ＣＯＸ阻害薬の心血管系リスク因子の改善方法
【課題】
【解決手段】ＣＯＸ阻害薬またはＣＯＸ−２選択的阻害薬の使用に伴う心血管系事象のリスクの増大を抑制する方法は、ＣＯＸ阻害薬またはＣＯＸ−２選択的阻害薬の使用により生じるコレステロール代謝機能の異常を修復する工程と、これにより引き起こされる泡沫細胞の生成を抑制する工程と、を備える。コレステロール代謝機能の異常の修復および泡沫細胞の生成の抑制は、ＣＯＸ阻害薬またはＣＯＸ−２阻害薬を投与された患者に対する活性の閾値レベルが０．１μＭであるアデノシンＡ２Ａ受容体作用薬を投与する工程により実現される。アデノシンＡ２Ａ受容体作用薬は、Ａ２Ａ受容体を飽和状態にするのに十分な量およびコレステロール代謝機能の修復を維持するのに十分な時間間隔で、経口投与される。
【解決手段】ＣＯＸ阻害薬またはＣＯＸ−２選択的阻害薬の使用に伴う心血管系事象のリスクの増大を抑制する方法は、ＣＯＸ阻害薬またはＣＯＸ−２選択的阻害薬の使用により生じるコレステロール代謝機能の異常を修復する工程と、これにより引き起こされる泡沫細胞の生成を抑制する工程と、を備える。コレステロール代謝機能の異常の修復および泡沫細胞の生成の抑制は、ＣＯＸ阻害薬またはＣＯＸ−２阻害薬を投与された患者に対する活性の閾値レベルが０．１μＭであるアデノシンＡ２Ａ受容体作用薬を投与する工程により実現される。アデノシンＡ２Ａ受容体作用薬は、Ａ２Ａ受容体を飽和状態にするのに十分な量およびコレステロール代謝機能の修復を維持するのに十分な時間間隔で、経口投与される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［クロスリファレンス］
本出願は、２００８年５月５日に出願された仮出願番号第６１／０５０，４９９号および２００８年１１月１７日に出願された仮出願番号第６１／１１５，２８９号に基づく優先権を主張する本出願である。前記出願の開示内容は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、ＣＯＸ−２選択的阻害薬を含むシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ：Cyclooxygenase）阻害薬の悪影響から、ヒトを含む哺乳類の心血管系を守る方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＣＯＸ−２阻害薬を含むＣＯＸ阻害薬ＮＳＡＩＤｓ（非ステロイド系抗炎症薬：non-steroidal anti-inflammatory drugs）と心筋梗塞や脳卒中のリスク増大の関連性は、大きな公衆衛生上の懸念となっている。心血管系有害事象のために、ＣＯＸ−２選択的阻害薬であるロフェコキシブ（ｒｏｆｅｃｏｘｉｂ）（バイオックス（Ｖｉｏｘｘ）（登録商標）、メルク（Ｍｅｒｃｋ）社）の世界規模での使用中止により、疼痛や炎症に苦しむ患者を治療する医師にとって、複雑な臨床的判断を迫られるようになっている。ＣＯＸ−２阻害薬（俗称として「コキシブ（ｃｏｘｉｂ）」とも称される）や他のＣＯＸ阻害薬ＮＳＡＩＤｓの便益が心血管系のリスクに勝るか否かに関する議論が続いている。
【０００４】
ＣＯＸ−２選択的阻害薬は、非常に効果の高い抗炎症性鎮痛薬であり、プロスタノイドの形成を妨害することによりその作用を発揮する。ＣＯＸ−２選択的阻害薬は、変形性関節炎や関節リウマチの症状を緩和し、月経困難症を治療する目的で、臨床上用いられている。
【０００５】
プラシーボ対照群と比較して、ロフェコキシブ治療群で、心血管系有害事象、特に致命的な心筋梗塞（心臓発作）の発生率が有意に増大するという臨床試験の結果を受けて、２００４年９月に、ロフェコキシブは市場から撤退した。続いて、心臓発作と脳卒中のリスクが有意に増大するという臨床試験の結果を受けて、バルデコキシブ（ｖａｌｄｅｃｏｘｉｂ）（ベクストラ（Ｂｅｘｔｒａ）（登録商標）、ファイザー（Ｐｆｉｚｅｒ）社）も市場から撤退した。ＣＯＸ−２阻害薬群が有意に心臓発作や脳卒中の発生率を増大させることが一般に知られるようになった。
【０００６】
ＣＯＸ−２選択的阻害薬により患者の心臓病や脳血管障害（脳卒中）の罹患率が増大する正確な作用機序はわかっていない。ＣＯＸ−２により生成されるプロスタサイクリンが心臓保護効果を発揮するため、実際のリスクの増大は、その発現の減少に関係しているとも考えられる。実際、ＣＯＸ−２阻害と心血管系リスクの増大との関連性を説明する仮説の一つは、プロスタサイクリンレベルの減少により、動脈に血栓が生じやすくなるというものである。ただし、心血管系リスクの出現前に「潜伏期」が存在する。たとえば、メルク（Ｍｅｒｃｋ）社が資金援助をしたＡＰＰＲＯＶｅ試験において、ロフェコキシブ治療群における心臓発作や脳卒中の出現率が顕著に増大するまで１８カ月の潜伏期があった。このため、上記仮説は十分に関連性を説明するものとはいえない。
【発明の概要】
【０００７】
我々は、ＣＯＸ−２阻害薬を含むＣＯＸ阻害薬ＮＳＡＩＤｓの使用が、正常なコレステロール代謝機能を乱し、動脈壁からのコレステロールの効果的な除去を妨害する効果があることを見出した。残留コレステロールの増大は、動脈壁に付着する有害な脂質含有泡沫細胞の生成の増大を伴い、アテローム性動脈硬化や心臓発作を含む心血管障害や脳血管障害（脳卒中）につながる。アテローム性動脈硬化は経時的に悪化するため、心血管系リスクの出現前に「潜伏期」が存在することが説明できる。
【０００８】
コレステロール代謝機能には、マクロファージ・シトクロムｐ４５０・コレステロール２７−ヒドロキシラーゼ（水酸化酵素）（以下、「２７−ＯＨアーゼ」）およびコレステロールの排出を促進することによりコレステロールの蓄積を妨げる他のコレステロール逆輸送系（ＲＣＴ）タンパク質が関わっている。さらに、抗動脈硬化内在性膜タンパク質であるＡＢＣ輸送体（ＡＴＰ結合カセットトランスポーター）Ａ１（以下、「ＡＢＣＡ１」）も、ＲＣＴプロセスに関わる因子である。
【０００９】
我々は、ＣＯＸ阻害薬ＮＳＡＩＤｓおよびＣＯＸ−２選択的阻害薬がＲＣＴタンパク質２７−ＯＨアーゼおよびＡＢＣＡ１の発現を抑制することにより、コレステロール代謝を乱し、コレステロールの排出を低下させて、コレステロールを残留させ、脂質含有泡沫細胞を生成させることを見出した。脂質含有泡沫細胞は、動脈壁に付着してプラークを形成して、アテローム性動脈硬化という心血管系に有害な状況を引き起こし、心臓発作や脳卒中という心血管系有害事象のリスク増大につながる。したがって、我々は、ＣＯＸ阻害およびＣＯＸ−２阻害がアテローム発生効果をもたらし、この薬剤群を長期間使用することにより、アテローム性動脈硬化症（ＡＳＣＶＤ）が進行するリスクを高める役割を果たすという結論に達した。
【００１０】
本発明は、ＣＯＸ−２選択的阻害薬または他のＣＯＸ阻害薬ＮＳＡＩＤｓの使用によると考えられる心血管障害および脳血管障害やアテローム性動脈硬化に関係するものを含むヒト等の哺乳類における有害事象のリスク増大を抑制する方法に関する。本発明は、また、このような方法に有用な医薬組成物に関する。本明細書において用いられる用語「心血管系事象」は、ＡＳＣＶＤおよび／またはコレステロール代謝の異常に起因する心筋梗塞や脳卒中等の有害事象を意味する。
【００１１】
本発明の方法は、ＣＯＸ阻害薬またはＣＯＸ−２選択的阻害薬の使用により生じるコレステロール代謝機能の異常を修復する工程と、ＣＯＸ阻害薬またはＣＯＸ−２選択的阻害薬の使用により引き起こされる脂質含有泡沫細胞の生成を抑制する工程と、を備える。医薬的に許容可能なアデノシンＡ２Ａ受容体作用薬を投与することによって、コレステロール代謝機能の異常を修復し、脂質含有泡沫細胞の生成を抑制する。ＣＯＸ阻害薬またはＣＯＸ−２選択的阻害薬を投与された患者に対するアデノシンＡ２Ａ受容体作用薬の活性または受容体親和性の閾値レベルは、初期濃度０．１μＭであり、最適濃度１μＭである。アデノシンＡ２Ａ受容体作用薬は、Ａ２Ａ受容体を飽和させるのに十分な量、また、コレステロール代謝機能の修復を維持するのに十分な時間間隔で投与される。本明細書において用いられる用語「アデノシンＡ２Ａ受容体作用薬の投与」には、アデノシンＡ２Ａ受容体作用薬の効果的なｉｎ ｓｉｔｕ（その場）生成を可能にする物質の投与も含まれる。
【００１２】
本発明の方法は、正常なコレステロール代謝機能を乱し、脂質含有泡沫細胞の生成につながるＣＯＸ阻害薬またはＣＯＸ−２選択的阻害薬を使用することに起因するヒトのアテローム性動脈硬化型心血管障害や脳血管障害のリスクの増大を抑制する。本発明の方法は、ＣＯＸ阻害薬またはＣＯＸ−２選択的阻害薬により生じるコレステロール代謝機能の異常を修復する工程と、ＣＯＸ阻害薬またはＣＯＸ−２選択的阻害薬の使用により引き起こされる脂質含有泡沫細胞の生成を抑制する工程と、を備える。
【００１３】
本発明の方法は、さらに、ヒトを含む哺乳類にアデノシンＡ２Ａ受容体作用薬を投与することにより、哺乳類におけるアテローム発生を改善する。この場合、アデノシンＡ２Ａ受容体作用薬は、必要に応じて、ヒトのＡ２Ａ受容体を飽和するのに実質的に十分な量を投与する。これにより、投与された被験者のアテローム発生が抑制または妨害される。
【００１４】
本発明の医薬組成物は、医薬的に許容可能なＣＯＸ阻害薬またはＣＯＸ−２選択的阻害薬と、医薬的に許容可能なＡ２Ａ受容体作用薬であって、ＣＯＸ阻害薬またはＣＯＸ−２選択的阻害薬によって乱されたコレステロール代謝機能を修復するのに十分な量のＡ２Ａ受容体作用薬と、を備える。あるいは、本発明の医薬組成物は、ＣＯＸ阻害薬またはＣＯＸ−２阻害薬とアデノシンＡ２Ａ受容体作用薬またはアデノシンＡ２Ａ受容体作用薬の効果的なｉｎ ｓｉｔｕ（その場）生成を可能にする物質との混合物を備える。本発明の医薬組成物は、鎮痛剤または抗炎症薬として有効量、たとえば、これに限定されるものではないが、標準的な薬剤投与量（たとえば、市販されているＣＯＸ−２阻害薬であるセレブレックス（Ｃｅｌｅｂｒｅｘ）の標準的な投与量は、５０、１００、２００および４００ｍｇである）のＣＯＸ阻害薬またはＣＯＸ−２阻害薬と、Ａ２Ａ受容体を飽和するのに十分な量のアデノシンＡ２Ａ受容体作用薬と、を備える。医薬組成物にアデノシンＡ２Ａ受容体作用薬の効果的な生成を可能にする物質（たとえば、アデノシンＡ２Ａ受容体作用薬のｉｎ ｓｉｔｕ（その場）生成を介在するメトトレキサート（ＭＴＸ））を備える場合には、Ａ２Ａ受容体を飽和するのに十分な量のアデノシンＡ２Ａ受容体作用薬が効果的に生成されるだけの量を含有する必要がある。本発明の医薬組成物は、さらに、担体や賦形剤、ＣＯＸ阻害薬またはＣＯＸ−２阻害薬の医薬組成物に通常用いられるような、その他医薬的に許容可能な物質を備えるようにしてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１ａ】種々の投与量レベルでＣＯＸ−２選択的阻害薬であるセレコキシブ（ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ）（セレブレックス（Ｃｅｌｅｂｒｅｘ）（登録商標）、ファイザー（Ｐｆｉｚｅｒ）社）を用いた場合のＡＢＣＡ１の遺伝子発現（図１ａ）およびタンパク質発現（図１ｂ）に及ぼす抑制効果を示す棒グラフ。
【図１ｂ】種々の投与量レベルでＣＯＸ−２選択的阻害薬であるセレコキシブ（ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ）（セレブレックス（Ｃｅｌｅｂｒｅｘ）（登録商標）、ファイザー（Ｐｆｉｚｅｒ）社）を用いた場合のＡＢＣＡ１の遺伝子発現（図１ａ）およびタンパク質発現（図１ｂ）に及ぼす抑制効果を示す棒グラフ。
【００１６】
【図２ａ】種々の投与量レベルでＣＯＸ−２選択的阻害薬であるＮＳ−３９８を用いた場合の２７−ＯＨアーゼ（図２ａ）およびＡＢＣＡ１（図２ｂ）の減少度合いを示す棒グラフ。
【図２ｂ】種々の投与量レベルでＣＯＸ−２選択的阻害薬であるＮＳ−３９８を用いた場合の２７−ＯＨアーゼ（図２ａ）およびＡＢＣＡ１（図２ｂ）の減少度合いを示す棒グラフ。
【００１７】
【図３ａ】種々のＡ２Ａ受容体作用薬およびＣＯＸ−２阻害剤の組み合わせを用いて調べた２７−ＯＨアーゼのレベルに及ぼすアデノシンＡ２Ａ受容体作用薬の効果およびそれらの組み合わせに及ぼすＡ２Ａ拮抗薬の効果（図３ｂおよび図３ｃ）を示す棒グラフ。
【図３ｂ】種々のＡ２Ａ受容体作用薬およびＣＯＸ−２阻害剤の組み合わせを用いて調べた２７−ＯＨアーゼのレベルに及ぼすアデノシンＡ２Ａ受容体作用薬の効果およびそれらの組み合わせに及ぼすＡ２Ａ拮抗薬の効果（図３ｂおよび図３ｃ）を示す棒グラフ。
【図３ｃ】種々のＡ２Ａ受容体作用薬およびＣＯＸ−２阻害剤の組み合わせを用いて調べた２７−ＯＨアーゼのレベルに及ぼすアデノシンＡ２Ａ受容体作用薬の効果およびそれらの組み合わせに及ぼすＡ２Ａ拮抗薬の効果（図３ｂおよび図３ｃ）を示す棒グラフ。
【図３ｄ】種々のＡ２Ａ受容体作用薬およびＣＯＸ−２阻害剤の組み合わせを用いて調べた２７−ＯＨアーゼのレベルに及ぼすアデノシンＡ２Ａ受容体作用薬の効果およびそれらの組み合わせに及ぼすＡ２Ａ拮抗薬の効果（図３ｂおよび図３ｃ）を示す棒グラフ。
【００１８】
【図４ａ】Ａ２Ａ作用薬であるＣＧＳ-２１６８０およびＡ２Ａ作用薬であるメトトレキサート（ＭＴＸ）のＡＢＣＡ１レベルに及ぼす効果がアデノシンＡ２Ａ受容体拮抗薬により抑制されることを示す棒グラフ。
【図４ｂ】Ａ２Ａ作用薬であるＣＧＳ-２１６８０およびＡ２Ａ作用薬であるメトトレキサート（ＭＴＸ）のＡＢＣＡ１レベルに及ぼす効果がアデノシンＡ２Ａ受容体拮抗薬により抑制されることを示す棒グラフ。
【００１９】
【図５】種々の濃度レベルでＭＴＸを用いた場合の２７−ＯＨアーゼのレベルに及ぼすＮＳ−３９８およびＭＴＸの効果を示す棒グラフ。
【００２０】
【図６ａ】２７−ＯＨアーゼのレベルおよびＡＢＣＡ１のレベルに及ぼすＭＴＸ、Ａ２Ａ拮抗薬、アテローム性動脈硬化を促進するサイトカイン、ＩＦＮ−γ、ＮＳ−３９８およびこれらの組み合わせの効果を示す棒グラフ。
【図６ｂ】２７−ＯＨアーゼのレベルおよびＡＢＣＡ１のレベルに及ぼすＭＴＸ、Ａ２Ａ拮抗薬、アテローム性動脈硬化を促進するサイトカイン、ＩＦＮ−γ、ＮＳ−３９８およびこれらの組み合わせの効果を示す棒グラフ。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
我々は、ぜんそくおよび炎症治療法の開発や心筋イメージングに現在用いられているものを含むアデノシンＡ２Ａ受容体作用薬に、ＲＣＴタンパク質の発現を増大させることによって、ＣＯＸ阻害薬またはＣＯＸ−２選択的阻害薬により生じるＲＣＴプロセスの異常を実質的に抑制する予期せぬ効果があることを見出した。Ａ２Ａ受容体作用薬は、さらに、動脈壁に付着して、プラークの沈着やアテローム性動脈硬化を引き起こす有害な脂質含有泡沫細胞の生成を阻害する。
【００２２】
ＲＣＴプロセスの異常を抑制するために有効なＡ２Ａ受容体作用薬の量はごく微量であり、ぜんそくや炎症の治療やイメージングの目的に必要な投与量のほんの一部に過ぎない。Ａ２Ａ受容体作用薬は、ナノモルレベルのＡ２Ａ受容体作用活性を備え、かつ、高親和性Ａ２Ａ受容体部位を飽和するのに十分な量が存在している必要がある。［３Ｈ］ＮＥＣＡを用いて飽和分析を行なったところ、ヒトＡ２Ａアデノシン受容体のＫＤ値は２０ｎＭであった。
【００２３】
所定のＡ２Ａ受容体作用薬の活性半減期が、ＣＯＸ阻害薬またはＣＯＸ−２阻害薬と同時にＡ２Ａ受容体作用薬を投与する決定要因となる。すなわち、所定のＡ２Ａ受容体作用薬活性半減期により必要な投与回数が決まる。Ａ２Ａ受容体作用薬の投与は、Ａ２Ａ受容体部位を飽和状態に保つために必要な時間間隔で行なう必要がある。ＣＧＳ−２１６８０（０．３ｍｇ／ｋｇ）の静脈内投与後のラットにおける終末相半減期は非常に短い（１９±４分）が、新しい薬剤は先行する薬剤に比べてより長い半減期を持つ。
【００２４】
Ａ２Ａ受容体の飽和状態を保つために必要な量および受容体の飽和状態を保つために必要な（Ａ２Ａ作用薬の半減期に応じた）期間を許容可能なリスクレベルに応じたものにすることにより、ＣＯＸ阻害薬またはＣＯＸ−２阻害薬の投与と同時にＡ２Ａ作用薬を長期間にわたって投与した場合に考えられる副作用を最小限に抑える。
【００２５】
アデノシンＡ２Ａ作用薬は他の受容体部位に対する活性も持つことが多いが、Ａ２Ａ受容体に特異的なＡ２Ａ作用薬は、効率が高く、コレステロール代謝機能の修復に関係しない他のアデノシン受容体の活性により生じる副作用を最小限に抑えることができる可能性が高い。現在のところ、別の受容体に対する活性も有する既存のＡ２Ａ作用薬に加えて、新しい特異的Ａ２Ａ作用薬の開発が進められており、ヒトへの使用が承認される様々な段階にある。他に特に規定しない限り、「Ａ２Ａ受容体作用薬」には、Ａ２Ａ受容体作用薬のｉｎ ｓｉｔｕ（その場）生成を介在する役割を果たす物質が含まれる。
【００２６】
現在知られているアデノシン受容体サブタイプとしては、Ａ１、Ａ２Ａ、Ａ２ＢおよびＡ３があるが、本発明に従うＲＣＴ修復に効果があるのは、Ａ２Ａ受容体部位の活性のみである。アデノシン自体の半減期は非常に短く、直接投与しても効果を発揮することはできない。本発明に従うＲＣＴ修復にＡ２Ａ受容体作用薬として効果のある適当な物質を以下に挙げる。メトトレキサート（ＭＴＸ）は、ヒトへの使用が承認されており、がんの治療に大量投与で、また、関節リウマチ（ＲＡ）の治療選択薬としてより少量の投与で用いられる。ＭＴＸは、それ自体がＡ２Ａ作用薬なのではなく、Ａ２Ａ作用薬としての活性を有するアデノシン放出を介在する。したがって、ＭＴＸは、本明細書で言うところのＡ２Ａ作用薬としての活性を持つ。実験的に利用可能な（ヒトへの使用は未承認）ＣＧＳ-２１６８０は、（他の受容体に対する活性を有してはいるが）主にＡ２Ａ作用薬として働き、コレステロール代謝機能の修復に有効な物質である。
【００２７】
開発されたおよび／またはヒトへの使用が承認された本発明に有用な他のＡ２Ａ受容体作用薬としては、ビノデノソン（ｂｉｎｏｄｅｎｏｓｏｎ）（ＣｏｒＶｕｅ（登録商標））、ＭＲＥ−００９４、ＵＫ−３７１１０４、ＡＴＬ３１３、レガデノソン（ｒｅｇａｄｅｎｏｓｏｎ）（レキスキャン（Ｌｅｘｉｓｃａｎ）（登録商標））、アパデノソン（ａｐａｄｅｎｏｓｏｎ）、ＡＰＥＣおよび２ＨＥ−ＮＥＣＡが挙げられる。
【００２８】
以下、本明細書で用いた実験方法、物質および結果を詳述する。
【００２９】
ＴＨＰ−１ヒト単球およびマクロファージにおけるコレステロール排出に関係するいくつかのタンパク質の発現に及ぼすＣＯＸ阻害剤の効果を評価した。我々は、ＣＯＸ−１および／またはＣＯＸ−２の薬理学的阻害作用が、２７−ＯＨアーゼおよびＡＢＣＡ１の発現を低下させて、泡沫細胞形成の増大とアテローム性動脈硬化を引き起こすことを見出した。
【００３０】
図１ａおよび図１ｂに、１０μＭおよび５０μＭの投与濃度でセレコキシブを用いた場合にＡＢＣＡ１遺伝子発現とタンパク質発現が減少する様子を示す。この結果から、少なくとも部分的に、ＣＯＸ阻害に伴うアテローム生成性向を説明することができる。ＣＯＸ−２選択的阻害薬であるＮＳ−３９８は、図２ａおよび図２ｂに示すように、ＴＨＰ−１単球およびマクロファージにおける２７−ＯＨアーゼおよびＡＢＣＡ１のメッセージおよびタンパク質を用量依存的に著しく減少させた。ＮＳ−３９８は、ＴＨＰ−１における２７−ＯＨアーゼのｍＲＮＡを対照群の６２．４±２．２％まで減少させた（５０μＭ、ｎ＝３、ｐ＜０．００１）。ＮＳ−３９８で処理したＴＨＰ−１マクロファージ群は、未処理細胞群と比べて、脂質含有泡沫細胞形成に対するぜい弱性が増大し、ＴＨＰ−１マクロファージ群では、対照群と比べて、ＮＳ−３９８の存在下で泡沫細胞形質転換の著しい増加がみられた（４２．７±６．６％対２０．１±３．４％、ｐ＝０．０４）。
【００３１】
我々は、また、免疫反応物質が、コレステロールを循環系を介して最終的に排出させるための細胞外への逆輸送に関係する二つのタンパク質、すなわち、コレステロール２７−ＯＨアーゼおよびＡＢＣＡ１、の発現を低下させることによって、コレステロール過負荷に対する細胞防御を阻害することを見出した。図６ａおよび図６ｂに示すように、アテローム性動脈硬化促進サイトカインＩＦＮ−γが、ヒトＴＨＰ−１単球／マクロファージにおける２７−ＯＨアーゼおよびＡＢＣＡ１のメッセージおよびタンパク質の発現を減少させることも見出した。
【００３２】
さらに、ＩＦＮ−γ処理したＴＨＰ−１マクロファージ群では、未処理細胞の対照群と比べて、泡沫細胞の形成速度および割合が増大した。ＴＨＰ−１単球／マクロファージにおけるシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）阻害は、用量依存的に２７−ＯＨアーゼおよびＡＢＣＡ１を減少させることにより、アテローム生成を促進させる作用がある。ＴＨＰ−１マクロファージ群は、対照群と比較して、ＣＯＸ−２選択的阻害薬であるＮＳ−３９８の存在下で泡沫細胞形質転換を著しく増大させた。これは、コレステロール逆輸送系（ＲＣＴ：Reverse cholesterol transport）の低下または異常が、ＣＯＸ−２阻害剤で治療した患者における周知の心血管系のリスクの増大に寄与していることを示す。
【００３３】
我々は、これらのタンパク質が、ＣＧＳ−２１６８０およびＭＲＥ−００９４を含む特異的Ａ２Ａ作用薬を用いたアデノシンＡ２Ａ受容体の活性を介して、コレステロール代謝機能の正常化に向けての上方制御が可能であることを見出した。Ａ２Ａ受容体のライゲーション（連結反応）は、コレステロール負荷条件下でマクロファージの泡沫細胞形質転換を阻害した。我々は、メトトレキサート（ＭＴＸ：methotrexate）が、コレステロール代謝および泡沫細胞形成に対するぜい弱性を変化させて、ＩＦＮ−γまたはＣＯＸ−２選択的阻害薬に暴露させたＴＨＰ−１単球／マクロファージにおけるコレステロール過負荷性向を低下させることを見出した。ＭＴＸは、アデノシンを放出させることによって、アテローム性動脈硬化症（ＡＳＣＶＤ：atherosclerotic cardiovascular disease）を防ぐ役割を果たす。ＭＴＸは、アデノシンＡ２Ａ受容体作用薬自体ではないが、Ａ２Ａ受容体作用活性を有するアデノシン供給源となるため、本発明の範囲内においてＡ２Ａ受容体作用薬に含まれる。
【００３４】
以下に詳述するように、我々は、ＣＯＸ−２阻害薬類がＲＣＴプロセスの周知のコレステロール代謝機能を乱し、その結果、コレステロールの残留および脂質含有泡沫細胞の形成を引き起こすことを立証した。図１ａおよび図１ｂに、セレコキシブには、対照群と比べて、ＡＢＣＡ１遺伝子およびタンパク質の発現を低下させる効果があることを示す。図２ａおよび図２ｂに、ＣＯＸ−２阻害薬ＮＳ−３９８により、ＴＨＰ−１における２７−ＯＨアーゼが用量依存的で連続的に減少する様子（図２ａ）およびＴＨＰ−１におけるＡＢＣＡ１が用量依存的で連続的に減少する様子（図２ｂ）を示す。
【００３５】
さらに、我々は、アデノシンＡ２Ａ受容体作用薬が、コレステロール代謝機能を修復することを証明した。図３ａにＡ２Ａ作用薬であるＣＧＳ−２１６８０を用いた場合にＴＨＰ−１における２７−ＯＨアーゼレベルが改善する様子を示す。図３ｃ、図３ｄおよび図５に、ＭＴＸを用いた場合に、ＮＳ−３９８によって減少したレベルから２７−ＯＨアーゼレベルが改善する様子を示す。図４ｂに、ＭＴＸを用いた場合に、ＭＳ−３９８によって減少したＡＢＣＡ１メッセージが改善する様子を示す。
【００３６】
また、我々は、アデノシンＡ２Ａ受容体の活性がコレステロール代謝機能の異常および修復の制御に関与していることを証明した。図３ｂに、Ａ２Ａ作用薬であるＡＴＬ３１３に、ＴＨＰ−１における２７−ＯＨアーゼレベルを上昇させる効果があることを示す。ＡＴＬ３１３がＴＨＰ−１マクロファージにおける２７−ＯＨアーゼのメッセージを増大させる役割を果たす一方、ＺＭ−２４１３８５（ＺＭ）は逆の働きを示す。図３ｂの４本の棒グラフが示すＴＨＰ−１マクロファージの処理条件は、左から右にそれぞれ以下の通りであった。１）０．５ｎＭのＤＭＳＯ（賦形剤）に１８時間、２）１０ｎＭのＡＴＬ３１３に１８時間、３）１０-5ＭのＺＭで１時間予備培養後、さらに１０ｎＭのＡＴＬ３１３に１８時間、４）１０-5ＭのＣＧＳ−２１６８０で１８時間。総ＲＮＡを抽出させて、ＱＲＴ−ＰＣＲ（定量ポリメラーゼ連鎖反応）で２７−ＯＨアーゼのｍＲＮＡに対する評価を行なった。ＧＡＰＤＨメッセージ増幅を内部コントロールとして用いた。
【００３７】
様々な組み合わせのＣＯＸ−２選択的阻害薬およびアデノシンＡ２Ａ受容体作用薬を用いた場合の２７−ＯＨアーゼおよびＡＢＣＡ１のレベルを定量した（ＭＴＸはＡ２Ａ受容体作用薬特性を有するアデノシンの生成を介在するため、本明細書では説明を簡単にするために、Ａ２Ａ作用薬の一つとみなす）。
【００３８】
上述したように、試験に用いたＮＳ−３９８（利用可能なＣＯＸ−２選択的阻害薬）およびセレコキシブ（米国において唯一市販されているＣＯＸ−２選択的阻害薬）は、いずれも、コレステロール代謝機能の異常を引き起こした。特異的Ａ２Ａ受容体作用薬であるＭＴＸ、ＣＧＳ−２１６８０、ＭＲＥ−００９４およびＡＴＬ３１３は、すべて、コレステロール代謝機能を修復させた。
図３ｂないし図３ｄ、図４ａ、図４ｂ、図６ａおよび図６ｂに示すように、Ａ２Ａ受容体部位をブロックする周知のＡ２Ａ拮抗薬であるＺＭ−２４１３８５を用いた場合に、Ａ２Ａ作用薬によるコレステロール代謝機能の修復が妨害されることは、Ａ２Ａ受容体活性が修復に関係していることの証拠となる。
【００３９】
ＭＴＸは、アデノシンの放出と心血管系のリスクの両方に影響を与えることが知られているため、ＭＴＸを用いて、コレステロール代謝および泡沫細胞形成に対するぜい弱性に変化が生じたか否かを判定した。我々は、ＭＴＸ処理が、ＩＦＮ−γまたはＣＯＸ−２選択的阻害薬に暴露させたＴＨＰ−１単球／マクロファージにおけるコレステロール過負荷性向を低下させることを見出した。したがって、ＭＴＸは、コレステロール流出に関与する坑アテローム生成分子の発現を増大させることによって、アテローム性動脈硬化症（ＡＳＣＶＤ）を防ぐ役割を果たす。
【００４０】
ＭＴＸは、単球性細胞株に加えて、末梢血から単離した正常単球において、２７−ＯＨアーゼを増加させる。直接的な生理作用の証拠となるように、末梢血単球として、人体から直接採取した一次細胞を用いた。
【００４１】
セレコキシブすなわちセレブレックス（ファイザー（Ｐｆｉｚｅｒ）社の登録商標）は、直接、培養ＴＨＰ−１単球に採用して、ＡＢＣＡ１を減少させる。これは、ＣＯＸ−２阻害薬であるＮＳ−３９８を用いた結果は、ヒトに用いられる他のＣＯＸ阻害薬にも一般化できることを示している。ＣＯＸ−２サイレンシングの研究により、非薬理学的方法によるＣＯＸ−２遺伝子のスイッチオフも同様に作用することがわかった。
【００４２】
セレコキシブは、ＴＨＰ−１マクロファージにおける泡沫細胞形成を増大させるため、セレコキシブは、遺伝子発現に影響を与えるのみではなく、アデノシンの放出に関与する経路を介して、コレステロールを除去し、脂質の過負荷（アテローム性動脈硬化につながるプラーク形成を開始する重要なプロセス）を防御する細胞の能力を弱める。
【００４３】
ＭＴＸに加え、Ａ２Ａ作用薬であるＣＧＳ−２１６８０も、マウス単球およびヒト単球における２７−ＯＨアーゼおよびＡＢＣＡ１のメッセージを増大させることが見出された。
【００４４】
アデノシンの効果を再現するまたはブロックする数多くの様々な受容体特異性の高いアデノシン受容体作用薬および拮抗薬が開発されている。我々は、選択的Ａ２Ａ受容体作用薬である２−（４−（２−カルボキシエチル）フェネチルアミノ）−５’−Ｎ−エチルカルボキサミドアデノシン（ＣＧＳ−２１６８０）を１０-5Ｍの濃度（３時間、３７℃、５％ＣＯ2条件）で用いたところ、Ｂａｌｂ／ｃマウスマクロファージにおける２７−ＯＨアーゼのｍＲＮＡ発現が４７±６．２％（各群ｎ＝３、スチューデントのｔ検定、ｐ＜０．００２）増大した。これは、内因性物質による２７−ＯＨアーゼのｍＲＮＡ発現の上方制御を最初に実証したものであると考えられる。ＣＧＳ−２１６８０に暴露させたマウス細胞における２７−ＯＨアーゼの上方制御に基づいて、ヒト単球様細胞における同様の効果を実証した。ＴＨＰ−１細胞において、ＡＢＣＡ１のｍＲＮＡは２７−ＯＨアーゼに合わせて増加した。Ａ２Ａ受容体拮抗薬であるＺＭ−２４１３８５の存在下および非存在下で、ＴＨＰ−１細胞をＣＧＳ−２１６８０に暴露させたところ、図４ａに示すように、拮抗薬の存在下では、２７−ＯＨアーゼおよびＡＢＣＡ１のメッセージレベルがいずれも増加しないことがわかった。
【００４５】
ＴＨＰ−１細胞において、ＣＧＳ−２１６８０は、用量依存的に１．８倍まで２７−ＯＨアーゼのメッセージを増大させた。より選択的なＡ２Ａ受容体作用薬であるＭＲＥ−００９４は、ＴＨＰ−１における２７−ＯＨアーゼ（２倍）およびＡＢＣＡ１（１．８倍）のｍＲＮＡ発現を増大させた。Ａ２Ａ受容体拮抗薬であるＺＭ−２４１３８５は、これら２７−ＯＨアーゼおよびＡＢＣＡ１のメッセージを増大させるＭＲＥ−００９４の効果を抑制した。
【００４６】
最近まで、静脈内投与が必要であることと、化合物の半減期が短いことが、Ａ２Ａ受容体作用薬の臨床的使用の大きな障害となっていた。新しく開発された持続性経口活性Ａ２Ａ受容体リガンドには、新しい有望な作用薬であるＡＴＬ３１３が含まれている。ＡＴＬ３１３は、培養下のＴＨＰ−１マクロファージにおいて強力な抗アテローム生成効果を発揮し、この結果は、ＣＧＳ−２１６８０を用いた結果と合致する。図３ｂに示すように、ＡＴＬ３１３は、ＴＨＰ−１マクロファージにおける２７−ＯＨアーゼおよびＡＢＣＡ１のｍＲＮＡおよびタンパク質を増加させ、一方、ＺＭ−２４１３８５は、これらの効果をブロックする。
【００４７】
ＲＣＴ修復にＡ２Ａ受容体の身が特異的に関わっていることを実証するために、以下の試験を行なった。
【００４８】
ＣＧＳ−２１６８０は、アデノシンＡ２Ａ受容体の活性剤として用いたところ、２７−ＯＨアーゼレベルに対するＮＳ−３９８の効果が抑制された。ただし、ＣＧＳ−２１６８０はＡ１受容体に結合する等他の作用を行なう可能性があるため、Ａ２Ａ受容体のライゲーションがＣＯＸ−２効果の抑制に関与していると結論付けることはできない。
【００４９】
効果にＡ２Ａが介在していることを確認する重要な局面として、Ａ２Ａ受容体をブロックしてオンできないようにするＡ２Ａ拮抗薬であるＺＭ−２４１３８５を加えてＡ２Ａ受容体をブロックした場合に、効果の喪失が生じた。ＣＯＸ−２阻害薬を（アデノシンの放出を引き起こす）ＭＴＸと混ぜた場合、ＭＴＸは、ＺＭ−２４１３８５の存在下でＣＯＸ−２阻害薬が２７−ＯＨアーゼおよびＡＢＣＡ１を減少させることを妨げられなかった。これにより、ＭＴＸすなわちＡ２Ａ作用薬は、一般的にＡ２Ａ受容体にアクセスできない状態では作用不能であることがはっきりと示された。
【００５０】
ヒトに投与可能な経口投与および経口活性薬剤であるＭＴＸおよびＡＴＬ３１３を以下に説明するようにテストした。
【００５１】
Ａ２Ａ受容体作用薬ＣＧＳ−２１６８０の効果を調べたが、ＣＧＳ−２１６８０は注入による投与が必須があり、現在のところ、ヒトではなく動物に実験的に用いられるものであるため、ＣＧＳ−２１６８０の使用が不都合な可能性があることに注目する必要がある。メトトレキサートおよび特異的Ａ２Ａ薬剤であるＡＴＬ３１３（アデノシンセラピューティクス（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）社により開発）は、いずれも経口活性があり、一連のＡＴＬアデノシンＡ２Ａ作用薬は、臨床試験中であるか、様々な疾患に対してヒトへの使用承認が近い状態である。ＡＴＬ３１３を、餌に混ぜて、最初は６時間ごとに５μｇ／ｋｇの量で、敗血症のマウス検体に対して投与した。餌に混ぜるＡＴＬ３１３の投与量を、その後、３０μｇ／ｋｇ／日とした。ヒト関節リウマチに対する典型的なＭＴＸの投薬処方は、１０ｍｇ／週のＭＴＸ投与量で開始して、第８週目までに２０ないし２５ｍｇ／週に用量増加させる。
【００５２】
Ａ２Ａ作用薬としてＭＴＸを、また、ＣＯＸ−２阻害薬としてＮＳ−３９８を用いた試験を以下に説明するように実施したところ、泡沫細胞形成が減少した。
【００５３】
脂肪過負荷マクロファージ由来の泡沫細胞は、アテローム性動脈硬化のすべての段階で基本的な役割を果たす。ＮＳ−３９８へのマクロファージの暴露とコレステロール過負荷を防御する細胞の能力との間に、直接的な生理学的因果関係があることが示された。一連の実験を行なった結果、アセチル化ＬＤＬの存在下でＮＳ−３９８に暴露することによりＴＨＰ−１マクロファージからの泡沫細胞形成が顕著に増大すること、ならびに、この泡沫細胞形成増大効果がＭＴＸにより軽減されることが実証された。ＭＴＸによる増大効果の軽減は、Ａ２Ａ受容体の活性に起因するものであるため、ＺＭ−２４１３８５がＭＴＸによるＮＳ−３９８誘導泡沫細胞形成の低下を妨害することがわかった。コレステロール２７−ＯＨアーゼおよびＡＢＣＡ１に対するＭＴＸおよびＮＳ−３９８の効果は、脂肪暴露ＴＨＰ−１マクロファージで見られる生理学的現象と密接に関係している。
【００５４】
方法：材料およびソース
このセクションでは、ａ）ＣＯＸ阻害薬によるコレステロール代謝異常、ｂ）２７−ＯＨアーゼおよびＡＢＣＡ１レベルにより測定したコレステロール代謝の修復、およびｃ）２７−ＯＨアーゼおよびＡＢＣＡ１レベルにより測定したコレステロール代謝の異常および修復の両方にＡ２Ａ受容体のみが関わっていることを示すために行なわれる、以下のすべての実験に用いられる生体物質（生物材料）を含む材料の概要を示す。
【００５５】
細胞および試薬
ＴＨＰ−１単球は、アメリカ合衆国培養細胞系保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣ、バージニア州マナッサス）から入手した。Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色色素およびＯｐｔｉＰｒｅｐ密度勾配遠心分離媒体は、シグマ（Ｓｉｇｍａ）社から購入した（ミズーリ州セントルイス）。トリゾール（ＴＲＩｚｏｌ）試薬は、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社（ニューヨーク州グランドアイランド）から購入した。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）試薬は、すべてアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社、ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）社から購入した。組み換えヒトＩＦＮ−γは、Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）社（ミネソタ州ミネアポリス）から購入した。ＮＳ−３９８は、ＲＢＩシグマ（ＲＢＩ−Ｓｉｇｍａ）社（マサチューセッツ州ナティック）から購入した。ＭＴＸは、ベッドフォード・ラボラトリーズ（Ｂｅｄｏｆｏｒｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社（オハイオ州ベッドフォード）から購入した。アセチル化ＬＤＬは、イントラセル（Ｉｎｔｒａｃｅｌ）社（ワシントン州イサクアー）から購入した。抗コレステロール２７−ＯＨアーゼ抗体は、コレステロール２７−ＯＨアーゼタンパク質の１５−２８残基に対するウサギのアフィニティー精製抗ペプチドポリクロナール抗体である。
【００５６】
生体物質の調整
細胞培養
ＴＨＰ−１単球を５％ＣＯ2雰囲気下３７℃で細胞１０6個／ｍｌの密度まで増殖させ。ＴＨＰ−１細胞の増殖培地として、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ：Fetal Bovine Serum）（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社、ニューヨーク州グランドアイランド）、５０ユニット／ｍｌのペニシリンおよび５０ユニット／ｍｌのストレプトマイシンを加えたＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）を用いた。マクロファージへの分化を促進するために、１２ウェルプレートでＴＨＰ−１単球（細胞１０6個／ｍｌ）を１００ｎＭのＰＭＡ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）社）で３７℃４日間処理した。
【００５７】
ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞、peripheral blood mononuclear cell）単離
健康なドナーから採取した血液をＥＤＴＡ処理管に入れて、プール処理し、４℃で保持する。メーカーの使用説明書に従って、ＯｐｔｉＰｒｅｐ密度勾配遠心分離媒体（シグマ（Ｓｉｇｍａ）社）を加えて、プール処理した血液の濃度を１．１２０ｇ／ｍｌに調整した。次に、１０％ＦＳＢおよびＯｐｔｉＰｒｅｐ媒体を含有する完全ＲＰＭＩ培地から成る１．０７４ｇ／ｍｌ濃度の溶液を血液に重層した。その上に１０％ＦＳＢを含有する完全ＲＰＭＩ培地を重層して、単球がプラスチック管にくっつかないようにした。血液を７５０Ｇ、４℃で３０分間遠心分離した。遠心分離後、１．０７４ｇ／ｍｌ濃度の溶液層とＲＰＭＩ培地層の間から、間期単球を採取した。採取した細胞を２容量の完全ＲＰＭＩ培地で希釈して、遠心分離により採取した。得られたペレットを完全ＲＰＭＩ培地に再懸濁させた。血球計で単球の数を計測し、２×１０6個／ウェルの細胞密度で６ウェルプレートを作成した。
【００５８】
方法：ＣＯＸ阻害剤とアデノシンＡ２Ａ作用薬および拮抗薬との組み合わせ
ＴＨＰ−１細胞
ＴＨＰ−１細胞を１０6個／ｍｌまで増殖させた後、培地を吸引し、カルシウムとマグネシウムを含まないダルベッコ・リン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ：Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline）で細胞を２回洗浄した。次に、以下の条件下で単球を６ウェルプレートで２４ないし４８時間培養した（３７℃、５％ＣＯ2）。ａ）ＲＰＭＩコントロール、ｂ）ＭＴＸ（５ｍＭ）含有ＲＰＭＩ、ｃ）ＮＳ−３９８（５０μＭ）含有ＲＰＭＩ、ｄ）ＮＳ−３９８（５０μＭ）およびＭＴＸ（含有量を０．１μＭ、０．５μＭ、５μＭと増加）含有ＲＰＭＩ、ｅ）ＩＦＮ−γ（５００Ｕ（ユニット）／ｍｌ）含有ＲＰＭＩ、およびｆ）ＩＦＮ−γ（５００Ｕ（ユニット）／ｍｌ）およびＭＴＸ（５μＭ）含有ＲＰＭＩ。
【００５９】
ＴＨＰ−１マクロファージを以下の条件で処理した。ａ）ＲＰＭＩコントロール、ｂ）ＺＭ−２４１３８５（１０μＭ）含有ＲＰＭＩ、ｃ）ＭＴＸ（５μＭ）含有ＲＰＭＩ、ｄ）ＩＦＮ−γ（５００Ｕ（ユニット）／ｍｌ）含有ＲＰＭＩ、ｅ）ＩＦＮ−γ（５００Ｕ（ユニット）／ｍｌ）およびＭＴＸ（５μＭ）含有ＲＰＭＩ、ｆ）ＺＭ−２４１３８５（１０μＭ）およびＭＴＸ（５μＭ）含有ＲＰＭＩ、ｇ）ＩＦＮ−γ（５００Ｕ（ユニット）／ｍｌ）、ＺＭ−２４１３８５（１０μＭ）およびＭＴＸ（５μＭ）含有ＲＰＭＩ、およびｈ）ＮＳ−３９８（５０μＭ）、ＺＭ−２４１３８５（１０μＭ）およびＭＴＸ（５μＭ）含有ＲＰＭＩ。
【００６０】
培養期間後直ちに、細胞を採取して、室温で１５００ＲＰＭで遠心分離した。培地を吸引して、細胞タンパク質およびＲＮＡを単離した。図６ａおよび図６ｂに得られた２７−ＯＨアーゼおよびＡＢＣＡ１レベルの測定値を示す。
【００６１】
ＰＢＭＣ
５μＭの濃度でＭＴＸを添加したまたは添加しない１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ培地で１８時間ＰＢＭＣを培養した。細胞を採取して、ＲＮＡを単離した。
【００６２】
ＴＨＰ−１およびＰＢＭＣの他の実験条件として、以下のパラメータおよび条件を採用した。ＴＨＰ−１単球を細胞１０6個／ｍｌまで増殖させた後、培地を吸引し、カルシウムとマグネシウムを含まないダルベッコ・リン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）で細胞を２回洗浄した。次に、以下の条件下で単球を６ウェルプレートで培養した（３７℃、５％ＣＯ2）。ａ）ＲＰＭＩコントロール、ｂ）１０μＭのＮＳ−３９８（１８時間）、ｃ）５０μＭのＮＳ−３９８（１８時間）、ｄ）１０μＭのセレコキシブ（１８時間）、ｅ）５０μＭのセレコキシブ（１８時間）、ｆ）ＩＦＮ−γ（５００Ｕ（ユニット）／ｍｌ）、ｇ）５０ｎＭのｓｉＲＮＡ（２４時間）、およびｈ）５０ｎＭのｍｏｃｋ ｓｉＲＮＡ（２４時間）。
【００６３】
ＴＨＰ−１マクロファージに、５０μｇ／ｍｌのアセチル化ＬＤＬでコレステロールを負荷し、Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色を行なう前に、さらに４８時間培養した。培養期間後直ちに、細胞を採取して、室温で１５００ＲＰＭで遠心分離した。培地を吸引して、細胞タンパク質およびＲＮＡを単離した。
【００６４】
５０μＭの濃度でセレコキシブを添加したまたは添加しない１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ培地で１８時間ＰＢＭＣを培養した。細胞を採取して、ＲＮＡを単離した。
【００６５】
結果
ＲＮＡ単離および定量
１０6個の細胞に対して１ｍｌのトリゾール試薬を用いて、ＲＮＡを単離して、ヌクレアーゼを含まない水に溶解させた。紫外分光光度法（日立Ｕ２０１０分光光度計）によりクオーツキュベットを用いて、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍの波長の吸収から、各条件におけるＲＮＡの総量を測定した。
【００６６】
２７−ＯＨアーゼのＲＴ−ＰＣＲ分析
リアルタイムＰＣＲで２７−ＯＨアーゼおよびＡＢＣＡ１のｍＲＮＡを定量した。オリゴｄＴに感作されたＭ−ＭＬＶ逆転写酵素を用いて、ｃＤＮＡを５μｇの総ＲＮＡから複製した。コレステロール２７−ＯＨアーゼ特異的プライマーまたはＡＢＣＡ１特異的プライマーならびにグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ：glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）コントロールプライマーを用いたＰＣＲ増幅を行なうために、各ＲＴ（逆転写酵素）反応混合物から同量のｃＤＮＡを採取した。コレステロール２７−ＯＨアーゼ特異的プライマーは、ヒトコレステロール２７−ＯＨアーゼのｃＤＮＡ（２４）のヌクレオチド４９１−８０２を包含する３１１塩基対配列から成る。ＡＢＣＡ１プライマーは、２３４塩基対増幅断片から成る。サイバーグリーン（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ）ＰＣＲ試薬キット（アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社）を用いて、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ＭＸ３００５Ｐ ＱＰＣＲ（定量ＰＣＲ）システムでリアルタイムＰＣＲ分析を行なった。
【００６７】
以下の手法でＰＣＲを行なった。各ＰＣＲ反応には、２．５μｌの１０ｘグリーンフルオレッセント（緑色蛍光）バッファと、３μｌの２５ｍＭ ＭｇＣｌ2、２μｌのｄＮＴＰ混合物（２５００μＭのｄＣＴＰ、２５００μＭのｄＧＴＰ、２５００μＭのｄＡＴＰおよび５０００μＭのｄＵＴＰ）、０．１５μｌのポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社）、０．２５μｌのウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）（１Ｕ／μｌＵＮＧ、ＡｍｐＥｒａｓｅ、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社）、０．５μｌのフォワード（順方向）およびリバース（逆方向）プライマー（１０μＭ濃度）、および４μｌのｃＤＮＡを用いて、水で最終的な容量を２５μｌに調整した。温度サイクルパラメータとして以下の条件を用いた。９５℃で５分間保持することによりポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社）を活性化させた後、９５℃で３０秒間、５８℃で４５秒間、７２℃で４５秒間のサイクルを４５サイクル繰り返す。各反応を３回ずつ（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅで）行なった。
【００６８】
メーカー（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））から提供されたソフトウェアを用いて、ＰＣＲ生成物の量を推定した。ＰＣＲサイクルの完了後、６０℃から９５℃まで３５℃の温度勾配で、反応物質を熱変性させた。検体間のｃＤＮＡ量の差を補正するために、ターゲットＰＣＲを内在性ハウスキーピング遺伝子であるグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）およびβアクチンを用いたリファレンスＰＣＲで正規化した。有意なレベルの汚染物質の有無をチェックするために、各プライマー対にはテンプレートではないコントロールを含有させた。蛍光発光スペクトルを監視し、分析した。特定の蛍光が検出可能な閾値サイクル（ＣＴ値）を用いて、ＰＣＲ生成物を測定した。ＣＴ値は、動態解析に用いられ、検体における目標複製量の初期値に比例する。融解曲線解析を行ない、ＰＣＲ増幅生成物の特異性の評価を行なった。連続希釈ＣＴ値を対照群と比較後、検体の量を算出した。精製したＰＣＲ生成物を１：１０に連続希釈することにより、ＱＲＴ−ＰＣＲ標準を調整した。
【００６９】
ウエスタンブロット
ＲＩＰＡ（放射性免疫沈降法）溶解バッファ（９８％ＰＢＳ、１％Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ−６３０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム［ＳＤＳ：sodium dodecyl sulfate］）を用いて、ウエスタン免疫ブロット用に全細胞溶解物を調整した。１００μｌのＲＩＰＡ溶解バッファと１０μｌのプロテアーゼ・インヒビター・カクテル（シグマ（Ｓｉｇｍａ）社）を各条件下の細胞ペレットに加えて、５分ごとにボルテックスを行ないながら、氷上で３５分間培養した。エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）５４１５Ｃ遠心分離機を用いて、１０分間、４℃、１０，０００Ｇで遠心分離後、上澄みを採取した。日立Ｕ２０１０分光光度計を用いて、５６０ｎｍの波長の吸収から、各上澄みに含まれるタンパク質の量を測定した。
【００７０】
全細胞溶解物を用いて、ウエスタンブロットを行なった。タンパク質検体（２０μｇ／レーン）を５分間沸騰させて、１０％ポリアクリルアミドゲル上に載せて、１００Ｖで１．５時間電気泳動を行なった後、半乾きのトランスブロット装置内のニトロセルロース膜に移して、１００Ｖで１時間処理した。ニトロセルロース膜は、４℃で４時間ブロッキング溶液（３％脱脂粉乳の１ｘＴｗｅｅｎ２０トリス緩衝食塩水［ＴＴＢＳ：1xTween20-tris-buffered saline］溶解液）でブロッキングした後、４℃で一晩、一次抗体（１８．７μｇ／ｍｌ）とブロッキング溶液の１：３００希釈液に浸漬した。一次抗体として、コレステロール２７−ＯＨアーゼタンパク質の１５−２８残基に対するウサギのアフィニティー精製抗ペプチドポリクロナール抗体を用いた。次の日に、膜をＴＴＢＳで５分間ずつ５回洗浄したのち、ＥＣＬロバ抗ウサギＩｇＧ西洋わさびペルオキシダーゼ結合種特異全抗体（アマシャム・バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社、製品コードＮＡ９３４）の１：３０００希釈液で室温で培養した。ＴＴＢＳで５回洗浄を繰り返したのち、ＥＣＬウエスタンブロット検出試薬（アマシャム・バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社、カタログ番号ＲＰＮ２１０６）およびＳＲＸ−１０１Ａ（コニカミノルタ（Ｋｏｎｉｃａ Ｍｉｎｏｌｔａ））を用いたフィルム現像により、免疫反応性タンパク質を検出した。
【００７１】
対照群として、同じ膜上で、マウス抗βアクチン（１：１０００希釈液、アブカム（ａｂＣａｍ）社、製品コードａｂ６２７６）およびＥＣＬヒツジ抗マウスＩｇＧ西洋わさびペルオキシダーゼ結合種特異全抗体（１：２０００希釈液、アマシャム・バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社、製品コードＮＡ９３１）を用いて、上記と同様の工程で、βアクチンを検出した。
【００７２】
ＡＢＣＡ１検出
ＡＢＣＡ１の検出は、マクロファージ細胞溶解物を１００Ｖで１．５時間電気泳動（１０％ポリアクリルアミドゲル）した後、ニトロセルロース膜に移した。膜は、４℃で４時間ブロッキング溶液でブロッキングした後、ウサギ抗ＡＢＣＡ１抗体（サンタクルーズ・バイオテクノロジー（Ｓａｍｔａ Ｃｒｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社）の１：２００希釈液で４℃で一晩培養した。次の日に、膜をＴＴＢＳで５分間ずつ５回洗浄したのち、ＥＣＬロバ抗ウサギＩｇＧ西洋わさびペルオキシダーゼ結合種特異全抗体の１：５０００希釈液で室温で培養した。２７−ＯＨアーゼ抗体に関して上述したものと同様に検出を行った。
【００７３】
泡沫細胞分析
マクロファージへの分化を促進するために、１２ウェルプレートでＴＨＰ−１ヒト単球（細胞１０6個／ｍｌ）を１００ｎＭのＰＭＡ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）社）で３７℃４日間処理した。分化したマクロファージをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：phosphate-buffered saline）で３回洗浄した後、以下の条件下でさらにＲＰＭＩ培地（３７℃、５％ＣＯ2）で４８時間培養した。ａ）アセチル化ＬＤＬ（５０μｇ／ｍｌ）、ｂ）アセチル化ＬＤＬ（５０μｇ／ｍｌ）およびＩＦＮ−γ（５００Ｕ／ｍｌ）、ｃ）アセチル化ＬＤＬ（５０μｇ／ｍｌ）およびＩＦＮ−γ中和抗体（１．２μｇ／ｍｌ）、ｄ）アセチル化ＬＤＬ（５０μｇ／ｍｌ）、ＩＦＮ−γ（５００Ｕ／ｍｌ）およびＩＦＮ−γ中和抗体（１．２μｇ／ｍｌ）、ｅ）アセチル化ＬＤＬ（５０μｇ／ｍｌ）およびＩＦＮ−γ受容体抗体（１２５ｎｇ／ｍｌ）、およびｆ）アセチル化ＬＤＬ（５０μｇ／ｍｌ）、ＩＦＮ−γ受容体抗体（１２５ｎｇ／ｍｌ）およびＩＦＮ−γ（５００Ｕ／ｍｌ）。
【００７４】
培養後直ちに、培地を吸引して、４％パラホルムアルデヒド水溶液を用いて、２ないし４分間、培養に用いたものと同じ１２ウェルプレートに細胞を固定した。０．２％Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏメタノール溶液を用いて、１ないし３分間、細胞を染色した。光学顕微鏡（Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２５−Ｚｅｉｓｓ）を用いて、１００倍の倍率で、細胞を観察した後、コダック（Ｋｏｄａｋ）社ＤＣ２９０ズームデジタルカメラで撮影した。各条件で形成された泡沫細胞の数を手作業で計算して、泡沫細胞形成率とした。
【００７５】
データ解析
ＧｒａｐｈＰａｄバージョン４．０２（グラフパッド（ＧｒａｐｈＰａｄ）社カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて統計分析を行った。すべてのデータを一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）で分析し、ボンフェローニ法でコントロール条件と処理条件との一対多重比較を行った。
【００７６】
追加実験：ＴＨＰ−１
ＴＨＰ−１ヒト単球−マクロファージ細胞株は、アメリカ合衆国培養細胞系保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣ、バージニア州マナッサス）から購入した。ＴＨＰ−１細胞を、１０％ＦＢＳ、５０Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび５０Ｕ／ｍｌのストレプトマイシンを加えたＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁させて、単球形態で、５％ＣＯ2雰囲気下３７℃で増殖させた。
【００７７】
ＴＨＰ−１単球を細胞１×１０6個／ｍｌの密度まで増殖させた後、カルシウムとマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した。その後、以下の条件下で新鮮培地を用いて、６ウェルプレートで培養した（１８時間、３７℃、５％ＣＯ2）。ａ）ＲＰＭＩコントロール、ｂ）ＮＳ−３９８（１０ないし１００μＭ：１８時間）、ｃ）ＣＧＳ−２１６８０（１０-5Ｍ、１８時間）およびｄ）ＮＳ−３９８（５０μＭ１８時間）＋ＣＧＳ−２１６８０（１０-5Ｍ、１８時間）。
【００７８】
リアルタイムＰＣＲで２７−ＯＨアーゼおよびＡＢＣＡ１のｍＲＮＡを定量した。オリゴｄＴに感作されたＭ−ＭＬＶ逆転写酵素を用いて、ｃＤＮＡを５μｇの総ＲＮＡから複製した。コレステロール２７−ＯＨアーゼ特異的プライマーまたはＡＢＣＡ１特異的プライマーならびにグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）コントロールプライマーを用いたＰＣＲ増幅を行なうために、各ＲＴ（逆転写酵素）反応混合物から同量のｃＤＮＡを採取した。コレステロール２７−ＯＨアーゼ特異的プライマーは、ヒトコレステロール２７−ＯＨアーゼのｃＤＮＡのヌクレオチド４９１−８０２を包含する３１１塩基対配列から成る。ＡＢＣＡ１プライマーは、２３４塩基対増幅断片から成る。サイバーグリーン（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ）ＰＣＲ試薬キット（アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社）を用いて、メーカーの使用説明書に従ってストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ＭＸ３００５Ｐ ＱＰＣＲ（定量ＰＣＲ）システムでリアルタイムＰＣＲ分析を行なった。
【００７９】
ＲＩＰＡ溶解バッファ（９８％ＰＢＳ、１％Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ−６３０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ）を用いて、ウエスタン免疫ブロット用に全細胞溶解物を単離した。１００μｌのＲＩＰＡ溶解バッファと１０μｌのプロテアーゼ・インヒビター・カクテル（シグマ（Ｓｉｇｍａ）社）を各条件下の細胞ペレットに加えて、５分ごとにボルテックスを行ないながら、氷上で３５分間培養した。エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）５４１５Ｃ遠心分離機を用いて、１０分間、４℃、１０，０００Ｇで遠心分離後、上澄みを採取した。日立Ｕ２０１０分光光度計を用いて、５６０ｎｍの波長の吸収から、各上澄みに含まれるタンパク質の量を測定した。
【００８０】
対照群として、同じ膜上で、マウス抗βアクチン（１：１０００希釈液、アブカム（ａｂＣａｍ）社、製品コードａｂ６２７６）およびＥＣＬヒツジ抗マウスＩｇＧ西洋わさびペルオキシダーゼ結合種特異全抗体（１：２０００希釈液、アマシャム・バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社、製品コードＮＡ９３１）を用いて、上記と同様の工程で、βアクチンを検出した。
【００８１】
ＳｉｇｍａＳｔａｔバージョン２．０３（ＳＰＳＳ社、イリノイ州シカゴ）を用いて、統計分析を行った。階数別一元配置分散分析Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定によりデータを解析した。Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法で一対多重比較を行った。
【００８２】
追加実験：泡沫細胞形成
マクロファージへの分化を促進するために、１２ウェルプレートでＴＨＰ−１ヒト単球（細胞１×１０6個／ｍｌ）を３００ｎＭのホルボール二酪酸（シグマ（Ｓｉｇｍａ）社）で３７℃４８時間処理した。分化したマクロファージをＰＢＳで３回洗浄し、その後、単独で、または、１０μＭのＮＳ−３９８の存在下で培養した（３７℃、５％ＣＯ2、１８時間）。アセチル化ＬＤＬ（５０μｇ／ｍｌ）を用いて細胞にコレステロールを負荷した後、さらに、ＲＰＭＩ培地で４８時間培養した（３７℃、５％ＣＯ2）。実験は３回ずつ（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅで）行った。
【００８３】
培養後直ちに、培地を吸引して、４％パラホルムアルデヒド水溶液を用いて、２ないし４分間、培養に用いたものと同じ１２ウェルプレートに細胞を固定した。０．２％Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏメタノール溶液を用いて、１ないし３分間、細胞を染色した。光学顕微鏡（Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２５−Ｚｅｉｓｓ）を用いて、１００倍の倍率で、細胞を観察した後、コダック（Ｋｏｄａｋ）社ＤＣ２９０ズームデジタルカメラで撮影した。各条件で形成された泡沫細胞の数を手作業で計算して、泡沫細胞形成率とした。
【００８４】
ＣＯＸ−２選択的阻害薬ＮＳ−３９８（５０μＭ）を用いて、または、用いることなく、特異的Ａ２Ａ受容体作用薬ＣＧＳ−２１６８０（１０μＭ）の存在下で、または、非存在下で、ＴＨＰ−１単球細胞（１０6個／ｍｌ）を培養した（１８時間、３７℃、５％ＣＯ2）。トリゾール試薬を用いて、培養皿から直接ＲＮＡを採取し、オリゴｄＴプライマーを用いた逆転写の条件ごとに５μｇの総ＲＮＡを用いて、２７−ＯＨアーゼおよびＡＢＣＡ１に関してＲＮＡの定量的リアルタイムＰＣＲを行った。
【００８５】
培養したＴＨＰ−１ヒト単球において、ＮＳ−３９８は、コレステロール代謝２７−ＯＨアーゼ酵素のｍＲＮＡ発現を容量依存的に、顕著に低下させた。ＮＳ−３９８に暴露させることにより、コレステロール流出タンパク質ＡＢＣＡ１のメッセージレベルも低下した。これらの結果を免疫ブロット法で確認した。抗炎症性アデノシンＡ２Ａ受容体作用薬を加えることにより、２７−ＯＨアーゼとＡＢＣＡ１の低下が抑制された。ＮＳ−３９８処理ＴＨＰ−１細胞にＣＧＳ−２１６８０を加えることにより、２７−ＯＨアーゼ発現が１８４％増大し、ＡＢＣＡ１発現が１４１％増大した（２７−ＯＨアーゼに関して、ＮＳ−３９８単独群で５８．９±２．３％に対してＣＧＳ−２１６８０＋ＮＳ−３９８群で１６７．２±８．５７％、ｎ＝３、ｐ＜０．００１、ＡＢＣＡ１に関して、ＮＳ−３９８単独群で６０．４９±４．４２％に対してＣＧＳ−２１６８０＋ＮＳ−３９８群で１４６．０±３．１５％、ｎ＝３、ｐ＜０．００１、１００％＝未処理ＴＨＰ−１細胞における基準発現量）。
【００８６】
結果に関する議論
ＣＯＸ−２阻害薬を用いた場合に心血管系リスクが増大する原因は、少なくとも部分的に、コレステロール流出の乱れに帰することができ、特定のアデノシン受容体の活性によりこの乱れを抑制することができる。これらの知見に基づき、関節炎やその他の炎症性疾患に対して持続的な鎮痛を必要とする患者にＣＯＸ−２阻害薬を用いた治療を行うことによる心血管系のリスクを減少させるＡ２Ａ受容体を標的とした新しい治療法を提供する。
【００８７】
これは、広く用いられている薬物療法が、抗アテローム生成２７−ＯＨアーゼまたはＡＢＣＡ１の発現を増大させ、ＣＯＸ−２阻害またはＩＦＮ−γ暴露が遺伝子発現に及ぼす効果を軽減することができるという証拠を初めて示すものである。ＭＴＸが脂肪過負荷条件下で泡沫細胞形成を阻害することが実証された。関節リウマチの患者におけるアテローム性動脈硬化症（ＡＳＣＶＤ）のリスクを軽減させるＭＴＸの能力は、アデノシンＡ２Ａ受容体の活性を媒介としたコレステロール・ホメオスタシスの望ましい変化に部分的に帰することができる。したがって、アデノシン受容体のライゲーションは、ＡＳＣＶＤ患者に長期的な効果をもたらす有望な治療パラダイムに適した機序を与えるものである。
【００８８】
市販のＣＯＸ−２阻害薬によるコレステロール代謝異常に及ぼすＡ２Ａ作用薬の効果を実証するために、ＣＯＸ−２阻害薬であるセレコキシブを用いた実験を行った。
【００８９】
セレコキシブの例および試験
セレコキシブ（ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ）は、米国において、関節炎痛および炎症の治療に利用可能なＣＯＸ−２阻害薬として唯一残された薬剤である。バルデコキシブ（ｖａｌｄｅｃｏｘｉｂ）およびロフェコキシブ（ｒｏｆｅｃｏｘｉｂ）、心血管系のリスクが増大するという証拠に基づき、市場から撤退した。
【００９０】
ＣＯＸ−２阻害がアテローム生成を増大させる正確な作用機序は解明されておらず、そのリスクがクラス効果である可能性に対する不安が残っている。我々は、ＮＳ−３９８を用いた場合ＣＯＸ−２の選択的阻害が、コレステロール蓄積細胞の除去に関わる重要な調整因子であるコレステロール逆輸送系（ＲＣＴ）タンパク質ＡＢＣＡ１を下方制御することを見出した。他のＣＯＸ−２阻害薬を用いた場合と同様に、セレコキシブは、ＴＨＰ−１マクロファージにおけるＲＣＴを低下させることによりアテローム生成を促進させる性質を示し、泡沫細胞形成に対するぜい弱性を増大させた。セレコキシブおよびＮＳ−３９８は、いずれもＣＯＸ−２阻害を介してＲＣＴを抑制するため、ＣＯＸ−２遺伝子サイレンシングがＲＣＴに悪影響を及ぼすと思われる。
【００９１】
方法
ＴＨＰ−１単球（ＲＰＭＩ１６４０、３７℃、５％ＣＯ2）を細胞１０6個／ｍｌの密度まで増殖させた。増殖したＴＨＰ−１細胞を以下に説明する実験条件に暴露した、あるいは、付着マクロファージに分化させた（ホルボール二酪酸、３００ｎＭ、４８時間）
【００９２】
培地を吸引し、Ｃａ2+とＭｇ2+を含まないダルベッコ・リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で細胞を３回洗浄した。次に、以下の条件下で細胞を６ウェルプレートで時間培養した。実験は３回ずつ（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅで）行った。（１）培地のみ、（２）１０μＭのＮＳ−３９８（１８時間）、（３）５０μＭのＮＳ−３９８（１８時間）、（４）１０μＭのセレコキシブ（１８時間）、（５）５０μＭのセレコキシブ（１８時間）、（６）５００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−γ（１２時間）、（７）５０ｎＭのｓｉＲＮＡ（２４時間）、（８）５０ｎＭのｍｏｃｋ ｓｉＲＮＡ（２４時間）。 ＴＨＰ−１マクロファージに、５０μｇ／ｍｌのアセチル化ＬＤＬでコレステロールを負荷し、Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色を行なう前に、さらに４８時間培養した。
【００９３】
細胞を採取して、室温１５００ＲＰＭで遠心分離をし、培地を吸引し、細胞のタンパク質およびＲＮＡを単離した（トリゾール試薬）。紫外（ＵＶ）分光光度法（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＤＵ８００）によりクオーツキュベットを用いて、２６０ｎｍの波長の吸収から、各条件におけるＲＮＡの総量を測定した。
【００９４】
エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）マスターサイクラ―・パーソナルで逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行った。各アッセイにおいて、１０Ｕ（ユニット）のＲＮアーゼ阻害薬および１μＭのオリゴｄＴプライマーの存在下で、Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素を用いて、１μｇのｍＲＮＡを逆転写した。ＡＢＣＡ１特異的プライマーおよびグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ：glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）コントロールプライマーを用いたＰＣＲ増幅を行なうために、各ＲＴ（逆転写酵素）反応混合物から同量のｃＤＮＡを採取した。ＡＢＣＡ１プライマーは、２３４塩基対（ｂｐ）から成り、ＧＡＰＤＨプライマーは３５７塩基対（ｂｐ）増幅断片から成る。ＰＣＲ生成物を２％アガロースゲル上に直接載せて、５Ｖ／ｃｍで１．５時間電気泳動を行った。ＤＮＡをエチジウムブロマイド染色した後、コダック（Ｋｏｄａｋ）トランスイルミネーターを用いて紫外線の下で可視化させて、撮影した。ゲル画像を写真で記録し、コダック・デジタルサイエンス電気泳動ドキュメンテーション解析システム１２０（Ｋｏｄａｋ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ１２０）で撮像後、コダック（Ｋｏｄａｋ）デジタルサイエンス１Ｄバージョン２．０．３で強度を測定した。実験結果は、すべて、ＧＡＰＤＨの平均密度で正規化した。
【００９５】
細胞トランスフェクションおよびＣＯＸサイレンシング
細胞をＰＢＳで３回洗浄した。新鮮培地ＲＰＭＩ１６４０（１００ｍｌ）を適当な各８チャンバプレートに加えた。トランスフェクションの前に、細胞を短時間培養した。２４ウェルプレートの各チャンバウェルに対して、以下の操作を行った。３７５ｎｇのｓｉＲＮＡ（ＰＴＧＳ２＿５ＨＰ有効ｓｉＲＮＡ、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）社）を１００ｍｌの無血清培養培地で希釈した（最終的な濃度：５０ｎＭ）。６ｍｌのＨｉＰｅｒＦｅｃｔトランスフェクション試薬を、希釈したｓｉＲＮＡに加えたのち、ボルテックスミキサーで混合した。検体を室温で５ないし１０分間培養して、トランスフェクション複合体を形成させた。形成された複合体を細胞に滴下した後、回転させて、一様に分布させた。次に、通常の増殖条件下で細胞を６時間培養した。４００ｍｌの血清含有培養培地および抗生物質を加えた後、さらに、細胞を２４ないし７２時間培養した。
【００９６】
培養後、培地を吸引して、４％パラホルムアルデヒド水溶液を用いて、２ないし４分間、細胞を固定した。０．４％トリパンブルーで、１ないし３分間、細胞を染色し、ＰＢＳで洗浄した後、０．２％Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏメタノール溶液を用いて、１ないし３分間、細胞を染色した。光学顕微鏡（ニコンエクリプス（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ）ＴＥ３００）を用いて４０倍の倍率で細胞の観察を行い、ソニー（ＳＯＮＹ）プログレッシブ３ＣＣＤカラービデオカメラを用いて細胞の撮影を行った。各条件で形成された泡沫細胞の数を手作業で計算して、泡沫細胞形成率とした。
【００９７】
ウエスタンブロット
全細胞溶解タンパク質検体（１０μｇ／レーン）を５分間沸騰させて、７．５％ポリアクリルアミドゲル上に載せて、１００Ｖで１．５時間電気泳動を行なった後、半乾きのトランスブロット装置内のニトロセルロース膜に移して、１００Ｖで１時間処理した。ＡＢＣＡ１検出のために、一次抗体として、ウサギ抗ヒトＡＢＣＡ１抗体（１：２０００希釈液、サンタクルーズ・バイオテクノロジー（Ｓａｍｔａ Ｃｒｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社）を用いた。また、二次抗体として、ＥＣＬロバ抗ウサギＩｇＧ西洋わさびペルオキシダーゼ結合種特異全抗体（１：４０００希釈液）を用いた。
【００９８】
Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン５．０１およびＳｉｇｍａＳｔａｔバージョン２．０３を用いて、統計分析を行った。両側９５％の信頼区間およびｐ＜０．０５の有意性で不対ｔ検定により、コントロール条件と処理条件との一対多重比較を行った。階数別一元配置分散分析Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定により泡沫細胞形成を解析した。Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法で一対多重比較を行った。
【００９９】
結果
セレコキシブは、ＡＢＣＡ１メッセージを有意に減少させた。対照群に対して５０μＭ群では、６５．１±１．５％の減少、ｐ＝０．００３。セレコキシブは、ＡＢＣＡ１タンパク質発現を容量依存的に減少させた（ｐ＝０．０００２）。ＣＯＸ−２ｓｉＲＮＡを用いたトランスフェクションにより、ＡＢＣＡ１メッセージが有意に減少した。ｍｏｃｋ群に対して２２．９±４．９％の減少、ｐ＝０．０３。
【０１００】
図１ａおよび図１ｂに示すように、セレコキシブは、ＡＢＣＡ１タンパク質発現を減少させた。対照群に対して５０μＭ群では、２５．６±１．３％の減少、ｐ＜０．０００１。５０μＭセレコキシブ群では、脂質含有泡沫細胞の形成が増大した。対照群における泡沫細胞の形成率が３９．１±５．４％であったの対して、５０μＭセレコキシブ群では、９５．０±０．７％であった（ｐ＝０．００３）。
【０１０１】
ＣＯＸ−２遺伝子サイレンサーでトランスフェクションを行ったＴＨＰ−１マクロファージは、ｍｏｃｋでトランスフェクションを行った細胞と比べて、脂質含有泡沫細胞の形成性向が高かった。５８．３±１．６％の増大、ｐ＝０．００３。
【０１０２】
アセチル化ＬＤＬのみでコレステロール負荷を行った場合の顕微鏡写真を撮り、次に、５０μＭのセレブレックス処理細胞の後にアセチル化ＬＤＬでコレステロール負荷を行った場合の顕微鏡写真を撮った。さらに、ｍｏｃｋトランスフェクションＣＯＸ−２ｓｉＲＮＡ処理細胞の後にアセチル化ＬＤＬでコレステロール負荷を行った場合の顕微鏡写真を撮った。
【０１０３】
ＭＴＸおよびＣＧＳ−２１６８０の試験結果
ＭＴＸ（５μＭ、１８時間）は、２７−ＯＨアーゼのｍＲＮＡ発現を増大させ（１１３．９±６．４％）、ＮＳ−３９８に誘導される２７−ＯＨアーゼメッセージの下方制御を完全にブロックした（未処理群を１００％とした場合、ＮＳ−３９８単独群で７１．１±４．３％、ＮＳ−３９８＋ＭＴＸ群で１１２．８±１３．１％、ｎ＝３、ｐ＜０．０１）。ＮＳ−３９８による２７−ＯＨアーゼ発現の低下を抑制するＭＴＸの能力は、タンパク質およびメッセージレベルの両方に関して、ＭＴＸ投与量が０．１μＭ群、０．５μＭ群および５μＭ群で観察された（図５参照）。
【０１０４】
ＭＴＸは、また、ＣＯＸ−２阻害薬により介在されるＴＨＰ−１単球におけるＡＢＣＡ１メッセージの下方制御のブロックに有効であった。ＺＭ−２４１３８５によるアデノシンＡ２Ａ受容体遮断は、２７−ＯＨアーゼ（図３ｃおよび図４ｂ参照）とＡＢＣＡ１の両方に及ぼすＣＯＸ−２阻害薬の効果を抑制するＭＴＸの能力を無効化した。同様に、上述したＴＨＰ−１単球におけるＩＦＮ−γによる２７−ＯＨアーゼとＡＢＣＡ１の下方制御も、ＭＴＸにより妨害され、ＭＴＸのこの効果はＺＭ−２４１３８５により無効化された（図６ａおよび図６ｂ参照）。
【０１０５】
アデノシンＡ２Ａ受容体作用薬ＣＧＳ−２１６８０をＮＳ−３９８に暴露されたＴＨＰ−１単球に加えることにより、２７−ＯＨアーゼ発現の低下が抑制された。これを免疫ブロットおよびＱＲＴ−ＰＣＲで実証した。ＮＳ−３９８で処理したＴＨＰ−１細胞にＣＧＳ−２１６８０を加えることにより、２７−ＯＨアーゼのｍＲＮＡに１８４％の増加が見られた（ＮＳ−３９８単独群が５８．９±２．３％であったのに対して、ＣＧＳ＋ＮＳ−３９８群では１６７．２±８．５％、ｎ＝３、ｐ＜０．００１）。
【０１０６】
泡沫細胞レベルに対するＭＴＸの作用
アセチルＬＤＬ処理ＴＨＰ−１マクロファージにおいて、対照群と比べて、ＭＴＸの存在下では、泡沫細胞の形質転換が有意に低下した（対照群の３９．３±５．０％に対してＭＴＸ群２９．７±２．０％、ｐ＜０．００１）。ＮＳ−３９８処理群における泡沫細胞が７２．７±４．９％であったのに対して、ＮＳ−３９８＋ＭＴＸ併用群では、泡沫細胞が３６．３±３．２％に過ぎなかった（ｎ＝３、ｐ＜０．００１）。アセチル化ＬＤＬによるコレステロール負荷前にＩＦＮ−γ処理をした群では、泡沫細胞が７１．０±５．０％であったのに対して、ＩＦＮ−γ＋ＭＴＸ群では、泡沫細胞が４６．０±７．２％に過ぎなかった（ｎ＝３、ｐ＜０．００１）。ＭＴＸ処理前に選択的Ａ２Ａ受容体拮抗薬（ＺＭ−２４１３８５）を加えて前培養を行なったＴＨＰ−１マクロファージでは、ＭＴＸのアテローム生成効果が抑制され、その結果、泡沫細胞の有意な増加がみられた（６２．１±１．５％）。
【０１０７】
ＣＯＸ−２阻害薬に仲介される２７−ＯＨアーゼのｍＲＮＡの減少は、ＭＴＸにより抑制される。４本の棒グラフが示すＴＨＰ−１ヒト単球の処理条件は、（図３ｄの左から右に）それぞれ以下の通りであった。（１）対照群としてＲＰＭＩ１６４０培地、（２）ＭＴＸ（５μＭ、１８時間）、（３）ＮＳ−３９８（５０μＭ、１８時間）および（４）ＭＴＸ（５μＭ、１８時間）＋ＮＳ−３９８（５０μＭ、１８時間）。細胞から総ＲＮＡを抽出し、ＱＲＴ−ＰＣＲで２７−ＯＨアーゼのｍＲＮＡ発現の評価を行った。ＧＡＰＤＨメッセージ増幅から得られた信号を内部コントロールとして用いた。対照群対ＮＳ−３９８群は＊ｐ＜０．０５であり、ＮＳ−３９８＋ＭＴＸ群対ＮＳ−３９８群は＃ｐ＜０．０１であった（ここで、＊ｐおよび＃ｐの表記は、いずれのｐ値がいずれの棒グラフに適合するかを示すために棒グラフで用いられるｐ値を示す）。
【０１０８】
ＮＳ−３９８処理ＴＨＰ−１細胞へのＭＴＸの投与量を変えてコレステロール２７−ＯＨアーゼの検出および定量を行ったところ、ＣＯＸ−２阻害薬ＮＳ−３９８で処理したＴＨＰ−１単球において、２７−ＯＨアーゼタンパク質の減少が見られたが、これはＭＴＸ濃度の増大により抑制された。培養したＴＨＰ−１単球細胞を未処理のまま、または、ＮＳ−３９８（５０μＭ、１８時間）に暴露後、未処理にした、または種々の投与量のＭＴＸに２４時間暴露させた。総細胞タンパク質を単離した後、特異的ウサギポリクロナール抗ヒト２７−ＯＨアーゼ抗体を用いて、２７−ＯＨアーゼを検出した。抗βアクチン抗体を用いたウエスタンブロットを行って、タンパク質負荷が等しいことを確認した。
【０１０９】
ＣＯＸ−２阻害薬が仲介するＴＨＰ−１単球における２７−ＯＨアーゼのｍＲＮＡ発現の低下は、ＭＴＸにより抑制される。培養したＴＨＰ−１単球細胞をＮＳ−３９８（５０μＭ、４８時間）で培養後、未処理にした、または種々の投与量のＭＴＸに２４時間暴露させた。総ＲＮＡの単離後、上述したように、ＲＮＡを逆転写して、ｃＤＮＡをＱＲＴ−ＰＣＲで増幅させた。ＧＡＰＤＨメッセージ増幅から得られた信号を内部コントロールとして用いた。ＭＴＸ群対対照群（Ｃ）は＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１であり、ＮＳ＋ＭＴＸ群対ＮＳ−３９８（ＮＳ）群は＃ｐ＜０．０１であった。
【０１１０】
Ａ２Ａ受容体拮抗薬であるＺＭ−２４１３８５の存在下または非存在下でＭＴＸに暴露したＮＳ−３９８処理ＴＨＰ−１細胞におけるコレステロール２７−ＯＨアーゼおよびＡＢＣＡ１のｍＲＮＡの検出および定量の結果から、ＮＳ−３９８によるＴＨＰ−１細胞における２７−ＯＨアーゼメッセージの低下がＭＴＸにより抑制され、この抑制効果が、ＺＭ−２４１３８５によりブロックされることを立証した。４本の棒グラフが示すＴＨＰ−１単球の処理条件は、（図３ｃの左から右に）それぞれ以下の通りであった。（１）対照群としてＲＰＭＩ１６４０培地、（２）ＮＳ−３９８（５０μＭ、２４時間）、（３）ＮＳ−３９８（５０μＭ、２４時間）後にＭＴＸ（５μＭ、２４時間）、（４）ＮＳ−３９８（５０μＭ）およびＺＭ−２４１３８５（１０μＭ）で２４時間処理後にＭＴＸ（５μＭ、２４時間）。細胞から総ＲＮＡを抽出し、ＱＲＴ−ＰＣＲで２７−ＯＨアーゼのｍＲＮＡ発現の評価を行った。ＧＡＰＤＨメッセージ増幅から得られた信号を内部コントロールとして用いた。
【０１１１】
ＮＳ−３９８によるＴＨＰ−１細胞におけるＡＢＣＡ１メッセージの低下がＭＴＸにより抑制され、この抑制効果が、ＺＭ−２４１３８５によりブロックされることをさらに立証した。４本の棒グラフが示すＴＨＰ−１単球の処理条件は、（図５の左から右に）それぞれ以下の通りであった。（１）対照群としてＲＰＭＩ１６４０培地、（２）ＮＳ−３９８（５０μＭ、２４時間）、（３）ＮＳ−３９８（５０μＭ、２４時間）後にＭＴＸ（５μＭ、２４時間）および（４）ＮＳ−３９８（５０μＭ）およびＺＭ−２４１３８５（１０μＭ）で２４時間処理後にＭＴＸ（５μＭ、２４時間）。細胞から総ＲＮＡを抽出し、ＱＲＴ−ＰＣＲで２７−ＯＨアーゼのｍＲＮＡ発現の評価を行った。ＧＡＰＤＨメッセージ増幅から得られた信号を内部コントロールとして用いた。ＭＴＸ群対対照群（Ｃ）は＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１であり、ＮＳ−３９８＋ＭＴＸ群対ＮＳ−３９８群は＃ｐ＜０．０１であった。
【０１１２】
Ａ２Ａ受容体拮抗薬であるＺＭ−２４１３８５の存在下または非存在下でＭＴＸに暴露したＩＦＮ−γ刺激ＴＨＰ−１細胞におけるコレステロール２７−ＯＨアーゼのｍＲＮＡおよびタンパク質ならびにＡＢＣＡ１のｍＲＮＡの検出および定量の結果から、ＩＦＮ−γによるＴＨＰ−１細胞における２７−ＯＨアーゼメッセージの低下がＭＴＸにより抑制され、この抑制効果が、ＺＭ−２４１３８５によりブロックされることを立証した。８本の棒グラフが示すＴＨＰ−１単球の処理条件は、（図６ａおよび図６ｂの左から右に）それぞれ以下の通りであった。（１）対照群としてＲＰＭＩ１６４０培地、（２）ＺＭ−２４１３８５（１０μＭ、２４時間）、（３）ＭＴＸ（５μＭ、２４時間）、（４）ＩＦＮ−γ（５００Ｕ／ｍｌ、２４時間）、（５）ＩＦＮ−γ（５００Ｕ／ｍｌ、２４時間）後にＭＴＸ（５μＭ、２４時間）、（６）ＺＭ−２４１３８５（１０μＭ、２４時間）後にＭＴＸ（５μＭ、２４時間）、（７）ＺＭ−２４１３８５（１０μＭ）およびＩＦＮ−γ（５００Ｕ／ｍｌ）で２４時間処理後にＭＴＸ（５μＭ、２４時間）および（８）ＺＭ−２４１３８５（１０μＭ）およびＮＳ−３９８（５０μＭ）で２４時間処理後にＭＴＸ（５μＭ、２４時間）。細胞から総ＲＮＡを抽出し、ＱＲＴ−ＰＣＲで２７−ＯＨアーゼのｍＲＮＡ発現の評価を行った。ＧＡＰＤＨメッセージ増幅から得られた信号を内部コントロールとして用いた。
【０１１３】
ＩＦＮ−γによるＴＨＰ−１細胞における２７−ＯＨアーゼタンパク質の低下がＭＴＸにより抑制され、この抑制効果が、ＺＭ−２４１３８５によりブロックされることをさらに立証した。図６ａの左から右に８本の免疫ブロットで示したものと同様に、ＴＨＰ−１単球を上述した条件（１）ないし（８）と同じ条件で処理した。総細胞タンパク質を単離した後、特異的ウサギポリクロナール抗ヒト２７−ＯＨアーゼ抗体を用いて、２７−ＯＨアーゼを検出した。抗βアクチン抗体を用いたウエスタンブロットを行って、タンパク質負荷が等しいことを確認した。
【０１１４】
ＩＦＮ−γによるＴＨＰ−１細胞におけるＡＢＣＡ１メッセージの低下がＭＴＸにより抑制され、この抑制効果が、ＺＭ−２４１３８５によりブロックされることをさらに立証した。図６ａの左から右に８本の棒グラフで示したものと同様に、ＴＨＰ−１単球を上述した条件（１）ないし（８）と同じ条件で処理した。細胞から総ＲＮＡを抽出し、ＱＲＴ−ＰＣＲで２７−ＯＨアーゼのｍＲＮＡ発現の評価を行った。ＧＡＰＤＨメッセージ増幅から得られた信号を内部コントロールとして用いた。
【０１１５】
ＣＧＳ−２１６８０
ＴＨＰ−１単球における２７−ＯＨアーゼ発現のＮＳ−３９８による抑制に及ぼすＡ２Ａ作用薬ＣＧＳ−２１６８０の効果を調べたところ、ＣＯＸ−２阻害薬ＮＳ−３９８（５０μＭ）により２７−ＯＨアーゼのメッセージレベルの低下が見られたが、この低下はアデノシンＡ２Ａ作用薬であるＣＧＳ−２１６８０（１０μＭ）を加えることにより抑制された。４本の棒グラフ（図３ａ）が示すＴＨＰ−１単球の処理条件は、左から右にそれぞれ以下の通りであった。（１）対照群としてＲＰＭＩ１６４０培地、（２）ＣＧＳ−２１６８０（１０μＭ、１８時間）、（３）ＮＳ−３９８（５０μＭ、１８時間）および（４）ＮＳ−３９８（５０μＭ、１８時間）およびＣＧＳ−２１６８０（１０μＭ、１８時間）。細胞から総ＲＮＡを抽出し、ＱＲＴ−ＰＣＲで２７−ＯＨアーゼのｍＲＮＡ発現の評価を行った。ＧＡＰＤＨメッセージ増幅から得られた信号を内部コントロールとして用いた。対照群対ＮＳ−３９８群は＊ｐ＜０．０１であり、ＮＳ−３９８＋ＣＧＳ−２１６８０群対ＮＳ−３９８群は＃ｐ＜０．０１であった。
【０１１６】
さらに、ＴＨＰ−１単球を以下の条件（１）対照群としてＲＰＭＩ１６４０培地、（２）ＣＧＳ−２１６８０（１０μＭ、１８時間）、（３）ＮＳ−３９８（５０μＭ、１８時間）および（４）ＮＳ−３９８（５０μＭ、１８時間）およびＣＧＳ−２１６８０（１０μＭ、１８時間）で処理した後、免疫ブロットを行なって、２７−ＯＨアーゼタンパク質の発現を評価した。この結果から、かなり有益な結果が得られた。対照群対ＮＳ−３９８群は＊ｐ＜０．０１であり、ＮＳ−３９８＋ＣＧＳ−２１６８０群対ＮＳ−３９８群は＃ｐ＜０．０１であった。この低下は、アデノシンＡ２Ａ作用薬であるＣＧＳ−２１６８０を加えることにより抑制される。したがって、２７−ＯＨアーゼのタンパク質レベルがＣＯＸ−２阻害薬であるＮＳ−３９８により低下し、この低下は、アデノシンＡ２Ａ作用薬であるＣＧＳ−２１６８０を加えることにより抑制されることが実証された。
【０１１７】
脂肪負荷ＴＨＰ−１マクロファージにおけるＮＳ−３９８およびＩＦＮ−γに誘導される泡沫細胞形質転換に対するＭＴＸの作用
Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏで染色した脂質含有マクロファージの代表的な顕微鏡写真を４０倍の倍率で撮り、以下の知見が得られた。（ａ）アセチル化ＬＤＬ処理ＴＨＰ−１マクロファージでは、対照群と比較して、ＭＴＸの存在下で、泡沫細胞形質転換の有意な減少がみられた。（ｂ）ＭＴＸは、ＴＨＰ−１マクロファージにおけるＮＳ−３９８に誘導される泡沫細胞形成の増大を抑制した。（ｃ）ＭＴＸは、ＴＨＰ−１マクロファージにおけるＩＦＮ−γに誘導される泡沫細胞形成の増大を抑制した。（ｄ）泡沫細胞形成を低下させるＭＴＸの効果は、Ａ２Ａ受容体拮抗薬であるＺＭ−２４１３８５を用いることにより抑制される。
【０１１８】
ＮＳ−３９８は、ＴＨＰ−１細胞におけるコレステロール２７−ＯＨアーゼのメッセージを容量依存的に著しく低下させた。この結果を、ウエスタン免疫ブロット法により確認した。２７−ＯＨアーゼのタンパク質発現は、ＣＯＸ−２阻害剤であるＮＳ−３９８の存在下で減少した。
【０１１９】
ＡＢＣＡ１メッセージは、ＮＳ−３９８暴露により、対照群の約７０％まで低下した（５０μＭ、対照群の７１．１±３．９％、ｎ＝３、ｐ＜０．０１）。この結果をウエスタン免疫ブロット法により確認した。
【０１２０】
アデノシンＡ２Ａ受容体作用薬であるＣＧＳ−２１６８０を加えることにより、２７−ＯＨアーゼおよびＡＢＣＡ１の発現の両方が抑制された（図３ａ参照）。ＮＳ−３９８処理ＴＨＰ−１細胞にＣＧＳ−２１６８０を加えることにより、２７−ＯＨアーゼのｍＲＮＡが１８４％増加し、ＡＢＣＡ１のｍＲＮＡが１４１％増加した（２７−ＯＨアーゼに関して、ＮＳ−３９８単独群で５８．９±２．３％に対してＣＧＳ−２１６８０＋ＮＳ−３９８群で１６７．２±８．５７％、ｎ＝３、ｐ＜０．００１、ＡＢＣＡ１に関して、ＮＳ−３９８単独群で６０．４９±４．４２％に対してＣＧＳ−２１６８０＋ＮＳ−３９８群で１４６．０±３．１５％、ｎ＝３、ｐ＜０．００１、１００％＝未処理ＴＨＰ−１細胞における基準発現量）。
【０１２１】
ＣＯＸ−２選択的阻害薬であるＮＳ−３９８で処理したＴＨＰ−１マクロファージは、アセチル化したＬＤＬを用いたコレステロール負荷条件下で、未処理の細胞と比べて、脂質含有泡沫細胞形成に対するぜい弱性が高かった。ＴＨＰ−１マクロファージでは、対照群と比べて、ＮＳ−３９８の存在下で、泡沫細胞形質転換の有意な増大がみられた（２０．１±３．４％に対して４２．７±６．６％、ｐ＝０．０４）。
【０１２２】
ＣＯＸ−２選択的阻害薬ＮＳ−３９８（５０μＭ）を用いて、または、用いることなく、特異的Ａ２Ａ受容体作用薬ＣＧＳ−２１６８０（１０μＭ）の存在下で、または、非存在下で、ＴＨＰ−１単球細胞（１０6個／ｍｌ）を培養した（１８時間、３７℃、５％ＣＯ2）。トリゾール試薬を用いて、培養皿から直接ＲＮＡを採取し、オリゴｄＴプライマーを用いた逆転写の条件ごとに５μｇの総ＲＮＡを用いて、２７−ＯＨアーゼおよびＡＢＣＡ１に関してＲＮＡの定量的リアルタイムＰＣＲを行った。
【０１２３】
要するに、培養したＴＨＰ−１ヒト単球において、ＮＳ−３９８は、コレステロール代謝２７−ＯＨアーゼ酵素のｍＲＮＡ発現を容量依存的に、顕著に低下させた。ＮＳ−３９８に暴露させることにより、コレステロール流出タンパク質ＡＢＣＡ１のメッセージレベルも低下した。これらの結果を免疫ブロット法で確認した。抗炎症性アデノシンＡ２Ａ受容体作用薬を加えることにより、２７−ＯＨアーゼとＡＢＣＡ１の低下が抑制された。ＮＳ−３９８処理ＴＨＰ−１細胞にＣＧＳ−２１６８０を加えることにより、２７−ＯＨアーゼ発現が１８４％増大し、ＡＢＣＡ１発現が１４１％増大した（２７−ＯＨアーゼに関して、ＮＳ−３９８単独群で５８．９±２．３％に対してＣＧＳ−２１６８０＋ＮＳ−３９８群で１６７．２±８．５７％、ｎ＝３、ｐ＜０．００１、ＡＢＣＡ１に関して、ＮＳ−３９８単独群で６０．４９±４．４２％に対してＣＧＳ−２１６８０＋ＮＳ−３９８群で１４６．０±３．１５％、ｎ＝３、ｐ＜０．００１、１００％＝未処理ＴＨＰ−１細胞における基準発現量）。
【０１２４】
上述の実施例は、本発明を例示するものであって、コレステロール代謝機能を乱す様々なＣＯＸ−２阻害薬またはその他ＮＳＡＩＤＳや、その機能を修復するＡ２Ａ作用薬も、本発明の要旨の範囲に含まれる。本発明を利用した治療は、以下に限定されるものではないが、たとえば、中枢投与、全身投与、末梢投与、静脈内投与、皮下投与、経口投与、鼻腔内投与および／または経皮投与等、様々な投与ルートのいずれを用いて実行されるものでもよい。当該技術分野における通常の技術を有する者であれば、有効な投与ルートを容易に決定および実行可能であると考えられる。絶対的な値か相対的な値かに関わらず、投与量や投与回数等は、以下の特許請求の範囲に従って、条件やリスクに対する患者の感受性等に応じて変更できる。当該技術分野における通常の技術を有する者であれば、適当な投薬料や治療計画を容易に理解し、実現することが可能であると考えられる。また、Ａ２Ａ作用薬は、同時にまたは連続的に、ＣＯＸ−２阻害薬と一緒にまたは別に投与可能である。
【０１２５】
以上、特定の実施態様に関して本発明を詳述したが、当業者には明らかなように、様々な変形、変更、使用が可能であり、本発明は何ら上述の特定の実施態様に限定されるものではない。
【技術分野】
【０００１】
［クロスリファレンス］
本出願は、２００８年５月５日に出願された仮出願番号第６１／０５０，４９９号および２００８年１１月１７日に出願された仮出願番号第６１／１１５，２８９号に基づく優先権を主張する本出願である。前記出願の開示内容は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、ＣＯＸ−２選択的阻害薬を含むシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ：Cyclooxygenase）阻害薬の悪影響から、ヒトを含む哺乳類の心血管系を守る方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＣＯＸ−２阻害薬を含むＣＯＸ阻害薬ＮＳＡＩＤｓ（非ステロイド系抗炎症薬：non-steroidal anti-inflammatory drugs）と心筋梗塞や脳卒中のリスク増大の関連性は、大きな公衆衛生上の懸念となっている。心血管系有害事象のために、ＣＯＸ−２選択的阻害薬であるロフェコキシブ（ｒｏｆｅｃｏｘｉｂ）（バイオックス（Ｖｉｏｘｘ）（登録商標）、メルク（Ｍｅｒｃｋ）社）の世界規模での使用中止により、疼痛や炎症に苦しむ患者を治療する医師にとって、複雑な臨床的判断を迫られるようになっている。ＣＯＸ−２阻害薬（俗称として「コキシブ（ｃｏｘｉｂ）」とも称される）や他のＣＯＸ阻害薬ＮＳＡＩＤｓの便益が心血管系のリスクに勝るか否かに関する議論が続いている。
【０００４】
ＣＯＸ−２選択的阻害薬は、非常に効果の高い抗炎症性鎮痛薬であり、プロスタノイドの形成を妨害することによりその作用を発揮する。ＣＯＸ−２選択的阻害薬は、変形性関節炎や関節リウマチの症状を緩和し、月経困難症を治療する目的で、臨床上用いられている。
【０００５】
プラシーボ対照群と比較して、ロフェコキシブ治療群で、心血管系有害事象、特に致命的な心筋梗塞（心臓発作）の発生率が有意に増大するという臨床試験の結果を受けて、２００４年９月に、ロフェコキシブは市場から撤退した。続いて、心臓発作と脳卒中のリスクが有意に増大するという臨床試験の結果を受けて、バルデコキシブ（ｖａｌｄｅｃｏｘｉｂ）（ベクストラ（Ｂｅｘｔｒａ）（登録商標）、ファイザー（Ｐｆｉｚｅｒ）社）も市場から撤退した。ＣＯＸ−２阻害薬群が有意に心臓発作や脳卒中の発生率を増大させることが一般に知られるようになった。
【０００６】
ＣＯＸ−２選択的阻害薬により患者の心臓病や脳血管障害（脳卒中）の罹患率が増大する正確な作用機序はわかっていない。ＣＯＸ−２により生成されるプロスタサイクリンが心臓保護効果を発揮するため、実際のリスクの増大は、その発現の減少に関係しているとも考えられる。実際、ＣＯＸ−２阻害と心血管系リスクの増大との関連性を説明する仮説の一つは、プロスタサイクリンレベルの減少により、動脈に血栓が生じやすくなるというものである。ただし、心血管系リスクの出現前に「潜伏期」が存在する。たとえば、メルク（Ｍｅｒｃｋ）社が資金援助をしたＡＰＰＲＯＶｅ試験において、ロフェコキシブ治療群における心臓発作や脳卒中の出現率が顕著に増大するまで１８カ月の潜伏期があった。このため、上記仮説は十分に関連性を説明するものとはいえない。
【発明の概要】
【０００７】
我々は、ＣＯＸ−２阻害薬を含むＣＯＸ阻害薬ＮＳＡＩＤｓの使用が、正常なコレステロール代謝機能を乱し、動脈壁からのコレステロールの効果的な除去を妨害する効果があることを見出した。残留コレステロールの増大は、動脈壁に付着する有害な脂質含有泡沫細胞の生成の増大を伴い、アテローム性動脈硬化や心臓発作を含む心血管障害や脳血管障害（脳卒中）につながる。アテローム性動脈硬化は経時的に悪化するため、心血管系リスクの出現前に「潜伏期」が存在することが説明できる。
【０００８】
コレステロール代謝機能には、マクロファージ・シトクロムｐ４５０・コレステロール２７−ヒドロキシラーゼ（水酸化酵素）（以下、「２７−ＯＨアーゼ」）およびコレステロールの排出を促進することによりコレステロールの蓄積を妨げる他のコレステロール逆輸送系（ＲＣＴ）タンパク質が関わっている。さらに、抗動脈硬化内在性膜タンパク質であるＡＢＣ輸送体（ＡＴＰ結合カセットトランスポーター）Ａ１（以下、「ＡＢＣＡ１」）も、ＲＣＴプロセスに関わる因子である。
【０００９】
我々は、ＣＯＸ阻害薬ＮＳＡＩＤｓおよびＣＯＸ−２選択的阻害薬がＲＣＴタンパク質２７−ＯＨアーゼおよびＡＢＣＡ１の発現を抑制することにより、コレステロール代謝を乱し、コレステロールの排出を低下させて、コレステロールを残留させ、脂質含有泡沫細胞を生成させることを見出した。脂質含有泡沫細胞は、動脈壁に付着してプラークを形成して、アテローム性動脈硬化という心血管系に有害な状況を引き起こし、心臓発作や脳卒中という心血管系有害事象のリスク増大につながる。したがって、我々は、ＣＯＸ阻害およびＣＯＸ−２阻害がアテローム発生効果をもたらし、この薬剤群を長期間使用することにより、アテローム性動脈硬化症（ＡＳＣＶＤ）が進行するリスクを高める役割を果たすという結論に達した。
【００１０】
本発明は、ＣＯＸ−２選択的阻害薬または他のＣＯＸ阻害薬ＮＳＡＩＤｓの使用によると考えられる心血管障害および脳血管障害やアテローム性動脈硬化に関係するものを含むヒト等の哺乳類における有害事象のリスク増大を抑制する方法に関する。本発明は、また、このような方法に有用な医薬組成物に関する。本明細書において用いられる用語「心血管系事象」は、ＡＳＣＶＤおよび／またはコレステロール代謝の異常に起因する心筋梗塞や脳卒中等の有害事象を意味する。
【００１１】
本発明の方法は、ＣＯＸ阻害薬またはＣＯＸ−２選択的阻害薬の使用により生じるコレステロール代謝機能の異常を修復する工程と、ＣＯＸ阻害薬またはＣＯＸ−２選択的阻害薬の使用により引き起こされる脂質含有泡沫細胞の生成を抑制する工程と、を備える。医薬的に許容可能なアデノシンＡ２Ａ受容体作用薬を投与することによって、コレステロール代謝機能の異常を修復し、脂質含有泡沫細胞の生成を抑制する。ＣＯＸ阻害薬またはＣＯＸ−２選択的阻害薬を投与された患者に対するアデノシンＡ２Ａ受容体作用薬の活性または受容体親和性の閾値レベルは、初期濃度０．１μＭであり、最適濃度１μＭである。アデノシンＡ２Ａ受容体作用薬は、Ａ２Ａ受容体を飽和させるのに十分な量、また、コレステロール代謝機能の修復を維持するのに十分な時間間隔で投与される。本明細書において用いられる用語「アデノシンＡ２Ａ受容体作用薬の投与」には、アデノシンＡ２Ａ受容体作用薬の効果的なｉｎ ｓｉｔｕ（その場）生成を可能にする物質の投与も含まれる。
【００１２】
本発明の方法は、正常なコレステロール代謝機能を乱し、脂質含有泡沫細胞の生成につながるＣＯＸ阻害薬またはＣＯＸ−２選択的阻害薬を使用することに起因するヒトのアテローム性動脈硬化型心血管障害や脳血管障害のリスクの増大を抑制する。本発明の方法は、ＣＯＸ阻害薬またはＣＯＸ−２選択的阻害薬により生じるコレステロール代謝機能の異常を修復する工程と、ＣＯＸ阻害薬またはＣＯＸ−２選択的阻害薬の使用により引き起こされる脂質含有泡沫細胞の生成を抑制する工程と、を備える。
【００１３】
本発明の方法は、さらに、ヒトを含む哺乳類にアデノシンＡ２Ａ受容体作用薬を投与することにより、哺乳類におけるアテローム発生を改善する。この場合、アデノシンＡ２Ａ受容体作用薬は、必要に応じて、ヒトのＡ２Ａ受容体を飽和するのに実質的に十分な量を投与する。これにより、投与された被験者のアテローム発生が抑制または妨害される。
【００１４】
本発明の医薬組成物は、医薬的に許容可能なＣＯＸ阻害薬またはＣＯＸ−２選択的阻害薬と、医薬的に許容可能なＡ２Ａ受容体作用薬であって、ＣＯＸ阻害薬またはＣＯＸ−２選択的阻害薬によって乱されたコレステロール代謝機能を修復するのに十分な量のＡ２Ａ受容体作用薬と、を備える。あるいは、本発明の医薬組成物は、ＣＯＸ阻害薬またはＣＯＸ−２阻害薬とアデノシンＡ２Ａ受容体作用薬またはアデノシンＡ２Ａ受容体作用薬の効果的なｉｎ ｓｉｔｕ（その場）生成を可能にする物質との混合物を備える。本発明の医薬組成物は、鎮痛剤または抗炎症薬として有効量、たとえば、これに限定されるものではないが、標準的な薬剤投与量（たとえば、市販されているＣＯＸ−２阻害薬であるセレブレックス（Ｃｅｌｅｂｒｅｘ）の標準的な投与量は、５０、１００、２００および４００ｍｇである）のＣＯＸ阻害薬またはＣＯＸ−２阻害薬と、Ａ２Ａ受容体を飽和するのに十分な量のアデノシンＡ２Ａ受容体作用薬と、を備える。医薬組成物にアデノシンＡ２Ａ受容体作用薬の効果的な生成を可能にする物質（たとえば、アデノシンＡ２Ａ受容体作用薬のｉｎ ｓｉｔｕ（その場）生成を介在するメトトレキサート（ＭＴＸ））を備える場合には、Ａ２Ａ受容体を飽和するのに十分な量のアデノシンＡ２Ａ受容体作用薬が効果的に生成されるだけの量を含有する必要がある。本発明の医薬組成物は、さらに、担体や賦形剤、ＣＯＸ阻害薬またはＣＯＸ−２阻害薬の医薬組成物に通常用いられるような、その他医薬的に許容可能な物質を備えるようにしてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１ａ】種々の投与量レベルでＣＯＸ−２選択的阻害薬であるセレコキシブ（ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ）（セレブレックス（Ｃｅｌｅｂｒｅｘ）（登録商標）、ファイザー（Ｐｆｉｚｅｒ）社）を用いた場合のＡＢＣＡ１の遺伝子発現（図１ａ）およびタンパク質発現（図１ｂ）に及ぼす抑制効果を示す棒グラフ。
【図１ｂ】種々の投与量レベルでＣＯＸ−２選択的阻害薬であるセレコキシブ（ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ）（セレブレックス（Ｃｅｌｅｂｒｅｘ）（登録商標）、ファイザー（Ｐｆｉｚｅｒ）社）を用いた場合のＡＢＣＡ１の遺伝子発現（図１ａ）およびタンパク質発現（図１ｂ）に及ぼす抑制効果を示す棒グラフ。
【００１６】
【図２ａ】種々の投与量レベルでＣＯＸ−２選択的阻害薬であるＮＳ−３９８を用いた場合の２７−ＯＨアーゼ（図２ａ）およびＡＢＣＡ１（図２ｂ）の減少度合いを示す棒グラフ。
【図２ｂ】種々の投与量レベルでＣＯＸ−２選択的阻害薬であるＮＳ−３９８を用いた場合の２７−ＯＨアーゼ（図２ａ）およびＡＢＣＡ１（図２ｂ）の減少度合いを示す棒グラフ。
【００１７】
【図３ａ】種々のＡ２Ａ受容体作用薬およびＣＯＸ−２阻害剤の組み合わせを用いて調べた２７−ＯＨアーゼのレベルに及ぼすアデノシンＡ２Ａ受容体作用薬の効果およびそれらの組み合わせに及ぼすＡ２Ａ拮抗薬の効果（図３ｂおよび図３ｃ）を示す棒グラフ。
【図３ｂ】種々のＡ２Ａ受容体作用薬およびＣＯＸ−２阻害剤の組み合わせを用いて調べた２７−ＯＨアーゼのレベルに及ぼすアデノシンＡ２Ａ受容体作用薬の効果およびそれらの組み合わせに及ぼすＡ２Ａ拮抗薬の効果（図３ｂおよび図３ｃ）を示す棒グラフ。
【図３ｃ】種々のＡ２Ａ受容体作用薬およびＣＯＸ−２阻害剤の組み合わせを用いて調べた２７−ＯＨアーゼのレベルに及ぼすアデノシンＡ２Ａ受容体作用薬の効果およびそれらの組み合わせに及ぼすＡ２Ａ拮抗薬の効果（図３ｂおよび図３ｃ）を示す棒グラフ。
【図３ｄ】種々のＡ２Ａ受容体作用薬およびＣＯＸ−２阻害剤の組み合わせを用いて調べた２７−ＯＨアーゼのレベルに及ぼすアデノシンＡ２Ａ受容体作用薬の効果およびそれらの組み合わせに及ぼすＡ２Ａ拮抗薬の効果（図３ｂおよび図３ｃ）を示す棒グラフ。
【００１８】
【図４ａ】Ａ２Ａ作用薬であるＣＧＳ-２１６８０およびＡ２Ａ作用薬であるメトトレキサート（ＭＴＸ）のＡＢＣＡ１レベルに及ぼす効果がアデノシンＡ２Ａ受容体拮抗薬により抑制されることを示す棒グラフ。
【図４ｂ】Ａ２Ａ作用薬であるＣＧＳ-２１６８０およびＡ２Ａ作用薬であるメトトレキサート（ＭＴＸ）のＡＢＣＡ１レベルに及ぼす効果がアデノシンＡ２Ａ受容体拮抗薬により抑制されることを示す棒グラフ。
【００１９】
【図５】種々の濃度レベルでＭＴＸを用いた場合の２７−ＯＨアーゼのレベルに及ぼすＮＳ−３９８およびＭＴＸの効果を示す棒グラフ。
【００２０】
【図６ａ】２７−ＯＨアーゼのレベルおよびＡＢＣＡ１のレベルに及ぼすＭＴＸ、Ａ２Ａ拮抗薬、アテローム性動脈硬化を促進するサイトカイン、ＩＦＮ−γ、ＮＳ−３９８およびこれらの組み合わせの効果を示す棒グラフ。
【図６ｂ】２７−ＯＨアーゼのレベルおよびＡＢＣＡ１のレベルに及ぼすＭＴＸ、Ａ２Ａ拮抗薬、アテローム性動脈硬化を促進するサイトカイン、ＩＦＮ−γ、ＮＳ−３９８およびこれらの組み合わせの効果を示す棒グラフ。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
我々は、ぜんそくおよび炎症治療法の開発や心筋イメージングに現在用いられているものを含むアデノシンＡ２Ａ受容体作用薬に、ＲＣＴタンパク質の発現を増大させることによって、ＣＯＸ阻害薬またはＣＯＸ−２選択的阻害薬により生じるＲＣＴプロセスの異常を実質的に抑制する予期せぬ効果があることを見出した。Ａ２Ａ受容体作用薬は、さらに、動脈壁に付着して、プラークの沈着やアテローム性動脈硬化を引き起こす有害な脂質含有泡沫細胞の生成を阻害する。
【００２２】
ＲＣＴプロセスの異常を抑制するために有効なＡ２Ａ受容体作用薬の量はごく微量であり、ぜんそくや炎症の治療やイメージングの目的に必要な投与量のほんの一部に過ぎない。Ａ２Ａ受容体作用薬は、ナノモルレベルのＡ２Ａ受容体作用活性を備え、かつ、高親和性Ａ２Ａ受容体部位を飽和するのに十分な量が存在している必要がある。［３Ｈ］ＮＥＣＡを用いて飽和分析を行なったところ、ヒトＡ２Ａアデノシン受容体のＫＤ値は２０ｎＭであった。
【００２３】
所定のＡ２Ａ受容体作用薬の活性半減期が、ＣＯＸ阻害薬またはＣＯＸ−２阻害薬と同時にＡ２Ａ受容体作用薬を投与する決定要因となる。すなわち、所定のＡ２Ａ受容体作用薬活性半減期により必要な投与回数が決まる。Ａ２Ａ受容体作用薬の投与は、Ａ２Ａ受容体部位を飽和状態に保つために必要な時間間隔で行なう必要がある。ＣＧＳ−２１６８０（０．３ｍｇ／ｋｇ）の静脈内投与後のラットにおける終末相半減期は非常に短い（１９±４分）が、新しい薬剤は先行する薬剤に比べてより長い半減期を持つ。
【００２４】
Ａ２Ａ受容体の飽和状態を保つために必要な量および受容体の飽和状態を保つために必要な（Ａ２Ａ作用薬の半減期に応じた）期間を許容可能なリスクレベルに応じたものにすることにより、ＣＯＸ阻害薬またはＣＯＸ−２阻害薬の投与と同時にＡ２Ａ作用薬を長期間にわたって投与した場合に考えられる副作用を最小限に抑える。
【００２５】
アデノシンＡ２Ａ作用薬は他の受容体部位に対する活性も持つことが多いが、Ａ２Ａ受容体に特異的なＡ２Ａ作用薬は、効率が高く、コレステロール代謝機能の修復に関係しない他のアデノシン受容体の活性により生じる副作用を最小限に抑えることができる可能性が高い。現在のところ、別の受容体に対する活性も有する既存のＡ２Ａ作用薬に加えて、新しい特異的Ａ２Ａ作用薬の開発が進められており、ヒトへの使用が承認される様々な段階にある。他に特に規定しない限り、「Ａ２Ａ受容体作用薬」には、Ａ２Ａ受容体作用薬のｉｎ ｓｉｔｕ（その場）生成を介在する役割を果たす物質が含まれる。
【００２６】
現在知られているアデノシン受容体サブタイプとしては、Ａ１、Ａ２Ａ、Ａ２ＢおよびＡ３があるが、本発明に従うＲＣＴ修復に効果があるのは、Ａ２Ａ受容体部位の活性のみである。アデノシン自体の半減期は非常に短く、直接投与しても効果を発揮することはできない。本発明に従うＲＣＴ修復にＡ２Ａ受容体作用薬として効果のある適当な物質を以下に挙げる。メトトレキサート（ＭＴＸ）は、ヒトへの使用が承認されており、がんの治療に大量投与で、また、関節リウマチ（ＲＡ）の治療選択薬としてより少量の投与で用いられる。ＭＴＸは、それ自体がＡ２Ａ作用薬なのではなく、Ａ２Ａ作用薬としての活性を有するアデノシン放出を介在する。したがって、ＭＴＸは、本明細書で言うところのＡ２Ａ作用薬としての活性を持つ。実験的に利用可能な（ヒトへの使用は未承認）ＣＧＳ-２１６８０は、（他の受容体に対する活性を有してはいるが）主にＡ２Ａ作用薬として働き、コレステロール代謝機能の修復に有効な物質である。
【００２７】
開発されたおよび／またはヒトへの使用が承認された本発明に有用な他のＡ２Ａ受容体作用薬としては、ビノデノソン（ｂｉｎｏｄｅｎｏｓｏｎ）（ＣｏｒＶｕｅ（登録商標））、ＭＲＥ−００９４、ＵＫ−３７１１０４、ＡＴＬ３１３、レガデノソン（ｒｅｇａｄｅｎｏｓｏｎ）（レキスキャン（Ｌｅｘｉｓｃａｎ）（登録商標））、アパデノソン（ａｐａｄｅｎｏｓｏｎ）、ＡＰＥＣおよび２ＨＥ−ＮＥＣＡが挙げられる。
【００２８】
以下、本明細書で用いた実験方法、物質および結果を詳述する。
【００２９】
ＴＨＰ−１ヒト単球およびマクロファージにおけるコレステロール排出に関係するいくつかのタンパク質の発現に及ぼすＣＯＸ阻害剤の効果を評価した。我々は、ＣＯＸ−１および／またはＣＯＸ−２の薬理学的阻害作用が、２７−ＯＨアーゼおよびＡＢＣＡ１の発現を低下させて、泡沫細胞形成の増大とアテローム性動脈硬化を引き起こすことを見出した。
【００３０】
図１ａおよび図１ｂに、１０μＭおよび５０μＭの投与濃度でセレコキシブを用いた場合にＡＢＣＡ１遺伝子発現とタンパク質発現が減少する様子を示す。この結果から、少なくとも部分的に、ＣＯＸ阻害に伴うアテローム生成性向を説明することができる。ＣＯＸ−２選択的阻害薬であるＮＳ−３９８は、図２ａおよび図２ｂに示すように、ＴＨＰ−１単球およびマクロファージにおける２７−ＯＨアーゼおよびＡＢＣＡ１のメッセージおよびタンパク質を用量依存的に著しく減少させた。ＮＳ−３９８は、ＴＨＰ−１における２７−ＯＨアーゼのｍＲＮＡを対照群の６２．４±２．２％まで減少させた（５０μＭ、ｎ＝３、ｐ＜０．００１）。ＮＳ−３９８で処理したＴＨＰ−１マクロファージ群は、未処理細胞群と比べて、脂質含有泡沫細胞形成に対するぜい弱性が増大し、ＴＨＰ−１マクロファージ群では、対照群と比べて、ＮＳ−３９８の存在下で泡沫細胞形質転換の著しい増加がみられた（４２．７±６．６％対２０．１±３．４％、ｐ＝０．０４）。
【００３１】
我々は、また、免疫反応物質が、コレステロールを循環系を介して最終的に排出させるための細胞外への逆輸送に関係する二つのタンパク質、すなわち、コレステロール２７−ＯＨアーゼおよびＡＢＣＡ１、の発現を低下させることによって、コレステロール過負荷に対する細胞防御を阻害することを見出した。図６ａおよび図６ｂに示すように、アテローム性動脈硬化促進サイトカインＩＦＮ−γが、ヒトＴＨＰ−１単球／マクロファージにおける２７−ＯＨアーゼおよびＡＢＣＡ１のメッセージおよびタンパク質の発現を減少させることも見出した。
【００３２】
さらに、ＩＦＮ−γ処理したＴＨＰ−１マクロファージ群では、未処理細胞の対照群と比べて、泡沫細胞の形成速度および割合が増大した。ＴＨＰ−１単球／マクロファージにおけるシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）阻害は、用量依存的に２７−ＯＨアーゼおよびＡＢＣＡ１を減少させることにより、アテローム生成を促進させる作用がある。ＴＨＰ−１マクロファージ群は、対照群と比較して、ＣＯＸ−２選択的阻害薬であるＮＳ−３９８の存在下で泡沫細胞形質転換を著しく増大させた。これは、コレステロール逆輸送系（ＲＣＴ：Reverse cholesterol transport）の低下または異常が、ＣＯＸ−２阻害剤で治療した患者における周知の心血管系のリスクの増大に寄与していることを示す。
【００３３】
我々は、これらのタンパク質が、ＣＧＳ−２１６８０およびＭＲＥ−００９４を含む特異的Ａ２Ａ作用薬を用いたアデノシンＡ２Ａ受容体の活性を介して、コレステロール代謝機能の正常化に向けての上方制御が可能であることを見出した。Ａ２Ａ受容体のライゲーション（連結反応）は、コレステロール負荷条件下でマクロファージの泡沫細胞形質転換を阻害した。我々は、メトトレキサート（ＭＴＸ：methotrexate）が、コレステロール代謝および泡沫細胞形成に対するぜい弱性を変化させて、ＩＦＮ−γまたはＣＯＸ−２選択的阻害薬に暴露させたＴＨＰ−１単球／マクロファージにおけるコレステロール過負荷性向を低下させることを見出した。ＭＴＸは、アデノシンを放出させることによって、アテローム性動脈硬化症（ＡＳＣＶＤ：atherosclerotic cardiovascular disease）を防ぐ役割を果たす。ＭＴＸは、アデノシンＡ２Ａ受容体作用薬自体ではないが、Ａ２Ａ受容体作用活性を有するアデノシン供給源となるため、本発明の範囲内においてＡ２Ａ受容体作用薬に含まれる。
【００３４】
以下に詳述するように、我々は、ＣＯＸ−２阻害薬類がＲＣＴプロセスの周知のコレステロール代謝機能を乱し、その結果、コレステロールの残留および脂質含有泡沫細胞の形成を引き起こすことを立証した。図１ａおよび図１ｂに、セレコキシブには、対照群と比べて、ＡＢＣＡ１遺伝子およびタンパク質の発現を低下させる効果があることを示す。図２ａおよび図２ｂに、ＣＯＸ−２阻害薬ＮＳ−３９８により、ＴＨＰ−１における２７−ＯＨアーゼが用量依存的で連続的に減少する様子（図２ａ）およびＴＨＰ−１におけるＡＢＣＡ１が用量依存的で連続的に減少する様子（図２ｂ）を示す。
【００３５】
さらに、我々は、アデノシンＡ２Ａ受容体作用薬が、コレステロール代謝機能を修復することを証明した。図３ａにＡ２Ａ作用薬であるＣＧＳ−２１６８０を用いた場合にＴＨＰ−１における２７−ＯＨアーゼレベルが改善する様子を示す。図３ｃ、図３ｄおよび図５に、ＭＴＸを用いた場合に、ＮＳ−３９８によって減少したレベルから２７−ＯＨアーゼレベルが改善する様子を示す。図４ｂに、ＭＴＸを用いた場合に、ＭＳ−３９８によって減少したＡＢＣＡ１メッセージが改善する様子を示す。
【００３６】
また、我々は、アデノシンＡ２Ａ受容体の活性がコレステロール代謝機能の異常および修復の制御に関与していることを証明した。図３ｂに、Ａ２Ａ作用薬であるＡＴＬ３１３に、ＴＨＰ−１における２７−ＯＨアーゼレベルを上昇させる効果があることを示す。ＡＴＬ３１３がＴＨＰ−１マクロファージにおける２７−ＯＨアーゼのメッセージを増大させる役割を果たす一方、ＺＭ−２４１３８５（ＺＭ）は逆の働きを示す。図３ｂの４本の棒グラフが示すＴＨＰ−１マクロファージの処理条件は、左から右にそれぞれ以下の通りであった。１）０．５ｎＭのＤＭＳＯ（賦形剤）に１８時間、２）１０ｎＭのＡＴＬ３１３に１８時間、３）１０-5ＭのＺＭで１時間予備培養後、さらに１０ｎＭのＡＴＬ３１３に１８時間、４）１０-5ＭのＣＧＳ−２１６８０で１８時間。総ＲＮＡを抽出させて、ＱＲＴ−ＰＣＲ（定量ポリメラーゼ連鎖反応）で２７−ＯＨアーゼのｍＲＮＡに対する評価を行なった。ＧＡＰＤＨメッセージ増幅を内部コントロールとして用いた。
【００３７】
様々な組み合わせのＣＯＸ−２選択的阻害薬およびアデノシンＡ２Ａ受容体作用薬を用いた場合の２７−ＯＨアーゼおよびＡＢＣＡ１のレベルを定量した（ＭＴＸはＡ２Ａ受容体作用薬特性を有するアデノシンの生成を介在するため、本明細書では説明を簡単にするために、Ａ２Ａ作用薬の一つとみなす）。
【００３８】
上述したように、試験に用いたＮＳ−３９８（利用可能なＣＯＸ−２選択的阻害薬）およびセレコキシブ（米国において唯一市販されているＣＯＸ−２選択的阻害薬）は、いずれも、コレステロール代謝機能の異常を引き起こした。特異的Ａ２Ａ受容体作用薬であるＭＴＸ、ＣＧＳ−２１６８０、ＭＲＥ−００９４およびＡＴＬ３１３は、すべて、コレステロール代謝機能を修復させた。
図３ｂないし図３ｄ、図４ａ、図４ｂ、図６ａおよび図６ｂに示すように、Ａ２Ａ受容体部位をブロックする周知のＡ２Ａ拮抗薬であるＺＭ−２４１３８５を用いた場合に、Ａ２Ａ作用薬によるコレステロール代謝機能の修復が妨害されることは、Ａ２Ａ受容体活性が修復に関係していることの証拠となる。
【００３９】
ＭＴＸは、アデノシンの放出と心血管系のリスクの両方に影響を与えることが知られているため、ＭＴＸを用いて、コレステロール代謝および泡沫細胞形成に対するぜい弱性に変化が生じたか否かを判定した。我々は、ＭＴＸ処理が、ＩＦＮ−γまたはＣＯＸ−２選択的阻害薬に暴露させたＴＨＰ−１単球／マクロファージにおけるコレステロール過負荷性向を低下させることを見出した。したがって、ＭＴＸは、コレステロール流出に関与する坑アテローム生成分子の発現を増大させることによって、アテローム性動脈硬化症（ＡＳＣＶＤ）を防ぐ役割を果たす。
【００４０】
ＭＴＸは、単球性細胞株に加えて、末梢血から単離した正常単球において、２７−ＯＨアーゼを増加させる。直接的な生理作用の証拠となるように、末梢血単球として、人体から直接採取した一次細胞を用いた。
【００４１】
セレコキシブすなわちセレブレックス（ファイザー（Ｐｆｉｚｅｒ）社の登録商標）は、直接、培養ＴＨＰ−１単球に採用して、ＡＢＣＡ１を減少させる。これは、ＣＯＸ−２阻害薬であるＮＳ−３９８を用いた結果は、ヒトに用いられる他のＣＯＸ阻害薬にも一般化できることを示している。ＣＯＸ−２サイレンシングの研究により、非薬理学的方法によるＣＯＸ−２遺伝子のスイッチオフも同様に作用することがわかった。
【００４２】
セレコキシブは、ＴＨＰ−１マクロファージにおける泡沫細胞形成を増大させるため、セレコキシブは、遺伝子発現に影響を与えるのみではなく、アデノシンの放出に関与する経路を介して、コレステロールを除去し、脂質の過負荷（アテローム性動脈硬化につながるプラーク形成を開始する重要なプロセス）を防御する細胞の能力を弱める。
【００４３】
ＭＴＸに加え、Ａ２Ａ作用薬であるＣＧＳ−２１６８０も、マウス単球およびヒト単球における２７−ＯＨアーゼおよびＡＢＣＡ１のメッセージを増大させることが見出された。
【００４４】
アデノシンの効果を再現するまたはブロックする数多くの様々な受容体特異性の高いアデノシン受容体作用薬および拮抗薬が開発されている。我々は、選択的Ａ２Ａ受容体作用薬である２−（４−（２−カルボキシエチル）フェネチルアミノ）−５’−Ｎ−エチルカルボキサミドアデノシン（ＣＧＳ−２１６８０）を１０-5Ｍの濃度（３時間、３７℃、５％ＣＯ2条件）で用いたところ、Ｂａｌｂ／ｃマウスマクロファージにおける２７−ＯＨアーゼのｍＲＮＡ発現が４７±６．２％（各群ｎ＝３、スチューデントのｔ検定、ｐ＜０．００２）増大した。これは、内因性物質による２７−ＯＨアーゼのｍＲＮＡ発現の上方制御を最初に実証したものであると考えられる。ＣＧＳ−２１６８０に暴露させたマウス細胞における２７−ＯＨアーゼの上方制御に基づいて、ヒト単球様細胞における同様の効果を実証した。ＴＨＰ−１細胞において、ＡＢＣＡ１のｍＲＮＡは２７−ＯＨアーゼに合わせて増加した。Ａ２Ａ受容体拮抗薬であるＺＭ−２４１３８５の存在下および非存在下で、ＴＨＰ−１細胞をＣＧＳ−２１６８０に暴露させたところ、図４ａに示すように、拮抗薬の存在下では、２７−ＯＨアーゼおよびＡＢＣＡ１のメッセージレベルがいずれも増加しないことがわかった。
【００４５】
ＴＨＰ−１細胞において、ＣＧＳ−２１６８０は、用量依存的に１．８倍まで２７−ＯＨアーゼのメッセージを増大させた。より選択的なＡ２Ａ受容体作用薬であるＭＲＥ−００９４は、ＴＨＰ−１における２７−ＯＨアーゼ（２倍）およびＡＢＣＡ１（１．８倍）のｍＲＮＡ発現を増大させた。Ａ２Ａ受容体拮抗薬であるＺＭ−２４１３８５は、これら２７−ＯＨアーゼおよびＡＢＣＡ１のメッセージを増大させるＭＲＥ−００９４の効果を抑制した。
【００４６】
最近まで、静脈内投与が必要であることと、化合物の半減期が短いことが、Ａ２Ａ受容体作用薬の臨床的使用の大きな障害となっていた。新しく開発された持続性経口活性Ａ２Ａ受容体リガンドには、新しい有望な作用薬であるＡＴＬ３１３が含まれている。ＡＴＬ３１３は、培養下のＴＨＰ−１マクロファージにおいて強力な抗アテローム生成効果を発揮し、この結果は、ＣＧＳ−２１６８０を用いた結果と合致する。図３ｂに示すように、ＡＴＬ３１３は、ＴＨＰ−１マクロファージにおける２７−ＯＨアーゼおよびＡＢＣＡ１のｍＲＮＡおよびタンパク質を増加させ、一方、ＺＭ−２４１３８５は、これらの効果をブロックする。
【００４７】
ＲＣＴ修復にＡ２Ａ受容体の身が特異的に関わっていることを実証するために、以下の試験を行なった。
【００４８】
ＣＧＳ−２１６８０は、アデノシンＡ２Ａ受容体の活性剤として用いたところ、２７−ＯＨアーゼレベルに対するＮＳ−３９８の効果が抑制された。ただし、ＣＧＳ−２１６８０はＡ１受容体に結合する等他の作用を行なう可能性があるため、Ａ２Ａ受容体のライゲーションがＣＯＸ−２効果の抑制に関与していると結論付けることはできない。
【００４９】
効果にＡ２Ａが介在していることを確認する重要な局面として、Ａ２Ａ受容体をブロックしてオンできないようにするＡ２Ａ拮抗薬であるＺＭ−２４１３８５を加えてＡ２Ａ受容体をブロックした場合に、効果の喪失が生じた。ＣＯＸ−２阻害薬を（アデノシンの放出を引き起こす）ＭＴＸと混ぜた場合、ＭＴＸは、ＺＭ−２４１３８５の存在下でＣＯＸ−２阻害薬が２７−ＯＨアーゼおよびＡＢＣＡ１を減少させることを妨げられなかった。これにより、ＭＴＸすなわちＡ２Ａ作用薬は、一般的にＡ２Ａ受容体にアクセスできない状態では作用不能であることがはっきりと示された。
【００５０】
ヒトに投与可能な経口投与および経口活性薬剤であるＭＴＸおよびＡＴＬ３１３を以下に説明するようにテストした。
【００５１】
Ａ２Ａ受容体作用薬ＣＧＳ−２１６８０の効果を調べたが、ＣＧＳ−２１６８０は注入による投与が必須があり、現在のところ、ヒトではなく動物に実験的に用いられるものであるため、ＣＧＳ−２１６８０の使用が不都合な可能性があることに注目する必要がある。メトトレキサートおよび特異的Ａ２Ａ薬剤であるＡＴＬ３１３（アデノシンセラピューティクス（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）社により開発）は、いずれも経口活性があり、一連のＡＴＬアデノシンＡ２Ａ作用薬は、臨床試験中であるか、様々な疾患に対してヒトへの使用承認が近い状態である。ＡＴＬ３１３を、餌に混ぜて、最初は６時間ごとに５μｇ／ｋｇの量で、敗血症のマウス検体に対して投与した。餌に混ぜるＡＴＬ３１３の投与量を、その後、３０μｇ／ｋｇ／日とした。ヒト関節リウマチに対する典型的なＭＴＸの投薬処方は、１０ｍｇ／週のＭＴＸ投与量で開始して、第８週目までに２０ないし２５ｍｇ／週に用量増加させる。
【００５２】
Ａ２Ａ作用薬としてＭＴＸを、また、ＣＯＸ−２阻害薬としてＮＳ−３９８を用いた試験を以下に説明するように実施したところ、泡沫細胞形成が減少した。
【００５３】
脂肪過負荷マクロファージ由来の泡沫細胞は、アテローム性動脈硬化のすべての段階で基本的な役割を果たす。ＮＳ−３９８へのマクロファージの暴露とコレステロール過負荷を防御する細胞の能力との間に、直接的な生理学的因果関係があることが示された。一連の実験を行なった結果、アセチル化ＬＤＬの存在下でＮＳ−３９８に暴露することによりＴＨＰ−１マクロファージからの泡沫細胞形成が顕著に増大すること、ならびに、この泡沫細胞形成増大効果がＭＴＸにより軽減されることが実証された。ＭＴＸによる増大効果の軽減は、Ａ２Ａ受容体の活性に起因するものであるため、ＺＭ−２４１３８５がＭＴＸによるＮＳ−３９８誘導泡沫細胞形成の低下を妨害することがわかった。コレステロール２７−ＯＨアーゼおよびＡＢＣＡ１に対するＭＴＸおよびＮＳ−３９８の効果は、脂肪暴露ＴＨＰ−１マクロファージで見られる生理学的現象と密接に関係している。
【００５４】
方法：材料およびソース
このセクションでは、ａ）ＣＯＸ阻害薬によるコレステロール代謝異常、ｂ）２７−ＯＨアーゼおよびＡＢＣＡ１レベルにより測定したコレステロール代謝の修復、およびｃ）２７−ＯＨアーゼおよびＡＢＣＡ１レベルにより測定したコレステロール代謝の異常および修復の両方にＡ２Ａ受容体のみが関わっていることを示すために行なわれる、以下のすべての実験に用いられる生体物質（生物材料）を含む材料の概要を示す。
【００５５】
細胞および試薬
ＴＨＰ−１単球は、アメリカ合衆国培養細胞系保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣ、バージニア州マナッサス）から入手した。Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色色素およびＯｐｔｉＰｒｅｐ密度勾配遠心分離媒体は、シグマ（Ｓｉｇｍａ）社から購入した（ミズーリ州セントルイス）。トリゾール（ＴＲＩｚｏｌ）試薬は、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社（ニューヨーク州グランドアイランド）から購入した。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）試薬は、すべてアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社、ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）社から購入した。組み換えヒトＩＦＮ−γは、Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）社（ミネソタ州ミネアポリス）から購入した。ＮＳ−３９８は、ＲＢＩシグマ（ＲＢＩ−Ｓｉｇｍａ）社（マサチューセッツ州ナティック）から購入した。ＭＴＸは、ベッドフォード・ラボラトリーズ（Ｂｅｄｏｆｏｒｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社（オハイオ州ベッドフォード）から購入した。アセチル化ＬＤＬは、イントラセル（Ｉｎｔｒａｃｅｌ）社（ワシントン州イサクアー）から購入した。抗コレステロール２７−ＯＨアーゼ抗体は、コレステロール２７−ＯＨアーゼタンパク質の１５−２８残基に対するウサギのアフィニティー精製抗ペプチドポリクロナール抗体である。
【００５６】
生体物質の調整
細胞培養
ＴＨＰ−１単球を５％ＣＯ2雰囲気下３７℃で細胞１０6個／ｍｌの密度まで増殖させ。ＴＨＰ−１細胞の増殖培地として、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ：Fetal Bovine Serum）（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社、ニューヨーク州グランドアイランド）、５０ユニット／ｍｌのペニシリンおよび５０ユニット／ｍｌのストレプトマイシンを加えたＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）を用いた。マクロファージへの分化を促進するために、１２ウェルプレートでＴＨＰ−１単球（細胞１０6個／ｍｌ）を１００ｎＭのＰＭＡ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）社）で３７℃４日間処理した。
【００５７】
ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞、peripheral blood mononuclear cell）単離
健康なドナーから採取した血液をＥＤＴＡ処理管に入れて、プール処理し、４℃で保持する。メーカーの使用説明書に従って、ＯｐｔｉＰｒｅｐ密度勾配遠心分離媒体（シグマ（Ｓｉｇｍａ）社）を加えて、プール処理した血液の濃度を１．１２０ｇ／ｍｌに調整した。次に、１０％ＦＳＢおよびＯｐｔｉＰｒｅｐ媒体を含有する完全ＲＰＭＩ培地から成る１．０７４ｇ／ｍｌ濃度の溶液を血液に重層した。その上に１０％ＦＳＢを含有する完全ＲＰＭＩ培地を重層して、単球がプラスチック管にくっつかないようにした。血液を７５０Ｇ、４℃で３０分間遠心分離した。遠心分離後、１．０７４ｇ／ｍｌ濃度の溶液層とＲＰＭＩ培地層の間から、間期単球を採取した。採取した細胞を２容量の完全ＲＰＭＩ培地で希釈して、遠心分離により採取した。得られたペレットを完全ＲＰＭＩ培地に再懸濁させた。血球計で単球の数を計測し、２×１０6個／ウェルの細胞密度で６ウェルプレートを作成した。
【００５８】
方法：ＣＯＸ阻害剤とアデノシンＡ２Ａ作用薬および拮抗薬との組み合わせ
ＴＨＰ−１細胞
ＴＨＰ−１細胞を１０6個／ｍｌまで増殖させた後、培地を吸引し、カルシウムとマグネシウムを含まないダルベッコ・リン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ：Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline）で細胞を２回洗浄した。次に、以下の条件下で単球を６ウェルプレートで２４ないし４８時間培養した（３７℃、５％ＣＯ2）。ａ）ＲＰＭＩコントロール、ｂ）ＭＴＸ（５ｍＭ）含有ＲＰＭＩ、ｃ）ＮＳ−３９８（５０μＭ）含有ＲＰＭＩ、ｄ）ＮＳ−３９８（５０μＭ）およびＭＴＸ（含有量を０．１μＭ、０．５μＭ、５μＭと増加）含有ＲＰＭＩ、ｅ）ＩＦＮ−γ（５００Ｕ（ユニット）／ｍｌ）含有ＲＰＭＩ、およびｆ）ＩＦＮ−γ（５００Ｕ（ユニット）／ｍｌ）およびＭＴＸ（５μＭ）含有ＲＰＭＩ。
【００５９】
ＴＨＰ−１マクロファージを以下の条件で処理した。ａ）ＲＰＭＩコントロール、ｂ）ＺＭ−２４１３８５（１０μＭ）含有ＲＰＭＩ、ｃ）ＭＴＸ（５μＭ）含有ＲＰＭＩ、ｄ）ＩＦＮ−γ（５００Ｕ（ユニット）／ｍｌ）含有ＲＰＭＩ、ｅ）ＩＦＮ−γ（５００Ｕ（ユニット）／ｍｌ）およびＭＴＸ（５μＭ）含有ＲＰＭＩ、ｆ）ＺＭ−２４１３８５（１０μＭ）およびＭＴＸ（５μＭ）含有ＲＰＭＩ、ｇ）ＩＦＮ−γ（５００Ｕ（ユニット）／ｍｌ）、ＺＭ−２４１３８５（１０μＭ）およびＭＴＸ（５μＭ）含有ＲＰＭＩ、およびｈ）ＮＳ−３９８（５０μＭ）、ＺＭ−２４１３８５（１０μＭ）およびＭＴＸ（５μＭ）含有ＲＰＭＩ。
【００６０】
培養期間後直ちに、細胞を採取して、室温で１５００ＲＰＭで遠心分離した。培地を吸引して、細胞タンパク質およびＲＮＡを単離した。図６ａおよび図６ｂに得られた２７−ＯＨアーゼおよびＡＢＣＡ１レベルの測定値を示す。
【００６１】
ＰＢＭＣ
５μＭの濃度でＭＴＸを添加したまたは添加しない１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ培地で１８時間ＰＢＭＣを培養した。細胞を採取して、ＲＮＡを単離した。
【００６２】
ＴＨＰ−１およびＰＢＭＣの他の実験条件として、以下のパラメータおよび条件を採用した。ＴＨＰ−１単球を細胞１０6個／ｍｌまで増殖させた後、培地を吸引し、カルシウムとマグネシウムを含まないダルベッコ・リン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）で細胞を２回洗浄した。次に、以下の条件下で単球を６ウェルプレートで培養した（３７℃、５％ＣＯ2）。ａ）ＲＰＭＩコントロール、ｂ）１０μＭのＮＳ−３９８（１８時間）、ｃ）５０μＭのＮＳ−３９８（１８時間）、ｄ）１０μＭのセレコキシブ（１８時間）、ｅ）５０μＭのセレコキシブ（１８時間）、ｆ）ＩＦＮ−γ（５００Ｕ（ユニット）／ｍｌ）、ｇ）５０ｎＭのｓｉＲＮＡ（２４時間）、およびｈ）５０ｎＭのｍｏｃｋ ｓｉＲＮＡ（２４時間）。
【００６３】
ＴＨＰ−１マクロファージに、５０μｇ／ｍｌのアセチル化ＬＤＬでコレステロールを負荷し、Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色を行なう前に、さらに４８時間培養した。培養期間後直ちに、細胞を採取して、室温で１５００ＲＰＭで遠心分離した。培地を吸引して、細胞タンパク質およびＲＮＡを単離した。
【００６４】
５０μＭの濃度でセレコキシブを添加したまたは添加しない１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ培地で１８時間ＰＢＭＣを培養した。細胞を採取して、ＲＮＡを単離した。
【００６５】
結果
ＲＮＡ単離および定量
１０6個の細胞に対して１ｍｌのトリゾール試薬を用いて、ＲＮＡを単離して、ヌクレアーゼを含まない水に溶解させた。紫外分光光度法（日立Ｕ２０１０分光光度計）によりクオーツキュベットを用いて、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍの波長の吸収から、各条件におけるＲＮＡの総量を測定した。
【００６６】
２７−ＯＨアーゼのＲＴ−ＰＣＲ分析
リアルタイムＰＣＲで２７−ＯＨアーゼおよびＡＢＣＡ１のｍＲＮＡを定量した。オリゴｄＴに感作されたＭ−ＭＬＶ逆転写酵素を用いて、ｃＤＮＡを５μｇの総ＲＮＡから複製した。コレステロール２７−ＯＨアーゼ特異的プライマーまたはＡＢＣＡ１特異的プライマーならびにグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ：glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）コントロールプライマーを用いたＰＣＲ増幅を行なうために、各ＲＴ（逆転写酵素）反応混合物から同量のｃＤＮＡを採取した。コレステロール２７−ＯＨアーゼ特異的プライマーは、ヒトコレステロール２７−ＯＨアーゼのｃＤＮＡ（２４）のヌクレオチド４９１−８０２を包含する３１１塩基対配列から成る。ＡＢＣＡ１プライマーは、２３４塩基対増幅断片から成る。サイバーグリーン（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ）ＰＣＲ試薬キット（アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社）を用いて、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ＭＸ３００５Ｐ ＱＰＣＲ（定量ＰＣＲ）システムでリアルタイムＰＣＲ分析を行なった。
【００６７】
以下の手法でＰＣＲを行なった。各ＰＣＲ反応には、２．５μｌの１０ｘグリーンフルオレッセント（緑色蛍光）バッファと、３μｌの２５ｍＭ ＭｇＣｌ2、２μｌのｄＮＴＰ混合物（２５００μＭのｄＣＴＰ、２５００μＭのｄＧＴＰ、２５００μＭのｄＡＴＰおよび５０００μＭのｄＵＴＰ）、０．１５μｌのポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社）、０．２５μｌのウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）（１Ｕ／μｌＵＮＧ、ＡｍｐＥｒａｓｅ、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社）、０．５μｌのフォワード（順方向）およびリバース（逆方向）プライマー（１０μＭ濃度）、および４μｌのｃＤＮＡを用いて、水で最終的な容量を２５μｌに調整した。温度サイクルパラメータとして以下の条件を用いた。９５℃で５分間保持することによりポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社）を活性化させた後、９５℃で３０秒間、５８℃で４５秒間、７２℃で４５秒間のサイクルを４５サイクル繰り返す。各反応を３回ずつ（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅで）行なった。
【００６８】
メーカー（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））から提供されたソフトウェアを用いて、ＰＣＲ生成物の量を推定した。ＰＣＲサイクルの完了後、６０℃から９５℃まで３５℃の温度勾配で、反応物質を熱変性させた。検体間のｃＤＮＡ量の差を補正するために、ターゲットＰＣＲを内在性ハウスキーピング遺伝子であるグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）およびβアクチンを用いたリファレンスＰＣＲで正規化した。有意なレベルの汚染物質の有無をチェックするために、各プライマー対にはテンプレートではないコントロールを含有させた。蛍光発光スペクトルを監視し、分析した。特定の蛍光が検出可能な閾値サイクル（ＣＴ値）を用いて、ＰＣＲ生成物を測定した。ＣＴ値は、動態解析に用いられ、検体における目標複製量の初期値に比例する。融解曲線解析を行ない、ＰＣＲ増幅生成物の特異性の評価を行なった。連続希釈ＣＴ値を対照群と比較後、検体の量を算出した。精製したＰＣＲ生成物を１：１０に連続希釈することにより、ＱＲＴ−ＰＣＲ標準を調整した。
【００６９】
ウエスタンブロット
ＲＩＰＡ（放射性免疫沈降法）溶解バッファ（９８％ＰＢＳ、１％Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ−６３０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム［ＳＤＳ：sodium dodecyl sulfate］）を用いて、ウエスタン免疫ブロット用に全細胞溶解物を調整した。１００μｌのＲＩＰＡ溶解バッファと１０μｌのプロテアーゼ・インヒビター・カクテル（シグマ（Ｓｉｇｍａ）社）を各条件下の細胞ペレットに加えて、５分ごとにボルテックスを行ないながら、氷上で３５分間培養した。エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）５４１５Ｃ遠心分離機を用いて、１０分間、４℃、１０，０００Ｇで遠心分離後、上澄みを採取した。日立Ｕ２０１０分光光度計を用いて、５６０ｎｍの波長の吸収から、各上澄みに含まれるタンパク質の量を測定した。
【００７０】
全細胞溶解物を用いて、ウエスタンブロットを行なった。タンパク質検体（２０μｇ／レーン）を５分間沸騰させて、１０％ポリアクリルアミドゲル上に載せて、１００Ｖで１．５時間電気泳動を行なった後、半乾きのトランスブロット装置内のニトロセルロース膜に移して、１００Ｖで１時間処理した。ニトロセルロース膜は、４℃で４時間ブロッキング溶液（３％脱脂粉乳の１ｘＴｗｅｅｎ２０トリス緩衝食塩水［ＴＴＢＳ：1xTween20-tris-buffered saline］溶解液）でブロッキングした後、４℃で一晩、一次抗体（１８．７μｇ／ｍｌ）とブロッキング溶液の１：３００希釈液に浸漬した。一次抗体として、コレステロール２７−ＯＨアーゼタンパク質の１５−２８残基に対するウサギのアフィニティー精製抗ペプチドポリクロナール抗体を用いた。次の日に、膜をＴＴＢＳで５分間ずつ５回洗浄したのち、ＥＣＬロバ抗ウサギＩｇＧ西洋わさびペルオキシダーゼ結合種特異全抗体（アマシャム・バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社、製品コードＮＡ９３４）の１：３０００希釈液で室温で培養した。ＴＴＢＳで５回洗浄を繰り返したのち、ＥＣＬウエスタンブロット検出試薬（アマシャム・バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社、カタログ番号ＲＰＮ２１０６）およびＳＲＸ−１０１Ａ（コニカミノルタ（Ｋｏｎｉｃａ Ｍｉｎｏｌｔａ））を用いたフィルム現像により、免疫反応性タンパク質を検出した。
【００７１】
対照群として、同じ膜上で、マウス抗βアクチン（１：１０００希釈液、アブカム（ａｂＣａｍ）社、製品コードａｂ６２７６）およびＥＣＬヒツジ抗マウスＩｇＧ西洋わさびペルオキシダーゼ結合種特異全抗体（１：２０００希釈液、アマシャム・バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社、製品コードＮＡ９３１）を用いて、上記と同様の工程で、βアクチンを検出した。
【００７２】
ＡＢＣＡ１検出
ＡＢＣＡ１の検出は、マクロファージ細胞溶解物を１００Ｖで１．５時間電気泳動（１０％ポリアクリルアミドゲル）した後、ニトロセルロース膜に移した。膜は、４℃で４時間ブロッキング溶液でブロッキングした後、ウサギ抗ＡＢＣＡ１抗体（サンタクルーズ・バイオテクノロジー（Ｓａｍｔａ Ｃｒｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社）の１：２００希釈液で４℃で一晩培養した。次の日に、膜をＴＴＢＳで５分間ずつ５回洗浄したのち、ＥＣＬロバ抗ウサギＩｇＧ西洋わさびペルオキシダーゼ結合種特異全抗体の１：５０００希釈液で室温で培養した。２７−ＯＨアーゼ抗体に関して上述したものと同様に検出を行った。
【００７３】
泡沫細胞分析
マクロファージへの分化を促進するために、１２ウェルプレートでＴＨＰ−１ヒト単球（細胞１０6個／ｍｌ）を１００ｎＭのＰＭＡ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）社）で３７℃４日間処理した。分化したマクロファージをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：phosphate-buffered saline）で３回洗浄した後、以下の条件下でさらにＲＰＭＩ培地（３７℃、５％ＣＯ2）で４８時間培養した。ａ）アセチル化ＬＤＬ（５０μｇ／ｍｌ）、ｂ）アセチル化ＬＤＬ（５０μｇ／ｍｌ）およびＩＦＮ−γ（５００Ｕ／ｍｌ）、ｃ）アセチル化ＬＤＬ（５０μｇ／ｍｌ）およびＩＦＮ−γ中和抗体（１．２μｇ／ｍｌ）、ｄ）アセチル化ＬＤＬ（５０μｇ／ｍｌ）、ＩＦＮ−γ（５００Ｕ／ｍｌ）およびＩＦＮ−γ中和抗体（１．２μｇ／ｍｌ）、ｅ）アセチル化ＬＤＬ（５０μｇ／ｍｌ）およびＩＦＮ−γ受容体抗体（１２５ｎｇ／ｍｌ）、およびｆ）アセチル化ＬＤＬ（５０μｇ／ｍｌ）、ＩＦＮ−γ受容体抗体（１２５ｎｇ／ｍｌ）およびＩＦＮ−γ（５００Ｕ／ｍｌ）。
【００７４】
培養後直ちに、培地を吸引して、４％パラホルムアルデヒド水溶液を用いて、２ないし４分間、培養に用いたものと同じ１２ウェルプレートに細胞を固定した。０．２％Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏメタノール溶液を用いて、１ないし３分間、細胞を染色した。光学顕微鏡（Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２５−Ｚｅｉｓｓ）を用いて、１００倍の倍率で、細胞を観察した後、コダック（Ｋｏｄａｋ）社ＤＣ２９０ズームデジタルカメラで撮影した。各条件で形成された泡沫細胞の数を手作業で計算して、泡沫細胞形成率とした。
【００７５】
データ解析
ＧｒａｐｈＰａｄバージョン４．０２（グラフパッド（ＧｒａｐｈＰａｄ）社カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて統計分析を行った。すべてのデータを一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）で分析し、ボンフェローニ法でコントロール条件と処理条件との一対多重比較を行った。
【００７６】
追加実験：ＴＨＰ−１
ＴＨＰ−１ヒト単球−マクロファージ細胞株は、アメリカ合衆国培養細胞系保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣ、バージニア州マナッサス）から購入した。ＴＨＰ−１細胞を、１０％ＦＢＳ、５０Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび５０Ｕ／ｍｌのストレプトマイシンを加えたＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁させて、単球形態で、５％ＣＯ2雰囲気下３７℃で増殖させた。
【００７７】
ＴＨＰ−１単球を細胞１×１０6個／ｍｌの密度まで増殖させた後、カルシウムとマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した。その後、以下の条件下で新鮮培地を用いて、６ウェルプレートで培養した（１８時間、３７℃、５％ＣＯ2）。ａ）ＲＰＭＩコントロール、ｂ）ＮＳ−３９８（１０ないし１００μＭ：１８時間）、ｃ）ＣＧＳ−２１６８０（１０-5Ｍ、１８時間）およびｄ）ＮＳ−３９８（５０μＭ１８時間）＋ＣＧＳ−２１６８０（１０-5Ｍ、１８時間）。
【００７８】
リアルタイムＰＣＲで２７−ＯＨアーゼおよびＡＢＣＡ１のｍＲＮＡを定量した。オリゴｄＴに感作されたＭ−ＭＬＶ逆転写酵素を用いて、ｃＤＮＡを５μｇの総ＲＮＡから複製した。コレステロール２７−ＯＨアーゼ特異的プライマーまたはＡＢＣＡ１特異的プライマーならびにグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）コントロールプライマーを用いたＰＣＲ増幅を行なうために、各ＲＴ（逆転写酵素）反応混合物から同量のｃＤＮＡを採取した。コレステロール２７−ＯＨアーゼ特異的プライマーは、ヒトコレステロール２７−ＯＨアーゼのｃＤＮＡのヌクレオチド４９１−８０２を包含する３１１塩基対配列から成る。ＡＢＣＡ１プライマーは、２３４塩基対増幅断片から成る。サイバーグリーン（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ）ＰＣＲ試薬キット（アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社）を用いて、メーカーの使用説明書に従ってストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ＭＸ３００５Ｐ ＱＰＣＲ（定量ＰＣＲ）システムでリアルタイムＰＣＲ分析を行なった。
【００７９】
ＲＩＰＡ溶解バッファ（９８％ＰＢＳ、１％Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ−６３０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ）を用いて、ウエスタン免疫ブロット用に全細胞溶解物を単離した。１００μｌのＲＩＰＡ溶解バッファと１０μｌのプロテアーゼ・インヒビター・カクテル（シグマ（Ｓｉｇｍａ）社）を各条件下の細胞ペレットに加えて、５分ごとにボルテックスを行ないながら、氷上で３５分間培養した。エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）５４１５Ｃ遠心分離機を用いて、１０分間、４℃、１０，０００Ｇで遠心分離後、上澄みを採取した。日立Ｕ２０１０分光光度計を用いて、５６０ｎｍの波長の吸収から、各上澄みに含まれるタンパク質の量を測定した。
【００８０】
対照群として、同じ膜上で、マウス抗βアクチン（１：１０００希釈液、アブカム（ａｂＣａｍ）社、製品コードａｂ６２７６）およびＥＣＬヒツジ抗マウスＩｇＧ西洋わさびペルオキシダーゼ結合種特異全抗体（１：２０００希釈液、アマシャム・バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社、製品コードＮＡ９３１）を用いて、上記と同様の工程で、βアクチンを検出した。
【００８１】
ＳｉｇｍａＳｔａｔバージョン２．０３（ＳＰＳＳ社、イリノイ州シカゴ）を用いて、統計分析を行った。階数別一元配置分散分析Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定によりデータを解析した。Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法で一対多重比較を行った。
【００８２】
追加実験：泡沫細胞形成
マクロファージへの分化を促進するために、１２ウェルプレートでＴＨＰ−１ヒト単球（細胞１×１０6個／ｍｌ）を３００ｎＭのホルボール二酪酸（シグマ（Ｓｉｇｍａ）社）で３７℃４８時間処理した。分化したマクロファージをＰＢＳで３回洗浄し、その後、単独で、または、１０μＭのＮＳ−３９８の存在下で培養した（３７℃、５％ＣＯ2、１８時間）。アセチル化ＬＤＬ（５０μｇ／ｍｌ）を用いて細胞にコレステロールを負荷した後、さらに、ＲＰＭＩ培地で４８時間培養した（３７℃、５％ＣＯ2）。実験は３回ずつ（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅで）行った。
【００８３】
培養後直ちに、培地を吸引して、４％パラホルムアルデヒド水溶液を用いて、２ないし４分間、培養に用いたものと同じ１２ウェルプレートに細胞を固定した。０．２％Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏメタノール溶液を用いて、１ないし３分間、細胞を染色した。光学顕微鏡（Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２５−Ｚｅｉｓｓ）を用いて、１００倍の倍率で、細胞を観察した後、コダック（Ｋｏｄａｋ）社ＤＣ２９０ズームデジタルカメラで撮影した。各条件で形成された泡沫細胞の数を手作業で計算して、泡沫細胞形成率とした。
【００８４】
ＣＯＸ−２選択的阻害薬ＮＳ−３９８（５０μＭ）を用いて、または、用いることなく、特異的Ａ２Ａ受容体作用薬ＣＧＳ−２１６８０（１０μＭ）の存在下で、または、非存在下で、ＴＨＰ−１単球細胞（１０6個／ｍｌ）を培養した（１８時間、３７℃、５％ＣＯ2）。トリゾール試薬を用いて、培養皿から直接ＲＮＡを採取し、オリゴｄＴプライマーを用いた逆転写の条件ごとに５μｇの総ＲＮＡを用いて、２７−ＯＨアーゼおよびＡＢＣＡ１に関してＲＮＡの定量的リアルタイムＰＣＲを行った。
【００８５】
培養したＴＨＰ−１ヒト単球において、ＮＳ−３９８は、コレステロール代謝２７−ＯＨアーゼ酵素のｍＲＮＡ発現を容量依存的に、顕著に低下させた。ＮＳ−３９８に暴露させることにより、コレステロール流出タンパク質ＡＢＣＡ１のメッセージレベルも低下した。これらの結果を免疫ブロット法で確認した。抗炎症性アデノシンＡ２Ａ受容体作用薬を加えることにより、２７−ＯＨアーゼとＡＢＣＡ１の低下が抑制された。ＮＳ−３９８処理ＴＨＰ−１細胞にＣＧＳ−２１６８０を加えることにより、２７−ＯＨアーゼ発現が１８４％増大し、ＡＢＣＡ１発現が１４１％増大した（２７−ＯＨアーゼに関して、ＮＳ−３９８単独群で５８．９±２．３％に対してＣＧＳ−２１６８０＋ＮＳ−３９８群で１６７．２±８．５７％、ｎ＝３、ｐ＜０．００１、ＡＢＣＡ１に関して、ＮＳ−３９８単独群で６０．４９±４．４２％に対してＣＧＳ−２１６８０＋ＮＳ−３９８群で１４６．０±３．１５％、ｎ＝３、ｐ＜０．００１、１００％＝未処理ＴＨＰ−１細胞における基準発現量）。
【００８６】
結果に関する議論
ＣＯＸ−２阻害薬を用いた場合に心血管系リスクが増大する原因は、少なくとも部分的に、コレステロール流出の乱れに帰することができ、特定のアデノシン受容体の活性によりこの乱れを抑制することができる。これらの知見に基づき、関節炎やその他の炎症性疾患に対して持続的な鎮痛を必要とする患者にＣＯＸ−２阻害薬を用いた治療を行うことによる心血管系のリスクを減少させるＡ２Ａ受容体を標的とした新しい治療法を提供する。
【００８７】
これは、広く用いられている薬物療法が、抗アテローム生成２７−ＯＨアーゼまたはＡＢＣＡ１の発現を増大させ、ＣＯＸ−２阻害またはＩＦＮ−γ暴露が遺伝子発現に及ぼす効果を軽減することができるという証拠を初めて示すものである。ＭＴＸが脂肪過負荷条件下で泡沫細胞形成を阻害することが実証された。関節リウマチの患者におけるアテローム性動脈硬化症（ＡＳＣＶＤ）のリスクを軽減させるＭＴＸの能力は、アデノシンＡ２Ａ受容体の活性を媒介としたコレステロール・ホメオスタシスの望ましい変化に部分的に帰することができる。したがって、アデノシン受容体のライゲーションは、ＡＳＣＶＤ患者に長期的な効果をもたらす有望な治療パラダイムに適した機序を与えるものである。
【００８８】
市販のＣＯＸ−２阻害薬によるコレステロール代謝異常に及ぼすＡ２Ａ作用薬の効果を実証するために、ＣＯＸ−２阻害薬であるセレコキシブを用いた実験を行った。
【００８９】
セレコキシブの例および試験
セレコキシブ（ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ）は、米国において、関節炎痛および炎症の治療に利用可能なＣＯＸ−２阻害薬として唯一残された薬剤である。バルデコキシブ（ｖａｌｄｅｃｏｘｉｂ）およびロフェコキシブ（ｒｏｆｅｃｏｘｉｂ）、心血管系のリスクが増大するという証拠に基づき、市場から撤退した。
【００９０】
ＣＯＸ−２阻害がアテローム生成を増大させる正確な作用機序は解明されておらず、そのリスクがクラス効果である可能性に対する不安が残っている。我々は、ＮＳ−３９８を用いた場合ＣＯＸ−２の選択的阻害が、コレステロール蓄積細胞の除去に関わる重要な調整因子であるコレステロール逆輸送系（ＲＣＴ）タンパク質ＡＢＣＡ１を下方制御することを見出した。他のＣＯＸ−２阻害薬を用いた場合と同様に、セレコキシブは、ＴＨＰ−１マクロファージにおけるＲＣＴを低下させることによりアテローム生成を促進させる性質を示し、泡沫細胞形成に対するぜい弱性を増大させた。セレコキシブおよびＮＳ−３９８は、いずれもＣＯＸ−２阻害を介してＲＣＴを抑制するため、ＣＯＸ−２遺伝子サイレンシングがＲＣＴに悪影響を及ぼすと思われる。
【００９１】
方法
ＴＨＰ−１単球（ＲＰＭＩ１６４０、３７℃、５％ＣＯ2）を細胞１０6個／ｍｌの密度まで増殖させた。増殖したＴＨＰ−１細胞を以下に説明する実験条件に暴露した、あるいは、付着マクロファージに分化させた（ホルボール二酪酸、３００ｎＭ、４８時間）
【００９２】
培地を吸引し、Ｃａ2+とＭｇ2+を含まないダルベッコ・リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で細胞を３回洗浄した。次に、以下の条件下で細胞を６ウェルプレートで時間培養した。実験は３回ずつ（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅで）行った。（１）培地のみ、（２）１０μＭのＮＳ−３９８（１８時間）、（３）５０μＭのＮＳ−３９８（１８時間）、（４）１０μＭのセレコキシブ（１８時間）、（５）５０μＭのセレコキシブ（１８時間）、（６）５００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−γ（１２時間）、（７）５０ｎＭのｓｉＲＮＡ（２４時間）、（８）５０ｎＭのｍｏｃｋ ｓｉＲＮＡ（２４時間）。 ＴＨＰ−１マクロファージに、５０μｇ／ｍｌのアセチル化ＬＤＬでコレステロールを負荷し、Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色を行なう前に、さらに４８時間培養した。
【００９３】
細胞を採取して、室温１５００ＲＰＭで遠心分離をし、培地を吸引し、細胞のタンパク質およびＲＮＡを単離した（トリゾール試薬）。紫外（ＵＶ）分光光度法（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＤＵ８００）によりクオーツキュベットを用いて、２６０ｎｍの波長の吸収から、各条件におけるＲＮＡの総量を測定した。
【００９４】
エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）マスターサイクラ―・パーソナルで逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行った。各アッセイにおいて、１０Ｕ（ユニット）のＲＮアーゼ阻害薬および１μＭのオリゴｄＴプライマーの存在下で、Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素を用いて、１μｇのｍＲＮＡを逆転写した。ＡＢＣＡ１特異的プライマーおよびグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ：glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）コントロールプライマーを用いたＰＣＲ増幅を行なうために、各ＲＴ（逆転写酵素）反応混合物から同量のｃＤＮＡを採取した。ＡＢＣＡ１プライマーは、２３４塩基対（ｂｐ）から成り、ＧＡＰＤＨプライマーは３５７塩基対（ｂｐ）増幅断片から成る。ＰＣＲ生成物を２％アガロースゲル上に直接載せて、５Ｖ／ｃｍで１．５時間電気泳動を行った。ＤＮＡをエチジウムブロマイド染色した後、コダック（Ｋｏｄａｋ）トランスイルミネーターを用いて紫外線の下で可視化させて、撮影した。ゲル画像を写真で記録し、コダック・デジタルサイエンス電気泳動ドキュメンテーション解析システム１２０（Ｋｏｄａｋ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ１２０）で撮像後、コダック（Ｋｏｄａｋ）デジタルサイエンス１Ｄバージョン２．０．３で強度を測定した。実験結果は、すべて、ＧＡＰＤＨの平均密度で正規化した。
【００９５】
細胞トランスフェクションおよびＣＯＸサイレンシング
細胞をＰＢＳで３回洗浄した。新鮮培地ＲＰＭＩ１６４０（１００ｍｌ）を適当な各８チャンバプレートに加えた。トランスフェクションの前に、細胞を短時間培養した。２４ウェルプレートの各チャンバウェルに対して、以下の操作を行った。３７５ｎｇのｓｉＲＮＡ（ＰＴＧＳ２＿５ＨＰ有効ｓｉＲＮＡ、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）社）を１００ｍｌの無血清培養培地で希釈した（最終的な濃度：５０ｎＭ）。６ｍｌのＨｉＰｅｒＦｅｃｔトランスフェクション試薬を、希釈したｓｉＲＮＡに加えたのち、ボルテックスミキサーで混合した。検体を室温で５ないし１０分間培養して、トランスフェクション複合体を形成させた。形成された複合体を細胞に滴下した後、回転させて、一様に分布させた。次に、通常の増殖条件下で細胞を６時間培養した。４００ｍｌの血清含有培養培地および抗生物質を加えた後、さらに、細胞を２４ないし７２時間培養した。
【００９６】
培養後、培地を吸引して、４％パラホルムアルデヒド水溶液を用いて、２ないし４分間、細胞を固定した。０．４％トリパンブルーで、１ないし３分間、細胞を染色し、ＰＢＳで洗浄した後、０．２％Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏメタノール溶液を用いて、１ないし３分間、細胞を染色した。光学顕微鏡（ニコンエクリプス（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ）ＴＥ３００）を用いて４０倍の倍率で細胞の観察を行い、ソニー（ＳＯＮＹ）プログレッシブ３ＣＣＤカラービデオカメラを用いて細胞の撮影を行った。各条件で形成された泡沫細胞の数を手作業で計算して、泡沫細胞形成率とした。
【００９７】
ウエスタンブロット
全細胞溶解タンパク質検体（１０μｇ／レーン）を５分間沸騰させて、７．５％ポリアクリルアミドゲル上に載せて、１００Ｖで１．５時間電気泳動を行なった後、半乾きのトランスブロット装置内のニトロセルロース膜に移して、１００Ｖで１時間処理した。ＡＢＣＡ１検出のために、一次抗体として、ウサギ抗ヒトＡＢＣＡ１抗体（１：２０００希釈液、サンタクルーズ・バイオテクノロジー（Ｓａｍｔａ Ｃｒｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社）を用いた。また、二次抗体として、ＥＣＬロバ抗ウサギＩｇＧ西洋わさびペルオキシダーゼ結合種特異全抗体（１：４０００希釈液）を用いた。
【００９８】
Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン５．０１およびＳｉｇｍａＳｔａｔバージョン２．０３を用いて、統計分析を行った。両側９５％の信頼区間およびｐ＜０．０５の有意性で不対ｔ検定により、コントロール条件と処理条件との一対多重比較を行った。階数別一元配置分散分析Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定により泡沫細胞形成を解析した。Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法で一対多重比較を行った。
【００９９】
結果
セレコキシブは、ＡＢＣＡ１メッセージを有意に減少させた。対照群に対して５０μＭ群では、６５．１±１．５％の減少、ｐ＝０．００３。セレコキシブは、ＡＢＣＡ１タンパク質発現を容量依存的に減少させた（ｐ＝０．０００２）。ＣＯＸ−２ｓｉＲＮＡを用いたトランスフェクションにより、ＡＢＣＡ１メッセージが有意に減少した。ｍｏｃｋ群に対して２２．９±４．９％の減少、ｐ＝０．０３。
【０１００】
図１ａおよび図１ｂに示すように、セレコキシブは、ＡＢＣＡ１タンパク質発現を減少させた。対照群に対して５０μＭ群では、２５．６±１．３％の減少、ｐ＜０．０００１。５０μＭセレコキシブ群では、脂質含有泡沫細胞の形成が増大した。対照群における泡沫細胞の形成率が３９．１±５．４％であったの対して、５０μＭセレコキシブ群では、９５．０±０．７％であった（ｐ＝０．００３）。
【０１０１】
ＣＯＸ−２遺伝子サイレンサーでトランスフェクションを行ったＴＨＰ−１マクロファージは、ｍｏｃｋでトランスフェクションを行った細胞と比べて、脂質含有泡沫細胞の形成性向が高かった。５８．３±１．６％の増大、ｐ＝０．００３。
【０１０２】
アセチル化ＬＤＬのみでコレステロール負荷を行った場合の顕微鏡写真を撮り、次に、５０μＭのセレブレックス処理細胞の後にアセチル化ＬＤＬでコレステロール負荷を行った場合の顕微鏡写真を撮った。さらに、ｍｏｃｋトランスフェクションＣＯＸ−２ｓｉＲＮＡ処理細胞の後にアセチル化ＬＤＬでコレステロール負荷を行った場合の顕微鏡写真を撮った。
【０１０３】
ＭＴＸおよびＣＧＳ−２１６８０の試験結果
ＭＴＸ（５μＭ、１８時間）は、２７−ＯＨアーゼのｍＲＮＡ発現を増大させ（１１３．９±６．４％）、ＮＳ−３９８に誘導される２７−ＯＨアーゼメッセージの下方制御を完全にブロックした（未処理群を１００％とした場合、ＮＳ−３９８単独群で７１．１±４．３％、ＮＳ−３９８＋ＭＴＸ群で１１２．８±１３．１％、ｎ＝３、ｐ＜０．０１）。ＮＳ−３９８による２７−ＯＨアーゼ発現の低下を抑制するＭＴＸの能力は、タンパク質およびメッセージレベルの両方に関して、ＭＴＸ投与量が０．１μＭ群、０．５μＭ群および５μＭ群で観察された（図５参照）。
【０１０４】
ＭＴＸは、また、ＣＯＸ−２阻害薬により介在されるＴＨＰ−１単球におけるＡＢＣＡ１メッセージの下方制御のブロックに有効であった。ＺＭ−２４１３８５によるアデノシンＡ２Ａ受容体遮断は、２７−ＯＨアーゼ（図３ｃおよび図４ｂ参照）とＡＢＣＡ１の両方に及ぼすＣＯＸ−２阻害薬の効果を抑制するＭＴＸの能力を無効化した。同様に、上述したＴＨＰ−１単球におけるＩＦＮ−γによる２７−ＯＨアーゼとＡＢＣＡ１の下方制御も、ＭＴＸにより妨害され、ＭＴＸのこの効果はＺＭ−２４１３８５により無効化された（図６ａおよび図６ｂ参照）。
【０１０５】
アデノシンＡ２Ａ受容体作用薬ＣＧＳ−２１６８０をＮＳ−３９８に暴露されたＴＨＰ−１単球に加えることにより、２７−ＯＨアーゼ発現の低下が抑制された。これを免疫ブロットおよびＱＲＴ−ＰＣＲで実証した。ＮＳ−３９８で処理したＴＨＰ−１細胞にＣＧＳ−２１６８０を加えることにより、２７−ＯＨアーゼのｍＲＮＡに１８４％の増加が見られた（ＮＳ−３９８単独群が５８．９±２．３％であったのに対して、ＣＧＳ＋ＮＳ−３９８群では１６７．２±８．５％、ｎ＝３、ｐ＜０．００１）。
【０１０６】
泡沫細胞レベルに対するＭＴＸの作用
アセチルＬＤＬ処理ＴＨＰ−１マクロファージにおいて、対照群と比べて、ＭＴＸの存在下では、泡沫細胞の形質転換が有意に低下した（対照群の３９．３±５．０％に対してＭＴＸ群２９．７±２．０％、ｐ＜０．００１）。ＮＳ−３９８処理群における泡沫細胞が７２．７±４．９％であったのに対して、ＮＳ−３９８＋ＭＴＸ併用群では、泡沫細胞が３６．３±３．２％に過ぎなかった（ｎ＝３、ｐ＜０．００１）。アセチル化ＬＤＬによるコレステロール負荷前にＩＦＮ−γ処理をした群では、泡沫細胞が７１．０±５．０％であったのに対して、ＩＦＮ−γ＋ＭＴＸ群では、泡沫細胞が４６．０±７．２％に過ぎなかった（ｎ＝３、ｐ＜０．００１）。ＭＴＸ処理前に選択的Ａ２Ａ受容体拮抗薬（ＺＭ−２４１３８５）を加えて前培養を行なったＴＨＰ−１マクロファージでは、ＭＴＸのアテローム生成効果が抑制され、その結果、泡沫細胞の有意な増加がみられた（６２．１±１．５％）。
【０１０７】
ＣＯＸ−２阻害薬に仲介される２７−ＯＨアーゼのｍＲＮＡの減少は、ＭＴＸにより抑制される。４本の棒グラフが示すＴＨＰ−１ヒト単球の処理条件は、（図３ｄの左から右に）それぞれ以下の通りであった。（１）対照群としてＲＰＭＩ１６４０培地、（２）ＭＴＸ（５μＭ、１８時間）、（３）ＮＳ−３９８（５０μＭ、１８時間）および（４）ＭＴＸ（５μＭ、１８時間）＋ＮＳ−３９８（５０μＭ、１８時間）。細胞から総ＲＮＡを抽出し、ＱＲＴ−ＰＣＲで２７−ＯＨアーゼのｍＲＮＡ発現の評価を行った。ＧＡＰＤＨメッセージ増幅から得られた信号を内部コントロールとして用いた。対照群対ＮＳ−３９８群は＊ｐ＜０．０５であり、ＮＳ−３９８＋ＭＴＸ群対ＮＳ−３９８群は＃ｐ＜０．０１であった（ここで、＊ｐおよび＃ｐの表記は、いずれのｐ値がいずれの棒グラフに適合するかを示すために棒グラフで用いられるｐ値を示す）。
【０１０８】
ＮＳ−３９８処理ＴＨＰ−１細胞へのＭＴＸの投与量を変えてコレステロール２７−ＯＨアーゼの検出および定量を行ったところ、ＣＯＸ−２阻害薬ＮＳ−３９８で処理したＴＨＰ−１単球において、２７−ＯＨアーゼタンパク質の減少が見られたが、これはＭＴＸ濃度の増大により抑制された。培養したＴＨＰ−１単球細胞を未処理のまま、または、ＮＳ−３９８（５０μＭ、１８時間）に暴露後、未処理にした、または種々の投与量のＭＴＸに２４時間暴露させた。総細胞タンパク質を単離した後、特異的ウサギポリクロナール抗ヒト２７−ＯＨアーゼ抗体を用いて、２７−ＯＨアーゼを検出した。抗βアクチン抗体を用いたウエスタンブロットを行って、タンパク質負荷が等しいことを確認した。
【０１０９】
ＣＯＸ−２阻害薬が仲介するＴＨＰ−１単球における２７−ＯＨアーゼのｍＲＮＡ発現の低下は、ＭＴＸにより抑制される。培養したＴＨＰ−１単球細胞をＮＳ−３９８（５０μＭ、４８時間）で培養後、未処理にした、または種々の投与量のＭＴＸに２４時間暴露させた。総ＲＮＡの単離後、上述したように、ＲＮＡを逆転写して、ｃＤＮＡをＱＲＴ−ＰＣＲで増幅させた。ＧＡＰＤＨメッセージ増幅から得られた信号を内部コントロールとして用いた。ＭＴＸ群対対照群（Ｃ）は＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１であり、ＮＳ＋ＭＴＸ群対ＮＳ−３９８（ＮＳ）群は＃ｐ＜０．０１であった。
【０１１０】
Ａ２Ａ受容体拮抗薬であるＺＭ−２４１３８５の存在下または非存在下でＭＴＸに暴露したＮＳ−３９８処理ＴＨＰ−１細胞におけるコレステロール２７−ＯＨアーゼおよびＡＢＣＡ１のｍＲＮＡの検出および定量の結果から、ＮＳ−３９８によるＴＨＰ−１細胞における２７−ＯＨアーゼメッセージの低下がＭＴＸにより抑制され、この抑制効果が、ＺＭ−２４１３８５によりブロックされることを立証した。４本の棒グラフが示すＴＨＰ−１単球の処理条件は、（図３ｃの左から右に）それぞれ以下の通りであった。（１）対照群としてＲＰＭＩ１６４０培地、（２）ＮＳ−３９８（５０μＭ、２４時間）、（３）ＮＳ−３９８（５０μＭ、２４時間）後にＭＴＸ（５μＭ、２４時間）、（４）ＮＳ−３９８（５０μＭ）およびＺＭ−２４１３８５（１０μＭ）で２４時間処理後にＭＴＸ（５μＭ、２４時間）。細胞から総ＲＮＡを抽出し、ＱＲＴ−ＰＣＲで２７−ＯＨアーゼのｍＲＮＡ発現の評価を行った。ＧＡＰＤＨメッセージ増幅から得られた信号を内部コントロールとして用いた。
【０１１１】
ＮＳ−３９８によるＴＨＰ−１細胞におけるＡＢＣＡ１メッセージの低下がＭＴＸにより抑制され、この抑制効果が、ＺＭ−２４１３８５によりブロックされることをさらに立証した。４本の棒グラフが示すＴＨＰ−１単球の処理条件は、（図５の左から右に）それぞれ以下の通りであった。（１）対照群としてＲＰＭＩ１６４０培地、（２）ＮＳ−３９８（５０μＭ、２４時間）、（３）ＮＳ−３９８（５０μＭ、２４時間）後にＭＴＸ（５μＭ、２４時間）および（４）ＮＳ−３９８（５０μＭ）およびＺＭ−２４１３８５（１０μＭ）で２４時間処理後にＭＴＸ（５μＭ、２４時間）。細胞から総ＲＮＡを抽出し、ＱＲＴ−ＰＣＲで２７−ＯＨアーゼのｍＲＮＡ発現の評価を行った。ＧＡＰＤＨメッセージ増幅から得られた信号を内部コントロールとして用いた。ＭＴＸ群対対照群（Ｃ）は＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１であり、ＮＳ−３９８＋ＭＴＸ群対ＮＳ−３９８群は＃ｐ＜０．０１であった。
【０１１２】
Ａ２Ａ受容体拮抗薬であるＺＭ−２４１３８５の存在下または非存在下でＭＴＸに暴露したＩＦＮ−γ刺激ＴＨＰ−１細胞におけるコレステロール２７−ＯＨアーゼのｍＲＮＡおよびタンパク質ならびにＡＢＣＡ１のｍＲＮＡの検出および定量の結果から、ＩＦＮ−γによるＴＨＰ−１細胞における２７−ＯＨアーゼメッセージの低下がＭＴＸにより抑制され、この抑制効果が、ＺＭ−２４１３８５によりブロックされることを立証した。８本の棒グラフが示すＴＨＰ−１単球の処理条件は、（図６ａおよび図６ｂの左から右に）それぞれ以下の通りであった。（１）対照群としてＲＰＭＩ１６４０培地、（２）ＺＭ−２４１３８５（１０μＭ、２４時間）、（３）ＭＴＸ（５μＭ、２４時間）、（４）ＩＦＮ−γ（５００Ｕ／ｍｌ、２４時間）、（５）ＩＦＮ−γ（５００Ｕ／ｍｌ、２４時間）後にＭＴＸ（５μＭ、２４時間）、（６）ＺＭ−２４１３８５（１０μＭ、２４時間）後にＭＴＸ（５μＭ、２４時間）、（７）ＺＭ−２４１３８５（１０μＭ）およびＩＦＮ−γ（５００Ｕ／ｍｌ）で２４時間処理後にＭＴＸ（５μＭ、２４時間）および（８）ＺＭ−２４１３８５（１０μＭ）およびＮＳ−３９８（５０μＭ）で２４時間処理後にＭＴＸ（５μＭ、２４時間）。細胞から総ＲＮＡを抽出し、ＱＲＴ−ＰＣＲで２７−ＯＨアーゼのｍＲＮＡ発現の評価を行った。ＧＡＰＤＨメッセージ増幅から得られた信号を内部コントロールとして用いた。
【０１１３】
ＩＦＮ−γによるＴＨＰ−１細胞における２７−ＯＨアーゼタンパク質の低下がＭＴＸにより抑制され、この抑制効果が、ＺＭ−２４１３８５によりブロックされることをさらに立証した。図６ａの左から右に８本の免疫ブロットで示したものと同様に、ＴＨＰ−１単球を上述した条件（１）ないし（８）と同じ条件で処理した。総細胞タンパク質を単離した後、特異的ウサギポリクロナール抗ヒト２７−ＯＨアーゼ抗体を用いて、２７−ＯＨアーゼを検出した。抗βアクチン抗体を用いたウエスタンブロットを行って、タンパク質負荷が等しいことを確認した。
【０１１４】
ＩＦＮ−γによるＴＨＰ−１細胞におけるＡＢＣＡ１メッセージの低下がＭＴＸにより抑制され、この抑制効果が、ＺＭ−２４１３８５によりブロックされることをさらに立証した。図６ａの左から右に８本の棒グラフで示したものと同様に、ＴＨＰ−１単球を上述した条件（１）ないし（８）と同じ条件で処理した。細胞から総ＲＮＡを抽出し、ＱＲＴ−ＰＣＲで２７−ＯＨアーゼのｍＲＮＡ発現の評価を行った。ＧＡＰＤＨメッセージ増幅から得られた信号を内部コントロールとして用いた。
【０１１５】
ＣＧＳ−２１６８０
ＴＨＰ−１単球における２７−ＯＨアーゼ発現のＮＳ−３９８による抑制に及ぼすＡ２Ａ作用薬ＣＧＳ−２１６８０の効果を調べたところ、ＣＯＸ−２阻害薬ＮＳ−３９８（５０μＭ）により２７−ＯＨアーゼのメッセージレベルの低下が見られたが、この低下はアデノシンＡ２Ａ作用薬であるＣＧＳ−２１６８０（１０μＭ）を加えることにより抑制された。４本の棒グラフ（図３ａ）が示すＴＨＰ−１単球の処理条件は、左から右にそれぞれ以下の通りであった。（１）対照群としてＲＰＭＩ１６４０培地、（２）ＣＧＳ−２１６８０（１０μＭ、１８時間）、（３）ＮＳ−３９８（５０μＭ、１８時間）および（４）ＮＳ−３９８（５０μＭ、１８時間）およびＣＧＳ−２１６８０（１０μＭ、１８時間）。細胞から総ＲＮＡを抽出し、ＱＲＴ−ＰＣＲで２７−ＯＨアーゼのｍＲＮＡ発現の評価を行った。ＧＡＰＤＨメッセージ増幅から得られた信号を内部コントロールとして用いた。対照群対ＮＳ−３９８群は＊ｐ＜０．０１であり、ＮＳ−３９８＋ＣＧＳ−２１６８０群対ＮＳ−３９８群は＃ｐ＜０．０１であった。
【０１１６】
さらに、ＴＨＰ−１単球を以下の条件（１）対照群としてＲＰＭＩ１６４０培地、（２）ＣＧＳ−２１６８０（１０μＭ、１８時間）、（３）ＮＳ−３９８（５０μＭ、１８時間）および（４）ＮＳ−３９８（５０μＭ、１８時間）およびＣＧＳ−２１６８０（１０μＭ、１８時間）で処理した後、免疫ブロットを行なって、２７−ＯＨアーゼタンパク質の発現を評価した。この結果から、かなり有益な結果が得られた。対照群対ＮＳ−３９８群は＊ｐ＜０．０１であり、ＮＳ−３９８＋ＣＧＳ−２１６８０群対ＮＳ−３９８群は＃ｐ＜０．０１であった。この低下は、アデノシンＡ２Ａ作用薬であるＣＧＳ−２１６８０を加えることにより抑制される。したがって、２７−ＯＨアーゼのタンパク質レベルがＣＯＸ−２阻害薬であるＮＳ−３９８により低下し、この低下は、アデノシンＡ２Ａ作用薬であるＣＧＳ−２１６８０を加えることにより抑制されることが実証された。
【０１１７】
脂肪負荷ＴＨＰ−１マクロファージにおけるＮＳ−３９８およびＩＦＮ−γに誘導される泡沫細胞形質転換に対するＭＴＸの作用
Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏで染色した脂質含有マクロファージの代表的な顕微鏡写真を４０倍の倍率で撮り、以下の知見が得られた。（ａ）アセチル化ＬＤＬ処理ＴＨＰ−１マクロファージでは、対照群と比較して、ＭＴＸの存在下で、泡沫細胞形質転換の有意な減少がみられた。（ｂ）ＭＴＸは、ＴＨＰ−１マクロファージにおけるＮＳ−３９８に誘導される泡沫細胞形成の増大を抑制した。（ｃ）ＭＴＸは、ＴＨＰ−１マクロファージにおけるＩＦＮ−γに誘導される泡沫細胞形成の増大を抑制した。（ｄ）泡沫細胞形成を低下させるＭＴＸの効果は、Ａ２Ａ受容体拮抗薬であるＺＭ−２４１３８５を用いることにより抑制される。
【０１１８】
ＮＳ−３９８は、ＴＨＰ−１細胞におけるコレステロール２７−ＯＨアーゼのメッセージを容量依存的に著しく低下させた。この結果を、ウエスタン免疫ブロット法により確認した。２７−ＯＨアーゼのタンパク質発現は、ＣＯＸ−２阻害剤であるＮＳ−３９８の存在下で減少した。
【０１１９】
ＡＢＣＡ１メッセージは、ＮＳ−３９８暴露により、対照群の約７０％まで低下した（５０μＭ、対照群の７１．１±３．９％、ｎ＝３、ｐ＜０．０１）。この結果をウエスタン免疫ブロット法により確認した。
【０１２０】
アデノシンＡ２Ａ受容体作用薬であるＣＧＳ−２１６８０を加えることにより、２７−ＯＨアーゼおよびＡＢＣＡ１の発現の両方が抑制された（図３ａ参照）。ＮＳ−３９８処理ＴＨＰ−１細胞にＣＧＳ−２１６８０を加えることにより、２７−ＯＨアーゼのｍＲＮＡが１８４％増加し、ＡＢＣＡ１のｍＲＮＡが１４１％増加した（２７−ＯＨアーゼに関して、ＮＳ−３９８単独群で５８．９±２．３％に対してＣＧＳ−２１６８０＋ＮＳ−３９８群で１６７．２±８．５７％、ｎ＝３、ｐ＜０．００１、ＡＢＣＡ１に関して、ＮＳ−３９８単独群で６０．４９±４．４２％に対してＣＧＳ−２１６８０＋ＮＳ−３９８群で１４６．０±３．１５％、ｎ＝３、ｐ＜０．００１、１００％＝未処理ＴＨＰ−１細胞における基準発現量）。
【０１２１】
ＣＯＸ−２選択的阻害薬であるＮＳ−３９８で処理したＴＨＰ−１マクロファージは、アセチル化したＬＤＬを用いたコレステロール負荷条件下で、未処理の細胞と比べて、脂質含有泡沫細胞形成に対するぜい弱性が高かった。ＴＨＰ−１マクロファージでは、対照群と比べて、ＮＳ−３９８の存在下で、泡沫細胞形質転換の有意な増大がみられた（２０．１±３．４％に対して４２．７±６．６％、ｐ＝０．０４）。
【０１２２】
ＣＯＸ−２選択的阻害薬ＮＳ−３９８（５０μＭ）を用いて、または、用いることなく、特異的Ａ２Ａ受容体作用薬ＣＧＳ−２１６８０（１０μＭ）の存在下で、または、非存在下で、ＴＨＰ−１単球細胞（１０6個／ｍｌ）を培養した（１８時間、３７℃、５％ＣＯ2）。トリゾール試薬を用いて、培養皿から直接ＲＮＡを採取し、オリゴｄＴプライマーを用いた逆転写の条件ごとに５μｇの総ＲＮＡを用いて、２７−ＯＨアーゼおよびＡＢＣＡ１に関してＲＮＡの定量的リアルタイムＰＣＲを行った。
【０１２３】
要するに、培養したＴＨＰ−１ヒト単球において、ＮＳ−３９８は、コレステロール代謝２７−ＯＨアーゼ酵素のｍＲＮＡ発現を容量依存的に、顕著に低下させた。ＮＳ−３９８に暴露させることにより、コレステロール流出タンパク質ＡＢＣＡ１のメッセージレベルも低下した。これらの結果を免疫ブロット法で確認した。抗炎症性アデノシンＡ２Ａ受容体作用薬を加えることにより、２７−ＯＨアーゼとＡＢＣＡ１の低下が抑制された。ＮＳ−３９８処理ＴＨＰ−１細胞にＣＧＳ−２１６８０を加えることにより、２７−ＯＨアーゼ発現が１８４％増大し、ＡＢＣＡ１発現が１４１％増大した（２７−ＯＨアーゼに関して、ＮＳ−３９８単独群で５８．９±２．３％に対してＣＧＳ−２１６８０＋ＮＳ−３９８群で１６７．２±８．５７％、ｎ＝３、ｐ＜０．００１、ＡＢＣＡ１に関して、ＮＳ−３９８単独群で６０．４９±４．４２％に対してＣＧＳ−２１６８０＋ＮＳ−３９８群で１４６．０±３．１５％、ｎ＝３、ｐ＜０．００１、１００％＝未処理ＴＨＰ−１細胞における基準発現量）。
【０１２４】
上述の実施例は、本発明を例示するものであって、コレステロール代謝機能を乱す様々なＣＯＸ−２阻害薬またはその他ＮＳＡＩＤＳや、その機能を修復するＡ２Ａ作用薬も、本発明の要旨の範囲に含まれる。本発明を利用した治療は、以下に限定されるものではないが、たとえば、中枢投与、全身投与、末梢投与、静脈内投与、皮下投与、経口投与、鼻腔内投与および／または経皮投与等、様々な投与ルートのいずれを用いて実行されるものでもよい。当該技術分野における通常の技術を有する者であれば、有効な投与ルートを容易に決定および実行可能であると考えられる。絶対的な値か相対的な値かに関わらず、投与量や投与回数等は、以下の特許請求の範囲に従って、条件やリスクに対する患者の感受性等に応じて変更できる。当該技術分野における通常の技術を有する者であれば、適当な投薬料や治療計画を容易に理解し、実現することが可能であると考えられる。また、Ａ２Ａ作用薬は、同時にまたは連続的に、ＣＯＸ−２阻害薬と一緒にまたは別に投与可能である。
【０１２５】
以上、特定の実施態様に関して本発明を詳述したが、当業者には明らかなように、様々な変形、変更、使用が可能であり、本発明は何ら上述の特定の実施態様に限定されるものではない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＯＸ阻害薬またはＣＯＸ−２選択的阻害薬を使用することに起因するヒトのアテローム性動脈硬化型心血管障害および脳血管障害のリスクの増大を抑制する方法であって、
ＣＯＸ阻害薬またはＣＯＸ−２選択的阻害薬により生じるコレステロール代謝機能の異常を修復する工程と、
前記ＣＯＸ阻害薬またはＣＯＸ−２阻害薬の使用により引き起こされる脂質含有泡沫細胞の生成を抑制する工程と、を備える方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
前記コレステロール代謝機能の異常の修復および前記脂質含有泡沫細胞の生成の抑制は、前記ＣＯＸ阻害薬またはＣＯＸ−２阻害薬を投与されたヒトに対する活性の閾値レベルが約０．１μＭであるアデノシンＡ２Ａ受容体作用薬を投与する工程により実現される、方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、
前記アデノシンＡ２Ａ受容体作用薬は、Ａ２Ａ受容体を実質的に飽和状態にするのに十分な量だけ、前記ヒトに投与される、方法。
【請求項４】
請求項２に記載の方法であって、
前記アデノシンＡ２Ａ受容体作用薬は、前記ＣＯＸ阻害薬またはＣＯＸ−２阻害薬が投与される際に、前記コレステロール代謝機能の修復を維持するのに十分な時間間隔で、前記ヒトに投与される、方法。
【請求項５】
請求項２に記載の方法であって、
前記アデノシンＡ２Ａ受容体作用薬は、メトトレキサート、ＣＧＳ−２１６８０、ＡＴＬ３１３、ビノデノソン（ｂｉｎｏｄｅｎｏｓｏｎ）、ＭＲＥ−００９４、ＵＫ−３７１１０４、レガデノソン（ｒｅｇａｄｅｎｏｓｏｎ）、アパデノソン（ａｐａｄｅｎｏｓｏｎ）、ＡＰＥＣおよび２ＨＥ−ＮＥＣＡからなる群から選択される、方法。
【請求項６】
請求項２に記載の方法であって、
前記阻害薬は、ＣＯＸ−２選択的阻害薬である、方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、
前記ＣＯＸ−２選択的阻害薬は、セレコキシブ（ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ）、バルデコキシブ（ｖａｌｄｅｃｏｘｉｂ）およびロフェコキシブ（ｒｏｆｅｃｏｘｉｂ）からなる群から選択される、方法。
【請求項８】
請求項５に記載の方法であって、
前記ＣＯＸ−２阻害薬は、セレコキシブ（ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ）、バルデコキシブ（ｖａｌｄｅｃｏｘｉｂ）およびロフェコキシブ（ｒｏｆｅｃｏｘｉｂ）からなる群から選択される、方法。
【請求項９】
請求項２に記載の方法であって、
前記Ａ２Ａ受容体作用薬は、Ａ２Ａ受容体に特異的である、方法。
【請求項１０】
請求項２に記載の方法であって、
前記Ａ２Ａ受容体作用薬は、前記ヒトに経口投与される、方法。
【請求項１１】
医薬組成物であって、
医薬的に許容可能なＣＯＸ−２選択的阻害薬と、
医薬的に許容可能なＡ２Ａ受容体作用薬であって、前記ＣＯＸ−２選択的阻害薬によって乱されたコレステロール代謝機能を修復するのに十分な量のＡ２Ａ受容体作用薬と、を備える医薬組成物。
【請求項１２】
請求項２に記載の方法であって、
前記阻害薬は、ＣＯＸ阻害薬である、方法。
【請求項１３】
請求項１０に記載の医薬組成物であって、
経口投与用に製剤される医薬組成物。
【請求項１４】
ＣＯＸ阻害薬またはＣＯＸ−２選択的阻害薬が投与されるヒトにおける心筋梗塞および脳卒中のリスクを低下させる方法であって、
前記ヒトにアデノシンＡ２Ａ受容体作用薬を投与する工程、を備える方法。
【請求項１５】
ヒトを含む哺乳類におけるアテローム発生を改善する方法であって、
哺乳類にアデノシンＡ２Ａ受容体作用薬を投与する工程であって、アデノシンＡ２Ａ受容体作用薬を、必要に応じて、ヒトのＡ２Ａ受容体を飽和するのに実質的に十分な量を投与し、これにより、投与された被験者のアテローム発生を抑制または妨害する工程、を備える方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、
前記アデノシンＡ２Ａ受容体作用薬は、メトトレキサート、ＣＧＳ−２１６８０、ＡＴＬ３１３、ビノデノソン（ｂｉｎｏｄｅｎｏｓｏｎ）、ＭＲＥ−００９４、ＵＫ−３７１１０４、レガデノソン（ｒｅｇａｄｅｎｏｓｏｎ）、アパデノソン（ａｐａｄｅｎｏｓｏｎ）、ＡＰＥＣおよび２ＨＥ−ＮＥＣＡからなる群から選択される、方法。
【請求項１７】
請求項１５に記載の方法であって、
前記アデノシンＡ２Ａ受容体作用薬は、前記ヒトのコレステロール代謝機能を維持するのに十分な回数投与される、方法。
【請求項１８】
請求項１５に記載の方法であって、
前記投与は経口投与である、方法。
【請求項１９】
請求項１５に記載の方法であって、
さらに、治療に有効な量のＣＯＸ−２選択的阻害薬が前記ヒトに投与される工程を備える、方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、
前記ＣＯＸ−２選択的阻害薬の投与は、前記ＣＯＸ−２選択的阻害薬の投与と同時にまたは連続的に行なわれる、方法。
【請求項２１】
請求項１９に記載の方法であって、
前記ＣＯＸ−２選択的阻害薬の投与と前記ＣＯＸ−２選択的阻害薬の投与は、前記ヒトのコレステロール代謝機能を維持するのに十分な回数行なわれる、方法。
【請求項２２】
請求項１９に記載の方法であって、
前記ＣＯＸ−２選択的阻害薬と前記ＣＯＸ−２選択的阻害薬は経口投与される、方法。
【請求項２３】
請求項１９に記載の方法であって、
前記ＣＯＸ−２阻害薬は、セレコキシブ（ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ）、バルデコキシブ（ｖａｌｄｅｃｏｘｉｂ）およびロフェコキシブ（ｒｏｆｅｃｏｘｉｂ）からなる群から選択される、方法。
【請求項２４】
医薬組成物であって、
医薬的に許容可能なＣＯＸ−２選択的阻害薬と、
医薬的に許容可能なＡ２Ａ受容体作用薬であって、被験者におけるアテローム発生を抑制または防止するのに十分な量存在するＡ２Ａ受容体作用薬と、を備える医薬組成物。
【請求項２５】
請求項２４に記載の医薬組成物であって、
経口投与用に製剤される医薬組成物。
【請求項２６】
正常なコレステロール代謝機能を乱すＣＯＸ阻害薬またはＣＯＸ−２選択的阻害薬を使用することに起因する哺乳類における影響を抑制する方法であって、
ＣＯＸ阻害薬またはＣＯＸ−２選択的阻害薬により生じるコレステロール代謝機能の異常を修復する工程、を備える方法。
【請求項２７】
ＣＯＸ阻害薬またはＣＯＸ−２選択的阻害薬を使用することに起因するヒトのアテローム性動脈硬化型心血管障害および脳血管障害のリスクの増大を抑制する方法であって、
ＣＯＸ阻害薬またはＣＯＸ−２選択的阻害薬により生じるコレステロール代謝機能の異常を修復する工程、を備える方法。
【請求項２８】
請求項１５に記載の方法であって、
前記哺乳類はヒトである、方法。
【請求項２９】
請求項１に記載の方法であって、
前記ＣＯＸ阻害薬またはＣＯＸ−２選択的阻害薬は、正常なコレステロール代謝機能を乱し、脂質含有泡沫細胞を生成する、方法。
【請求項１】
ＣＯＸ阻害薬またはＣＯＸ−２選択的阻害薬を使用することに起因するヒトのアテローム性動脈硬化型心血管障害および脳血管障害のリスクの増大を抑制する方法であって、
ＣＯＸ阻害薬またはＣＯＸ−２選択的阻害薬により生じるコレステロール代謝機能の異常を修復する工程と、
前記ＣＯＸ阻害薬またはＣＯＸ−２阻害薬の使用により引き起こされる脂質含有泡沫細胞の生成を抑制する工程と、を備える方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
前記コレステロール代謝機能の異常の修復および前記脂質含有泡沫細胞の生成の抑制は、前記ＣＯＸ阻害薬またはＣＯＸ−２阻害薬を投与されたヒトに対する活性の閾値レベルが約０．１μＭであるアデノシンＡ２Ａ受容体作用薬を投与する工程により実現される、方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、
前記アデノシンＡ２Ａ受容体作用薬は、Ａ２Ａ受容体を実質的に飽和状態にするのに十分な量だけ、前記ヒトに投与される、方法。
【請求項４】
請求項２に記載の方法であって、
前記アデノシンＡ２Ａ受容体作用薬は、前記ＣＯＸ阻害薬またはＣＯＸ−２阻害薬が投与される際に、前記コレステロール代謝機能の修復を維持するのに十分な時間間隔で、前記ヒトに投与される、方法。
【請求項５】
請求項２に記載の方法であって、
前記アデノシンＡ２Ａ受容体作用薬は、メトトレキサート、ＣＧＳ−２１６８０、ＡＴＬ３１３、ビノデノソン（ｂｉｎｏｄｅｎｏｓｏｎ）、ＭＲＥ−００９４、ＵＫ−３７１１０４、レガデノソン（ｒｅｇａｄｅｎｏｓｏｎ）、アパデノソン（ａｐａｄｅｎｏｓｏｎ）、ＡＰＥＣおよび２ＨＥ−ＮＥＣＡからなる群から選択される、方法。
【請求項６】
請求項２に記載の方法であって、
前記阻害薬は、ＣＯＸ−２選択的阻害薬である、方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、
前記ＣＯＸ−２選択的阻害薬は、セレコキシブ（ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ）、バルデコキシブ（ｖａｌｄｅｃｏｘｉｂ）およびロフェコキシブ（ｒｏｆｅｃｏｘｉｂ）からなる群から選択される、方法。
【請求項８】
請求項５に記載の方法であって、
前記ＣＯＸ−２阻害薬は、セレコキシブ（ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ）、バルデコキシブ（ｖａｌｄｅｃｏｘｉｂ）およびロフェコキシブ（ｒｏｆｅｃｏｘｉｂ）からなる群から選択される、方法。
【請求項９】
請求項２に記載の方法であって、
前記Ａ２Ａ受容体作用薬は、Ａ２Ａ受容体に特異的である、方法。
【請求項１０】
請求項２に記載の方法であって、
前記Ａ２Ａ受容体作用薬は、前記ヒトに経口投与される、方法。
【請求項１１】
医薬組成物であって、
医薬的に許容可能なＣＯＸ−２選択的阻害薬と、
医薬的に許容可能なＡ２Ａ受容体作用薬であって、前記ＣＯＸ−２選択的阻害薬によって乱されたコレステロール代謝機能を修復するのに十分な量のＡ２Ａ受容体作用薬と、を備える医薬組成物。
【請求項１２】
請求項２に記載の方法であって、
前記阻害薬は、ＣＯＸ阻害薬である、方法。
【請求項１３】
請求項１０に記載の医薬組成物であって、
経口投与用に製剤される医薬組成物。
【請求項１４】
ＣＯＸ阻害薬またはＣＯＸ−２選択的阻害薬が投与されるヒトにおける心筋梗塞および脳卒中のリスクを低下させる方法であって、
前記ヒトにアデノシンＡ２Ａ受容体作用薬を投与する工程、を備える方法。
【請求項１５】
ヒトを含む哺乳類におけるアテローム発生を改善する方法であって、
哺乳類にアデノシンＡ２Ａ受容体作用薬を投与する工程であって、アデノシンＡ２Ａ受容体作用薬を、必要に応じて、ヒトのＡ２Ａ受容体を飽和するのに実質的に十分な量を投与し、これにより、投与された被験者のアテローム発生を抑制または妨害する工程、を備える方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、
前記アデノシンＡ２Ａ受容体作用薬は、メトトレキサート、ＣＧＳ−２１６８０、ＡＴＬ３１３、ビノデノソン（ｂｉｎｏｄｅｎｏｓｏｎ）、ＭＲＥ−００９４、ＵＫ−３７１１０４、レガデノソン（ｒｅｇａｄｅｎｏｓｏｎ）、アパデノソン（ａｐａｄｅｎｏｓｏｎ）、ＡＰＥＣおよび２ＨＥ−ＮＥＣＡからなる群から選択される、方法。
【請求項１７】
請求項１５に記載の方法であって、
前記アデノシンＡ２Ａ受容体作用薬は、前記ヒトのコレステロール代謝機能を維持するのに十分な回数投与される、方法。
【請求項１８】
請求項１５に記載の方法であって、
前記投与は経口投与である、方法。
【請求項１９】
請求項１５に記載の方法であって、
さらに、治療に有効な量のＣＯＸ−２選択的阻害薬が前記ヒトに投与される工程を備える、方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、
前記ＣＯＸ−２選択的阻害薬の投与は、前記ＣＯＸ−２選択的阻害薬の投与と同時にまたは連続的に行なわれる、方法。
【請求項２１】
請求項１９に記載の方法であって、
前記ＣＯＸ−２選択的阻害薬の投与と前記ＣＯＸ−２選択的阻害薬の投与は、前記ヒトのコレステロール代謝機能を維持するのに十分な回数行なわれる、方法。
【請求項２２】
請求項１９に記載の方法であって、
前記ＣＯＸ−２選択的阻害薬と前記ＣＯＸ−２選択的阻害薬は経口投与される、方法。
【請求項２３】
請求項１９に記載の方法であって、
前記ＣＯＸ−２阻害薬は、セレコキシブ（ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ）、バルデコキシブ（ｖａｌｄｅｃｏｘｉｂ）およびロフェコキシブ（ｒｏｆｅｃｏｘｉｂ）からなる群から選択される、方法。
【請求項２４】
医薬組成物であって、
医薬的に許容可能なＣＯＸ−２選択的阻害薬と、
医薬的に許容可能なＡ２Ａ受容体作用薬であって、被験者におけるアテローム発生を抑制または防止するのに十分な量存在するＡ２Ａ受容体作用薬と、を備える医薬組成物。
【請求項２５】
請求項２４に記載の医薬組成物であって、
経口投与用に製剤される医薬組成物。
【請求項２６】
正常なコレステロール代謝機能を乱すＣＯＸ阻害薬またはＣＯＸ−２選択的阻害薬を使用することに起因する哺乳類における影響を抑制する方法であって、
ＣＯＸ阻害薬またはＣＯＸ−２選択的阻害薬により生じるコレステロール代謝機能の異常を修復する工程、を備える方法。
【請求項２７】
ＣＯＸ阻害薬またはＣＯＸ−２選択的阻害薬を使用することに起因するヒトのアテローム性動脈硬化型心血管障害および脳血管障害のリスクの増大を抑制する方法であって、
ＣＯＸ阻害薬またはＣＯＸ−２選択的阻害薬により生じるコレステロール代謝機能の異常を修復する工程、を備える方法。
【請求項２８】
請求項１５に記載の方法であって、
前記哺乳類はヒトである、方法。
【請求項２９】
請求項１に記載の方法であって、
前記ＣＯＸ阻害薬またはＣＯＸ−２選択的阻害薬は、正常なコレステロール代謝機能を乱し、脂質含有泡沫細胞を生成する、方法。
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図３ｃ】
【図３ｄ】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図５】
【図６ａ】
【図６ｂ】
【図１ｂ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図３ｃ】
【図３ｄ】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図５】
【図６ａ】
【図６ｂ】
【公表番号】特表２０１１−５１９９２６（Ｐ２０１１−５１９９２６Ａ）
【公表日】平成２３年７月１４日（２０１１．７．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５０８４９９（Ｐ２０１１−５０８４９９）
【出願日】平成２１年５月５日（２００９．５．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／００２７９５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１３７０５２
【国際公開日】平成２１年１１月１２日（２００９．１１．１２）
【出願人】（５００２６２５４４）ウィンスロップ−ユニバーシティー ホスピタル (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年７月１４日（２０１１．７．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年５月５日（２００９．５．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／００２７９５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１３７０５２
【国際公開日】平成２１年１１月１２日（２００９．１１．１２）
【出願人】（５００２６２５４４）ウィンスロップ−ユニバーシティー ホスピタル (1)
【Ｆターム（参考）】
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