静脈血栓症に関連する異常リポタンパク血症
本発明は、静脈血栓症の患者が大ＨＤＬ粒子、ＨＤＬ−コレステロール及びアポリポタンパク質ＡＩのレベルが著しく低く、並びに小ＬＤＬ粒子、ＬＤＬ−コレステロール及びアポリポタンパク質Ｂのレベルが著しく高いという所見に基づき、ヒトの患者の静脈血栓症のリスクを判定する方法を提供する。遺伝子型解析により、静脈血栓症の患者のＣＥＴＰ遺伝子型は、コントロールのＣＥＴＰ遺伝子型とは明らかに相違し、ＶＴＥの被検者に観察されるＣＥＴＰはＣＥＴＰの質量と活性の上昇に連関している。静脈血栓症のリスクを判定するための、血漿若しくは血清のサンプルでの脂質又はリポタンパク質のレベルを測定する方法を提供する。静脈血栓症のリスクを減少する方法もまた提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、米国政府により提供された資金援助によりなされた。米国政府は、本発明に対し一定の権利を保有し、国立衛生研究所認可番号Ｒ３７ＨＬ５２２４６、Ｒ０１ＨＬ２１５４４、及びＮＩＨ−ＧＣＲＣＭ０１００８３３に従うものである。
【０００２】
本発明は、静脈血栓症（venous thrombosis）のリスクのある個人を診断し、治療する方法に関する。本発明は、さらに血漿中の脂質又はリポタンパク質濃度を測定するアッセイに関する。本発明はまた、静脈血栓症のリスクを減少させる脂質低下薬（lipid-lowering drugs）の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
静脈血栓塞栓症（venous thromboembolic disease）（ＶＴＥ）は、遺伝的及び環境的な危険因子（risk factor）の両方が病因の一因として関与する多遺伝子病（polygenic disease）であり（例えば、非特許文献１及び２参照）、発病率及び死亡率の一因となっている。ライデン第５因子を含むプロテインＣ経路における様々な分子機能不全は（例えば、非特許文献３及び４参照）、現在最も一般的に特定できるＶＴＥの遺伝的危険因子を含んでいる（例えば、非特許文献５参照）。異常リポタンパク血症は、動脈血栓症（arterial thrombosis）と関連するものであるが、ＶＴＥと血漿リポタンパク質との関係についてはほとんど知られていない。特に、突発性（spontaneous）ＶＴＥは、臨床的に無症状性動脈硬化血管障害（silent artherosclerotic vascular disease）と関連し（例えば、非特許文献６参照）、スタチンの使用は、ＶＴＥを減少させるので（例えば、非特許文献７〜９参照）、ＶＴＥと異常脂質血症（dyslipidemia）との関係を示唆するものである。実際、ＶＴＥ患者では、血漿レベルにおけるグルコシルセラミドは正常値以下である（例えば、非特許文献１０参照）。グリコシルセラミドと高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）は両方とも、活性化したプロテインＣの抗凝血性補因子を増強するので（例えば、非特許文献１０〜１２参照）、本発明者らは、ＨＤＬはＶＴＥに対する防御に役立つであろうと推測した（例えば、非特許文献１３参照）。
【０００４】
多くの遺伝的因子及び後天性因子が、静脈血栓塞栓症（ＶＴＥ）の危険因子として認定されているが（例えば、非特許文献１４、１５参照）、男性について根拠が明らかになり、（例えば、非特許文献１６、１７参照）、男性の異常リポタンパク血症（例えば、非特許文献１８参照）が有意な危険因子としてさらに明らかになったのはつい最近のことである。驚くべきことに、無症状性動脈硬化血管障害は、何ら因果関係又は機構的関係は示唆されていないが、静脈血栓症と関連していた（例えば、非特許文献１９参照）。反対に、異常リポタンパク血症と動脈血栓症（arterial thrombosis）の関連は長年十分に認定されており、多重機構（multiple mechanisms）や成功した治療法は、この関連性について納得の行く説明を与えている（例えば、非特許文献２０〜２２参照）。
【非特許文献１】Lancet 1999;353:1167-73
【非特許文献２】Lancet 1999;353:479-85
【非特許文献３】Nature 1994;369:64-7
【非特許文献４】Lancet 1994;343:1361-2
【非特許文献５】Hereditary Thrombophilia. In:6th ed. Williams Hematology. New York: McGraw-Hill, 2001: 1697-1714
【非特許文献６】N Engl J Med 2003;348:1435-41
【非特許文献７】Ann Intern Med 2000;132:689-96
【非特許文献８】Circulation 2002;105:2962-7
【非特許文献９】Arch Intern Med 2001;161:1405-10
【非特許文献１０】Blood 2001;97:1907-14
【非特許文献１１】J Biol Chem 2002;277:8861-5
【非特許文献１２】J Clin Invest 1999;103:219-27
【非特許文献１３】Thromb Haemost 2001;86:386 -94
【非特許文献１４】Lancet. 2005; 365: 1163-1174
【非特許文献１５】Lancet. 1999;353:1167-1173
【非特許文献１６】N Engl J Med. 2004; 350:2558-2563
【非特許文献１７】J Thromb Haemost. 2004;2:2152-2155
【非特許文献１８】Circulation.2005;112:893-899
【非特許文献１９】N Engl J Med. 2003;348:1435-1441
【非特許文献２０】Circulation. 1998;97:1837-1847
【非特許文献２１】Circulation. 1999;100:988-998
【非特許文献２２】Circulation. 2000;102:IV94-IV102
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
（発明の概要）
本発明は、静脈血栓症に関連する新規の危険因子の発見に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一態様では、ＨＤＬ−コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）の欠如、又は大ＨＤＬ粒子（ＨＤＬ２）、アポリポタンパク質ＡＩ（ａｐｏＡＩ）、及び／又はアポリポタンパク質Ｂと関連していないアポリポタンパク質ＣIII（ａｐｏＣIII）（ＡｐｏＣIII−Ｌｐ−ｎｏｎＢ）の欠如を判定することにより、個人の静脈血栓症のリスクを判定する方法を提供する。かかる欠如は、静脈血栓症の危険因子の指標となるからである。
【０００７】
本発明の別の態様では、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）−コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）の増加、又は中間比重リポタンパク質（ＩＤＬ）粒子、及び／又は小ＨＤＬ粒子を含むＬＤＬ粒子の増加を判定することにより、個人の静脈血栓症のリスクを判定する方法を提供する。かかる増加は、静脈血栓症の危険因子の指標となるからである。
【０００８】
本発明は、アポリポタンパク質Ｂ（ａｐｏＢ）とアポリポタンパク質ＡＩの比率（the ratio of apolipoprotein B(apoB) to apolipoprotein AI）の増加、及び／又はＬＤＬ−ＣとＨＤＬ−Ｃの比率（ratio of LDL-C to HDL-C）の増加を判定することにより、個人の静脈血栓症のリスクを判定する方法を提供する。かかる増加は、静脈血栓症の危険因子の指標となるからである。
【０００９】
本発明の別の態様では、コレステロールエステル転送タンパク質（ＣＥＴＰ）遺伝子型の判定をすることにより、個人の静脈血栓症のリスクを判定する方法を提供する。かかる遺伝子型は、ＣＥＴＰＴａｑＩ多型のＢ１／Ｂ２一塩基多型（single nucleotide polymorphism）を含み、Ｂ２アレルの頻度が正常よりも低いこと、又はＢ１アレルの頻度が正常よりも高いことが、個人の静脈血栓症の危険因子の指標となる。ＣＥＴＰ遺伝子にＢ１アレルが存在することは、ＣＥＴＰの質量と活性のレベルがより高くなることと関連し、静脈血栓症が、ＣＥＴＰの質量と活性のレベルがより高くなることと関連していることを示唆するものであることはよく知られている。さらに、２つのＣＥＴＰに関連した遺伝子変異（ＣＥＴＰ−linked gene variations）であるＰｒｏ３７３とＧｌｎ４５１が存在することは、ＨＤＬと大ＨＤＬの血漿レベルの減少が起こり、ＣＥＴＰの質量と活性が正常のレベルより高くなることと関連して、静脈血栓症の危険因子の指標となる。
【００１０】
本発明は、生体試料（biological specimen）内の脂質又はリポタンパク質濃度を測定する方法を提供する。
【００１１】
本発明は、脂質低下薬又はＨＤＬを上昇させる薬剤を含む、リポタンパク質レベル又は脂質レベルを好ましく変化させる薬剤を投与し、静脈血栓症の危険因子を阻害し、減少させる方法をさらに提供する。
【００１２】
本発明のこれらの及びその他の態様は、添付の図面と併せて読むべき以下の詳細な説明において説明される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、静脈血栓症に関連する新規の危険因子の発見に基づく。特に本発明は、静脈血栓症が、防御的（protective）大ＨＤＬ粒子のレベルの減少と、男性については有害な小ＨＤＬ粒子とＩＤＬ粒子のレベルの上昇とに関連しているという所見（finding）に基づくものである。遺伝学研究では、静脈血栓症の男性は、男性のＶＴＥ患者に観察される異常リポタンパク血症の一因となると思われるＣＥＴＰ質量と活性の上昇をもたらすＣＥＴＰアレルを過度に（disproportionately）有している。
【００１４】
一つの態様では、本発明は、個人から入手した被検生体試料におけるＨＤＬ−Ｃ、ＨＤＬ粒子、大ＨＤＬ粒子（ＨＤＬ２）、ＣＥＴＰ、アポタンパク質ＡＩ、及び／又はアポリポタンパク質ＣIIIのレベルを測定することと、被検生体試料における脂質又はリポタンパク質のレベルを、正常な生体試料における脂質又はリポタンパク質の正常範囲と比較することとを含む、個人の静脈血栓症のリスクを判定する方法を提供するものである。被検生体試料におけるＨＤＬ−コレステロール、大ＨＤＬ粒子（ＨＤＬ２）、アポリポタンパク質ＡＩ、及び／又はアポリポタンパク質ＣIIIの欠如又はレベルの低下は、個人の静脈血栓症の危険因子の指標となるからである。アポリポタンパク質ＣIIIの測定のための好ましい態様では、アポリポタンパク質Ｂが結合していないアポリポタンパク質ＣIIIの測定が行われる。ＣＥＴＰの好ましい実施態様では、ＣＥＴＰ質量と活性の測定は、リスクの増加を示唆するレベルに上昇した場合に行われる。
【００１５】
脂質又はリポタンパク質のレベルの定量は、当業者に周知の技術により標準試料と比較して測定される。かかる技術としては、例えば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトロスコピー、血漿又は血清脂質アッセイ、ＥＬＩＳＡアッセイ、免疫比濁法（immunoturbidmetric assays）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、キャピラリー電気泳動法、及び免疫検出法の有無を問わない二次元ゲル電気泳動を挙げることができるがこれらに限定されない。生体液は、血液、血漿、又は血清が好ましいが、肺液、唾液、脳脊髄液（cerebrospinal fluid）、リンパ液、尿、精液、唾液などでもよい。当該技術分野では周知であるが、脂質又はリポタンパク質検体（analytes）は、男女で濃度が異なることがある。
【００１６】
一実施態様では、正常範囲は、正常なコントロールの被検者の２５パーセンタイルと７５パーセンタイルの間の値を示し、正常な男性の血清ＨＤＬ−Ｃ、血漿のＨＤＬ粒子及び大ＨＤＬ粒子（ＨＤＬ２）、アポリポタンパク質ＡI、並びに／又はＨＤＬと関連するアポリポタンパク質ＣIIIは、それぞれ、４３〜６１．５ｍｇ／ｄＬ、２３．９〜２８．９μＭ、２．５５〜６．７μＭ，０．９〜１．１７ｍｇ／ｍＬ、及び０．０７７〜０．１０ｍｇ／ｍＬの範囲である。かかるＨＤＬに関連するパラメーターの値が正常の２５パーセンタイル未満であると、正常より低い値であると判断される。別の実施態様では、血清ＨＤＬ−Ｃのレベルが５０ｍｇ／ｄＬ未満であり、血漿ＨＤＬ粒子、大ＨＤＬ粒子（ＨＤＬ２）、及びアポリポタンパク質ＡＩのレベルが規定した正常範囲の３３パーセンタイル未満又は規定した正常範囲の３５パーセンタイル未満であると、脂質のパラメーターが正常より低い値であると判断される。さらに別の実施態様では、アポリポタンパク質Ｂが関連していないアポリポタンパク質ＣIIIが、規定した正常範囲の１５パーセンタイル未満であると低い値であると判断される。さらにまた別の実施態様では、脂質パラメーターのレベルが、血漿ＨＤＬ−Ｃが４５ｍｇ／ｄＬ未満のレベルであり、血漿ＨＤＬ粒子、大ＨＤＬ粒子（ＨＤＬ２）及びアポリポタンパク質ＡＩが規定した正常範囲の２５パーセンタイル未満であると、正常より低いレベルであると判断される。さらには、アポリポタンパク質Ｂが関連していないアポリポタンパク質ＣIIIが規定した正常範囲の１０パーセンタイル未満であると低い値であると考えられている。血漿又は血清のＨＤＬ粒子、大ＨＤＬ粒子（ＨＤＬ２）及びアポリポタンパク質ＡＩが、規定した正常範囲の３５パーセンタイル未満又は規定した正常範囲の３３パーセンタイル未満、並びに／或いはアポリポタンパク質Ｂと関連していない血漿又は血清のアポリポタンパク質ＣIIIが正常範囲の１５パーセンタイル未満であると、欠乏していると判断される。かかる欠乏は、血漿ＨＤＬ粒子、大ＨＤＬ粒子（ＨＤＬ２）、アポリポタンパク質ＡＩ、及び／又はアポリポタンパク質Ｂが関連していないアポリポタンパク質ＣIIIが、男性ではそれぞれ約２５．４μＭ、３．４μＭ、０．９６６ｍｇ／ｍＬ、及び０．０７３ｍｇ／ｍＬかそれより少ない血漿濃度に相当する。さらなる実施態様では、欠乏は、血漿ＨＤＬ粒子、大ＨＤＬ粒子（ＨＤＬ２）、アポリポタンパク質ＡＩが正常平均範囲の２５パーセンパーセンタイル未満であり、及び／又はアポリポタンパク質Ｂが関連していないアポリポタンパク質ＣIIIが正常平均範囲の１０パーセンパーセンタイル未満であることが好ましい。一実施態様では、血漿ＨＤＬ粒子、大ＨＤＬ粒子（ＨＤＬ２）、アポリポタンパク質ＡＩ及びアポリポタンパク質Ｂが関連していないアポリポタンパク質ＣIIIは、男性ではそれぞれ約２３．９μＭ、２．５５μＭ、０．９０ｍｇ／ｍＬ、及び０．０７０ｍｇ／ｍＬかそれより少ない血漿濃度に相当する。
【００１７】
別の実施態様では、本発明は、個人から入手した被検生体試料におけるＬＤＬ−Ｃ又はＬＤＬ粒子のレベルを測定し、ＩＤＬ及び／又は小ＨＤＬ粒子等を含む、しかしこれらに限定されないＬＤＬ−Ｃ又はＬＤＬ粒子のレベルを生体試料におけるＬＤＬ−Ｃ又はＬＤＬ粒子の正常範囲と比較することとを含む、個人の静脈血栓症のリスクを判定する方法を提供するものである。正常な生体試料と比較して生体試料におけるＬＤＬ−Ｃ又はＬＤＬ粒子が正常レベルよりも増加したり高くなったりすることは、個人の静脈血栓症の危険因子の指標となるからである。
【００１８】
一実施態様では、正常な範囲が、正常なコントロールの被検者の２５パーセンタイルと７５パーセンタイルの範囲内の血漿値を示し、男性の血清ＬＤＬ−Ｃ、血漿ＬＤＬ粒子、ＩＤＬ粒子、小ＬＤＬ粒子、及びアポリポタンパク質Ｂの正常範囲は、それぞれ１００〜１４０ｍｇ／ｄＬ、７５０〜１１７５ｎＭ、９〜４８ｎＭ、４４０〜９２７ｎＭ、及び０．６５〜０．９２ｍｇ／ｍＬである。かかるＬＤＬに関連するパラメーターの値が正常の７５パーセンタイルを超えると、静脈血栓症のリスクの増加に関連する正常より高い値であると判断される。別の実施態様では、血清ＬＤＬ−Ｃのレベルが１４０ｍｇ／ｄＬを超えており、血漿ＬＤＬ粒子、ＩＤＬ粒子、小ＨＤＬ粒子及びアポリポタンパク質Ｂのレベルが正常平均範囲の６５パーセンタイルを超えると、脂質のパラメーターが、静脈血栓症のリスクの増加に関連する正常より高い値であると判断される。さらなる態様では、血清ＬＤＬ−Ｃのレベルが１６０ｍｇ／ｄＬを超えており、血漿ＬＤＬ粒子、ＩＤＬ粒子、小ＬＤＬ粒子及びアポリポタンパク質Ｂのレベルが正常範囲の７５パーセンタイルを超えると、脂質のパラメーターが、正常より高い値であると判断される。
【００１９】
別の実施態様では、血栓症のリスクの増加は、脂質若しくはリポタンパク質の血漿又は血清レベルが上昇した被検者の血栓症と関連し、血漿ＬＤＬ粒子、ＩＤＬ粒子、小ＨＤＬ粒子、及び／又はアポリポタンパク質Ｂが正常平均範囲の６５パーセンタイルを超えたと定義される。一実施態様では、男性における血漿及び又は血清濃度が、それぞれ約１１３０ｎＭ、３５ｎＭ、８１０ｎＭ及び０．８７ｍｇ／ｍＬかそれより多いと過度の又は上昇したレベルを意味する。別の実施態様では、ＬＤＬ粒子、ＩＤＬ粒子、小ＨＤＬ粒子及び／又はアポリポタンパク質Ｂの血漿若しくは血清レベルが正常平均範囲の７５パーセンタイルを超えると、静脈血栓症のリスクの増加に関連する脂質又はリポタンパク質レベルの上昇であると定義される。男性ではそれぞれ約１１７０ｎＭ、４８ｎＭ、９２５ｎＭ、及び０．９２ｍｇ／ｍＬかそれより高いと血漿及び／又は血清濃度が上昇したレベルを意味する。
【００２０】
さらに別の実施態様では、本発明は個人から入手した被検生体試料におけるアポリポタンパク質Ｂ及びアポタンパク質ＡＩのレベル、又はＬＤＬ−Ｃ及びＨＤＬ−Ｃを測定することと、アポリポタンパク質Ｂとアポタンパク質ＡＩの比率(the ratio of apolipoprotein B to apolipoprotein AI)、又はＬＤＬ−ＣとＨＤＬ−Ｃの比率（the ratio of LDL-C to HDL-C）を決定することと、生体試料の試験被検者の比率を、正常な比率の範囲と比較することとを含む、個人の静脈血栓症のリスクを判定する方法であって、正常な生体試料と比較して被検生体試料におけるアポリポタンパク質Ｂとアポタンパク質ＡＩの比率、又はＬＤＬ−ＣとＨＤＬ−Ｃの比率が増加し、より高くなることが、個人の静脈血栓症の危険因子の指標となることを特徴とする方法を提供する。一実施例では、生体試料は血漿又は血清である。
【００２１】
血漿若しくは血清のＨＤＬ−Ｃ及びＬＤＬ−Ｃ、又はアポリポタンパク質ＡＩ並びにアポリポタンパク質Ｂは当業者に周知の方法によって測定され、比率の値を計算する。正常範囲は、正常な被検者について測定した比率の値に基づくものである。正常範囲を超える比の値は、血栓症のリスクの増加の指標となる。一実施態様では、アポリポタンパク質Ｂとアポリポタンパク質ＡＩの比率の正常範囲、及びＬＤＬ−ＣとＨＤＬ−Ｃの比率の正常範囲は、それぞれ０．５９〜０．９６及び１．７〜２．９である。別の実施態様では、アポリポタンパク質Ｂとアポリポタンパク質ＡＩの比率の正常範囲、及びＬＤＬ−ＣとＨＤＬ−Ｃの比率の正常範囲は、それぞれ０．７０〜０．８５及び２．０〜３．５である。さらに別の実施態様では、アポリポタンパク質Ｂとアポリポタンパク質ＡＩの比率、又はＬＤＬ−ＣとＨＤＬ−Ｃの比率が、正常範囲の６５パーセンタイルを超えると、正常レベルを超えたと考えられ、血栓症のリスクが増えることの指標となる。アポリポタンパク質Ｂとアポリポタンパク質ＡＩの比率、又はＬＤＬ−ＣとＨＤＬ−Ｃの比率が、正常範囲の６５パーセンタイルを超えた値は、それぞれ約０．８３及び２．６である。さらに別の実施態様では、アポリポタンパク質Ｂとアポリポタンパク質ＡＩの比率、又はＬＤＬ−ＣとＨＤＬ−Ｃの比率が、正常範囲の７５パーセンタイルを超えると、正常を超えたと考えられ、血栓症のリスクが増える指標となる。アポリポタンパク質Ｂとアポリポタンパク質ＡＩの比率、又はＬＤＬ−ＣとＨＤＬ−Ｃの比率が、正常範囲の７５パーセンタイルを超える値は、それぞれ約０．９６及び２．９である。さらにまた別の実施態様では、アポリポタンパク質Ｂとアポリポタンパク質ＡＩの比率、又はＬＤＬ−ＣとＨＤＬ−Ｃの比率が、正常範囲の８５パーセンタイルを超えると、正常を超えたと考えられ、血栓症のリスクが増える指標となる。アポリポタンパク質Ｂとアポリポタンパク質ＡＩの比率、又はＬＤＬ−ＣとＨＤＬ−Ｃの比率が、正常範囲の７５パーセンタイルを超える値は、それぞれ約１．０５及び３．２５である。
【００２２】
ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、電気泳動、ＨＰＬＣ、ＦＡＣＳ、免疫比濁法、キャピラリー電気泳動、及び免疫検出法の有無を問わないが二次元ゲル電気泳動を含む、当業界に知られた様々なプロトコールを、脂質又はリポタンパク質を測定するＮＭＲスペクトロスコピーの代替として用いることができ、血液サンプルにおける脂質又はリポタンパク質のレベルの変化や異常を検出及び／又は診断するための同様の基準を提供する。脂質若しくはリポタンパク質の正常な値若しくは標準的な値は、正常な哺乳類の被検体、好ましくはヒトから採取した血液、血漿、若しくは血清サンプル又は試料のコレクションと、複合体形成に適した条件下で脂質若しくはリポタンパク質への抗体とを用いて決定したパラメーターの正常な範囲若しくは対照範囲を定義することによって決められる。脂質若しくはリポタンパク質の正常な値若しくは標準的な値は、哺乳類の被検体、好ましくはヒトから採取した血液、血清、血漿サンプルのプールを用いることにより規定することもできる。脂質又はリポタンパク質の量は様々な方法で定量化できるが、好ましくは光度計による（photometric）方法が好ましい。免疫学的検定プロトコール（immunoassay protocols）としては、脂質又はリポタンパク質への抗体は適切な条件下で複合体を形成し、光度計、比色分析（colorimetric）、又は比濁法（turbidometic）等の方法により定量化できる。血液サンプル由来の被検体のサンプル、コントロールのサンプル、及び試験サンプルにおける脂質又はリポタンパク質の量は、標準コントロールの値と比較される。コントロール又は標準値と被検体の値との偏差は脂質、又はリポタンパク質の欠如、又は正常レベルを超えていることを診断するパラメーターを規定し、それにより個人の静脈血栓症のリスクを判定する。この判定は、血栓症治療の開始又は継続に関する決定をするために、及び治療上の措置をモニターするために役立つ。当業者において知られているように、いくつかの脂質又はリポタンパク質レベルは、性別によって相違し、性差に基づいて（gender-specific）正常な又は標準的な基準値が必要となることもある。
【００２３】
生体試料において、特に血液において、本明細書に記載されているように脂質、アポリポタンパク質、又はリポタンパク質粒子の正常なレベルよりも高いこと又は低いことは、静脈血栓症の危険因子である。静脈血栓症は、発作（stroke）、外科手術（surgery）、外傷性障害（trauma）、ガン、肢の麻痺（leg paresis）、長期の旅行、炎症性腸疾患、ベーチェット病、骨折、化学療法、糖尿病と関連して発症することがあり、又は第５因子ライデン、プロテインＣ欠乏、プロテインＳ欠乏、抗トロンビン欠乏等の存在のような血栓性素因（thrombophilia）の遺伝的危険因子を有する被検者に発症しうるものである。
【００２４】
本発明の別の実施態様では、例えば、ＣＥＴＰＴａｑＩ多型のＢ１又はＢ２アレルを含むＣＥＴＰ遺伝子型を決定することを含む、個人の静脈血栓症のリスクの判定方法を提供する。被検生体試料において、Ｂ２アレルが存在しないこと又はＢ１アレルが存在することが、個人の静脈血栓症の危険因子の指標となる。Ｂ１又はＢ２アレルとの連鎖不均衡と関連した別のＣＥＴＰ遺伝子の多型を使用してもよい。ＣＥＴＰＴａｑＩＢ多型のＢ１（野生型若しくは優性）又はＢ２（変異型（variant）又は頻度が低い）アレルの決定は、ＣＥＴＰ遺伝子のイントロン１の２７７番目のヌクレオチドに存在するヌクレオチドに依存する（Drayna D et al, Nucl Acids Res 1987;15:4698）。かかる位置にグアニジン「Ｇ」があるとＢ１アレルとなり、アデニン「Ａ」があるとＢ２アレルになる。
【００２５】
好ましい実施態様では、本発明は、ＣＥＴＰに関連した遺伝子変異型（CETP-linked gene variants）である、Ａｌａ３７３からＰｒｏ、及びＡｒｇ４５１からＧｌｎの存在を判定することを含む、個人の静脈血栓症のリスクの判定方法をさらに提供する。被検生体試料に変異型が１つ又は両方が存在することは、個人の静脈血栓症の危険因子の指標となる。
【００２６】
当業者に知られているＣＥＴＰ多型を検出する様々なプロトコールを用いることができる。かかるプロトコールは、例えば血液、口腔細胞（buccal cells）、精液、唾液、細胞生検などを含むがこれらに限定されない、被検者の試料由来のヒト被検者の遺伝物質（ＤＮＡ又はＲＮＡ）の使用と関連する。多型検出は、当業者には周知の技術であり、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、すなわち制限断片長多型（restriction fragment length polymorphisms）（部位特異的突然変異誘発を含む）、アレル特異的ＰＣＲ、又は増幅不応突然変異系（amplification refractory mutation system）（ＡＲＭＳ）、直接配列決定、リアルタイムＰＣＲ、一本鎖高次構造多型（single-stranded conformational polymorphisms）（ＳＳＣＰ）、又はヘテロデュプレックス分析、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（denaturing gradient gel electrophoresis）（ＤＧＧＥ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）クランプ、オリゴヌクレオチド連結、ハイブリダイゼーション若しくは伸長アッセイ、ＴａｑＭａｎ若しくは分子指標、高速液体クロマトグラフなどを挙げることができるがこれらに制限されない。
【００２７】
本明細書に記載されている異常リポタンパク血症パターンに基づき静脈血栓症の個人のリスクを評価できるようになれば、医師が、リスクが増加している個人における静脈血栓症の発症及び／又はリスクを減少するための特別な治療法を見い出し、モニターすることができるようになる。
【００２８】
したがって、本発明の別の実施態様では、個人の静脈血栓症のリスクを減少させるために十分な量の脂質低下剤又は脂質変化剤を投与することを含む、個人の静脈血栓症のリスクを減少させる方法を提供する。ＨＤＬ−Ｃ及び／又は大ＨＤＬ粒子（ＨＤＬ２）を増加させる薬剤を静脈血栓症のリスクを減少させるために用いてもよい。かかるＨＤＬを好ましく増加させる薬剤は、ＣＥＴＰ阻害剤を含む。ＬＤＬ−Ｃ及び／又は小ＬＤＬ粒子のレベルを減少させる薬剤を、被検者の静脈血栓症のリスクを減少させるために用いてもよい。かかる脂質低下剤としては、例えば、スタチンとＣＥＴＰ阻害剤を挙げることができるがこれらに制限されない。静脈血栓症のリスクを減少させるためにも用いることのできる脂質変化剤としては、ニコチン酸、フィブラート、胆汁酸抑制薬や、ＨＤＬ―Ｃ若しくは大ＨＤＬ粒子を増加、及び／又はＬＤＬ−Ｃを減少、及び／又は小ＬＤＬ粒子を減少させることのいずれかができる新しく発見された薬を挙げることができる。
【００２９】
サンプルの脂質又はリポタンパク質レベルを測定するために、静脈血栓症のリスクを阻害するために、或いは危険因子をスクリーニングするために必要とされる、必須物質及び試薬はキットの中に一緒に詰め合わせてもよい。キットの構成要素は１又は２以上の溶液である場合、液体は好ましくは水溶液であり、殺菌した水溶液が特に好ましい。
【００３０】
脂質又はリポタンパク質の検出のために、キットはカラム、ビーズ、樹脂、ゲルマトリックス、フィルター、ＴＬＣプレート、バッファー及び適当な溶媒などのクロマトグラフ分離のための物質を含んでもよい。あるいは検出が免疫学的手段によるときは、キットは、脂質又はアポリポタンパク質に対する抗体、一次抗体に結合する二次抗体、標識（labels）又はシグナルを形成する化合物（結合型若しくは非結合型（conjugated or unconjugated））、及びシグナルを形成し検出するための様々な試薬を含んでいてもよい。
【００３１】
かかるキットの構成要素は、乾燥又は凍結乾燥された形態で提供されてもよい。試薬又は構成要素が乾燥した形態で提供されるときは、再構成は通常適当な溶媒を添加して行われる。溶媒が別の容器に提供されることも予想される。本発明のキットは、サンプルの脂質又はリポタンパク質レベルを測定するためのアッセイを説明する説明書を含んでいてもよい。
【００３２】
本発明のキットは、バイアルを厳重に密封（in close confinement）するための市販の手段を一般に包含する。たとえば、注射、又は望ましいバイアルが入った中空成形プラスティック容器などである。器具には、例えば、インビボで反応を読みとることができ、又はモニターすることができる装置を含んでもよい。
【００３３】
本明細書で引用されている全ての発行された刊行物、書籍、参考資料及び抜粋は、本発明の内容を説明するために、全体として参照により本明細書に援用される。
【００３４】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を説明するものである。当然のことながら、いかなる面でも本発明の範囲を限定しない。本発明者らによって発見された代表的な技術に従った実施例に開示された技術は、本発明の実施において、良好に機能し、したがって、本発明の実施における好ましい形態を行使するとみなすことができることが、当業者によって理解されるものとする。当業者は、本発明の開示に照らして、特定の実施態様に加えることの様々の変更を考慮し、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、同様の結果を得ることができることを理解すべきである。
【実施例１】
【００３５】
各リポタンパク質サブクラスの濃度とアポリポタンパク質（ａｐｏ）ＡＩとＢの（血漿と抗原の）レベルを、プロトン核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）を用いて測定した。リポタンパク質代謝と部分母集団（subpopulation）のレベル、肝性リパーゼ、内皮リパーゼ（endothelial lipase）、並びにコレステロールエステル転送タンパク質（ＣＥＴＰ）に影響を与える３つの鍵遺伝子の一塩基多型（ＳＮＰｓ）を分析した（文献番号１６〜２０参照）。
【００３６】
（方法）
［研究グループ（study group）］
スクリップス静脈血栓症レジストリ（The Scripps Venous Thrombosis Registry）はＶＴＥの危険因子の進行中の症例コントロール研究（case-control study）である。ＶＴＥであると客観的に確認された患者を、スクリップス抗凝血サービス（Scripps Anticoagulation Service）と地域社会から募集した。ＶＴＥの新規の遺伝的危険因子の同定がレジストリの主要な目的であり、遺伝的因子は、５５歳未満の若年被検者のＶＴＥの一因となる可能性が高い。本研究の試験対象患者基準（inclusion criteria）は、５５歳未満の血栓症患者であること、急性血栓症の診断から３ケ月を超えて経過していること、推定余命が少なくとも３年あること、脂質低下剤（lipid lowering medications）を使用していないこと、また転移性ガンではないことが含まれた。年齢と性別が一致する健常コントロール（healthy controls）を、スクリップス一般臨床リサーチセンター（Scripps General Clinical Research Center）（ＧＣＲＣ）採血プログラムを通じて募集した。収集された臨床データには、病歴の詳細及び静脈血栓症の危険因子の存在の有無が含まれた。プロトコールは、スクリップスクリニック（Scripps clinic）の施設内治験審査委員会（Institutional Review Board）により承認され、患者は書面によるインフォームドコンセントに同意した。
【００３７】
臨床的特徴と、特定された危険因子の頻度と血漿脂質データとを表１に示す。１１５人のＶＴＥ患者中５７人（４９．６％）は、外科手術、外傷性障害、長期の固定（major immobilizaion）後９０日以内に発症していず、かつ、ライデン第５因子、プロトロンビン２０２１０Ａ、妊娠、又はエストロゲンの使用に関連しない発症として定義される特発性（idiopathic）ＶＴＥを呈していた。ＶＴＥは、女性（２４．６％）よりも、男性（８２％）でより多く特発性であった（Ｐ＜０．００１）。女性ＶＴＥ患者６５人中、ＶＴＥの発症は、７人（１１％）は妊娠、２５人（３９％）は経口避妊薬の使用、及び７人（１１％）はエストロゲン補充療法と関連していた。コントロールにおける経口避妊薬の使用（３０％）は同程度であったが、コントロールにおけるエストロゲン補充療法（２２％）は、ＶＴＥ患者よりも多かった。ＶＴＥの女性は、ＶＴＥの発症時（episode）にエストロゲンを使用していた。患者の８４％は、血液を提供した時ワルファリンを服用していた。
【００３８】
【表１】
【００３９】
［血液採取、脂質及びアポリポタンパク質］
ＶＴＥの診断後少なくとも３ケ月経過後に、１２時間の絶食後に、ＧＣＲＣで血液を採取した。血清とＥＤＴＡ血漿を調製し、血漿を−７０℃で保存した。ＡｐｏＡＩ及びＡｐｏＢの血漿レベルを免疫比濁法（immunoturbidometric assay）キット（DiaSorin社製、Stillwater, MN）を用いて測定した。標準的な方法を用いた日常の臨床検査から、血清脂質プロファイルデータを得た。
【００４０】
［ＮＭＲリポタンパク質サブクラス分析］
ＥＤＴＡ血漿における１０個のリポタンパク質サブクラスのリポタンパク質粒子の濃度を、LipoScience（Raleigh,NC）にて、プロトン核磁気共鳴スペクトルによって測定した（文献番号２１参照）。粒子の粒径範囲に基づくサブクラスのカテゴリーは、３つのＶＬＤＬ部分母集団（subpopulations）［キロミクロン／大ＶＬＤＬ（large VLDL）；中間ＶＬＤＬ（intermediate VLDL）；及び小ＶＬＤＬ（smallＶＬＤＬ）］と、３つのＬＤＬ部分母集団［ＩＤＬ；大ＬＤＬ（large LDL）；中小ＬＤＬ（medium small LDL）及び極小ＬＤＬ(very small LDL)とも報告されている小ＬＤＬ(small LDL) ］と、３つのＨＤＬ部分母集団［（大ＨＤＬ(large HDL)；中間ＨＤＬ(medium HDL)；及び小ＨＤＬ(small HDL）とを含む。ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、及びＨＤＬの平均の粒子サイズの値もまた計算した。文献に強調されているように（文献番号２１、２２参照）、ＮＭＲ由来のリポタンパク質粒子レベルは、典型的なリポタンパク質粒子に特徴的なＮＭＲシグナルに基づくものであり、実際の脂質測定によるものではない。ＮＭＲデータは粒子数に正比例し、個々人によって異なる場合もある粒子ごとの脂質又はアポリポタンパク質とは非依存的である。
【００４１】
［ＤＮＡ分析］
ゲノムＤＮＡは、Puregene（登録商標）ＤＮＡ精製キット（Gentra Systems社製、Minneapolis, MN）を用いてＥＤＴＡ血液から抽出した。第５因子ライデン及びプロトロンビン２０２１０ＡのＳＮＰｓ、並びに肝性リパーゼ（ＬＩＰＣ―５１４Ｃ／Ｔ）、内皮リパーゼ（ＬＩＰＧＴ１１１Ｉ）、及びＣＥＴＰ（ＴａｑＩＢとＩ４０５Ｖ）のＳＮＰｓを、文献に記載の通りにアッセイした（文献番号１７、２０、及び２３〜２５参照）。
【００４２】
［統計的分析］
グループ間のカテゴリーデータを、分割表解析（contingency-table analysis）（カイ二乗検定（chi-squared test））を用いて比較し、連続データを、対応のないスチューデントのｔ−検定（unpaired student t-test）又はマン−ホイットニーの検定（Mann-Whitney data）を必要に応じて用いて比較した（Prism（登録商標）３．０ソフトウェア、Graph Pad Software社製、San Diego, CA）。ｐ値はすべて両側検定（two-tailed）であった。プロトロンビン危険因子の多因子性の役割を、多変量ロジスティック回帰解析（multivariate logistic regression analysis）を用いて評価し、調整したｐ値又は調整したオッズ比を、ミニタブ１４ソフトウェア（Minitab社製、State College, PA）を用いて計算した。
【００４３】
（結果）
男性のＶＴＥ患者は、男性のコントロールよりも平均ＨＤＬ粒子濃度が有意に低かった（ｐ＜０．００１）（図１Ａ参照）。ＨＤＬリポタンパク質サブクラスでは、大ＨＤＬ粒子濃度が、男性のＶＴＥ患者では男性のコントロールよりも低かった（ｐ＝０．０１）一方、中間と小ＨＤＬ粒子は有意な相違はなかった（それぞれｐ＝０．１３及び０．１３）（図１Ｂ〜Ｄ参照）。ＨＤＬ粒子サイズもまた、男性のＶＴＥ患者では男性のコントロールよりも小さかった（ｐ＝０．０２）（データは示されていない）。
【００４４】
男性のＶＴＥ患者のＬＤＬリポタンパク質粒子濃度は、男性のコントロールよりも有意に高かった（図２Ａ参照、ｐ＝０．０１）。ＬＤＬリポタンパク質サブクラスでは、ＩＤＬ及び小ＬＤＬ粒子の濃度が、男性のＶＴＥ患者でより高かった（それぞれｐ＝０．０１及び０．０２）一方、大ＬＤＬ粒子は相違がなかった（ｐ＝０．３３）（図２Ｂ−Ｄ参照）。小ＨＤＬ粒子の２つのサブグループ、即ち中小粒子と極小粒子は、男性のＶＴＥ患者では上昇した（それぞれｐ＝０．０１及び０．０２、データは示されていない）。ＬＤＬ粒子サイズは、男性のコントロールと比較して男性のＶＴＥ患者ではより小さかった（ｐ＝０．０４）（データは示されていない）。静脈血栓症のよく知られた３つの危険因子である第５因子ライデン、プロトロンビン２０２１０Ａ、及び肥満度指数（ＢＭＩ）の調整後も、男性のＨＤＬ粒子、大ＨＤＬ粒子、ＬＤＬ粒子、及び小ＨＤＬ粒子の濃度は依然として著しく相違しており、調整したｐ値はそれぞれ０．００４、０．０４、０．０１、及び０．０２であった。ＩＤＬ粒子の調整したｐ値の相違はやや減少し、０．０７であった。
【００４５】
男性の被検者のデータとは対照的に、女性のＶＴＥ患者と女性のコントロールとを比較したときには、ＨＤＬ粒子又はＬＤＬ粒子の濃度には有意な相違はみられなかった（図１及び図２参照）。男性においても女性においても、ＶＬＤＬ粒子の合計濃度、ＶＬＤＬサブクラス（大、中間、及び小ＶＬＤＬ粒子）について、又はＶＬＤＬ粒子サイズについて、統計的に有意な相違は観察されなかった（データは示されていない）。
【００４６】
男性のＶＴＥ患者では、男性のコントロールと比較して、ＡｐｏＡＩレベルがより低く（ｐ＝０．０４）（図１Ｅ参照）、ａｐｏＢレベルはより高かった（ｐ＝０．０４）（図２Ｅ参照）。アポリポタンパク質Ｂが関連していないアポリポタンパク質ＣIII（ａｐｏＣIII−Ｌｐ−ｎｏｎＢ）のレベルもまた、ＶＴＥではより低かった（ｐ＝０．０３）（データは示されていない）。男性のＶＴＥ患者のａｐｏＢ対ａｐｏＡＩ比（apoB to apoAI ratio）の平均値は、男性のコントロールよりも有意に高かった（ｐ＝０．００１）（図２Ｇ参照）。ＶＴＥ患者とコントロールとを比較したときに、ａｐｏＢ／ａｐｏＡＩ比の平均値のかかる相違は、ａｐｏＡＩ単独又はａｐｏＢ単独の平均値の相違よりも統計的により大きかった（図２Ｇと、図１Ｅ及び２Ｅ参照）。第５因子ライデン、プロトロンビン２０２１０Ａ、及びＢＭＩの調整後も調整したｐ値は０．００８であった。ａｐｏＡＩ又はａｐｏＢの平均値の相違は、女性のＶＴＥ患者と女性のコントロールとの比較ではみられなかった。
【００４７】
総血清コレステロール及びトリグリセリドのレベルは、どちらの性別でもＶＴＥとコントロールググループの平均値に相違はみられなかった（表１参照）。男性のコントロールと比較して、男性のＶＴＥ患者ではＨＤＬ−Ｃの平均値がより低い（ｐ＝０．０３）一方、ＬＤＬ−Ｃの平均値はより高かった（ｐ＝０．０５）。しかしながら特に、男性のコントロールと比較して、男性のＶＴＥ患者ではＬＤＬ−Ｃ対ＨＤＬ−Ｃの平均比（LDL-C to HDL-C mean ratio）がより顕著に高かった（ｐ＝０．００２）。第５因子ライデン、プロトロンビン２０２１０Ａ、及びＢＭＩの調整後、比平均値の相違について調整したｐ値は、０．００２であった。
【００４８】
男性のＶＴＥ患者における減少したＨＤＬパラメーター（＜２５％）、増加したＬＤＬパラメーター（＞７５％）の四分位数（quartile）に基づいたオッズ比（ＯＲ）を表２に示す。総ＨＤＬ粒子と大ＨＤＬ粒子のレベルの減少は、ＶＴＥのリスクが増加したことと関連し、それぞれＯＲ＝７．２（９５％ＣI：３．０−１８）、及び３．３（９５％ＣI：１．４〜７．９）であった。より小さいＨＤＬの平均粒子サイズは、有意なオッズ比３．１を有していた（９５％ＣI：１．３−７．３）。総ＬＤＬ粒子と、２つのサブフラクションであるＩＤＬと小ＨＤＬ粒子が、高レベル(＞７５パーセンタイル)であることは、ＶＴＥのリスクを増加させる［それぞれＯＲ＝２．９(９５％ＣI：１．２−６．７)、２．６(９５％ＣI：１．１−６．２)、及び３．６(９５％ＣI：１．５−８．５)］。男性のＶＴＥについては、小ＨＤＬ粒子サブクラス、即ち中程度に小さい及び非常に小さいＬＤＬ粒子の２つの部分母集団のそれぞれが、ＯＲが３．３(それぞれ９５％ＣI：１．４−７．９及び１．５−８．５、データは示されていない)であり、小ＨＤＬ粒子のＯＲ＝３．６と同様の値であった（表２参照）。第５因子ライデン、プロトロンビン２０２１０Ａ、及びＢＭＩを調整した後、統計学的に有意な四分位数を基にしたＯＲ値は全て、強い統計的な有意性を維持した（データは示されていない)。
【００４９】
【表２】
【００５０】
男性では、低いレベルのａｐｏＡＩと高いレベルのａｐｏＢは、それぞれＯＲ＝５．５(９５％ＣI：２．３−１３)と２．４(９５％ＣI：１．０−５．７)という、ＶＴＥのリスクの増加に対して有意なＯＲ値を与えるものであり、ＡｐｏＢ／ＡｐｏＡＩの比［ＯＲ＝３．９(９５％ＣI：１．７−９．３)］も同様であった。低いレベルのａｐｏＣIII−Ｌｐ−ｎｏｎＢ(コントロールの１０パーセンタイル未満)は、ＶＴＥのリスクの増加［ＯＲ＝３．１(９５％ＣI：１．０−９．５)、ｐ＝０．０４］と関連していた（データは示されていない)。男性の臨床検査の血清コレステロールデータに基づく、低いＨＤＬ−ＣのＯＲは、統計学的に有意であるが［ＯＲ＝３．３(９５％ＣI：１．４−７．９)］、ＬＤＬ−Ｃの上昇は、上昇してはいるが、統計的な有意性を得ることはなかった［ＯＲ＝２．２(９５％ＣI：０．９４−５．３)］。男性のＶＴＥについては、ＬＤＬ−Ｃ／ＨＤＬ−Ｃの高い比は、ＶＴＥのリスクの増加に対して統計的に有意であった［ＯＲ＝３．３(９５％ＣI：１．４−７．９)］。ＬＤＬ−Ｃレベルが１６０ｍｇ／ｄｌより高い男性では、ＶＴＥのＯＲが４．８(９５％ＣI：１．５−１６)であったが、ＨＤＬ−Ｃが４０ｍｇ／ｄｌより低い場合は、ＶＴＥのＯＲは３．１(９５％ＣI：１．２−８．１)であった（データは示されていない)。
【００５１】
異常リポタンパク血症（dyslipoproteinemia）の一因となる遺伝的影響を特定するために、リポタンパク質部分母集団、及びＨＤＬ−Ｃ、肝性リパーゼ（ＬＩＰＣ−５１４Ｃ／Ｔ）、内皮リパーゼ（ＬＩＰＧＴ１１１Ｉ）、並びにＣＥＴＰ（ＴａｑＩ及びＩ４０５Ｖ）に影響を与える３つの鍵遺伝子の周知のＳＮＰを決定した（表３参照）。カイ二乗検定を用いた、ＳＮＰｓのアレル（allele）頻度は、全てのＶＴＥ患者とコントロールグループの間で相違はなかった。しかしながら、ＣＥＴＰ Ｂ２アレルは、コントロールよりも男性のＶＴＥ患者では、非常にまれなものであって（ｐ＝０．０４）、ＣＥＴＰ Ｂ２アレルの相違は、ＯＲが１．９(９５％ＣI：１．１−３．４)であった。
【００５２】
【表３】
【００５３】
（考察）
動脈血栓症と循環器疾患は、明らかに異常リポタンパク血症と関連するものであるが（文献番号２６〜３１参照）、ＶＴＥでの異常リポタンパク血症は当業者に知られていない。本実施例では、男性のＶＴＥ患者は男性のコントロールよりも、総ＨＤＬ粒子濃度が顕著に低くＬＤＬ粒子レベルが顕著に高い。リポタンパク質サブクラス分析は、これらの相違がより低いレベルの大ＨＤＬ粒子、並びにより高いレベルのＩＤＬ及び小ＨＤＬ粒子を反映することを示す。ＮＭＲに基づくデモンストレーションで男性のＶＴＥ患者の異常リポタンパク血症を確認したところ、ＨＤＬとＬＤＬの主要タンパク質の抗原アッセイデータは、より低いＡｐｏＡＩとより上昇したＡｐｏＢレベルを示した。男性のＶＴＥ患者とコントロールとの間の、ＡｐｏＢ／ＡｐｏＡＩ比（ApoB/ApoAI ratios）の相違は、いずれのアポタンパク質単独の相違よりも統計的により大きいものであった。本実施例では、ＶＴＥ患者とコントロールの間の、より低いＨＤＬパラメーターと上昇したＬＤＬパラメーターの統計的な有意差は、女性と比較した男性にのみに限定されていた。この結果は、特発性ＶＴＥであった女性患者（２５％）の比率が男性（８２％）と比較して非常に少ないことに関連している。特発性ＶＴＥである女性のＶＴＥ患者についての本発明者らの研究は、女性の突発性ＶＴＥのリスクが、本研究における男性のＶＴＥ患者が明らかに呈している異常リポタンパク血症のパターンの１又は複数の要素と関連している可能性を排除できるほど強力ではない。実施例３及び４で示すように、低いレベルのＨＤＬは、原因不明の（unprovoked）ＶＴＥを経験する女性のＶＴＥのリスクの増加と関連している。
【００５４】
本実施例では、四分位数分析に基づいて、低いレベルのＨＤＬ粒子と関連したＶＴＥのＯＲはかなり高く、７．２（９５％ＣI：３．０〜１８）であり、低いレベルの大ＨＤＬ粒子と特に関連していたが、中間及び小ＨＤＬ粒子の相違とは関連していなかった。統計的に有意なＯＲ値は、大ＬＤＬ粒子ではなく、小ＨＤＬ粒子とＩＤＬ粒子の上昇によるＬＤＬ粒子の上昇と関連することが見い出された。
【００５５】
血清コレステロールデータに基づくと、ＨＤＬ−Ｃは、男性ではコントロールよりもＶＴＥ患者で有意に低く、ＬＤＬ−Ｃ／ＨＤＬ−Ｃ比は、コントロールよりもＶＴＥ患者で有意に高かった。ＬＤＬ−Ｃのデータは特に目を見張るものではなかったが、ＬＤＬ−Ｃレベルが１６０ｍｇ／ｄＬよりも高い被検者でのＶＴＥのＯＲは、４．８（９５％ＣI：１．５〜１６）であり、ＬＤＬ−Ｃの上昇はＶＴＥに関連することを示唆していた。ＬＤＬ−Ｃの上昇に関連したＶＴＥの四分位数分析に基づいたＯＲを計算したが、ＯＲは、統計的な有意性を得ることはなかった。
【００５６】
異常リポタンパク血症の所見の一因となる遺伝因子を同定するために、ＨＤＬ代謝を制御する３つの遺伝子で、遺伝的変異（genetic variation）を評価した（文献番号１７、１８、２０、３２、及び３３参照）。ＣＥＴＰのＴａｑＩ多型であるＢ２アレルは、コントロールと比較して男性のＶＴＥ患者では頻度がより低かった（ｐ＝０．０４）。ＣＥＴＰの欠如、又はＣＥＴＰ阻害剤は、ＨＤＬレベルを増加させるため、ＣＥＴＰは、ＨＤＬからＡｐｏＢを含むリポタンパク質への、コレステリルエステル転送に重要な役割を果たしている (文献番号３３、３４参照)。ＴａｑＩＢ２アレルは、ＣＥＴＰ活性の減少と連関している。それによりＨＤＬ粒子サイズとＬＤＬ粒子のサイズが大きくなり(文献番号１６参照)、ＶＴＥでのＢ２の頻度の低さは、低いＨＤＬとより高いＬＤＬレベルを予測するものである。注目すべき点は、ＣＥＴＰのＴａｑＩ遺伝子座（locus）が、ＣＥＴＰ遺伝子の他の多型の不均衡と強く連関し、ＣＥＴＰの活性と濃度に直接に影響を及ぼしうることである（文献番号３５参照）。それゆえ、ＴａｑＩＢ多型は、男性の静脈血栓症のリスクの増加に連関しているＣＥＴＰ遺伝子型のいくつかのＳＮＰマーカー中、一つのみを提供する。ＶＴＥに関連している各々のＣＥＴＰのＳＮＰは、より高いレベルのＣＥＴＰの質量及び活性に連関しており、遺伝的研究が、高レベルのＣＥＴＰの質量及び活性ＶＴＥのリスクに連関していることを示唆することを示すものである。
【００５７】
ＶＴＥの再発は、女性よりも男性に多く起こるが、明確な要因について何ら説明はなかった（文献番号３６参照）。ＶＴＥの再発リスクが増加することと、女性よりも男性のＶＴＥのリスクが本質的により高いことは、男性に特有の危険因子がある、及び／又は女性に特有の保護因子（protective factor）があることを示唆している。一般的に、閉経前の女性は男性よりも、好ましい脂質／リポタンパク質プロファイルを有する。この発見は、なぜ男性はＶＴＥのリスクがより大きいのかということを説明する手助けになる。他所で概説されていることであるが（文献番号１３参照）、ＬＤＬの上昇又はＬＤＬの酸化は、トロンビンの形成を促進できる一方、ＨＤＬは、プロテインＣの経路を増強し、トロンビンの生成を減少させることができる。それゆえ、ａｐｏＢ／ａｐｏＡＩ若しくはＬＤＬ−Ｃ／ＨＤＬ−Ｃ値に反映される、ＬＤＬとＨＤＬの比率（ratio of LDL to HDL）の増加は、プロトロンビンに起因し（prothrombotic）、異常リポタンパク血症がＶＴＥに対してプロトロンビンに起因するものであるメカニズムの実質的な生物学的妥当性が存在する。
【００５８】
本実施例において及び他の実施例において、異常リポタンパク血症が、ＶＴＥに関連するという所見に基づく、明確な治療及び診断に関する暗示がある。以下に新規の療法を挙げることができるがこれらに限定されない。本明細書で記述されている異常リポタンパク血症のパターンを有する被検者はＶＴＥのリスクがより高いので、かかる被検者は、異常リポタンパク血症を好都合に変化させる治療法の恩恵を受けることができる。特発性ＶＴＥとしても知られる、原因不明のＶＴＥを経験した患者にとって、脂質変化剤（lipid altering drugs）による血栓予防（thromboprophylaxis）は、再発性ＶＴＥを防ぐものとなろう。ＶＴＥの危険因子としてかかる異常リポタンパク血症パターンを示す、ＶＴＥを発症したことのない被検者にとって、スタチン療法又はＣＥＴＰ療法は、リスクが増加している状況において、ＶＴＥ発症のリスクを減らすことに効果的であるといえる。臨床試験では、ＣＥＴＰの阻害剤が、大ＬＤＬ粒子レベルを増加させ、ＬＤＬ粒子レベルの減少させること、すなわち、ＶＴＥ患者にみられる異常リポタンパク血症パターンの好ましい逆転（文献番号３４参照）を示すものであり、ＣＥＴＰ阻害療法が、異常リポタンパク血症の患者の再発性ＶＴＥのリスクを減少させるのに役立つことを示唆するものである。ＣＥＴＰ阻害剤は、被検者の以前のＶＴＥの有無にかかわらず、ＨＤＬが欠乏している被検者が、予防法から恩恵を受けてＶＴＥを防止するために役立つであろう。
【００５９】
診断への応用としては、以下を挙げることができるが、これに限定されない。例えばＬＤＬＣ／ＨＤＬ−Ｃ比が、ＶＴＥのリスクを評価するために臨床的に有用であるかもしれない。血清脂質アッセイよりも簡便ではないが、ａｐｏＢ／ａｐｏＡＩを測定するためのＥＬＩＳＡアッセイ若しくは当業者に知られている別の免疫アッセイ法が有用な場合もある。さらに、ＶＴＥ患者のリポタンパク質サブクラスレベルを定量するためのＮＭＲスペクトロスコピー（ＮＭＲspectroscopy）を用いた臨床研究は、ＨＤＬ及びＬＤＬ代謝を制御する遺伝子のＳＮＰｓの研究と同様に確証されている。目的のＳＮＰｓは、ＣＥＴＰのＴａｑ１Ｂ１／Ｂ２多型又は当業者に知られた別の遺伝的に連関した多型を含む。
【００６０】
本発明者らのデータは、多くの別個に測定されたパラメーター、即ちＮＭＲデータ、抗原データ、臨床血清コレステロールデータが、大ＨＤＬ粒子の低レベル及び小ＨＤＬとＩＤＬ粒子のレベルの上昇により特徴づけられる異常リポタンパク血症の特定パターンの定義と完全に合致しているため、強力である。
【００６１】
要約すると、実施例１では、男性のＶＴＥは、保護的な大ＨＤＬ粒子のレベルの減少、及び有害な小ＨＤＬとＩＤＬ粒子のレベルの上昇と関連していた。遺伝学研究では、ＶＴＥの男性は、ＣＥＴＰ活性を上昇させ、男性ＶＴＥ患者で観察される異常リポタンパク血症一因となるＣＥＴＰ遺伝子型を過度に有していることを示している。
【実施例２】
【００６２】
２つの比較的まれなＣＥＴＰ変異型（variant）である、Ａｌａ３７３ＰｒｏとＡｒｇ４５１Ｇｌｎを、ＶＴＥ男性患者のコホートと対応コントロールとで決定した。データによれば、まれであって通常は連関しているＣＥＴＰ変異型であるＰｒｏ３７３とＧｌｎ４５１は、静脈血栓症及び血漿濃度が低いＨＤＬと関連していた。ＣＥＴＰ変異型であるＡｌａ３７３ＰｒｏとＡｒｇ４５１Ｇｌｎは、ＣＥＴＰの質量及び活性のレベルの上昇に関連することが知られており、ＣＥＴＰの質量及び活性の上昇がＶＴＥに連関していることを示している。
【００６３】
（方法）
［研究グループ］
ＶＴＥであると客観的に確認された男性のＶＴＥ患者（ｎ＝４９）を、スクリップス静脈血栓症レジストリで募集した（文献４２参照）。様々な基準の中で、試験対象患者基準は、５５歳未満の血栓症患者であること、急性血栓症の診断から３ケ月を超えて経過していること、脂質低下剤を使用していないこと、また、ガンではないことが含まれた。健常男性コントロール（ｎ＝４９）は、年齢（±２歳）と民族グループ（９２％が非ヒスパニックの白人）とで適合させた。ＶＴＥは、患者の８２％（４０／４９）で特発性と分類された。プロトコールは、スクリップスクリニックの施設内治験審査委員会により承認され、患者は書面によるインフォームドコンセントに同意した。
【００６４】
［血液採取、脂質及びアポリポタンパク質サブクラス分析］
血清とＥＤＴＡ血漿を、ＶＴＥの診断後少なくとも３ケ月経過後に、１２時間の絶食後に患者から採取した血液から調製し、−７０℃で保存した。標準的な方法を用いた日常の臨床検査から、血清脂質プロファイルデータを得た。
【００６５】
ＥＤＴＡ血漿における１０個のリポタンパク質サブクラスのリポタンパク質粒子の濃度を、LipoScience（Raleigh,NC）にて、プロトン核磁気共鳴スペクトル（文献番号５８及び５９参照）によって、文献に記述されているように測定した（文献４２参照）。サブクラスのカテゴリーは、粒子の粒径範囲に基づいており、３つのＶＬＤＬ部分母集団［キロミクロン／大ＶＬＤＬ；中間ＶＬＤＬ；及び小ＶＬＤＬ］と、３つのＬＤＬ部分母集団［ＩＤＬ；大ＬＤＬ；及び小ＨＤＬ］と、３つのＨＤＬ部分母集団［大ＨＤＬ；中間ＨＤＬ；及び小ＨＤＬ］である。ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、及びＨＤＬの平均の粒子サイズも計算した。文献に強調されているように（文献番号５８及び５９参照）、ＮＭＲ由来のリポタンパク質粒子のレベルは、典型的なリポタンパク質粒子に特徴的なＮＭＲシグナルに基づくものであり、実際の脂質測定によるものではない。ＮＭＲデータは粒子数に正比例し、個々人によって異なる場合もある粒子ごとの脂質又はアポリポタンパク質とは非依存的である
【００６６】
［ＤＮＡ分析］
ゲノムＤＮＡは、Puregene（登録商標）ＤＮＡ精製キット（Gentra Systems社製、Minneapolis, MN）を用いてＥＤＴＡ血液から抽出した。ＣＥＴＰ遺伝子の４つのＳＮＰｓ（ＴａｑＩＢ１／Ｂ２、Ａｌａ３７３Ｐｒｏ、Ｉｌｅ４０５Ｖａｌ、及びＡｒｇ４５１Ｇｌｎ）を文献に記載されているように測定した（文献番号４２及び５２参照）。ＶＴＥの遺伝子多型との関連を評価するためにカイ二乗検定を用いた。
【００６７】
（結果と考察）
ＣＥＴＰは、リポタンパク質代謝において重要な役割を果たし、異なるリポタンパク質間の様々な脂質を運搬することによりＨＤＬを潜在的に再構築し（remodel）、ＣＥＴＰ欠如、又はＣＥＴＰ阻害剤は、ＨＤＬレベルを増加させる（文献番号５３〜５５及び６０〜６２参照）。４つのＣＥＴＰ遺伝子の変異（variation）、すなわち比較的一般的なＴａｑＩＢ１とＩｌｅ４０５の変異型、及び比較的まれなＰｒｏ３７３とＧｌｎ４５１の変異型は、ＨＤＬコレステロールレベルをより低くし、より小さい（smaller）ＨＤＬ粒子を生じさせるより高いレベルの血漿ＣＥＴＰと関連していた（文献番号５２〜５７参照）。男性静脈血栓症患者でのＨＤＬ欠乏に関する知見を得るために（文献番号４２参照）、ＣＥＴＰ遺伝子でのＡｌａ３７３ＰｒｏとＡｒｇ４５１Ｇｌｎ変異（variation）を、男性のＶＴＥ患者４９人と対応コントロール４９人において分析した。Ｐｒｏ３７３のヘテロ接合性（heterozygosity）は、ＶＴＥ患者では２０％（４９人中１０人）、コントロールでは２％（４９人中１人）が特定された（ｐ＝０．００４０）。一方、Ｇｌｎ４５１のヘテロ接合性は、ＶＴＥ患者では１６％（４９人中８人）、コントロールでは０％が特定された（ｐ＝０．００３２）。かかる２つのＣＥＴＰ変異型のいずれにおいてもホモ接合体は、研究中の９８人の被検者で観察されなかった。Ｇｌｎ４５１を有する被検者は、全員Ｐｒｏ３７３を有していた。比較として、第５因子ライデン及びプロトロンビン２０２１０Ａは、ＶＴＥ患者の２６％（４９人中１３人）及び１４％（４９人中７人）にそれぞれみいだされた一方、かかる２つの遺伝的変異は、報告のあるとおり（文献番号４２参照）、それぞれコントロールの４％（それぞれの変異型につき４９人中２人）に別個に観察された。
【００６８】
本発明者らのスクリップスのコントロール（表４参照）で調査された４つのＣＥＴＰ変異型のアレル頻度の値は、発表されている集団（population）の数値と類似していた（esembled）。例えば、コーカサス人の集団では、発表されているＰｒｏ３７３とＧｌｎ４５１のアレル頻度の値は、それぞれ約０．０２と０．０１であり、ＴａｑＩＢ１とＩｌｅ４０５アレル頻度の値は、それぞれ０．５７と０．６２である。対照的に、スクリップスのＶＴＥ患者のすべてのアレル頻度の値は、Ｐｒｏ３７３、Ｇｌｎ４５１、ＴａｑＩＢ１、及びＩｌｅ４０５の本発明者らのスクリップスのコントロールの数値を超えていた。計算されたアレル頻度の差を表４に示す。
【００６９】
【表４】
【００７０】
７つの異なるＣＥＴＰ ＳＮＰｓの分析に基づく従前の研究は、それぞれの推定有病率が０．５％を超えている（＞０．５％）、少なくとも１４の異なるＣＥＴＰハプロタイプの存在を推測させるものであった（文献番号５６参照）。かかる１４個のハプロタイプのうち１個のみがＧｌｎ４５１を有しており、１４個中２個のハプロタイプがＰｒｏ３７３を有している。ＴａｑＩＢ１、Ｐｒｏ３７３、Ｉｌｅ４０５、及びＧｌｎ４５１を有しているこれらの２つのハプロタイプがより多くみられ、本発明者らの研究で決定された４つのＣＥＴＰのＳＮＰｓがＶＴＥ患者では、コントロールと比較して過度に観察された。ＶＴＥ患者とコントロールとの間のアレル頻度の相違は、Ｐｒｏ３７３では０．０９であり、Ｇｌｎ４５１では０．０８であった（表４）。本発明者らの研究ではより一般的なＴａｑＩＢ１とＩｌｅ４０５Ｉの変異型についてのＶＴＥ患者とコントロールの間のアレル頻度の相違は、それぞれ０．１４と０．１１であった。それゆえ、アレル頻度のそれぞれの相違はかなり類似しており、０．０８〜０．１４の範囲であり、本発明者らは、Ｐｒｏ３７３とＧｌｎ４５１の両方を呈する本発明者らのＶＴＥ患者の１６％が、一般的なＣＥＴＰ変異型であるＴａｑＩＢ１とＩｌｅ４０５及び比較的まれな変異型であるＰｒｏ３７３とＧｌｎ４５１を含むハプロタイプ（文献番号５６参照）を有すると推定する。
【００７１】
８人のＶＴＥ患者において、血漿リポタンパク質濃度とＰｒｏ３７３とＧｌｎ４５１の存在との関係について分析した。かかる８人のＶＴＥ患者のＨＤＬパラメーターを、コントロール及び正常型のＡｒｇ４５１ＣＥＴＰ遺伝子型を有する別のＶＴＥ患者のＨＤＬパラメーターと比較した。ＨＤＬコレステロールとＨＤＬ粒子の血漿レベルは、Ｐｒｏ３７３とＧｌｎ４５１を有する８人のＶＴＥ患者では、正常型のＡｒｇ４５１ＣＥＴＰ遺伝子型の者よりも低かった（図３参照）。Ｐｒｏ３７３とＧｌｎ４５１遺伝子型の両方を有するＶＴＥ被検者の、ＮＭＲスペクトロスコピーを用いて測定したリポタンパク質の濃度、即ちＶＬＤＬ粒子とＬＤＬ粒子の濃度は、他の被検者と有意な相違はなかった（データは示されていない）。それゆえ、ＶＴＥ患者のＣＥＴＰでＰｒｏ３７３とＧｌｎ４５１が存在することは、静脈血栓症に関連するＨＤＬ欠乏の所見を説明するための重要な手助けとなることを示唆する（文献４２参照）。
【００７２】
以下のことは興味を持って注目すべきである。Ｐｒｏ３７３とＧｌｎ４５１の両方を有する８人すべてのＶＴＥ患者は、コントロールの２５パーセンタイル以下（≦the 25thpercentile）のＨＤＬコレステロールレベルを有する一方、これら８人のＶＴＥの患者のうち８人中６人は、コントロールの２５パーセンタイル以下のＨＤＬ粒子濃度を有する（図３参照）。比較として、正常なＣＥＴＰ遺伝子型の５４％のＶＴＥ患者は、コントロールの２５パーセンタイル未満のＨＤＬコレステロールレベルを有する一方、ＶＴＥ患者の６８％は、コントロールの２５パーセンタイル以下のＨＤＬ粒子濃度を有する（図３参照）ことに注目すべきである。これらのデータは、野生型であるＡｌａ３７３とＡｒｇ４５１のＣＥＴＰ遺伝子型のＶＴＥ患者の相当数が、ＨＤＬコレステロールが低く、ＨＤＬ粒子濃度が低いことを示す（図３参照）。結果として、Ｐｒｏ３７３とＧｌｎ４５１の存在が、多少のＶＴＥ患者のＨＤＬ欠乏の所見を説明することの有効な手助けになるが、静脈血栓症でのＨＤＬ欠乏に有意に一因となる遺伝的及び／又は環境的な別の因子がある。
【００７３】
ＨＤＬは、コレステロール逆転送系（reverse cholesterol transport process）の一因となり、抗炎症性活性、抗酸化活性、及び抗アポトーシス活性に影響を及ぼす（文献番号４４〜４６、５４、５５、及び６２〜６６参照）。ＨＤＬはまた、少なくともインビトロにおいて活性化したプロテインＣの抗凝固作用を増強する（文献番号５０参照）。それゆえ、発病のメカニズムについては実質的な生物学的妥当性があり、ＣＥＴＰ変異型であるＰｒｏ３７３とＧｌｎ４５１により引き起こされるＨＤＬ欠乏はプロトロンビンに起因し、ＶＴＥのリスクの増加の一因となるのかもしれない。
【００７４】
本研究における所見は、非常に強力な統計学的重要性を有する。研究は男性に限定されているが、同様の所見は女性のＶＴＥ患者でも適用されるものであろう。
【００７５】
異常脂質血症（dyslipidemia）及び異常リポタンパク血症は、薬物治療を受け入れることができるものであるから、ＶＴＥのリスクを減少させるための治療と関連するものである。例えば、ＣＥＴＰ阻害剤（文献番号６０〜６２参照）を用いてＨＤＬを上昇させる治療は、ＶＴＥのリスクを減少させるものとなろう。
【００７６】
本実施例の概要として、高比重リポタンパク質欠乏を含む異常リポタンパク血症を呈している５５歳未満の男性での静脈血栓塞栓症は、高比重リポタンパク質の減少とＣＥＴＰの質量と活性の上昇を引き起こすことが知られている２つの比較的まれなコレステリルエステル転送タンパク質遺伝子の変異型であるＡｌａ３７３からＰｒｏとＡｒｇ４５１からＧｌｎと関連している。
【実施例３】
【００７７】
以下の研究グループのＡｐｏＡＩ（ＨＤＬの主要なアポリポタンパク質）の抗原レベルを測定した。
【００７８】
［研究グループ］
５７人のＶＴＥ患者と５４人の対応コントロールからなる白人女性の研究集団。患者が最初に血栓症を発症したのが４５歳未満であり、以前に報告のある研究（文献７７参照）のサブセットであった。すべての被検者に、協会のガイドラインに沿ってインフォームドコンセントを行った。
【００７９】
経口抗凝固薬を服用している患者、抗トロンビン、プロテインＣ、プロテインＳ、プラスミノーゲン、又はヘパリン補因子IIの欠陥などの公知のトロンビン因子の（thrombophilic）欠如の患者、及びＡＰＣ抵抗性（resistance）第５因子ライデン、及びプロトロンビン２０２１０Ａ、又は抗リン脂質抗体、或いはループス性抗凝固因子（lupus anticoagulant）を有する患者は、悪性腫瘍（malignancy）、ネフローゼ症候群、腎臓及び肝臓不全、炎症性疾患若しくは感染症、又は心臓疾患の患者と同様除外された。すべての患者のＶＴＥの診断は、入院して行った客観的方法（下肢のＶＴＥのための静脈造影法（venography）若しくは超音波検査法（ultrasonography））、又は肺塞栓症（pulmonary embolism）のための肺血管造影（pulmonary angiography）若しくは肺潅流喚起スキャン（perfusion-ventlation lung scan））によって確定された。
【００８０】
グループ間のカテゴリーデータを、分割表解析（カイ二乗検定）を用いて比較し、連続データは、対応のないスチューデントのｔ−検定、又はマン−ホイットニーの検定を必要に応じて用いて比較した（Prism（登録商標）３．０ソフトウェア、Graph Pad Software社製、San Diego, CA）。ｐ値はすべて両側検定であった。プロトロンビンの危険因子の多因子性の役割を、多変量ロジスティック回帰解析を用いて評価し、調整したｐ値又は調整したオッズ比を、ミニタブ１４ソフトウェア（Minitab社製、State College, PA）を用いて評価した。
【００８１】
図４に示すように、女性のコントロールと比較して、女性のＶＴＥ患者ではＡｐｏＡＩレベルがより低かった（ｐ＝０．０２６）。
【実施例４】
【００８２】
この実施例では、静脈血栓症の発症を経験したことのある患者の大規模コホートについて追跡調査し、高比重リポタンパク質パラメーターと再発性静脈血栓塞栓症との関係を調査した。
【００８３】
（方法）
［研究グループ］
患者は、静脈血栓塞栓症の患者に対する、進行中のプロスペクティブ多施設コホート研究であるオーストリア再発性静脈血栓塞栓症研究（Austrian Study on Recurrent Venous Thromboembolism）（ＡＵＲＥＣ）の参加者であった。研究の特徴は詳細に報告されている（文献番号３６参照）。１９９２年の７月から２００４年の１１月の間で、静脈血栓塞栓症後少なくとも３ケ月間ビタミンＫ拮抗薬（vitamin K-antagonists）で治療していた１８歳を超える２７６４人の患者が選ばれた。深部静脈血栓症（deep vein thrombosis）は、静脈造影法（venography）又はカラー二重超音波造影術（近位深部静脈血栓症の場合）により診断した。肺塞栓症（Pulmorary embolism）は、肺塞栓症診断の予測試験（Prospective Investigation）の基準による肺換気血流スキャン（ventilation perfusion scan）又は多層コンピュータ断層撮影法（multi-slice computed tomography）により診断した（文献３６参照）。過去の血栓症（３２９人）、外科手術、外傷性障害、若しくは妊娠において二次的に起こる静脈血栓塞栓症（４２３人）、抗トロンビン、プロテインＣ、若しくはプロテインＳの欠如（６６人）、ループス性抗凝固因子（６７人）、ガン（４３４人）、静脈血栓塞栓症以外の理由による長期間の抗血栓剤治療の必要性（４２８人）、或いは臨床試験用の機材が用意できない（１２２人）ことを理由に、１９９２人の患者が除外された。再発リスクに対する長期間の抗凝固剤の効果を調査する介入試験に参加した第８因子レベルの高い２６人の患者も分析から除外した。スタチンを用いた９７人の患者も除外した。
【００８４】
研究は、協会の倫理委員会により承認され、患者は書面によるインフォームドコンセントに同意した。患者はビタミンＫ拮抗薬を中断しているときに研究に参加し、最初の１年は３ケ月の間隔をおいて、その後は６ケ月毎に調査を行った。患者らは、静脈血栓塞栓症の症状について書面で情報を受け取り、症状が出たときには報告する旨指導を受けた。
【００８５】
［研究の終了］
研究は、客観的方法により別々の臨床医及び放射線科医によって、再発性深部静脈血栓症の兆候が確認されたときに終了した。
【００８６】
［血液採取と実験室分析］
静脈血を、プロトロンビン時間の正常化（normalization）後（ビタミンＫ拮抗薬の中断後約３週間）、絶食状態で、１／１０容量の０．１１ｍモル／Ｌクエン酸三ナトリウム内に採取した。２０００ｇで２０分間遠心分離して血漿を調製し、−８０℃で保存した。ゲノムＤＮＡは、標準的な方法で、血液白血球（blood leukocytes）から単離した。抗トロンビン、プロテインＣ、プロテインＳ、第５因子ライデン、プロトロンビンＧ２０２１０Ａ変異体（mutation）、第８因子、及びループス性抗凝固因子を、従前記述されている通り（文献番号３６参照）決定した。アポリポタンパク質ＡＩとアポリポタンパク質Ｂの血漿レベルは、免疫比濁アッセイキット（DiaSorin社製、Stillwater, MN, USA）を用いて測定した（文献番号４２参照）。プロトン核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトロスコピーを用いて、３９６人の患者のＥＤＴＡ血漿での、１０のリポタンパク質サブクラスのレベルとＥＤＴＡ血漿の脂質のレベルを、文献（文献番号２１、２２、及び４２参照）に記述されている通り決定した。ＮＭＲ由来のリポタンパク質粒子のレベルは、典型的なリポタンパク質粒子に特徴的なＮＭＲシグナルに基づくものであり、実際の脂質測定によるものではない。ＮＭＲデータは粒子数に正比例し、個々人によって異なる場合もある粒子ごとの脂質又はアポリポタンパク質とは非依存的である。ＨＤＬコレステロールとＬＤＬコレステロールのレベルをＮＭＲスペクトロスコピーを用いて計算し、かかる方法は、従来の化学的方法により決定された脂質濃度と強い相関を示した（文献番号２２参照）。ＮＭＲスペクトロスコピーを用いて、計算されたＨＤＬコレステロールとＬＤＬコレステロールレベルは、脂質濃度を決定するための従来の化学的方法と強い相関を示した（文献番号２２参照）。ＮＭＲスペクトロスコピー分析のための患者のサンプルは、再発の状況によって選択した。年齢と性別に照らして、再発した患者一人につき、再発していない３人の患者を対応させた。
【００８７】
［統計的分析］
算術演算に、ＳＰＳＳ１２．０ソフトウェアの（SPSSInc. Headquarters, Chicago、Illinois, USA）を用いた。階層（strata）間の均一性（homogeneity）を試験するために、ログランク検定（log-rank）、及び一般化ウィルコクソン検定（generalized Wilcoxon test）を適用した。カテゴリーデータの均一性を、分割表解析（カイ二乗検定により）を用いてチェックし、連続データ（平均±ＳＤとして表す）をマン−ホイットニーのＵ検定によって比較した。再発までの時間（非打切り観察（uncensored observations））又は再発のない患者では追跡調査（follow up）の時間（打切り観察（censored observations）)をサバイバルメソッドを用いて分析した。再発の確率は、KaplanとMeier（文献番号７８参照）により推定した。単変量と多変量のコックス比例ハザードモデル（Cox proportional hazards models）をアポリポタンパク質ＡＩとアポリポタンパク質Ｂのレベルと再発リスクとの間の関連を分析するために用いた。分析は、年齢、性別、肥満度指数、及び第８因子の高さについて調整した（９０パーセンタイル（２２５ＩＵ／ｄｌ）で二分化）。
【００８８】
本発明の実施例では、突発性静脈血栓塞栓症を初めて発症した患者７７２人を研究した。患者の平均年齢は、４７±１６歳であり、７７２人中４４０人の患者が女性であった（５７パーセント）。患者の経過観察は平均４８ケ月であった。１９２人の患者が、ガン（患者１５人）若しくは妊娠（患者３３人）の診断のため、又は、静脈血栓塞栓症以外の理由による抗血栓剤の治療が必要（患者１１２人）のため研究から退き、患者１５人は経過観察ができなくなり、患者１７人が死亡したが、そのうち２人は再発性ＶＴＥが死亡原因であった。患者は、データを打ち切って研究を退くまで経過観察された。
【００８９】
７７２人中１００人の患者（１３％）が静脈血栓塞栓症を再発した。再発箇所は、６１人が深部静脈血栓症、３９人が肺塞栓症であった。多変量解析によると、男性で第８因子が高いことが、再発リスクの主要な決定要因であった（表５参照）。再発リスクは、肥満度指数の増加に伴い増加する。第５因子ライデン又は第２因子Ｇ２０２１０Ａのいずれかのヘテロ接合性のキャリアシップ（heterozygous carriership）は、野生型のキャリアと比較して有意に再発リスクをより高くするものではなかった。
【００９０】
【表５】
【００９１】
再発性静脈血栓塞栓症の患者は、再発していない患者よりも、アポリポタンパク質ＡＩが有意により低いレベルであった（１．１２±０．２２ｍｇ／ｍＬ対１．２３±０．２７ｍｇ／ｍＬ、Ｐ＜０．００１）。アポリポタンパク質ＡＩを、Ｃｏｘ比例ハザードモデル（Cox proportional hazard model）に連続変数として入力したとき、再発の相対リスクは、アポリポタンパク質ＡＩのレベルが０．１ｍｇ／ｍＬ増加するごとに０．８７（９５パーセント信頼区間０．８０〜０．９４）であって、年齢、性別、第８因子の高さ、及び肥満度指数による調整後も変化がなかった［相対リスク０．８８（９５パーセント信頼区間０．８０〜０．９７）］。
【００９２】
アポリポタンパク質ＡＩレベルの増加に伴う再発リスクが減少する潜在的直線性（potential linearity）を検出するため、アポリポタンパク質ＡＩレベルの三分位数（tertiles）に対応する患者のグループにおける再発の相対リスクを計算した（表６参照）。アポリポタンパク質ＡＩレベルが１．０７ｍｇ／ｍＬより低い患者と比較して、アポリポタンパク質ＡＩレベルが１．０７〜１．３ｍｇ／ｍＬである患者では再発の相対リスクはより低く［０．７８（９５パーセント信頼区間０．５０〜１．２２）］、アポリポタンパク質ＡＩレベルが一番高い患者（１．３ｍｇ／ｍＬ以上）では、一番低かった［０．４６（９５パーセント信頼区間０．２７〜０．７７）］。潜在的な交絡変数（confounding variables）の調整は、これらの所見に実質的に影響を与えることはなかった。
【００９３】
【表６】
【００９４】
患者は、アポリポタンパク質ＡＩのレベルが１．３ｍｇ／ｍＬ（血栓患者の６７パーセンタイルに対応する）以上のレベルの者と、１．３ｍｇ／ｍＬよりも低い者の２つに分けられた。表７にこれらの患者の特性を示す。アポリポタンパク質ＡＩのレベルが低い患者はより若く、より高い肥満度指数を有していた。カプラン−マイヤー分析によると、かかる二つのグループでは再発率に明確な相違（divergence）はみられなかった(図５参照)。４年後、アポリポタンパク質ＡＩのレベルが１．３ｍｇ／ｍＬ以上である患者の再発の累積確率は８．８パーセントであった（９５パーセント信頼区間４．６〜１２．９パーセント）が、比較として、アポリポタンパク質ＡＩのレベルが１．３ｍｇ／ｍＬよりも低い患者（Ｐ＝０．００６）は、１５．９パーセントであった。多変量解析では、アポリポタンパク質ＡＩの高レベルであると、再発の相対リスクが０．５１になった（９５パーセント信頼区間０．３２〜０．８３）。年齢、性別、第８因子の高さ、及び肥満度指数により調整後の再発リスクは０．５８であり（９５パーセント信頼区間０．３５〜０．９７）、より低いアポリポタンパク質ＡＩのレベルの者と比較すると再発の相対リスクは、４３パーセント低くなるものと言い換えることができる。
【００９５】
【表７】
【００９６】
アポリポタンパク質ＡＩのレベルは、女性と比較すると男性では有意に低かった（１．１５±０．２３対１．２６±０．２８ｍｇ／ｍＬ、Ｐ＜０．００１）。より低い三分位数でのアポリポタンパク質ＡＩのレベル（１．０７ｍｇ／ｍＬ未満）の男性の比率は、女性の比率と比較するとより高かった［３３２人中１２６人、（３８パーセント）対４４０人中１１７人、（２７パーセント、Ｐ＜０．００１］。反対に、上位三分位数でのアポリポタンパク質ＡＩのレベル（１．３ｍｇ／ｍＬ以上）が、女性ではより多く見られた［４４０人中１８０人、（４１パーセント）対３３２人中８２人、（２５パーセント）、Ｐ＜０．００１）。再発した男性は、アポリポタンパク質ＡＩのレベルが一番低く、再発しなかった女性はレベルが一番高かった（図６、パネルＡ）。当業者には周知であるが、それぞれのＨＤＬパラメーターを基礎とするＨＤＬのレベルは、女性の方が本来男性より高い。
【００９７】
２６１人の男性と１３２人の女性の血漿の高比重リポタンパクコレステロールのレベルを、ＮＭＲスペクトロスコピー分析を用いて測定した。アポリポタンパク質ＡＩと高比重リポタンパクコレステロールのレベルとの正相関がみられた（ｒ２＝０．８７、Ｐ＜０．００１）。高比重リポタンパクコレステロールのレベルは、再発した男性が最も低く、再発しなかった女性が最も高かった（図６、パネルＢ参照）。
【００９８】
被検者の血漿サンプルの大ＨＤＬ粒子濃度を、ＮＭＲスペクトロスコピー分析を用いて測定した。図６Ｃに示すように、再発性静脈血栓症の男性は、再発しない男性よりもかかる粒子のレベルが低く、再発しない女性と比較して、再発した女性についても同じことがいえる。
【実施例５】
【００９９】
本実施例では、ＨＤＬとリポタンパク質パラメーターの特性の差異を決定するために、男性のＶＴＥ被検者と男性の対応コントロールとを比較した。この目的の研究グループは、実施例１に記述したコホートから採用された若い成人男性のサブセットであった。被検者らは、脂質低下剤を服用していなかった。
【０１００】
研究グループ：本実施例では、男性のＶＴＥ患者（ｎ＝４９）と年齢が一致するコントロール（ｎ＝４９）の、脂質とリポタンパク質の特性について分析した。臨床的特徴と、特定された危険因子の頻度と、血漿脂質データとを表８に示す。４９人のＶＴＥ患者中４０人（８２％）は、外科手術、外傷性障害、長期の固定後９０日以内に発症していないと定義される特発性ＶＴＥを呈した。ＶＴＥ患者とコントロールについて、脂質代謝の変化に関連する臨床症状を記録した。ＶＴＥ患者の一人は糖尿病の症状を呈していた。３人のＶＴＥ患者は高血圧を呈し、コントロールは症状を呈さなかった。コントロールと比較して、男性のＶＴＥ患者の従前の喫煙歴は同程度であった（８対６、ｐ＝０．７９）。コントロールと比較して男性のＶＴＥ患者の現在の喫煙率（current smoking）は同程度であった（５対４、ｐ＝１．０）。男性のＶＴＥ患者中、１８人（３７％）が一回以上の血栓症の発症しており、１７人（３５％）が肺塞栓症を確認されていた。患者の８４％は、血液を採取したときワルファリンを服用していた。ＶＴＥ患者とコントロールではガンについては確認がとれなかった。
【０１０１】
【表８】
【０１０２】
血液採取、脂質分析、アポリポタンパク質アッセイ、ＮＭＲ分析、及びＤＮＡ分析の方法は、実施例１に記載されている。
【０１０３】
統計的分析：患者（cases）は、年齢（±２歳）、性別、及び民族性の各要素を１：１の比で、コントロールと適合させた。対応のあるｔ−検定又はウィルコクソン検定（Prizm（登録商標）３．０、Software, GraphPad Software, SanDiego, CA）で、相違０（相違なし）の帰無仮説（null hypothsis）に対して、計算し、検定した。ｐ値はすべて両側検定であった。マクネマーの検定（McNemar's test）は、カテゴリー変数（例えばＶＴＥ陽性家族暦、喫煙状況等）の対応対（matched pair）間の比率の相違を評価するために用いた。
【０１０４】
脂質レベルは、対照分類（reference category）として用いられる最も低い又は最も高い四分位数で、四分位数に分割した後にカテゴリー変数として分析した。条件付ロジスティック回帰（年齢及び性別の適合に相当する）が、オッズ比（ＯＲｓ）を評価するために用いられた。周知の危険因子であるＢＭＩ、ライデン第５因子、及びプロトロンビン２０２１０Ａが、条件付ロジスティック回帰（STATA8.0、Stata Corporation, College Station, TX）を用いて行われた。患者と対応コントロールのリポタンパク質のパラメーターの相違を計算した。個人のモデルは各脂質パラメーターについて、修正したＯＲを計算するために用いられた。各バイオマーカーの四分位数を横断した線形トレンドのＰ値を多重比較の調整なしに計算した。遺伝子多型とＶＴＥとの関連を評価するために、条件付ロジスティック回帰とカイ二乗分析の両方を、２つのグループの間の遺伝子型と対立遺伝子頻度の比較のために用いた。
【０１０５】
男性のＶＴＥ患者は、コントロールよりも有意に低い平均ＨＤＬ粒子濃度を有していた（ｐ＝０．００１）（図７Ａ参照）。ＨＤＬリポタンパク質サブクラスでは、大ＨＤＬリポタンパク質粒子濃度は、患者ではコントロールよりも低かった一方（ｐ＝０．０４７）、中間と小ＨＤＬ粒子は、有意な相違はなかった（図７Ｂ〜Ｄ参照）。ＨＤＬ平均粒子サイズもまた、コントロールよりもＶＴＥ患者では低かった。
【０１０６】
ＶＴＥ患者のＬＤＬリポタンパク質粒子濃度は、コントロールよりも有意に高かった（図８Ａ、ｐ＝０．０２）。ＬＤＬリポタンパク質サブクラスでは、小ＨＤＬ粒子濃度は、患者でより高かった一方、ＩＤＬと大ＬＤＬ粒子レベルは、何ら統計学的相違を示さなかった（図８Ｂ−Ｄ参照）。小ＨＤＬ粒子の２つのサブグループ、すなわち中小ＬＤＬ粒子と極小ＬＤＬ粒子は、ＶＴＥ患者では上昇した（それぞれｐ＝０．０２と０．０３、データは示されていない）。ＬＤＬ平均粒子サイズは、コントロールと比較して患者では小さかった（ｐ＝０．０４）。ＶＬＤＬ粒子の合計濃度又はＶＬＤＬのサブクラス（大、中間及び小ＶＬＤＬ粒子）又は、ＶＬＤＬ粒子サイズについては、患者とコントロールの間には何ら統計学的に有意な相違は観察されなかった。
【０１０７】
アポリポタンパク質ＡＩとＢの免疫学的検定データは、ＮＭＲに基づいたリポタンパク質サブクラスデータと一致した。コントロールと比較して、ＶＴＥ患者ではａｐｏＢレベルに何ら相違はなかったけれども（図８Ｅ参照）、ＡｐｏＡＩレベルは、ＶＴＥ患者ではより低かった（ｐ＝０．０１）（図７Ｅ参照）。ＶＴＥ患者のａｐｏＢ対ａｐｏＡＩの比は、コントロールに比べて有意により高く（ｐ＝０．００２）（図８Ｇ参照）、ａｐｏＢ／ａｐｏＡＩの平均比の相違は、ＡｐｏＡＩ又はＡｐｏＢいずれか単独の平均値の相違よりも統計学的に大きかった。
【０１０８】
コントロールと比較してＶＴＥ患者では、ＨＤＬコレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）がより低かった一方、ＬＤＬコレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）（ｐ＝０．１１）（図７Ｆ及び図８Ｆ参照）。際立って、しかしながら、ＬＤＬ−ＣとＨＤＬ−Ｃの比率平均（LDL-C to HDL-C mean ratio）は、コントロールと比較した場合ＶＴＥ患者では有意により高かった。
【０１０９】
リポタンパク質変数とＶＴＥが関連する四分位数に基づいたオッズ比（ＯＲ）を、四分位数１（lowest ＨＤＬ）と、四分位数２〜４又は四分位数４（一番高いＬＤＬ）とＨＤＬパラメーターの減少又はＬＤＬパラメーターの上昇について四分位数１〜３とを比較することで、計算した。総ＨＤＬ粒子濃度と大ＨＤＬ粒子濃度の低いレベルは、それぞれＯＲ＝６．５（９５％ＣI：２．３−１９）、及び２．８（９５％ＣI：１．２−６．２）であり、ＶＴＥのリスクの増加に有意に関連した。より小さいＨＤＬ平均粒子サイズは、有意なＯＲが３．２（９５％ＣI：１．３−７．９）であった。総ＬＤＬ粒子濃度と２つの亜分画（subfraction）の高いレベル（コントロールの７５％を超えた）は、ＩＤＬと小ＬＤＬ粒子濃度が、それぞれＯＲ＝２．２（９５％ＣI：１．０−４．９）、２．７（９５％ＣI：１．０−６．８）、及び３．１（９５％ＣI：１．３−７．４）であり、ＶＴＥのリスクが有意に関連した。小ＬＤＬ粒子サブクラスの２つの部分母集団、すなわち中小ＬＤＬ粒子及び極小ＬＤＬ粒子が、それぞれ３．０と３．１（９５％ＣI：１．３−７．０と１．３−７．４）のＯＲを与えたが（データは示されていない）、小ＬＤＬ粒子濃度の３．１のＯＲに類似する値であった（表９）。公知のＶＴＥ危険因子、第５因子ライデン、プロトロンビン２０２１０Ａ、及びＢＭＩの調整後、大ＨＤＬ粒子（ｐ＝０．０５６）の濃度を除いては、すべての統計学的に有意な四分位数分析に基づいたＯＲ値は、統計学的に有意であった（表９参照）。ＬＤＬ平均粒子サイズが減少すると、第５因子ライデン、プロトロンビン２０２１０Ａ、及びＢＭＩの調整後、有意なＯＲ、７．６（９５％ＣI：１．５−３９）となった。
【０１１０】
ａｐｏＡＩとａｐｏＢの血漿レベルを標準的な免疫学的検定で測定した。ＶＴＥについては四分位数分析に基づくａｐｏＡＩのレベルが低いと、有意なＯＲであるＯＲ＝６．０（９５％ＣI：２．１−１７）であって、ＡｐｏＢ／ＡｐｏＡＩの比は、ＯＲ＝６．３（９５％ＣI：１．９−２１）であった。ライデン第５因子、プロトロンビン２０２１０Ａ、及びＢＭＩを調整後、これらのＯＲについて有意性が残存した。臨床上の血漿コレステロールデータに基づくと、低いＨＤＬ−ＣのＯＲは統計学的有意性があった[ＯＲ＝３．０（９５％ＣI：１．３−７．１）]一方、上昇したＬＤＬ−Ｃは、統計学的有意性を獲得できなかった[ＯＲ＝１．９（９５％ＣI：０．８４−４．２）]。ライデン第５因子、プロトロンビン２０２１０Ａ、及びＢＭＩを調整後、上昇したＬＤＬ−ＣではＯＲは、統計学的有意性を獲得したが[ＯＲ＝３．９（９５％ＣI：１．１−１４）]、低いＨＤＬ−Ｃでは、統計学的に有意性がなかった[ＯＲ＝３．９（９５％ＣI：０．７８−８．９）]。ＶＴＥのＯＲでの上位四分位数のＬＤＬ−Ｃ／ＨＤＬ−Ｃの比は、調整がなくてもＶＴＥのリスクに統計学的に有意であったが[ＯＲ＝２．７（９５％ＣI：１．１−６．５）]、調整後のＯＲは、５．０であった（９５％ＣI：１．３−２０）（表１０）。１６０ｍｇ／ｄＬより高いＬＤＬ−ＣレベルでのＶＴＥのＯＲは、３．５（９５％ＣI：１．２−１１）であり、４０ｍｇ／ｄＬ未満のＨＤＬ−ＣでのＶＴＥのＯＲは、２．８（９５％ＣI：１．１−７．２）である（データは示されていない。）。
【０１１１】
【表９】
【０１１２】
脂質パラメーターレベルとＶＴＥのリスクとの線形連関（linear association）を評価するために、四分位数の対応対間の分析を行い、傾きのｐ値を計算した（表１０参照）。総ＨＤＬ粒子濃度、大ＨＤＬ粒子濃度、及びより高いレベルの総ＬＤＬ、ＩＤＬ、若しくは小ＨＤＬ粒子濃度がより低いレベルであると、ＶＴＥのリスクの増加（それぞれｐ＝０．００４、０．００９、０．０３、０．０３、及び０．０３）に関連していた。より小さいＨＤＬサイズとより大きいＬＤＬサイズもまた、ＶＴＥのリスクの増加と関連していた（それぞれｐ＝０．０２と０．０１）。
【表１０】
【０１１３】
ＶＴＥ患者の異常リポタンパク血症の一因となる遺伝的影響を特定するために、リポタンパク質部分母集団のスペクトラムと及びＨＤＬ−Ｃレベルに影響を与える３つの鍵遺伝子のＳＮＰｓ、（ＬＩＰＣ−５１４Ｃ／Ｔ）、内皮リパーゼ（ＬＩＰＧＴ１１１Ｉ）及びＣＥＴＰ(ＴａｑＩＢ及びＩ４０５Ｖ)を決定した。ＶＴＥ患者とコントロールの間のアレル頻度の相違を、カイ二乗検定を用いて調べたところ、ＣＥＴＰのＴａｑＩＢ２アレルはコントロールよりもＶＴＥ患者においては有意にまれなものであった（ｐ＝０．０４）（表１１）。研究に用いた肝性リパーゼと内皮リパーゼのＳＮＰｓでは、アレル頻度の相違はみられなかった。ＶＴＥの遺伝子型の関連を評価するために、条件付ロジスティック回帰もまた行った。ＣＥＴＰ ＴａｑＩＢ遺伝子型は、有意にＶＴＥに関連していたが（ｐ＝０．０１７）、この実施例の研究グループでは、ＣＥＴＰ Ｉ４０５Ｖ、ＬＩＰＣ又はＬＩＰＧ多型では関連は見られなかった（それぞれｐ＝０．１５、０．６０及び０．４８）。
【０１１４】
【表１１】
【０１１５】
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【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】性別ごとのＶＴＥとコントロールのＨＤＬ関連脂質パラメーターを示す。太い実線は、平均値を示し、点線はコントロール値の２５パーセンタイルの値を示す。（Ｆ）における低いほうの点線は、４０ｍｇ／ｄＬを示す。（Ａ）ＨＤＬ粒子；（Ｂ）大ＨＤＬ粒子；（Ｃ）中間ＨＤＬ粒子；（Ｄ）小ＨＤＬ粒子；（Ｅ）ＡｐｏＡＩ；（Ｆ）ＨＤＬ−Ｃ。
【図２】性別ごとのＶＴＥとコントロールのＬＤＬ関連脂質パラメーターを示す。太い実線は、平均値を示し、点線はコントロール値の７５パーセンタイルの値を示す。（Ｆ）における高いほうの点線は、１６０ｍｇ／ｄＬを示す。（Ａ）ＬＤＬ粒子；（Ｂ）ＩＤＬ粒子；（Ｃ）大ＬＤＬ粒子；（Ｄ）小ＬＤＬ粒子；（Ｅ）ＡｐｏＢ；（Ｆ）ＬＤＬ−Ｃ；（Ｇ）ＡｐｏＢ／ＡｐｏＡＩ；（Ｈ）ＬＤＬ−Ｃ／ＨＤＬ−Ｃ。
【図３】男性被験者の３つのグループの高比重リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）レベルとＨＤＬ粒子濃度を示す。コントロール（ｎ＝４９）、正常なＣＥＴＰＡｒｇ４５１遺伝子型を有するＶＴＥ患者（ｎ＝４１）、及び２つの比較的まれなＣＥＴＰが連関する変異型であるＰｒｏ３７３及びＧｌｎ４５１を有するＶＴＥ患者（ｎ＝８）。患者の最初の２つのグループでは、正常なＣＥＴＰであるＡｌａ３７３／Ａｒｇ４５１遺伝子型を有する患者は白丸で示しており、まれなＰｒｏ３７３変異型を有しているが正常なＡｒｇ４５１を有している３人の患者（１人のコントロールと２人のＶＴＥ患者）は「Ｘ」で示している。実線は平均レベルを示し、点線はコントロールグループの２５パーセンタイルを示す。
【図４】女性のＶＴＥとコントロールのアポリポタンパク質ＡＩを示す。太い実線は、平均値を示す。
【図５】アポリポタンパク質ＡＩのレベルが１．３ｍｇ／ｍＬ以上（血栓症患者の６７パーセンタイル）である、より低いレベルの患者の再発性静脈血栓塞栓症の確率のカプラン−マイヤー分析による推定を示す。アポリポタンパク質ＡＩの６７パーセンタイルは、男性では１．２２（ｍｇ／ｍＬ）であり、女性では１．３５（ｍｇ／ｍＬ）である。
【図６】再発性静脈血栓塞栓症の有無と、男性と女性での、アポリポタンパク質ＡＩレベル（パネルＡ）、高比重脂質コレステロールレベル（パネルＢ）、及び大高比重リポタンパク質レベル（パネルＣ）を示す。ボックスは２５〜７５パーセンタイルの値を示し、実線は中央値を示し、細線（whiskers）は、５〜９５パーセンタイルを示す。Ａ．アポリポタンパク質ＡＩ（ｎ＝７７２、総コホート）；Ｂ．高比重リポタンパク質コレステロール（ｎ＝３９６、ネスト化されたコホートデータ）；Ｃ．大高比重リポタンパク質粒子（ｎ＝３９６、ネスト化されたコホートデータ）。
【図７】男性のＶＴＥ患者とコントロールのＨＤＬ部分母集団とＨＤＬパラメーターを示す。太い実線は平均値を示し、点線はコントロール値の２５パーセンタイルの値を示す。（Ｆ）における低いほうの点線は、４０ｍｇ／ｄＬを示す。（Ａ）ＨＤＬ粒子；（Ｂ）大ＨＤＬ；（Ｃ）中間ＨＤＬ；（Ｄ）小ＨＤＬ；（Ｅ）ＡｐｏＡＩ；（Ｆ）ＨＤＬ−Ｃ。
【図８】男性のＶＴＥ患者とコントロールのＬＤＬ部分母集団とＬＤＬパラメーターの図を示す。太い実線は平均値を示し点線はコントロール値の７５パーセンタイルの値を示す。（Ｆ）における高いほうの点線は、１６０ｍｇ／ｄＬを示す。（Ａ）ＬＤＬ粒子；（Ｂ）ＩＤＬ；（Ｃ）大ＬＤＬ；（Ｄ）小ＬＤＬ；（Ｅ）ＡｐｏＢ；（Ｆ）ＬＤＬ−Ｃ；（Ｇ）ＡｐｏＢ／ＡｐｏＡＩ比；（Ｈ）ＬＤＬ−Ｃ／ＨＤＬ−Ｃ比。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、米国政府により提供された資金援助によりなされた。米国政府は、本発明に対し一定の権利を保有し、国立衛生研究所認可番号Ｒ３７ＨＬ５２２４６、Ｒ０１ＨＬ２１５４４、及びＮＩＨ−ＧＣＲＣＭ０１００８３３に従うものである。
【０００２】
本発明は、静脈血栓症（venous thrombosis）のリスクのある個人を診断し、治療する方法に関する。本発明は、さらに血漿中の脂質又はリポタンパク質濃度を測定するアッセイに関する。本発明はまた、静脈血栓症のリスクを減少させる脂質低下薬（lipid-lowering drugs）の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
静脈血栓塞栓症（venous thromboembolic disease）（ＶＴＥ）は、遺伝的及び環境的な危険因子（risk factor）の両方が病因の一因として関与する多遺伝子病（polygenic disease）であり（例えば、非特許文献１及び２参照）、発病率及び死亡率の一因となっている。ライデン第５因子を含むプロテインＣ経路における様々な分子機能不全は（例えば、非特許文献３及び４参照）、現在最も一般的に特定できるＶＴＥの遺伝的危険因子を含んでいる（例えば、非特許文献５参照）。異常リポタンパク血症は、動脈血栓症（arterial thrombosis）と関連するものであるが、ＶＴＥと血漿リポタンパク質との関係についてはほとんど知られていない。特に、突発性（spontaneous）ＶＴＥは、臨床的に無症状性動脈硬化血管障害（silent artherosclerotic vascular disease）と関連し（例えば、非特許文献６参照）、スタチンの使用は、ＶＴＥを減少させるので（例えば、非特許文献７〜９参照）、ＶＴＥと異常脂質血症（dyslipidemia）との関係を示唆するものである。実際、ＶＴＥ患者では、血漿レベルにおけるグルコシルセラミドは正常値以下である（例えば、非特許文献１０参照）。グリコシルセラミドと高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）は両方とも、活性化したプロテインＣの抗凝血性補因子を増強するので（例えば、非特許文献１０〜１２参照）、本発明者らは、ＨＤＬはＶＴＥに対する防御に役立つであろうと推測した（例えば、非特許文献１３参照）。
【０００４】
多くの遺伝的因子及び後天性因子が、静脈血栓塞栓症（ＶＴＥ）の危険因子として認定されているが（例えば、非特許文献１４、１５参照）、男性について根拠が明らかになり、（例えば、非特許文献１６、１７参照）、男性の異常リポタンパク血症（例えば、非特許文献１８参照）が有意な危険因子としてさらに明らかになったのはつい最近のことである。驚くべきことに、無症状性動脈硬化血管障害は、何ら因果関係又は機構的関係は示唆されていないが、静脈血栓症と関連していた（例えば、非特許文献１９参照）。反対に、異常リポタンパク血症と動脈血栓症（arterial thrombosis）の関連は長年十分に認定されており、多重機構（multiple mechanisms）や成功した治療法は、この関連性について納得の行く説明を与えている（例えば、非特許文献２０〜２２参照）。
【非特許文献１】Lancet 1999;353:1167-73
【非特許文献２】Lancet 1999;353:479-85
【非特許文献３】Nature 1994;369:64-7
【非特許文献４】Lancet 1994;343:1361-2
【非特許文献５】Hereditary Thrombophilia. In:6th ed. Williams Hematology. New York: McGraw-Hill, 2001: 1697-1714
【非特許文献６】N Engl J Med 2003;348:1435-41
【非特許文献７】Ann Intern Med 2000;132:689-96
【非特許文献８】Circulation 2002;105:2962-7
【非特許文献９】Arch Intern Med 2001;161:1405-10
【非特許文献１０】Blood 2001;97:1907-14
【非特許文献１１】J Biol Chem 2002;277:8861-5
【非特許文献１２】J Clin Invest 1999;103:219-27
【非特許文献１３】Thromb Haemost 2001;86:386 -94
【非特許文献１４】Lancet. 2005; 365: 1163-1174
【非特許文献１５】Lancet. 1999;353:1167-1173
【非特許文献１６】N Engl J Med. 2004; 350:2558-2563
【非特許文献１７】J Thromb Haemost. 2004;2:2152-2155
【非特許文献１８】Circulation.2005;112:893-899
【非特許文献１９】N Engl J Med. 2003;348:1435-1441
【非特許文献２０】Circulation. 1998;97:1837-1847
【非特許文献２１】Circulation. 1999;100:988-998
【非特許文献２２】Circulation. 2000;102:IV94-IV102
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
（発明の概要）
本発明は、静脈血栓症に関連する新規の危険因子の発見に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一態様では、ＨＤＬ−コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）の欠如、又は大ＨＤＬ粒子（ＨＤＬ２）、アポリポタンパク質ＡＩ（ａｐｏＡＩ）、及び／又はアポリポタンパク質Ｂと関連していないアポリポタンパク質ＣIII（ａｐｏＣIII）（ＡｐｏＣIII−Ｌｐ−ｎｏｎＢ）の欠如を判定することにより、個人の静脈血栓症のリスクを判定する方法を提供する。かかる欠如は、静脈血栓症の危険因子の指標となるからである。
【０００７】
本発明の別の態様では、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）−コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）の増加、又は中間比重リポタンパク質（ＩＤＬ）粒子、及び／又は小ＨＤＬ粒子を含むＬＤＬ粒子の増加を判定することにより、個人の静脈血栓症のリスクを判定する方法を提供する。かかる増加は、静脈血栓症の危険因子の指標となるからである。
【０００８】
本発明は、アポリポタンパク質Ｂ（ａｐｏＢ）とアポリポタンパク質ＡＩの比率（the ratio of apolipoprotein B(apoB) to apolipoprotein AI）の増加、及び／又はＬＤＬ−ＣとＨＤＬ−Ｃの比率（ratio of LDL-C to HDL-C）の増加を判定することにより、個人の静脈血栓症のリスクを判定する方法を提供する。かかる増加は、静脈血栓症の危険因子の指標となるからである。
【０００９】
本発明の別の態様では、コレステロールエステル転送タンパク質（ＣＥＴＰ）遺伝子型の判定をすることにより、個人の静脈血栓症のリスクを判定する方法を提供する。かかる遺伝子型は、ＣＥＴＰＴａｑＩ多型のＢ１／Ｂ２一塩基多型（single nucleotide polymorphism）を含み、Ｂ２アレルの頻度が正常よりも低いこと、又はＢ１アレルの頻度が正常よりも高いことが、個人の静脈血栓症の危険因子の指標となる。ＣＥＴＰ遺伝子にＢ１アレルが存在することは、ＣＥＴＰの質量と活性のレベルがより高くなることと関連し、静脈血栓症が、ＣＥＴＰの質量と活性のレベルがより高くなることと関連していることを示唆するものであることはよく知られている。さらに、２つのＣＥＴＰに関連した遺伝子変異（ＣＥＴＰ−linked gene variations）であるＰｒｏ３７３とＧｌｎ４５１が存在することは、ＨＤＬと大ＨＤＬの血漿レベルの減少が起こり、ＣＥＴＰの質量と活性が正常のレベルより高くなることと関連して、静脈血栓症の危険因子の指標となる。
【００１０】
本発明は、生体試料（biological specimen）内の脂質又はリポタンパク質濃度を測定する方法を提供する。
【００１１】
本発明は、脂質低下薬又はＨＤＬを上昇させる薬剤を含む、リポタンパク質レベル又は脂質レベルを好ましく変化させる薬剤を投与し、静脈血栓症の危険因子を阻害し、減少させる方法をさらに提供する。
【００１２】
本発明のこれらの及びその他の態様は、添付の図面と併せて読むべき以下の詳細な説明において説明される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、静脈血栓症に関連する新規の危険因子の発見に基づく。特に本発明は、静脈血栓症が、防御的（protective）大ＨＤＬ粒子のレベルの減少と、男性については有害な小ＨＤＬ粒子とＩＤＬ粒子のレベルの上昇とに関連しているという所見（finding）に基づくものである。遺伝学研究では、静脈血栓症の男性は、男性のＶＴＥ患者に観察される異常リポタンパク血症の一因となると思われるＣＥＴＰ質量と活性の上昇をもたらすＣＥＴＰアレルを過度に（disproportionately）有している。
【００１４】
一つの態様では、本発明は、個人から入手した被検生体試料におけるＨＤＬ−Ｃ、ＨＤＬ粒子、大ＨＤＬ粒子（ＨＤＬ２）、ＣＥＴＰ、アポタンパク質ＡＩ、及び／又はアポリポタンパク質ＣIIIのレベルを測定することと、被検生体試料における脂質又はリポタンパク質のレベルを、正常な生体試料における脂質又はリポタンパク質の正常範囲と比較することとを含む、個人の静脈血栓症のリスクを判定する方法を提供するものである。被検生体試料におけるＨＤＬ−コレステロール、大ＨＤＬ粒子（ＨＤＬ２）、アポリポタンパク質ＡＩ、及び／又はアポリポタンパク質ＣIIIの欠如又はレベルの低下は、個人の静脈血栓症の危険因子の指標となるからである。アポリポタンパク質ＣIIIの測定のための好ましい態様では、アポリポタンパク質Ｂが結合していないアポリポタンパク質ＣIIIの測定が行われる。ＣＥＴＰの好ましい実施態様では、ＣＥＴＰ質量と活性の測定は、リスクの増加を示唆するレベルに上昇した場合に行われる。
【００１５】
脂質又はリポタンパク質のレベルの定量は、当業者に周知の技術により標準試料と比較して測定される。かかる技術としては、例えば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトロスコピー、血漿又は血清脂質アッセイ、ＥＬＩＳＡアッセイ、免疫比濁法（immunoturbidmetric assays）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、キャピラリー電気泳動法、及び免疫検出法の有無を問わない二次元ゲル電気泳動を挙げることができるがこれらに限定されない。生体液は、血液、血漿、又は血清が好ましいが、肺液、唾液、脳脊髄液（cerebrospinal fluid）、リンパ液、尿、精液、唾液などでもよい。当該技術分野では周知であるが、脂質又はリポタンパク質検体（analytes）は、男女で濃度が異なることがある。
【００１６】
一実施態様では、正常範囲は、正常なコントロールの被検者の２５パーセンタイルと７５パーセンタイルの間の値を示し、正常な男性の血清ＨＤＬ−Ｃ、血漿のＨＤＬ粒子及び大ＨＤＬ粒子（ＨＤＬ２）、アポリポタンパク質ＡI、並びに／又はＨＤＬと関連するアポリポタンパク質ＣIIIは、それぞれ、４３〜６１．５ｍｇ／ｄＬ、２３．９〜２８．９μＭ、２．５５〜６．７μＭ，０．９〜１．１７ｍｇ／ｍＬ、及び０．０７７〜０．１０ｍｇ／ｍＬの範囲である。かかるＨＤＬに関連するパラメーターの値が正常の２５パーセンタイル未満であると、正常より低い値であると判断される。別の実施態様では、血清ＨＤＬ−Ｃのレベルが５０ｍｇ／ｄＬ未満であり、血漿ＨＤＬ粒子、大ＨＤＬ粒子（ＨＤＬ２）、及びアポリポタンパク質ＡＩのレベルが規定した正常範囲の３３パーセンタイル未満又は規定した正常範囲の３５パーセンタイル未満であると、脂質のパラメーターが正常より低い値であると判断される。さらに別の実施態様では、アポリポタンパク質Ｂが関連していないアポリポタンパク質ＣIIIが、規定した正常範囲の１５パーセンタイル未満であると低い値であると判断される。さらにまた別の実施態様では、脂質パラメーターのレベルが、血漿ＨＤＬ−Ｃが４５ｍｇ／ｄＬ未満のレベルであり、血漿ＨＤＬ粒子、大ＨＤＬ粒子（ＨＤＬ２）及びアポリポタンパク質ＡＩが規定した正常範囲の２５パーセンタイル未満であると、正常より低いレベルであると判断される。さらには、アポリポタンパク質Ｂが関連していないアポリポタンパク質ＣIIIが規定した正常範囲の１０パーセンタイル未満であると低い値であると考えられている。血漿又は血清のＨＤＬ粒子、大ＨＤＬ粒子（ＨＤＬ２）及びアポリポタンパク質ＡＩが、規定した正常範囲の３５パーセンタイル未満又は規定した正常範囲の３３パーセンタイル未満、並びに／或いはアポリポタンパク質Ｂと関連していない血漿又は血清のアポリポタンパク質ＣIIIが正常範囲の１５パーセンタイル未満であると、欠乏していると判断される。かかる欠乏は、血漿ＨＤＬ粒子、大ＨＤＬ粒子（ＨＤＬ２）、アポリポタンパク質ＡＩ、及び／又はアポリポタンパク質Ｂが関連していないアポリポタンパク質ＣIIIが、男性ではそれぞれ約２５．４μＭ、３．４μＭ、０．９６６ｍｇ／ｍＬ、及び０．０７３ｍｇ／ｍＬかそれより少ない血漿濃度に相当する。さらなる実施態様では、欠乏は、血漿ＨＤＬ粒子、大ＨＤＬ粒子（ＨＤＬ２）、アポリポタンパク質ＡＩが正常平均範囲の２５パーセンパーセンタイル未満であり、及び／又はアポリポタンパク質Ｂが関連していないアポリポタンパク質ＣIIIが正常平均範囲の１０パーセンパーセンタイル未満であることが好ましい。一実施態様では、血漿ＨＤＬ粒子、大ＨＤＬ粒子（ＨＤＬ２）、アポリポタンパク質ＡＩ及びアポリポタンパク質Ｂが関連していないアポリポタンパク質ＣIIIは、男性ではそれぞれ約２３．９μＭ、２．５５μＭ、０．９０ｍｇ／ｍＬ、及び０．０７０ｍｇ／ｍＬかそれより少ない血漿濃度に相当する。
【００１７】
別の実施態様では、本発明は、個人から入手した被検生体試料におけるＬＤＬ−Ｃ又はＬＤＬ粒子のレベルを測定し、ＩＤＬ及び／又は小ＨＤＬ粒子等を含む、しかしこれらに限定されないＬＤＬ−Ｃ又はＬＤＬ粒子のレベルを生体試料におけるＬＤＬ−Ｃ又はＬＤＬ粒子の正常範囲と比較することとを含む、個人の静脈血栓症のリスクを判定する方法を提供するものである。正常な生体試料と比較して生体試料におけるＬＤＬ−Ｃ又はＬＤＬ粒子が正常レベルよりも増加したり高くなったりすることは、個人の静脈血栓症の危険因子の指標となるからである。
【００１８】
一実施態様では、正常な範囲が、正常なコントロールの被検者の２５パーセンタイルと７５パーセンタイルの範囲内の血漿値を示し、男性の血清ＬＤＬ−Ｃ、血漿ＬＤＬ粒子、ＩＤＬ粒子、小ＬＤＬ粒子、及びアポリポタンパク質Ｂの正常範囲は、それぞれ１００〜１４０ｍｇ／ｄＬ、７５０〜１１７５ｎＭ、９〜４８ｎＭ、４４０〜９２７ｎＭ、及び０．６５〜０．９２ｍｇ／ｍＬである。かかるＬＤＬに関連するパラメーターの値が正常の７５パーセンタイルを超えると、静脈血栓症のリスクの増加に関連する正常より高い値であると判断される。別の実施態様では、血清ＬＤＬ−Ｃのレベルが１４０ｍｇ／ｄＬを超えており、血漿ＬＤＬ粒子、ＩＤＬ粒子、小ＨＤＬ粒子及びアポリポタンパク質Ｂのレベルが正常平均範囲の６５パーセンタイルを超えると、脂質のパラメーターが、静脈血栓症のリスクの増加に関連する正常より高い値であると判断される。さらなる態様では、血清ＬＤＬ−Ｃのレベルが１６０ｍｇ／ｄＬを超えており、血漿ＬＤＬ粒子、ＩＤＬ粒子、小ＬＤＬ粒子及びアポリポタンパク質Ｂのレベルが正常範囲の７５パーセンタイルを超えると、脂質のパラメーターが、正常より高い値であると判断される。
【００１９】
別の実施態様では、血栓症のリスクの増加は、脂質若しくはリポタンパク質の血漿又は血清レベルが上昇した被検者の血栓症と関連し、血漿ＬＤＬ粒子、ＩＤＬ粒子、小ＨＤＬ粒子、及び／又はアポリポタンパク質Ｂが正常平均範囲の６５パーセンタイルを超えたと定義される。一実施態様では、男性における血漿及び又は血清濃度が、それぞれ約１１３０ｎＭ、３５ｎＭ、８１０ｎＭ及び０．８７ｍｇ／ｍＬかそれより多いと過度の又は上昇したレベルを意味する。別の実施態様では、ＬＤＬ粒子、ＩＤＬ粒子、小ＨＤＬ粒子及び／又はアポリポタンパク質Ｂの血漿若しくは血清レベルが正常平均範囲の７５パーセンタイルを超えると、静脈血栓症のリスクの増加に関連する脂質又はリポタンパク質レベルの上昇であると定義される。男性ではそれぞれ約１１７０ｎＭ、４８ｎＭ、９２５ｎＭ、及び０．９２ｍｇ／ｍＬかそれより高いと血漿及び／又は血清濃度が上昇したレベルを意味する。
【００２０】
さらに別の実施態様では、本発明は個人から入手した被検生体試料におけるアポリポタンパク質Ｂ及びアポタンパク質ＡＩのレベル、又はＬＤＬ−Ｃ及びＨＤＬ−Ｃを測定することと、アポリポタンパク質Ｂとアポタンパク質ＡＩの比率(the ratio of apolipoprotein B to apolipoprotein AI)、又はＬＤＬ−ＣとＨＤＬ−Ｃの比率（the ratio of LDL-C to HDL-C）を決定することと、生体試料の試験被検者の比率を、正常な比率の範囲と比較することとを含む、個人の静脈血栓症のリスクを判定する方法であって、正常な生体試料と比較して被検生体試料におけるアポリポタンパク質Ｂとアポタンパク質ＡＩの比率、又はＬＤＬ−ＣとＨＤＬ−Ｃの比率が増加し、より高くなることが、個人の静脈血栓症の危険因子の指標となることを特徴とする方法を提供する。一実施例では、生体試料は血漿又は血清である。
【００２１】
血漿若しくは血清のＨＤＬ−Ｃ及びＬＤＬ−Ｃ、又はアポリポタンパク質ＡＩ並びにアポリポタンパク質Ｂは当業者に周知の方法によって測定され、比率の値を計算する。正常範囲は、正常な被検者について測定した比率の値に基づくものである。正常範囲を超える比の値は、血栓症のリスクの増加の指標となる。一実施態様では、アポリポタンパク質Ｂとアポリポタンパク質ＡＩの比率の正常範囲、及びＬＤＬ−ＣとＨＤＬ−Ｃの比率の正常範囲は、それぞれ０．５９〜０．９６及び１．７〜２．９である。別の実施態様では、アポリポタンパク質Ｂとアポリポタンパク質ＡＩの比率の正常範囲、及びＬＤＬ−ＣとＨＤＬ−Ｃの比率の正常範囲は、それぞれ０．７０〜０．８５及び２．０〜３．５である。さらに別の実施態様では、アポリポタンパク質Ｂとアポリポタンパク質ＡＩの比率、又はＬＤＬ−ＣとＨＤＬ−Ｃの比率が、正常範囲の６５パーセンタイルを超えると、正常レベルを超えたと考えられ、血栓症のリスクが増えることの指標となる。アポリポタンパク質Ｂとアポリポタンパク質ＡＩの比率、又はＬＤＬ−ＣとＨＤＬ−Ｃの比率が、正常範囲の６５パーセンタイルを超えた値は、それぞれ約０．８３及び２．６である。さらに別の実施態様では、アポリポタンパク質Ｂとアポリポタンパク質ＡＩの比率、又はＬＤＬ−ＣとＨＤＬ−Ｃの比率が、正常範囲の７５パーセンタイルを超えると、正常を超えたと考えられ、血栓症のリスクが増える指標となる。アポリポタンパク質Ｂとアポリポタンパク質ＡＩの比率、又はＬＤＬ−ＣとＨＤＬ−Ｃの比率が、正常範囲の７５パーセンタイルを超える値は、それぞれ約０．９６及び２．９である。さらにまた別の実施態様では、アポリポタンパク質Ｂとアポリポタンパク質ＡＩの比率、又はＬＤＬ−ＣとＨＤＬ−Ｃの比率が、正常範囲の８５パーセンタイルを超えると、正常を超えたと考えられ、血栓症のリスクが増える指標となる。アポリポタンパク質Ｂとアポリポタンパク質ＡＩの比率、又はＬＤＬ−ＣとＨＤＬ−Ｃの比率が、正常範囲の７５パーセンタイルを超える値は、それぞれ約１．０５及び３．２５である。
【００２２】
ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、電気泳動、ＨＰＬＣ、ＦＡＣＳ、免疫比濁法、キャピラリー電気泳動、及び免疫検出法の有無を問わないが二次元ゲル電気泳動を含む、当業界に知られた様々なプロトコールを、脂質又はリポタンパク質を測定するＮＭＲスペクトロスコピーの代替として用いることができ、血液サンプルにおける脂質又はリポタンパク質のレベルの変化や異常を検出及び／又は診断するための同様の基準を提供する。脂質若しくはリポタンパク質の正常な値若しくは標準的な値は、正常な哺乳類の被検体、好ましくはヒトから採取した血液、血漿、若しくは血清サンプル又は試料のコレクションと、複合体形成に適した条件下で脂質若しくはリポタンパク質への抗体とを用いて決定したパラメーターの正常な範囲若しくは対照範囲を定義することによって決められる。脂質若しくはリポタンパク質の正常な値若しくは標準的な値は、哺乳類の被検体、好ましくはヒトから採取した血液、血清、血漿サンプルのプールを用いることにより規定することもできる。脂質又はリポタンパク質の量は様々な方法で定量化できるが、好ましくは光度計による（photometric）方法が好ましい。免疫学的検定プロトコール（immunoassay protocols）としては、脂質又はリポタンパク質への抗体は適切な条件下で複合体を形成し、光度計、比色分析（colorimetric）、又は比濁法（turbidometic）等の方法により定量化できる。血液サンプル由来の被検体のサンプル、コントロールのサンプル、及び試験サンプルにおける脂質又はリポタンパク質の量は、標準コントロールの値と比較される。コントロール又は標準値と被検体の値との偏差は脂質、又はリポタンパク質の欠如、又は正常レベルを超えていることを診断するパラメーターを規定し、それにより個人の静脈血栓症のリスクを判定する。この判定は、血栓症治療の開始又は継続に関する決定をするために、及び治療上の措置をモニターするために役立つ。当業者において知られているように、いくつかの脂質又はリポタンパク質レベルは、性別によって相違し、性差に基づいて（gender-specific）正常な又は標準的な基準値が必要となることもある。
【００２３】
生体試料において、特に血液において、本明細書に記載されているように脂質、アポリポタンパク質、又はリポタンパク質粒子の正常なレベルよりも高いこと又は低いことは、静脈血栓症の危険因子である。静脈血栓症は、発作（stroke）、外科手術（surgery）、外傷性障害（trauma）、ガン、肢の麻痺（leg paresis）、長期の旅行、炎症性腸疾患、ベーチェット病、骨折、化学療法、糖尿病と関連して発症することがあり、又は第５因子ライデン、プロテインＣ欠乏、プロテインＳ欠乏、抗トロンビン欠乏等の存在のような血栓性素因（thrombophilia）の遺伝的危険因子を有する被検者に発症しうるものである。
【００２４】
本発明の別の実施態様では、例えば、ＣＥＴＰＴａｑＩ多型のＢ１又はＢ２アレルを含むＣＥＴＰ遺伝子型を決定することを含む、個人の静脈血栓症のリスクの判定方法を提供する。被検生体試料において、Ｂ２アレルが存在しないこと又はＢ１アレルが存在することが、個人の静脈血栓症の危険因子の指標となる。Ｂ１又はＢ２アレルとの連鎖不均衡と関連した別のＣＥＴＰ遺伝子の多型を使用してもよい。ＣＥＴＰＴａｑＩＢ多型のＢ１（野生型若しくは優性）又はＢ２（変異型（variant）又は頻度が低い）アレルの決定は、ＣＥＴＰ遺伝子のイントロン１の２７７番目のヌクレオチドに存在するヌクレオチドに依存する（Drayna D et al, Nucl Acids Res 1987;15:4698）。かかる位置にグアニジン「Ｇ」があるとＢ１アレルとなり、アデニン「Ａ」があるとＢ２アレルになる。
【００２５】
好ましい実施態様では、本発明は、ＣＥＴＰに関連した遺伝子変異型（CETP-linked gene variants）である、Ａｌａ３７３からＰｒｏ、及びＡｒｇ４５１からＧｌｎの存在を判定することを含む、個人の静脈血栓症のリスクの判定方法をさらに提供する。被検生体試料に変異型が１つ又は両方が存在することは、個人の静脈血栓症の危険因子の指標となる。
【００２６】
当業者に知られているＣＥＴＰ多型を検出する様々なプロトコールを用いることができる。かかるプロトコールは、例えば血液、口腔細胞（buccal cells）、精液、唾液、細胞生検などを含むがこれらに限定されない、被検者の試料由来のヒト被検者の遺伝物質（ＤＮＡ又はＲＮＡ）の使用と関連する。多型検出は、当業者には周知の技術であり、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、すなわち制限断片長多型（restriction fragment length polymorphisms）（部位特異的突然変異誘発を含む）、アレル特異的ＰＣＲ、又は増幅不応突然変異系（amplification refractory mutation system）（ＡＲＭＳ）、直接配列決定、リアルタイムＰＣＲ、一本鎖高次構造多型（single-stranded conformational polymorphisms）（ＳＳＣＰ）、又はヘテロデュプレックス分析、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（denaturing gradient gel electrophoresis）（ＤＧＧＥ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）クランプ、オリゴヌクレオチド連結、ハイブリダイゼーション若しくは伸長アッセイ、ＴａｑＭａｎ若しくは分子指標、高速液体クロマトグラフなどを挙げることができるがこれらに制限されない。
【００２７】
本明細書に記載されている異常リポタンパク血症パターンに基づき静脈血栓症の個人のリスクを評価できるようになれば、医師が、リスクが増加している個人における静脈血栓症の発症及び／又はリスクを減少するための特別な治療法を見い出し、モニターすることができるようになる。
【００２８】
したがって、本発明の別の実施態様では、個人の静脈血栓症のリスクを減少させるために十分な量の脂質低下剤又は脂質変化剤を投与することを含む、個人の静脈血栓症のリスクを減少させる方法を提供する。ＨＤＬ−Ｃ及び／又は大ＨＤＬ粒子（ＨＤＬ２）を増加させる薬剤を静脈血栓症のリスクを減少させるために用いてもよい。かかるＨＤＬを好ましく増加させる薬剤は、ＣＥＴＰ阻害剤を含む。ＬＤＬ−Ｃ及び／又は小ＬＤＬ粒子のレベルを減少させる薬剤を、被検者の静脈血栓症のリスクを減少させるために用いてもよい。かかる脂質低下剤としては、例えば、スタチンとＣＥＴＰ阻害剤を挙げることができるがこれらに制限されない。静脈血栓症のリスクを減少させるためにも用いることのできる脂質変化剤としては、ニコチン酸、フィブラート、胆汁酸抑制薬や、ＨＤＬ―Ｃ若しくは大ＨＤＬ粒子を増加、及び／又はＬＤＬ−Ｃを減少、及び／又は小ＬＤＬ粒子を減少させることのいずれかができる新しく発見された薬を挙げることができる。
【００２９】
サンプルの脂質又はリポタンパク質レベルを測定するために、静脈血栓症のリスクを阻害するために、或いは危険因子をスクリーニングするために必要とされる、必須物質及び試薬はキットの中に一緒に詰め合わせてもよい。キットの構成要素は１又は２以上の溶液である場合、液体は好ましくは水溶液であり、殺菌した水溶液が特に好ましい。
【００３０】
脂質又はリポタンパク質の検出のために、キットはカラム、ビーズ、樹脂、ゲルマトリックス、フィルター、ＴＬＣプレート、バッファー及び適当な溶媒などのクロマトグラフ分離のための物質を含んでもよい。あるいは検出が免疫学的手段によるときは、キットは、脂質又はアポリポタンパク質に対する抗体、一次抗体に結合する二次抗体、標識（labels）又はシグナルを形成する化合物（結合型若しくは非結合型（conjugated or unconjugated））、及びシグナルを形成し検出するための様々な試薬を含んでいてもよい。
【００３１】
かかるキットの構成要素は、乾燥又は凍結乾燥された形態で提供されてもよい。試薬又は構成要素が乾燥した形態で提供されるときは、再構成は通常適当な溶媒を添加して行われる。溶媒が別の容器に提供されることも予想される。本発明のキットは、サンプルの脂質又はリポタンパク質レベルを測定するためのアッセイを説明する説明書を含んでいてもよい。
【００３２】
本発明のキットは、バイアルを厳重に密封（in close confinement）するための市販の手段を一般に包含する。たとえば、注射、又は望ましいバイアルが入った中空成形プラスティック容器などである。器具には、例えば、インビボで反応を読みとることができ、又はモニターすることができる装置を含んでもよい。
【００３３】
本明細書で引用されている全ての発行された刊行物、書籍、参考資料及び抜粋は、本発明の内容を説明するために、全体として参照により本明細書に援用される。
【００３４】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を説明するものである。当然のことながら、いかなる面でも本発明の範囲を限定しない。本発明者らによって発見された代表的な技術に従った実施例に開示された技術は、本発明の実施において、良好に機能し、したがって、本発明の実施における好ましい形態を行使するとみなすことができることが、当業者によって理解されるものとする。当業者は、本発明の開示に照らして、特定の実施態様に加えることの様々の変更を考慮し、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、同様の結果を得ることができることを理解すべきである。
【実施例１】
【００３５】
各リポタンパク質サブクラスの濃度とアポリポタンパク質（ａｐｏ）ＡＩとＢの（血漿と抗原の）レベルを、プロトン核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）を用いて測定した。リポタンパク質代謝と部分母集団（subpopulation）のレベル、肝性リパーゼ、内皮リパーゼ（endothelial lipase）、並びにコレステロールエステル転送タンパク質（ＣＥＴＰ）に影響を与える３つの鍵遺伝子の一塩基多型（ＳＮＰｓ）を分析した（文献番号１６〜２０参照）。
【００３６】
（方法）
［研究グループ（study group）］
スクリップス静脈血栓症レジストリ（The Scripps Venous Thrombosis Registry）はＶＴＥの危険因子の進行中の症例コントロール研究（case-control study）である。ＶＴＥであると客観的に確認された患者を、スクリップス抗凝血サービス（Scripps Anticoagulation Service）と地域社会から募集した。ＶＴＥの新規の遺伝的危険因子の同定がレジストリの主要な目的であり、遺伝的因子は、５５歳未満の若年被検者のＶＴＥの一因となる可能性が高い。本研究の試験対象患者基準（inclusion criteria）は、５５歳未満の血栓症患者であること、急性血栓症の診断から３ケ月を超えて経過していること、推定余命が少なくとも３年あること、脂質低下剤（lipid lowering medications）を使用していないこと、また転移性ガンではないことが含まれた。年齢と性別が一致する健常コントロール（healthy controls）を、スクリップス一般臨床リサーチセンター（Scripps General Clinical Research Center）（ＧＣＲＣ）採血プログラムを通じて募集した。収集された臨床データには、病歴の詳細及び静脈血栓症の危険因子の存在の有無が含まれた。プロトコールは、スクリップスクリニック（Scripps clinic）の施設内治験審査委員会（Institutional Review Board）により承認され、患者は書面によるインフォームドコンセントに同意した。
【００３７】
臨床的特徴と、特定された危険因子の頻度と血漿脂質データとを表１に示す。１１５人のＶＴＥ患者中５７人（４９．６％）は、外科手術、外傷性障害、長期の固定（major immobilizaion）後９０日以内に発症していず、かつ、ライデン第５因子、プロトロンビン２０２１０Ａ、妊娠、又はエストロゲンの使用に関連しない発症として定義される特発性（idiopathic）ＶＴＥを呈していた。ＶＴＥは、女性（２４．６％）よりも、男性（８２％）でより多く特発性であった（Ｐ＜０．００１）。女性ＶＴＥ患者６５人中、ＶＴＥの発症は、７人（１１％）は妊娠、２５人（３９％）は経口避妊薬の使用、及び７人（１１％）はエストロゲン補充療法と関連していた。コントロールにおける経口避妊薬の使用（３０％）は同程度であったが、コントロールにおけるエストロゲン補充療法（２２％）は、ＶＴＥ患者よりも多かった。ＶＴＥの女性は、ＶＴＥの発症時（episode）にエストロゲンを使用していた。患者の８４％は、血液を提供した時ワルファリンを服用していた。
【００３８】
【表１】
【００３９】
［血液採取、脂質及びアポリポタンパク質］
ＶＴＥの診断後少なくとも３ケ月経過後に、１２時間の絶食後に、ＧＣＲＣで血液を採取した。血清とＥＤＴＡ血漿を調製し、血漿を−７０℃で保存した。ＡｐｏＡＩ及びＡｐｏＢの血漿レベルを免疫比濁法（immunoturbidometric assay）キット（DiaSorin社製、Stillwater, MN）を用いて測定した。標準的な方法を用いた日常の臨床検査から、血清脂質プロファイルデータを得た。
【００４０】
［ＮＭＲリポタンパク質サブクラス分析］
ＥＤＴＡ血漿における１０個のリポタンパク質サブクラスのリポタンパク質粒子の濃度を、LipoScience（Raleigh,NC）にて、プロトン核磁気共鳴スペクトルによって測定した（文献番号２１参照）。粒子の粒径範囲に基づくサブクラスのカテゴリーは、３つのＶＬＤＬ部分母集団（subpopulations）［キロミクロン／大ＶＬＤＬ（large VLDL）；中間ＶＬＤＬ（intermediate VLDL）；及び小ＶＬＤＬ（smallＶＬＤＬ）］と、３つのＬＤＬ部分母集団［ＩＤＬ；大ＬＤＬ（large LDL）；中小ＬＤＬ（medium small LDL）及び極小ＬＤＬ(very small LDL)とも報告されている小ＬＤＬ(small LDL) ］と、３つのＨＤＬ部分母集団［（大ＨＤＬ(large HDL)；中間ＨＤＬ(medium HDL)；及び小ＨＤＬ(small HDL）とを含む。ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、及びＨＤＬの平均の粒子サイズの値もまた計算した。文献に強調されているように（文献番号２１、２２参照）、ＮＭＲ由来のリポタンパク質粒子レベルは、典型的なリポタンパク質粒子に特徴的なＮＭＲシグナルに基づくものであり、実際の脂質測定によるものではない。ＮＭＲデータは粒子数に正比例し、個々人によって異なる場合もある粒子ごとの脂質又はアポリポタンパク質とは非依存的である。
【００４１】
［ＤＮＡ分析］
ゲノムＤＮＡは、Puregene（登録商標）ＤＮＡ精製キット（Gentra Systems社製、Minneapolis, MN）を用いてＥＤＴＡ血液から抽出した。第５因子ライデン及びプロトロンビン２０２１０ＡのＳＮＰｓ、並びに肝性リパーゼ（ＬＩＰＣ―５１４Ｃ／Ｔ）、内皮リパーゼ（ＬＩＰＧＴ１１１Ｉ）、及びＣＥＴＰ（ＴａｑＩＢとＩ４０５Ｖ）のＳＮＰｓを、文献に記載の通りにアッセイした（文献番号１７、２０、及び２３〜２５参照）。
【００４２】
［統計的分析］
グループ間のカテゴリーデータを、分割表解析（contingency-table analysis）（カイ二乗検定（chi-squared test））を用いて比較し、連続データを、対応のないスチューデントのｔ−検定（unpaired student t-test）又はマン−ホイットニーの検定（Mann-Whitney data）を必要に応じて用いて比較した（Prism（登録商標）３．０ソフトウェア、Graph Pad Software社製、San Diego, CA）。ｐ値はすべて両側検定（two-tailed）であった。プロトロンビン危険因子の多因子性の役割を、多変量ロジスティック回帰解析（multivariate logistic regression analysis）を用いて評価し、調整したｐ値又は調整したオッズ比を、ミニタブ１４ソフトウェア（Minitab社製、State College, PA）を用いて計算した。
【００４３】
（結果）
男性のＶＴＥ患者は、男性のコントロールよりも平均ＨＤＬ粒子濃度が有意に低かった（ｐ＜０．００１）（図１Ａ参照）。ＨＤＬリポタンパク質サブクラスでは、大ＨＤＬ粒子濃度が、男性のＶＴＥ患者では男性のコントロールよりも低かった（ｐ＝０．０１）一方、中間と小ＨＤＬ粒子は有意な相違はなかった（それぞれｐ＝０．１３及び０．１３）（図１Ｂ〜Ｄ参照）。ＨＤＬ粒子サイズもまた、男性のＶＴＥ患者では男性のコントロールよりも小さかった（ｐ＝０．０２）（データは示されていない）。
【００４４】
男性のＶＴＥ患者のＬＤＬリポタンパク質粒子濃度は、男性のコントロールよりも有意に高かった（図２Ａ参照、ｐ＝０．０１）。ＬＤＬリポタンパク質サブクラスでは、ＩＤＬ及び小ＬＤＬ粒子の濃度が、男性のＶＴＥ患者でより高かった（それぞれｐ＝０．０１及び０．０２）一方、大ＬＤＬ粒子は相違がなかった（ｐ＝０．３３）（図２Ｂ−Ｄ参照）。小ＨＤＬ粒子の２つのサブグループ、即ち中小粒子と極小粒子は、男性のＶＴＥ患者では上昇した（それぞれｐ＝０．０１及び０．０２、データは示されていない）。ＬＤＬ粒子サイズは、男性のコントロールと比較して男性のＶＴＥ患者ではより小さかった（ｐ＝０．０４）（データは示されていない）。静脈血栓症のよく知られた３つの危険因子である第５因子ライデン、プロトロンビン２０２１０Ａ、及び肥満度指数（ＢＭＩ）の調整後も、男性のＨＤＬ粒子、大ＨＤＬ粒子、ＬＤＬ粒子、及び小ＨＤＬ粒子の濃度は依然として著しく相違しており、調整したｐ値はそれぞれ０．００４、０．０４、０．０１、及び０．０２であった。ＩＤＬ粒子の調整したｐ値の相違はやや減少し、０．０７であった。
【００４５】
男性の被検者のデータとは対照的に、女性のＶＴＥ患者と女性のコントロールとを比較したときには、ＨＤＬ粒子又はＬＤＬ粒子の濃度には有意な相違はみられなかった（図１及び図２参照）。男性においても女性においても、ＶＬＤＬ粒子の合計濃度、ＶＬＤＬサブクラス（大、中間、及び小ＶＬＤＬ粒子）について、又はＶＬＤＬ粒子サイズについて、統計的に有意な相違は観察されなかった（データは示されていない）。
【００４６】
男性のＶＴＥ患者では、男性のコントロールと比較して、ＡｐｏＡＩレベルがより低く（ｐ＝０．０４）（図１Ｅ参照）、ａｐｏＢレベルはより高かった（ｐ＝０．０４）（図２Ｅ参照）。アポリポタンパク質Ｂが関連していないアポリポタンパク質ＣIII（ａｐｏＣIII−Ｌｐ−ｎｏｎＢ）のレベルもまた、ＶＴＥではより低かった（ｐ＝０．０３）（データは示されていない）。男性のＶＴＥ患者のａｐｏＢ対ａｐｏＡＩ比（apoB to apoAI ratio）の平均値は、男性のコントロールよりも有意に高かった（ｐ＝０．００１）（図２Ｇ参照）。ＶＴＥ患者とコントロールとを比較したときに、ａｐｏＢ／ａｐｏＡＩ比の平均値のかかる相違は、ａｐｏＡＩ単独又はａｐｏＢ単独の平均値の相違よりも統計的により大きかった（図２Ｇと、図１Ｅ及び２Ｅ参照）。第５因子ライデン、プロトロンビン２０２１０Ａ、及びＢＭＩの調整後も調整したｐ値は０．００８であった。ａｐｏＡＩ又はａｐｏＢの平均値の相違は、女性のＶＴＥ患者と女性のコントロールとの比較ではみられなかった。
【００４７】
総血清コレステロール及びトリグリセリドのレベルは、どちらの性別でもＶＴＥとコントロールググループの平均値に相違はみられなかった（表１参照）。男性のコントロールと比較して、男性のＶＴＥ患者ではＨＤＬ−Ｃの平均値がより低い（ｐ＝０．０３）一方、ＬＤＬ−Ｃの平均値はより高かった（ｐ＝０．０５）。しかしながら特に、男性のコントロールと比較して、男性のＶＴＥ患者ではＬＤＬ−Ｃ対ＨＤＬ−Ｃの平均比（LDL-C to HDL-C mean ratio）がより顕著に高かった（ｐ＝０．００２）。第５因子ライデン、プロトロンビン２０２１０Ａ、及びＢＭＩの調整後、比平均値の相違について調整したｐ値は、０．００２であった。
【００４８】
男性のＶＴＥ患者における減少したＨＤＬパラメーター（＜２５％）、増加したＬＤＬパラメーター（＞７５％）の四分位数（quartile）に基づいたオッズ比（ＯＲ）を表２に示す。総ＨＤＬ粒子と大ＨＤＬ粒子のレベルの減少は、ＶＴＥのリスクが増加したことと関連し、それぞれＯＲ＝７．２（９５％ＣI：３．０−１８）、及び３．３（９５％ＣI：１．４〜７．９）であった。より小さいＨＤＬの平均粒子サイズは、有意なオッズ比３．１を有していた（９５％ＣI：１．３−７．３）。総ＬＤＬ粒子と、２つのサブフラクションであるＩＤＬと小ＨＤＬ粒子が、高レベル(＞７５パーセンタイル)であることは、ＶＴＥのリスクを増加させる［それぞれＯＲ＝２．９(９５％ＣI：１．２−６．７)、２．６(９５％ＣI：１．１−６．２)、及び３．６(９５％ＣI：１．５−８．５)］。男性のＶＴＥについては、小ＨＤＬ粒子サブクラス、即ち中程度に小さい及び非常に小さいＬＤＬ粒子の２つの部分母集団のそれぞれが、ＯＲが３．３(それぞれ９５％ＣI：１．４−７．９及び１．５−８．５、データは示されていない)であり、小ＨＤＬ粒子のＯＲ＝３．６と同様の値であった（表２参照）。第５因子ライデン、プロトロンビン２０２１０Ａ、及びＢＭＩを調整した後、統計学的に有意な四分位数を基にしたＯＲ値は全て、強い統計的な有意性を維持した（データは示されていない)。
【００４９】
【表２】
【００５０】
男性では、低いレベルのａｐｏＡＩと高いレベルのａｐｏＢは、それぞれＯＲ＝５．５(９５％ＣI：２．３−１３)と２．４(９５％ＣI：１．０−５．７)という、ＶＴＥのリスクの増加に対して有意なＯＲ値を与えるものであり、ＡｐｏＢ／ＡｐｏＡＩの比［ＯＲ＝３．９(９５％ＣI：１．７−９．３)］も同様であった。低いレベルのａｐｏＣIII−Ｌｐ−ｎｏｎＢ(コントロールの１０パーセンタイル未満)は、ＶＴＥのリスクの増加［ＯＲ＝３．１(９５％ＣI：１．０−９．５)、ｐ＝０．０４］と関連していた（データは示されていない)。男性の臨床検査の血清コレステロールデータに基づく、低いＨＤＬ−ＣのＯＲは、統計学的に有意であるが［ＯＲ＝３．３(９５％ＣI：１．４−７．９)］、ＬＤＬ−Ｃの上昇は、上昇してはいるが、統計的な有意性を得ることはなかった［ＯＲ＝２．２(９５％ＣI：０．９４−５．３)］。男性のＶＴＥについては、ＬＤＬ−Ｃ／ＨＤＬ−Ｃの高い比は、ＶＴＥのリスクの増加に対して統計的に有意であった［ＯＲ＝３．３(９５％ＣI：１．４−７．９)］。ＬＤＬ−Ｃレベルが１６０ｍｇ／ｄｌより高い男性では、ＶＴＥのＯＲが４．８(９５％ＣI：１．５−１６)であったが、ＨＤＬ−Ｃが４０ｍｇ／ｄｌより低い場合は、ＶＴＥのＯＲは３．１(９５％ＣI：１．２−８．１)であった（データは示されていない)。
【００５１】
異常リポタンパク血症（dyslipoproteinemia）の一因となる遺伝的影響を特定するために、リポタンパク質部分母集団、及びＨＤＬ−Ｃ、肝性リパーゼ（ＬＩＰＣ−５１４Ｃ／Ｔ）、内皮リパーゼ（ＬＩＰＧＴ１１１Ｉ）、並びにＣＥＴＰ（ＴａｑＩ及びＩ４０５Ｖ）に影響を与える３つの鍵遺伝子の周知のＳＮＰを決定した（表３参照）。カイ二乗検定を用いた、ＳＮＰｓのアレル（allele）頻度は、全てのＶＴＥ患者とコントロールグループの間で相違はなかった。しかしながら、ＣＥＴＰ Ｂ２アレルは、コントロールよりも男性のＶＴＥ患者では、非常にまれなものであって（ｐ＝０．０４）、ＣＥＴＰ Ｂ２アレルの相違は、ＯＲが１．９(９５％ＣI：１．１−３．４)であった。
【００５２】
【表３】
【００５３】
（考察）
動脈血栓症と循環器疾患は、明らかに異常リポタンパク血症と関連するものであるが（文献番号２６〜３１参照）、ＶＴＥでの異常リポタンパク血症は当業者に知られていない。本実施例では、男性のＶＴＥ患者は男性のコントロールよりも、総ＨＤＬ粒子濃度が顕著に低くＬＤＬ粒子レベルが顕著に高い。リポタンパク質サブクラス分析は、これらの相違がより低いレベルの大ＨＤＬ粒子、並びにより高いレベルのＩＤＬ及び小ＨＤＬ粒子を反映することを示す。ＮＭＲに基づくデモンストレーションで男性のＶＴＥ患者の異常リポタンパク血症を確認したところ、ＨＤＬとＬＤＬの主要タンパク質の抗原アッセイデータは、より低いＡｐｏＡＩとより上昇したＡｐｏＢレベルを示した。男性のＶＴＥ患者とコントロールとの間の、ＡｐｏＢ／ＡｐｏＡＩ比（ApoB/ApoAI ratios）の相違は、いずれのアポタンパク質単独の相違よりも統計的により大きいものであった。本実施例では、ＶＴＥ患者とコントロールの間の、より低いＨＤＬパラメーターと上昇したＬＤＬパラメーターの統計的な有意差は、女性と比較した男性にのみに限定されていた。この結果は、特発性ＶＴＥであった女性患者（２５％）の比率が男性（８２％）と比較して非常に少ないことに関連している。特発性ＶＴＥである女性のＶＴＥ患者についての本発明者らの研究は、女性の突発性ＶＴＥのリスクが、本研究における男性のＶＴＥ患者が明らかに呈している異常リポタンパク血症のパターンの１又は複数の要素と関連している可能性を排除できるほど強力ではない。実施例３及び４で示すように、低いレベルのＨＤＬは、原因不明の（unprovoked）ＶＴＥを経験する女性のＶＴＥのリスクの増加と関連している。
【００５４】
本実施例では、四分位数分析に基づいて、低いレベルのＨＤＬ粒子と関連したＶＴＥのＯＲはかなり高く、７．２（９５％ＣI：３．０〜１８）であり、低いレベルの大ＨＤＬ粒子と特に関連していたが、中間及び小ＨＤＬ粒子の相違とは関連していなかった。統計的に有意なＯＲ値は、大ＬＤＬ粒子ではなく、小ＨＤＬ粒子とＩＤＬ粒子の上昇によるＬＤＬ粒子の上昇と関連することが見い出された。
【００５５】
血清コレステロールデータに基づくと、ＨＤＬ−Ｃは、男性ではコントロールよりもＶＴＥ患者で有意に低く、ＬＤＬ−Ｃ／ＨＤＬ−Ｃ比は、コントロールよりもＶＴＥ患者で有意に高かった。ＬＤＬ−Ｃのデータは特に目を見張るものではなかったが、ＬＤＬ−Ｃレベルが１６０ｍｇ／ｄＬよりも高い被検者でのＶＴＥのＯＲは、４．８（９５％ＣI：１．５〜１６）であり、ＬＤＬ−Ｃの上昇はＶＴＥに関連することを示唆していた。ＬＤＬ−Ｃの上昇に関連したＶＴＥの四分位数分析に基づいたＯＲを計算したが、ＯＲは、統計的な有意性を得ることはなかった。
【００５６】
異常リポタンパク血症の所見の一因となる遺伝因子を同定するために、ＨＤＬ代謝を制御する３つの遺伝子で、遺伝的変異（genetic variation）を評価した（文献番号１７、１８、２０、３２、及び３３参照）。ＣＥＴＰのＴａｑＩ多型であるＢ２アレルは、コントロールと比較して男性のＶＴＥ患者では頻度がより低かった（ｐ＝０．０４）。ＣＥＴＰの欠如、又はＣＥＴＰ阻害剤は、ＨＤＬレベルを増加させるため、ＣＥＴＰは、ＨＤＬからＡｐｏＢを含むリポタンパク質への、コレステリルエステル転送に重要な役割を果たしている (文献番号３３、３４参照)。ＴａｑＩＢ２アレルは、ＣＥＴＰ活性の減少と連関している。それによりＨＤＬ粒子サイズとＬＤＬ粒子のサイズが大きくなり(文献番号１６参照)、ＶＴＥでのＢ２の頻度の低さは、低いＨＤＬとより高いＬＤＬレベルを予測するものである。注目すべき点は、ＣＥＴＰのＴａｑＩ遺伝子座（locus）が、ＣＥＴＰ遺伝子の他の多型の不均衡と強く連関し、ＣＥＴＰの活性と濃度に直接に影響を及ぼしうることである（文献番号３５参照）。それゆえ、ＴａｑＩＢ多型は、男性の静脈血栓症のリスクの増加に連関しているＣＥＴＰ遺伝子型のいくつかのＳＮＰマーカー中、一つのみを提供する。ＶＴＥに関連している各々のＣＥＴＰのＳＮＰは、より高いレベルのＣＥＴＰの質量及び活性に連関しており、遺伝的研究が、高レベルのＣＥＴＰの質量及び活性ＶＴＥのリスクに連関していることを示唆することを示すものである。
【００５７】
ＶＴＥの再発は、女性よりも男性に多く起こるが、明確な要因について何ら説明はなかった（文献番号３６参照）。ＶＴＥの再発リスクが増加することと、女性よりも男性のＶＴＥのリスクが本質的により高いことは、男性に特有の危険因子がある、及び／又は女性に特有の保護因子（protective factor）があることを示唆している。一般的に、閉経前の女性は男性よりも、好ましい脂質／リポタンパク質プロファイルを有する。この発見は、なぜ男性はＶＴＥのリスクがより大きいのかということを説明する手助けになる。他所で概説されていることであるが（文献番号１３参照）、ＬＤＬの上昇又はＬＤＬの酸化は、トロンビンの形成を促進できる一方、ＨＤＬは、プロテインＣの経路を増強し、トロンビンの生成を減少させることができる。それゆえ、ａｐｏＢ／ａｐｏＡＩ若しくはＬＤＬ−Ｃ／ＨＤＬ−Ｃ値に反映される、ＬＤＬとＨＤＬの比率（ratio of LDL to HDL）の増加は、プロトロンビンに起因し（prothrombotic）、異常リポタンパク血症がＶＴＥに対してプロトロンビンに起因するものであるメカニズムの実質的な生物学的妥当性が存在する。
【００５８】
本実施例において及び他の実施例において、異常リポタンパク血症が、ＶＴＥに関連するという所見に基づく、明確な治療及び診断に関する暗示がある。以下に新規の療法を挙げることができるがこれらに限定されない。本明細書で記述されている異常リポタンパク血症のパターンを有する被検者はＶＴＥのリスクがより高いので、かかる被検者は、異常リポタンパク血症を好都合に変化させる治療法の恩恵を受けることができる。特発性ＶＴＥとしても知られる、原因不明のＶＴＥを経験した患者にとって、脂質変化剤（lipid altering drugs）による血栓予防（thromboprophylaxis）は、再発性ＶＴＥを防ぐものとなろう。ＶＴＥの危険因子としてかかる異常リポタンパク血症パターンを示す、ＶＴＥを発症したことのない被検者にとって、スタチン療法又はＣＥＴＰ療法は、リスクが増加している状況において、ＶＴＥ発症のリスクを減らすことに効果的であるといえる。臨床試験では、ＣＥＴＰの阻害剤が、大ＬＤＬ粒子レベルを増加させ、ＬＤＬ粒子レベルの減少させること、すなわち、ＶＴＥ患者にみられる異常リポタンパク血症パターンの好ましい逆転（文献番号３４参照）を示すものであり、ＣＥＴＰ阻害療法が、異常リポタンパク血症の患者の再発性ＶＴＥのリスクを減少させるのに役立つことを示唆するものである。ＣＥＴＰ阻害剤は、被検者の以前のＶＴＥの有無にかかわらず、ＨＤＬが欠乏している被検者が、予防法から恩恵を受けてＶＴＥを防止するために役立つであろう。
【００５９】
診断への応用としては、以下を挙げることができるが、これに限定されない。例えばＬＤＬＣ／ＨＤＬ−Ｃ比が、ＶＴＥのリスクを評価するために臨床的に有用であるかもしれない。血清脂質アッセイよりも簡便ではないが、ａｐｏＢ／ａｐｏＡＩを測定するためのＥＬＩＳＡアッセイ若しくは当業者に知られている別の免疫アッセイ法が有用な場合もある。さらに、ＶＴＥ患者のリポタンパク質サブクラスレベルを定量するためのＮＭＲスペクトロスコピー（ＮＭＲspectroscopy）を用いた臨床研究は、ＨＤＬ及びＬＤＬ代謝を制御する遺伝子のＳＮＰｓの研究と同様に確証されている。目的のＳＮＰｓは、ＣＥＴＰのＴａｑ１Ｂ１／Ｂ２多型又は当業者に知られた別の遺伝的に連関した多型を含む。
【００６０】
本発明者らのデータは、多くの別個に測定されたパラメーター、即ちＮＭＲデータ、抗原データ、臨床血清コレステロールデータが、大ＨＤＬ粒子の低レベル及び小ＨＤＬとＩＤＬ粒子のレベルの上昇により特徴づけられる異常リポタンパク血症の特定パターンの定義と完全に合致しているため、強力である。
【００６１】
要約すると、実施例１では、男性のＶＴＥは、保護的な大ＨＤＬ粒子のレベルの減少、及び有害な小ＨＤＬとＩＤＬ粒子のレベルの上昇と関連していた。遺伝学研究では、ＶＴＥの男性は、ＣＥＴＰ活性を上昇させ、男性ＶＴＥ患者で観察される異常リポタンパク血症一因となるＣＥＴＰ遺伝子型を過度に有していることを示している。
【実施例２】
【００６２】
２つの比較的まれなＣＥＴＰ変異型（variant）である、Ａｌａ３７３ＰｒｏとＡｒｇ４５１Ｇｌｎを、ＶＴＥ男性患者のコホートと対応コントロールとで決定した。データによれば、まれであって通常は連関しているＣＥＴＰ変異型であるＰｒｏ３７３とＧｌｎ４５１は、静脈血栓症及び血漿濃度が低いＨＤＬと関連していた。ＣＥＴＰ変異型であるＡｌａ３７３ＰｒｏとＡｒｇ４５１Ｇｌｎは、ＣＥＴＰの質量及び活性のレベルの上昇に関連することが知られており、ＣＥＴＰの質量及び活性の上昇がＶＴＥに連関していることを示している。
【００６３】
（方法）
［研究グループ］
ＶＴＥであると客観的に確認された男性のＶＴＥ患者（ｎ＝４９）を、スクリップス静脈血栓症レジストリで募集した（文献４２参照）。様々な基準の中で、試験対象患者基準は、５５歳未満の血栓症患者であること、急性血栓症の診断から３ケ月を超えて経過していること、脂質低下剤を使用していないこと、また、ガンではないことが含まれた。健常男性コントロール（ｎ＝４９）は、年齢（±２歳）と民族グループ（９２％が非ヒスパニックの白人）とで適合させた。ＶＴＥは、患者の８２％（４０／４９）で特発性と分類された。プロトコールは、スクリップスクリニックの施設内治験審査委員会により承認され、患者は書面によるインフォームドコンセントに同意した。
【００６４】
［血液採取、脂質及びアポリポタンパク質サブクラス分析］
血清とＥＤＴＡ血漿を、ＶＴＥの診断後少なくとも３ケ月経過後に、１２時間の絶食後に患者から採取した血液から調製し、−７０℃で保存した。標準的な方法を用いた日常の臨床検査から、血清脂質プロファイルデータを得た。
【００６５】
ＥＤＴＡ血漿における１０個のリポタンパク質サブクラスのリポタンパク質粒子の濃度を、LipoScience（Raleigh,NC）にて、プロトン核磁気共鳴スペクトル（文献番号５８及び５９参照）によって、文献に記述されているように測定した（文献４２参照）。サブクラスのカテゴリーは、粒子の粒径範囲に基づいており、３つのＶＬＤＬ部分母集団［キロミクロン／大ＶＬＤＬ；中間ＶＬＤＬ；及び小ＶＬＤＬ］と、３つのＬＤＬ部分母集団［ＩＤＬ；大ＬＤＬ；及び小ＨＤＬ］と、３つのＨＤＬ部分母集団［大ＨＤＬ；中間ＨＤＬ；及び小ＨＤＬ］である。ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、及びＨＤＬの平均の粒子サイズも計算した。文献に強調されているように（文献番号５８及び５９参照）、ＮＭＲ由来のリポタンパク質粒子のレベルは、典型的なリポタンパク質粒子に特徴的なＮＭＲシグナルに基づくものであり、実際の脂質測定によるものではない。ＮＭＲデータは粒子数に正比例し、個々人によって異なる場合もある粒子ごとの脂質又はアポリポタンパク質とは非依存的である
【００６６】
［ＤＮＡ分析］
ゲノムＤＮＡは、Puregene（登録商標）ＤＮＡ精製キット（Gentra Systems社製、Minneapolis, MN）を用いてＥＤＴＡ血液から抽出した。ＣＥＴＰ遺伝子の４つのＳＮＰｓ（ＴａｑＩＢ１／Ｂ２、Ａｌａ３７３Ｐｒｏ、Ｉｌｅ４０５Ｖａｌ、及びＡｒｇ４５１Ｇｌｎ）を文献に記載されているように測定した（文献番号４２及び５２参照）。ＶＴＥの遺伝子多型との関連を評価するためにカイ二乗検定を用いた。
【００６７】
（結果と考察）
ＣＥＴＰは、リポタンパク質代謝において重要な役割を果たし、異なるリポタンパク質間の様々な脂質を運搬することによりＨＤＬを潜在的に再構築し（remodel）、ＣＥＴＰ欠如、又はＣＥＴＰ阻害剤は、ＨＤＬレベルを増加させる（文献番号５３〜５５及び６０〜６２参照）。４つのＣＥＴＰ遺伝子の変異（variation）、すなわち比較的一般的なＴａｑＩＢ１とＩｌｅ４０５の変異型、及び比較的まれなＰｒｏ３７３とＧｌｎ４５１の変異型は、ＨＤＬコレステロールレベルをより低くし、より小さい（smaller）ＨＤＬ粒子を生じさせるより高いレベルの血漿ＣＥＴＰと関連していた（文献番号５２〜５７参照）。男性静脈血栓症患者でのＨＤＬ欠乏に関する知見を得るために（文献番号４２参照）、ＣＥＴＰ遺伝子でのＡｌａ３７３ＰｒｏとＡｒｇ４５１Ｇｌｎ変異（variation）を、男性のＶＴＥ患者４９人と対応コントロール４９人において分析した。Ｐｒｏ３７３のヘテロ接合性（heterozygosity）は、ＶＴＥ患者では２０％（４９人中１０人）、コントロールでは２％（４９人中１人）が特定された（ｐ＝０．００４０）。一方、Ｇｌｎ４５１のヘテロ接合性は、ＶＴＥ患者では１６％（４９人中８人）、コントロールでは０％が特定された（ｐ＝０．００３２）。かかる２つのＣＥＴＰ変異型のいずれにおいてもホモ接合体は、研究中の９８人の被検者で観察されなかった。Ｇｌｎ４５１を有する被検者は、全員Ｐｒｏ３７３を有していた。比較として、第５因子ライデン及びプロトロンビン２０２１０Ａは、ＶＴＥ患者の２６％（４９人中１３人）及び１４％（４９人中７人）にそれぞれみいだされた一方、かかる２つの遺伝的変異は、報告のあるとおり（文献番号４２参照）、それぞれコントロールの４％（それぞれの変異型につき４９人中２人）に別個に観察された。
【００６８】
本発明者らのスクリップスのコントロール（表４参照）で調査された４つのＣＥＴＰ変異型のアレル頻度の値は、発表されている集団（population）の数値と類似していた（esembled）。例えば、コーカサス人の集団では、発表されているＰｒｏ３７３とＧｌｎ４５１のアレル頻度の値は、それぞれ約０．０２と０．０１であり、ＴａｑＩＢ１とＩｌｅ４０５アレル頻度の値は、それぞれ０．５７と０．６２である。対照的に、スクリップスのＶＴＥ患者のすべてのアレル頻度の値は、Ｐｒｏ３７３、Ｇｌｎ４５１、ＴａｑＩＢ１、及びＩｌｅ４０５の本発明者らのスクリップスのコントロールの数値を超えていた。計算されたアレル頻度の差を表４に示す。
【００６９】
【表４】
【００７０】
７つの異なるＣＥＴＰ ＳＮＰｓの分析に基づく従前の研究は、それぞれの推定有病率が０．５％を超えている（＞０．５％）、少なくとも１４の異なるＣＥＴＰハプロタイプの存在を推測させるものであった（文献番号５６参照）。かかる１４個のハプロタイプのうち１個のみがＧｌｎ４５１を有しており、１４個中２個のハプロタイプがＰｒｏ３７３を有している。ＴａｑＩＢ１、Ｐｒｏ３７３、Ｉｌｅ４０５、及びＧｌｎ４５１を有しているこれらの２つのハプロタイプがより多くみられ、本発明者らの研究で決定された４つのＣＥＴＰのＳＮＰｓがＶＴＥ患者では、コントロールと比較して過度に観察された。ＶＴＥ患者とコントロールとの間のアレル頻度の相違は、Ｐｒｏ３７３では０．０９であり、Ｇｌｎ４５１では０．０８であった（表４）。本発明者らの研究ではより一般的なＴａｑＩＢ１とＩｌｅ４０５Ｉの変異型についてのＶＴＥ患者とコントロールの間のアレル頻度の相違は、それぞれ０．１４と０．１１であった。それゆえ、アレル頻度のそれぞれの相違はかなり類似しており、０．０８〜０．１４の範囲であり、本発明者らは、Ｐｒｏ３７３とＧｌｎ４５１の両方を呈する本発明者らのＶＴＥ患者の１６％が、一般的なＣＥＴＰ変異型であるＴａｑＩＢ１とＩｌｅ４０５及び比較的まれな変異型であるＰｒｏ３７３とＧｌｎ４５１を含むハプロタイプ（文献番号５６参照）を有すると推定する。
【００７１】
８人のＶＴＥ患者において、血漿リポタンパク質濃度とＰｒｏ３７３とＧｌｎ４５１の存在との関係について分析した。かかる８人のＶＴＥ患者のＨＤＬパラメーターを、コントロール及び正常型のＡｒｇ４５１ＣＥＴＰ遺伝子型を有する別のＶＴＥ患者のＨＤＬパラメーターと比較した。ＨＤＬコレステロールとＨＤＬ粒子の血漿レベルは、Ｐｒｏ３７３とＧｌｎ４５１を有する８人のＶＴＥ患者では、正常型のＡｒｇ４５１ＣＥＴＰ遺伝子型の者よりも低かった（図３参照）。Ｐｒｏ３７３とＧｌｎ４５１遺伝子型の両方を有するＶＴＥ被検者の、ＮＭＲスペクトロスコピーを用いて測定したリポタンパク質の濃度、即ちＶＬＤＬ粒子とＬＤＬ粒子の濃度は、他の被検者と有意な相違はなかった（データは示されていない）。それゆえ、ＶＴＥ患者のＣＥＴＰでＰｒｏ３７３とＧｌｎ４５１が存在することは、静脈血栓症に関連するＨＤＬ欠乏の所見を説明するための重要な手助けとなることを示唆する（文献４２参照）。
【００７２】
以下のことは興味を持って注目すべきである。Ｐｒｏ３７３とＧｌｎ４５１の両方を有する８人すべてのＶＴＥ患者は、コントロールの２５パーセンタイル以下（≦the 25thpercentile）のＨＤＬコレステロールレベルを有する一方、これら８人のＶＴＥの患者のうち８人中６人は、コントロールの２５パーセンタイル以下のＨＤＬ粒子濃度を有する（図３参照）。比較として、正常なＣＥＴＰ遺伝子型の５４％のＶＴＥ患者は、コントロールの２５パーセンタイル未満のＨＤＬコレステロールレベルを有する一方、ＶＴＥ患者の６８％は、コントロールの２５パーセンタイル以下のＨＤＬ粒子濃度を有する（図３参照）ことに注目すべきである。これらのデータは、野生型であるＡｌａ３７３とＡｒｇ４５１のＣＥＴＰ遺伝子型のＶＴＥ患者の相当数が、ＨＤＬコレステロールが低く、ＨＤＬ粒子濃度が低いことを示す（図３参照）。結果として、Ｐｒｏ３７３とＧｌｎ４５１の存在が、多少のＶＴＥ患者のＨＤＬ欠乏の所見を説明することの有効な手助けになるが、静脈血栓症でのＨＤＬ欠乏に有意に一因となる遺伝的及び／又は環境的な別の因子がある。
【００７３】
ＨＤＬは、コレステロール逆転送系（reverse cholesterol transport process）の一因となり、抗炎症性活性、抗酸化活性、及び抗アポトーシス活性に影響を及ぼす（文献番号４４〜４６、５４、５５、及び６２〜６６参照）。ＨＤＬはまた、少なくともインビトロにおいて活性化したプロテインＣの抗凝固作用を増強する（文献番号５０参照）。それゆえ、発病のメカニズムについては実質的な生物学的妥当性があり、ＣＥＴＰ変異型であるＰｒｏ３７３とＧｌｎ４５１により引き起こされるＨＤＬ欠乏はプロトロンビンに起因し、ＶＴＥのリスクの増加の一因となるのかもしれない。
【００７４】
本研究における所見は、非常に強力な統計学的重要性を有する。研究は男性に限定されているが、同様の所見は女性のＶＴＥ患者でも適用されるものであろう。
【００７５】
異常脂質血症（dyslipidemia）及び異常リポタンパク血症は、薬物治療を受け入れることができるものであるから、ＶＴＥのリスクを減少させるための治療と関連するものである。例えば、ＣＥＴＰ阻害剤（文献番号６０〜６２参照）を用いてＨＤＬを上昇させる治療は、ＶＴＥのリスクを減少させるものとなろう。
【００７６】
本実施例の概要として、高比重リポタンパク質欠乏を含む異常リポタンパク血症を呈している５５歳未満の男性での静脈血栓塞栓症は、高比重リポタンパク質の減少とＣＥＴＰの質量と活性の上昇を引き起こすことが知られている２つの比較的まれなコレステリルエステル転送タンパク質遺伝子の変異型であるＡｌａ３７３からＰｒｏとＡｒｇ４５１からＧｌｎと関連している。
【実施例３】
【００７７】
以下の研究グループのＡｐｏＡＩ（ＨＤＬの主要なアポリポタンパク質）の抗原レベルを測定した。
【００７８】
［研究グループ］
５７人のＶＴＥ患者と５４人の対応コントロールからなる白人女性の研究集団。患者が最初に血栓症を発症したのが４５歳未満であり、以前に報告のある研究（文献７７参照）のサブセットであった。すべての被検者に、協会のガイドラインに沿ってインフォームドコンセントを行った。
【００７９】
経口抗凝固薬を服用している患者、抗トロンビン、プロテインＣ、プロテインＳ、プラスミノーゲン、又はヘパリン補因子IIの欠陥などの公知のトロンビン因子の（thrombophilic）欠如の患者、及びＡＰＣ抵抗性（resistance）第５因子ライデン、及びプロトロンビン２０２１０Ａ、又は抗リン脂質抗体、或いはループス性抗凝固因子（lupus anticoagulant）を有する患者は、悪性腫瘍（malignancy）、ネフローゼ症候群、腎臓及び肝臓不全、炎症性疾患若しくは感染症、又は心臓疾患の患者と同様除外された。すべての患者のＶＴＥの診断は、入院して行った客観的方法（下肢のＶＴＥのための静脈造影法（venography）若しくは超音波検査法（ultrasonography））、又は肺塞栓症（pulmonary embolism）のための肺血管造影（pulmonary angiography）若しくは肺潅流喚起スキャン（perfusion-ventlation lung scan））によって確定された。
【００８０】
グループ間のカテゴリーデータを、分割表解析（カイ二乗検定）を用いて比較し、連続データは、対応のないスチューデントのｔ−検定、又はマン−ホイットニーの検定を必要に応じて用いて比較した（Prism（登録商標）３．０ソフトウェア、Graph Pad Software社製、San Diego, CA）。ｐ値はすべて両側検定であった。プロトロンビンの危険因子の多因子性の役割を、多変量ロジスティック回帰解析を用いて評価し、調整したｐ値又は調整したオッズ比を、ミニタブ１４ソフトウェア（Minitab社製、State College, PA）を用いて評価した。
【００８１】
図４に示すように、女性のコントロールと比較して、女性のＶＴＥ患者ではＡｐｏＡＩレベルがより低かった（ｐ＝０．０２６）。
【実施例４】
【００８２】
この実施例では、静脈血栓症の発症を経験したことのある患者の大規模コホートについて追跡調査し、高比重リポタンパク質パラメーターと再発性静脈血栓塞栓症との関係を調査した。
【００８３】
（方法）
［研究グループ］
患者は、静脈血栓塞栓症の患者に対する、進行中のプロスペクティブ多施設コホート研究であるオーストリア再発性静脈血栓塞栓症研究（Austrian Study on Recurrent Venous Thromboembolism）（ＡＵＲＥＣ）の参加者であった。研究の特徴は詳細に報告されている（文献番号３６参照）。１９９２年の７月から２００４年の１１月の間で、静脈血栓塞栓症後少なくとも３ケ月間ビタミンＫ拮抗薬（vitamin K-antagonists）で治療していた１８歳を超える２７６４人の患者が選ばれた。深部静脈血栓症（deep vein thrombosis）は、静脈造影法（venography）又はカラー二重超音波造影術（近位深部静脈血栓症の場合）により診断した。肺塞栓症（Pulmorary embolism）は、肺塞栓症診断の予測試験（Prospective Investigation）の基準による肺換気血流スキャン（ventilation perfusion scan）又は多層コンピュータ断層撮影法（multi-slice computed tomography）により診断した（文献３６参照）。過去の血栓症（３２９人）、外科手術、外傷性障害、若しくは妊娠において二次的に起こる静脈血栓塞栓症（４２３人）、抗トロンビン、プロテインＣ、若しくはプロテインＳの欠如（６６人）、ループス性抗凝固因子（６７人）、ガン（４３４人）、静脈血栓塞栓症以外の理由による長期間の抗血栓剤治療の必要性（４２８人）、或いは臨床試験用の機材が用意できない（１２２人）ことを理由に、１９９２人の患者が除外された。再発リスクに対する長期間の抗凝固剤の効果を調査する介入試験に参加した第８因子レベルの高い２６人の患者も分析から除外した。スタチンを用いた９７人の患者も除外した。
【００８４】
研究は、協会の倫理委員会により承認され、患者は書面によるインフォームドコンセントに同意した。患者はビタミンＫ拮抗薬を中断しているときに研究に参加し、最初の１年は３ケ月の間隔をおいて、その後は６ケ月毎に調査を行った。患者らは、静脈血栓塞栓症の症状について書面で情報を受け取り、症状が出たときには報告する旨指導を受けた。
【００８５】
［研究の終了］
研究は、客観的方法により別々の臨床医及び放射線科医によって、再発性深部静脈血栓症の兆候が確認されたときに終了した。
【００８６】
［血液採取と実験室分析］
静脈血を、プロトロンビン時間の正常化（normalization）後（ビタミンＫ拮抗薬の中断後約３週間）、絶食状態で、１／１０容量の０．１１ｍモル／Ｌクエン酸三ナトリウム内に採取した。２０００ｇで２０分間遠心分離して血漿を調製し、−８０℃で保存した。ゲノムＤＮＡは、標準的な方法で、血液白血球（blood leukocytes）から単離した。抗トロンビン、プロテインＣ、プロテインＳ、第５因子ライデン、プロトロンビンＧ２０２１０Ａ変異体（mutation）、第８因子、及びループス性抗凝固因子を、従前記述されている通り（文献番号３６参照）決定した。アポリポタンパク質ＡＩとアポリポタンパク質Ｂの血漿レベルは、免疫比濁アッセイキット（DiaSorin社製、Stillwater, MN, USA）を用いて測定した（文献番号４２参照）。プロトン核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトロスコピーを用いて、３９６人の患者のＥＤＴＡ血漿での、１０のリポタンパク質サブクラスのレベルとＥＤＴＡ血漿の脂質のレベルを、文献（文献番号２１、２２、及び４２参照）に記述されている通り決定した。ＮＭＲ由来のリポタンパク質粒子のレベルは、典型的なリポタンパク質粒子に特徴的なＮＭＲシグナルに基づくものであり、実際の脂質測定によるものではない。ＮＭＲデータは粒子数に正比例し、個々人によって異なる場合もある粒子ごとの脂質又はアポリポタンパク質とは非依存的である。ＨＤＬコレステロールとＬＤＬコレステロールのレベルをＮＭＲスペクトロスコピーを用いて計算し、かかる方法は、従来の化学的方法により決定された脂質濃度と強い相関を示した（文献番号２２参照）。ＮＭＲスペクトロスコピーを用いて、計算されたＨＤＬコレステロールとＬＤＬコレステロールレベルは、脂質濃度を決定するための従来の化学的方法と強い相関を示した（文献番号２２参照）。ＮＭＲスペクトロスコピー分析のための患者のサンプルは、再発の状況によって選択した。年齢と性別に照らして、再発した患者一人につき、再発していない３人の患者を対応させた。
【００８７】
［統計的分析］
算術演算に、ＳＰＳＳ１２．０ソフトウェアの（SPSSInc. Headquarters, Chicago、Illinois, USA）を用いた。階層（strata）間の均一性（homogeneity）を試験するために、ログランク検定（log-rank）、及び一般化ウィルコクソン検定（generalized Wilcoxon test）を適用した。カテゴリーデータの均一性を、分割表解析（カイ二乗検定により）を用いてチェックし、連続データ（平均±ＳＤとして表す）をマン−ホイットニーのＵ検定によって比較した。再発までの時間（非打切り観察（uncensored observations））又は再発のない患者では追跡調査（follow up）の時間（打切り観察（censored observations）)をサバイバルメソッドを用いて分析した。再発の確率は、KaplanとMeier（文献番号７８参照）により推定した。単変量と多変量のコックス比例ハザードモデル（Cox proportional hazards models）をアポリポタンパク質ＡＩとアポリポタンパク質Ｂのレベルと再発リスクとの間の関連を分析するために用いた。分析は、年齢、性別、肥満度指数、及び第８因子の高さについて調整した（９０パーセンタイル（２２５ＩＵ／ｄｌ）で二分化）。
【００８８】
本発明の実施例では、突発性静脈血栓塞栓症を初めて発症した患者７７２人を研究した。患者の平均年齢は、４７±１６歳であり、７７２人中４４０人の患者が女性であった（５７パーセント）。患者の経過観察は平均４８ケ月であった。１９２人の患者が、ガン（患者１５人）若しくは妊娠（患者３３人）の診断のため、又は、静脈血栓塞栓症以外の理由による抗血栓剤の治療が必要（患者１１２人）のため研究から退き、患者１５人は経過観察ができなくなり、患者１７人が死亡したが、そのうち２人は再発性ＶＴＥが死亡原因であった。患者は、データを打ち切って研究を退くまで経過観察された。
【００８９】
７７２人中１００人の患者（１３％）が静脈血栓塞栓症を再発した。再発箇所は、６１人が深部静脈血栓症、３９人が肺塞栓症であった。多変量解析によると、男性で第８因子が高いことが、再発リスクの主要な決定要因であった（表５参照）。再発リスクは、肥満度指数の増加に伴い増加する。第５因子ライデン又は第２因子Ｇ２０２１０Ａのいずれかのヘテロ接合性のキャリアシップ（heterozygous carriership）は、野生型のキャリアと比較して有意に再発リスクをより高くするものではなかった。
【００９０】
【表５】
【００９１】
再発性静脈血栓塞栓症の患者は、再発していない患者よりも、アポリポタンパク質ＡＩが有意により低いレベルであった（１．１２±０．２２ｍｇ／ｍＬ対１．２３±０．２７ｍｇ／ｍＬ、Ｐ＜０．００１）。アポリポタンパク質ＡＩを、Ｃｏｘ比例ハザードモデル（Cox proportional hazard model）に連続変数として入力したとき、再発の相対リスクは、アポリポタンパク質ＡＩのレベルが０．１ｍｇ／ｍＬ増加するごとに０．８７（９５パーセント信頼区間０．８０〜０．９４）であって、年齢、性別、第８因子の高さ、及び肥満度指数による調整後も変化がなかった［相対リスク０．８８（９５パーセント信頼区間０．８０〜０．９７）］。
【００９２】
アポリポタンパク質ＡＩレベルの増加に伴う再発リスクが減少する潜在的直線性（potential linearity）を検出するため、アポリポタンパク質ＡＩレベルの三分位数（tertiles）に対応する患者のグループにおける再発の相対リスクを計算した（表６参照）。アポリポタンパク質ＡＩレベルが１．０７ｍｇ／ｍＬより低い患者と比較して、アポリポタンパク質ＡＩレベルが１．０７〜１．３ｍｇ／ｍＬである患者では再発の相対リスクはより低く［０．７８（９５パーセント信頼区間０．５０〜１．２２）］、アポリポタンパク質ＡＩレベルが一番高い患者（１．３ｍｇ／ｍＬ以上）では、一番低かった［０．４６（９５パーセント信頼区間０．２７〜０．７７）］。潜在的な交絡変数（confounding variables）の調整は、これらの所見に実質的に影響を与えることはなかった。
【００９３】
【表６】
【００９４】
患者は、アポリポタンパク質ＡＩのレベルが１．３ｍｇ／ｍＬ（血栓患者の６７パーセンタイルに対応する）以上のレベルの者と、１．３ｍｇ／ｍＬよりも低い者の２つに分けられた。表７にこれらの患者の特性を示す。アポリポタンパク質ＡＩのレベルが低い患者はより若く、より高い肥満度指数を有していた。カプラン−マイヤー分析によると、かかる二つのグループでは再発率に明確な相違（divergence）はみられなかった(図５参照)。４年後、アポリポタンパク質ＡＩのレベルが１．３ｍｇ／ｍＬ以上である患者の再発の累積確率は８．８パーセントであった（９５パーセント信頼区間４．６〜１２．９パーセント）が、比較として、アポリポタンパク質ＡＩのレベルが１．３ｍｇ／ｍＬよりも低い患者（Ｐ＝０．００６）は、１５．９パーセントであった。多変量解析では、アポリポタンパク質ＡＩの高レベルであると、再発の相対リスクが０．５１になった（９５パーセント信頼区間０．３２〜０．８３）。年齢、性別、第８因子の高さ、及び肥満度指数により調整後の再発リスクは０．５８であり（９５パーセント信頼区間０．３５〜０．９７）、より低いアポリポタンパク質ＡＩのレベルの者と比較すると再発の相対リスクは、４３パーセント低くなるものと言い換えることができる。
【００９５】
【表７】
【００９６】
アポリポタンパク質ＡＩのレベルは、女性と比較すると男性では有意に低かった（１．１５±０．２３対１．２６±０．２８ｍｇ／ｍＬ、Ｐ＜０．００１）。より低い三分位数でのアポリポタンパク質ＡＩのレベル（１．０７ｍｇ／ｍＬ未満）の男性の比率は、女性の比率と比較するとより高かった［３３２人中１２６人、（３８パーセント）対４４０人中１１７人、（２７パーセント、Ｐ＜０．００１］。反対に、上位三分位数でのアポリポタンパク質ＡＩのレベル（１．３ｍｇ／ｍＬ以上）が、女性ではより多く見られた［４４０人中１８０人、（４１パーセント）対３３２人中８２人、（２５パーセント）、Ｐ＜０．００１）。再発した男性は、アポリポタンパク質ＡＩのレベルが一番低く、再発しなかった女性はレベルが一番高かった（図６、パネルＡ）。当業者には周知であるが、それぞれのＨＤＬパラメーターを基礎とするＨＤＬのレベルは、女性の方が本来男性より高い。
【００９７】
２６１人の男性と１３２人の女性の血漿の高比重リポタンパクコレステロールのレベルを、ＮＭＲスペクトロスコピー分析を用いて測定した。アポリポタンパク質ＡＩと高比重リポタンパクコレステロールのレベルとの正相関がみられた（ｒ２＝０．８７、Ｐ＜０．００１）。高比重リポタンパクコレステロールのレベルは、再発した男性が最も低く、再発しなかった女性が最も高かった（図６、パネルＢ参照）。
【００９８】
被検者の血漿サンプルの大ＨＤＬ粒子濃度を、ＮＭＲスペクトロスコピー分析を用いて測定した。図６Ｃに示すように、再発性静脈血栓症の男性は、再発しない男性よりもかかる粒子のレベルが低く、再発しない女性と比較して、再発した女性についても同じことがいえる。
【実施例５】
【００９９】
本実施例では、ＨＤＬとリポタンパク質パラメーターの特性の差異を決定するために、男性のＶＴＥ被検者と男性の対応コントロールとを比較した。この目的の研究グループは、実施例１に記述したコホートから採用された若い成人男性のサブセットであった。被検者らは、脂質低下剤を服用していなかった。
【０１００】
研究グループ：本実施例では、男性のＶＴＥ患者（ｎ＝４９）と年齢が一致するコントロール（ｎ＝４９）の、脂質とリポタンパク質の特性について分析した。臨床的特徴と、特定された危険因子の頻度と、血漿脂質データとを表８に示す。４９人のＶＴＥ患者中４０人（８２％）は、外科手術、外傷性障害、長期の固定後９０日以内に発症していないと定義される特発性ＶＴＥを呈した。ＶＴＥ患者とコントロールについて、脂質代謝の変化に関連する臨床症状を記録した。ＶＴＥ患者の一人は糖尿病の症状を呈していた。３人のＶＴＥ患者は高血圧を呈し、コントロールは症状を呈さなかった。コントロールと比較して、男性のＶＴＥ患者の従前の喫煙歴は同程度であった（８対６、ｐ＝０．７９）。コントロールと比較して男性のＶＴＥ患者の現在の喫煙率（current smoking）は同程度であった（５対４、ｐ＝１．０）。男性のＶＴＥ患者中、１８人（３７％）が一回以上の血栓症の発症しており、１７人（３５％）が肺塞栓症を確認されていた。患者の８４％は、血液を採取したときワルファリンを服用していた。ＶＴＥ患者とコントロールではガンについては確認がとれなかった。
【０１０１】
【表８】
【０１０２】
血液採取、脂質分析、アポリポタンパク質アッセイ、ＮＭＲ分析、及びＤＮＡ分析の方法は、実施例１に記載されている。
【０１０３】
統計的分析：患者（cases）は、年齢（±２歳）、性別、及び民族性の各要素を１：１の比で、コントロールと適合させた。対応のあるｔ−検定又はウィルコクソン検定（Prizm（登録商標）３．０、Software, GraphPad Software, SanDiego, CA）で、相違０（相違なし）の帰無仮説（null hypothsis）に対して、計算し、検定した。ｐ値はすべて両側検定であった。マクネマーの検定（McNemar's test）は、カテゴリー変数（例えばＶＴＥ陽性家族暦、喫煙状況等）の対応対（matched pair）間の比率の相違を評価するために用いた。
【０１０４】
脂質レベルは、対照分類（reference category）として用いられる最も低い又は最も高い四分位数で、四分位数に分割した後にカテゴリー変数として分析した。条件付ロジスティック回帰（年齢及び性別の適合に相当する）が、オッズ比（ＯＲｓ）を評価するために用いられた。周知の危険因子であるＢＭＩ、ライデン第５因子、及びプロトロンビン２０２１０Ａが、条件付ロジスティック回帰（STATA8.0、Stata Corporation, College Station, TX）を用いて行われた。患者と対応コントロールのリポタンパク質のパラメーターの相違を計算した。個人のモデルは各脂質パラメーターについて、修正したＯＲを計算するために用いられた。各バイオマーカーの四分位数を横断した線形トレンドのＰ値を多重比較の調整なしに計算した。遺伝子多型とＶＴＥとの関連を評価するために、条件付ロジスティック回帰とカイ二乗分析の両方を、２つのグループの間の遺伝子型と対立遺伝子頻度の比較のために用いた。
【０１０５】
男性のＶＴＥ患者は、コントロールよりも有意に低い平均ＨＤＬ粒子濃度を有していた（ｐ＝０．００１）（図７Ａ参照）。ＨＤＬリポタンパク質サブクラスでは、大ＨＤＬリポタンパク質粒子濃度は、患者ではコントロールよりも低かった一方（ｐ＝０．０４７）、中間と小ＨＤＬ粒子は、有意な相違はなかった（図７Ｂ〜Ｄ参照）。ＨＤＬ平均粒子サイズもまた、コントロールよりもＶＴＥ患者では低かった。
【０１０６】
ＶＴＥ患者のＬＤＬリポタンパク質粒子濃度は、コントロールよりも有意に高かった（図８Ａ、ｐ＝０．０２）。ＬＤＬリポタンパク質サブクラスでは、小ＨＤＬ粒子濃度は、患者でより高かった一方、ＩＤＬと大ＬＤＬ粒子レベルは、何ら統計学的相違を示さなかった（図８Ｂ−Ｄ参照）。小ＨＤＬ粒子の２つのサブグループ、すなわち中小ＬＤＬ粒子と極小ＬＤＬ粒子は、ＶＴＥ患者では上昇した（それぞれｐ＝０．０２と０．０３、データは示されていない）。ＬＤＬ平均粒子サイズは、コントロールと比較して患者では小さかった（ｐ＝０．０４）。ＶＬＤＬ粒子の合計濃度又はＶＬＤＬのサブクラス（大、中間及び小ＶＬＤＬ粒子）又は、ＶＬＤＬ粒子サイズについては、患者とコントロールの間には何ら統計学的に有意な相違は観察されなかった。
【０１０７】
アポリポタンパク質ＡＩとＢの免疫学的検定データは、ＮＭＲに基づいたリポタンパク質サブクラスデータと一致した。コントロールと比較して、ＶＴＥ患者ではａｐｏＢレベルに何ら相違はなかったけれども（図８Ｅ参照）、ＡｐｏＡＩレベルは、ＶＴＥ患者ではより低かった（ｐ＝０．０１）（図７Ｅ参照）。ＶＴＥ患者のａｐｏＢ対ａｐｏＡＩの比は、コントロールに比べて有意により高く（ｐ＝０．００２）（図８Ｇ参照）、ａｐｏＢ／ａｐｏＡＩの平均比の相違は、ＡｐｏＡＩ又はＡｐｏＢいずれか単独の平均値の相違よりも統計学的に大きかった。
【０１０８】
コントロールと比較してＶＴＥ患者では、ＨＤＬコレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）がより低かった一方、ＬＤＬコレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）（ｐ＝０．１１）（図７Ｆ及び図８Ｆ参照）。際立って、しかしながら、ＬＤＬ−ＣとＨＤＬ−Ｃの比率平均（LDL-C to HDL-C mean ratio）は、コントロールと比較した場合ＶＴＥ患者では有意により高かった。
【０１０９】
リポタンパク質変数とＶＴＥが関連する四分位数に基づいたオッズ比（ＯＲ）を、四分位数１（lowest ＨＤＬ）と、四分位数２〜４又は四分位数４（一番高いＬＤＬ）とＨＤＬパラメーターの減少又はＬＤＬパラメーターの上昇について四分位数１〜３とを比較することで、計算した。総ＨＤＬ粒子濃度と大ＨＤＬ粒子濃度の低いレベルは、それぞれＯＲ＝６．５（９５％ＣI：２．３−１９）、及び２．８（９５％ＣI：１．２−６．２）であり、ＶＴＥのリスクの増加に有意に関連した。より小さいＨＤＬ平均粒子サイズは、有意なＯＲが３．２（９５％ＣI：１．３−７．９）であった。総ＬＤＬ粒子濃度と２つの亜分画（subfraction）の高いレベル（コントロールの７５％を超えた）は、ＩＤＬと小ＬＤＬ粒子濃度が、それぞれＯＲ＝２．２（９５％ＣI：１．０−４．９）、２．７（９５％ＣI：１．０−６．８）、及び３．１（９５％ＣI：１．３−７．４）であり、ＶＴＥのリスクが有意に関連した。小ＬＤＬ粒子サブクラスの２つの部分母集団、すなわち中小ＬＤＬ粒子及び極小ＬＤＬ粒子が、それぞれ３．０と３．１（９５％ＣI：１．３−７．０と１．３−７．４）のＯＲを与えたが（データは示されていない）、小ＬＤＬ粒子濃度の３．１のＯＲに類似する値であった（表９）。公知のＶＴＥ危険因子、第５因子ライデン、プロトロンビン２０２１０Ａ、及びＢＭＩの調整後、大ＨＤＬ粒子（ｐ＝０．０５６）の濃度を除いては、すべての統計学的に有意な四分位数分析に基づいたＯＲ値は、統計学的に有意であった（表９参照）。ＬＤＬ平均粒子サイズが減少すると、第５因子ライデン、プロトロンビン２０２１０Ａ、及びＢＭＩの調整後、有意なＯＲ、７．６（９５％ＣI：１．５−３９）となった。
【０１１０】
ａｐｏＡＩとａｐｏＢの血漿レベルを標準的な免疫学的検定で測定した。ＶＴＥについては四分位数分析に基づくａｐｏＡＩのレベルが低いと、有意なＯＲであるＯＲ＝６．０（９５％ＣI：２．１−１７）であって、ＡｐｏＢ／ＡｐｏＡＩの比は、ＯＲ＝６．３（９５％ＣI：１．９−２１）であった。ライデン第５因子、プロトロンビン２０２１０Ａ、及びＢＭＩを調整後、これらのＯＲについて有意性が残存した。臨床上の血漿コレステロールデータに基づくと、低いＨＤＬ−ＣのＯＲは統計学的有意性があった[ＯＲ＝３．０（９５％ＣI：１．３−７．１）]一方、上昇したＬＤＬ−Ｃは、統計学的有意性を獲得できなかった[ＯＲ＝１．９（９５％ＣI：０．８４−４．２）]。ライデン第５因子、プロトロンビン２０２１０Ａ、及びＢＭＩを調整後、上昇したＬＤＬ−ＣではＯＲは、統計学的有意性を獲得したが[ＯＲ＝３．９（９５％ＣI：１．１−１４）]、低いＨＤＬ−Ｃでは、統計学的に有意性がなかった[ＯＲ＝３．９（９５％ＣI：０．７８−８．９）]。ＶＴＥのＯＲでの上位四分位数のＬＤＬ−Ｃ／ＨＤＬ−Ｃの比は、調整がなくてもＶＴＥのリスクに統計学的に有意であったが[ＯＲ＝２．７（９５％ＣI：１．１−６．５）]、調整後のＯＲは、５．０であった（９５％ＣI：１．３−２０）（表１０）。１６０ｍｇ／ｄＬより高いＬＤＬ−ＣレベルでのＶＴＥのＯＲは、３．５（９５％ＣI：１．２−１１）であり、４０ｍｇ／ｄＬ未満のＨＤＬ−ＣでのＶＴＥのＯＲは、２．８（９５％ＣI：１．１−７．２）である（データは示されていない。）。
【０１１１】
【表９】
【０１１２】
脂質パラメーターレベルとＶＴＥのリスクとの線形連関（linear association）を評価するために、四分位数の対応対間の分析を行い、傾きのｐ値を計算した（表１０参照）。総ＨＤＬ粒子濃度、大ＨＤＬ粒子濃度、及びより高いレベルの総ＬＤＬ、ＩＤＬ、若しくは小ＨＤＬ粒子濃度がより低いレベルであると、ＶＴＥのリスクの増加（それぞれｐ＝０．００４、０．００９、０．０３、０．０３、及び０．０３）に関連していた。より小さいＨＤＬサイズとより大きいＬＤＬサイズもまた、ＶＴＥのリスクの増加と関連していた（それぞれｐ＝０．０２と０．０１）。
【表１０】
【０１１３】
ＶＴＥ患者の異常リポタンパク血症の一因となる遺伝的影響を特定するために、リポタンパク質部分母集団のスペクトラムと及びＨＤＬ−Ｃレベルに影響を与える３つの鍵遺伝子のＳＮＰｓ、（ＬＩＰＣ−５１４Ｃ／Ｔ）、内皮リパーゼ（ＬＩＰＧＴ１１１Ｉ）及びＣＥＴＰ(ＴａｑＩＢ及びＩ４０５Ｖ)を決定した。ＶＴＥ患者とコントロールの間のアレル頻度の相違を、カイ二乗検定を用いて調べたところ、ＣＥＴＰのＴａｑＩＢ２アレルはコントロールよりもＶＴＥ患者においては有意にまれなものであった（ｐ＝０．０４）（表１１）。研究に用いた肝性リパーゼと内皮リパーゼのＳＮＰｓでは、アレル頻度の相違はみられなかった。ＶＴＥの遺伝子型の関連を評価するために、条件付ロジスティック回帰もまた行った。ＣＥＴＰ ＴａｑＩＢ遺伝子型は、有意にＶＴＥに関連していたが（ｐ＝０．０１７）、この実施例の研究グループでは、ＣＥＴＰ Ｉ４０５Ｖ、ＬＩＰＣ又はＬＩＰＧ多型では関連は見られなかった（それぞれｐ＝０．１５、０．６０及び０．４８）。
【０１１４】
【表１１】
【０１１５】
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【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】性別ごとのＶＴＥとコントロールのＨＤＬ関連脂質パラメーターを示す。太い実線は、平均値を示し、点線はコントロール値の２５パーセンタイルの値を示す。（Ｆ）における低いほうの点線は、４０ｍｇ／ｄＬを示す。（Ａ）ＨＤＬ粒子；（Ｂ）大ＨＤＬ粒子；（Ｃ）中間ＨＤＬ粒子；（Ｄ）小ＨＤＬ粒子；（Ｅ）ＡｐｏＡＩ；（Ｆ）ＨＤＬ−Ｃ。
【図２】性別ごとのＶＴＥとコントロールのＬＤＬ関連脂質パラメーターを示す。太い実線は、平均値を示し、点線はコントロール値の７５パーセンタイルの値を示す。（Ｆ）における高いほうの点線は、１６０ｍｇ／ｄＬを示す。（Ａ）ＬＤＬ粒子；（Ｂ）ＩＤＬ粒子；（Ｃ）大ＬＤＬ粒子；（Ｄ）小ＬＤＬ粒子；（Ｅ）ＡｐｏＢ；（Ｆ）ＬＤＬ−Ｃ；（Ｇ）ＡｐｏＢ／ＡｐｏＡＩ；（Ｈ）ＬＤＬ−Ｃ／ＨＤＬ−Ｃ。
【図３】男性被験者の３つのグループの高比重リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）レベルとＨＤＬ粒子濃度を示す。コントロール（ｎ＝４９）、正常なＣＥＴＰＡｒｇ４５１遺伝子型を有するＶＴＥ患者（ｎ＝４１）、及び２つの比較的まれなＣＥＴＰが連関する変異型であるＰｒｏ３７３及びＧｌｎ４５１を有するＶＴＥ患者（ｎ＝８）。患者の最初の２つのグループでは、正常なＣＥＴＰであるＡｌａ３７３／Ａｒｇ４５１遺伝子型を有する患者は白丸で示しており、まれなＰｒｏ３７３変異型を有しているが正常なＡｒｇ４５１を有している３人の患者（１人のコントロールと２人のＶＴＥ患者）は「Ｘ」で示している。実線は平均レベルを示し、点線はコントロールグループの２５パーセンタイルを示す。
【図４】女性のＶＴＥとコントロールのアポリポタンパク質ＡＩを示す。太い実線は、平均値を示す。
【図５】アポリポタンパク質ＡＩのレベルが１．３ｍｇ／ｍＬ以上（血栓症患者の６７パーセンタイル）である、より低いレベルの患者の再発性静脈血栓塞栓症の確率のカプラン−マイヤー分析による推定を示す。アポリポタンパク質ＡＩの６７パーセンタイルは、男性では１．２２（ｍｇ／ｍＬ）であり、女性では１．３５（ｍｇ／ｍＬ）である。
【図６】再発性静脈血栓塞栓症の有無と、男性と女性での、アポリポタンパク質ＡＩレベル（パネルＡ）、高比重脂質コレステロールレベル（パネルＢ）、及び大高比重リポタンパク質レベル（パネルＣ）を示す。ボックスは２５〜７５パーセンタイルの値を示し、実線は中央値を示し、細線（whiskers）は、５〜９５パーセンタイルを示す。Ａ．アポリポタンパク質ＡＩ（ｎ＝７７２、総コホート）；Ｂ．高比重リポタンパク質コレステロール（ｎ＝３９６、ネスト化されたコホートデータ）；Ｃ．大高比重リポタンパク質粒子（ｎ＝３９６、ネスト化されたコホートデータ）。
【図７】男性のＶＴＥ患者とコントロールのＨＤＬ部分母集団とＨＤＬパラメーターを示す。太い実線は平均値を示し、点線はコントロール値の２５パーセンタイルの値を示す。（Ｆ）における低いほうの点線は、４０ｍｇ／ｄＬを示す。（Ａ）ＨＤＬ粒子；（Ｂ）大ＨＤＬ；（Ｃ）中間ＨＤＬ；（Ｄ）小ＨＤＬ；（Ｅ）ＡｐｏＡＩ；（Ｆ）ＨＤＬ−Ｃ。
【図８】男性のＶＴＥ患者とコントロールのＬＤＬ部分母集団とＬＤＬパラメーターの図を示す。太い実線は平均値を示し点線はコントロール値の７５パーセンタイルの値を示す。（Ｆ）における高いほうの点線は、１６０ｍｇ／ｄＬを示す。（Ａ）ＬＤＬ粒子；（Ｂ）ＩＤＬ；（Ｃ）大ＬＤＬ；（Ｄ）小ＬＤＬ；（Ｅ）ＡｐｏＢ；（Ｆ）ＬＤＬ−Ｃ；（Ｇ）ＡｐｏＢ／ＡｐｏＡＩ比；（Ｈ）ＬＤＬ−Ｃ／ＨＤＬ−Ｃ比。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａ）個人から入手した被検生体試料における脂質又はリポタンパク質のレベルを測定すること、
Ｂ）前記被検生体試料における前記脂質又はリポタンパク質のレベルと正常な生体試料における脂質又はリポタンパク質の正常範囲とを比較すること
を含む、個人の静脈血栓症のリスクを判定する方法であって、
被検生体試料における脂質又はリポタンパク質のレベルがより低いことが、個人の静脈血栓症の危険因子の指標となることを特徴とする方法。
【請求項２】
生体試料が、血液、血漿、血清、脳脊髄液、精液、肺液、リンパ液、唾液、又は尿であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
脂質又はリポタンパク質が、ＨＤＬ−コレステロール、ＨＤＬ粒子、大ＨＤＬ粒子（ＨＤＬ２）、アポリポタンパク質ＡＩ、アポリポタンパク質ＣIII、及びアポリポタンパク質Ｂと関連していないアポリポタンパク質ＣIIIからなる群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
Ａ）個人から入手した被検生体試料における脂質又はリポタンパク質のレベルを測定すること、
Ｂ）前記脂質又はリポタンパク質のレベルと正常の生体試料における脂質又はリポタンパク質の正常範囲とを比較すること、
を含む、個人の静脈血栓症のリスクを判定する方法であって、
正常な生体試料と比較して、被検生体試料における脂質又はリポタンパク質のレベルが正常よりも高いことが、個人の静脈血栓症の危険因子の指標となることを特徴とする方法。
【請求項５】
生体試料が、血液、血漿、血清、脳脊髄液、精液、肺液、唾液、リンパ液、又は尿であることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
脂質又はリポタンパク質が、ＬＤＬコレステロール、アポリポタンパク質Ｂ、及びＬＤＬ粒子からなる群から選択されることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項７】
ＬＤＬ粒子が、ＩＤＬ粒子及び小ＬＤＬ粒子からなる群から選択されることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
Ａ）個人から入手した被検生体試料における少なくとも２つの脂質又はリポタンパク質のレベルを測定すること、
Ｂ）一方の脂質又はリポタンパク質と、他方の脂質又はリポタンパク質との比率を測定すること、及び
Ｃ）前記脂質又はリポタンパク質の比と生体試料における脂質又はリポタンパク質の比率の正常範囲とを比較すること、
を含む、個人の静脈血栓症のリスクを判定する方法であって、
正常な生体試料における脂質又はリポタンパク質の比率と比較して、被検生体試料での脂質又はリポタンパク質の比率が正常よりも高いことが、個人の静脈血栓症の危険因子の指標となることを特徴とする方法。
【請求項９】
生体試料が、血液、血漿、血清、脳脊髄液、精液、肺液、唾液、リンパ液、又は尿であることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
脂質又はリポタンパク質の比率が、アポリポタンパク質Ｂ／アポリポタンパク質ＡＩ比、及びＬＤＬコレステロール／ＨＤＬコレステロール比からなる群から選択されることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１１】
個人のコレステリルエステル転送タンパク質（ＣＥＴＰ）遺伝子型を判定することを含む個人の静脈血栓症のリスクを判定する方法であって、コントロールと比較してＣＥＴＰ遺伝子型の変異が、静脈血栓症の危険因子の指標となることを特徴とする方法。
【請求項１２】
脂質、リポタンパク質、又はリポタンパク質粒子の濃度の測定がＮＭＲスペクトロスコピーを用いて行われることを特徴とする請求項１〜１０いずれかに記載の方法。
【請求項１３】
脂質又はリポタンパク質が、ＬＤＬ、ＬＤＬコレステロール、ＬＤＬ小粒子、ＩＤＬ粒子、ＨＤＬコレステロール、ＨＤＬ粒子、及び大ＨＤＬ粒子からなる群から選択されることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
個人の静脈血栓症のリスクを減少させるために十分な量の脂質変化剤を投与することを含む、個人の静脈血栓症のリスクを減少させる方法。
【請求項１５】
脂質変化剤が、スタチン、ＣＥＴＰ阻害剤、ニコチン酸、フィブラート、胆汁酸抑制薬、並びにＨＤＬコレステロール若しくは大ＨＤＬ粒子を上昇、及び／又はＬＤＬコレステロール若しくは小ＬＤＬ粒子を低下させる薬剤からなる群から選択されることを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
ＣＥＴＰＴａｑＩ多型のＢ１アレルの存在を判定することを含む請求項１１記載の方法であって、被検生体試料における前記遺伝子型の存在が、個人の静脈血栓症の危険因子を示すことを特徴とする方法。
【請求項１７】
Ｐｒｏ３７３及び／又はＧｌｎ４５１をコードするＣＥＴＰ遺伝子変異型の存在を判定することを含む請求項１１記載の方法であって、被検生体試料における一又は両方の遺伝子変異型の存在が、個人の静脈血栓症の危険因子の指標となることを特徴とする方法。
【請求項１８】
Ａ）個人から入手した被検生体試料におけるＣＥＴＰ質量又は活性のレベルを測定すること、
Ｂ）前記被検生体試料における前記ＣＥＴＰ質量又は活性を正常な生体試料におけるＣＥＴＰ質量又は活性の正常範囲と比較すること、
を含む、個人の静脈血栓症のリスクを判定する方法であって、
被検生体試料におけるＣＥＴＰのレベルがより高いことが、個人の静脈血栓症の危険因子の指標となることを特徴とする方法。
【請求項１】
Ａ）個人から入手した被検生体試料における脂質又はリポタンパク質のレベルを測定すること、
Ｂ）前記被検生体試料における前記脂質又はリポタンパク質のレベルと正常な生体試料における脂質又はリポタンパク質の正常範囲とを比較すること
を含む、個人の静脈血栓症のリスクを判定する方法であって、
被検生体試料における脂質又はリポタンパク質のレベルがより低いことが、個人の静脈血栓症の危険因子の指標となることを特徴とする方法。
【請求項２】
生体試料が、血液、血漿、血清、脳脊髄液、精液、肺液、リンパ液、唾液、又は尿であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
脂質又はリポタンパク質が、ＨＤＬ−コレステロール、ＨＤＬ粒子、大ＨＤＬ粒子（ＨＤＬ２）、アポリポタンパク質ＡＩ、アポリポタンパク質ＣIII、及びアポリポタンパク質Ｂと関連していないアポリポタンパク質ＣIIIからなる群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
Ａ）個人から入手した被検生体試料における脂質又はリポタンパク質のレベルを測定すること、
Ｂ）前記脂質又はリポタンパク質のレベルと正常の生体試料における脂質又はリポタンパク質の正常範囲とを比較すること、
を含む、個人の静脈血栓症のリスクを判定する方法であって、
正常な生体試料と比較して、被検生体試料における脂質又はリポタンパク質のレベルが正常よりも高いことが、個人の静脈血栓症の危険因子の指標となることを特徴とする方法。
【請求項５】
生体試料が、血液、血漿、血清、脳脊髄液、精液、肺液、唾液、リンパ液、又は尿であることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
脂質又はリポタンパク質が、ＬＤＬコレステロール、アポリポタンパク質Ｂ、及びＬＤＬ粒子からなる群から選択されることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項７】
ＬＤＬ粒子が、ＩＤＬ粒子及び小ＬＤＬ粒子からなる群から選択されることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
Ａ）個人から入手した被検生体試料における少なくとも２つの脂質又はリポタンパク質のレベルを測定すること、
Ｂ）一方の脂質又はリポタンパク質と、他方の脂質又はリポタンパク質との比率を測定すること、及び
Ｃ）前記脂質又はリポタンパク質の比と生体試料における脂質又はリポタンパク質の比率の正常範囲とを比較すること、
を含む、個人の静脈血栓症のリスクを判定する方法であって、
正常な生体試料における脂質又はリポタンパク質の比率と比較して、被検生体試料での脂質又はリポタンパク質の比率が正常よりも高いことが、個人の静脈血栓症の危険因子の指標となることを特徴とする方法。
【請求項９】
生体試料が、血液、血漿、血清、脳脊髄液、精液、肺液、唾液、リンパ液、又は尿であることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
脂質又はリポタンパク質の比率が、アポリポタンパク質Ｂ／アポリポタンパク質ＡＩ比、及びＬＤＬコレステロール／ＨＤＬコレステロール比からなる群から選択されることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１１】
個人のコレステリルエステル転送タンパク質（ＣＥＴＰ）遺伝子型を判定することを含む個人の静脈血栓症のリスクを判定する方法であって、コントロールと比較してＣＥＴＰ遺伝子型の変異が、静脈血栓症の危険因子の指標となることを特徴とする方法。
【請求項１２】
脂質、リポタンパク質、又はリポタンパク質粒子の濃度の測定がＮＭＲスペクトロスコピーを用いて行われることを特徴とする請求項１〜１０いずれかに記載の方法。
【請求項１３】
脂質又はリポタンパク質が、ＬＤＬ、ＬＤＬコレステロール、ＬＤＬ小粒子、ＩＤＬ粒子、ＨＤＬコレステロール、ＨＤＬ粒子、及び大ＨＤＬ粒子からなる群から選択されることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
個人の静脈血栓症のリスクを減少させるために十分な量の脂質変化剤を投与することを含む、個人の静脈血栓症のリスクを減少させる方法。
【請求項１５】
脂質変化剤が、スタチン、ＣＥＴＰ阻害剤、ニコチン酸、フィブラート、胆汁酸抑制薬、並びにＨＤＬコレステロール若しくは大ＨＤＬ粒子を上昇、及び／又はＬＤＬコレステロール若しくは小ＬＤＬ粒子を低下させる薬剤からなる群から選択されることを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
ＣＥＴＰＴａｑＩ多型のＢ１アレルの存在を判定することを含む請求項１１記載の方法であって、被検生体試料における前記遺伝子型の存在が、個人の静脈血栓症の危険因子を示すことを特徴とする方法。
【請求項１７】
Ｐｒｏ３７３及び／又はＧｌｎ４５１をコードするＣＥＴＰ遺伝子変異型の存在を判定することを含む請求項１１記載の方法であって、被検生体試料における一又は両方の遺伝子変異型の存在が、個人の静脈血栓症の危険因子の指標となることを特徴とする方法。
【請求項１８】
Ａ）個人から入手した被検生体試料におけるＣＥＴＰ質量又は活性のレベルを測定すること、
Ｂ）前記被検生体試料における前記ＣＥＴＰ質量又は活性を正常な生体試料におけるＣＥＴＰ質量又は活性の正常範囲と比較すること、
を含む、個人の静脈血栓症のリスクを判定する方法であって、
被検生体試料におけるＣＥＴＰのレベルがより高いことが、個人の静脈血栓症の危険因子の指標となることを特徴とする方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２００８−５３０５３０（Ｐ２００８−５３０５３０Ａ）
【公表日】平成２０年８月７日（２００８．８．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５５４２４５（Ｐ２００７−５５４２４５）
【出願日】平成１８年２月３日（２００６．２．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００３８６２
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０８４１４２
【国際公開日】平成１８年８月１０日（２００６．８．１０）
【出願人】（５９３０５２７８５）ザ スクリップス リサーチ インスティテュート (91)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年８月７日（２００８．８．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年２月３日（２００６．２．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００３８６２
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０８４１４２
【国際公開日】平成１８年８月１０日（２００６．８．１０）
【出願人】（５９３０５２７８５）ザ スクリップス リサーチ インスティテュート (91)
【Ｆターム（参考）】
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