出部移動手段に指令を行い、流路毎の制御情報を前記メモリに記憶させる請求項１に記載の蛍光検出装置。
【請求項４】
前記コントロール部は、前記流路毎の制御情報から蛍光値の最大値を抽出し、前記最大値の７０％に付近の複数の蛍光値を前記メモリから選択して前記最大値の流路位置よりも小である前記選択した複数の蛍光値を第１組と前記最大値の流路位置よりも大である前記選択した複数の蛍光値を第２組とし、前記第１組での最大の蛍光値の流路位置を第１の流路位置とし前記第２組での最大の蛍光値の流路位置を第２の流路位置とし、前記第１と第２との流路位置の平均値を前記測定流路の中心値と演算する請求項３に記載の蛍光検出装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００９−４７５６４（Ｐ２００９−４７５６４Ａ）
【公開日】平成２１年３月５日（２００９．３．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２１４３３４（Ｐ２００７−２１４３３４）
【出願日】平成１９年８月２１日（２００７．８．２１）
【出願人】（０００００５８２１）パナソニック株式会社 (73,050)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年３月５日（２００９．３．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年８月２１日（２００７．８．２１）
【出願人】（０００００５８２１）パナソニック株式会社 (73,050)
【Ｆターム（参考）】
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