遺伝子導入剤及びその製造方法並びに核酸複合体
【課題】遺伝子導入効率がさらに向上した遺伝子導入剤及びその製造方法を提供する。
【解決手段】芳香環に、分岐鎖としてのＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が３個以上導入された芳香族化合物をイニファターとし、このイニファターの分岐鎖に少なくともビニル系モノマーを光照射リビング重合させた分岐型重合体、又はこの分岐型重合体の分岐鎖を架橋反応させた架橋体よりなる遺伝子導入剤であって、該分岐型重合体又は該架橋体を分子量分画して得た、重量平均分子量Ｍｗと数平均分子量Ｍｎとの比Ｍｗ／Ｍｎが１．０〜１．５の画分よりなることを特徴とする遺伝子導入剤。
【解決手段】芳香環に、分岐鎖としてのＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が３個以上導入された芳香族化合物をイニファターとし、このイニファターの分岐鎖に少なくともビニル系モノマーを光照射リビング重合させた分岐型重合体、又はこの分岐型重合体の分岐鎖を架橋反応させた架橋体よりなる遺伝子導入剤であって、該分岐型重合体又は該架橋体を分子量分画して得た、重量平均分子量Ｍｗと数平均分子量Ｍｎとの比Ｍｗ／Ｍｎが１．０〜１．５の画分よりなることを特徴とする遺伝子導入剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子導入剤及びその製造方法並びに核酸複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
安全性、品質安定性、製造コストに問題があるウイルスベクターに代わる遺伝子導入技術として、合成高分子ベクター、カチオン性脂質ベクターが研究開発されている。
【０００３】
本出願人らは、合成高分子ベクターとして、ベンゼンなどの芳香環を核としてカチオン性ポリマー鎖が放射状に伸延する分岐構造のベクターが、ＤＮＡを高密度で凝縮させて小さな核酸複合体微粒子を形成させ、効率良く細胞へ遺伝子導入できることを見出し、先に特許出願した（下記特許文献１，２）。この複合体微粒子が細胞膜を透過するメカニズムとしては、カチオン性ポリマー鎖による陽電荷が細胞膜表面の陰電荷と静電的に結合し、エンドサイトーシスにより細胞内へ取り込まれる作用に大きく依存していると考えられる。
【特許文献１】ＷＯ２００４／０９２３８８
【特許文献２】特開２００７−７０５７９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、遺伝子導入効率がさらに向上した遺伝子導入剤及びその製造方法と、この遺伝子導入剤を用いた核酸複合体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明（請求項１）の遺伝子導入剤は、芳香環に、分岐鎖としてのＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が３個以上導入された芳香族化合物をイニファターとし、このイニファターの分岐鎖に少なくともビニル系モノマーを光照射リビング重合させた分岐型重合体、又はこの分岐型重合体の分岐鎖を架橋反応させた架橋体よりなる遺伝子導入剤であって、該分岐型重合体又は該架橋体を分子量分画して得た、重量平均分子量Ｍｗと数平均分子量Ｍｎとの比Ｍｗ／Ｍｎが１．０〜１．５の画分よりなることを特徴とする。
【０００６】
請求項２の遺伝子導入剤は、請求項１において、前記架橋体は、前記分岐型重合体に光照射することにより、該分岐型重合体の分岐鎖を架橋反応させたものであることを特徴とする。
【０００７】
請求項３の遺伝子導入剤は、請求項１又は２において、該Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基がＮ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル基であることを特徴とする。
【０００８】
請求項４の遺伝子導入剤は、請求項１ないし３のいずれか１項において、前記イニファターが、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が結合していることを特徴とする。
【０００９】
請求項５の遺伝子導入剤は、請求項１ないし４のいずれか１項において、前記ビニル系モノマーが、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド及び／又は２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートを含むことを特徴とする。
【００１０】
本発明（請求項６）の遺伝子導入剤の製造方法は、芳香環に、分岐鎖としてのＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が３個以上導入された芳香族化合物をイニファターとし、このイニファターの分岐鎖にビニル系モノマーを光照射リビング重合させて分岐型重合反応生成物を得る工程と、該分岐型重合反応生成物を分子量分画して、重量平均分子量Ｍｗと数平均分子量Ｍｎとの比Ｍｗ／Ｍｎが１．０〜１．５の画分を分取する工程とを有することを特徴とする。
【００１１】
本発明（請求項７）の遺伝子導入剤の製造方法は、芳香環に、分岐鎖としてのＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が３個以上導入された芳香族化合物をイニファターとし、このイニファターの分岐鎖にビニル系モノマーを光照射リビング重合させて分岐型重合体を製造する工程と、得られた分岐型重合体の分岐鎖を架橋反応させて架橋反応生成物を得る工程と、該架橋反応生成物を分子量分画して、重量平均分子量Ｍｗと数平均分子量Ｍｎとの比Ｍｗ／Ｍｎが１．０〜１．５の画分を分取する工程とを有することを特徴とする。
【００１２】
本発明（請求項８）の核酸複合体は、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の遺伝子導入剤と核酸とを複合させてなるものである。
【００１３】
本発明（請求項９）の核酸複合体は、請求項６又は７の遺伝子導入剤の製造方法で製造された遺伝子導入剤と核酸とを複合させてなるものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の遺伝子導入剤は、Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基を有する芳香族化合物をイニファクターとし、これにビニル系モノマーを光照射リビング重合させて合成した、芳香環を核として、分岐鎖が放射状に伸延する分岐型重合体（以下「第１次分岐型重合体」ということがある。）よりなるか、或いは、この第１次分岐型重合体に光を照射するなどして分岐鎖を架橋させた架橋体よりなり、かつ、これらのうち、特に遺伝子導入活性の高い、重量平均分子量Ｍｗと数平均分子量Ｍｎとの比Ｍｗ／Ｍｎが１．０〜１．５の画分を分取して得た合成高分子ベクターであり、高い遺伝子導入活性を示す。
【００１５】
なお、上記の架橋体は、第１次分岐型重合体に光照射するなどして第１次分岐型重合体の末端のＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基などを架橋点として寄与させることにより第１次分岐型重合体同士がその分岐鎖で架橋してなる分子間架橋体であると推察されるが（請求項２）、種々の研究の結果、この架橋体は、第１次分岐型重合体よりもＤＮＡなどの核酸を高密度に凝縮することができることが認められた。即ち、この架橋体は、第１次分岐型重合体を架橋することにより、第１次分岐型重合体よりも更に分岐鎖が入り組んだ複雑な立体構造を有するものとなり、この構造的な特徴から核酸をより一層効果的に凝縮させて高い遺伝子導入活性を示す。
【００１６】
本発明において、イニファターが有するＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基としてはＮ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル基が好ましく（請求項３）、特にイニファターは、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が結合しているものが好ましい（請求項４）。また、イニファターの分岐鎖に光照射リビング重合させるビニル系モノマーとしては、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド及び／又は２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートが好ましい（請求項５）。
【００１７】
本発明の遺伝子導入剤は、芳香環に、分岐鎖としてのＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が３個以上導入された芳香族化合物をイニファターとし、このイニファターの分岐鎖にビニル系モノマーを光照射リビング重合させて分岐型重合反応生成物を得る工程と、該分岐型重合反応生成物を分子量分画して、重量平均分子量Ｍｗと数平均分子量Ｍｎとの比Ｍｗ／Ｍｎが１．０〜１．５の画分を分取する工程とを有することを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法（請求項６）、或いは、芳香環に、分岐鎖としてのＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が３個以上導入された芳香族化合物をイニファターとし、このイニファターの分岐鎖にビニル系モノマーを光照射リビング重合させて分岐型重合体を製造する工程と、得られた分岐型重合体の分岐鎖を架橋反応させて架橋反応生成物を得る工程と、該架橋反応生成物を分子量分画して、重量平均分子量Ｍｗと数平均分子量Ｍｎとの比Ｍｗ／Ｍｎが１．０〜１．５の画分を分取する工程とを有することを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法（請求項７）により、容易に製造される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下に本発明の実施の形態を詳細に説明する。
【００１９】
本発明の遺伝子導入剤は、芳香環に分岐鎖としてのＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が３個以上導入された芳香族化合物をイニファター（以下「特定イニファター」と称す場合がある。）とし、この特定イニファターの分岐鎖に少なくともビニル系モノマーを光照射リビング重合させて得たスター型の第１次分岐型重合体よりなるか、又はこの第１次分岐型重合体を架橋反応させた架橋体よりなり、かつ該第１次分岐型重合体又は架橋体を分子量分画して得た重量平均分子量Ｍｗと数平均分子量Ｍｎとの比Ｍｗ／Ｍｎが１．０〜１．５の画分よりなるものである。
【００２０】
即ち、上記の第１次分岐型重合体それ自体がある程度の分子量分布を有したものである。この第１次分岐型重合体に光を照射するなどして架橋反応させると、複数の第１次分岐型重合体が分子間架橋して、分子量の異なる様々な分子間架橋体が生成する。
【００２１】
本発明者らは、この第１次分岐型重合体又はその架橋体を分子量分画して、分子量と遺伝子導入活性との関係を調べたところ、Ｍｗ／Ｍｎが１．０〜１．５の画分に属する分岐型重合体又はその架橋体が高い遺伝子導入活性を示すことを見出した。
【００２２】
本発明はこのような知見に基いて達成されたものである。
【００２３】
［第１次分岐型重合体］
第１次分岐型重合体は、Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する芳香族化合物をイニファターとし、これにビニル系モノマーを光照射リビング重合させた分岐型重合体（以下「スター型分岐型重合体」或いは「スター型ポリマー」と称す場合がある。）である。
【００２４】
なお、本明細書において、イニファターとは、光照射によりラジカルを発生させる重合開始剤、連鎖移動剤としての機能と共に、成長末端と結合して成長を停止する機能、さらに光照射が停止すると重合を停止させる重合開始・重合停止剤として機能する分子のことである。
【００２５】
イニファターとなるＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する芳香族化合物としては、ベンゼン環に該Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基、好ましくはＮ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル基が３個以上分岐鎖として結合しているものが好適であり、具体的には次が例示される。即ち、３分岐鎖化合物としては、１，３，５−トリ（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，３，５−トリ（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、４分岐鎖化合物としては、１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、６分岐鎖化合物としては、ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られるヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンが挙げられる。なお、ここで、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル基に含まれるジアルキル部分のアルキル基としては、エチル基等の炭素数２〜１８個のアルキル基が好ましいが、アルキル基に限らず、フェニル基など芳香族系の炭化水素基であっても構わない。即ち、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル基に限らず、Ｎ，Ｎ−ジアリールジチオカルバミルメチル基等を含む、脂肪族炭化水素基及び／又は芳香族炭化水素基で置換されたＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基であれば目的を達成することができる。
【００２６】
上記のイニファターは、アルコール等の極性溶媒に対しては殆ど不溶であるが、非極性溶媒には易溶である。この非極性溶媒としては炭化水素、ハロゲン化炭化水素が好適であり、特に、ベンゼン、トルエン、クロロホルム又は塩化メチレン、中でも特にトルエンが好適である。
【００２７】
このイニファターに重合させるビニル系モノマーとしては、アクリル酸誘導体、スチレン誘導体等のビニル系モノマーが好適であり、具体的には３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣ３Ｈ６Ｎ（ＣＨ３）２、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ-ジメチルアクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド及びＮ−イソプロピルアクリルアミドの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種が挙げられ、特に、耐加水分解性に優れることから、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣ３Ｈ６Ｎ（ＣＨ３）２、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート等のカチオン性ビニル系モノマーが好ましい。これらのビニル系モノマーは１種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
【００２８】
イニファターと上記ビニル系モノマーとを反応させるには、イニファター及びビニル系モノマーを含んでなる原料溶液を調製し、これに光照射することによって、イニファターに対しビニル系モノマーが結合した反応生成物を生成させる。
【００２９】
該原料溶液中のビニル系モノマーの濃度は０．５Ｍ以上、例えば０．５Ｍ〜２．５Ｍが好適である。また、原料溶液中のイニファターの濃度は０．１〜１００ｍＭ程度が好適である。
【００３０】
照射する光の波長は３００〜４００ｎｍが好適であり、例えば低圧水銀灯や高圧水銀灯などを用いることができる。光の照射時間は照射強度にも依存するが、１〜６０分程度が好適であり、１μＷ／ｃｍ２〜１０ｍＷ／ｃｍ２程度の低い照射強度で１分〜３０分程度が特に好適である。
【００３１】
この光照射により、反応液中に目的とする分岐型重合体が生成するので、必要に応じ精製して第１次分岐型重合体としてのカチオン性ホモポリマー等のポリマーを得る。
【００３２】
この第１次分岐型重合体の分子量は分岐鎖の鎖数によるが、２，０００〜５００，０００、特に２，０００〜１５０，０００、とりわけ２，０００〜１００，０００程度が好ましい。
【００３３】
なお、本明細書において、分子量とは、特記しない限り、ＧＰＣ（ゲルパーミエーションクロマトグラフィー）によるポリエチレングリコール換算の数平均分子量をさす。
【００３４】
第１次分岐型重合体は、上記のホモポリマーであってもよく、さらに異なるモノマーを導入したブロック共重合体又はランダム共重合体であってもよい。例えば、上記ホモポリマーに対し、ホモポリマーの合成に用いたビニル系モノマーとは異なるビニル系モノマー、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、メトキシエチル（メタ）アクリレートなどを導入してもよい。また、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体をブロック共重合させて温度感応性ポリマーブロックを導入してもよい。
【００３５】
即ち、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体のポリマー鎖は、低温度では親水性、高温では疎水性となる温度依存性を有する。これにより遺伝子導入剤が上記温度応答性を具備するようになる。
【００３６】
なお、先に上記の「異なるポリマー」例えばＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド又はＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体等のポリマーよりなる分岐鎖を有した分岐型重合体を形成し、その後、各分岐鎖の先端側に前述のカチオン性ビニル系モノマーよりなるポリマーブロックを導入するようにしてもよい。
【００３７】
カチオン性ポリマーブロックにＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドあるいはＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体等をブロック共重合させるには、上記のようにして合成した分岐型重合体を好ましくはアルコール例えばメタノール等の溶媒に溶解させ、これにＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド又はＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体を混合し、光を照射して重合させればよい。この重合反応を開始する際の溶液中における分岐型重合体の濃度は０．０１〜１０重量％程度が好適であり、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド又はＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体の濃度は０．３〜３０重量％程度が好適である。光の照射条件は、光波長２５０〜４００ｎｍ、照射時間１〜１５０分、照射強度１００〜１０，０００μＷ／ｃｍ２程度が好適である。
【００３８】
このように分岐鎖をブロック又はランダム共重合体にて構成したスター型分岐型共重合体（スター型コポリマー）を第１次分岐型重合体として用いる場合、その重量平均分子量は３，０００〜６００，０００、特に３，０００〜１５０，０００であることが好ましい。
【００３９】
［第１次分岐型重合体の架橋］
本発明では、上記のように合成した第１次分岐型重合体架橋反応させて、これらが２〜１０個程度、好ましくは２〜５個程度架橋した架橋体としてもよい。この架橋反応では、分岐型重合体の分岐鎖のＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基のチオ基が開いて分岐鎖同士が架橋するものと推察される。この第１次分岐型重合体の架橋を行うには、次のｉ），ii），iii），iv）の方法を採用することができる。
【００４０】
ｉ)第１次分岐型重合体をベンゼン、トルエン、エタノールなど適宜の溶媒に溶解させ、加熱するか、光を照射することにより、分岐型重合体同士を架橋する。この架橋反応を開始させる際の溶液中の第１次分岐型重合体の濃度は１〜２０重量％程度が好適である。加熱条件は、３０〜３００℃、１分〜３０,０００時間程度が好適である。加熱の代わりに、又は加熱と共に、光照射することによっても架橋させることができる。光の照射条件は、光波長１８０〜７００ｎｍ、照射時間１分〜３０，０００時間、照射強度０．００１〜１０，０００μＷ／ｃｍ２程度が好適である。
【００４１】
ii）第１次分岐型重合体へ直接光照射や加熱処理を行うことによって分岐型重合体を架橋させる。この場合、ｉ)の溶媒へ溶解した溶液への処理と相違して、分岐型重合体の主鎖及び又は側鎖へ発生したラジカルが溶媒によって捕捉され、分岐型重合体の架橋反応が阻害されることを抑制することが可能となる。直接光照射を行う場合は、凍結乾燥粉末を霧状に攪拌して、ここへ光を照射することで均質な処理が可能となる。なお、第１次分岐型重合体をフィルム状に加工し、このフィルムへ処理を行うことも均質な架橋体を得る方法として好ましい。具体的には、ガラス板、金属板などの上へ第１次分岐型重合体の溶液、例えば、クロロホルム溶液を流延させ、ドクターナイフなどで液切りして均一な厚みとし、これを乾燥させることで均質なフィルムを形成させることが可能である。この場合の溶媒としては揮発性が高いメタノール、クロロホルムが好適である。
【００４２】
iii）常温又は冷却下に長期間保持することによって第１次分岐型重合体を架橋させる。例えば、４℃、−２０℃などの冷却下においても１５，０００時間程度の時間を経過すれば十分に架橋の効果が現れる。この場合、第１次分岐型重合体は凍結乾燥フィルムまたはフィルム状態で経時変化させることが好ましく、遮光状態でも蛍光灯程度の光が迷光として暴露されていても良い。凍結乾燥状態で経時変化をさせるのであれば、高分子量成分の乾燥重量で１．５ｇ／５０ｍＬ程度の密度とすることで均質な架橋体を得ることが可能である。
【００４３】
iv）固体状態の第１次分岐型重合体、好ましくはフィルム状の第１次分岐型重合体を液状エーテルに浸漬させた状態で光照射することにより、第１次分岐型重合体同士を架橋させる。
【００４４】
この場合の液状エーテルとしては、ジエチルエーテル、ジエチルエーテル、ジオクチルエーテル、メチルシクロヘキシルエーテル、ビス（メチルベンジル）エーテル、メチルブチルエーテル、ブチルヘキシルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、クラウンエーテル等が挙げられる。これらは１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００４５】
液状エーテルに浸漬させると、光架橋反応においてジチオカルバミル基から脱離して生成するジスルフィド化合物がエーテル中に拡散し、抽出除去されるようになる。ジスルフィド化合物を固層からエーテル中へ抽出除去することにより、効率的に架橋反応を行うことができる。
【００４６】
［その他の第１次分岐型重合体又はその架橋体の他の形態］
本発明の遺伝子導入剤を構成する第１次分岐型重合体は、前述のカチオン性ホモポリマー又はカチオン性コポリマーの他、次のようなものであっても良い。従って、本発明の遺伝子導入剤は、以下の第１次分岐型重合体を上述の方法で架橋した架橋体であっても良い。
【００４７】
＜カチオン性／疎水性ブロックコポリマー＞
前述の特定イニファターに対してまずカチオン性モノマーを光照射リビング重合させ、次いで疎水性モノマーを光照射リビングブロック共重合させることにより、基端側がカチオン性ポリマーブロック、先端側が疎水性ポリマーブロックで構成されたブロックコポリマー鎖よりなる分岐鎖を有する分岐型共重合体（ブロックコポリマー）。
【００４８】
ここで、特定イニファター、カチオン性モノマー、及びその光照射リビング重合方法としては、前述のカチオン性ホモポリマーのそれと同様である。
【００４９】
一方、疎水性モノマーとしては、特に、水溶液中で、疎水結合性に凝集する性質が必要であることから、側鎖に炭素数５以上、好ましくは炭素数５〜２０の非極性基、例えば、フェニル基、ベンジル基、オクチル基、オクタデシル基、フォロレニル基等を有するものが好ましく、このような疎水性モノマーとしては、４−ビニル安息香酸メチル、９−ビニルカルバゾール、スチレン、４−アセチルアミノスチレン等が挙げられるが、特に４−ビニル安息香酸メチルが好ましい。
なお、疎水性モノマーは、中性の水溶液で疎水性のものであれば良い。従って、酸又はアルカリ性で親水性の４−アミノスチレンや４−ビニル安息香酸であっても良い。
これらの疎水性モノマーは、１種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
【００５０】
カチオン性ホモポリマーに対し、疎水性モノマーを光照射リビング重合によりブロック共重合させるには、前述のようにして合成したカチオン性ホモポリマーをメタノール等の溶媒に溶解させ、これに疎水性モノマーを混合し、光を照射して重合させればよい。この重合反応を開始する際の溶液中におけるカチオン性ホモポリマーの濃度は０．０１〜１０重量％程度が好適であり、疎水性モノマーの濃度は０．３〜３０重量％程度が好適である。光の照射条件は、光波長２５０〜４００ｎｍ、照射時間１〜１５０分、照射強度１００〜１０，０００μＷ／ｃｍ２程度が好適である。
【００５１】
このブロックコポリマーの分子量は、これを構成するイニファター、カチオン性モノマー、及び疎水性モノマーの種類等によっても異なり、一概には言えないが、３，０００〜６００，０００、特に３，０００〜１５０，０００であることが好ましい。ポリマー材料の分子量が小さ過ぎると、本発明に好適な分岐型コポリマーの分子設計を十分に行うことができず、ポリマー材料の分子量が大き過ぎると、代謝性、生分解性などが劣る傾向にあり、好ましくない。
【００５２】
また、カチオン性ポリマーブロックの分子量は、カチオン性ポリマーブロックを構成するカチオン性モノマーの種類等によっても異なり、一概には言えないが、１５，０００〜３００，０００、特に３０，０００〜１５０，０００であることが好ましい。このカチオン性ポリマーブロックの分子量が小さ過ぎると遺伝子導入活性が劣る傾向にあり、大き過ぎると、ポリマー材料の分子量が徒に大きくなり、好ましくない。
【００５３】
また、疎水性ポリマーブロックの分子量は、疎水性ポリマーブロックを構成する疎水性モノマーの種類等によっても異なり、一概には言えないが、５，０００〜５０，０００、特に１０，０００〜２０，０００であることが好ましい。この疎水性ポリマーブロックの分子量が小さ過ぎると、分岐鎖が水溶液中で安定に分散し、以下のような自己環化現象が起こらず、大き過ぎると、ポリマー材料が乳化してマクロ粒子を形成してしまい、好ましくない。
【００５４】
このように、基端側がカチオン性ポリマーブロックで、先端側が疎水性ポリマーブロックのブロックコポリマー鎖よりなる分岐鎖を有する分岐型重合体であれば、この分岐鎖のカチオン性ポリマーブロックによってアニオン性のＤＮＡとイオン複合体を形成して、これを運搬する。この際、分岐鎖の先端側の疎水性ポリマーブロックは、おそらくは水溶液中において、水にはじかれて先端側の疎水性ポリマーブロック同士が互いの親和性により近接ないし結合し、一方で、分岐鎖の基端側のカチオン性ポリマーブロック部分は静電気的に互いに反発し合い、これにより、複数の分岐鎖が、鳥篭のようにカチオン性ポリマーブロックとイオン複合体を形成しているＤＮＡを包蔵して一分子ミセルを形成する自己環化現象で、高い遺伝子導入活性を示すようになる。
【００５５】
なお、細胞の細胞膜やエンドソーム膜は二重リン脂質を主成分に形成されており、疎水性物質は細胞膜を溶解するようにして膜を透過する性質がある。本発明の遺伝子導入剤は、疎水性ポリマーブロックを有しているので、細胞の細胞膜と融合するようにして細胞膜を透過し、細胞内へ遺伝子を運搬する効果が期待できる。
【００５６】
＜疎水性／カチオン性ブロックコポリマー＞
前述の特定イニファターに疎水性モノマーを光照射リビング重合させて疎水性ポリマーブロック鎖を形成させた後、さらに、カチオン性モノマーを光照射リビング重合させて、カチオン性ポリマーブロック鎖を形成させた、基端側が疎水性ポリマーブロック鎖で構成され、先端側がカチオン性ポリマーブロック鎖で構成された分岐鎖を有する分岐型重合体（ブロックコポリマー）。
【００５７】
ここで、特定イニファター、カチオン性モノマーとしては、前述のカチオン性ホモポリマーのそれと同様である。
また、２種類のモノマーを順次光照射リビング重合させる方法は、上述のカチオン性／疎水性ブロックコポリマーの場合と同様である。
【００５８】
疎水性モノマーとしては、炭素数が５以上、特に５〜２０の非極性基を有するものが好ましい。炭素数が５以上の非極性基としては、フェニル基、ベンジル基、オクチル基、オクタデシル基、フロレニル基等が挙げられる。
【００５９】
疎水性モノマーとしては、具体的には、９−ビニルカルバゾール、スチレン、４−アセチルアミノスチレン及び４−ビニル安息香酸メチルなどが挙げられる。また、酸性又は、アルカリ性条件下では親水性であっても、中性条件下では疎水性である４−アミノスチレン及び４−ビニル安息香酸などを用いることもできる。
【００６０】
これらの疎水性モノマーは、１種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。即ち、疎水性ポリマーブロック鎖は、２種以上の疎水性モノマーの共重合体であってもよい。
【００６１】
疎水性ポリマーブロックの分子量は、１，０００〜２０，０００程度、特に１，０００〜１０，０００程度が好ましい。
【００６２】
また、カチオン性ポリマーブロックの分子量は１５，０００〜３００，０００程度、特に３０，０００〜１５０，０００程度が好ましい。
【００６３】
カチオン性ポリマーブロック鎖の分子量が上記下限未満であると核酸のイオン凝集力が不足しやすく、分子量が上記上限を超えると細胞毒性が強く発現されやすい。
【００６４】
この疎水性／カチオン性ブロックコポリマーは、分岐鎖のカチオン性ポリマーブロック鎖が核酸を捕捉して包囲し、生体内の酵素による核酸の失活、分解を抑制することができる。
【００６５】
また、水に溶解すると疎水性ブロック鎖同士の間に吸引力ないし凝集力が生じ、複数個のスター型ポリマーが各々の中心部（芳香族環及び分岐鎖基端側）を重畳させる如くして集合ないし凝集し、スター型ポリマー複合体を構成するものと考えられる。このスター型ポリマー複合体は、１個のスター型ポリマーの分岐鎖をｎとして、集合したスター型ポリマーの数をｍとした場合、中心部からｎ×ｍ本の分岐鎖が放射方向に伸延した、分岐鎖の数が著しく多いものとなる。
【００６６】
また、このスター型ポリマー複合体の各分岐鎖の末端側は、カチオン性であり、互いに反発するので、各分岐鎖は、相互間に距離をあけて、スター型ポリマー複合体の中心部から放射方向に伸延する。
【００６７】
このように、放射状に伸延したスター型ポリマー複合体は、単独で存在する１個のスター型ポリマーに比べて、ＤＮＡの包蔵能力が著しく高いものとなる。
【００６８】
このスター型ポリマー複合体は、水溶液中において疎水性ポリマーブロック鎖をカチオン性ブロック鎖が包囲するミセルを形成するものと推察される。また、このスター型ポリマー複合体は、カチオン性ポリマーブロック鎖同士が電荷によって反発して伸延するため、３次元のデンドリマー様のミセルを形成するものと考えられる。
【００６９】
このスター型ポリマーは、疎水性ポリマーブロック鎖を有しているので、エンドソーム膜を効率よく、脂質融合するように透過して核へ外来遺伝子を運搬する作用も奏し得るものと考えられる。
【００７０】
＜非イオン性／カチオン性ブロックコポリマー＞
前述の特定イニファターに、非イオン性モノマーを光照射リビング重合させて非イオン性ポリマーブロック鎖を形成させた後、さらに、カチオン性モノマーを光照射リビング重合させてカチオン性ポリマーブロック鎖を形成させた、基端側が非イオン性ポリマーブロック鎖で構成され、先端側がカチオン性ポリマーブロック鎖で構成された分岐鎖を有する分岐型重合体（ブロックコポリマー）。
【００７１】
ここで、特定イニファター、カチオン性モノマーとしては、前述のカチオン性ホモポリマーのそれと同様である。
また、２種類のモノマーを順次光照射リビング重合させる方法は、前述のカチオン性／疎水性ブロックコポリマーの場合と同様である。
【００７２】
非イオン性モノマーとしては、この非イオン性モノマーの重合体が水溶液中において静電気的、疎水結合的又は立体的に干渉し合うことがないものであればどのようなモノマーでもよく、例えば、炭素数が１０以下、特に５〜８の非イオン性モノマーを挙げることができ、具体的には、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート及び２−メトキシエチル（メタ）アクリレート等を挙げることができる。
【００７３】
これらの非イオン性モノマーは、１種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。即ち、非イオン性ポリマーブロック鎖は、２種以上の非イオン性モノマーの共重合体であってもよい。
【００７４】
この非イオン性ポリマーブロック鎖よりなる分岐鎖の好ましい分子量は１００〜５００００であり、特に好ましい分子量は１００〜１００００であり、さらに好ましい分子量は１００〜５０００である。この非イオン性ポリマーブロック鎖は、核酸とは結合しないポリマーブロック鎖であるので、生分解、代謝、排泄の観点から、できるだけ短いほうが好ましい。
【００７５】
また、カチオン性ポリマーブロック鎖の分子量は３，０００〜３００，０００程度、特に１５，０００〜１５０，０００程度が好ましい。カチオン性ポリマーブロック鎖の分子量が上記下限未満であると、カチオン性ポリマーブロックによる核酸の吸着効果を十分に得ることができず、分子量が上記上限を超えると得られる遺伝子導入剤の分子量が大きくなりすぎ、細胞障害性の面で好ましくない。
【００７６】
非イオン性／カチオン性ブロックコポリマーは、分岐鎖の基端側が非イオン性ポリマーブロックによって構成されているため、分岐鎖の基端側において、分岐鎖同士が電気的斥力によって反発することがなく、分岐鎖の動きが制限されにくく、各分岐鎖の運動自由度が大きい。
【００７７】
また、各分岐鎖の先端側は、カチオン性モノマーにより構成されているが、非イオン性ポリマーブロック鎖の長さの分だけ核から離れているため、カチオン性ポリマーブロック鎖の相互間の距離が遠くなっている。従って、カチオン性ポリマーブロック同士の反発力が小さく、カチオン性ポリマーブロック鎖の運動自由度が大きい。即ち、核に直接カチオン性モノマーを重合した遺伝子導入剤よりもカチオン性ポリマーブロック鎖の運動自由度が大きく、核酸の包蔵能力が高いものである。
【００７８】
＜カチオン性ポリマーブロック部分に疎水基を含む側鎖を有するカチオン性ポリマー＞
前述の特定イニファターに少なくともカチオン性モノマーを光照射リビング重合させて得られた分岐型重合体のカチオン性ポリマーブロックに疎水基を導入したもの。この場合、この分岐型重合体を第１次分岐型重合体として架橋反応させた架橋体とすることが有効である。
【００７９】
ここで、特定イニファター、カチオン性モノマー及びその光照射リビング重合方法としては、前述のカチオン性ホモポリマーのそれと同様である。
【００８０】
カチオン性ポリマーブロック部分への疎水基を有する側鎖の導入は、以下の方法に従って、架橋反応と同時に行うことが好ましい。
即ち、疎水基導入のために１次分岐型重合体に反応させる化合物としてベンジル（Ｎ，Ｎ−ジアルキル）ジチオカルバメート等のベンジル（Ｎ，Ｎ−ジ置換）ジチオカルバメートを用い、これと１次分岐型重合体との混合物、好ましくはペースト状混合物に光照射することにより、１次分岐型重合体のカチオン性ポリマーブロックの側鎖に疎水基を導入すると共に、１次分岐型重合体を架橋反応させる。
【００８１】
即ち、この方法であれば、光照射により、ベンジル（Ｎ，Ｎ−ジ置換）ジチオカルバメートのベンジルラジカルが生成し、これが１次分岐型重合体のカチオン性ポリマーブロックの側鎖、例えば、カチオン性ポリマーブロックを構成するカチオン性モノマーである３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドのプロピル鎖部分に付加反応して、この３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドで構成される側鎖にベンジル基の疎水基が導入される。同時に、１次分岐型重合体は光照射により、分岐鎖のＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミル基のチオ基が開いて分岐鎖同士が架橋することにより架橋体が生成する。
【００８２】
疎水基導入のための化合物として液体のベンジル（Ｎ，Ｎ−ジ置換）ジチオカルバメートを用いることにより、このベンジル（Ｎ，Ｎ−ジ置換）ジチオカルバメートと１次分岐型重合体とでペースト状の混合物とすることが可能となり、この混合ペーストに対して、均質な光照射を行って、効率的なベンジル基の付加反応と架橋反応を行うことができる。
【００８３】
ここで用いるベンジル（Ｎ，Ｎ−ジ置換）ジチオカルバメートとしては、特に、エチル基等の炭素数２〜１８個のアルキル基で置換されたベンジル（Ｎ，Ｎ−ジアルキル）ジチオカルバメートが好ましいが、この置換基はアルキル基に限らず、フェニル基など芳香族系の炭化水素基であっても構わない。即ち、ベンジル（Ｎ，Ｎ−ジアルキル）ジチオカルバメートに限らず、ベンジル（Ｎ，Ｎ−ジアリール）ジチオカルバメートの脂肪族炭化水素基及び／又は芳香族炭化水素基で置換されたベンジル（Ｎ，Ｎ−ジ置換）ジチオカルバメートであれば目的を達成することができる。
なお、ベンジル（Ｎ，Ｎ−ジ置換）ジチオカルバメートのベンジル基のベンゼン環は、その疎水性や反応性に影響しないメチル基等の置換基で置換されていても良い。
【００８４】
このようなベンジル（Ｎ，Ｎ−ジ置換）ジチオカルバメートと１次分岐型重合体とを混合してペースト化する際の混合割合は、光照射効率と取り扱い性に優れたペースト状混合物が得られれば良く、特に制限はないが、通常、１次分岐型重合体に対して１〜２０重量倍のベンジル（Ｎ，Ｎ−ジ置換）ジチオカルバメートを混合することが好ましい。
【００８５】
このような混合ペーストへの光の照射条件は、光波長１８０〜７００ｎｍ、照射時間１分〜３０，０００時間、照射強度０．００１〜１０，０００μＷ／ｃｍ２程度が好適である。
【００８６】
このようにして得られる架橋体の分子量は３０，０００〜３００，０００、特に５０，０００〜１５０，０００であることが好ましい。
また、架橋体に導入されるベンジル基等の疎水基の数は、架橋前の１次分岐型重合体の１分子当たり３〜３００個程度であることが好ましい。
【００８７】
ここで、１次分岐型重合体や架橋体の分子量が小さ過ぎると核酸を凝集する能力に欠け、大き過ぎると細胞毒性が強くなり好ましくない。
また、疎水基の導入量が少な過ぎると疎水基を導入したことによる細胞透過性の向上効果を十分に得ることができず、多過ぎると、分岐型重合体の疎水性が強くなり過ぎて、核酸の凝縮作用が劣る傾向にある。
【００８８】
即ち、このカチオン性ポリマーの架橋体では、分岐型重合体のカチオン性ポリマーブロック部分に疎水基を有し、かつ分岐型重合体が架橋された架橋体よりなるため、その構造上の利点により、ＤＮＡなどの核酸を高密度に凝縮することができる。即ち、この架橋体は、分岐型重合体が複数個架橋したものであるため、１個の分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤に比べてＤＮＡなどの核酸をより広いネットワークで包蔵することができ、優れた遺伝子導入活性を示すようになる。しかも、分岐型重合体のカチオン性ポリマーブロック部分に疎水基が導入されていることによる良好な細胞透過性を有し、エンドソーム膜を効率よく、脂質融合するように透過して核へ外来遺伝子を運搬する。
【００８９】
＜感温性／カチオン性ブロックコポリマー＞
前述の特定イニファターに、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体を光照射リビング重合させてそのポリマーブロック鎖を形成した後、さらに、カチオン性モノマーを光照射リビング重合させてカチオン性ポリマーブロック鎖を形成し、基端側がＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体のポリマーブロック（以下、「感温性ポリマーブロック」と称す場合がある。）で、先端側がカチオン性ポリマーブロックのブロックコポリマーよりなる分岐鎖を形成した分岐型重合体（ブロックコポリマー）。
【００９０】
このカチオン性分岐型重合体に導入されたＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体は、生体温度よりも低温の所定温度（Ｔ）よりも低い温度では親水性であるが、該所定温度（Ｔ）よりも高い温度環境下に置くと、相転移して疎水性となる温度感応性のモノマーである。即ち、このブロックコポリマーは、核となる芳香族環に温度感応性モノマーであるＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体を重合させた後、カチオン性モノマーを重合させたものである。この遺伝子導入剤は、従って、該所定温度（Ｔ）よりも高い状態にあるときには、スター型ポリマーの分岐鎖の基端側は疎水性ポリマーブロック鎖にて構成され、それよりも先端側はカチオン性ポリマーブロック鎖にて構成されたものとなる。
【００９１】
このブロックコポリマーは、カチオン性ポリマーブロック鎖が、アニオン性の核酸を捕捉して包蔵する。また、この遺伝子導入剤は、上記所定温度（Ｔ）よりも高い温度の水溶液中において、分岐鎖の基端側を構成している各疎水性ポリマーブロック鎖同士の間に吸引力ないし凝集力が生じ、複数個のスター型ポリマーが各々の中心部（芳香環及び分岐鎖基端側）を重畳させる如くして集合ないし凝集し（以下、この現象を「分子間凝集現象」と称す場合がある。）、デンドリマー様のスター型ポリマー複合体を構成するものと考えられる。このスター型ポリマー複合体は、１個のスター型ポリマーの分岐鎖をｎとして、集合したスター型ポリマーの数をｍとした場合、中心部からｎ×ｍ本の分岐鎖が放射方向に伸延した、分岐鎖の数が著しく多いものとなる。
【００９２】
また、このスター型ポリマー複合体の各分岐鎖の末端側は、カチオン性であり、互いに反発するので、各分岐鎖は、相互間に距離をあけて、スター型ポリマー複合体の中心部から放射方向に伸延する。
このように、放射状に伸延したスター型ポリマー複合体は、単独で存在する１個のスター型ポリマーに比べて、ＤＮＡの包蔵能力が著しく高いものとなる。
このようなことから、遺伝子導入効率に優れた核酸複合体を製造することができる。
【００９３】
なお、生体温度よりも低温度の所定温度（Ｔ）とは、２５〜３５℃、例えば３０℃前後であることが好ましく、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドのポリマーブロック鎖を導入した場合には、通常、この所定温度（Ｔ）は約３０℃である。
【００９４】
ここで、特定イニファター、カチオン性モノマーとしては、前述のカチオン性ホモポリマーのそれと同様である。
また、２種類のモノマーを順次光照射リビング重合させる方法は、前述のカチオン性／疎水性ブロックコポリマーの場合と同様である。
【００９５】
このブロックコポリマーよりなるカチオン性分岐型重合体の分子量は、これを構成するイニファター、カチオン性モノマー、及びＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体の種類等によっても異なり、一概には言えないが、３，０００〜１，０００，０００、特に１５，０００〜１５０，０００であることが好ましい。カチオン性分岐型重合体の分子量がこの範囲外であると核酸複合体を生成しにくく、特に、カチオン性分岐型重合体の分子量が小さ過ぎると、好適な分岐型コポリマーの分子設計を十分に行うことができず、カチオン性分岐型重合体の分子量が大き過ぎると、代謝性、生分解性などが劣る傾向にあり、好ましくない。
【００９６】
また、カチオン性分岐型重合体中の感温性ポリマーブロック及びカチオン性ポリマーブロックの各々の分子量についても、各々のポリマーブロックを構成するモノマーの種類等によっても異なり、一概には言えないが、感温性ポリマーブロックの分子量は１，０００〜１０，０００、特に３，０００〜８，０００であり、カチオン性ポリマーブロックの分子量は１５，０００〜１５０，０００であることが好ましい。
【００９７】
感温性ポリマーブロックの分子量が小さ過ぎると、上述のカチオン性分岐型重合体の好適な分子量範囲において、生体温度よりも低温の所定温度（Ｔ）、例えば３０℃以上の温度でも水溶液中で安定してしまい、前述の分子間凝集現象が起こらず、大き過ぎると、カチオン性分岐型重合体の水に対する親和性が低過ぎて、水中で乳化してマクロ粒子を形成してしまい、好ましくない。
【００９８】
また、カチオン性ポリマーブロックの分子量が小さ過ぎると遺伝子導入活性が劣る傾向にあり、大き過ぎると、カチオン性分岐型重合体の分子量が徒に大きくなり、好ましくない。
【００９９】
＜カチオン性／アニオン性ブロックコポリマー＞
前述の特定イニファターにカチオン性モノマーを光照射リビング重合させてカチオン性ポリマーブロック鎖を形成させた後、さらに、アニオン性モノマーを光照射リビング重合させて、アニオン性ポリマーブロック鎖を形成させ、基端側がカチオン性ポリマーブロック鎖で構成され、先端側がアニオン性ポリマーブロック鎖で構成された分岐鎖を有する分岐型重合体（ブロックコポリマー）。或いは、逆に、前述の特定イニファターにアニオン性モノマーを光照射リビング重合させてアニオン性ポリマーブロック鎖を形成させた後、さらに、カチオン性モノマーを光照射リビング重合させて、カチオン性ポリマーブロック鎖を形成させ、基端側がアニオン性ポリマーブロック鎖で構成され、先端側がカチオン性ポリマーブロック鎖で構成された分岐鎖を有する分岐型重合体（ブロックコポリマー）。
ただし、いずれの場合も、カチオン性ポリマーブロックの重合度がアニオン性ポリマーブロックの重合度よりも大きく、複数の分岐鎖が多価陽イオンを介して架橋されている。アニオン性ポリマーブロックは酸性官能基を有した側鎖を有する分岐型重合体が、複数個、多価陽イオンを介して架橋されたものであっても良い。
【０１００】
ここで、特定イニファター、カチオン性モノマーとしては、前述のカチオン性ホモポリマーのそれと同様である。
また、２種類のモノマーを順次光照射リビング重合させる方法は、前述のカチオン性／疎水性ブロックコポリマーの場合と同様である。
【０１０１】
酸性官能基としてはカルボキシル基が好適であり、酸性官能基を有したアニオン性モノマーとしては、カルボキシスチレン具体的には４−ビニル安息香酸（４−カルボキシスチレン）又は３，４−カルボキシスチレンなどのカルボキシビニルベンゼンが好適である。なお、カルボキシビニルベンゼンは置換基を有していてもよい。
【０１０２】
カチオン性ポリマーブロックの重合度はアニオン性ポリマーブロックの重合度の２〜１００倍が好適である。
【０１０３】
なお、モノマーとして、カチオン性モノマーと、アニオン性モノマーと、非イオン性モノマーとを用いても良く、この場合、イニファターに対する重合の順序は、任意である。即ち、１つの分岐鎖を構成するカチオン性ブロック、アニオン性モノマーのブロック、非イオン性ポリマーブロックの配列順序は任意である。
【０１０４】
非イオン性モノマーとしては、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールアルキルエステル（メタ）アクリレート、ポリビニルピロリドンなどを用いることができる。非イオン性ポリマーブロックの分子量は、２，０００〜５００，０００が好適である。
【０１０５】
架橋部分の多価陽イオンとしては多価金属イオン特に２価の金属イオンとりわけカルシウムイオン及び／又はマグネシウムイオンが好適である。
【０１０６】
多価陽イオンを介して分岐型重合体同士を架橋させるには、多価陽イオン好ましくは多価陽イオンの塩の水溶液を分岐型重合体の水溶液に添加し、常温又は加温下で１０〜６０分程度撹拌するのが好ましい。この塩としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、りん酸塩、炭酸塩、カルボン酸塩などが好適であり、具体的には塩化カルシウム、塩化マグネシウムが好ましい。この塩の水溶液の濃度は通常は０．１ｗｔ％〜飽和濃度程度が好ましい。添加する塩の量は、分岐型重合体の酸性官能基の当量の０．１倍〜１０倍程度が好ましい。
【０１０７】
架橋反応させた後は、水を透析液として透析処理し、未反応の塩や残留する酸根を除去するのが好ましい。
【０１０８】
このようにして生成したカチオン性ポリマーブロックを有したブロックコポリマーの架橋体が核酸を核酸含有複合体として包囲することによって、生体内の酵素による核酸の失活、分解を抑制することができる。
【０１０９】
このブロックコポリマーは、強酸性のエンドソーム内でイオン結合の破壊によって解離して、イオン複合体からの遺伝子を拡散を促進できるほか、ポリマー自体も低分子量化が進み、細胞外への排除が容易に行われる。すなわち、ＤＮＡとの混合時、細胞への作用時である生理的ｐＨにおいては、多価陽イオンのキレーションによる分子間架橋を維持しているが、細胞内へ取り込まれた後、強酸性のエンドソーム内ではこのキレーションによる分子間結合は容易に解離し、架橋前のスター型ポリマーへ可逆的に戻ることができる。
【０１１０】
なお、アニオン性ブロック鎖がｐＫａ＝１〜６程度のカルボキシル基などの酸性官能基を側鎖に有するものである場合、強酸性のエンドソーム内で疎水変性し、エンドソームからの脱出効率の向上をも期待することができる。
【０１１１】
＜カチオン性／アニオン性低級アルキルエステルランダムコポリマー＞
前述の特定イニファターに、カチオン性モノマーと、アニオン性モノマーの低級アルキルエステルとをランダム共重合させた分岐型重合体（ランダムコポリマー）。
【０１１２】
このように、カチオン性モノマーとアニオン性モノマーの低級アルキルエステルとのランダム共重合部分を有するランダムコポリマーのエステル部分は、ＤＮＡとの混合時、細胞への作用時である生理的ｐＨにおいては、電気的に中性なエステルのままとなっているが、細胞内へ取り込まれた後、強酸性のエンドソーム内ではこのエステル部分が加水分解し、酸性基となる。これにより、ランダムコポリマーのカチオン性モノマー由来の正電荷が電気的に中和されるようになり、ポリプレックスが崩解し易くなる。この結果、ポリプレックスからの核酸の放出が促進される。
【０１１３】
特に、アニオン性モノマーの低級アルキルエステルとして、４−ビニル安息香酸等の芳香族カルボン酸の低級アルキルエステルを用いると、製造されたランダムコポリマーのエステル部分が加水分解によりｐＫａ＝１〜６程度の酸性官能基（カルボキシル基）を側鎖に有するものとなり、強酸性のエンドソーム内でのポリプレックスの崩解が促進される。
【０１１４】
特定イニファターに重合させるカチオン性モノマーとしては、アクリル酸誘導体、スチレン誘導体等のビニル系モノマーが好適であり、特に、耐加水分解性に優れることから、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣ３Ｈ６Ｎ（ＣＨ３）２が好ましい。
【０１１５】
アニオン性モノマーの低級アルキルエステルとしては、ビニル基を有する芳香族カルボン酸の低級アルキルエステルが好適であり、特に４−ビニル安息香酸（４−メトキシカルボニルスチレン）又は３，４−ジメトキシカルボニルスチレンなどのビニルベンゼンカルボン酸と低級アルキルとのエステルが好適である。なお、ビニルベンゼンカルボン酸はその他の置換基を有していてもよい。また、低級アルキルエステルのアルキル基としては、炭素数１〜８のアルキル基、特にメチル基及びエチル基が好適である。
【０１１６】
前述の特定イニファターに対し、カチオン性モノマーとアニオン性モノマーの低級アルキルエステルとをランダム共重合させるには、イニファター及び各モノマーを含んでなる原料溶液を調製し、これに光照射する。この溶液の溶媒としては、アルカン、アルケン、アロマチック、ハロゲン化炭化水素が好適であり、具体的にはベンゼン、トルエン、クロロホルム、四塩化炭素又は塩化メチレンが挙げられ、中でもトルエン又はクロロホルムが好適である。
【０１１７】
カチオン性モノマー及びアニオン性モノマーの該原料溶液中の濃度は各々０．５Ｍ以上、例えば０．５〜２．５Ｍが好適である。イニファターの濃度は０．１〜１００ｍＭ程度が好適である。
【０１１８】
照射する光の波長は３００〜４００ｎｍが好適であり、例えば低圧水銀灯や高圧水銀灯などを用いることができる。光の照射時間は照射強度にも依存するが、１〜６０分程度が好適であり、１μＷ／ｃｍ２〜１０ｍＷ／ｃｍ２程度の低い照射強度で１分〜３０分程度が特に好適である。
【０１１９】
このようにして得られるカチオン性モノマーとアニオン性モノマーの低級アルキルエステルのランダム共重合部分を有した分岐型重合体の分子量は分岐鎖の鎖数にもよるが、３，０００〜６００，０００、特に３，０００〜１５０，０００程度であることが好ましい。
【０１２０】
なお、カチオン性モノマー由来の単位成分の数が５０〜１，０００であり、上記低級アルキルエステルモノマー由来の単位成分の数が５〜１，０００であり、カチオン性モノマー由来の単位成分の数が上記低級アルキルエステルモノマー由来の単位成分の数の０．５〜１００倍であることが好ましい。
【０１２１】
＜カチオン性ポリマーブロックを架橋反応させてなる架橋体＞
前述の特定イニファターに、カチオン性モノマーを光照射リビング重合させてカチオン性ポリマーブロックを形成し、さらに非イオン性モノマーを光照射リビング重合させると共に、少なくとも一部の分岐鎖のＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基を失活させてなる第１次分岐型重合体の、カチオン性ポリマーブロック部位を架橋反応させてなる架橋体。
【０１２２】
特定イニファターに重合させるカチオン性モノマーとしては、アクリル酸誘導体、スチレン誘導体等のカチオン性モノマーが好適なものとして挙げられるが、このカチオン性モノマーにより形成されるカチオン性ポリマーブロックが、架橋性を有すること、好ましくは光に感光して自己架橋（光解裂性官能基非由来性の架橋）する性質のものであることが必要であり、そのために、このカチオン性モノマーとしては、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣ３Ｈ６Ｎ（ＣＨ３）２等の自己架橋性カチオン性ビニル系モノマーが好ましい。
【０１２３】
一方、非イオン性モノマーとしては、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド等のＮ，Ｎ−ジアルキル（このアルキル基の炭素数は１〜５が好ましい。）アクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールアルキルエステル（メタ）アクリレート、ポリビニルピロリドンなどを用いることができる。これらの非イオン性モノマーは、１種を単独で用いても良く、２種以上を併用しても良い。
【０１２４】
イニファターと上記カチオン性モノマーとを反応させる方法は、前述のカチオン性ホモポリマーの場合と同様である。
【０１２５】
得られたカチオン性ホモポリマーに対し、非イオン性モノマーを光照射リビング重合させると共に、少なくとも一部の分岐鎖のＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基を失活させて目的とする第１次分岐型重合体とする。
【０１２６】
ここで、分岐鎖のＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基を失活させる方法としては、
(1) アルカリ触媒の存在下に加水分解させることによりＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基を除去する方法
(2) 非イオン性モノマーの光照射リビング重合時に、反応溶媒としてクロロホルム、塩化メチレンなどの連鎖移動性の溶媒を用い、光照射時にＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基を脱離させる方法
(3) Ｎ,Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチルベンゼンの存在下で希薄溶液で光照射を行ってＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基を脱離させる方法
(4) アスコルビン酸、安息香酸、システイン、メルカプトエタノール、酸素ガスなどのラジカル捕捉剤として周知の化合物の溶液中で光照射を行ってＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基を脱離させる方法
などが挙げられるが、非イオン性モノマーの光照射リビング重合時に併せてＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基の失活も行えることから、上記(2)の方法を採用することが好ましい。
【０１２７】
上記(2)の方法を採用して、前述のカチオン性ホモポリマーに非イオン性モノマーを光照射リビング重合によりブロック共重合させると共に、Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基を失活させるには、上記のようにして得られたカチオン性ホモポリマーを、クロロホルム、塩化メチレン、クロロベンゼン、ジクロロベンゼン等の連鎖移動性の溶媒に溶解させ、これに非イオン性モノマーを混合し、光を照射して重合させればよい。この重合反応を開始する際の溶液中におけるカチオン性ホモポリマーの濃度は０．０１〜１０重量％程度が好適であり、非イオン性モノマーの濃度は０．３〜３０重量％程度が好適である。光の照射条件は、光波長２５０〜４００ｎｍ、照射時間１〜１５０分、照射強度１００〜１０，０００μＷ／ｃｍ２程度が好適である。
【０１２８】
このようにして、イニファターに対してまずカチオン性モノマーを光照射リビング重合させ、次いで非イオン性モノマーを光照射リビングブロック共重合させると共にＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基を失活させることにより、基端側がカチオン性ポリマーブロック、先端側が非イオン性ポリマーブロックで構成され、かつ先端のＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基が失活することにより、分岐鎖の先端部分の光架橋性が消失ないしは低減されたブロックコポリマー鎖よりなる分岐鎖を有する第1次分岐型重合体（ブロックコポリマー）を得ることができる。
【０１２９】
このブロックコポリマーよりなる第1次分岐型重合体の分子量は、分岐鎖の数、これを構成するイニファター、カチオン性モノマー、及び非イオン性モノマーの種類等によっても異なり、一概には言えないが、１５，０００〜１，５００，０００、特に３０，０００〜３００，０００であることが好ましい。第1次分岐型重合体の分子量が小さ過ぎると、本発明に好適な分岐型重合体の分子設計を十分に行うことができず、第1次分岐型重合体の分子量が大き過ぎると、代謝性、生分解性などが劣る傾向にあり、好ましくない。また、第1次分岐型重合体を構成する前述のカチオン性ポリマーブロックの分子量及び、このカチオン性ホモポリマーに導入される非イオン性ポリマーブロックについても、分岐鎖の数や各々のポリマーブロックを構成するモノマーの種類等によって異なり、一概には言えないが、カチオン性ポリマーブロックの分子量は１５，０００〜３００，０００、特に３０，０００〜８０，０００で、非イオン性ポリマーブロックの分子量は１５，０００〜１５０，０００、特に３０，０００〜１００，０００であることが好ましい。カチオン性ポリマーブロックの分子量が小さ過ぎると核酸の吸着効果が低く、大き過ぎると細胞毒性が強くなり好ましくない。また、非イオン性ポリマーブロックの分子量が小さ過ぎると非イオン性ポリマーブロックを導入したことによる陽電荷の遮蔽効果を十分に得ることができず、大き過ぎると核酸とのイオン凝集を阻害してしまう。
【０１３０】
得られた第１次分岐型重合体のカチオン性ポリマーブロック部分を架橋反応させて架橋体とする架橋反応は、第1次分岐型重合体に光照射することによる光架橋反応で行うことが好ましい。
この第1次分岐型重合体の光架橋を行うには、次のｉ）又はii）の方法を採用することができる。
【０１３１】
ｉ)第１次分岐型重合体をメタノールなど適宜の溶媒に溶解させ、光を照射することにより、第1次分岐型重合体を架橋する。この架橋反応を開始させる際の溶液中の第１次分岐型重合体の濃度は０．０１〜１０重量％程度が好適である。
【０１３２】
ii）第１次分岐型重合体へ直接光照射を行うことによって分岐型重合体を架橋させる。この場合、ｉ)の溶媒へ溶解した溶液への処理と相違して、分岐型重合体の主鎖及び又は側鎖へ発生したラジカルが溶媒によって捕捉され、分岐型重合体の架橋反応が阻害されることを抑制することが可能となる。直接光照射を行う場合は、凍結乾燥粉末を霧状に攪拌して、ここへ光を照射することで均質な処理が可能となる。なお、第１次分岐型重合体をフィルム状に加工し、このフィルムへ処理を行うことも均質な架橋体を得る方法として好ましい。具体的には、ガラス板、金属板などの上へ第１次分岐型重合体の溶液、例えば、クロロホルム溶液を流延させ、ドクターナイフなどで液切りして均一な厚みとし、これを乾燥させることで均質なフィルムを形成させることが可能である。この場合の溶媒としては揮発性が高いメタノール、クロロホルムが好適である。
【０１３３】
第１次分岐型重合体の形状としてフィルム状を採用した場合、フィルムの厚さは１０μｍ〜２０００μｍ程度、特に５０μｍ〜１０００μｍ程度が好ましい。極端にフィルムが薄いと架橋効率が悪く、また極端にフィルムが厚いと光照射の効果が十分に得られない。
【０１３４】
また、第１次分岐型重合体の形状を粉末状にした場合、粉末の粒径は０．１〜１０００μｍ程度特に１００〜５００μｍ程度が好ましい。粒径を極端に小さくすることは困難であるが、逆に粒径を大きくした場合は光照射の効果及び光架橋効率が低下する。
【０１３５】
光の照射条件は、光波長３００〜４００ｎｍ、照射時間１〜３００分、照射強度０．１〜１０ｍＷ／ｃｍ２程度が好適である。
【０１３６】
このような光照射により、第１次分岐型重合体に含まれる自己架橋性のカチオン性ポリマーブロックが架橋反応を起こし架橋体が得られる。
【０１３７】
なお、この架橋反応で得られる架橋体の分子量（数平均分子量）には特に制限はないが、通常３０，０００〜３００，０００程度である。この分子量が小さ過ぎると第１次分岐型重合体を架橋したことによる本発明の効果を十分に得ることができず、大き過ぎると代謝性、生分解性などが劣るものとなる。
【０１３８】
この架橋体は、第１次分岐型重合体の末端の少なくとも一部のＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基が失活していることにより、その第１次分岐型重合体の分岐鎖の基端側のカチオン性ポリマーブロック同士が架橋してなる架橋体であると推察されるが、本発明者らによる種々の研究の結果、この遺伝子導入剤は、その構造上の利点により、第１次分岐型重合体よりもＤＮＡなどの核酸を高密度に凝縮することができることが認められた。
【０１３９】
即ち、この架橋体は、カチオン性の第１次分岐型重合体が複数個架橋したものであるため、１個のカチオン性分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤に比べて、その分岐鎖が入り組んだ複雑な３Ｄ構造により、ＤＮＡなどの核酸をより広いネットワークで包蔵することができ、優れた遺伝子導入活性を示すようになる。
【０１４０】
しかも、この第１次分岐型重合体の分岐鎖の基端側のカチオン性ポリマーブロックの先端側に非イオン性ポリマーブロックが形成されているため、この架橋体と核酸とを複合させた核酸複合体微粒子の粒子外周面にこの非イオン性ポリマーブロックが存在することにより、核酸複合体微粒子への血清タンパクの吸着が抑制される。即ち、カチオン性ポリマーブロックを内郭に配置してその外層へ非イオン性ポリマーブロックを配置することで、陽電荷を遮蔽し、水溶液中で斥力を働かせる分子設計がなされる。
【０１４１】
＜カチオン性ホモポリマーを非イオン性架橋鎖を介して架橋した架橋体＞
ここで、カチオン性ホモポリマーとは、前述の特定イニファターにカチオン性モノマーを光照射リビング重合して得られるものである。このカチオン性ホモポリマーを非イオン性架橋鎖を介して架橋した架橋体は、その構造上の利点により、ＤＮＡなどの核酸を高密度に凝縮することができる。すなわち、この架橋体は、カチオン性分岐型重合体が複数個架橋したものであるため、１個のカチオン性分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤に比べてＤＮＡなどの核酸をより広いネットワークで包蔵することができ、優れた遺伝子導入活性を示すようになる。
【０１４２】
また、このカチオン性分岐型重合体同士を架橋する架橋鎖が非イオン性であり、この架橋体と核酸とを複合させた核酸複合体微粒子の粒子外周面にこの非イオン性架橋鎖が存在することにより、核酸複合体微粒子への血清タンパクの吸着が抑制される。
【０１４３】
なお、カチオン性分岐型重合体同士を架橋する非イオン性架橋鎖のカチオン性分岐鎖への結合位置は分岐鎖の中間でも末端でも良く、また、カチオン性分岐鎖を構成する主鎖、側鎖、主鎖末端のいずれでも良い。
【０１４４】
カチオン性ホモポリマーの架橋を行うには、カチオン性ホモポリマーと、非イオン性架橋鎖導入のための非イオン性化合物（「架橋用化合物」と称す。）とをメタノール、クロロホルムなど適宜の溶媒に溶解させ、加熱するか、光を照射することにより、非イオン性架橋鎖を介してカチオン性スター型ポリマー同士を架橋するのが好ましい。
【０１４５】
この架橋反応を開始させる際の溶液中のカチオン性スター型ポリマーの濃度は０．０１〜１０重量％程度が好適であり、架橋用化合物の濃度は１０〜９９重量％程度が好適である。熱架橋させる場合の加熱条件は、３０〜３００℃、１分〜３０,０００時間程度が好適である。加熱の代わりに、又は加熱と共に、光照射することによっても架橋させることができる。光の照射条件は、光波長１８０〜７００ｎｍ、照射時間１分〜３０，０００時間、照射強度０．００１〜１０，０００μＷ／ｃｍ２程度が好適である。光架橋させる場合、カチオン性スター型ポリマーと架橋用化合物との混合溶液をガラス等の透明プレート上に流延させて乾燥させた後、３００〜４００ｎｍの光を１０秒〜５００時間程度照射するのが好ましい。
なお、光架橋のための光照射に際しては、カチオン性スター型ポリマーと架橋用化合物との混合溶液を凍結乾燥するなどして粉末化し、この粉末状態のカチオン性スター型ポリマーと架橋用化合物との混合物に対して光照射を行って光架橋させても良い。
【０１４６】
この架橋反応により、カチオン性スター型ポリマーを２〜１０個、特に２〜５個程度架橋させてマルチスター型ポリマーを形成するのが好ましい。
【０１４７】
この非イオン性架橋鎖は、Ｎ，Ｎ-ジメチルアクリルアミド、エチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルピロリドン、オキシアルキレン（メタ）アクリル酸エステル及びオキシアルキレンアクリルアミドなどの重合体部分を有するものが好適である。
【０１４８】
非イオン性架橋鎖は、スター型であってもよい。すなわち、上記カチオン性スター型ポリマーを製造するものと同様のイニファターに対し、Ｎ，Ｎ-ジメチルアクリルアミド、エチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルピロリドン、オキシアルキレン（メタ）アクリル酸エステル及びオキシアルキレンアクリルアミドの少なくとも１種を光照射リビング重合させた非イオン性分岐型重合体（以下「非イオン性スター型ポリマー」と称す場合がある。）を架橋用化合物として用いてもよい。この非イオン性分岐型重合体よりなる架橋鎖の製造条件は上記のカチオン性スター型ポリマーの製造条件と同様でよい。架橋鎖としての非イオン性スター型ポリマーの分子量は５０００〜２００，０００、特に１０，０００〜５０，０００程度が好適である。
【０１４９】
架橋鎖はスター型ではなく、線形であってもよい。線形架橋鎖としては、ポリマー鎖の両末端にラジカル解裂性官能基、好ましくはジチオカルバメート基を有した架橋鎖は、架橋反応に際し、ジチオカルバメート基のチオ基が開いてカチオン性スター型ポリマーの分岐鎖に結合し、この架橋鎖を介してカチオン性スター型ポリマー同士が連結されるものと推察される。
【０１５０】
［第１次分岐型重合体又はその架橋体の修飾形態］
本発明に係る第１次分岐型重合体又はその架橋体は、以下の［Ｉ］〜［Ｖ］のような修飾がなされたものであっても良い。
【０１５１】
［Ｉ］分岐鎖の末端に蛍光物質を導入することにより、核酸複合体を蛍光顕微鏡で観察することを可能としたもの。
この形態では、細胞内へ侵入した核酸複合体がどのように核まで移行するか、別波長の蛍光物質でラベルした核酸と併用することで核酸が細胞内でどのようにリリースされているかを研究することが可能となる。
【０１５２】
この蛍光物質としては、ｏ−フタルアルデヒド、ダンシルクロライド、フロレサミン、チアミン、マレイミド、ニンヒドリン、カテコールアミン、クマリン、トリヒドロキシインドール、ピレン、ベンゾピレン、ナフタレン、アントラセン、アミノナフタレンスルホン酸からなる群から選択される物質の誘導体などを用いることができる。
【０１５３】
この蛍光物質を導入するには、前述した光照射リビング重合工程において、４−アミノスチレンなどをモノマーとして追加重合を行い、スター型重合体の分岐鎖の末端に反応活性点であるアミノ基を導入する手法が代表例として挙げられる。導入したアミノ基へ反応性の蛍光物質を反応させれば良く、当業者に周知の蛍光分析用発色試薬などが利用可能である。また、４−アミノスチレンの代わりにメタクリル酸を追加重合し、分岐鎖の末端に導入されたカルボキシル基へ蛍光物質を導入することも可能である。この場合も当業者に周知のカルボン酸分析用の蛍光発色試薬などが利用可能である。
【０１５４】
［II］分岐鎖に、ＲＧＤ配列（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列）を有するペプチドが結合しているもの。
この形態のものは、ＲＧＤ配列を有するペプチドを有していることにより、血管内皮細胞のインテグリンを介して血管内皮細胞内へも容易に侵入し得る。
【０１５５】
［III］分岐鎖に、ポリＬ−リジンが導入されているもの。
この形態のものは、例えば、リジンが７個以上重合したポリＬ−リジンは肝細胞のレセプタであるヘパラン硫酸に対する指向性を有しており、肝細胞に容易に侵入し得る。
【０１５６】
ポリＬ−リジンを導入するには、まず分岐鎖にアミノ基を導入する。このアミノ基を導入するには、アミノ基を有するポリマー鎖を上記高分子ブロック鎖に結合させるのが好ましい。アミノ基を有するポリマー鎖としては、ポリアミノスチレン、メタクリル酸２−アミノエチル、などが使用可能であるが、とりわけポリアミノスチレンが好適である。ポリアミノスチレンを導入するには、上記３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドの重合体が結合した分岐型重合体を溶媒に溶解させ、アミノスチレンを添加し、光照射重合させるのが好ましい。高分子鎖１本当りに導入するポリアミノスチレンの重合度は２分子ブロック〜２０分子ブロック程度が好適である。
【０１５７】
このようにアミノ基を導入した分岐型重合体に対しポリＬ−リジンを導入する。詳しくは、ポリＬ−リジンの末端のカルボキシル基と、上記アミノ基とを脱水縮合させる。このポリＬ−リジンの重合度は３以上、好ましくは５〜５０程度が好ましい。ポリＬ−リジンを上記アミノ基を有する高分子化合物に導入するには、この高分子化合物をリン酸バッファー中に溶解させ、Ｎ−［ｅ−マレイミドカプロイルオキシ］スクシンアミドエステルを触媒として添加し、ポリＬ−リジンを混合し、室温程度で反応させればよい。
【０１５８】
［IV］分岐鎖に、加水分解性結合を有するもの。
この形態のものは、ランダムにモノマーユニット又はオリゴマーユニットに分解されることにより分子量が小さくなる。従って、生体から排出され易く、生体への蓄積を防止ないし抑制することが期待できる。
【０１５９】
加水分解性結合を導入するには、上記特定イニファターに対し加水分解性結合を有する化合物を結合させてから、この化合物に対し主鎖を重合させて分岐型重合体を合成する（即ち、分岐鎖の基端に加水分解性結合を導入する）か、又は、この分岐型重合体を合成する途中で、成長しつつある主鎖末端に加水分解性結合を有する化合物を重合させ、その後、再度主鎖を成長させる。もしくは、上記のように合成したスター型分岐型重合体を加水分解性結合を有する架橋鎖を介して架橋させることにより、マルチスター型ポリマーよりなる架橋体を合成する。
【０１６０】
この分岐型重合体（スター型ホモポリマー）の架橋を行うには、スター型ホモポリマーと、加水分解性結合を有する架橋用化合物とをメタノールなど適宜の溶媒に溶解させ、加熱するか、光を照射することにより、架橋鎖を介してスター型ホモポリマー同士を架橋するのが好ましい。
【０１６１】
この加水分解性結合としてはエステル結合、エーテル結合、アミド結合などが好ましく、特にエステル結合が好ましい。エステル結合を有する架橋用化合物としては、両端にＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を有し、途中にエステル結合を有する鎖状化合物が好ましい。この鎖状化合物の炭素数は２〜１０００程度が好ましく、エステル結合の数は１〜２０個程度が好ましい。好適な架橋用化合物は、炭素数２〜２０の末端ジカルボン酸のそれぞれにＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸又はその塩（例えばナトリウム塩又はカリウム塩）を縮合させたビスチオカルバメートである。
【０１６２】
スター型ホモポリマー同士をビスチオカルバメートを介して架橋反応させる架橋反応では、ビスチオカルバメートの両端のＮ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団のチオ基が開いて架橋鎖が分岐鎖に結合し、この架橋鎖を介して分岐鎖同士が連結されるものと推察される。
【０１６３】
［Ｖ］分岐鎖に炭酸系イオンが結合しているもの。
このように分岐鎖に炭酸系イオンを有するものは、負電荷を有する核酸とイオン複合体を形成し、細胞へ作用させることでエンドサイトーシスにより細胞内へ取り込まれる。細胞取り込み後は強酸性でかつ３７℃付近の生理的温度下にあるエンドソーム中でポリカチオンの側鎖に付加した炭酸塩から炭酸ガスが気体として放出され、容積の膨張によってエンドソームへ穿孔してイオン複合体のエンドソーム脱出を促進する。
【０１６４】
このように、浸透したプロトンによるエンドソーム内外の浸透圧差だけでなく、イオン複合体から積極的に炭酸ガスを放出させることで内圧を上げてエンドソーム膜の破壊を助長させるものである。なお、生成した二酸化炭素は生体への影響が少ない。
【０１６５】
炭酸系イオンとしては、炭酸イオン及び炭酸水素イオンの少なくとも１種が好ましい。炭酸系イオンの結合量としては、分岐鎖の主鎖の炭素原子１０００個当たり、炭酸系イオンが１０〜５００程度結合する程度が好ましい。
【０１６６】
炭酸系イオンとして炭酸イオンを分岐鎖に結合させるには、この分岐型重合体（スター型ホモポリマー）の架橋を行うには、スター型ホモポリマーの濃度０．１〜２０重量％程度の水溶液に炭酸ガスをバブリング（通気）するのが好ましい。炭酸ガスの通気量としては、水溶液１Ｌ当り０．１〜５．０Ｌ／ｍｉｎ程度であればよいが、これに限定されない。通気時間は１０〜６０ｍｉｎ程度が好適である。この通気時の水温は低い方が好ましい。
【０１６７】
［分子量分画］
本発明では、上記のような第1次分岐型重合体又はこの第１次分岐型重合体を架橋させて得られた架橋体を分子量分画し、重量平均分子量Ｍｗと数平均分子量Ｍｎとの比Ｍｗ／Ｍｎが１．０〜１．５の画分を分取して遺伝子導入剤とする。
【０１６８】
即ち、本発明者らの研究により、前述の第１次分岐型重合体又はこの第１次分岐型重合体を架橋してなる架橋体は、遺伝子導入活性に優れたものであるが、光照射リビング重合、更にはその後の架橋反応により、種々の分子量のものが混在する反応生成物が得られ、この反応生成物を分子量毎に分画すると、遺伝子導入活性が高い画分と、遺伝子導入活性が高くない画分とがあり、分子量毎に遺伝子導入活性に大きな差異があることが判明した。
【０１６９】
本発明では、このような様々な分子量の第１次分岐型重合体又はその架橋体が混在する反応生成物から、遺伝子導入活性が非常に高い画分として、重量平均分子量Ｍｗと数平均分子量Ｍｎとの比Ｍｗ／Ｍｎが１．０〜１．５の画分を分子量分画により取り出して遺伝子導入剤として用いる。
【０１７０】
例えば、第１次分岐型重合体を架橋して分岐鎖が第１次分岐型重合体よりも更に複雑に入り組んだ架橋体とすることにより、核酸の包蔵効果、凝縮効果を高めて、架橋前の第１次分岐型重合体に対して約１０倍の遺伝子導入活性の向上効果を得ることができたが、本発明では、このような架橋反応生成物から、特定の、遺伝子導入活性が飛躍的に向上した画分のみを選択的に抽出して用いることにより、架橋前の第１次分岐型重合体に比べて約１００倍の遺伝子導入活性を得ることができる。
【０１７１】
なお、第１次分岐型重合体の架橋により遺伝子導入活性が低下している画分のうち、分子量が著しく高い画分では細胞毒性が発現されるおそれがあり、逆に低分子量側では、単なる光分解性側鎖の分解による極性基の露出やイオン交換容量の低下などが考えられる。
【０１７２】
本発明で抽出する重量平均分子量Ｍｗと数平均分子量Ｍｎとの比Ｍｗ／Ｍｎが１．０〜１．５の画分とは、これらの幅広い分子量分布のうちの略中央付近に存在する画分である。
【０１７３】
この分子量分画は、液体クロマトグラフィー、サイス排除クロマトグラフィー、イオン交換法、電気泳動法、遠心分離法、疎水分離法、ゲル浸透遠心法などによって行うことができる。
【０１７４】
分子量分画を液体クロマトグラフィーで行う場合、その移動相およびカラムの選択に関しては、ポリマーの化学構造を考慮して当業者に周知の方法を行えば良い。例えば、アルキルアミン系のカチオン性ポリマーの場合であれば、アクリルアミドゲル系のカラムを使用し、移動相に臭化リチウム等の電解質を５〜５０ｍＭ程度含むＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド等の溶媒を用いて、カラムとポリマー分子の間のイオン排除作用やポリマー鎖のイオン反発を抑制しながらゲル浸透により分子量に応じた精度の高い分離を行う方法が挙げられる。
【０１７５】
液体クロマトグラフィーにおけるカラム温度は４０〜６０℃とすることが室温との差が大きいために温度制御が安定して精度高く行え、かつ、移動相の溶液粘度を下げてカラム性能を最大限に引き出せる点で好ましい。
【０１７６】
本発明では、このような分子量分画により、重量平均分子量Ｍｗと数平均分子量Ｍｎとの比Ｍｗ／Ｍｎが１．０〜１．５の画分を抽出するが、より好ましくはこのＭｗ／Ｍｎは１．０〜１．４、特に好ましくは１．０〜１．２であり、このように、分子量分布が適度に狭い画分を分取することにより、遺伝子導入活性に優れた遺伝子導入剤を得ることができる。
ここで、重量平均分子量Ｍｗ、数平均分子量ＭｎとはＧＰＣ（ゲルパーミエーションクロマトグラフィー）によるポリエチレングリコール換算の値である。
【０１７７】
なお、この分取する画分の量が少な過ぎると遺伝子導入剤の製造効率が悪く、多過ぎると、特定のＭｗ／Ｍｎ比の画分を分取することによる本発明の効果を十分に得ることができない。従って、架橋体を得るための架橋反応生成物又は分岐型重合体を得るための分岐型重合反応生成物のうち、Ｍｗ／Ｍｎが１．０〜１．５の画分であって、１０〜３０重量％、例えば２０重量％程度の画分を分取することが好ましい。
【０１７８】
本発明では、このように分子量分画して得られた特定の画分の第１次分岐型重合体又はその架橋体を遺伝子導入剤とする。
【０１７９】
［核酸複合体］
上述のようにして得られた本発明の遺伝子導入剤（ベクター）が核酸を核酸含有複合体として包囲することによって、生体内の酵素による核酸の失活、分解を抑制することができる。
【０１８０】
上記遺伝子導入剤と核酸とを複合させるには、遺伝子導入剤の濃度１〜１０００μｇ／ｍＬ程度の溶液に対し、核酸を添加し、混合すればよい。核酸に対して遺伝子導入剤を過剰量添加し、遺伝子導入剤中のカチオン性ポリマーを核酸に対し飽和状態に核酸含有複合体として複合化させるのが好ましい。
【０１８１】
なお、前記の通り、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体をブロック共重合させた遺伝子導入剤は、約３０℃よりも高い温度で疎水性であり、約３０℃よりも低い温度で親水性である。従って、３０℃よりも低い温度で核酸と遺伝子導入剤の水溶液とを混合して遺伝子導入剤に核酸を複合させることができる。
【０１８２】
約３０℃よりも高い温度では、核酸を複合した遺伝子導入剤は、温度感応性核酸よりなる疎水性部分を有し、水不溶性となる。
【０１８３】
核酸の好ましい例としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子），ｐ５３癌抑制遺伝子及びＢＲＣＡ１癌抑制遺伝子やサイトカイン遺伝子としてＴＮＦ−α遺伝子，ＩＬ−２遺伝子，ＩＬ−４遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／ＩＬ−２遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／Ｂ２Ｍ遺伝子，ＩＬ−７遺伝子，ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子，ＩＦＮ−γ遺伝子及びＩＬ−１２遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｇｐ−１００，ＭＡＲＴ−１及びＭＡＧＥ−１などの癌抗原ペプチド遺伝子が癌治療に利用できる。
【０１８４】
また、ＶＥＧＦ遺伝子，ＨＧＦ遺伝子及びＦＧＦ遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｃ−ｍｙｃアンチセンス，ｃ−ｍｙｂアンチセンス，ｃｄｃ２キナーゼアンチセンス，ＰＣＮＡアンチセンス，Ｅ２Ｆデコイやｐ２１（ｓｄｉ−１）遺伝子が血管治療に利用できる。かかる一連の遺伝子は当業者には良く知られたものである。
【０１８５】
核酸複合体の粒径は５０〜４００ｎｍ程度が好適である。この粒径は、例えばレーザを用いた動的光散乱法によって測定される。粒径がこれよりも小さいと、核酸複合体内部の核酸にまで酵素の作用が及ぶおそれ、あるいは腎臓にて濾過排出されるおそれがある。また、これよりも大きいと、細胞に導入されにくくなるおそれがある。
【０１８６】
核酸は、細胞に導入されることによりその細胞内で機能を発現することができるような形態で用いる。例えばＤＮＡの場合、導入された細胞内で当該ＤＮＡが転写され、それにコードされるポリペプチドの産生を経て機能発現されるように当該ＤＮＡが配置されたプラスミドとして用いる。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、所望の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列されている。
【０１８７】
所望により２種以上の核酸をひとつのプラスミドに含めることも可能である。
【０１８８】
本発明において、核酸を導入する対象として望ましい「細胞」としては、当該核酸の機能発現が求められるものであり、このような細胞としては、例えば使用する核酸（すなわちその機能）に応じて種々選択され、例えば心筋細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、骨格筋細胞、血管内皮細胞、骨髄細胞、骨細胞、血球幹細胞、血球細胞等が挙げられる。また、単球、樹状細胞、マクロファージ、組織球、クッパー細胞、破骨細胞、滑膜Ａ細胞、小膠細胞、ランゲルハンス細胞、類上皮細胞、多核巨細胞等、消化管上皮細胞・尿細管上皮細胞などである。
【０１８９】
本発明の核酸複合体は培養試験に用いるほか、任意の方法で生体に投与することができる。
【０１９０】
生体への投与方法としては静脈内又は動脈内への注入が特に好ましいが、筋肉内、脂肪組織内、皮下、皮内、リンパ管内、リンパ節内、体腔（心膜腔、胸腔、腹腔、脳脊髄腔等）内、骨髄内への投与の他に病変組織内に直接投与することも可能である。
【０１９１】
この核酸複合体を有効成分とする医薬は、更に必要に応じて製剤上許容し得る担体（浸透圧調整剤、安定化剤、保存剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、増粘剤等）と混合することが可能である。これら担体は公知のものが使用できる。
【０１９２】
また、この核酸複合体を有効成分とする医薬は、含まれる核酸の種類が異なる２種以上の核酸含有複合体を含めたものも包含される。このような複数の治療目的を併せ持つ医薬は、多様化する遺伝子治療の分野で特に有用である。
【０１９３】
投与量としては、動物、特にヒトに投与される用量は目的の核酸、投与方法および治療される特定部位等、種々の要因によって変化する。しかしながら、その投与量は治療的応答をもたらすに十分であるべきである。
【０１９４】
この核酸複合体は、好ましくは遺伝子治療に適用される。適用可能な疾患としては、当該複合体に含められる核酸の種類によって異なるが、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、動脈拡張術後再狭窄等の病変を生じる循環器領域での疾患に加え、癌（悪性黒色腫、脳腫瘍、転移性悪性腫瘍、乳癌等）、感染症（ＨＩＶ等）、単一遺伝病（嚢胞性線維症、慢性肉芽腫、α１−アンチトリプシン欠損症、Gaucher病等）等が挙げられる。
【０１９５】
また、この核酸を複合した遺伝子導入剤の水溶液を基材に塗布などにより付着させ、必要に応じ乾燥させることにより、核酸を担持したポリマーのコーティング等が形成される。
【０１９６】
上記の核酸複合遺伝子導入剤を基材に付着させる場合、基材としてはシート状のものが好適である。このシート状基材の厚さは０．０５〜１０ｍｍ程度であることが好ましく、シート面の大きさは、方形の場合、一辺が１〜２０ｍｍであり他辺が１〜２０ｍｍであり、円形又は楕円形の場合、径は１〜２０ｍｍ程度が好ましい。基材の材料としては、ポリオレフィン、ポリスチレン、ポリエステル、ポリアミド、ポリウレタン、シリコン樹脂、フッ素樹脂などの合成樹脂が好適である。この基材は多孔質であってもよい。
【０１９７】
この基材に対する核酸複合遺伝子導入剤の付着量は、基材表面１ｃｍ２当り０．００１〜１０ｍｇ程度が好ましい。
【０１９８】
核酸複合遺伝子導入剤を担持させた基材よりなる遺伝子導入材料は、皮下組織、心筋組織、病変組織、病変血管を包囲するようにシート状基材を配置したり、カバードステントのフィルムへ塗布することによって生体内に配置したり、生体外面に粘着テープを用いて貼り付けたりするようにして用いられる。
【実施例】
【０１９９】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明する。
【０２００】
［実施例１］
＜（ａ）イニファターの合成＞
イニファターとしての１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンを次のようにして合成した。
【０２０１】
１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチルベンゼン）５．０ｇとＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム３４．０ｇをエタノール１００ｍＬ中へ加え、遮光下にて室温で４日間攪拌した。沈殿物を濾過し、３リットルのメタノールへ投入して３０分間攪拌して濾過した。この操作を繰り返して合計４回行った。沈殿物をトルエン２００ｍＬへ溶解した後、１００ｍＬのメタノールを加えて５０℃に加温し、冷蔵庫中で１５時間保管して再結晶させ、結晶を濾別後に大量のメタノールで洗浄した。結晶を室温で減圧乾燥して、白色の１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンの針状結晶を得た（収率９０％）。高速液体クロマトグラフィーにより、原料ピークが消失し、精製物が単一物質であることを確認した。
【０２０２】
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）の測定結果はδ１．２６−１．３１ｐｐｍ（ｔ，２４Ｈ，ＣＨ２ＣＨ３），δ３．６９−３．７７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ３．９９−４．０７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ４．５７ｐｐｍ（ｓ，８Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２），δ７．４９ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）となった。
【０２０３】
【化１】
【０２０４】
＜（ｂ）４分岐型スター型重合体よりなるカチオン性ホモポリマーの光重合による合成＞
３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドをカチオン性ビニル系モノマーとして用い、１，２，４，５−テトラキス［（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）ポリ（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル］ベンゼン（以下、ｐＤＭＡＰＡＡｍと記載することがある。）よりなるカチオン性ホモポリマーの合成を行った。
【０２０５】
即ち、上記（ａ）により合成した１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン４５．６ｍｇを２０ｍＬのトルエンへ溶解し、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド（３−Ｎ，Ｎ−ＤＭＡＰＡＡｍ）７．９ｇを加えて混合し、全量をトルエンで５０ｍＬに調整した。この液を３ｍｍ厚軟質ガラスセル中で激しく攪拌しながら高純度窒素ガスで５分間パージした後に、３００Ｗショートアークキセノンランプ（朝日分光社製、ＭＡＸ−３０１）で波長２５０ｎｍ〜４００ｎｍの混合紫外線を３０分間照射した。照射強度はウシオ電機社のＵＩＴ−１５０へＵＶＤ−Ｃ４０５（検出波長範囲３２０ｎｍ〜４７０ｎｍ）を装着して２．５ｍＷ／ｃｍ２に調整した。重合溶液をエバポレーターで濃縮し、ジエチルエーテルで重合物を再沈殿させ、クロロホルム／ジエチルエーテル系で３回再沈殿を繰り返して精製し、エーテルを蒸散させた後に少量の水へ溶解し、０．２μｍフィルターで濾過してから凍結乾燥させて４分岐型スター型ホモポリマーｐＤＭＡＰＡＡｍよりなるカチオン性ホモポリマーを得た（重合率３２％）。このカチオン性ホモポリマーの重量平均分子量はＧＰＣにより、５８，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．３３）と測定された。
【０２０６】
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ Ｄ２Ｏ）の測定結果は、δ１．５−１．８ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−），δ２．１−２．２ｐｐｍ(ｂｒ，６Ｈ，Ｎ−ＣＨ３)，δ２．２−２．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＣＨ２−Ｎ），δ３．０−３．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＮＨ−ＣＨ２），δ７．４−７．８ｐｐｍ（ｂｒ，１Ｈ，−ＮＨ−）となった。
【０２０７】
【化２】
【０２０８】
＜（ｃ）カチオン性ホモポリマーの光架橋＞
１，２，４，５−テトラキス［（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）−ポリ−（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル］ベンゼンの光架橋を行った。
即ち、上記（ｂ）で合成した分子量５８，０００の４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍホモポリマー０．３ｇを１００ｍＬ滅菌瓶へ入れ、土星型回転子で激しく攪拌しながら高純度窒素ガス（２Ｌ／分）で３０分間パージして均質な粉末状態へ粉砕した。ここへ窒素パージ及び激しい攪拌を続けながら（ｂ)と同じ光照射装置で光照射重合を行った。照射強度は１．０ｍＷ／ｃｍ２、光照射時間は２４０分で行った。照射終了後、得られた粉末は淡い黄褐色を帯びていた。これを５０ｍＬのメタノールを投入すると少量の不溶性のゲル状成分が生成していた。この溶液を＃２の濾紙で濾過した後、エバポレーターで濃縮し、ジエチルエーテルへ滴下してポリマー成分を沈殿させた。その後、クロロホルム／ジエチルエーテル系で３回再沈殿処理を行って精製した。
このものの分子量はＧＰＣにより１０９，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝２．５）と測定され、分子量の増大と分散のブロード化が確認された。
【０２０９】
＜（ｄ）カチオン性ホモポリマー光架橋体のフラクション分離と特定分子量分画の採取＞
島津製作所高速液体クロマトグラフシステムＬＣ１０Ａｖｐを使用し、上記（ｃ）で合成したカチオン性ホモポリマーの光架橋反応生成物のフラクション分離を行った。
移動相は臭化リチウム３０ｍＭのＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド溶液を使用した。カラムにはＡｓａｈｉｐａｃｋＧＦ−５１０ＨＱとＡｓａｈｉｐａｃｋ７１０ＨＱを連結したものを用い、カラム温度４０℃でサイズ排除分離を行った。フラクション分離はフラクションコレクターＦＲＣ−１０Ａを使用して行った。
【０２１０】
Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドを高真空エバポレーターで留去し、ジエチルエーテル中へ滴下してポリマー成分と電解質成分を沈殿させ、超遠心限外濾過キット（アミネックスス）を使用して脱塩し、凍結乾燥することでポリマー成分を分離精製した。
分離後の各フラクションの分子量、分離前の光架橋反応生成物中の存在比率（この面積比は重量比に等しい）を以下の表１にまとめた。
【０２１１】
【表１】
【０２１２】
＜（ｅ）各フラクションの遺伝子導入活性＞
細胞にはアフリカミドリサル腎細胞の由来のＣＯＳ-１を使用し、ＤＮＡにはｐＧＬ３コントロールベクターを使用した。ＣＯＳ-１細胞は細胞数を４万個／ｍＬへ調整して２４Ｗｅｌｌ培養皿へ播種し、培養２４時間後に遺伝子導入を行った。
上記ｄ）にて合成したカチオン性ホモポリマー架橋体のフラクション分離体の各画分を遺伝子導入剤として使用した。遺伝子導入剤中の単位重量あたりの陽電荷数はカチオン性ホモポリマーのモノマー単位の分子量１５６から計算して求めた。ＤＮＡ中の単位重量あたりの陰電荷数は配列マップによる塩基対数と核酸塩基の平均的分子量６６０とから計算した。
【０２１３】
この遺伝子導入剤をＤＮＡと１５０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ中で３０分間インキュベートした。混合比は電荷数の関係が陽電荷数が陰電荷数の２０倍となるように調整し、０．５μｇのＤＮＡが各Ｗｅｌｌへ投与されるように溶液を調整し、培養細胞へ加えた。トランスフェクションの４８時間後にルシフェラーゼアッセにより遺伝子導入活性の評価を行った（プロメガ社、アッセイキット試薬)。補正はタンパク濃度で行い、タンパク定量はＢｉｏＲａｄ社のＢｒａｄｆｏｒｄ試薬で行った。結果を図１に示す。
【０２１４】
［比較例１］
実施例１の（ｂ）で合成したカチオン性ホモポリマーを遺伝子導入剤として使用する以外は、実施例１における（ｅ）に準拠して遺伝子導入活性を評価した。結果を図２に示す。
【０２１５】
［比較例２］
実施例１の（ｃ）で合成したカチオン性ホモポリマーの架橋体を分子量分画することなくそのまま遺伝子導入剤として使用する以外は、実施例１における（ｅ）に準拠して遺伝子導入活性を評価した。結果を図２に示す。
【０２１６】
図２には、実施例１においてカチオン性ホモポリマーの架橋体から分子量分画により分取した画分４の遺伝子導入活性を併記した。
【０２１７】
図１より、光架橋反応生成物を分子量分画して得られた画分には、その遺伝子導入活性に大きな差異があり、Ｍｗ／Ｍｎが１．３０のものが著しく遺伝子導入活性に優れることが分かる。
また、図２より、カチオン性ホモポリマーを架橋することにより、遺伝子導入活性の向上が認められるが（比較例１と比較例２との対比）、この光架橋反応生成物から、特定の分子量分布の画分を抽出することにより、遺伝子導入活性が飛躍的に向上した遺伝子導入剤が得られることが分かる（比較例２と実施例１との対比）。
【図面の簡単な説明】
【０２１８】
【図１】実施例１における分子量分画で得られた各画分の遺伝子導入活性の評価結果を示すグラフである。
【図２】実施例１、比較例１及び比較例２における遺伝子導入活性の評価結果を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子導入剤及びその製造方法並びに核酸複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
安全性、品質安定性、製造コストに問題があるウイルスベクターに代わる遺伝子導入技術として、合成高分子ベクター、カチオン性脂質ベクターが研究開発されている。
【０００３】
本出願人らは、合成高分子ベクターとして、ベンゼンなどの芳香環を核としてカチオン性ポリマー鎖が放射状に伸延する分岐構造のベクターが、ＤＮＡを高密度で凝縮させて小さな核酸複合体微粒子を形成させ、効率良く細胞へ遺伝子導入できることを見出し、先に特許出願した（下記特許文献１，２）。この複合体微粒子が細胞膜を透過するメカニズムとしては、カチオン性ポリマー鎖による陽電荷が細胞膜表面の陰電荷と静電的に結合し、エンドサイトーシスにより細胞内へ取り込まれる作用に大きく依存していると考えられる。
【特許文献１】ＷＯ２００４／０９２３８８
【特許文献２】特開２００７−７０５７９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、遺伝子導入効率がさらに向上した遺伝子導入剤及びその製造方法と、この遺伝子導入剤を用いた核酸複合体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明（請求項１）の遺伝子導入剤は、芳香環に、分岐鎖としてのＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が３個以上導入された芳香族化合物をイニファターとし、このイニファターの分岐鎖に少なくともビニル系モノマーを光照射リビング重合させた分岐型重合体、又はこの分岐型重合体の分岐鎖を架橋反応させた架橋体よりなる遺伝子導入剤であって、該分岐型重合体又は該架橋体を分子量分画して得た、重量平均分子量Ｍｗと数平均分子量Ｍｎとの比Ｍｗ／Ｍｎが１．０〜１．５の画分よりなることを特徴とする。
【０００６】
請求項２の遺伝子導入剤は、請求項１において、前記架橋体は、前記分岐型重合体に光照射することにより、該分岐型重合体の分岐鎖を架橋反応させたものであることを特徴とする。
【０００７】
請求項３の遺伝子導入剤は、請求項１又は２において、該Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基がＮ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル基であることを特徴とする。
【０００８】
請求項４の遺伝子導入剤は、請求項１ないし３のいずれか１項において、前記イニファターが、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が結合していることを特徴とする。
【０００９】
請求項５の遺伝子導入剤は、請求項１ないし４のいずれか１項において、前記ビニル系モノマーが、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド及び／又は２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートを含むことを特徴とする。
【００１０】
本発明（請求項６）の遺伝子導入剤の製造方法は、芳香環に、分岐鎖としてのＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が３個以上導入された芳香族化合物をイニファターとし、このイニファターの分岐鎖にビニル系モノマーを光照射リビング重合させて分岐型重合反応生成物を得る工程と、該分岐型重合反応生成物を分子量分画して、重量平均分子量Ｍｗと数平均分子量Ｍｎとの比Ｍｗ／Ｍｎが１．０〜１．５の画分を分取する工程とを有することを特徴とする。
【００１１】
本発明（請求項７）の遺伝子導入剤の製造方法は、芳香環に、分岐鎖としてのＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が３個以上導入された芳香族化合物をイニファターとし、このイニファターの分岐鎖にビニル系モノマーを光照射リビング重合させて分岐型重合体を製造する工程と、得られた分岐型重合体の分岐鎖を架橋反応させて架橋反応生成物を得る工程と、該架橋反応生成物を分子量分画して、重量平均分子量Ｍｗと数平均分子量Ｍｎとの比Ｍｗ／Ｍｎが１．０〜１．５の画分を分取する工程とを有することを特徴とする。
【００１２】
本発明（請求項８）の核酸複合体は、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の遺伝子導入剤と核酸とを複合させてなるものである。
【００１３】
本発明（請求項９）の核酸複合体は、請求項６又は７の遺伝子導入剤の製造方法で製造された遺伝子導入剤と核酸とを複合させてなるものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の遺伝子導入剤は、Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基を有する芳香族化合物をイニファクターとし、これにビニル系モノマーを光照射リビング重合させて合成した、芳香環を核として、分岐鎖が放射状に伸延する分岐型重合体（以下「第１次分岐型重合体」ということがある。）よりなるか、或いは、この第１次分岐型重合体に光を照射するなどして分岐鎖を架橋させた架橋体よりなり、かつ、これらのうち、特に遺伝子導入活性の高い、重量平均分子量Ｍｗと数平均分子量Ｍｎとの比Ｍｗ／Ｍｎが１．０〜１．５の画分を分取して得た合成高分子ベクターであり、高い遺伝子導入活性を示す。
【００１５】
なお、上記の架橋体は、第１次分岐型重合体に光照射するなどして第１次分岐型重合体の末端のＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基などを架橋点として寄与させることにより第１次分岐型重合体同士がその分岐鎖で架橋してなる分子間架橋体であると推察されるが（請求項２）、種々の研究の結果、この架橋体は、第１次分岐型重合体よりもＤＮＡなどの核酸を高密度に凝縮することができることが認められた。即ち、この架橋体は、第１次分岐型重合体を架橋することにより、第１次分岐型重合体よりも更に分岐鎖が入り組んだ複雑な立体構造を有するものとなり、この構造的な特徴から核酸をより一層効果的に凝縮させて高い遺伝子導入活性を示す。
【００１６】
本発明において、イニファターが有するＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基としてはＮ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル基が好ましく（請求項３）、特にイニファターは、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が結合しているものが好ましい（請求項４）。また、イニファターの分岐鎖に光照射リビング重合させるビニル系モノマーとしては、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド及び／又は２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートが好ましい（請求項５）。
【００１７】
本発明の遺伝子導入剤は、芳香環に、分岐鎖としてのＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が３個以上導入された芳香族化合物をイニファターとし、このイニファターの分岐鎖にビニル系モノマーを光照射リビング重合させて分岐型重合反応生成物を得る工程と、該分岐型重合反応生成物を分子量分画して、重量平均分子量Ｍｗと数平均分子量Ｍｎとの比Ｍｗ／Ｍｎが１．０〜１．５の画分を分取する工程とを有することを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法（請求項６）、或いは、芳香環に、分岐鎖としてのＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が３個以上導入された芳香族化合物をイニファターとし、このイニファターの分岐鎖にビニル系モノマーを光照射リビング重合させて分岐型重合体を製造する工程と、得られた分岐型重合体の分岐鎖を架橋反応させて架橋反応生成物を得る工程と、該架橋反応生成物を分子量分画して、重量平均分子量Ｍｗと数平均分子量Ｍｎとの比Ｍｗ／Ｍｎが１．０〜１．５の画分を分取する工程とを有することを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法（請求項７）により、容易に製造される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下に本発明の実施の形態を詳細に説明する。
【００１９】
本発明の遺伝子導入剤は、芳香環に分岐鎖としてのＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が３個以上導入された芳香族化合物をイニファター（以下「特定イニファター」と称す場合がある。）とし、この特定イニファターの分岐鎖に少なくともビニル系モノマーを光照射リビング重合させて得たスター型の第１次分岐型重合体よりなるか、又はこの第１次分岐型重合体を架橋反応させた架橋体よりなり、かつ該第１次分岐型重合体又は架橋体を分子量分画して得た重量平均分子量Ｍｗと数平均分子量Ｍｎとの比Ｍｗ／Ｍｎが１．０〜１．５の画分よりなるものである。
【００２０】
即ち、上記の第１次分岐型重合体それ自体がある程度の分子量分布を有したものである。この第１次分岐型重合体に光を照射するなどして架橋反応させると、複数の第１次分岐型重合体が分子間架橋して、分子量の異なる様々な分子間架橋体が生成する。
【００２１】
本発明者らは、この第１次分岐型重合体又はその架橋体を分子量分画して、分子量と遺伝子導入活性との関係を調べたところ、Ｍｗ／Ｍｎが１．０〜１．５の画分に属する分岐型重合体又はその架橋体が高い遺伝子導入活性を示すことを見出した。
【００２２】
本発明はこのような知見に基いて達成されたものである。
【００２３】
［第１次分岐型重合体］
第１次分岐型重合体は、Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する芳香族化合物をイニファターとし、これにビニル系モノマーを光照射リビング重合させた分岐型重合体（以下「スター型分岐型重合体」或いは「スター型ポリマー」と称す場合がある。）である。
【００２４】
なお、本明細書において、イニファターとは、光照射によりラジカルを発生させる重合開始剤、連鎖移動剤としての機能と共に、成長末端と結合して成長を停止する機能、さらに光照射が停止すると重合を停止させる重合開始・重合停止剤として機能する分子のことである。
【００２５】
イニファターとなるＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する芳香族化合物としては、ベンゼン環に該Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基、好ましくはＮ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル基が３個以上分岐鎖として結合しているものが好適であり、具体的には次が例示される。即ち、３分岐鎖化合物としては、１，３，５−トリ（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，３，５−トリ（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、４分岐鎖化合物としては、１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、６分岐鎖化合物としては、ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られるヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンが挙げられる。なお、ここで、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル基に含まれるジアルキル部分のアルキル基としては、エチル基等の炭素数２〜１８個のアルキル基が好ましいが、アルキル基に限らず、フェニル基など芳香族系の炭化水素基であっても構わない。即ち、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル基に限らず、Ｎ，Ｎ−ジアリールジチオカルバミルメチル基等を含む、脂肪族炭化水素基及び／又は芳香族炭化水素基で置換されたＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基であれば目的を達成することができる。
【００２６】
上記のイニファターは、アルコール等の極性溶媒に対しては殆ど不溶であるが、非極性溶媒には易溶である。この非極性溶媒としては炭化水素、ハロゲン化炭化水素が好適であり、特に、ベンゼン、トルエン、クロロホルム又は塩化メチレン、中でも特にトルエンが好適である。
【００２７】
このイニファターに重合させるビニル系モノマーとしては、アクリル酸誘導体、スチレン誘導体等のビニル系モノマーが好適であり、具体的には３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣ３Ｈ６Ｎ（ＣＨ３）２、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ-ジメチルアクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド及びＮ−イソプロピルアクリルアミドの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種が挙げられ、特に、耐加水分解性に優れることから、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣ３Ｈ６Ｎ（ＣＨ３）２、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート等のカチオン性ビニル系モノマーが好ましい。これらのビニル系モノマーは１種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
【００２８】
イニファターと上記ビニル系モノマーとを反応させるには、イニファター及びビニル系モノマーを含んでなる原料溶液を調製し、これに光照射することによって、イニファターに対しビニル系モノマーが結合した反応生成物を生成させる。
【００２９】
該原料溶液中のビニル系モノマーの濃度は０．５Ｍ以上、例えば０．５Ｍ〜２．５Ｍが好適である。また、原料溶液中のイニファターの濃度は０．１〜１００ｍＭ程度が好適である。
【００３０】
照射する光の波長は３００〜４００ｎｍが好適であり、例えば低圧水銀灯や高圧水銀灯などを用いることができる。光の照射時間は照射強度にも依存するが、１〜６０分程度が好適であり、１μＷ／ｃｍ２〜１０ｍＷ／ｃｍ２程度の低い照射強度で１分〜３０分程度が特に好適である。
【００３１】
この光照射により、反応液中に目的とする分岐型重合体が生成するので、必要に応じ精製して第１次分岐型重合体としてのカチオン性ホモポリマー等のポリマーを得る。
【００３２】
この第１次分岐型重合体の分子量は分岐鎖の鎖数によるが、２，０００〜５００，０００、特に２，０００〜１５０，０００、とりわけ２，０００〜１００，０００程度が好ましい。
【００３３】
なお、本明細書において、分子量とは、特記しない限り、ＧＰＣ（ゲルパーミエーションクロマトグラフィー）によるポリエチレングリコール換算の数平均分子量をさす。
【００３４】
第１次分岐型重合体は、上記のホモポリマーであってもよく、さらに異なるモノマーを導入したブロック共重合体又はランダム共重合体であってもよい。例えば、上記ホモポリマーに対し、ホモポリマーの合成に用いたビニル系モノマーとは異なるビニル系モノマー、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、メトキシエチル（メタ）アクリレートなどを導入してもよい。また、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体をブロック共重合させて温度感応性ポリマーブロックを導入してもよい。
【００３５】
即ち、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体のポリマー鎖は、低温度では親水性、高温では疎水性となる温度依存性を有する。これにより遺伝子導入剤が上記温度応答性を具備するようになる。
【００３６】
なお、先に上記の「異なるポリマー」例えばＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド又はＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体等のポリマーよりなる分岐鎖を有した分岐型重合体を形成し、その後、各分岐鎖の先端側に前述のカチオン性ビニル系モノマーよりなるポリマーブロックを導入するようにしてもよい。
【００３７】
カチオン性ポリマーブロックにＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドあるいはＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体等をブロック共重合させるには、上記のようにして合成した分岐型重合体を好ましくはアルコール例えばメタノール等の溶媒に溶解させ、これにＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド又はＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体を混合し、光を照射して重合させればよい。この重合反応を開始する際の溶液中における分岐型重合体の濃度は０．０１〜１０重量％程度が好適であり、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド又はＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体の濃度は０．３〜３０重量％程度が好適である。光の照射条件は、光波長２５０〜４００ｎｍ、照射時間１〜１５０分、照射強度１００〜１０，０００μＷ／ｃｍ２程度が好適である。
【００３８】
このように分岐鎖をブロック又はランダム共重合体にて構成したスター型分岐型共重合体（スター型コポリマー）を第１次分岐型重合体として用いる場合、その重量平均分子量は３，０００〜６００，０００、特に３，０００〜１５０，０００であることが好ましい。
【００３９】
［第１次分岐型重合体の架橋］
本発明では、上記のように合成した第１次分岐型重合体架橋反応させて、これらが２〜１０個程度、好ましくは２〜５個程度架橋した架橋体としてもよい。この架橋反応では、分岐型重合体の分岐鎖のＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基のチオ基が開いて分岐鎖同士が架橋するものと推察される。この第１次分岐型重合体の架橋を行うには、次のｉ），ii），iii），iv）の方法を採用することができる。
【００４０】
ｉ)第１次分岐型重合体をベンゼン、トルエン、エタノールなど適宜の溶媒に溶解させ、加熱するか、光を照射することにより、分岐型重合体同士を架橋する。この架橋反応を開始させる際の溶液中の第１次分岐型重合体の濃度は１〜２０重量％程度が好適である。加熱条件は、３０〜３００℃、１分〜３０,０００時間程度が好適である。加熱の代わりに、又は加熱と共に、光照射することによっても架橋させることができる。光の照射条件は、光波長１８０〜７００ｎｍ、照射時間１分〜３０，０００時間、照射強度０．００１〜１０，０００μＷ／ｃｍ２程度が好適である。
【００４１】
ii）第１次分岐型重合体へ直接光照射や加熱処理を行うことによって分岐型重合体を架橋させる。この場合、ｉ)の溶媒へ溶解した溶液への処理と相違して、分岐型重合体の主鎖及び又は側鎖へ発生したラジカルが溶媒によって捕捉され、分岐型重合体の架橋反応が阻害されることを抑制することが可能となる。直接光照射を行う場合は、凍結乾燥粉末を霧状に攪拌して、ここへ光を照射することで均質な処理が可能となる。なお、第１次分岐型重合体をフィルム状に加工し、このフィルムへ処理を行うことも均質な架橋体を得る方法として好ましい。具体的には、ガラス板、金属板などの上へ第１次分岐型重合体の溶液、例えば、クロロホルム溶液を流延させ、ドクターナイフなどで液切りして均一な厚みとし、これを乾燥させることで均質なフィルムを形成させることが可能である。この場合の溶媒としては揮発性が高いメタノール、クロロホルムが好適である。
【００４２】
iii）常温又は冷却下に長期間保持することによって第１次分岐型重合体を架橋させる。例えば、４℃、−２０℃などの冷却下においても１５，０００時間程度の時間を経過すれば十分に架橋の効果が現れる。この場合、第１次分岐型重合体は凍結乾燥フィルムまたはフィルム状態で経時変化させることが好ましく、遮光状態でも蛍光灯程度の光が迷光として暴露されていても良い。凍結乾燥状態で経時変化をさせるのであれば、高分子量成分の乾燥重量で１．５ｇ／５０ｍＬ程度の密度とすることで均質な架橋体を得ることが可能である。
【００４３】
iv）固体状態の第１次分岐型重合体、好ましくはフィルム状の第１次分岐型重合体を液状エーテルに浸漬させた状態で光照射することにより、第１次分岐型重合体同士を架橋させる。
【００４４】
この場合の液状エーテルとしては、ジエチルエーテル、ジエチルエーテル、ジオクチルエーテル、メチルシクロヘキシルエーテル、ビス（メチルベンジル）エーテル、メチルブチルエーテル、ブチルヘキシルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、クラウンエーテル等が挙げられる。これらは１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００４５】
液状エーテルに浸漬させると、光架橋反応においてジチオカルバミル基から脱離して生成するジスルフィド化合物がエーテル中に拡散し、抽出除去されるようになる。ジスルフィド化合物を固層からエーテル中へ抽出除去することにより、効率的に架橋反応を行うことができる。
【００４６】
［その他の第１次分岐型重合体又はその架橋体の他の形態］
本発明の遺伝子導入剤を構成する第１次分岐型重合体は、前述のカチオン性ホモポリマー又はカチオン性コポリマーの他、次のようなものであっても良い。従って、本発明の遺伝子導入剤は、以下の第１次分岐型重合体を上述の方法で架橋した架橋体であっても良い。
【００４７】
＜カチオン性／疎水性ブロックコポリマー＞
前述の特定イニファターに対してまずカチオン性モノマーを光照射リビング重合させ、次いで疎水性モノマーを光照射リビングブロック共重合させることにより、基端側がカチオン性ポリマーブロック、先端側が疎水性ポリマーブロックで構成されたブロックコポリマー鎖よりなる分岐鎖を有する分岐型共重合体（ブロックコポリマー）。
【００４８】
ここで、特定イニファター、カチオン性モノマー、及びその光照射リビング重合方法としては、前述のカチオン性ホモポリマーのそれと同様である。
【００４９】
一方、疎水性モノマーとしては、特に、水溶液中で、疎水結合性に凝集する性質が必要であることから、側鎖に炭素数５以上、好ましくは炭素数５〜２０の非極性基、例えば、フェニル基、ベンジル基、オクチル基、オクタデシル基、フォロレニル基等を有するものが好ましく、このような疎水性モノマーとしては、４−ビニル安息香酸メチル、９−ビニルカルバゾール、スチレン、４−アセチルアミノスチレン等が挙げられるが、特に４−ビニル安息香酸メチルが好ましい。
なお、疎水性モノマーは、中性の水溶液で疎水性のものであれば良い。従って、酸又はアルカリ性で親水性の４−アミノスチレンや４−ビニル安息香酸であっても良い。
これらの疎水性モノマーは、１種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
【００５０】
カチオン性ホモポリマーに対し、疎水性モノマーを光照射リビング重合によりブロック共重合させるには、前述のようにして合成したカチオン性ホモポリマーをメタノール等の溶媒に溶解させ、これに疎水性モノマーを混合し、光を照射して重合させればよい。この重合反応を開始する際の溶液中におけるカチオン性ホモポリマーの濃度は０．０１〜１０重量％程度が好適であり、疎水性モノマーの濃度は０．３〜３０重量％程度が好適である。光の照射条件は、光波長２５０〜４００ｎｍ、照射時間１〜１５０分、照射強度１００〜１０，０００μＷ／ｃｍ２程度が好適である。
【００５１】
このブロックコポリマーの分子量は、これを構成するイニファター、カチオン性モノマー、及び疎水性モノマーの種類等によっても異なり、一概には言えないが、３，０００〜６００，０００、特に３，０００〜１５０，０００であることが好ましい。ポリマー材料の分子量が小さ過ぎると、本発明に好適な分岐型コポリマーの分子設計を十分に行うことができず、ポリマー材料の分子量が大き過ぎると、代謝性、生分解性などが劣る傾向にあり、好ましくない。
【００５２】
また、カチオン性ポリマーブロックの分子量は、カチオン性ポリマーブロックを構成するカチオン性モノマーの種類等によっても異なり、一概には言えないが、１５，０００〜３００，０００、特に３０，０００〜１５０，０００であることが好ましい。このカチオン性ポリマーブロックの分子量が小さ過ぎると遺伝子導入活性が劣る傾向にあり、大き過ぎると、ポリマー材料の分子量が徒に大きくなり、好ましくない。
【００５３】
また、疎水性ポリマーブロックの分子量は、疎水性ポリマーブロックを構成する疎水性モノマーの種類等によっても異なり、一概には言えないが、５，０００〜５０，０００、特に１０，０００〜２０，０００であることが好ましい。この疎水性ポリマーブロックの分子量が小さ過ぎると、分岐鎖が水溶液中で安定に分散し、以下のような自己環化現象が起こらず、大き過ぎると、ポリマー材料が乳化してマクロ粒子を形成してしまい、好ましくない。
【００５４】
このように、基端側がカチオン性ポリマーブロックで、先端側が疎水性ポリマーブロックのブロックコポリマー鎖よりなる分岐鎖を有する分岐型重合体であれば、この分岐鎖のカチオン性ポリマーブロックによってアニオン性のＤＮＡとイオン複合体を形成して、これを運搬する。この際、分岐鎖の先端側の疎水性ポリマーブロックは、おそらくは水溶液中において、水にはじかれて先端側の疎水性ポリマーブロック同士が互いの親和性により近接ないし結合し、一方で、分岐鎖の基端側のカチオン性ポリマーブロック部分は静電気的に互いに反発し合い、これにより、複数の分岐鎖が、鳥篭のようにカチオン性ポリマーブロックとイオン複合体を形成しているＤＮＡを包蔵して一分子ミセルを形成する自己環化現象で、高い遺伝子導入活性を示すようになる。
【００５５】
なお、細胞の細胞膜やエンドソーム膜は二重リン脂質を主成分に形成されており、疎水性物質は細胞膜を溶解するようにして膜を透過する性質がある。本発明の遺伝子導入剤は、疎水性ポリマーブロックを有しているので、細胞の細胞膜と融合するようにして細胞膜を透過し、細胞内へ遺伝子を運搬する効果が期待できる。
【００５６】
＜疎水性／カチオン性ブロックコポリマー＞
前述の特定イニファターに疎水性モノマーを光照射リビング重合させて疎水性ポリマーブロック鎖を形成させた後、さらに、カチオン性モノマーを光照射リビング重合させて、カチオン性ポリマーブロック鎖を形成させた、基端側が疎水性ポリマーブロック鎖で構成され、先端側がカチオン性ポリマーブロック鎖で構成された分岐鎖を有する分岐型重合体（ブロックコポリマー）。
【００５７】
ここで、特定イニファター、カチオン性モノマーとしては、前述のカチオン性ホモポリマーのそれと同様である。
また、２種類のモノマーを順次光照射リビング重合させる方法は、上述のカチオン性／疎水性ブロックコポリマーの場合と同様である。
【００５８】
疎水性モノマーとしては、炭素数が５以上、特に５〜２０の非極性基を有するものが好ましい。炭素数が５以上の非極性基としては、フェニル基、ベンジル基、オクチル基、オクタデシル基、フロレニル基等が挙げられる。
【００５９】
疎水性モノマーとしては、具体的には、９−ビニルカルバゾール、スチレン、４−アセチルアミノスチレン及び４−ビニル安息香酸メチルなどが挙げられる。また、酸性又は、アルカリ性条件下では親水性であっても、中性条件下では疎水性である４−アミノスチレン及び４−ビニル安息香酸などを用いることもできる。
【００６０】
これらの疎水性モノマーは、１種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。即ち、疎水性ポリマーブロック鎖は、２種以上の疎水性モノマーの共重合体であってもよい。
【００６１】
疎水性ポリマーブロックの分子量は、１，０００〜２０，０００程度、特に１，０００〜１０，０００程度が好ましい。
【００６２】
また、カチオン性ポリマーブロックの分子量は１５，０００〜３００，０００程度、特に３０，０００〜１５０，０００程度が好ましい。
【００６３】
カチオン性ポリマーブロック鎖の分子量が上記下限未満であると核酸のイオン凝集力が不足しやすく、分子量が上記上限を超えると細胞毒性が強く発現されやすい。
【００６４】
この疎水性／カチオン性ブロックコポリマーは、分岐鎖のカチオン性ポリマーブロック鎖が核酸を捕捉して包囲し、生体内の酵素による核酸の失活、分解を抑制することができる。
【００６５】
また、水に溶解すると疎水性ブロック鎖同士の間に吸引力ないし凝集力が生じ、複数個のスター型ポリマーが各々の中心部（芳香族環及び分岐鎖基端側）を重畳させる如くして集合ないし凝集し、スター型ポリマー複合体を構成するものと考えられる。このスター型ポリマー複合体は、１個のスター型ポリマーの分岐鎖をｎとして、集合したスター型ポリマーの数をｍとした場合、中心部からｎ×ｍ本の分岐鎖が放射方向に伸延した、分岐鎖の数が著しく多いものとなる。
【００６６】
また、このスター型ポリマー複合体の各分岐鎖の末端側は、カチオン性であり、互いに反発するので、各分岐鎖は、相互間に距離をあけて、スター型ポリマー複合体の中心部から放射方向に伸延する。
【００６７】
このように、放射状に伸延したスター型ポリマー複合体は、単独で存在する１個のスター型ポリマーに比べて、ＤＮＡの包蔵能力が著しく高いものとなる。
【００６８】
このスター型ポリマー複合体は、水溶液中において疎水性ポリマーブロック鎖をカチオン性ブロック鎖が包囲するミセルを形成するものと推察される。また、このスター型ポリマー複合体は、カチオン性ポリマーブロック鎖同士が電荷によって反発して伸延するため、３次元のデンドリマー様のミセルを形成するものと考えられる。
【００６９】
このスター型ポリマーは、疎水性ポリマーブロック鎖を有しているので、エンドソーム膜を効率よく、脂質融合するように透過して核へ外来遺伝子を運搬する作用も奏し得るものと考えられる。
【００７０】
＜非イオン性／カチオン性ブロックコポリマー＞
前述の特定イニファターに、非イオン性モノマーを光照射リビング重合させて非イオン性ポリマーブロック鎖を形成させた後、さらに、カチオン性モノマーを光照射リビング重合させてカチオン性ポリマーブロック鎖を形成させた、基端側が非イオン性ポリマーブロック鎖で構成され、先端側がカチオン性ポリマーブロック鎖で構成された分岐鎖を有する分岐型重合体（ブロックコポリマー）。
【００７１】
ここで、特定イニファター、カチオン性モノマーとしては、前述のカチオン性ホモポリマーのそれと同様である。
また、２種類のモノマーを順次光照射リビング重合させる方法は、前述のカチオン性／疎水性ブロックコポリマーの場合と同様である。
【００７２】
非イオン性モノマーとしては、この非イオン性モノマーの重合体が水溶液中において静電気的、疎水結合的又は立体的に干渉し合うことがないものであればどのようなモノマーでもよく、例えば、炭素数が１０以下、特に５〜８の非イオン性モノマーを挙げることができ、具体的には、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート及び２−メトキシエチル（メタ）アクリレート等を挙げることができる。
【００７３】
これらの非イオン性モノマーは、１種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。即ち、非イオン性ポリマーブロック鎖は、２種以上の非イオン性モノマーの共重合体であってもよい。
【００７４】
この非イオン性ポリマーブロック鎖よりなる分岐鎖の好ましい分子量は１００〜５００００であり、特に好ましい分子量は１００〜１００００であり、さらに好ましい分子量は１００〜５０００である。この非イオン性ポリマーブロック鎖は、核酸とは結合しないポリマーブロック鎖であるので、生分解、代謝、排泄の観点から、できるだけ短いほうが好ましい。
【００７５】
また、カチオン性ポリマーブロック鎖の分子量は３，０００〜３００，０００程度、特に１５，０００〜１５０，０００程度が好ましい。カチオン性ポリマーブロック鎖の分子量が上記下限未満であると、カチオン性ポリマーブロックによる核酸の吸着効果を十分に得ることができず、分子量が上記上限を超えると得られる遺伝子導入剤の分子量が大きくなりすぎ、細胞障害性の面で好ましくない。
【００７６】
非イオン性／カチオン性ブロックコポリマーは、分岐鎖の基端側が非イオン性ポリマーブロックによって構成されているため、分岐鎖の基端側において、分岐鎖同士が電気的斥力によって反発することがなく、分岐鎖の動きが制限されにくく、各分岐鎖の運動自由度が大きい。
【００７７】
また、各分岐鎖の先端側は、カチオン性モノマーにより構成されているが、非イオン性ポリマーブロック鎖の長さの分だけ核から離れているため、カチオン性ポリマーブロック鎖の相互間の距離が遠くなっている。従って、カチオン性ポリマーブロック同士の反発力が小さく、カチオン性ポリマーブロック鎖の運動自由度が大きい。即ち、核に直接カチオン性モノマーを重合した遺伝子導入剤よりもカチオン性ポリマーブロック鎖の運動自由度が大きく、核酸の包蔵能力が高いものである。
【００７８】
＜カチオン性ポリマーブロック部分に疎水基を含む側鎖を有するカチオン性ポリマー＞
前述の特定イニファターに少なくともカチオン性モノマーを光照射リビング重合させて得られた分岐型重合体のカチオン性ポリマーブロックに疎水基を導入したもの。この場合、この分岐型重合体を第１次分岐型重合体として架橋反応させた架橋体とすることが有効である。
【００７９】
ここで、特定イニファター、カチオン性モノマー及びその光照射リビング重合方法としては、前述のカチオン性ホモポリマーのそれと同様である。
【００８０】
カチオン性ポリマーブロック部分への疎水基を有する側鎖の導入は、以下の方法に従って、架橋反応と同時に行うことが好ましい。
即ち、疎水基導入のために１次分岐型重合体に反応させる化合物としてベンジル（Ｎ，Ｎ−ジアルキル）ジチオカルバメート等のベンジル（Ｎ，Ｎ−ジ置換）ジチオカルバメートを用い、これと１次分岐型重合体との混合物、好ましくはペースト状混合物に光照射することにより、１次分岐型重合体のカチオン性ポリマーブロックの側鎖に疎水基を導入すると共に、１次分岐型重合体を架橋反応させる。
【００８１】
即ち、この方法であれば、光照射により、ベンジル（Ｎ，Ｎ−ジ置換）ジチオカルバメートのベンジルラジカルが生成し、これが１次分岐型重合体のカチオン性ポリマーブロックの側鎖、例えば、カチオン性ポリマーブロックを構成するカチオン性モノマーである３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドのプロピル鎖部分に付加反応して、この３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドで構成される側鎖にベンジル基の疎水基が導入される。同時に、１次分岐型重合体は光照射により、分岐鎖のＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミル基のチオ基が開いて分岐鎖同士が架橋することにより架橋体が生成する。
【００８２】
疎水基導入のための化合物として液体のベンジル（Ｎ，Ｎ−ジ置換）ジチオカルバメートを用いることにより、このベンジル（Ｎ，Ｎ−ジ置換）ジチオカルバメートと１次分岐型重合体とでペースト状の混合物とすることが可能となり、この混合ペーストに対して、均質な光照射を行って、効率的なベンジル基の付加反応と架橋反応を行うことができる。
【００８３】
ここで用いるベンジル（Ｎ，Ｎ−ジ置換）ジチオカルバメートとしては、特に、エチル基等の炭素数２〜１８個のアルキル基で置換されたベンジル（Ｎ，Ｎ−ジアルキル）ジチオカルバメートが好ましいが、この置換基はアルキル基に限らず、フェニル基など芳香族系の炭化水素基であっても構わない。即ち、ベンジル（Ｎ，Ｎ−ジアルキル）ジチオカルバメートに限らず、ベンジル（Ｎ，Ｎ−ジアリール）ジチオカルバメートの脂肪族炭化水素基及び／又は芳香族炭化水素基で置換されたベンジル（Ｎ，Ｎ−ジ置換）ジチオカルバメートであれば目的を達成することができる。
なお、ベンジル（Ｎ，Ｎ−ジ置換）ジチオカルバメートのベンジル基のベンゼン環は、その疎水性や反応性に影響しないメチル基等の置換基で置換されていても良い。
【００８４】
このようなベンジル（Ｎ，Ｎ−ジ置換）ジチオカルバメートと１次分岐型重合体とを混合してペースト化する際の混合割合は、光照射効率と取り扱い性に優れたペースト状混合物が得られれば良く、特に制限はないが、通常、１次分岐型重合体に対して１〜２０重量倍のベンジル（Ｎ，Ｎ−ジ置換）ジチオカルバメートを混合することが好ましい。
【００８５】
このような混合ペーストへの光の照射条件は、光波長１８０〜７００ｎｍ、照射時間１分〜３０，０００時間、照射強度０．００１〜１０，０００μＷ／ｃｍ２程度が好適である。
【００８６】
このようにして得られる架橋体の分子量は３０，０００〜３００，０００、特に５０，０００〜１５０，０００であることが好ましい。
また、架橋体に導入されるベンジル基等の疎水基の数は、架橋前の１次分岐型重合体の１分子当たり３〜３００個程度であることが好ましい。
【００８７】
ここで、１次分岐型重合体や架橋体の分子量が小さ過ぎると核酸を凝集する能力に欠け、大き過ぎると細胞毒性が強くなり好ましくない。
また、疎水基の導入量が少な過ぎると疎水基を導入したことによる細胞透過性の向上効果を十分に得ることができず、多過ぎると、分岐型重合体の疎水性が強くなり過ぎて、核酸の凝縮作用が劣る傾向にある。
【００８８】
即ち、このカチオン性ポリマーの架橋体では、分岐型重合体のカチオン性ポリマーブロック部分に疎水基を有し、かつ分岐型重合体が架橋された架橋体よりなるため、その構造上の利点により、ＤＮＡなどの核酸を高密度に凝縮することができる。即ち、この架橋体は、分岐型重合体が複数個架橋したものであるため、１個の分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤に比べてＤＮＡなどの核酸をより広いネットワークで包蔵することができ、優れた遺伝子導入活性を示すようになる。しかも、分岐型重合体のカチオン性ポリマーブロック部分に疎水基が導入されていることによる良好な細胞透過性を有し、エンドソーム膜を効率よく、脂質融合するように透過して核へ外来遺伝子を運搬する。
【００８９】
＜感温性／カチオン性ブロックコポリマー＞
前述の特定イニファターに、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体を光照射リビング重合させてそのポリマーブロック鎖を形成した後、さらに、カチオン性モノマーを光照射リビング重合させてカチオン性ポリマーブロック鎖を形成し、基端側がＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体のポリマーブロック（以下、「感温性ポリマーブロック」と称す場合がある。）で、先端側がカチオン性ポリマーブロックのブロックコポリマーよりなる分岐鎖を形成した分岐型重合体（ブロックコポリマー）。
【００９０】
このカチオン性分岐型重合体に導入されたＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体は、生体温度よりも低温の所定温度（Ｔ）よりも低い温度では親水性であるが、該所定温度（Ｔ）よりも高い温度環境下に置くと、相転移して疎水性となる温度感応性のモノマーである。即ち、このブロックコポリマーは、核となる芳香族環に温度感応性モノマーであるＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体を重合させた後、カチオン性モノマーを重合させたものである。この遺伝子導入剤は、従って、該所定温度（Ｔ）よりも高い状態にあるときには、スター型ポリマーの分岐鎖の基端側は疎水性ポリマーブロック鎖にて構成され、それよりも先端側はカチオン性ポリマーブロック鎖にて構成されたものとなる。
【００９１】
このブロックコポリマーは、カチオン性ポリマーブロック鎖が、アニオン性の核酸を捕捉して包蔵する。また、この遺伝子導入剤は、上記所定温度（Ｔ）よりも高い温度の水溶液中において、分岐鎖の基端側を構成している各疎水性ポリマーブロック鎖同士の間に吸引力ないし凝集力が生じ、複数個のスター型ポリマーが各々の中心部（芳香環及び分岐鎖基端側）を重畳させる如くして集合ないし凝集し（以下、この現象を「分子間凝集現象」と称す場合がある。）、デンドリマー様のスター型ポリマー複合体を構成するものと考えられる。このスター型ポリマー複合体は、１個のスター型ポリマーの分岐鎖をｎとして、集合したスター型ポリマーの数をｍとした場合、中心部からｎ×ｍ本の分岐鎖が放射方向に伸延した、分岐鎖の数が著しく多いものとなる。
【００９２】
また、このスター型ポリマー複合体の各分岐鎖の末端側は、カチオン性であり、互いに反発するので、各分岐鎖は、相互間に距離をあけて、スター型ポリマー複合体の中心部から放射方向に伸延する。
このように、放射状に伸延したスター型ポリマー複合体は、単独で存在する１個のスター型ポリマーに比べて、ＤＮＡの包蔵能力が著しく高いものとなる。
このようなことから、遺伝子導入効率に優れた核酸複合体を製造することができる。
【００９３】
なお、生体温度よりも低温度の所定温度（Ｔ）とは、２５〜３５℃、例えば３０℃前後であることが好ましく、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドのポリマーブロック鎖を導入した場合には、通常、この所定温度（Ｔ）は約３０℃である。
【００９４】
ここで、特定イニファター、カチオン性モノマーとしては、前述のカチオン性ホモポリマーのそれと同様である。
また、２種類のモノマーを順次光照射リビング重合させる方法は、前述のカチオン性／疎水性ブロックコポリマーの場合と同様である。
【００９５】
このブロックコポリマーよりなるカチオン性分岐型重合体の分子量は、これを構成するイニファター、カチオン性モノマー、及びＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体の種類等によっても異なり、一概には言えないが、３，０００〜１，０００，０００、特に１５，０００〜１５０，０００であることが好ましい。カチオン性分岐型重合体の分子量がこの範囲外であると核酸複合体を生成しにくく、特に、カチオン性分岐型重合体の分子量が小さ過ぎると、好適な分岐型コポリマーの分子設計を十分に行うことができず、カチオン性分岐型重合体の分子量が大き過ぎると、代謝性、生分解性などが劣る傾向にあり、好ましくない。
【００９６】
また、カチオン性分岐型重合体中の感温性ポリマーブロック及びカチオン性ポリマーブロックの各々の分子量についても、各々のポリマーブロックを構成するモノマーの種類等によっても異なり、一概には言えないが、感温性ポリマーブロックの分子量は１，０００〜１０，０００、特に３，０００〜８，０００であり、カチオン性ポリマーブロックの分子量は１５，０００〜１５０，０００であることが好ましい。
【００９７】
感温性ポリマーブロックの分子量が小さ過ぎると、上述のカチオン性分岐型重合体の好適な分子量範囲において、生体温度よりも低温の所定温度（Ｔ）、例えば３０℃以上の温度でも水溶液中で安定してしまい、前述の分子間凝集現象が起こらず、大き過ぎると、カチオン性分岐型重合体の水に対する親和性が低過ぎて、水中で乳化してマクロ粒子を形成してしまい、好ましくない。
【００９８】
また、カチオン性ポリマーブロックの分子量が小さ過ぎると遺伝子導入活性が劣る傾向にあり、大き過ぎると、カチオン性分岐型重合体の分子量が徒に大きくなり、好ましくない。
【００９９】
＜カチオン性／アニオン性ブロックコポリマー＞
前述の特定イニファターにカチオン性モノマーを光照射リビング重合させてカチオン性ポリマーブロック鎖を形成させた後、さらに、アニオン性モノマーを光照射リビング重合させて、アニオン性ポリマーブロック鎖を形成させ、基端側がカチオン性ポリマーブロック鎖で構成され、先端側がアニオン性ポリマーブロック鎖で構成された分岐鎖を有する分岐型重合体（ブロックコポリマー）。或いは、逆に、前述の特定イニファターにアニオン性モノマーを光照射リビング重合させてアニオン性ポリマーブロック鎖を形成させた後、さらに、カチオン性モノマーを光照射リビング重合させて、カチオン性ポリマーブロック鎖を形成させ、基端側がアニオン性ポリマーブロック鎖で構成され、先端側がカチオン性ポリマーブロック鎖で構成された分岐鎖を有する分岐型重合体（ブロックコポリマー）。
ただし、いずれの場合も、カチオン性ポリマーブロックの重合度がアニオン性ポリマーブロックの重合度よりも大きく、複数の分岐鎖が多価陽イオンを介して架橋されている。アニオン性ポリマーブロックは酸性官能基を有した側鎖を有する分岐型重合体が、複数個、多価陽イオンを介して架橋されたものであっても良い。
【０１００】
ここで、特定イニファター、カチオン性モノマーとしては、前述のカチオン性ホモポリマーのそれと同様である。
また、２種類のモノマーを順次光照射リビング重合させる方法は、前述のカチオン性／疎水性ブロックコポリマーの場合と同様である。
【０１０１】
酸性官能基としてはカルボキシル基が好適であり、酸性官能基を有したアニオン性モノマーとしては、カルボキシスチレン具体的には４−ビニル安息香酸（４−カルボキシスチレン）又は３，４−カルボキシスチレンなどのカルボキシビニルベンゼンが好適である。なお、カルボキシビニルベンゼンは置換基を有していてもよい。
【０１０２】
カチオン性ポリマーブロックの重合度はアニオン性ポリマーブロックの重合度の２〜１００倍が好適である。
【０１０３】
なお、モノマーとして、カチオン性モノマーと、アニオン性モノマーと、非イオン性モノマーとを用いても良く、この場合、イニファターに対する重合の順序は、任意である。即ち、１つの分岐鎖を構成するカチオン性ブロック、アニオン性モノマーのブロック、非イオン性ポリマーブロックの配列順序は任意である。
【０１０４】
非イオン性モノマーとしては、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールアルキルエステル（メタ）アクリレート、ポリビニルピロリドンなどを用いることができる。非イオン性ポリマーブロックの分子量は、２，０００〜５００，０００が好適である。
【０１０５】
架橋部分の多価陽イオンとしては多価金属イオン特に２価の金属イオンとりわけカルシウムイオン及び／又はマグネシウムイオンが好適である。
【０１０６】
多価陽イオンを介して分岐型重合体同士を架橋させるには、多価陽イオン好ましくは多価陽イオンの塩の水溶液を分岐型重合体の水溶液に添加し、常温又は加温下で１０〜６０分程度撹拌するのが好ましい。この塩としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、りん酸塩、炭酸塩、カルボン酸塩などが好適であり、具体的には塩化カルシウム、塩化マグネシウムが好ましい。この塩の水溶液の濃度は通常は０．１ｗｔ％〜飽和濃度程度が好ましい。添加する塩の量は、分岐型重合体の酸性官能基の当量の０．１倍〜１０倍程度が好ましい。
【０１０７】
架橋反応させた後は、水を透析液として透析処理し、未反応の塩や残留する酸根を除去するのが好ましい。
【０１０８】
このようにして生成したカチオン性ポリマーブロックを有したブロックコポリマーの架橋体が核酸を核酸含有複合体として包囲することによって、生体内の酵素による核酸の失活、分解を抑制することができる。
【０１０９】
このブロックコポリマーは、強酸性のエンドソーム内でイオン結合の破壊によって解離して、イオン複合体からの遺伝子を拡散を促進できるほか、ポリマー自体も低分子量化が進み、細胞外への排除が容易に行われる。すなわち、ＤＮＡとの混合時、細胞への作用時である生理的ｐＨにおいては、多価陽イオンのキレーションによる分子間架橋を維持しているが、細胞内へ取り込まれた後、強酸性のエンドソーム内ではこのキレーションによる分子間結合は容易に解離し、架橋前のスター型ポリマーへ可逆的に戻ることができる。
【０１１０】
なお、アニオン性ブロック鎖がｐＫａ＝１〜６程度のカルボキシル基などの酸性官能基を側鎖に有するものである場合、強酸性のエンドソーム内で疎水変性し、エンドソームからの脱出効率の向上をも期待することができる。
【０１１１】
＜カチオン性／アニオン性低級アルキルエステルランダムコポリマー＞
前述の特定イニファターに、カチオン性モノマーと、アニオン性モノマーの低級アルキルエステルとをランダム共重合させた分岐型重合体（ランダムコポリマー）。
【０１１２】
このように、カチオン性モノマーとアニオン性モノマーの低級アルキルエステルとのランダム共重合部分を有するランダムコポリマーのエステル部分は、ＤＮＡとの混合時、細胞への作用時である生理的ｐＨにおいては、電気的に中性なエステルのままとなっているが、細胞内へ取り込まれた後、強酸性のエンドソーム内ではこのエステル部分が加水分解し、酸性基となる。これにより、ランダムコポリマーのカチオン性モノマー由来の正電荷が電気的に中和されるようになり、ポリプレックスが崩解し易くなる。この結果、ポリプレックスからの核酸の放出が促進される。
【０１１３】
特に、アニオン性モノマーの低級アルキルエステルとして、４−ビニル安息香酸等の芳香族カルボン酸の低級アルキルエステルを用いると、製造されたランダムコポリマーのエステル部分が加水分解によりｐＫａ＝１〜６程度の酸性官能基（カルボキシル基）を側鎖に有するものとなり、強酸性のエンドソーム内でのポリプレックスの崩解が促進される。
【０１１４】
特定イニファターに重合させるカチオン性モノマーとしては、アクリル酸誘導体、スチレン誘導体等のビニル系モノマーが好適であり、特に、耐加水分解性に優れることから、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣ３Ｈ６Ｎ（ＣＨ３）２が好ましい。
【０１１５】
アニオン性モノマーの低級アルキルエステルとしては、ビニル基を有する芳香族カルボン酸の低級アルキルエステルが好適であり、特に４−ビニル安息香酸（４−メトキシカルボニルスチレン）又は３，４−ジメトキシカルボニルスチレンなどのビニルベンゼンカルボン酸と低級アルキルとのエステルが好適である。なお、ビニルベンゼンカルボン酸はその他の置換基を有していてもよい。また、低級アルキルエステルのアルキル基としては、炭素数１〜８のアルキル基、特にメチル基及びエチル基が好適である。
【０１１６】
前述の特定イニファターに対し、カチオン性モノマーとアニオン性モノマーの低級アルキルエステルとをランダム共重合させるには、イニファター及び各モノマーを含んでなる原料溶液を調製し、これに光照射する。この溶液の溶媒としては、アルカン、アルケン、アロマチック、ハロゲン化炭化水素が好適であり、具体的にはベンゼン、トルエン、クロロホルム、四塩化炭素又は塩化メチレンが挙げられ、中でもトルエン又はクロロホルムが好適である。
【０１１７】
カチオン性モノマー及びアニオン性モノマーの該原料溶液中の濃度は各々０．５Ｍ以上、例えば０．５〜２．５Ｍが好適である。イニファターの濃度は０．１〜１００ｍＭ程度が好適である。
【０１１８】
照射する光の波長は３００〜４００ｎｍが好適であり、例えば低圧水銀灯や高圧水銀灯などを用いることができる。光の照射時間は照射強度にも依存するが、１〜６０分程度が好適であり、１μＷ／ｃｍ２〜１０ｍＷ／ｃｍ２程度の低い照射強度で１分〜３０分程度が特に好適である。
【０１１９】
このようにして得られるカチオン性モノマーとアニオン性モノマーの低級アルキルエステルのランダム共重合部分を有した分岐型重合体の分子量は分岐鎖の鎖数にもよるが、３，０００〜６００，０００、特に３，０００〜１５０，０００程度であることが好ましい。
【０１２０】
なお、カチオン性モノマー由来の単位成分の数が５０〜１，０００であり、上記低級アルキルエステルモノマー由来の単位成分の数が５〜１，０００であり、カチオン性モノマー由来の単位成分の数が上記低級アルキルエステルモノマー由来の単位成分の数の０．５〜１００倍であることが好ましい。
【０１２１】
＜カチオン性ポリマーブロックを架橋反応させてなる架橋体＞
前述の特定イニファターに、カチオン性モノマーを光照射リビング重合させてカチオン性ポリマーブロックを形成し、さらに非イオン性モノマーを光照射リビング重合させると共に、少なくとも一部の分岐鎖のＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基を失活させてなる第１次分岐型重合体の、カチオン性ポリマーブロック部位を架橋反応させてなる架橋体。
【０１２２】
特定イニファターに重合させるカチオン性モノマーとしては、アクリル酸誘導体、スチレン誘導体等のカチオン性モノマーが好適なものとして挙げられるが、このカチオン性モノマーにより形成されるカチオン性ポリマーブロックが、架橋性を有すること、好ましくは光に感光して自己架橋（光解裂性官能基非由来性の架橋）する性質のものであることが必要であり、そのために、このカチオン性モノマーとしては、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣ３Ｈ６Ｎ（ＣＨ３）２等の自己架橋性カチオン性ビニル系モノマーが好ましい。
【０１２３】
一方、非イオン性モノマーとしては、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド等のＮ，Ｎ−ジアルキル（このアルキル基の炭素数は１〜５が好ましい。）アクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールアルキルエステル（メタ）アクリレート、ポリビニルピロリドンなどを用いることができる。これらの非イオン性モノマーは、１種を単独で用いても良く、２種以上を併用しても良い。
【０１２４】
イニファターと上記カチオン性モノマーとを反応させる方法は、前述のカチオン性ホモポリマーの場合と同様である。
【０１２５】
得られたカチオン性ホモポリマーに対し、非イオン性モノマーを光照射リビング重合させると共に、少なくとも一部の分岐鎖のＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基を失活させて目的とする第１次分岐型重合体とする。
【０１２６】
ここで、分岐鎖のＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基を失活させる方法としては、
(1) アルカリ触媒の存在下に加水分解させることによりＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基を除去する方法
(2) 非イオン性モノマーの光照射リビング重合時に、反応溶媒としてクロロホルム、塩化メチレンなどの連鎖移動性の溶媒を用い、光照射時にＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基を脱離させる方法
(3) Ｎ,Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチルベンゼンの存在下で希薄溶液で光照射を行ってＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基を脱離させる方法
(4) アスコルビン酸、安息香酸、システイン、メルカプトエタノール、酸素ガスなどのラジカル捕捉剤として周知の化合物の溶液中で光照射を行ってＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基を脱離させる方法
などが挙げられるが、非イオン性モノマーの光照射リビング重合時に併せてＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基の失活も行えることから、上記(2)の方法を採用することが好ましい。
【０１２７】
上記(2)の方法を採用して、前述のカチオン性ホモポリマーに非イオン性モノマーを光照射リビング重合によりブロック共重合させると共に、Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基を失活させるには、上記のようにして得られたカチオン性ホモポリマーを、クロロホルム、塩化メチレン、クロロベンゼン、ジクロロベンゼン等の連鎖移動性の溶媒に溶解させ、これに非イオン性モノマーを混合し、光を照射して重合させればよい。この重合反応を開始する際の溶液中におけるカチオン性ホモポリマーの濃度は０．０１〜１０重量％程度が好適であり、非イオン性モノマーの濃度は０．３〜３０重量％程度が好適である。光の照射条件は、光波長２５０〜４００ｎｍ、照射時間１〜１５０分、照射強度１００〜１０，０００μＷ／ｃｍ２程度が好適である。
【０１２８】
このようにして、イニファターに対してまずカチオン性モノマーを光照射リビング重合させ、次いで非イオン性モノマーを光照射リビングブロック共重合させると共にＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基を失活させることにより、基端側がカチオン性ポリマーブロック、先端側が非イオン性ポリマーブロックで構成され、かつ先端のＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基が失活することにより、分岐鎖の先端部分の光架橋性が消失ないしは低減されたブロックコポリマー鎖よりなる分岐鎖を有する第1次分岐型重合体（ブロックコポリマー）を得ることができる。
【０１２９】
このブロックコポリマーよりなる第1次分岐型重合体の分子量は、分岐鎖の数、これを構成するイニファター、カチオン性モノマー、及び非イオン性モノマーの種類等によっても異なり、一概には言えないが、１５，０００〜１，５００，０００、特に３０，０００〜３００，０００であることが好ましい。第1次分岐型重合体の分子量が小さ過ぎると、本発明に好適な分岐型重合体の分子設計を十分に行うことができず、第1次分岐型重合体の分子量が大き過ぎると、代謝性、生分解性などが劣る傾向にあり、好ましくない。また、第1次分岐型重合体を構成する前述のカチオン性ポリマーブロックの分子量及び、このカチオン性ホモポリマーに導入される非イオン性ポリマーブロックについても、分岐鎖の数や各々のポリマーブロックを構成するモノマーの種類等によって異なり、一概には言えないが、カチオン性ポリマーブロックの分子量は１５，０００〜３００，０００、特に３０，０００〜８０，０００で、非イオン性ポリマーブロックの分子量は１５，０００〜１５０，０００、特に３０，０００〜１００，０００であることが好ましい。カチオン性ポリマーブロックの分子量が小さ過ぎると核酸の吸着効果が低く、大き過ぎると細胞毒性が強くなり好ましくない。また、非イオン性ポリマーブロックの分子量が小さ過ぎると非イオン性ポリマーブロックを導入したことによる陽電荷の遮蔽効果を十分に得ることができず、大き過ぎると核酸とのイオン凝集を阻害してしまう。
【０１３０】
得られた第１次分岐型重合体のカチオン性ポリマーブロック部分を架橋反応させて架橋体とする架橋反応は、第1次分岐型重合体に光照射することによる光架橋反応で行うことが好ましい。
この第1次分岐型重合体の光架橋を行うには、次のｉ）又はii）の方法を採用することができる。
【０１３１】
ｉ)第１次分岐型重合体をメタノールなど適宜の溶媒に溶解させ、光を照射することにより、第1次分岐型重合体を架橋する。この架橋反応を開始させる際の溶液中の第１次分岐型重合体の濃度は０．０１〜１０重量％程度が好適である。
【０１３２】
ii）第１次分岐型重合体へ直接光照射を行うことによって分岐型重合体を架橋させる。この場合、ｉ)の溶媒へ溶解した溶液への処理と相違して、分岐型重合体の主鎖及び又は側鎖へ発生したラジカルが溶媒によって捕捉され、分岐型重合体の架橋反応が阻害されることを抑制することが可能となる。直接光照射を行う場合は、凍結乾燥粉末を霧状に攪拌して、ここへ光を照射することで均質な処理が可能となる。なお、第１次分岐型重合体をフィルム状に加工し、このフィルムへ処理を行うことも均質な架橋体を得る方法として好ましい。具体的には、ガラス板、金属板などの上へ第１次分岐型重合体の溶液、例えば、クロロホルム溶液を流延させ、ドクターナイフなどで液切りして均一な厚みとし、これを乾燥させることで均質なフィルムを形成させることが可能である。この場合の溶媒としては揮発性が高いメタノール、クロロホルムが好適である。
【０１３３】
第１次分岐型重合体の形状としてフィルム状を採用した場合、フィルムの厚さは１０μｍ〜２０００μｍ程度、特に５０μｍ〜１０００μｍ程度が好ましい。極端にフィルムが薄いと架橋効率が悪く、また極端にフィルムが厚いと光照射の効果が十分に得られない。
【０１３４】
また、第１次分岐型重合体の形状を粉末状にした場合、粉末の粒径は０．１〜１０００μｍ程度特に１００〜５００μｍ程度が好ましい。粒径を極端に小さくすることは困難であるが、逆に粒径を大きくした場合は光照射の効果及び光架橋効率が低下する。
【０１３５】
光の照射条件は、光波長３００〜４００ｎｍ、照射時間１〜３００分、照射強度０．１〜１０ｍＷ／ｃｍ２程度が好適である。
【０１３６】
このような光照射により、第１次分岐型重合体に含まれる自己架橋性のカチオン性ポリマーブロックが架橋反応を起こし架橋体が得られる。
【０１３７】
なお、この架橋反応で得られる架橋体の分子量（数平均分子量）には特に制限はないが、通常３０，０００〜３００，０００程度である。この分子量が小さ過ぎると第１次分岐型重合体を架橋したことによる本発明の効果を十分に得ることができず、大き過ぎると代謝性、生分解性などが劣るものとなる。
【０１３８】
この架橋体は、第１次分岐型重合体の末端の少なくとも一部のＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基が失活していることにより、その第１次分岐型重合体の分岐鎖の基端側のカチオン性ポリマーブロック同士が架橋してなる架橋体であると推察されるが、本発明者らによる種々の研究の結果、この遺伝子導入剤は、その構造上の利点により、第１次分岐型重合体よりもＤＮＡなどの核酸を高密度に凝縮することができることが認められた。
【０１３９】
即ち、この架橋体は、カチオン性の第１次分岐型重合体が複数個架橋したものであるため、１個のカチオン性分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤に比べて、その分岐鎖が入り組んだ複雑な３Ｄ構造により、ＤＮＡなどの核酸をより広いネットワークで包蔵することができ、優れた遺伝子導入活性を示すようになる。
【０１４０】
しかも、この第１次分岐型重合体の分岐鎖の基端側のカチオン性ポリマーブロックの先端側に非イオン性ポリマーブロックが形成されているため、この架橋体と核酸とを複合させた核酸複合体微粒子の粒子外周面にこの非イオン性ポリマーブロックが存在することにより、核酸複合体微粒子への血清タンパクの吸着が抑制される。即ち、カチオン性ポリマーブロックを内郭に配置してその外層へ非イオン性ポリマーブロックを配置することで、陽電荷を遮蔽し、水溶液中で斥力を働かせる分子設計がなされる。
【０１４１】
＜カチオン性ホモポリマーを非イオン性架橋鎖を介して架橋した架橋体＞
ここで、カチオン性ホモポリマーとは、前述の特定イニファターにカチオン性モノマーを光照射リビング重合して得られるものである。このカチオン性ホモポリマーを非イオン性架橋鎖を介して架橋した架橋体は、その構造上の利点により、ＤＮＡなどの核酸を高密度に凝縮することができる。すなわち、この架橋体は、カチオン性分岐型重合体が複数個架橋したものであるため、１個のカチオン性分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤に比べてＤＮＡなどの核酸をより広いネットワークで包蔵することができ、優れた遺伝子導入活性を示すようになる。
【０１４２】
また、このカチオン性分岐型重合体同士を架橋する架橋鎖が非イオン性であり、この架橋体と核酸とを複合させた核酸複合体微粒子の粒子外周面にこの非イオン性架橋鎖が存在することにより、核酸複合体微粒子への血清タンパクの吸着が抑制される。
【０１４３】
なお、カチオン性分岐型重合体同士を架橋する非イオン性架橋鎖のカチオン性分岐鎖への結合位置は分岐鎖の中間でも末端でも良く、また、カチオン性分岐鎖を構成する主鎖、側鎖、主鎖末端のいずれでも良い。
【０１４４】
カチオン性ホモポリマーの架橋を行うには、カチオン性ホモポリマーと、非イオン性架橋鎖導入のための非イオン性化合物（「架橋用化合物」と称す。）とをメタノール、クロロホルムなど適宜の溶媒に溶解させ、加熱するか、光を照射することにより、非イオン性架橋鎖を介してカチオン性スター型ポリマー同士を架橋するのが好ましい。
【０１４５】
この架橋反応を開始させる際の溶液中のカチオン性スター型ポリマーの濃度は０．０１〜１０重量％程度が好適であり、架橋用化合物の濃度は１０〜９９重量％程度が好適である。熱架橋させる場合の加熱条件は、３０〜３００℃、１分〜３０,０００時間程度が好適である。加熱の代わりに、又は加熱と共に、光照射することによっても架橋させることができる。光の照射条件は、光波長１８０〜７００ｎｍ、照射時間１分〜３０，０００時間、照射強度０．００１〜１０，０００μＷ／ｃｍ２程度が好適である。光架橋させる場合、カチオン性スター型ポリマーと架橋用化合物との混合溶液をガラス等の透明プレート上に流延させて乾燥させた後、３００〜４００ｎｍの光を１０秒〜５００時間程度照射するのが好ましい。
なお、光架橋のための光照射に際しては、カチオン性スター型ポリマーと架橋用化合物との混合溶液を凍結乾燥するなどして粉末化し、この粉末状態のカチオン性スター型ポリマーと架橋用化合物との混合物に対して光照射を行って光架橋させても良い。
【０１４６】
この架橋反応により、カチオン性スター型ポリマーを２〜１０個、特に２〜５個程度架橋させてマルチスター型ポリマーを形成するのが好ましい。
【０１４７】
この非イオン性架橋鎖は、Ｎ，Ｎ-ジメチルアクリルアミド、エチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルピロリドン、オキシアルキレン（メタ）アクリル酸エステル及びオキシアルキレンアクリルアミドなどの重合体部分を有するものが好適である。
【０１４８】
非イオン性架橋鎖は、スター型であってもよい。すなわち、上記カチオン性スター型ポリマーを製造するものと同様のイニファターに対し、Ｎ，Ｎ-ジメチルアクリルアミド、エチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルピロリドン、オキシアルキレン（メタ）アクリル酸エステル及びオキシアルキレンアクリルアミドの少なくとも１種を光照射リビング重合させた非イオン性分岐型重合体（以下「非イオン性スター型ポリマー」と称す場合がある。）を架橋用化合物として用いてもよい。この非イオン性分岐型重合体よりなる架橋鎖の製造条件は上記のカチオン性スター型ポリマーの製造条件と同様でよい。架橋鎖としての非イオン性スター型ポリマーの分子量は５０００〜２００，０００、特に１０，０００〜５０，０００程度が好適である。
【０１４９】
架橋鎖はスター型ではなく、線形であってもよい。線形架橋鎖としては、ポリマー鎖の両末端にラジカル解裂性官能基、好ましくはジチオカルバメート基を有した架橋鎖は、架橋反応に際し、ジチオカルバメート基のチオ基が開いてカチオン性スター型ポリマーの分岐鎖に結合し、この架橋鎖を介してカチオン性スター型ポリマー同士が連結されるものと推察される。
【０１５０】
［第１次分岐型重合体又はその架橋体の修飾形態］
本発明に係る第１次分岐型重合体又はその架橋体は、以下の［Ｉ］〜［Ｖ］のような修飾がなされたものであっても良い。
【０１５１】
［Ｉ］分岐鎖の末端に蛍光物質を導入することにより、核酸複合体を蛍光顕微鏡で観察することを可能としたもの。
この形態では、細胞内へ侵入した核酸複合体がどのように核まで移行するか、別波長の蛍光物質でラベルした核酸と併用することで核酸が細胞内でどのようにリリースされているかを研究することが可能となる。
【０１５２】
この蛍光物質としては、ｏ−フタルアルデヒド、ダンシルクロライド、フロレサミン、チアミン、マレイミド、ニンヒドリン、カテコールアミン、クマリン、トリヒドロキシインドール、ピレン、ベンゾピレン、ナフタレン、アントラセン、アミノナフタレンスルホン酸からなる群から選択される物質の誘導体などを用いることができる。
【０１５３】
この蛍光物質を導入するには、前述した光照射リビング重合工程において、４−アミノスチレンなどをモノマーとして追加重合を行い、スター型重合体の分岐鎖の末端に反応活性点であるアミノ基を導入する手法が代表例として挙げられる。導入したアミノ基へ反応性の蛍光物質を反応させれば良く、当業者に周知の蛍光分析用発色試薬などが利用可能である。また、４−アミノスチレンの代わりにメタクリル酸を追加重合し、分岐鎖の末端に導入されたカルボキシル基へ蛍光物質を導入することも可能である。この場合も当業者に周知のカルボン酸分析用の蛍光発色試薬などが利用可能である。
【０１５４】
［II］分岐鎖に、ＲＧＤ配列（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列）を有するペプチドが結合しているもの。
この形態のものは、ＲＧＤ配列を有するペプチドを有していることにより、血管内皮細胞のインテグリンを介して血管内皮細胞内へも容易に侵入し得る。
【０１５５】
［III］分岐鎖に、ポリＬ−リジンが導入されているもの。
この形態のものは、例えば、リジンが７個以上重合したポリＬ−リジンは肝細胞のレセプタであるヘパラン硫酸に対する指向性を有しており、肝細胞に容易に侵入し得る。
【０１５６】
ポリＬ−リジンを導入するには、まず分岐鎖にアミノ基を導入する。このアミノ基を導入するには、アミノ基を有するポリマー鎖を上記高分子ブロック鎖に結合させるのが好ましい。アミノ基を有するポリマー鎖としては、ポリアミノスチレン、メタクリル酸２−アミノエチル、などが使用可能であるが、とりわけポリアミノスチレンが好適である。ポリアミノスチレンを導入するには、上記３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドの重合体が結合した分岐型重合体を溶媒に溶解させ、アミノスチレンを添加し、光照射重合させるのが好ましい。高分子鎖１本当りに導入するポリアミノスチレンの重合度は２分子ブロック〜２０分子ブロック程度が好適である。
【０１５７】
このようにアミノ基を導入した分岐型重合体に対しポリＬ−リジンを導入する。詳しくは、ポリＬ−リジンの末端のカルボキシル基と、上記アミノ基とを脱水縮合させる。このポリＬ−リジンの重合度は３以上、好ましくは５〜５０程度が好ましい。ポリＬ−リジンを上記アミノ基を有する高分子化合物に導入するには、この高分子化合物をリン酸バッファー中に溶解させ、Ｎ−［ｅ−マレイミドカプロイルオキシ］スクシンアミドエステルを触媒として添加し、ポリＬ−リジンを混合し、室温程度で反応させればよい。
【０１５８】
［IV］分岐鎖に、加水分解性結合を有するもの。
この形態のものは、ランダムにモノマーユニット又はオリゴマーユニットに分解されることにより分子量が小さくなる。従って、生体から排出され易く、生体への蓄積を防止ないし抑制することが期待できる。
【０１５９】
加水分解性結合を導入するには、上記特定イニファターに対し加水分解性結合を有する化合物を結合させてから、この化合物に対し主鎖を重合させて分岐型重合体を合成する（即ち、分岐鎖の基端に加水分解性結合を導入する）か、又は、この分岐型重合体を合成する途中で、成長しつつある主鎖末端に加水分解性結合を有する化合物を重合させ、その後、再度主鎖を成長させる。もしくは、上記のように合成したスター型分岐型重合体を加水分解性結合を有する架橋鎖を介して架橋させることにより、マルチスター型ポリマーよりなる架橋体を合成する。
【０１６０】
この分岐型重合体（スター型ホモポリマー）の架橋を行うには、スター型ホモポリマーと、加水分解性結合を有する架橋用化合物とをメタノールなど適宜の溶媒に溶解させ、加熱するか、光を照射することにより、架橋鎖を介してスター型ホモポリマー同士を架橋するのが好ましい。
【０１６１】
この加水分解性結合としてはエステル結合、エーテル結合、アミド結合などが好ましく、特にエステル結合が好ましい。エステル結合を有する架橋用化合物としては、両端にＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を有し、途中にエステル結合を有する鎖状化合物が好ましい。この鎖状化合物の炭素数は２〜１０００程度が好ましく、エステル結合の数は１〜２０個程度が好ましい。好適な架橋用化合物は、炭素数２〜２０の末端ジカルボン酸のそれぞれにＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸又はその塩（例えばナトリウム塩又はカリウム塩）を縮合させたビスチオカルバメートである。
【０１６２】
スター型ホモポリマー同士をビスチオカルバメートを介して架橋反応させる架橋反応では、ビスチオカルバメートの両端のＮ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団のチオ基が開いて架橋鎖が分岐鎖に結合し、この架橋鎖を介して分岐鎖同士が連結されるものと推察される。
【０１６３】
［Ｖ］分岐鎖に炭酸系イオンが結合しているもの。
このように分岐鎖に炭酸系イオンを有するものは、負電荷を有する核酸とイオン複合体を形成し、細胞へ作用させることでエンドサイトーシスにより細胞内へ取り込まれる。細胞取り込み後は強酸性でかつ３７℃付近の生理的温度下にあるエンドソーム中でポリカチオンの側鎖に付加した炭酸塩から炭酸ガスが気体として放出され、容積の膨張によってエンドソームへ穿孔してイオン複合体のエンドソーム脱出を促進する。
【０１６４】
このように、浸透したプロトンによるエンドソーム内外の浸透圧差だけでなく、イオン複合体から積極的に炭酸ガスを放出させることで内圧を上げてエンドソーム膜の破壊を助長させるものである。なお、生成した二酸化炭素は生体への影響が少ない。
【０１６５】
炭酸系イオンとしては、炭酸イオン及び炭酸水素イオンの少なくとも１種が好ましい。炭酸系イオンの結合量としては、分岐鎖の主鎖の炭素原子１０００個当たり、炭酸系イオンが１０〜５００程度結合する程度が好ましい。
【０１６６】
炭酸系イオンとして炭酸イオンを分岐鎖に結合させるには、この分岐型重合体（スター型ホモポリマー）の架橋を行うには、スター型ホモポリマーの濃度０．１〜２０重量％程度の水溶液に炭酸ガスをバブリング（通気）するのが好ましい。炭酸ガスの通気量としては、水溶液１Ｌ当り０．１〜５．０Ｌ／ｍｉｎ程度であればよいが、これに限定されない。通気時間は１０〜６０ｍｉｎ程度が好適である。この通気時の水温は低い方が好ましい。
【０１６７】
［分子量分画］
本発明では、上記のような第1次分岐型重合体又はこの第１次分岐型重合体を架橋させて得られた架橋体を分子量分画し、重量平均分子量Ｍｗと数平均分子量Ｍｎとの比Ｍｗ／Ｍｎが１．０〜１．５の画分を分取して遺伝子導入剤とする。
【０１６８】
即ち、本発明者らの研究により、前述の第１次分岐型重合体又はこの第１次分岐型重合体を架橋してなる架橋体は、遺伝子導入活性に優れたものであるが、光照射リビング重合、更にはその後の架橋反応により、種々の分子量のものが混在する反応生成物が得られ、この反応生成物を分子量毎に分画すると、遺伝子導入活性が高い画分と、遺伝子導入活性が高くない画分とがあり、分子量毎に遺伝子導入活性に大きな差異があることが判明した。
【０１６９】
本発明では、このような様々な分子量の第１次分岐型重合体又はその架橋体が混在する反応生成物から、遺伝子導入活性が非常に高い画分として、重量平均分子量Ｍｗと数平均分子量Ｍｎとの比Ｍｗ／Ｍｎが１．０〜１．５の画分を分子量分画により取り出して遺伝子導入剤として用いる。
【０１７０】
例えば、第１次分岐型重合体を架橋して分岐鎖が第１次分岐型重合体よりも更に複雑に入り組んだ架橋体とすることにより、核酸の包蔵効果、凝縮効果を高めて、架橋前の第１次分岐型重合体に対して約１０倍の遺伝子導入活性の向上効果を得ることができたが、本発明では、このような架橋反応生成物から、特定の、遺伝子導入活性が飛躍的に向上した画分のみを選択的に抽出して用いることにより、架橋前の第１次分岐型重合体に比べて約１００倍の遺伝子導入活性を得ることができる。
【０１７１】
なお、第１次分岐型重合体の架橋により遺伝子導入活性が低下している画分のうち、分子量が著しく高い画分では細胞毒性が発現されるおそれがあり、逆に低分子量側では、単なる光分解性側鎖の分解による極性基の露出やイオン交換容量の低下などが考えられる。
【０１７２】
本発明で抽出する重量平均分子量Ｍｗと数平均分子量Ｍｎとの比Ｍｗ／Ｍｎが１．０〜１．５の画分とは、これらの幅広い分子量分布のうちの略中央付近に存在する画分である。
【０１７３】
この分子量分画は、液体クロマトグラフィー、サイス排除クロマトグラフィー、イオン交換法、電気泳動法、遠心分離法、疎水分離法、ゲル浸透遠心法などによって行うことができる。
【０１７４】
分子量分画を液体クロマトグラフィーで行う場合、その移動相およびカラムの選択に関しては、ポリマーの化学構造を考慮して当業者に周知の方法を行えば良い。例えば、アルキルアミン系のカチオン性ポリマーの場合であれば、アクリルアミドゲル系のカラムを使用し、移動相に臭化リチウム等の電解質を５〜５０ｍＭ程度含むＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド等の溶媒を用いて、カラムとポリマー分子の間のイオン排除作用やポリマー鎖のイオン反発を抑制しながらゲル浸透により分子量に応じた精度の高い分離を行う方法が挙げられる。
【０１７５】
液体クロマトグラフィーにおけるカラム温度は４０〜６０℃とすることが室温との差が大きいために温度制御が安定して精度高く行え、かつ、移動相の溶液粘度を下げてカラム性能を最大限に引き出せる点で好ましい。
【０１７６】
本発明では、このような分子量分画により、重量平均分子量Ｍｗと数平均分子量Ｍｎとの比Ｍｗ／Ｍｎが１．０〜１．５の画分を抽出するが、より好ましくはこのＭｗ／Ｍｎは１．０〜１．４、特に好ましくは１．０〜１．２であり、このように、分子量分布が適度に狭い画分を分取することにより、遺伝子導入活性に優れた遺伝子導入剤を得ることができる。
ここで、重量平均分子量Ｍｗ、数平均分子量ＭｎとはＧＰＣ（ゲルパーミエーションクロマトグラフィー）によるポリエチレングリコール換算の値である。
【０１７７】
なお、この分取する画分の量が少な過ぎると遺伝子導入剤の製造効率が悪く、多過ぎると、特定のＭｗ／Ｍｎ比の画分を分取することによる本発明の効果を十分に得ることができない。従って、架橋体を得るための架橋反応生成物又は分岐型重合体を得るための分岐型重合反応生成物のうち、Ｍｗ／Ｍｎが１．０〜１．５の画分であって、１０〜３０重量％、例えば２０重量％程度の画分を分取することが好ましい。
【０１７８】
本発明では、このように分子量分画して得られた特定の画分の第１次分岐型重合体又はその架橋体を遺伝子導入剤とする。
【０１７９】
［核酸複合体］
上述のようにして得られた本発明の遺伝子導入剤（ベクター）が核酸を核酸含有複合体として包囲することによって、生体内の酵素による核酸の失活、分解を抑制することができる。
【０１８０】
上記遺伝子導入剤と核酸とを複合させるには、遺伝子導入剤の濃度１〜１０００μｇ／ｍＬ程度の溶液に対し、核酸を添加し、混合すればよい。核酸に対して遺伝子導入剤を過剰量添加し、遺伝子導入剤中のカチオン性ポリマーを核酸に対し飽和状態に核酸含有複合体として複合化させるのが好ましい。
【０１８１】
なお、前記の通り、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体をブロック共重合させた遺伝子導入剤は、約３０℃よりも高い温度で疎水性であり、約３０℃よりも低い温度で親水性である。従って、３０℃よりも低い温度で核酸と遺伝子導入剤の水溶液とを混合して遺伝子導入剤に核酸を複合させることができる。
【０１８２】
約３０℃よりも高い温度では、核酸を複合した遺伝子導入剤は、温度感応性核酸よりなる疎水性部分を有し、水不溶性となる。
【０１８３】
核酸の好ましい例としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子），ｐ５３癌抑制遺伝子及びＢＲＣＡ１癌抑制遺伝子やサイトカイン遺伝子としてＴＮＦ−α遺伝子，ＩＬ−２遺伝子，ＩＬ−４遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／ＩＬ−２遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／Ｂ２Ｍ遺伝子，ＩＬ−７遺伝子，ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子，ＩＦＮ−γ遺伝子及びＩＬ−１２遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｇｐ−１００，ＭＡＲＴ−１及びＭＡＧＥ−１などの癌抗原ペプチド遺伝子が癌治療に利用できる。
【０１８４】
また、ＶＥＧＦ遺伝子，ＨＧＦ遺伝子及びＦＧＦ遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｃ−ｍｙｃアンチセンス，ｃ−ｍｙｂアンチセンス，ｃｄｃ２キナーゼアンチセンス，ＰＣＮＡアンチセンス，Ｅ２Ｆデコイやｐ２１（ｓｄｉ−１）遺伝子が血管治療に利用できる。かかる一連の遺伝子は当業者には良く知られたものである。
【０１８５】
核酸複合体の粒径は５０〜４００ｎｍ程度が好適である。この粒径は、例えばレーザを用いた動的光散乱法によって測定される。粒径がこれよりも小さいと、核酸複合体内部の核酸にまで酵素の作用が及ぶおそれ、あるいは腎臓にて濾過排出されるおそれがある。また、これよりも大きいと、細胞に導入されにくくなるおそれがある。
【０１８６】
核酸は、細胞に導入されることによりその細胞内で機能を発現することができるような形態で用いる。例えばＤＮＡの場合、導入された細胞内で当該ＤＮＡが転写され、それにコードされるポリペプチドの産生を経て機能発現されるように当該ＤＮＡが配置されたプラスミドとして用いる。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、所望の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列されている。
【０１８７】
所望により２種以上の核酸をひとつのプラスミドに含めることも可能である。
【０１８８】
本発明において、核酸を導入する対象として望ましい「細胞」としては、当該核酸の機能発現が求められるものであり、このような細胞としては、例えば使用する核酸（すなわちその機能）に応じて種々選択され、例えば心筋細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、骨格筋細胞、血管内皮細胞、骨髄細胞、骨細胞、血球幹細胞、血球細胞等が挙げられる。また、単球、樹状細胞、マクロファージ、組織球、クッパー細胞、破骨細胞、滑膜Ａ細胞、小膠細胞、ランゲルハンス細胞、類上皮細胞、多核巨細胞等、消化管上皮細胞・尿細管上皮細胞などである。
【０１８９】
本発明の核酸複合体は培養試験に用いるほか、任意の方法で生体に投与することができる。
【０１９０】
生体への投与方法としては静脈内又は動脈内への注入が特に好ましいが、筋肉内、脂肪組織内、皮下、皮内、リンパ管内、リンパ節内、体腔（心膜腔、胸腔、腹腔、脳脊髄腔等）内、骨髄内への投与の他に病変組織内に直接投与することも可能である。
【０１９１】
この核酸複合体を有効成分とする医薬は、更に必要に応じて製剤上許容し得る担体（浸透圧調整剤、安定化剤、保存剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、増粘剤等）と混合することが可能である。これら担体は公知のものが使用できる。
【０１９２】
また、この核酸複合体を有効成分とする医薬は、含まれる核酸の種類が異なる２種以上の核酸含有複合体を含めたものも包含される。このような複数の治療目的を併せ持つ医薬は、多様化する遺伝子治療の分野で特に有用である。
【０１９３】
投与量としては、動物、特にヒトに投与される用量は目的の核酸、投与方法および治療される特定部位等、種々の要因によって変化する。しかしながら、その投与量は治療的応答をもたらすに十分であるべきである。
【０１９４】
この核酸複合体は、好ましくは遺伝子治療に適用される。適用可能な疾患としては、当該複合体に含められる核酸の種類によって異なるが、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、動脈拡張術後再狭窄等の病変を生じる循環器領域での疾患に加え、癌（悪性黒色腫、脳腫瘍、転移性悪性腫瘍、乳癌等）、感染症（ＨＩＶ等）、単一遺伝病（嚢胞性線維症、慢性肉芽腫、α１−アンチトリプシン欠損症、Gaucher病等）等が挙げられる。
【０１９５】
また、この核酸を複合した遺伝子導入剤の水溶液を基材に塗布などにより付着させ、必要に応じ乾燥させることにより、核酸を担持したポリマーのコーティング等が形成される。
【０１９６】
上記の核酸複合遺伝子導入剤を基材に付着させる場合、基材としてはシート状のものが好適である。このシート状基材の厚さは０．０５〜１０ｍｍ程度であることが好ましく、シート面の大きさは、方形の場合、一辺が１〜２０ｍｍであり他辺が１〜２０ｍｍであり、円形又は楕円形の場合、径は１〜２０ｍｍ程度が好ましい。基材の材料としては、ポリオレフィン、ポリスチレン、ポリエステル、ポリアミド、ポリウレタン、シリコン樹脂、フッ素樹脂などの合成樹脂が好適である。この基材は多孔質であってもよい。
【０１９７】
この基材に対する核酸複合遺伝子導入剤の付着量は、基材表面１ｃｍ２当り０．００１〜１０ｍｇ程度が好ましい。
【０１９８】
核酸複合遺伝子導入剤を担持させた基材よりなる遺伝子導入材料は、皮下組織、心筋組織、病変組織、病変血管を包囲するようにシート状基材を配置したり、カバードステントのフィルムへ塗布することによって生体内に配置したり、生体外面に粘着テープを用いて貼り付けたりするようにして用いられる。
【実施例】
【０１９９】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明する。
【０２００】
［実施例１］
＜（ａ）イニファターの合成＞
イニファターとしての１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンを次のようにして合成した。
【０２０１】
１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチルベンゼン）５．０ｇとＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム３４．０ｇをエタノール１００ｍＬ中へ加え、遮光下にて室温で４日間攪拌した。沈殿物を濾過し、３リットルのメタノールへ投入して３０分間攪拌して濾過した。この操作を繰り返して合計４回行った。沈殿物をトルエン２００ｍＬへ溶解した後、１００ｍＬのメタノールを加えて５０℃に加温し、冷蔵庫中で１５時間保管して再結晶させ、結晶を濾別後に大量のメタノールで洗浄した。結晶を室温で減圧乾燥して、白色の１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンの針状結晶を得た（収率９０％）。高速液体クロマトグラフィーにより、原料ピークが消失し、精製物が単一物質であることを確認した。
【０２０２】
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）の測定結果はδ１．２６−１．３１ｐｐｍ（ｔ，２４Ｈ，ＣＨ２ＣＨ３），δ３．６９−３．７７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ３．９９−４．０７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ４．５７ｐｐｍ（ｓ，８Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２），δ７．４９ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）となった。
【０２０３】
【化１】
【０２０４】
＜（ｂ）４分岐型スター型重合体よりなるカチオン性ホモポリマーの光重合による合成＞
３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドをカチオン性ビニル系モノマーとして用い、１，２，４，５−テトラキス［（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）ポリ（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル］ベンゼン（以下、ｐＤＭＡＰＡＡｍと記載することがある。）よりなるカチオン性ホモポリマーの合成を行った。
【０２０５】
即ち、上記（ａ）により合成した１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン４５．６ｍｇを２０ｍＬのトルエンへ溶解し、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド（３−Ｎ，Ｎ−ＤＭＡＰＡＡｍ）７．９ｇを加えて混合し、全量をトルエンで５０ｍＬに調整した。この液を３ｍｍ厚軟質ガラスセル中で激しく攪拌しながら高純度窒素ガスで５分間パージした後に、３００Ｗショートアークキセノンランプ（朝日分光社製、ＭＡＸ−３０１）で波長２５０ｎｍ〜４００ｎｍの混合紫外線を３０分間照射した。照射強度はウシオ電機社のＵＩＴ−１５０へＵＶＤ−Ｃ４０５（検出波長範囲３２０ｎｍ〜４７０ｎｍ）を装着して２．５ｍＷ／ｃｍ２に調整した。重合溶液をエバポレーターで濃縮し、ジエチルエーテルで重合物を再沈殿させ、クロロホルム／ジエチルエーテル系で３回再沈殿を繰り返して精製し、エーテルを蒸散させた後に少量の水へ溶解し、０．２μｍフィルターで濾過してから凍結乾燥させて４分岐型スター型ホモポリマーｐＤＭＡＰＡＡｍよりなるカチオン性ホモポリマーを得た（重合率３２％）。このカチオン性ホモポリマーの重量平均分子量はＧＰＣにより、５８，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．３３）と測定された。
【０２０６】
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ Ｄ２Ｏ）の測定結果は、δ１．５−１．８ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−），δ２．１−２．２ｐｐｍ(ｂｒ，６Ｈ，Ｎ−ＣＨ３)，δ２．２−２．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＣＨ２−Ｎ），δ３．０−３．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＮＨ−ＣＨ２），δ７．４−７．８ｐｐｍ（ｂｒ，１Ｈ，−ＮＨ−）となった。
【０２０７】
【化２】
【０２０８】
＜（ｃ）カチオン性ホモポリマーの光架橋＞
１，２，４，５−テトラキス［（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）−ポリ−（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル］ベンゼンの光架橋を行った。
即ち、上記（ｂ）で合成した分子量５８，０００の４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍホモポリマー０．３ｇを１００ｍＬ滅菌瓶へ入れ、土星型回転子で激しく攪拌しながら高純度窒素ガス（２Ｌ／分）で３０分間パージして均質な粉末状態へ粉砕した。ここへ窒素パージ及び激しい攪拌を続けながら（ｂ)と同じ光照射装置で光照射重合を行った。照射強度は１．０ｍＷ／ｃｍ２、光照射時間は２４０分で行った。照射終了後、得られた粉末は淡い黄褐色を帯びていた。これを５０ｍＬのメタノールを投入すると少量の不溶性のゲル状成分が生成していた。この溶液を＃２の濾紙で濾過した後、エバポレーターで濃縮し、ジエチルエーテルへ滴下してポリマー成分を沈殿させた。その後、クロロホルム／ジエチルエーテル系で３回再沈殿処理を行って精製した。
このものの分子量はＧＰＣにより１０９，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝２．５）と測定され、分子量の増大と分散のブロード化が確認された。
【０２０９】
＜（ｄ）カチオン性ホモポリマー光架橋体のフラクション分離と特定分子量分画の採取＞
島津製作所高速液体クロマトグラフシステムＬＣ１０Ａｖｐを使用し、上記（ｃ）で合成したカチオン性ホモポリマーの光架橋反応生成物のフラクション分離を行った。
移動相は臭化リチウム３０ｍＭのＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド溶液を使用した。カラムにはＡｓａｈｉｐａｃｋＧＦ−５１０ＨＱとＡｓａｈｉｐａｃｋ７１０ＨＱを連結したものを用い、カラム温度４０℃でサイズ排除分離を行った。フラクション分離はフラクションコレクターＦＲＣ−１０Ａを使用して行った。
【０２１０】
Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドを高真空エバポレーターで留去し、ジエチルエーテル中へ滴下してポリマー成分と電解質成分を沈殿させ、超遠心限外濾過キット（アミネックスス）を使用して脱塩し、凍結乾燥することでポリマー成分を分離精製した。
分離後の各フラクションの分子量、分離前の光架橋反応生成物中の存在比率（この面積比は重量比に等しい）を以下の表１にまとめた。
【０２１１】
【表１】
【０２１２】
＜（ｅ）各フラクションの遺伝子導入活性＞
細胞にはアフリカミドリサル腎細胞の由来のＣＯＳ-１を使用し、ＤＮＡにはｐＧＬ３コントロールベクターを使用した。ＣＯＳ-１細胞は細胞数を４万個／ｍＬへ調整して２４Ｗｅｌｌ培養皿へ播種し、培養２４時間後に遺伝子導入を行った。
上記ｄ）にて合成したカチオン性ホモポリマー架橋体のフラクション分離体の各画分を遺伝子導入剤として使用した。遺伝子導入剤中の単位重量あたりの陽電荷数はカチオン性ホモポリマーのモノマー単位の分子量１５６から計算して求めた。ＤＮＡ中の単位重量あたりの陰電荷数は配列マップによる塩基対数と核酸塩基の平均的分子量６６０とから計算した。
【０２１３】
この遺伝子導入剤をＤＮＡと１５０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ中で３０分間インキュベートした。混合比は電荷数の関係が陽電荷数が陰電荷数の２０倍となるように調整し、０．５μｇのＤＮＡが各Ｗｅｌｌへ投与されるように溶液を調整し、培養細胞へ加えた。トランスフェクションの４８時間後にルシフェラーゼアッセにより遺伝子導入活性の評価を行った（プロメガ社、アッセイキット試薬)。補正はタンパク濃度で行い、タンパク定量はＢｉｏＲａｄ社のＢｒａｄｆｏｒｄ試薬で行った。結果を図１に示す。
【０２１４】
［比較例１］
実施例１の（ｂ）で合成したカチオン性ホモポリマーを遺伝子導入剤として使用する以外は、実施例１における（ｅ）に準拠して遺伝子導入活性を評価した。結果を図２に示す。
【０２１５】
［比較例２］
実施例１の（ｃ）で合成したカチオン性ホモポリマーの架橋体を分子量分画することなくそのまま遺伝子導入剤として使用する以外は、実施例１における（ｅ）に準拠して遺伝子導入活性を評価した。結果を図２に示す。
【０２１６】
図２には、実施例１においてカチオン性ホモポリマーの架橋体から分子量分画により分取した画分４の遺伝子導入活性を併記した。
【０２１７】
図１より、光架橋反応生成物を分子量分画して得られた画分には、その遺伝子導入活性に大きな差異があり、Ｍｗ／Ｍｎが１．３０のものが著しく遺伝子導入活性に優れることが分かる。
また、図２より、カチオン性ホモポリマーを架橋することにより、遺伝子導入活性の向上が認められるが（比較例１と比較例２との対比）、この光架橋反応生成物から、特定の分子量分布の画分を抽出することにより、遺伝子導入活性が飛躍的に向上した遺伝子導入剤が得られることが分かる（比較例２と実施例１との対比）。
【図面の簡単な説明】
【０２１８】
【図１】実施例１における分子量分画で得られた各画分の遺伝子導入活性の評価結果を示すグラフである。
【図２】実施例１、比較例１及び比較例２における遺伝子導入活性の評価結果を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
芳香環に、分岐鎖としてのＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が３個以上導入された芳香族化合物をイニファターとし、このイニファターの分岐鎖に少なくともビニル系モノマーを光照射リビング重合させた分岐型重合体、又はこの分岐型重合体の分岐鎖を架橋反応させた架橋体よりなる遺伝子導入剤であって、
該分岐型重合体又は該架橋体を分子量分画して得た、重量平均分子量Ｍｗと数平均分子量Ｍｎとの比Ｍｗ／Ｍｎが１．０〜１．５の画分よりなることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項２】
請求項１において、前記架橋体は、前記分岐型重合体に光照射することにより、該分岐型重合体の分岐鎖を架橋反応させたものであることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項３】
請求項１又は２において、該Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基がＮ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル基であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項において、前記イニファターが、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が結合していることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項において、前記ビニル系モノマーが、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド及び／又は２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートを含むことを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項６】
芳香環に、分岐鎖としてのＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が３個以上導入された芳香族化合物をイニファターとし、このイニファターの分岐鎖にビニル系モノマーを光照射リビング重合させて分岐型重合反応生成物を得る工程と、
該分岐型重合反応生成物を分子量分画して、重量平均分子量Ｍｗと数平均分子量Ｍｎとの比Ｍｗ／Ｍｎが１．０〜１．５の画分を分取する工程とを有することを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項７】
芳香環に、分岐鎖としてのＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が３個以上導入された芳香族化合物をイニファターとし、このイニファターの分岐鎖にビニル系モノマーを光照射リビング重合させて分岐型重合体を製造する工程と、
得られた分岐型重合体の分岐鎖を架橋反応させて架橋反応生成物を得る工程と、
該架橋反応生成物を分子量分画して、重量平均分子量Ｍｗと数平均分子量Ｍｎとの比Ｍｗ／Ｍｎが１．０〜１．５の画分を分取する工程とを有することを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項８】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載の遺伝子導入剤と核酸とを複合させてなる核酸複合体。
【請求項９】
請求項６又は７の遺伝子導入剤の製造方法で製造された遺伝子導入剤と核酸とを複合させてなる核酸複合体。
【請求項１】
芳香環に、分岐鎖としてのＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が３個以上導入された芳香族化合物をイニファターとし、このイニファターの分岐鎖に少なくともビニル系モノマーを光照射リビング重合させた分岐型重合体、又はこの分岐型重合体の分岐鎖を架橋反応させた架橋体よりなる遺伝子導入剤であって、
該分岐型重合体又は該架橋体を分子量分画して得た、重量平均分子量Ｍｗと数平均分子量Ｍｎとの比Ｍｗ／Ｍｎが１．０〜１．５の画分よりなることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項２】
請求項１において、前記架橋体は、前記分岐型重合体に光照射することにより、該分岐型重合体の分岐鎖を架橋反応させたものであることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項３】
請求項１又は２において、該Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基がＮ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル基であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項において、前記イニファターが、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が結合していることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項において、前記ビニル系モノマーが、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド及び／又は２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートを含むことを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項６】
芳香環に、分岐鎖としてのＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が３個以上導入された芳香族化合物をイニファターとし、このイニファターの分岐鎖にビニル系モノマーを光照射リビング重合させて分岐型重合反応生成物を得る工程と、
該分岐型重合反応生成物を分子量分画して、重量平均分子量Ｍｗと数平均分子量Ｍｎとの比Ｍｗ／Ｍｎが１．０〜１．５の画分を分取する工程とを有することを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項７】
芳香環に、分岐鎖としてのＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が３個以上導入された芳香族化合物をイニファターとし、このイニファターの分岐鎖にビニル系モノマーを光照射リビング重合させて分岐型重合体を製造する工程と、
得られた分岐型重合体の分岐鎖を架橋反応させて架橋反応生成物を得る工程と、
該架橋反応生成物を分子量分画して、重量平均分子量Ｍｗと数平均分子量Ｍｎとの比Ｍｗ／Ｍｎが１．０〜１．５の画分を分取する工程とを有することを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項８】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載の遺伝子導入剤と核酸とを複合させてなる核酸複合体。
【請求項９】
請求項６又は７の遺伝子導入剤の製造方法で製造された遺伝子導入剤と核酸とを複合させてなる核酸複合体。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００９−２７４９９７（Ｐ２００９−２７４９９７Ａ）
【公開日】平成２１年１１月２６日（２００９．１１．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１２８５６５（Ｐ２００８−１２８５６５）
【出願日】平成２０年５月１５日（２００８．５．１５）
【出願人】（５９１１０８８８０）国立循環器病センター総長 (159)
【出願人】（０００００５２７８）株式会社ブリヂストン (11,469)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１１月２６日（２００９．１１．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月１５日（２００８．５．１５）
【出願人】（５９１１０８８８０）国立循環器病センター総長 (159)
【出願人】（０００００５２７８）株式会社ブリヂストン (11,469)
【Ｆターム（参考）】
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