齲蝕予防のための食品及び口腔ケア剤組成物
【課題】より安全かつ安価で、消費者に受け入れられやすく、機能性食品への使用も可能なバイオフィルム形成阻害、バイオフィルム分解成分を提供する。
【解決手段】キノコ類、特にシイタケから、歯垢生成阻害、及び分解を促すことで齲蝕予防を促進する成分を含む水溶液を抽出し、その水溶性抽出液に含まれる成分を有効成分とする齲蝕予防用組成物、洗口剤、歯磨剤等の口腔ケア剤、及び齲蝕予防用食品とする。また、本発明はシイタケ等α‐グルカンを細胞壁に有するキノコ子実体のタンパク質抽出液で、好ましくは０．４Ｍ以上の塩を含んだバッファーによって破砕抽出した成分を含む。子実体のみならず、菌糸体培養物からの水溶性抽出成分、あるいはキノコの菌床栽培にて菌床中に蓄積する水溶液を含む。
【解決手段】キノコ類、特にシイタケから、歯垢生成阻害、及び分解を促すことで齲蝕予防を促進する成分を含む水溶液を抽出し、その水溶性抽出液に含まれる成分を有効成分とする齲蝕予防用組成物、洗口剤、歯磨剤等の口腔ケア剤、及び齲蝕予防用食品とする。また、本発明はシイタケ等α‐グルカンを細胞壁に有するキノコ子実体のタンパク質抽出液で、好ましくは０．４Ｍ以上の塩を含んだバッファーによって破砕抽出した成分を含む。子実体のみならず、菌糸体培養物からの水溶性抽出成分、あるいはキノコの菌床栽培にて菌床中に蓄積する水溶液を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、齲蝕の原因となる歯垢生成阻害及び分解を促すことで、齲蝕予防を促進する成分に関し、さらに、キノコ類、特にシイタケの水溶性抽出液に含まれる歯垢、齲蝕原性口腔バイオフィルムの形成阻害能、及び分解能をもつ成分を、齲蝕予防用食品、洗口剤、歯磨剤等の有効成分として有する食品、及び口腔ケア剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
齲蝕予防には、デンタルプラーク、齲蝕原性バイオフィルム等と呼ばれる歯垢の除去や形成阻害が必要である。齲蝕の原因となる歯垢は、ミュータンス連鎖球菌が砂糖を基質として合成するα‐１，３‐１，６‐グルカンを多量に含む、強固なバイオフィルムであることが知られている（非特許文献１）。
【０００３】
一方、シイタケ等のキノコ類は免疫活性化能を持つなど、一般に全身の健康維持増進に有効であることが知られ、様々な健康食品が作られている（特許文献１）。特に、免疫賦活成分である、シイタケβ‐グルカンを主成分とした健康食品はヒトにおける臨床試験での安全性も確認されている。
【０００４】
しかしながら、キノコの口腔保健への効果については情報が少なく、齲蝕予防においての研究例に関してはほとんど見あたらない。ところが、キノコ類は多種多用なグルカン分解酵素を持つことが分かってきており（特許文献２）、その細胞壁、特にシイタケには、大量のα‐１，３‐グルカンが多量に含まれることも、報告されている（非特許文献２）。したがって、シイタケを代表とする、α‐グルカンを細胞壁成分に含むキノコ類はα‐グルカンの合成や分解、伸長調整等に関与するタンパク質等の機能性成分を有することが予想される。
【０００５】
現在、歯垢の除去や形成阻害を目的として、デキストラナーゼ（α‐１，６‐グルカナーゼ）が実用化され、歯磨剤等に配合されている（特許文献３及び４）。しかし、デキストラナーゼ単独では歯垢の除去や形成阻害効果は限定的であることも知られており、α‐１，３‐グルカナーゼ（ムタナーゼ）等の開発研究が継続して行われている（特許文献５〜７）。
【０００６】
これまでの報告や研究は主としてバチルス属やペニシリウム属といった土壌細菌や糸状菌が生産するデキストラナーゼ及びムタナーゼに限定されていた。デキストラナーゼやムタナーゼの由来となる微生物は我々が食経験を持たない生物種であり、それらの生産にはAspergillus oryzaeやBacillus subtillisなどの組換え微生物が想定されている。消費者に受け入れられやすいとはいえないものであり、より安全かつ安価で、さらには機能性食品への使用も可能なバイオフィルム形成阻害、バイオフィルム分解成分の開発が求められていた。
【０００７】
【非特許文献１】Kuramitsu and Ellen (2000) Oral Bacterial Ecology. P226-228. Horizon scientific press.
【非特許文献２】松田和雄 編著（１９８７）多糖の分離・精製法 p50-51. 学会出版センター
【特許文献１】国際公開０２／０８７６０３号パンフレット
【特許文献２】特開２００７−３１２６１８号公報
【特許文献３】特許第３３５１０３５号公報
【特許文献４】特許第３４９６２７９号公報
【特許文献５】特表２０００−５０５６４９号公報
【特許文献６】特開平８−３０８５５８号公報
【特許文献７】特開２００６−１３６２８４号公報
【特許文献８】特開２００５−３４１８８２号報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記問題に鑑み、より安全かつ安価で、消費者に受け入れられやすく、機能性食品への使用も可能なバイオフィルム形成阻害、バイオフィルム分解成分を提供することを課題とする。
すなわち、本発明は、キノコ類、特にシイタケの水溶性抽出液に含まれる成分を有効利用した齲蝕予防用組成物、及び、食品、洗口剤及び歯磨剤等の有効成分とすることによって、より安全かつ安価で消費者に受け入れやすい機能性食品及び口腔ケア剤等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
シイタケ等の食用キノコ類は世界各地で長い食経験を有し、健康機能性を認知されてきた有用食品であり、細胞壁中にβ‐グルカンやα‐グルカンを有することが知られている。従って、α‐グルカンの合成や分解、伸長促進など、様々な調整成分を有することが予想される。しかし、キノコのα‐グルカンには、β‐グルカンのような顕著な健康機能が見いだされなかった経緯から、α‐グルカンに関連する研究はほとんど行われていないのが現状であった。発明者は、α‐グルカンを主要な構成成分とする歯垢の除去や形成阻害にキノコの有するα‐グルカン関連成分を利用すべく鋭意研究した結果、齲蝕原性バイオフィルムの形成阻害、分解能を有するシイタケの水溶性抽出液の開発に成功した。
【００１０】
すなわち、本発明はキノコ類、特にシイタケから、歯垢生成阻害、及び分解を促すことで齲蝕予防を促進する成分を含む水溶液を抽出し、その水溶性抽出液に含まれる成分を有効成分とする齲蝕予防用組成物、洗口剤、歯磨剤等の口腔ケア剤、及び齲蝕予防用食品を提供するものであり、具体的には次の技術を基礎とする。
【００１１】
（１） キノコ由来の水溶性抽出成分を有効成分とする齲蝕予防用組成物。
【００１２】
（２） 水溶性抽出成分が歯垢形成抑制及び分解活性を有するものであることを特徴とする（１）記載の齲蝕予防用組成物。
【００１３】
（３） キノコ由来の水溶性抽出成分がシイタケ由来のものであることを特徴とする（２）記載の齲蝕予防用組成物。
【００１４】
（４） キノコ由来の水溶性抽出成分がシイタケ菌床培養廃液中に含まれる成分であることを特徴とする（３）記載の齲蝕予防用組成物。
【００１５】
（５） キノコ由来の水溶性抽出成分がスクロース依存的なバイオフィルム形成を阻害する活性を有するタンパク質を含むことを特徴とする（１）記載の齲蝕予防用組成物。
【００１６】
（６） 上記（１）〜（５）のいずれかに記載の齲蝕予防用組成物を有効成分として含むことを特徴とする食品。
【００１７】
（７） 上記（１）〜（５）のいずれかに記載の齲蝕予防用組成物を有効成分として含むことを特徴とする口腔ケア剤。
【００１８】
（８） 上記（１）〜（５）のいずれかに記載の齲蝕予防用組成物を有効成分として含むことを特徴とする家畜用飼料。
【００１９】
本発明はシイタケ等α‐グルカンを細胞壁に有するキノコ子実体のタンパク質抽出液で、好ましくは０．４Ｍ以上の塩を含んだバッファーによって破砕抽出した成分を含む。
また、子実体のみならず、菌糸体培養物からの水溶性抽出成分、あるいはキノコの菌床栽培にて菌床中に蓄積する水溶液を含む。
また、α‐グルカンを細胞壁に有することが知られる他の微生物、例えば麹菌等の糸状菌、酵母等のタンパク質抽出液にも、一定のバイオフィルム抑制、分解効果が期待できる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明により、多彩な健康機能を持つキノコ、好ましくはシイタケを齲蝕予防に活用することが可能となった。シイタケ抽出液は簡便に調整でき、グルカナーゼ等の活性成分を高度に精製すること無くバイオフィルムの形成阻害効果のある齲蝕予防用組成物を得ることができる。
また、加工食品中にシイタケ抽出成分を添加することで、口腔バイオフィルムへ作用する新規の機能性食品を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
各種キノコから水溶性の有効成分を抽出し、齲蝕予防用組成物を得る。効果の確認は、齲蝕病原細菌であるS. mutans, S. sobrinusが形成するスクロース依存的バイオフィルム、すなわち歯垢の実験モデルを分解、あるいは形成阻害することを確認することによって行う。
【００２２】
＜キノコ成分の抽出について＞
キノコは生でも乾燥したものでもよく、カッター等で切り刻んだものや各種のミルで粉状に粉砕したものでも良い。各種キノコからの水溶性成分抽出は、一般的なタンパク質抽出に用いられる方法、例えば標準的なナトリウムリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を用い、好ましくは０．４Ｍ以上の食塩を加えたＰＢＳを用いる。また、キノコの重量に対し２倍容量以上の緩衝液を使用すること、及び抽出を４℃程度の低温で行うことが望ましい。キノコに緩衝液を加えた後、ブレンダー（ワーリング社ブレンダー等）やホモジナイザー（KINEMATICA社ポリトロン等）など標準的な装置を用いて破砕する。破砕後、冷却遠心機で遠心を行って細胞残渣を沈殿させ、上清の水溶性画分を回収し、ポアサイズ０．４５μｍ以下のフィルター（ミリポア社マイレクス‐HVフィルターユニット等）で滅菌を行い、実験に用いる。
【００２３】
＜バイオフィルムの形成＞
歯垢モデルである、スクロース依存的バイオフィルムの形成は、S. mutans, S. sobrinusを０．５％のスクロースを加えたBrain Heart Infusion(BHI)培地中でアネロパック・ケンキ（三菱ガス化学株式会社）等を用いて、組織培養用９６穴プレート（コーニング社、住友ベークライト社など）中に嫌気的に培養することによって行う。
【００２４】
＜バイオフィルム分解効果及び形成阻害効果の定量＞
バイオフィルムの分解効果は、バイオフィルム形成後、プレートをＰＢＳ等の緩衝液で洗浄して浮遊する菌を除き、乾燥させたバイオフィルムに対し、キノコ抽出成分を緩衝液と共に加え、３７℃でインキュベートすることで行う。その後、バイオフィルム量を定量することによって、バイオフィルム形成阻害効果、バイオフィルム分解効果を定量することが出来る。
【００２５】
＜バイオフィルムの定量＞
バイオフィルムの定量は、１％クリスタルバイオレット水溶液等の色素溶液でバイオフィルムを染色し、ＰＢＳ等の水溶性バッファーを用いて余分な色素を洗い流した後、メタノールでバイオフィルムを染色した色素を溶出させ、メタノール中の色素量を、吸光度（ＯＤ５９５）を測定することによって行う。
以上の方法を用いることで、キノコ抽出成分に含まれるバイオフィルム分解、及びバイオフィルム形成阻害効果を定量できる。
【００２６】
＜キノコ抽出成分を含む歯磨剤、及び口腔洗浄液＞
齲蝕予防のために様々な成分が開発され、歯磨剤や洗口液中に配合されており、バイオフィルムの分解や形成抑制を目的として、デキストラナーゼを配合した商品も販売されている。
本発明のシイタケ抽出液等に含まれる成分を配合して歯磨剤及び口腔洗浄液を得る。
デキストラナーゼとの相乗効果が認められることから、デキストラナーゼを含む歯磨剤や洗口液中にキノコ由来成分を配合することで、よりいっそうのバイオフィルム形成抑制及び分解効果が発揮される。このとき、安定剤や、殺菌成分、抗炎症成分、フッ化ナトリウム等の成分を適宜加えてもよい。
【００２７】
＜キノコ抽出成分をふくむ食品＞
本発明のキノコ抽出成分をガムなどの食品中に配合することで、バイオフィルム形成阻害効果のある食品を製造することができる。シイタケ抽出液５％、あるいは凍結乾燥粉末１％をチューインガムに配合することによってバイオフィルム形成阻害効果を付加し、齲蝕予防を推進する。好ましくは、精製デキストラナーゼ０．５％と共に配合することで、強力なバイオフィルム抑制が実現可能である。また、キシリトールなど、既知の齲蝕予防成分と併用することで、相乗的な齲蝕予防効果を期待できる。
また、食後に食べること、あるいは間食を行うことで齲蝕抑制効果が期待できる食品として、シイタケの風味を生かした菓子類も製造できる。
【００２８】
＜シイタケ菌床培養廃液由来成分を含む、齲蝕抑制機能を持つ家畜飼料＞
シイタケの菌床栽培、特に菌床を覆う袋の上面のみを開封して培養する上面栽培においては、定期的に菌床に含まれる水を交換することにより、菌糸、及び子実体の品質を維持できることが知られている。このときに排出される水は廃棄されてしまうが、この廃液中にもバイオフィルム分解活性、形成抑制活性が含まれることを見いだしている。この廃液（特許文献８）は、JAS法に基づいた生産法を採用するシイタケ生産工場では、食べて有害な成分を含むことは考えにくいが、ヒトに用いることは困難である。そこで、5,000 ×g 連続遠心分離を行い不溶性の高分子成分を除き、UV照射等による滅菌行程を経て限外濾過により10倍に濃縮した菌床廃液を、家畜の飼料に配合することで、家畜の齲蝕予防効果のある飼料を作製する。タンパク質成分を大きく変成させない、より経済的あるいは、効果的な前処理方法があれば、そちらを採用してもよい。濃縮液を牛や豚など、歯を有する家畜の飼料に１％混合することによって、家畜の齲蝕予防が可能である。また、犬や猫、ハムスターなどの愛玩動物用に、齲蝕抑制効果の高いペットフードを作製することが可能である。また、バイオフィルムが制御されることによって、ペットの口腔細菌が正常化し、口臭等の予防効果も期待できる。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明する。本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３０】
［実施例１〜４］
市販の食用キノコよりエリンギ（株式会社 雪国まいたけ）、シメジ（株式会社 雪国まいたけ）、ナメコ（ＪＡ岩手）、シイタケ（株式会社 北研Ｈ６００株：菌床から採取後５日以上経過し褐色に変色した物を使用）から、水溶性抽出成分を得、各キノコについて、バイオフィルム形成阻害活性、及びバイオフィルム分解活性を調べた。
【００３１】
各キノコ子実体をはさみで５ｍｍ角程度の大きさに裁断したのち、２倍量（ｖ/ｗ）の１ｘＰＢＳ／０．５Ｍ ＮａＣｌバッファーを加え、モーターホモジナイザー（ＩＫＡ社Ｔ２５ウルトラスタックス）を用いて、氷上で冷却しながら破砕した。６，０００×ｇ５分の遠心を行い上清を回収し、フィルター滅菌した。これを水溶性抽出液として、以下の実験に用いた。抽出液のタンパク質濃度はエリンギ２．９ ｍｇ/ｍｌ、 シメジ１．３ ｍｇ/ｍｌ、 ナメコ１．２ ｍｇ/ｍｌ、シイタケ０．６ ｍｇ/ｍｌであった。これらの抽出液を各２０μｇのタンパク質相当量を用いてバイオフィルム形成阻害、及びバイオフィルム分解実験を行った。
【００３２】
バイオフィルム形成にはＳ.mutansXC株、Ｓ.sobrinusＡＴＣＣ３３４７８株に加え、非水溶性のα‐１,３‐グルカンのみを生成するＳ.mutansＵＡ１３０△gtfＣ/gtfＤ/ftf株（Δgtf株）を用いた。ＢＨＩ培地で１日培養した培養液２０μｌをCorning社の細胞培養用９６穴プレートの各ウェルにいれ、さらに１８０μｌの０．５％スクロース入りＢＨＩを加え、アネロパック・ケンキを用いて、３７℃２０時間培養することでプレートのウェルの底にバイオフィルムを形成させた。このとき、各抽出液２０μｇタンパク質相当のキノコ抽出液を加え、バイオフィルム形成阻害効果を検討した。ネガティブコントロールとして、ＢＳＡ（牛血清アルブミン）を用いた。
【００３３】
また、形成済みのバイオフィルムにキノコ抽出液２０μｇタンパク質相当分と１００μｌ ＰＢＳを加え、３７℃で１２時間インキュベートして、バイオフィルム分解活性を測定した。さらに各キノコ抽出液にα‐１，６‐グルカンを分解することが知られているデキストラナーゼ（Novozyme社Chaetomium erraticum由来）を各ウェルに０．１μｌづつ加え、同様にバイオフィルム分解活性を測定した。
【００３４】
バイオフィルム量は、培養液を吸引し、ＰＢＳ又はTBS（中性トリス緩衝液）バッファーで３回洗浄した。６５〜７０℃の乾燥器中で乾燥後、１％ クリスタルバイオレット水溶液１００μｌを各ウェルに添加し１５分間バイオフィルムを染色した。染色後、余分な色素をＰＢＳ又はＴＢＳで洗い流し、再び乾燥器中で乾燥させた。２００μｌの１００％メタノールでバイオフィルムから色素を溶出し、溶出液中の色素量を、ＯＤ５９５を測定することで定量し、バイオフィルム量の指標とした。ＢＳＡ存在下で形成されるバイオフィルムから得られたＯＤ５９５値を１としたときの相対吸光度で示す。
【００３５】
表１にバイオフィルム形成阻害活性及び分解活性についての試験結果を表１に、バイオフィルム分解活性についての試験結果を表２〜４に示す。
【００３６】
【表１】
【００３７】
表１によれば、バイオフィルムの形成阻害効果は、シイタケ抽出液ではS.mutans,S.sobrius, Δgtf株すべてにおいて確認できた。Δgtf株については、エリンギ、ナメコでも非常に強い形成阻害効果が見られた。
【００３８】
【表２】
【００３９】
【表３】
【００４０】
【表４】
【００４１】
バイオフィルム分解活性は、表２〜４に示すように、S.mutansのバイオフィルム分解効果がナメコ、シイタケとデキストラナーゼを併用したときに分解活性が見られ、S.sobrinusのバイオフィルム分解活性はシイタケ単独、あるいはシメジ、ナメコ、シイタケとデキストラナーゼを併用したときに分解活性が見られた。また、Δgtf株が生成したバイオフィルムについては、すべての抽出液中に分解活性が確認できた。
【００４２】
［実施例５］
＜シイタケ抽出液によるミュータンス連鎖球菌のスクロース依存的バイオフィルム形成の阻害＞
レンチヌラ・エドデス（Ｈ６００）株の子実体を菌床から収穫し、すぐに−８０℃にて凍結保存した新鮮なサンプル、及び湿度約８０％、２５℃の環境下で５日から６日間保存し、自己溶解が始まった老化サンプルを用いた。各々のサンプルは２倍量（ｖ/ｗ）のＰＢＳに０．５Ｍの食塩が添加された抽出バッファーを用いて、モーターホモジナイザー（ＩＫＡ社 ウルトラスタックス）にて粉砕、又は凍結乾燥後、乳鉢で粉末にした後に湿重量の２倍量（ｖ/ｗ）のバッファーを加えモーターホモジナイザーを用いて氷上で破砕した。遠心後、上清を回収し、ポアサイズ０．４５ｍｍのフィルターで滅菌したものを以下の実験に用いた。シイタケ菌床より回収した廃液を濃縮した溶液についても、ＰＢＳで１μｇ/μｌ程度のタンパク質量に調製し、遠心、フィルター滅菌後、実験を行った。
【００４３】
齲蝕の原因菌として知られるS.mutans,S.sobrinus, 及びα‐1,6‐グルカン合成遺伝子であるgtfC, gtfDを破壊しα‐１,３‐グルカンのみを菌体外多糖として生産するS.mutans 破壊株ΔgtfをＢＨＩ(Difco)を培地として３７℃２４時間、アネロパック・ケンキ（三菱化学）を用いて静止培養を行い定常期に達した培養液２０μｌ、０．５％スクロース入りＢＨＩ培地を加え２００μｌとし、タンパク質２５μｇを含むシイタケ抽出液（８〜３０μｌ）あるいは０．１％ＢＳＡ溶液（２５μｌ）と共に細胞培養用９６ 穴プレート (Corning)の各ウェルに入れ、３７℃２４時間アネロパック・ケンキにてバイオフィルム形成を行った。
【００４４】
また、各サンプルに、０．１μｌのデキストラナーゼ(Novozyme社)を加え、バイオフィルム形成の阻害効果を調べた。コントロールとして、バイオフィルム形成能が非常に弱いS.gordonniを用いた。培養後、バイオフィルムを壊さないよう静かに培養液を吸引し、各バイオフィルムをPBS又はTBSで３回洗浄した。６５〜７０℃の乾燥器中で乾燥後、１％クリスタルバイオレット水溶液１００μｌをウェルに添加し１５分間バイオフィルムを染色した。染色後、余分な色素を洗い流し、再び乾燥器で乾燥させた。０．２ｍｌの１００％メタノールでバイオフィルムから色素を溶出し、溶出液中の色素量を、ＯＤ５９５を測定することで定量し、バイオフィルム量の指標とした（バイオフィルム形成阻害活性）。
ＢＳＡ存在下で形成されるバイオフィルムから得られたＯＤ５９５値を１としたときの相対吸光度を表５に示す。
【００４５】
【表５】
【００４６】
表５に示す結果より、S.mutans,S.sobrinus及びS.mutansΔgtf株において、シイタケ抽出液にバイオフィルム形成阻害効果があることが分かった。また、デキストラナーゼの併用により、バイオフィルム形成阻害効果が増強されることが分かった。
【００４７】
［実施例６］
＜ミュータンス連鎖球菌がスクロース存在下で生成した非水溶性グルカンのシイタケ抽出液による分解＞
S.mutans,S.sobrinus,S.mutansΔgtfを5％スクロース入りＢＨＩ培地２Lを用いて、３７℃４日間マグネティックスターラーを用いて静かに撹拌しながら培養したのち、遠心して菌体とグルカンからなる沈殿を回収した。沈殿を蒸留水で洗浄後、１Ｎ 水酸化ナトリウム溶液によりアルカリ可溶性グルカンのみを溶解させ、遠心によってアルカリ不溶性の菌体成分を除いた。グルカン溶液を酢酸によって中和し、非水溶性グルカンを析出させ遠心で回収後、蒸留水で洗浄、再びアルカリで溶解し、中和して回収、洗浄する作業を数回繰り返した。残存タンパク質が吸光度による測定で検出できなくなるまで操作を行い、得られた沈殿物を凍結乾燥し、０．３Ｍ水酸化ナトリウムにて水溶液にして実験に用いた。
【００４８】
実施例４、実施例５で用いたシイタケ抽出液等各１００μｇに１００μｌの０．３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．２とグルカン溶液（S.mutansグルカン５ｍｇ又はS.sobrinusグルカン８ｍｇ又はΔgtfグルカン０．５ｍｇ）をマイクロチューブに入れ、蒸留水で反応液を１ｍｌに調整した後、３７℃で撹拌しながら一晩（１２時間）反応させた。このとき、S.mutans,S.sobrinusの生成するグルカンはα‐１,３結合とα‐１,６結合が混じり合ったグルカンであるのに対し、Δgtf株が生成するグルカンはグルカン合成酵素gtfBによって合成されたα‐１,３‐グルカンのみで構成されていると考えられる。反応後、卓上遠心機を用いて１４，０００ｒｐｍ ２ｍｉｎｘ２回の遠心を行い、非水溶性グルカンを完全に沈殿させ、上清を回収し、フェノール硫酸法にて、上清中に可溶化された糖の量を測定し、非水溶性αグルカンを可溶化するグルカナーゼ活性とした（表６）。
【００４９】
【表６】
【００５０】
その結果、表６のように、S.sobrinus由来のグルカンを基質としたときに、グルカンの分解活性が見られ、α‐１,３グルカンを基質としたときにも若干の活性が確認できた。また、サンプルを１０分間煮沸すると、グルカナーゼ活性、バイオフィルム形成阻害活性が失われること、４０％硫安沈殿画分、あるいは８０％硫安沈殿画分にも、グルカナーゼ活性、バイオフィルム形成阻害活性が見られたことから、シイタケ抽出液中のタンパク質が、バイオフィルム制御因子であると考えられる。
【００５１】
［実施例７］
＜キノコ抽出成分を含む歯磨剤＞
リン酸水素カルシウム３５％、ソルビトール２０％、プロピレングリコール５％、カルボキシルメチルセルロース２％、ポリエチレングリコール１％、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１％、香料１％、ラウリル硫酸ナトリウム１％、精製デキストラナーゼ０．２５％、シイタケ抽出成分凍結乾燥粉末１％に水を加え１００％とし、これらを混合し歯磨剤を調整した。安定剤や、殺菌成分、フッ化ナトリウム等成分を必要に応じて適宜加える。
【００５２】
［実施例８］
＜キノコ抽出成分を含むガム＞
ガムベース２５％、キシリトール２５％、マルトース２１％、コーンシロップ２０％、トレハロース５％、軟化剤１％、香料０．５％、ローズマリー抽出物１％、シイタケ抽出液粉末１％、デキストラナーゼ０．５％という組成をニーダーで混合し、圧延機や成形機を用いて成形し、１個当り３ｇの板状の無糖、及び２gの糖衣ガムを得た。
【００５３】
［実施例９］
＜キノコ抽出成分を含む菓子＞
ブドウ糖果糖液２０％、トレハロース５％、梅エキス（又は梅酒）５％を水６３．７５％に粉末寒天０．７５％を加えて混合し７０℃まで加熱し、寒天を完全に溶かす。寒天が５０℃以下に冷えた状態でかつ固化しないうちにフィルター滅菌済みのシイタケ抽出液５％、デキストラナーゼ０．５％を混合して冷却することで、和風味の寒天菓子が得られた。寒天は、冷蔵保存することで食品衛生上問題のない保存期間においては齲蝕予防効果が維持される。
【００５４】
［実施例１０］
＜シイタケ菌床培養廃液由来成分を含む、齲蝕抑制機能を持つ家畜飼料＞
以下により、ハムスター等のげっ歯類用の合成餌を製造した。
カゼイン２０％、コーンスターチ３０％、デキストリン２．５％、マルトース３０％、セルロース５％、大豆オイル２．５％、ラード２．０％、ＡＩＮ‐９３Ｇ ミネラル混合物 ３．５％, ＡＩＮ‐９３ビタミン混合物１％（ＡＩＮ：American Institute of Nutrition（米国国立栄養研究所）によって作られた標準飼料)、デキストラナーゼ０．５％、菌床廃液３％、以上を混合し、成形機によってペレットに加工したものを齲蝕予防用の飼料とした。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明により、多彩な健康機能を持つキノコ、好ましくはシイタケを齲蝕予防に活用することが可能になる。シイタケ抽出液は簡便に調整可能で、グルカナーゼ活性成分を高度に精製すること無くバイオフィルムの形成阻害効果が期待できる。シイタケ抽出成分は他のデキストラナーゼ等との併用によって、さらに齲蝕予防効果を高めることが可能である。
また、加工食品中にシイタケ抽出成分を添加することで、口腔バイオフィルムへ作用する新規の機能性食品の開発も可能になる。
さらに、シイタケ由来の新規遺伝子を用いることで、遺伝子工学的なバイオフィルム制御タンパク質の生産を行うことも可能である。組換え技術への消費者の抵抗感がなくなれば、レタスなどの可食性の植物等に本発明のタンパク質や既知のデキストラナーゼを発現させることで、齲蝕予防レタスなどの開発も可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、齲蝕の原因となる歯垢生成阻害及び分解を促すことで、齲蝕予防を促進する成分に関し、さらに、キノコ類、特にシイタケの水溶性抽出液に含まれる歯垢、齲蝕原性口腔バイオフィルムの形成阻害能、及び分解能をもつ成分を、齲蝕予防用食品、洗口剤、歯磨剤等の有効成分として有する食品、及び口腔ケア剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
齲蝕予防には、デンタルプラーク、齲蝕原性バイオフィルム等と呼ばれる歯垢の除去や形成阻害が必要である。齲蝕の原因となる歯垢は、ミュータンス連鎖球菌が砂糖を基質として合成するα‐１，３‐１，６‐グルカンを多量に含む、強固なバイオフィルムであることが知られている（非特許文献１）。
【０００３】
一方、シイタケ等のキノコ類は免疫活性化能を持つなど、一般に全身の健康維持増進に有効であることが知られ、様々な健康食品が作られている（特許文献１）。特に、免疫賦活成分である、シイタケβ‐グルカンを主成分とした健康食品はヒトにおける臨床試験での安全性も確認されている。
【０００４】
しかしながら、キノコの口腔保健への効果については情報が少なく、齲蝕予防においての研究例に関してはほとんど見あたらない。ところが、キノコ類は多種多用なグルカン分解酵素を持つことが分かってきており（特許文献２）、その細胞壁、特にシイタケには、大量のα‐１，３‐グルカンが多量に含まれることも、報告されている（非特許文献２）。したがって、シイタケを代表とする、α‐グルカンを細胞壁成分に含むキノコ類はα‐グルカンの合成や分解、伸長調整等に関与するタンパク質等の機能性成分を有することが予想される。
【０００５】
現在、歯垢の除去や形成阻害を目的として、デキストラナーゼ（α‐１，６‐グルカナーゼ）が実用化され、歯磨剤等に配合されている（特許文献３及び４）。しかし、デキストラナーゼ単独では歯垢の除去や形成阻害効果は限定的であることも知られており、α‐１，３‐グルカナーゼ（ムタナーゼ）等の開発研究が継続して行われている（特許文献５〜７）。
【０００６】
これまでの報告や研究は主としてバチルス属やペニシリウム属といった土壌細菌や糸状菌が生産するデキストラナーゼ及びムタナーゼに限定されていた。デキストラナーゼやムタナーゼの由来となる微生物は我々が食経験を持たない生物種であり、それらの生産にはAspergillus oryzaeやBacillus subtillisなどの組換え微生物が想定されている。消費者に受け入れられやすいとはいえないものであり、より安全かつ安価で、さらには機能性食品への使用も可能なバイオフィルム形成阻害、バイオフィルム分解成分の開発が求められていた。
【０００７】
【非特許文献１】Kuramitsu and Ellen (2000) Oral Bacterial Ecology. P226-228. Horizon scientific press.
【非特許文献２】松田和雄 編著（１９８７）多糖の分離・精製法 p50-51. 学会出版センター
【特許文献１】国際公開０２／０８７６０３号パンフレット
【特許文献２】特開２００７−３１２６１８号公報
【特許文献３】特許第３３５１０３５号公報
【特許文献４】特許第３４９６２７９号公報
【特許文献５】特表２０００−５０５６４９号公報
【特許文献６】特開平８−３０８５５８号公報
【特許文献７】特開２００６−１３６２８４号公報
【特許文献８】特開２００５−３４１８８２号報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記問題に鑑み、より安全かつ安価で、消費者に受け入れられやすく、機能性食品への使用も可能なバイオフィルム形成阻害、バイオフィルム分解成分を提供することを課題とする。
すなわち、本発明は、キノコ類、特にシイタケの水溶性抽出液に含まれる成分を有効利用した齲蝕予防用組成物、及び、食品、洗口剤及び歯磨剤等の有効成分とすることによって、より安全かつ安価で消費者に受け入れやすい機能性食品及び口腔ケア剤等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
シイタケ等の食用キノコ類は世界各地で長い食経験を有し、健康機能性を認知されてきた有用食品であり、細胞壁中にβ‐グルカンやα‐グルカンを有することが知られている。従って、α‐グルカンの合成や分解、伸長促進など、様々な調整成分を有することが予想される。しかし、キノコのα‐グルカンには、β‐グルカンのような顕著な健康機能が見いだされなかった経緯から、α‐グルカンに関連する研究はほとんど行われていないのが現状であった。発明者は、α‐グルカンを主要な構成成分とする歯垢の除去や形成阻害にキノコの有するα‐グルカン関連成分を利用すべく鋭意研究した結果、齲蝕原性バイオフィルムの形成阻害、分解能を有するシイタケの水溶性抽出液の開発に成功した。
【００１０】
すなわち、本発明はキノコ類、特にシイタケから、歯垢生成阻害、及び分解を促すことで齲蝕予防を促進する成分を含む水溶液を抽出し、その水溶性抽出液に含まれる成分を有効成分とする齲蝕予防用組成物、洗口剤、歯磨剤等の口腔ケア剤、及び齲蝕予防用食品を提供するものであり、具体的には次の技術を基礎とする。
【００１１】
（１） キノコ由来の水溶性抽出成分を有効成分とする齲蝕予防用組成物。
【００１２】
（２） 水溶性抽出成分が歯垢形成抑制及び分解活性を有するものであることを特徴とする（１）記載の齲蝕予防用組成物。
【００１３】
（３） キノコ由来の水溶性抽出成分がシイタケ由来のものであることを特徴とする（２）記載の齲蝕予防用組成物。
【００１４】
（４） キノコ由来の水溶性抽出成分がシイタケ菌床培養廃液中に含まれる成分であることを特徴とする（３）記載の齲蝕予防用組成物。
【００１５】
（５） キノコ由来の水溶性抽出成分がスクロース依存的なバイオフィルム形成を阻害する活性を有するタンパク質を含むことを特徴とする（１）記載の齲蝕予防用組成物。
【００１６】
（６） 上記（１）〜（５）のいずれかに記載の齲蝕予防用組成物を有効成分として含むことを特徴とする食品。
【００１７】
（７） 上記（１）〜（５）のいずれかに記載の齲蝕予防用組成物を有効成分として含むことを特徴とする口腔ケア剤。
【００１８】
（８） 上記（１）〜（５）のいずれかに記載の齲蝕予防用組成物を有効成分として含むことを特徴とする家畜用飼料。
【００１９】
本発明はシイタケ等α‐グルカンを細胞壁に有するキノコ子実体のタンパク質抽出液で、好ましくは０．４Ｍ以上の塩を含んだバッファーによって破砕抽出した成分を含む。
また、子実体のみならず、菌糸体培養物からの水溶性抽出成分、あるいはキノコの菌床栽培にて菌床中に蓄積する水溶液を含む。
また、α‐グルカンを細胞壁に有することが知られる他の微生物、例えば麹菌等の糸状菌、酵母等のタンパク質抽出液にも、一定のバイオフィルム抑制、分解効果が期待できる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明により、多彩な健康機能を持つキノコ、好ましくはシイタケを齲蝕予防に活用することが可能となった。シイタケ抽出液は簡便に調整でき、グルカナーゼ等の活性成分を高度に精製すること無くバイオフィルムの形成阻害効果のある齲蝕予防用組成物を得ることができる。
また、加工食品中にシイタケ抽出成分を添加することで、口腔バイオフィルムへ作用する新規の機能性食品を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
各種キノコから水溶性の有効成分を抽出し、齲蝕予防用組成物を得る。効果の確認は、齲蝕病原細菌であるS. mutans, S. sobrinusが形成するスクロース依存的バイオフィルム、すなわち歯垢の実験モデルを分解、あるいは形成阻害することを確認することによって行う。
【００２２】
＜キノコ成分の抽出について＞
キノコは生でも乾燥したものでもよく、カッター等で切り刻んだものや各種のミルで粉状に粉砕したものでも良い。各種キノコからの水溶性成分抽出は、一般的なタンパク質抽出に用いられる方法、例えば標準的なナトリウムリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を用い、好ましくは０．４Ｍ以上の食塩を加えたＰＢＳを用いる。また、キノコの重量に対し２倍容量以上の緩衝液を使用すること、及び抽出を４℃程度の低温で行うことが望ましい。キノコに緩衝液を加えた後、ブレンダー（ワーリング社ブレンダー等）やホモジナイザー（KINEMATICA社ポリトロン等）など標準的な装置を用いて破砕する。破砕後、冷却遠心機で遠心を行って細胞残渣を沈殿させ、上清の水溶性画分を回収し、ポアサイズ０．４５μｍ以下のフィルター（ミリポア社マイレクス‐HVフィルターユニット等）で滅菌を行い、実験に用いる。
【００２３】
＜バイオフィルムの形成＞
歯垢モデルである、スクロース依存的バイオフィルムの形成は、S. mutans, S. sobrinusを０．５％のスクロースを加えたBrain Heart Infusion(BHI)培地中でアネロパック・ケンキ（三菱ガス化学株式会社）等を用いて、組織培養用９６穴プレート（コーニング社、住友ベークライト社など）中に嫌気的に培養することによって行う。
【００２４】
＜バイオフィルム分解効果及び形成阻害効果の定量＞
バイオフィルムの分解効果は、バイオフィルム形成後、プレートをＰＢＳ等の緩衝液で洗浄して浮遊する菌を除き、乾燥させたバイオフィルムに対し、キノコ抽出成分を緩衝液と共に加え、３７℃でインキュベートすることで行う。その後、バイオフィルム量を定量することによって、バイオフィルム形成阻害効果、バイオフィルム分解効果を定量することが出来る。
【００２５】
＜バイオフィルムの定量＞
バイオフィルムの定量は、１％クリスタルバイオレット水溶液等の色素溶液でバイオフィルムを染色し、ＰＢＳ等の水溶性バッファーを用いて余分な色素を洗い流した後、メタノールでバイオフィルムを染色した色素を溶出させ、メタノール中の色素量を、吸光度（ＯＤ５９５）を測定することによって行う。
以上の方法を用いることで、キノコ抽出成分に含まれるバイオフィルム分解、及びバイオフィルム形成阻害効果を定量できる。
【００２６】
＜キノコ抽出成分を含む歯磨剤、及び口腔洗浄液＞
齲蝕予防のために様々な成分が開発され、歯磨剤や洗口液中に配合されており、バイオフィルムの分解や形成抑制を目的として、デキストラナーゼを配合した商品も販売されている。
本発明のシイタケ抽出液等に含まれる成分を配合して歯磨剤及び口腔洗浄液を得る。
デキストラナーゼとの相乗効果が認められることから、デキストラナーゼを含む歯磨剤や洗口液中にキノコ由来成分を配合することで、よりいっそうのバイオフィルム形成抑制及び分解効果が発揮される。このとき、安定剤や、殺菌成分、抗炎症成分、フッ化ナトリウム等の成分を適宜加えてもよい。
【００２７】
＜キノコ抽出成分をふくむ食品＞
本発明のキノコ抽出成分をガムなどの食品中に配合することで、バイオフィルム形成阻害効果のある食品を製造することができる。シイタケ抽出液５％、あるいは凍結乾燥粉末１％をチューインガムに配合することによってバイオフィルム形成阻害効果を付加し、齲蝕予防を推進する。好ましくは、精製デキストラナーゼ０．５％と共に配合することで、強力なバイオフィルム抑制が実現可能である。また、キシリトールなど、既知の齲蝕予防成分と併用することで、相乗的な齲蝕予防効果を期待できる。
また、食後に食べること、あるいは間食を行うことで齲蝕抑制効果が期待できる食品として、シイタケの風味を生かした菓子類も製造できる。
【００２８】
＜シイタケ菌床培養廃液由来成分を含む、齲蝕抑制機能を持つ家畜飼料＞
シイタケの菌床栽培、特に菌床を覆う袋の上面のみを開封して培養する上面栽培においては、定期的に菌床に含まれる水を交換することにより、菌糸、及び子実体の品質を維持できることが知られている。このときに排出される水は廃棄されてしまうが、この廃液中にもバイオフィルム分解活性、形成抑制活性が含まれることを見いだしている。この廃液（特許文献８）は、JAS法に基づいた生産法を採用するシイタケ生産工場では、食べて有害な成分を含むことは考えにくいが、ヒトに用いることは困難である。そこで、5,000 ×g 連続遠心分離を行い不溶性の高分子成分を除き、UV照射等による滅菌行程を経て限外濾過により10倍に濃縮した菌床廃液を、家畜の飼料に配合することで、家畜の齲蝕予防効果のある飼料を作製する。タンパク質成分を大きく変成させない、より経済的あるいは、効果的な前処理方法があれば、そちらを採用してもよい。濃縮液を牛や豚など、歯を有する家畜の飼料に１％混合することによって、家畜の齲蝕予防が可能である。また、犬や猫、ハムスターなどの愛玩動物用に、齲蝕抑制効果の高いペットフードを作製することが可能である。また、バイオフィルムが制御されることによって、ペットの口腔細菌が正常化し、口臭等の予防効果も期待できる。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明する。本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３０】
［実施例１〜４］
市販の食用キノコよりエリンギ（株式会社 雪国まいたけ）、シメジ（株式会社 雪国まいたけ）、ナメコ（ＪＡ岩手）、シイタケ（株式会社 北研Ｈ６００株：菌床から採取後５日以上経過し褐色に変色した物を使用）から、水溶性抽出成分を得、各キノコについて、バイオフィルム形成阻害活性、及びバイオフィルム分解活性を調べた。
【００３１】
各キノコ子実体をはさみで５ｍｍ角程度の大きさに裁断したのち、２倍量（ｖ/ｗ）の１ｘＰＢＳ／０．５Ｍ ＮａＣｌバッファーを加え、モーターホモジナイザー（ＩＫＡ社Ｔ２５ウルトラスタックス）を用いて、氷上で冷却しながら破砕した。６，０００×ｇ５分の遠心を行い上清を回収し、フィルター滅菌した。これを水溶性抽出液として、以下の実験に用いた。抽出液のタンパク質濃度はエリンギ２．９ ｍｇ/ｍｌ、 シメジ１．３ ｍｇ/ｍｌ、 ナメコ１．２ ｍｇ/ｍｌ、シイタケ０．６ ｍｇ/ｍｌであった。これらの抽出液を各２０μｇのタンパク質相当量を用いてバイオフィルム形成阻害、及びバイオフィルム分解実験を行った。
【００３２】
バイオフィルム形成にはＳ.mutansXC株、Ｓ.sobrinusＡＴＣＣ３３４７８株に加え、非水溶性のα‐１,３‐グルカンのみを生成するＳ.mutansＵＡ１３０△gtfＣ/gtfＤ/ftf株（Δgtf株）を用いた。ＢＨＩ培地で１日培養した培養液２０μｌをCorning社の細胞培養用９６穴プレートの各ウェルにいれ、さらに１８０μｌの０．５％スクロース入りＢＨＩを加え、アネロパック・ケンキを用いて、３７℃２０時間培養することでプレートのウェルの底にバイオフィルムを形成させた。このとき、各抽出液２０μｇタンパク質相当のキノコ抽出液を加え、バイオフィルム形成阻害効果を検討した。ネガティブコントロールとして、ＢＳＡ（牛血清アルブミン）を用いた。
【００３３】
また、形成済みのバイオフィルムにキノコ抽出液２０μｇタンパク質相当分と１００μｌ ＰＢＳを加え、３７℃で１２時間インキュベートして、バイオフィルム分解活性を測定した。さらに各キノコ抽出液にα‐１，６‐グルカンを分解することが知られているデキストラナーゼ（Novozyme社Chaetomium erraticum由来）を各ウェルに０．１μｌづつ加え、同様にバイオフィルム分解活性を測定した。
【００３４】
バイオフィルム量は、培養液を吸引し、ＰＢＳ又はTBS（中性トリス緩衝液）バッファーで３回洗浄した。６５〜７０℃の乾燥器中で乾燥後、１％ クリスタルバイオレット水溶液１００μｌを各ウェルに添加し１５分間バイオフィルムを染色した。染色後、余分な色素をＰＢＳ又はＴＢＳで洗い流し、再び乾燥器中で乾燥させた。２００μｌの１００％メタノールでバイオフィルムから色素を溶出し、溶出液中の色素量を、ＯＤ５９５を測定することで定量し、バイオフィルム量の指標とした。ＢＳＡ存在下で形成されるバイオフィルムから得られたＯＤ５９５値を１としたときの相対吸光度で示す。
【００３５】
表１にバイオフィルム形成阻害活性及び分解活性についての試験結果を表１に、バイオフィルム分解活性についての試験結果を表２〜４に示す。
【００３６】
【表１】
【００３７】
表１によれば、バイオフィルムの形成阻害効果は、シイタケ抽出液ではS.mutans,S.sobrius, Δgtf株すべてにおいて確認できた。Δgtf株については、エリンギ、ナメコでも非常に強い形成阻害効果が見られた。
【００３８】
【表２】
【００３９】
【表３】
【００４０】
【表４】
【００４１】
バイオフィルム分解活性は、表２〜４に示すように、S.mutansのバイオフィルム分解効果がナメコ、シイタケとデキストラナーゼを併用したときに分解活性が見られ、S.sobrinusのバイオフィルム分解活性はシイタケ単独、あるいはシメジ、ナメコ、シイタケとデキストラナーゼを併用したときに分解活性が見られた。また、Δgtf株が生成したバイオフィルムについては、すべての抽出液中に分解活性が確認できた。
【００４２】
［実施例５］
＜シイタケ抽出液によるミュータンス連鎖球菌のスクロース依存的バイオフィルム形成の阻害＞
レンチヌラ・エドデス（Ｈ６００）株の子実体を菌床から収穫し、すぐに−８０℃にて凍結保存した新鮮なサンプル、及び湿度約８０％、２５℃の環境下で５日から６日間保存し、自己溶解が始まった老化サンプルを用いた。各々のサンプルは２倍量（ｖ/ｗ）のＰＢＳに０．５Ｍの食塩が添加された抽出バッファーを用いて、モーターホモジナイザー（ＩＫＡ社 ウルトラスタックス）にて粉砕、又は凍結乾燥後、乳鉢で粉末にした後に湿重量の２倍量（ｖ/ｗ）のバッファーを加えモーターホモジナイザーを用いて氷上で破砕した。遠心後、上清を回収し、ポアサイズ０．４５ｍｍのフィルターで滅菌したものを以下の実験に用いた。シイタケ菌床より回収した廃液を濃縮した溶液についても、ＰＢＳで１μｇ/μｌ程度のタンパク質量に調製し、遠心、フィルター滅菌後、実験を行った。
【００４３】
齲蝕の原因菌として知られるS.mutans,S.sobrinus, 及びα‐1,6‐グルカン合成遺伝子であるgtfC, gtfDを破壊しα‐１,３‐グルカンのみを菌体外多糖として生産するS.mutans 破壊株ΔgtfをＢＨＩ(Difco)を培地として３７℃２４時間、アネロパック・ケンキ（三菱化学）を用いて静止培養を行い定常期に達した培養液２０μｌ、０．５％スクロース入りＢＨＩ培地を加え２００μｌとし、タンパク質２５μｇを含むシイタケ抽出液（８〜３０μｌ）あるいは０．１％ＢＳＡ溶液（２５μｌ）と共に細胞培養用９６ 穴プレート (Corning)の各ウェルに入れ、３７℃２４時間アネロパック・ケンキにてバイオフィルム形成を行った。
【００４４】
また、各サンプルに、０．１μｌのデキストラナーゼ(Novozyme社)を加え、バイオフィルム形成の阻害効果を調べた。コントロールとして、バイオフィルム形成能が非常に弱いS.gordonniを用いた。培養後、バイオフィルムを壊さないよう静かに培養液を吸引し、各バイオフィルムをPBS又はTBSで３回洗浄した。６５〜７０℃の乾燥器中で乾燥後、１％クリスタルバイオレット水溶液１００μｌをウェルに添加し１５分間バイオフィルムを染色した。染色後、余分な色素を洗い流し、再び乾燥器で乾燥させた。０．２ｍｌの１００％メタノールでバイオフィルムから色素を溶出し、溶出液中の色素量を、ＯＤ５９５を測定することで定量し、バイオフィルム量の指標とした（バイオフィルム形成阻害活性）。
ＢＳＡ存在下で形成されるバイオフィルムから得られたＯＤ５９５値を１としたときの相対吸光度を表５に示す。
【００４５】
【表５】
【００４６】
表５に示す結果より、S.mutans,S.sobrinus及びS.mutansΔgtf株において、シイタケ抽出液にバイオフィルム形成阻害効果があることが分かった。また、デキストラナーゼの併用により、バイオフィルム形成阻害効果が増強されることが分かった。
【００４７】
［実施例６］
＜ミュータンス連鎖球菌がスクロース存在下で生成した非水溶性グルカンのシイタケ抽出液による分解＞
S.mutans,S.sobrinus,S.mutansΔgtfを5％スクロース入りＢＨＩ培地２Lを用いて、３７℃４日間マグネティックスターラーを用いて静かに撹拌しながら培養したのち、遠心して菌体とグルカンからなる沈殿を回収した。沈殿を蒸留水で洗浄後、１Ｎ 水酸化ナトリウム溶液によりアルカリ可溶性グルカンのみを溶解させ、遠心によってアルカリ不溶性の菌体成分を除いた。グルカン溶液を酢酸によって中和し、非水溶性グルカンを析出させ遠心で回収後、蒸留水で洗浄、再びアルカリで溶解し、中和して回収、洗浄する作業を数回繰り返した。残存タンパク質が吸光度による測定で検出できなくなるまで操作を行い、得られた沈殿物を凍結乾燥し、０．３Ｍ水酸化ナトリウムにて水溶液にして実験に用いた。
【００４８】
実施例４、実施例５で用いたシイタケ抽出液等各１００μｇに１００μｌの０．３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．２とグルカン溶液（S.mutansグルカン５ｍｇ又はS.sobrinusグルカン８ｍｇ又はΔgtfグルカン０．５ｍｇ）をマイクロチューブに入れ、蒸留水で反応液を１ｍｌに調整した後、３７℃で撹拌しながら一晩（１２時間）反応させた。このとき、S.mutans,S.sobrinusの生成するグルカンはα‐１,３結合とα‐１,６結合が混じり合ったグルカンであるのに対し、Δgtf株が生成するグルカンはグルカン合成酵素gtfBによって合成されたα‐１,３‐グルカンのみで構成されていると考えられる。反応後、卓上遠心機を用いて１４，０００ｒｐｍ ２ｍｉｎｘ２回の遠心を行い、非水溶性グルカンを完全に沈殿させ、上清を回収し、フェノール硫酸法にて、上清中に可溶化された糖の量を測定し、非水溶性αグルカンを可溶化するグルカナーゼ活性とした（表６）。
【００４９】
【表６】
【００５０】
その結果、表６のように、S.sobrinus由来のグルカンを基質としたときに、グルカンの分解活性が見られ、α‐１,３グルカンを基質としたときにも若干の活性が確認できた。また、サンプルを１０分間煮沸すると、グルカナーゼ活性、バイオフィルム形成阻害活性が失われること、４０％硫安沈殿画分、あるいは８０％硫安沈殿画分にも、グルカナーゼ活性、バイオフィルム形成阻害活性が見られたことから、シイタケ抽出液中のタンパク質が、バイオフィルム制御因子であると考えられる。
【００５１】
［実施例７］
＜キノコ抽出成分を含む歯磨剤＞
リン酸水素カルシウム３５％、ソルビトール２０％、プロピレングリコール５％、カルボキシルメチルセルロース２％、ポリエチレングリコール１％、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１％、香料１％、ラウリル硫酸ナトリウム１％、精製デキストラナーゼ０．２５％、シイタケ抽出成分凍結乾燥粉末１％に水を加え１００％とし、これらを混合し歯磨剤を調整した。安定剤や、殺菌成分、フッ化ナトリウム等成分を必要に応じて適宜加える。
【００５２】
［実施例８］
＜キノコ抽出成分を含むガム＞
ガムベース２５％、キシリトール２５％、マルトース２１％、コーンシロップ２０％、トレハロース５％、軟化剤１％、香料０．５％、ローズマリー抽出物１％、シイタケ抽出液粉末１％、デキストラナーゼ０．５％という組成をニーダーで混合し、圧延機や成形機を用いて成形し、１個当り３ｇの板状の無糖、及び２gの糖衣ガムを得た。
【００５３】
［実施例９］
＜キノコ抽出成分を含む菓子＞
ブドウ糖果糖液２０％、トレハロース５％、梅エキス（又は梅酒）５％を水６３．７５％に粉末寒天０．７５％を加えて混合し７０℃まで加熱し、寒天を完全に溶かす。寒天が５０℃以下に冷えた状態でかつ固化しないうちにフィルター滅菌済みのシイタケ抽出液５％、デキストラナーゼ０．５％を混合して冷却することで、和風味の寒天菓子が得られた。寒天は、冷蔵保存することで食品衛生上問題のない保存期間においては齲蝕予防効果が維持される。
【００５４】
［実施例１０］
＜シイタケ菌床培養廃液由来成分を含む、齲蝕抑制機能を持つ家畜飼料＞
以下により、ハムスター等のげっ歯類用の合成餌を製造した。
カゼイン２０％、コーンスターチ３０％、デキストリン２．５％、マルトース３０％、セルロース５％、大豆オイル２．５％、ラード２．０％、ＡＩＮ‐９３Ｇ ミネラル混合物 ３．５％, ＡＩＮ‐９３ビタミン混合物１％（ＡＩＮ：American Institute of Nutrition（米国国立栄養研究所）によって作られた標準飼料)、デキストラナーゼ０．５％、菌床廃液３％、以上を混合し、成形機によってペレットに加工したものを齲蝕予防用の飼料とした。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明により、多彩な健康機能を持つキノコ、好ましくはシイタケを齲蝕予防に活用することが可能になる。シイタケ抽出液は簡便に調整可能で、グルカナーゼ活性成分を高度に精製すること無くバイオフィルムの形成阻害効果が期待できる。シイタケ抽出成分は他のデキストラナーゼ等との併用によって、さらに齲蝕予防効果を高めることが可能である。
また、加工食品中にシイタケ抽出成分を添加することで、口腔バイオフィルムへ作用する新規の機能性食品の開発も可能になる。
さらに、シイタケ由来の新規遺伝子を用いることで、遺伝子工学的なバイオフィルム制御タンパク質の生産を行うことも可能である。組換え技術への消費者の抵抗感がなくなれば、レタスなどの可食性の植物等に本発明のタンパク質や既知のデキストラナーゼを発現させることで、齲蝕予防レタスなどの開発も可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キノコ由来の水溶性抽出成分を有効成分とする齲蝕予防用組成物。
【請求項２】
水溶性抽出成分が歯垢形成抑制及び分解活性を有するものであることを特徴とする請求項１記載の齲蝕予防用組成物。
【請求項３】
キノコ由来の水溶性抽出成分がシイタケ由来のものであることを特徴とする請求項２記載の齲蝕予防用組成物。
【請求項４】
キノコ由来の水溶性抽出成分がシイタケ菌床培養廃液中に含まれる成分であることを特徴とする請求項３記載の齲蝕予防用組成物。
【請求項５】
キノコ由来の水溶性抽出成分がスクロース依存的なバイオフィルム形成を阻害する活性を有するタンパク質を含むことを特徴とする請求項１記載の齲蝕予防用組成物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の齲蝕予防用組成物を有効成分として含むことを特徴とする食品。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかに記載の齲蝕予防用組成物を有効成分として含むことを特徴とする口腔ケア剤。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれかに記載の齲蝕予防用組成物を有効成分として含むことを特徴とする家畜用飼料。
【請求項１】
キノコ由来の水溶性抽出成分を有効成分とする齲蝕予防用組成物。
【請求項２】
水溶性抽出成分が歯垢形成抑制及び分解活性を有するものであることを特徴とする請求項１記載の齲蝕予防用組成物。
【請求項３】
キノコ由来の水溶性抽出成分がシイタケ由来のものであることを特徴とする請求項２記載の齲蝕予防用組成物。
【請求項４】
キノコ由来の水溶性抽出成分がシイタケ菌床培養廃液中に含まれる成分であることを特徴とする請求項３記載の齲蝕予防用組成物。
【請求項５】
キノコ由来の水溶性抽出成分がスクロース依存的なバイオフィルム形成を阻害する活性を有するタンパク質を含むことを特徴とする請求項１記載の齲蝕予防用組成物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の齲蝕予防用組成物を有効成分として含むことを特徴とする食品。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかに記載の齲蝕予防用組成物を有効成分として含むことを特徴とする口腔ケア剤。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれかに記載の齲蝕予防用組成物を有効成分として含むことを特徴とする家畜用飼料。
【公開番号】特開２０１０−７７０２８（Ｐ２０１０−７７０２８Ａ）
【公開日】平成２２年４月８日（２０１０．４．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２４３５６８（Ｐ２００８−２４３５６８）
【出願日】平成２０年９月２４日（２００８．９．２４）
【出願人】（３９００２５７９３）岩手県 (38)
【出願人】（５０７１４８４５６）学校法人 岩手医科大学 (19)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年４月８日（２０１０．４．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年９月２４日（２００８．９．２４）
【出願人】（３９００２５７９３）岩手県 (38)
【出願人】（５０７１４８４５６）学校法人 岩手医科大学 (19)
【Ｆターム（参考）】
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