本開示は、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）の変異体、ＣＮＰ変異体を含む医薬組成物、およびＣＮＰ変異体を作製する方法を提供する。ＣＮＰ変異体は、骨格異形成症（例えば、軟骨無形成症）などの骨関連障害ならびに血管平滑筋障害（例えば、再狭窄およびアテローム動脈硬化症）を含むが、これらに限定されない、ＣＮＰに対して反応性を示す疾患の治療のための治療薬として有用である。本開示は、骨関連障害および血管平滑筋障害の治療に有用であるＣ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）の変異体に関する。本開示は、ＣＮＰの機能性を保持すると同時に、例えば、中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）に結合する能力の低下、ＮＥＰによるタンパク質分解に対するより大きい抵抗性および／またはクリアランスナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ（ＮＰＲ−Ｃ）に対する親和性の低下の結果としての長い血清半減期を有するＣＮＰ変異体を含む。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
【化２４】

【化２５】

【化２６】

【化２７】

からなる群から選択されるＣ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）の変異体。
【請求項２】
ＣＮＰ変異体および薬学的に許容される賦形剤、キャリアまたは希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項３】
凍結乾燥製剤である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記凍結乾燥製剤を、約４から約６までのｐＨを有する緩衝液を含む製剤から調製する、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記緩衝液がクエン酸／クエン酸塩緩衝液または酢酸／酢酸塩緩衝液である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記凍結乾燥製剤を、等張性調節剤および／または増量剤をさらに含む製剤から調製する、請求項４または５に記載の組成物。
【請求項７】
前記等張性調節剤および／または前記増量剤がマンニトール、スクロース、ソルビトールおよびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記凍結乾燥製剤を、抗酸化剤をさらに含む製剤から調製する、請求項４から７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記抗酸化剤がメチオニン、アスコルビン酸、アスコルビン酸の塩の形態、チオグリセロールおよびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ＣＮＰ変異体が請求項１に記載のＣＮＰ変異体である、請求項２から９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
骨関節症、低リン酸血症性くる病、軟骨無形成症、低軟骨形成症、低身長、低身長症、骨軟骨異形成症、致死性異形成症、骨形成不全症、軟骨無発生症、点状軟骨異形成症、ホモ接合性軟骨無形成症、点状軟骨異形成症、弯曲肢異形成症、先天性致死性低リン酸血症、周生期致死型骨形成不全症、短肋骨多指症候群、低軟骨形成症、近節短縮型点状軟骨異形成症、ジャンセン型骨幹端異形成症、先天性脊椎骨端異形成症、骨形成不全症、捻曲性骨異形成症、先天性大腿骨短縮症、ランガー型中間肢異形成症、ニーバーゲルト型中間肢異形成症、ロビノウ症候群、ラインハルド症候群、先端異骨症、末梢性骨形成不全症、クニースト異形成症、線維軟骨形成、ロバーツ症候群、遠位中間肢異形成症、小肢症、モルキオ症候群、クニースト症候群、変容性骨異形成症および脊椎骨端骨幹端異形成症からなる群から選択される骨関連障害または骨格異形成症の治療で使用するための請求項１に記載のＣＮＰ変異体または請求項２から１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記骨関連障害または骨格異形成症が軟骨無形成症である、請求項１１に記載のＣＮＰ変異体または医薬組成物。
【請求項１３】
高血圧、再狭窄、アテローム動脈硬化症、急性非代償性心不全、鬱血性心不全、心臓浮腫、腎性浮腫、肝性浮腫、急性腎不全および慢性腎不全からなる群から選択される血管平滑筋障害の治療で使用するための請求項１に記載のＣＮＰ変異体または請求項２から１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
切断可能なペプチドもしくはタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドに連結されたＣＮＰ変異体ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、該第１および該第２のポリヌクレオチドによりコードされる融合ポリペプチドの発現をもたらす条件下で培地で培養するステップを含み、該融合ポリペプチドが該切断可能なペプチドもしくはタンパク質に直接的に連結された、またはリンカーを介して該切断可能なペプチドもしくはタンパク質に間接的に連結された該ＣＮＰ変異体ポリペプチドを含む、ＣＮＰ変異体の組換え産生の方法。
【請求項１５】
前記宿主細胞が、前記切断可能なペプチドもしくはタンパク質をコードする前記第２のポリヌクレオチドに連結された前記ＣＮＰ変異体ポリペプチドをコードする前記第１のポリヌクレオチドを含む発現ベクターにより形質転換されている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導ベクターを用いて、前記融合ポリペプチドをコードする前記第１および前記第２のポリヌクレオチドの発現を増大させる、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記宿主細胞を約０．４ｍＭ〜約１．５ｍＭ ＩＰＴＧの存在下で約２０℃〜約４０℃の温度で一定の期間培養する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ベクターがプラスミドである、請求項１５から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記プラスミドがｐＪｅｘｐｒｅｓｓ、ｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０１、ｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０４、ｐＥＴ−１５ｂ、ｐＥＴ−２１ａ、ｐＥＴ−２２ｂ、ｐＥＴ−３１ｂ、ｐＥＴ−３２ａ、ｐＥＴ−４１ａ、ｐＭＡＬ、ｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ、ｐＱＥ−３０、ｐＥＴ−ＳＵＭＯおよびｐＴＹＢ１１からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記切断可能なペプチドもしくはタンパク質がヒスチジンタグ、ヒト転写因子ＴＡＦ１２、ＴＡＦ１２断片、ＴＡＦ１２ヒストン折りたたみドメイン、ＴＡＦ１２の突然変異体およびその断片、ＴＡＦ１２（Ｃ／Ａ）、ＴＡＦ１２（Ｄ／Ｅ）、ＴＡＦ１２（４Ｄ／４Ｅ）、ＴＡＦ１２（６Ｄ／６Ｅ）、ＴＡＦ１２（１０Ｄ／１０Ｅ）、ＴＡＦ１２（Ｃ／Ａ＆Ｄ／Ｅ）、ＴＡＦ１２（Ｃ／Ａ＆４Ｄ／４Ｅ）、ＴＡＦ１２（Ｃ／Ａ＆６Ｄ／６Ｅ）、ＴＡＦ１２（Ｃ／Ａ＆１０Ｄ／１０Ｅ）、ケトステロイドイソメラーゼ、マルトース結合タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、チオレドキシン、キチン結合ドメイン、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−２突然変異体、ＢＭＰ−２（Ｃ／Ａ）ならびにそれらの突然変異体および断片からなる群から選択される、請求項１４から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記切断可能なペプチドもしくはタンパク質がヒト転写因子ＴＡＦ１２、ＴＡＦ１２断片、ＴＡＦ１２ヒストン折りたたみドメイン、ＴＡＦ１２の突然変異体およびその断片、ＴＡＦ１２（Ｃ／Ａ）、ＴＡＦ１２（Ｄ／Ｅ）、ＴＡＦ１２（４Ｄ／４Ｅ）、ＴＡＦ１２（６Ｄ／６Ｅ）、ＴＡＦ１２（１０Ｄ／１０Ｅ）、ＴＡＦ１２（Ｃ／Ａ＆Ｄ／Ｅ）、ＴＡＦ１２（Ｃ／Ａ＆４Ｄ／４Ｅ）、ＴＡＦ１２（Ｃ／Ａ＆６Ｄ／６Ｅ）およびＴＡＦ１２（Ｃ／Ａ＆１０Ｄ／１０Ｅ）からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記切断可能なペプチドもしくはタンパク質が切断剤により切断される、請求項１４から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記切断剤がギ酸、臭化シアン（ＣＮＢｒ）、ヒドロキシルアミン、自己切断タンパク質、Ｘａ因子、エンテロキナーゼ、ＰｒｏＴＥＶおよびＳＵＭＯプロテアーゼからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記宿主細胞が細菌宿主細胞である、請求項１４から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記細菌宿主細胞がＥ．ｃｏｌｉである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記Ｅ．ｃｏｌｉ細胞がＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＧｒｏ７、ＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ（ＤＥ３）、Ｃ４１（ＤＥ３）、Ｃ４３（ＤＥ３）、ＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）、ＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＫＲＸおよびＴｕｎｅｒ（ＤＥ３）からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記Ｅ．ｃｏｌｉ細胞がＢＬ２１（ＤＥ３）である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記融合ポリペプチドを可溶性タンパク質または封入体として発現させる、請求項１４から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記発現した融合ポリペプチドを前記宿主細胞または培地から単離するステップをさらに含む、請求項１４から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記単離した融合ポリペプチドを、ギ酸、臭化シアン（ＣＮＢｒ）、ヒドロキシルアミン、自己切断タンパク質、Ｘａ因子、エンテロキナーゼ、ＰｒｏＴＥＶおよびＳＵＭＯプロテアーゼからなる群から選択される切断剤と接触させるステップをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記切断剤がギ酸である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記単離した融合ポリペプチドを切断剤と接触させる前記ステップを約１％〜約１０％ギ酸の存在下で約５０℃〜約７０℃の温度で行う、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
ギ酸の存在下で接触させる前記ステップを約５時間から約３６時間の期間にわたり行う、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
【化２８】

【化２９】

【化３０】

からなる群から選択されるＣＮＰ変異体を産生させる、請求項１４から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
ＣＮＰ−２２またはＣＮＰ−５３を産生しない、請求項１４から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
【化３１】

【化３２】

からなる群から選択される、請求項１４から３３のいずれか一項に記載の方法により産生されるＣＮＰ変異体。
【請求項３７】
切断可能なペプチドもしくはタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドに連結されたＣＮＰ変異体ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項３８】
前記切断可能なペプチドもしくはタンパク質がヒスチジンタグ、ヒト転写因子ＴＡＦ１２、ＴＡＦ１２断片、ＴＡＦ１２ヒストン折りたたみドメイン、ＴＡＦ１２の突然変異体およびその断片、ＴＡＦ１２（Ｃ／Ａ）、ＴＡＦ１２（Ｄ／Ｅ）、ＴＡＦ１２（４Ｄ／４Ｅ）、ＴＡＦ１２（６Ｄ／６Ｅ）、ＴＡＦ１２（１０Ｄ／１０Ｅ）、ＴＡＦ１２（Ｃ／Ａ＆Ｄ／Ｅ）、ＴＡＦ１２（Ｃ／Ａ＆４Ｄ／４Ｅ）、ＴＡＦ１２（Ｃ／Ａ＆６Ｄ／６Ｅ）、ＴＡＦ１２（Ｃ／Ａ＆１０Ｄ／１０Ｅ）、ケトステロイドイソメラーゼ、マルトース結合タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、チオレドキシン、キチン結合ドメイン、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−２突然変異体、ＢＭＰ−２（Ｃ／Ａ）ならびにそれらの突然変異体および断片からなる群から選択される、請求項３７に記載の宿主細胞。
【請求項３９】
前記宿主細胞が細菌宿主細胞である、請求項３７または３８に記載の宿主細胞。
【請求項４０】
前記細菌宿主細胞がＥ．ｃｏｌｉである、請求項３９に記載の宿主細胞。
【請求項４１】
前記Ｅ．ｃｏｌｉ細胞がＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＧｒｏ７、ＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ（ＤＥ３）、Ｃ４１（ＤＥ３）、Ｃ４３（ＤＥ３）、ＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）、ＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＫＲＸおよびＴｕｎｅｒ（ＤＥ３）からなる群から選択される、請求項４０に記載の宿主細胞。
【請求項４２】
前記Ｅ．ｃｏｌｉ細胞がＢＬ２１（ＤＥ３）である、請求項４１に記載の宿主細胞。
【請求項４３】
前記ベクターがプラスミドである、請求項３７から４２のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項４４】
前記プラスミドがｐＪｅｘｐｒｅｓｓ、ｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０１、ｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０４、ｐＥＴ−１５ｂ、ｐＥＴ−２１ａ、ｐＥＴ−２２ｂ、ｐＥＴ−３１ｂ、ｐＥＴ−３２ａ、ｐＥＴ−４１ａ、ｐＭＡＬ、ｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ、ｐＱＥ−３０、ｐＥＴ−ＳＵＭＯおよびｐＴＹＢ１１からなる群から選択される、請求項４３に記載の宿主細胞。
【請求項４５】
細胞培養前に前記ベクターで形質転換される、請求項３７から４４のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項４６】
前記切断可能なペプチドもしくはタンパク質に直接的に連結された、またはリンカーを介して該切断可能なペプチドもしくはタンパク質に間接的に連結された前記ＣＮＰ変異体ポリペプチドを含み、前記第１および前記第２のポリヌクレオチドによりコードされる融合ポリペプチドの発現に適する条件下で培地中で培養される、請求項３７から４５のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項４７】
前記融合ポリペプチドが可溶性タンパク質または封入体として発現される、請求項４６に記載の宿主細胞。
【請求項４８】
前記宿主細胞または培地から前記発現した融合ポリペプチドが単離される、請求項４６または４７に記載の宿主細胞。
【請求項４９】
前記単離した融合ポリペプチドが、ギ酸、臭化シアン（ＣＮＢｒ）、ヒドロキシルアミン、自己切断タンパク質、Ｘａ因子、エンテロキナーゼ、ＰｒｏＴＥＶおよびＳＵＭＯプロテアーゼからなる群から選択される切断剤と接触される、請求項４８に記載の宿主細胞。
【請求項５０】
前記ＣＮＰ変異体ポリペプチドがＣＮＰ−２２でもＣＮＰ−５３でもない、請求項３７から４９のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項５１】
ＣＮＰペプチドまたは変異体が投与されている被験体からの生物学的試料中の少なくとも１つの骨関連バイオマーカーまたは軟骨関連バイオマーカーのレベルをアッセイするステップを含む、被験体における少なくとも１つの骨関連バイオマーカーまたは軟骨関連バイオマーカーのレベルに対するＣＮＰペプチドまたは変異体の効果を評価する方法。
【請求項５２】
前記少なくとも１つの骨関連バイオマーカーまたは軟骨関連バイオマーカーのレベルをアッセイする前に前記ＣＮＰペプチドまたは変異体を前記被験体に投与するステップをさらに含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
ＣＮＰ反応性の状態もしくは障害を治療する方法であって、
ＣＮＰペプチドまたは変異体を被験体に投与するステップと、
該被験体における少なくとも１つの骨関連バイオマーカーまたは軟骨関連バイオマーカーのレベルをモニターするステップとを含み、
該少なくとも１つの骨関連バイオマーカーまたは軟骨関連バイオマーカーのレベルの増加が該被験体または該状態もしくは障害に対する該ＣＮＰペプチドまたは変異体の治療効果を示す、方法。
【請求項５４】
前記ＣＮＰペプチドまたは変異体の投与の量または頻度を調節するステップをさらに含み、
ｉ）前記少なくとも１つの骨関連バイオマーカーまたは軟骨関連バイオマーカーのレベルが標的レベルを下回っている場合、前記ＣＮＰペプチドまたは変異体の投与の量または頻度を増加させ、
ｉｉ）該少なくとも１つの骨関連バイオマーカーまたは軟骨関連バイオマーカーのレベルが標的レベルを上回っている場合、該ＣＮＰペプチドまたは変異体の投与の量または頻度を減少させる、
請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記少なくとも１つの骨関連バイオマーカーまたは軟骨関連バイオマーカーがＣＮＰ、ｃＧＭＰ、ＩＩ型コラーゲンのプロペプチドおよびその断片、ＩＩ型コラーゲンおよびその断片、オステオカルシン、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、Ｉ型プロコラーゲンのプロペプチド（ＰＩＮＰ）およびその断片、Ｉ型コラーゲンおよびその断片、アグリカンコンドロイチン硫酸ならびにアルカリホスファターゼからなる群から選択される、請求項５１から５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記ＣＮＰペプチドまたは変異体が
【化３３】

【化３４】

【化３５】

【化３６】

【化３７】

からなる群から選択される、請求項５１から５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記ＣＮＰペプチドまたは変異体がＣＮＰ−２２でもＣＮＰ−５３でもない、請求項５６に記載の方法。

【図１】

【図２】

【図３−１】

【図３−２】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図２８】

【図２９】

【図３０】

【図３１】

【図３２】

【図３３】

【図３４】

【図３５】

【図３６】

【図３７】

【図３８】

【図３９】

【図４０】

【図４１】

【図４２】

【図４３】

【図４４】

【図４５】

【図４６】

【図４７】

【図４８】

【図４９】

【図５０】

【図５１】

【図５２】

【図５３】

【図５４】

【図５５】

【図５６】

【図５７】

【図５８】

【図５９】

【図６０】

【図６１】

【図６２】

【図６３】

【図６４】

【図６５】

【図６６】

【図６７】

【図６８】

【図６９】

【図７０】

【図７１】

【図７２】

【図７３】

【図７４】

【図７５】

【図７６】

【図７７】

【図７８】

【図７９】

【図８０】

【図８１】

【図８２】

【図８３】

【公表番号】特表２０１２−５２７２４４（Ｐ２０１２−５２７２４４Ａ）
【公表日】平成２４年１１月８日（２０１２．１１．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１２０３５（Ｐ２０１２−５１２０３５）
【出願日】平成２２年５月２０日（２０１０．５．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３５５８６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１３５５４１
【国際公開日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【出願人】（５０６１３６４８３）バイオマリン　ファーマシューティカル　インコーポレイテッド (18)
【Ｆターム（参考）】