ＣＩＺ１複製タンパク質
本発明は、癌治療におけるインターベンションのための標的として、Ｃｉｚ１ ＤＮＡ複製タンパク質の活性を調節する因子を同定するためのスクリーニング方法に関し、上記活性を調節する因子を包含する。本発明はまた、増殖性疾患（例えば、癌）の予後および診断における、ＤＮＡ複製タンパク質、およびそのＲＮＡ転写物の使用に関する。本発明の１つの局面に従って、ＤＮＡ複製を調節する因子の同定のための標的としての、Ｃｉｚ１ヌクレオチド配列もしくはＣｉｚ１ポリペプチド配列、またはその任意のフラグメントもしくは改変体の使用が提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ複製タンパク質の活性を、癌治療における介入のための標的として調節する因子の同定のためのスクリーニング方法に関する。本発明は、上記活性を調節する因子を包含する。
【０００２】
本発明はまた、増殖性疾患（例えば、癌）の予後判定および診断における、上記ＤＮＡ複製タンパク質およびそのＲＮＡ転写産物の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
（導入）
ＤＮＡ複製の開始は、哺乳動物細胞周期における主要な制御点であり、癌において誤調節される多くの遺伝子産物の作用点である（ＨａｎａｈａｎおよびＷｅｉｎｂｅｒｇ，２０００）。この開始プロセスは、プレ複製複合体タンパク質のアセンブリを伴い、この複合体は、細胞周期のＧ１期の間に、複製起点において、起点認識複合体（ＯＲＣ）、Ｃｄｃ６、Ｃｄｔ１およびＭｃｍタンパク質を含む。この後、第２のタンパク質群の作用が生じる。この作用により、ＤＮＡポリメラーゼおよびその補助因子（ＰＣＮＡを含む）のローディング、およびＳ期への遷移が促進される。この開始プロセスは、サイクリン依存性プロテインキナーゼ２（Ｃｄｋ２）、Ｃｄｃ７−ｄｂｆ４およびＣｄｔ１インヒビターであるゲミニンによって調節される（概説については、ＢｅｌｌおよびＤｕｔｔａ，２００２を参照）。Ｓ期の細胞の核において、複製フォークが、一緒にクラスター形成して、数百個の複製「焦点」すなわち複製工場を形成する（Ｃｏｏｋ、１９９９）。複製因子は、核中の構造フレームワークと連結しているようであるが、この連結を形成する分子の性質および複製フォーク活性におけるこれらの役割は、不明のままである。
【０００４】
真核生物ＤＮＡ複製に関与するタンパク質の同定、およびその細胞周期の間のそれらの活性を調節する基本経路の分析は、ほぼ酵母遺伝学によって駆動されてきた。これらのタンパク質および経路は、一般的には、酵母からヒトまで保存されている。しかし、多岐にわたる発生経路に沿って分化する多細胞生物において、さらなる複雑な層が、明らかにされている。例えば、脊椎動物において、ニューロン分化に関与するいくつかのタンパク質はまた、Ｇ１→Ｓ期遷移を調節する（Ｏｈｎｕｍａら、２００１）。これらは、ｃｄｋインヒビターであるｐ２１ＣＩＰ１／ＷＡＦ１／ＳＤＩ１を含み、これは、増殖停止後の希突起神経膠細胞の分化に関係付けられており（Ｚｅｚｕｌａら、２００１）、そして他の細胞型の最終分化に関係付けられている（Ｐａｒｋｅｒら、１９９５）。
【０００５】
ＤＮＡ複製の開始は、哺乳動物細胞からの単離された核および細胞質ゾル抽出物を用いて、インビトロで再構成され得る（Ｋｒｕｄｅ、２０００；Ｋｒｕｄｅら、１９９７；Ｌａｍａｎら、２００１；Ｓｔｏｅｂｅｒら、１９９８）。さらに、サイクリンＥまたはサイクリンＡのいずれかと複合体形成した組換えＣｄｋ２を使用して、複製複合体のアセンブリおよびＤＮＡ合成の活性化が、独立して再構成され得る（Ｃｏｖｅｒｌｅｙら、２００２）。本発明者らは、サイクリンＡ−ｃｄｋ２によりインビトロで触媒される上記活性化工程を研究し、比較的研究されていないタンパク質であるｐ２１−Ｃｉｐ１相互作用ジンクフィンガータンパク質（Ｃｉｚ１）が、この開始プロセスのこの段階の間に機能することを示した。ヒトＣｉｚ１は、サイクリンＥ−ｐ２１を用いる改変型酵母ツーハイブリッドスクリーニングを使用して、以前に同定された。生化学分析によって、ｐ２１との相互作用が支持された（Ｍｉｔｓｕｉら、１９９９）。転写における潜在的役割が提唱されたが、実証はされておらず、Ｃｉｚ１には、他の機能は割り当てられていない。より最近には、Ｃｉｚ１遺伝子が、インビボ腫瘍形成モデルを使用して、ヒト髄芽細胞腫由来ｃＤＮＡライブラリーから単離された（ＷａｒｄｅｒおよびＫｅｈｅｒｌｙ，２００３）。本発明者らの分析は、Ｃｉｚ１が、ＤＮＡ複製の開始において積極的な役割を果たすことを初めて示す。
【０００６】
クロマチン結合型タンパク質に対する多数の変化が、ＤＮＡ合成が組換えサイクリンＡ−ｃｄｋ２によりインビトロで活性化された場合に生じる。本発明は、ｃｄｃ６関連抗原であるｐ８５が、ＤＮＡ複製の開始と相関し、かつサイクリンＡ−ｃｄｋ２により調節されるという知見に関する。このタンパク質は、マウス胚ライブラリーからクローン化され、マウスＣｉｚ１として同定された。
【０００７】
インビトロ分析によって、Ｃｉｚ１タンパク質が、ＤＮＡ複製の開始を正に調節すること、このタンパク質の活性は、スレオニン１９１／２におけるｃｄｋリン酸化により調節され、これによりこのタンパク質は、開始を制御するｃｄｋ依存性経路に関連付けられることが、示された。胚形態のマウスＣｉｚ１は、推定される体細胞形態と比較して、選択的スプライシングされる。ヒトＣｉｚ１はまた、選択的スプライシングされ、マウスＣｉｚ１と同じエキソンにおいて変動がある。組換え胚形態のＣｉｚ１タンパク質は、哺乳動物のＤＮＡ複製の開始を促進すること、および小児癌は、「胚様」形態のＣｉｚ１を発現することが、見出されている。１つの理論に拘束されることは望まないが、本発明者らは、Ｃｉｚ１のミススプライシングが、発生における不適切な時点で、胚様形態のＣｉｚ１を生成することを提唱する。このことは、不適切に調節されたＤＮＡ複製を促進し、癌細胞系列の形成または進行に寄与する。
【０００８】
遺伝子および／または遺伝子産物を特異的に除去すると主張する多数の技術が、近年開発されている。例えば、標的ｍＲＮＡ分子に結合することによりその分子をブロックまたは不活化するためのアンチセンス核酸分子の使用は、遺伝子産物の生成を阻害するための有効な手段である。
【０００９】
遺伝子機能を特異的に除去するためのかなりより最近の技術は、二本鎖ＲＮＡ（阻害ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）とも呼ばれる）を細胞中に導入することを介し、これは、このＲＮＡｉ分子中に含まれる配列と相補的なｍＲＮＡの破壊をもたらす。このＲＮＡｉ分子は、互いにアニーリングして二本鎖ＲＮＡ分子を形成したＲＮＡの２つの相補鎖（センス鎖およびアンチセンス鎖）を含む。このＲＮＡｉ分子は、代表的には、除去されるべき遺伝子のエキソン配列またはコード配列に由来する。
【００１０】
核酸およびタンパク質は両方とも、その塩基配列またはアミノ酸配列によって規定される、直鎖状配列構造を有し、そしてまた、その直鎖状配列とこれらの分子が位置する環境とにより部分的に決定される３次元構造を有する。従来の治療分子は、標的分子に結合してアゴニスト効果またはアンタゴニスト効果を生じる、低分子（例えば、ペプチド、ポリペプチド、または抗体）である。核酸分子はまた、治療的有用性を有し得る必須の結合特性を因子に提供することに関して、能力を有することが明らかになっている。これらの核酸分子は、代表的には、アプタマーと呼ばれる。アプタマーは、小さく、通常は安定化されている、核酸分子であり、標的分子の結合ドメインを含む。
【００１１】
アプタマーは、少なくとも１つの改変型ヌクレオチド塩基を含み得る。用語「改変型ヌクレオチド塩基」は、共有結合改変型塩基および／または糖を含むヌクレオチドを包含する。例えば、改変型ヌクレオチドは、３’位でヒドロキシル基以外の低分子量有機基に共有結合している糖を有するヌクレオチド、および５’位でリン酸基以外の低分子量有機基に共有結合している糖を有するヌクレオチドを包含する。従って、改変型ヌクレオチドとしてはまた、２’置換糖（例えば、２’−Ｏ−メチルリボ−ス；２’−Ｏ−アルキルリボ−ス；２’−Ｏ−アリルリボ−ス；２’−Ｓ−アルキルリボ−ス；２’−Ｓ−アリルリボ−ス；２’−フルオロリボ−ス；２’−ハロリボ−スまたは２’−アジドリボ−ス）；炭素環式糖アナログ；α−アノマー糖；エピマー糖（例えば、アラビノース、キシロース、もしくはリキソース）、ピラノース糖、フラノース糖、およびセドヘプツロースが挙げられ得る。
【００１２】
改変型ヌクレオチドは、当該分野で公知であり、例えば、アルキル化プリンおよび／またはアルキル化ピリミジン；アシル化プリンおよび／またはアシル化ピリミジン；または他の複素環が挙げられるが、これらは限定として挙げるのではない。これらの種類のピリミジンおよびプリンは、当該分野で公知であり、これには、プソイドイソシトシン；Ｎ４，Ｎ４−エタノシトシン；８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデニン；４−アセチルシトシン；５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル；５−フルオロウラシル；５−ブロモウラシル；５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル；５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル；ジヒドロウラシル；イノシン；Ｎ６−イソペンチルアデニン；１−メチルアデニン；１−メチルプソイドウラシル；１−メチルグアニン；２，２−ジメチルグアニン；２−メチルアデニン；２−メチルグアニン；３−メチルシトシン；５−メチルシトシン；Ｎ６−メチルアデニン；７−メチルグアニン；５−メチルアミノメチルウラシル；５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル；β−Ｄ−マンノシルキューオシン；５−メトキシカルボニルメチルウラシル；５−メトキシウラシル；２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン；ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル；プソイドウラシル；２−チオシトシン；５−メチル−２−チオウラシル；２−チオウラシル；４−チオウラシル；５−メチルウラシル；Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル；ウラシル５−オキシ酢酸；キューオシン；２−チオシトシン；５−プロピルウラシル；５−プロピルシトシン；５−エチルウラシル；５−エチルシトシン；５−ブチルウラシル；５−ペンチルウラシル；５−ペンチルシトシン；および２，６−ジアミノプリン；メチルプソイドウラシル；１−メチルグアニン；１−メチルシトシンが挙げられる。
【００１３】
アプタマーは、当該分野で公知の標準的な固相合成技術または溶液相合成技術を使用して、従来のホスホジエステル連結ヌクレオチドを使用して合成され得る。ヌクレオチド間の結合は、代替的な連結分子を使用し得る。例えば、式Ｐ（Ｏ）Ｓの連結基（チオエート）；式Ｐ（Ｓ）Ｓの連結基（ジチオエート）；式Ｐ（Ｏ）ＮＲ’２の連結基；式Ｐ（Ｏ）Ｒ’の連結基；式Ｐ（Ｏ）ＯＲ６の連結基；式ＣＯの連結基；または式ＣＯＮＲ’２の連結基（ここで、Ｒは、Ｈ（もしくは塩）またはアルキル（１〜１２Ｃ）であり、Ｒ６はアルキル（１〜９Ｃ）である）は、隣接するヌクレオチドに−Ｏ−または−Ｓ−を介して連結される。
【００１４】
遺伝子および／または遺伝子産物を特異的に切断するといわれる他の技術は、タンパク質分子の機能を調節すること、またはタンパク質分子の活性を妨げることに焦点を当てている。タンパク質は、例えば、既存の低分子ライブラリーから取り出される化学インヒビターによって、標的にされ得る。
【００１５】
抗体（好ましくは、モノクローナル抗体）は、例えば、様々なタンパク質アイソフォームに対して、マウスまたはラットにおいて惹起され得る。抗体（免疫グロブリンとしてもまた公知である）は、外来分子（抗原）に対して特異性を有するタンパク質分子である。免疫グロブリン（Ｉｇ）は、２対のポリペプチド鎖、１対の軽（Ｌ）（低分子量）鎖（κまたはλ）、および１対の重（Ｈ）鎖（γ、α、μ、δおよびε）からなり、４つすべてがジスルフィド結合によって一緒に結合している、構造的に関連するタンパク質のクラスである。Ｈ鎖およびＬ鎖の両方が、抗原の結合に寄与し、あるＩｇ分子から別のＩｇ分子に高度に可変性である領域を有する。さらに、Ｈ鎖およびＬ鎖は、非可変性であるかまたは定常である領域を含む。
【００１６】
Ｌ鎖は、２つのドメインからなる。カルボキシ末端ドメインは、所定の型のＬ鎖間で本質的に同一であり、「定常」（Ｃ）領域と称される。アミノ末端ドメインは、あるＬ鎖から別のＬ鎖に変化し、抗体の結合部位に寄与する。その可変性に起因して、「可変」（Ｖ）領域と称される。
【００１７】
Ｉｇ分子のＨ鎖は、いくつかのクラス（α、μ、σ、α、およびγ（これらにはいくつかのサブクラスが存在する））からなる。２つの同一のＨ鎖およびＬ鎖の１以上の単位からなる集合したＩｇ分子は、その分子が保有するＨ鎖からその名前を得る。従って、以下の５つのＩｇアイソタイプが存在する：ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＧ（Ｈ鎖における相違に基づいて４つのサブクラス（すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）を有する）。さらに、抗体構造およびそれらの種々の機能に関する詳細は、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓにおいて見出され得る。
【００１８】
キメラ抗体は、マウス抗体またはラット抗体のＶ領域のすべてがヒト抗体Ｃ領域と結合されている組換え抗体である。ヒト化抗体は、げっ歯類抗体Ｖ領域に由来する相補性決定領域と、ヒト抗体Ｖ領域に由来するフレームワーク領域とが融合している組換えハイブリッド抗体である。ヒト抗体に由来するＣ領域もまた、使用される。相補性決定領域（ＣＤＲ）は、抗体の重鎖および軽鎖の両方のＮ末端ドメイン内の領域であり、この領域に対して、Ｖ領域のバリエーションの大多数が制限される。これらの領域は、抗体分子の表面でループを形成する。これらのループは、抗体と抗原との間の結合面を提供する。
【００１９】
非ヒト動物に由来する抗体は、外来抗体に対する免疫応答およびその循環からの除去を誘発する。キメラ抗体およびヒト化抗体のいずれも、組換えハイブリッド抗体内に減少した量のげっ歯類（すなわち、外来）抗体が存在するので、ヒト被験体に注射された場合に抗原性を減少させるが、ヒト抗体領域は免疫応答を不当に減少させない。このことは、より弱い免疫応答および抗体の除去の減少を生じる。このことは、ヒト疾患の処置において治療用抗体を使用する場合に、明らかに望ましい。ヒト化抗体は、「外来」抗体領域をあまり有さないように設計され、従って、キメラ抗体よりも抗原性が小さいと考えられる。
【００２０】
タンパク質レベルで標的する他の技術としては、タンパク質に特異的に結合するランダムに生成したペプチドの使用、およびタンパク質またはタンパク質改変体に結合し、その機能を改変する任意の他の分子の使用が挙げられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
ＤＮＡ複製プロセスを理解することは、癌治療の分野において最大の関心事である。癌細胞が、化学療法剤に対して耐性になり得、免疫系による検出を回避し得ることが公知である。新しい因子を同定し得るように、癌治療のための標的を同定することに対する必要性が存在し続けている。ＤＮＡ複製プロセスは、癌治療における薬物介入のための第一の標的を示す。ＤＮＡ複製を調節し、癌細胞系統の形成または進行に寄与する遺伝子産物を同定し、それらの機能に影響を及ぼす因子を開発する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
（発明の記述）
本発明の１つの局面に従って、ＤＮＡ複製を調節する因子の同定のための標的としての、Ｃｉｚ１ヌクレオチド配列もしくはＣｉｚ１ポリペプチド配列、またはその任意のフラグメントもしくは改変体の使用が提供される。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、用語「フラグメント」または「改変体」は、Ｃｉｚ１の全長ヌクレオチド配列もしくはアミノ酸配列に由来するか、またはそのスプライス改変体に由来する任意の核酸配列またはアミノ酸配列をいうように使用される。本発明の１つの実施形態において、フラグメントは、Ｃｉｚ１のＤＮＡ複製活性を保持するために、十分な長さであり、かつ／または全長Ｃｉｚ１に対して十分に相同である。代替的実施形態において、不活性なＣｉｚ１フラグメントが使用される。用語「フラグメント」または「改変体」はまた、本明細書中に記載されるＣｉｚ１ ＲＮＡ転写物およびタンパク質アイソフォーム（もしくはその部分）に関する。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、用語「調節する」は、ＤＮＡ複製を、特定の因子の非存在下で通常観察されるレベル以上に増加させるか、またはそのレベル以下に減少させるかのいずれか（すなわち、因子の使用に直接的に関連するかまたは間接的に関連するかのいずれかの、ＤＮＡ複製活性における任意の変化）をいうように使用される。用語「調節する」はまた、ＤＮＡ複製の空間的組織化または時間的組織化の変化への言及を包含する。
【００２５】
本発明の代替的局面に従って、ＤＮＡ複製を調節する因子の同定のためのスクリーニング方法が提供され、ここで、そのスクリーニング方法は、Ｃｉｚ１ヌクレオチド配列もしくはＣｉｚ１ポリペプチド配列、またはその任意のフラグメントもしくは改変体の使用を包含する。
【００２６】
好ましくは、上記スクリーニング方法は、以下：
ａ）図１４、１５、または２１のいずれかに示される核酸配列を含む核酸分子；
ｂ）（ａ）中の核酸配列にハイブリダイズし、かつＣｉｚ１活性またはその改変体の活性を有する核酸分子；
ｃ）遺伝暗号が原因でａ）およびｂ）中の配列、ならびに試験されるべき候補因子に対して縮重している核酸配列を有する核酸分子；
ｄ）Ｃｉｚ１遺伝子座でのゲノム配列に由来する核酸分子、または該ゲノム配列にハイブリダイズする核酸分子
からなる群より選択される核酸分子に対する因子の効果を検出または測定する工程
を包含する。
【００２７】
本発明の１つの実施形態において、上記核酸分子は、上記核酸配列のうちの少なくとも１つの核酸残基の欠失、置換または付加によって改変されている。
【００２８】
あるいは、上記スクリーニング方法は、以下の工程：
（ｉ）以下：
ａ）図１４、１５、または２１のいずれかに示される核酸配列を含む核酸分子；
ｂ）（ａ）の核酸配列にハイブリダイズし、かつＣｉｚ１活性またはその改変体の活性を有する核酸分子；
ｃ）遺伝暗号が原因でａ）およびｂ）中の配列、ならびに試験されるべき候補因子に対して縮重している核酸配列を有する核酸分子；
ｄ）Ｃｉｚ１遺伝子座でのゲノム配列に由来する核酸分子、または該ゲノム配列にハイブリダイズする核酸分子
からなる群より選択される核酸分子によってコードされるポリペプチド分子、またはその活性フラグメントを含む調製物を形成する工程；ならびに
（ｉｉ）該ポリペプチドの活性に対する前記因子の効果を検出または測定する工程
を包含する。
【００２９】
ＤＮＡ複製の検出のためのアッセイは、当該分野で公知である。Ｃｉｚ１に存在するか、またはペプチドフラグメントに由来する活性、およびその活性に対する潜在的治療剤の効果が、インビトロまたはインビボでアッセイされる。
【００３０】
Ｃｉｚ１タンパク質活性についてのインビトロアッセイは、同期化され、単離されたＧ１期の核と、サイクリン依存性キナーゼを補充されたＳ期抽出物またはＧ１期抽出物のいずれかとを含む。Ｃｉｚ１またはＣｉｚ１に由来するペプチドフラグメントを含むことは、これらの条件においてＤＮＡ複製の開始を刺激し、そして視覚的に（インビトロ反応の間に取り込まれた蛍光ヌクレオチドを有する核を記録することによって）かまたは放射性ヌクレオチドの取り込みを測定することによって、モニタリングされ得る。Ｃｉｚ１タンパク質機能を妨害する治療試薬についてのアッセイは、これらのアッセイにおけるＤＮＡ複製の阻害を探索することを含む。Ｃｉｚ１の、核への局在化、クロマチン結合、安定性、改変、およびタンパク質−タンパク質相互作用に対する因子の影響もまた、これらのアッセイにおいてモニタリングされ得る。
【００３１】
インビボアッセイは、Ｃｉｚ１もしくはＣｉｚ１に由来するフラグメントを過剰発現するか、またはＣｉｚ１もしくはＣｉｚ１に由来するフラグメントを過小に発現して、変化された細胞増殖をもたらす細胞モデルおよびマウスモデルの作製を包含する。このトランスジェニック動物の調製は、一般的に、当該分野で公知であり、当業者の技術範囲内である。治療試薬についてのアッセイは、Ｃｉｚ１およびその改変体をＲＮＡレベルで標的することによって、Ｃｉｚ１タンパク質活性に影響を与えるかまたはＣｉｚ１生成を妨害するかのいずれかである薬物の存在下および非存在下での、細胞周期時間、ＤＮＡ複製の開始、および癌の発症の分析を包含する。
【００３２】
本発明の好ましい方法において、前述のハイブリダイゼーション条件は、ストリンジェントである。
【００３３】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション／洗浄の条件は、当該分野で周知である。例えば、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での、６０℃での洗浄後に安定な核酸ハイブリッド。核酸の配列が既知である場合に最適なハイブリダイゼーション条件が計算され得ることは、当該分野で周知である。代表的に、ハイブリダイゼーション条件は、４〜６×ＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥは、１Ｌに溶解された１７５．３ｇのＮａＣｌ、８８．２ｇのＮａＨ２ＰＯ４ Ｈ２Ｏ、および７．４ｇのＥＤＴＡを含有し、そのｐＨは７．４に調整される）；５〜１０×デンハルト溶液（５０×デンハルト溶液は、５ｇのＦｉｃｏｌｌ（Ｔｙｐｅ ４００、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、５ｇのポリビニルピロリドン、および５ｇのウシ血清アルブミンを含有する）；１００μｇ〜１．０ｍｇ／ｍｌの超音波処理されたサケ／ニシンＤＮＡ；０．１〜１．０％ドデシル硫酸ナトリウム；必要に応じて、４０〜６０％脱イオンホルムアミドを用いる。ハイブリダイゼーション温度は、核酸標的配列のＧＣ含量に依存して変動するが、代表的に、４２℃〜６５℃の間である。
【００３４】
本発明の好ましい方法において、前述のポリペプチドは、このポリペプチド配列の少なくとも一アミノ酸残基の欠失、置換または付加によって改変される。
【００３５】
改変型かまたは改変体（すなわち、フラグメントポリペプチド）と参照ポリペプチドとは、任意の組合せで存在し得る一以上の置換、付加、欠失、短縮によってアミノ酸配列が異なり得る。好ましい改変体には、保存的アミノ酸置換によって参照ポリペプチドと異なる改変体がある。このような置換は、所定のアミノ酸を、同様の特徴の別のアミノ酸で置換する置換である。以下の、アミノ酸の非限定的なリストは、保存的置換（類似）とみなされる：ａ）アラニン、セリンおよびスレオニン；ｂ）グルタミン酸およびアスパラギン酸；ｃ）アスパラギンおよびグルタミン；ｄ）アルギニンおよびリジン；ｅ）イソロイシン、ロイシン、メチオニンおよびバリン、ならびにｆ）フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン。好ましいのは、参照ポリペプチド（これから改変体が変化する）と、同じ生物学的機能および活性を保持する改変体である。あるいは、改変体は、変化した生物学的機能を有する改変体（例えば、アンタゴニストとして働く改変体、いわゆる「ドミナントネガティブ」改変体）を包含する。
【００３６】
あるいは、または加えて、非保存的置換は、所望の生物活性を生じ得る（参考として援用される、Ｃａｉｎ ＳＡ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＤＭ，Ｈａｒｒｉｓ Ｖ，Ｍｏｎｋ ＰＮ．Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｌｉｇａｎｄｓ ｆｒｏｍ ａ ｗｈｏｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｒａｎｄｏｍｌｙ ｍｕｔａｔｅｄ Ｃ５ａ ｌｉｂｒａｒｙ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．２００１ Ｍａｒ；１４（３）：１８９−９３を参照このと）。
【００３７】
本発明に従う機能的に等価なポリペプチド配列は、一以上のアミノ酸残基が、保存的アミノ酸残基もしくは非保存的アミノ酸残基で置換された改変体であるか、または一以上のアミノ酸残基が置換基を含有する改変体である。保存的置換は、以下である：脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの間の一つから別のものへの置換；ヒドロキシル（ｈｙｄｒｏｘｌ）残基ＳｅｒとＴｈｒとの交換；酸性残基ＡｓｐとＧｌｕとの交換；アミド残基ＡｓｎとＧｌｎとの間での置換；塩基性残基ＬｙｓとＡｒｇとの間での交換；ならびに芳香族残基ＰｈｅとＴｙｒとの間での置換。
【００３８】
加えて、本発明は、本明細書中で開示されるようなヌクレオチド配列もしくはポリペプチド配列と少なくとも５０％の同一性を有するヌクレオチド配列もしくはポリペプチド配列、またはそのフラグメントおよび機能的に等価なポリペプチドを特徴とする。一実施形態において、このヌクレオチド配列もしくはポリペプチド配列は、本明細書に例示されるヌクレオチド配列およびアミノ酸配列と、少なくとも７５％〜８５％の同一性を有し、より好ましくは少なくとも９０％の同一性を有し、なおより好ましくは少なくとも９５％の同一性を有し、さらにより好ましくは少なくとも９７％の同一性を有し、そして最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する。
【００３９】
本発明の好ましい方法において、前述の核酸分子は、図１６もしくは図１７のＣｉｚ１のアミノ酸配列をコードする核酸配列、または図２０Ａおよび図２０Ｂに記載される改変体を含む、Ｃｉｚ１の任意の改変体をコードする核酸配列を包含する。本発明のさらなる好ましい方法において、前述の核酸分子は、図１６もしくは図１７のＣｉｚ１のアミノ酸配列をコードする核酸配列、または図２０Ａおよび図２０Ｂに記載される改変体を含む、アミノ酸配列Ｃｉｚ１の改変体をコードする核酸配列からなる。
【００４０】
本発明のさらなる好ましい方法において、前述のポリペプチド分子は、図１６もしくは図１７のＣｉｚ１のアミノ酸配列か、または図２０Ａおよび図２０Ｂに記載される改変体を含む、Ｃｉｚ１の改変体を包含する。本発明のさらなる好ましい方法において、前述のポリペプチド分子は、図１６もしくは図１７のＣｉｚ１のアミノ酸配列か、または図２０Ａおよび図２０Ｂに記載される改変体を含む、Ｃｉｚ１の改変体からなる。
【００４１】
本発明のさらなる好ましい方法において、前述のポリペプチドは、細胞（好ましくは哺乳動物細胞）または動物によって発現され、そして前述のスクリーニング方法は、細胞ベースのスクリーニング方法である。
【００４２】
好ましくは、前述の細胞は、Ｃｉｚ１ポリペプチドを天然に発現する。あるいは、前述の細胞は、Ｃｉｚ１ポリペプチド（または、例えば、癌細胞系統に見出されるその改変体分子）をコードする核酸分子によってトランスフェクトされる。
【００４３】
本発明のさらなる局面に従って、本発明に従う方法によって得られる因子が提供される。
【００４４】
好ましくは、前述の因子は、Ｃｉｚ１媒介性ＤＮＡ複製のアンタゴニストである。あるいは、前述の因子は、Ｃｉｚ１媒介性ＤＮＡ複製のアゴニストである。
【００４５】
本発明のさらなる好ましい方法において、前述の因子は、ポリペプチド；ペプチド；アプタマー；化学物質；抗体；核酸；またはポリペプチドプローブもしくはヌクレオチドプローブからなる群より選択される。
【００４６】
好ましくは、この因子は、標的に相補的である配列、または標的への特異的結合を生ずるに十分な相同性のある配列を含み、そして診断目的で核酸またはタンパク質のレベルを検出するために使用され得る。
【００４７】
あるいは、本発明の方法によって同定される因子は、治療剤であり、そして疾患の処置のために使用され得る。
【００４８】
本発明の一実施形態において、この因子は抗体分子であり、そして図１６、図１７または図２０によって表される配列のいずれかに結合する。
【００４９】
好ましくは、前述の抗体は、モノクローナル抗体である。
【００５０】
あるいは、前述の因子は、上記（ｉ）の核酸配列のいずれかによってコードされるｍＲＮＡに結合し、それによってこのｍＲＮＡをブロックするかまたは不活性化する、アンチセンス核酸分子である。
【００５１】
代替的実施形態において、前述の因子は、ＲＮＡｉ分子であり、これは互いにアニーリングして二本鎖ＲＮＡ分子を形成する、二つのＲＮＡ相補鎖（センス鎖およびアンチセンス鎖）を含む。好ましくはこのＲＮＡｉ分子は、Ｃｉｚ１遺伝子のエキソン配列に由来するか、または別の重複遺伝子に由来する。
【００５２】
一実施形態においては、スプライシングされていないｍＲＮＡがＲＮＡｉに標的とされて、スプライシング改変体の生成を阻害する。別の実施形態においては、このスプライシング改変体ｍＲＮＡは、非改変ｍＲＮＡに影響することなく除去される。
【００５３】
本発明の好ましい方法において、上記ペプチドは、オリゴペプチドである。好ましくは、上記オリゴペプチドは、少なくとも１０アミノ酸長である。好ましくは、上記オリゴペプチドは、少なくとも２０アミノ酸長、３０アミノ酸長、４０アミノ酸長、５０アミノ酸長である。
【００５４】
本発明のさらに好ましい方法において、上記ペプチドは、改変型ペプチドである。
【００５５】
改変型アミノ酸としては、例として、４−ヒドロキシプロリン、５−ヒドロキシリジン、Ｎ６−アセチルリジン、Ｎ６−メチルリジン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチルリジン、Ｎ６，Ｎ６，Ｎ６−トリメチルリジン、シクロヘキシアラニン、Ｄ−アミノ酸、オルニチンが挙げられるが、これらに限定されないことが、当業者にとって明らかである。他の改変としては、ハロ（例えば、Ｆ、Ｂｒ、Ｉ）、ヒドロキシもしくはＣ１〜Ｃ４アルコキシから選択される１個、２個もしくは３個の置換基で必要に応じて置換されたＣ２アルキルＲ基、Ｃ３アルキルＲ基もしくはＣ４アルキルＲ基を含むアミノ酸が挙げられる。
【００５６】
あるいは、上記ペプチドは、アセチル化および／またはアミド化によって改変される。
【００５７】
本発明の好ましい方法において、上記ポリペプチドまたはペプチドは、環化によって改変される。環化は、当該分野で公知である（Ｓｃｏｔｔら、Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ（２００１）８：８０１〜８１５；Ｇｅｌｌｅｒｍａｎら、Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ（２００１）５７：２７７〜２９１；Ｄｕｔｔａら、Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ（２０００）８：３９８〜４１２；ＮｇｏｋａおよびＧｒｏｓｓ，Ｊ Ａｍｅｒ Ｓｏｃ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ（１９９９）１０：３６０〜３６３を参照のこと）。
【００５８】
本発明のさらなる局面によると、例えば、Ｃｉｚ１またはその改変体を阻害し、それによって標的とされるべきタンパク質を発現する細胞の標的化を可能にするアンチセンスまたはＲＮＡｉ分子のための、送達手段としてのベクターが提供される。
【００５９】
本発明の一実施形態において、ウイルスベクターが、送達手段として使用される。
【００６０】
好ましくは、上記ベクターは、ヌクレオチド配列を含む発現カセットを含み、このヌクレオチド配列は、
ａ）図１４、図１５、および図２１に示されるＣｉｚ１アミノ酸配列をコードする核酸配列；
ｂ）（ａ）の核酸配列にハイブリダイズする核酸分子；
ｃ）遺伝コードが原因でａ）およびｂ）中の配列ならびに上記配列のうちのいずれかと相補的な任意の配列に対して縮重している核酸配列を有する、核酸分子；
ｄ）Ｃｉｚ１プレｍＲＮＡをコードする核酸配列（すなわち、ゲノム配列）；
からなる群より選択され、上記発現カセットは、プロモーター配列に対して転写的に連結されている。
【００６１】
好ましくは、上記発現カセットを含むベクターは、真核生物遺伝子発現のために適合される。代表的には、上記適合としては、例として、細胞特異的発現／組織特異的発現を媒介する転写制御配列（プロモーター配列）の提供が挙げられるが、これに限定されない。これらのプロモーター配列は、細胞特異的／組織特異的であっても、誘導性であっても、構成的であってもよい。；
プロモーターエレメントはまた、代表的には、所謂ＴＡＴＡボックス、および転写開始部位を選択するように機能するＲＮＡポリメラーゼ開始選択配列を含む。これらの配列はまた、特に、ＲＮＡポリメラーゼによる転写開始選択を促進するように機能するポリペプチドに結合する。
【００６２】
適合としてはまた、選択マーカーおよび自己複製配列の提供が挙げられ、これらは両方とも、真核生物細胞または原核生物宿主のいずれかにおける上記ベクターの維持を促進する。自律的に維持されるベクターは、エピソーム性ベクターと呼ばれる。ベクターによりコードされる遺伝子の発現を促進するさらなる適合としては、転写終結配列の提供が挙げられる。
【００６３】
これらの適合は、当該分野で周知である。発現ベクターの構築および組換えＤＮＡ技術一般に関する、かなりの量の刊行文献が存在する。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ，ＮＹおよびその中の参考文献；Ｍａｒｓｔｏｎ，Ｆ（１９８７）ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｖｏｌ ＩＩＩ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ ＵＫ；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＦＭ Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）を参照されたい。
【００６４】
本発明によると、増殖性傷害の同定のための診断方法が、提供され、この方法は、そのゲノム配列またはタンパク質配列における、Ｃｉｚ１遺伝子、Ｃｉｚ１スプライス改変体および変異の存在または発現を検出する工程を包含する。
【００６５】
好ましくは、上記診断方法は、以下の工程：
（ｉ）試験されるべき被験体から単離したサンプルを、Ｃｉｚ１活性を有するポリペプチドまたはＣｉｚ１活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子に特異的に結合する因子と、接触させる工程；ならびに
（ｉｉ）上記サンプル中の上記ポリペプチドまたは核酸に対する上記因子の結合を検出または測定する工程；
（ｉｉｉ）逆転写ＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲを使用して、Ｃｉｚ１アイソフォーム発現をモニターし、発現レベルを測定する工程；
（ｉｖ）上記分子の変化した立体構造特性に基づいて、核酸変異またはアミノ酸変異の存在を測定する工程；
のうちの１つ以上を包含する。
【００６６】
一次実施形態において、本発明の診断方法は、インビボで実行される。
【００６７】
代替的実施形態において、本発明の診断方法は、エキソビボまたはインビトロで実行される。
【００６８】
好ましくは、上記診断方法は、サンプル中のＣｉｚ１ ＲＮＡまたはＣｉｚ１タンパク質改変体の定量的測定を提供する。
【００６９】
本発明の一実施形態において、Ｃｉｚ１ ＲＮＡもしくはＣｉｚ１タンパク質またはそれらの改変体を調節する因子を、薬剤として使用することを提供する。
【００７０】
好ましくは、上記薬剤は、本発明のスクリーニング方法によって同定される因子を、薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤、もしくは希釈剤と、組み合わせてかまたは会合して含む。
【００７１】
好ましくは、上記薬剤は、経口投与用もしくは局所投与用、または注射による投与用である。本発明の代替的実施形態において、上記薬剤は、エアロゾルとして投与される。
【００７２】
本発明のさらなる好ましい実施形態において、増殖性疾患の処置において使用するための医薬の製造のための、本発明に従う因子の使用が提供される。好ましくは、上記増殖性疾患は、癌である。
【００７３】
好ましくは、上記癌は、小児癌であり、網膜芽細胞腫、神経芽細胞腫、バーキットリンパ腫、髄芽細胞腫、ユーイング肉腫家族腫瘍（ＥＳＦＴ）からなる群より選択される。
【００７４】
代替的実施形態において、上記癌は、癌腫、腺癌、リンパ腫、または白血病である。
【００７５】
代替的実施形態において、上記疾患は、肝臓癌、肺癌、もしくは皮膚癌、または肝臓転移、肺転移、もしくは皮膚転移である。
【００７６】
本発明のさらなる局面によると、増殖性疾患を処置するための方法が、提供され、この方法は、動物（好ましくはヒト）に、本発明に従う方法によって入手可能な因子を投与する工程を包含する。
【００７７】
本発明の代替的局面によると、細胞分裂または細胞増殖を遅くするための医薬の製造のための、本発明に従う因子の使用が提供される。
【００７８】
本発明はまた、合理的な薬物設計におけるＣｉｚ１アミノ酸配列およびタンパク質構造の使用、ならびにＣｉｚ１に特異的に結合する薬剤に関する化学ライブラリーのスクリーニングに対するＣｉｚ１ヌクレオチドおよびそのアミノ酸配列またはそれらの改変体の使用を包含する。
【００７９】
本発明はまた、本発明の方法によって同定された診断薬、予後薬または治療薬を備えるキットを包含する。
【００８０】
本発明の代替的実施形態において、アレイに基づく配列決定チップが、変化したＣｉｚ１の検出のために使用される。
【００８１】
（発明の詳細な説明）
ここで、本発明の実施形態は、以下の図を参照して単なる例として記載される。
【００８２】
（Ｃｉｚ１の同定）
本発明者らは、その挙動がインビトロでのＤＮＡ複製の開始に関連する未知の抗原を同定し、そして研究するための組換えヒトＣｄｃ６に対して惹起させたポリクローナル抗体（抗体Ｖ１）を発見した（Ｃｏｖｅｒｌｅｙら、２０００；Ｓｔｏｅｂｅｒら、１９９８；Ｗｉｌｌｉａｍｓら、１９９８）。この抗原は、１００ｋＤａの見かけの分子量を有し（ｐ８５と呼ばれる）、３Ｔ３細胞からの抽出物において容易に検出可能である（図１Ａ）。
【００８３】
ＤＮＡ合成は、「複製能のある」後期Ｇ１期の核、Ｇ１抽出物および組換え型サイクリンＡ−ｃｄｋ２を用いて、細胞を含まない複製実験において達成され得る。これらの条件下で、核は、活性なプロテインキナーゼの濃度に厳密に依存する様式で、新生ＤＮＡへと標識されたヌクレオチドを組み込む（図１Ｂ）。最適な濃度の上および下では、ＤＮＡ複製の開始は起こらない。しかし、開始と逆に相関する他の事象が生じる（Ｃｏｖｅｒｌｅｙら、２００２）。ここで、本発明者らは、ＤＮＡ合成の活性化（図１Ｂ）およびＭｃｍ２リン酸化（移動度の増加を生じる、図１Ｃ）を用いて、細胞を含まない複製実験における組換え型サイクリンＡ−ｃｄｋ２の効果を較正し、ＤＮＡ合成の活性化とのｐ８５の挙動を相関させる。
【００８４】
開始を誘導する濃度のサイクリンＡ−ｃｄｋ２を含有する反応から再び単離したＧ１核において、ｐ８５抗原は、より低いかまたはより高い濃度のキナーゼに曝露された核と比較して、より優勢である（図１Ｄ）。このことは、ｐ８５が、ＤＮＡ合成の活性化と同時に起こる様式で、サイクリンＡ−ｃｄｋ２によりある程度のレベルにおいて調節されることを示唆する。細胞を含まない開始プロセスにおけるこの段階と密接に関連する他の抗原はなく、したがって、本発明者らは、マウスｐ８５についての遺伝子をクローニングするために、抗体Ｖ１を用いた。
【００８５】
１１日目のマウス胚由来のｃＤＮＡ発現ライブラリーに適用される場合、抗体Ｖ１は、複数回のスクリーニングを生き残った２つのクローンを見出した（方法を参照のこと）。１つは、マウスＣｄｃ６をコードし、一方で、他のものは、ヒトＣｉｚ１（Ｍｉｔｓｕｉら、１９９９）のマウスホモログの７１６個のアミノ酸をコードした。全長ヒトＣｉｚ１および全長マウスＣｉｚ１は、アミノ酸レベルで全体で約７０％の相同性を有し、最も大きい（８０％を超える）相同性は、Ｎ末端領域およびＣ末端領域にある。Ｃｉｚ１は、ラットおよびフグにおいて存在するホモログとして、脊椎動物の間で保存されるが、高度な相同性または類似のドメイン構造を有するタンパク質は、下等真核生物において同定され得ず、Ｃｉｚ１が脊椎動物の発生において特殊化された役割を果たすように進化した可能性を生じる。
【００８６】
ヒトＣｉｚ１に関する以前の刊行物（Ｍｉｔｓｕｉら、１９９９）は、細胞周期タンパク質ｐ２１−ＣＩＰ１との相互作用を実証し、ＤＮＡ複製因子ではなく転写因子としての提唱された役割の調査をもたらした。本特許出願の優先日より後に刊行された第二の論文（ＷａｒｄｅｒおよびＫｅｈｅｒｌｙ、２００３）は、Ｃｉｚ１の腫瘍形成における役割を示唆するが、ＤＮＡ複製における役割を実証せず、そしてＣｉｚ１スプライシング改変体発現の重要性を認識しない。
【００８７】
（複数のＣｉｚ１のアイソフォーム）
予測されたマウスＣｉｚ１のオープンリーディングフレームおよびマウス乳腫瘤ライブラリー（ＢＣ０１８４８３）由来のｃＤＮＡは、本発明者らの胚クローン（ＡＪ５７５０５７）（本明細書中以下でＥＣｉｚ１と称される（図２Ａ））には存在しない３つの領域を含む。ＥＣｉｚ１におけるこれらの３つの可変領域は、エキソン２／３、６および８の選択的スプライシングの結果であるようである（図２Ｂ）。マウス黒色腫クローンＡＫ０８９９８６は、ＥＣｉｚ１と同じ３つの領域のうちの２つを欠き（図２Ａ）、一方で、第三のものは、Ｎ末端ポリグルタミン伸長部（これもまた、ヒト骨髄芽球腫由来のクローンに存在しない）をコードする。エキソン３／４由来の第四の配列ブロックは、マウスＥＳ細胞由来のＣｉｚ１転写産物、およびマウス原始生殖細胞におけるエキソン４に存在しない（図７）。ヒトＣｉｚ１はまた、ＲＮＡレベルで選択的にスプライシングされて、マウスＣｉｚ１と同じ４つの配列ブロックの組み合わせを排除する転写産物を与える（以下を参照のこと）。実際に、マウスＣｉｚ１ ｃＤＮＡにおける全ての公知のバリエーションは、ヒトにおける密接な類似物を有し、これらのいくつかは、アミノ酸レベルで同一である。このことは、異なるＣｉｚ１アイソフォームが、機能的重要性を有することを示唆する。第五の可変領域（マウスにおいてはまだ観察されていない）は、主として癌腫由来のヒトＣｉｚ１転写産物において選択的にスプライシングされる。
【００８８】
これらのデータは、Ｃｉｚ１のより短い形態（選択的にスプライシングされるエキソンを欠くもの）が、発生の初期において、および生殖系列を生じる細胞系統において、最も普及していることを示唆する。図７に示される分析において、完全に発達した新生児心臓由来のＣｉｚ１のみが、選択的スプライシングを示さず、一方で、すべての胚細胞型が、選択的にスプライシングされた形態を含む。さらに、公共のデータベース（ヒトまたはマウス）における完全なＣｉｚ１ ｃＤＮＡのみが、非胚細胞型由来であり、そして胚供給源由来のもののみが、選択的にスプライシングされる。従って、Ｃｉｚ１スプライス改変体発現は、まだ完全には分化していない細胞型において優先的に起こるようである。
【００８９】
顕著なことに、小児の癌由来のＣｉｚ１ ｃＤＮＡもまた、選択的にスプライシングされる（以下を参照のこと）。このことにより、本発明者らは、適切なＣｉｚ１アイソフォームの、発達における正しい時点での発現の失敗が、不適切に調節されたＣｉｚ１活性をもたらすことを仮定する。このことは、計画されていない増殖および細胞形質転換に寄与し得る。
【００９０】
（ＥＣｉｚ１は、インビトロでのＤＮＡ複製を刺激する）
Ｓ期の細胞からの細胞質ゾル抽出物へと曝露すると、Ｇ１後期の核は、ＤＮＡ複製を開始し、そして新生ＤＮＡを合成し始める（Ｋｒｕｄｅら、１９９７）。本発明者らは、この無細胞アッセイを使用して、ＥＣｉｚ１および誘導される組換えフラグメントの、ＤＮＡ合成に対する効果を試験した（図３）。全長ＥＣｉｚ１タンパク質は、インビトロで複製される核の数を、３０％（＋／−０．９％）から４６％（＋／−５．５％）へと一貫して増加させた。このことは、Ｃｉｚ１が、Ｓ期抽出物中の開始の制限物であることを示唆する（図３Ａ）。２つのみの他のクラスのタンパク質（サイクリン依存性キナーゼ、Ｃｏｖｅｒｌｅｙら、２００２；Ｋｒｕｄｅら、１９９７；Ｌａｍａｎら、２００１、およびＣｄｃ６タンパク質、Ｃｏｖｅｒｌｅｙら、２００２；Ｓｔｏｅｂｅｒら、１９９８）が、無細胞開始を刺激することが以前に見出された。従って、ＥＣｉｚ１は、複製プロセスに関与することがまだ公知ではなかったタンパク質で、この特性を有する最初のタンパク質である。組換えＥＣｉｚ１の、無細胞開始に対するポジティブな効果は、内因性Ｃｉｚ１が、哺乳動物細胞中でのＤＮＡ複製においてポジティブな役割を果たすことを立証する。
【００９１】
無細胞開始の刺激は、濃度依存性であり、Ｓ期抽出物において、約１ｎＭ ＥＣｉｚ１にピーク活性を有する（図３Ｂ）。このことは、他の組換えタンパク質を用いた、以前の無細胞分析（Ｃｏｖｅｒｌｅｙら、２００２；Ｋｒｕｄｅら、１９９７）を反映し、この以前の分析において、開始の刺激は、代表的に、ピークになり、次いで、低下して、高濃度での刺激されていないレベルまで戻る。ＥＣｉｚ１に関して、高濃度にて活性が低下することの理由は、未だに明らかではない。しかし、変異誘発研究（以下を参照のこと）は、この制限機構が、より高次のタンパク質複合体の組成における一般的な不均衡に起因するよりむしろ、活性かつ特異的であるようであることを示唆する。
【００９２】
（ＥＣｉｚ１のダウンレギュレーションは、スレオニン１９１／１９２に関連する）
Ｃｉｚ１は、インビボにおいて、リンタンパク質であるようである。なぜなら、Ｃｉｚ１は、多数の推定リン酸化部位を含み、そして３Ｔ３細胞抽出物がλホスファターゼで処理された場合に、変化した移動度を示すからである（図示せず）。マウスＣｉｚ１は、２つのＲＸＬサイクリン結合モチーフおよび５つの推定ｃｄｋリン酸化部位を含み、これらは、全ての公知の改変体に存在する。これらのうちの４つは、ＥＣｉｚ１の、インビトロ複製活性を含むＮ末端フラグメントに存在し（以下を参照のこと）、そして１つは、エキソン６が短いＤＳＳＳＱ配列モチーフを排除するように選択的にスプライシングされた部位に隣接する（図２Ａ、Ｃ）。このモチーフは、マウスとヒトとの両方において、１００％同一であり、そして選択的にスプライシングされるので、本発明者らは、条件的封入が、Ｃｉｚ１活性を調節するように働き得ると判断し、このタンパク質のこの領域を、潜在的に重要であると同定した。従って、本発明者らは、遺伝アプローチを無細胞複製アッセイと組み合わせることによって、４残基上流であり、そしてまた、マウスおよびヒトにおいて保存されるｃｄｋ部位に焦点を合わせることを選択した。ＥＣｉｚ１から開始して、１９１位および１９２位の２つのスレオニンを、２つのアラニンに変化させて、Ｅｃｉｚ１Ｔ（１９１／２）Ａ（図２Ｄ）を生成した。インビトロにおいて、ＤＮＡ複製活性について試験される場合、ＥＣｉｚ１Ｔ（１９１／２）Ａは、ＥＣｉｚ１と同程度に、後期Ｇ１核の開始を刺激した（図３Ｃ）。しかし、ＥＣｉｚ１とは異なり、開始の刺激は、少なくとも３桁に及ぶ広範な濃度にわたって維持された。従って、過剰のＥＣｉｚ１の活性を制限する機構は、無細胞環境において存在し、そして作動する。別の構築物において、２９３位のスレオニンもまた、アラニンに変化させて、ＥＣｉｚ１Ｔ（２９３）Ａを生成したが（図２Ｄ）、この変化は、インビトロにおいてアッセイされたＥＣｉｚ１活性に対してほとんど影響を有さなかった（図３Ｄ）。
【００９３】
これらの結果は、ＥＣｉｚ１活性のダウンレギュレーションが、スレオニン１９１／２に関連し、そしておそらく、サイクリン依存性キナーゼによって媒介されるこの部位におけるリン酸化によって引き起こされることを実証する。このことは、Ｃｉｚ１活性を、全ての主要な細胞周期事象（ＤＮＡ複製の開始を含む）を制御するｃｄｋ依存性経路に結び付ける。
【００９４】
ほとんどの複製前複合タンパク質および多くの複製フォークタンパク質は、しばしば、サイクリン依存性キナーゼによって、インビボでリン酸化される（ＢｅｌｌおよびＤｕｔｔａ、２００２；Ｆｕｊｉｔａ，１９９９）。本発明者らのデータは、ｐ８５−Ｃｉｚ１抗原の核蓄積が、サイクリンＡ−ｃｄｋ２によって（直接的にかまたは間接的に）調節されること、を示唆し、そしてこれらのデータは、スレオニン１９１／１９２における特異的なコンセンサスｃｄｋリン酸化部位が、Ｃｉｚ１活性の制御に関与することを示す。この部位がリン酸化不可能にされる場合、Ｃｉｚ１活性は、無細胞アッセイにおける広範な濃度にわたって維持される。従って、Ｃｉｚ１活性は、通常、この部位における改変によってダウンレギュレートされる。他の保存されたｃｄｋリン酸化部位の機能、およびＣｉｚ１の選択的にスプライシングされたＮ末端部分におけるＲＸＬサイクリン結合モチーフの条件的封入の効果は、まだ決定されていない。従って、Ｃｉｚ１活性とｃｄｋ依存性リン酸化との間の、ここで明らかになった単純なネガティブな関係が、一部始終ではないようである。しかし、本発明者らの分析は、これまでは、Ｃｉｚ１を、全ての主要な細胞周期移行を制御するｃｄｋ依存性経路に結び付け、従って、Ｃｉｚ１がＤＮＡ複製の開始に関与するという、本発明者らの主要な結論と一致する。
【００９５】
（インビトロ複製活性は、Ｎ末端に存在する）
Ｃｉｚ１は、タンパク質を核内に繋留し得る、いくつかのＣ末端特徴を保有する。ｍａｔｒｉｎ３ドメインは、核マトリックスとの相互作用を示唆し、そして３つのジンクフィンガーは、核酸との相互作用を示唆する。実際に、最近の証拠は、ヒトＣｉｚ１が、弱い配列特異的様式で、ＤＮＡを結合することを示唆する（ＷａｒｄｅｒおよびＫｅｈｅｒｌｅｙ，２００３）。Ｃ末端ドメインがＥＣｉｚ１複製活性のために重要であるか否かを決定するために、本発明者らは、このタンパク質を２つのフラグメントに分割した（図２Ｄ）。Ｎｔｅｒｍ４４２（これは、ＮＬＳ、２つの保存されたｃｄｋ部位、１つのジンクフィンガー、および可変スプライシングが観察された全ての公知の部位を含む）は、ＥＣｉｚ１と同程度に、そして同じ濃度で、開始を刺激する（図３Ｅ）。対照的に、Ｃ末端部分（Ｃｔｅｒｍ２７４）は、残余の複製活性を含まない（図３Ｆ）。従って、ｍａｔｒｉｎ３ドメイン、サイクリン依存性キナーゼリン酸化部位のうちの１つおよびジンクフィンガーのうちの２つは、インビトロにおいてアッセイされる場合、ＥＣｉｚ１のＤＮＡ複製活性のために必要とはされない。しかし、この分析は、ＥＣｉｚ１の活性を、トランスで、誤局在化の結果が検出されにくい条件下で測定することが注目されるべきである。従って、ｍａｔｒｉｎ３ドメインおよびジンクフィンガーが、インビボで作用して、Ｃｉｚ１活性を、核における特定の部位に指向し、これによって、Ｃｉｚ１活性の範囲を制限することは、可能なままである。
【００９６】
（内因性Ｃｉｚ１）
抗体Ｖ１は、Ｃｄｃ６ならびにｐ８５−Ｃｉｚ１を認識（図１Ａ）し、それゆえ、内因性Ｃｉｚ１の細胞内局在を可視化することを目的とする免疫蛍光実験には適切ではない。それゆえ、本発明者らは、組換えＥＣｉｚ１フラグメントＮｔｅｒｍ４４２に対する２つの新たなウサギポリクローナル抗血清（抗Ｃｉｚ１ １７９３および抗Ｃｉｚ１ １７９４と命名された）を作製した。予想されたように、精製されたＮｔｅｒｍ４４２は、ウエスタンブロットにおいて抗Ｃｉｚ１抗体１７９３および抗Ｃｉｚ１抗体１７９４によって認識されるが、これはまた、抗体Ｖ１によっても認識され（図４Ａ）、このことは、ｐ８５（ｐ１００）が実際にＣｉｚ１であるという結論を支持する。
【００９７】
増殖中の３Ｔ３細胞由来のタンパク質抽出物に適用した場合、抗Ｃｉｚ１ １７９３は、１２５ｋＤａおよび１００ｋＤａのＭｒで２つの抗原を認識し（図４Ｂ）、この相対比率は、調製物毎に変化した。１００ｋＤａバンドは、抗体Ｖ１によって認識されるサイクリン−Ａ応答性抗原と同時に移動し（図１および図４Ｂ）、このことは、両方の抗体が、インビボで同じタンパク質を認識することを示唆する。本発明者らは、抗体Ｖ１および１７９３によって認識されるｐ１００−Ｃｉｚ１バンドが同じタンパク質であることを、免疫沈降によって確認した（図４Ｃ）。抗体Ｖ１は、１７９３によるウエスタンブロットにおいて認識された１００ｋＤａバンドを沈降し、その逆もそうであった。さらに、同じ実験において、１７９３、およびより低い程度で抗体Ｖ１は、１７９３によってウエスタンブロットにおいて認識された１２５ｋＤａ抗原を沈降させた。まとめて考えると、本発明者らの観察は、１００ｋＤａバンドが実際にＣｉｚ１（以前はｐ８５として公知）であることを示し、これらは、Ｃｉｚ１タンパク質が、細胞周期を進行している細胞において少なくとも２つの形態で存在することを示唆する。
【００９８】
上記の免疫沈降の証拠に加えて、いくつかの他の観察によって、ｐ１２５もまた、Ｃｉｚ１の１形態であるとの結論が導かれた。第１に、本発明者らの両方の抗Ｃｉｚ１抗体（１７９３および１７９４）は、共通してこのバンドを有する。両方の抗体は、免疫蛍光実験において、同じパターンの核染色を生じ、そしてこれは、Ｃｉｚ１ ｓｉＲＮＡで処理された細胞において破壊される（以下を参照のこと）。第２に、ｐ１００およびｐ１２５の相対比は、調製物毎に変動し、それゆえ、この相対比は、タンパク質分解切断の結果であり得る。第３に、本発明者らの結果は、抗ヒトＣｉｚ１モノクローナル抗体が、ＨＥＫ２９３細胞において１２０ｋＤａおよび９５ｋＤａの見かけのＭｒを有する２つの抗体を検出したＭｉｔｓｕｉら（１９９９）の結果と顕著に類似する。彼らは、１２０ｋＤａ形態のヒトＣｉｚ１タンパク質がプロセシングされて９５ｋＤａ形態を生成することを提唱した。そして本発明者らの結果は、この提唱と一致する。
【００９９】
マウス細胞およびヒト細胞において抗体１７９３によって認識された１２５ｋＤａバンドは、非形質転換ヒト細胞（Ｗｉ３８−以下を参照のこと）およびマウス細胞（ＮＩＨ３Ｔ３−示さず）由来の物質の高分解能電気泳動の間に３本のＣｉｚ１関連バンドに分離した。これは、Ｃｉｚ１タンパク質の翻訳後修飾またはＣｉｚ１転写産物の選択的スプライシングの結果であり得る。
【０１００】
（Ｃｉｚ１の細胞内分布）
抗Ｃｉｚ１ １７９３を用いて、３Ｔ３細胞（図５Ａ）およびＨｅＬａ細胞（示さず）中のＣｉｚ１タンパク質（ｐ８５およびｐ１２５）の細胞内分布を可視化した。両方の細胞型において、１７９３は、核特異的抗原と反応し、そしてこれは、組換えＮｔｅｒｍ４４２フラグメントを含めることによってブロックされた（図５Ｂ）。比較のために示したＣｄｃ６（図５Ａ）とは異なり、Ｃｉｚ１は、この細胞周期進行中の集団の全ての３Ｔ３細胞において明確に検出可能である。それゆえ、量のわずかな変動またはアイソフォームは、この方法によっては検出されないが、Ｃｉｚ１は、中期を通して核中に存在する。界面活性剤での処理後、全体的核Ｃｉｚ１染色は、全ての核において減少した。このことは、Ｃｉｚ１が、可溶性画分として、および不溶性核構造体に結合しての両方で核に存在することを示唆する。
【０１０１】
可溶性タンパク質を洗浄した場合、この不溶性の固定化抗原は、高倍率では、斑点状の核内斑点パターンに分離する（図５Ｃ、Ｄ）。Ｃｉｚ１斑点は、ＤＮＡ合成がＳ期で生じる部位である、複製「点」または複製「工場」と類似のサイズ範囲および分布を示す。Ｃｉｚ１が複製工場の部位と同時に生じるか否かをみるために、本発明者らは、Ｃｉｚ１斑点の位置を、ＰＣＮＡ（Ｓ期の細胞における複製複合体の一成分である）の位置と比較した（図５Ｃ）。共焦点切片では、ＰＣＮＡ点は、Ｃｉｚ１点よりも少ないが、これらは、ほぼ全てＣｉｚ１と同時に生じる（図５Ｄ、図５Ｅ、図５Ｆ）。これは特に、中間サイズ範囲の点については顕著である。合わせた画像では、ＰＣＮＡ点の位置とＣｉｚ１点の位置との間の重複は、黄色のスポットを生じ、一方、残りのＰＣＮＡと同時に生じないＣｉｚ１点は、赤色である。緑色（ＰＣＮＡ単独）の点は、実質的に存在せず、このことは、Ｃｉｚ１が、ＤＮＡ複製工場が形成された全ての部位に存在することを示唆する。
【０１０２】
Ｃｉｚ１はまた、ＰＣＮＡを含まない部位に存在し（図５Ｄ）、そしてＰＣＮＡとは異なり、Ｃｉｚ１点は、中期を通して持続する（図５Ａ）。これらの観察の１つの解釈は、Ｃｉｚ１が、Ｓ期にＰＣＮＡ含有複製工場が形成され得る核内の位置を標識するが、これらの部位の全てが同時に使用されるわけではないということである。異なるＣｉｚ１点が、Ｓ期の種々の時点においてＤＮＡ複製の活性部位になるか否か、または他の核の活性もまたＣｉｚ１が結合した部位において生じるか否かは決定されていないままである。実際、この時期において、Ｃｉｚ１の１００ｋＤａ形態および１２５ｋＤａの改変体が異なる活性を有し、そしてこれらが異なる機能を有する核部位に存在するということもまた依然として可能性が残る。
【０１０３】
（Ｃｉｚ１は、細胞増殖に必須である）
これまでに、本発明者らは、ｐ８５（ｐ１００）−Ｃｉｚ１の挙動が無細胞アッセイにおけるＤＮＡ複製の開始と相関すること、組換えＣｉｚ１が開始頻度を刺激すること、およびＣｉｚ１がＤＮＡ複製機構と同じ核部位に存在することを示した。しかし、これらのデータは、Ｃｉｚ１が増殖中の細胞において必須の機能を有することを示さない。これを試験するために、本発明者らは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を用いて、ＮＩＨ３Ｔ３細胞中のＣｉｚ１転写産物レベルを選択的に減少させた。Ｃｉｚ１内の４つの標的配列を選択し（図２を参照のこと）そして短鎖干渉（ｓｉ）ＲＮＡ分子をインビトロで生成した。細胞に適用した場合、４つ全てのＣｉｚ１ ｓｉＲＮＡは、増殖を制限し（図６Ａ）、そして４８時間後にＣｉｚ１タンパク質レベルの明らかな減少を引き起こした（図６Ｂ）。増殖に対するＣｉｚ１低減の効果は、トランスフェクションの２３時間後と４０時間後との間で明らかになる。このことは、Ｃｉｚ１ ＲＮＡなしでの最初の細胞周期が比較的影響を受けないことを示唆する。４０時間までに、コントロール細胞およびＣｉｚ１ ｓｉＲＮＡ処理細胞は有意に異なり、Ｃｉｚ１低減集団においてはさらなる増殖がなかった。Ｃｉｚ１低減の特異性を確認するために、増殖が有意に阻害される前に、転写産物レベルを２４時間においてモニタリングした（図６Ｃ）。この時点で、Ｃｉｚ１転写産物は、ＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡで処理したコントロール細胞において４２％のレベルまで低下した。これらの実験は、Ｃｉｚ１が細胞増殖に必要とされ、そしてＤＮＡ複製の主な機能と一致することを示す。
【０１０４】
これをさらに試験するために、細胞を、ｓｉＲＮＡ処理の４８時間後にＢｒｄＵでパルス標識して、ＤＮＡ合成に関与した細胞の割合を決定した（図６Ｄ）。Ｃｉｚ１レベルが低下した場合、ＢｒｄＵ標識の割合もまた減少した。このことは、ＤＮＡ合成が、これらの条件下で阻害される示唆する。さらに、Ｃｉｚ１低減集団における、ＢｒｄＵを取り込まない細胞（この集団の約１５％）は、より弱く標識された。それゆえ、いくつかのＣｉｚ１ ｓｉＲＮＡ処理細胞では、おそらく不完全な低減に起因して、Ｓ期は、完全に阻害されるよりも遅延する。
【０１０５】
Ｃｉｚ１ ｓｉＲＮＡによるＤＮＡ合成の阻害は、核機能の全般的破壊の二次的結果であり得る。それゆえ、本発明者らは、そのレベルが細胞周期依存性様式で調節される他の複製タンパク質をある範囲でより詳細に調べて、低減細胞がランダムに停止するのかまたは特定の点で集積するのかをみた。
【０１０６】
真核生物ＤＮＡ複製の開始の間、複製Ｍｃｍ複合体タンパク質は、Ｇ１後期にＣｄｃ６依存性様式で複製起源に集合する。その後、ＤＮＡポリメラーゼおよびそれらの補助因子（ＰＣＮＡを含む）は、クロマチンに結合するようになり、そして起源が活性化される。これは、Ｃｄｃ６の大多数の核輸送およびタンパク質分解、そしてＤＮＡ合成が進行するのに従う、クロマチンからのＭｃｍ複合体の段階的移動と関連する（ＢｅｌｌおよびＤｕｔｔａ，２００２）。Ｃｉｚ１の作用点を同定するために、本発明者らは、免疫蛍光を用いて、Ｍｃｍ３およびＰＣＮＡをモニタリングした。Ｃｉｚ１低減細胞（図６Ｅ、Ｆ）では、両方のタンパク質が、界面活性剤耐性核構造体に結合した核において検出可能であった。それゆえ、これらの因子は、Ｃｉｚ１に直接は結合しないようであり、その集合はＣｉｚ１依存性でもないようである。実際、４つの独立した実験では、界面活性剤耐性クロマチンに結合したＭｃｍ３を有する細胞の平均数は、事実上、３１％（＋／−６％）から５１％（＋／−５％）へと増加した（図６Ｅ）。増加したＭｃｍ３は、Ｃｉｚ１依存性工程が、複製前の複合体の集合後に（しかし、Ｓ期の完了の前に）生じることを示す。同じ細胞集団では、ＰＣＮＡ陽性の割合もまた、３２％（＋／−５％）から４９％（＋／−６％）へと増加し（図６Ｆ）、ＰＣＮＡの集合後のＣｉｚ１作用点を狭めた。従って、Ｃｉｚ１は、Ｓ期を通した進行を阻害するように作用することができないながら、Ｍｃｍ３およびＰＣＮＡを適所に残して、開始プロセスにおける後期段階の間のＤＮＡ複製を促進するように作用する可能性が最も高い。
【０１０７】
まとめると、本発明者らの無細胞の調査、および細胞を基礎にした調査は、Ｃｉｚ１の主要な機能について一貫した画像を描く。それらは、Ｃｉｚ１がＤＮＡ複製工場の新規な成分であることを示唆し、そしてそれらは、Ｃｉｚ１が哺乳動物細胞周期において正の役割を演じ、ＤＮＡ複製の開始を促進するように作用することを示す。
【０１０８】
３つの本発明者らの調査のラインは、Ｃｉｚ１が、複製前複合体形成後、開始プロセス中の後期段階の間に必要であることを示唆している。第１に、ｐ８５（ｐ１００）−Ｃｉｚ１抗原は、ＤＮＡ合成を活性化するサイクリンＡ−ｃｄｋ２濃度に曝された核中で蓄積し、Ｃｉｚ１が初期の複製複合体アセンブリステップの間（Ｃｏｖｅｒｌｅｙら、２００２）よりむしろ、このステップの間に機能することを示す。第２に、後期Ｇ１核を用いる機能的研究は、組換えＥＣｉｚ１が、標識されたヌクレオチドをインビトロで取り込む核の数を増加することを示す。従って、Ｃｉｚ１は、ＤＮＡ合成を開始するように釣り合わされている核を、活性にＤＮＡを合成する核に転換するステップで活性でなければならない。第３に、ＲＮＡ干渉研究は、Ｍｃｍ複合体形成後、およびＰＣＮＡがＤＮＡ上にアセンブルされるようになった後であるが、これらタンパク質が置換される前の、Ｃｉｚ１依存性ステップを示す。これらの別個の調査のラインは、Ｃｉｚ１を開始の後期段階に置くＣｉｚ１の作用の点について顕著に類似する結論に至る。
【０１０９】
（治療戦略としての抗Ｃｉｚ１ ｓｉＲＮＡ）
本発明者らの分析は、Ｃｉｚ１が細胞増殖に必須であり、しかも、Ｃｉｚ１を標的にすることが、増殖を抑制するための実行可能な戦略であることを示す。種々の癌で本発明者らが観察するＣｉｚ１の選択的スプライス形態（以下を参照のこと）は、Ｃｉｚ１が、集団内の細胞のサブセット中の増殖を抑制するために選択的な方法で標的され得ることを意味している。
【０１１０】
例として、これは、小細胞肺癌腫細胞中で、Ｃ末端配列ＧＴＴＧＡＧＧＡＧＧＡＡＣＴＣＴＧＣＡＡＧＣＡＧを欠いているときにＣｉｚ１転写物中で生成される接続配列にｓｉＲＮＡを標的することによるか、または特異的な化学的インヒビターを選択するために対応するＶＥＥＥＬＣＫＱ配列を欠くＣｉｚ１タンパク質を用いることにより、なされ得る。
【０１１１】
従って、本発明はまた、診断マーカー、予後指標または治療標的としての選択的スプライス配列が存在しないときにＣｉｚ１転写物およびＣｉｚ１タンパク質中に生成される接続配列の使用を提供する。
【０１１２】
（胚形態Ｃｉｚ１は核に局在化する）
潜在的に可変であるエキソン全域にわたるＲＴ−ＰＣＲ分析は、３Ｔ３細胞が全長Ｃｉｚ１を優勢に発現することを示唆し、そこで、内因性Ｃｉｚ１に関する本発明者らの免疫局在化研究（図５）は、いくつかの配列ブロックを欠き、そしておそらくそれ故、そのタンパク質を局在化するために用いられる情報を欠く、ＥＣｉｚ１の挙動を必ずしも反映しない。ＥＣｉｚ１と全長Ｃｉｚ１との局在化を直接比較するために、増大されたＧＦＰタグ構築物を、３Ｔ３細胞中にトランスフェクトし（図８Ａ）、そしてマウスの前核中にマイクロインジェクトした（図８Ｂ）。すべての場合において、タグ化Ｃｉｚ１およびタグ化ＥＣｉｚ１は専ら核にあり、その一方、ＧＦＰ単独を発現するコントロール構築物は、核および細胞質中に存在した。ＧＦＰ−Ｃｉｚ１およびＧＦＰ−Ｃｉｚ１は両者とも、生存細胞中で、免疫蛍光によって固定された細胞中で観察された複製中心に類似する副核中心として見えた。従って、ＥＣｉｚ１から存在しない３つの配列ブロックは、Ｃｉｚ１の核局在化に寄与するように見えなかった。
【０１１３】
トランスフェクション後３日間に亘り、ＧＦＰ−Ｃｉｚ１およびＧＦＰ−ＥＣｉｚ１でトクランスフェクトした細胞中では細胞分裂は観察されなかった。これらのデータは、機能的Ｃｉｚ１の過剰発現が、（調節経路をインタクトで有する細胞において）細胞周期に対して阻害効果を有することを示唆する。
【０１１４】
（融合）
Ｃｉｚ１のＣ末端の１／３が除去されたＧＦＰタグ化構築物が３Ｔ３細胞中にトランスフェクトされたとき、ＥＣｉｚ１と全長Ｃｉｚ１との間の差異が観察された（図８Ｃ）。４８時間までに、ＦＬ Ｃｉｚ１ Ｎ末端（４４２相当）は、大きな核内斑点（ｂｌｏｂ）へと融合し、これは、３日目までまたそれより遅く、ＥＣｉｚ１ Ｎ末端４４２トランスフェクション集団中でのみ見えるようになった。この時点より前は、ＥＣｉｚ１ Ｎ末端４４２は、核に特異的であるが拡散したパターンとして局在化した。従って、融合する能力は、Ｃｉｚ１とＥＣｉｚ１との間で定量可能に異なり、そしてそれ故、３つの選択的にスプライスされたエキソンのうちの１つ（２／３、６または８）によって影響される。
【０１１５】
全長Ｃｉｚ１およびＥＣｉｚ１でトランスフェクトされた細胞のように、Ｃ末端の１／３が除去された構築物でトランスフェクトされた細胞は、３日間のモニタリング期間の間に増えるようには見えなかった。
【０１１６】
（Ｃ末端ドメインはＣｉｚ１を核構造に係留する）
上記で説明したように、Ｃｉｚ１とＥＣｉｚ１ Ｎ末端との間の差異は、Ｃ末端ドメインもまた存在するときマスクされる（図８Ａ）。さらに、Ｃ末端フラグメント単独は、ＧＦＰタグをクロマチンに向け、Ｃｉｚ１またはＥＣｉｚ１のようなスポット状（中心）ではない不規則パターンを形成するが、これは、有糸分裂の間に染色体に付着したままである（図８Ｄ）。これは、Ｃ末端ドメインが、核中の構造的フレームワーク上にＣｉｚ１を固定化することに関与していることを示唆する。注目すべきことに、Ｃ末端フラグメントで一時的にトランスフェクトした細胞は、分裂し続け、緑の蛍光の段階的な希釈を生じた。
【０１１７】
（異所性Ｃｉｚ１は、Ｓ期への未成熟エントリーを促進する）
本発明者らは、トランスフェクション後、最初の日の間に生じる事象を調べた。トランスフェクトされた細胞（緑）中のＳ期の画分を、非トランスフェクション細胞中のＳ期の画分と、ＢｒｄＵで種々の間隔で標識することにより比較した。０〜２２時間（図８Ｅ）、０〜１２時間および０〜７時間（示さず）を含む長い標識時間体の間、一致して、非トランスフェクション細胞に比較して、より多くのＣｉｚ１トランスフェクション細胞およびＥＣｉｚ１トランスフェクション細胞がＤＮＡ合成に従事した。これは、Ｃｉｚ１およびＥＣｉｚ１が、Ｇ１→Ｓ遷移に対して正の影響を有し、Ｓ期へのスケジュールされないエントリーを促進することを示唆する。類似の結果が、トランスフェクション前に密にプレートされた３Ｔ３細胞集団で得られた。これは、正常細胞周期の一部としてＳ期に従事した非トランスフェクション集団にある画分を最小にするためになされた。これらの条件の下、トランスフェクション集団と非トランスフェクション集団との間の差異は最大になり、ＤＮＡ複製の開始に対する異所性Ｃｉｚ１の効果を明瞭に示した。
【０１１８】
逆に、細胞が、トランスフェクション後２２時間（図８Ｅ）、または１０時間または１２時間（示さず）で投与された短パルスの間に、ＢｒｄＵで標識されたとき、この標識された画分は、一貫して、Ｃｉｚ１トランスフェクション集団およびＥＣｉｚ１トランスフェクション集団で減少した。これは、異所性Ｃｉｚ１またはＥＣｉｚ１によって誘導されるＳ期は異常であり、遅延または廃されたＤＮＡ合成が、ＢｒｄＵへの曝露の短時間帯の間に細胞を標識するには十分でないことを示唆する。
【０１１９】
従って、異所性Ｃｉｚ１および異所性ＥＣｉｚ１は、培養細胞中のＳ期に対し２つの効果を有している。それらは、ＤＮＡ複製を促進するが、これは、遅延または廃されたＤＮＡを生じる。
【０１２０】
（改変された増殖能力をもつクローン）
本発明者らはまた、３週間の期間に亘り３Ｔ３細胞のトランスフェクション集団をモニターした。ＧＦＰ−Ｎ末端４４２または非選択的スプライス等価物でトランスフェクションされ、かつＧ４１８での選択下で維持された細胞では、数百の細胞を含む大きな増殖巣が観察された（図９Ａ）。これらのクラスターは多数のＧＦＰ発現細胞を含み、このことは、（複製活性が存在する）ＥＣｉｚ１のＮ末端部分の過剰発現が致死的ではないことを示し、そしてこの過剰発現が、非トランスフェクション細胞と比較して、接触阻害の損失および単層形成の不能を含む、改変された増殖表現型に至ることを示唆している。このＣｉｚ１依存性の改変された挙動は、腫瘍形成に寄与し得る。推定のクロマチン相互作用ドメインを欠く、マウスＣｉｚ１の類似する短縮型バージョンは、マウス黒色腫から先に単離された（図２）。
【０１２１】
（ヒトＣｉｚ１および癌）
（公開データベース中のＣｉｚ１ ｃＤＮＡ）
上記で述べたように、ヒトＣｉｚ１は、ＲＮＡレベルで選択的にスプライスされ、マウス胚Ｃｉｚ１と同じ３つのエキソンを欠く転写物を生じる。７つのヒトＣｉｚ１ ｃＤＮＡが、Ｍｉｔｓｕｉら（１９９９）、ＷａｒｄｅｒおよびＫｅｈｅｒｌｙ（２００３）および大規模ゲノム分析プロジェクト（ＮＩＨ−ＭＧＣプロジェクト、ＮＥＤＯヒトｃＤＮＡ配列決定プロジェクト）によって提出された公開データベースに記録されている（図１０）。１つだけが正常成体組織由来であり、そしてこれは、すべての推定されたエキソンを含む（ＡＢ０３０８３５）。残りは、胚細胞由来である（ＡＫ０２７２８７）か、または特に４つの異なるタイプの小児癌由来である（髄芽細胞腫、ＡＦ１５９０２５、ＡＦ０２３４１６１、網膜芽細胞腫、ＡＫ０２３９７８、神経芽細胞腫、ＢＣ００４１１９およびバーキットリンパ腫、ＢＣ０２１１６３）。この胚形態および癌由来形態は、本発明者らの胚マウスクローンと同じ３つの領域から、およびエキソン４に対応する第４の領域からの、配列ブロックを欠く。従って、この制限されたデータは、選択的スプライス形態が、発生の初期により優勢であることを示唆する。この相関関係は、先には科学的文献には記載されていない。小児癌における選択的にスプライスされたＣｉｚ１の存在は、Ｃｉｚ１誤スプライシングが不適切な細胞増殖に関連し得る可能性を挙げる。
【０１２２】
例えば、可変エキソンの１つは、マウスＥＣｉｚ１およびヒト髄芽細胞腫に存在しない、短い保存されたＤＳＳＳＱ配列をコードする。これは、本発明者らがＥＣｉｚ１機能の調節に関係することを示したコンセンサスｃｄｋリン酸化部位に直接隣接する。ＤＳＳＳＱ配列の条件付き包含は、Ｃｉｚ１をプロテインキナーゼのＡＴＭ／ＡＴＲファミリーによる調節の対象にし得、このプロテインキナーゼは、ＳＱ配列においてタンパク質をリン酸化し、それによって、ＤＮＡ損傷に応答してＣｉｚ１開始機能を抑制する。
【０１２３】
（発現される配列タグの分析）
小児癌における選択的にスプライシングされたＣｉｚ１の存在は、Ｃｉｚ１ ＥＳＴの詳細な分析を促進した。ＮＣＢＩ ユニジーンクラスターＨｓ．２３４７６（ヒトＣｉｚ１）に含まれる５６７個の発現配列タグ（ＥＳＴ）が存在する。これらは、幅広い範囲の正常および疾患の組織および細胞株に由来する。配列は、翻訳されて、ヒトＣｉｚ１の予測全長アミノ酸配列に対してマッピングされた。アミノ酸置換、欠失、フレームシフトおよび翻訳の早期の終了を生じる配列の変化が記録された。
【０１２４】
選択的にスプライシングされたＣｉｚ１改変体はまた、ＥＳＴデータセットに見出され、本明細書中に記録される。ヒトおよびマウスのＣｉｚ１において選択的にスプライシングされることが以前に報告された４つの配列ブロック（図２）は、ＥＳＴ配列、およびエキソン１４由来の配列ＶＥＥＥＬＣＫＱを欠く以前に検出されなかった改変体において観察された。これらの繰り返される改変体配列ブロックの全てが、適切なスプライシング部位によって制限される。６番目の可変配列ブロックは、以下：
【０１２５】
【数１】
【０１２６】
の包含によって引き起こされる、１つの癌由来のライブラリーにおいて同定された。
【０１２７】
ＥＳＴは、成体起源、幼児起源または胚起源の新生物細胞間で生じる最初の区分を用いて、それらが由来する細胞型に従って、グループ分けされる。胚起源または成体起源の正常組織由来のＥＳＴが、比較のために含まれる。ＥＳＴ由来のＣｉｚ１タンパク質マップを図１１Ａ〜Ｅに示し、選択的にスプライシングされたエキソンを図１１Ｆにまとめる。
【０１２８】
ヒトＣｉｚ１のＮ末端における３つの配列ブロックは、髄芽細胞種および神経芽細胞種由来の転写物に存在せず（図１１Ａ）、そして他の癌由来のＣｉｚ１転写物からの転写物にはときどき存在しない。本発明者らはまた、第３の小児癌、ユーイング肉腫（以下を参照のこと）において類似の選択的スプライシングを見出した。小児癌に関係する選択的にスプライシングされた配列は、エキソン２／３（少なくとも２つのバージョン）、エキソン４およびエキソン６に由来する。
【０１２９】
Ｑリッチ縮重リピートの１つ以上のコピーが存在しないエキソン８改変体は、（胚起源または成体神経起源の）正常細胞由来の転写物および種々の癌由来の転写物において注目された。この領域における選択的スプライシングは、不適切な活性を有するＣｉｚ１を生成し得、従って、エキソン８改変体発現、またはこの領域のスプライシングに影響する点変異の存在は、癌の診断マーカーまたは予後マーカーとして有用であり得る。エキソン８の選択的にスプライシングされた縮重リピートを、以下に詳細に記載し、図１１Ｆにまとめる。
【０１３０】
ヒトＣｉｚ１タンパク質のＣ末端の半分において、２つの配列ブロックは、種々にスプライシングされる。これらのうちの１つは、５つの肺癌および肺カルチノイドライブラリーのうちの３つ由来の転写物、および３つの他の癌腫由来の転写物から失われている（しかし、他の細胞型由来の転写物からは非常にまれである）。
【０１３１】
第２の改変体配列ブロックは、類表皮癌腫ライブラリー（ＭＧＣ１０２）由来の転写物における外部配列の不適切な包含に起因する。
【０１３２】
Ｃｉｚ１タンパク質において形成されるこれらの配列および連結配列、これらのセグメントが排除される場合または含まれる場合のＣｉｚ１転写物は、幅広い範囲の異なる癌において細胞増殖の選択的阻害のための潜在的標的である。残りの非改変体配列は、細胞増殖の非選択的阻害のための潜在的標的である。
【０１３３】
スプライシング改変体に加えて、他の非典型的Ｃｉｚ１転写物は、好ましくは、いくつかの癌において存在することが見出された。横紋筋肉腫において、Ｃｉｚ１は、早期に終了し、Ｃ末端核結合ドメインを欠く予測タンパク質を導く。これは、不適切なＤＮＡ複製を導き得、従って、この型の癌における治療標的またはマーカーであり得る。
【０１３４】
いくつかの転写物は、推定サイクリン依存性キナーゼ（ｃｄｋ）リン酸化部位にアミノ酸置換を導く点変異を含む。頸癌ライブラリーＭＧＣ１２において、これは、２回生じる。本発明者らは、２つのｃｄｋリン酸化部位がＣｉｚ１活性の制限に関係することを示し（図３ＣおよびＤ）、これは、癌細胞における増殖の調節解除におけるこれらの変異を関係させる。これらのうちの１つが、上記の癌由来の変異と同じである（図１１Ｅ）。Ｃｉｚ１に点変異を有する癌由来の転写物はまた、ＲＮＡ干渉によって標的化され得るか、または診断指標または予後指標としての価値を有し得る。
【０１３５】
（小児癌におけるＣｉｚ１改変体発現の調査）
Ｃｉｚ１改変体発現を、公知のＣｉｚ１可変性の３つの領域にわたるプライマーセットを用いるＲＴＰＣＲを使用して、６つのユーイング肉腫ファミリー腫瘍細胞株（ＥＳＦＴ）および２つの神経芽細胞株において調査した（図１２Ａ）。この分析は、Ｃｉｚ１改変体発現のパターンが、神経芽細胞と比較して、非形質転換株と比較して、ＥＳＦＴ細胞において異なるが、同じ腫瘍由来の細胞株のセットにおいて明らかに非常に類似していることを示した。従って、Ｃｉｚ１改変体発現は、これらの癌についての診断の可能性または予後の可能性を有し得る。同じ腫瘍型由来の株のセット内のより小さな改変は、予後的価値を有し得る。
【０１３６】
増幅された転写物をサブクローニングし、そして配列決定することによって、本発明者らは、試験された６つ全てのＥＳＦＴ株がＣｉｚ１のエキソン４マイナス形態を発現することを見出した。Ｃｉｚ１が細胞増殖に必須である（以下を参照のこと）ので、これは、ＥＳＦＴ細胞の選択的制限のための可能性のある経路を提供する。試験された２つの神経芽細胞株由来の転写物は、まれにエキソン４を欠くが、しばしば、エキソン６によってコードされるＤＳＳＳＱモチーフの配列を欠く（図１２Ｂ）。
【０１３７】
この実験の分析は、小児癌が、エキソン４、６およびおそらくエキソン２／３の可変の包含を伴って、Ｃｉｚ１の形態を発現することを確認する。
【０１３８】
エキソン８およびＶＥＥＥＬＣＫＱコード配列を含む配列の１つの形態を含む配列の２つのバージョンを、ＥＳＦＴ、神経芽細胞腫およびコントロールにおいて検出し、これは、これらの領域が、これらの小児癌においてＣｉｚ１の調節解除に寄与しないことを示唆する。
【０１３９】
全ての場合において、Ｃｉｚ１ ＲＴ−ＰＣＲ産物は、コントロール（Ｗｉ３８、ＨＥＫ２９３、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、および初代ヒト骨芽細胞）と比較して、癌細胞株由来のＲＮＡサンプルを用いて実行した反応において最も多量に存在した。これは、腫瘍におけるＣｉｚ１改変体の増加した発現と一致する。
【０１４０】
（前立腺癌細胞株のＣｉｚ１タンパク質発現の分析）
正常非形質転換ヒト肺線維芽細胞（およびマウスＮＩＨ３Ｔ３細胞）は、ウエスタンブロットにおいて抗Ｃｉｚ１ポリクローナル抗体１７９３によって検出されるＣｉｚ１の２つの主要な形態を発現する（図１３Ａ）。より大きな（約１２５ｋＤａ）バンドは、Ｗｉ３８細胞において等しい割合で存在する３つの異なるバンドに分解するが、前立腺癌細胞株ＰＣ３およびＬＮＣＡＰ（およびＥＳＦＴ細胞株−示さない）において非常に一様でない割合で存在する。本発明者らは、これらのタンパク質アイソフォームが、可変にスプライシングされるエキソンの発現によって生成することを推定する。両方の腫瘍細胞株がまた、Ｗｉ３８細胞よりもＣｉｚ１抗原を含み、これは、これらの癌細胞株におけるＣｉｚ１の過剰発現と一致する。
【０１４１】
まとめると、本発明者らの結果（ゲノムデータの実験分析およびバイオインフォマティクス分析）は、幅広い範囲のヒト癌において誤調節されるという結論を支持する。本発明者らは、Ｃｉｚ１タンパク質が、ＤＮＡ複製プロセスにおいてポジティブな役割を果たし、従って、変異体Ｃｉｚ１が、細胞形質転換の結果であるというよりも、細胞形質転換に寄与し得ることを示した。Ｃｉｚ１の調節解除が、このプロセスにおける共通の工程である場合、このＣｉｚ１の調節解除は、治療剤の開発における非常に魅力的な標的を示す。
【０１４２】
本発明者らはまた、特定の癌に特定の変化を関連付けており、これにより、Ｃｉｚ１が診断マーカーまたは予後マーカーとして有用である可能性を実現する。これらの変化としては、以下が挙げられる：
・小児癌におけるタンパク質のＮ末端部分（インビトロにおける複製活性を有する）における可変スプライシング。
【０１４３】
・Ｃｉｚ１複製活性の抑制に関連することが公知であるサイクリン依存性キナーゼリン酸化部位における点変異。
【０１４４】
・前立腺癌腫細胞株におけるＣｉｚ１−ｐ１２５形態の非典型的な発現および核酸結合特性（おそらく、エキソン８または他のエキソンの縮重リピートのスプライシング調節の誤りに起因する）。
【０１４５】
・肺における小細胞癌および他の癌腫におけるＣｉｚ１のＣ末端における異なったモチーフ（ＶＥＥＥＬＣＫＱ）の条件的除外（おそらく、Ｃｉｚ１タンパク質の核内局在に関連する）。
【０１４６】
・Ｗｉ３８正常胚肺線維芽細胞、ヒト骨芽細胞ＲＮＡおよびマウスＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞と比較した場合の、従来試験した全ての癌由来細胞株における、Ｃｉｚ１タンパク質およびＲＮＡのレベルの上昇（ウエスタンブロットおよびＲＴ−ＰＣＲによって検出される）。
【０１４７】
図１４〜図２１に示した配列は、治療試薬、診断試薬または予後試薬の開発のために役立つ。
【０１４８】
（材料と方法）
（クローニング）
１１日齢マウス胚由来のｌａｍｂａ ｔｒｉｐｌＥｘ ５’伸長全長富化ｃＤＮＡ発現ライブラリー（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ ＭＬ５０１５ｔ）を、推奨プロトコール（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）に従ってＥ．ｃｏｌｉ Ｘｌ１ｂｌｕｅに感染させるために使用した。プラークを、１０ｍＭ ＩＰＴＧ（Ｓｉｇｍａ）に事前に浸した０．４５ミクロンのニトロセルロースフィルター上に乗せた。抗体非存在下での３０分間のブロッキング後、アフィニティ精製抗体Ｖ１を、約３×１０６個のプラークに、ＰＢＳ、１０％無脂肪乳粉末、０．４％ Ｔｗｅｅｎ２０中１／１０００希釈で適用した。２時間後、フィルターを同じ緩衝液で３回洗浄し、反応性プラークを、標準的手順に従い、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合体化した抗ウサギ二次抗体（Ｓｉｇｍａ）を用い、化学発光を増強して（ＥＣＬ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）、可視化した。４３個の独立したプラークを調べたが、２株のファージのみが、さらなる３周のスクリーニングで残った。これらを、ＢＭ２５．８内への形質転換によってｐＴｒｉｐ１Ｅｘへ変換して、配列決定した。１つは、マウスＣｄｃ６（クローンＰ）をコードし、他方（クローンＬ）は、ヒトＣｉｚ１に相同な未知のマウスタンパク質をコードしていた。本発明者らは、これを胚性Ｃｉｚ１（ＥＣｉｚ１）と呼び、これを、ＥＭＢＬに登録番号ＡＪ５７５０５７の下で登録した。
【０１４９】
（細菌発現）
ｐＧＥＸベースの細菌発現構築物（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用し、インビトロ分析のためにＥＣｉｚ１タンパク質を産生した。ｐＧＥＸ−ＥＣｉｚ１を、クローンＬ由来の２．３ｋｂのＳｍａＩ−ＸｂａＩ（平滑末端）フラグメントをｐＧＥＸ−６Ｐ−３のＳｍａＩ部位内に挿入することによって産生した。ｐＧＥＸ−Ｎｔｅｒｍ４４２を、１．３５ｋｂのＸｍａＩ−ＸｈｏＩフラグメントをＸｍａＩ−ＸｈｏＩ切断したｐＧＥＸ−６Ｐ−３内に挿入することによって産生し、そしてｐＧＥＸ−Ｃｔｅｒｍ２７４を、０．９５ｋｂのＸｈｏＩフラグメントをＸｈｏＩ切断したｐＧＥＸ−６Ｐ−３内に挿入することによって産生した。ｐＧＥＸ−Ｔ（１９１／２）Ａを、ｐＧＥＸ ＥＣｉｚ１から、以下のプライマーを用いた部位特異的変異誘発（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ）によって産生した：
【０１５０】
【数２】
【０１５１】
ｐＧＥＸ−Ｔ（２９３）Ａを、以下のプライマーを用いて産生した：
【０１５２】
【数３】
【０１５３】
全てのクローンの読み取り枠の完全性を、配列評価した。
【０１５４】
組換えＣｉｚ１、Ｃｉｚ１フラグメントおよび点変異を、ＢＬ２１−ｐＬｙｓＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）内で、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ−タグ化タンパク質として産生した。これを、超音波処理し清浄化した細菌溶解物から、グルタチオンセファロース４Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）への結合によって精製した。組換えタンパク質を、ＧＳＴタグから、精密プロテアーゼを用いて（製造業者Ａｍｅｒｓｈａｍによって推奨されるように）切断することにより、緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ（ｐＨ７．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ）中に溶出した。このタンパク質沈殿の収率は、０．２〜２．０ｍｇ／ｍｌであった。複製アッセイのために、１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．８）、１ｍＭ ＤＴＴ、５０％グリセロール中で連続希釈を行い、その結果、１ｍｌ以下のタンパク質溶液を１０ｍｌ複製アッセイに添加して、示した濃度を得た。以前の観察（Ｍｉｔｓｕｉら，１９９９；ＷａｒｄｅｒおよびＫｅｈｅｒｌｙ，２００３）と一致して、組換えＣｉｚ１、および生成されたフラグメントＮ−ｔｅｒｍ４４２は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、異常に高分子量で移動した。サイクリンＡ−ｃｄｋ２を、以前に記載されたように（Ｃｏｖｅｒｌｅｙら，２００２）、細菌中で産生した。
【０１５５】
（抗Ｃｉｚ１抗体）
ウサギポリクローナル抗体Ｖ１（Ｃｏｖｅｒｌｅｙら，２０００；Ｓｔｏｅｂｅｒら，１９９８；Ｗｉｌｌｉａｍｓら，１９９８）を、細菌的に発現されたヒトＣｄｃ６の内部フラグメント（アミノ酸１４５〜３６０に対応する）に対して惹起し、標準的手順（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，１９８８）によりアフィニティ精製した。この抗体は、内在性ｐ１００−Ｃｉｚ１およびまたＥＣｉｚ１ Ｎｔｅｒｍ４４２フラグメントに対して強く反応する。Ｎｔｅｒｍ４４２とＣｄｃ６アミノ酸１４５〜３６０とのアラインメントは、共有エピトープがマウスＣｉｚ１における２９４〜２９８または３０４〜３１２であり得ることを示唆する。組換えＮｔｅｒｍ４４２を使用し、１７９３および１７９４と名付けられた２つのＣｉｚ１特異的ポリクローナル抗血清（Ａｂｃａｍ）を生成した。１７９３は、本明細書中に記載される実験において慣用的に使用されている。その特異性を、抗体Ｖを用いた相反免疫沈降およびウエスタンブロット分析、内在性エピトープの反応性をブロックするＮｔｅｒｍ４４２の取り込み（抗体緩衝液（ＰＢＳ中１０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．０２％ ＳＤＳ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００）中２５μｇ／ｍｌ）、およびｓｉＲＮＡ媒介性のＣｉｚ１欠乏（１７９３核染色を特異的に低下させる）によって評価した。
【０１５６】
（免疫沈降）
非同時性増殖中の３Ｔ３細胞を、複製抽出物について、ＰＢＳ中で洗浄し、抽出緩衝液（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．８）、５ｍＭ酢酸カリウム、０．５ｍＭ塩化マグネシウム）中ですすぎ、ＥＤＴＡ非含有プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ）で補強し、そして掻きとって回収した。細胞を、０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ１００で溶解し、そして界面活性剤耐性ペレット画分を、抽出緩衝液中０．３Ｍ ＮａＣｌに抽出した。１００μｌの抽出物につき、５μｌの１７９３または２μｌの抗体Ｖを使用し、１時間４℃でインキュベートした。抗原−抗体複合体を、１００μｌのタンパク質Ｇ−セファロース（Ｓｉｇｍａ）で抽出し、ビーズを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．８）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＮＰ４０、１５０ｍＭ ＮａＣｌで５回洗浄した。複合体を、ローディング緩衝液（１００ｍＭ ＤＴＴ、２％ ＳＤＳ、６０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）、０．００１％ブロモフェノールブルー）中で煮沸し、そして６．５％ ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で解析した。
【０１５７】
（免疫蛍光）
細胞を、カバーガラス上で増殖させ、ＰＢＳ中０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００への短い事前曝露を行うかまたは行わずに、４％パラホルムアルデヒド中で固定した。内在性Ｃｉｚ１を、標準的手順に従い、抗体緩衝液中１／２０００に希釈した１７９３血清で検出した。Ｍｃｍ３を、モノクローナル抗体ｓｃ９８５０（１／１０００）で、Ｃｄｃ６をモノクローナルｓｃ９９６４（１／１００）で、そしてＰＣＮＡをモノクローナル抗体ＰＣ１０（１／１００）（全てＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で、検出した。二重染色蛍光共焦点画像の共局在分析を、記載されるように実施した（ＲｕｂｂｉおよびＭｉｌｎｅｒ，２０００；ｖａｎ Ｓｔｅｅｎｓｅｌら，１９９６）。
【０１５８】
（細胞同期性）
マウス３Ｔ３細胞を、以前に記載されるように（Ｃｏｖｅｒｌｅｙら，２００２）、静止状態からの解放によって同期させた。解放の１７時間後（「後期Ｇ１」と呼ぶ）に回収した細胞から調製した核を、本明細書中に記載される全ての無細胞複製実験において使用した。これにより、Ｓ期の核、複製能のある後期Ｇ１の核および非応答性初期Ｇ１／Ｇ０の核を、異なる割合で含む集団を得た。レシピエント、中期Ｇ１ ３Ｔ３抽出物を、１５時間目に調製した（これらは代表的に、約５％のＳ期細胞を含む）。本明細書中に記載される一連の無細胞複製実験は、大量の標準化抽出物を必要とするため、ＨｅＬａ細胞を使用した。何故なら、ＨｅＬａ細胞は、大量に、容易に同期化するからである。Ｓ期ＨｅＬａ抽出物を、２回の連続的チミジン誘導性Ｓ期ブロックから２時間解放された細胞（Ｋｒｕｄｅら，１９９７に記載される）から調製した。
【０１５９】
（無細胞ＤＮＡ複製）
ＤＮＡ複製アッセイを、記載されるように実施した（Ｃｏｖｅｒｌｅｙら，２００２；Ｋｒｕｄｅら，１９９７）。簡潔に言うと、１０μｌの中期Ｇ１期またはＳ期の抽出物（エネルギー再生系、核酸およびビオチン化ｄＵＴＰで補充される）および５×１０４後期Ｇ１期核を、６０分間３７℃でインキュベートした。反応物を、サイクリンＡ−ｃｄｋ２（図１ＢおよびＣ）を含むバキュロウイルス溶解物で補強した。ここで、０．１μｌの溶解物は、１ｎＭ精製キナーゼと同じ特異的活性を有する（Ｃｏｖｅｒｌｅｙら，２００２）。全ての組換えタンパク質を、１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．８）、１ｍＭ ＤＴＴ、５０％グリセロール中で連続希釈し、それにより、１μｌ以下を１０μｌの複製アッセイに添加し、示した濃度を得た。反応を、５０μｌの０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００で停止し、５０μｌの８％パラホルムアルデヒドの添加によって５分間固定した。カバーガラスへ移した後、核をストレプトアビジン−ＦＩＴＣ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で染色し、Ｔｏｔｏ−３−ヨウ化物（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で対比染色した。標識化した核の割合を、１０００×解像度で観察することによって定量し、蛍光焦点または激しい一様な標識を有する全ての核を、ポジティブとして記録した。ヨウ化プロピジウムで対比染色したサンプルのインビトロ複製する核の画像を、６００×解像度での共焦点顕微鏡検査により作製した。核タンパク質の分析のために、開始条件への１５分間の曝露（冷ＰＢＳでの２倍の希釈反応および穏やかな遠心分離による）後、核を再度単離した。
【０１６０】
（データ分析および提示）
開始アッセイにおいて使用する前に、同期したＧ１期の核の各調製物を試験し、既にＳ期にある核の割合を確立する（「％Ｓ」）。これを行うために、核を抽出物中でインキュベートする。この抽出物は、（静止状態からの解放の１５時間後に回収されるＧ１中期細胞からの）ＤＮＡ合成の開始を誘導し得ないが、（インビボで開始される）起点からの伸長ＤＮＡ合成を効率的に支持する。核の伸長画分は、インビトロ開始アッセイ中に、標識されたヌクレオチドを効率的に取り込むが、有益ではない。慣用的には、この画分は、予め確立され、生データから減算される。２０％未満がＳ期である同期した集団を、開始アッセイのために使用する。
【０１６１】
３Ｔ３細胞を、本明細書中で使用されるプロトコールによって静止状態から解放する場合、集団全体のわずか７０％がＳ期に入る（Ｃｏｖｅｒｌｅｙら，２００２）。しかし、インビトロで最も観察された複製は、５０％近くであり；通常、ＥＣｉｚ１とのインキュベーションによって得られる。本明細書中で使用される３Ｔ３核のＧ１集団について、１７％がＳ期であり（％Ｓ）、そしてインビトロでの任意のアッセイにおいて複製される最大数は、５１％（％複製）であった。従って、この集団の３４％が、インビトロでの複製を開始する能力がある（％Ｃ）。従って、図３Ｂ〜Ｆにおける各データ点について、％開始＝（％複製−％Ｓ）／％Ｃ×１００である。
【０１６２】
（ＲＮＡ干渉）
内因性Ｃｉｚ１を、増殖するＮＩＨ３Ｔ３細胞において、インビトロ転写されたｓｉＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ Ｓｉｌｅｎｃｅｒキット）を用いて、マウスＣｉｚ１の４つの領域に対して標的化した。ｓｉＲＮＡを生成するために使用されるオリゴヌクレオチド配列は、以下である：
【０１６３】
【数４】
【０１６４】
Ｃｉｚ１転写物全体にわたって分布する標的配列を、低い二次構造予測およびエキソン内への局在に基づいて選択した。これは、可変的にスプライシングされることが公知であるもの（ｓｉＲＮＡ ９）を除いて、Ｃｉｚ１の全ての公知の形態（配列４、８、１１）で一貫して発現される。ネガティブコントロールは、未処理、擬似処理（ｓｉＲＮＡを含まないトランスフェクション試薬）およびＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ）で処理した細胞であった。Ｃｙ３標識化ｓｉＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ）を使用してトランスフェクション効率を推定し、これが９５％を超えることを見出した。ＲＮＡ干渉実験を、５００μｌの培地（４％ ＦＣＳを補充したｇｌｕｔａｍａｘ含有ＤＭＥＭ）中の１ウェルあたり２×１０４細胞で開始し、２４ウェル様式で実施した。ｓｉＲＮＡを、プレーティングの１２時間後に、送達用のオリゴフェクタミン（ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して添加した。他で述べられない限り、ｓｉＲＮＡは、第１用量の２４時間後に、新しい培地中で送達される第２用量を含む２つの用量として、対で（培地中の総濃度２ｎＭ）使用した。第１曝露の４８時間後に、細胞数、Ｓ期標識化、および免疫染色によって結果を評価した。ノーザンブロットを、単回用量のｓｉＲＮＡで２４時間処理した細胞から単離したＲＮＡ（反応中、５倍までスケールアップした）において行った。ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて調製し、そしてサンプルを、１％アガロースで電気泳動し、ＮｏｒｔｈｅｒｎＭａｘキット試薬（Ａｍｂｉｏｎ）を製造業者の指示書に従って用いて、Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋ナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に転写し、そしてｃＤＮＡプローブと、５０℃で連続的にハイブリダイズさせた。各ハイブリダイゼーションの間に、０．５％ ＳＤＳ溶液を９０℃で使用して膜を剥がし、室温までゆっくりと冷却した。プローブを、Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒｓ ＤＮＡラベリングシステム（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を使用して［３２Ｐ］−ｄＣＴＰ標識し、以下の順序で使用した：ｉ．ＥＣｉｚ１に由来する１．３５ｋｂ Ｘｍａ１−Ｘｈｏ１フラグメント、ｉｉ．ヒトβアクチンｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびｉｉｉ．マウスＧＡＰＤＨ ｃＤＮＡ（ＲＮＷＡＹ研究所）。この膜を、使用したプローブに依存して５５℃〜６５℃で、２×ＳＳＣ、０．２％ ＳＤＳ中で各３０〜６０分間２回洗浄し、その後、０．２×ＳＳＣ、０．２％ ＳＤＳ中で３０分間１回洗浄した。ハイブリダイゼーションシグナルを、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｔｙｐｈｏｏｎ ９４１０可変様式イメージャー、およびＩｍａｇｅ Ｑｕａｎｔ ＴＬソフトウェア（ｖ２００２）を使用して定量した。バンド強度を、任意の単位（カッコ内）で表し、Ｃｉｚ１およびＧＡＰＤＨについての結果を、βアクチンについての結果に対して正規化し、％で表す。
【０１６５】
（Ｓ期標識）
インビボでＤＮＡ合成を行う核の画分を、２０μＭのブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ、Ｓｉｇｍａ）を培養培地に補充することによって、２０分間モニターした。酸処理後、取り込まれたＢｒｄＵを、製造業者の指示書に従ってＦＩＴＣ結合体化抗ＢｒｄＵモノクローナル抗体（Ａｌｅｘｉｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）によって可視化した。核を、Ｈｏｅｓｃｈｔ ３３２５８を用いて対比染色し、そして高（１０００×）解像度下で記録した。
【０１６６】
（緑色蛍光タンパク質タグ化Ｃｉｚ１）
全長マウスＣｉｚ１ ｃＤＮＡを、ＵＫ ＨＧＭＰ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｒｅから入手し（ＭＧＣクローン２７９８８）、配列を完全に検証した。このクローン由来の２．８ｋｂのＳｍａＩ−ＸｂａＩ（平滑末端）全長Ｃｉｚ１フラグメント、およびｐＴｒｉｐ１ＥｘクローンＬ由来の２．３ｋｂのＳｍａＩ−ＸｂａＩ（平滑末端）ＥＣｉｚ１フラグメントを、増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）を用いて、ｐＥＧＦＰ−Ｃ３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＳｍａＩ部位にインフレームで切断した。挿入のないｐＥＧＦＰ−Ｃ３を、コントロールとして使用した。構築物を、製造業者の指示書に従ってＴｒａｎｓＩＴ−２９３（Ｍｉｒｕｓ）を用いてＮＩＨ３Ｔ３細胞内にトランスフェクトするか、またはある細胞期の受精マウス卵の雄性前核内に微量注入した。全長ＥＧＦＰ−Ｃｉｚ１またはＥＧＦＰ−ＥＣｉｚ１でトランスフェクトした増殖中の３Ｔ３細胞を、生細胞蛍光顕微鏡検査によって、トランスフェクション３日後まで分析した。ＤＮＡ合成を、細胞培養培地中にヌクレオチドアナログＢｒｄＵを含めることによって、図面の説明において示されるような種々の時点について、トランスフェクション後最初の２４時間の間にモニターした。上述のように、ＢｒｄＵに曝される間にＤＮＡ合成を行う任意の細胞を、抗ＢｒｄＵモノクローナル抗体で染色し、赤色の核を生成した。
【０１６７】
また、Ｃｉｚ１トランスフェクト細胞を、標準培養培地（ＤＭＥＭ Ｇｌｕｔａｍａｘ ＋ １０％ウシ胎仔血清）中、５０μｇ／ｍｌ Ｇ４１８での選択下で、１ヶ月まで維持し、形態の変化した細胞集団を得た。
【０１６８】
（ＥＳＴ配列分析）
癌細胞における再発性の変化を同定する目的で、ＮＣＢＩユニジーンクラスターＨｓ．２３４７６（ヒトＣｉｚ１）に対する個々の発現配列タグ（ＥＳＴ）マッピングを、Ｇｅｎｅｊｏｃｋｅｙを使用して翻訳し、予測アミノ酸配列を全長Ｃｉｚ１についての予測配列と比較した。品質の低いＤＮＡ配列を反映する誤差（例えば、長い配列決定の終わりに生じる誤差）を除外するために、中断されない配列の末端から８アミノ酸より遠くに位置する変化のみを、この分析に含めた。読み取りの後半における二度目の変化により回復したフレームシフト、および終止コドンが後に続くフレームシフトを、中断されない配列が後に続く場合にのみ含めた。従って、配列誤差の大部分は、この分析から除外される。しかし、残存する多くの点変異（フレームシフトおよび終止を含む）が、配列決定の間に導入された誤差を反映することが予測される。従って、この分析は、点変異が１より多く出現した場合にのみ点変異に重点が与えられる、明らかな傾向を目指す。
【０１６９】
本発明者らは、Ｃｉｚ１ユニジーンクラスターに対してマッピングした５６７配列に関して、ほとんど（全ての小児癌、前立腺癌および肺癌、白血病およびリンパ腫ならびに広範な非疾患組織）を分析した。いくつかはマッピングしなかった。なぜなら、それらは、非常に短い読み取りであるからであり、すなわち翻訳の際に非常に短いアミノ酸配列を生じ、そして本発明者らが検出した少数の読み取りについて、Ｃｉｚ１コーディング配列に対して相同性が全く検出されなかったからである。インビボで使用される読み取り枠の指標を全く有さずに、３つ全てのフレームで相同性の拡大を生じる多重フレームシフトが原因で、少数のＥＳＴを、複数のフレームシフトを分析から除外した。これらは全て、癌誘導物質由来（通常は腺癌）である。
【０１７０】
（Ｃｉｚアイソフォーム発現のＲＴ−ＰＣＲ分析）
推奨される手順に従ってトリゾール（ｔｒｉｚｏｌ）試薬を用いて、ＲＮＡを単離し、ＤＮａｓｅ処理し、そしてランダムヘキサマーおよびｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩを用いて逆転写し、次いで以下のＣｉｚ１特異的プライマーを用いて増幅した：
【０１７１】
【数５】
【０１７２】
（癌細胞株におけるＣｉｚ１タンパク質アイソフォームの分析）
細胞を、１０％ ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中でサブコンフルエントまで増殖させ、ＥＤＴＡを含まないプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ）を補充した冷ｈｅｐｅｓ緩衝化生理食塩水中でリンスし、次いで掻きとって回収し、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００を補充した。界面活性剤不溶性物質（核を含む）を、穏やかな遠心分離によってペレット化して、上清画分（ＳＮ）とペレット画分（Ｐ）とを得た。これらを、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液中で煮沸し、そしてタンパク質を、８％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの電気泳動によって解析した。ニトロセルロースへの転写後、Ｃｉｚ１アイソフォームを、抗Ｃｉｚ１抗体１７９３で検出した。この分析において使用した全ての方法は、他で十分に記載されている。
【０１７３】
【数６】
【０１７４】
【数７】
【０１７５】
【数８】
【０１７６】
【数９】
【図面の簡単な説明】
【０１７７】
【図１】図１は、後期Ｇ１核に対するサイクリンＡ−ｃｄｋ２の効果を図示する。Ａ）抗Ｃｄｃ６抗体Ｖ１は、３Ｔ３全細胞抽出物のウエスタンブロットにおいてマウスＣｄｃ６および第二抗原を検出し、約１００ｋＤａのＭｒを伴って移動する（Ｍｃｍ３タンパク質の移動度に基づいて、これは、これまでに８５ｋＤａ付近であると推定されていたので、この抗原は、ｐ８５と名付けられている−本発明者らは、明確さのために、本明細書中では、同じ名称を維持した）。Ｐ８５は、溶解性画分および不溶性の核画分（インビトロ複製条件下で調製した）の両方に存在する。Ｂ）Ｇ１期抽出物による「複製コンピテントな」後期Ｇ１期核におけるＤＮＡ合成の開始は、組換えサイクリンＡ−ｃｄｋ２で補われる。コントロールの棒グラフは、既にＳ期にある核の割合を示し（陰影なし）、Ｓ期細胞からの抽出物における複製を開始した核の割合を示す（陰影あり）。Ｃ）細胞を含まない複製条件下で１５分後、核を洗浄し、クロマチン画分を再度単離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、Ｍｃｍ２およびＭｃｍ３についてブロッティングした。Ｄ）同一の核を、抗体Ｖ１でブロッティングした。ｐ８５抗原は、開始誘導濃度のサイクリンＡ−ｃｄｋ２に暴露した核においてより多く存在する。抗体Ｖ１を用いて、Ｃｉｚ１として同定されたマウス胚発現ライブラリーからｐ８５に対する遺伝子をクローニングした。
【図２−１】マウスＣｉｚ１改変体のアラインメント。予測された全長Ｃｉｚ１アミノ酸配列（「全長」）は、マウス乳腺腫瘍ｃＤＮＡクローン（ＢＣ０１８４８３）と同一であるが、胚Ｃｉｚ１（「ＥＣｉｚ１」、ＡＪ５７５０５７）および黒色腫由来クローン（ＡＫ０８９９８６）は、二つの別々の内部の配列を欠如している。さらに、ＥＣｉｚ１中の一番目に利用可能なメチオニンは、エキソン３の中間（Ｍｅｔ８４）に存在し、これは、Ｎ末端からポリグルタミンリッチ領域を排除する。黒色腫由来のＡＫ０８９９８６は、全ての他のマウスのクローンおよびヒトのクローンのＣ末端の前の７７コドンを最終部分とするので、不完全であり得る。星印は、Ｄに示される構築物中の部位特異的変異誘発によって変化したアミノ酸を示す。ｓｉＲＮＡによって標的化されるコドンに対応するアミノ酸に、下線を引く。Ｂ）マウスＣｉｚ１は、少なくとも１７エキソンによってコードされる。コードするエキソンは、灰色で示され、選択的に、スプライシングされた領域は、黒色であり、非翻訳領域は、白色である。二つの代替的なエキソン１配列は、いくつかのＣｉｚ１転写物に含まれる（示さず）が、二つの本明細書中で示されるものの上流の代替的な翻訳開始部位は、まだ見出されていない。
【図２−２】マウスＣｉｚ１改変体のアラインメント。予測された全長Ｃｉｚ１アミノ酸配列（「全長」）は、マウス乳腺腫瘍ｃＤＮＡクローン（ＢＣ０１８４８３）と同一であるが、胚Ｃｉｚ１（「ＥＣｉｚ１」、ＡＪ５７５０５７）および黒色腫由来クローン（ＡＫ０８９９８６）は、二つの別々の内部の配列を欠如している。さらに、ＥＣｉｚ１中の一番目に利用可能なメチオニンは、エキソン３の中間（Ｍｅｔ８４）に存在し、これは、Ｎ末端からポリグルタミンリッチ領域を排除する。黒色腫由来のＡＫ０８９９８６は、全ての他のマウスのクローンおよびヒトのクローンのＣ末端の前の７７コドンを最終部分とするので、不完全であり得る。星印は、Ｄに示される構築物中の部位特異的変異誘発によって変化したアミノ酸を示す。ｓｉＲＮＡによって標的化されるコドンに対応するアミノ酸に、下線を引く。Ｃ）ＥＣｉｚ１における配列の特徴および推定ドメイン。予測される核局在化配列（ＮＬＳ）、推定サイクリン依存性キナーゼリン酸化部位、Ｃ２Ｈ２型ジンクフィンガーおよび核マトリックスタンパク質ｍａｔｒｉｎ３（ＮａｋａｙａｓｕおよびＢｅｒｅｚｎｅｙ、１９９１）に対して相同性を有するＣ末端ドメインが示される。ＥＣｉｚ１を有さない配列の位置を、三角形によって示す。Ｄ）ＥＣｉｚ１および由来する短縮変異体および点変異体を、細胞を含まないＤＮＡ複製実験に使用した。かっこの中の数字は、Ａに示すマウスＣｉｚ１の全長形態におけるアミノ酸位置に関連する。星印は、部位特異的変異誘発によって除去された推定リン酸化部位を示唆する。
【図３】図３は、Ｃｉｚ１タンパク質の効果および細胞を含まないＤＮＡ複製実験において誘導されたフラグメントの効果を示し、ＥＣｉｚ１が、哺乳動物のＤＮＡ複製の開始を促進することを示している。Ａ）組換えＥＣｉｚ１は、Ｓ期抽出物のインキュベーションの間の「複製コンピテントな」後期Ｇ１期核におけるＤＮＡ複製の開始を刺激する。ヒストグラムは、異所性のＥＣｉｚ１の存在または非存在下で、ビオチン化ヌクレオチドをインビトロで組み込んだ核の平均の数を、４回の独立した実験から計算した標準偏差を伴って示す（黒色）。核調製がなされた時に既にＳ期にあった１７％の核を作製し、白色に示す。画像は、１ｎＭのＥＣｉｚ１を含むか、または含まないインビトロでの核の複製を示す。全ての核を、ヨウ化プロピジウムで対比染色（赤色）する。Ｂ）組換えＥＣｉｚ１に対する反応は、ｎＭ範囲で、シャープな最適条件を伴って濃度依存性である。この実験およびＢ−Ｉに示される全ての実験において、結果は、複製％ではなく、開始％として表される。これは、インビトロで開始する核の数およびインビトロで開始するのに「コンピテント」である核の数から計算する（方法を参照のこと）。Ｃ）スレオニン１９１／２は、ＥＣｉｚ１ ｃｄｋ部位変異体Ｔ（１９１／２）Ａが、高濃度で、抑制を回避するときのＣｉｚ１ ＤＮＡ複製活性の調節に関与している。Ｄ）Ｃｄｋ部位変異体Ｔ（２９３）Ａは、ＥＣｉｚ１に対して類似したプロフィールで、（しかし、より低濃度で）開始を刺激する。Ｅ）短縮ＥＣｉｚ１（Ｎ末端４４２）は、Ｃ末端配列を欠如するが、インビトロで、ＥＣｉｚ１と類似した程度に、開始を刺激する。Ｆ）Ｃ末端２７４は、このアッセイにおいて、ＤＮＡ複製活性を保持しない。Ｇ）、Ｈ）、Ｉ）Ｎ末端の三分の二のＥＣｉｚ１タンパク質におけるさらなる欠失分析は、エキソン８の３’の短い領域が、インビトロでアッセイする場合のＣｉｚ１の機能に必要であることを示す。
【図４】抗Ｃｉｚ１ポリクローナル抗体の特徴づけおよび１２５ｋＤａのＣｉｚ１に関連するバンドの同定。Ａ）精製した組換えＥＣｉｚ１フラグメントＮ末端４４２、および抗Ｃｄｃ６抗体Ｖ１を使用する組換えＮ末端４４２のウエスタンブロット、および抗Ｃｉｚ１抗体１７９３および１７９４を示すクーマシー染色したＳＤＳポリアクリルアミドゲル。Ｂ）３Ｔ３全細胞抽出物のウエスタンブロット。抗Ｃｉｚ１抗体１７９３によって検出された二つのバンドの内の一つは、抗体Ｖ１によって認識されるｐ８５−Ｃｉｚ１（１００ｋＤａ）と同じ移動度を有していて、もう一方は、１２５ｋＤａの見かけのＭｒを有する。抗Ｃｉｚ１抗体１７９４は、Ｃｉｚ１の１２５ｋＤａの形態（および８０ｋＤａ付近の第二の抗原）のみを認識する。Ｃ）抗体Ｖ１または抗Ｃｉｚ１ １７９３を使用する３Ｔ３核抽出物由来の免疫沈降。両方の抗体ともに、ｐ８５を沈降させ、ｐ８５は、ウエスタンブロットにおける相反（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ）抗体によって認識される。Ｐ１２５は、抗体１７９３によって沈降し、そして、抗体Ｖ１によってより少ない程度に沈降し、そして、これらは、ウエスタンブロットにおいて、１７９３によって認識される。Ｍｃｍ３をコントロールとして示す。
【図５】内生Ｃｉｚ１の免疫蛍光分析。Ｃｉｚ１は、ＤＮＡ複製の部位と重複する核内の中心に存在する。Ａ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １００に暴露する前（未処理）または暴露後（界面活性剤処理）に固定した３Ｔ３細胞における内生Ｃｉｚ１（赤色）を、抗Ｃｉｚ１抗体１７９３を用いて検出した。核を、Ｈｏｅｓｃｈｔ ３３２５８を用いて対比染色する（青色）。Ｃｄｃ６特異的モノクローナル抗体により検出したＣｄｃ６（緑色）を、比較として示す。Ｂ）組換えＣｉｚ１の封入は、抗体１７９３の、界面活性剤処理した核との反応性をブロックする。Ｃ）界面活性剤耐性のＣｉｚ１（赤色）は、周期する集団の全ての核に存在するが、界面活性剤耐性のＰＣＮＡ（緑色）は、Ｓ期の核のみに、存在し続ける。Ｄ）界面活性剤耐性のＣｉｚ１およびＰＣＮＡの高倍率共焦点切片、および同時局在する中心（黄色）を示す併合像である。Ｅ）示した位置（ｉおよびｉｉ）で、Ｄにおける併合像を横断する赤色および緑色の蛍光の折れ線グラフである。Ｆ）Ｄにおける全併合像を横断する赤色と比較した緑色中心に対する相互相関プロット（ＲｕｂｂｉおよびＭｉｌｎｅｒ、２０００；ｖａｎ Ｓｔｅｅｎｓｅｌら、１９９６）、および（挿入図）Ｅｉｉに示されるレベルでの限界（ｔｈｒｅｓｈ−ｈｏｌｄｉｎｇ）蛍光後の印をつけた切片。Ｆへの挿入図における赤い線は、Ｃｉｚ１像を、ＰＣＮＡに対して９０°回転させた場合の相間関係の喪失を示す。棒は、１０μＭである。
【図６−１】ＲＮＡ干渉。Ｃｉｚ１枯渇は、Ｓ期を阻害する。Ａ）４つの部位でＣｉｚ１転写物を標的するｓｉＲＮＡ（図２Ａを参照のこと）を、単一３ｎＭ用量として、周期する３Ｔ３細胞に個々に適用し、細胞数を、示した時間でモニタリングした。ｓｉＲＮＡ ８でトランスフェクトした（赤色の輪郭）または模擬処理した（青色の輪郭）後、１６時間および４０時間における細胞集団の像を、示す。Ｂ）Ｃｉｚ１ ｓｉＲＮＡ（４および８）またはコントロールＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡに暴露した後、４８時間の抗Ｃｉｚ１ １７９３で検出したＣｉｚ１タンパク質（緑色）。
【図６−２】ＲＮＡ干渉。Ｃｉｚ１枯渇は、Ｓ期を阻害する。Ｃ）Ｃｉｚ１ ｓｉＲＮＡ（４および８）またはコントロールＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡに２４時間暴露した細胞におけるＣｉｚ１レベル、ＧＡＰＤＨのレベルおよびβアクチン転写物のレベル。かっこの中の数字は、任意の単位におけるバンドの強度を反映し、そして、Ｃｉｚ１およびＧＡＰＤＨ転写物の全体の減少（βアクチンに対して、標準化した）を、百分率として表す。Ｄ）ＢｒｄＵをＤＮＡ中に取り込んだ細胞の集団（緑色）は、Ｃｉｚ１ ｓｉＲＮＡで処理した後４８時間で、Ｃｉｚ１枯渇細胞において、有意に減少している。ヒストグラムは、４回の独立した実験の平均の結果を示す。Ｅ）界面活性剤耐性のＭｃｍ３を有する核（緑色）の数は、Ｃｉｚ１ ｓｉＲＮＡで処理した集団で、増加する。Ｆ）界面活性剤耐性のＰＣＮＡを有する核（緑色）の集団もまた、これらの条件下で増加する。全ての核は、対比染色され、みせかけの色（赤色）で示される。
【図７】マウス始原生殖細胞および胚幹細胞におけるＣｉｚ１エキソン３／４スプライシング改変体の発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。エキソン３および／または４は、これらの細胞型において、選択的にスプライシングされるが、新生児の心臓においては、スプライシングされない。これらのデータは、新生児の体細胞組織において全長Ｃｉｚ１が優性な形態であるという仮説、ならびに改変体が発生の初期および生殖系列組織に、より高い頻度で生じるという仮説と一致する。
【図８−１】図８ マウス３Ｔ３細胞の一過性トランスフェクション。Ａ．ＧＦＰタグ化したＣｉｚ１構築物を、ＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトするか、またはＢ．雄性前核もしくは１細胞期のマウス受精卵にマイクロインジェクションした。２４時間までに、Ｃｉｚ１およびＥＣｉｚ１は核に局在化し、亜核に斑点状のパターンを形成したが、ＧＦＰ単独では、核および細胞質の両方に存在した。Ｃ．ＥＧＦＰタグ化したＣｉｚ１およびＥＣｉｚ１ならびにＣ末端フラグメント（Ｃ末端２７４に等価）が取り除かれた派生フラグメントの亜核組織を示す、トランスフェクションの２４時間後の生きた３Ｔ３細胞の核の高解像画像。Ｃ末端ドメインが存在しない場合、ＧＦＰ−ＥＣｉｚ１は、トランスフェクションの２４時間後に核内に拡散性に局在化するが、ＧＦＰ−Ｃｉｚ１は凝集して、核内に１つまたは２つの大きな斑点を形成する。Ｄ．細胞が有糸分裂を通過するまでは、Ｃ末端の２７４ドメイン単独は細胞質内である（核局在化配列の欠如および核への受動流入に起因する可能性が高い）が、一旦内側に来ると、核構造体に結合し、そして、染色体と共に凝集する。
【図８−２】図８ マウス３Ｔ３細胞の一過性トランスフェクション。Ｅ．トランスフェクションの最初の１２時間後のＢｒｄＵで標識された集団におけるＧＦＰ−Ｃｉｚ１（緑）、ＢｒｄＵ（赤）および全核（青）の代表的画像を示す。ヒストグラムは、３つの別個の標識窓についての、トランスフェクトされていない（灰色）細胞の数と比較して、ＢｒｄＵを取り込んだ、トランスフェクトされた（緑）細胞の集団を示す。トランスフェクション後０〜２２時間の間は、迅速に回転する細胞が、Ｃｉｚ１もしくはＥＣｉｚ１のいずれかでトランスフェクトされた場合に、ＢｒｄＵ標識した分画の一定の増加を記録した。密な培養で類似の結果が得られ、ここでは、ほとんどの細胞が、細胞周期を出て、静止状態に入っていた。しかし、迅速に回転する細胞が、トランスフェクションの２２時間後にＢｒｄＵに短時間（２０分）パルスで曝露された場合、ＤＮＡ合成に関与する細胞の数は、トランスフェクトしていないコントロールおよびＧＦＰ単独でトランスフェクトした細胞と比較して、Ｃｉｚ１およびＥＣｉｚ１でトランスフェクトした集団において減少した。このことは、２２時間までに、ＤＮＡ合成がＣｉｚ１発現細胞において停止したことを示す。
【図９】図９ トランスフェクトした集団における増殖能力および細胞形態の変更。トランスフェクトした３Ｔ３細胞集団において細胞クラスターが生じる。Ａ．細胞を、ＧＦＰをタグ化したＣｉｚ１もしくはＥＣｉｚ１のＮ末端の３分の２（Ｎ末端４４２）を用いてトランスフェクトし、そして、５０μｇ／ｍｌ Ｇ４１８の選択下で維持した。選択下で３週間の後、細胞凝集物は、内部のＧＦＰ陽性細胞によって可視であった。
【図１０】図１０ 小児癌におけるヒトＣｉｚ１スプライス改変体。公的データベースには７つのヒトＣｉｚ１ ｃＤＮＡが存在するが、１つのみが、正常な成人組織（Ｂ細胞）に由来し、そして、これは全推定エキソンを含む。他の６つは、胚細胞または小児癌に由来する。これらのうちの５つは、エキソン２、３、６および８において（マウスＥＣｚｉ１のように）、そしてまた、エキソン４において（マウスＥＳ細胞、始原生殖細胞および精巣のように）可変性を伴って、選択的にスプライシングされる。６つ目（ＡＦ１５９０２５）は、第１メチオニンを欠き、アミノ酸置換を生じる単一ヌクレオチド多型を含む。推定配列（ＡＢ０３０８３５）からの全ての相違に印を付ける。
【図１１Ａ】図１１ ＥＳＴ配列分析。各マップ上に、Ｃｉｚ１タンパク質の略図が参考として含められ、これらは、選択的にスプライシングされたエキソンの位置（黒）、推定クロマチン相互作用ドメイン（灰色）および予想ジンクフィンガー（黒の縦線）を示す。全てのＥＳＴ配列に、そのＧｅｎｂａｎｋ登録番号を添え、その配列が由来したライブラリーを括弧内に示す。選択的スプライシングの結果、Ｃｉｚ１ ＥＳＴを含まない配列を、黄色で示し、フレームシフトを赤で示し、推定欠失を灰色で示す。アミノ酸置換を生じる単一ヌクレオチド多型を、黒点で示し、これらのいくつかは、本発明者らがＣｉｚ１活性の調節に重要であると示してきたコンセンサスｃｄｋリン酸化部位（青点）に生じる。癌腫細胞株ＭＧＣ１０２における挿入配列の位置を三角で示す。Ａ）小児癌および成人の神経癌に由来する翻訳されたＥＳＴ。
【図１１Ｂ】図１１ ＥＳＴ配列分析。各マップ上に、Ｃｉｚ１タンパク質の略図が参考として含められ、これらは、選択的にスプライシングされたエキソンの位置（黒）、推定クロマチン相互作用ドメイン（灰色）および予想ジンクフィンガー（黒の縦線）を示す。全てのＥＳＴ配列に、そのＧｅｎｂａｎｋ登録番号を添え、その配列が由来したライブラリーを括弧内に示す。選択的スプライシングの結果、Ｃｉｚ１ ＥＳＴを含まない配列を、黄色で示し、フレームシフトを赤で示し、推定欠失を灰色で示す。アミノ酸置換を生じる単一ヌクレオチド多型を、黒点で示し、これらのいくつかは、本発明者らがＣｉｚ１活性の調節に重要であると示してきたコンセンサスｃｄｋリン酸化部位（青点）に生じる。癌腫細胞株ＭＧＣ１０２における挿入配列の位置を三角で示す。Ｂ）種々の非癌性細胞および組織に由来する翻訳されたＥＳＴ。
【図１１Ｃ】図１１ ＥＳＴ配列分析。各マップ上に、Ｃｉｚ１タンパク質の略図が参考として含められ、これらは、選択的にスプライシングされたエキソンの位置（黒）、推定クロマチン相互作用ドメイン（灰色）および予想ジンクフィンガー（黒の縦線）を示す。全てのＥＳＴ配列に、そのＧｅｎｂａｎｋ登録番号を添え、その配列が由来したライブラリーを括弧内に示す。選択的スプライシングの結果、Ｃｉｚ１ ＥＳＴを含まない配列を、黄色で示し、フレームシフトを赤で示し、推定欠失を灰色で示す。アミノ酸置換を生じる単一ヌクレオチド多型を、黒点で示し、これらのいくつかは、本発明者らがＣｉｚ１活性の調節に重要であると示してきたコンセンサスｃｄｋリン酸化部位（青点）に生じる。癌腫細胞株ＭＧＣ１０２における挿入配列の位置を三角で示す。Ｃ）白血病、リンパ腫に由来する翻訳されたＥＳＴ、そして、正常な造血細胞およびリンパ球に由来する翻訳されたＥＳＴ。
【図１１Ｄ】図１１ ＥＳＴ配列分析。各マップ上に、Ｃｉｚ１タンパク質の略図が参考として含められ、これらは、選択的にスプライシングされたエキソンの位置（黒）、推定クロマチン相互作用ドメイン（灰色）および予想ジンクフィンガー（黒の縦線）を示す。全てのＥＳＴ配列に、そのＧｅｎｂａｎｋ登録番号を添え、その配列が由来したライブラリーを括弧内に示す。選択的スプライシングの結果、Ｃｉｚ１ ＥＳＴを含まない配列を、黄色で示し、フレームシフトを赤で示し、推定欠失を灰色で示す。アミノ酸置換を生じる単一ヌクレオチド多型を、黒点で示し、これらのいくつかは、本発明者らがＣｉｚ１活性の調節に重要であると示してきたコンセンサスｃｄｋリン酸化部位（青点）に生じる。癌腫細胞株ＭＧＣ１０２における挿入配列の位置を三角で示す。Ｄ）癌腫に由来する翻訳されたＥＳＴ。
【図１１Ｅ】図１１ ＥＳＴ配列分析。各マップ上に、Ｃｉｚ１タンパク質の略図が参考として含められ、これらは、選択的にスプライシングされたエキソンの位置（黒）、推定クロマチン相互作用ドメイン（灰色）および予想ジンクフィンガー（黒の縦線）を示す。全てのＥＳＴ配列に、そのＧｅｎｂａｎｋ登録番号を添え、その配列が由来したライブラリーを括弧内に示す。選択的スプライシングの結果、Ｃｉｚ１ ＥＳＴを含まない配列を、黄色で示し、フレームシフトを赤で示し、推定欠失を灰色で示す。アミノ酸置換を生じる単一ヌクレオチド多型を、黒点で示し、これらのいくつかは、本発明者らがＣｉｚ１活性の調節に重要であると示してきたコンセンサスｃｄｋリン酸化部位（青点）に生じる。癌腫細胞株ＭＧＣ１０２における挿入配列の位置を三角で示す。Ｅ）ある範囲の他の癌に由来する翻訳されたＥＳＴ。
【図１１Ｆ】図１１ ＥＳＴ配列分析。各マップ上に、Ｃｉｚ１タンパク質の略図が参考として含められ、これらは、選択的にスプライシングされたエキソンの位置（黒）、推定クロマチン相互作用ドメイン（灰色）および予想ジンクフィンガー（黒の縦線）を示す。全てのＥＳＴ配列に、そのＧｅｎｂａｎｋ登録番号を添え、その配列が由来したライブラリーを括弧内に示す。選択的スプライシングの結果、Ｃｉｚ１ ＥＳＴを含まない配列を、黄色で示し、フレームシフトを赤で示し、推定欠失を灰色で示す。アミノ酸置換を生じる単一ヌクレオチド多型を、黒点で示し、これらのいくつかは、本発明者らがＣｉｚ１活性の調節に重要であると示してきたコンセンサスｃｄｋリン酸化部位（青点）に生じる。癌腫細胞株ＭＧＣ１０２における挿入配列の位置を三角で示す。Ｆ）条件つきで導入された配列を示す、ヒトＣｉｚ１における選択的にスプライシングされた領域のまとめ。
【図１２Ａ】図１２ Ｅｗｉｎｇ肉腫ファミリーの腫瘍細胞株（ＥＳＦＴ）および神経芽細胞腫細胞株におけるＣｉｚ１のスプライス改変体の発現。Ａ．６つの別個のＥＳＦＴ細胞株、２つの神経芽細胞腫細胞株およびコントロール細胞株（ＨＥＫ２９３細胞）に由来する総ＲＮＡサンプルを、４つの異なるプライマーセットを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ分析に供した。ＥＳＦＴ細胞株は、以下である：１）Ａ６７３、２）ＲＤＥＳ、３）ＳＫＥＳ１、４）ＳＫＮＭＣ、５）ＴＣ３、６）ＴＴＣ４６６。神経芽細胞腫細胞株は、以下である：１）ＩＭＲ３２、２）ＳＫＮＳＨ。
【図１２Ｂ】図１２ ユーイング肉腫ファミリーの腫瘍細胞株（ＥＳＦＴ）および神経芽細胞腫細胞株におけるＣｉｚ１のスプライス改変体の発現。Ｂ．ＥＳＦＴおよび神経芽細胞腫におけるＣｉｚ１エキソン３／４／５のＰＣＲ生成物の分析。プライマーｈ３およびｈ４の生成物（潜在的に可変のエキソン４および６にまたがる）を、より詳細に分析した。ＰＣＲフラグメントを、標準的な手順によってアガロースゲルから精製し、サブクローニングして、そして、配列決定して、フラグメントのサイズ変化の原因を同定した。７つの細胞株の各々について、１と１１との間の個々のクローンを配列決定し、この結果を表にまとめる。ＥＳＦＴ細胞株由来のＣｉｚ１は、転写物全体の３１％において、エキソン４が欠失し、いくつかのＥＳＦＴ細胞株については、５０％近くがエキソン４を欠失する。ＤＳＳＳＱは、本明細書で試験された２つの神経芽細胞腫細胞株においてより一般に存在しない。
【図１３Ａ】図１３ 正常ヒト線維芽細胞（Ｗｉ３８）および転移性前立腺癌細胞株（ＰＣ３およびＬＮＣＡＰ）におけるＣｉｚ１のアイソフォーム。Ａ．非癌細胞株と比較して、両方の前立腺癌細胞株が、核分画において、過剰の最も大きいｐ１２５ Ｃｉｚ１タンパク質改変体を含む。
【図１３Ｂ】図１３ 正常ヒト線維芽細胞（Ｗｉ３８）および転移性前立腺癌細胞株（ＰＣ３およびＬＮＣＡＰ）におけるＣｉｚ１のアイソフォーム。Ｂ．ＤＮＡ複製の開始の間のタンパク質プロセシングによるｐ１２５改変体からのｐ８５（１００）の生成のためのモデル。
【図１４】図１４は、全長マウスｍＲＮＡ配列を示す。
【図１５】図１５は、全長ヒトｍＲＮＡ配列を示す。
【図１６】図１６は、全長マウスタンパク質配列を示す。
【図１７】図１７は、全長ヒトタンパク質配列を示す。
【図１８】図１８は、ヒトの選択的にスプライシングされたタンパク質配列を示す。示される配列は、スプライシングされたタンパク質配列を含まない。
【図１９】図１９は、ヒトの選択的にスプライシングされたｍＲＮＡ配列を示す。示される配列は、スプライシングされたタンパク質配列を含まない。
【図２０Ａ】図２０Ａは、欠けたエキソン（ｍｉｓｓｉｎｇ ｅｘｏｎ）によってヒトＣｉｚ１タンパク質において作成された独特のジャンクション配列を示す。このジャンクション配列は、本発明の方法によって同定された治療剤のための標的の主要な部位を表す。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、欠けたエキソンによってヒトＣｉｚ１タンパク質において作成された独特のジャンクション配列を示す。このジャンクション配列は、本発明の方法によって同定された治療剤のための標的の主要な部位を表す。
【図２１Ａ】図２１Ａ〜Ｈは、ヒトＣｉｚ１ ｍＲＮＡにおいて作成されたジャンクション配列を示す。
【図２１Ｂ】図２１Ａ〜Ｈは、ヒトＣｉｚ１ ｍＲＮＡにおいて作成されたジャンクション配列を示す。
【図２１Ｃ】図２１Ａ〜Ｈは、ヒトＣｉｚ１ ｍＲＮＡにおいて作成されたジャンクション配列を示す。
【図２１Ｄ】図２１Ａ〜Ｈは、ヒトＣｉｚ１ ｍＲＮＡにおいて作成されたジャンクション配列を示す。
【図２１Ｅ】図２１Ａ〜Ｈは、ヒトＣｉｚ１ ｍＲＮＡにおいて作成されたジャンクション配列を示す。
【図２１Ｆ】図２１Ａ〜Ｈは、ヒトＣｉｚ１ ｍＲＮＡにおいて作成されたジャンクション配列を示す。
【図２１Ｇ】図２１Ａ〜Ｈは、ヒトＣｉｚ１ ｍＲＮＡにおいて作成されたジャンクション配列を示す。
【図２１Ｈ】図２１Ａ〜Ｈは、ヒトＣｉｚ１ ｍＲＮＡにおいて作成されたジャンクション配列を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ複製タンパク質の活性を、癌治療における介入のための標的として調節する因子の同定のためのスクリーニング方法に関する。本発明は、上記活性を調節する因子を包含する。
【０００２】
本発明はまた、増殖性疾患（例えば、癌）の予後判定および診断における、上記ＤＮＡ複製タンパク質およびそのＲＮＡ転写産物の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
（導入）
ＤＮＡ複製の開始は、哺乳動物細胞周期における主要な制御点であり、癌において誤調節される多くの遺伝子産物の作用点である（ＨａｎａｈａｎおよびＷｅｉｎｂｅｒｇ，２０００）。この開始プロセスは、プレ複製複合体タンパク質のアセンブリを伴い、この複合体は、細胞周期のＧ１期の間に、複製起点において、起点認識複合体（ＯＲＣ）、Ｃｄｃ６、Ｃｄｔ１およびＭｃｍタンパク質を含む。この後、第２のタンパク質群の作用が生じる。この作用により、ＤＮＡポリメラーゼおよびその補助因子（ＰＣＮＡを含む）のローディング、およびＳ期への遷移が促進される。この開始プロセスは、サイクリン依存性プロテインキナーゼ２（Ｃｄｋ２）、Ｃｄｃ７−ｄｂｆ４およびＣｄｔ１インヒビターであるゲミニンによって調節される（概説については、ＢｅｌｌおよびＤｕｔｔａ，２００２を参照）。Ｓ期の細胞の核において、複製フォークが、一緒にクラスター形成して、数百個の複製「焦点」すなわち複製工場を形成する（Ｃｏｏｋ、１９９９）。複製因子は、核中の構造フレームワークと連結しているようであるが、この連結を形成する分子の性質および複製フォーク活性におけるこれらの役割は、不明のままである。
【０００４】
真核生物ＤＮＡ複製に関与するタンパク質の同定、およびその細胞周期の間のそれらの活性を調節する基本経路の分析は、ほぼ酵母遺伝学によって駆動されてきた。これらのタンパク質および経路は、一般的には、酵母からヒトまで保存されている。しかし、多岐にわたる発生経路に沿って分化する多細胞生物において、さらなる複雑な層が、明らかにされている。例えば、脊椎動物において、ニューロン分化に関与するいくつかのタンパク質はまた、Ｇ１→Ｓ期遷移を調節する（Ｏｈｎｕｍａら、２００１）。これらは、ｃｄｋインヒビターであるｐ２１ＣＩＰ１／ＷＡＦ１／ＳＤＩ１を含み、これは、増殖停止後の希突起神経膠細胞の分化に関係付けられており（Ｚｅｚｕｌａら、２００１）、そして他の細胞型の最終分化に関係付けられている（Ｐａｒｋｅｒら、１９９５）。
【０００５】
ＤＮＡ複製の開始は、哺乳動物細胞からの単離された核および細胞質ゾル抽出物を用いて、インビトロで再構成され得る（Ｋｒｕｄｅ、２０００；Ｋｒｕｄｅら、１９９７；Ｌａｍａｎら、２００１；Ｓｔｏｅｂｅｒら、１９９８）。さらに、サイクリンＥまたはサイクリンＡのいずれかと複合体形成した組換えＣｄｋ２を使用して、複製複合体のアセンブリおよびＤＮＡ合成の活性化が、独立して再構成され得る（Ｃｏｖｅｒｌｅｙら、２００２）。本発明者らは、サイクリンＡ−ｃｄｋ２によりインビトロで触媒される上記活性化工程を研究し、比較的研究されていないタンパク質であるｐ２１−Ｃｉｐ１相互作用ジンクフィンガータンパク質（Ｃｉｚ１）が、この開始プロセスのこの段階の間に機能することを示した。ヒトＣｉｚ１は、サイクリンＥ−ｐ２１を用いる改変型酵母ツーハイブリッドスクリーニングを使用して、以前に同定された。生化学分析によって、ｐ２１との相互作用が支持された（Ｍｉｔｓｕｉら、１９９９）。転写における潜在的役割が提唱されたが、実証はされておらず、Ｃｉｚ１には、他の機能は割り当てられていない。より最近には、Ｃｉｚ１遺伝子が、インビボ腫瘍形成モデルを使用して、ヒト髄芽細胞腫由来ｃＤＮＡライブラリーから単離された（ＷａｒｄｅｒおよびＫｅｈｅｒｌｙ，２００３）。本発明者らの分析は、Ｃｉｚ１が、ＤＮＡ複製の開始において積極的な役割を果たすことを初めて示す。
【０００６】
クロマチン結合型タンパク質に対する多数の変化が、ＤＮＡ合成が組換えサイクリンＡ−ｃｄｋ２によりインビトロで活性化された場合に生じる。本発明は、ｃｄｃ６関連抗原であるｐ８５が、ＤＮＡ複製の開始と相関し、かつサイクリンＡ−ｃｄｋ２により調節されるという知見に関する。このタンパク質は、マウス胚ライブラリーからクローン化され、マウスＣｉｚ１として同定された。
【０００７】
インビトロ分析によって、Ｃｉｚ１タンパク質が、ＤＮＡ複製の開始を正に調節すること、このタンパク質の活性は、スレオニン１９１／２におけるｃｄｋリン酸化により調節され、これによりこのタンパク質は、開始を制御するｃｄｋ依存性経路に関連付けられることが、示された。胚形態のマウスＣｉｚ１は、推定される体細胞形態と比較して、選択的スプライシングされる。ヒトＣｉｚ１はまた、選択的スプライシングされ、マウスＣｉｚ１と同じエキソンにおいて変動がある。組換え胚形態のＣｉｚ１タンパク質は、哺乳動物のＤＮＡ複製の開始を促進すること、および小児癌は、「胚様」形態のＣｉｚ１を発現することが、見出されている。１つの理論に拘束されることは望まないが、本発明者らは、Ｃｉｚ１のミススプライシングが、発生における不適切な時点で、胚様形態のＣｉｚ１を生成することを提唱する。このことは、不適切に調節されたＤＮＡ複製を促進し、癌細胞系列の形成または進行に寄与する。
【０００８】
遺伝子および／または遺伝子産物を特異的に除去すると主張する多数の技術が、近年開発されている。例えば、標的ｍＲＮＡ分子に結合することによりその分子をブロックまたは不活化するためのアンチセンス核酸分子の使用は、遺伝子産物の生成を阻害するための有効な手段である。
【０００９】
遺伝子機能を特異的に除去するためのかなりより最近の技術は、二本鎖ＲＮＡ（阻害ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）とも呼ばれる）を細胞中に導入することを介し、これは、このＲＮＡｉ分子中に含まれる配列と相補的なｍＲＮＡの破壊をもたらす。このＲＮＡｉ分子は、互いにアニーリングして二本鎖ＲＮＡ分子を形成したＲＮＡの２つの相補鎖（センス鎖およびアンチセンス鎖）を含む。このＲＮＡｉ分子は、代表的には、除去されるべき遺伝子のエキソン配列またはコード配列に由来する。
【００１０】
核酸およびタンパク質は両方とも、その塩基配列またはアミノ酸配列によって規定される、直鎖状配列構造を有し、そしてまた、その直鎖状配列とこれらの分子が位置する環境とにより部分的に決定される３次元構造を有する。従来の治療分子は、標的分子に結合してアゴニスト効果またはアンタゴニスト効果を生じる、低分子（例えば、ペプチド、ポリペプチド、または抗体）である。核酸分子はまた、治療的有用性を有し得る必須の結合特性を因子に提供することに関して、能力を有することが明らかになっている。これらの核酸分子は、代表的には、アプタマーと呼ばれる。アプタマーは、小さく、通常は安定化されている、核酸分子であり、標的分子の結合ドメインを含む。
【００１１】
アプタマーは、少なくとも１つの改変型ヌクレオチド塩基を含み得る。用語「改変型ヌクレオチド塩基」は、共有結合改変型塩基および／または糖を含むヌクレオチドを包含する。例えば、改変型ヌクレオチドは、３’位でヒドロキシル基以外の低分子量有機基に共有結合している糖を有するヌクレオチド、および５’位でリン酸基以外の低分子量有機基に共有結合している糖を有するヌクレオチドを包含する。従って、改変型ヌクレオチドとしてはまた、２’置換糖（例えば、２’−Ｏ−メチルリボ−ス；２’−Ｏ−アルキルリボ−ス；２’−Ｏ−アリルリボ−ス；２’−Ｓ−アルキルリボ−ス；２’−Ｓ−アリルリボ−ス；２’−フルオロリボ−ス；２’−ハロリボ−スまたは２’−アジドリボ−ス）；炭素環式糖アナログ；α−アノマー糖；エピマー糖（例えば、アラビノース、キシロース、もしくはリキソース）、ピラノース糖、フラノース糖、およびセドヘプツロースが挙げられ得る。
【００１２】
改変型ヌクレオチドは、当該分野で公知であり、例えば、アルキル化プリンおよび／またはアルキル化ピリミジン；アシル化プリンおよび／またはアシル化ピリミジン；または他の複素環が挙げられるが、これらは限定として挙げるのではない。これらの種類のピリミジンおよびプリンは、当該分野で公知であり、これには、プソイドイソシトシン；Ｎ４，Ｎ４−エタノシトシン；８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデニン；４−アセチルシトシン；５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル；５−フルオロウラシル；５−ブロモウラシル；５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル；５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル；ジヒドロウラシル；イノシン；Ｎ６−イソペンチルアデニン；１−メチルアデニン；１−メチルプソイドウラシル；１−メチルグアニン；２，２−ジメチルグアニン；２−メチルアデニン；２−メチルグアニン；３−メチルシトシン；５−メチルシトシン；Ｎ６−メチルアデニン；７−メチルグアニン；５−メチルアミノメチルウラシル；５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル；β−Ｄ−マンノシルキューオシン；５−メトキシカルボニルメチルウラシル；５−メトキシウラシル；２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン；ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル；プソイドウラシル；２−チオシトシン；５−メチル−２−チオウラシル；２−チオウラシル；４−チオウラシル；５−メチルウラシル；Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル；ウラシル５−オキシ酢酸；キューオシン；２−チオシトシン；５−プロピルウラシル；５−プロピルシトシン；５−エチルウラシル；５−エチルシトシン；５−ブチルウラシル；５−ペンチルウラシル；５−ペンチルシトシン；および２，６−ジアミノプリン；メチルプソイドウラシル；１−メチルグアニン；１−メチルシトシンが挙げられる。
【００１３】
アプタマーは、当該分野で公知の標準的な固相合成技術または溶液相合成技術を使用して、従来のホスホジエステル連結ヌクレオチドを使用して合成され得る。ヌクレオチド間の結合は、代替的な連結分子を使用し得る。例えば、式Ｐ（Ｏ）Ｓの連結基（チオエート）；式Ｐ（Ｓ）Ｓの連結基（ジチオエート）；式Ｐ（Ｏ）ＮＲ’２の連結基；式Ｐ（Ｏ）Ｒ’の連結基；式Ｐ（Ｏ）ＯＲ６の連結基；式ＣＯの連結基；または式ＣＯＮＲ’２の連結基（ここで、Ｒは、Ｈ（もしくは塩）またはアルキル（１〜１２Ｃ）であり、Ｒ６はアルキル（１〜９Ｃ）である）は、隣接するヌクレオチドに−Ｏ−または−Ｓ−を介して連結される。
【００１４】
遺伝子および／または遺伝子産物を特異的に切断するといわれる他の技術は、タンパク質分子の機能を調節すること、またはタンパク質分子の活性を妨げることに焦点を当てている。タンパク質は、例えば、既存の低分子ライブラリーから取り出される化学インヒビターによって、標的にされ得る。
【００１５】
抗体（好ましくは、モノクローナル抗体）は、例えば、様々なタンパク質アイソフォームに対して、マウスまたはラットにおいて惹起され得る。抗体（免疫グロブリンとしてもまた公知である）は、外来分子（抗原）に対して特異性を有するタンパク質分子である。免疫グロブリン（Ｉｇ）は、２対のポリペプチド鎖、１対の軽（Ｌ）（低分子量）鎖（κまたはλ）、および１対の重（Ｈ）鎖（γ、α、μ、δおよびε）からなり、４つすべてがジスルフィド結合によって一緒に結合している、構造的に関連するタンパク質のクラスである。Ｈ鎖およびＬ鎖の両方が、抗原の結合に寄与し、あるＩｇ分子から別のＩｇ分子に高度に可変性である領域を有する。さらに、Ｈ鎖およびＬ鎖は、非可変性であるかまたは定常である領域を含む。
【００１６】
Ｌ鎖は、２つのドメインからなる。カルボキシ末端ドメインは、所定の型のＬ鎖間で本質的に同一であり、「定常」（Ｃ）領域と称される。アミノ末端ドメインは、あるＬ鎖から別のＬ鎖に変化し、抗体の結合部位に寄与する。その可変性に起因して、「可変」（Ｖ）領域と称される。
【００１７】
Ｉｇ分子のＨ鎖は、いくつかのクラス（α、μ、σ、α、およびγ（これらにはいくつかのサブクラスが存在する））からなる。２つの同一のＨ鎖およびＬ鎖の１以上の単位からなる集合したＩｇ分子は、その分子が保有するＨ鎖からその名前を得る。従って、以下の５つのＩｇアイソタイプが存在する：ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＧ（Ｈ鎖における相違に基づいて４つのサブクラス（すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）を有する）。さらに、抗体構造およびそれらの種々の機能に関する詳細は、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓにおいて見出され得る。
【００１８】
キメラ抗体は、マウス抗体またはラット抗体のＶ領域のすべてがヒト抗体Ｃ領域と結合されている組換え抗体である。ヒト化抗体は、げっ歯類抗体Ｖ領域に由来する相補性決定領域と、ヒト抗体Ｖ領域に由来するフレームワーク領域とが融合している組換えハイブリッド抗体である。ヒト抗体に由来するＣ領域もまた、使用される。相補性決定領域（ＣＤＲ）は、抗体の重鎖および軽鎖の両方のＮ末端ドメイン内の領域であり、この領域に対して、Ｖ領域のバリエーションの大多数が制限される。これらの領域は、抗体分子の表面でループを形成する。これらのループは、抗体と抗原との間の結合面を提供する。
【００１９】
非ヒト動物に由来する抗体は、外来抗体に対する免疫応答およびその循環からの除去を誘発する。キメラ抗体およびヒト化抗体のいずれも、組換えハイブリッド抗体内に減少した量のげっ歯類（すなわち、外来）抗体が存在するので、ヒト被験体に注射された場合に抗原性を減少させるが、ヒト抗体領域は免疫応答を不当に減少させない。このことは、より弱い免疫応答および抗体の除去の減少を生じる。このことは、ヒト疾患の処置において治療用抗体を使用する場合に、明らかに望ましい。ヒト化抗体は、「外来」抗体領域をあまり有さないように設計され、従って、キメラ抗体よりも抗原性が小さいと考えられる。
【００２０】
タンパク質レベルで標的する他の技術としては、タンパク質に特異的に結合するランダムに生成したペプチドの使用、およびタンパク質またはタンパク質改変体に結合し、その機能を改変する任意の他の分子の使用が挙げられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
ＤＮＡ複製プロセスを理解することは、癌治療の分野において最大の関心事である。癌細胞が、化学療法剤に対して耐性になり得、免疫系による検出を回避し得ることが公知である。新しい因子を同定し得るように、癌治療のための標的を同定することに対する必要性が存在し続けている。ＤＮＡ複製プロセスは、癌治療における薬物介入のための第一の標的を示す。ＤＮＡ複製を調節し、癌細胞系統の形成または進行に寄与する遺伝子産物を同定し、それらの機能に影響を及ぼす因子を開発する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
（発明の記述）
本発明の１つの局面に従って、ＤＮＡ複製を調節する因子の同定のための標的としての、Ｃｉｚ１ヌクレオチド配列もしくはＣｉｚ１ポリペプチド配列、またはその任意のフラグメントもしくは改変体の使用が提供される。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、用語「フラグメント」または「改変体」は、Ｃｉｚ１の全長ヌクレオチド配列もしくはアミノ酸配列に由来するか、またはそのスプライス改変体に由来する任意の核酸配列またはアミノ酸配列をいうように使用される。本発明の１つの実施形態において、フラグメントは、Ｃｉｚ１のＤＮＡ複製活性を保持するために、十分な長さであり、かつ／または全長Ｃｉｚ１に対して十分に相同である。代替的実施形態において、不活性なＣｉｚ１フラグメントが使用される。用語「フラグメント」または「改変体」はまた、本明細書中に記載されるＣｉｚ１ ＲＮＡ転写物およびタンパク質アイソフォーム（もしくはその部分）に関する。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、用語「調節する」は、ＤＮＡ複製を、特定の因子の非存在下で通常観察されるレベル以上に増加させるか、またはそのレベル以下に減少させるかのいずれか（すなわち、因子の使用に直接的に関連するかまたは間接的に関連するかのいずれかの、ＤＮＡ複製活性における任意の変化）をいうように使用される。用語「調節する」はまた、ＤＮＡ複製の空間的組織化または時間的組織化の変化への言及を包含する。
【００２５】
本発明の代替的局面に従って、ＤＮＡ複製を調節する因子の同定のためのスクリーニング方法が提供され、ここで、そのスクリーニング方法は、Ｃｉｚ１ヌクレオチド配列もしくはＣｉｚ１ポリペプチド配列、またはその任意のフラグメントもしくは改変体の使用を包含する。
【００２６】
好ましくは、上記スクリーニング方法は、以下：
ａ）図１４、１５、または２１のいずれかに示される核酸配列を含む核酸分子；
ｂ）（ａ）中の核酸配列にハイブリダイズし、かつＣｉｚ１活性またはその改変体の活性を有する核酸分子；
ｃ）遺伝暗号が原因でａ）およびｂ）中の配列、ならびに試験されるべき候補因子に対して縮重している核酸配列を有する核酸分子；
ｄ）Ｃｉｚ１遺伝子座でのゲノム配列に由来する核酸分子、または該ゲノム配列にハイブリダイズする核酸分子
からなる群より選択される核酸分子に対する因子の効果を検出または測定する工程
を包含する。
【００２７】
本発明の１つの実施形態において、上記核酸分子は、上記核酸配列のうちの少なくとも１つの核酸残基の欠失、置換または付加によって改変されている。
【００２８】
あるいは、上記スクリーニング方法は、以下の工程：
（ｉ）以下：
ａ）図１４、１５、または２１のいずれかに示される核酸配列を含む核酸分子；
ｂ）（ａ）の核酸配列にハイブリダイズし、かつＣｉｚ１活性またはその改変体の活性を有する核酸分子；
ｃ）遺伝暗号が原因でａ）およびｂ）中の配列、ならびに試験されるべき候補因子に対して縮重している核酸配列を有する核酸分子；
ｄ）Ｃｉｚ１遺伝子座でのゲノム配列に由来する核酸分子、または該ゲノム配列にハイブリダイズする核酸分子
からなる群より選択される核酸分子によってコードされるポリペプチド分子、またはその活性フラグメントを含む調製物を形成する工程；ならびに
（ｉｉ）該ポリペプチドの活性に対する前記因子の効果を検出または測定する工程
を包含する。
【００２９】
ＤＮＡ複製の検出のためのアッセイは、当該分野で公知である。Ｃｉｚ１に存在するか、またはペプチドフラグメントに由来する活性、およびその活性に対する潜在的治療剤の効果が、インビトロまたはインビボでアッセイされる。
【００３０】
Ｃｉｚ１タンパク質活性についてのインビトロアッセイは、同期化され、単離されたＧ１期の核と、サイクリン依存性キナーゼを補充されたＳ期抽出物またはＧ１期抽出物のいずれかとを含む。Ｃｉｚ１またはＣｉｚ１に由来するペプチドフラグメントを含むことは、これらの条件においてＤＮＡ複製の開始を刺激し、そして視覚的に（インビトロ反応の間に取り込まれた蛍光ヌクレオチドを有する核を記録することによって）かまたは放射性ヌクレオチドの取り込みを測定することによって、モニタリングされ得る。Ｃｉｚ１タンパク質機能を妨害する治療試薬についてのアッセイは、これらのアッセイにおけるＤＮＡ複製の阻害を探索することを含む。Ｃｉｚ１の、核への局在化、クロマチン結合、安定性、改変、およびタンパク質−タンパク質相互作用に対する因子の影響もまた、これらのアッセイにおいてモニタリングされ得る。
【００３１】
インビボアッセイは、Ｃｉｚ１もしくはＣｉｚ１に由来するフラグメントを過剰発現するか、またはＣｉｚ１もしくはＣｉｚ１に由来するフラグメントを過小に発現して、変化された細胞増殖をもたらす細胞モデルおよびマウスモデルの作製を包含する。このトランスジェニック動物の調製は、一般的に、当該分野で公知であり、当業者の技術範囲内である。治療試薬についてのアッセイは、Ｃｉｚ１およびその改変体をＲＮＡレベルで標的することによって、Ｃｉｚ１タンパク質活性に影響を与えるかまたはＣｉｚ１生成を妨害するかのいずれかである薬物の存在下および非存在下での、細胞周期時間、ＤＮＡ複製の開始、および癌の発症の分析を包含する。
【００３２】
本発明の好ましい方法において、前述のハイブリダイゼーション条件は、ストリンジェントである。
【００３３】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション／洗浄の条件は、当該分野で周知である。例えば、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での、６０℃での洗浄後に安定な核酸ハイブリッド。核酸の配列が既知である場合に最適なハイブリダイゼーション条件が計算され得ることは、当該分野で周知である。代表的に、ハイブリダイゼーション条件は、４〜６×ＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥは、１Ｌに溶解された１７５．３ｇのＮａＣｌ、８８．２ｇのＮａＨ２ＰＯ４ Ｈ２Ｏ、および７．４ｇのＥＤＴＡを含有し、そのｐＨは７．４に調整される）；５〜１０×デンハルト溶液（５０×デンハルト溶液は、５ｇのＦｉｃｏｌｌ（Ｔｙｐｅ ４００、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、５ｇのポリビニルピロリドン、および５ｇのウシ血清アルブミンを含有する）；１００μｇ〜１．０ｍｇ／ｍｌの超音波処理されたサケ／ニシンＤＮＡ；０．１〜１．０％ドデシル硫酸ナトリウム；必要に応じて、４０〜６０％脱イオンホルムアミドを用いる。ハイブリダイゼーション温度は、核酸標的配列のＧＣ含量に依存して変動するが、代表的に、４２℃〜６５℃の間である。
【００３４】
本発明の好ましい方法において、前述のポリペプチドは、このポリペプチド配列の少なくとも一アミノ酸残基の欠失、置換または付加によって改変される。
【００３５】
改変型かまたは改変体（すなわち、フラグメントポリペプチド）と参照ポリペプチドとは、任意の組合せで存在し得る一以上の置換、付加、欠失、短縮によってアミノ酸配列が異なり得る。好ましい改変体には、保存的アミノ酸置換によって参照ポリペプチドと異なる改変体がある。このような置換は、所定のアミノ酸を、同様の特徴の別のアミノ酸で置換する置換である。以下の、アミノ酸の非限定的なリストは、保存的置換（類似）とみなされる：ａ）アラニン、セリンおよびスレオニン；ｂ）グルタミン酸およびアスパラギン酸；ｃ）アスパラギンおよびグルタミン；ｄ）アルギニンおよびリジン；ｅ）イソロイシン、ロイシン、メチオニンおよびバリン、ならびにｆ）フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン。好ましいのは、参照ポリペプチド（これから改変体が変化する）と、同じ生物学的機能および活性を保持する改変体である。あるいは、改変体は、変化した生物学的機能を有する改変体（例えば、アンタゴニストとして働く改変体、いわゆる「ドミナントネガティブ」改変体）を包含する。
【００３６】
あるいは、または加えて、非保存的置換は、所望の生物活性を生じ得る（参考として援用される、Ｃａｉｎ ＳＡ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＤＭ，Ｈａｒｒｉｓ Ｖ，Ｍｏｎｋ ＰＮ．Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｌｉｇａｎｄｓ ｆｒｏｍ ａ ｗｈｏｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｒａｎｄｏｍｌｙ ｍｕｔａｔｅｄ Ｃ５ａ ｌｉｂｒａｒｙ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．２００１ Ｍａｒ；１４（３）：１８９−９３を参照このと）。
【００３７】
本発明に従う機能的に等価なポリペプチド配列は、一以上のアミノ酸残基が、保存的アミノ酸残基もしくは非保存的アミノ酸残基で置換された改変体であるか、または一以上のアミノ酸残基が置換基を含有する改変体である。保存的置換は、以下である：脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの間の一つから別のものへの置換；ヒドロキシル（ｈｙｄｒｏｘｌ）残基ＳｅｒとＴｈｒとの交換；酸性残基ＡｓｐとＧｌｕとの交換；アミド残基ＡｓｎとＧｌｎとの間での置換；塩基性残基ＬｙｓとＡｒｇとの間での交換；ならびに芳香族残基ＰｈｅとＴｙｒとの間での置換。
【００３８】
加えて、本発明は、本明細書中で開示されるようなヌクレオチド配列もしくはポリペプチド配列と少なくとも５０％の同一性を有するヌクレオチド配列もしくはポリペプチド配列、またはそのフラグメントおよび機能的に等価なポリペプチドを特徴とする。一実施形態において、このヌクレオチド配列もしくはポリペプチド配列は、本明細書に例示されるヌクレオチド配列およびアミノ酸配列と、少なくとも７５％〜８５％の同一性を有し、より好ましくは少なくとも９０％の同一性を有し、なおより好ましくは少なくとも９５％の同一性を有し、さらにより好ましくは少なくとも９７％の同一性を有し、そして最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する。
【００３９】
本発明の好ましい方法において、前述の核酸分子は、図１６もしくは図１７のＣｉｚ１のアミノ酸配列をコードする核酸配列、または図２０Ａおよび図２０Ｂに記載される改変体を含む、Ｃｉｚ１の任意の改変体をコードする核酸配列を包含する。本発明のさらなる好ましい方法において、前述の核酸分子は、図１６もしくは図１７のＣｉｚ１のアミノ酸配列をコードする核酸配列、または図２０Ａおよび図２０Ｂに記載される改変体を含む、アミノ酸配列Ｃｉｚ１の改変体をコードする核酸配列からなる。
【００４０】
本発明のさらなる好ましい方法において、前述のポリペプチド分子は、図１６もしくは図１７のＣｉｚ１のアミノ酸配列か、または図２０Ａおよび図２０Ｂに記載される改変体を含む、Ｃｉｚ１の改変体を包含する。本発明のさらなる好ましい方法において、前述のポリペプチド分子は、図１６もしくは図１７のＣｉｚ１のアミノ酸配列か、または図２０Ａおよび図２０Ｂに記載される改変体を含む、Ｃｉｚ１の改変体からなる。
【００４１】
本発明のさらなる好ましい方法において、前述のポリペプチドは、細胞（好ましくは哺乳動物細胞）または動物によって発現され、そして前述のスクリーニング方法は、細胞ベースのスクリーニング方法である。
【００４２】
好ましくは、前述の細胞は、Ｃｉｚ１ポリペプチドを天然に発現する。あるいは、前述の細胞は、Ｃｉｚ１ポリペプチド（または、例えば、癌細胞系統に見出されるその改変体分子）をコードする核酸分子によってトランスフェクトされる。
【００４３】
本発明のさらなる局面に従って、本発明に従う方法によって得られる因子が提供される。
【００４４】
好ましくは、前述の因子は、Ｃｉｚ１媒介性ＤＮＡ複製のアンタゴニストである。あるいは、前述の因子は、Ｃｉｚ１媒介性ＤＮＡ複製のアゴニストである。
【００４５】
本発明のさらなる好ましい方法において、前述の因子は、ポリペプチド；ペプチド；アプタマー；化学物質；抗体；核酸；またはポリペプチドプローブもしくはヌクレオチドプローブからなる群より選択される。
【００４６】
好ましくは、この因子は、標的に相補的である配列、または標的への特異的結合を生ずるに十分な相同性のある配列を含み、そして診断目的で核酸またはタンパク質のレベルを検出するために使用され得る。
【００４７】
あるいは、本発明の方法によって同定される因子は、治療剤であり、そして疾患の処置のために使用され得る。
【００４８】
本発明の一実施形態において、この因子は抗体分子であり、そして図１６、図１７または図２０によって表される配列のいずれかに結合する。
【００４９】
好ましくは、前述の抗体は、モノクローナル抗体である。
【００５０】
あるいは、前述の因子は、上記（ｉ）の核酸配列のいずれかによってコードされるｍＲＮＡに結合し、それによってこのｍＲＮＡをブロックするかまたは不活性化する、アンチセンス核酸分子である。
【００５１】
代替的実施形態において、前述の因子は、ＲＮＡｉ分子であり、これは互いにアニーリングして二本鎖ＲＮＡ分子を形成する、二つのＲＮＡ相補鎖（センス鎖およびアンチセンス鎖）を含む。好ましくはこのＲＮＡｉ分子は、Ｃｉｚ１遺伝子のエキソン配列に由来するか、または別の重複遺伝子に由来する。
【００５２】
一実施形態においては、スプライシングされていないｍＲＮＡがＲＮＡｉに標的とされて、スプライシング改変体の生成を阻害する。別の実施形態においては、このスプライシング改変体ｍＲＮＡは、非改変ｍＲＮＡに影響することなく除去される。
【００５３】
本発明の好ましい方法において、上記ペプチドは、オリゴペプチドである。好ましくは、上記オリゴペプチドは、少なくとも１０アミノ酸長である。好ましくは、上記オリゴペプチドは、少なくとも２０アミノ酸長、３０アミノ酸長、４０アミノ酸長、５０アミノ酸長である。
【００５４】
本発明のさらに好ましい方法において、上記ペプチドは、改変型ペプチドである。
【００５５】
改変型アミノ酸としては、例として、４−ヒドロキシプロリン、５−ヒドロキシリジン、Ｎ６−アセチルリジン、Ｎ６−メチルリジン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチルリジン、Ｎ６，Ｎ６，Ｎ６−トリメチルリジン、シクロヘキシアラニン、Ｄ−アミノ酸、オルニチンが挙げられるが、これらに限定されないことが、当業者にとって明らかである。他の改変としては、ハロ（例えば、Ｆ、Ｂｒ、Ｉ）、ヒドロキシもしくはＣ１〜Ｃ４アルコキシから選択される１個、２個もしくは３個の置換基で必要に応じて置換されたＣ２アルキルＲ基、Ｃ３アルキルＲ基もしくはＣ４アルキルＲ基を含むアミノ酸が挙げられる。
【００５６】
あるいは、上記ペプチドは、アセチル化および／またはアミド化によって改変される。
【００５７】
本発明の好ましい方法において、上記ポリペプチドまたはペプチドは、環化によって改変される。環化は、当該分野で公知である（Ｓｃｏｔｔら、Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ（２００１）８：８０１〜８１５；Ｇｅｌｌｅｒｍａｎら、Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ（２００１）５７：２７７〜２９１；Ｄｕｔｔａら、Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ（２０００）８：３９８〜４１２；ＮｇｏｋａおよびＧｒｏｓｓ，Ｊ Ａｍｅｒ Ｓｏｃ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ（１９９９）１０：３６０〜３６３を参照のこと）。
【００５８】
本発明のさらなる局面によると、例えば、Ｃｉｚ１またはその改変体を阻害し、それによって標的とされるべきタンパク質を発現する細胞の標的化を可能にするアンチセンスまたはＲＮＡｉ分子のための、送達手段としてのベクターが提供される。
【００５９】
本発明の一実施形態において、ウイルスベクターが、送達手段として使用される。
【００６０】
好ましくは、上記ベクターは、ヌクレオチド配列を含む発現カセットを含み、このヌクレオチド配列は、
ａ）図１４、図１５、および図２１に示されるＣｉｚ１アミノ酸配列をコードする核酸配列；
ｂ）（ａ）の核酸配列にハイブリダイズする核酸分子；
ｃ）遺伝コードが原因でａ）およびｂ）中の配列ならびに上記配列のうちのいずれかと相補的な任意の配列に対して縮重している核酸配列を有する、核酸分子；
ｄ）Ｃｉｚ１プレｍＲＮＡをコードする核酸配列（すなわち、ゲノム配列）；
からなる群より選択され、上記発現カセットは、プロモーター配列に対して転写的に連結されている。
【００６１】
好ましくは、上記発現カセットを含むベクターは、真核生物遺伝子発現のために適合される。代表的には、上記適合としては、例として、細胞特異的発現／組織特異的発現を媒介する転写制御配列（プロモーター配列）の提供が挙げられるが、これに限定されない。これらのプロモーター配列は、細胞特異的／組織特異的であっても、誘導性であっても、構成的であってもよい。；
プロモーターエレメントはまた、代表的には、所謂ＴＡＴＡボックス、および転写開始部位を選択するように機能するＲＮＡポリメラーゼ開始選択配列を含む。これらの配列はまた、特に、ＲＮＡポリメラーゼによる転写開始選択を促進するように機能するポリペプチドに結合する。
【００６２】
適合としてはまた、選択マーカーおよび自己複製配列の提供が挙げられ、これらは両方とも、真核生物細胞または原核生物宿主のいずれかにおける上記ベクターの維持を促進する。自律的に維持されるベクターは、エピソーム性ベクターと呼ばれる。ベクターによりコードされる遺伝子の発現を促進するさらなる適合としては、転写終結配列の提供が挙げられる。
【００６３】
これらの適合は、当該分野で周知である。発現ベクターの構築および組換えＤＮＡ技術一般に関する、かなりの量の刊行文献が存在する。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ，ＮＹおよびその中の参考文献；Ｍａｒｓｔｏｎ，Ｆ（１９８７）ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｖｏｌ ＩＩＩ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ ＵＫ；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＦＭ Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）を参照されたい。
【００６４】
本発明によると、増殖性傷害の同定のための診断方法が、提供され、この方法は、そのゲノム配列またはタンパク質配列における、Ｃｉｚ１遺伝子、Ｃｉｚ１スプライス改変体および変異の存在または発現を検出する工程を包含する。
【００６５】
好ましくは、上記診断方法は、以下の工程：
（ｉ）試験されるべき被験体から単離したサンプルを、Ｃｉｚ１活性を有するポリペプチドまたはＣｉｚ１活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子に特異的に結合する因子と、接触させる工程；ならびに
（ｉｉ）上記サンプル中の上記ポリペプチドまたは核酸に対する上記因子の結合を検出または測定する工程；
（ｉｉｉ）逆転写ＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲを使用して、Ｃｉｚ１アイソフォーム発現をモニターし、発現レベルを測定する工程；
（ｉｖ）上記分子の変化した立体構造特性に基づいて、核酸変異またはアミノ酸変異の存在を測定する工程；
のうちの１つ以上を包含する。
【００６６】
一次実施形態において、本発明の診断方法は、インビボで実行される。
【００６７】
代替的実施形態において、本発明の診断方法は、エキソビボまたはインビトロで実行される。
【００６８】
好ましくは、上記診断方法は、サンプル中のＣｉｚ１ ＲＮＡまたはＣｉｚ１タンパク質改変体の定量的測定を提供する。
【００６９】
本発明の一実施形態において、Ｃｉｚ１ ＲＮＡもしくはＣｉｚ１タンパク質またはそれらの改変体を調節する因子を、薬剤として使用することを提供する。
【００７０】
好ましくは、上記薬剤は、本発明のスクリーニング方法によって同定される因子を、薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤、もしくは希釈剤と、組み合わせてかまたは会合して含む。
【００７１】
好ましくは、上記薬剤は、経口投与用もしくは局所投与用、または注射による投与用である。本発明の代替的実施形態において、上記薬剤は、エアロゾルとして投与される。
【００７２】
本発明のさらなる好ましい実施形態において、増殖性疾患の処置において使用するための医薬の製造のための、本発明に従う因子の使用が提供される。好ましくは、上記増殖性疾患は、癌である。
【００７３】
好ましくは、上記癌は、小児癌であり、網膜芽細胞腫、神経芽細胞腫、バーキットリンパ腫、髄芽細胞腫、ユーイング肉腫家族腫瘍（ＥＳＦＴ）からなる群より選択される。
【００７４】
代替的実施形態において、上記癌は、癌腫、腺癌、リンパ腫、または白血病である。
【００７５】
代替的実施形態において、上記疾患は、肝臓癌、肺癌、もしくは皮膚癌、または肝臓転移、肺転移、もしくは皮膚転移である。
【００７６】
本発明のさらなる局面によると、増殖性疾患を処置するための方法が、提供され、この方法は、動物（好ましくはヒト）に、本発明に従う方法によって入手可能な因子を投与する工程を包含する。
【００７７】
本発明の代替的局面によると、細胞分裂または細胞増殖を遅くするための医薬の製造のための、本発明に従う因子の使用が提供される。
【００７８】
本発明はまた、合理的な薬物設計におけるＣｉｚ１アミノ酸配列およびタンパク質構造の使用、ならびにＣｉｚ１に特異的に結合する薬剤に関する化学ライブラリーのスクリーニングに対するＣｉｚ１ヌクレオチドおよびそのアミノ酸配列またはそれらの改変体の使用を包含する。
【００７９】
本発明はまた、本発明の方法によって同定された診断薬、予後薬または治療薬を備えるキットを包含する。
【００８０】
本発明の代替的実施形態において、アレイに基づく配列決定チップが、変化したＣｉｚ１の検出のために使用される。
【００８１】
（発明の詳細な説明）
ここで、本発明の実施形態は、以下の図を参照して単なる例として記載される。
【００８２】
（Ｃｉｚ１の同定）
本発明者らは、その挙動がインビトロでのＤＮＡ複製の開始に関連する未知の抗原を同定し、そして研究するための組換えヒトＣｄｃ６に対して惹起させたポリクローナル抗体（抗体Ｖ１）を発見した（Ｃｏｖｅｒｌｅｙら、２０００；Ｓｔｏｅｂｅｒら、１９９８；Ｗｉｌｌｉａｍｓら、１９９８）。この抗原は、１００ｋＤａの見かけの分子量を有し（ｐ８５と呼ばれる）、３Ｔ３細胞からの抽出物において容易に検出可能である（図１Ａ）。
【００８３】
ＤＮＡ合成は、「複製能のある」後期Ｇ１期の核、Ｇ１抽出物および組換え型サイクリンＡ−ｃｄｋ２を用いて、細胞を含まない複製実験において達成され得る。これらの条件下で、核は、活性なプロテインキナーゼの濃度に厳密に依存する様式で、新生ＤＮＡへと標識されたヌクレオチドを組み込む（図１Ｂ）。最適な濃度の上および下では、ＤＮＡ複製の開始は起こらない。しかし、開始と逆に相関する他の事象が生じる（Ｃｏｖｅｒｌｅｙら、２００２）。ここで、本発明者らは、ＤＮＡ合成の活性化（図１Ｂ）およびＭｃｍ２リン酸化（移動度の増加を生じる、図１Ｃ）を用いて、細胞を含まない複製実験における組換え型サイクリンＡ−ｃｄｋ２の効果を較正し、ＤＮＡ合成の活性化とのｐ８５の挙動を相関させる。
【００８４】
開始を誘導する濃度のサイクリンＡ−ｃｄｋ２を含有する反応から再び単離したＧ１核において、ｐ８５抗原は、より低いかまたはより高い濃度のキナーゼに曝露された核と比較して、より優勢である（図１Ｄ）。このことは、ｐ８５が、ＤＮＡ合成の活性化と同時に起こる様式で、サイクリンＡ−ｃｄｋ２によりある程度のレベルにおいて調節されることを示唆する。細胞を含まない開始プロセスにおけるこの段階と密接に関連する他の抗原はなく、したがって、本発明者らは、マウスｐ８５についての遺伝子をクローニングするために、抗体Ｖ１を用いた。
【００８５】
１１日目のマウス胚由来のｃＤＮＡ発現ライブラリーに適用される場合、抗体Ｖ１は、複数回のスクリーニングを生き残った２つのクローンを見出した（方法を参照のこと）。１つは、マウスＣｄｃ６をコードし、一方で、他のものは、ヒトＣｉｚ１（Ｍｉｔｓｕｉら、１９９９）のマウスホモログの７１６個のアミノ酸をコードした。全長ヒトＣｉｚ１および全長マウスＣｉｚ１は、アミノ酸レベルで全体で約７０％の相同性を有し、最も大きい（８０％を超える）相同性は、Ｎ末端領域およびＣ末端領域にある。Ｃｉｚ１は、ラットおよびフグにおいて存在するホモログとして、脊椎動物の間で保存されるが、高度な相同性または類似のドメイン構造を有するタンパク質は、下等真核生物において同定され得ず、Ｃｉｚ１が脊椎動物の発生において特殊化された役割を果たすように進化した可能性を生じる。
【００８６】
ヒトＣｉｚ１に関する以前の刊行物（Ｍｉｔｓｕｉら、１９９９）は、細胞周期タンパク質ｐ２１−ＣＩＰ１との相互作用を実証し、ＤＮＡ複製因子ではなく転写因子としての提唱された役割の調査をもたらした。本特許出願の優先日より後に刊行された第二の論文（ＷａｒｄｅｒおよびＫｅｈｅｒｌｙ、２００３）は、Ｃｉｚ１の腫瘍形成における役割を示唆するが、ＤＮＡ複製における役割を実証せず、そしてＣｉｚ１スプライシング改変体発現の重要性を認識しない。
【００８７】
（複数のＣｉｚ１のアイソフォーム）
予測されたマウスＣｉｚ１のオープンリーディングフレームおよびマウス乳腫瘤ライブラリー（ＢＣ０１８４８３）由来のｃＤＮＡは、本発明者らの胚クローン（ＡＪ５７５０５７）（本明細書中以下でＥＣｉｚ１と称される（図２Ａ））には存在しない３つの領域を含む。ＥＣｉｚ１におけるこれらの３つの可変領域は、エキソン２／３、６および８の選択的スプライシングの結果であるようである（図２Ｂ）。マウス黒色腫クローンＡＫ０８９９８６は、ＥＣｉｚ１と同じ３つの領域のうちの２つを欠き（図２Ａ）、一方で、第三のものは、Ｎ末端ポリグルタミン伸長部（これもまた、ヒト骨髄芽球腫由来のクローンに存在しない）をコードする。エキソン３／４由来の第四の配列ブロックは、マウスＥＳ細胞由来のＣｉｚ１転写産物、およびマウス原始生殖細胞におけるエキソン４に存在しない（図７）。ヒトＣｉｚ１はまた、ＲＮＡレベルで選択的にスプライシングされて、マウスＣｉｚ１と同じ４つの配列ブロックの組み合わせを排除する転写産物を与える（以下を参照のこと）。実際に、マウスＣｉｚ１ ｃＤＮＡにおける全ての公知のバリエーションは、ヒトにおける密接な類似物を有し、これらのいくつかは、アミノ酸レベルで同一である。このことは、異なるＣｉｚ１アイソフォームが、機能的重要性を有することを示唆する。第五の可変領域（マウスにおいてはまだ観察されていない）は、主として癌腫由来のヒトＣｉｚ１転写産物において選択的にスプライシングされる。
【００８８】
これらのデータは、Ｃｉｚ１のより短い形態（選択的にスプライシングされるエキソンを欠くもの）が、発生の初期において、および生殖系列を生じる細胞系統において、最も普及していることを示唆する。図７に示される分析において、完全に発達した新生児心臓由来のＣｉｚ１のみが、選択的スプライシングを示さず、一方で、すべての胚細胞型が、選択的にスプライシングされた形態を含む。さらに、公共のデータベース（ヒトまたはマウス）における完全なＣｉｚ１ ｃＤＮＡのみが、非胚細胞型由来であり、そして胚供給源由来のもののみが、選択的にスプライシングされる。従って、Ｃｉｚ１スプライス改変体発現は、まだ完全には分化していない細胞型において優先的に起こるようである。
【００８９】
顕著なことに、小児の癌由来のＣｉｚ１ ｃＤＮＡもまた、選択的にスプライシングされる（以下を参照のこと）。このことにより、本発明者らは、適切なＣｉｚ１アイソフォームの、発達における正しい時点での発現の失敗が、不適切に調節されたＣｉｚ１活性をもたらすことを仮定する。このことは、計画されていない増殖および細胞形質転換に寄与し得る。
【００９０】
（ＥＣｉｚ１は、インビトロでのＤＮＡ複製を刺激する）
Ｓ期の細胞からの細胞質ゾル抽出物へと曝露すると、Ｇ１後期の核は、ＤＮＡ複製を開始し、そして新生ＤＮＡを合成し始める（Ｋｒｕｄｅら、１９９７）。本発明者らは、この無細胞アッセイを使用して、ＥＣｉｚ１および誘導される組換えフラグメントの、ＤＮＡ合成に対する効果を試験した（図３）。全長ＥＣｉｚ１タンパク質は、インビトロで複製される核の数を、３０％（＋／−０．９％）から４６％（＋／−５．５％）へと一貫して増加させた。このことは、Ｃｉｚ１が、Ｓ期抽出物中の開始の制限物であることを示唆する（図３Ａ）。２つのみの他のクラスのタンパク質（サイクリン依存性キナーゼ、Ｃｏｖｅｒｌｅｙら、２００２；Ｋｒｕｄｅら、１９９７；Ｌａｍａｎら、２００１、およびＣｄｃ６タンパク質、Ｃｏｖｅｒｌｅｙら、２００２；Ｓｔｏｅｂｅｒら、１９９８）が、無細胞開始を刺激することが以前に見出された。従って、ＥＣｉｚ１は、複製プロセスに関与することがまだ公知ではなかったタンパク質で、この特性を有する最初のタンパク質である。組換えＥＣｉｚ１の、無細胞開始に対するポジティブな効果は、内因性Ｃｉｚ１が、哺乳動物細胞中でのＤＮＡ複製においてポジティブな役割を果たすことを立証する。
【００９１】
無細胞開始の刺激は、濃度依存性であり、Ｓ期抽出物において、約１ｎＭ ＥＣｉｚ１にピーク活性を有する（図３Ｂ）。このことは、他の組換えタンパク質を用いた、以前の無細胞分析（Ｃｏｖｅｒｌｅｙら、２００２；Ｋｒｕｄｅら、１９９７）を反映し、この以前の分析において、開始の刺激は、代表的に、ピークになり、次いで、低下して、高濃度での刺激されていないレベルまで戻る。ＥＣｉｚ１に関して、高濃度にて活性が低下することの理由は、未だに明らかではない。しかし、変異誘発研究（以下を参照のこと）は、この制限機構が、より高次のタンパク質複合体の組成における一般的な不均衡に起因するよりむしろ、活性かつ特異的であるようであることを示唆する。
【００９２】
（ＥＣｉｚ１のダウンレギュレーションは、スレオニン１９１／１９２に関連する）
Ｃｉｚ１は、インビボにおいて、リンタンパク質であるようである。なぜなら、Ｃｉｚ１は、多数の推定リン酸化部位を含み、そして３Ｔ３細胞抽出物がλホスファターゼで処理された場合に、変化した移動度を示すからである（図示せず）。マウスＣｉｚ１は、２つのＲＸＬサイクリン結合モチーフおよび５つの推定ｃｄｋリン酸化部位を含み、これらは、全ての公知の改変体に存在する。これらのうちの４つは、ＥＣｉｚ１の、インビトロ複製活性を含むＮ末端フラグメントに存在し（以下を参照のこと）、そして１つは、エキソン６が短いＤＳＳＳＱ配列モチーフを排除するように選択的にスプライシングされた部位に隣接する（図２Ａ、Ｃ）。このモチーフは、マウスとヒトとの両方において、１００％同一であり、そして選択的にスプライシングされるので、本発明者らは、条件的封入が、Ｃｉｚ１活性を調節するように働き得ると判断し、このタンパク質のこの領域を、潜在的に重要であると同定した。従って、本発明者らは、遺伝アプローチを無細胞複製アッセイと組み合わせることによって、４残基上流であり、そしてまた、マウスおよびヒトにおいて保存されるｃｄｋ部位に焦点を合わせることを選択した。ＥＣｉｚ１から開始して、１９１位および１９２位の２つのスレオニンを、２つのアラニンに変化させて、Ｅｃｉｚ１Ｔ（１９１／２）Ａ（図２Ｄ）を生成した。インビトロにおいて、ＤＮＡ複製活性について試験される場合、ＥＣｉｚ１Ｔ（１９１／２）Ａは、ＥＣｉｚ１と同程度に、後期Ｇ１核の開始を刺激した（図３Ｃ）。しかし、ＥＣｉｚ１とは異なり、開始の刺激は、少なくとも３桁に及ぶ広範な濃度にわたって維持された。従って、過剰のＥＣｉｚ１の活性を制限する機構は、無細胞環境において存在し、そして作動する。別の構築物において、２９３位のスレオニンもまた、アラニンに変化させて、ＥＣｉｚ１Ｔ（２９３）Ａを生成したが（図２Ｄ）、この変化は、インビトロにおいてアッセイされたＥＣｉｚ１活性に対してほとんど影響を有さなかった（図３Ｄ）。
【００９３】
これらの結果は、ＥＣｉｚ１活性のダウンレギュレーションが、スレオニン１９１／２に関連し、そしておそらく、サイクリン依存性キナーゼによって媒介されるこの部位におけるリン酸化によって引き起こされることを実証する。このことは、Ｃｉｚ１活性を、全ての主要な細胞周期事象（ＤＮＡ複製の開始を含む）を制御するｃｄｋ依存性経路に結び付ける。
【００９４】
ほとんどの複製前複合タンパク質および多くの複製フォークタンパク質は、しばしば、サイクリン依存性キナーゼによって、インビボでリン酸化される（ＢｅｌｌおよびＤｕｔｔａ、２００２；Ｆｕｊｉｔａ，１９９９）。本発明者らのデータは、ｐ８５−Ｃｉｚ１抗原の核蓄積が、サイクリンＡ−ｃｄｋ２によって（直接的にかまたは間接的に）調節されること、を示唆し、そしてこれらのデータは、スレオニン１９１／１９２における特異的なコンセンサスｃｄｋリン酸化部位が、Ｃｉｚ１活性の制御に関与することを示す。この部位がリン酸化不可能にされる場合、Ｃｉｚ１活性は、無細胞アッセイにおける広範な濃度にわたって維持される。従って、Ｃｉｚ１活性は、通常、この部位における改変によってダウンレギュレートされる。他の保存されたｃｄｋリン酸化部位の機能、およびＣｉｚ１の選択的にスプライシングされたＮ末端部分におけるＲＸＬサイクリン結合モチーフの条件的封入の効果は、まだ決定されていない。従って、Ｃｉｚ１活性とｃｄｋ依存性リン酸化との間の、ここで明らかになった単純なネガティブな関係が、一部始終ではないようである。しかし、本発明者らの分析は、これまでは、Ｃｉｚ１を、全ての主要な細胞周期移行を制御するｃｄｋ依存性経路に結び付け、従って、Ｃｉｚ１がＤＮＡ複製の開始に関与するという、本発明者らの主要な結論と一致する。
【００９５】
（インビトロ複製活性は、Ｎ末端に存在する）
Ｃｉｚ１は、タンパク質を核内に繋留し得る、いくつかのＣ末端特徴を保有する。ｍａｔｒｉｎ３ドメインは、核マトリックスとの相互作用を示唆し、そして３つのジンクフィンガーは、核酸との相互作用を示唆する。実際に、最近の証拠は、ヒトＣｉｚ１が、弱い配列特異的様式で、ＤＮＡを結合することを示唆する（ＷａｒｄｅｒおよびＫｅｈｅｒｌｅｙ，２００３）。Ｃ末端ドメインがＥＣｉｚ１複製活性のために重要であるか否かを決定するために、本発明者らは、このタンパク質を２つのフラグメントに分割した（図２Ｄ）。Ｎｔｅｒｍ４４２（これは、ＮＬＳ、２つの保存されたｃｄｋ部位、１つのジンクフィンガー、および可変スプライシングが観察された全ての公知の部位を含む）は、ＥＣｉｚ１と同程度に、そして同じ濃度で、開始を刺激する（図３Ｅ）。対照的に、Ｃ末端部分（Ｃｔｅｒｍ２７４）は、残余の複製活性を含まない（図３Ｆ）。従って、ｍａｔｒｉｎ３ドメイン、サイクリン依存性キナーゼリン酸化部位のうちの１つおよびジンクフィンガーのうちの２つは、インビトロにおいてアッセイされる場合、ＥＣｉｚ１のＤＮＡ複製活性のために必要とはされない。しかし、この分析は、ＥＣｉｚ１の活性を、トランスで、誤局在化の結果が検出されにくい条件下で測定することが注目されるべきである。従って、ｍａｔｒｉｎ３ドメインおよびジンクフィンガーが、インビボで作用して、Ｃｉｚ１活性を、核における特定の部位に指向し、これによって、Ｃｉｚ１活性の範囲を制限することは、可能なままである。
【００９６】
（内因性Ｃｉｚ１）
抗体Ｖ１は、Ｃｄｃ６ならびにｐ８５−Ｃｉｚ１を認識（図１Ａ）し、それゆえ、内因性Ｃｉｚ１の細胞内局在を可視化することを目的とする免疫蛍光実験には適切ではない。それゆえ、本発明者らは、組換えＥＣｉｚ１フラグメントＮｔｅｒｍ４４２に対する２つの新たなウサギポリクローナル抗血清（抗Ｃｉｚ１ １７９３および抗Ｃｉｚ１ １７９４と命名された）を作製した。予想されたように、精製されたＮｔｅｒｍ４４２は、ウエスタンブロットにおいて抗Ｃｉｚ１抗体１７９３および抗Ｃｉｚ１抗体１７９４によって認識されるが、これはまた、抗体Ｖ１によっても認識され（図４Ａ）、このことは、ｐ８５（ｐ１００）が実際にＣｉｚ１であるという結論を支持する。
【００９７】
増殖中の３Ｔ３細胞由来のタンパク質抽出物に適用した場合、抗Ｃｉｚ１ １７９３は、１２５ｋＤａおよび１００ｋＤａのＭｒで２つの抗原を認識し（図４Ｂ）、この相対比率は、調製物毎に変化した。１００ｋＤａバンドは、抗体Ｖ１によって認識されるサイクリン−Ａ応答性抗原と同時に移動し（図１および図４Ｂ）、このことは、両方の抗体が、インビボで同じタンパク質を認識することを示唆する。本発明者らは、抗体Ｖ１および１７９３によって認識されるｐ１００−Ｃｉｚ１バンドが同じタンパク質であることを、免疫沈降によって確認した（図４Ｃ）。抗体Ｖ１は、１７９３によるウエスタンブロットにおいて認識された１００ｋＤａバンドを沈降し、その逆もそうであった。さらに、同じ実験において、１７９３、およびより低い程度で抗体Ｖ１は、１７９３によってウエスタンブロットにおいて認識された１２５ｋＤａ抗原を沈降させた。まとめて考えると、本発明者らの観察は、１００ｋＤａバンドが実際にＣｉｚ１（以前はｐ８５として公知）であることを示し、これらは、Ｃｉｚ１タンパク質が、細胞周期を進行している細胞において少なくとも２つの形態で存在することを示唆する。
【００９８】
上記の免疫沈降の証拠に加えて、いくつかの他の観察によって、ｐ１２５もまた、Ｃｉｚ１の１形態であるとの結論が導かれた。第１に、本発明者らの両方の抗Ｃｉｚ１抗体（１７９３および１７９４）は、共通してこのバンドを有する。両方の抗体は、免疫蛍光実験において、同じパターンの核染色を生じ、そしてこれは、Ｃｉｚ１ ｓｉＲＮＡで処理された細胞において破壊される（以下を参照のこと）。第２に、ｐ１００およびｐ１２５の相対比は、調製物毎に変動し、それゆえ、この相対比は、タンパク質分解切断の結果であり得る。第３に、本発明者らの結果は、抗ヒトＣｉｚ１モノクローナル抗体が、ＨＥＫ２９３細胞において１２０ｋＤａおよび９５ｋＤａの見かけのＭｒを有する２つの抗体を検出したＭｉｔｓｕｉら（１９９９）の結果と顕著に類似する。彼らは、１２０ｋＤａ形態のヒトＣｉｚ１タンパク質がプロセシングされて９５ｋＤａ形態を生成することを提唱した。そして本発明者らの結果は、この提唱と一致する。
【００９９】
マウス細胞およびヒト細胞において抗体１７９３によって認識された１２５ｋＤａバンドは、非形質転換ヒト細胞（Ｗｉ３８−以下を参照のこと）およびマウス細胞（ＮＩＨ３Ｔ３−示さず）由来の物質の高分解能電気泳動の間に３本のＣｉｚ１関連バンドに分離した。これは、Ｃｉｚ１タンパク質の翻訳後修飾またはＣｉｚ１転写産物の選択的スプライシングの結果であり得る。
【０１００】
（Ｃｉｚ１の細胞内分布）
抗Ｃｉｚ１ １７９３を用いて、３Ｔ３細胞（図５Ａ）およびＨｅＬａ細胞（示さず）中のＣｉｚ１タンパク質（ｐ８５およびｐ１２５）の細胞内分布を可視化した。両方の細胞型において、１７９３は、核特異的抗原と反応し、そしてこれは、組換えＮｔｅｒｍ４４２フラグメントを含めることによってブロックされた（図５Ｂ）。比較のために示したＣｄｃ６（図５Ａ）とは異なり、Ｃｉｚ１は、この細胞周期進行中の集団の全ての３Ｔ３細胞において明確に検出可能である。それゆえ、量のわずかな変動またはアイソフォームは、この方法によっては検出されないが、Ｃｉｚ１は、中期を通して核中に存在する。界面活性剤での処理後、全体的核Ｃｉｚ１染色は、全ての核において減少した。このことは、Ｃｉｚ１が、可溶性画分として、および不溶性核構造体に結合しての両方で核に存在することを示唆する。
【０１０１】
可溶性タンパク質を洗浄した場合、この不溶性の固定化抗原は、高倍率では、斑点状の核内斑点パターンに分離する（図５Ｃ、Ｄ）。Ｃｉｚ１斑点は、ＤＮＡ合成がＳ期で生じる部位である、複製「点」または複製「工場」と類似のサイズ範囲および分布を示す。Ｃｉｚ１が複製工場の部位と同時に生じるか否かをみるために、本発明者らは、Ｃｉｚ１斑点の位置を、ＰＣＮＡ（Ｓ期の細胞における複製複合体の一成分である）の位置と比較した（図５Ｃ）。共焦点切片では、ＰＣＮＡ点は、Ｃｉｚ１点よりも少ないが、これらは、ほぼ全てＣｉｚ１と同時に生じる（図５Ｄ、図５Ｅ、図５Ｆ）。これは特に、中間サイズ範囲の点については顕著である。合わせた画像では、ＰＣＮＡ点の位置とＣｉｚ１点の位置との間の重複は、黄色のスポットを生じ、一方、残りのＰＣＮＡと同時に生じないＣｉｚ１点は、赤色である。緑色（ＰＣＮＡ単独）の点は、実質的に存在せず、このことは、Ｃｉｚ１が、ＤＮＡ複製工場が形成された全ての部位に存在することを示唆する。
【０１０２】
Ｃｉｚ１はまた、ＰＣＮＡを含まない部位に存在し（図５Ｄ）、そしてＰＣＮＡとは異なり、Ｃｉｚ１点は、中期を通して持続する（図５Ａ）。これらの観察の１つの解釈は、Ｃｉｚ１が、Ｓ期にＰＣＮＡ含有複製工場が形成され得る核内の位置を標識するが、これらの部位の全てが同時に使用されるわけではないということである。異なるＣｉｚ１点が、Ｓ期の種々の時点においてＤＮＡ複製の活性部位になるか否か、または他の核の活性もまたＣｉｚ１が結合した部位において生じるか否かは決定されていないままである。実際、この時期において、Ｃｉｚ１の１００ｋＤａ形態および１２５ｋＤａの改変体が異なる活性を有し、そしてこれらが異なる機能を有する核部位に存在するということもまた依然として可能性が残る。
【０１０３】
（Ｃｉｚ１は、細胞増殖に必須である）
これまでに、本発明者らは、ｐ８５（ｐ１００）−Ｃｉｚ１の挙動が無細胞アッセイにおけるＤＮＡ複製の開始と相関すること、組換えＣｉｚ１が開始頻度を刺激すること、およびＣｉｚ１がＤＮＡ複製機構と同じ核部位に存在することを示した。しかし、これらのデータは、Ｃｉｚ１が増殖中の細胞において必須の機能を有することを示さない。これを試験するために、本発明者らは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を用いて、ＮＩＨ３Ｔ３細胞中のＣｉｚ１転写産物レベルを選択的に減少させた。Ｃｉｚ１内の４つの標的配列を選択し（図２を参照のこと）そして短鎖干渉（ｓｉ）ＲＮＡ分子をインビトロで生成した。細胞に適用した場合、４つ全てのＣｉｚ１ ｓｉＲＮＡは、増殖を制限し（図６Ａ）、そして４８時間後にＣｉｚ１タンパク質レベルの明らかな減少を引き起こした（図６Ｂ）。増殖に対するＣｉｚ１低減の効果は、トランスフェクションの２３時間後と４０時間後との間で明らかになる。このことは、Ｃｉｚ１ ＲＮＡなしでの最初の細胞周期が比較的影響を受けないことを示唆する。４０時間までに、コントロール細胞およびＣｉｚ１ ｓｉＲＮＡ処理細胞は有意に異なり、Ｃｉｚ１低減集団においてはさらなる増殖がなかった。Ｃｉｚ１低減の特異性を確認するために、増殖が有意に阻害される前に、転写産物レベルを２４時間においてモニタリングした（図６Ｃ）。この時点で、Ｃｉｚ１転写産物は、ＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡで処理したコントロール細胞において４２％のレベルまで低下した。これらの実験は、Ｃｉｚ１が細胞増殖に必要とされ、そしてＤＮＡ複製の主な機能と一致することを示す。
【０１０４】
これをさらに試験するために、細胞を、ｓｉＲＮＡ処理の４８時間後にＢｒｄＵでパルス標識して、ＤＮＡ合成に関与した細胞の割合を決定した（図６Ｄ）。Ｃｉｚ１レベルが低下した場合、ＢｒｄＵ標識の割合もまた減少した。このことは、ＤＮＡ合成が、これらの条件下で阻害される示唆する。さらに、Ｃｉｚ１低減集団における、ＢｒｄＵを取り込まない細胞（この集団の約１５％）は、より弱く標識された。それゆえ、いくつかのＣｉｚ１ ｓｉＲＮＡ処理細胞では、おそらく不完全な低減に起因して、Ｓ期は、完全に阻害されるよりも遅延する。
【０１０５】
Ｃｉｚ１ ｓｉＲＮＡによるＤＮＡ合成の阻害は、核機能の全般的破壊の二次的結果であり得る。それゆえ、本発明者らは、そのレベルが細胞周期依存性様式で調節される他の複製タンパク質をある範囲でより詳細に調べて、低減細胞がランダムに停止するのかまたは特定の点で集積するのかをみた。
【０１０６】
真核生物ＤＮＡ複製の開始の間、複製Ｍｃｍ複合体タンパク質は、Ｇ１後期にＣｄｃ６依存性様式で複製起源に集合する。その後、ＤＮＡポリメラーゼおよびそれらの補助因子（ＰＣＮＡを含む）は、クロマチンに結合するようになり、そして起源が活性化される。これは、Ｃｄｃ６の大多数の核輸送およびタンパク質分解、そしてＤＮＡ合成が進行するのに従う、クロマチンからのＭｃｍ複合体の段階的移動と関連する（ＢｅｌｌおよびＤｕｔｔａ，２００２）。Ｃｉｚ１の作用点を同定するために、本発明者らは、免疫蛍光を用いて、Ｍｃｍ３およびＰＣＮＡをモニタリングした。Ｃｉｚ１低減細胞（図６Ｅ、Ｆ）では、両方のタンパク質が、界面活性剤耐性核構造体に結合した核において検出可能であった。それゆえ、これらの因子は、Ｃｉｚ１に直接は結合しないようであり、その集合はＣｉｚ１依存性でもないようである。実際、４つの独立した実験では、界面活性剤耐性クロマチンに結合したＭｃｍ３を有する細胞の平均数は、事実上、３１％（＋／−６％）から５１％（＋／−５％）へと増加した（図６Ｅ）。増加したＭｃｍ３は、Ｃｉｚ１依存性工程が、複製前の複合体の集合後に（しかし、Ｓ期の完了の前に）生じることを示す。同じ細胞集団では、ＰＣＮＡ陽性の割合もまた、３２％（＋／−５％）から４９％（＋／−６％）へと増加し（図６Ｆ）、ＰＣＮＡの集合後のＣｉｚ１作用点を狭めた。従って、Ｃｉｚ１は、Ｓ期を通した進行を阻害するように作用することができないながら、Ｍｃｍ３およびＰＣＮＡを適所に残して、開始プロセスにおける後期段階の間のＤＮＡ複製を促進するように作用する可能性が最も高い。
【０１０７】
まとめると、本発明者らの無細胞の調査、および細胞を基礎にした調査は、Ｃｉｚ１の主要な機能について一貫した画像を描く。それらは、Ｃｉｚ１がＤＮＡ複製工場の新規な成分であることを示唆し、そしてそれらは、Ｃｉｚ１が哺乳動物細胞周期において正の役割を演じ、ＤＮＡ複製の開始を促進するように作用することを示す。
【０１０８】
３つの本発明者らの調査のラインは、Ｃｉｚ１が、複製前複合体形成後、開始プロセス中の後期段階の間に必要であることを示唆している。第１に、ｐ８５（ｐ１００）−Ｃｉｚ１抗原は、ＤＮＡ合成を活性化するサイクリンＡ−ｃｄｋ２濃度に曝された核中で蓄積し、Ｃｉｚ１が初期の複製複合体アセンブリステップの間（Ｃｏｖｅｒｌｅｙら、２００２）よりむしろ、このステップの間に機能することを示す。第２に、後期Ｇ１核を用いる機能的研究は、組換えＥＣｉｚ１が、標識されたヌクレオチドをインビトロで取り込む核の数を増加することを示す。従って、Ｃｉｚ１は、ＤＮＡ合成を開始するように釣り合わされている核を、活性にＤＮＡを合成する核に転換するステップで活性でなければならない。第３に、ＲＮＡ干渉研究は、Ｍｃｍ複合体形成後、およびＰＣＮＡがＤＮＡ上にアセンブルされるようになった後であるが、これらタンパク質が置換される前の、Ｃｉｚ１依存性ステップを示す。これらの別個の調査のラインは、Ｃｉｚ１を開始の後期段階に置くＣｉｚ１の作用の点について顕著に類似する結論に至る。
【０１０９】
（治療戦略としての抗Ｃｉｚ１ ｓｉＲＮＡ）
本発明者らの分析は、Ｃｉｚ１が細胞増殖に必須であり、しかも、Ｃｉｚ１を標的にすることが、増殖を抑制するための実行可能な戦略であることを示す。種々の癌で本発明者らが観察するＣｉｚ１の選択的スプライス形態（以下を参照のこと）は、Ｃｉｚ１が、集団内の細胞のサブセット中の増殖を抑制するために選択的な方法で標的され得ることを意味している。
【０１１０】
例として、これは、小細胞肺癌腫細胞中で、Ｃ末端配列ＧＴＴＧＡＧＧＡＧＧＡＡＣＴＣＴＧＣＡＡＧＣＡＧを欠いているときにＣｉｚ１転写物中で生成される接続配列にｓｉＲＮＡを標的することによるか、または特異的な化学的インヒビターを選択するために対応するＶＥＥＥＬＣＫＱ配列を欠くＣｉｚ１タンパク質を用いることにより、なされ得る。
【０１１１】
従って、本発明はまた、診断マーカー、予後指標または治療標的としての選択的スプライス配列が存在しないときにＣｉｚ１転写物およびＣｉｚ１タンパク質中に生成される接続配列の使用を提供する。
【０１１２】
（胚形態Ｃｉｚ１は核に局在化する）
潜在的に可変であるエキソン全域にわたるＲＴ−ＰＣＲ分析は、３Ｔ３細胞が全長Ｃｉｚ１を優勢に発現することを示唆し、そこで、内因性Ｃｉｚ１に関する本発明者らの免疫局在化研究（図５）は、いくつかの配列ブロックを欠き、そしておそらくそれ故、そのタンパク質を局在化するために用いられる情報を欠く、ＥＣｉｚ１の挙動を必ずしも反映しない。ＥＣｉｚ１と全長Ｃｉｚ１との局在化を直接比較するために、増大されたＧＦＰタグ構築物を、３Ｔ３細胞中にトランスフェクトし（図８Ａ）、そしてマウスの前核中にマイクロインジェクトした（図８Ｂ）。すべての場合において、タグ化Ｃｉｚ１およびタグ化ＥＣｉｚ１は専ら核にあり、その一方、ＧＦＰ単独を発現するコントロール構築物は、核および細胞質中に存在した。ＧＦＰ−Ｃｉｚ１およびＧＦＰ−Ｃｉｚ１は両者とも、生存細胞中で、免疫蛍光によって固定された細胞中で観察された複製中心に類似する副核中心として見えた。従って、ＥＣｉｚ１から存在しない３つの配列ブロックは、Ｃｉｚ１の核局在化に寄与するように見えなかった。
【０１１３】
トランスフェクション後３日間に亘り、ＧＦＰ−Ｃｉｚ１およびＧＦＰ−ＥＣｉｚ１でトクランスフェクトした細胞中では細胞分裂は観察されなかった。これらのデータは、機能的Ｃｉｚ１の過剰発現が、（調節経路をインタクトで有する細胞において）細胞周期に対して阻害効果を有することを示唆する。
【０１１４】
（融合）
Ｃｉｚ１のＣ末端の１／３が除去されたＧＦＰタグ化構築物が３Ｔ３細胞中にトランスフェクトされたとき、ＥＣｉｚ１と全長Ｃｉｚ１との間の差異が観察された（図８Ｃ）。４８時間までに、ＦＬ Ｃｉｚ１ Ｎ末端（４４２相当）は、大きな核内斑点（ｂｌｏｂ）へと融合し、これは、３日目までまたそれより遅く、ＥＣｉｚ１ Ｎ末端４４２トランスフェクション集団中でのみ見えるようになった。この時点より前は、ＥＣｉｚ１ Ｎ末端４４２は、核に特異的であるが拡散したパターンとして局在化した。従って、融合する能力は、Ｃｉｚ１とＥＣｉｚ１との間で定量可能に異なり、そしてそれ故、３つの選択的にスプライスされたエキソンのうちの１つ（２／３、６または８）によって影響される。
【０１１５】
全長Ｃｉｚ１およびＥＣｉｚ１でトランスフェクトされた細胞のように、Ｃ末端の１／３が除去された構築物でトランスフェクトされた細胞は、３日間のモニタリング期間の間に増えるようには見えなかった。
【０１１６】
（Ｃ末端ドメインはＣｉｚ１を核構造に係留する）
上記で説明したように、Ｃｉｚ１とＥＣｉｚ１ Ｎ末端との間の差異は、Ｃ末端ドメインもまた存在するときマスクされる（図８Ａ）。さらに、Ｃ末端フラグメント単独は、ＧＦＰタグをクロマチンに向け、Ｃｉｚ１またはＥＣｉｚ１のようなスポット状（中心）ではない不規則パターンを形成するが、これは、有糸分裂の間に染色体に付着したままである（図８Ｄ）。これは、Ｃ末端ドメインが、核中の構造的フレームワーク上にＣｉｚ１を固定化することに関与していることを示唆する。注目すべきことに、Ｃ末端フラグメントで一時的にトランスフェクトした細胞は、分裂し続け、緑の蛍光の段階的な希釈を生じた。
【０１１７】
（異所性Ｃｉｚ１は、Ｓ期への未成熟エントリーを促進する）
本発明者らは、トランスフェクション後、最初の日の間に生じる事象を調べた。トランスフェクトされた細胞（緑）中のＳ期の画分を、非トランスフェクション細胞中のＳ期の画分と、ＢｒｄＵで種々の間隔で標識することにより比較した。０〜２２時間（図８Ｅ）、０〜１２時間および０〜７時間（示さず）を含む長い標識時間体の間、一致して、非トランスフェクション細胞に比較して、より多くのＣｉｚ１トランスフェクション細胞およびＥＣｉｚ１トランスフェクション細胞がＤＮＡ合成に従事した。これは、Ｃｉｚ１およびＥＣｉｚ１が、Ｇ１→Ｓ遷移に対して正の影響を有し、Ｓ期へのスケジュールされないエントリーを促進することを示唆する。類似の結果が、トランスフェクション前に密にプレートされた３Ｔ３細胞集団で得られた。これは、正常細胞周期の一部としてＳ期に従事した非トランスフェクション集団にある画分を最小にするためになされた。これらの条件の下、トランスフェクション集団と非トランスフェクション集団との間の差異は最大になり、ＤＮＡ複製の開始に対する異所性Ｃｉｚ１の効果を明瞭に示した。
【０１１８】
逆に、細胞が、トランスフェクション後２２時間（図８Ｅ）、または１０時間または１２時間（示さず）で投与された短パルスの間に、ＢｒｄＵで標識されたとき、この標識された画分は、一貫して、Ｃｉｚ１トランスフェクション集団およびＥＣｉｚ１トランスフェクション集団で減少した。これは、異所性Ｃｉｚ１またはＥＣｉｚ１によって誘導されるＳ期は異常であり、遅延または廃されたＤＮＡ合成が、ＢｒｄＵへの曝露の短時間帯の間に細胞を標識するには十分でないことを示唆する。
【０１１９】
従って、異所性Ｃｉｚ１および異所性ＥＣｉｚ１は、培養細胞中のＳ期に対し２つの効果を有している。それらは、ＤＮＡ複製を促進するが、これは、遅延または廃されたＤＮＡを生じる。
【０１２０】
（改変された増殖能力をもつクローン）
本発明者らはまた、３週間の期間に亘り３Ｔ３細胞のトランスフェクション集団をモニターした。ＧＦＰ−Ｎ末端４４２または非選択的スプライス等価物でトランスフェクションされ、かつＧ４１８での選択下で維持された細胞では、数百の細胞を含む大きな増殖巣が観察された（図９Ａ）。これらのクラスターは多数のＧＦＰ発現細胞を含み、このことは、（複製活性が存在する）ＥＣｉｚ１のＮ末端部分の過剰発現が致死的ではないことを示し、そしてこの過剰発現が、非トランスフェクション細胞と比較して、接触阻害の損失および単層形成の不能を含む、改変された増殖表現型に至ることを示唆している。このＣｉｚ１依存性の改変された挙動は、腫瘍形成に寄与し得る。推定のクロマチン相互作用ドメインを欠く、マウスＣｉｚ１の類似する短縮型バージョンは、マウス黒色腫から先に単離された（図２）。
【０１２１】
（ヒトＣｉｚ１および癌）
（公開データベース中のＣｉｚ１ ｃＤＮＡ）
上記で述べたように、ヒトＣｉｚ１は、ＲＮＡレベルで選択的にスプライスされ、マウス胚Ｃｉｚ１と同じ３つのエキソンを欠く転写物を生じる。７つのヒトＣｉｚ１ ｃＤＮＡが、Ｍｉｔｓｕｉら（１９９９）、ＷａｒｄｅｒおよびＫｅｈｅｒｌｙ（２００３）および大規模ゲノム分析プロジェクト（ＮＩＨ−ＭＧＣプロジェクト、ＮＥＤＯヒトｃＤＮＡ配列決定プロジェクト）によって提出された公開データベースに記録されている（図１０）。１つだけが正常成体組織由来であり、そしてこれは、すべての推定されたエキソンを含む（ＡＢ０３０８３５）。残りは、胚細胞由来である（ＡＫ０２７２８７）か、または特に４つの異なるタイプの小児癌由来である（髄芽細胞腫、ＡＦ１５９０２５、ＡＦ０２３４１６１、網膜芽細胞腫、ＡＫ０２３９７８、神経芽細胞腫、ＢＣ００４１１９およびバーキットリンパ腫、ＢＣ０２１１６３）。この胚形態および癌由来形態は、本発明者らの胚マウスクローンと同じ３つの領域から、およびエキソン４に対応する第４の領域からの、配列ブロックを欠く。従って、この制限されたデータは、選択的スプライス形態が、発生の初期により優勢であることを示唆する。この相関関係は、先には科学的文献には記載されていない。小児癌における選択的にスプライスされたＣｉｚ１の存在は、Ｃｉｚ１誤スプライシングが不適切な細胞増殖に関連し得る可能性を挙げる。
【０１２２】
例えば、可変エキソンの１つは、マウスＥＣｉｚ１およびヒト髄芽細胞腫に存在しない、短い保存されたＤＳＳＳＱ配列をコードする。これは、本発明者らがＥＣｉｚ１機能の調節に関係することを示したコンセンサスｃｄｋリン酸化部位に直接隣接する。ＤＳＳＳＱ配列の条件付き包含は、Ｃｉｚ１をプロテインキナーゼのＡＴＭ／ＡＴＲファミリーによる調節の対象にし得、このプロテインキナーゼは、ＳＱ配列においてタンパク質をリン酸化し、それによって、ＤＮＡ損傷に応答してＣｉｚ１開始機能を抑制する。
【０１２３】
（発現される配列タグの分析）
小児癌における選択的にスプライシングされたＣｉｚ１の存在は、Ｃｉｚ１ ＥＳＴの詳細な分析を促進した。ＮＣＢＩ ユニジーンクラスターＨｓ．２３４７６（ヒトＣｉｚ１）に含まれる５６７個の発現配列タグ（ＥＳＴ）が存在する。これらは、幅広い範囲の正常および疾患の組織および細胞株に由来する。配列は、翻訳されて、ヒトＣｉｚ１の予測全長アミノ酸配列に対してマッピングされた。アミノ酸置換、欠失、フレームシフトおよび翻訳の早期の終了を生じる配列の変化が記録された。
【０１２４】
選択的にスプライシングされたＣｉｚ１改変体はまた、ＥＳＴデータセットに見出され、本明細書中に記録される。ヒトおよびマウスのＣｉｚ１において選択的にスプライシングされることが以前に報告された４つの配列ブロック（図２）は、ＥＳＴ配列、およびエキソン１４由来の配列ＶＥＥＥＬＣＫＱを欠く以前に検出されなかった改変体において観察された。これらの繰り返される改変体配列ブロックの全てが、適切なスプライシング部位によって制限される。６番目の可変配列ブロックは、以下：
【０１２５】
【数１】
【０１２６】
の包含によって引き起こされる、１つの癌由来のライブラリーにおいて同定された。
【０１２７】
ＥＳＴは、成体起源、幼児起源または胚起源の新生物細胞間で生じる最初の区分を用いて、それらが由来する細胞型に従って、グループ分けされる。胚起源または成体起源の正常組織由来のＥＳＴが、比較のために含まれる。ＥＳＴ由来のＣｉｚ１タンパク質マップを図１１Ａ〜Ｅに示し、選択的にスプライシングされたエキソンを図１１Ｆにまとめる。
【０１２８】
ヒトＣｉｚ１のＮ末端における３つの配列ブロックは、髄芽細胞種および神経芽細胞種由来の転写物に存在せず（図１１Ａ）、そして他の癌由来のＣｉｚ１転写物からの転写物にはときどき存在しない。本発明者らはまた、第３の小児癌、ユーイング肉腫（以下を参照のこと）において類似の選択的スプライシングを見出した。小児癌に関係する選択的にスプライシングされた配列は、エキソン２／３（少なくとも２つのバージョン）、エキソン４およびエキソン６に由来する。
【０１２９】
Ｑリッチ縮重リピートの１つ以上のコピーが存在しないエキソン８改変体は、（胚起源または成体神経起源の）正常細胞由来の転写物および種々の癌由来の転写物において注目された。この領域における選択的スプライシングは、不適切な活性を有するＣｉｚ１を生成し得、従って、エキソン８改変体発現、またはこの領域のスプライシングに影響する点変異の存在は、癌の診断マーカーまたは予後マーカーとして有用であり得る。エキソン８の選択的にスプライシングされた縮重リピートを、以下に詳細に記載し、図１１Ｆにまとめる。
【０１３０】
ヒトＣｉｚ１タンパク質のＣ末端の半分において、２つの配列ブロックは、種々にスプライシングされる。これらのうちの１つは、５つの肺癌および肺カルチノイドライブラリーのうちの３つ由来の転写物、および３つの他の癌腫由来の転写物から失われている（しかし、他の細胞型由来の転写物からは非常にまれである）。
【０１３１】
第２の改変体配列ブロックは、類表皮癌腫ライブラリー（ＭＧＣ１０２）由来の転写物における外部配列の不適切な包含に起因する。
【０１３２】
Ｃｉｚ１タンパク質において形成されるこれらの配列および連結配列、これらのセグメントが排除される場合または含まれる場合のＣｉｚ１転写物は、幅広い範囲の異なる癌において細胞増殖の選択的阻害のための潜在的標的である。残りの非改変体配列は、細胞増殖の非選択的阻害のための潜在的標的である。
【０１３３】
スプライシング改変体に加えて、他の非典型的Ｃｉｚ１転写物は、好ましくは、いくつかの癌において存在することが見出された。横紋筋肉腫において、Ｃｉｚ１は、早期に終了し、Ｃ末端核結合ドメインを欠く予測タンパク質を導く。これは、不適切なＤＮＡ複製を導き得、従って、この型の癌における治療標的またはマーカーであり得る。
【０１３４】
いくつかの転写物は、推定サイクリン依存性キナーゼ（ｃｄｋ）リン酸化部位にアミノ酸置換を導く点変異を含む。頸癌ライブラリーＭＧＣ１２において、これは、２回生じる。本発明者らは、２つのｃｄｋリン酸化部位がＣｉｚ１活性の制限に関係することを示し（図３ＣおよびＤ）、これは、癌細胞における増殖の調節解除におけるこれらの変異を関係させる。これらのうちの１つが、上記の癌由来の変異と同じである（図１１Ｅ）。Ｃｉｚ１に点変異を有する癌由来の転写物はまた、ＲＮＡ干渉によって標的化され得るか、または診断指標または予後指標としての価値を有し得る。
【０１３５】
（小児癌におけるＣｉｚ１改変体発現の調査）
Ｃｉｚ１改変体発現を、公知のＣｉｚ１可変性の３つの領域にわたるプライマーセットを用いるＲＴＰＣＲを使用して、６つのユーイング肉腫ファミリー腫瘍細胞株（ＥＳＦＴ）および２つの神経芽細胞株において調査した（図１２Ａ）。この分析は、Ｃｉｚ１改変体発現のパターンが、神経芽細胞と比較して、非形質転換株と比較して、ＥＳＦＴ細胞において異なるが、同じ腫瘍由来の細胞株のセットにおいて明らかに非常に類似していることを示した。従って、Ｃｉｚ１改変体発現は、これらの癌についての診断の可能性または予後の可能性を有し得る。同じ腫瘍型由来の株のセット内のより小さな改変は、予後的価値を有し得る。
【０１３６】
増幅された転写物をサブクローニングし、そして配列決定することによって、本発明者らは、試験された６つ全てのＥＳＦＴ株がＣｉｚ１のエキソン４マイナス形態を発現することを見出した。Ｃｉｚ１が細胞増殖に必須である（以下を参照のこと）ので、これは、ＥＳＦＴ細胞の選択的制限のための可能性のある経路を提供する。試験された２つの神経芽細胞株由来の転写物は、まれにエキソン４を欠くが、しばしば、エキソン６によってコードされるＤＳＳＳＱモチーフの配列を欠く（図１２Ｂ）。
【０１３７】
この実験の分析は、小児癌が、エキソン４、６およびおそらくエキソン２／３の可変の包含を伴って、Ｃｉｚ１の形態を発現することを確認する。
【０１３８】
エキソン８およびＶＥＥＥＬＣＫＱコード配列を含む配列の１つの形態を含む配列の２つのバージョンを、ＥＳＦＴ、神経芽細胞腫およびコントロールにおいて検出し、これは、これらの領域が、これらの小児癌においてＣｉｚ１の調節解除に寄与しないことを示唆する。
【０１３９】
全ての場合において、Ｃｉｚ１ ＲＴ−ＰＣＲ産物は、コントロール（Ｗｉ３８、ＨＥＫ２９３、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、および初代ヒト骨芽細胞）と比較して、癌細胞株由来のＲＮＡサンプルを用いて実行した反応において最も多量に存在した。これは、腫瘍におけるＣｉｚ１改変体の増加した発現と一致する。
【０１４０】
（前立腺癌細胞株のＣｉｚ１タンパク質発現の分析）
正常非形質転換ヒト肺線維芽細胞（およびマウスＮＩＨ３Ｔ３細胞）は、ウエスタンブロットにおいて抗Ｃｉｚ１ポリクローナル抗体１７９３によって検出されるＣｉｚ１の２つの主要な形態を発現する（図１３Ａ）。より大きな（約１２５ｋＤａ）バンドは、Ｗｉ３８細胞において等しい割合で存在する３つの異なるバンドに分解するが、前立腺癌細胞株ＰＣ３およびＬＮＣＡＰ（およびＥＳＦＴ細胞株−示さない）において非常に一様でない割合で存在する。本発明者らは、これらのタンパク質アイソフォームが、可変にスプライシングされるエキソンの発現によって生成することを推定する。両方の腫瘍細胞株がまた、Ｗｉ３８細胞よりもＣｉｚ１抗原を含み、これは、これらの癌細胞株におけるＣｉｚ１の過剰発現と一致する。
【０１４１】
まとめると、本発明者らの結果（ゲノムデータの実験分析およびバイオインフォマティクス分析）は、幅広い範囲のヒト癌において誤調節されるという結論を支持する。本発明者らは、Ｃｉｚ１タンパク質が、ＤＮＡ複製プロセスにおいてポジティブな役割を果たし、従って、変異体Ｃｉｚ１が、細胞形質転換の結果であるというよりも、細胞形質転換に寄与し得ることを示した。Ｃｉｚ１の調節解除が、このプロセスにおける共通の工程である場合、このＣｉｚ１の調節解除は、治療剤の開発における非常に魅力的な標的を示す。
【０１４２】
本発明者らはまた、特定の癌に特定の変化を関連付けており、これにより、Ｃｉｚ１が診断マーカーまたは予後マーカーとして有用である可能性を実現する。これらの変化としては、以下が挙げられる：
・小児癌におけるタンパク質のＮ末端部分（インビトロにおける複製活性を有する）における可変スプライシング。
【０１４３】
・Ｃｉｚ１複製活性の抑制に関連することが公知であるサイクリン依存性キナーゼリン酸化部位における点変異。
【０１４４】
・前立腺癌腫細胞株におけるＣｉｚ１−ｐ１２５形態の非典型的な発現および核酸結合特性（おそらく、エキソン８または他のエキソンの縮重リピートのスプライシング調節の誤りに起因する）。
【０１４５】
・肺における小細胞癌および他の癌腫におけるＣｉｚ１のＣ末端における異なったモチーフ（ＶＥＥＥＬＣＫＱ）の条件的除外（おそらく、Ｃｉｚ１タンパク質の核内局在に関連する）。
【０１４６】
・Ｗｉ３８正常胚肺線維芽細胞、ヒト骨芽細胞ＲＮＡおよびマウスＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞と比較した場合の、従来試験した全ての癌由来細胞株における、Ｃｉｚ１タンパク質およびＲＮＡのレベルの上昇（ウエスタンブロットおよびＲＴ−ＰＣＲによって検出される）。
【０１４７】
図１４〜図２１に示した配列は、治療試薬、診断試薬または予後試薬の開発のために役立つ。
【０１４８】
（材料と方法）
（クローニング）
１１日齢マウス胚由来のｌａｍｂａ ｔｒｉｐｌＥｘ ５’伸長全長富化ｃＤＮＡ発現ライブラリー（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ ＭＬ５０１５ｔ）を、推奨プロトコール（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）に従ってＥ．ｃｏｌｉ Ｘｌ１ｂｌｕｅに感染させるために使用した。プラークを、１０ｍＭ ＩＰＴＧ（Ｓｉｇｍａ）に事前に浸した０．４５ミクロンのニトロセルロースフィルター上に乗せた。抗体非存在下での３０分間のブロッキング後、アフィニティ精製抗体Ｖ１を、約３×１０６個のプラークに、ＰＢＳ、１０％無脂肪乳粉末、０．４％ Ｔｗｅｅｎ２０中１／１０００希釈で適用した。２時間後、フィルターを同じ緩衝液で３回洗浄し、反応性プラークを、標準的手順に従い、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合体化した抗ウサギ二次抗体（Ｓｉｇｍａ）を用い、化学発光を増強して（ＥＣＬ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）、可視化した。４３個の独立したプラークを調べたが、２株のファージのみが、さらなる３周のスクリーニングで残った。これらを、ＢＭ２５．８内への形質転換によってｐＴｒｉｐ１Ｅｘへ変換して、配列決定した。１つは、マウスＣｄｃ６（クローンＰ）をコードし、他方（クローンＬ）は、ヒトＣｉｚ１に相同な未知のマウスタンパク質をコードしていた。本発明者らは、これを胚性Ｃｉｚ１（ＥＣｉｚ１）と呼び、これを、ＥＭＢＬに登録番号ＡＪ５７５０５７の下で登録した。
【０１４９】
（細菌発現）
ｐＧＥＸベースの細菌発現構築物（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用し、インビトロ分析のためにＥＣｉｚ１タンパク質を産生した。ｐＧＥＸ−ＥＣｉｚ１を、クローンＬ由来の２．３ｋｂのＳｍａＩ−ＸｂａＩ（平滑末端）フラグメントをｐＧＥＸ−６Ｐ−３のＳｍａＩ部位内に挿入することによって産生した。ｐＧＥＸ−Ｎｔｅｒｍ４４２を、１．３５ｋｂのＸｍａＩ−ＸｈｏＩフラグメントをＸｍａＩ−ＸｈｏＩ切断したｐＧＥＸ−６Ｐ−３内に挿入することによって産生し、そしてｐＧＥＸ−Ｃｔｅｒｍ２７４を、０．９５ｋｂのＸｈｏＩフラグメントをＸｈｏＩ切断したｐＧＥＸ−６Ｐ−３内に挿入することによって産生した。ｐＧＥＸ−Ｔ（１９１／２）Ａを、ｐＧＥＸ ＥＣｉｚ１から、以下のプライマーを用いた部位特異的変異誘発（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ）によって産生した：
【０１５０】
【数２】
【０１５１】
ｐＧＥＸ−Ｔ（２９３）Ａを、以下のプライマーを用いて産生した：
【０１５２】
【数３】
【０１５３】
全てのクローンの読み取り枠の完全性を、配列評価した。
【０１５４】
組換えＣｉｚ１、Ｃｉｚ１フラグメントおよび点変異を、ＢＬ２１−ｐＬｙｓＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）内で、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ−タグ化タンパク質として産生した。これを、超音波処理し清浄化した細菌溶解物から、グルタチオンセファロース４Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）への結合によって精製した。組換えタンパク質を、ＧＳＴタグから、精密プロテアーゼを用いて（製造業者Ａｍｅｒｓｈａｍによって推奨されるように）切断することにより、緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ（ｐＨ７．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ）中に溶出した。このタンパク質沈殿の収率は、０．２〜２．０ｍｇ／ｍｌであった。複製アッセイのために、１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．８）、１ｍＭ ＤＴＴ、５０％グリセロール中で連続希釈を行い、その結果、１ｍｌ以下のタンパク質溶液を１０ｍｌ複製アッセイに添加して、示した濃度を得た。以前の観察（Ｍｉｔｓｕｉら，１９９９；ＷａｒｄｅｒおよびＫｅｈｅｒｌｙ，２００３）と一致して、組換えＣｉｚ１、および生成されたフラグメントＮ−ｔｅｒｍ４４２は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、異常に高分子量で移動した。サイクリンＡ−ｃｄｋ２を、以前に記載されたように（Ｃｏｖｅｒｌｅｙら，２００２）、細菌中で産生した。
【０１５５】
（抗Ｃｉｚ１抗体）
ウサギポリクローナル抗体Ｖ１（Ｃｏｖｅｒｌｅｙら，２０００；Ｓｔｏｅｂｅｒら，１９９８；Ｗｉｌｌｉａｍｓら，１９９８）を、細菌的に発現されたヒトＣｄｃ６の内部フラグメント（アミノ酸１４５〜３６０に対応する）に対して惹起し、標準的手順（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，１９８８）によりアフィニティ精製した。この抗体は、内在性ｐ１００−Ｃｉｚ１およびまたＥＣｉｚ１ Ｎｔｅｒｍ４４２フラグメントに対して強く反応する。Ｎｔｅｒｍ４４２とＣｄｃ６アミノ酸１４５〜３６０とのアラインメントは、共有エピトープがマウスＣｉｚ１における２９４〜２９８または３０４〜３１２であり得ることを示唆する。組換えＮｔｅｒｍ４４２を使用し、１７９３および１７９４と名付けられた２つのＣｉｚ１特異的ポリクローナル抗血清（Ａｂｃａｍ）を生成した。１７９３は、本明細書中に記載される実験において慣用的に使用されている。その特異性を、抗体Ｖを用いた相反免疫沈降およびウエスタンブロット分析、内在性エピトープの反応性をブロックするＮｔｅｒｍ４４２の取り込み（抗体緩衝液（ＰＢＳ中１０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．０２％ ＳＤＳ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００）中２５μｇ／ｍｌ）、およびｓｉＲＮＡ媒介性のＣｉｚ１欠乏（１７９３核染色を特異的に低下させる）によって評価した。
【０１５６】
（免疫沈降）
非同時性増殖中の３Ｔ３細胞を、複製抽出物について、ＰＢＳ中で洗浄し、抽出緩衝液（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．８）、５ｍＭ酢酸カリウム、０．５ｍＭ塩化マグネシウム）中ですすぎ、ＥＤＴＡ非含有プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ）で補強し、そして掻きとって回収した。細胞を、０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ１００で溶解し、そして界面活性剤耐性ペレット画分を、抽出緩衝液中０．３Ｍ ＮａＣｌに抽出した。１００μｌの抽出物につき、５μｌの１７９３または２μｌの抗体Ｖを使用し、１時間４℃でインキュベートした。抗原−抗体複合体を、１００μｌのタンパク質Ｇ−セファロース（Ｓｉｇｍａ）で抽出し、ビーズを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．８）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＮＰ４０、１５０ｍＭ ＮａＣｌで５回洗浄した。複合体を、ローディング緩衝液（１００ｍＭ ＤＴＴ、２％ ＳＤＳ、６０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）、０．００１％ブロモフェノールブルー）中で煮沸し、そして６．５％ ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で解析した。
【０１５７】
（免疫蛍光）
細胞を、カバーガラス上で増殖させ、ＰＢＳ中０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００への短い事前曝露を行うかまたは行わずに、４％パラホルムアルデヒド中で固定した。内在性Ｃｉｚ１を、標準的手順に従い、抗体緩衝液中１／２０００に希釈した１７９３血清で検出した。Ｍｃｍ３を、モノクローナル抗体ｓｃ９８５０（１／１０００）で、Ｃｄｃ６をモノクローナルｓｃ９９６４（１／１００）で、そしてＰＣＮＡをモノクローナル抗体ＰＣ１０（１／１００）（全てＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で、検出した。二重染色蛍光共焦点画像の共局在分析を、記載されるように実施した（ＲｕｂｂｉおよびＭｉｌｎｅｒ，２０００；ｖａｎ Ｓｔｅｅｎｓｅｌら，１９９６）。
【０１５８】
（細胞同期性）
マウス３Ｔ３細胞を、以前に記載されるように（Ｃｏｖｅｒｌｅｙら，２００２）、静止状態からの解放によって同期させた。解放の１７時間後（「後期Ｇ１」と呼ぶ）に回収した細胞から調製した核を、本明細書中に記載される全ての無細胞複製実験において使用した。これにより、Ｓ期の核、複製能のある後期Ｇ１の核および非応答性初期Ｇ１／Ｇ０の核を、異なる割合で含む集団を得た。レシピエント、中期Ｇ１ ３Ｔ３抽出物を、１５時間目に調製した（これらは代表的に、約５％のＳ期細胞を含む）。本明細書中に記載される一連の無細胞複製実験は、大量の標準化抽出物を必要とするため、ＨｅＬａ細胞を使用した。何故なら、ＨｅＬａ細胞は、大量に、容易に同期化するからである。Ｓ期ＨｅＬａ抽出物を、２回の連続的チミジン誘導性Ｓ期ブロックから２時間解放された細胞（Ｋｒｕｄｅら，１９９７に記載される）から調製した。
【０１５９】
（無細胞ＤＮＡ複製）
ＤＮＡ複製アッセイを、記載されるように実施した（Ｃｏｖｅｒｌｅｙら，２００２；Ｋｒｕｄｅら，１９９７）。簡潔に言うと、１０μｌの中期Ｇ１期またはＳ期の抽出物（エネルギー再生系、核酸およびビオチン化ｄＵＴＰで補充される）および５×１０４後期Ｇ１期核を、６０分間３７℃でインキュベートした。反応物を、サイクリンＡ−ｃｄｋ２（図１ＢおよびＣ）を含むバキュロウイルス溶解物で補強した。ここで、０．１μｌの溶解物は、１ｎＭ精製キナーゼと同じ特異的活性を有する（Ｃｏｖｅｒｌｅｙら，２００２）。全ての組換えタンパク質を、１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．８）、１ｍＭ ＤＴＴ、５０％グリセロール中で連続希釈し、それにより、１μｌ以下を１０μｌの複製アッセイに添加し、示した濃度を得た。反応を、５０μｌの０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００で停止し、５０μｌの８％パラホルムアルデヒドの添加によって５分間固定した。カバーガラスへ移した後、核をストレプトアビジン−ＦＩＴＣ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で染色し、Ｔｏｔｏ−３−ヨウ化物（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で対比染色した。標識化した核の割合を、１０００×解像度で観察することによって定量し、蛍光焦点または激しい一様な標識を有する全ての核を、ポジティブとして記録した。ヨウ化プロピジウムで対比染色したサンプルのインビトロ複製する核の画像を、６００×解像度での共焦点顕微鏡検査により作製した。核タンパク質の分析のために、開始条件への１５分間の曝露（冷ＰＢＳでの２倍の希釈反応および穏やかな遠心分離による）後、核を再度単離した。
【０１６０】
（データ分析および提示）
開始アッセイにおいて使用する前に、同期したＧ１期の核の各調製物を試験し、既にＳ期にある核の割合を確立する（「％Ｓ」）。これを行うために、核を抽出物中でインキュベートする。この抽出物は、（静止状態からの解放の１５時間後に回収されるＧ１中期細胞からの）ＤＮＡ合成の開始を誘導し得ないが、（インビボで開始される）起点からの伸長ＤＮＡ合成を効率的に支持する。核の伸長画分は、インビトロ開始アッセイ中に、標識されたヌクレオチドを効率的に取り込むが、有益ではない。慣用的には、この画分は、予め確立され、生データから減算される。２０％未満がＳ期である同期した集団を、開始アッセイのために使用する。
【０１６１】
３Ｔ３細胞を、本明細書中で使用されるプロトコールによって静止状態から解放する場合、集団全体のわずか７０％がＳ期に入る（Ｃｏｖｅｒｌｅｙら，２００２）。しかし、インビトロで最も観察された複製は、５０％近くであり；通常、ＥＣｉｚ１とのインキュベーションによって得られる。本明細書中で使用される３Ｔ３核のＧ１集団について、１７％がＳ期であり（％Ｓ）、そしてインビトロでの任意のアッセイにおいて複製される最大数は、５１％（％複製）であった。従って、この集団の３４％が、インビトロでの複製を開始する能力がある（％Ｃ）。従って、図３Ｂ〜Ｆにおける各データ点について、％開始＝（％複製−％Ｓ）／％Ｃ×１００である。
【０１６２】
（ＲＮＡ干渉）
内因性Ｃｉｚ１を、増殖するＮＩＨ３Ｔ３細胞において、インビトロ転写されたｓｉＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ Ｓｉｌｅｎｃｅｒキット）を用いて、マウスＣｉｚ１の４つの領域に対して標的化した。ｓｉＲＮＡを生成するために使用されるオリゴヌクレオチド配列は、以下である：
【０１６３】
【数４】
【０１６４】
Ｃｉｚ１転写物全体にわたって分布する標的配列を、低い二次構造予測およびエキソン内への局在に基づいて選択した。これは、可変的にスプライシングされることが公知であるもの（ｓｉＲＮＡ ９）を除いて、Ｃｉｚ１の全ての公知の形態（配列４、８、１１）で一貫して発現される。ネガティブコントロールは、未処理、擬似処理（ｓｉＲＮＡを含まないトランスフェクション試薬）およびＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ）で処理した細胞であった。Ｃｙ３標識化ｓｉＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ）を使用してトランスフェクション効率を推定し、これが９５％を超えることを見出した。ＲＮＡ干渉実験を、５００μｌの培地（４％ ＦＣＳを補充したｇｌｕｔａｍａｘ含有ＤＭＥＭ）中の１ウェルあたり２×１０４細胞で開始し、２４ウェル様式で実施した。ｓｉＲＮＡを、プレーティングの１２時間後に、送達用のオリゴフェクタミン（ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して添加した。他で述べられない限り、ｓｉＲＮＡは、第１用量の２４時間後に、新しい培地中で送達される第２用量を含む２つの用量として、対で（培地中の総濃度２ｎＭ）使用した。第１曝露の４８時間後に、細胞数、Ｓ期標識化、および免疫染色によって結果を評価した。ノーザンブロットを、単回用量のｓｉＲＮＡで２４時間処理した細胞から単離したＲＮＡ（反応中、５倍までスケールアップした）において行った。ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて調製し、そしてサンプルを、１％アガロースで電気泳動し、ＮｏｒｔｈｅｒｎＭａｘキット試薬（Ａｍｂｉｏｎ）を製造業者の指示書に従って用いて、Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋ナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に転写し、そしてｃＤＮＡプローブと、５０℃で連続的にハイブリダイズさせた。各ハイブリダイゼーションの間に、０．５％ ＳＤＳ溶液を９０℃で使用して膜を剥がし、室温までゆっくりと冷却した。プローブを、Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒｓ ＤＮＡラベリングシステム（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を使用して［３２Ｐ］−ｄＣＴＰ標識し、以下の順序で使用した：ｉ．ＥＣｉｚ１に由来する１．３５ｋｂ Ｘｍａ１−Ｘｈｏ１フラグメント、ｉｉ．ヒトβアクチンｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびｉｉｉ．マウスＧＡＰＤＨ ｃＤＮＡ（ＲＮＷＡＹ研究所）。この膜を、使用したプローブに依存して５５℃〜６５℃で、２×ＳＳＣ、０．２％ ＳＤＳ中で各３０〜６０分間２回洗浄し、その後、０．２×ＳＳＣ、０．２％ ＳＤＳ中で３０分間１回洗浄した。ハイブリダイゼーションシグナルを、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｔｙｐｈｏｏｎ ９４１０可変様式イメージャー、およびＩｍａｇｅ Ｑｕａｎｔ ＴＬソフトウェア（ｖ２００２）を使用して定量した。バンド強度を、任意の単位（カッコ内）で表し、Ｃｉｚ１およびＧＡＰＤＨについての結果を、βアクチンについての結果に対して正規化し、％で表す。
【０１６５】
（Ｓ期標識）
インビボでＤＮＡ合成を行う核の画分を、２０μＭのブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ、Ｓｉｇｍａ）を培養培地に補充することによって、２０分間モニターした。酸処理後、取り込まれたＢｒｄＵを、製造業者の指示書に従ってＦＩＴＣ結合体化抗ＢｒｄＵモノクローナル抗体（Ａｌｅｘｉｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）によって可視化した。核を、Ｈｏｅｓｃｈｔ ３３２５８を用いて対比染色し、そして高（１０００×）解像度下で記録した。
【０１６６】
（緑色蛍光タンパク質タグ化Ｃｉｚ１）
全長マウスＣｉｚ１ ｃＤＮＡを、ＵＫ ＨＧＭＰ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｒｅから入手し（ＭＧＣクローン２７９８８）、配列を完全に検証した。このクローン由来の２．８ｋｂのＳｍａＩ−ＸｂａＩ（平滑末端）全長Ｃｉｚ１フラグメント、およびｐＴｒｉｐ１ＥｘクローンＬ由来の２．３ｋｂのＳｍａＩ−ＸｂａＩ（平滑末端）ＥＣｉｚ１フラグメントを、増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）を用いて、ｐＥＧＦＰ−Ｃ３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＳｍａＩ部位にインフレームで切断した。挿入のないｐＥＧＦＰ−Ｃ３を、コントロールとして使用した。構築物を、製造業者の指示書に従ってＴｒａｎｓＩＴ−２９３（Ｍｉｒｕｓ）を用いてＮＩＨ３Ｔ３細胞内にトランスフェクトするか、またはある細胞期の受精マウス卵の雄性前核内に微量注入した。全長ＥＧＦＰ−Ｃｉｚ１またはＥＧＦＰ−ＥＣｉｚ１でトランスフェクトした増殖中の３Ｔ３細胞を、生細胞蛍光顕微鏡検査によって、トランスフェクション３日後まで分析した。ＤＮＡ合成を、細胞培養培地中にヌクレオチドアナログＢｒｄＵを含めることによって、図面の説明において示されるような種々の時点について、トランスフェクション後最初の２４時間の間にモニターした。上述のように、ＢｒｄＵに曝される間にＤＮＡ合成を行う任意の細胞を、抗ＢｒｄＵモノクローナル抗体で染色し、赤色の核を生成した。
【０１６７】
また、Ｃｉｚ１トランスフェクト細胞を、標準培養培地（ＤＭＥＭ Ｇｌｕｔａｍａｘ ＋ １０％ウシ胎仔血清）中、５０μｇ／ｍｌ Ｇ４１８での選択下で、１ヶ月まで維持し、形態の変化した細胞集団を得た。
【０１６８】
（ＥＳＴ配列分析）
癌細胞における再発性の変化を同定する目的で、ＮＣＢＩユニジーンクラスターＨｓ．２３４７６（ヒトＣｉｚ１）に対する個々の発現配列タグ（ＥＳＴ）マッピングを、Ｇｅｎｅｊｏｃｋｅｙを使用して翻訳し、予測アミノ酸配列を全長Ｃｉｚ１についての予測配列と比較した。品質の低いＤＮＡ配列を反映する誤差（例えば、長い配列決定の終わりに生じる誤差）を除外するために、中断されない配列の末端から８アミノ酸より遠くに位置する変化のみを、この分析に含めた。読み取りの後半における二度目の変化により回復したフレームシフト、および終止コドンが後に続くフレームシフトを、中断されない配列が後に続く場合にのみ含めた。従って、配列誤差の大部分は、この分析から除外される。しかし、残存する多くの点変異（フレームシフトおよび終止を含む）が、配列決定の間に導入された誤差を反映することが予測される。従って、この分析は、点変異が１より多く出現した場合にのみ点変異に重点が与えられる、明らかな傾向を目指す。
【０１６９】
本発明者らは、Ｃｉｚ１ユニジーンクラスターに対してマッピングした５６７配列に関して、ほとんど（全ての小児癌、前立腺癌および肺癌、白血病およびリンパ腫ならびに広範な非疾患組織）を分析した。いくつかはマッピングしなかった。なぜなら、それらは、非常に短い読み取りであるからであり、すなわち翻訳の際に非常に短いアミノ酸配列を生じ、そして本発明者らが検出した少数の読み取りについて、Ｃｉｚ１コーディング配列に対して相同性が全く検出されなかったからである。インビボで使用される読み取り枠の指標を全く有さずに、３つ全てのフレームで相同性の拡大を生じる多重フレームシフトが原因で、少数のＥＳＴを、複数のフレームシフトを分析から除外した。これらは全て、癌誘導物質由来（通常は腺癌）である。
【０１７０】
（Ｃｉｚアイソフォーム発現のＲＴ−ＰＣＲ分析）
推奨される手順に従ってトリゾール（ｔｒｉｚｏｌ）試薬を用いて、ＲＮＡを単離し、ＤＮａｓｅ処理し、そしてランダムヘキサマーおよびｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩを用いて逆転写し、次いで以下のＣｉｚ１特異的プライマーを用いて増幅した：
【０１７１】
【数５】
【０１７２】
（癌細胞株におけるＣｉｚ１タンパク質アイソフォームの分析）
細胞を、１０％ ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中でサブコンフルエントまで増殖させ、ＥＤＴＡを含まないプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ）を補充した冷ｈｅｐｅｓ緩衝化生理食塩水中でリンスし、次いで掻きとって回収し、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００を補充した。界面活性剤不溶性物質（核を含む）を、穏やかな遠心分離によってペレット化して、上清画分（ＳＮ）とペレット画分（Ｐ）とを得た。これらを、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液中で煮沸し、そしてタンパク質を、８％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの電気泳動によって解析した。ニトロセルロースへの転写後、Ｃｉｚ１アイソフォームを、抗Ｃｉｚ１抗体１７９３で検出した。この分析において使用した全ての方法は、他で十分に記載されている。
【０１７３】
【数６】
【０１７４】
【数７】
【０１７５】
【数８】
【０１７６】
【数９】
【図面の簡単な説明】
【０１７７】
【図１】図１は、後期Ｇ１核に対するサイクリンＡ−ｃｄｋ２の効果を図示する。Ａ）抗Ｃｄｃ６抗体Ｖ１は、３Ｔ３全細胞抽出物のウエスタンブロットにおいてマウスＣｄｃ６および第二抗原を検出し、約１００ｋＤａのＭｒを伴って移動する（Ｍｃｍ３タンパク質の移動度に基づいて、これは、これまでに８５ｋＤａ付近であると推定されていたので、この抗原は、ｐ８５と名付けられている−本発明者らは、明確さのために、本明細書中では、同じ名称を維持した）。Ｐ８５は、溶解性画分および不溶性の核画分（インビトロ複製条件下で調製した）の両方に存在する。Ｂ）Ｇ１期抽出物による「複製コンピテントな」後期Ｇ１期核におけるＤＮＡ合成の開始は、組換えサイクリンＡ−ｃｄｋ２で補われる。コントロールの棒グラフは、既にＳ期にある核の割合を示し（陰影なし）、Ｓ期細胞からの抽出物における複製を開始した核の割合を示す（陰影あり）。Ｃ）細胞を含まない複製条件下で１５分後、核を洗浄し、クロマチン画分を再度単離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、Ｍｃｍ２およびＭｃｍ３についてブロッティングした。Ｄ）同一の核を、抗体Ｖ１でブロッティングした。ｐ８５抗原は、開始誘導濃度のサイクリンＡ−ｃｄｋ２に暴露した核においてより多く存在する。抗体Ｖ１を用いて、Ｃｉｚ１として同定されたマウス胚発現ライブラリーからｐ８５に対する遺伝子をクローニングした。
【図２−１】マウスＣｉｚ１改変体のアラインメント。予測された全長Ｃｉｚ１アミノ酸配列（「全長」）は、マウス乳腺腫瘍ｃＤＮＡクローン（ＢＣ０１８４８３）と同一であるが、胚Ｃｉｚ１（「ＥＣｉｚ１」、ＡＪ５７５０５７）および黒色腫由来クローン（ＡＫ０８９９８６）は、二つの別々の内部の配列を欠如している。さらに、ＥＣｉｚ１中の一番目に利用可能なメチオニンは、エキソン３の中間（Ｍｅｔ８４）に存在し、これは、Ｎ末端からポリグルタミンリッチ領域を排除する。黒色腫由来のＡＫ０８９９８６は、全ての他のマウスのクローンおよびヒトのクローンのＣ末端の前の７７コドンを最終部分とするので、不完全であり得る。星印は、Ｄに示される構築物中の部位特異的変異誘発によって変化したアミノ酸を示す。ｓｉＲＮＡによって標的化されるコドンに対応するアミノ酸に、下線を引く。Ｂ）マウスＣｉｚ１は、少なくとも１７エキソンによってコードされる。コードするエキソンは、灰色で示され、選択的に、スプライシングされた領域は、黒色であり、非翻訳領域は、白色である。二つの代替的なエキソン１配列は、いくつかのＣｉｚ１転写物に含まれる（示さず）が、二つの本明細書中で示されるものの上流の代替的な翻訳開始部位は、まだ見出されていない。
【図２−２】マウスＣｉｚ１改変体のアラインメント。予測された全長Ｃｉｚ１アミノ酸配列（「全長」）は、マウス乳腺腫瘍ｃＤＮＡクローン（ＢＣ０１８４８３）と同一であるが、胚Ｃｉｚ１（「ＥＣｉｚ１」、ＡＪ５７５０５７）および黒色腫由来クローン（ＡＫ０８９９８６）は、二つの別々の内部の配列を欠如している。さらに、ＥＣｉｚ１中の一番目に利用可能なメチオニンは、エキソン３の中間（Ｍｅｔ８４）に存在し、これは、Ｎ末端からポリグルタミンリッチ領域を排除する。黒色腫由来のＡＫ０８９９８６は、全ての他のマウスのクローンおよびヒトのクローンのＣ末端の前の７７コドンを最終部分とするので、不完全であり得る。星印は、Ｄに示される構築物中の部位特異的変異誘発によって変化したアミノ酸を示す。ｓｉＲＮＡによって標的化されるコドンに対応するアミノ酸に、下線を引く。Ｃ）ＥＣｉｚ１における配列の特徴および推定ドメイン。予測される核局在化配列（ＮＬＳ）、推定サイクリン依存性キナーゼリン酸化部位、Ｃ２Ｈ２型ジンクフィンガーおよび核マトリックスタンパク質ｍａｔｒｉｎ３（ＮａｋａｙａｓｕおよびＢｅｒｅｚｎｅｙ、１９９１）に対して相同性を有するＣ末端ドメインが示される。ＥＣｉｚ１を有さない配列の位置を、三角形によって示す。Ｄ）ＥＣｉｚ１および由来する短縮変異体および点変異体を、細胞を含まないＤＮＡ複製実験に使用した。かっこの中の数字は、Ａに示すマウスＣｉｚ１の全長形態におけるアミノ酸位置に関連する。星印は、部位特異的変異誘発によって除去された推定リン酸化部位を示唆する。
【図３】図３は、Ｃｉｚ１タンパク質の効果および細胞を含まないＤＮＡ複製実験において誘導されたフラグメントの効果を示し、ＥＣｉｚ１が、哺乳動物のＤＮＡ複製の開始を促進することを示している。Ａ）組換えＥＣｉｚ１は、Ｓ期抽出物のインキュベーションの間の「複製コンピテントな」後期Ｇ１期核におけるＤＮＡ複製の開始を刺激する。ヒストグラムは、異所性のＥＣｉｚ１の存在または非存在下で、ビオチン化ヌクレオチドをインビトロで組み込んだ核の平均の数を、４回の独立した実験から計算した標準偏差を伴って示す（黒色）。核調製がなされた時に既にＳ期にあった１７％の核を作製し、白色に示す。画像は、１ｎＭのＥＣｉｚ１を含むか、または含まないインビトロでの核の複製を示す。全ての核を、ヨウ化プロピジウムで対比染色（赤色）する。Ｂ）組換えＥＣｉｚ１に対する反応は、ｎＭ範囲で、シャープな最適条件を伴って濃度依存性である。この実験およびＢ−Ｉに示される全ての実験において、結果は、複製％ではなく、開始％として表される。これは、インビトロで開始する核の数およびインビトロで開始するのに「コンピテント」である核の数から計算する（方法を参照のこと）。Ｃ）スレオニン１９１／２は、ＥＣｉｚ１ ｃｄｋ部位変異体Ｔ（１９１／２）Ａが、高濃度で、抑制を回避するときのＣｉｚ１ ＤＮＡ複製活性の調節に関与している。Ｄ）Ｃｄｋ部位変異体Ｔ（２９３）Ａは、ＥＣｉｚ１に対して類似したプロフィールで、（しかし、より低濃度で）開始を刺激する。Ｅ）短縮ＥＣｉｚ１（Ｎ末端４４２）は、Ｃ末端配列を欠如するが、インビトロで、ＥＣｉｚ１と類似した程度に、開始を刺激する。Ｆ）Ｃ末端２７４は、このアッセイにおいて、ＤＮＡ複製活性を保持しない。Ｇ）、Ｈ）、Ｉ）Ｎ末端の三分の二のＥＣｉｚ１タンパク質におけるさらなる欠失分析は、エキソン８の３’の短い領域が、インビトロでアッセイする場合のＣｉｚ１の機能に必要であることを示す。
【図４】抗Ｃｉｚ１ポリクローナル抗体の特徴づけおよび１２５ｋＤａのＣｉｚ１に関連するバンドの同定。Ａ）精製した組換えＥＣｉｚ１フラグメントＮ末端４４２、および抗Ｃｄｃ６抗体Ｖ１を使用する組換えＮ末端４４２のウエスタンブロット、および抗Ｃｉｚ１抗体１７９３および１７９４を示すクーマシー染色したＳＤＳポリアクリルアミドゲル。Ｂ）３Ｔ３全細胞抽出物のウエスタンブロット。抗Ｃｉｚ１抗体１７９３によって検出された二つのバンドの内の一つは、抗体Ｖ１によって認識されるｐ８５−Ｃｉｚ１（１００ｋＤａ）と同じ移動度を有していて、もう一方は、１２５ｋＤａの見かけのＭｒを有する。抗Ｃｉｚ１抗体１７９４は、Ｃｉｚ１の１２５ｋＤａの形態（および８０ｋＤａ付近の第二の抗原）のみを認識する。Ｃ）抗体Ｖ１または抗Ｃｉｚ１ １７９３を使用する３Ｔ３核抽出物由来の免疫沈降。両方の抗体ともに、ｐ８５を沈降させ、ｐ８５は、ウエスタンブロットにおける相反（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ）抗体によって認識される。Ｐ１２５は、抗体１７９３によって沈降し、そして、抗体Ｖ１によってより少ない程度に沈降し、そして、これらは、ウエスタンブロットにおいて、１７９３によって認識される。Ｍｃｍ３をコントロールとして示す。
【図５】内生Ｃｉｚ１の免疫蛍光分析。Ｃｉｚ１は、ＤＮＡ複製の部位と重複する核内の中心に存在する。Ａ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １００に暴露する前（未処理）または暴露後（界面活性剤処理）に固定した３Ｔ３細胞における内生Ｃｉｚ１（赤色）を、抗Ｃｉｚ１抗体１７９３を用いて検出した。核を、Ｈｏｅｓｃｈｔ ３３２５８を用いて対比染色する（青色）。Ｃｄｃ６特異的モノクローナル抗体により検出したＣｄｃ６（緑色）を、比較として示す。Ｂ）組換えＣｉｚ１の封入は、抗体１７９３の、界面活性剤処理した核との反応性をブロックする。Ｃ）界面活性剤耐性のＣｉｚ１（赤色）は、周期する集団の全ての核に存在するが、界面活性剤耐性のＰＣＮＡ（緑色）は、Ｓ期の核のみに、存在し続ける。Ｄ）界面活性剤耐性のＣｉｚ１およびＰＣＮＡの高倍率共焦点切片、および同時局在する中心（黄色）を示す併合像である。Ｅ）示した位置（ｉおよびｉｉ）で、Ｄにおける併合像を横断する赤色および緑色の蛍光の折れ線グラフである。Ｆ）Ｄにおける全併合像を横断する赤色と比較した緑色中心に対する相互相関プロット（ＲｕｂｂｉおよびＭｉｌｎｅｒ、２０００；ｖａｎ Ｓｔｅｅｎｓｅｌら、１９９６）、および（挿入図）Ｅｉｉに示されるレベルでの限界（ｔｈｒｅｓｈ−ｈｏｌｄｉｎｇ）蛍光後の印をつけた切片。Ｆへの挿入図における赤い線は、Ｃｉｚ１像を、ＰＣＮＡに対して９０°回転させた場合の相間関係の喪失を示す。棒は、１０μＭである。
【図６−１】ＲＮＡ干渉。Ｃｉｚ１枯渇は、Ｓ期を阻害する。Ａ）４つの部位でＣｉｚ１転写物を標的するｓｉＲＮＡ（図２Ａを参照のこと）を、単一３ｎＭ用量として、周期する３Ｔ３細胞に個々に適用し、細胞数を、示した時間でモニタリングした。ｓｉＲＮＡ ８でトランスフェクトした（赤色の輪郭）または模擬処理した（青色の輪郭）後、１６時間および４０時間における細胞集団の像を、示す。Ｂ）Ｃｉｚ１ ｓｉＲＮＡ（４および８）またはコントロールＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡに暴露した後、４８時間の抗Ｃｉｚ１ １７９３で検出したＣｉｚ１タンパク質（緑色）。
【図６−２】ＲＮＡ干渉。Ｃｉｚ１枯渇は、Ｓ期を阻害する。Ｃ）Ｃｉｚ１ ｓｉＲＮＡ（４および８）またはコントロールＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡに２４時間暴露した細胞におけるＣｉｚ１レベル、ＧＡＰＤＨのレベルおよびβアクチン転写物のレベル。かっこの中の数字は、任意の単位におけるバンドの強度を反映し、そして、Ｃｉｚ１およびＧＡＰＤＨ転写物の全体の減少（βアクチンに対して、標準化した）を、百分率として表す。Ｄ）ＢｒｄＵをＤＮＡ中に取り込んだ細胞の集団（緑色）は、Ｃｉｚ１ ｓｉＲＮＡで処理した後４８時間で、Ｃｉｚ１枯渇細胞において、有意に減少している。ヒストグラムは、４回の独立した実験の平均の結果を示す。Ｅ）界面活性剤耐性のＭｃｍ３を有する核（緑色）の数は、Ｃｉｚ１ ｓｉＲＮＡで処理した集団で、増加する。Ｆ）界面活性剤耐性のＰＣＮＡを有する核（緑色）の集団もまた、これらの条件下で増加する。全ての核は、対比染色され、みせかけの色（赤色）で示される。
【図７】マウス始原生殖細胞および胚幹細胞におけるＣｉｚ１エキソン３／４スプライシング改変体の発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。エキソン３および／または４は、これらの細胞型において、選択的にスプライシングされるが、新生児の心臓においては、スプライシングされない。これらのデータは、新生児の体細胞組織において全長Ｃｉｚ１が優性な形態であるという仮説、ならびに改変体が発生の初期および生殖系列組織に、より高い頻度で生じるという仮説と一致する。
【図８−１】図８ マウス３Ｔ３細胞の一過性トランスフェクション。Ａ．ＧＦＰタグ化したＣｉｚ１構築物を、ＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトするか、またはＢ．雄性前核もしくは１細胞期のマウス受精卵にマイクロインジェクションした。２４時間までに、Ｃｉｚ１およびＥＣｉｚ１は核に局在化し、亜核に斑点状のパターンを形成したが、ＧＦＰ単独では、核および細胞質の両方に存在した。Ｃ．ＥＧＦＰタグ化したＣｉｚ１およびＥＣｉｚ１ならびにＣ末端フラグメント（Ｃ末端２７４に等価）が取り除かれた派生フラグメントの亜核組織を示す、トランスフェクションの２４時間後の生きた３Ｔ３細胞の核の高解像画像。Ｃ末端ドメインが存在しない場合、ＧＦＰ−ＥＣｉｚ１は、トランスフェクションの２４時間後に核内に拡散性に局在化するが、ＧＦＰ−Ｃｉｚ１は凝集して、核内に１つまたは２つの大きな斑点を形成する。Ｄ．細胞が有糸分裂を通過するまでは、Ｃ末端の２７４ドメイン単独は細胞質内である（核局在化配列の欠如および核への受動流入に起因する可能性が高い）が、一旦内側に来ると、核構造体に結合し、そして、染色体と共に凝集する。
【図８−２】図８ マウス３Ｔ３細胞の一過性トランスフェクション。Ｅ．トランスフェクションの最初の１２時間後のＢｒｄＵで標識された集団におけるＧＦＰ−Ｃｉｚ１（緑）、ＢｒｄＵ（赤）および全核（青）の代表的画像を示す。ヒストグラムは、３つの別個の標識窓についての、トランスフェクトされていない（灰色）細胞の数と比較して、ＢｒｄＵを取り込んだ、トランスフェクトされた（緑）細胞の集団を示す。トランスフェクション後０〜２２時間の間は、迅速に回転する細胞が、Ｃｉｚ１もしくはＥＣｉｚ１のいずれかでトランスフェクトされた場合に、ＢｒｄＵ標識した分画の一定の増加を記録した。密な培養で類似の結果が得られ、ここでは、ほとんどの細胞が、細胞周期を出て、静止状態に入っていた。しかし、迅速に回転する細胞が、トランスフェクションの２２時間後にＢｒｄＵに短時間（２０分）パルスで曝露された場合、ＤＮＡ合成に関与する細胞の数は、トランスフェクトしていないコントロールおよびＧＦＰ単独でトランスフェクトした細胞と比較して、Ｃｉｚ１およびＥＣｉｚ１でトランスフェクトした集団において減少した。このことは、２２時間までに、ＤＮＡ合成がＣｉｚ１発現細胞において停止したことを示す。
【図９】図９ トランスフェクトした集団における増殖能力および細胞形態の変更。トランスフェクトした３Ｔ３細胞集団において細胞クラスターが生じる。Ａ．細胞を、ＧＦＰをタグ化したＣｉｚ１もしくはＥＣｉｚ１のＮ末端の３分の２（Ｎ末端４４２）を用いてトランスフェクトし、そして、５０μｇ／ｍｌ Ｇ４１８の選択下で維持した。選択下で３週間の後、細胞凝集物は、内部のＧＦＰ陽性細胞によって可視であった。
【図１０】図１０ 小児癌におけるヒトＣｉｚ１スプライス改変体。公的データベースには７つのヒトＣｉｚ１ ｃＤＮＡが存在するが、１つのみが、正常な成人組織（Ｂ細胞）に由来し、そして、これは全推定エキソンを含む。他の６つは、胚細胞または小児癌に由来する。これらのうちの５つは、エキソン２、３、６および８において（マウスＥＣｚｉ１のように）、そしてまた、エキソン４において（マウスＥＳ細胞、始原生殖細胞および精巣のように）可変性を伴って、選択的にスプライシングされる。６つ目（ＡＦ１５９０２５）は、第１メチオニンを欠き、アミノ酸置換を生じる単一ヌクレオチド多型を含む。推定配列（ＡＢ０３０８３５）からの全ての相違に印を付ける。
【図１１Ａ】図１１ ＥＳＴ配列分析。各マップ上に、Ｃｉｚ１タンパク質の略図が参考として含められ、これらは、選択的にスプライシングされたエキソンの位置（黒）、推定クロマチン相互作用ドメイン（灰色）および予想ジンクフィンガー（黒の縦線）を示す。全てのＥＳＴ配列に、そのＧｅｎｂａｎｋ登録番号を添え、その配列が由来したライブラリーを括弧内に示す。選択的スプライシングの結果、Ｃｉｚ１ ＥＳＴを含まない配列を、黄色で示し、フレームシフトを赤で示し、推定欠失を灰色で示す。アミノ酸置換を生じる単一ヌクレオチド多型を、黒点で示し、これらのいくつかは、本発明者らがＣｉｚ１活性の調節に重要であると示してきたコンセンサスｃｄｋリン酸化部位（青点）に生じる。癌腫細胞株ＭＧＣ１０２における挿入配列の位置を三角で示す。Ａ）小児癌および成人の神経癌に由来する翻訳されたＥＳＴ。
【図１１Ｂ】図１１ ＥＳＴ配列分析。各マップ上に、Ｃｉｚ１タンパク質の略図が参考として含められ、これらは、選択的にスプライシングされたエキソンの位置（黒）、推定クロマチン相互作用ドメイン（灰色）および予想ジンクフィンガー（黒の縦線）を示す。全てのＥＳＴ配列に、そのＧｅｎｂａｎｋ登録番号を添え、その配列が由来したライブラリーを括弧内に示す。選択的スプライシングの結果、Ｃｉｚ１ ＥＳＴを含まない配列を、黄色で示し、フレームシフトを赤で示し、推定欠失を灰色で示す。アミノ酸置換を生じる単一ヌクレオチド多型を、黒点で示し、これらのいくつかは、本発明者らがＣｉｚ１活性の調節に重要であると示してきたコンセンサスｃｄｋリン酸化部位（青点）に生じる。癌腫細胞株ＭＧＣ１０２における挿入配列の位置を三角で示す。Ｂ）種々の非癌性細胞および組織に由来する翻訳されたＥＳＴ。
【図１１Ｃ】図１１ ＥＳＴ配列分析。各マップ上に、Ｃｉｚ１タンパク質の略図が参考として含められ、これらは、選択的にスプライシングされたエキソンの位置（黒）、推定クロマチン相互作用ドメイン（灰色）および予想ジンクフィンガー（黒の縦線）を示す。全てのＥＳＴ配列に、そのＧｅｎｂａｎｋ登録番号を添え、その配列が由来したライブラリーを括弧内に示す。選択的スプライシングの結果、Ｃｉｚ１ ＥＳＴを含まない配列を、黄色で示し、フレームシフトを赤で示し、推定欠失を灰色で示す。アミノ酸置換を生じる単一ヌクレオチド多型を、黒点で示し、これらのいくつかは、本発明者らがＣｉｚ１活性の調節に重要であると示してきたコンセンサスｃｄｋリン酸化部位（青点）に生じる。癌腫細胞株ＭＧＣ１０２における挿入配列の位置を三角で示す。Ｃ）白血病、リンパ腫に由来する翻訳されたＥＳＴ、そして、正常な造血細胞およびリンパ球に由来する翻訳されたＥＳＴ。
【図１１Ｄ】図１１ ＥＳＴ配列分析。各マップ上に、Ｃｉｚ１タンパク質の略図が参考として含められ、これらは、選択的にスプライシングされたエキソンの位置（黒）、推定クロマチン相互作用ドメイン（灰色）および予想ジンクフィンガー（黒の縦線）を示す。全てのＥＳＴ配列に、そのＧｅｎｂａｎｋ登録番号を添え、その配列が由来したライブラリーを括弧内に示す。選択的スプライシングの結果、Ｃｉｚ１ ＥＳＴを含まない配列を、黄色で示し、フレームシフトを赤で示し、推定欠失を灰色で示す。アミノ酸置換を生じる単一ヌクレオチド多型を、黒点で示し、これらのいくつかは、本発明者らがＣｉｚ１活性の調節に重要であると示してきたコンセンサスｃｄｋリン酸化部位（青点）に生じる。癌腫細胞株ＭＧＣ１０２における挿入配列の位置を三角で示す。Ｄ）癌腫に由来する翻訳されたＥＳＴ。
【図１１Ｅ】図１１ ＥＳＴ配列分析。各マップ上に、Ｃｉｚ１タンパク質の略図が参考として含められ、これらは、選択的にスプライシングされたエキソンの位置（黒）、推定クロマチン相互作用ドメイン（灰色）および予想ジンクフィンガー（黒の縦線）を示す。全てのＥＳＴ配列に、そのＧｅｎｂａｎｋ登録番号を添え、その配列が由来したライブラリーを括弧内に示す。選択的スプライシングの結果、Ｃｉｚ１ ＥＳＴを含まない配列を、黄色で示し、フレームシフトを赤で示し、推定欠失を灰色で示す。アミノ酸置換を生じる単一ヌクレオチド多型を、黒点で示し、これらのいくつかは、本発明者らがＣｉｚ１活性の調節に重要であると示してきたコンセンサスｃｄｋリン酸化部位（青点）に生じる。癌腫細胞株ＭＧＣ１０２における挿入配列の位置を三角で示す。Ｅ）ある範囲の他の癌に由来する翻訳されたＥＳＴ。
【図１１Ｆ】図１１ ＥＳＴ配列分析。各マップ上に、Ｃｉｚ１タンパク質の略図が参考として含められ、これらは、選択的にスプライシングされたエキソンの位置（黒）、推定クロマチン相互作用ドメイン（灰色）および予想ジンクフィンガー（黒の縦線）を示す。全てのＥＳＴ配列に、そのＧｅｎｂａｎｋ登録番号を添え、その配列が由来したライブラリーを括弧内に示す。選択的スプライシングの結果、Ｃｉｚ１ ＥＳＴを含まない配列を、黄色で示し、フレームシフトを赤で示し、推定欠失を灰色で示す。アミノ酸置換を生じる単一ヌクレオチド多型を、黒点で示し、これらのいくつかは、本発明者らがＣｉｚ１活性の調節に重要であると示してきたコンセンサスｃｄｋリン酸化部位（青点）に生じる。癌腫細胞株ＭＧＣ１０２における挿入配列の位置を三角で示す。Ｆ）条件つきで導入された配列を示す、ヒトＣｉｚ１における選択的にスプライシングされた領域のまとめ。
【図１２Ａ】図１２ Ｅｗｉｎｇ肉腫ファミリーの腫瘍細胞株（ＥＳＦＴ）および神経芽細胞腫細胞株におけるＣｉｚ１のスプライス改変体の発現。Ａ．６つの別個のＥＳＦＴ細胞株、２つの神経芽細胞腫細胞株およびコントロール細胞株（ＨＥＫ２９３細胞）に由来する総ＲＮＡサンプルを、４つの異なるプライマーセットを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ分析に供した。ＥＳＦＴ細胞株は、以下である：１）Ａ６７３、２）ＲＤＥＳ、３）ＳＫＥＳ１、４）ＳＫＮＭＣ、５）ＴＣ３、６）ＴＴＣ４６６。神経芽細胞腫細胞株は、以下である：１）ＩＭＲ３２、２）ＳＫＮＳＨ。
【図１２Ｂ】図１２ ユーイング肉腫ファミリーの腫瘍細胞株（ＥＳＦＴ）および神経芽細胞腫細胞株におけるＣｉｚ１のスプライス改変体の発現。Ｂ．ＥＳＦＴおよび神経芽細胞腫におけるＣｉｚ１エキソン３／４／５のＰＣＲ生成物の分析。プライマーｈ３およびｈ４の生成物（潜在的に可変のエキソン４および６にまたがる）を、より詳細に分析した。ＰＣＲフラグメントを、標準的な手順によってアガロースゲルから精製し、サブクローニングして、そして、配列決定して、フラグメントのサイズ変化の原因を同定した。７つの細胞株の各々について、１と１１との間の個々のクローンを配列決定し、この結果を表にまとめる。ＥＳＦＴ細胞株由来のＣｉｚ１は、転写物全体の３１％において、エキソン４が欠失し、いくつかのＥＳＦＴ細胞株については、５０％近くがエキソン４を欠失する。ＤＳＳＳＱは、本明細書で試験された２つの神経芽細胞腫細胞株においてより一般に存在しない。
【図１３Ａ】図１３ 正常ヒト線維芽細胞（Ｗｉ３８）および転移性前立腺癌細胞株（ＰＣ３およびＬＮＣＡＰ）におけるＣｉｚ１のアイソフォーム。Ａ．非癌細胞株と比較して、両方の前立腺癌細胞株が、核分画において、過剰の最も大きいｐ１２５ Ｃｉｚ１タンパク質改変体を含む。
【図１３Ｂ】図１３ 正常ヒト線維芽細胞（Ｗｉ３８）および転移性前立腺癌細胞株（ＰＣ３およびＬＮＣＡＰ）におけるＣｉｚ１のアイソフォーム。Ｂ．ＤＮＡ複製の開始の間のタンパク質プロセシングによるｐ１２５改変体からのｐ８５（１００）の生成のためのモデル。
【図１４】図１４は、全長マウスｍＲＮＡ配列を示す。
【図１５】図１５は、全長ヒトｍＲＮＡ配列を示す。
【図１６】図１６は、全長マウスタンパク質配列を示す。
【図１７】図１７は、全長ヒトタンパク質配列を示す。
【図１８】図１８は、ヒトの選択的にスプライシングされたタンパク質配列を示す。示される配列は、スプライシングされたタンパク質配列を含まない。
【図１９】図１９は、ヒトの選択的にスプライシングされたｍＲＮＡ配列を示す。示される配列は、スプライシングされたタンパク質配列を含まない。
【図２０Ａ】図２０Ａは、欠けたエキソン（ｍｉｓｓｉｎｇ ｅｘｏｎ）によってヒトＣｉｚ１タンパク質において作成された独特のジャンクション配列を示す。このジャンクション配列は、本発明の方法によって同定された治療剤のための標的の主要な部位を表す。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、欠けたエキソンによってヒトＣｉｚ１タンパク質において作成された独特のジャンクション配列を示す。このジャンクション配列は、本発明の方法によって同定された治療剤のための標的の主要な部位を表す。
【図２１Ａ】図２１Ａ〜Ｈは、ヒトＣｉｚ１ ｍＲＮＡにおいて作成されたジャンクション配列を示す。
【図２１Ｂ】図２１Ａ〜Ｈは、ヒトＣｉｚ１ ｍＲＮＡにおいて作成されたジャンクション配列を示す。
【図２１Ｃ】図２１Ａ〜Ｈは、ヒトＣｉｚ１ ｍＲＮＡにおいて作成されたジャンクション配列を示す。
【図２１Ｄ】図２１Ａ〜Ｈは、ヒトＣｉｚ１ ｍＲＮＡにおいて作成されたジャンクション配列を示す。
【図２１Ｅ】図２１Ａ〜Ｈは、ヒトＣｉｚ１ ｍＲＮＡにおいて作成されたジャンクション配列を示す。
【図２１Ｆ】図２１Ａ〜Ｈは、ヒトＣｉｚ１ ｍＲＮＡにおいて作成されたジャンクション配列を示す。
【図２１Ｇ】図２１Ａ〜Ｈは、ヒトＣｉｚ１ ｍＲＮＡにおいて作成されたジャンクション配列を示す。
【図２１Ｈ】図２１Ａ〜Ｈは、ヒトＣｉｚ１ ｍＲＮＡにおいて作成されたジャンクション配列を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ複製を調節する因子の同定のための標的としての、Ｃｉｚ１ヌクレオチド配列もしくはＣｉｚ１ポリペプチド配列、またはその任意のフラグメントもしくは改変体の、使用。
【請求項２】
ＤＮＡ複製を調節する因子の同定のためのスクリーニング方法であって、該スクリーニング方法は、Ｃｉｚ１ヌクレオチド配列もしくはＣｉｚ１ポリペプチド配列、またはその任意のフラグメントもしくは改変体の使用を包含する、スクリーニング方法。
【請求項３】
請求項２に記載のスクリーニング方法であって、該方法は、以下：
ａ）図１４、１５、または２１のいずれかに示される核酸配列を含む核酸分子；
ｂ）（ａ）中の核酸配列にハイブリダイズし、かつＣｉｚ１活性またはその改変体の活性を有する核酸分子；
ｃ）遺伝暗号が原因でａ）およびｂ）中の配列、ならびに試験されるべき候補因子に対して縮重している核酸配列を有する核酸分子；
ｄ）Ｃｉｚ１遺伝子座でのゲノム配列に由来する核酸分子、または該ゲノム配列にハイブリダイズする核酸分子
からなる群より選択される核酸分子に対する因子の効果を検出または測定する工程
を包含する、方法。
【請求項４】
前記核酸分子が、前記核酸配列のうちの少なくとも１つの核酸残基の欠失、置換または付加によって改変されている、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記方法が、以下：
（ｉ）以下：
ａ）図１４、１５、または２１のいずれかに示される核酸配列を含む核酸分子；
ｂ）（ａ）の核酸配列にハイブリダイズし、かつＣｉｚ１活性またはその改変体の活性を有する核酸分子；
ｃ）遺伝暗号が原因でａ）およびｂ）中の配列、ならびに試験されるべき候補因子に対して縮重している核酸配列を有する核酸分子；
ｄ）Ｃｉｚ１遺伝子座でのゲノム配列に由来する核酸分子、または該ゲノム配列にハイブリダイズする核酸分子
からなる群より選択される核酸分子によってコードされるポリペプチド分子、またはその活性フラグメントを含む調製物を形成する工程；ならびに
（ｉｉ）該ポリペプチドの活性に対する前記因子の効果を検出または測定する工程
のうちの１つ以上を包含する、請求項２に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、前記ポリペプチド配列のうちの少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、置換または付加によって改変されている、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記スクリーニング方法が、細胞ベースのスクリーニング方法である、請求項３〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が、前記Ｃｉｚ１ポリペプチドを天然に発現する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞が、Ｃｉｚ１またはそのフラグメントもしくは改変体をコードする核酸分子でトランスフェクトされている、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の方法によって同定される、因子。
【請求項１１】
前記因子が、Ｃｉｚ１媒介性ＤＮＡ複製のアンタゴニストである、請求項１０に記載の因子。
【請求項１２】
前記因子が、Ｃｉｚ１媒介性ＤＮＡ複製のアゴニストである、請求項１０に記載の因子。
【請求項１３】
前記因子が、以下：ポリペプチドプローブもしくは核酸プローブ；ポリペプチド；ペプチド；アプタマー；化学物質；抗体；核酸からなる群より選択される、請求項１０〜１２のいずれかに記載の因子。
【請求項１４】
前記因子が、抗体分子であり、そして図１６、１７、または２０に示される配列のうちのいずれかに結合する、請求項１２に記載の因子。
【請求項１５】
前記因子が、アンチセンス核酸分子またはＲＮＡｉであり、該因子は、Ｃｉｚ１またはその任意の改変体のｍＲＮＡ配列に結合し、それによって、該Ｃｉｚ１またはその任意の改変体のｍＲＮＡ配列をブロックまたは不活性化する、請求項１２に記載の因子。
【請求項１６】
前記因子が、図１４、１５、または２１、あるいは請求項３の（ｉ）ｂ〜ｄの部分に示される配列の任意の部分に結合する、請求項１５に記載の因子。
【請求項１７】
アンチセンス分子またはＲＮＡｉ分子を細胞に送達するための送達手段としての、ベクター。
【請求項１８】
請求項１７に記載のベクターであって、該ベクターは、以下：
ａ）図１４、図１５、および図２１に示されるＣｉｚ１アミノ酸配列をコードする核酸配列；
ｂ）（ａ）の核酸配列にハイブリダイズする核酸分子；
ｃ）遺伝暗号が原因でａ）およびｂ）中の配列ならびに該配列のうちのいずれかと相補的な任意の配列に対して縮重している核酸配列を有する、核酸分子；
ｄ）Ｃｉｚ１プレｍＲＮＡをコードする核酸配列（すなわち、ゲノム配列）；
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む、ベクター。
【請求項１９】
前記発現カセットが、プロモーター配列に対して転写的に連結されている、請求項１８に記載のベクター。
【請求項２０】
増殖性障害の同定のための診断方法であって、該方法は、そのゲノム配列またはタンパク質配列における、Ｃｉｚ１遺伝子、Ｃｉｚ１スプライス改変体および変異の存在または発現を検出する工程を包含する、診断方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の診断方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）試験されるべき被験体から単離されたサンプルを、Ｃｉｚ１活性を有するポリペプチドまたはＣｉｚ１活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子に特異的に結合する因子と、接触させる工程；
（ｉｉ）該サンプル中の該ポリペプチドまたは核酸に対する該因子の結合を検出または測定する工程；
（ｉｉｉ）逆転写ＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲを使用して、Ｃｉｚ１発現およびＣｉｚ１アイソフォーム発現をモニターし、発現レベルを測定する工程；ならびに
（ｉｖ）該分子の変化した立体構造特性に基づいて、核酸変異またはアミノ酸変異の存在を測定する工程
のうちの１以上を包含する、診断方法。
【請求項２２】
薬剤として、薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤、もしくは希釈剤を伴う、請求項１〜９のいずれかに記載の方法によって同定される因子の、使用。
【請求項２３】
増殖性疾患の処置における使用のための医薬の製造のための、請求項１〜９のいずれかに記載の方法によって同定される因子の、使用。
【請求項２４】
前記増殖性疾患が癌である、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
前記癌が、小児癌であり、網膜芽細胞腫、神経芽細胞腫、バーキットリンパ腫、髄芽細胞腫、ユーイング肉腫家族腫瘍（ＥＳＦＴ）からなる群より選択される、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
前記癌が、癌腫、腺癌、リンパ腫または白血病である、請求項２４に記載の使用。
【請求項２７】
前記疾患が、肝臓癌、肺癌、もしくは皮膚癌、または肝臓転移、肺転移、もしくは皮膚転移である、請求項２３に記載の使用。
【請求項２８】
増殖性疾患を処置するための方法であって、該方法は、動物に、請求項１〜９のいずれかに記載の方法によって同定される因子を投与する工程を包含する、方法。
【請求項２９】
細胞分裂または細胞増殖を遅くするための医薬の製造のための、請求項１〜９のいずれかに記載の方法によって同定される因子の、使用。
【請求項３０】
請求項１〜９のいずれかの方法によって同定される診断剤、予後剤または治療剤を含む、キット。
【請求項１】
ＤＮＡ複製を調節する因子の同定のための標的としての、Ｃｉｚ１ヌクレオチド配列もしくはＣｉｚ１ポリペプチド配列、またはその任意のフラグメントもしくは改変体の、使用。
【請求項２】
ＤＮＡ複製を調節する因子の同定のためのスクリーニング方法であって、該スクリーニング方法は、Ｃｉｚ１ヌクレオチド配列もしくはＣｉｚ１ポリペプチド配列、またはその任意のフラグメントもしくは改変体の使用を包含する、スクリーニング方法。
【請求項３】
請求項２に記載のスクリーニング方法であって、該方法は、以下：
ａ）図１４、１５、または２１のいずれかに示される核酸配列を含む核酸分子；
ｂ）（ａ）中の核酸配列にハイブリダイズし、かつＣｉｚ１活性またはその改変体の活性を有する核酸分子；
ｃ）遺伝暗号が原因でａ）およびｂ）中の配列、ならびに試験されるべき候補因子に対して縮重している核酸配列を有する核酸分子；
ｄ）Ｃｉｚ１遺伝子座でのゲノム配列に由来する核酸分子、または該ゲノム配列にハイブリダイズする核酸分子
からなる群より選択される核酸分子に対する因子の効果を検出または測定する工程
を包含する、方法。
【請求項４】
前記核酸分子が、前記核酸配列のうちの少なくとも１つの核酸残基の欠失、置換または付加によって改変されている、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記方法が、以下：
（ｉ）以下：
ａ）図１４、１５、または２１のいずれかに示される核酸配列を含む核酸分子；
ｂ）（ａ）の核酸配列にハイブリダイズし、かつＣｉｚ１活性またはその改変体の活性を有する核酸分子；
ｃ）遺伝暗号が原因でａ）およびｂ）中の配列、ならびに試験されるべき候補因子に対して縮重している核酸配列を有する核酸分子；
ｄ）Ｃｉｚ１遺伝子座でのゲノム配列に由来する核酸分子、または該ゲノム配列にハイブリダイズする核酸分子
からなる群より選択される核酸分子によってコードされるポリペプチド分子、またはその活性フラグメントを含む調製物を形成する工程；ならびに
（ｉｉ）該ポリペプチドの活性に対する前記因子の効果を検出または測定する工程
のうちの１つ以上を包含する、請求項２に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、前記ポリペプチド配列のうちの少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、置換または付加によって改変されている、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記スクリーニング方法が、細胞ベースのスクリーニング方法である、請求項３〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が、前記Ｃｉｚ１ポリペプチドを天然に発現する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞が、Ｃｉｚ１またはそのフラグメントもしくは改変体をコードする核酸分子でトランスフェクトされている、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の方法によって同定される、因子。
【請求項１１】
前記因子が、Ｃｉｚ１媒介性ＤＮＡ複製のアンタゴニストである、請求項１０に記載の因子。
【請求項１２】
前記因子が、Ｃｉｚ１媒介性ＤＮＡ複製のアゴニストである、請求項１０に記載の因子。
【請求項１３】
前記因子が、以下：ポリペプチドプローブもしくは核酸プローブ；ポリペプチド；ペプチド；アプタマー；化学物質；抗体；核酸からなる群より選択される、請求項１０〜１２のいずれかに記載の因子。
【請求項１４】
前記因子が、抗体分子であり、そして図１６、１７、または２０に示される配列のうちのいずれかに結合する、請求項１２に記載の因子。
【請求項１５】
前記因子が、アンチセンス核酸分子またはＲＮＡｉであり、該因子は、Ｃｉｚ１またはその任意の改変体のｍＲＮＡ配列に結合し、それによって、該Ｃｉｚ１またはその任意の改変体のｍＲＮＡ配列をブロックまたは不活性化する、請求項１２に記載の因子。
【請求項１６】
前記因子が、図１４、１５、または２１、あるいは請求項３の（ｉ）ｂ〜ｄの部分に示される配列の任意の部分に結合する、請求項１５に記載の因子。
【請求項１７】
アンチセンス分子またはＲＮＡｉ分子を細胞に送達するための送達手段としての、ベクター。
【請求項１８】
請求項１７に記載のベクターであって、該ベクターは、以下：
ａ）図１４、図１５、および図２１に示されるＣｉｚ１アミノ酸配列をコードする核酸配列；
ｂ）（ａ）の核酸配列にハイブリダイズする核酸分子；
ｃ）遺伝暗号が原因でａ）およびｂ）中の配列ならびに該配列のうちのいずれかと相補的な任意の配列に対して縮重している核酸配列を有する、核酸分子；
ｄ）Ｃｉｚ１プレｍＲＮＡをコードする核酸配列（すなわち、ゲノム配列）；
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む、ベクター。
【請求項１９】
前記発現カセットが、プロモーター配列に対して転写的に連結されている、請求項１８に記載のベクター。
【請求項２０】
増殖性障害の同定のための診断方法であって、該方法は、そのゲノム配列またはタンパク質配列における、Ｃｉｚ１遺伝子、Ｃｉｚ１スプライス改変体および変異の存在または発現を検出する工程を包含する、診断方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の診断方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）試験されるべき被験体から単離されたサンプルを、Ｃｉｚ１活性を有するポリペプチドまたはＣｉｚ１活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子に特異的に結合する因子と、接触させる工程；
（ｉｉ）該サンプル中の該ポリペプチドまたは核酸に対する該因子の結合を検出または測定する工程；
（ｉｉｉ）逆転写ＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲを使用して、Ｃｉｚ１発現およびＣｉｚ１アイソフォーム発現をモニターし、発現レベルを測定する工程；ならびに
（ｉｖ）該分子の変化した立体構造特性に基づいて、核酸変異またはアミノ酸変異の存在を測定する工程
のうちの１以上を包含する、診断方法。
【請求項２２】
薬剤として、薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤、もしくは希釈剤を伴う、請求項１〜９のいずれかに記載の方法によって同定される因子の、使用。
【請求項２３】
増殖性疾患の処置における使用のための医薬の製造のための、請求項１〜９のいずれかに記載の方法によって同定される因子の、使用。
【請求項２４】
前記増殖性疾患が癌である、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
前記癌が、小児癌であり、網膜芽細胞腫、神経芽細胞腫、バーキットリンパ腫、髄芽細胞腫、ユーイング肉腫家族腫瘍（ＥＳＦＴ）からなる群より選択される、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
前記癌が、癌腫、腺癌、リンパ腫または白血病である、請求項２４に記載の使用。
【請求項２７】
前記疾患が、肝臓癌、肺癌、もしくは皮膚癌、または肝臓転移、肺転移、もしくは皮膚転移である、請求項２３に記載の使用。
【請求項２８】
増殖性疾患を処置するための方法であって、該方法は、動物に、請求項１〜９のいずれかに記載の方法によって同定される因子を投与する工程を包含する、方法。
【請求項２９】
細胞分裂または細胞増殖を遅くするための医薬の製造のための、請求項１〜９のいずれかに記載の方法によって同定される因子の、使用。
【請求項３０】
請求項１〜９のいずれかの方法によって同定される診断剤、予後剤または治療剤を含む、キット。
【図１】
【図２−１】
【図２−２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６−１】
【図６−２】
【図７】
【図８−１】
【図８−２】
【図９】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１１Ｄ】
【図１１Ｅ】
【図１１Ｆ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０Ａ】
【図２０Ｂ】
【図２１Ａ】
【図２１Ｂ】
【図２１Ｃ】
【図２１Ｄ】
【図２１Ｅ】
【図２１Ｆ】
【図２１Ｇ】
【図２１Ｈ】
【図２−１】
【図２−２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６−１】
【図６−２】
【図７】
【図８−１】
【図８−２】
【図９】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１１Ｄ】
【図１１Ｅ】
【図１１Ｆ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０Ａ】
【図２０Ｂ】
【図２１Ａ】
【図２１Ｂ】
【図２１Ｃ】
【図２１Ｄ】
【図２１Ｅ】
【図２１Ｆ】
【図２１Ｇ】
【図２１Ｈ】
【公表番号】特表２００６−５０８６５９（Ｐ２００６−５０８６５９Ａ）
【公表日】平成１８年３月１６日（２００６．３．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５５６５５６（Ｐ２００４−５５６５５６）
【出願日】平成１５年１２月５日（２００３．１２．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００３／００５３３４
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０５１２６９
【国際公開日】平成１６年６月１７日（２００４．６．１７）
【出願人】（５０５２１１６５１）ヨークシャー キャンサー リサーチ (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年３月１６日（２００６．３．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１２月５日（２００３．１２．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００３／００５３３４
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０５１２６９
【国際公開日】平成１６年６月１７日（２００４．６．１７）
【出願人】（５０５２１１６５１）ヨークシャー キャンサー リサーチ (1)
【Ｆターム（参考）】
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