観察測光装置および観察測光方法
【課題】標本内の発光領域を特定することができ、その特定領域から発せられる光を選択的に測光することができること。
【解決手段】観察測光装置１００は、ピンホール２３ａが形成されたピンホール板２３ｂと、ピンホール２３ａを照明するピンホール照明系２４と、このピンホール照明系２４によって照明されたピンホール２３ａのピンホール像を標本Ｓ上に投影し、そのピンホール像内の標本Ｓから発せられる光をピンホール２３ａ内に集光させる投影測光光学系と、標本Ｓの観察像とともにピンホール像の２次ピンホール像を結像する観察光学系と、投影測光光学系およびピンホール２３ａを介し、ピンホール像内の標本Ｓから発せられた光を測光する光検出器２６と、ピンホール像と標本Ｓとの少なくとも一方を移動させる相対移動手段と、を備え、ピンホール２３ａは、投影測光光学系の結像面に配設される。
【解決手段】観察測光装置１００は、ピンホール２３ａが形成されたピンホール板２３ｂと、ピンホール２３ａを照明するピンホール照明系２４と、このピンホール照明系２４によって照明されたピンホール２３ａのピンホール像を標本Ｓ上に投影し、そのピンホール像内の標本Ｓから発せられる光をピンホール２３ａ内に集光させる投影測光光学系と、標本Ｓの観察像とともにピンホール像の２次ピンホール像を結像する観察光学系と、投影測光光学系およびピンホール２３ａを介し、ピンホール像内の標本Ｓから発せられた光を測光する光検出器２６と、ピンホール像と標本Ｓとの少なくとも一方を移動させる相対移動手段と、を備え、ピンホール２３ａは、投影測光光学系の結像面に配設される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標本の観察像を生成するとともに、標本から発せられた光を測光する観察測光装置および観察測光方法に関し、特に標本上の部分領域から発せられる微弱光の測光に適用して好適な観察測光装置および観察測光方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、細胞生物学、分子生物学などの研究分野では、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ：Green Fluorescent Protein）や生物発光酵素であるルシフェラーゼ遺伝子を発現のレポーターとして働かせ、細胞内の特定部位や機能蛋白質に蛍光標識、発光標識等を付して生体細胞を観察する必要性が高まっている。特に、ルシフェラーゼ−ルシフェリン発光を利用した遺伝子の研究は、従来の励起光照射による蛍光発光を利用した遺伝子の研究に比べ、励起光照射に起因する生体細胞の損傷が生じないことから長時間にわたって遺伝子の振る舞いを観察できることで注目されている。ところが、ルシフェラーゼ−ルシフェリン発光の観測には、その発光量が微弱なことから、明るい光学系と高感度の光検出器とが必要とされる。
【０００３】
従来、微弱光を測光する測光装置として、例えば特許文献１または２に開示された蛍光読み取り装置がある。この蛍光読み取り装置では、標本から発せられた微弱光である蛍光は、レンズ系で結像され、その結像位置に配置された受光ピンホールを介した後、光検出器によって検出されて測光される。この光検出器には、例えば光電子増倍管（ＰＭＴ：Photomultiplier Tube）やアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ：Avalanche Photodiode）が用いられる。
【０００４】
一般に、光電子増倍管は、ＣＣＤに比べて受光感度が高くＳ／Ｎ比に優れている。また、ＣＣＤにおける画素間の仕切りのような不感帯がなく、高い受光効率で大きな受光エリアを確保することができる。このような特性から、光電子増倍管は、ＣＣＤに比して微弱光測光用の光検出器に適しているといえる。なお、光電子増倍管を測光用の光検出器に用いた場合、ＣＣＤに比して高速測光が可能となる効果も得られる。
【０００５】
【特許文献１】特開２００２−３５７５４９号公報
【特許文献２】特開２００４−１９１２５２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ところで、ルシフェラーゼ−ルシフェリン発光を利用した研究では、標本内で発光している細胞の特定と、その細胞からの発光量の測定とが必要とされる。さらには、細胞内の発光部位の特定が要望される。しかしながら、上述した従来技術にかかる測光装置では、受光ピンホールの大きさによって標本上の測光領域を制限することができるものの、その位置は、装置機構や光学系の倍率等から推定することしかできなかった。つまり、標本上で発光している部位を直接的かつ視覚的に認識することができず、発光している細胞位置を正確に特定することが困難であった。また、測光領域を細胞の大きさに制限し、特定の細胞から発せられた光のみ測光することが困難であった。
【０００７】
本発明は、上記に鑑みてなされたものであって、標本内の発光領域を特定することができ、その特定領域から発せられる光を選択的に測光することができるとともに、標本から微弱光が発せられる場合にも高精度に測光することができる観察測光装置および観察測光方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明にかかる観察測光装置は、開口が形成された開口部材と、前記開口を照明する開口照明手段と、前記開口照明手段によって照明された前記開口の開口像を標本上に投影し、前記開口像内の前記標本から発せられる光を前記開口内に集光させる投影測光光学系と、前記標本の観察とともに前記開口像を観察する観察光学系と、前記投影測光光学系および前記開口を介し、前記開口像内の前記標本から発せられた光を測光する測光手段と、前記開口像と前記標本との少なくとも一方を移動させる相対移動手段と、を備え、前記開口は、前記投影測光光学系の結像面に配設されたことを特徴とする。
【０００９】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、前記観察光学系の観察光路に対して前記投影測光光学系の投影測光光路を合分岐する合分岐手段を備え、前記投影測光光学系は、前記観察光学系の一部または全部を共用して前記開口を前記標本上に投影することを特徴とする。
【００１０】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、前記合分岐手段は、透過率および反射率の少なくとも一方が異なる複数の光分割素子と、複数の前記光分割素子のうち１つを前記観察光路上に択一的に配置する選択配置機構とを有することを特徴とする。
【００１１】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、前記合分岐手段は、複数の前記光分割素子として、反射率と透過率との割合が異なる少なくとも３種類の素子を有することを特徴とする。
【００１２】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、３種類の前記光分割素子は、標本からの光を１００％反射する反射素子と、標本からの光を１００％透過する透過素子と、少なくとも反射と透過とを共に行わせる素子とからなることを特徴とする。
【００１３】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、前記開口照明手段は、照明光を発する光源手段と、該照明光を前記測光手段の測光光路内に導入して前記開口に導く照明光導入手段とを有することを特徴とする。
【００１４】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、前記照明光導入手段は、前記測光光路内に配置され、前記照明光を所定反射率で反射させて前記開口に導くとともに、前記標本から発せられて前記開口を通過した光を所定透過率で透過させる半透明素子であることを特徴とする。
【００１５】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、前記投影測光光学系に対して前記開口の大きさおよび形状の少なくとも一方を変更する開口切換機構を備えたことを特徴とする。
【００１６】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、前記開口部材は、大きさおよび形状の少なくとも一方が異なる複数の前記開口を有し、前記開口切換機構は、複数の前記開口のうち１つを前記投影測光光学系の投影測光光路内に択一的に配置することを特徴とする。
【００１７】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、前記開口部材は、その周方向に複数の前記開口が配列された円盤状部材であり、前記開口切換機構は、前記開口部材をその周方向に回動させ、複数の前記開口のうち１つを前記投影測光光路内に択一的に配置することを特徴とする。
【００１８】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、前記開口は、前記開口部材上に形成された透孔または切欠であることを特徴とする。
【００１９】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、前記相対移動手段は、前記標本を保持し、該標本を前記観察光学系の観察光軸に垂直な面内で移動させる標本移動手段と、前記開口を前記投影測光光学系の投影測光光軸に垂直な面内で移動させる開口移動手段との少なくとも一方を有することを特徴とする。
【００２０】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、前記標本移動手段は、前記観察光軸に垂直な面内で前記標本を自在に移動させる電動ステージを有することを特徴とする。
【００２１】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、前記開口移動手段は、前記開口部材を介して前記開口を前記投影測光光軸に垂直な面内で移動させることを特徴とする。
【００２２】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、前記開口部材、前記開口照明手段および前記測光手段を一体に保持する一体保持機構を備え、前記開口移動手段は、前記一体保持機構を介して前記開口を前記投影測光光軸に垂直な面内で移動させることを特徴とする。
【００２３】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、前記相対移動手段は、前記観察光学系の観察視野内に位置する前記標本上の指定標本領域の領域位置を読取る領域位置読取手段を有することを特徴とする。
【００２４】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、前記領域位置読取手段は、前記観察光軸に対する前記標本の指定標本位置を読取る標本位置読取手段と、前記観察光軸に対する前記開口像の開口像位置を読取る開口位置読取手段との少なくとも一方を有したことを特徴とする。
【００２５】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、前記領域位置を記憶する記憶手段と、前記領域位置読取手段が読取った前記領域位置を前記記憶手段に記憶させる位置記憶制御手段と、を備えたことを特徴とする。
【００２６】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、あらかじめ１以上の前記領域位置を記憶した記憶手段と、前記相対移動手段によって、１以上の前記領域位置に対応する各指定標本領域を前記開口像内に順次配置させ、順次配置させるごとに該指定標本領域から発せられた光を前記測光手段に測光させるとともに、この測光結果を測光時点の前記領域位置に対応付けて前記記憶手段に記憶させる制御を１回または所定期間ごとに繰り返す測光制御手段と、を備えたことを特徴とする。
【００２７】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、あらかじめ１以上の前記標本位置および前記開口位置の少なくとも一方を前記領域位置として記憶した記憶手段と、前記標本移動手段および／または前記開口移動手段によって、１以上の前記標本位置および／または前記開口位置の各々に前記標本および／または前記開口を順次配置させ、順次配置させるごとに前記開口像内の前記標本から発せられた光を前記測光手段に測光させるとともに、この測光結果を測光時点の前記標本位置および／または前記開口位置に対応付けて前記記憶手段に記憶させる制御を１回または所定期間ごとに繰り返す測光制御手段と、を備えたことを特徴とする。
【００２８】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、前記投影測光光学系に対して前記開口の大きさおよび形状の少なくとも一方を変更する開口切換機構を備え、前記記憶手段は、あらかじめ前記領域位置ごとに、前記開口の大きさおよび形状を特定する開口情報を対応づけて記憶し、前記測光制御手段は、前記記憶手段に記憶された前記領域位置に対応する前記指定標本領域を前記開口像内に配置させるごとに、該領域位置に対応付けられた前記開口情報に基づいて前記開口切換機構に前記開口を切り換えさせる制御をすることを特徴とする。
【００２９】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、異なる波長域の光を抽出する複数の波長抽出フィルタを有し、複数の前記波長抽出フィルタの少なくとも１つを、非配置を含めて選択的に前記測光手段の測光光路内に配置する波長抽出手段を備え、前記記憶手段は、あらかじめ前記領域位置ごとに、前記測光光路上に配置する前記波長抽出フィルタを指定するフィルタ情報を対応付けて記憶し、前記測光制御手段は、前記記憶手段に記憶された前記領域位置に対応する前記指定標本領域を前記開口像内に配置させるごとに、該領域位置に対応付けられた前記フィルタ情報に基づいて前記波長抽出手段に前記波長抽出フィルタを配置させる制御をすることを特徴とする。
【００３０】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、前記記憶手段は、あらかじめ前記領域位置ごとに、該領域位置に対応する前記指定標本領域を識別する領域識別情報を対応付けて記憶することを特徴とする。
【００３１】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、複数の前記光分割素子のうち前記標本から発せられた光を前記測光手段に対して１００％配分する光分割素子を前記選択配置機構によって配置し、前記標本から発せられた光を前記測光手段に測光させる制御をする測光制御手段を備えたことを特徴とする。
【００３２】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、前記測光制御手段は、前記測光手段に測光させない場合、複数の前記光分割素子のうち前記標本から発せられた光を前記観察像に対して１００％配分する光分割素子を前記選択配置機構に配置させる制御をすることを特徴とする。
【００３３】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、前記観察光学系は、観察視野内に配置された前記標本上の各点からの光を受光して各々平行光束に変換する対物レンズと、該対物レンズと協働して前記観察像とともに前記２次開口像を結像する結像レンズとを有することを特徴とする。
【００３４】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、前記観察光学系による前記観察像の総合結像倍率は、２倍以上、８倍以下であることを特徴とする。
【００３５】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、前記観察像および前記２次開口像の少なくとも一方を撮像して観察画像を生成する撮像手段を備えたことを特徴とする。
【００３６】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、前記観察画像を表示する表示手段を備えたことを特徴とする。
【００３７】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、前記観察画像として、前記標本に対して照射された光をもとに生成された照明観察画像と、前記標本が発した光をもとに生成された発光観察画像とを重ね合わせて前記表示手段に表示させる制御をする表示制御手段を備えたことを特徴とする。
【００３８】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、所定の照明指示情報に基づいて前記開口照明手段による照明の開始および停止制御をする照明制御手段を備えたことを特徴とする。
【００３９】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、前記標本に対して明視野照明を行う明視野照明手段および該標本を励起する励起光照明を行う励起光照明手段の少なくとも一方を備えたことを特徴とする。
【００４０】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、所定の照明指示情報に基づいて前記明視野照明手段および前記励起光照明手段の少なくとも一方による照明の開始および停止制御をする照明制御手段を備えたことを特徴とする。
【００４１】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、前記標本は、微弱光を発する自己発光体および蛍光発光体の少なくとも一方を含むことを特徴とする。
【００４２】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、前記測光手段は、微弱光検出素子を有し、前記標本から発せられた光を該微弱光検出素子によって検出することを特徴とする。
【００４３】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、前記微弱光検出素子は、光電子増倍管またはアバランシェフォトダイオードであることを特徴とする。
【００４４】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、前記標本と前記観察光学系との相対距離を変化させ、前記標本に対する前記観察光学系の焦点合わせを行う焦準機構を備えたことを特徴とする。
【００４５】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、前記焦準機構は、電動焦準機構であり、所定の焦準指示情報に基づき、前記焦準機構によって前記標本に対する前記観察光学系の焦点合わせを行う制御をする焦準制御手段を備えたことを特徴とする。
【００４６】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、当該観察測光装置の一部または全部を遮蔽し、外部から照射される光を遮断する遮蔽手段を備えたことを特徴とする。
【００４７】
また本発明にかかる観察測光方法は、標本を照明し、該標本を撮影して照明観察画像を取得する照明画像取得ステップと、前記照明観察画像をもとに、前記標本の中から測光対象とする標本領域を１以上選択し、この選択した各標本領域の領域位置を記録する標本領域選択ステップと、を含む観察測光準備ステップと、前記標本領域選択ステップで選択された各標本領域から発せられた光を順次測光するとともに、各測光結果を測光時点の前記領域位置に対応付けて記録する測光ステップを所定時間ごとに繰り返す繰り返し測光ステップと、を含むことを特徴とする。
【００４８】
また、本発明にかかる観察測光方法は、上記の発明において、前記観察測光準備ステップは、前記標本領域ごとに、該標本領域から発せられた光を選択的に通過させる開口を選定し、この選定した開口の大きさおよび形状を特定する開口情報を前記領域位置に対応付けて記録する開口選定ステップを含み、前記測光ステップは、前記標本領域選択ステップで選択された前記標本領域ごとに、該標本領域の前記領域位置に対応付けられた前記開口情報が示す前記開口を順次設定し、順次設定するごとに前記標本領域から発せられた光を測光するとともに、各測光結果を測光時点の前記領域位置に対応付けて記録することを特徴とする。
【００４９】
また、本発明にかかる観察測光方法は、上記の発明において、前記観察測光準備ステップは、前記標本領域ごとに、該標本領域から発せられた光の中から所定波長域の光を抽出する波長抽出フィルタを選定し、この選定した波長抽出フィルタを特定するフィルタ情報を前記領域位置に対応付けて記録するフィルタ選定ステップを含み、前記測光ステップは、前記標本領域選択ステップで選択された前記標本領域ごとに、該標本領域の前記領域位置に対応付けられた前記フィルタ情報が示す前記波長抽出フィルタを順次設定し、順次設定するごとに前記標本領域から発せられた光を測光するとともに、各測光結果を測光時点の前記領域位置に対応付けて記録することを特徴とする。
【００５０】
また、本発明にかかる観察測光方法は、上記の発明において、前記繰り返し測光ステップは、前記標本に対する撮影視野全体を前記標本領域とし、該撮影視野に応じた前記開口を設定して該撮影視野内の前記標本から発せられた光を測光するとともに、この測光結果を記録する全視野測光ステップを前記所定時間ごとに繰り返すことを特徴とする。
【００５１】
また、本発明にかかる観察測光方法は、上記の発明において、前記繰り返し測光ステップは、前記標本が発した光をもとに該標本を撮影して発光観察画像を取得する発光画像取得ステップを前記所定時間ごとに繰り返すことを特徴とする。
【発明の効果】
【００５２】
本発明にかかる観察測光装置および観察測光方法によれば、標本内の発光領域を特定することができ、その特定領域から発せられる光を選択的に測光することができるとともに、標本から微弱光が発せられる場合にも高精度に測光することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５３】
以下、添付図面を参照して、本発明にかかる観察測光装置および観察測光方法の好適な実施の形態を詳細に説明する。この実施の形態では、本発明にかかる観察測光装置が、例えばルシフェラーゼ遺伝子を含んだ生細胞など、微弱光を発する発光体を含んだ標本を観察測光対象とするものとして説明する。なお、この実施の形態により本発明が限定されるものではない。また、図面の記載において、同一部分には同一符号を付して示している。
【００５４】
（実施の形態）
図１は、本実施の形態１にかかる観察測光装置１００の構成を示す図である。この図に示す観察測光装置１００は、大別して、標本Ｓを観察する観察系１と、後述する開口を照明し開口像を標本Ｓ上に作成し標本Ｓから発せられた光を測光する測光系２と、標本Ｓを保持および移動させる電動ステージ系３と、標本Ｓを照明する照明系４と、各部の動作制御および各種情報の処理制御等を行う制御系５と、観察測光装置１００の一部を遮蔽する遮蔽部６とを備える。
【００５５】
観察系１は、対物レンズ１１、結像レンズ１２および撮像装置１３を用いて構成されている。観察光学系としての対物レンズ１１および結像レンズ１２は、標本Ｓの観察像を撮像装置１３の撮像面１３ａ上に結像させる。ここで、対物レンズ１１は、無限遠補正された対物レンズであって、前側焦点位置で観察視野内に設けられた標本Ｓ上の各点からの光を受光して各々平行光束に変換する。このとき対物レンズ１１は、標本Ｓ側にテレセントリックとされる。また、対物レンズ１１は、標本Ｓからの光を高い開口数（ＮＡ）で受光する高ＮＡかつ高倍率の対物レンズであって、例えば倍率２０倍、ＮＡ０．８、焦点距離１０ｍｍである対物レンズが用いられる。
【００５６】
結像レンズ１２は、その前側焦点位置を対物レンズ１１の後側焦点位置と一致させて設けられ、対物レンズ１１が変換した平行光束を集光して撮像面１３ａ上にテレセントリックに結像する。これによって、この観察光学系は、両側にテレセントリックな結像光学系として構成される。また、結像レンズ１２は、観察光学系の総合結像倍率が例えば４倍となるように、上記に例示した対物レンズ１１に対して焦点距離４０ｍｍ、ＮＡ０．２のレンズ系が用いられる。なお、観察光学系の総合結像倍率は、４倍に限定して解釈する必要はなく、２倍以上、８倍以下とすることが好ましい。また、結像レンズ１２は、中間像を結像するリレーレンズ系を含んだ結像レンズ系としてもよい。
【００５７】
撮像装置１３は、撮像素子として例えば冷却ＣＣＤを用いた撮像装置であり、その撮像面１３ａを結像レンズ１２の焦点面上に配置して設けられる。撮像装置１３は、撮像面１３ａ上に結像される標本Ｓの観察像等を撮像して観察画像を生成し、画像信号として出力する。なお、撮像素子は、冷却ＣＣＤに限定されず、所望の感度有するものであればＣＭＯＳ等、他の撮像素子であってもよい。
【００５８】
対物レンズ１１および結像レンズ１２を用いて構成される観察光学系は、撮像面１３ａ上の各画素と同等または各画素より小さいエアリーディスク（Airy Disc）を形成するように、その結像特性が設定されている。すなわち、この観察光学系は、エアリーディスク径が撮像面１３ａ上の各画素における受光領域内に含まれるように、標本Ｓ上の各点からの光を撮像面１３ａ上に結像する。これによって観察系１では、通常の結像特性に基づく場合よりも各画素における受光量および起電流を増大させ、Ｓ／Ｎ比を向上させることができ、標本Ｓ上の各点から発せられる微弱光を高感度に検出して撮像することができる。
【００５９】
なお、対物レンズ１１には、この対物レンズ１１を観察光学系の観察光軸ＯＡ１方向に移動させ、標本Ｓとの相対距離を変化させる焦準機構１４が連接されており、これによって標本Ｓに対する観察光学系の焦点合わせを行うことができる。
【００６０】
測光系２は、対物レンズ１１、波長抽出フィルタユニット２１、結像レンズ２２、ピンホールユニット２３、ピンホール照明系２４、集光レンズ２５および光検出器２６を用いて構成されている。ここで、対物レンズ１１および結像レンズ２２を用いて構成される投影測光光学系の投影測光光路は、上述した観察光学系の観察光路に対し、光路切換ユニット２７によって合分岐されている。これによって投影測光光学系は、対物レンズ１１を観察光学系と共用し、ピンホールユニット２３に設けられたピンホール２３ａのピンホール像を標本Ｓ上に投影することができるとともに、標本Ｓから発せられた光をピンホール２３ａ上に集光することができる。言い換えると、この投影測光光学系は、ピンホール２３ａと標本Ｓとを光学的に共役関係とし、互いに一方の像を他方の上に結像させることができる。ここで、投影測光光学系における標本Ｓからピンホール２３ａへの総合倍率は、例えば観察光学系の総合結像倍率と等しく４倍とされる。ただし、これらの倍率は、必ずしも等しくさせる必要はなく、異ならせてもよい。また、ピンホール２３ａは、結像レンズ２２の後側焦点位置、つまり投影測光光学系の結像面（一次結像面）に配置されている。
【００６１】
観察光路に対して投影測光光路を合分岐する光路切換ユニット２７は、透過率および反射率の少なくとも一方が異なる複数の光分割プリズム２７ａと、この複数の光分割プリズム２７ａのうち１つを観察光路上に択一的に配置する選択配置機構２７ｂとを用いて構成されている。図２は、その光路切換ユニット２７の構成を示す図である。この図は、図１に示したII矢視方向に対応する矢視図であり、一部を断面図として示している。
【００６２】
図２に示すように、光路切換ユニット２７は、複数の光分割プリズム２７ａとして、透過率に比して反射率が高い光分割プリズム２７ａ−１と、透過率に比して反射率が低い光分割プリズム２７ａ−２と、透過率と反射率とが等しい光分割プリズム２７ａ−３とを有する。より具体的には、各光分割プリズム２７ａ−１〜２７ａ−３の分割比（＝透過率：反射率）は、例えば順に０：１００、１００：０および５０：５０とされる。ただし、ここに例示した分割比に限定して解釈する必要はない。例えば、光分割プリズム２７ａ−３における分割比は、透過率と反射率とを厳密に等しくする必要はなく、ピンホール照明光量やＣＣＤ感度等を考慮して定めればよい。
【００６３】
選択配置機構２７ｂは、光分割プリズム２７ａを保持するスライダ２７１と、このスライダ２７１をＹ軸方向（図２における左右方向）に移動させるスライダ駆動部２７２とを用いて構成されている。スライダ２７１は、Ｙ軸方向に貫通孔２７１−１〜２７１−３が設けられ、この各貫通孔２７１−１〜２７１−３内に各々光分割プリズム２７ａ−１〜２７ａ−３を嵌設して保持している。スライダ駆動部２７２は、スライダ２７１をＹ軸方向に所定量ごと移動させ、光分割プリズム２７ａ−１〜２７ａ−３のいずれかを観察光路上の観察光軸ＯＡ１上に択一的に配置する。
【００６４】
ここで、分割比が０：１００の光分割プリズム２７ａ−１が配置された場合、標本Ｓから発せられた光はすべて反射され、結像レンズ２２によって結像される。一方、分割比が１００：０の光分割プリズム２７ａ−２が配置された場合、標本Ｓからの光はすべて透過され、結像レンズ１２によって撮像面１３ａ上に結像される。また、分割比が５０：５０の光分割プリズム２７ａ−３が配置された場合、後述するように照明されるピンホール２３ａからの光は、標本Ｓ上に投影され、標本Ｓ上で反射した後、その半分が光分割プリズム２７ａ−３を透過し、結像レンズ１２によって撮像面１３ａ上に結像される。
【００６５】
なお、選択配置機構２７ｂは、スライダ２７１に替えてターレットを備え、このターレット上に複数の光分割プリズム２７ａを保持して回動させることで、複数の光分割プリズム２７ａのうち１つを観察光路上に択一的に配置する機構としてもよい。また、選択配置機構２７ｂは、３つに限定されず、さらに多くの光分割プリズム２７ａを保持し、観察光路上に択一的に配置させることもできる。
【００６６】
ピンホールユニット２３は、図１に示すように、ピンホール２３ａおよび切欠２３ｄ（図３参照）が形成されたピンホール板２３ｂと、このピンホール板２３ｂを回動および移動させるピンホール駆動部２３ｃとを用いて構成されている。ピンホール板２３ｂは、大きさおよび形状の少なくとも一方が異なる複数の開口がピンホール２３ａとして形成された円盤状部材である。複数のピンホール２３ａは、ピンホール板２３ｂの外縁部で周方向に配列して設けられている。図３は、そのピンホール板２３ｂに設けられた複数のピンホール２３ａを例示する正面図であり、図１に示したIII矢視方向に対応する矢視図である。この図に示すようにピンホール板２３ｂは、複数のピンホール２３ａが透孔として形成され、さらにこの透孔群に連設して切欠２３ｄが形成されている。すなわち、大きさが異なる５つの円孔２３ａと、大きさが異なる４つの正方孔２３ａと、外縁部の一部を周方向に沿って切り欠いた切欠２３ｄとを有する。なお、ピンホール２３ａは、円形および正方形に限らず、楕円形、矩形、その他の多角形等、任意の形状にすることができ、その形状の向きおよび大きさも任意に設定することができる。
【００６７】
ピンホール駆動部２３ｃは、ピンホール板２３ｂをその周方向に回動自在に保持する。具体的には、ピンホール駆動部２３ｃは、ピンホール板２３ｂの中心部を保持し、その中心軸ＰＡ回りに回動させる。これによって各ピンホール２３ａおよび切欠２３ｄは、所定の円周ＣＲ上で自在に配置変更される（図３参照）。また、ピンホール板２３ｂは、図１に示すように、中心軸ＰＡを投影測光光学系の投影測光光軸ＯＡ２と平行にして配置されるとともに、初期状態として円周ＣＲが投影測光光軸ＯＡ２と交差するように配置される。ピンホール駆動部２３ｃは、ピンホール板２３ｂを回動させ、複数のピンホール２３ａのうち１つを投影測光光軸ＯＡ２上で投影測光光路内に択一的に配置する。
【００６８】
また、ピンホール駆動部２３ｃは、ピンホール板２３ｂを投影測光光軸ＯＡ２に垂直な面内（図１におけるＹ−Ｚ面内）で２次元的に移動させる。これによってピンホール駆動部２３ｃは、投影測光光路内に配置されたピンホール２３ａを投影測光光学系の結像面に沿って移動させ、投影測光光学系によって投影されるピンホール２３ａのピンホール像を標本Ｓ上で移動させる。ここで、ピンホール駆動部２３ｃは、ピンホール像を観察光学系の観察視野内で自在に移動可能な移動ストロークを有しており、例えば、対物レンズ１１が倍率２０倍で視野φ１．２ｍｍとし、投影測光光学系における標本Ｓからピンホール２３ａへの総合倍率を４倍とすると、移動可能範囲はφ４．８ｍｍとすればよい。なお、投影測光光軸ＯＡ２に垂直な面内とは、厳密に垂直である必要はなく略垂直である場合を含むものである。
【００６９】
さらに、ピンホール駆動部２３ｃは、例えばエンコーダを用い、回動および２次元移動させたピンホール板２３ｂの回動位置および移動位置を検出し、この検出結果をもとに、投影測光光路内に配置したピンホール２３ａの、投影測光光軸ＯＡ２に対する位置を示すピンホール位置とピンホール開口径とを特定する。投影測光光学系の総合倍率が既知であることから、このピンホール位置に対応して標本Ｓ上でのピンホール像位置も決定されることになる。また、ピンホール駆動部２３ｃは、ピンホール位置が指定された場合、そのピンホール位置に基づいて、ピンホール２３ａを投影測光光路内に配置することもできる。
【００７０】
ピンホール照明系２４は、ハロゲンランプ等を用いたランプ光源２４ａ、拡散板２４ｂ、コンデンサレンズ２４ｃおよび低反射ミラー２４ｄを用いて構成されている。照明光導入手段としての低反射ミラー２４ｄは、ピンホール板２３ｂと集光レンズ２５との間の測光光路上に配置されており、ランプ光源２４ａが発して拡散板２４ｂおよびコンデンサレンズ２４ｃを介したピンホール照明光を所定の反射率で反射させ、測光手段としての集光レンズ２５および光検出器２６における測光光路内に導入し、ピンホール２３ａに照射する。また、低反射ミラー２４ｄは、標本Ｓから発せられて投影測光光学系を介すとともにピンホール２３ａを通過した光を所定の透過率で透過させる。
【００７１】
低反射ミラー２４ｄの反射率および透過率は、光検出器２６による測光、とりわけ微弱光の測光に影響を与えない範囲に設定されるとともに、後述するピンホール２３ａのピンホール像の観察に支障をきたさない範囲内で設定される。具体的には、透過率に比して反射率が低く設定され、例えば反射率は１〜２％程度、透過率は９８〜９９％程度とされる。この理由は、撮像装置１３（例えばＣＣＤカメラ）の感度が高いため、標本Ｓ上でのピンホール像は暗くてもよく、一方光検出器２６には多くの光を透過させることにある。
【００７２】
なお、ランプ光源２４ａが発したピンホール照明光は、拡散板２４ｂによって拡散された後、コンデンサレンズ２４ｃによって、投影測光光路内に配置されたピンホール２３ａに導かれる。投影測光光学系は、このようにしてピンホール２３ａのピンホール像を標本Ｓ上に投影する。
【００７３】
集光レンズ２５は、標本Ｓから発せられてピンホール２３ａを通過した光を、低反射ミラー２４ｄを介して受光し、光検出器２６の受光エリア内に集光させる。光検出器２６は、この集光された光を検出して光電変換し、検出光量に応じた測光信号を出力する。この光検出器２６は、光検出素子として微弱光を高感度および高精度に検出可能な微弱光検出素子を用いた光検出器であって、その微弱光検出素子には、例えば光電子増倍管またはアバランシェフォトダイオードが用いられる。なお、これら集光レンズ２５および光検出器２６と、ピンホール照明系２４と、ピンホールユニット２３とは、一体保持機構２８によって一体に保持され、ユニット化されている。
【００７４】
ここで、光検出器２６が検出する標本Ｓからの光は、波長抽出フィルタユニット２１によって所定波長域の光に制限される。波長抽出フィルタユニット２１は、異なる波長域の光を抽出する複数の波長抽出フィルタ２１ａと、この複数の波長抽出フィルタ２１ａの少なくとも１つを、非配置を含めて選択的に測光光路としての投影測光光路内に配置する選択配置機構２１ｂとを備えており、投影測光光路内に配置した波長抽出フィルタ２１ａによって、標本Ｓから発せられた光の中から特定の波長域の光を選択的に透過させて抽出する。これによって光検出器２６は、標本Ｓから発せられた光のうち、波長抽出フィルタ２１ａを透過した特定の波長域の光を検出して測光する。
【００７５】
図４は、波長抽出フィルタユニット２１の構成を示す図である。この図は、図１に示したIV矢視方向に対応する矢視図であり、一部を断面図として示している。図４に示すように、波長抽出フィルタユニット２１は、複数の波長抽出フィルタ２１ａとして、例えば６５０ｎｍ以上の長波長域の光を透過させるロングウェーブパスフィルタとしての波長抽出フィルタ２１ａ−１と、５５０ｎｍ以下の短波長域の光を透過させるショートウェーブパスフィルタとしての波長抽出フィルタ２１ａ−２とを有する。
【００７６】
選択配置機構２１ｂは、波長抽出フィルタ２１ａを保持するスライダ２１１と、このスライダ２１１をＹ軸方向（図４における上下方向）に移動させるスライダ駆動部２１２とを用いて構成されている。スライダ２１１は、Ｙ軸に沿って貫通孔２１１−１〜２１１−３が設けられ、貫通孔２１１−１，２１１−２内に各々波長抽出フィルタ２１ａ−１，２１ａ−２を嵌設して保持している。スライダ駆動部２１２は、スライダ２１１をＹ軸方向に所定量ごと移動させ、波長抽出フィルタ２１ａ−１，２１ａ−２および空穴としての貫通孔２１１−３のいずれかを投影測光光路内の投影測光光軸ＯＡ２上に択一的に配置する。
【００７７】
ここで、光検出器２６は、波長抽出フィルタ２１ａ−１が配置された場合、標本Ｓから発せられた光のうち波長６５０ｎｍ以上の赤色系統の光を検出し、波長抽出フィルタ２１ａ−２が配置された場合、波長５５０ｎｍ以下の緑色系統の光を検出する。また、空穴としての貫通孔２１１−３が配置された場合には、波長域を制限することなく、標本Ｓから発せられた光を検出する。
【００７８】
なお、選択配置機構２１ｂは、スライダ２１１に替えてターレットを備え、このターレット上に複数の波長抽出フィルタ２１ａを保持して回動させることで、複数の波長抽出フィルタ２１ａの少なくとも１つまたは空穴を投影測光光路内に択一的に配置する機構としてもよい。また、選択配置機構２１ｂは、２つに限定されず、さらに多くの波長抽出フィルタ２１ａを備えることもでき、１つの貫通孔内に２つ以上の波長抽出フィルタ２１ａを嵌設することもできる。これによって、１つの波長抽出フィルタでは抽出し得ない波長域の光を抽出することができる。また、波長抽出フィルタユニット２１は、投影測光光路内に限定されず、ピンホール板２３ｂから光検出器２６に至る測光光路内に配置させてもよい。
【００７９】
電動ステージ系３は、図１に示すように、シャーレ等の容器３１を介して標本Ｓを保持するステージ部３２と、このステージ部３２を観察光学系の観察光軸ＯＡ１に垂直な面内（図１におけるＸ−Ｙ面内）で２次元的に移動させるステージ駆動部３３とを用いて構成されている。ステージ駆動部３３は、ステージ部３２を移動させることで、観察光学系の観察光軸ＯＡ１および観察視野に対して標本Ｓを移動させるとともに、投影測光光学系によって投影されるピンホール２３ａのピンホール像に対して標本Ｓを移動させる。ここで、ステージ駆動部３３は、標本Ｓの全領域を観察視野内に適宜移動させることができる移動ストロークを有している。なお、観察光軸ＯＡ１に垂直な面内とは、厳密に垂直である必要はなく略垂直である場合を含むものである。なお、ステージのみの駆動の場合は、開口像は観察光学系の光軸上に固定されている。
【００８０】
また、ステージ駆動部３３は、ステッピングモータやエンコーダ等を用い、２次元移動させた標本Ｓの、観察光軸ＯＡ１に対する位置を示す標本位置を特定する。さらに、ステージ駆動部３３は、標本位置が指定された場合、その標本位置に基づいて、標本Ｓを観察視野内に配置することもできる。なお、標本Ｓはステージ部３２上に固定して保持され、ステージ部３２に対する標本Ｓの位置関係は、あらかじめ測定されてキャリブレーションされる。
【００８１】
照明系４は、白色光等の標本照明光を発する光源装置４１と、この標本照明光を一端から受光して他端から射出するファイバーライトガイド４２とを用いて構成されている。照明系４は、ファイバーライトガイド４２が射出する標本照明光を標本Ｓに対して対物レンズ１１と反対側（図１における上側）から照射することで、標本Ｓに対して明視野照明としての透過照明を行う。
【００８２】
制御系５は、例えばパーソナルコンピュータ（ＰＣ）によって実現され、各部の作動を指示する指示情報等を制御系５に対して入力する入力部５１と、画像情報や文字情報等を表示する表示部５２と、観察画像や測光データ等を記憶する記憶部５３と、各部における処理および動作を制御する制御部５４とを備える。制御部５４は、入力部５１、表示部５２および記憶部５３と、観察系１、測光系２、電動ステージ系３および照明系４が備える各稼働部とに電気的に接続されている。
【００８３】
制御部５４は、機能別に観察測光制御部５４ａ、記憶制御部５４ｂ、表示制御部５４ｃ、切換制御部５４ｄ、照明制御部５４ｅ、移動制御部５４ｆおよび焦準制御部５４ｇを備える。観察測光制御部５４ａは、観察系１による観察および測光系２による測光に関わる各稼働部の動作を制御する。具体的には、観察測光制御部５４ａは、例えば、標本Ｓの観察像を撮像装置１３によって撮像する撮像処理、標本Ｓから発せられた光を光検出器２６によって測光する測光処理の制御を行う。また、あらかじめ設定された各種測光条件に基づいて所定期間ごとに測光を繰り返す繰り返し測光（以下、タイムラプス測光と呼ぶ。）を行う場合に各稼働部の設定および切換等を行う制御をする。
【００８４】
記憶制御部５４ｂは、観察系１によって生成された観察画像、測光系２によって測光された測光データ、各観察画像および各測光データに対応する各種設定条件等を記憶部５３に記憶させる制御を行う。また、タイムラプス測光を行うために設定されるタイムラプス測光条件を記憶部５３に記憶させる制御を行う。
【００８５】
表示制御部５４ｃは、観察画像や測光データ等を画像情報あるいは文字情報として表示部５２に表示させる制御を行う。その際、表示制御部５４ｃは、各種画像情報および文字情報を適宜対応付けて表示部５２に表示させる。これによって表示制御部５４ｃは、例えば、観察画像と、この観察画像に対応する測光データとを対応付けて表示させたり、照明系４によって照明された標本Ｓを撮影した観察画像と、自家発光した標本Ｓを撮影した観察画像とを重ね合わせて表示させるなどの表示処理を表示部５２に行わせることができる。また、表示制御部５４ｃは、撮像装置１３が撮像して生成する画像をライブ映像（リアルタイム表示画像）として表示部５２に表示させることもできる。
【００８６】
切換制御部５４ｄ、照明制御部５４ｅ、移動制御部５４ｆおよび焦準制御部５４ｇは、それぞれ入力部５１から入力される所定の指示情報に対応した制御を行う。具体的には、切換制御部５４ｄは、指示情報に応じてピンホール２３ａ、波長抽出フィルタ２１ａおよび光分割プリズム２７ａを個別に切り換える制御をする。照明制御部５４ｅは、指示情報に応じてランプ光源２４ａ、光源装置４１を個別に点灯および消灯制御し、ピンホール照明系２４および照明系４による各照明の開始および停止制御をする。移動制御部５４ｆは、指示情報に応じてピンホール２３ａおよび標本Ｓの少なくとも一方を個別に２次元移動させる制御をする。すなわち、移動制御手段５４ｆは、指示情報に応じてピンホール板２３ｂをＹ−Ｚ移動させる制御および／もしくはステージ部３２をＸ−Ｙ移動させる制御を個別に行う。焦準制御部５４ｇは、指示情報に応じて対物レンズ１１を焦準移動させ、標本Ｓに対する観察光学系の焦点合わせを行う制御をする。これらの制御によって、利用者は、各種観察条件および測光条件の切り換え、照明の開始および停止、標本Ｓ上の観察位置および測光位置の変更、観察画像のピント合わせ等を適宜行うことができる。
【００８７】
遮蔽部６は、照明系４の一部と制御系５とを除き観察測光装置１００を内部に収容し、観察測光装置１００に対して外部から照射される光を遮断する。これによって、遮蔽部６は暗室を形成し、この暗室内で観察測光装置１００に安定かつ高精度に微弱光の測光および観察を実施させることができる。なお、遮蔽部６は、観察測光装置１００の全部を内部に収容して遮光するようにしてもよい。この場合、利用者等が内部に入れるスペースを有することが好ましい。
【００８８】
以上のように構成された観察測光装置１００では、ピンホール照明系２４からのピンホール照明光は、ピンホール２３ａに照射され、これを通過した後、投影測光光学系としての結像レンズ２２および対物レンズ１１によって標本Ｓに照射される。これによって標本Ｓ上には、ピンホール２３ａの開口形状に応じた明るいスポット像がピンホール像として結像される。さらにピンホール照明光は、標本Ｓによって反射され、観察光学系としての対物レンズ１１および結像レンズ１２によって撮像面１３ａ上に照射される。これによって撮像面１３ａ上には、ピンホール像の共役像である２次ピンホール像と、ピンホール像内で照明された標本Ｓの観察像とが結像され、この結像された各像が撮像装置１３によって撮像される。このとき、波長抽出フィルタユニット２１では、空穴もしくは波長抽出フィルタ２１ａが投影測光光路内に適宜配置され、光路切換ユニット２７では、分割比が５０：５０である光分割プリズム２７ａ−３が観察光路上に配置される。
【００８９】
一方、測光対象としてピンホール像内の標本Ｓから発せられた光は、投影測光光学系によってピンホール２３ａ上に集光され、ピンホール２３ａを通過した後、集光レンズ２５によって光検出器２６の受光エリア内に集光される。このとき、ピンホール像外の標本Ｓから発せられた光は、投影測光光学系によってピンホール２３ａ外のピンホール板２３ｂ上に集光されて遮光される。これによって、光検出器２６にはピンホール像内の標本Ｓから発せられた光のみ集光され、この集光された光のみが測光される。この場合、光路切換ユニット２７では、分割比が０：１００である光分割プリズム２７ａ−１が観察光路上に配置され、標本Ｓからの光は、すべて結像レンズ２２に向けて反射されてピンホール２３ａ上に光量損失なく集光される。また、波長抽出フィルタユニット２１では、測光対象とする波長域の光を抽出できる波長抽出フィルタ２１ａもしくは空穴が投影測光光路内に適宜配置される。
【００９０】
また、明視野観察のためファイバーライトガイド４２から標本Ｓに照射された標本照明光は、標本Ｓを透過し、観察光学系によって撮像面１３ａ上に照射される。これによって、撮像面１３ａ上には標本Ｓの明視野観察像が結像され、この明視野観察像が撮像装置１３によって撮像される。このとき、光路切換ユニット２７では、分割比が１００：０である光分割プリズム２７ａ−２が観察光路上に配置され、標本Ｓからの光はすべて撮像面１３ａ上に結像される。また、明視野観察のためのファイバーライトガイド４２からの照明をオフして標本Ｓの発光状態を観察する場合も同様な分割比で行う。
【００９１】
つぎに、観察測光装置１００によってタイムラプス測光を行う処理手順について説明する。図５は、タイムラプス測光処理手順を示すフローチャートである。また、図６−１〜図６−４は、タイムラプス測光処理手順における処理工程に応じて観察される観察像を説明する図である。なお、ここでは標本Ｓが、発光体として微弱光を発する複数の細胞を含み、このうちいくつかの細胞を測光対象細胞としてタイムラプス測光を行う処理手順を説明する。
【００９２】
はじめに測光準備工程として、標本Ｓの中から測光対象細胞等を選択して記録する処理を行う。すなわち、まず光源装置４１を点灯し、標本Ｓに対して透過照明を行い、撮像装置１３によって標本Ｓの観察像を撮像して、図６−１に示すような明視野観察像をライブ画像として取得する（ステップＳ１０１）。この明視野観察像は、表示制御部５４ｃによって表示部５２にリアルタイム表示され、これによって利用者等は、標本Ｓの現在の状態を観察できる。なお、このステップＳ１０１では、光路切換ユニット２７によって、分割比が５０：５０である光分割プリズム２７ａ−３が観察光路上に配置される。
【００９３】
つづいて、リアルタイム表示された明視野観察像をもとに、標本Ｓの中から測光対象細胞を選択し、この選択した測光対象細胞を特定する細胞位置を記憶部５３に記憶させる（ステップＳ１０２）。このステップＳ１０２では、透過照明に加え、ランプ光源２４ａを点灯してピンホール照明を行い、標本Ｓ上に明るいピンホール像を投影する。そして、ピンホール駆動部２３ｃおよびステージ駆動部３３によってピンホール２３ａおよび標本Ｓを適宜移動させ、図６−２に示すように、所望の測光対象細胞上にピンホール像ＰＩを重ね合わせる。この状態でピンホール位置および標本位置を検出し、各検出結果を測光対象細胞の細胞位置として記録する。この細胞位置の記録は、例えば利用者等が記録を指示する指示情報を入力部５１から入力し、入力された指示情報に応じて記憶制御部５４ｂがピンホール駆動部２３ｃおよびステージ駆動部３３から各々ピンホール位置および標本位置を取得して記憶部５３に記憶させることで行われる。
【００９４】
なお、ここではピンホール２３ａおよび標本Ｓを両方移動させて測光対象細胞とピンホール像とを重ね合わせるものとしたが、どちらか一方を所定位置に固定し、他方のみ移動させて重ね合わせることもできる。例えば、ピンホール２３ａを投影測光光軸上に固定配置してピンホール像を観察光軸ＯＡ１上に投影させ、ステージ駆動部３３によって所望の測光対象細胞を観察光軸ＯＡ１上に移動させることで重ね合わせをすることができる。この場合、標本位置によって細胞位置が特定可能であるため、標本位置のみを細胞位置として記憶部５３に記憶させるようにしてもよい。また、例えば、標本Ｓを観察光軸ＯＡ１に対して固定配置し、観察視野内でピンホール像を適宜移動させることで重ね合わせをすることもできる。この場合には、ピンホール位置によって細胞位置が特定可能であるため、ピンホール位置のみを細胞位置として記憶部５３に記憶させてもよい。この場合の細胞の測光エリアは、対物レンズ１１の視野内に限定される。
【００９５】
また、ステップＳ１０２では、透過照明とピンホール照明とを同時に行うものとして説明したが、測光対象細胞を観測しやすいように一方の照明を適宜消灯させてもよい。各照明の点灯および消灯は、利用者等が各照明の開始および停止を指示する所定の指示情報を入力部５１から入力し、この指示情報に応じて照明制御部５４ｅが光源装置４１およびランプ光源２４ａの点灯および消灯制御をすることで行われる。
【００９６】
さらに、ステップＳ１０２では、選択した測光対象細胞を識別する細胞識別情報としての細胞ＩＤを細胞位置に対応付けて記憶部５３に記憶させることができる。この細胞ＩＤは、例えば利用者等が任意に設定して入力部５１から入力し、記憶制御部５４ｂが記憶部５３に記憶させることで行われる。あるいは、記憶制御部５４ｂが細胞位置を記憶させるごとに、所定の一連の細胞ＩＤを順次対応付けて記憶させるようにすることもできる。
【００９７】
つぎに、ステップＳ１０２で選択した測光対象細胞に応じて、この測光対象細胞から発せられる光のみを選択的に測光できるようにピンホール２３ａを設定し、この設定したピンホール２３ａの大きさおよび形状を特定するピンホール情報を細胞位置に対応付けて記憶部５３に記憶させる（ステップＳ１０３）。具体的には、このステップＳ１０３では、ピンホール駆動部２３ｃによってピンホール板２３ｂを回動させ、測光対象細胞に適した大きさおよび形状を有するピンホール２３ａを選択し、選択したピンホール２３ａを識別するピンホールＩＤをピンホール情報として記録する。なお、選択するピンホール２３ａの大きさは、測光対象細胞よりも若干大きくすることが好ましい。また、ステップＳ１０３では、透過照明を適宜消灯してピンホール像を確認するとよい。透過照明を消灯させることで、図６−３に示すように、ピンホール像ＰＩと、このピンホール像ＰＩ内の測光対象細胞とが鮮明に観察可能となって、測光対象細胞に適したピンホール２３ａを確認しやすくなる。
【００９８】
つづいて、ステップＳ１０２で選択した測光対象細胞に応じて、この測光対象細胞から発せられる光のうち測光すべき波長域の光を抽出するための波長抽出フィルタ２１ａを設定し、この設定した波長抽出フィルタ２１ａを特定するフィルタ情報を細胞位置に対応付けて記憶部５３に記憶させる（ステップＳ１０４）。このステップＳ１０４では、あらかじめ波長抽出フィルタユニット２１のスライダ２１１にセットされた複数の波長抽出フィルタ２１ａの中から、測光波長域に対応する抽出波長域を有した波長抽出フィルタ２１ａを選択し、選択した波長抽出フィルタ２１ａを識別するフィルタＩＤをフィルタ情報として記録する。
【００９９】
その後、所望の測光対象細胞をすべて選択したか否かを判断し（ステップＳ１０５）、すべてを選択していない場合（ステップＳ１０５：Ｎｏ）、ステップＳ１０２からの処理手順を繰り返して測光対象細胞を順次選択する。所望の測光対象細胞をすべて選択した場合には（ステップＳ１０５：Ｙｅｓ）、以上の測光準備工程を終了し、以降のタイムラプス測光工程に移行する。
【０１００】
なお、測光準備工程を終了した段階で、記憶部５３には、図７に示すように、選択した測光対象細胞ごとに細胞ＩＤ、細胞位置、ピンホールＩＤおよびフィルタＩＤが互いに対応付けられたタイムラプス測光条件が記憶されている。以降のタイムラプス測光工程では、このタイムラプス測光条件をもとに、各測光対象細胞から発せられる光が順次測光され、その一連の測光が所定期間ごとに繰り返されるとともに、各測光結果が各測光対照細胞に逐次対応付けられ、タイムラプス測光データとして記録される。
【０１０１】
つぎに、そのタイムラプス測光工程の処理手順について説明する。タイムラプス測光を開始する所定の指示情報が入力部５１から入力されることで、まず観察測光制御部５４ａは、タイムラプス測光条件に記録された測光対象細胞をステージ部３２を移動させながら順次測光し、各測光結果を各測光対象細胞の細胞ＩＤ、つまり測光時点の細胞位置に対応付けて記録する（ステップＳ１０６）。このステップＳ１０６では、観察測光制御部５４ａは、ランプ光源２４ａおよび光源装置４１を消灯し、ピンホール照明および透過照明も停止させるとともに、光路切換ユニット２７によって、分割比が０：１００である光分割プリズム２７ａ−１を観察光路上に配置する。また、観察測光制御部５４ａは、測光対象細胞ごとに、その細胞位置に対応付けられたピンホールＩＤおよびフィルタＩＤが示すピンホール２３ａおよび波長抽出フィルタ２１ａを、それぞれピンホールユニット２３および波長抽出フィルタユニット２１によって順次設定する。
【０１０２】
タイムラプス測光条件に記録された各測光対象細胞を一通り測光し終わった後、観察測光制御部５４ａは、観察視野全体の測光、つまり観察視野内に位置する標本Ｓ全体から発せられる光の測光を行い、この測光結果をタイムラプス測光データに記録する（ステップＳ１０７）。このステップＳ１０７では、観察測光制御部５４ａは、ピンホールユニット２３によって、観察視野全体に対応する切欠２３ｄを投影測光光軸ＯＡ２上に配置する。これは、ピンホール板２３ｂを開放することに相当する。
【０１０３】
つづいて、観察測光制御部５４ａは、標本Ｓが発した光をもとに撮像装置１３によって標本像を撮像して発光観察画像を取得し、この取得した発光観察画像を記録する（ステップＳ１０８）。このとき観察測光制御部５４ａは、光路切換ユニット２７によって、分割比が１００：０である光分割プリズム２７ａ−２を観察光路上に配置する。また、観察測光制御部５４ａは、直前のステップＳ１０６，Ｓ１０７で取得した測光結果に対応付けて発光観察画像を記憶部５３に記憶させる。つまり、観察測光制御部５４ａは、各測光対象細胞を一通り測光する測光サイクルごとに発光観察画像を取得するとともに、取得した発光観察画像をその測光サイクルで検出した測光データに対応付けて記録する。なお、このステップＳ１０８では、発光観察画像として、例えば図６−４に示すように暗い背景中で発光した細胞の観察像である発光観察像が撮像される。
【０１０４】
その後、観察測光制御部５４ａは、各測光対象細胞の測光つまり測光サイクルを所定回数繰り返したか否かを判断し（ステップＳ１０９）、所定回数繰り返していない場合（ステップＳ１０９：Ｎｏ）、インターバルの時間として所定時間待機し（ステップＳ１１０）、ステップＳ１０６からの処理を繰り返す。一方、所定回数繰り返した場合には（ステップＳ１０９：Ｙｅｓ）、観察測光制御部５４ａは、一連のタイムラプス測光を終了する。なお、タイムラプス測光終了後、タイムラプス測光データは、制御部５４によって適宜解析処理され、表示制御部５４ｃによって表示部５２に適宜表示される。
【０１０５】
ここで、上述した測光準備工程およびタイムラプス測光工程における各部の設定状態を図８にまとめて示す。この図の測光準備工程における工程「Ａ１」〜「Ａ４」は、それぞれ図５に示したステップＳ１０１〜Ｓ１０４に対応し、タイムラプス測光工程における工程「Ｂ１」〜「Ｂ３」は、それぞれステップＳ１０６〜Ｓ１０８に対応する。また、図８中の「↑」は、直前の工程の設定内容に等しいことを示している。
【０１０６】
なお、上述した測光準備工程では、利用者等が明視野観察像のライブ画像をもとに測光対象細胞の選択を行うものとして説明したが、明視野観察像を撮像した観察画像を画像処理することによって測光対象細胞を選定するようにしてもよい。また、選定した測光対象細胞に対して適切なピンホール２３ａを画像処理によって設定するようにしてもよい。
【０１０７】
以上説明したように、本実施の形態にかかる観察測光装置１００は、ピンホール２３ａが形成されたピンホール板２３ｂを有し、このピンホール板２３ｂによって光の通過領域を制限するピンホールユニット２３と、ピンホール２３ａを照明するピンホール照明系２４と、ピンホール照明系２４によって照明されたピンホール２３ａのピンホール像を標本Ｓ上に投影する投影測光光学系と、標本Ｓの観察像とともにピンホール像の２次ピンホール像を結像する観察光学系と、投影測光光学系およびピンホール２３ａを介し、ピンホール像内の標本Ｓから発せられた光を測光する光検出器２６と、を備えている。このため、観察測光装置１００では、標本Ｓ内の発光領域を特定することができ、その特定領域から発せられる光を選択的に測光することができる。また、光検出器２６が微弱光を高感度および高精度に検出可能な微弱光検出素子を用いた光検出器であるため、標本Ｓから微弱光が発せられる場合にも高精度に測光をすることができる。
【０１０８】
ここまで、本発明を実施する最良の形態を実施の形態として説明したが、本発明は、上述した実施の形態に限定されず、本発明の趣旨を逸脱しない範囲であれば、種々の変形が可能である。
【０１０９】
例えば、上述した実施の形態では、標本Ｓが自家発光する発光体を含み、この発光体から発せられる光を測光および観察するものとして説明したが、標本Ｓが蛍光体を含む場合には、励起光照射に応じてその蛍光体から発せられる蛍光を測光および観察することもできる。この場合、観察測光装置１００は、例えば図９に示すように、励起光照射のための落射蛍光装置７を備えるとよい。
【０１１０】
落射蛍光装置７は、励起光源７１、励起光投光管７２および蛍光キューブ７３を用いて構成されている。励起光源７１は、水銀ランプ、キセノンランプ、レーザ等が用いられ、標本Ｓが有する蛍光体に応じた所定の励起光を発する。励起光投光管７２は、集光レンズ７２ａ、明るさ絞り作りレンズ７２ｂ、明るさ絞りＡＳ、視野絞りＦＳおよび投光レンズ７２ｃをこの順に配置して備える。蛍光キューブ７３は、標本Ｓを励起する励起光を選択的に透過させる励起フィルタ７３ａと、標本Ｓから発せられた蛍光を選択的に透過させる吸収フィルタ７３ｂと、励起光を反射させて蛍光を透過させるダイクロイックミラー７３ｃとを一体に備える。ここで、励起フィルタ７３ａは、励起光源７１から発せられる光の中から所定の励起光を抽出するバンドパスフィルタであり、吸収フィルタ７３ｂは、標本Ｓから発せられる蛍光に応じた所定のカットオフ波長を有するロングウェーブパスフィルタである。
【０１１１】
落射蛍光装置７は、対物レンズ１１と光路切換ユニット２７との間の観察光軸ＯＡ１上に蛍光キューブ７３が設けられ、励起光源７１が発した励起光を、励起光投光管７２を介してダイクロイックミラー７３ｃで反射させ、対物レンズ１１を介して標本Ｓ上に照射させる。励起光源７１の点灯および消灯、つまり落射蛍光装置７による励起光照明の開始および停止は、入力部５１から入力される所定の照明指示情報をもとに、照明制御部５４ｅによって制御される。なお、落射蛍光装置７では、蛍光キューブ７３として、励起光および蛍光の少なくとも一方に対する光学特性が異なる複数の蛍光キューブを備え、そのうち１つを、非配置も含めて選択的に観察光軸ＯＡ１上に挿脱配置させることもできる。
【０１１２】
また、上述した実施の形態では、光路切換ユニット２７を対物レンズ１１と結像レンズ１２との間の観察光路上に設けるものとしたが、結像レンズ１２と撮像装置１３との間の観察光路上に設けることもできる。この場合、対物レンズ１１に加えて結像レンズ１２を観察光学系と投影測光光学系とで共用することとなる。また、光路切換ユニット２７では、透過光路上に観察光学系を構成し、反射光路上に投影測光光学系を構成したが、かかる構成関係を入れ換えてもよい。つまり、透過光路上に投影測光光学系を構成し、反射光路上に観察光学系を構成することもできる。ただし、その場合には、上述した光分割プリズム２７ａ−１と２７ａ−２との作用関係も入れ換えて解釈する必要がある。さらに、光路切換ユニット２７では、キューブ状の光分割プリズム２７ａを用いるものとしたが、板状の光分割素子あるいは反射ミラーを用いることもできる。
【０１１３】
また、上述した実施の形態では、円盤状のピンホール板２３ｂにピンホール２３ａを形成し、ピンホール板２３ｂをピンホール駆動部２３ｃによって回動することでピンホール２３ａを投影測光光路内に配置するものとしたが、ピンホール駆動部２３ｃによってピンホール板２３ｂをその板面方向に２次元移動させることでピンホール２３ａを投影測光光路内に配置させることもできる。この場合、ピンホール駆動部２３ｃは、ピンホール像を観察光学系の観察視野内で自在に移動可能な移動ストロークに加えて、ピンホール板２３ｂ上のすべてのピンホール２３ａを投影測光光路内に配置可能な移動ストロークを有するものとする。また、ピンホール駆動部２３ｃは、投影測光光軸ＯＡ２に対してピンホール板２３ｂを２次元移動させるものとしたが、一体保持機構２８の全体、つまりピンホールユニット２３、ピンホール照明系２４、集光レンズ２５および光検出器２６を一体に投影測光光軸ＯＡ２に対して２次元移動させるようにしてもよい。
【０１１４】
また、上述した実施の形態では、ピンホール照明系２４では、低反射ミラー２４ｄを測光光路上に固定配置して設けるものとしたが、挿脱自在に配置させることもできる。この場合、ピンホール像を標本Ｓ上に投影するときに低反射ミラー２４ｄを測光光路内に挿入配置し、標本Ｓから発せられる光を測光するときに低反射ミラー２４ｄを測光光路上から取り除くとよい。これによって、低反射ミラー２４ｄによる反射損失をなくすことができ、標本Ｓから発せられる微弱光の測光を一層高感度に行うことができる。また、このように挿脱配置を行う場合には、低反射ミラー２４ｄに替えて全反射ミラーもしくは所定反射率のミラーを用いることができる。その反射率は、撮像装置１３によって撮像される２次ピンホール像の明るさ等に応じて適宜設定するとよい。さらに、ピンホール照明系２４では、ピンホール照明光を発する光源としてランプ光源２４ａを配置するものとしたが、ファイバーライトガイド等を用いてピンホール照明光を導入するようにしてもよい。この場合、拡散板２４ｂは適宜取り除くことができる。
【０１１５】
また、上述した実施の形態では、焦準機構１４は、対物レンズ１１を標本Ｓに対して移動させて焦点合わせをするものとしたが、ステージ部３２とともに標本ＳをＺ軸方向に移動させて焦点合わせを行うようにしてもよい。あるいは、対物レンズ１１とステージ部３２とをそれぞれ移動させて焦点合わせを行うようにしてもよい。
【０１１６】
また、上述した実施の形態では、標本Ｓに対する明視野照明系として、透過照明系である照明系４を備えるものとしたが、落射照明系を備えるようにしてもよい。さらに、ここまで観察測光装置１００が倒立型であるものとして説明したが、正立型とすることもできる。また、ここまで観察光路と測光光路とを標本Ｓに対して同じ側に設け、観察光路と測光光路とを光路切換ユニット２７によって合分岐するものとして説明したが、観察光路と測光光路とを標本Ｓに対して互いに反対側に設けることもできる。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】本発明の実施の形態にかかる観察測光装置の構成を示す図である。
【図２】図１に示した光路切換ユニットの構成を示す図である。
【図３】図１に示したピンホール板を示す図である。
【図４】図１に示した波長抽出フィルタユニットの構成を示す図である。
【図５】タイムラプス測光処理手順を示すフローチャートである。
【図６−１】標本の明視野観察像を示す図である。
【図６−２】標本の明視野観察像と２次ピンホール像とを示す図である。
【図６−３】２次ピンホール像を示す図である。
【図６−４】標本の発光観察像を示す図である。
【図７】タイムラプス測光データを示す図である。
【図８】タイムラプス測光にかかる各工程の設定状態を示す図である。
【図９】観察測光装置に搭載可能な落射蛍光装置の構成を示す図である。
【符号の説明】
【０１１８】
１ 観察系
２ 測光系
３ 電動ステージ系
４ 照明系
５ 制御系
６ 遮蔽部
７ 落射蛍光装置
１１ 対物レンズ
１２ 結像レンズ
１３ 撮像装置
１３ａ 撮像面
１４ 焦準機構
２１ 波長抽出フィルタユニット
２１ａ 波長抽出フィルタ
２１ｂ 選択配置機構
２２ 結像レンズ
２３ ピンホールユニット
２３ａ ピンホール
２３ｂ ピンホール板
２３ｃ ピンホール駆動部
２３ｄ 切欠
２４ ピンホール照明系
２４ａ ランプ光源
２４ｂ 拡散板
２４ｃ コンデンサレンズ
２４ｄ 低反射ミラー
２５ 集光レンズ
２６ 光検出器
２７ 光路切換ユニット
２７ａ 光分割プリズム
２７ｂ 選択配置機構
２８ 一体保持機構
３１ 容器
３２ ステージ部
３３ ステージ駆動部
４１ 光源装置
４２ ファイバーライトガイド
５１ 入力部
５２ 表示部
５３ 記憶部
５４ 制御部
５４ａ 観察測光制御部
５４ｂ 記憶制御部
５４ｃ 表示制御部
５４ｄ 切換制御部
５４ｅ 照明制御部
５４ｆ 移動制御部
５４ｇ 焦準制御部
７１ 励起光源
７２ 励起光投光管
７２ａ 集光レンズ
７２ｂ 明るさ絞り作りレンズ
７２ｃ 投光レンズ
７３ 蛍光キューブ
７３ａ 励起フィルタ
７３ｂ 吸収フィルタ
７３ｃ ダイクロイックミラー
１００ 観察測光装置
２１１，２７１ スライダ
２１１−１〜２１１−３，２７１−１〜２７１−３ 貫通孔
２１２，２７２ スライダ駆動部
ＯＡ１ 観察光軸
ＯＡ２ 投影測光光軸
ＰＡ 中心軸
ＰＩ ピンホール像
Ｓ 標本
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標本の観察像を生成するとともに、標本から発せられた光を測光する観察測光装置および観察測光方法に関し、特に標本上の部分領域から発せられる微弱光の測光に適用して好適な観察測光装置および観察測光方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、細胞生物学、分子生物学などの研究分野では、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ：Green Fluorescent Protein）や生物発光酵素であるルシフェラーゼ遺伝子を発現のレポーターとして働かせ、細胞内の特定部位や機能蛋白質に蛍光標識、発光標識等を付して生体細胞を観察する必要性が高まっている。特に、ルシフェラーゼ−ルシフェリン発光を利用した遺伝子の研究は、従来の励起光照射による蛍光発光を利用した遺伝子の研究に比べ、励起光照射に起因する生体細胞の損傷が生じないことから長時間にわたって遺伝子の振る舞いを観察できることで注目されている。ところが、ルシフェラーゼ−ルシフェリン発光の観測には、その発光量が微弱なことから、明るい光学系と高感度の光検出器とが必要とされる。
【０００３】
従来、微弱光を測光する測光装置として、例えば特許文献１または２に開示された蛍光読み取り装置がある。この蛍光読み取り装置では、標本から発せられた微弱光である蛍光は、レンズ系で結像され、その結像位置に配置された受光ピンホールを介した後、光検出器によって検出されて測光される。この光検出器には、例えば光電子増倍管（ＰＭＴ：Photomultiplier Tube）やアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ：Avalanche Photodiode）が用いられる。
【０００４】
一般に、光電子増倍管は、ＣＣＤに比べて受光感度が高くＳ／Ｎ比に優れている。また、ＣＣＤにおける画素間の仕切りのような不感帯がなく、高い受光効率で大きな受光エリアを確保することができる。このような特性から、光電子増倍管は、ＣＣＤに比して微弱光測光用の光検出器に適しているといえる。なお、光電子増倍管を測光用の光検出器に用いた場合、ＣＣＤに比して高速測光が可能となる効果も得られる。
【０００５】
【特許文献１】特開２００２−３５７５４９号公報
【特許文献２】特開２００４−１９１２５２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ところで、ルシフェラーゼ−ルシフェリン発光を利用した研究では、標本内で発光している細胞の特定と、その細胞からの発光量の測定とが必要とされる。さらには、細胞内の発光部位の特定が要望される。しかしながら、上述した従来技術にかかる測光装置では、受光ピンホールの大きさによって標本上の測光領域を制限することができるものの、その位置は、装置機構や光学系の倍率等から推定することしかできなかった。つまり、標本上で発光している部位を直接的かつ視覚的に認識することができず、発光している細胞位置を正確に特定することが困難であった。また、測光領域を細胞の大きさに制限し、特定の細胞から発せられた光のみ測光することが困難であった。
【０００７】
本発明は、上記に鑑みてなされたものであって、標本内の発光領域を特定することができ、その特定領域から発せられる光を選択的に測光することができるとともに、標本から微弱光が発せられる場合にも高精度に測光することができる観察測光装置および観察測光方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明にかかる観察測光装置は、開口が形成された開口部材と、前記開口を照明する開口照明手段と、前記開口照明手段によって照明された前記開口の開口像を標本上に投影し、前記開口像内の前記標本から発せられる光を前記開口内に集光させる投影測光光学系と、前記標本の観察とともに前記開口像を観察する観察光学系と、前記投影測光光学系および前記開口を介し、前記開口像内の前記標本から発せられた光を測光する測光手段と、前記開口像と前記標本との少なくとも一方を移動させる相対移動手段と、を備え、前記開口は、前記投影測光光学系の結像面に配設されたことを特徴とする。
【０００９】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、前記観察光学系の観察光路に対して前記投影測光光学系の投影測光光路を合分岐する合分岐手段を備え、前記投影測光光学系は、前記観察光学系の一部または全部を共用して前記開口を前記標本上に投影することを特徴とする。
【００１０】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、前記合分岐手段は、透過率および反射率の少なくとも一方が異なる複数の光分割素子と、複数の前記光分割素子のうち１つを前記観察光路上に択一的に配置する選択配置機構とを有することを特徴とする。
【００１１】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、前記合分岐手段は、複数の前記光分割素子として、反射率と透過率との割合が異なる少なくとも３種類の素子を有することを特徴とする。
【００１２】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、３種類の前記光分割素子は、標本からの光を１００％反射する反射素子と、標本からの光を１００％透過する透過素子と、少なくとも反射と透過とを共に行わせる素子とからなることを特徴とする。
【００１３】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、前記開口照明手段は、照明光を発する光源手段と、該照明光を前記測光手段の測光光路内に導入して前記開口に導く照明光導入手段とを有することを特徴とする。
【００１４】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、前記照明光導入手段は、前記測光光路内に配置され、前記照明光を所定反射率で反射させて前記開口に導くとともに、前記標本から発せられて前記開口を通過した光を所定透過率で透過させる半透明素子であることを特徴とする。
【００１５】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、前記投影測光光学系に対して前記開口の大きさおよび形状の少なくとも一方を変更する開口切換機構を備えたことを特徴とする。
【００１６】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、前記開口部材は、大きさおよび形状の少なくとも一方が異なる複数の前記開口を有し、前記開口切換機構は、複数の前記開口のうち１つを前記投影測光光学系の投影測光光路内に択一的に配置することを特徴とする。
【００１７】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、前記開口部材は、その周方向に複数の前記開口が配列された円盤状部材であり、前記開口切換機構は、前記開口部材をその周方向に回動させ、複数の前記開口のうち１つを前記投影測光光路内に択一的に配置することを特徴とする。
【００１８】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、前記開口は、前記開口部材上に形成された透孔または切欠であることを特徴とする。
【００１９】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、前記相対移動手段は、前記標本を保持し、該標本を前記観察光学系の観察光軸に垂直な面内で移動させる標本移動手段と、前記開口を前記投影測光光学系の投影測光光軸に垂直な面内で移動させる開口移動手段との少なくとも一方を有することを特徴とする。
【００２０】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、前記標本移動手段は、前記観察光軸に垂直な面内で前記標本を自在に移動させる電動ステージを有することを特徴とする。
【００２１】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、前記開口移動手段は、前記開口部材を介して前記開口を前記投影測光光軸に垂直な面内で移動させることを特徴とする。
【００２２】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、前記開口部材、前記開口照明手段および前記測光手段を一体に保持する一体保持機構を備え、前記開口移動手段は、前記一体保持機構を介して前記開口を前記投影測光光軸に垂直な面内で移動させることを特徴とする。
【００２３】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、前記相対移動手段は、前記観察光学系の観察視野内に位置する前記標本上の指定標本領域の領域位置を読取る領域位置読取手段を有することを特徴とする。
【００２４】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、前記領域位置読取手段は、前記観察光軸に対する前記標本の指定標本位置を読取る標本位置読取手段と、前記観察光軸に対する前記開口像の開口像位置を読取る開口位置読取手段との少なくとも一方を有したことを特徴とする。
【００２５】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、前記領域位置を記憶する記憶手段と、前記領域位置読取手段が読取った前記領域位置を前記記憶手段に記憶させる位置記憶制御手段と、を備えたことを特徴とする。
【００２６】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、あらかじめ１以上の前記領域位置を記憶した記憶手段と、前記相対移動手段によって、１以上の前記領域位置に対応する各指定標本領域を前記開口像内に順次配置させ、順次配置させるごとに該指定標本領域から発せられた光を前記測光手段に測光させるとともに、この測光結果を測光時点の前記領域位置に対応付けて前記記憶手段に記憶させる制御を１回または所定期間ごとに繰り返す測光制御手段と、を備えたことを特徴とする。
【００２７】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、あらかじめ１以上の前記標本位置および前記開口位置の少なくとも一方を前記領域位置として記憶した記憶手段と、前記標本移動手段および／または前記開口移動手段によって、１以上の前記標本位置および／または前記開口位置の各々に前記標本および／または前記開口を順次配置させ、順次配置させるごとに前記開口像内の前記標本から発せられた光を前記測光手段に測光させるとともに、この測光結果を測光時点の前記標本位置および／または前記開口位置に対応付けて前記記憶手段に記憶させる制御を１回または所定期間ごとに繰り返す測光制御手段と、を備えたことを特徴とする。
【００２８】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、前記投影測光光学系に対して前記開口の大きさおよび形状の少なくとも一方を変更する開口切換機構を備え、前記記憶手段は、あらかじめ前記領域位置ごとに、前記開口の大きさおよび形状を特定する開口情報を対応づけて記憶し、前記測光制御手段は、前記記憶手段に記憶された前記領域位置に対応する前記指定標本領域を前記開口像内に配置させるごとに、該領域位置に対応付けられた前記開口情報に基づいて前記開口切換機構に前記開口を切り換えさせる制御をすることを特徴とする。
【００２９】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、異なる波長域の光を抽出する複数の波長抽出フィルタを有し、複数の前記波長抽出フィルタの少なくとも１つを、非配置を含めて選択的に前記測光手段の測光光路内に配置する波長抽出手段を備え、前記記憶手段は、あらかじめ前記領域位置ごとに、前記測光光路上に配置する前記波長抽出フィルタを指定するフィルタ情報を対応付けて記憶し、前記測光制御手段は、前記記憶手段に記憶された前記領域位置に対応する前記指定標本領域を前記開口像内に配置させるごとに、該領域位置に対応付けられた前記フィルタ情報に基づいて前記波長抽出手段に前記波長抽出フィルタを配置させる制御をすることを特徴とする。
【００３０】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、前記記憶手段は、あらかじめ前記領域位置ごとに、該領域位置に対応する前記指定標本領域を識別する領域識別情報を対応付けて記憶することを特徴とする。
【００３１】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、複数の前記光分割素子のうち前記標本から発せられた光を前記測光手段に対して１００％配分する光分割素子を前記選択配置機構によって配置し、前記標本から発せられた光を前記測光手段に測光させる制御をする測光制御手段を備えたことを特徴とする。
【００３２】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、前記測光制御手段は、前記測光手段に測光させない場合、複数の前記光分割素子のうち前記標本から発せられた光を前記観察像に対して１００％配分する光分割素子を前記選択配置機構に配置させる制御をすることを特徴とする。
【００３３】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、前記観察光学系は、観察視野内に配置された前記標本上の各点からの光を受光して各々平行光束に変換する対物レンズと、該対物レンズと協働して前記観察像とともに前記２次開口像を結像する結像レンズとを有することを特徴とする。
【００３４】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、前記観察光学系による前記観察像の総合結像倍率は、２倍以上、８倍以下であることを特徴とする。
【００３５】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、前記観察像および前記２次開口像の少なくとも一方を撮像して観察画像を生成する撮像手段を備えたことを特徴とする。
【００３６】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、前記観察画像を表示する表示手段を備えたことを特徴とする。
【００３７】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、前記観察画像として、前記標本に対して照射された光をもとに生成された照明観察画像と、前記標本が発した光をもとに生成された発光観察画像とを重ね合わせて前記表示手段に表示させる制御をする表示制御手段を備えたことを特徴とする。
【００３８】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、所定の照明指示情報に基づいて前記開口照明手段による照明の開始および停止制御をする照明制御手段を備えたことを特徴とする。
【００３９】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、前記標本に対して明視野照明を行う明視野照明手段および該標本を励起する励起光照明を行う励起光照明手段の少なくとも一方を備えたことを特徴とする。
【００４０】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、所定の照明指示情報に基づいて前記明視野照明手段および前記励起光照明手段の少なくとも一方による照明の開始および停止制御をする照明制御手段を備えたことを特徴とする。
【００４１】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、前記標本は、微弱光を発する自己発光体および蛍光発光体の少なくとも一方を含むことを特徴とする。
【００４２】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、前記測光手段は、微弱光検出素子を有し、前記標本から発せられた光を該微弱光検出素子によって検出することを特徴とする。
【００４３】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、前記微弱光検出素子は、光電子増倍管またはアバランシェフォトダイオードであることを特徴とする。
【００４４】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、前記標本と前記観察光学系との相対距離を変化させ、前記標本に対する前記観察光学系の焦点合わせを行う焦準機構を備えたことを特徴とする。
【００４５】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、前記焦準機構は、電動焦準機構であり、所定の焦準指示情報に基づき、前記焦準機構によって前記標本に対する前記観察光学系の焦点合わせを行う制御をする焦準制御手段を備えたことを特徴とする。
【００４６】
また、本発明にかかる観察測光装置は、上記の発明において、当該観察測光装置の一部または全部を遮蔽し、外部から照射される光を遮断する遮蔽手段を備えたことを特徴とする。
【００４７】
また本発明にかかる観察測光方法は、標本を照明し、該標本を撮影して照明観察画像を取得する照明画像取得ステップと、前記照明観察画像をもとに、前記標本の中から測光対象とする標本領域を１以上選択し、この選択した各標本領域の領域位置を記録する標本領域選択ステップと、を含む観察測光準備ステップと、前記標本領域選択ステップで選択された各標本領域から発せられた光を順次測光するとともに、各測光結果を測光時点の前記領域位置に対応付けて記録する測光ステップを所定時間ごとに繰り返す繰り返し測光ステップと、を含むことを特徴とする。
【００４８】
また、本発明にかかる観察測光方法は、上記の発明において、前記観察測光準備ステップは、前記標本領域ごとに、該標本領域から発せられた光を選択的に通過させる開口を選定し、この選定した開口の大きさおよび形状を特定する開口情報を前記領域位置に対応付けて記録する開口選定ステップを含み、前記測光ステップは、前記標本領域選択ステップで選択された前記標本領域ごとに、該標本領域の前記領域位置に対応付けられた前記開口情報が示す前記開口を順次設定し、順次設定するごとに前記標本領域から発せられた光を測光するとともに、各測光結果を測光時点の前記領域位置に対応付けて記録することを特徴とする。
【００４９】
また、本発明にかかる観察測光方法は、上記の発明において、前記観察測光準備ステップは、前記標本領域ごとに、該標本領域から発せられた光の中から所定波長域の光を抽出する波長抽出フィルタを選定し、この選定した波長抽出フィルタを特定するフィルタ情報を前記領域位置に対応付けて記録するフィルタ選定ステップを含み、前記測光ステップは、前記標本領域選択ステップで選択された前記標本領域ごとに、該標本領域の前記領域位置に対応付けられた前記フィルタ情報が示す前記波長抽出フィルタを順次設定し、順次設定するごとに前記標本領域から発せられた光を測光するとともに、各測光結果を測光時点の前記領域位置に対応付けて記録することを特徴とする。
【００５０】
また、本発明にかかる観察測光方法は、上記の発明において、前記繰り返し測光ステップは、前記標本に対する撮影視野全体を前記標本領域とし、該撮影視野に応じた前記開口を設定して該撮影視野内の前記標本から発せられた光を測光するとともに、この測光結果を記録する全視野測光ステップを前記所定時間ごとに繰り返すことを特徴とする。
【００５１】
また、本発明にかかる観察測光方法は、上記の発明において、前記繰り返し測光ステップは、前記標本が発した光をもとに該標本を撮影して発光観察画像を取得する発光画像取得ステップを前記所定時間ごとに繰り返すことを特徴とする。
【発明の効果】
【００５２】
本発明にかかる観察測光装置および観察測光方法によれば、標本内の発光領域を特定することができ、その特定領域から発せられる光を選択的に測光することができるとともに、標本から微弱光が発せられる場合にも高精度に測光することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５３】
以下、添付図面を参照して、本発明にかかる観察測光装置および観察測光方法の好適な実施の形態を詳細に説明する。この実施の形態では、本発明にかかる観察測光装置が、例えばルシフェラーゼ遺伝子を含んだ生細胞など、微弱光を発する発光体を含んだ標本を観察測光対象とするものとして説明する。なお、この実施の形態により本発明が限定されるものではない。また、図面の記載において、同一部分には同一符号を付して示している。
【００５４】
（実施の形態）
図１は、本実施の形態１にかかる観察測光装置１００の構成を示す図である。この図に示す観察測光装置１００は、大別して、標本Ｓを観察する観察系１と、後述する開口を照明し開口像を標本Ｓ上に作成し標本Ｓから発せられた光を測光する測光系２と、標本Ｓを保持および移動させる電動ステージ系３と、標本Ｓを照明する照明系４と、各部の動作制御および各種情報の処理制御等を行う制御系５と、観察測光装置１００の一部を遮蔽する遮蔽部６とを備える。
【００５５】
観察系１は、対物レンズ１１、結像レンズ１２および撮像装置１３を用いて構成されている。観察光学系としての対物レンズ１１および結像レンズ１２は、標本Ｓの観察像を撮像装置１３の撮像面１３ａ上に結像させる。ここで、対物レンズ１１は、無限遠補正された対物レンズであって、前側焦点位置で観察視野内に設けられた標本Ｓ上の各点からの光を受光して各々平行光束に変換する。このとき対物レンズ１１は、標本Ｓ側にテレセントリックとされる。また、対物レンズ１１は、標本Ｓからの光を高い開口数（ＮＡ）で受光する高ＮＡかつ高倍率の対物レンズであって、例えば倍率２０倍、ＮＡ０．８、焦点距離１０ｍｍである対物レンズが用いられる。
【００５６】
結像レンズ１２は、その前側焦点位置を対物レンズ１１の後側焦点位置と一致させて設けられ、対物レンズ１１が変換した平行光束を集光して撮像面１３ａ上にテレセントリックに結像する。これによって、この観察光学系は、両側にテレセントリックな結像光学系として構成される。また、結像レンズ１２は、観察光学系の総合結像倍率が例えば４倍となるように、上記に例示した対物レンズ１１に対して焦点距離４０ｍｍ、ＮＡ０．２のレンズ系が用いられる。なお、観察光学系の総合結像倍率は、４倍に限定して解釈する必要はなく、２倍以上、８倍以下とすることが好ましい。また、結像レンズ１２は、中間像を結像するリレーレンズ系を含んだ結像レンズ系としてもよい。
【００５７】
撮像装置１３は、撮像素子として例えば冷却ＣＣＤを用いた撮像装置であり、その撮像面１３ａを結像レンズ１２の焦点面上に配置して設けられる。撮像装置１３は、撮像面１３ａ上に結像される標本Ｓの観察像等を撮像して観察画像を生成し、画像信号として出力する。なお、撮像素子は、冷却ＣＣＤに限定されず、所望の感度有するものであればＣＭＯＳ等、他の撮像素子であってもよい。
【００５８】
対物レンズ１１および結像レンズ１２を用いて構成される観察光学系は、撮像面１３ａ上の各画素と同等または各画素より小さいエアリーディスク（Airy Disc）を形成するように、その結像特性が設定されている。すなわち、この観察光学系は、エアリーディスク径が撮像面１３ａ上の各画素における受光領域内に含まれるように、標本Ｓ上の各点からの光を撮像面１３ａ上に結像する。これによって観察系１では、通常の結像特性に基づく場合よりも各画素における受光量および起電流を増大させ、Ｓ／Ｎ比を向上させることができ、標本Ｓ上の各点から発せられる微弱光を高感度に検出して撮像することができる。
【００５９】
なお、対物レンズ１１には、この対物レンズ１１を観察光学系の観察光軸ＯＡ１方向に移動させ、標本Ｓとの相対距離を変化させる焦準機構１４が連接されており、これによって標本Ｓに対する観察光学系の焦点合わせを行うことができる。
【００６０】
測光系２は、対物レンズ１１、波長抽出フィルタユニット２１、結像レンズ２２、ピンホールユニット２３、ピンホール照明系２４、集光レンズ２５および光検出器２６を用いて構成されている。ここで、対物レンズ１１および結像レンズ２２を用いて構成される投影測光光学系の投影測光光路は、上述した観察光学系の観察光路に対し、光路切換ユニット２７によって合分岐されている。これによって投影測光光学系は、対物レンズ１１を観察光学系と共用し、ピンホールユニット２３に設けられたピンホール２３ａのピンホール像を標本Ｓ上に投影することができるとともに、標本Ｓから発せられた光をピンホール２３ａ上に集光することができる。言い換えると、この投影測光光学系は、ピンホール２３ａと標本Ｓとを光学的に共役関係とし、互いに一方の像を他方の上に結像させることができる。ここで、投影測光光学系における標本Ｓからピンホール２３ａへの総合倍率は、例えば観察光学系の総合結像倍率と等しく４倍とされる。ただし、これらの倍率は、必ずしも等しくさせる必要はなく、異ならせてもよい。また、ピンホール２３ａは、結像レンズ２２の後側焦点位置、つまり投影測光光学系の結像面（一次結像面）に配置されている。
【００６１】
観察光路に対して投影測光光路を合分岐する光路切換ユニット２７は、透過率および反射率の少なくとも一方が異なる複数の光分割プリズム２７ａと、この複数の光分割プリズム２７ａのうち１つを観察光路上に択一的に配置する選択配置機構２７ｂとを用いて構成されている。図２は、その光路切換ユニット２７の構成を示す図である。この図は、図１に示したII矢視方向に対応する矢視図であり、一部を断面図として示している。
【００６２】
図２に示すように、光路切換ユニット２７は、複数の光分割プリズム２７ａとして、透過率に比して反射率が高い光分割プリズム２７ａ−１と、透過率に比して反射率が低い光分割プリズム２７ａ−２と、透過率と反射率とが等しい光分割プリズム２７ａ−３とを有する。より具体的には、各光分割プリズム２７ａ−１〜２７ａ−３の分割比（＝透過率：反射率）は、例えば順に０：１００、１００：０および５０：５０とされる。ただし、ここに例示した分割比に限定して解釈する必要はない。例えば、光分割プリズム２７ａ−３における分割比は、透過率と反射率とを厳密に等しくする必要はなく、ピンホール照明光量やＣＣＤ感度等を考慮して定めればよい。
【００６３】
選択配置機構２７ｂは、光分割プリズム２７ａを保持するスライダ２７１と、このスライダ２７１をＹ軸方向（図２における左右方向）に移動させるスライダ駆動部２７２とを用いて構成されている。スライダ２７１は、Ｙ軸方向に貫通孔２７１−１〜２７１−３が設けられ、この各貫通孔２７１−１〜２７１−３内に各々光分割プリズム２７ａ−１〜２７ａ−３を嵌設して保持している。スライダ駆動部２７２は、スライダ２７１をＹ軸方向に所定量ごと移動させ、光分割プリズム２７ａ−１〜２７ａ−３のいずれかを観察光路上の観察光軸ＯＡ１上に択一的に配置する。
【００６４】
ここで、分割比が０：１００の光分割プリズム２７ａ−１が配置された場合、標本Ｓから発せられた光はすべて反射され、結像レンズ２２によって結像される。一方、分割比が１００：０の光分割プリズム２７ａ−２が配置された場合、標本Ｓからの光はすべて透過され、結像レンズ１２によって撮像面１３ａ上に結像される。また、分割比が５０：５０の光分割プリズム２７ａ−３が配置された場合、後述するように照明されるピンホール２３ａからの光は、標本Ｓ上に投影され、標本Ｓ上で反射した後、その半分が光分割プリズム２７ａ−３を透過し、結像レンズ１２によって撮像面１３ａ上に結像される。
【００６５】
なお、選択配置機構２７ｂは、スライダ２７１に替えてターレットを備え、このターレット上に複数の光分割プリズム２７ａを保持して回動させることで、複数の光分割プリズム２７ａのうち１つを観察光路上に択一的に配置する機構としてもよい。また、選択配置機構２７ｂは、３つに限定されず、さらに多くの光分割プリズム２７ａを保持し、観察光路上に択一的に配置させることもできる。
【００６６】
ピンホールユニット２３は、図１に示すように、ピンホール２３ａおよび切欠２３ｄ（図３参照）が形成されたピンホール板２３ｂと、このピンホール板２３ｂを回動および移動させるピンホール駆動部２３ｃとを用いて構成されている。ピンホール板２３ｂは、大きさおよび形状の少なくとも一方が異なる複数の開口がピンホール２３ａとして形成された円盤状部材である。複数のピンホール２３ａは、ピンホール板２３ｂの外縁部で周方向に配列して設けられている。図３は、そのピンホール板２３ｂに設けられた複数のピンホール２３ａを例示する正面図であり、図１に示したIII矢視方向に対応する矢視図である。この図に示すようにピンホール板２３ｂは、複数のピンホール２３ａが透孔として形成され、さらにこの透孔群に連設して切欠２３ｄが形成されている。すなわち、大きさが異なる５つの円孔２３ａと、大きさが異なる４つの正方孔２３ａと、外縁部の一部を周方向に沿って切り欠いた切欠２３ｄとを有する。なお、ピンホール２３ａは、円形および正方形に限らず、楕円形、矩形、その他の多角形等、任意の形状にすることができ、その形状の向きおよび大きさも任意に設定することができる。
【００６７】
ピンホール駆動部２３ｃは、ピンホール板２３ｂをその周方向に回動自在に保持する。具体的には、ピンホール駆動部２３ｃは、ピンホール板２３ｂの中心部を保持し、その中心軸ＰＡ回りに回動させる。これによって各ピンホール２３ａおよび切欠２３ｄは、所定の円周ＣＲ上で自在に配置変更される（図３参照）。また、ピンホール板２３ｂは、図１に示すように、中心軸ＰＡを投影測光光学系の投影測光光軸ＯＡ２と平行にして配置されるとともに、初期状態として円周ＣＲが投影測光光軸ＯＡ２と交差するように配置される。ピンホール駆動部２３ｃは、ピンホール板２３ｂを回動させ、複数のピンホール２３ａのうち１つを投影測光光軸ＯＡ２上で投影測光光路内に択一的に配置する。
【００６８】
また、ピンホール駆動部２３ｃは、ピンホール板２３ｂを投影測光光軸ＯＡ２に垂直な面内（図１におけるＹ−Ｚ面内）で２次元的に移動させる。これによってピンホール駆動部２３ｃは、投影測光光路内に配置されたピンホール２３ａを投影測光光学系の結像面に沿って移動させ、投影測光光学系によって投影されるピンホール２３ａのピンホール像を標本Ｓ上で移動させる。ここで、ピンホール駆動部２３ｃは、ピンホール像を観察光学系の観察視野内で自在に移動可能な移動ストロークを有しており、例えば、対物レンズ１１が倍率２０倍で視野φ１．２ｍｍとし、投影測光光学系における標本Ｓからピンホール２３ａへの総合倍率を４倍とすると、移動可能範囲はφ４．８ｍｍとすればよい。なお、投影測光光軸ＯＡ２に垂直な面内とは、厳密に垂直である必要はなく略垂直である場合を含むものである。
【００６９】
さらに、ピンホール駆動部２３ｃは、例えばエンコーダを用い、回動および２次元移動させたピンホール板２３ｂの回動位置および移動位置を検出し、この検出結果をもとに、投影測光光路内に配置したピンホール２３ａの、投影測光光軸ＯＡ２に対する位置を示すピンホール位置とピンホール開口径とを特定する。投影測光光学系の総合倍率が既知であることから、このピンホール位置に対応して標本Ｓ上でのピンホール像位置も決定されることになる。また、ピンホール駆動部２３ｃは、ピンホール位置が指定された場合、そのピンホール位置に基づいて、ピンホール２３ａを投影測光光路内に配置することもできる。
【００７０】
ピンホール照明系２４は、ハロゲンランプ等を用いたランプ光源２４ａ、拡散板２４ｂ、コンデンサレンズ２４ｃおよび低反射ミラー２４ｄを用いて構成されている。照明光導入手段としての低反射ミラー２４ｄは、ピンホール板２３ｂと集光レンズ２５との間の測光光路上に配置されており、ランプ光源２４ａが発して拡散板２４ｂおよびコンデンサレンズ２４ｃを介したピンホール照明光を所定の反射率で反射させ、測光手段としての集光レンズ２５および光検出器２６における測光光路内に導入し、ピンホール２３ａに照射する。また、低反射ミラー２４ｄは、標本Ｓから発せられて投影測光光学系を介すとともにピンホール２３ａを通過した光を所定の透過率で透過させる。
【００７１】
低反射ミラー２４ｄの反射率および透過率は、光検出器２６による測光、とりわけ微弱光の測光に影響を与えない範囲に設定されるとともに、後述するピンホール２３ａのピンホール像の観察に支障をきたさない範囲内で設定される。具体的には、透過率に比して反射率が低く設定され、例えば反射率は１〜２％程度、透過率は９８〜９９％程度とされる。この理由は、撮像装置１３（例えばＣＣＤカメラ）の感度が高いため、標本Ｓ上でのピンホール像は暗くてもよく、一方光検出器２６には多くの光を透過させることにある。
【００７２】
なお、ランプ光源２４ａが発したピンホール照明光は、拡散板２４ｂによって拡散された後、コンデンサレンズ２４ｃによって、投影測光光路内に配置されたピンホール２３ａに導かれる。投影測光光学系は、このようにしてピンホール２３ａのピンホール像を標本Ｓ上に投影する。
【００７３】
集光レンズ２５は、標本Ｓから発せられてピンホール２３ａを通過した光を、低反射ミラー２４ｄを介して受光し、光検出器２６の受光エリア内に集光させる。光検出器２６は、この集光された光を検出して光電変換し、検出光量に応じた測光信号を出力する。この光検出器２６は、光検出素子として微弱光を高感度および高精度に検出可能な微弱光検出素子を用いた光検出器であって、その微弱光検出素子には、例えば光電子増倍管またはアバランシェフォトダイオードが用いられる。なお、これら集光レンズ２５および光検出器２６と、ピンホール照明系２４と、ピンホールユニット２３とは、一体保持機構２８によって一体に保持され、ユニット化されている。
【００７４】
ここで、光検出器２６が検出する標本Ｓからの光は、波長抽出フィルタユニット２１によって所定波長域の光に制限される。波長抽出フィルタユニット２１は、異なる波長域の光を抽出する複数の波長抽出フィルタ２１ａと、この複数の波長抽出フィルタ２１ａの少なくとも１つを、非配置を含めて選択的に測光光路としての投影測光光路内に配置する選択配置機構２１ｂとを備えており、投影測光光路内に配置した波長抽出フィルタ２１ａによって、標本Ｓから発せられた光の中から特定の波長域の光を選択的に透過させて抽出する。これによって光検出器２６は、標本Ｓから発せられた光のうち、波長抽出フィルタ２１ａを透過した特定の波長域の光を検出して測光する。
【００７５】
図４は、波長抽出フィルタユニット２１の構成を示す図である。この図は、図１に示したIV矢視方向に対応する矢視図であり、一部を断面図として示している。図４に示すように、波長抽出フィルタユニット２１は、複数の波長抽出フィルタ２１ａとして、例えば６５０ｎｍ以上の長波長域の光を透過させるロングウェーブパスフィルタとしての波長抽出フィルタ２１ａ−１と、５５０ｎｍ以下の短波長域の光を透過させるショートウェーブパスフィルタとしての波長抽出フィルタ２１ａ−２とを有する。
【００７６】
選択配置機構２１ｂは、波長抽出フィルタ２１ａを保持するスライダ２１１と、このスライダ２１１をＹ軸方向（図４における上下方向）に移動させるスライダ駆動部２１２とを用いて構成されている。スライダ２１１は、Ｙ軸に沿って貫通孔２１１−１〜２１１−３が設けられ、貫通孔２１１−１，２１１−２内に各々波長抽出フィルタ２１ａ−１，２１ａ−２を嵌設して保持している。スライダ駆動部２１２は、スライダ２１１をＹ軸方向に所定量ごと移動させ、波長抽出フィルタ２１ａ−１，２１ａ−２および空穴としての貫通孔２１１−３のいずれかを投影測光光路内の投影測光光軸ＯＡ２上に択一的に配置する。
【００７７】
ここで、光検出器２６は、波長抽出フィルタ２１ａ−１が配置された場合、標本Ｓから発せられた光のうち波長６５０ｎｍ以上の赤色系統の光を検出し、波長抽出フィルタ２１ａ−２が配置された場合、波長５５０ｎｍ以下の緑色系統の光を検出する。また、空穴としての貫通孔２１１−３が配置された場合には、波長域を制限することなく、標本Ｓから発せられた光を検出する。
【００７８】
なお、選択配置機構２１ｂは、スライダ２１１に替えてターレットを備え、このターレット上に複数の波長抽出フィルタ２１ａを保持して回動させることで、複数の波長抽出フィルタ２１ａの少なくとも１つまたは空穴を投影測光光路内に択一的に配置する機構としてもよい。また、選択配置機構２１ｂは、２つに限定されず、さらに多くの波長抽出フィルタ２１ａを備えることもでき、１つの貫通孔内に２つ以上の波長抽出フィルタ２１ａを嵌設することもできる。これによって、１つの波長抽出フィルタでは抽出し得ない波長域の光を抽出することができる。また、波長抽出フィルタユニット２１は、投影測光光路内に限定されず、ピンホール板２３ｂから光検出器２６に至る測光光路内に配置させてもよい。
【００７９】
電動ステージ系３は、図１に示すように、シャーレ等の容器３１を介して標本Ｓを保持するステージ部３２と、このステージ部３２を観察光学系の観察光軸ＯＡ１に垂直な面内（図１におけるＸ−Ｙ面内）で２次元的に移動させるステージ駆動部３３とを用いて構成されている。ステージ駆動部３３は、ステージ部３２を移動させることで、観察光学系の観察光軸ＯＡ１および観察視野に対して標本Ｓを移動させるとともに、投影測光光学系によって投影されるピンホール２３ａのピンホール像に対して標本Ｓを移動させる。ここで、ステージ駆動部３３は、標本Ｓの全領域を観察視野内に適宜移動させることができる移動ストロークを有している。なお、観察光軸ＯＡ１に垂直な面内とは、厳密に垂直である必要はなく略垂直である場合を含むものである。なお、ステージのみの駆動の場合は、開口像は観察光学系の光軸上に固定されている。
【００８０】
また、ステージ駆動部３３は、ステッピングモータやエンコーダ等を用い、２次元移動させた標本Ｓの、観察光軸ＯＡ１に対する位置を示す標本位置を特定する。さらに、ステージ駆動部３３は、標本位置が指定された場合、その標本位置に基づいて、標本Ｓを観察視野内に配置することもできる。なお、標本Ｓはステージ部３２上に固定して保持され、ステージ部３２に対する標本Ｓの位置関係は、あらかじめ測定されてキャリブレーションされる。
【００８１】
照明系４は、白色光等の標本照明光を発する光源装置４１と、この標本照明光を一端から受光して他端から射出するファイバーライトガイド４２とを用いて構成されている。照明系４は、ファイバーライトガイド４２が射出する標本照明光を標本Ｓに対して対物レンズ１１と反対側（図１における上側）から照射することで、標本Ｓに対して明視野照明としての透過照明を行う。
【００８２】
制御系５は、例えばパーソナルコンピュータ（ＰＣ）によって実現され、各部の作動を指示する指示情報等を制御系５に対して入力する入力部５１と、画像情報や文字情報等を表示する表示部５２と、観察画像や測光データ等を記憶する記憶部５３と、各部における処理および動作を制御する制御部５４とを備える。制御部５４は、入力部５１、表示部５２および記憶部５３と、観察系１、測光系２、電動ステージ系３および照明系４が備える各稼働部とに電気的に接続されている。
【００８３】
制御部５４は、機能別に観察測光制御部５４ａ、記憶制御部５４ｂ、表示制御部５４ｃ、切換制御部５４ｄ、照明制御部５４ｅ、移動制御部５４ｆおよび焦準制御部５４ｇを備える。観察測光制御部５４ａは、観察系１による観察および測光系２による測光に関わる各稼働部の動作を制御する。具体的には、観察測光制御部５４ａは、例えば、標本Ｓの観察像を撮像装置１３によって撮像する撮像処理、標本Ｓから発せられた光を光検出器２６によって測光する測光処理の制御を行う。また、あらかじめ設定された各種測光条件に基づいて所定期間ごとに測光を繰り返す繰り返し測光（以下、タイムラプス測光と呼ぶ。）を行う場合に各稼働部の設定および切換等を行う制御をする。
【００８４】
記憶制御部５４ｂは、観察系１によって生成された観察画像、測光系２によって測光された測光データ、各観察画像および各測光データに対応する各種設定条件等を記憶部５３に記憶させる制御を行う。また、タイムラプス測光を行うために設定されるタイムラプス測光条件を記憶部５３に記憶させる制御を行う。
【００８５】
表示制御部５４ｃは、観察画像や測光データ等を画像情報あるいは文字情報として表示部５２に表示させる制御を行う。その際、表示制御部５４ｃは、各種画像情報および文字情報を適宜対応付けて表示部５２に表示させる。これによって表示制御部５４ｃは、例えば、観察画像と、この観察画像に対応する測光データとを対応付けて表示させたり、照明系４によって照明された標本Ｓを撮影した観察画像と、自家発光した標本Ｓを撮影した観察画像とを重ね合わせて表示させるなどの表示処理を表示部５２に行わせることができる。また、表示制御部５４ｃは、撮像装置１３が撮像して生成する画像をライブ映像（リアルタイム表示画像）として表示部５２に表示させることもできる。
【００８６】
切換制御部５４ｄ、照明制御部５４ｅ、移動制御部５４ｆおよび焦準制御部５４ｇは、それぞれ入力部５１から入力される所定の指示情報に対応した制御を行う。具体的には、切換制御部５４ｄは、指示情報に応じてピンホール２３ａ、波長抽出フィルタ２１ａおよび光分割プリズム２７ａを個別に切り換える制御をする。照明制御部５４ｅは、指示情報に応じてランプ光源２４ａ、光源装置４１を個別に点灯および消灯制御し、ピンホール照明系２４および照明系４による各照明の開始および停止制御をする。移動制御部５４ｆは、指示情報に応じてピンホール２３ａおよび標本Ｓの少なくとも一方を個別に２次元移動させる制御をする。すなわち、移動制御手段５４ｆは、指示情報に応じてピンホール板２３ｂをＹ−Ｚ移動させる制御および／もしくはステージ部３２をＸ−Ｙ移動させる制御を個別に行う。焦準制御部５４ｇは、指示情報に応じて対物レンズ１１を焦準移動させ、標本Ｓに対する観察光学系の焦点合わせを行う制御をする。これらの制御によって、利用者は、各種観察条件および測光条件の切り換え、照明の開始および停止、標本Ｓ上の観察位置および測光位置の変更、観察画像のピント合わせ等を適宜行うことができる。
【００８７】
遮蔽部６は、照明系４の一部と制御系５とを除き観察測光装置１００を内部に収容し、観察測光装置１００に対して外部から照射される光を遮断する。これによって、遮蔽部６は暗室を形成し、この暗室内で観察測光装置１００に安定かつ高精度に微弱光の測光および観察を実施させることができる。なお、遮蔽部６は、観察測光装置１００の全部を内部に収容して遮光するようにしてもよい。この場合、利用者等が内部に入れるスペースを有することが好ましい。
【００８８】
以上のように構成された観察測光装置１００では、ピンホール照明系２４からのピンホール照明光は、ピンホール２３ａに照射され、これを通過した後、投影測光光学系としての結像レンズ２２および対物レンズ１１によって標本Ｓに照射される。これによって標本Ｓ上には、ピンホール２３ａの開口形状に応じた明るいスポット像がピンホール像として結像される。さらにピンホール照明光は、標本Ｓによって反射され、観察光学系としての対物レンズ１１および結像レンズ１２によって撮像面１３ａ上に照射される。これによって撮像面１３ａ上には、ピンホール像の共役像である２次ピンホール像と、ピンホール像内で照明された標本Ｓの観察像とが結像され、この結像された各像が撮像装置１３によって撮像される。このとき、波長抽出フィルタユニット２１では、空穴もしくは波長抽出フィルタ２１ａが投影測光光路内に適宜配置され、光路切換ユニット２７では、分割比が５０：５０である光分割プリズム２７ａ−３が観察光路上に配置される。
【００８９】
一方、測光対象としてピンホール像内の標本Ｓから発せられた光は、投影測光光学系によってピンホール２３ａ上に集光され、ピンホール２３ａを通過した後、集光レンズ２５によって光検出器２６の受光エリア内に集光される。このとき、ピンホール像外の標本Ｓから発せられた光は、投影測光光学系によってピンホール２３ａ外のピンホール板２３ｂ上に集光されて遮光される。これによって、光検出器２６にはピンホール像内の標本Ｓから発せられた光のみ集光され、この集光された光のみが測光される。この場合、光路切換ユニット２７では、分割比が０：１００である光分割プリズム２７ａ−１が観察光路上に配置され、標本Ｓからの光は、すべて結像レンズ２２に向けて反射されてピンホール２３ａ上に光量損失なく集光される。また、波長抽出フィルタユニット２１では、測光対象とする波長域の光を抽出できる波長抽出フィルタ２１ａもしくは空穴が投影測光光路内に適宜配置される。
【００９０】
また、明視野観察のためファイバーライトガイド４２から標本Ｓに照射された標本照明光は、標本Ｓを透過し、観察光学系によって撮像面１３ａ上に照射される。これによって、撮像面１３ａ上には標本Ｓの明視野観察像が結像され、この明視野観察像が撮像装置１３によって撮像される。このとき、光路切換ユニット２７では、分割比が１００：０である光分割プリズム２７ａ−２が観察光路上に配置され、標本Ｓからの光はすべて撮像面１３ａ上に結像される。また、明視野観察のためのファイバーライトガイド４２からの照明をオフして標本Ｓの発光状態を観察する場合も同様な分割比で行う。
【００９１】
つぎに、観察測光装置１００によってタイムラプス測光を行う処理手順について説明する。図５は、タイムラプス測光処理手順を示すフローチャートである。また、図６−１〜図６−４は、タイムラプス測光処理手順における処理工程に応じて観察される観察像を説明する図である。なお、ここでは標本Ｓが、発光体として微弱光を発する複数の細胞を含み、このうちいくつかの細胞を測光対象細胞としてタイムラプス測光を行う処理手順を説明する。
【００９２】
はじめに測光準備工程として、標本Ｓの中から測光対象細胞等を選択して記録する処理を行う。すなわち、まず光源装置４１を点灯し、標本Ｓに対して透過照明を行い、撮像装置１３によって標本Ｓの観察像を撮像して、図６−１に示すような明視野観察像をライブ画像として取得する（ステップＳ１０１）。この明視野観察像は、表示制御部５４ｃによって表示部５２にリアルタイム表示され、これによって利用者等は、標本Ｓの現在の状態を観察できる。なお、このステップＳ１０１では、光路切換ユニット２７によって、分割比が５０：５０である光分割プリズム２７ａ−３が観察光路上に配置される。
【００９３】
つづいて、リアルタイム表示された明視野観察像をもとに、標本Ｓの中から測光対象細胞を選択し、この選択した測光対象細胞を特定する細胞位置を記憶部５３に記憶させる（ステップＳ１０２）。このステップＳ１０２では、透過照明に加え、ランプ光源２４ａを点灯してピンホール照明を行い、標本Ｓ上に明るいピンホール像を投影する。そして、ピンホール駆動部２３ｃおよびステージ駆動部３３によってピンホール２３ａおよび標本Ｓを適宜移動させ、図６−２に示すように、所望の測光対象細胞上にピンホール像ＰＩを重ね合わせる。この状態でピンホール位置および標本位置を検出し、各検出結果を測光対象細胞の細胞位置として記録する。この細胞位置の記録は、例えば利用者等が記録を指示する指示情報を入力部５１から入力し、入力された指示情報に応じて記憶制御部５４ｂがピンホール駆動部２３ｃおよびステージ駆動部３３から各々ピンホール位置および標本位置を取得して記憶部５３に記憶させることで行われる。
【００９４】
なお、ここではピンホール２３ａおよび標本Ｓを両方移動させて測光対象細胞とピンホール像とを重ね合わせるものとしたが、どちらか一方を所定位置に固定し、他方のみ移動させて重ね合わせることもできる。例えば、ピンホール２３ａを投影測光光軸上に固定配置してピンホール像を観察光軸ＯＡ１上に投影させ、ステージ駆動部３３によって所望の測光対象細胞を観察光軸ＯＡ１上に移動させることで重ね合わせをすることができる。この場合、標本位置によって細胞位置が特定可能であるため、標本位置のみを細胞位置として記憶部５３に記憶させるようにしてもよい。また、例えば、標本Ｓを観察光軸ＯＡ１に対して固定配置し、観察視野内でピンホール像を適宜移動させることで重ね合わせをすることもできる。この場合には、ピンホール位置によって細胞位置が特定可能であるため、ピンホール位置のみを細胞位置として記憶部５３に記憶させてもよい。この場合の細胞の測光エリアは、対物レンズ１１の視野内に限定される。
【００９５】
また、ステップＳ１０２では、透過照明とピンホール照明とを同時に行うものとして説明したが、測光対象細胞を観測しやすいように一方の照明を適宜消灯させてもよい。各照明の点灯および消灯は、利用者等が各照明の開始および停止を指示する所定の指示情報を入力部５１から入力し、この指示情報に応じて照明制御部５４ｅが光源装置４１およびランプ光源２４ａの点灯および消灯制御をすることで行われる。
【００９６】
さらに、ステップＳ１０２では、選択した測光対象細胞を識別する細胞識別情報としての細胞ＩＤを細胞位置に対応付けて記憶部５３に記憶させることができる。この細胞ＩＤは、例えば利用者等が任意に設定して入力部５１から入力し、記憶制御部５４ｂが記憶部５３に記憶させることで行われる。あるいは、記憶制御部５４ｂが細胞位置を記憶させるごとに、所定の一連の細胞ＩＤを順次対応付けて記憶させるようにすることもできる。
【００９７】
つぎに、ステップＳ１０２で選択した測光対象細胞に応じて、この測光対象細胞から発せられる光のみを選択的に測光できるようにピンホール２３ａを設定し、この設定したピンホール２３ａの大きさおよび形状を特定するピンホール情報を細胞位置に対応付けて記憶部５３に記憶させる（ステップＳ１０３）。具体的には、このステップＳ１０３では、ピンホール駆動部２３ｃによってピンホール板２３ｂを回動させ、測光対象細胞に適した大きさおよび形状を有するピンホール２３ａを選択し、選択したピンホール２３ａを識別するピンホールＩＤをピンホール情報として記録する。なお、選択するピンホール２３ａの大きさは、測光対象細胞よりも若干大きくすることが好ましい。また、ステップＳ１０３では、透過照明を適宜消灯してピンホール像を確認するとよい。透過照明を消灯させることで、図６−３に示すように、ピンホール像ＰＩと、このピンホール像ＰＩ内の測光対象細胞とが鮮明に観察可能となって、測光対象細胞に適したピンホール２３ａを確認しやすくなる。
【００９８】
つづいて、ステップＳ１０２で選択した測光対象細胞に応じて、この測光対象細胞から発せられる光のうち測光すべき波長域の光を抽出するための波長抽出フィルタ２１ａを設定し、この設定した波長抽出フィルタ２１ａを特定するフィルタ情報を細胞位置に対応付けて記憶部５３に記憶させる（ステップＳ１０４）。このステップＳ１０４では、あらかじめ波長抽出フィルタユニット２１のスライダ２１１にセットされた複数の波長抽出フィルタ２１ａの中から、測光波長域に対応する抽出波長域を有した波長抽出フィルタ２１ａを選択し、選択した波長抽出フィルタ２１ａを識別するフィルタＩＤをフィルタ情報として記録する。
【００９９】
その後、所望の測光対象細胞をすべて選択したか否かを判断し（ステップＳ１０５）、すべてを選択していない場合（ステップＳ１０５：Ｎｏ）、ステップＳ１０２からの処理手順を繰り返して測光対象細胞を順次選択する。所望の測光対象細胞をすべて選択した場合には（ステップＳ１０５：Ｙｅｓ）、以上の測光準備工程を終了し、以降のタイムラプス測光工程に移行する。
【０１００】
なお、測光準備工程を終了した段階で、記憶部５３には、図７に示すように、選択した測光対象細胞ごとに細胞ＩＤ、細胞位置、ピンホールＩＤおよびフィルタＩＤが互いに対応付けられたタイムラプス測光条件が記憶されている。以降のタイムラプス測光工程では、このタイムラプス測光条件をもとに、各測光対象細胞から発せられる光が順次測光され、その一連の測光が所定期間ごとに繰り返されるとともに、各測光結果が各測光対照細胞に逐次対応付けられ、タイムラプス測光データとして記録される。
【０１０１】
つぎに、そのタイムラプス測光工程の処理手順について説明する。タイムラプス測光を開始する所定の指示情報が入力部５１から入力されることで、まず観察測光制御部５４ａは、タイムラプス測光条件に記録された測光対象細胞をステージ部３２を移動させながら順次測光し、各測光結果を各測光対象細胞の細胞ＩＤ、つまり測光時点の細胞位置に対応付けて記録する（ステップＳ１０６）。このステップＳ１０６では、観察測光制御部５４ａは、ランプ光源２４ａおよび光源装置４１を消灯し、ピンホール照明および透過照明も停止させるとともに、光路切換ユニット２７によって、分割比が０：１００である光分割プリズム２７ａ−１を観察光路上に配置する。また、観察測光制御部５４ａは、測光対象細胞ごとに、その細胞位置に対応付けられたピンホールＩＤおよびフィルタＩＤが示すピンホール２３ａおよび波長抽出フィルタ２１ａを、それぞれピンホールユニット２３および波長抽出フィルタユニット２１によって順次設定する。
【０１０２】
タイムラプス測光条件に記録された各測光対象細胞を一通り測光し終わった後、観察測光制御部５４ａは、観察視野全体の測光、つまり観察視野内に位置する標本Ｓ全体から発せられる光の測光を行い、この測光結果をタイムラプス測光データに記録する（ステップＳ１０７）。このステップＳ１０７では、観察測光制御部５４ａは、ピンホールユニット２３によって、観察視野全体に対応する切欠２３ｄを投影測光光軸ＯＡ２上に配置する。これは、ピンホール板２３ｂを開放することに相当する。
【０１０３】
つづいて、観察測光制御部５４ａは、標本Ｓが発した光をもとに撮像装置１３によって標本像を撮像して発光観察画像を取得し、この取得した発光観察画像を記録する（ステップＳ１０８）。このとき観察測光制御部５４ａは、光路切換ユニット２７によって、分割比が１００：０である光分割プリズム２７ａ−２を観察光路上に配置する。また、観察測光制御部５４ａは、直前のステップＳ１０６，Ｓ１０７で取得した測光結果に対応付けて発光観察画像を記憶部５３に記憶させる。つまり、観察測光制御部５４ａは、各測光対象細胞を一通り測光する測光サイクルごとに発光観察画像を取得するとともに、取得した発光観察画像をその測光サイクルで検出した測光データに対応付けて記録する。なお、このステップＳ１０８では、発光観察画像として、例えば図６−４に示すように暗い背景中で発光した細胞の観察像である発光観察像が撮像される。
【０１０４】
その後、観察測光制御部５４ａは、各測光対象細胞の測光つまり測光サイクルを所定回数繰り返したか否かを判断し（ステップＳ１０９）、所定回数繰り返していない場合（ステップＳ１０９：Ｎｏ）、インターバルの時間として所定時間待機し（ステップＳ１１０）、ステップＳ１０６からの処理を繰り返す。一方、所定回数繰り返した場合には（ステップＳ１０９：Ｙｅｓ）、観察測光制御部５４ａは、一連のタイムラプス測光を終了する。なお、タイムラプス測光終了後、タイムラプス測光データは、制御部５４によって適宜解析処理され、表示制御部５４ｃによって表示部５２に適宜表示される。
【０１０５】
ここで、上述した測光準備工程およびタイムラプス測光工程における各部の設定状態を図８にまとめて示す。この図の測光準備工程における工程「Ａ１」〜「Ａ４」は、それぞれ図５に示したステップＳ１０１〜Ｓ１０４に対応し、タイムラプス測光工程における工程「Ｂ１」〜「Ｂ３」は、それぞれステップＳ１０６〜Ｓ１０８に対応する。また、図８中の「↑」は、直前の工程の設定内容に等しいことを示している。
【０１０６】
なお、上述した測光準備工程では、利用者等が明視野観察像のライブ画像をもとに測光対象細胞の選択を行うものとして説明したが、明視野観察像を撮像した観察画像を画像処理することによって測光対象細胞を選定するようにしてもよい。また、選定した測光対象細胞に対して適切なピンホール２３ａを画像処理によって設定するようにしてもよい。
【０１０７】
以上説明したように、本実施の形態にかかる観察測光装置１００は、ピンホール２３ａが形成されたピンホール板２３ｂを有し、このピンホール板２３ｂによって光の通過領域を制限するピンホールユニット２３と、ピンホール２３ａを照明するピンホール照明系２４と、ピンホール照明系２４によって照明されたピンホール２３ａのピンホール像を標本Ｓ上に投影する投影測光光学系と、標本Ｓの観察像とともにピンホール像の２次ピンホール像を結像する観察光学系と、投影測光光学系およびピンホール２３ａを介し、ピンホール像内の標本Ｓから発せられた光を測光する光検出器２６と、を備えている。このため、観察測光装置１００では、標本Ｓ内の発光領域を特定することができ、その特定領域から発せられる光を選択的に測光することができる。また、光検出器２６が微弱光を高感度および高精度に検出可能な微弱光検出素子を用いた光検出器であるため、標本Ｓから微弱光が発せられる場合にも高精度に測光をすることができる。
【０１０８】
ここまで、本発明を実施する最良の形態を実施の形態として説明したが、本発明は、上述した実施の形態に限定されず、本発明の趣旨を逸脱しない範囲であれば、種々の変形が可能である。
【０１０９】
例えば、上述した実施の形態では、標本Ｓが自家発光する発光体を含み、この発光体から発せられる光を測光および観察するものとして説明したが、標本Ｓが蛍光体を含む場合には、励起光照射に応じてその蛍光体から発せられる蛍光を測光および観察することもできる。この場合、観察測光装置１００は、例えば図９に示すように、励起光照射のための落射蛍光装置７を備えるとよい。
【０１１０】
落射蛍光装置７は、励起光源７１、励起光投光管７２および蛍光キューブ７３を用いて構成されている。励起光源７１は、水銀ランプ、キセノンランプ、レーザ等が用いられ、標本Ｓが有する蛍光体に応じた所定の励起光を発する。励起光投光管７２は、集光レンズ７２ａ、明るさ絞り作りレンズ７２ｂ、明るさ絞りＡＳ、視野絞りＦＳおよび投光レンズ７２ｃをこの順に配置して備える。蛍光キューブ７３は、標本Ｓを励起する励起光を選択的に透過させる励起フィルタ７３ａと、標本Ｓから発せられた蛍光を選択的に透過させる吸収フィルタ７３ｂと、励起光を反射させて蛍光を透過させるダイクロイックミラー７３ｃとを一体に備える。ここで、励起フィルタ７３ａは、励起光源７１から発せられる光の中から所定の励起光を抽出するバンドパスフィルタであり、吸収フィルタ７３ｂは、標本Ｓから発せられる蛍光に応じた所定のカットオフ波長を有するロングウェーブパスフィルタである。
【０１１１】
落射蛍光装置７は、対物レンズ１１と光路切換ユニット２７との間の観察光軸ＯＡ１上に蛍光キューブ７３が設けられ、励起光源７１が発した励起光を、励起光投光管７２を介してダイクロイックミラー７３ｃで反射させ、対物レンズ１１を介して標本Ｓ上に照射させる。励起光源７１の点灯および消灯、つまり落射蛍光装置７による励起光照明の開始および停止は、入力部５１から入力される所定の照明指示情報をもとに、照明制御部５４ｅによって制御される。なお、落射蛍光装置７では、蛍光キューブ７３として、励起光および蛍光の少なくとも一方に対する光学特性が異なる複数の蛍光キューブを備え、そのうち１つを、非配置も含めて選択的に観察光軸ＯＡ１上に挿脱配置させることもできる。
【０１１２】
また、上述した実施の形態では、光路切換ユニット２７を対物レンズ１１と結像レンズ１２との間の観察光路上に設けるものとしたが、結像レンズ１２と撮像装置１３との間の観察光路上に設けることもできる。この場合、対物レンズ１１に加えて結像レンズ１２を観察光学系と投影測光光学系とで共用することとなる。また、光路切換ユニット２７では、透過光路上に観察光学系を構成し、反射光路上に投影測光光学系を構成したが、かかる構成関係を入れ換えてもよい。つまり、透過光路上に投影測光光学系を構成し、反射光路上に観察光学系を構成することもできる。ただし、その場合には、上述した光分割プリズム２７ａ−１と２７ａ−２との作用関係も入れ換えて解釈する必要がある。さらに、光路切換ユニット２７では、キューブ状の光分割プリズム２７ａを用いるものとしたが、板状の光分割素子あるいは反射ミラーを用いることもできる。
【０１１３】
また、上述した実施の形態では、円盤状のピンホール板２３ｂにピンホール２３ａを形成し、ピンホール板２３ｂをピンホール駆動部２３ｃによって回動することでピンホール２３ａを投影測光光路内に配置するものとしたが、ピンホール駆動部２３ｃによってピンホール板２３ｂをその板面方向に２次元移動させることでピンホール２３ａを投影測光光路内に配置させることもできる。この場合、ピンホール駆動部２３ｃは、ピンホール像を観察光学系の観察視野内で自在に移動可能な移動ストロークに加えて、ピンホール板２３ｂ上のすべてのピンホール２３ａを投影測光光路内に配置可能な移動ストロークを有するものとする。また、ピンホール駆動部２３ｃは、投影測光光軸ＯＡ２に対してピンホール板２３ｂを２次元移動させるものとしたが、一体保持機構２８の全体、つまりピンホールユニット２３、ピンホール照明系２４、集光レンズ２５および光検出器２６を一体に投影測光光軸ＯＡ２に対して２次元移動させるようにしてもよい。
【０１１４】
また、上述した実施の形態では、ピンホール照明系２４では、低反射ミラー２４ｄを測光光路上に固定配置して設けるものとしたが、挿脱自在に配置させることもできる。この場合、ピンホール像を標本Ｓ上に投影するときに低反射ミラー２４ｄを測光光路内に挿入配置し、標本Ｓから発せられる光を測光するときに低反射ミラー２４ｄを測光光路上から取り除くとよい。これによって、低反射ミラー２４ｄによる反射損失をなくすことができ、標本Ｓから発せられる微弱光の測光を一層高感度に行うことができる。また、このように挿脱配置を行う場合には、低反射ミラー２４ｄに替えて全反射ミラーもしくは所定反射率のミラーを用いることができる。その反射率は、撮像装置１３によって撮像される２次ピンホール像の明るさ等に応じて適宜設定するとよい。さらに、ピンホール照明系２４では、ピンホール照明光を発する光源としてランプ光源２４ａを配置するものとしたが、ファイバーライトガイド等を用いてピンホール照明光を導入するようにしてもよい。この場合、拡散板２４ｂは適宜取り除くことができる。
【０１１５】
また、上述した実施の形態では、焦準機構１４は、対物レンズ１１を標本Ｓに対して移動させて焦点合わせをするものとしたが、ステージ部３２とともに標本ＳをＺ軸方向に移動させて焦点合わせを行うようにしてもよい。あるいは、対物レンズ１１とステージ部３２とをそれぞれ移動させて焦点合わせを行うようにしてもよい。
【０１１６】
また、上述した実施の形態では、標本Ｓに対する明視野照明系として、透過照明系である照明系４を備えるものとしたが、落射照明系を備えるようにしてもよい。さらに、ここまで観察測光装置１００が倒立型であるものとして説明したが、正立型とすることもできる。また、ここまで観察光路と測光光路とを標本Ｓに対して同じ側に設け、観察光路と測光光路とを光路切換ユニット２７によって合分岐するものとして説明したが、観察光路と測光光路とを標本Ｓに対して互いに反対側に設けることもできる。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】本発明の実施の形態にかかる観察測光装置の構成を示す図である。
【図２】図１に示した光路切換ユニットの構成を示す図である。
【図３】図１に示したピンホール板を示す図である。
【図４】図１に示した波長抽出フィルタユニットの構成を示す図である。
【図５】タイムラプス測光処理手順を示すフローチャートである。
【図６−１】標本の明視野観察像を示す図である。
【図６−２】標本の明視野観察像と２次ピンホール像とを示す図である。
【図６−３】２次ピンホール像を示す図である。
【図６−４】標本の発光観察像を示す図である。
【図７】タイムラプス測光データを示す図である。
【図８】タイムラプス測光にかかる各工程の設定状態を示す図である。
【図９】観察測光装置に搭載可能な落射蛍光装置の構成を示す図である。
【符号の説明】
【０１１８】
１ 観察系
２ 測光系
３ 電動ステージ系
４ 照明系
５ 制御系
６ 遮蔽部
７ 落射蛍光装置
１１ 対物レンズ
１２ 結像レンズ
１３ 撮像装置
１３ａ 撮像面
１４ 焦準機構
２１ 波長抽出フィルタユニット
２１ａ 波長抽出フィルタ
２１ｂ 選択配置機構
２２ 結像レンズ
２３ ピンホールユニット
２３ａ ピンホール
２３ｂ ピンホール板
２３ｃ ピンホール駆動部
２３ｄ 切欠
２４ ピンホール照明系
２４ａ ランプ光源
２４ｂ 拡散板
２４ｃ コンデンサレンズ
２４ｄ 低反射ミラー
２５ 集光レンズ
２６ 光検出器
２７ 光路切換ユニット
２７ａ 光分割プリズム
２７ｂ 選択配置機構
２８ 一体保持機構
３１ 容器
３２ ステージ部
３３ ステージ駆動部
４１ 光源装置
４２ ファイバーライトガイド
５１ 入力部
５２ 表示部
５３ 記憶部
５４ 制御部
５４ａ 観察測光制御部
５４ｂ 記憶制御部
５４ｃ 表示制御部
５４ｄ 切換制御部
５４ｅ 照明制御部
５４ｆ 移動制御部
５４ｇ 焦準制御部
７１ 励起光源
７２ 励起光投光管
７２ａ 集光レンズ
７２ｂ 明るさ絞り作りレンズ
７２ｃ 投光レンズ
７３ 蛍光キューブ
７３ａ 励起フィルタ
７３ｂ 吸収フィルタ
７３ｃ ダイクロイックミラー
１００ 観察測光装置
２１１，２７１ スライダ
２１１−１〜２１１−３，２７１−１〜２７１−３ 貫通孔
２１２，２７２ スライダ駆動部
ＯＡ１ 観察光軸
ＯＡ２ 投影測光光軸
ＰＡ 中心軸
ＰＩ ピンホール像
Ｓ 標本
【特許請求の範囲】
【請求項１】
開口が形成された開口部材と、
前記開口を照明する開口照明手段と、
前記開口照明手段によって照明された前記開口の開口像を標本上に投影し、前記開口像内の前記標本から発せられる光を前記開口内に集光させる投影測光光学系と、
前記標本の観察とともに前記開口像を観察する観察光学系と、
前記投影測光光学系および前記開口を介し、前記開口像内の前記標本から発せられた光を測光する測光手段と、
前記開口像と前記標本との少なくとも一方を移動させる相対移動手段と、
を備え、前記開口は、前記投影測光光学系の結像面に配設されたことを特徴とする観察測光装置。
【請求項２】
前記観察光学系の観察光路に対して前記投影測光光学系の投影測光光路を合分岐する合分岐手段を備え、
前記投影測光光学系は、前記観察光学系の一部または全部を共用して前記開口を前記標本上に投影することを特徴とする請求項１に記載の観察測光装置。
【請求項３】
前記合分岐手段は、透過率および反射率の少なくとも一方が異なる複数の光分割素子と、複数の前記光分割素子のうち１つを前記観察光路上に択一的に配置する選択配置機構とを有することを特徴とする請求項２に記載の観察測光装置。
【請求項４】
前記合分岐手段は、複数の前記光分割素子として、反射率と透過率との割合が異なる少なくとも３種類の素子を有することを特徴とする請求項３に記載の観察測光装置。
【請求項５】
３種類の前記光分割素子は、標本からの光を１００％反射する反射素子と、標本からの光を１００％透過する透過素子と、少なくとも反射と透過とを共に行わせる素子とからなることを特徴とする請求項４に記載の観察測光装置。
【請求項６】
前記開口照明手段は、照明光を発する光源手段と、該照明光を前記測光手段の測光光路内に導入して前記開口に導く照明光導入手段とを有することを特徴とする請求項１〜５のいずれか一つに記載の観察測光装置。
【請求項７】
前記照明光導入手段は、前記測光光路内に配置され、前記照明光を所定反射率で反射させて前記開口に導くとともに、前記標本から発せられて前記開口を通過した光を所定透過率で透過させる半透明素子であることを特徴とする請求項６に記載の観察測光装置。
【請求項８】
前記投影測光光学系に対して前記開口の大きさおよび形状の少なくとも一方を変更する開口切換機構を備えたことを特徴とする請求項１〜７のいずれか一つに記載の観察測光装置。
【請求項９】
前記開口部材は、大きさおよび形状の少なくとも一方が異なる複数の前記開口を有し、
前記開口切換機構は、複数の前記開口のうち１つを前記投影測光光学系の投影測光光路内に択一的に配置することを特徴とする請求項８に記載の観察測光装置。
【請求項１０】
前記開口部材は、その周方向に複数の前記開口が配列された円盤状部材であり、
前記開口切換機構は、前記開口部材をその周方向に回動させ、複数の前記開口のうち１つを前記投影測光光路内に択一的に配置することを特徴とする請求項９に記載の観察測光装置。
【請求項１１】
前記開口は、前記開口部材上に形成された透孔または切欠であることを特徴とする請求項９または１０に記載の観察測光装置。
【請求項１２】
前記相対移動手段は、前記標本を保持し、該標本を前記観察光学系の観察光軸に垂直な面内で移動させる標本移動手段と、前記開口を前記投影測光光学系の投影測光光軸に垂直な面内で移動させる開口移動手段との少なくとも一方を有することを特徴とする請求項１〜１１のいずれか一つに記載の観察測光装置。
【請求項１３】
前記標本移動手段は、前記観察光軸に垂直な面内で前記標本を自在に移動させる電動ステージを有することを特徴とする請求項１２に記載の観察測光装置。
【請求項１４】
前記開口移動手段は、前記開口部材を介して前記開口を前記投影測光光軸に垂直な面内で移動させることを特徴とする請求項１２または１３に記載の観察測光装置。
【請求項１５】
前記開口部材、前記開口照明手段および前記測光手段を一体に保持する一体保持機構を備え、
前記開口移動手段は、前記一体保持機構を介して前記開口を前記投影測光光軸に垂直な面内で移動させることを特徴とする請求項１２〜１４のいずれか一つに記載の観察測光装置。
【請求項１６】
前記相対移動手段は、前記観察光学系の観察視野内に位置する前記標本上の指定標本領域の領域位置を読取る領域位置読取手段を有することを特徴とする請求項１〜１５のいずれか一つに記載の観察測光装置。
【請求項１７】
前記領域位置読取手段は、前記観察光軸に対する前記標本の指定標本位置を読取る標本位置読取手段と、前記観察光軸に対する前記開口像の開口像位置を読取る開口位置読取手段との少なくとも一方を有したことを特徴とする請求項１６に記載の観察測光装置。
【請求項１８】
前記領域位置を記憶する記憶手段と、
前記領域位置読取手段が読取った前記領域位置を前記記憶手段に記憶させる位置記憶制御手段と、
を備えたことを特徴とする請求項１６または１７に記載の観察測光装置。
【請求項１９】
あらかじめ１以上の前記領域位置を記憶した記憶手段と、
前記相対移動手段によって、１以上の前記領域位置に対応する各指定標本領域を前記開口像内に順次配置させ、順次配置させるごとに該指定標本領域から発せられた光を前記測光手段に測光させるとともに、この測光結果を測光時点の前記領域位置に対応付けて前記記憶手段に記憶させる制御を１回または所定期間ごとに繰り返す測光制御手段と、
を備えたことを特徴とする請求項１６〜１８のいずれか一つに記載の観察測光装置。
【請求項２０】
あらかじめ１以上の前記標本位置および前記開口位置の少なくとも一方を前記領域位置として記憶した記憶手段と、
前記標本移動手段および／または前記開口移動手段によって、１以上の前記標本位置および／または前記開口位置の各々に前記標本および／または前記開口を順次配置させ、順次配置させるごとに前記開口像内の前記標本から発せられた光を前記測光手段に測光させるとともに、この測光結果を測光時点の前記標本位置および／または前記開口位置に対応付けて前記記憶手段に記憶させる制御を１回または所定期間ごとに繰り返す測光制御手段と、
を備えたことを特徴とする請求項１７に記載の観察測光装置。
【請求項２１】
前記投影測光光学系に対して前記開口の大きさおよび形状の少なくとも一方を変更する開口切換機構を備え、
前記記憶手段は、あらかじめ前記領域位置ごとに、前記開口の大きさおよび形状を特定する開口情報を対応づけて記憶し、
前記測光制御手段は、前記記憶手段に記憶された前記領域位置に対応する前記指定標本領域を前記開口像内に配置させるごとに、該領域位置に対応付けられた前記開口情報に基づいて前記開口切換機構に前記開口を切り換えさせる制御をすることを特徴とする請求項１９または２０に記載の観察測光装置。
【請求項２２】
異なる波長域の光を抽出する複数の波長抽出フィルタを有し、複数の前記波長抽出フィルタの少なくとも１つを、非配置を含めて選択的に前記測光手段の測光光路内に配置する波長抽出手段を備え、
前記記憶手段は、あらかじめ前記領域位置ごとに、前記測光光路内に配置する前記波長抽出フィルタを指定するフィルタ情報を対応付けて記憶し、
前記測光制御手段は、前記記憶手段に記憶された前記領域位置に対応する前記指定標本領域を前記開口像内に配置させるごとに、該領域位置に対応付けられた前記フィルタ情報に基づいて前記波長抽出手段に前記波長抽出フィルタを配置させる制御をすることを特徴とする請求項１９〜２１のいずれか一つに記載の観察測光装置。
【請求項２３】
前記記憶手段は、あらかじめ前記領域位置ごとに、該領域位置に対応する前記指定標本領域を識別する領域識別情報を対応付けて記憶することを特徴とする請求項１９〜２２のいずれか一つに記載の観察測光装置。
【請求項２４】
複数の前記光分割素子のうち前記標本から発せられた光を前記測光手段に対して１００％配分する光分割素子を前記選択配置機構によって配置し、前記標本から発せられた光を前記測光手段に測光させる制御をする測光制御手段を備えたことを特徴とする請求項３または４に記載の観察測光装置。
【請求項２５】
前記測光制御手段は、前記測光手段に測光させない場合、複数の前記光分割素子のうち前記標本から発せられた光を前記観察像に対して１００％配分する光分割素子を前記選択配置機構に配置させる制御をすることを特徴とする請求項２４に記載の観察測光装置。
【請求項２６】
前記観察光学系は、観察視野内に配置された前記標本上の各点からの光を受光して各々平行光束に変換する対物レンズと、該対物レンズと協働して前記観察像とともに前記２次開口像を結像する結像レンズとを有することを特徴とする請求項１〜２５のいずれか一つに記載の観察測光装置。
【請求項２７】
前記観察光学系による前記観察像の総合結像倍率は、２倍以上、８倍以下であることを特徴とする請求項１〜２６のいずれか一つに記載の観察測光装置。
【請求項２８】
前記観察像および前記２次開口像の少なくとも一方を撮像して観察画像を生成する撮像手段を備えたことを特徴とする請求項１〜２７のいずれか一つに記載の観察測光装置。
【請求項２９】
前記観察画像を表示する表示手段を備えたことを特徴とする請求項２８に記載の観察測光装置。
【請求項３０】
前記観察画像として、前記標本に対して照射された光をもとに生成された照明観察画像と、前記標本が発した光をもとに生成された発光観察画像とを重ね合わせて前記表示手段に表示させる制御をする表示制御手段を備えたことを特徴とする請求項２９に記載の観察測光装置。
【請求項３１】
所定の照明指示情報に基づいて前記開口照明手段による照明の開始および停止制御をする照明制御手段を備えたことを特徴とする請求項１〜３０のいずれか一つに記載の観察測光装置。
【請求項３２】
前記標本に対して明視野照明を行う明視野照明手段および該標本を励起する励起光照明を行う励起光照明手段の少なくとも一方を備えたことを特徴とする請求項１〜３１のいずれか一つに記載の観察測光装置。
【請求項３３】
所定の照明指示情報に基づいて前記明視野照明手段および前記励起光照明手段の少なくとも一方による照明の開始および停止制御をする照明制御手段を備えたことを特徴とする請求項３２に記載の観察測光装置。
【請求項３４】
前記標本は、微弱光を発する自己発光体および蛍光発光体の少なくとも一方を含むことを特徴とする請求項１〜３３のいずれか一つに記載の観察測光装置。
【請求項３５】
前記測光手段は、微弱光検出素子を有し、前記標本から発せられた光を該微弱光検出素子によって検出することを特徴とする請求項１〜３４のいずれか一つに記載の観察測光装置。
【請求項３６】
前記微弱光検出素子は、光電子増倍管またはアバランシェフォトダイオードであることを特徴とする請求項３５に記載の観察測光装置。
【請求項３７】
前記標本と前記観察光学系との相対距離を変化させ、前記標本に対する前記観察光学系の焦点合わせを行う焦準機構を備えたことを特徴とする請求項１〜３６のいずれか一つに記載の観察測光装置。
【請求項３８】
前記焦準機構は、電動焦準機構であり、
所定の焦準指示情報に基づき、前記焦準機構によって前記標本に対する前記観察光学系の焦点合わせを行う制御をする焦準制御手段を備えたことを特徴とする請求項３７に記載の観察測光装置。
【請求項３９】
当該観察測光装置の一部または全部を遮蔽し、外部から照射される光を遮断する遮蔽手段を備えたことを特徴とする請求項１〜３８のいずれか一つに記載の観察測光装置。
【請求項４０】
標本を照明し、該標本を撮影して照明観察画像を取得する照明画像取得ステップと、
前記照明観察画像をもとに、前記標本の中から測光対象とする標本領域を１以上選択し、この選択した各標本領域の領域位置を記録する標本領域選択ステップと、
を含む観察測光準備ステップと、
前記標本領域選択ステップで選択された各標本領域から発せられた光を順次測光するとともに、各測光結果を測光時点の前記領域位置に対応付けて記録する測光ステップを所定時間ごとに繰り返す繰り返し測光ステップと、
を含むことを特徴とする観察測光方法。
【請求項４１】
前記観察測光準備ステップは、前記標本領域ごとに、該標本領域から発せられた光を選択的に通過させる開口を選定し、この選定した開口の大きさおよび形状を特定する開口情報を前記領域位置に対応付けて記録する開口選定ステップを含み、
前記測光ステップは、前記標本領域選択ステップで選択された前記標本領域ごとに、該標本領域の前記領域位置に対応付けられた前記開口情報が示す前記開口を順次設定し、順次設定するごとに前記標本領域から発せられた光を測光するとともに、各測光結果を測光時点の前記領域位置に対応付けて記録することを特徴とする請求項４０に記載の観察測光方法。
【請求項４２】
前記観察測光準備ステップは、前記標本領域ごとに、該標本領域から発せられた光の中から所定波長域の光を抽出する波長抽出フィルタを選定し、この選定した波長抽出フィルタを特定するフィルタ情報を前記領域位置に対応付けて記録するフィルタ選定ステップを含み、
前記測光ステップは、前記標本領域選択ステップで選択された前記標本領域ごとに、該標本領域の前記領域位置に対応付けられた前記フィルタ情報が示す前記波長抽出フィルタを順次設定し、順次設定するごとに前記標本領域から発せられた光を測光するとともに、各測光結果を測光時点の前記領域位置に対応付けて記録することを特徴とする請求項４０または４１に記載の観察測光方法。
【請求項４３】
前記繰り返し測光ステップは、前記標本に対する撮影視野全体を前記標本領域とし、該撮影視野に応じた前記開口を設定して該撮影視野内の前記標本から発せられた光を測光するとともに、この測光結果を記録する全視野測光ステップを前記所定時間ごとに繰り返すことを特徴とする請求項４０〜４２のいずれか一つに記載の観察測光方法。
【請求項４４】
前記繰り返し測光ステップは、前記標本が発した光をもとに該標本を撮影して発光観察画像を取得する発光画像取得ステップを前記所定時間ごとに繰り返すことを特徴とする請求項４０〜４３のいずれか一つに記載の観察測光方法。
【請求項１】
開口が形成された開口部材と、
前記開口を照明する開口照明手段と、
前記開口照明手段によって照明された前記開口の開口像を標本上に投影し、前記開口像内の前記標本から発せられる光を前記開口内に集光させる投影測光光学系と、
前記標本の観察とともに前記開口像を観察する観察光学系と、
前記投影測光光学系および前記開口を介し、前記開口像内の前記標本から発せられた光を測光する測光手段と、
前記開口像と前記標本との少なくとも一方を移動させる相対移動手段と、
を備え、前記開口は、前記投影測光光学系の結像面に配設されたことを特徴とする観察測光装置。
【請求項２】
前記観察光学系の観察光路に対して前記投影測光光学系の投影測光光路を合分岐する合分岐手段を備え、
前記投影測光光学系は、前記観察光学系の一部または全部を共用して前記開口を前記標本上に投影することを特徴とする請求項１に記載の観察測光装置。
【請求項３】
前記合分岐手段は、透過率および反射率の少なくとも一方が異なる複数の光分割素子と、複数の前記光分割素子のうち１つを前記観察光路上に択一的に配置する選択配置機構とを有することを特徴とする請求項２に記載の観察測光装置。
【請求項４】
前記合分岐手段は、複数の前記光分割素子として、反射率と透過率との割合が異なる少なくとも３種類の素子を有することを特徴とする請求項３に記載の観察測光装置。
【請求項５】
３種類の前記光分割素子は、標本からの光を１００％反射する反射素子と、標本からの光を１００％透過する透過素子と、少なくとも反射と透過とを共に行わせる素子とからなることを特徴とする請求項４に記載の観察測光装置。
【請求項６】
前記開口照明手段は、照明光を発する光源手段と、該照明光を前記測光手段の測光光路内に導入して前記開口に導く照明光導入手段とを有することを特徴とする請求項１〜５のいずれか一つに記載の観察測光装置。
【請求項７】
前記照明光導入手段は、前記測光光路内に配置され、前記照明光を所定反射率で反射させて前記開口に導くとともに、前記標本から発せられて前記開口を通過した光を所定透過率で透過させる半透明素子であることを特徴とする請求項６に記載の観察測光装置。
【請求項８】
前記投影測光光学系に対して前記開口の大きさおよび形状の少なくとも一方を変更する開口切換機構を備えたことを特徴とする請求項１〜７のいずれか一つに記載の観察測光装置。
【請求項９】
前記開口部材は、大きさおよび形状の少なくとも一方が異なる複数の前記開口を有し、
前記開口切換機構は、複数の前記開口のうち１つを前記投影測光光学系の投影測光光路内に択一的に配置することを特徴とする請求項８に記載の観察測光装置。
【請求項１０】
前記開口部材は、その周方向に複数の前記開口が配列された円盤状部材であり、
前記開口切換機構は、前記開口部材をその周方向に回動させ、複数の前記開口のうち１つを前記投影測光光路内に択一的に配置することを特徴とする請求項９に記載の観察測光装置。
【請求項１１】
前記開口は、前記開口部材上に形成された透孔または切欠であることを特徴とする請求項９または１０に記載の観察測光装置。
【請求項１２】
前記相対移動手段は、前記標本を保持し、該標本を前記観察光学系の観察光軸に垂直な面内で移動させる標本移動手段と、前記開口を前記投影測光光学系の投影測光光軸に垂直な面内で移動させる開口移動手段との少なくとも一方を有することを特徴とする請求項１〜１１のいずれか一つに記載の観察測光装置。
【請求項１３】
前記標本移動手段は、前記観察光軸に垂直な面内で前記標本を自在に移動させる電動ステージを有することを特徴とする請求項１２に記載の観察測光装置。
【請求項１４】
前記開口移動手段は、前記開口部材を介して前記開口を前記投影測光光軸に垂直な面内で移動させることを特徴とする請求項１２または１３に記載の観察測光装置。
【請求項１５】
前記開口部材、前記開口照明手段および前記測光手段を一体に保持する一体保持機構を備え、
前記開口移動手段は、前記一体保持機構を介して前記開口を前記投影測光光軸に垂直な面内で移動させることを特徴とする請求項１２〜１４のいずれか一つに記載の観察測光装置。
【請求項１６】
前記相対移動手段は、前記観察光学系の観察視野内に位置する前記標本上の指定標本領域の領域位置を読取る領域位置読取手段を有することを特徴とする請求項１〜１５のいずれか一つに記載の観察測光装置。
【請求項１７】
前記領域位置読取手段は、前記観察光軸に対する前記標本の指定標本位置を読取る標本位置読取手段と、前記観察光軸に対する前記開口像の開口像位置を読取る開口位置読取手段との少なくとも一方を有したことを特徴とする請求項１６に記載の観察測光装置。
【請求項１８】
前記領域位置を記憶する記憶手段と、
前記領域位置読取手段が読取った前記領域位置を前記記憶手段に記憶させる位置記憶制御手段と、
を備えたことを特徴とする請求項１６または１７に記載の観察測光装置。
【請求項１９】
あらかじめ１以上の前記領域位置を記憶した記憶手段と、
前記相対移動手段によって、１以上の前記領域位置に対応する各指定標本領域を前記開口像内に順次配置させ、順次配置させるごとに該指定標本領域から発せられた光を前記測光手段に測光させるとともに、この測光結果を測光時点の前記領域位置に対応付けて前記記憶手段に記憶させる制御を１回または所定期間ごとに繰り返す測光制御手段と、
を備えたことを特徴とする請求項１６〜１８のいずれか一つに記載の観察測光装置。
【請求項２０】
あらかじめ１以上の前記標本位置および前記開口位置の少なくとも一方を前記領域位置として記憶した記憶手段と、
前記標本移動手段および／または前記開口移動手段によって、１以上の前記標本位置および／または前記開口位置の各々に前記標本および／または前記開口を順次配置させ、順次配置させるごとに前記開口像内の前記標本から発せられた光を前記測光手段に測光させるとともに、この測光結果を測光時点の前記標本位置および／または前記開口位置に対応付けて前記記憶手段に記憶させる制御を１回または所定期間ごとに繰り返す測光制御手段と、
を備えたことを特徴とする請求項１７に記載の観察測光装置。
【請求項２１】
前記投影測光光学系に対して前記開口の大きさおよび形状の少なくとも一方を変更する開口切換機構を備え、
前記記憶手段は、あらかじめ前記領域位置ごとに、前記開口の大きさおよび形状を特定する開口情報を対応づけて記憶し、
前記測光制御手段は、前記記憶手段に記憶された前記領域位置に対応する前記指定標本領域を前記開口像内に配置させるごとに、該領域位置に対応付けられた前記開口情報に基づいて前記開口切換機構に前記開口を切り換えさせる制御をすることを特徴とする請求項１９または２０に記載の観察測光装置。
【請求項２２】
異なる波長域の光を抽出する複数の波長抽出フィルタを有し、複数の前記波長抽出フィルタの少なくとも１つを、非配置を含めて選択的に前記測光手段の測光光路内に配置する波長抽出手段を備え、
前記記憶手段は、あらかじめ前記領域位置ごとに、前記測光光路内に配置する前記波長抽出フィルタを指定するフィルタ情報を対応付けて記憶し、
前記測光制御手段は、前記記憶手段に記憶された前記領域位置に対応する前記指定標本領域を前記開口像内に配置させるごとに、該領域位置に対応付けられた前記フィルタ情報に基づいて前記波長抽出手段に前記波長抽出フィルタを配置させる制御をすることを特徴とする請求項１９〜２１のいずれか一つに記載の観察測光装置。
【請求項２３】
前記記憶手段は、あらかじめ前記領域位置ごとに、該領域位置に対応する前記指定標本領域を識別する領域識別情報を対応付けて記憶することを特徴とする請求項１９〜２２のいずれか一つに記載の観察測光装置。
【請求項２４】
複数の前記光分割素子のうち前記標本から発せられた光を前記測光手段に対して１００％配分する光分割素子を前記選択配置機構によって配置し、前記標本から発せられた光を前記測光手段に測光させる制御をする測光制御手段を備えたことを特徴とする請求項３または４に記載の観察測光装置。
【請求項２５】
前記測光制御手段は、前記測光手段に測光させない場合、複数の前記光分割素子のうち前記標本から発せられた光を前記観察像に対して１００％配分する光分割素子を前記選択配置機構に配置させる制御をすることを特徴とする請求項２４に記載の観察測光装置。
【請求項２６】
前記観察光学系は、観察視野内に配置された前記標本上の各点からの光を受光して各々平行光束に変換する対物レンズと、該対物レンズと協働して前記観察像とともに前記２次開口像を結像する結像レンズとを有することを特徴とする請求項１〜２５のいずれか一つに記載の観察測光装置。
【請求項２７】
前記観察光学系による前記観察像の総合結像倍率は、２倍以上、８倍以下であることを特徴とする請求項１〜２６のいずれか一つに記載の観察測光装置。
【請求項２８】
前記観察像および前記２次開口像の少なくとも一方を撮像して観察画像を生成する撮像手段を備えたことを特徴とする請求項１〜２７のいずれか一つに記載の観察測光装置。
【請求項２９】
前記観察画像を表示する表示手段を備えたことを特徴とする請求項２８に記載の観察測光装置。
【請求項３０】
前記観察画像として、前記標本に対して照射された光をもとに生成された照明観察画像と、前記標本が発した光をもとに生成された発光観察画像とを重ね合わせて前記表示手段に表示させる制御をする表示制御手段を備えたことを特徴とする請求項２９に記載の観察測光装置。
【請求項３１】
所定の照明指示情報に基づいて前記開口照明手段による照明の開始および停止制御をする照明制御手段を備えたことを特徴とする請求項１〜３０のいずれか一つに記載の観察測光装置。
【請求項３２】
前記標本に対して明視野照明を行う明視野照明手段および該標本を励起する励起光照明を行う励起光照明手段の少なくとも一方を備えたことを特徴とする請求項１〜３１のいずれか一つに記載の観察測光装置。
【請求項３３】
所定の照明指示情報に基づいて前記明視野照明手段および前記励起光照明手段の少なくとも一方による照明の開始および停止制御をする照明制御手段を備えたことを特徴とする請求項３２に記載の観察測光装置。
【請求項３４】
前記標本は、微弱光を発する自己発光体および蛍光発光体の少なくとも一方を含むことを特徴とする請求項１〜３３のいずれか一つに記載の観察測光装置。
【請求項３５】
前記測光手段は、微弱光検出素子を有し、前記標本から発せられた光を該微弱光検出素子によって検出することを特徴とする請求項１〜３４のいずれか一つに記載の観察測光装置。
【請求項３６】
前記微弱光検出素子は、光電子増倍管またはアバランシェフォトダイオードであることを特徴とする請求項３５に記載の観察測光装置。
【請求項３７】
前記標本と前記観察光学系との相対距離を変化させ、前記標本に対する前記観察光学系の焦点合わせを行う焦準機構を備えたことを特徴とする請求項１〜３６のいずれか一つに記載の観察測光装置。
【請求項３８】
前記焦準機構は、電動焦準機構であり、
所定の焦準指示情報に基づき、前記焦準機構によって前記標本に対する前記観察光学系の焦点合わせを行う制御をする焦準制御手段を備えたことを特徴とする請求項３７に記載の観察測光装置。
【請求項３９】
当該観察測光装置の一部または全部を遮蔽し、外部から照射される光を遮断する遮蔽手段を備えたことを特徴とする請求項１〜３８のいずれか一つに記載の観察測光装置。
【請求項４０】
標本を照明し、該標本を撮影して照明観察画像を取得する照明画像取得ステップと、
前記照明観察画像をもとに、前記標本の中から測光対象とする標本領域を１以上選択し、この選択した各標本領域の領域位置を記録する標本領域選択ステップと、
を含む観察測光準備ステップと、
前記標本領域選択ステップで選択された各標本領域から発せられた光を順次測光するとともに、各測光結果を測光時点の前記領域位置に対応付けて記録する測光ステップを所定時間ごとに繰り返す繰り返し測光ステップと、
を含むことを特徴とする観察測光方法。
【請求項４１】
前記観察測光準備ステップは、前記標本領域ごとに、該標本領域から発せられた光を選択的に通過させる開口を選定し、この選定した開口の大きさおよび形状を特定する開口情報を前記領域位置に対応付けて記録する開口選定ステップを含み、
前記測光ステップは、前記標本領域選択ステップで選択された前記標本領域ごとに、該標本領域の前記領域位置に対応付けられた前記開口情報が示す前記開口を順次設定し、順次設定するごとに前記標本領域から発せられた光を測光するとともに、各測光結果を測光時点の前記領域位置に対応付けて記録することを特徴とする請求項４０に記載の観察測光方法。
【請求項４２】
前記観察測光準備ステップは、前記標本領域ごとに、該標本領域から発せられた光の中から所定波長域の光を抽出する波長抽出フィルタを選定し、この選定した波長抽出フィルタを特定するフィルタ情報を前記領域位置に対応付けて記録するフィルタ選定ステップを含み、
前記測光ステップは、前記標本領域選択ステップで選択された前記標本領域ごとに、該標本領域の前記領域位置に対応付けられた前記フィルタ情報が示す前記波長抽出フィルタを順次設定し、順次設定するごとに前記標本領域から発せられた光を測光するとともに、各測光結果を測光時点の前記領域位置に対応付けて記録することを特徴とする請求項４０または４１に記載の観察測光方法。
【請求項４３】
前記繰り返し測光ステップは、前記標本に対する撮影視野全体を前記標本領域とし、該撮影視野に応じた前記開口を設定して該撮影視野内の前記標本から発せられた光を測光するとともに、この測光結果を記録する全視野測光ステップを前記所定時間ごとに繰り返すことを特徴とする請求項４０〜４２のいずれか一つに記載の観察測光方法。
【請求項４４】
前記繰り返し測光ステップは、前記標本が発した光をもとに該標本を撮影して発光観察画像を取得する発光画像取得ステップを前記所定時間ごとに繰り返すことを特徴とする請求項４０〜４３のいずれか一つに記載の観察測光方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６−１】
【図６−２】
【図６−３】
【図６−４】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６−１】
【図６−２】
【図６−３】
【図６−４】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２００８−５８２４９（Ｐ２００８−５８２４９Ａ）
【公開日】平成２０年３月１３日（２００８．３．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２３８２８７（Ｐ２００６−２３８２８７）
【出願日】平成１８年９月１日（２００６．９．１）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年３月１３日（２００８．３．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年９月１日（２００６．９．１）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
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