高品質核酸のセルフリー生合成及びその使用
本発明は，改良されたセルフリーの応用方法であって，治療に用いることができる品質の大量の核酸を生成する方法及び合成された核酸を研究，治療及びその他の用途に使用する方法を提供する。これらの方法は，様々な最先端の手順を組み合わせ，治療目的の核酸を手ごろな価格で合成できるように用途を調整している。本発明は，インビトロでローリングサークル型増幅，高いフィデリティーを持つポリメラーゼ，高親和性のプライマー，及び特定の用途のために設計された合理化された鋳型を組み合わせる。発現を目的とする場合，真核生物のプロモーター，目的とする遺伝子のコード配列，及び真核生物の終止配列を含む発現カセットが鋳型に含まれている。増幅に続き，その使用目的に応じてコンカテマーが処理され，この処理には，短い発現カセット（ＳＥＣｓ）を生成するための制限酵素による切断，ＳＥＣを環状化（ＣＮＡｓ）するライゲーション工程，及び／又はｓＣＮＡｓを生成するスーパーコイル化工程が含まれる。最終産物に含まれる細菌エンドトキシンはほとんど検出不能なレベルである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は高品質核酸の合成方法，及びその使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子導入，遺伝子治療及びＤＮＡワクチン接種におけるＤＮＡに基づく治療法の開発により，純度，有効性，効能及び安全性に関して厳密な品質基準を満たすＤＮＡの大規模な生産に対する需要が高まってきた。標的組織における遺伝子発現の効能及び持続期間は比較的低いため，通常多くのＤＮＡがそのような用途に必要とされていた。
【０００３】
現在の技術状態は，バクテリア培養液中のプラスミドの増殖及び高額な精製技術に依存して，治療に利用可能な品質の核酸を生成している。バクテリア及び他の細胞源からの典型的なプラスミド精製手順には，フェノール，臭化エチジウム及び塩化セシウムを含む有機化合物，変異原物質及び毒性化合物及びリゾチーム，プロテイナーゼＫ，リボヌクレアーゼＡ（ＲＮａｓｅＡ）等の酵素を用いる方法がある。これら全てはＤＮＡに基づく治療法において夾雑物として投与された場合，健康被害をもたらす可能性を含んでいる。このような手順にはまた，意図しない汚染性トランスポゾン及びその他の外来性エピソーマルＤＮＡがプラスミドに混入する危険性を孕んでいる（Ｈａａｐａ， Ｓ．，Ｎｕｃ．Ａｃ．Ｒｅｓ．，２７（１３）： ２７７７−８４， １９９９）。また宿主細胞核酸，その他の細胞タンパク及びエンドトキシンの残留物が混入する可能性もある。このような不純物はＤＮＡ取り込みの効率を低減させるだけでなく，量依存的な毒性につながる。これらの不純物を除去するため，一般に受け入れられている精製方法は，アニオン交換，アフィニティー，及び分子サイズ排除等の複数のクロマトグラフィー手順を利用している。これらの手順は費用がかかるものである。
【０００４】
米国特許第５，５６１，０６４号（‘０６４）は，薬理学的に許容されるレベルのプラスミドをバクテリア培養液から得るための試みを示した。この特許はバクテリア細胞を溶解するためにポリエチレングリコールを用い，一連のクロマトグラフィーによる分離を利用して有毒な化学物質を付加することなく遺伝子治療に適用可能な，より純度の高いＤＮＡを生産する方法について述べたものである。この方法は精製時に付加的な要素は加えられないが，有毒となる可能性がある細胞環境中においてのプラスミド生産に依存したものである。
【０００５】
対照的に，セルフリー核酸増幅は，合理化された生産と単純化した精製法により，顕著な費用削減を提供することができ，バクテリアによってプラスミドを合成した場合に伴う不純物を除去することができる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のようなインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）増幅は，１９８０年中盤から研究にうまく利用されている。ＰＣＲは迅速かつコストが低い。しかしながら，ＰＣＲは急速な温度サイクリングに依存しており，大規模の増幅には実用的ではない。
【０００６】
インビトロの定温増幅技術が知られているが，主として核酸複製の機構を研究するために利用されてきた。１９８４年に，ＢｌａｎｃｏとＳａｌａｓは，ファージ由来の（ｐｈａｇｅ）Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼを単離した。それは，高度に逐次前進性の（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｅ）鎖置換ポリメラーゼである。Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼは，Ｐｈｉ２９ゲノムの完全長である７０キロベース超の長さのＤＮＡ鎖を確実に複製することができる（Ｂｌａｎｃｏ，Ｌ． ａｎｄ Ｓａｌａｓ，Ｍ．，ＰＮＡＳ ８１（１７）：５３２５−５３２９，１９８４）。効率的なインビトロでの定温ＤＮＡ増幅のためには，Ｐｈｉ２９ポリメラーゼは端末タンパク質として二本鎖ＤＮＡ結合タンパク及び一本鎖ＤＮＡ結合タンパク（ＳＳＢ）を必要とする（Ｂｌａｎｃｏ， Ｌ． ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９１：１２１９８−２０２， １９９４）。
【０００７】
米国特許第５，００１，０５０号（‘０５０）は，ＤＮＡ塩基配列決定，ＤＮＡ増幅，及び１０キロベースを超えるＤＮＡ合成におけるＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼの使用を主張するものである。米国特許第５，１９８，５４３号（‘５４３）及び第５，５７６，２０４号（‘２０４）はシークエンス反応改善のためのエキソヌクレアーゼ欠損型Ｐｈｉ２９ポリメラーゼを含め，この酵素の改良型を請求している。しかしながら，これら改良されたポリメラーゼはフィデリティ（ｆｉｄｅｌｉｔｙ）が低く，シークエンス反応のみに有効であった。
【０００８】
本質的に，プラスミド及び数種のウイルスＤＮＡを含め，環状ＤＮＡ分子の複製は頻繁にローリングサイクル増幅（ＲＣＡ）によって起きるが，ここにおいて環状ＤＮＡ鋳型は直列反復の長いコンカテマー（ｃｏｎｃａｔａｍｅｒ）へと複製される。コンカテマーは次に切断されタンパク膜中へとパッケージされる（Ｄｅａｎ， Ｆ．Ｂ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． １１： １０９５−９９， ２００１）。ＲＣＡを用いて，複数の研究室がＤＮＡ塩基配列決定，クローニング，ライブラリ構築，及びスクリーニングを含め様々な目的に用いられるＤＮＡ増幅法を開発した（Ｉｎｏｕｅ−Ｎａｇａｔａ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １１６： ２０９−２１１，２００３）。
【０００９】
米国特許第５，６５４，０３３号，第６，２１０，８８４号，第６，３１６，２２９号，第６，３４４，３２９号，及び第６，７９７，４７４号（それぞれ‘０３３，‘８８４，‘２２９，‘３２９，及び‘４７４）はＲＣＡ法に関するが，特定のサンプルにおける標的メッセージのコピー数の同定など，研究用途のみに限定されていた。この方法は始めにＤＮＡサンプルを環状鋳型に変換し，制御された（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ）サイクル増幅によってもともとのメッセージの相対的な量を同定するものである。その他の応用例は，このような定量的増幅と標的遺伝子の突然変異遺伝子（ｍｕｔａｎｔ ａｌｌｅｌｅ）の検出を組み合わせたものである。
【００１０】
米国特許第６，２８０，９４９号及び第６，１２４，１２０号は，ランダムプライマーを用いた全ゲノム増幅におけるＲＣＡの応用を教示している。いくつかの実施例では，ゲノムの特異的領域を増幅させるため，ランダムプライマーと特異的プライマーを組み合わせて用いている。
【００１１】
米国特許第６，３２９，１５０号は新規に合成されたＤＮＡ上で入れ子になるよう設計されたプライマーを用い，既に増幅された産物の二次的な合成を起こす改良ＲＣＡ法を教示している。この方法によって，増幅は幾何学級数的に起こり，ＰＣＲに代わって多数の標的を同時に検出する定温の代替法が提供される。米国特許第６，２５５，０８２号は長い末端リピートをこれらの入れ子状の（ｎｅｓｔｅｄ）増幅を容易にするため利用する方法を教示している。これらの特許はサンプルにおける特定の配列の存在を速やかに同定するためＲＣＡを改良している。
【００１２】
米国特許第６，６４２，０３４号は複数のプライマー及び鎖置換ＤＮＡポリメラーゼを用いた増幅の一般的方法を教示している。この方法は標的配列の同定，全ゲノムの増幅，標的配列あるいは変異の検出，アドレスタグの合成及び検出，及びオリゴヌクレオチドの合成に利用される。
【００１３】
その他のＲＣＡの応用には，配列決定，クローニング，マッピング，遺伝子型決定，プローブ作製，及び診断スクリーニングがある。米国特許出願公開第２００３／０２０７２６７号では３’，５’−エキソヌクレアーゼ活性を持つ異なるＤＮＡポリメラーゼにより，複数のプライマーを用いて標的サークルを同時に増幅し，増幅効率を改善する例が挙げられている。
【００１４】
現在まで，その他のポリメラーゼの利用も時折取り上げられたものの，ほとんどのＲＣＡ技術はＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼの利用に重点を置いていた。これはＰｈｉ２９ポリメラーゼの生産効率が高いために核酸の長いコンカテマーを短時間に合成することができ，また鎖置換活性があるため接触したあらゆる二次プライマーを置換しつつ，連続的に新規核酸配列合成できることが理由に挙げられる。加えて，大量の高いフィデリティーをもつ核酸を温度サイクリングなしに比較的短期間で生産できる。Ｐｈｉ２９ポリメラーゼはエラー比率が４×１０−６と非常に低い。（Ｅｓｔｅｂａｎ， Ｊ．Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，２６８（４）：２７１９−２７２６，１９９３）。
【００１５】
ほとんどのＲＣＡ技術はＰｈｉ２９ポリメラーゼを使用しているにも関わらず，米国特許第６，５７６，４４８号及び第６，２３５，５０２号はＲＣＡ法におけるバクテリアＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩＩ）の使用を開示している。Ｐｏｌ ＩＩＩはＤＮＡ合成効率を上昇させる（一秒あたり約７００−８００ヌクレオチド）クランプ様の活性を持つことが報告されており，ヘリカーゼあるいは安定化タンパク質を付加することで最適化可能である。バクテリアＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｐｏｌ Ｉ）もまた１００ｂｐ以下の小さい鋳型増幅のＲＣＡ法において利用されている（Ｆｉｒｅ ａｎｄ Ｘｕ， ＰＮＡＳ ９２：４６４１−４５，１９９５）。Ｐｏｌ Ｉは主に一本鎖鋳型を用い，極端に短い二本鎖鋳型にしばしば伴う立体障害なく，小さい環状鋳型がすぐに形成される。米国特許第５，６１４，３６５号はＴ７ＤＮＡポリメラーゼの配列を含み，効率が５００−倍まで上昇する改良Ｐｏｌ Ｉを開示している。このポリメラーゼはデオキシヌクレオチド及びダイデオキシヌクレオチドを区別する能力が減少しており，シークエンシング反応への利用に好適である。
【００１６】
一般的に，ＲＣＡ反応は一本鎖あるいは二本鎖核酸鋳型を用いることができる。Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼは一本鎖あるいは二本鎖鋳型を用いることができるが，Ｐｏｌ Ｉが利用できるのは一本鎖鋳型のみである。加えて，Ｐｈｉ２９ポリメラーゼはＲＮＡあるいはＤＮＡ鋳型を用いることができる。それゆえ，Ｐｈｉ２９ポリメラーゼはＲＣＡ法及び他の増幅法においてより適用範囲が広い。
【００１７】
米国特許第６，３６８，８０２号，第６，０９６，８８０号及び第５，７１４，３２０号はＲＣＡ法で適切なポリメラーゼ及び小さい一本鎖環状ＤＮＡ鋳型を用いＲＮＡあるいはＤＮＡオリゴヌクレオチド（２８−７４ヌクレオチド長）を合成する例を挙げている。このように合成されたＤＮＡオリゴヌクレオチドは細胞内における発現に必要とされる遺伝的情報を欠いている。
【００１８】
Ｍｏｒｅｎｏ Ｓらは最小限の，免疫原生として同定可能な遺伝子発現ベクター（ＭＩＤＧＥ）をＤＮＡワクチン生産のために開発した（Ｖａｃｃｉｎｅ，２２： １７０９−１７１６， ２００４）。これらのベクターは真核生物の遺伝子発現及び免疫反応の誘導に最小限の配列のみを含む。加えて，直鎖上の発現カセット末端は，その寿命及び発現効率を向上させるために，ヘアピン状に改変することが可能である。この方法は大きな進歩を意味するものの，バクテリア培養液からプラスミドを精製した後不必要なバクテリア配列の除去を行わなければならず，手間のかかる工程を含むものである。ＭＩＤＧＥ工程は前駆体としてやはりバクテリア由来のプラスミドに依存している。
【００１９】
同様に，Ｃｈｅｎ， Ｚ．Ｙ．らはバクテリア配列をベクターから除去するミニサークルを開発した。彼らはシスに結合されたバクテリア配列が真核生物の発現を抑制できることを示した（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １６： １２６−１３１， ２００５）。彼らはまた，バクテリアの遺伝物質を全く連結していない直鎖状発現カセットは，バクテリアプラスミド骨格に連結された発現カセットを有する共有結合により閉鎖された環状プラスミドに比べ１０−１００倍高効率で発現することを示した。バクテリアフリーの発現カセットの発現はトランスフェクションの後９０日間まで継続する。
【００２０】
このグループはこの工程を米国特許出願公開第２００４−０２１４３２９号に記述しており，環状発現カセット，それらから合成される治療用組成物，及び標的細胞に環状発現カセットを導入する方法を教示している。加えて，この応用は発現カセットに隣接するａｔｔＢ及びａｔｔＰ配列を利用し組み換えによるバクテリア配列の除去を容易にしている。通常条件におけるバクテリア培養に続いて，リコンビナーゼをコードする誘導カセットを有するバクテリアにおいては，リコンビナーゼの合成が誘導され，充分量のプラスミドが合成された後ａｔｔＢ及びａｔｔＰ部位における組み換えが誘導される。細胞内組み換えは二つの独立したミニサークルを作り出す。一方は発現カセットを有し，他方はバクテリアの遺伝物質を有する。バクテリア遺伝子の夾雑を最小限にするために合理化された方法ではあるが，この方法はやはりバクテリア培養中でのプラスミド合成に依存している。
【００２１】
ＤＮＡを用いた治療への適用は安全性及び効果基準を厳密に順守することが必要である（Ｐｒａｚｅｒｅｓ， Ｄ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １７（４）：１６９−１７３， １９９９）。大規模設備で生成されたプラスミドＤＮＡは夾雑なゲノムＤＮＡ（＜１０ｎｇ／投与量），宿主タンパク質（＜１０ｎｇ／投与量），ＲＮＡ（０．８％アガロースゲルで検出されない）及びエンドトキシン（＜１ユニット／ｋｇ体重，あるいは＜０．１ＥＵ／μｇプラスミド）が含まれていないことが必要である。加えて，プラスミドは無菌状態であるべきで，より効率よく発現されるスーパーコイル状であることが望ましい。その他最終調製物から除去される必要がある夾雑物には，臭化エチジウム，クロロホルム，フェノール，リゾチーム，プロテイナーゼＫ，ＲＮａｓｅＡ等の精製試薬及び精製カラムから浸出する可能性があるアニオン交換体由来の第４級アミン等の夾雑物が含まれる。
【００２２】
これらの純度基準は主に大規模でしばしば高額な精製技術をバクテリアに産生されたプラスミドに利用することで対応されてきた。先述の通り，一般的に受け入れられている精製方法は主に複数のクロマトグラフィー法を用い，アニオン交換，アフィニティー，及びサイズ除去クロマトグラフィー精製の段階の組合わせを含む。治療に用いることができる品質のプラスミドをバクテリアから合成するために必要な精製方法には，特別な装置，高価なレジン，大規模な設備と長い時間が必要であるという点は重要である。現在非ＧＭＰ（研究品質）のプラスミドＤＮＡにかかる費用は最終産物１グラムあたり３０，０００−１５０，０００ドルであり，ＧＭＰ品質のＤＮＡにかかる費用はおおよそ２−３倍高い。つまり，バクテリアにより合成されたプラスミドＤＮＡから治療に用いるＤＮＡを生合成することは非常にコストが高くなりうる。
【００２３】
セルフリー増幅の利用に焦点を当てた方法では，多数のバクテリア夾雑物への曝露を回避することが可能であることから，著しいコスト及び時間の削減を提供し得る。セルフリー系に存在するものはすべて明確に区別することができる。高品質の試薬及び酵素のみを用いれば，この系には微量の夾雑物しか存在しない。このように，最終精製は透析，限外ろ過及び／又はゲルろ過，等の単純な方法を用いることが可能であり，精製に必要な反応混合物は少量でよい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
現在まで，ＲＣＡ系は核酸のセルフリー合成を遺伝治療用，ＤＮＡワクチンあるいはその他の治療への応用に適合させていなかった。対照的に，ほとんどの文献はＲＣＡ系の有用性が，配列決定，ゲノム増幅，ゲノム解析，標識，クローニング，ＰＣＲ型の応用，ライブラリの構築及びその他の解析への応用を含め，厳密に診断あるいは研究目的に限定されると示唆している。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本発明の一つの側面はインビトロのＲＣＡ系を最適化し，合理化された発現カセット，高度に特異的あるいは無作為のプライマー，高いフィデリティを持つポリメラーゼ，及び最小限の緩衝系を用い核酸大量調整（例えば＞１ｍｇ）を行うセルフリー系を構築することに関する。この系では核酸の大量合成を，小さい容量で，短期間に最小限でかつ費用のかからない精製方法で行うことが可能である。このように，この系は，治療に利用できる高品質な核酸を，あらゆる基礎解析あるいは研究目的のため，さらに重要なことには治療上の使用のために合成可能である。
【００２６】
本発明は治療，診療，診断，及び研究に用いられる高品質の核酸を安価に大量合成する目的でいくつかの技術を組み合わせている。本発明の方法は同程度の容量のバクテリア培養液で合成されるものと比較して２５０−３００倍の核酸を合成することができる。本発明において，使用された試薬に最小限含まれるものを除いて，エンドトキシンの混入源は存在しない。さらなる有利な点として，研究用の小さいフラスコで発酵様の大量合成が可能である点，必要な試薬が最小限の数である点，比較的短い期間で大量合成が行える点，及び合理化された精製方法が含まれる。併せて，これらの利点は治療に利用する高品質核酸の大量合成を安価に行う方法となる。
【００２７】
本発明の一つの実施形態においては，プラスミド選択及び複製にバクテリアにおいて必要とされる典型的な遺伝的配列を欠損する改変されたプラスミドが鋳型として用いられる。あらゆる環状核酸の鋳型を利用することが可能である。本発明の実施態様にしたがって，目的とする遺伝子近傍に宿主での発現及び発現産物の生成に必要な遺伝子要素が存在する環状発現カセットが鋳型となりうる。
【００２８】
通常のプラスミドも本発明の方法を用いて複製可能であるが，余分な遺伝子配列を含まない合理化された鋳型は様々な利益を与える。目的とする配列の発現を抑制する可能性がある外来配列を除去する。より小さな構成（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）はよりコンパクトであり，標的細胞により効率よく組み込まれ，トランスフェクション効率がより高くなる。また，より少ない材料でより大量の発現カセットを生成できること，最終産物のフィデリティが統計的に向上すること，及び大規模な精製を行う必要が無いことから，より費用効率が高いといえる。
【００２９】
無作為プライマーあるいは配列特異的プライマーを用いることが可能であるが，大規模増幅においては配列特異的プライマーがより効率的で経済的である。プライマーの大きさは４から２０ヌクレオチド超までの範囲をとることができ，親和性の向上，安定性及び長期保存のため改変された塩基及び／又は骨格を含むことができる。一つの実施態様においては，ホスホロチオエート末端改変を含む特異的プライマーを大量の（１ｍｌ中に約１．５ｍｇ）核酸を合成するために用いることができる。
【００３０】
増幅工程には，緩衝液及び温度条件をポリメラーゼの特異的な要求に対応するように調節すれば，増幅反応にはあらゆるポリメラーゼを用いることができる。例えば，高温ｔａｑ様のポリメラーゼを用いる際に必須の変性及びアニーリング段階が含まれる。しかしながら，本発明の好ましい実施態様は，Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのような逐次前進性の鎖置換性ポリメラーゼを用いており，熱サイクリングなしに効率的に鋳型を増幅させるものである。好ましい実施態様は，Ｐｈｉ２９あるいはＰｈｉ２９様ポリメラーゼを用いるものであるが，Ｐｏｌ Ｉ及びＰｏｌ ＩＩＩ，Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼのような他のポリメラーゼ，及びその派生物も用いることができる。本発明はまた，効率及び／又はフィデリティを改善するよう設計された，その他の改変されたポリメラーゼあるいはキメラポリメラーゼも用いることができる。
【００３１】
増幅に続き，核酸産物は意図する使用を容易にするように更なる処理を加えることができる。検出，同定あるいは配列決定を含む研究目的には，通常はコンカテマーの短い直鎖状ユニット（送達（ｄｅｌｉｖｅｒｙ）ユニット）のみが要求され，これは制限酵素による切断あるいはせん断もしくは特異的，光解離性ヌクレオチドにおいて誘発される切断のように物理的あるいは化学的方法によって得られる。細胞へのトランスフェクションは様々な形態において成されるが，高効率の取り込みは一般的に環状あるいはスーパーコイル化された核酸によって得られる。一つの実施態様は，増幅に続くＤＮＡリガーゼを用いたライゲーション工程を含み，環状核酸（ＣＮＡｓ）を形成する。別の実施形態では，リコンビナーゼあるいは同様な酵素を用いて送達ユニットを円形にして環状核酸とする。また別の実施態様は，ＤＮＡジャイレース（ｇｙｒａｓｅ）を用いた環状産物をスーパーコイル化しスーパーコイル化ＣＮＡ（ｓＣＮＡ）を形成する付加的な段階を含む。
【００３２】
産物の真核細胞における発現を意図する場合，培養の場合においても治療利用の場合においても，細胞による取り込みが重大である。トランスフェクションは環状，スーパーコイル化されたＣＮＡあるいは直鎖ユニットの内部塩基及び／又は末端の改変により安定化された特別に設計された直鎖状核酸を用いて成される。このような改変に含まれるのは，クレノーフラグメント様酵素を用いた挿入による末端の平滑化；適切に改変された塩基を用いた直鎖末端のホスホロチオエート化；インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で直鎖の安定化あるいは分解を最小にする，増幅工程あるいはそれに続くコンカテマー切断工程中における他の改変された塩基の取り込み；及び速やかな取り込み及び／又は細胞への取り込み後長期間にわたるカセット発現を容易にする，安定化配列を含む発現カセットの設計である（Ｋａｙ， Ｍ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃ． Ｔｈｅｒ． ３（３）： ４０３−４１０， Ｍａｒ． ２００１）。
【００３３】
セルフリー増幅工程に続く改変あるいは処理の程度は，産物の使用目的による。最終的に処理された産物は，その後試薬，夾雑物，及び／又はあらゆる異なる形状の産物を除去するため精製される。産物の異なる形状には，直鎖断片，開環状核酸，単量体，二量体，三量体等からなる共有結合的に閉環状となった核酸，及びスーパーコイル化した環状核酸を含む。目的の形状は特異的な適用に依存し上記の形状に変えることができる。使用する試薬の数及び必要とされる純度に応じて，産物に対しクロマトグラフィー，限外ろ過，透析，核酸沈殿，あるいは本分野で知られるその他の適切な方法を行う。ゲルろ過及び／又は透析を含むこれらの実施態様は治療利用のための高品質産物を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
本発明の実施態様は大量の高品質核酸を生産するための方法及び装置に関する。本発明の方法は治療上有用な，夾雑物が最小限である核酸産物を生産するため，ローリングサークル増幅法（ＲＣＡ）に基づくセルフリー系を用いる（図２）。
【００３５】
本発明に関連して用いられる「核酸」，「オリゴ」，あるいは「オリゴヌクレオチド」とは，ＤＮＡあるいはＲＮＡ，あるいはその類似物（例えばホスホロチオエート類似物）でありうる。核酸あるいはオリゴヌクレオチドは，改変された塩基，骨格，及び／又は末端を含んでもよい。合成骨格は，核酸に対し安定性及び／又はその他の有利な点を与えるホスホロチオエート（Ｐｔ），ペプチド核酸（ＰＣＡ），構造的に固定された核酸（ＬＮＡ），キシロース核酸（ＸＮＡ），あるいはその類似物を含んでもよい。
【００３６】
図２に示すように，本発明のある実施態様に係る方法はＲＣＡに基づくものである。この工程は環状鋳型からコンカテマーを合成するためにポリメラーゼを用いる。コンカテマーは少なくとも一つの欠損のない発現カセットを含むより小さいフラグメントへと処理される。合成された産物は短い直鎖状ユニットとして利用されるか，あるいは環状化された核酸（ＣＮＡｓ）あるいはスーパーコイルの環状核酸（ｓＣＮＡｓ）へとさらに処理される。
【００３７】
本発明の方法はＤＮＡあるいはＲＮＡの鋳型から開始できる。ＲＮＡ鋳型から開始したものはｃＤＮＡ鋳型を合成するため，トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素のような逆転写酵素を含む。図２に示すように，本発明の方法で用いられる環状の鋳型を調製するために，当該技術分野において知られているあらゆる方法を用いることができる。これらの方法のうちいくつかを図１を参照しつつ詳細に記述する。
【００３８】
いくつかのポリメラーゼに対し，鋳型を安定化し増幅効率を改善するために一本鎖結合タンパクを利用することができる。誤りを修復するために増幅反応に付加的な酵素を含めることもできる。変異スプライシングタンパク（ＭｕｔＳ）のようなタンパクを介したエラー修正酵素もまたポリメラーゼの全体のフィデリティを効果的に改善し増幅反応中あるいは反応後に用いることができる（Ｃａｒｒ， Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃ Ａｃ Ｒｅｓ ３２（２０）： ｅｌ６２， ２００４）。
【００３９】
目的の用途に応じて，本発明の方法で用いるＤＮＡポリメラーゼには，原核生物，菌類，ウイルス，バクテリオファージ，植物あるいは真核生物のあらゆる既知のＤＮＡポリメラーゼを用いることが可能であり，核酸分子の合成が可能なホロ酵素及びあらゆる機能的なホロ酵素の一部あるいは改変されたポリメラーゼを含んでもよい。有用なＤＮＡポリメラーゼとしては，バクテリオファージｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ，他のｐｈｉ２９様ポリメラーゼ（例えば，ファージＭ２ ＤＮＡポリメラーゼ，ファージＢ １０３ ＤＮＡポリメラーゼ，あるいはファージ ＧＡ−１ ＤＮＡポリメラーゼ），ファージpｈｉ−ＰＲＤ１ポリメラーゼ，ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ，ＤＥＥＰ ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ，ＫｌｅｎＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ，ＤＮＡポリメラーゼＩ，ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント，ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素，Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼ，Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼホロ酵素，Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ，Ｂｓｔポリメラーゼ，ｒＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ，Ｎ２９ ＤＮＡポリメラーゼ，ＴｏｐｏＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ，及びＴｈｅｒｍｏＰｈｉＴＭＤＮＡポリメラーゼがある。本発明の好ましい実施態様は，Ｐｈｉ２９ポリメラーゼ，Ｐｈｉ２９様ポリメラーゼ，あるいは他のフィデリティの高いポリメラーゼ（例えば，ハイブリッド融合ポリメラーゼ）を用いる。
【００４０】
本発明の好ましい実施態様は，フィデリティの高い塩基取り込み条件でＤＮＡ増幅を行うため鎖置換ポリメラーゼを用いる。本発明に関連して，フィデリティの高い「ＤＮＡポリメラーゼ」とは，推奨される条件において，エラー取り込み率が一般的に用いられるＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ，ＫｌｅｎＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ，あるいはＴ７ ＤＮＡポリメラーゼのような熱安定的なＰＣＲポリメラーゼに関連した値（１．５×１０−５−５．７×１０−５）に等しいかあるいはそれよりも低いものを指す。付加的な酵素は誤った取り込みを最小限にするために反応に付与することができ，ポリメラーゼ反応の期間中あるいは反応後に効果的にポリメラーゼのフィデリティを向上させるＭｕｔｓ等のタンパクを介したエラー修正酵素を含む（Ｃａｒｒ， Ｐ． ｅｔ ａｌ， Ｎｕｃ Ａｃ Ｒｅｓ ３２（２０）： ｅｌ６２， ２００４）。
【００４１】
同様に，フィデリティの高い「ＲＮＡポリメラーゼ」は，エラー取り込み率が一般的なＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のものに等しいあるいはそれよりも低い。本発明に有用なＲＮＡポリメラーゼとしては，Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ，ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ，Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ，及びそれらの改変体あるいはキメラ体が含まれる。
【００４２】
増幅反応中において，環状鋳型はデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ），リボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰｓ），あるいは改変された対応物の存在下でポリメラーゼによって鋳型の直列反復からなる長いコンカテマーを形成しながら複製される。コンカテマーは続いて制限酵素による切断あるいは物理的なせん断によって，「短い発現カセット」（ＳＥＣｓ）と呼ばれる小さな断片へと切断される。ＳＥＣは目的とする配列及び任意的に真核生物の発現配列（あるいはカセット）を含む。好ましい実施態様においては少なくとも一つの真核生物発現カセットを含むＳＥＣを用いる。従来のバクテリアにより合成されたプラスミドと異なり，本発明のＳＥＣは対象とする真核生物配列を近傍に持つ目的とする配列のみからなり，バクテリアの遺伝物質を含まない。
【００４３】
「短い発現カセット」としては，標的細胞により認識される真核生物のプロモーター；欠損のない遺伝子，遺伝子断片，あるいは目的とする特異的な配列（ＳＯＩ）といった目的とする配列；及び転写終結配列がある。短い発現カセットはライゲーション（例えば，ＣＡＮの合成）を容易にするため，あるいは直鎖状の断片を安定化するための付加的な配列を近傍に置くことが可能である。発現カセットは，望ましい近傍配列と共に，「送達ユニット」（ＤＵ）をなし，バクテリア培養液中で生産されるプラスミドの選択と複製のみに利用されていた不要な遺伝物質を含まない。真核細胞において意味を持たないバクテリアの遺伝物質を最小にすることで，高濃度の高品質で生理活性を持つＤＮＡ分子を生産することが可能となる。合成された核酸は典型的なプラスミドよりも小さく，細胞により効率よく導入され，また遺伝子導入に際して細胞内でより効率よく発現される。
【００４４】
酵素的あるいは化学的方法を用いて，ポリマー化のエラーによるミスマッチのヌクレオチドを含むＤＵを除去することにより，最終産物の均一性を改善することができる。この目的を達成するために，例えば，変異を検出するために用いられる酵素（例えば，レゾルベース，Ｔ４ エンドヌクレアーゼ ＶＩＩ，あるいはＴ７ エンドヌクレアーゼ Ｉ）あるいは遺伝子突然変異あるいは遺伝子多型を検出するために用いられる，あるいは点突然変異のハイスループットスクリーニング（例えば，ＴＩＬＬＩＮＧ）に用いられる他の酵素を用いることができる。
【００４５】
先述の通り，本発明の方法に使用する環状鋳型を調製するためあらゆる方法を用いることができる。図１は目的とする配列（ＳＥＣあるいはＤＵ）を少なくとも一つ含む有用な環状鋳型を合成するため，一般的に用いられる三つの方法を示す。一つの方法は既存のプラスミドの酵素による改変を含み，これにより真核細胞の発現カセットを含むＤＵがプラスミドから制限エンドヌクレアーゼで選択的に切り出される。ＤＵはインビボにおけるＳＯＩの発現を抑制する可能性がある複製起点あるいは抗生物質耐性メディエーター等の選択マーカー遺伝子を含まない。
【００４６】
本発明の好ましい実施形態は，欠損のない真核細胞発現カセットであってカセットの両端に近傍の配列を有するものを含む鋳型を用い（図１），直鎖ＳＥＣをＣＮＡへと環状化することを可能にしている。鋳型は，プラスミド，ミニサークルＤＮＡなど環状の鋳型に変換されるものであれば，あらゆる一本鎖核酸あるいは二本鎖核酸（ＤＮＡあるいはＲＮＡ）であってよい。パドロック・プローブを用いる場合と同様に，前もってライゲーション反応を行ってもよい（Ｂａｎｅｒ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ， Ｎｕｃ Ａｃ Ｒｅｓ ２６（２２）： ５０７３−７８， １９９８）。
【００４７】
ポリメラーゼ反応を最適化するため，使用するポリメラーゼによっては二本鎖鋳型は初めに変性させる必要がある。そのような反応においては，フォワード鎖及びリバース鎖の両方を同時に同じ反応で増幅することができる。次のプロセシングには制限エンドヌクレアーゼ，リガーゼ，及び／又はジャイレースの添加が必要となる。その後に治療への応用に用いられるＤＵを得るために産物の精製が行われる。
【００４８】
鋳型を作製するための第二の方法はより大きなＤＮＡ鋳型からのＰＣＲ増幅を含み，特異的な発現カセット近傍に位置する特異的なオリゴヌクレオチドを用いて環状化するための相対的に短いＤＵを生成する。
【００４９】
図１に示す第三の方法は，オリゴヌクレオチド（オリゴ）の化学合成を含み，一本鎖核酸あるいは相補鎖を合成した後，環状化によりＤＵあるいは発現カセットを含む鋳型を生成する。
【００５０】
増幅時において，鋳型は溶液中に懸濁させても，染色体あるいはタンパク（米国特許第５，８５４，０３３号）のような担体あるいはガラスまたはポリスチレンビーズのような固体の担体に結合させてもよい。
【００５１】
本発明の実施形態に係る別の方法を図３に示す。図３に示されるように，二本鎖鋳型のどちらの鎖も一本鎖ＤＵのコンカテマーを合成するために適切に設計されたプライマーを用いて別々に増幅される。別々に増幅されたコンカテマーは個々に特異的な制限酵素切断部位を含むオリゴと混合され制限酵素により切断される。これら断片の一時的に二本鎖となった末端は連結され環状の一本鎖産物となる（Ｄａｈｌ， Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ １０１（１３）： ４５４８−５３， ２００４）。この方法の利点は，各反応において合成される一本鎖環が連結され単一種類の単量体二本鎖環を形成し，そのため同一反応中に合成されるその他の多量体型から単量体を精製する必要性を避けることができることにある。その後単量体環はＤＮＡジャイレースあるいは同様の酵素によりスーパーコイル化し，発現カセットの取り込み及び発現効率を改善させることができる。
【００５２】
多数の実施態様において，特異的に指定の部位に結合するプライマーを有する環状の二本鎖ＤＮＡ鋳型を用い，コンカテマー合成を開始させている。プライマーは安定性を向上させるため「核酸」のあらゆる異なる変形物で構成することができ，使用するＤＮＡポリメラーゼのアニーリング温度により規定される様々な長さのものを用いることができる。プライマー配列は無作為配列あるいは特異的配列で構成され，特異的配列改変を含むよう設計すること，あるいは増幅された配列の操作あるいは解析を容易にする目的で鋳型に非相補的な標識あるいは検出配列を含めることができる。例えば，一実施態様においては，無作為のヘキサマーを用いて，プロセシング及び細胞へのトランスフェクションに際し望ましい効果を生み出すＤＵを効率的に増幅している。別の実施形態では，特異的に設計されたプライマーを用い，イニシエーション部位と一定の間隔を空けること，及び増幅反応条件を最適化するように親和性をコントロールされたプライマーを用いることにより，ＲＣＡ反応をコントロールすることを可能にしている。テトラマー程度の短い配列特異的なプライマーが特異的ＤＵを効率的に増幅するために用いられる。
【００５３】
ほとんどの用途において，本発明において用いられたようにポリメラーゼ，制限エンドヌクレアーゼ，リガーゼ，及び他の酵素はその酵素の可溶性の形態をとる。しかしながら，制限酵素反応，ライゲーション及びスーパーコイル化反応を含む固相増幅反応あるいは固相プロセシング反応も増幅工程を合理化するために用いることができる。加えて，フィデリティ，効率，及びプロセシングあるいは最終産物を改善する目的で設計された異なる酵素（特にポリメラーゼ）の最適領域からなる融合タンパクを用いることができる。バクテリア，菌類，植物，昆虫，あるいは動物細胞において発現された一つあるいはそれ以上のアフィニティー標識（例えば，６ＸＨｉｓ，Ｓ−Ｔａｇ，カルモジュリン結合ペプチド，タンパクＡ等）を含む酵素のリコンビナント型も利用可能である。標識された酵素を用いる利点は，アフィニティークロマトグラフィーにより最終産物から酵素をすぐに除去できる点にある。精製に続いて，標識部分を介して固相マトリクスに固定され，回収された酵素は次の酵素反応に利用できる。
【００５４】
増幅に続き，コンカテマーは少なくとも一つのＤＵを含む短い発現カセット（ＳＥＣｓ）へと切断される。ここにおいて単一ＳＥＣはＤＵの複数コピーから構成され送達と発現を最適化するように設計することができる。直鎖状ＳＥＣは標的細胞による取り込みを容易にするため直鎖状断片として，環状化された断片として（ＣＮＡｓ），あるいはスーパーコイル化した環状断片（ｓＣＮＡｓ）として直接投与できる。このように，増幅後のプロセシングは使用目的により異なる。
【００５５】
ＳＥＣのプロセシングは以下の一つあるいはそれ以上を含むことができる。その他の物理的あるいは酵素を用いた方法による更なるＳＥＣの切断；クレノーを利用する場合のような酵素による切断，あるいは化学的方法によるＳＥＣ末端の付加あるいはプロセシング；環状化されたＣＮＡを合成するためＳＥＣ両端の分子内ライゲーション；ＩＩ型トポイソメラーゼを含むジャイレース様酵素を用いたＣＮＡのスーパーコイル化；いずれかの形態のＳＥＣに対し分子内塩基あるいは末端を改変するための酵素的あるいは化学的処理；二つあるいはそれ以上のＳＥＣの連結；あるいは機能的複合体を生成するためＳＥＣを特異的リガンドに結合させること。本発明に関して定義される用語リガンドには，ＤＮＡ，ＲＮＡ，ＰＮＡ，ＬＮＡあるいはそれらの改変を含む核酸；標的化及び細胞による取り込みを容易にする，あるいは治療的効果を増すためのペプチド；酵素的に活性のある及び／又は物理的に機能的なポリペプチド；タンパクの機能を認識，結合及び改変する核酸であるアプタマー；蛍光，磁気，及び放射線標識された要素を含む生物物理学的な標識；及び核酸の安定化，あるいは産物の目的の細胞あるいは組織への標的化を容易にするポリマーが含まれる。
【００５６】
本発明により合成されたＤＮＡを用いて投与に成功し得る治療的用途は，抗体産生あるいは遺伝子サイレンシング等いくつかのＤＮＡ療法に向けた方法を含む。例えば，インフルエンザあるいはＨＩＶウイルス等の病原体により引き起こされる疾患の予防あるいは治療のために設計された適切な発現カセットの投与が成功すると抗体がインビボで合成される。例えば，真核生物のプロモーター制御下にあるインフルエンザヘムアグルチニンタンパクをコードする配列は，インフルエンザＡウイルスに感染した動物の液性及び細胞性免疫反応を誘発するために用いることができる。同様に，切断されたヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）エンベロープタンパクをコードする配列を発現させると，マウスにおいてＨＩＶに対する効果的な免疫反応を引き起こすことができる。
【００５７】
本発明において増幅された核酸はインビボにおいて標的化遺伝子サイレンシングを触媒することも可能である。痛みを伴う水泡及び体の様々な部位の痛みを引き起こす単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ），水痘（初期感染）及び帯状疱疹（再発時）を引き起こす帯状疱疹ウイルスは同じファミリーに属するウイルスであり，ウイルス感染を達成するためにはＩＣＰ４及びＩＣＰ４７の発現を必要とする。培養細胞へのトランスフェクションに際して，ＩＣＰ４あるいはＩＣＰ４７に特異的なアンチセンスオリゴを発現する増幅されたＳＥＣはインビボでこれらのタンパクの発現を調節し，ウイルスの更なる増殖を最小限に抑えることができる。アンチ−ＩＣＰ４転写産物のインビボにおける発現はＩＣＰ４遺伝子を抑制することができ，細胞内のＩＣＰ４タンパク発現を妨げる。同様の効果は本法により生成されたＩＣＰ４７発現カセットの発現の後にも見られる。
【００５８】
ＩＣＰ４７は主要組織適合複合体（ＭＨＣ）提示経路を阻害するように機能し，これが宿主の免疫原生に対する攻撃をウイルスがしないようにするために重要となっている。ＩＣＰ４７の遺伝子産物は感染細胞表面における抗原提示に関わるトランスポータータンパクに結合して主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ抗原提示経路を阻害する。結果として，ＨＳＶ感染細胞は細胞傷害性Ｔリンパ球による免疫認識から遮蔽される。このように，ＩＣＰ４７はＨＳＶ感染において重要な役割を果たす。
【００５９】
肺がん細胞株，Ａ５４９に本発明に従って増幅されたＩＣＰ４７ ＳＥＣをトランスフェクションした場合，効果的にアンチセンス配列が発現し，ウエスタンブロットによる解析によれば，ＩＣＰ４７タンパクの生成を阻害する。単純ヘルペスウイルスのゲノム中には，同様に抑制される感染細胞タンパクがさらに存在する。
【００６０】
その他の遺伝子抑制の標的には，ライノウイルス，コロナウイルス，アデノウイルス，インフルエンザ及びパラインフルエンザウイルス等の呼吸器系ウイルスがある。これらは一般的な風邪，肺炎，喘息，及び慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を含む上気道及び下気道の感染を頻繁に伴う。ヒトライノウイルス（ＨＲＶ）は大きさにして約７．２ｋｂ長でキャプシドコートタンパク，ＲＮＡポリメラーゼ及び二つのウイルスプロテアーゼをコードする単一オープンリーディングフレームを含む一本鎖ＲＮＡゲノムを持つ。感染に際し，ウイルスタンパクは効果的に数千のウイルス粒子を宿主の機構を用いて産生させ，最終的にこれらの粒子は細胞が溶解するときに放出される。
【００６１】
大多数のライノウイルスは細胞間接着分子Ｉ（ＩＣＡＭ−１）を細胞に感染するためのレセプターとして利用している。ＩＣＡＭ−１のメッセージに対するアンチセンス鎖をコードする増幅されたＳＥＣを発現させると，効果的にインビボでのＩＣＡＭ−１タンパク発現を阻害でき，ウイルス感染を最小限にするために有用であることが分かる。その他の呼吸器系疾患に対する有用な方法には，ウイルス粒子の生成に必要となるウイルスプロテアーゼのように，感染を触媒する必須タンパクの活性を阻害することを目的としたアンチセンス様分子（アンチセンス，アプタマー，トリプレックス形成分子，及び同様の分子）のインビボでの発現が含まれる。その他の方法には，ＳＥＣを用いた病原体により引き起こされる組織反応のメディエーター（例えば，ブラジキニン，プロスタグランジン，タチキニン，ヒスタミン，及び様々なサイトカイン）の阻害，あるいはこれらメディエーターにより引き起こされる生理学的な効果を達成する細胞レセプターの阻害が含まれる。
【００６２】
本発明の治療的用途の他の標的には，ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶｓ）により引き起こされる感染の調節が含まれる。この感染は初期には良性の，非癌性疣贅の症状を示すが，悪性増殖へと発展する症例もある。例えば，生殖器ＨＰＶは一患者から他者へと性交渉及び口腔あるいは肛門性交により感染する。子宮頸部ウイルス感染細胞は，初期の良性疣贅から悪性細胞前駆体へと移行し，最終的に癌腫へと発展する。子宮頸癌はおそらくウイルス感染が癌に至る最もよく知られた例の一つである。ヒト及び動物において，細胞分裂は主にＲｂ及びｐ５３によって制御されている。ＨＰＶのＥ６タンパク及びＥ７タンパクは，直接Ｒｂ及び／又はｐ５３に結合し，これらのタンパクの腫瘍抑制効果を阻害し，感染細胞の無秩序な複製を引き起こす（Ｄｉｄｅｌｏｔ， Ｃ． ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔｌ Ｊ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２３：８１−８７， ２００３）。ウイルスが開始段階のみに作用するのに対して，時間と共に無秩序に増殖したいくつかの細胞では遺伝的構造に修復不可能な永続的変化が起こる。Ｅ６及びＥ７を阻害するように設計されたアンチセンス様構成を発現させることでウイルス感染は無効にされる。
【００６３】
その他のＨＰＶ感染は，それ自身男性及び女性において生殖器及び肛門あるいはその付近の疣贅として現れ，本発明により生成された核酸を用いた治療用アンチセンス様物質の発現の妥当な候補である。女性においては，子宮頸部にも目に見える疣贅が現れる。この型の生殖器疣贅は，専門的には尖圭コンジロームとして知られ，一般的に６番及び１１番の二つのＨＰＶ型と関連している。これらの疣贅は癌に進行することは稀であり，「低リスク」のウイルスであると考えられている。その他の性交渉により伝播されるＨＰＶは，男性及び女性において生殖器あるいは肛門癌と関連している。これらは「高リスク」ＨＰＶ型と呼ばれ，ＨＰＶ−１６，ＨＰＶ−１８，ＨＰＶ−３１，ＨＰＶ−４５，及びその他の型を含む。高リスクＨＰＶ型は，通常目に見える疣贅には含まれないが，高リスクＨＰＶ及び低リスクＨＰＶの両方が子宮頸部における異常細胞の増殖を誘発しうる。どちらの型のＨＰＶ感染も治療用のインビボにおけるアンチセンス様物質発現により効果的に調節することができる。
【００６４】
本発明の増幅反応は，バクテリア配列を含む欠損のないプラスミド，あるいはこれらの配列を除去するために改変されたプラスミドを増幅する目的にも利用することができる。例えば，１）欠損しているが完全な酵素活性をもつＲＴをコードするマウスモロニー白血病ウイルス逆転写酵素（ＭｏＭｕＬＶ ＲＴ）遺伝子；２）ＭｏＭｕＬＶ ＲＴによる逆転写開始に必須の近傍領域を含むプライマー結合部位（ＰＢＳ）；３）アンチセンス，アプタマー，ＤＮＡエンザイム，あるいはトリプレックス形成を誘導する配列を生成することを目的とした標的遺伝子コーディング配列；及び４）逆転写反応を終結させるために設計されたステムループ構造を含む一本鎖ＤＮＡ発現ベクター，ｐｓｓＸＥを，本発明に従って欠損のない発現カセットとして効率的に増幅できる。増幅された産物はトランスフェクションされ，哺乳類，ウイルス，及びバクテリア遺伝子を効果的に抑制するために利用できる。細胞内での発現において，トランスフェクションされたＲＴは内在性宿主ｔＲＮＡ（例えば，ｔＲＮＡ ＰｒｏあるいはｔＲＮＡ Ｖａｌ）をＲＮＡ転写物の３’末端に位置するプライマー結合部位（ＰＢＳ）に結合するためのプライマーとして利用し，ｓｓＤＮＡ合成を開始する。逆転写後，ｓｓＤＮＡはｍＲＮＡ鋳型がＲＴのＲＮａｓｅ ＨあるいはＲＮａｓｅ Ｈ活性によって分解されると放出される。
【００６５】
核酸（ＳＥＣ）の送達は安定化緩衝液に溶解した裸の核酸の標的受容体への単純な投与によって達成できる。本発明の実施態様は，細胞への核酸の標的化及び送達を援助する送達ベクター（Ｄｉａｓ，Ｎ． Ｍｏｌｅｃ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １：３４７−３５５；２００２）も利用できる。いくつかの実施態様においては，弱毒化されたウイルスベクター系，すなわちウイルスパッケージング系で免疫遺伝的タンパクの少ないあるいは無いもの（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ， Ｉ．Ｋ． ａｎｄ Ｌｉｕ， Ｍ．Ａ． Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ． １３８： ５５０−５５９， ２００３）を利用している。その他の実施態様は，核酸を封入するあるいは静電気的相互作用により核酸を結合する，中性あるいはカチオン性リポソームの使用を含む。これらの実施態様は，送達された核酸がエンドソーム分画に隔離されることを防ぐ目的でヘルパー分子（例えば，クロロキンあるいは１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン）を使用することができる。市販のリポソーマルベクターには，リポフェクチン，ユーフェクチン，サイトフェクチン及びリポフェクタミンがある。
【００６６】
その他の送達方法には，物理的作用，レセプターあるいはトランスポーターを介した機構により原形質膜への浸透性を調節するカチオン性ペプチドへの核酸の共有結合が含まれる。このような結合は，細胞質に直接送達され，速やかに核へ送られ発現されるため，送達された核酸の効果を向上させる（Ｌｕｏ， Ｄ． ａｎｄ Ｓａｌｔｚｍａｎ， Ｗ．Ｍ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １８： ３３−３７， ２０００）。さらに他の実施形態では，細胞に核酸を送達するために治療用核酸と静電気的に相互作用するカチオン性ポリマーを用いる。カチオン性ポリマーには，例えば，ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ），ポリエチレングリコール（ＰＥＧ），ＰＥＧブロックＰＬＬデンドリマー，ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー，ポリアルキルシアノ−アクリル酸ナノ粒子，及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）及びその複合体（例えば，マンノース−ＰＥＩ，トランスフェリン−ＰＥＩ，直鎖ＰＥＩ）が含まれる。
【００６７】
エアロゾルによる送達は，気道上皮及び肺表面への非侵襲性の送達形式である。例えば，ＰＥＩ及び核酸を含む処方は中和により高レベルの気道あるいは肺へのトランスフェクションを達成可能である。このＰＥＩ−核酸複合体の適用は，多くのカチオン性脂質製剤より高レベルの遺伝子発現が達成でき，気道上皮及び肺柔組織の細胞へのトランスフェクションは非常に高レベルの効率（ほぼ１００％）を示す。加えて，ＰＥＩに基づく製剤の度重なるエアロゾル投与に伴う毒性は非常に低い。この送達方法が誘発する腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）及びインターロイキン１ベータ（ＩＬ−１Ｂ）は，ＰＥＩ−核酸複合体の静脈内注射あるいはカチオン性リポソーム−核酸複合体のエアロゾル送達と比較して最小限のもののみである。
【００６８】
バクテリアにより生成されたプラスミドＤＮＡを用いる場合に頻繁に起こる問題は，バクテリアによって処理されたＤＮＡに固有の非メチル化モチーフに宿主が曝露されることに由来する。非メチル化されたＤＮＡは，ＣｐＧに触媒されるサイトカイン反応及び炎症性サイトカインを誘発するが，これは肺に対する毒性及び治療用途の効率低下に関連する深刻な問題である。結果的に，バクテリアによって生成されたＤＮＡの使用は，今まで用いられてきた現行の遺伝子治療法の多くにとって大幅な妨げとなっていた。ＰＥＩによるＣｐＧ反応の遮蔽はＰＥＩ−遺伝子エアロゾルを介して送達された遺伝子の持続的発現を容易にし，したがって，治療に対する反応の持続が達成される。本発明のセルフリー増幅法により生成された核酸と組み合わせて利用する場合，ＰＥＩに基づくエアロゾルは肺及び気道上皮に対するＤＮＡ治療のための極めて効果的な送達系となり得る。
【００６９】
いくつかの実施態様においては，長期放出系も用いている。ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）ミクロスフェア及びポリ（エチレン−ｃｏ−ビニル酢酸（ＥＶＡｃ）マトリックスといった生体適合放出制御性ポリマーは，生理活性のある核酸を数ヶ月に渡って制御，調節し予期できる形で放出させることができ，両成分は治療目的の使用が米国食品医薬品局により承認されている。
【００７０】
物理的送達系もまた利用可能である。エレクトロポレーションは治療薬を皮膚細胞，角膜内皮細胞及び筋肉を含むその他の組織に送達するために効果的である。圧力による，あるいは水圧注入は哺乳類の系では５０％の効率まで達成可能である。その他の方法には，植物を含む様々な細胞型におけるＤＮＡ−脂質複合体の超音波による噴霧が含まれ，植物においては粒子衝突も有用である。
【００７１】
セルフリー増幅工程のスケールアップは，半自動化あるいは完全自動化されたプラットフォームによって行われ，ここにおいては，温度及び静置時間と共に，塩，酵素及び核酸の順次添加が最適効率を得るために厳密に制御される（図４）。一実施形態においては，各反応容量を比較的小さく（＜１ｍｌ）保ったまま反応回数を増加させることによってスケールアップが達成され，これによりマルチウェルプレートを用いて標準プラットフォームあるいは特別に注文したプラットフォームを用いて鋳型を同時に増幅できる（図５Ａ）。もう一つの方法では，大量（ｋｇ単位）の単一核酸産物を環境制御下において発酵槽様容器を用い一回の実行で産生するため，より大きな容量（例えば，１０リットル）を必要とする（図５Ｂ）。より大きな収量の産物を得るためにはより大きな容量が用いられる。異なる限度容量をもつ複数のプラットフォームは，限られた空間に平衡して設置することができ，様々な増幅容量の要求を満たすより大きな生合成設備の一部として連携して機能することができる。
【００７２】
小容量での大量の核酸生産には粘性の高い反応混合液に試薬を混合するという問題が生じる。本発明の反応槽には，硬質の前成形容器あるいは内蔵式のプラスチック袋のように可塑性のある容器が含まれる。好ましい実施態様においては，反応混合液と接触する反応槽及びすべての構成材は清潔で，滅菌されており核酸配列のいかなる夾雑も含まない。硬質前成形容器の内容物は好ましくは反応槽内部に含まれる装置により混合されるが，再循環装置を用いてもよい。可塑性のある反応層では，好ましくは蠕動様ポンプの利用を含む再循環機構により混合されるか，あるいは自動圧搾装置あるいは核酸産物のせん断を避ける低エネルギーパルス装置等の外部の機械装置により混合される。
【００７３】
内部装置は，電気的に速度制御され自動で時間的な調節が行われるプロペラ様攪拌装置（図６Ａ），あるいは反応槽の内径内で上から下まで連続している軸に固定された穴あきディスクを用いて制御された液体置換工程（図６Ｂ）を含む様々に異なる機構を利用できる。このディスクは，液体中で最適な混合を提供するよう，様々な速度で上昇及び下降される。これら混合チャンバーは共に小さいチューブが各混合装置の軸に装着され，混合槽の外部に分離して補充された様々な在庫溶液が蠕動ポンプを用いて正確に制御され順次反応混合液へと送達されるようになっている放出装置を装備してもよい。
【００７４】
別の実施態様では，反応混合液の安定した継続的な流れがチャンバーからポンプ輸送で送り出されてから戻る系を実施している。例えば，チャンバーの底部に位置する送出口は，流動体の小さな流れが添加される試薬と混合され，同じ反応チャンバーの上部に位置する入口を通じて再び流れて戻り，完全に混合されるようにしている（図６Ｃ）。蠕動ポンプ及び吸気弁は再循環工程中様々な溶質及び酵素の分注を制御し監視する（図６Ｃ）。
【００７５】
また別の実施態様では，ＤＮＡ混合物の揺変性の性質を利用しており，ここにおいて，混合物は円筒状に伸長した形状をとる。揺変性化合物は，化合物に加えられたせん断力の度合いに応じて粘性を変化させられる。通常，せん断力が増大すると揺変性化合物の粘性は低下する。いったんせん断力が除去されると，このような化合物は本来の粘性へと戻り始める。この実施態様においては，粘性のある反応混合液を含む容器には等間隔に開けられた穴があり，ここから処理に必要な化学物質が投与される。そのため，直径の小さいシリンダーを介した粘性の高い反応混合液を伸長することにより，混合を達成するのに十分な長期間にわたって粘性を十分に変化させ，シリンダー及び粘性が低くなった反応混合液にゆっくりと注入される試薬との局所的な混合を促進させる。
【００７６】
装置には，好ましくは一つあるいはそれ以上の関連する物理的及び生化学的パラメーターのインライン（ｉｎｌｉｎｅ）リアルタイムモニタリングを含み，産物の安定性を確認し品質管理及び品質保証を維持する。これらは治療用途が許容される産物に必要とされる，適正製造基準認定（ｃＧＭＰ）に必須である。これには粘性，核酸濃度，溶液の濁度，導電率，ｐＨ，温度，タンパク含有率，エンドトキシン，バイオバーデン及び／又は系の構成材に由来する化学夾雑物を監視するコンピューターあるいは同様の手段を含む。
【００７７】
直鎖状ＳＥＣを環状の形態に処理する工程には，分子間反応よりも分子内ライゲーション（自己接着）反応を起こしやすいライゲーション工程を必要とする。従来の最終増幅産物の希釈は分子内ライゲーションを起こしやすい分子比率を操作するために利用できる。しかしながら，好ましい実施態様においては，少量の反応混合液を酵素及び緩衝液を含むライゲーション混合物（ｃｏｃｋｔａｉｌ）に混合させることで，全体の反応容量を最小限にしている。一実施態様においては，増幅された産物が図６Ｃに示すように非常にゆっくりとした，あるいは脈動するポンプ速度を利用して反応混合液の流れに添加される。その他の実施態様では，ライゲーション混合物を含む二番目の反応槽へと増幅された反応混合液を滴下して分注することで，大容量のライゲーション反応混合液を発生させることなく希釈を達成する（図７）。毎回新しく一定分量が分注される際に分子内ライゲーション工程を最適化するため，各分量の添加には十分な時間が与えられる。一度一定分量のライゲーションが完了すると，環状ＤＮＡは酵素の基質にはならず希釈混合液の一部となる。それから次の一定分量が分注され，このサイクルは増幅されたＤＮＡが全て分注されライゲーションされるまで繰返される。この工程は，初期増幅反応の大幅な希釈なしに分子内ライゲーションを可能にし，複数の分注チャンバーを組み込むことで複数の一定分量のライゲーションを同時に行うこと，及び処理時間の最小化を可能とする。
【００７８】
産物の最終的な精製は，反応工程中に透過性膜に基づく方法を利用し合理化できる。これらの膜は，産物を保持したままで，増幅されたＤＮＡ反応混合液中の低分子量分子（塩，取り込まれなかったプライマー，ｄＮＴＰ，ＮＴＰ及び他の小分子）の拡散を許容する。その他の反応構成要素に対し増幅されたＤＮＡの選択的な残留を可能にするため，血液透析工程を改変した方法が利用できる。一度反応が完了すると，増幅反応は反応槽から特異的な分子量を遮断する膜からなるフィルターへと送り込まれる。ＤＮＡはこれらの小さいキャピラリーの膜を通過して分子量の小さい試薬が反応液から拡散する時点で少なくとも部分的に精製される。精製されたＤＮＡは続いて，貯蔵されるか，品質評価され，さらに／あるいは最終的な用途のために分注されるか，あるいは後の解析のために直接一定分量に分けられて（ａｌｉｑｕｏｔｅｄ）貯蔵される。その他の実施態様は，供給される液体から高分子量化合物を分離するための低圧膜分離工程からなる限外ろ過精製工程を利用し最終ＲＣＡ産物の望ましい精製を達成する。
【００７９】
最終産物は，従来の方法を用い大きさ，形状，夾雑，及び発現容量に関して解析される。ゲル電気泳動，配列決定，及び生化学的解析あるいはＨＰＬＣ解析が通常行われる。最終産物の発現は，リン酸化カルシウム法，エレクトロポレーションあるいは関連した技法等，標準的技法を用いた適切な細胞へのトランスフェクションによって検定される。
【００８０】
増幅された産物の治療用化合物としての投与には，局所投与，静脈内投与，筋内投与及び組織内投与，鼻腔投与，坐薬投与，オマヤレザバーのように移植された貯蔵装置及び／又はポンプ，点眼薬投与，薬剤の口腔投与，及び超音技術を利用した送達が含まれるが，これに限定されない。送達媒体には，例えば，リポソームを介した輸送媒体あるいはポリマーを介した輸送媒体，並びに各種カプセル媒体あるいはタンパク標的化媒体，及び呼吸器を介した投与に適したエアロゾル担体が含まれる。
【実施例１】
【００８１】
実施例１−β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ−ＤＵ）の合成及びセルフリー増幅
ａ）プラスミドに基づく鋳型 ｐＳＶ−β−ガラクトシダーゼベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ． Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ， ＵＳＡ）をＥｃｏＲ Ｉ及びＰｓｔ Ｉにより部分的に切断した。ＣＭＶプロモーター，Ｌａｃ ＺのＯＲＦ及びＳＶ４０小Ｔ抗原終結配列を含む約４．２ｋｂの断片（Ｌａｃ Ｚ−ＤＵ）を単離し，Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼによって平滑末端処理し，ｐＧＥＭＴＭ−７Ｚｆ（＋）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ． Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ， ＵＳＡ）のＳｍａ Ｉ切断部位にクローニングし，ｐＧＥＭ−ＬａｃＺ−ＤＵベクターを作製した。Ｌａｃ Ｚ−ＤＵを続いてＸｂａ ＩによってｐＧＥＭ−ＬａｃＺ−ＤＵから切除し，ゲル精製し，Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ， ＵＳＡ）を用いて製造業者の推奨に従って環状化した。
【００８２】
ｂ）ＰＣＲに基づく鋳型 ＬａｃＺ−ＤＵをｐＶＡＸＴＭ２００−ＧＷ／ｌａｃＺベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， ＵＳＡ）からＢａｍＨ Ｉエンドヌクレアーゼ認識部位を含むプライマー対，フォワード（５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＡＣＴＣＴＴＣＧＣＧＡＴＧＴＡＣ −３’）及びリバース（５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＡＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣ−３’）を用いて増幅した。Ｌａｃ Ｚ−ＤＵは各プライマー２００ｎｇ，１０ｎｇ ｐＶＡＸＴＭ２００−ＧＷ／ｌａｃＺベクター；０．２ｍＭ ｄＮＴＰ；１ｘ ヘラクレス緩衝液及び２．５ＵヘラクレスＴＭポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ， ＵＳＡ）を含む５０μｌの反応液で増幅した。増幅はロボサイクラーグラジエント ４０（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ， ＵＳＡ）において以下の条件で行った：９４℃で２分；５サイクル（９２℃で３０秒，４０℃で３０秒，７２℃で５分）；２５サイクル（９２℃で３０秒，５５℃で３０秒，７２℃で５分）及び７２℃で１０分。約４．２ｋｂの増幅産物をＢａｍＨ Ｉで切断し，ゲル精製及びＴ４ ＤＮＡリガーゼによる環状化を行った。
【００８３】
ｃ）無作為ヘキサマーによる増幅 １０ｍＭのトリス塩酸ｐＨ８，１０ｎｇの環状ＬａｃＺ−ＤＵ及び２００ｐｍｏｌの無作為ヘキサマー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ． Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ ＩＡ， ＵＳＡ）を含む反応液を９５℃まで３分加熱し，室温まで冷却した。Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ（１０Ｕ， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ， ＵＳＡ）；０．２ｍＭのｄＮＴＰ及び１００μｇ／ｍｌのＢＤＡを添加した。増幅は，３０℃で，５０ｍＭのトリス塩酸（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）ｐＨ７．５；１０ｍＭの塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）；１０ｍＭの硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４），４ｍＭのＤＴＴ中で１６時間行なった。増幅に続いてＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼを熱失活させ（６５℃で５分），増幅したＬａｃＺ−ＤＵコンカテマーをエタノール／塩沈殿し適切なエンドヌクレアーゼ（Ｘｂａ ＩあるいはＢａｍＨ Ｉ）にて製造業者の推奨に従い切断した。
【００８４】
ｄ）特異的プライマーによる増幅 先述と同様の条件を用い，規定された配列及び反対の相補鎖のプライマー二つを２７８８塩基対ＤＵの選択的な増幅に利用した。規定されたプライマー対は各々２００ｐｍｏｌの濃度で用い，以下の配列からなる。フォワードプライマー：５’−ＣＴＧＣＣＡＡＣＡＡＧＧＴＡＣＴＣＧ−３’；リバースプライマー：５’−ＡＧＣＴＧＣＴＡＣＴＧＧＧＴＣＴＡＧ−３’である。増幅は先述と同様に行われ増幅反応の成功はゲル電気泳動によって評価された。
【００８５】
ｅ）配列の規定された単一ヘキサマーによる増幅 Ｌａｃ Ｚ−ＤＵの８つの異なる部位（４つはリバースＤＮＡ鎖の４６４，１３２５，２５７９及び３９１１の位置；４つはフォワード鎖の７５０，２８７１，３２３９及び３２６０の位置）にアニールする４００ｐｍｏｌのヘキサマー５’−ＧｐＧｐＡｐＡｐＡｐＡ−３’及び１０ｎｇの環状ＬａｃＺ−ＤＵを４０ｍＭのトリス塩酸ｐＨ８，１０ｍＭのＭｇＣｌ２中で９５℃まで３分加熱し室温まで冷却した。Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ（１０Ｕ， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ， ＵＳＡ）；１ｍＭのｄＮＴＰ；５％のグリセロール；０．７Ｕの酵母由来無機ピロホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ， ＵＳＡ）及び１００μｇ／ｍｌのＢＳＡを添加した。増幅反応は３０℃で５０ｍＭのトリス塩酸ｐＨ７．５；１０ｍＭの塩化マグネシウム；１０ｍＭの硫酸アンモニウム，４ｍＭのＤＴＴ中で１６時間行った。増幅に続いてＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼを熱失活（６５℃で１０分）し，増幅されたＬａｃＺ−ＤＵコンカテマーをエタノール／塩沈殿して酵素製造業者の推奨に従い適切なエンドヌクレアーゼ（Ｘｂａ Ｉ）により切断した。エンドヌクレアーゼを熱失活（６５℃で２０分）した後，直鎖ＬａｃＺ−ＤＵの環状化を１００ｆｍｏｌのＤＮＡ当たり約０．１ユニット／μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， ＵＳＡ）を含むライゲーション緩衝液（５０ｍＭのトリス塩酸ｐＨ７．６；５ｍＭの塩化マグネシウム；１ｍＭのＡＴＰ；１ｍＭのＤＴＴ；５％のＰＥＧ−８０００）中，約２２℃（あるいはやや低い温度）で１６時間行った。続いて環状化ＬａｃＺ−ＤＵをエタノール／塩沈殿して１０ｍＭのトリス塩酸ｐＨ８に再懸濁した。
【００８６】
ｆ）エキソヌクレアーゼ耐性の配列が規定された単一ヘキサマーを用いた増幅 先述したものと同様の条件を用い，３’末端に二つのチオリン酸エステル結合を持つ規定されたヘキサマー（５’ＧｐＧｐＡｐＡｐｓＡｐｓＡ−３’）を用いてＬａｃＺ−ＤＵを増幅した。
【００８７】
ｇ）配列の規定された単一ペンタマーを用いた増幅 先述したものと同様の条件を用い，配列が規定されたペンタマー（５’ＧｐＧｐＡｐＡｐＡ−３’）を用いてＬａｃＺ−ＤＵを増幅した。このペンタマーは，ＬａｃＺ−ＤＵ中の１９の異なる部位，８つはリバース鎖の４６５，８８９，１３２６，１６９５，２５８０，３６６６及び３９１２の位置；１１箇所はフォワード鎖の８０，１１９，１９１，６０２，７５０，９１２，２８７１，３２３９，３６０６，３８１５の位置にアニールする。
【００８８】
ｈ）エキソヌクレアーゼ耐性の配列が規定された単一ペンタマーを用いた増幅 先述したものと同様の条件を用い，二つの３’末端にチオリン酸エステル結合を持つ配列が規定されたペンタマー（５’ＧｐＧｐＡｐｓＡｐｓＡ−３’）を用いてＬａｃＺ−ＤＵを増幅した。
【００８９】
ｉ）ポリメラーゼ混合物を用いた増幅 １−ｅ節で説明したとおりの条件を用い，Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ及びＴ４ ＤＮＡポリメラーゼが比率１０：３から３：１０（Ｐｈｉ２９酵素ユニット：Ｔ４酵素ユニット）の範囲で存在する条件下においてＬａｃＺ−プラスミドを増幅した。その他の鋳型，すなわち，Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ＤＵについても最適な増幅条件が有効であることが示された。
【実施例２】
【００９０】
実施例２−ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ−ＤＵ）の合成及びセルフリー増幅
ｐＧＬ３ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ． Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ， ＵＳＡ）をＳａｌ Ｉ及びＸｈｏ Ｉで切断した。ＳＶ４０プロモーター，ルシフェラーゼＯＲＦ及びＳＶ４０小Ｔ抗原終結配列を含む約２．１７ｋｂの断片（Ｌｕｃ−ＤＵ）を単離し，精製し，Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， ＵＳＡ）を用いて製造業者の推奨に従って再環状化した。
【００９１】
ａ）セルフリー増幅 ヘキサマー５’−ＡｐＡｐＴｐＴｐｓＧｐｓＣ−３’及び５’−ＡｐＧｐＣｐＡｐｓＡｐｓＴ−３’を各々４００ｐｍｏｌと反応液２５μｌあたり１０ｎｇの環状Ｌｕｃ−ＤＵを含む反応液を９５℃まで３分，４０ｍＭのトリス塩酸ｐＨ８；１０ｍＭの塩化マグネシウム中で加熱し，室温まで冷却した。Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ（１０Ｕ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ， ＵＳＡ）；１ｍＭのｄＮＴＰ（２５／２５／２５／２５）；５％のグリセロール；０．７Ｕの酵母由来無機ピロホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ， ＵＳＡ）及び１００μｇ／ｍｌのＢＳＡを添加した。増幅反応は２５μｌ反応液において３０℃で５０ｍＭのトリス塩酸ｐＨ７．５；１０ｍＭの塩化マグネシウム；１０ｍＭの硫酸アンモニウム，４ｍＭのＤＴＴ中で１６時間行った。増幅に続いて，Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼを熱失活（６５℃で１０分）し，増幅されたＬｕｃ−ＤＵコンカテマーをエタノール／塩沈殿して酵素製造業者の推奨に従いエンドヌクレアーゼ（ＢａｍＨ Ｉ）により切断した。エンドヌクレアーゼを熱失活（６５℃で２０分）した後，直鎖Ｌｕｃ−ＤＵの環状化をＤＮＡの１μｇあたり０．１ユニット／μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， ＵＳＡ）を含むライゲーション緩衝液（５０ｍＭのトリス塩酸ｐＨ７．６；５ｍＭの塩化マグネシウム；１ｍＭのＡＴＰ；１ｍＭのＤＴＴ；５％のＰＥＧ−８０００）中にて１４℃で１２から１６時間行った。環状化Ｌｕｃ−ＤＵをエタノール／塩沈殿して１０ｍＭのトリス塩酸ｐＨ８．０に再懸濁した。
【実施例３】
【００９２】
実施例３−増幅されたＤＮＡのヒト細胞における発現
ヒトＡ５４９肺癌腫細胞（ＡＴＣ）を，熱失活した１０％のウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ， Ｌｏｇａｎ， ＵＴ， ＵＳＡ），１００Ｕ／ｍｌのペニシリン，１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， ＵＳＡ）を補完したＤｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ； Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， ＵＳＡ）で培養し，３７℃，５％二酸化炭素環境中に静置した。
【００９３】
ａ）ＤＮＡトランスフェクション トランスフェクション前日，Ａ５４９細胞を６ウェルプレートに１×１０５細胞／ｍｌの濃度で播いた。ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ ２トランスフェクション試薬（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， ＵＳＡ）を製造業者の示す使用法に従い細胞へのトランスフェクションに用いた。簡潔に説明すると，セルフリー増幅されたＤＵあるいは元のプラスミドＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ． Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ， ＵＳＡ）を５０μｌのＤＮＡ希釈緩衝液Ｂ中において２μｇのキャリアーｐｓｓＸＥ ＤＮＡ（Ｃｈｅｎ ａｎｄ ＭｃＭｉｃｋｅｎ， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １０：１７７６−１７８０， ２００３）と混合し，５分間室温で静置した。ＤＮＡ溶液は，５０μｌの血清／抗生物質なしのＤＭＥＭにてあらかじめ希釈された７μｌのＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ ２試薬と混合し，室温にてさらに５分静置した。その間，Ａ５４９細胞をＰＢＳにて洗浄し０．９ｍｌの血清／抗生物質なしのＤＭＥＭを上層し，続いてＤＮＡ／ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ溶液を加えた。４時間通常の生育環境にて静置した後，細胞をＰＢＳにて洗浄しトランスフェクション培地を１０μｌ／ｍｌのＢｏｏｓｔｅｒ ３（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， ＵＳＡ）を添加した通常の増殖培地に置換した。ＬａｃＺをレポーターとして用いた実験においては，５０−１００ｎｇのＬａｃＺ−ＤＵ（約４．２ｋｂ）を用いたトランスフェクションを１００ｎｇの元のｐＧＥＭ−ＬａｃＺ−ＤＵプラスミド（約７．２ｋｂ）を用いたトランスフェクションと比較した。ルシフェラーゼ酵素をレポーターとして用いた他の実施例においては，２４９ｎｇのＬｕｃ−ＤＵ（約２．１７ｋｂ）を５７０ｎｇの元のｐＧＬ３ベクター（５．０１ｋｂ； Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）と比較した。
【００９４】
ｂ）トランスフェクションされた細胞でのβ−ガラクトシダーゼ活性の検出 トランスフェクションから２４時間後，Ａ５４９細胞をＰＢＳで洗浄（ｒｉｎｓｅ）し，２００／２５０ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．５；０．０２％のトライトンＸ−１００中で室温にて一時間溶解した。続いて細胞残屑を１０−１３，０００ｒｐｍ，５分の遠心によって除去した。細胞溶解液の合計タンパク濃度は２８０ｎｍの吸光度あるいは改良型ブラッドフォード解析によって検定した。合計タンパク量のうち５０μｇを０．０１Ｍのリン酸緩衝液ｐＨ７．５；０．１Ｍの塩化マグネシウム，４５ｍＭのβ−メルカプトエタノール及び０．０１ｍＭの（ｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトピロニダーゼ）と１ｍｌ反応液中にて混合した。１−１６時間３７℃で静置した後，４１０ｎｍの吸光度を測定した。
【００９５】
ｃ）トランスフェクションされた細胞のルシフェラーゼ活性の検定 トランスフェクションから２４時間後，細胞を先述のとおり処理した。続いて細胞溶解物を等しい合計タンパク量を反映するよう調整し等量の２ｘ Ｂｒｉｇｈｔ−ＧｌｏＴＭ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）と混合した。光放出を速やかにＴｕｒｎｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ２０／２０ｎルミノメーターで記録した。
【実施例４】
【００９６】
実施例４−増幅条件
ａ）増幅緩衝液
グリセロール濃度−各々１０ｎｇのＬｕｃ−ＤＵ鋳型を用いる二つの増幅反応を実施例２で説明したように準備した。一方は，グリセロール添加を省き水で置換した。増幅に続き，ＤＮＡをエタノール／塩沈殿し２６０ｎｍ及び２８０ｎｍの波長における吸光度測定に先駆けて適切な制限酵素で切断した。グリセロール濃度が４％ｗ／ｖ以下（Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ及び無機ピロホスファターゼストック溶液からの繰り越し）においては増幅効率に５．６５％の上昇が見られた。
【００９７】
分子スポンジの添加：各々１０ｎｇのＬｕｃ−ＤＵ鋳型を用いる二つの増幅反応を実施例２で説明したたように準備した。一方には，５％ｗ／ｖのＰＥＧ−８０００を添加した。増幅に続き，ＤＮＡをエタノール／塩沈殿し２６０ｎｍ及び２８０ｎｍの波長における吸光度測定に先駆けて適切な制限酵素で切断した。増幅収量に対しいかなる明確な効果も見られなかった。
【００９８】
ｂ）鋳型濃度 １．１５６ｎＭから２９ｎＭの濃度範囲を持つＬｕｃ−ＤＵ鋳型を含む増幅反応液を実施例２で説明したように調製した。増幅に続き，ＤＮＡをエタノール／塩沈殿し２６０ｎｍ及び２８０ｎｍの波長における吸光度測定に先駆けて適切な制限酵素で切断した。核酸濃度は波長２６０ｎｍ及び２８０ｎｍにおける吸光度測定によって決定した。上述の増幅条件下で５７８ｎＭの鋳型を用いたとき６７０倍の増幅が見られた。
【００９９】
ｃ）デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）濃度 ５７８ｎＭのＤＵを含む増幅反応液を実施例２で説明したように調製した。濃度１ｍＭから９ｍＭの範囲でｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｃＧＴＰ及びｄＴＴＰ（２５／２５／２５／２５の比率）を含む反応を検査した。増幅に続き，ＤＮＡを適切な制限酵素で切断し核酸濃度を吸光度測定により決定した。上述の増幅条件下で６ｍＭのｄＮＴＰ存在下で増幅は約３０００倍となった。
【０１００】
ｄ）鋳型に対するｄＮＴＰ比率のカスタマイズ（ｃｕｓｔｏｍｉｚａｔｉｏｎ） ５７８ｎＭのＬｕｃ−ＤＵ鋳型を含む増幅反応を本質的に実施例２で説明したとおり行った。ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを各々増幅混合液に最終濃度９ｎＭとなるように添加した。全体に対する各ｄＮＴＰの比率はルシフェラーゼ鋳型ＤＮＡユニットの組成を反映するように，すなわち２７．２％Ａ，２２．３％Ｃ，２４．２％Ｇ及び２６．３％Ｔを含むように調節した。増幅に続き，ＤＮＡをエタノール／塩沈殿し適切な制限酵素で切断した。核酸濃度は波長２６０ｎｍ及び２８０ｎｍにおける吸光度測定によって決定した。上述の増幅条件下で５７８ｎＭの鋳型を用いたとき約２，７８０倍の増幅が記録された。
【０１０１】
ｅ）Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ濃度 増幅反応液を上述のとおり調製し，９ｍＭのｄＮＴＰ存在下で５７８ｎＭのＤＮＡ鋳型に対し１から２０Ｕの範囲にわたる様々なＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）濃度を検査した。増幅に続いて，ＤＮＡを適切な制限酵素で切断し核酸濃度を吸光度測定により決定した。５７８ｎＭの鋳型に対し１ＵのＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼが２９０倍の増幅を起こすために十分であり，２０ＵのＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼは１０ｎｇの鋳型ＤＮＡを３，９８５倍に増幅した。
【０１０２】
ｆ）配列の規定されたエキソヌクレアーゼ耐性ヘキサマー濃度 増幅反応液を上述のとおり調製し，８００ｐｍｏｌまでの様々な濃度の配列が規定されたエキソヌクレアーゼ耐性ヘキサマーを検査した。増幅に続いてＤＮＡを適切な制限酵素で切断し核酸濃度を吸光度測定により決定した。プライマー濃度を初期実験条件（実施例２）から２倍に増加させると増幅収率が１．２５倍に増加した。
【０１０３】
ｇ）一段階増幅制限酵素反応 ５７８ｎＭのＬｕｃ−ＤＵ鋳型を含む増幅反応液を実施例２で説明したように調製した。増幅に続き，Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼを６５℃で２０分間反応させて熱失活し，６ＵのＢａｍＨ Ｉ酵素を直接反応液に添加した。３７℃で２時間反応させた後，酵素を熱失活しＤＮＡをエタノール／塩沈殿した。ＤＮＡ切断効率は上述のとおりアガロースゲル電気泳動により評価した。
【０１０４】
ｈ）様々な温度条件 先述（実施例１）のように設定された条件において，ＬａｃＺ−プラスミドの増幅を２５℃から３４℃の様々な温度にて実施した。最適温度はＤＮＡ収量及び品質によって決定した。ＤＮＡ収量は吸光度測定法により決定し，ＤＮＡ品質は完全長ＬａｃＺ遺伝子（３０４６ｂｐ）をレポーターとして改良型クンケル法（Ｎｅｌｓｏｎ， Ｊ．Ｒ． ｅｔ ａｌ．， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３２：Ｓ４４−Ｓ４７， ２００２に記載された（Ｋｕｎｋｅｌ Ｔ．Ａ； ＪＢＣ ２６０：５７８７−５７９６， １９８５））を用いたエラー率によって評価した。３２℃で行なわれた増幅反応により，３３００倍以上の増幅及び１．２２×１０−６のエラー率（報告されているＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのエラー率から２．５倍の低下）となった。
【０１０５】
ｉ）様々な反応回数による増幅 実施例１で説明した条件を用い，ＬａｃＺ−プラスミドの増幅を３２℃において１から１６時間にわたる様々な期間（反応回数）で行った。各時点においてＤＮＡポリメラーゼを６５℃で２０分間反応させて熱失活しＤＮＡを適切量の制限エンドヌクレアーゼを直接反応液に添加し切断した。最適な反応時間はＤＮＡ収量及び品質によって決定した。最適な反応時間では，３８００倍以上の増幅がポリマー化エラー率１．７×１０−６で得られた。
【０１０６】
ｊ）より低い酵素及び鋳型濃度での増幅 実施例１で説明した条件を用い，ＬａｃＺ−プラスミド及びルシフェラーゼ−ＤＵを，全量の酵素（Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ，Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ及び無機ピロホスファターゼを含む）濃度の半分量及び２８９ｎＭのＤＮＡ鋳型を含む反応液中で増幅した。増幅反応は３２℃で１６時間行った。ポリメラーゼの熱失活及びそれに続く増幅産物のエンドヌクレアーゼ切断の後，上述のとおりＤＮＡ収量及び品質を決定した。初期実験条件（実施例１）から酵素及び鋳型濃度を半量にすると，５０００倍以上の増幅がポリマー化エラー率７．７×１０−７（報告されているＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのエラー率から約４倍の低下）で得られた。
【０１０７】
ｋ）ＲＣＡにおけるコンカテマー形成の除去あるいは低減 実施例１で説明した条件を用い，ＬａｃＺ−プラスミドをＤＮＡポリメラーゼに加え２Ｕのメチル化感受性ＳｅｘＡＩエンドヌクレアーゼを含む反応液中で増幅した。反応は３２℃で１６時間行った。増幅及び切断に続き，合成されたＤＮＡのアガロースゲル電気泳動による解析により分離した（ｄｉｓｃｒｅｅｔ）直鎖ＤＮＡユニットが確認された。
【実施例５】
【０１０８】
実施例５−分子内ライゲーションの条件
ａ）Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ セルフリー増幅されたＤＮＡを制限酵素にて切断し，先述の酵素の熱失活及びＤＮＡのエタノール／塩沈殿を行った後，直鎖ＤＵの分子内ライゲーション（セルフライゲーション）を，それぞれ１ｘライゲーション緩衝液（５％のＰＥＧ−８０００；５０ｍＭのトリス塩酸ｐＨ７．５；１０ｍＭの塩化マグネシウム；１ｍＭのＤＴＴ；１ｍＭのＡＴＰ）中に７００ｆｍｏｌのＤＮＡを含む，１３８μｌ及び６９０μｌの反応液で行った。様々な量のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， ＵＳＡ）を添加し（０．６−１．５Ｕ），１４℃で少なくとも一時間ライゲーションを行った。先述のＤＮＡ対するライゲーション効率はアガロースゲル電気泳動により視覚的に決定された。６９０μｌ反応液中のｆｍｏｌのＤＮＡ当たり２９０μＵのＴ４ ＤＮＡリガーゼが単量体環状ＤＵの合成を促すために十分であると判断された。
【０１０９】
ｂ）その他のＤＮＡリガーゼ ＤＮＡを適切な制限酵素で直鎖化し先述の酵素を熱失活した後，直鎖ＤＵの分子内ライゲーション（セルフライゲーション）を行った。ライゲーションはＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）あるいはＴａｑ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を用い，製造業者の推奨に従いそれぞれ１４℃及び４５℃にて行った。ライゲーション効率はアガロースゲル電気泳動により視覚的に決定され，Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ産物と比較した。
【実施例６】
【０１１０】
実施例６−二本鎖環状ＤＮＡの濃縮
Ｔ４ ＤＮＡによるライゲーション産物をエタノール／塩沈殿し，製造業者の推奨に従い５ＵのＡＴＰ依存性ＤＮａｓｅを含有する２０μｌのＰｌａｓｍｉｄ ＳａｆｅＴＭＤＮａｓｅ緩衝液（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ）に再懸濁した。３７℃で３０分静置した後，ＤＮａｓｅ酵素を６５℃で２０分間反応させて熱失活した。反応効率はアガロースゲル電気泳動によって視覚的に決定し，適切な制限酵素によって再度直鎖状に切断できる環状ｄｓＤＮＡのみが存在することを確認した。
【実施例７】
【０１１１】
実施例７−増幅されたＤＮＡのマウスにおける発現
直鎖状のもの，ホスホロチオ酸化された直鎖状のもの，環状のもの，Ｐｌａｓｍｉｄ−ＳａｆｅＴＭＡＴＰ−依存性ＤＮａｓｅ（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）処理された環状のものを含む様々な形状のＬｕｃ−ＤＵが調整された。１μｇの様々な形状のＬｕｃ−ＤＵをマウス当たり２００μｌの最終容量，Ｎ：Ｐ比率１５：１でＰＢＳ中にてＭＡＡ−ＰＥＩと複合体を形成させた。各群は５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスからなり，マウスに対し単一形式のＭＡＡ−ＰＥＩ−Ｌｕｃ−ＤＵを尾部静脈から麻酔無しに投与した。マウス肺を投与から２４時間後に回収し，ルシフェラーゼ活性測定用緩衝液にホモジナイズした。ルシフェラーゼ遺伝子発現はＰｒｏｍｅｇａのＢｒｉｇｈｔ−ＧｌｏＴＭキットを用い，製造業者の取扱説明書に従い測定した。
【０１１２】
【表１】
【０１１３】
ＤＮＡにＭＡＡ−ＰＥＩを複合させないその他の実験において，ルシフェラーゼ酵素に対する発現カセットをより強いプロモーターに置換し，先述の実験を繰り返した。結果を以下の表にまとめる。
【０１１４】
【表２】
【０１１５】
“裸の”ＤＮＡを用いた実験も行った。この実験においては，ルシフェラーゼ遺伝子を発現する様々なＤＮＡ１５μｇを，担体を添加することなしに皮内投与によってマウスに導入した。投与部位としては尾の上部及び中間部を選択した。投与から２４時間後，実験動物を殺し，尾の上部及び中間部を解剖してホモジナイズし，先述のとおりルシフェラーゼ活性を評価した。これらの実験の結果を以下にまとめる。
【０１１６】
【表３】
【実施例８】
【０１１７】
実施例８−マウスにおけるＨＩＶ−１タンパクｇｐｌ６０に対する遺伝的免疫付与
ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ−１）エンベロープタンパクｇｐｌ６０の改変型（ｇｐｌ４５ΔＣＦｌ；Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ２００２； ７６： ５３５７−６８； Ｋｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ２００３； ７７： １２７６４−７２）を発現する真核生物カセットを鋳型として用い，直鎖状ｇｐｌ４５ΔＣＦｌ−ＤＵ発現カセットを実施例２で説明したとおり大量生成した。
【０１１８】
すべての動物実験は動物研究に対する施設内倫理委員会（Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ； ＢＣＭ）による承認を受けた。ｇｐｌ４５ΔＣＦｌタンパクを発現するスーパーコイル化したプラスミドＤＮＡ及びセルフリー増幅された直鎖状ＤＮＡ（プラスミド骨格の配列を含まない）を生理食塩水に希釈し，ＢＡＬＢ／ｃマウスの前脛骨筋に投与した。各マウスは０日目，１４日目及び２８日目に各脚に５０μｇの投与を受けた。血液サンプルは１４日目（２週間），２８日目（４週間），４２日目（６週間）及び５６日目（８週間）に回収した。生理食塩水のみを投与したコントロール群に加え，各ＤＮＡ型に対し５匹のマウスからなる群を用いた。各血液サンプル由来の血清を酵素免疫測定法（ＥＬＩＺＡ）に用い，ｇｐｌ６０に対するＩｇＧ抗体力価を評価した。簡潔に説明すると，９６ウェルマイクロ力価測定プレートを，５０ｍＭのカルボン酸緩衝液ｐＨ９．５中に１２．５ｎｇ／μＬの精製リコンビナントＨＩＶ−１ＩＩＩＢｇｐｌ６０（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）を含む溶液でコートした。ウェルを続いて０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）にて洗浄し，ＰＢＳ−Ｔに３％ＢＳＡを含む溶液でブロックした。系列希釈したマウス抗血清１００μｌ（３％ＢＳＡ中）をプレートに上層し４℃で一晩静置した。プレートをＰＢＳ−Ｔにて洗浄し，１：１０，０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ共役ヤギ抗マウス二次抗体（Ｐｉｅｒｃｅ）１００μｌで満たした。十分な洗浄後，３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（Ｓｉｇｍａ）５０μｌを添加し比色分析反応を０．５規定硫酸（Ｈ２ＳＯ４）にて停止した。最適な濃度測定は４６０ｎｍにて測定した。
【実施例９】
【０１１９】
実施例９−増幅産物の精製
最終的な形状（直鎖状，環状あるいはその他）に一度処理されると，増幅産物はセファクリルＳＦ−１０００（ＧＥＨＣ）によるゲルろ過クロマトグラフィーを用いて精製される。簡潔に説明すると，ＤＮＡは１．７ｍ×１．５ｃｍのＥｃｏｎｏカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に加えられ，１０ｍＭのトリス塩酸ｐＨ８，１５０ｍＭの塩化ナトリウム，５ｍＭのＥＤＴＡにて流出速度１ｍＬ／３．６分で溶出した。各溶出画分に含まれるＤＮＡをアガロースゲル電気泳動によって測定し，望ましい画分を回収した。続いて画分をＣｅｎｔｒｉｐｌｕｓ ３００カートリッジ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．）を用い製造業者の推奨に従って濃縮した。
【０１２０】
別の方法として，ＦＰＬＣあるいはＨＰＬＣ系に装着したＱセファロースカラムを用いたアニオン交換クロマトグラフィーを利用できる。低塩緩衝液（ＬＳＢ；１０ｍＭのトリス塩酸 ｐＨ８）に溶解したＤＮＡをカラムに上層する。カラムを１０倍容量のＬＳＢで洗浄する。ＤＮＡはレジンからカラムの２０倍容量の１０−１００％直線低濃度勾配を持つ溶出緩衝液（ＥＢ；ＬＳＢ及び３Ｍ塩化ナトリウム）により溶出した。溶出液を２５４ｎｍにおいて測定し，ＤＮＡを含むピークのみを回収した。続いてＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社のＰｅｌｌｉｃｏｎ ＩＩ ＵＦ膜を用いた限界ろ過により脱塩を行った。ＤＮＡの品質／完全性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）をアガロースゲル電気泳動にて解析した。
【実施例１０】
【０１２１】
実施例１０−セルフリー増幅されたＤＮＡの品質評価
各産物ロットには，個別の識別番号を割り当て，ＤＮＡ濃度，純度及び信頼性を決定するため一連の検査を行った。ＤＮＡ濃度は２６０ｎｍにおける吸光度によって決定した。ＤＮＡ純度は複数の方法により決定した。吸光度Ａ２６０／２８０比，リアルタイムＰＣＲ（ゲノムＤＮＡの夾雑），ＨＰＬＣ（ＲＮＡの夾雑），マイクロ−ＢＣＡ検定（タンパク含有量，Ｐｉｅｒｃｅキット）及びＬＡＬ検定（エンドトキシン含有量，Ｃａｍｂｒｅｘキット）により決定した。加えてバイオバーデン検査を行い最終産物の無菌性を確認した。各検定の都度，薬品業者が定めた仕様に従う必要があった。
【０１２２】
【表４】
【実施例１１】
【０１２３】
実施例１１−ウサギにおけるＢ型肝炎ウイルスに対する遺伝的免疫付与
Ｂ型肝炎ウイルス小表面抗原（ＨＢｓ（Ｓ）； Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９９３； Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． ２： １８４７−１８５１．）を鋳型として利用し，直鎖ＨＢｓ（Ｓ）−ＤＵ発現カセットを実施例２で説明したように大量生成した。３匹の雌ＮＺアルビノウサギからなる群を０日目，２８日目，及び５６日目において各回の合計投与量４００μｇのプラスミドあるいはセルフリー増幅された同等量の直鎖ＤＮＡを両側（後肢）筋内投与することにより免疫付与した。各サンプル由来の血清を０日目，２８日目，４２日目，５６日目及び６３日目に回収し，確立されたＥＬＩＺＡ法により解析し液性免疫反応の程度を決定した。図９はＨＢｓ（Ｓ）スーパーコイル化プラスミドあるいはセルフリ−ＨＢＶｓ（Ｓ）−ＤＵ直鎖ＤＮＡで免疫付与したウサギ３匹に由来する血清の，２８日目及び６３日目（０日目で正規化した）のＥＬＩＺＡ解析吸光度を示す。
【実施例１２】
【０１２４】
実施例１２−マウスにおけるインフルエンザＨＩＮＩウイルスに対する遺伝的免疫付与
各実験につきＢＡＬＢ／ｃマウスを５匹ずつ用いた。すべての動物実験は動物研究に関する施設内倫理委員会（Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ； ＢＣＭ）の承認を受けた。インフルエンザＡ／プエルトリコ／８／３４（Ａ／ＰＲ８；ＨＩＮＩ）をＢＣＭの呼吸器病原体研究ユニットより入手した。ＤＮＡによる免疫付与はＰＢＳ中の５０μｇ全核酸を用い，上述のとおり行った。ウイルス系統Ａ／ＰＲ８／３４（ＨＡ）由来のインフルエンザヘムアグルチニンのオープンリーディングフレームをｐＣＡＧ−ＨＡ−ＷＰＲＥプラスミド（Ｇａｒｇ ｅｔ ａｌ， ２００４， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７３（ｌ）：５５０−８）より単離し，ｐＣＭＶ−ＭＣＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングしてｐＣＭＶ−ＨＡを作製した。プラスミド骨格を除いたＣＭＶ−ＨＡ発現カセットを実施例２で説明したように増幅した。動物には３回，０週目，２週目及び６週目において投与した。５つの異なる実験を実施した。１）マウスを５０μｇのｐＣＭＶ−ＨＡにより免疫付与した。２）マウスを５０μｇのＨＡ−ＤＵにより免疫付与した。３）マウスを２５μｇのＨＡ−ＤＵ及び２５μｇのあらゆる発現カセットの骨格を除いたプラスミドＤＮＡ（エンプティーベクター，ｐＥＶ）の混合物により免疫付与した。４）マウスを１６．７μｇのＨＡ−ＤＵ及び二つのサイトカイン発現プラスミド，すなわち１６．７μｇのｐＣＭＶｉ−ＧＭＣＳＦ及び１６．７μｇのｐＣＡＧＧＳＩＬ１２（Ｏｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２００５， Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｅｒｏｓｏｌ ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ （Ｉｎ Ｐｒｅｓｓ））の混合物により免疫付与した。５）マウスを１６．７μｇのｐＣＭＶ−ＨＡ及び上述の二つのサイトカイン発現プラスミドの混合物により免疫付与した。
【０１２５】
免疫付与の８週間後，血清サンプルを各動物から回収し，ウイルス中和力価解析を行った。免疫付与実験において回収された血清を熱失活し（５６℃で３０分），標準化されたマイクロ中和試験を用いて中和効率をインビトロで評価した。簡潔に説明すると，血清サンプルを９６ウェル丸底型組織培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ ３０７７）２つを一式とし，ＭＥＭを希釈液に用い１：２に系列希釈した。その後約１００メジアンの５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）のＡ／ＰＲ８ウイルスを各ウェルに添加した。検査ウイルスの逆滴定もこの時点で行った。血清及びウイルスを含むプレートを３７℃にて９０分間静置し，後に丸底型プレートの内容物を単層のＭａｄｉｎ Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞を含む新しいプレートに移した。３７℃にて一晩静置した後，各ウェルの培地を除去し２μｇ／ｍｌのＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎトリプシン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．， カタログ番号 ３２Ｃ５４６８），ペニシリン及びストレプトマイシンを含み，血清を含まないＭＥＭで置換した。４日後，洗浄しＰＢＳ中に再懸濁した０．５％トリ血球細胞懸濁液（ｒｂｃ）を各ウェルに添加した。血清コントロールウェル中のｒｂｃが堅固なボタンを形成した時点で，各ウェルのヘムアグルチニン化パターンを読み取り記録した。ｒｂｃの堅固なボタンが見られるウェルはＦＶ陰性と考えられ，拡散したヘムアグルチニン化パターンが記録されたウェルはウイルスに対し陽性であると考えられた。図１０は，様々な遺伝的免疫付与実験に対しウイルス複製が阻害される限界希釈率として記録したウイルス中和力価を示す。
【産業上の利用可能性】
【０１２６】
本発明は高品質核酸の合成方法及びその使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】図１は有用な鋳型を作成する多様な機構を示す。例えば，鋳型はプラスミド改変，ＰＣＲ増幅，化学合成，あるいはｃＤＮＡ合成によって生成される。
【図２】図２は本発明の一実施態様に関するＲＣＡ法に基づく増幅工程を示す。この工程は環状の鋳型からコンカテマーを合成するためにポリメラーゼを用いる。コンカテマーは少なくとも一つの欠損のない発現カセットを含む小さいフラグメントに処理される。合成された産物は短い直鎖状ユニット，環状化された核酸（ＣＮＡｓ），あるいはスーパーコイル化された環状核酸（ｓＣＮＡｓ）として用いることができる。
【図３】図３は本発明のその他の実施態様に関する方法を示す。この方法は二本鎖鋳型のフォワード鎖（Ａ）及びリバース鎖（Ｂ）を別々に増幅する。二つの分離した反応槽において，各鎖を増幅し環状化して一本鎖環を形成する。各槽においては鎖特異的なプライマーを用いて一つの鎖のみが増幅される。その後，制限酵素切断部位の配列（ＯＲ１あるいはＯＲ２）からなる二番目のオリゴヌクレオチドを一本鎖におけるあらかじめ設計された部位にアニール化させ，短い断片の二本鎖鋳型が形成され制限酵素による切断が可能となる。切断に続き，変性させる前に，二本鎖末端をＤＮＡリガーゼにより環状化する。ライゲーションに続き，オリゴヌクレオチドを変性させ一本鎖環を形成させ，次に相補的な一本鎖環と結合させて単量体のみを含む二本鎖環を形成させる。本方法は二量体，三量体及び他の多量体副産物の形成を最小にする。
【図４】図４は本発明の一実施態様に関するＲＣＡ工程のスケールアップを示す。この工程は鋳型，プライマー，緩衝液要素及び酵素の，指定時間における段階的な添加及び指定温度への変化を含む。これにより産物の大量生成を短期間に行う効率的な方法を提供できる。ライゲーションに先駆けて反応容量を希釈することにより単量体環状産物の生成が優勢となる。
【図５】図５は自動化された増幅装置の設計を示す。（Ａ）は多数の１ｍｌ以下の容量からなる個々の反応により多数の異なる鋳型を同時に増幅するために用いられるモデルを示す。（Ｂ）は大量の単一ＤＮＡ産物合成を可能にする単一の槽の利用を示す。（１）反応パラメーターをコントロールするためにプログラム可能なコンピューターへのアクセス部；（２）反応パラメーターを評価し調整するためのモニター：（３）酵素，緩衝液，及び他の構成物を含むストック溶液のための温度調節されたチャンバー；（４）反応槽に試薬を添加するための分注口；（５）温度調節された反応槽；（６）多数のウェルを持つディスペンサー；（７）多数のウェルをもつ反応槽プレート；（８）多数のウェルをもつプレートのための温度調節されたチャンバーである。
【図６】図６は粘性のある反応混合液を混合するための様々な方法を概略的に示したものである。（Ａ）プロペラ様混合槽；（Ｂ）孔の開いたディスクによる混合槽；（Ｃ）蠕動ポンプを用いた再循環混合槽である。（Ｃ）においては，（１）は（２）に保持された試薬を目盛測定により添加するための調節可能な自動化制御部及び引き込み口である。（１）の調節可能な制御部により試薬と反応混合液を制御して混合することができ，送出口の反対側に位置するチャンバーに試薬の加えられた反応混合液を戻すことにより反応混合液を全体的に混合することができる。試薬なしに連続的なポンプによる送り込みを行うことで完全な混合が容易となる。
【図７】図７は分子内ライゲーションの工程を示す。槽（Ｂ）におけるＤＮＡ増幅及び切断の後，反応混合液をゆっくりとライゲーション混合液を含む二番目の槽（Ａ）に加える。槽（Ａ）にＤＮＡをゆっくりと加えることによりＤＮＡが十分に希釈され単量体ＣＮＡ形成が容易となる。
【図８】図８は本発明の一実施態様に従って合成されたプラスミド，短い発現カセット（合成ＤＮＡ，ｓｙｎＤＮＡ），及びコントロール溶液により免疫付与したＢａｌｂ／ｃマウスにおいて生産されたｇｐｌ６０に対するＩｇＧ抗体の力価を示す。
【図９】図９は本発明の一実施態様に従って調製されたＢ型肝炎ウイルス表面小抗原（ｓｍａｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ）（ＨＢｓ（Ｓ））の配列を含むプラスミドあるいは合成ＤＮＡ（発現カセット）を用い，ウサギに免疫付与した結果を示す。これらの結果は本発明の合成発現カセットがウサギにおいて免疫反応を誘導するために効果的であることを明確に示す。
【図１０】図１０はＢＡＬＢｃマウスのインフルエンザＨ１Ｎ１ウイルスに対する免疫付与の結果を示す。図はウイルス中和力価を様々な遺伝子による免疫付与実験に対しウイルス複製が阻害される最終希釈率として記録したものを示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は高品質核酸の合成方法，及びその使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子導入，遺伝子治療及びＤＮＡワクチン接種におけるＤＮＡに基づく治療法の開発により，純度，有効性，効能及び安全性に関して厳密な品質基準を満たすＤＮＡの大規模な生産に対する需要が高まってきた。標的組織における遺伝子発現の効能及び持続期間は比較的低いため，通常多くのＤＮＡがそのような用途に必要とされていた。
【０００３】
現在の技術状態は，バクテリア培養液中のプラスミドの増殖及び高額な精製技術に依存して，治療に利用可能な品質の核酸を生成している。バクテリア及び他の細胞源からの典型的なプラスミド精製手順には，フェノール，臭化エチジウム及び塩化セシウムを含む有機化合物，変異原物質及び毒性化合物及びリゾチーム，プロテイナーゼＫ，リボヌクレアーゼＡ（ＲＮａｓｅＡ）等の酵素を用いる方法がある。これら全てはＤＮＡに基づく治療法において夾雑物として投与された場合，健康被害をもたらす可能性を含んでいる。このような手順にはまた，意図しない汚染性トランスポゾン及びその他の外来性エピソーマルＤＮＡがプラスミドに混入する危険性を孕んでいる（Ｈａａｐａ， Ｓ．，Ｎｕｃ．Ａｃ．Ｒｅｓ．，２７（１３）： ２７７７−８４， １９９９）。また宿主細胞核酸，その他の細胞タンパク及びエンドトキシンの残留物が混入する可能性もある。このような不純物はＤＮＡ取り込みの効率を低減させるだけでなく，量依存的な毒性につながる。これらの不純物を除去するため，一般に受け入れられている精製方法は，アニオン交換，アフィニティー，及び分子サイズ排除等の複数のクロマトグラフィー手順を利用している。これらの手順は費用がかかるものである。
【０００４】
米国特許第５，５６１，０６４号（‘０６４）は，薬理学的に許容されるレベルのプラスミドをバクテリア培養液から得るための試みを示した。この特許はバクテリア細胞を溶解するためにポリエチレングリコールを用い，一連のクロマトグラフィーによる分離を利用して有毒な化学物質を付加することなく遺伝子治療に適用可能な，より純度の高いＤＮＡを生産する方法について述べたものである。この方法は精製時に付加的な要素は加えられないが，有毒となる可能性がある細胞環境中においてのプラスミド生産に依存したものである。
【０００５】
対照的に，セルフリー核酸増幅は，合理化された生産と単純化した精製法により，顕著な費用削減を提供することができ，バクテリアによってプラスミドを合成した場合に伴う不純物を除去することができる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のようなインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）増幅は，１９８０年中盤から研究にうまく利用されている。ＰＣＲは迅速かつコストが低い。しかしながら，ＰＣＲは急速な温度サイクリングに依存しており，大規模の増幅には実用的ではない。
【０００６】
インビトロの定温増幅技術が知られているが，主として核酸複製の機構を研究するために利用されてきた。１９８４年に，ＢｌａｎｃｏとＳａｌａｓは，ファージ由来の（ｐｈａｇｅ）Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼを単離した。それは，高度に逐次前進性の（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｅ）鎖置換ポリメラーゼである。Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼは，Ｐｈｉ２９ゲノムの完全長である７０キロベース超の長さのＤＮＡ鎖を確実に複製することができる（Ｂｌａｎｃｏ，Ｌ． ａｎｄ Ｓａｌａｓ，Ｍ．，ＰＮＡＳ ８１（１７）：５３２５−５３２９，１９８４）。効率的なインビトロでの定温ＤＮＡ増幅のためには，Ｐｈｉ２９ポリメラーゼは端末タンパク質として二本鎖ＤＮＡ結合タンパク及び一本鎖ＤＮＡ結合タンパク（ＳＳＢ）を必要とする（Ｂｌａｎｃｏ， Ｌ． ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９１：１２１９８−２０２， １９９４）。
【０００７】
米国特許第５，００１，０５０号（‘０５０）は，ＤＮＡ塩基配列決定，ＤＮＡ増幅，及び１０キロベースを超えるＤＮＡ合成におけるＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼの使用を主張するものである。米国特許第５，１９８，５４３号（‘５４３）及び第５，５７６，２０４号（‘２０４）はシークエンス反応改善のためのエキソヌクレアーゼ欠損型Ｐｈｉ２９ポリメラーゼを含め，この酵素の改良型を請求している。しかしながら，これら改良されたポリメラーゼはフィデリティ（ｆｉｄｅｌｉｔｙ）が低く，シークエンス反応のみに有効であった。
【０００８】
本質的に，プラスミド及び数種のウイルスＤＮＡを含め，環状ＤＮＡ分子の複製は頻繁にローリングサイクル増幅（ＲＣＡ）によって起きるが，ここにおいて環状ＤＮＡ鋳型は直列反復の長いコンカテマー（ｃｏｎｃａｔａｍｅｒ）へと複製される。コンカテマーは次に切断されタンパク膜中へとパッケージされる（Ｄｅａｎ， Ｆ．Ｂ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． １１： １０９５−９９， ２００１）。ＲＣＡを用いて，複数の研究室がＤＮＡ塩基配列決定，クローニング，ライブラリ構築，及びスクリーニングを含め様々な目的に用いられるＤＮＡ増幅法を開発した（Ｉｎｏｕｅ−Ｎａｇａｔａ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １１６： ２０９−２１１，２００３）。
【０００９】
米国特許第５，６５４，０３３号，第６，２１０，８８４号，第６，３１６，２２９号，第６，３４４，３２９号，及び第６，７９７，４７４号（それぞれ‘０３３，‘８８４，‘２２９，‘３２９，及び‘４７４）はＲＣＡ法に関するが，特定のサンプルにおける標的メッセージのコピー数の同定など，研究用途のみに限定されていた。この方法は始めにＤＮＡサンプルを環状鋳型に変換し，制御された（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ）サイクル増幅によってもともとのメッセージの相対的な量を同定するものである。その他の応用例は，このような定量的増幅と標的遺伝子の突然変異遺伝子（ｍｕｔａｎｔ ａｌｌｅｌｅ）の検出を組み合わせたものである。
【００１０】
米国特許第６，２８０，９４９号及び第６，１２４，１２０号は，ランダムプライマーを用いた全ゲノム増幅におけるＲＣＡの応用を教示している。いくつかの実施例では，ゲノムの特異的領域を増幅させるため，ランダムプライマーと特異的プライマーを組み合わせて用いている。
【００１１】
米国特許第６，３２９，１５０号は新規に合成されたＤＮＡ上で入れ子になるよう設計されたプライマーを用い，既に増幅された産物の二次的な合成を起こす改良ＲＣＡ法を教示している。この方法によって，増幅は幾何学級数的に起こり，ＰＣＲに代わって多数の標的を同時に検出する定温の代替法が提供される。米国特許第６，２５５，０８２号は長い末端リピートをこれらの入れ子状の（ｎｅｓｔｅｄ）増幅を容易にするため利用する方法を教示している。これらの特許はサンプルにおける特定の配列の存在を速やかに同定するためＲＣＡを改良している。
【００１２】
米国特許第６，６４２，０３４号は複数のプライマー及び鎖置換ＤＮＡポリメラーゼを用いた増幅の一般的方法を教示している。この方法は標的配列の同定，全ゲノムの増幅，標的配列あるいは変異の検出，アドレスタグの合成及び検出，及びオリゴヌクレオチドの合成に利用される。
【００１３】
その他のＲＣＡの応用には，配列決定，クローニング，マッピング，遺伝子型決定，プローブ作製，及び診断スクリーニングがある。米国特許出願公開第２００３／０２０７２６７号では３’，５’−エキソヌクレアーゼ活性を持つ異なるＤＮＡポリメラーゼにより，複数のプライマーを用いて標的サークルを同時に増幅し，増幅効率を改善する例が挙げられている。
【００１４】
現在まで，その他のポリメラーゼの利用も時折取り上げられたものの，ほとんどのＲＣＡ技術はＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼの利用に重点を置いていた。これはＰｈｉ２９ポリメラーゼの生産効率が高いために核酸の長いコンカテマーを短時間に合成することができ，また鎖置換活性があるため接触したあらゆる二次プライマーを置換しつつ，連続的に新規核酸配列合成できることが理由に挙げられる。加えて，大量の高いフィデリティーをもつ核酸を温度サイクリングなしに比較的短期間で生産できる。Ｐｈｉ２９ポリメラーゼはエラー比率が４×１０−６と非常に低い。（Ｅｓｔｅｂａｎ， Ｊ．Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，２６８（４）：２７１９−２７２６，１９９３）。
【００１５】
ほとんどのＲＣＡ技術はＰｈｉ２９ポリメラーゼを使用しているにも関わらず，米国特許第６，５７６，４４８号及び第６，２３５，５０２号はＲＣＡ法におけるバクテリアＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩＩ）の使用を開示している。Ｐｏｌ ＩＩＩはＤＮＡ合成効率を上昇させる（一秒あたり約７００−８００ヌクレオチド）クランプ様の活性を持つことが報告されており，ヘリカーゼあるいは安定化タンパク質を付加することで最適化可能である。バクテリアＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｐｏｌ Ｉ）もまた１００ｂｐ以下の小さい鋳型増幅のＲＣＡ法において利用されている（Ｆｉｒｅ ａｎｄ Ｘｕ， ＰＮＡＳ ９２：４６４１−４５，１９９５）。Ｐｏｌ Ｉは主に一本鎖鋳型を用い，極端に短い二本鎖鋳型にしばしば伴う立体障害なく，小さい環状鋳型がすぐに形成される。米国特許第５，６１４，３６５号はＴ７ＤＮＡポリメラーゼの配列を含み，効率が５００−倍まで上昇する改良Ｐｏｌ Ｉを開示している。このポリメラーゼはデオキシヌクレオチド及びダイデオキシヌクレオチドを区別する能力が減少しており，シークエンシング反応への利用に好適である。
【００１６】
一般的に，ＲＣＡ反応は一本鎖あるいは二本鎖核酸鋳型を用いることができる。Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼは一本鎖あるいは二本鎖鋳型を用いることができるが，Ｐｏｌ Ｉが利用できるのは一本鎖鋳型のみである。加えて，Ｐｈｉ２９ポリメラーゼはＲＮＡあるいはＤＮＡ鋳型を用いることができる。それゆえ，Ｐｈｉ２９ポリメラーゼはＲＣＡ法及び他の増幅法においてより適用範囲が広い。
【００１７】
米国特許第６，３６８，８０２号，第６，０９６，８８０号及び第５，７１４，３２０号はＲＣＡ法で適切なポリメラーゼ及び小さい一本鎖環状ＤＮＡ鋳型を用いＲＮＡあるいはＤＮＡオリゴヌクレオチド（２８−７４ヌクレオチド長）を合成する例を挙げている。このように合成されたＤＮＡオリゴヌクレオチドは細胞内における発現に必要とされる遺伝的情報を欠いている。
【００１８】
Ｍｏｒｅｎｏ Ｓらは最小限の，免疫原生として同定可能な遺伝子発現ベクター（ＭＩＤＧＥ）をＤＮＡワクチン生産のために開発した（Ｖａｃｃｉｎｅ，２２： １７０９−１７１６， ２００４）。これらのベクターは真核生物の遺伝子発現及び免疫反応の誘導に最小限の配列のみを含む。加えて，直鎖上の発現カセット末端は，その寿命及び発現効率を向上させるために，ヘアピン状に改変することが可能である。この方法は大きな進歩を意味するものの，バクテリア培養液からプラスミドを精製した後不必要なバクテリア配列の除去を行わなければならず，手間のかかる工程を含むものである。ＭＩＤＧＥ工程は前駆体としてやはりバクテリア由来のプラスミドに依存している。
【００１９】
同様に，Ｃｈｅｎ， Ｚ．Ｙ．らはバクテリア配列をベクターから除去するミニサークルを開発した。彼らはシスに結合されたバクテリア配列が真核生物の発現を抑制できることを示した（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １６： １２６−１３１， ２００５）。彼らはまた，バクテリアの遺伝物質を全く連結していない直鎖状発現カセットは，バクテリアプラスミド骨格に連結された発現カセットを有する共有結合により閉鎖された環状プラスミドに比べ１０−１００倍高効率で発現することを示した。バクテリアフリーの発現カセットの発現はトランスフェクションの後９０日間まで継続する。
【００２０】
このグループはこの工程を米国特許出願公開第２００４−０２１４３２９号に記述しており，環状発現カセット，それらから合成される治療用組成物，及び標的細胞に環状発現カセットを導入する方法を教示している。加えて，この応用は発現カセットに隣接するａｔｔＢ及びａｔｔＰ配列を利用し組み換えによるバクテリア配列の除去を容易にしている。通常条件におけるバクテリア培養に続いて，リコンビナーゼをコードする誘導カセットを有するバクテリアにおいては，リコンビナーゼの合成が誘導され，充分量のプラスミドが合成された後ａｔｔＢ及びａｔｔＰ部位における組み換えが誘導される。細胞内組み換えは二つの独立したミニサークルを作り出す。一方は発現カセットを有し，他方はバクテリアの遺伝物質を有する。バクテリア遺伝子の夾雑を最小限にするために合理化された方法ではあるが，この方法はやはりバクテリア培養中でのプラスミド合成に依存している。
【００２１】
ＤＮＡを用いた治療への適用は安全性及び効果基準を厳密に順守することが必要である（Ｐｒａｚｅｒｅｓ， Ｄ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １７（４）：１６９−１７３， １９９９）。大規模設備で生成されたプラスミドＤＮＡは夾雑なゲノムＤＮＡ（＜１０ｎｇ／投与量），宿主タンパク質（＜１０ｎｇ／投与量），ＲＮＡ（０．８％アガロースゲルで検出されない）及びエンドトキシン（＜１ユニット／ｋｇ体重，あるいは＜０．１ＥＵ／μｇプラスミド）が含まれていないことが必要である。加えて，プラスミドは無菌状態であるべきで，より効率よく発現されるスーパーコイル状であることが望ましい。その他最終調製物から除去される必要がある夾雑物には，臭化エチジウム，クロロホルム，フェノール，リゾチーム，プロテイナーゼＫ，ＲＮａｓｅＡ等の精製試薬及び精製カラムから浸出する可能性があるアニオン交換体由来の第４級アミン等の夾雑物が含まれる。
【００２２】
これらの純度基準は主に大規模でしばしば高額な精製技術をバクテリアに産生されたプラスミドに利用することで対応されてきた。先述の通り，一般的に受け入れられている精製方法は主に複数のクロマトグラフィー法を用い，アニオン交換，アフィニティー，及びサイズ除去クロマトグラフィー精製の段階の組合わせを含む。治療に用いることができる品質のプラスミドをバクテリアから合成するために必要な精製方法には，特別な装置，高価なレジン，大規模な設備と長い時間が必要であるという点は重要である。現在非ＧＭＰ（研究品質）のプラスミドＤＮＡにかかる費用は最終産物１グラムあたり３０，０００−１５０，０００ドルであり，ＧＭＰ品質のＤＮＡにかかる費用はおおよそ２−３倍高い。つまり，バクテリアにより合成されたプラスミドＤＮＡから治療に用いるＤＮＡを生合成することは非常にコストが高くなりうる。
【００２３】
セルフリー増幅の利用に焦点を当てた方法では，多数のバクテリア夾雑物への曝露を回避することが可能であることから，著しいコスト及び時間の削減を提供し得る。セルフリー系に存在するものはすべて明確に区別することができる。高品質の試薬及び酵素のみを用いれば，この系には微量の夾雑物しか存在しない。このように，最終精製は透析，限外ろ過及び／又はゲルろ過，等の単純な方法を用いることが可能であり，精製に必要な反応混合物は少量でよい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
現在まで，ＲＣＡ系は核酸のセルフリー合成を遺伝治療用，ＤＮＡワクチンあるいはその他の治療への応用に適合させていなかった。対照的に，ほとんどの文献はＲＣＡ系の有用性が，配列決定，ゲノム増幅，ゲノム解析，標識，クローニング，ＰＣＲ型の応用，ライブラリの構築及びその他の解析への応用を含め，厳密に診断あるいは研究目的に限定されると示唆している。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本発明の一つの側面はインビトロのＲＣＡ系を最適化し，合理化された発現カセット，高度に特異的あるいは無作為のプライマー，高いフィデリティを持つポリメラーゼ，及び最小限の緩衝系を用い核酸大量調整（例えば＞１ｍｇ）を行うセルフリー系を構築することに関する。この系では核酸の大量合成を，小さい容量で，短期間に最小限でかつ費用のかからない精製方法で行うことが可能である。このように，この系は，治療に利用できる高品質な核酸を，あらゆる基礎解析あるいは研究目的のため，さらに重要なことには治療上の使用のために合成可能である。
【００２６】
本発明は治療，診療，診断，及び研究に用いられる高品質の核酸を安価に大量合成する目的でいくつかの技術を組み合わせている。本発明の方法は同程度の容量のバクテリア培養液で合成されるものと比較して２５０−３００倍の核酸を合成することができる。本発明において，使用された試薬に最小限含まれるものを除いて，エンドトキシンの混入源は存在しない。さらなる有利な点として，研究用の小さいフラスコで発酵様の大量合成が可能である点，必要な試薬が最小限の数である点，比較的短い期間で大量合成が行える点，及び合理化された精製方法が含まれる。併せて，これらの利点は治療に利用する高品質核酸の大量合成を安価に行う方法となる。
【００２７】
本発明の一つの実施形態においては，プラスミド選択及び複製にバクテリアにおいて必要とされる典型的な遺伝的配列を欠損する改変されたプラスミドが鋳型として用いられる。あらゆる環状核酸の鋳型を利用することが可能である。本発明の実施態様にしたがって，目的とする遺伝子近傍に宿主での発現及び発現産物の生成に必要な遺伝子要素が存在する環状発現カセットが鋳型となりうる。
【００２８】
通常のプラスミドも本発明の方法を用いて複製可能であるが，余分な遺伝子配列を含まない合理化された鋳型は様々な利益を与える。目的とする配列の発現を抑制する可能性がある外来配列を除去する。より小さな構成（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）はよりコンパクトであり，標的細胞により効率よく組み込まれ，トランスフェクション効率がより高くなる。また，より少ない材料でより大量の発現カセットを生成できること，最終産物のフィデリティが統計的に向上すること，及び大規模な精製を行う必要が無いことから，より費用効率が高いといえる。
【００２９】
無作為プライマーあるいは配列特異的プライマーを用いることが可能であるが，大規模増幅においては配列特異的プライマーがより効率的で経済的である。プライマーの大きさは４から２０ヌクレオチド超までの範囲をとることができ，親和性の向上，安定性及び長期保存のため改変された塩基及び／又は骨格を含むことができる。一つの実施態様においては，ホスホロチオエート末端改変を含む特異的プライマーを大量の（１ｍｌ中に約１．５ｍｇ）核酸を合成するために用いることができる。
【００３０】
増幅工程には，緩衝液及び温度条件をポリメラーゼの特異的な要求に対応するように調節すれば，増幅反応にはあらゆるポリメラーゼを用いることができる。例えば，高温ｔａｑ様のポリメラーゼを用いる際に必須の変性及びアニーリング段階が含まれる。しかしながら，本発明の好ましい実施態様は，Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのような逐次前進性の鎖置換性ポリメラーゼを用いており，熱サイクリングなしに効率的に鋳型を増幅させるものである。好ましい実施態様は，Ｐｈｉ２９あるいはＰｈｉ２９様ポリメラーゼを用いるものであるが，Ｐｏｌ Ｉ及びＰｏｌ ＩＩＩ，Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼのような他のポリメラーゼ，及びその派生物も用いることができる。本発明はまた，効率及び／又はフィデリティを改善するよう設計された，その他の改変されたポリメラーゼあるいはキメラポリメラーゼも用いることができる。
【００３１】
増幅に続き，核酸産物は意図する使用を容易にするように更なる処理を加えることができる。検出，同定あるいは配列決定を含む研究目的には，通常はコンカテマーの短い直鎖状ユニット（送達（ｄｅｌｉｖｅｒｙ）ユニット）のみが要求され，これは制限酵素による切断あるいはせん断もしくは特異的，光解離性ヌクレオチドにおいて誘発される切断のように物理的あるいは化学的方法によって得られる。細胞へのトランスフェクションは様々な形態において成されるが，高効率の取り込みは一般的に環状あるいはスーパーコイル化された核酸によって得られる。一つの実施態様は，増幅に続くＤＮＡリガーゼを用いたライゲーション工程を含み，環状核酸（ＣＮＡｓ）を形成する。別の実施形態では，リコンビナーゼあるいは同様な酵素を用いて送達ユニットを円形にして環状核酸とする。また別の実施態様は，ＤＮＡジャイレース（ｇｙｒａｓｅ）を用いた環状産物をスーパーコイル化しスーパーコイル化ＣＮＡ（ｓＣＮＡ）を形成する付加的な段階を含む。
【００３２】
産物の真核細胞における発現を意図する場合，培養の場合においても治療利用の場合においても，細胞による取り込みが重大である。トランスフェクションは環状，スーパーコイル化されたＣＮＡあるいは直鎖ユニットの内部塩基及び／又は末端の改変により安定化された特別に設計された直鎖状核酸を用いて成される。このような改変に含まれるのは，クレノーフラグメント様酵素を用いた挿入による末端の平滑化；適切に改変された塩基を用いた直鎖末端のホスホロチオエート化；インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で直鎖の安定化あるいは分解を最小にする，増幅工程あるいはそれに続くコンカテマー切断工程中における他の改変された塩基の取り込み；及び速やかな取り込み及び／又は細胞への取り込み後長期間にわたるカセット発現を容易にする，安定化配列を含む発現カセットの設計である（Ｋａｙ， Ｍ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃ． Ｔｈｅｒ． ３（３）： ４０３−４１０， Ｍａｒ． ２００１）。
【００３３】
セルフリー増幅工程に続く改変あるいは処理の程度は，産物の使用目的による。最終的に処理された産物は，その後試薬，夾雑物，及び／又はあらゆる異なる形状の産物を除去するため精製される。産物の異なる形状には，直鎖断片，開環状核酸，単量体，二量体，三量体等からなる共有結合的に閉環状となった核酸，及びスーパーコイル化した環状核酸を含む。目的の形状は特異的な適用に依存し上記の形状に変えることができる。使用する試薬の数及び必要とされる純度に応じて，産物に対しクロマトグラフィー，限外ろ過，透析，核酸沈殿，あるいは本分野で知られるその他の適切な方法を行う。ゲルろ過及び／又は透析を含むこれらの実施態様は治療利用のための高品質産物を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
本発明の実施態様は大量の高品質核酸を生産するための方法及び装置に関する。本発明の方法は治療上有用な，夾雑物が最小限である核酸産物を生産するため，ローリングサークル増幅法（ＲＣＡ）に基づくセルフリー系を用いる（図２）。
【００３５】
本発明に関連して用いられる「核酸」，「オリゴ」，あるいは「オリゴヌクレオチド」とは，ＤＮＡあるいはＲＮＡ，あるいはその類似物（例えばホスホロチオエート類似物）でありうる。核酸あるいはオリゴヌクレオチドは，改変された塩基，骨格，及び／又は末端を含んでもよい。合成骨格は，核酸に対し安定性及び／又はその他の有利な点を与えるホスホロチオエート（Ｐｔ），ペプチド核酸（ＰＣＡ），構造的に固定された核酸（ＬＮＡ），キシロース核酸（ＸＮＡ），あるいはその類似物を含んでもよい。
【００３６】
図２に示すように，本発明のある実施態様に係る方法はＲＣＡに基づくものである。この工程は環状鋳型からコンカテマーを合成するためにポリメラーゼを用いる。コンカテマーは少なくとも一つの欠損のない発現カセットを含むより小さいフラグメントへと処理される。合成された産物は短い直鎖状ユニットとして利用されるか，あるいは環状化された核酸（ＣＮＡｓ）あるいはスーパーコイルの環状核酸（ｓＣＮＡｓ）へとさらに処理される。
【００３７】
本発明の方法はＤＮＡあるいはＲＮＡの鋳型から開始できる。ＲＮＡ鋳型から開始したものはｃＤＮＡ鋳型を合成するため，トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素のような逆転写酵素を含む。図２に示すように，本発明の方法で用いられる環状の鋳型を調製するために，当該技術分野において知られているあらゆる方法を用いることができる。これらの方法のうちいくつかを図１を参照しつつ詳細に記述する。
【００３８】
いくつかのポリメラーゼに対し，鋳型を安定化し増幅効率を改善するために一本鎖結合タンパクを利用することができる。誤りを修復するために増幅反応に付加的な酵素を含めることもできる。変異スプライシングタンパク（ＭｕｔＳ）のようなタンパクを介したエラー修正酵素もまたポリメラーゼの全体のフィデリティを効果的に改善し増幅反応中あるいは反応後に用いることができる（Ｃａｒｒ， Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃ Ａｃ Ｒｅｓ ３２（２０）： ｅｌ６２， ２００４）。
【００３９】
目的の用途に応じて，本発明の方法で用いるＤＮＡポリメラーゼには，原核生物，菌類，ウイルス，バクテリオファージ，植物あるいは真核生物のあらゆる既知のＤＮＡポリメラーゼを用いることが可能であり，核酸分子の合成が可能なホロ酵素及びあらゆる機能的なホロ酵素の一部あるいは改変されたポリメラーゼを含んでもよい。有用なＤＮＡポリメラーゼとしては，バクテリオファージｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ，他のｐｈｉ２９様ポリメラーゼ（例えば，ファージＭ２ ＤＮＡポリメラーゼ，ファージＢ １０３ ＤＮＡポリメラーゼ，あるいはファージ ＧＡ−１ ＤＮＡポリメラーゼ），ファージpｈｉ−ＰＲＤ１ポリメラーゼ，ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ，ＤＥＥＰ ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ，ＫｌｅｎＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ，ＤＮＡポリメラーゼＩ，ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント，ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素，Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼ，Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼホロ酵素，Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ，Ｂｓｔポリメラーゼ，ｒＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ，Ｎ２９ ＤＮＡポリメラーゼ，ＴｏｐｏＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ，及びＴｈｅｒｍｏＰｈｉＴＭＤＮＡポリメラーゼがある。本発明の好ましい実施態様は，Ｐｈｉ２９ポリメラーゼ，Ｐｈｉ２９様ポリメラーゼ，あるいは他のフィデリティの高いポリメラーゼ（例えば，ハイブリッド融合ポリメラーゼ）を用いる。
【００４０】
本発明の好ましい実施態様は，フィデリティの高い塩基取り込み条件でＤＮＡ増幅を行うため鎖置換ポリメラーゼを用いる。本発明に関連して，フィデリティの高い「ＤＮＡポリメラーゼ」とは，推奨される条件において，エラー取り込み率が一般的に用いられるＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ，ＫｌｅｎＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ，あるいはＴ７ ＤＮＡポリメラーゼのような熱安定的なＰＣＲポリメラーゼに関連した値（１．５×１０−５−５．７×１０−５）に等しいかあるいはそれよりも低いものを指す。付加的な酵素は誤った取り込みを最小限にするために反応に付与することができ，ポリメラーゼ反応の期間中あるいは反応後に効果的にポリメラーゼのフィデリティを向上させるＭｕｔｓ等のタンパクを介したエラー修正酵素を含む（Ｃａｒｒ， Ｐ． ｅｔ ａｌ， Ｎｕｃ Ａｃ Ｒｅｓ ３２（２０）： ｅｌ６２， ２００４）。
【００４１】
同様に，フィデリティの高い「ＲＮＡポリメラーゼ」は，エラー取り込み率が一般的なＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のものに等しいあるいはそれよりも低い。本発明に有用なＲＮＡポリメラーゼとしては，Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ，ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ，Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ，及びそれらの改変体あるいはキメラ体が含まれる。
【００４２】
増幅反応中において，環状鋳型はデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ），リボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰｓ），あるいは改変された対応物の存在下でポリメラーゼによって鋳型の直列反復からなる長いコンカテマーを形成しながら複製される。コンカテマーは続いて制限酵素による切断あるいは物理的なせん断によって，「短い発現カセット」（ＳＥＣｓ）と呼ばれる小さな断片へと切断される。ＳＥＣは目的とする配列及び任意的に真核生物の発現配列（あるいはカセット）を含む。好ましい実施態様においては少なくとも一つの真核生物発現カセットを含むＳＥＣを用いる。従来のバクテリアにより合成されたプラスミドと異なり，本発明のＳＥＣは対象とする真核生物配列を近傍に持つ目的とする配列のみからなり，バクテリアの遺伝物質を含まない。
【００４３】
「短い発現カセット」としては，標的細胞により認識される真核生物のプロモーター；欠損のない遺伝子，遺伝子断片，あるいは目的とする特異的な配列（ＳＯＩ）といった目的とする配列；及び転写終結配列がある。短い発現カセットはライゲーション（例えば，ＣＡＮの合成）を容易にするため，あるいは直鎖状の断片を安定化するための付加的な配列を近傍に置くことが可能である。発現カセットは，望ましい近傍配列と共に，「送達ユニット」（ＤＵ）をなし，バクテリア培養液中で生産されるプラスミドの選択と複製のみに利用されていた不要な遺伝物質を含まない。真核細胞において意味を持たないバクテリアの遺伝物質を最小にすることで，高濃度の高品質で生理活性を持つＤＮＡ分子を生産することが可能となる。合成された核酸は典型的なプラスミドよりも小さく，細胞により効率よく導入され，また遺伝子導入に際して細胞内でより効率よく発現される。
【００４４】
酵素的あるいは化学的方法を用いて，ポリマー化のエラーによるミスマッチのヌクレオチドを含むＤＵを除去することにより，最終産物の均一性を改善することができる。この目的を達成するために，例えば，変異を検出するために用いられる酵素（例えば，レゾルベース，Ｔ４ エンドヌクレアーゼ ＶＩＩ，あるいはＴ７ エンドヌクレアーゼ Ｉ）あるいは遺伝子突然変異あるいは遺伝子多型を検出するために用いられる，あるいは点突然変異のハイスループットスクリーニング（例えば，ＴＩＬＬＩＮＧ）に用いられる他の酵素を用いることができる。
【００４５】
先述の通り，本発明の方法に使用する環状鋳型を調製するためあらゆる方法を用いることができる。図１は目的とする配列（ＳＥＣあるいはＤＵ）を少なくとも一つ含む有用な環状鋳型を合成するため，一般的に用いられる三つの方法を示す。一つの方法は既存のプラスミドの酵素による改変を含み，これにより真核細胞の発現カセットを含むＤＵがプラスミドから制限エンドヌクレアーゼで選択的に切り出される。ＤＵはインビボにおけるＳＯＩの発現を抑制する可能性がある複製起点あるいは抗生物質耐性メディエーター等の選択マーカー遺伝子を含まない。
【００４６】
本発明の好ましい実施形態は，欠損のない真核細胞発現カセットであってカセットの両端に近傍の配列を有するものを含む鋳型を用い（図１），直鎖ＳＥＣをＣＮＡへと環状化することを可能にしている。鋳型は，プラスミド，ミニサークルＤＮＡなど環状の鋳型に変換されるものであれば，あらゆる一本鎖核酸あるいは二本鎖核酸（ＤＮＡあるいはＲＮＡ）であってよい。パドロック・プローブを用いる場合と同様に，前もってライゲーション反応を行ってもよい（Ｂａｎｅｒ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ， Ｎｕｃ Ａｃ Ｒｅｓ ２６（２２）： ５０７３−７８， １９９８）。
【００４７】
ポリメラーゼ反応を最適化するため，使用するポリメラーゼによっては二本鎖鋳型は初めに変性させる必要がある。そのような反応においては，フォワード鎖及びリバース鎖の両方を同時に同じ反応で増幅することができる。次のプロセシングには制限エンドヌクレアーゼ，リガーゼ，及び／又はジャイレースの添加が必要となる。その後に治療への応用に用いられるＤＵを得るために産物の精製が行われる。
【００４８】
鋳型を作製するための第二の方法はより大きなＤＮＡ鋳型からのＰＣＲ増幅を含み，特異的な発現カセット近傍に位置する特異的なオリゴヌクレオチドを用いて環状化するための相対的に短いＤＵを生成する。
【００４９】
図１に示す第三の方法は，オリゴヌクレオチド（オリゴ）の化学合成を含み，一本鎖核酸あるいは相補鎖を合成した後，環状化によりＤＵあるいは発現カセットを含む鋳型を生成する。
【００５０】
増幅時において，鋳型は溶液中に懸濁させても，染色体あるいはタンパク（米国特許第５，８５４，０３３号）のような担体あるいはガラスまたはポリスチレンビーズのような固体の担体に結合させてもよい。
【００５１】
本発明の実施形態に係る別の方法を図３に示す。図３に示されるように，二本鎖鋳型のどちらの鎖も一本鎖ＤＵのコンカテマーを合成するために適切に設計されたプライマーを用いて別々に増幅される。別々に増幅されたコンカテマーは個々に特異的な制限酵素切断部位を含むオリゴと混合され制限酵素により切断される。これら断片の一時的に二本鎖となった末端は連結され環状の一本鎖産物となる（Ｄａｈｌ， Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ １０１（１３）： ４５４８−５３， ２００４）。この方法の利点は，各反応において合成される一本鎖環が連結され単一種類の単量体二本鎖環を形成し，そのため同一反応中に合成されるその他の多量体型から単量体を精製する必要性を避けることができることにある。その後単量体環はＤＮＡジャイレースあるいは同様の酵素によりスーパーコイル化し，発現カセットの取り込み及び発現効率を改善させることができる。
【００５２】
多数の実施態様において，特異的に指定の部位に結合するプライマーを有する環状の二本鎖ＤＮＡ鋳型を用い，コンカテマー合成を開始させている。プライマーは安定性を向上させるため「核酸」のあらゆる異なる変形物で構成することができ，使用するＤＮＡポリメラーゼのアニーリング温度により規定される様々な長さのものを用いることができる。プライマー配列は無作為配列あるいは特異的配列で構成され，特異的配列改変を含むよう設計すること，あるいは増幅された配列の操作あるいは解析を容易にする目的で鋳型に非相補的な標識あるいは検出配列を含めることができる。例えば，一実施態様においては，無作為のヘキサマーを用いて，プロセシング及び細胞へのトランスフェクションに際し望ましい効果を生み出すＤＵを効率的に増幅している。別の実施形態では，特異的に設計されたプライマーを用い，イニシエーション部位と一定の間隔を空けること，及び増幅反応条件を最適化するように親和性をコントロールされたプライマーを用いることにより，ＲＣＡ反応をコントロールすることを可能にしている。テトラマー程度の短い配列特異的なプライマーが特異的ＤＵを効率的に増幅するために用いられる。
【００５３】
ほとんどの用途において，本発明において用いられたようにポリメラーゼ，制限エンドヌクレアーゼ，リガーゼ，及び他の酵素はその酵素の可溶性の形態をとる。しかしながら，制限酵素反応，ライゲーション及びスーパーコイル化反応を含む固相増幅反応あるいは固相プロセシング反応も増幅工程を合理化するために用いることができる。加えて，フィデリティ，効率，及びプロセシングあるいは最終産物を改善する目的で設計された異なる酵素（特にポリメラーゼ）の最適領域からなる融合タンパクを用いることができる。バクテリア，菌類，植物，昆虫，あるいは動物細胞において発現された一つあるいはそれ以上のアフィニティー標識（例えば，６ＸＨｉｓ，Ｓ−Ｔａｇ，カルモジュリン結合ペプチド，タンパクＡ等）を含む酵素のリコンビナント型も利用可能である。標識された酵素を用いる利点は，アフィニティークロマトグラフィーにより最終産物から酵素をすぐに除去できる点にある。精製に続いて，標識部分を介して固相マトリクスに固定され，回収された酵素は次の酵素反応に利用できる。
【００５４】
増幅に続き，コンカテマーは少なくとも一つのＤＵを含む短い発現カセット（ＳＥＣｓ）へと切断される。ここにおいて単一ＳＥＣはＤＵの複数コピーから構成され送達と発現を最適化するように設計することができる。直鎖状ＳＥＣは標的細胞による取り込みを容易にするため直鎖状断片として，環状化された断片として（ＣＮＡｓ），あるいはスーパーコイル化した環状断片（ｓＣＮＡｓ）として直接投与できる。このように，増幅後のプロセシングは使用目的により異なる。
【００５５】
ＳＥＣのプロセシングは以下の一つあるいはそれ以上を含むことができる。その他の物理的あるいは酵素を用いた方法による更なるＳＥＣの切断；クレノーを利用する場合のような酵素による切断，あるいは化学的方法によるＳＥＣ末端の付加あるいはプロセシング；環状化されたＣＮＡを合成するためＳＥＣ両端の分子内ライゲーション；ＩＩ型トポイソメラーゼを含むジャイレース様酵素を用いたＣＮＡのスーパーコイル化；いずれかの形態のＳＥＣに対し分子内塩基あるいは末端を改変するための酵素的あるいは化学的処理；二つあるいはそれ以上のＳＥＣの連結；あるいは機能的複合体を生成するためＳＥＣを特異的リガンドに結合させること。本発明に関して定義される用語リガンドには，ＤＮＡ，ＲＮＡ，ＰＮＡ，ＬＮＡあるいはそれらの改変を含む核酸；標的化及び細胞による取り込みを容易にする，あるいは治療的効果を増すためのペプチド；酵素的に活性のある及び／又は物理的に機能的なポリペプチド；タンパクの機能を認識，結合及び改変する核酸であるアプタマー；蛍光，磁気，及び放射線標識された要素を含む生物物理学的な標識；及び核酸の安定化，あるいは産物の目的の細胞あるいは組織への標的化を容易にするポリマーが含まれる。
【００５６】
本発明により合成されたＤＮＡを用いて投与に成功し得る治療的用途は，抗体産生あるいは遺伝子サイレンシング等いくつかのＤＮＡ療法に向けた方法を含む。例えば，インフルエンザあるいはＨＩＶウイルス等の病原体により引き起こされる疾患の予防あるいは治療のために設計された適切な発現カセットの投与が成功すると抗体がインビボで合成される。例えば，真核生物のプロモーター制御下にあるインフルエンザヘムアグルチニンタンパクをコードする配列は，インフルエンザＡウイルスに感染した動物の液性及び細胞性免疫反応を誘発するために用いることができる。同様に，切断されたヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）エンベロープタンパクをコードする配列を発現させると，マウスにおいてＨＩＶに対する効果的な免疫反応を引き起こすことができる。
【００５７】
本発明において増幅された核酸はインビボにおいて標的化遺伝子サイレンシングを触媒することも可能である。痛みを伴う水泡及び体の様々な部位の痛みを引き起こす単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ），水痘（初期感染）及び帯状疱疹（再発時）を引き起こす帯状疱疹ウイルスは同じファミリーに属するウイルスであり，ウイルス感染を達成するためにはＩＣＰ４及びＩＣＰ４７の発現を必要とする。培養細胞へのトランスフェクションに際して，ＩＣＰ４あるいはＩＣＰ４７に特異的なアンチセンスオリゴを発現する増幅されたＳＥＣはインビボでこれらのタンパクの発現を調節し，ウイルスの更なる増殖を最小限に抑えることができる。アンチ−ＩＣＰ４転写産物のインビボにおける発現はＩＣＰ４遺伝子を抑制することができ，細胞内のＩＣＰ４タンパク発現を妨げる。同様の効果は本法により生成されたＩＣＰ４７発現カセットの発現の後にも見られる。
【００５８】
ＩＣＰ４７は主要組織適合複合体（ＭＨＣ）提示経路を阻害するように機能し，これが宿主の免疫原生に対する攻撃をウイルスがしないようにするために重要となっている。ＩＣＰ４７の遺伝子産物は感染細胞表面における抗原提示に関わるトランスポータータンパクに結合して主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ抗原提示経路を阻害する。結果として，ＨＳＶ感染細胞は細胞傷害性Ｔリンパ球による免疫認識から遮蔽される。このように，ＩＣＰ４７はＨＳＶ感染において重要な役割を果たす。
【００５９】
肺がん細胞株，Ａ５４９に本発明に従って増幅されたＩＣＰ４７ ＳＥＣをトランスフェクションした場合，効果的にアンチセンス配列が発現し，ウエスタンブロットによる解析によれば，ＩＣＰ４７タンパクの生成を阻害する。単純ヘルペスウイルスのゲノム中には，同様に抑制される感染細胞タンパクがさらに存在する。
【００６０】
その他の遺伝子抑制の標的には，ライノウイルス，コロナウイルス，アデノウイルス，インフルエンザ及びパラインフルエンザウイルス等の呼吸器系ウイルスがある。これらは一般的な風邪，肺炎，喘息，及び慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を含む上気道及び下気道の感染を頻繁に伴う。ヒトライノウイルス（ＨＲＶ）は大きさにして約７．２ｋｂ長でキャプシドコートタンパク，ＲＮＡポリメラーゼ及び二つのウイルスプロテアーゼをコードする単一オープンリーディングフレームを含む一本鎖ＲＮＡゲノムを持つ。感染に際し，ウイルスタンパクは効果的に数千のウイルス粒子を宿主の機構を用いて産生させ，最終的にこれらの粒子は細胞が溶解するときに放出される。
【００６１】
大多数のライノウイルスは細胞間接着分子Ｉ（ＩＣＡＭ−１）を細胞に感染するためのレセプターとして利用している。ＩＣＡＭ−１のメッセージに対するアンチセンス鎖をコードする増幅されたＳＥＣを発現させると，効果的にインビボでのＩＣＡＭ−１タンパク発現を阻害でき，ウイルス感染を最小限にするために有用であることが分かる。その他の呼吸器系疾患に対する有用な方法には，ウイルス粒子の生成に必要となるウイルスプロテアーゼのように，感染を触媒する必須タンパクの活性を阻害することを目的としたアンチセンス様分子（アンチセンス，アプタマー，トリプレックス形成分子，及び同様の分子）のインビボでの発現が含まれる。その他の方法には，ＳＥＣを用いた病原体により引き起こされる組織反応のメディエーター（例えば，ブラジキニン，プロスタグランジン，タチキニン，ヒスタミン，及び様々なサイトカイン）の阻害，あるいはこれらメディエーターにより引き起こされる生理学的な効果を達成する細胞レセプターの阻害が含まれる。
【００６２】
本発明の治療的用途の他の標的には，ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶｓ）により引き起こされる感染の調節が含まれる。この感染は初期には良性の，非癌性疣贅の症状を示すが，悪性増殖へと発展する症例もある。例えば，生殖器ＨＰＶは一患者から他者へと性交渉及び口腔あるいは肛門性交により感染する。子宮頸部ウイルス感染細胞は，初期の良性疣贅から悪性細胞前駆体へと移行し，最終的に癌腫へと発展する。子宮頸癌はおそらくウイルス感染が癌に至る最もよく知られた例の一つである。ヒト及び動物において，細胞分裂は主にＲｂ及びｐ５３によって制御されている。ＨＰＶのＥ６タンパク及びＥ７タンパクは，直接Ｒｂ及び／又はｐ５３に結合し，これらのタンパクの腫瘍抑制効果を阻害し，感染細胞の無秩序な複製を引き起こす（Ｄｉｄｅｌｏｔ， Ｃ． ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔｌ Ｊ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２３：８１−８７， ２００３）。ウイルスが開始段階のみに作用するのに対して，時間と共に無秩序に増殖したいくつかの細胞では遺伝的構造に修復不可能な永続的変化が起こる。Ｅ６及びＥ７を阻害するように設計されたアンチセンス様構成を発現させることでウイルス感染は無効にされる。
【００６３】
その他のＨＰＶ感染は，それ自身男性及び女性において生殖器及び肛門あるいはその付近の疣贅として現れ，本発明により生成された核酸を用いた治療用アンチセンス様物質の発現の妥当な候補である。女性においては，子宮頸部にも目に見える疣贅が現れる。この型の生殖器疣贅は，専門的には尖圭コンジロームとして知られ，一般的に６番及び１１番の二つのＨＰＶ型と関連している。これらの疣贅は癌に進行することは稀であり，「低リスク」のウイルスであると考えられている。その他の性交渉により伝播されるＨＰＶは，男性及び女性において生殖器あるいは肛門癌と関連している。これらは「高リスク」ＨＰＶ型と呼ばれ，ＨＰＶ−１６，ＨＰＶ−１８，ＨＰＶ−３１，ＨＰＶ−４５，及びその他の型を含む。高リスクＨＰＶ型は，通常目に見える疣贅には含まれないが，高リスクＨＰＶ及び低リスクＨＰＶの両方が子宮頸部における異常細胞の増殖を誘発しうる。どちらの型のＨＰＶ感染も治療用のインビボにおけるアンチセンス様物質発現により効果的に調節することができる。
【００６４】
本発明の増幅反応は，バクテリア配列を含む欠損のないプラスミド，あるいはこれらの配列を除去するために改変されたプラスミドを増幅する目的にも利用することができる。例えば，１）欠損しているが完全な酵素活性をもつＲＴをコードするマウスモロニー白血病ウイルス逆転写酵素（ＭｏＭｕＬＶ ＲＴ）遺伝子；２）ＭｏＭｕＬＶ ＲＴによる逆転写開始に必須の近傍領域を含むプライマー結合部位（ＰＢＳ）；３）アンチセンス，アプタマー，ＤＮＡエンザイム，あるいはトリプレックス形成を誘導する配列を生成することを目的とした標的遺伝子コーディング配列；及び４）逆転写反応を終結させるために設計されたステムループ構造を含む一本鎖ＤＮＡ発現ベクター，ｐｓｓＸＥを，本発明に従って欠損のない発現カセットとして効率的に増幅できる。増幅された産物はトランスフェクションされ，哺乳類，ウイルス，及びバクテリア遺伝子を効果的に抑制するために利用できる。細胞内での発現において，トランスフェクションされたＲＴは内在性宿主ｔＲＮＡ（例えば，ｔＲＮＡ ＰｒｏあるいはｔＲＮＡ Ｖａｌ）をＲＮＡ転写物の３’末端に位置するプライマー結合部位（ＰＢＳ）に結合するためのプライマーとして利用し，ｓｓＤＮＡ合成を開始する。逆転写後，ｓｓＤＮＡはｍＲＮＡ鋳型がＲＴのＲＮａｓｅ ＨあるいはＲＮａｓｅ Ｈ活性によって分解されると放出される。
【００６５】
核酸（ＳＥＣ）の送達は安定化緩衝液に溶解した裸の核酸の標的受容体への単純な投与によって達成できる。本発明の実施態様は，細胞への核酸の標的化及び送達を援助する送達ベクター（Ｄｉａｓ，Ｎ． Ｍｏｌｅｃ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １：３４７−３５５；２００２）も利用できる。いくつかの実施態様においては，弱毒化されたウイルスベクター系，すなわちウイルスパッケージング系で免疫遺伝的タンパクの少ないあるいは無いもの（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ， Ｉ．Ｋ． ａｎｄ Ｌｉｕ， Ｍ．Ａ． Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ． １３８： ５５０−５５９， ２００３）を利用している。その他の実施態様は，核酸を封入するあるいは静電気的相互作用により核酸を結合する，中性あるいはカチオン性リポソームの使用を含む。これらの実施態様は，送達された核酸がエンドソーム分画に隔離されることを防ぐ目的でヘルパー分子（例えば，クロロキンあるいは１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン）を使用することができる。市販のリポソーマルベクターには，リポフェクチン，ユーフェクチン，サイトフェクチン及びリポフェクタミンがある。
【００６６】
その他の送達方法には，物理的作用，レセプターあるいはトランスポーターを介した機構により原形質膜への浸透性を調節するカチオン性ペプチドへの核酸の共有結合が含まれる。このような結合は，細胞質に直接送達され，速やかに核へ送られ発現されるため，送達された核酸の効果を向上させる（Ｌｕｏ， Ｄ． ａｎｄ Ｓａｌｔｚｍａｎ， Ｗ．Ｍ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １８： ３３−３７， ２０００）。さらに他の実施形態では，細胞に核酸を送達するために治療用核酸と静電気的に相互作用するカチオン性ポリマーを用いる。カチオン性ポリマーには，例えば，ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ），ポリエチレングリコール（ＰＥＧ），ＰＥＧブロックＰＬＬデンドリマー，ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー，ポリアルキルシアノ−アクリル酸ナノ粒子，及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）及びその複合体（例えば，マンノース−ＰＥＩ，トランスフェリン−ＰＥＩ，直鎖ＰＥＩ）が含まれる。
【００６７】
エアロゾルによる送達は，気道上皮及び肺表面への非侵襲性の送達形式である。例えば，ＰＥＩ及び核酸を含む処方は中和により高レベルの気道あるいは肺へのトランスフェクションを達成可能である。このＰＥＩ−核酸複合体の適用は，多くのカチオン性脂質製剤より高レベルの遺伝子発現が達成でき，気道上皮及び肺柔組織の細胞へのトランスフェクションは非常に高レベルの効率（ほぼ１００％）を示す。加えて，ＰＥＩに基づく製剤の度重なるエアロゾル投与に伴う毒性は非常に低い。この送達方法が誘発する腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）及びインターロイキン１ベータ（ＩＬ−１Ｂ）は，ＰＥＩ−核酸複合体の静脈内注射あるいはカチオン性リポソーム−核酸複合体のエアロゾル送達と比較して最小限のもののみである。
【００６８】
バクテリアにより生成されたプラスミドＤＮＡを用いる場合に頻繁に起こる問題は，バクテリアによって処理されたＤＮＡに固有の非メチル化モチーフに宿主が曝露されることに由来する。非メチル化されたＤＮＡは，ＣｐＧに触媒されるサイトカイン反応及び炎症性サイトカインを誘発するが，これは肺に対する毒性及び治療用途の効率低下に関連する深刻な問題である。結果的に，バクテリアによって生成されたＤＮＡの使用は，今まで用いられてきた現行の遺伝子治療法の多くにとって大幅な妨げとなっていた。ＰＥＩによるＣｐＧ反応の遮蔽はＰＥＩ−遺伝子エアロゾルを介して送達された遺伝子の持続的発現を容易にし，したがって，治療に対する反応の持続が達成される。本発明のセルフリー増幅法により生成された核酸と組み合わせて利用する場合，ＰＥＩに基づくエアロゾルは肺及び気道上皮に対するＤＮＡ治療のための極めて効果的な送達系となり得る。
【００６９】
いくつかの実施態様においては，長期放出系も用いている。ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）ミクロスフェア及びポリ（エチレン−ｃｏ−ビニル酢酸（ＥＶＡｃ）マトリックスといった生体適合放出制御性ポリマーは，生理活性のある核酸を数ヶ月に渡って制御，調節し予期できる形で放出させることができ，両成分は治療目的の使用が米国食品医薬品局により承認されている。
【００７０】
物理的送達系もまた利用可能である。エレクトロポレーションは治療薬を皮膚細胞，角膜内皮細胞及び筋肉を含むその他の組織に送達するために効果的である。圧力による，あるいは水圧注入は哺乳類の系では５０％の効率まで達成可能である。その他の方法には，植物を含む様々な細胞型におけるＤＮＡ−脂質複合体の超音波による噴霧が含まれ，植物においては粒子衝突も有用である。
【００７１】
セルフリー増幅工程のスケールアップは，半自動化あるいは完全自動化されたプラットフォームによって行われ，ここにおいては，温度及び静置時間と共に，塩，酵素及び核酸の順次添加が最適効率を得るために厳密に制御される（図４）。一実施形態においては，各反応容量を比較的小さく（＜１ｍｌ）保ったまま反応回数を増加させることによってスケールアップが達成され，これによりマルチウェルプレートを用いて標準プラットフォームあるいは特別に注文したプラットフォームを用いて鋳型を同時に増幅できる（図５Ａ）。もう一つの方法では，大量（ｋｇ単位）の単一核酸産物を環境制御下において発酵槽様容器を用い一回の実行で産生するため，より大きな容量（例えば，１０リットル）を必要とする（図５Ｂ）。より大きな収量の産物を得るためにはより大きな容量が用いられる。異なる限度容量をもつ複数のプラットフォームは，限られた空間に平衡して設置することができ，様々な増幅容量の要求を満たすより大きな生合成設備の一部として連携して機能することができる。
【００７２】
小容量での大量の核酸生産には粘性の高い反応混合液に試薬を混合するという問題が生じる。本発明の反応槽には，硬質の前成形容器あるいは内蔵式のプラスチック袋のように可塑性のある容器が含まれる。好ましい実施態様においては，反応混合液と接触する反応槽及びすべての構成材は清潔で，滅菌されており核酸配列のいかなる夾雑も含まない。硬質前成形容器の内容物は好ましくは反応槽内部に含まれる装置により混合されるが，再循環装置を用いてもよい。可塑性のある反応層では，好ましくは蠕動様ポンプの利用を含む再循環機構により混合されるか，あるいは自動圧搾装置あるいは核酸産物のせん断を避ける低エネルギーパルス装置等の外部の機械装置により混合される。
【００７３】
内部装置は，電気的に速度制御され自動で時間的な調節が行われるプロペラ様攪拌装置（図６Ａ），あるいは反応槽の内径内で上から下まで連続している軸に固定された穴あきディスクを用いて制御された液体置換工程（図６Ｂ）を含む様々に異なる機構を利用できる。このディスクは，液体中で最適な混合を提供するよう，様々な速度で上昇及び下降される。これら混合チャンバーは共に小さいチューブが各混合装置の軸に装着され，混合槽の外部に分離して補充された様々な在庫溶液が蠕動ポンプを用いて正確に制御され順次反応混合液へと送達されるようになっている放出装置を装備してもよい。
【００７４】
別の実施態様では，反応混合液の安定した継続的な流れがチャンバーからポンプ輸送で送り出されてから戻る系を実施している。例えば，チャンバーの底部に位置する送出口は，流動体の小さな流れが添加される試薬と混合され，同じ反応チャンバーの上部に位置する入口を通じて再び流れて戻り，完全に混合されるようにしている（図６Ｃ）。蠕動ポンプ及び吸気弁は再循環工程中様々な溶質及び酵素の分注を制御し監視する（図６Ｃ）。
【００７５】
また別の実施態様では，ＤＮＡ混合物の揺変性の性質を利用しており，ここにおいて，混合物は円筒状に伸長した形状をとる。揺変性化合物は，化合物に加えられたせん断力の度合いに応じて粘性を変化させられる。通常，せん断力が増大すると揺変性化合物の粘性は低下する。いったんせん断力が除去されると，このような化合物は本来の粘性へと戻り始める。この実施態様においては，粘性のある反応混合液を含む容器には等間隔に開けられた穴があり，ここから処理に必要な化学物質が投与される。そのため，直径の小さいシリンダーを介した粘性の高い反応混合液を伸長することにより，混合を達成するのに十分な長期間にわたって粘性を十分に変化させ，シリンダー及び粘性が低くなった反応混合液にゆっくりと注入される試薬との局所的な混合を促進させる。
【００７６】
装置には，好ましくは一つあるいはそれ以上の関連する物理的及び生化学的パラメーターのインライン（ｉｎｌｉｎｅ）リアルタイムモニタリングを含み，産物の安定性を確認し品質管理及び品質保証を維持する。これらは治療用途が許容される産物に必要とされる，適正製造基準認定（ｃＧＭＰ）に必須である。これには粘性，核酸濃度，溶液の濁度，導電率，ｐＨ，温度，タンパク含有率，エンドトキシン，バイオバーデン及び／又は系の構成材に由来する化学夾雑物を監視するコンピューターあるいは同様の手段を含む。
【００７７】
直鎖状ＳＥＣを環状の形態に処理する工程には，分子間反応よりも分子内ライゲーション（自己接着）反応を起こしやすいライゲーション工程を必要とする。従来の最終増幅産物の希釈は分子内ライゲーションを起こしやすい分子比率を操作するために利用できる。しかしながら，好ましい実施態様においては，少量の反応混合液を酵素及び緩衝液を含むライゲーション混合物（ｃｏｃｋｔａｉｌ）に混合させることで，全体の反応容量を最小限にしている。一実施態様においては，増幅された産物が図６Ｃに示すように非常にゆっくりとした，あるいは脈動するポンプ速度を利用して反応混合液の流れに添加される。その他の実施態様では，ライゲーション混合物を含む二番目の反応槽へと増幅された反応混合液を滴下して分注することで，大容量のライゲーション反応混合液を発生させることなく希釈を達成する（図７）。毎回新しく一定分量が分注される際に分子内ライゲーション工程を最適化するため，各分量の添加には十分な時間が与えられる。一度一定分量のライゲーションが完了すると，環状ＤＮＡは酵素の基質にはならず希釈混合液の一部となる。それから次の一定分量が分注され，このサイクルは増幅されたＤＮＡが全て分注されライゲーションされるまで繰返される。この工程は，初期増幅反応の大幅な希釈なしに分子内ライゲーションを可能にし，複数の分注チャンバーを組み込むことで複数の一定分量のライゲーションを同時に行うこと，及び処理時間の最小化を可能とする。
【００７８】
産物の最終的な精製は，反応工程中に透過性膜に基づく方法を利用し合理化できる。これらの膜は，産物を保持したままで，増幅されたＤＮＡ反応混合液中の低分子量分子（塩，取り込まれなかったプライマー，ｄＮＴＰ，ＮＴＰ及び他の小分子）の拡散を許容する。その他の反応構成要素に対し増幅されたＤＮＡの選択的な残留を可能にするため，血液透析工程を改変した方法が利用できる。一度反応が完了すると，増幅反応は反応槽から特異的な分子量を遮断する膜からなるフィルターへと送り込まれる。ＤＮＡはこれらの小さいキャピラリーの膜を通過して分子量の小さい試薬が反応液から拡散する時点で少なくとも部分的に精製される。精製されたＤＮＡは続いて，貯蔵されるか，品質評価され，さらに／あるいは最終的な用途のために分注されるか，あるいは後の解析のために直接一定分量に分けられて（ａｌｉｑｕｏｔｅｄ）貯蔵される。その他の実施態様は，供給される液体から高分子量化合物を分離するための低圧膜分離工程からなる限外ろ過精製工程を利用し最終ＲＣＡ産物の望ましい精製を達成する。
【００７９】
最終産物は，従来の方法を用い大きさ，形状，夾雑，及び発現容量に関して解析される。ゲル電気泳動，配列決定，及び生化学的解析あるいはＨＰＬＣ解析が通常行われる。最終産物の発現は，リン酸化カルシウム法，エレクトロポレーションあるいは関連した技法等，標準的技法を用いた適切な細胞へのトランスフェクションによって検定される。
【００８０】
増幅された産物の治療用化合物としての投与には，局所投与，静脈内投与，筋内投与及び組織内投与，鼻腔投与，坐薬投与，オマヤレザバーのように移植された貯蔵装置及び／又はポンプ，点眼薬投与，薬剤の口腔投与，及び超音技術を利用した送達が含まれるが，これに限定されない。送達媒体には，例えば，リポソームを介した輸送媒体あるいはポリマーを介した輸送媒体，並びに各種カプセル媒体あるいはタンパク標的化媒体，及び呼吸器を介した投与に適したエアロゾル担体が含まれる。
【実施例１】
【００８１】
実施例１−β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ−ＤＵ）の合成及びセルフリー増幅
ａ）プラスミドに基づく鋳型 ｐＳＶ−β−ガラクトシダーゼベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ． Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ， ＵＳＡ）をＥｃｏＲ Ｉ及びＰｓｔ Ｉにより部分的に切断した。ＣＭＶプロモーター，Ｌａｃ ＺのＯＲＦ及びＳＶ４０小Ｔ抗原終結配列を含む約４．２ｋｂの断片（Ｌａｃ Ｚ−ＤＵ）を単離し，Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼによって平滑末端処理し，ｐＧＥＭＴＭ−７Ｚｆ（＋）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ． Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ， ＵＳＡ）のＳｍａ Ｉ切断部位にクローニングし，ｐＧＥＭ−ＬａｃＺ−ＤＵベクターを作製した。Ｌａｃ Ｚ−ＤＵを続いてＸｂａ ＩによってｐＧＥＭ−ＬａｃＺ−ＤＵから切除し，ゲル精製し，Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ， ＵＳＡ）を用いて製造業者の推奨に従って環状化した。
【００８２】
ｂ）ＰＣＲに基づく鋳型 ＬａｃＺ−ＤＵをｐＶＡＸＴＭ２００−ＧＷ／ｌａｃＺベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， ＵＳＡ）からＢａｍＨ Ｉエンドヌクレアーゼ認識部位を含むプライマー対，フォワード（５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＡＣＴＣＴＴＣＧＣＧＡＴＧＴＡＣ −３’）及びリバース（５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＡＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣ−３’）を用いて増幅した。Ｌａｃ Ｚ−ＤＵは各プライマー２００ｎｇ，１０ｎｇ ｐＶＡＸＴＭ２００−ＧＷ／ｌａｃＺベクター；０．２ｍＭ ｄＮＴＰ；１ｘ ヘラクレス緩衝液及び２．５ＵヘラクレスＴＭポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ， ＵＳＡ）を含む５０μｌの反応液で増幅した。増幅はロボサイクラーグラジエント ４０（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ， ＵＳＡ）において以下の条件で行った：９４℃で２分；５サイクル（９２℃で３０秒，４０℃で３０秒，７２℃で５分）；２５サイクル（９２℃で３０秒，５５℃で３０秒，７２℃で５分）及び７２℃で１０分。約４．２ｋｂの増幅産物をＢａｍＨ Ｉで切断し，ゲル精製及びＴ４ ＤＮＡリガーゼによる環状化を行った。
【００８３】
ｃ）無作為ヘキサマーによる増幅 １０ｍＭのトリス塩酸ｐＨ８，１０ｎｇの環状ＬａｃＺ−ＤＵ及び２００ｐｍｏｌの無作為ヘキサマー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ． Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ ＩＡ， ＵＳＡ）を含む反応液を９５℃まで３分加熱し，室温まで冷却した。Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ（１０Ｕ， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ， ＵＳＡ）；０．２ｍＭのｄＮＴＰ及び１００μｇ／ｍｌのＢＤＡを添加した。増幅は，３０℃で，５０ｍＭのトリス塩酸（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）ｐＨ７．５；１０ｍＭの塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）；１０ｍＭの硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４），４ｍＭのＤＴＴ中で１６時間行なった。増幅に続いてＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼを熱失活させ（６５℃で５分），増幅したＬａｃＺ−ＤＵコンカテマーをエタノール／塩沈殿し適切なエンドヌクレアーゼ（Ｘｂａ ＩあるいはＢａｍＨ Ｉ）にて製造業者の推奨に従い切断した。
【００８４】
ｄ）特異的プライマーによる増幅 先述と同様の条件を用い，規定された配列及び反対の相補鎖のプライマー二つを２７８８塩基対ＤＵの選択的な増幅に利用した。規定されたプライマー対は各々２００ｐｍｏｌの濃度で用い，以下の配列からなる。フォワードプライマー：５’−ＣＴＧＣＣＡＡＣＡＡＧＧＴＡＣＴＣＧ−３’；リバースプライマー：５’−ＡＧＣＴＧＣＴＡＣＴＧＧＧＴＣＴＡＧ−３’である。増幅は先述と同様に行われ増幅反応の成功はゲル電気泳動によって評価された。
【００８５】
ｅ）配列の規定された単一ヘキサマーによる増幅 Ｌａｃ Ｚ−ＤＵの８つの異なる部位（４つはリバースＤＮＡ鎖の４６４，１３２５，２５７９及び３９１１の位置；４つはフォワード鎖の７５０，２８７１，３２３９及び３２６０の位置）にアニールする４００ｐｍｏｌのヘキサマー５’−ＧｐＧｐＡｐＡｐＡｐＡ−３’及び１０ｎｇの環状ＬａｃＺ−ＤＵを４０ｍＭのトリス塩酸ｐＨ８，１０ｍＭのＭｇＣｌ２中で９５℃まで３分加熱し室温まで冷却した。Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ（１０Ｕ， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ， ＵＳＡ）；１ｍＭのｄＮＴＰ；５％のグリセロール；０．７Ｕの酵母由来無機ピロホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ， ＵＳＡ）及び１００μｇ／ｍｌのＢＳＡを添加した。増幅反応は３０℃で５０ｍＭのトリス塩酸ｐＨ７．５；１０ｍＭの塩化マグネシウム；１０ｍＭの硫酸アンモニウム，４ｍＭのＤＴＴ中で１６時間行った。増幅に続いてＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼを熱失活（６５℃で１０分）し，増幅されたＬａｃＺ−ＤＵコンカテマーをエタノール／塩沈殿して酵素製造業者の推奨に従い適切なエンドヌクレアーゼ（Ｘｂａ Ｉ）により切断した。エンドヌクレアーゼを熱失活（６５℃で２０分）した後，直鎖ＬａｃＺ−ＤＵの環状化を１００ｆｍｏｌのＤＮＡ当たり約０．１ユニット／μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， ＵＳＡ）を含むライゲーション緩衝液（５０ｍＭのトリス塩酸ｐＨ７．６；５ｍＭの塩化マグネシウム；１ｍＭのＡＴＰ；１ｍＭのＤＴＴ；５％のＰＥＧ−８０００）中，約２２℃（あるいはやや低い温度）で１６時間行った。続いて環状化ＬａｃＺ−ＤＵをエタノール／塩沈殿して１０ｍＭのトリス塩酸ｐＨ８に再懸濁した。
【００８６】
ｆ）エキソヌクレアーゼ耐性の配列が規定された単一ヘキサマーを用いた増幅 先述したものと同様の条件を用い，３’末端に二つのチオリン酸エステル結合を持つ規定されたヘキサマー（５’ＧｐＧｐＡｐＡｐｓＡｐｓＡ−３’）を用いてＬａｃＺ−ＤＵを増幅した。
【００８７】
ｇ）配列の規定された単一ペンタマーを用いた増幅 先述したものと同様の条件を用い，配列が規定されたペンタマー（５’ＧｐＧｐＡｐＡｐＡ−３’）を用いてＬａｃＺ−ＤＵを増幅した。このペンタマーは，ＬａｃＺ−ＤＵ中の１９の異なる部位，８つはリバース鎖の４６５，８８９，１３２６，１６９５，２５８０，３６６６及び３９１２の位置；１１箇所はフォワード鎖の８０，１１９，１９１，６０２，７５０，９１２，２８７１，３２３９，３６０６，３８１５の位置にアニールする。
【００８８】
ｈ）エキソヌクレアーゼ耐性の配列が規定された単一ペンタマーを用いた増幅 先述したものと同様の条件を用い，二つの３’末端にチオリン酸エステル結合を持つ配列が規定されたペンタマー（５’ＧｐＧｐＡｐｓＡｐｓＡ−３’）を用いてＬａｃＺ−ＤＵを増幅した。
【００８９】
ｉ）ポリメラーゼ混合物を用いた増幅 １−ｅ節で説明したとおりの条件を用い，Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ及びＴ４ ＤＮＡポリメラーゼが比率１０：３から３：１０（Ｐｈｉ２９酵素ユニット：Ｔ４酵素ユニット）の範囲で存在する条件下においてＬａｃＺ−プラスミドを増幅した。その他の鋳型，すなわち，Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ＤＵについても最適な増幅条件が有効であることが示された。
【実施例２】
【００９０】
実施例２−ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ−ＤＵ）の合成及びセルフリー増幅
ｐＧＬ３ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ． Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ， ＵＳＡ）をＳａｌ Ｉ及びＸｈｏ Ｉで切断した。ＳＶ４０プロモーター，ルシフェラーゼＯＲＦ及びＳＶ４０小Ｔ抗原終結配列を含む約２．１７ｋｂの断片（Ｌｕｃ−ＤＵ）を単離し，精製し，Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， ＵＳＡ）を用いて製造業者の推奨に従って再環状化した。
【００９１】
ａ）セルフリー増幅 ヘキサマー５’−ＡｐＡｐＴｐＴｐｓＧｐｓＣ−３’及び５’−ＡｐＧｐＣｐＡｐｓＡｐｓＴ−３’を各々４００ｐｍｏｌと反応液２５μｌあたり１０ｎｇの環状Ｌｕｃ−ＤＵを含む反応液を９５℃まで３分，４０ｍＭのトリス塩酸ｐＨ８；１０ｍＭの塩化マグネシウム中で加熱し，室温まで冷却した。Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ（１０Ｕ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ， ＵＳＡ）；１ｍＭのｄＮＴＰ（２５／２５／２５／２５）；５％のグリセロール；０．７Ｕの酵母由来無機ピロホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ， ＵＳＡ）及び１００μｇ／ｍｌのＢＳＡを添加した。増幅反応は２５μｌ反応液において３０℃で５０ｍＭのトリス塩酸ｐＨ７．５；１０ｍＭの塩化マグネシウム；１０ｍＭの硫酸アンモニウム，４ｍＭのＤＴＴ中で１６時間行った。増幅に続いて，Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼを熱失活（６５℃で１０分）し，増幅されたＬｕｃ−ＤＵコンカテマーをエタノール／塩沈殿して酵素製造業者の推奨に従いエンドヌクレアーゼ（ＢａｍＨ Ｉ）により切断した。エンドヌクレアーゼを熱失活（６５℃で２０分）した後，直鎖Ｌｕｃ−ＤＵの環状化をＤＮＡの１μｇあたり０．１ユニット／μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， ＵＳＡ）を含むライゲーション緩衝液（５０ｍＭのトリス塩酸ｐＨ７．６；５ｍＭの塩化マグネシウム；１ｍＭのＡＴＰ；１ｍＭのＤＴＴ；５％のＰＥＧ−８０００）中にて１４℃で１２から１６時間行った。環状化Ｌｕｃ−ＤＵをエタノール／塩沈殿して１０ｍＭのトリス塩酸ｐＨ８．０に再懸濁した。
【実施例３】
【００９２】
実施例３−増幅されたＤＮＡのヒト細胞における発現
ヒトＡ５４９肺癌腫細胞（ＡＴＣ）を，熱失活した１０％のウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ， Ｌｏｇａｎ， ＵＴ， ＵＳＡ），１００Ｕ／ｍｌのペニシリン，１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， ＵＳＡ）を補完したＤｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ； Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， ＵＳＡ）で培養し，３７℃，５％二酸化炭素環境中に静置した。
【００９３】
ａ）ＤＮＡトランスフェクション トランスフェクション前日，Ａ５４９細胞を６ウェルプレートに１×１０５細胞／ｍｌの濃度で播いた。ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ ２トランスフェクション試薬（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， ＵＳＡ）を製造業者の示す使用法に従い細胞へのトランスフェクションに用いた。簡潔に説明すると，セルフリー増幅されたＤＵあるいは元のプラスミドＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ． Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ， ＵＳＡ）を５０μｌのＤＮＡ希釈緩衝液Ｂ中において２μｇのキャリアーｐｓｓＸＥ ＤＮＡ（Ｃｈｅｎ ａｎｄ ＭｃＭｉｃｋｅｎ， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １０：１７７６−１７８０， ２００３）と混合し，５分間室温で静置した。ＤＮＡ溶液は，５０μｌの血清／抗生物質なしのＤＭＥＭにてあらかじめ希釈された７μｌのＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ ２試薬と混合し，室温にてさらに５分静置した。その間，Ａ５４９細胞をＰＢＳにて洗浄し０．９ｍｌの血清／抗生物質なしのＤＭＥＭを上層し，続いてＤＮＡ／ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ溶液を加えた。４時間通常の生育環境にて静置した後，細胞をＰＢＳにて洗浄しトランスフェクション培地を１０μｌ／ｍｌのＢｏｏｓｔｅｒ ３（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， ＵＳＡ）を添加した通常の増殖培地に置換した。ＬａｃＺをレポーターとして用いた実験においては，５０−１００ｎｇのＬａｃＺ−ＤＵ（約４．２ｋｂ）を用いたトランスフェクションを１００ｎｇの元のｐＧＥＭ−ＬａｃＺ−ＤＵプラスミド（約７．２ｋｂ）を用いたトランスフェクションと比較した。ルシフェラーゼ酵素をレポーターとして用いた他の実施例においては，２４９ｎｇのＬｕｃ−ＤＵ（約２．１７ｋｂ）を５７０ｎｇの元のｐＧＬ３ベクター（５．０１ｋｂ； Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）と比較した。
【００９４】
ｂ）トランスフェクションされた細胞でのβ−ガラクトシダーゼ活性の検出 トランスフェクションから２４時間後，Ａ５４９細胞をＰＢＳで洗浄（ｒｉｎｓｅ）し，２００／２５０ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．５；０．０２％のトライトンＸ−１００中で室温にて一時間溶解した。続いて細胞残屑を１０−１３，０００ｒｐｍ，５分の遠心によって除去した。細胞溶解液の合計タンパク濃度は２８０ｎｍの吸光度あるいは改良型ブラッドフォード解析によって検定した。合計タンパク量のうち５０μｇを０．０１Ｍのリン酸緩衝液ｐＨ７．５；０．１Ｍの塩化マグネシウム，４５ｍＭのβ−メルカプトエタノール及び０．０１ｍＭの（ｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトピロニダーゼ）と１ｍｌ反応液中にて混合した。１−１６時間３７℃で静置した後，４１０ｎｍの吸光度を測定した。
【００９５】
ｃ）トランスフェクションされた細胞のルシフェラーゼ活性の検定 トランスフェクションから２４時間後，細胞を先述のとおり処理した。続いて細胞溶解物を等しい合計タンパク量を反映するよう調整し等量の２ｘ Ｂｒｉｇｈｔ−ＧｌｏＴＭ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）と混合した。光放出を速やかにＴｕｒｎｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ２０／２０ｎルミノメーターで記録した。
【実施例４】
【００９６】
実施例４−増幅条件
ａ）増幅緩衝液
グリセロール濃度−各々１０ｎｇのＬｕｃ−ＤＵ鋳型を用いる二つの増幅反応を実施例２で説明したように準備した。一方は，グリセロール添加を省き水で置換した。増幅に続き，ＤＮＡをエタノール／塩沈殿し２６０ｎｍ及び２８０ｎｍの波長における吸光度測定に先駆けて適切な制限酵素で切断した。グリセロール濃度が４％ｗ／ｖ以下（Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ及び無機ピロホスファターゼストック溶液からの繰り越し）においては増幅効率に５．６５％の上昇が見られた。
【００９７】
分子スポンジの添加：各々１０ｎｇのＬｕｃ−ＤＵ鋳型を用いる二つの増幅反応を実施例２で説明したたように準備した。一方には，５％ｗ／ｖのＰＥＧ−８０００を添加した。増幅に続き，ＤＮＡをエタノール／塩沈殿し２６０ｎｍ及び２８０ｎｍの波長における吸光度測定に先駆けて適切な制限酵素で切断した。増幅収量に対しいかなる明確な効果も見られなかった。
【００９８】
ｂ）鋳型濃度 １．１５６ｎＭから２９ｎＭの濃度範囲を持つＬｕｃ−ＤＵ鋳型を含む増幅反応液を実施例２で説明したように調製した。増幅に続き，ＤＮＡをエタノール／塩沈殿し２６０ｎｍ及び２８０ｎｍの波長における吸光度測定に先駆けて適切な制限酵素で切断した。核酸濃度は波長２６０ｎｍ及び２８０ｎｍにおける吸光度測定によって決定した。上述の増幅条件下で５７８ｎＭの鋳型を用いたとき６７０倍の増幅が見られた。
【００９９】
ｃ）デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）濃度 ５７８ｎＭのＤＵを含む増幅反応液を実施例２で説明したように調製した。濃度１ｍＭから９ｍＭの範囲でｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｃＧＴＰ及びｄＴＴＰ（２５／２５／２５／２５の比率）を含む反応を検査した。増幅に続き，ＤＮＡを適切な制限酵素で切断し核酸濃度を吸光度測定により決定した。上述の増幅条件下で６ｍＭのｄＮＴＰ存在下で増幅は約３０００倍となった。
【０１００】
ｄ）鋳型に対するｄＮＴＰ比率のカスタマイズ（ｃｕｓｔｏｍｉｚａｔｉｏｎ） ５７８ｎＭのＬｕｃ−ＤＵ鋳型を含む増幅反応を本質的に実施例２で説明したとおり行った。ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを各々増幅混合液に最終濃度９ｎＭとなるように添加した。全体に対する各ｄＮＴＰの比率はルシフェラーゼ鋳型ＤＮＡユニットの組成を反映するように，すなわち２７．２％Ａ，２２．３％Ｃ，２４．２％Ｇ及び２６．３％Ｔを含むように調節した。増幅に続き，ＤＮＡをエタノール／塩沈殿し適切な制限酵素で切断した。核酸濃度は波長２６０ｎｍ及び２８０ｎｍにおける吸光度測定によって決定した。上述の増幅条件下で５７８ｎＭの鋳型を用いたとき約２，７８０倍の増幅が記録された。
【０１０１】
ｅ）Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ濃度 増幅反応液を上述のとおり調製し，９ｍＭのｄＮＴＰ存在下で５７８ｎＭのＤＮＡ鋳型に対し１から２０Ｕの範囲にわたる様々なＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）濃度を検査した。増幅に続いて，ＤＮＡを適切な制限酵素で切断し核酸濃度を吸光度測定により決定した。５７８ｎＭの鋳型に対し１ＵのＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼが２９０倍の増幅を起こすために十分であり，２０ＵのＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼは１０ｎｇの鋳型ＤＮＡを３，９８５倍に増幅した。
【０１０２】
ｆ）配列の規定されたエキソヌクレアーゼ耐性ヘキサマー濃度 増幅反応液を上述のとおり調製し，８００ｐｍｏｌまでの様々な濃度の配列が規定されたエキソヌクレアーゼ耐性ヘキサマーを検査した。増幅に続いてＤＮＡを適切な制限酵素で切断し核酸濃度を吸光度測定により決定した。プライマー濃度を初期実験条件（実施例２）から２倍に増加させると増幅収率が１．２５倍に増加した。
【０１０３】
ｇ）一段階増幅制限酵素反応 ５７８ｎＭのＬｕｃ−ＤＵ鋳型を含む増幅反応液を実施例２で説明したように調製した。増幅に続き，Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼを６５℃で２０分間反応させて熱失活し，６ＵのＢａｍＨ Ｉ酵素を直接反応液に添加した。３７℃で２時間反応させた後，酵素を熱失活しＤＮＡをエタノール／塩沈殿した。ＤＮＡ切断効率は上述のとおりアガロースゲル電気泳動により評価した。
【０１０４】
ｈ）様々な温度条件 先述（実施例１）のように設定された条件において，ＬａｃＺ−プラスミドの増幅を２５℃から３４℃の様々な温度にて実施した。最適温度はＤＮＡ収量及び品質によって決定した。ＤＮＡ収量は吸光度測定法により決定し，ＤＮＡ品質は完全長ＬａｃＺ遺伝子（３０４６ｂｐ）をレポーターとして改良型クンケル法（Ｎｅｌｓｏｎ， Ｊ．Ｒ． ｅｔ ａｌ．， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３２：Ｓ４４−Ｓ４７， ２００２に記載された（Ｋｕｎｋｅｌ Ｔ．Ａ； ＪＢＣ ２６０：５７８７−５７９６， １９８５））を用いたエラー率によって評価した。３２℃で行なわれた増幅反応により，３３００倍以上の増幅及び１．２２×１０−６のエラー率（報告されているＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのエラー率から２．５倍の低下）となった。
【０１０５】
ｉ）様々な反応回数による増幅 実施例１で説明した条件を用い，ＬａｃＺ−プラスミドの増幅を３２℃において１から１６時間にわたる様々な期間（反応回数）で行った。各時点においてＤＮＡポリメラーゼを６５℃で２０分間反応させて熱失活しＤＮＡを適切量の制限エンドヌクレアーゼを直接反応液に添加し切断した。最適な反応時間はＤＮＡ収量及び品質によって決定した。最適な反応時間では，３８００倍以上の増幅がポリマー化エラー率１．７×１０−６で得られた。
【０１０６】
ｊ）より低い酵素及び鋳型濃度での増幅 実施例１で説明した条件を用い，ＬａｃＺ−プラスミド及びルシフェラーゼ−ＤＵを，全量の酵素（Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ，Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ及び無機ピロホスファターゼを含む）濃度の半分量及び２８９ｎＭのＤＮＡ鋳型を含む反応液中で増幅した。増幅反応は３２℃で１６時間行った。ポリメラーゼの熱失活及びそれに続く増幅産物のエンドヌクレアーゼ切断の後，上述のとおりＤＮＡ収量及び品質を決定した。初期実験条件（実施例１）から酵素及び鋳型濃度を半量にすると，５０００倍以上の増幅がポリマー化エラー率７．７×１０−７（報告されているＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのエラー率から約４倍の低下）で得られた。
【０１０７】
ｋ）ＲＣＡにおけるコンカテマー形成の除去あるいは低減 実施例１で説明した条件を用い，ＬａｃＺ−プラスミドをＤＮＡポリメラーゼに加え２Ｕのメチル化感受性ＳｅｘＡＩエンドヌクレアーゼを含む反応液中で増幅した。反応は３２℃で１６時間行った。増幅及び切断に続き，合成されたＤＮＡのアガロースゲル電気泳動による解析により分離した（ｄｉｓｃｒｅｅｔ）直鎖ＤＮＡユニットが確認された。
【実施例５】
【０１０８】
実施例５−分子内ライゲーションの条件
ａ）Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ セルフリー増幅されたＤＮＡを制限酵素にて切断し，先述の酵素の熱失活及びＤＮＡのエタノール／塩沈殿を行った後，直鎖ＤＵの分子内ライゲーション（セルフライゲーション）を，それぞれ１ｘライゲーション緩衝液（５％のＰＥＧ−８０００；５０ｍＭのトリス塩酸ｐＨ７．５；１０ｍＭの塩化マグネシウム；１ｍＭのＤＴＴ；１ｍＭのＡＴＰ）中に７００ｆｍｏｌのＤＮＡを含む，１３８μｌ及び６９０μｌの反応液で行った。様々な量のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， ＵＳＡ）を添加し（０．６−１．５Ｕ），１４℃で少なくとも一時間ライゲーションを行った。先述のＤＮＡ対するライゲーション効率はアガロースゲル電気泳動により視覚的に決定された。６９０μｌ反応液中のｆｍｏｌのＤＮＡ当たり２９０μＵのＴ４ ＤＮＡリガーゼが単量体環状ＤＵの合成を促すために十分であると判断された。
【０１０９】
ｂ）その他のＤＮＡリガーゼ ＤＮＡを適切な制限酵素で直鎖化し先述の酵素を熱失活した後，直鎖ＤＵの分子内ライゲーション（セルフライゲーション）を行った。ライゲーションはＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）あるいはＴａｑ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を用い，製造業者の推奨に従いそれぞれ１４℃及び４５℃にて行った。ライゲーション効率はアガロースゲル電気泳動により視覚的に決定され，Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ産物と比較した。
【実施例６】
【０１１０】
実施例６−二本鎖環状ＤＮＡの濃縮
Ｔ４ ＤＮＡによるライゲーション産物をエタノール／塩沈殿し，製造業者の推奨に従い５ＵのＡＴＰ依存性ＤＮａｓｅを含有する２０μｌのＰｌａｓｍｉｄ ＳａｆｅＴＭＤＮａｓｅ緩衝液（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ）に再懸濁した。３７℃で３０分静置した後，ＤＮａｓｅ酵素を６５℃で２０分間反応させて熱失活した。反応効率はアガロースゲル電気泳動によって視覚的に決定し，適切な制限酵素によって再度直鎖状に切断できる環状ｄｓＤＮＡのみが存在することを確認した。
【実施例７】
【０１１１】
実施例７−増幅されたＤＮＡのマウスにおける発現
直鎖状のもの，ホスホロチオ酸化された直鎖状のもの，環状のもの，Ｐｌａｓｍｉｄ−ＳａｆｅＴＭＡＴＰ−依存性ＤＮａｓｅ（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）処理された環状のものを含む様々な形状のＬｕｃ−ＤＵが調整された。１μｇの様々な形状のＬｕｃ−ＤＵをマウス当たり２００μｌの最終容量，Ｎ：Ｐ比率１５：１でＰＢＳ中にてＭＡＡ−ＰＥＩと複合体を形成させた。各群は５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスからなり，マウスに対し単一形式のＭＡＡ−ＰＥＩ−Ｌｕｃ−ＤＵを尾部静脈から麻酔無しに投与した。マウス肺を投与から２４時間後に回収し，ルシフェラーゼ活性測定用緩衝液にホモジナイズした。ルシフェラーゼ遺伝子発現はＰｒｏｍｅｇａのＢｒｉｇｈｔ−ＧｌｏＴＭキットを用い，製造業者の取扱説明書に従い測定した。
【０１１２】
【表１】
【０１１３】
ＤＮＡにＭＡＡ−ＰＥＩを複合させないその他の実験において，ルシフェラーゼ酵素に対する発現カセットをより強いプロモーターに置換し，先述の実験を繰り返した。結果を以下の表にまとめる。
【０１１４】
【表２】
【０１１５】
“裸の”ＤＮＡを用いた実験も行った。この実験においては，ルシフェラーゼ遺伝子を発現する様々なＤＮＡ１５μｇを，担体を添加することなしに皮内投与によってマウスに導入した。投与部位としては尾の上部及び中間部を選択した。投与から２４時間後，実験動物を殺し，尾の上部及び中間部を解剖してホモジナイズし，先述のとおりルシフェラーゼ活性を評価した。これらの実験の結果を以下にまとめる。
【０１１６】
【表３】
【実施例８】
【０１１７】
実施例８−マウスにおけるＨＩＶ−１タンパクｇｐｌ６０に対する遺伝的免疫付与
ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ−１）エンベロープタンパクｇｐｌ６０の改変型（ｇｐｌ４５ΔＣＦｌ；Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ２００２； ７６： ５３５７−６８； Ｋｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ２００３； ７７： １２７６４−７２）を発現する真核生物カセットを鋳型として用い，直鎖状ｇｐｌ４５ΔＣＦｌ−ＤＵ発現カセットを実施例２で説明したとおり大量生成した。
【０１１８】
すべての動物実験は動物研究に対する施設内倫理委員会（Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ； ＢＣＭ）による承認を受けた。ｇｐｌ４５ΔＣＦｌタンパクを発現するスーパーコイル化したプラスミドＤＮＡ及びセルフリー増幅された直鎖状ＤＮＡ（プラスミド骨格の配列を含まない）を生理食塩水に希釈し，ＢＡＬＢ／ｃマウスの前脛骨筋に投与した。各マウスは０日目，１４日目及び２８日目に各脚に５０μｇの投与を受けた。血液サンプルは１４日目（２週間），２８日目（４週間），４２日目（６週間）及び５６日目（８週間）に回収した。生理食塩水のみを投与したコントロール群に加え，各ＤＮＡ型に対し５匹のマウスからなる群を用いた。各血液サンプル由来の血清を酵素免疫測定法（ＥＬＩＺＡ）に用い，ｇｐｌ６０に対するＩｇＧ抗体力価を評価した。簡潔に説明すると，９６ウェルマイクロ力価測定プレートを，５０ｍＭのカルボン酸緩衝液ｐＨ９．５中に１２．５ｎｇ／μＬの精製リコンビナントＨＩＶ−１ＩＩＩＢｇｐｌ６０（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）を含む溶液でコートした。ウェルを続いて０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）にて洗浄し，ＰＢＳ−Ｔに３％ＢＳＡを含む溶液でブロックした。系列希釈したマウス抗血清１００μｌ（３％ＢＳＡ中）をプレートに上層し４℃で一晩静置した。プレートをＰＢＳ−Ｔにて洗浄し，１：１０，０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ共役ヤギ抗マウス二次抗体（Ｐｉｅｒｃｅ）１００μｌで満たした。十分な洗浄後，３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（Ｓｉｇｍａ）５０μｌを添加し比色分析反応を０．５規定硫酸（Ｈ２ＳＯ４）にて停止した。最適な濃度測定は４６０ｎｍにて測定した。
【実施例９】
【０１１９】
実施例９−増幅産物の精製
最終的な形状（直鎖状，環状あるいはその他）に一度処理されると，増幅産物はセファクリルＳＦ−１０００（ＧＥＨＣ）によるゲルろ過クロマトグラフィーを用いて精製される。簡潔に説明すると，ＤＮＡは１．７ｍ×１．５ｃｍのＥｃｏｎｏカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に加えられ，１０ｍＭのトリス塩酸ｐＨ８，１５０ｍＭの塩化ナトリウム，５ｍＭのＥＤＴＡにて流出速度１ｍＬ／３．６分で溶出した。各溶出画分に含まれるＤＮＡをアガロースゲル電気泳動によって測定し，望ましい画分を回収した。続いて画分をＣｅｎｔｒｉｐｌｕｓ ３００カートリッジ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．）を用い製造業者の推奨に従って濃縮した。
【０１２０】
別の方法として，ＦＰＬＣあるいはＨＰＬＣ系に装着したＱセファロースカラムを用いたアニオン交換クロマトグラフィーを利用できる。低塩緩衝液（ＬＳＢ；１０ｍＭのトリス塩酸 ｐＨ８）に溶解したＤＮＡをカラムに上層する。カラムを１０倍容量のＬＳＢで洗浄する。ＤＮＡはレジンからカラムの２０倍容量の１０−１００％直線低濃度勾配を持つ溶出緩衝液（ＥＢ；ＬＳＢ及び３Ｍ塩化ナトリウム）により溶出した。溶出液を２５４ｎｍにおいて測定し，ＤＮＡを含むピークのみを回収した。続いてＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社のＰｅｌｌｉｃｏｎ ＩＩ ＵＦ膜を用いた限界ろ過により脱塩を行った。ＤＮＡの品質／完全性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）をアガロースゲル電気泳動にて解析した。
【実施例１０】
【０１２１】
実施例１０−セルフリー増幅されたＤＮＡの品質評価
各産物ロットには，個別の識別番号を割り当て，ＤＮＡ濃度，純度及び信頼性を決定するため一連の検査を行った。ＤＮＡ濃度は２６０ｎｍにおける吸光度によって決定した。ＤＮＡ純度は複数の方法により決定した。吸光度Ａ２６０／２８０比，リアルタイムＰＣＲ（ゲノムＤＮＡの夾雑），ＨＰＬＣ（ＲＮＡの夾雑），マイクロ−ＢＣＡ検定（タンパク含有量，Ｐｉｅｒｃｅキット）及びＬＡＬ検定（エンドトキシン含有量，Ｃａｍｂｒｅｘキット）により決定した。加えてバイオバーデン検査を行い最終産物の無菌性を確認した。各検定の都度，薬品業者が定めた仕様に従う必要があった。
【０１２２】
【表４】
【実施例１１】
【０１２３】
実施例１１−ウサギにおけるＢ型肝炎ウイルスに対する遺伝的免疫付与
Ｂ型肝炎ウイルス小表面抗原（ＨＢｓ（Ｓ）； Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９９３； Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． ２： １８４７−１８５１．）を鋳型として利用し，直鎖ＨＢｓ（Ｓ）−ＤＵ発現カセットを実施例２で説明したように大量生成した。３匹の雌ＮＺアルビノウサギからなる群を０日目，２８日目，及び５６日目において各回の合計投与量４００μｇのプラスミドあるいはセルフリー増幅された同等量の直鎖ＤＮＡを両側（後肢）筋内投与することにより免疫付与した。各サンプル由来の血清を０日目，２８日目，４２日目，５６日目及び６３日目に回収し，確立されたＥＬＩＺＡ法により解析し液性免疫反応の程度を決定した。図９はＨＢｓ（Ｓ）スーパーコイル化プラスミドあるいはセルフリ−ＨＢＶｓ（Ｓ）−ＤＵ直鎖ＤＮＡで免疫付与したウサギ３匹に由来する血清の，２８日目及び６３日目（０日目で正規化した）のＥＬＩＺＡ解析吸光度を示す。
【実施例１２】
【０１２４】
実施例１２−マウスにおけるインフルエンザＨＩＮＩウイルスに対する遺伝的免疫付与
各実験につきＢＡＬＢ／ｃマウスを５匹ずつ用いた。すべての動物実験は動物研究に関する施設内倫理委員会（Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ； ＢＣＭ）の承認を受けた。インフルエンザＡ／プエルトリコ／８／３４（Ａ／ＰＲ８；ＨＩＮＩ）をＢＣＭの呼吸器病原体研究ユニットより入手した。ＤＮＡによる免疫付与はＰＢＳ中の５０μｇ全核酸を用い，上述のとおり行った。ウイルス系統Ａ／ＰＲ８／３４（ＨＡ）由来のインフルエンザヘムアグルチニンのオープンリーディングフレームをｐＣＡＧ−ＨＡ−ＷＰＲＥプラスミド（Ｇａｒｇ ｅｔ ａｌ， ２００４， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７３（ｌ）：５５０−８）より単離し，ｐＣＭＶ−ＭＣＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングしてｐＣＭＶ−ＨＡを作製した。プラスミド骨格を除いたＣＭＶ−ＨＡ発現カセットを実施例２で説明したように増幅した。動物には３回，０週目，２週目及び６週目において投与した。５つの異なる実験を実施した。１）マウスを５０μｇのｐＣＭＶ−ＨＡにより免疫付与した。２）マウスを５０μｇのＨＡ−ＤＵにより免疫付与した。３）マウスを２５μｇのＨＡ−ＤＵ及び２５μｇのあらゆる発現カセットの骨格を除いたプラスミドＤＮＡ（エンプティーベクター，ｐＥＶ）の混合物により免疫付与した。４）マウスを１６．７μｇのＨＡ−ＤＵ及び二つのサイトカイン発現プラスミド，すなわち１６．７μｇのｐＣＭＶｉ−ＧＭＣＳＦ及び１６．７μｇのｐＣＡＧＧＳＩＬ１２（Ｏｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２００５， Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｅｒｏｓｏｌ ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ （Ｉｎ Ｐｒｅｓｓ））の混合物により免疫付与した。５）マウスを１６．７μｇのｐＣＭＶ−ＨＡ及び上述の二つのサイトカイン発現プラスミドの混合物により免疫付与した。
【０１２５】
免疫付与の８週間後，血清サンプルを各動物から回収し，ウイルス中和力価解析を行った。免疫付与実験において回収された血清を熱失活し（５６℃で３０分），標準化されたマイクロ中和試験を用いて中和効率をインビトロで評価した。簡潔に説明すると，血清サンプルを９６ウェル丸底型組織培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ ３０７７）２つを一式とし，ＭＥＭを希釈液に用い１：２に系列希釈した。その後約１００メジアンの５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）のＡ／ＰＲ８ウイルスを各ウェルに添加した。検査ウイルスの逆滴定もこの時点で行った。血清及びウイルスを含むプレートを３７℃にて９０分間静置し，後に丸底型プレートの内容物を単層のＭａｄｉｎ Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞を含む新しいプレートに移した。３７℃にて一晩静置した後，各ウェルの培地を除去し２μｇ／ｍｌのＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎトリプシン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．， カタログ番号 ３２Ｃ５４６８），ペニシリン及びストレプトマイシンを含み，血清を含まないＭＥＭで置換した。４日後，洗浄しＰＢＳ中に再懸濁した０．５％トリ血球細胞懸濁液（ｒｂｃ）を各ウェルに添加した。血清コントロールウェル中のｒｂｃが堅固なボタンを形成した時点で，各ウェルのヘムアグルチニン化パターンを読み取り記録した。ｒｂｃの堅固なボタンが見られるウェルはＦＶ陰性と考えられ，拡散したヘムアグルチニン化パターンが記録されたウェルはウイルスに対し陽性であると考えられた。図１０は，様々な遺伝的免疫付与実験に対しウイルス複製が阻害される限界希釈率として記録したウイルス中和力価を示す。
【産業上の利用可能性】
【０１２６】
本発明は高品質核酸の合成方法及びその使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】図１は有用な鋳型を作成する多様な機構を示す。例えば，鋳型はプラスミド改変，ＰＣＲ増幅，化学合成，あるいはｃＤＮＡ合成によって生成される。
【図２】図２は本発明の一実施態様に関するＲＣＡ法に基づく増幅工程を示す。この工程は環状の鋳型からコンカテマーを合成するためにポリメラーゼを用いる。コンカテマーは少なくとも一つの欠損のない発現カセットを含む小さいフラグメントに処理される。合成された産物は短い直鎖状ユニット，環状化された核酸（ＣＮＡｓ），あるいはスーパーコイル化された環状核酸（ｓＣＮＡｓ）として用いることができる。
【図３】図３は本発明のその他の実施態様に関する方法を示す。この方法は二本鎖鋳型のフォワード鎖（Ａ）及びリバース鎖（Ｂ）を別々に増幅する。二つの分離した反応槽において，各鎖を増幅し環状化して一本鎖環を形成する。各槽においては鎖特異的なプライマーを用いて一つの鎖のみが増幅される。その後，制限酵素切断部位の配列（ＯＲ１あるいはＯＲ２）からなる二番目のオリゴヌクレオチドを一本鎖におけるあらかじめ設計された部位にアニール化させ，短い断片の二本鎖鋳型が形成され制限酵素による切断が可能となる。切断に続き，変性させる前に，二本鎖末端をＤＮＡリガーゼにより環状化する。ライゲーションに続き，オリゴヌクレオチドを変性させ一本鎖環を形成させ，次に相補的な一本鎖環と結合させて単量体のみを含む二本鎖環を形成させる。本方法は二量体，三量体及び他の多量体副産物の形成を最小にする。
【図４】図４は本発明の一実施態様に関するＲＣＡ工程のスケールアップを示す。この工程は鋳型，プライマー，緩衝液要素及び酵素の，指定時間における段階的な添加及び指定温度への変化を含む。これにより産物の大量生成を短期間に行う効率的な方法を提供できる。ライゲーションに先駆けて反応容量を希釈することにより単量体環状産物の生成が優勢となる。
【図５】図５は自動化された増幅装置の設計を示す。（Ａ）は多数の１ｍｌ以下の容量からなる個々の反応により多数の異なる鋳型を同時に増幅するために用いられるモデルを示す。（Ｂ）は大量の単一ＤＮＡ産物合成を可能にする単一の槽の利用を示す。（１）反応パラメーターをコントロールするためにプログラム可能なコンピューターへのアクセス部；（２）反応パラメーターを評価し調整するためのモニター：（３）酵素，緩衝液，及び他の構成物を含むストック溶液のための温度調節されたチャンバー；（４）反応槽に試薬を添加するための分注口；（５）温度調節された反応槽；（６）多数のウェルを持つディスペンサー；（７）多数のウェルをもつ反応槽プレート；（８）多数のウェルをもつプレートのための温度調節されたチャンバーである。
【図６】図６は粘性のある反応混合液を混合するための様々な方法を概略的に示したものである。（Ａ）プロペラ様混合槽；（Ｂ）孔の開いたディスクによる混合槽；（Ｃ）蠕動ポンプを用いた再循環混合槽である。（Ｃ）においては，（１）は（２）に保持された試薬を目盛測定により添加するための調節可能な自動化制御部及び引き込み口である。（１）の調節可能な制御部により試薬と反応混合液を制御して混合することができ，送出口の反対側に位置するチャンバーに試薬の加えられた反応混合液を戻すことにより反応混合液を全体的に混合することができる。試薬なしに連続的なポンプによる送り込みを行うことで完全な混合が容易となる。
【図７】図７は分子内ライゲーションの工程を示す。槽（Ｂ）におけるＤＮＡ増幅及び切断の後，反応混合液をゆっくりとライゲーション混合液を含む二番目の槽（Ａ）に加える。槽（Ａ）にＤＮＡをゆっくりと加えることによりＤＮＡが十分に希釈され単量体ＣＮＡ形成が容易となる。
【図８】図８は本発明の一実施態様に従って合成されたプラスミド，短い発現カセット（合成ＤＮＡ，ｓｙｎＤＮＡ），及びコントロール溶液により免疫付与したＢａｌｂ／ｃマウスにおいて生産されたｇｐｌ６０に対するＩｇＧ抗体の力価を示す。
【図９】図９は本発明の一実施態様に従って調製されたＢ型肝炎ウイルス表面小抗原（ｓｍａｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ）（ＨＢｓ（Ｓ））の配列を含むプラスミドあるいは合成ＤＮＡ（発現カセット）を用い，ウサギに免疫付与した結果を示す。これらの結果は本発明の合成発現カセットがウサギにおいて免疫反応を誘導するために効果的であることを明確に示す。
【図１０】図１０はＢＡＬＢｃマウスのインフルエンザＨ１Ｎ１ウイルスに対する免疫付与の結果を示す。図はウイルス中和力価を様々な遺伝子による免疫付与実験に対しウイルス複製が阻害される最終希釈率として記録したものを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）鋳型−プライマーの複合体を形成させるため，反応液中の環状鋳型を少なくとも鋳型の一方の鎖に相補的な一つあるいはそれ以上のプライマーと結合させる工程と，
（ｂ）前記環状鋳型のタンデムユニットを含むコンカテマーを合成するため，前記鋳型−プライマーの複合体を少なくとも一つのフィデリティの高い核酸ポリメラーゼと培養する工程と，
（ｃ）前記コンカテマーを，目的とする配列を持つ送達ユニットを少なくとも一つ含む小さいフラグメントに切断する工程と，
を含む高品質核酸をセルフリー系で生産するための方法。
【請求項２】
（ｄ）前記小さいフラグメントの末端を挿入あるいは除去する工程，小さい環状フラグメントを得るために前記小さいフラグメントの端部をライゲーションする工程，及び前記小さい環状フラグメントをスーパーコイル化する工程のうち，一つあるいはそれ以上の工程をさらに含む，請求項１に記載の方法。
【請求項３】
改変された末端及び／又は改変された内部塩基を得るために，前記小さいフラグメント又は前記小さい環状フラグメントを改変する工程をさらに含む，請求項１あるいは２に記載の方法。
【請求項４】
前記小さいフラグメントあるいは前記小さい環状フラグメントをペプチドと共役させる工程をさらに含む，請求項１−３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記送達ユニットが一つあるいはそれ以上の発現カセットを含む，請求項１−４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記フィデリティの高い核酸ポリメラーゼがＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼあるいはその派生物である，請求項１−５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記フィデリティの高い核酸ポリメラーゼが，ＤＮＡポリメラーゼＩ，ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ，Ｔ３ ＤＮＡポリメラーゼ，Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ，Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼ，Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ，及びそれらの派生物から選択されるものである，請求項１−５のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記コンカテマーの切断を，制限酵素を用いることにより行う，請求項１−７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
請求項１−８のいずれかに記載の方法により調製された前記送達ユニットを含む組成物。
【請求項１０】
請求項１−８のいずれかに記載の方法により調製された前記送達ユニットの，ヒト，動物あるいは植物の疾病又は遺伝的疾患の予防用あるいは治療用の薬剤製造のための使用。
【請求項１１】
前記疾病が，ＨＩＶ，インフルエンザウイルス，パラインフルエンザウイルス，アデノウイルス，コロナウイルス，単純ヘルペスウイルス，帯状疱疹ウイルス，パピローマウイルス，及びライノウイルスのいずれかにより引き起こされる，請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記疾病が，バクテリア，ミコバクテリア，真正細菌，あるいは真菌により引き起こされる，請求項１０に記載の使用。
【請求項１３】
ヒトあるいは動物の免疫付与における，請求項１−８に記載の方法により調整された前記送達ユニットあるいは請求項９の組成物の使用。
【請求項１４】
直接投与（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ），エアロゾル，リポソーム，あるいはウイルス由来の粒子により前記送達ユニットあるいは前記組成物が送達される，請求項１３の使用。
【請求項１５】
少なくとも一つの注入口及び注出口を持ち，連続的にｃＧＭＰ品質を確証可能な反応槽と，
前記注入口に装着され，少なくとも一つの外部要素を外部の保持チャンバーから前記反応槽に供給する入力装置と，
前記入力装置に連結された少なくとも一つの外部保持チャンバーと，
前記外部保持チャンバーから前記入力装置を介して前記反応槽へと外部要素をポンプ輸送する手段と，
前記反応槽の注出口に装着された出力（ｅｘｐｏｒｔ）装置と，
前記出力装置に連結された少なくとも一つの受け入れチャンバーと，
前記反応槽の温度を制御する手段と，
前記反応槽中の反応混合液（ｍｉｘｔｕｒｅ）の進行を監視及び制御する手段と，
前記反応混合液を混合する手段と，
を含む高品質核酸を産生するための装置。
【請求項１６】
前記反応槽が，可塑性の素材で形成されて槽外に前記混合装置が装備されたもの，又は，固めた形成材で形成されて槽中に前記混合装置が装備されたものである，請求項１５の装置。
【請求項１７】
前記ポンプが蠕動式ポンプを含む，請求項１５又は１６の装置。
【請求項１８】
前記入力装置が，前記反応槽を通して前記反応混合液の循環を容易にするために前記出力装置と連結可能である，請求項１５，１６又は１７の装置。
【請求項１９】
前記反応槽が第二の注入口及び第二の注出口をさらに含み，前記反応混合液をポンプ輸送する手段を有する循環装置が前記第二の注入口を前記第二の注出口に連結する，請求項１５，１６又は１７の装置。
【請求項２０】
前記循環装置が，少なくとも一つの外部要素を外部の保持チャンバーから前記循環装置内に含まれる前記反応混合液に添加する手段を含む，請求項１８の装置。
【請求項１】
（ａ）鋳型−プライマーの複合体を形成させるため，反応液中の環状鋳型を少なくとも鋳型の一方の鎖に相補的な一つあるいはそれ以上のプライマーと結合させる工程と，
（ｂ）前記環状鋳型のタンデムユニットを含むコンカテマーを合成するため，前記鋳型−プライマーの複合体を少なくとも一つのフィデリティの高い核酸ポリメラーゼと培養する工程と，
（ｃ）前記コンカテマーを，目的とする配列を持つ送達ユニットを少なくとも一つ含む小さいフラグメントに切断する工程と，
を含む高品質核酸をセルフリー系で生産するための方法。
【請求項２】
（ｄ）前記小さいフラグメントの末端を挿入あるいは除去する工程，小さい環状フラグメントを得るために前記小さいフラグメントの端部をライゲーションする工程，及び前記小さい環状フラグメントをスーパーコイル化する工程のうち，一つあるいはそれ以上の工程をさらに含む，請求項１に記載の方法。
【請求項３】
改変された末端及び／又は改変された内部塩基を得るために，前記小さいフラグメント又は前記小さい環状フラグメントを改変する工程をさらに含む，請求項１あるいは２に記載の方法。
【請求項４】
前記小さいフラグメントあるいは前記小さい環状フラグメントをペプチドと共役させる工程をさらに含む，請求項１−３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記送達ユニットが一つあるいはそれ以上の発現カセットを含む，請求項１−４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記フィデリティの高い核酸ポリメラーゼがＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼあるいはその派生物である，請求項１−５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記フィデリティの高い核酸ポリメラーゼが，ＤＮＡポリメラーゼＩ，ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ，Ｔ３ ＤＮＡポリメラーゼ，Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ，Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼ，Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ，及びそれらの派生物から選択されるものである，請求項１−５のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記コンカテマーの切断を，制限酵素を用いることにより行う，請求項１−７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
請求項１−８のいずれかに記載の方法により調製された前記送達ユニットを含む組成物。
【請求項１０】
請求項１−８のいずれかに記載の方法により調製された前記送達ユニットの，ヒト，動物あるいは植物の疾病又は遺伝的疾患の予防用あるいは治療用の薬剤製造のための使用。
【請求項１１】
前記疾病が，ＨＩＶ，インフルエンザウイルス，パラインフルエンザウイルス，アデノウイルス，コロナウイルス，単純ヘルペスウイルス，帯状疱疹ウイルス，パピローマウイルス，及びライノウイルスのいずれかにより引き起こされる，請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記疾病が，バクテリア，ミコバクテリア，真正細菌，あるいは真菌により引き起こされる，請求項１０に記載の使用。
【請求項１３】
ヒトあるいは動物の免疫付与における，請求項１−８に記載の方法により調整された前記送達ユニットあるいは請求項９の組成物の使用。
【請求項１４】
直接投与（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ），エアロゾル，リポソーム，あるいはウイルス由来の粒子により前記送達ユニットあるいは前記組成物が送達される，請求項１３の使用。
【請求項１５】
少なくとも一つの注入口及び注出口を持ち，連続的にｃＧＭＰ品質を確証可能な反応槽と，
前記注入口に装着され，少なくとも一つの外部要素を外部の保持チャンバーから前記反応槽に供給する入力装置と，
前記入力装置に連結された少なくとも一つの外部保持チャンバーと，
前記外部保持チャンバーから前記入力装置を介して前記反応槽へと外部要素をポンプ輸送する手段と，
前記反応槽の注出口に装着された出力（ｅｘｐｏｒｔ）装置と，
前記出力装置に連結された少なくとも一つの受け入れチャンバーと，
前記反応槽の温度を制御する手段と，
前記反応槽中の反応混合液（ｍｉｘｔｕｒｅ）の進行を監視及び制御する手段と，
前記反応混合液を混合する手段と，
を含む高品質核酸を産生するための装置。
【請求項１６】
前記反応槽が，可塑性の素材で形成されて槽外に前記混合装置が装備されたもの，又は，固めた形成材で形成されて槽中に前記混合装置が装備されたものである，請求項１５の装置。
【請求項１７】
前記ポンプが蠕動式ポンプを含む，請求項１５又は１６の装置。
【請求項１８】
前記入力装置が，前記反応槽を通して前記反応混合液の循環を容易にするために前記出力装置と連結可能である，請求項１５，１６又は１７の装置。
【請求項１９】
前記反応槽が第二の注入口及び第二の注出口をさらに含み，前記反応混合液をポンプ輸送する手段を有する循環装置が前記第二の注入口を前記第二の注出口に連結する，請求項１５，１６又は１７の装置。
【請求項２０】
前記循環装置が，少なくとも一つの外部要素を外部の保持チャンバーから前記循環装置内に含まれる前記反応混合液に添加する手段を含む，請求項１８の装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２００８−５２２６２８（Ｐ２００８−５２２６２８Ａ）
【公表日】平成２０年７月３日（２００８．７．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５４５７１７（Ｐ２００７−５４５７１７）
【出願日】平成１７年１２月１２日（２００５．１２．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４５０２８
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０６３３５５
【国際公開日】平成１８年６月１５日（２００６．６．１５）
【出願人】（５０５４４８７３０）サイトジェニックス， インコーポレイテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年７月３日（２００８．７．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１２月１２日（２００５．１２．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４５０２８
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０６３３５５
【国際公開日】平成１８年６月１５日（２００６．６．１５）
【出願人】（５０５４４８７３０）サイトジェニックス， インコーポレイテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]