Ｌ１ＣＡＭの活性または発現を抑制する物質および抗癌剤を含む抗癌用組成物
【課題】本発明は、Ｌ１ＣＡＭの活性または発現を抑制する物質および抗癌剤を含む抗癌用組成物に関し、より詳細には、Ｌ１ＣＡＭの活性を抑制する物質としてＬ１ＣＡＭに特異的な抗Ｌ１ＣＡＭ抗体、Ｌ１ＣＡＭの発現を抑制する物質としてＬ１ＣＡＭの発明を抑制するオリゴヌクレオチド、および抗癌剤としてシスプラチン、ゲムシタビン(gemcitabine)、５−フルオロウラシルおよびタキソールから選択される物質を含むことを特徴とする抗癌用組成物に関するものである。
【解決手段】本発明による組成物は、それに含まれるＬ１ＣＡＭの活性または発現を抑制する物質および抗癌剤を同時に、個別にまたは、順次に併用することによって、これらの物質単独で処理したそれぞれの薬理学的効果に比べてはるかに強力でありながら有意的な癌細胞成長および死滅効果を示して、癌の治療に非常に有用である。
【解決手段】本発明による組成物は、それに含まれるＬ１ＣＡＭの活性または発現を抑制する物質および抗癌剤を同時に、個別にまたは、順次に併用することによって、これらの物質単独で処理したそれぞれの薬理学的効果に比べてはるかに強力でありながら有意的な癌細胞成長および死滅効果を示して、癌の治療に非常に有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ１ＣＡＭの活性または発現を抑制する物質および抗癌剤を含む抗癌用組成物に関し、より詳細には、Ｌ１ＣＡＭの活性を抑制する物質としてＬ１ＣＡＭに特異的な抗Ｌ１ＣＡＭ抗体、Ｌ１ＣＡＭの発現を抑制する物質としてＬ１ＣＡＭの発明を抑制するオリゴヌクレオチド、および抗癌剤としてシスプラチン、ゲムシタビン(gemcitabine)、５−フルオロウラシルおよびタキソールから選択される物質を含むことを特徴とする、前記２つの物質を単独で投与した時よりも相乗的な治療効果を示し、癌、特にＬ１ＣＡＭを発現する癌を効果的に治療する抗癌用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ１ＣＡＭ(L1 cell adhesion molecule)は、細胞の表面上で細胞間接着(cell-to-cell adhesion)を仲介する免疫グロブリンスーパーファミリー細胞接着蛋白質(immunoglobulin superfamily cell adhesion molecules，ＣＡＭｓ)に属する内在性膜糖蛋白質(integral membrane glycoprotein)の１つであって、その分子量は２２０ｋＤａに達する。Ｌ１ＣＡＭは元々ニューロンなどから発見され、その機能はニューロンの移動、神経突起の成長および細胞移動と知られている。Ｌ１ＣＡＭは、神経組織の他にもいくつかの正常組織で発現するものとして知られており、最近では様々な癌細胞でも発見され始めている。
【０００３】
Ｌ１ＣＡＭと癌との関連性は、Ｌ１ＣＡＭが黒色腫(melanoma)、神経芽細胞腫 (neuroblastoma)、卵巣癌および大腸癌などの様々な癌で発現されることが報告され(Takeda,et al.，J. Neurochem. 66:2338-2349，1996；Thies et al，Eur. J. Cancer，38：1708-1716，2002；Arlt et al.，Cancer Res. 66：936-943，2006；Gavert et al.，J. Cell Biol. 168：633-642，2005)、膜結合型(membrane bound form)の他にも、切断された産物(cleavage product)が細胞外に分泌されることが発見された(Gutwein et al.，FASEP J. 17(2)：292-4，2003)。そして、最近、癌細胞の成長に重要な役割を果たす分子の１つとして探索されることによって(Primiano，et al.，Cancer Cell. 4(1)：41-53 2003)、癌治療の新しいターゲットとして浮上した(US2004/0115206 A1出願2004.6.17)。最近、Ｌ１ＣＡＭに対する抗体が卵巣癌細胞の成長と転移を抑制するということが明らかになった(Arlt，et al.，Cancer Res. 66：936-943.2006)。
【０００４】
ヨーロッパ特許出願ＥＰ１１７２６５４および米国特許出願ＵＳ２００４／０２５９０８４号は、Ｌ１ＣＡＭが卵巣癌、子宮内膜癌または、そのような癌の素因の存在に対する標識になるという前提下に、卵巣癌または子宮内膜癌の診断および予後のために、患者のサンプルからＬ１ＣＡＭの抗体を介してＬ１ＣＡＭレベルを決めることを特徴とする手段および細胞毒性を有した薬物とＬ１ＣＡＭ抗体およびその部分を結合させて十分な量で患者に投与して癌を治療する方法に関して開示している。しかし、この文献は単にＬ１ＣＡＭ蛋白質が体液または組織で卵巣癌または子宮内膜癌の非常に特異的なマーカーであることを記載しているだけである。
【０００５】
米国特許出願ＵＳ２００４／０１１５２０６号は、Ｌ１ＣＡＭに特異的に結合する抗体を使用して乳癌、大腸癌、子宮頸部癌などの癌細胞死滅を誘導する製剤、細胞死滅のために前記の抗体を使用する手段およびＬ１ＣＡＭ抗体が含まれた薬剤学的組成物に関して開示しながら、癌細胞で細胞成長を阻害し、細胞死を誘導できる有効量の抗Ｌ１ＣＡＭ抗体を細胞に接触(contacting)させることによって、細胞の成長を抑制し、細胞死滅を誘導することを開示している。
【０００６】
また、国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００８１４８号は、卵巣および子宮内膜癌で過発現されるＬ１ＣＡＭ蛋白質およびそれらの発現を阻害する組成物並びに、これを用いて卵巣および子宮内膜癌を予防および治療する方法を提供する。この文献は、Ｌ１ＣＡＭ蛋白質の機能を阻害するＬ１ＣＡＭ抗体およびその誘導体を含む組成物が卵巣癌および子宮内膜癌の機能を抑制して癌細胞の移動および進展を阻止して癌の治療が可能であると記載している。
【０００７】
最近、大韓民国特許出願第１０−２００７−００８４８６８号では、胆道癌細胞株でハツカネズミを免疫して単クローン抗体(A10-A3)を得、Ａ１０−Ａ３抗体がＬ１ＣＡＭを特異的に認識するということを確認し、前記Ａ１０−Ａ３抗体を用いてＬ１ＣＡＭが胆道癌細胞の表面に発現するということを確認し、胆道癌患者のＬ１ＣＡＭの発現率と生存率との関係に対する統計学的分析結果から、Ｌ１ＣＡＭ発現率の高いグループの死亡率がＬ１ＣＡＭ発現率の低いグループの死亡率より確かに高いことを確認してＬ１ＣＡＭが胆道癌の悪い予後因子(poor prognositic factor)として作用するということを記載し、インビトロ(in vitro)とインビボ(in vivo)の動物実験を介してＬ１ＣＡＭに対する抗体が胆道癌細胞の成長、移動または、浸潤を抑制する効果があるということを明らかにすることによって、Ｌ１ＣＡＭが胆道癌に対する卓越した診断または、治療効果を有することができることを記載している。
【０００８】
最近の研究によれば、Ｌ１ＣＡＭがＣ２−セラミド(C2-ceramide)、スタウロスポリン(staurosporine)、シスプラチン(cisplatin)、そして、ハイポキシア(hypoxia)による卵巣癌の細胞死を抑制する機能が報告されており(Stoeck A. et al Gynecol Oncol. 2007；104(2)：461-469)、シスプラチン(cisplatin)で処理した卵巣癌、膵臓癌細胞でＬ１ＣＡＭが増加することが報告されている。
【０００９】
しかし、前記のどの文献もＬ１ＣＡＭの作用を阻害する抗体と抗癌剤の併用投与時の相乗的な癌治療効能を観察したことに関しては記載していない。
【００１０】
抗癌剤とは、癌細胞の各種代謝経路に作用して癌細胞に対して細胞毒性(cytotoxicity)や成長抑制効果(cytostatic effects)を示す薬剤を総称し、今まで開発された抗癌剤は、その作用機序と化学構造により代謝拮抗剤、植物性アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤(topoisomerase inhibitor)、アルキル化剤、抗癌性抗生物質、ホルモン剤およびその他薬剤に分類することができる。抗癌剤は、薬剤により細胞内標的が多様であるが、細胞のＤＮＡ複製、転写および翻訳過程を遮断したり、細胞生存に重要な蛋白質の作用を邪魔し、このような細胞内標的への影響は、以後、ネクローシス(necrosis)やアポトーシス(apoptosis)の過程を介して細胞を死滅させる。このような抗癌剤が作用する代謝経路は、癌細胞のみに特異的ではなく、正常細胞にも同様であるから、抗癌剤投与時、正常組織の損傷、即ち、毒性は不可避であるといえる。しかし、癌細胞と正常細胞との代謝の間には、量的な差が存在し、これによって抗癌剤は癌組織により大きい毒性を示すようになるところ、このような抗癌剤の選択的毒性(selective toxicity)を用いて臨床的に抗癌化学療法が可能であり、治療指数(therapeutic index)が大きいほど正常組織の毒性は避けながら癌細胞をなくすことができるため、安全な抗癌剤といえる。
【００１１】
今まで５０余個以上の抗癌剤が開発され、癌の種類および特性により使用される抗癌剤も違いがあり、単独あるいは他の抗癌療法と併用して癌治療に用いられている。最も一般的に使用される抗癌剤としては、ＤＮＡアルキル化剤(シクロホスファミド(cyclophosphamide)、イホスファミド(ifosfamide))、代謝拮抗剤(メトトレキサート(methotrexate)、葉酸塩(folate)阻害剤、５−フルオロウラシル(5-fluorouracil)、ピリミジン阻害剤)、微小管(microtubule)阻害剤(ビンクリスチン(vincristine)、ビンブラスチン(vinblastine)、パクリタキセル (paclitaxel))、ＤＮＡインターカレーター(intercalators)(ドキソルビシン(doxorubicin)、シスプラチン(cisplatin))、そして、ホルモン治療剤(タモキシフェン(tamoxifen)、フルタミド(flutamide))などが開発された。
【００１２】
シスプラチン(Cisplatin)は、１９６８年に細胞毒性を有した抗癌剤として開発され、ＤＮＡの二重鎖に結合して隣合ったＤＮＡを互いに連結させてＤＮＡ鎖の分離を阻害することによって細胞分裂(cell division)を抑制すると知られている。シスプラチンは、最も広範囲に使用される抗癌剤であり、特に卵巣癌、睾丸癌および頭頸部癌のような固形癌治療に使用されている。しかし、内在的あるいは外来的要因でシスプラチンに対して耐性を獲得した癌においてはその使用が制限的である(Andrews，P.A. and Howell,SB.(1990) Cancer cells.；Kelley，s.l. and Rozencweig，M (1989) Eur. J. Clin. Oncol. 25：1135-1140；Perez，R.P. et al. (1990) pharmacol. Ther. 48：19-27；and Timmer-Bosscha，H. et al. (1992) Br. J. Cancer 66：227-238)。したがって、耐性を誘導する因子に対する阻害剤と併用投与を介する治療が要求されている。
【００１３】
ゲムシタビン(Gemcitabine)(2’-デオキシ-2’,2’-ジフルオロシチジン)は、ヌクレオシド類似体であって、ＤＮＡの合成を介して細胞増殖を抑制する抗癌剤として膀胱癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、胆道癌、および膵臓癌のような固形癌治療に用いられている。ゲムシタビンは、臨床学的にその効能は非常に優れているが、貧血、白血球および好中球減少症、肝での酵素増加、嘔吐、および高熱のような副作用が深刻であるため使用される濃度が極めて制限的である。したがって、ゲムシタビンの濃度を減少させながら治療効能は増加させ得る併用治療剤開発が要求されている。
【００１４】
５−フルオロウラシル(5-fluorouracil)は、細胞毒性を有した代謝拮抗剤であって、胃腸癌、乳癌、そして頭頸部癌などの固形癌治療に用いられている抗癌剤であり、特に他の抗癌剤との併用投与で広く用いられている。特にロイコボリン(leucovorin)、そして、フォリン酸(folinic acid)のカルシウム塩と併用投与時、固形癌治療に非常に効果的であると知られている(Malet-martino M et al. Clinical studies of three oral prodrugs of 5-fluorouracil(Capecitabine，UFT，S-1)：A review. Oncologist 2002；4(4)228-323)。しかし、経口投与による細胞毒性と低い生体利用率によって静脈投与のみ可能であるという短所があり、静脈投与時８５％以上がＤＰＤ(dihydropyrimidine dehydrogenase)酵素によって不活性されるため、ＤＰＤの強い活性を示す患者を治療するにあたっては制限的である。したがって、５−フルオロウラシル(5-fluorouracil)の効能を増加させるためには他の抗癌剤との併用投与が要求されている(Malet-martino M et al.)。
【００１５】
ドセタキセル(Docetaxel，Taxol)とそれの誘導体であるパクリタキセル (paclitaxel)は、固形癌や転移性の強い悪性腫瘍を治療するのに使用される抗癌剤であって、ヨーロッパ特許ＥＰ０２５３７３８号と国際公開特許ＷＯ９２／０９５８９号は、ドセタキセルの製造方法に関して開示している。ドセタキセルの使用量は６０−３００ｍｇ／ｍ２であり、患者により極めて異なり、一般的に静脈投与経路を介して６０−１００ｍｇ／ｍ２の濃度で３週間１時間以上注入される(Texbook of Medical Oncology，Franco Cavelli et al.，Martin Dunitz Ltd.，p.4623(1997))。多くの臨床学的研究のうち、特に乳癌治療においてドセタキセルの効能が検証され、一般的にその効能は１−２治療後に見ることができると知られている。ドセタキセルの作用機序は微小管(microtuble)の会合(assembly)を増加させ、チューブリン(tubulin)の脱重合(depolymerization)を抑制することであると明らかになった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明者らは、抗癌剤として卓越した効果を有する有効な成分を研究している間に、それぞれ単一製剤として利用できるＬ１ＣＡＭの活性または発現を抑制する物質と既存の抗癌剤とを併用することによって、顕著に効果が優れた抗癌剤を提供できることを確認して本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の目的は、Ｌ１ＣＡＭの活性または発現を抑制する物質および抗癌剤を含むが、前記２つの物質を単独で投与した時よりも相乗的な治療効果を示し、癌、特にＬ１ＣＡＭを発現する癌を効果的に治療する抗癌用組成物を提供することにある。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によるＬ１ＣＡＭの活性または発現を抑制する物質および抗癌剤を含む抗癌用組成物を投与する場合、それに含まれるＬ１ＣＡＭの活性または発現を抑制する物質および抗癌剤を同時に、個別にまたは、順次に併用することによって、これらの物質単独で処理したそれぞれの薬理学的効果に比べてはるかに強力でありながら有意的な癌細胞成長および死滅効果を示し、癌の治療、特にＬ１ＣＡＭを発現する癌腫として知られている卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頸部癌、乳癌、大腸癌、黒色腫、神経芽細胞腫、胆道癌、肺癌および膵臓癌のような様々な癌に対して非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１の（Ａ）は、Ｌ１ＣＡＭを発現する胆道癌細胞株(SCK)にＬ１ＣＡＭに対する抗体Ａ１０−Ａ３とシスプラチンをそれぞれ、あるいは併用投与した後、細胞増殖抑制効果を分析した結果であり、図１の（Ｂ）は、Ｌ１ＣＡＭを発現する胆道癌細胞株(SCK)にＬ１ＣＡＭに対する抗体Ａ１０−Ａ３とシスプラチンをそれぞれ、あるいは併用投与した後、細胞死滅誘導効果を分析した結果である。
【図２】図２は、Ｌ１ＣＡＭを発現する胆道癌細胞株(SCK)を移植したマウス(xenograft)モデルにおいてｍＩｇＧ、Ｌ１ＣＡＭに対する抗体Ａ１０−Ａ３、シスプラチン、あるいはＡ１０−Ａ３とシスプラチンとを併用投与したマウス群（各１０匹）において癌の成長程度を示した結果である。
【図３】図３の（Ａ）および（Ｂ）は、Ｌ１ＣＡＭを発現する胆道癌細胞株(SCK)と卵巣癌細胞株(SK-OV3)にＬ１ＣＡＭに対する抗体Ａ１０−Ａ３とゲムシタビンとを、それぞれ、あるいは併用投与した後、細胞増殖抑制効果を分析した結果である。
【図４】図４の（Ａ）と（Ｂ）は、Ｌ１ＣＡＭを発現する胆道癌細胞株(SCK)と卵巣癌細胞株(SK-OV3)にＬ１ＣＡＭに対する抗体Ａ１０−Ａ３と５−フルオロウラシルとをそれぞれ、あるいは併用投与した後、細胞増殖抑制効果を分析した結果である。
【図５】図５の（Ａ）は、Ｌ１ＣＡＭを発現する胆道癌細胞株(SCK)にＬ１ＣＡＭに対する特異的ｓｉＲＮＡを用いてＬ１ＣＡＭの発現を阻害させた細胞株と対照群細胞株においてＬ１ＣＡＭのｍＲＮＡおよび蛋白質の発現量を比較した結果であり、図５の（Ｂ）は、Ｌ１ＣＡＭを発現する胆道癌細胞株(SCK)にＬ１ＣＡＭに対する特異的ｓｉＲＮＡを用いてＬ１ＣＡＭの発現を阻害させた細胞株と対照群細胞株においてシスプラチンの併用投与による細胞増殖阻害効果を示した結果であり、図５の（Ｃ）は、Ｌ１ＣＡＭを発現する胆道癌細胞株(SCK)にＬ１ＣＡＭに対する特異的ｓｉＲＮＡを用いてＬ１ＣＡＭの発現を阻害させた細胞株と対照群細胞株においてシスプラチンの併用投与による細胞死滅誘導効果を示した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
前記のような目的を達成するための１つの態様として、本発明は（ａ）Ｌ１ＣＡＭの活性または発現を抑制する物質および（ｂ）抗癌剤を、同時に、個別にまたは、順次に併用するために有効成分として含む抗癌用組成物に関するものである。
【００２１】
具体的な一態様として、本発明の組成物は、前記の（ａ）として、Ｌ１ＣＡＭの活性を抑制する物質を含むことができる。好ましくは、前記の活性抑制物質は、癌細胞表面抗原または、分泌された表面抗原として知られているＬ１ＣＡＭを特異的に認識する抗Ｌ１ＣＡＭ抗体である。このような抗体には、単クローン抗体およびこれに対するキメラ(Chimeric)抗体およびヒト化抗体が全て含まれ、新規の抗体の他にすでに当該技術分野において公知の抗体も含まれることができ、これらは当該分野において良く知られている方法によって製造することができる。例えば、本発明の組成物に含まれる抗体は公知の単クローン抗体製造技術およびこのような単クローン抗体をキメラ化、ヒト化する公知の方法によって容易に製造され得る。例えば、単クローン抗体を製造する方法は、免疫された動物から得たＢリンパ球を使用してハイブリドーマを製造することによって行えるし(Koeher and Milstein，1976，Nature，256：495)、ファージディスプレイ(phage display)技術を用いることによって行えるが、これらに制限されない。
【００２２】
ファージディスプレイ技術を用いた抗体ライブラリーは、ハイブリドーマを製作せず、すぐにＢリンパ球から抗体遺伝子を得てファージ(phage)表面に抗体を発現させる方法である。ファージディスプレイ技術を用いると、Ｂ細胞不死化(immortalization)により単クローン抗体を生成するのに関する既存の多くの困難さが克服され得る。一般的なファージディスプレイ技術は１）ファージの外皮蛋白質(coat protein)ｐＩＩＩ（または、ｐＩＶ）のＮ末端に該当する遺伝子部位にランダム配列のオリゴヌクレオチド(oligonucleotide)を挿入する段階；２）天然型の外皮蛋白質の一部と前記ランダム配列のオリゴヌクレオチドによってコーディングされるポリペプチドとの融合蛋白質を発現させる段階；３）前記オリゴヌクレオチドによってコーディングされたポリペプチドと結合できる受容体物質で処理する段階；４）受容体に結合されたペプチド−ファージ粒子を低いｐＨや結合競合力のある分子を用いて溶出させる段階；５）パニング(panning)によって溶出されたファージを宿主細胞内で増幅させる段階；６）所望の量を得るために前記方法を繰り返す段階；および７）パニングによって選別されたファージクローンのＤＮＡ配列から活性のあるペプチドの配列を決定する段階から構成される。
【００２３】
したがって、Ｌ１ＣＡＭ特異的な抗Ｌ１ＣＡＭの製造方法は、例えば、ヒト抗体ライブラリーからＬ１ＣＡＭに結合する抗体をパニングによって選び出すファージディスプレイ方法によるとか、Ｌ１ＣＡＭ蛋白質でハツカネズミを免疫してライブラリーを製造するとか、ハイブリドーマを製造してＬ１ＣＡＭに結合する抗体を製造する方法によることができる。より好ましくは、前記抗体は、大韓民国登録特許第１０−０７５６０５１号および／または大韓民国公開特許第１０−２００８−００１８１４９号に記載された抗Ｌ１ＣＡＭ抗体であるＡ１０−Ａ３であり、このようなＡ１０−Ａ３抗体は、前記の公知文献に記載されたような方法によって生産されることができ、好ましくは、受託番号ＫＣＴＣ１０９０９ＢＰによって分泌されて生産される。
【００２４】
前記の抗Ｌ１ＣＡＭ抗体は、Ｌ１ＣＡＭを特異的に認識する結合特性を有する限り、２つの重鎖と２つの軽鎖の全長を有する完全な形態だけでなく、抗体分子の機能的な抗原性断片を含む。抗体分子の機能的な抗原性断片とは、少なくとも抗原結合機能を保有している断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖなどがある。
【００２５】
また他の具体的な一態様として、前記の抗癌用組成物は、前記（ａ）としてＬ１ＣＡＭの発現を抑制する物質を含むことができる。Ｌ１ＣＡＭを発現する癌細胞においてＬ１ＣＡＭの発現を抑制する物質などを用いてＬ１ＣＡＭの発現を抑制させると、癌細胞の成長と転移の役割をするＬ１ＣＡＭの作用が減って癌治療が可能である。好ましくは、前記Ｌ１ＣＡＭの発現を抑制する物質は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド(antisense oligonucleotide)からなる群より選択され、より好ましくは、５’−ＧＣＣＡＡＴＧＣＣＴＡＣＡＴＣＴＡＣＧＴＴ−３’配列(配列番号１)を含むｓｉＲＮＡである。
【００２６】
用語“ｓｉＲＮＡ”は、ＲＮＡ干渉または、遺伝子サイレンシング(silencing)を媒介できる約２０ヌクレオチドサイズの小さい核酸分子を意味し、“ｓｈＲＮＡ”は、ｓｉＲＮＡターゲット配列のセンスおよびアンチセンス配列が５−９個の塩基から構成されたループ(loop)を間に置いて位置した短いヘアピンＲＮＡ(short hairpin RNA)を意味する。最近の遺伝子レベルで蛋白質の発現を調節するための方法として、ＲＮＡ干渉(RNA interference，RNAi)現象を用いた方法が研究されており、一般的にｓｉＲＮＡは、相補的な配列を有するｍＲＮＡに特異的に結合して蛋白質発現を抑制するものとして明らかになった。
【００２７】
本発明の組成物に含まれるｓｉＲＮＡを製造する方法には、ｓｉＲＮＡを直接化学的に合成する方法(Sui Gら，(2002) Proc Natl Acad Sci USA 99：5515-5520)、インビトロ転写を用いたｓｉＲＮＡの合成法(Brummelkamp TRら、(2002) Science 296：550-553)などがあるが、これらに限定されない。また、ｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡの高価な生合成費用、低い細胞形質感染効率によるＲＮＡ干渉効果の短時間維持などの短所を克服するためのものであって、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのプロモーターからアデノウイルス、レンチウイルスおよびプラスミド発現ベクターシステムを用いてこれを細胞内へ導入して発現させることができ、このようなｓｈＲＮＡは、細胞内に存在するｓｉＲＮＡプロセシング酵素(Dicer or Rnase ＩＩＩ)により正確な構造を有するｓｉＲＮＡに転換されて目的遺伝子のサイレンシングを誘導することが広く知られている。
【００２８】
用語“アンチセンス”は、アンチセンスオリゴマーがワトソン−クリック塩基対形成によってＲＮＡ内の標的配列と混成化され、標的配列内で、典型的にｍＲＮＡとのＲＮＡ：オリゴマーヘテロダイマーの形成を許容する、ヌクレオチド塩基の配列およびサブユニット間バックボーンを有するオリゴマーを指し示す。オリゴマーは、標的配列に対する正確な配列相補性または近似相補性を有することができる。このアンチセンスオリゴマーは、ｍＲＮＡの翻訳を遮断または阻害して、ｍＲＮＡのスプライス変異体を生産するｍＲＮＡのプロセシング過程を変化させ得る。したがって、本発明のアンチセンスオリゴマーは、Ｌ１ＣＡＭ遺伝子のｍＲＮＡに相補的なアンチセンスオリゴマーである。
【００２９】
また、本発明の組成物は、前記（ｂ）として抗癌剤を（ａ）と併用投与するために含む。
【００３０】
用語“抗癌剤”とは、癌細胞の各腫代謝経路に作用して癌細胞に対し細胞毒性(cytotoxicity)や成長抑制効果(cytostatic effects)を示す既存の癌治療に使用される公知の薬剤を総称するものであり、今まで開発された代謝拮抗剤、植物性アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤(topoisomerase inhibitor)、アルキル化剤、抗癌性抗生物質、ホルモン剤およびその他薬剤を全て含むものである。 本発明による組成物に含まれてＬ１ＣＡＭの活性または発現を抑制する物質と、特に上昇効果を示す抗癌剤としては、シスプラチン、カルボプラチンおよびヘプタプラチンのようなシスプラチン(cisplatin)類、ゲムシタビン、５−フルオロウラシル(5-fluorouracil)、およびドセタキセル並びにその誘導体であるパクリタキセルのようなタキソール類が好ましく、特に好ましい抗癌剤は、シスプラチンである。このような抗癌剤は、公知の方法によって製造するとか、あるいは市販品を使用することができる。
【００３１】
本発明において、前記Ｌ１ＣＡＭの活性または発現を抑制する物質と、抗癌剤は、混合して同時に投与することも可能であるが、それぞれを個別に同時または、連鎖的に、あるいは時間を置いて個別に投与することも可能である。同時に投与することではない場合は、例えば、２つの有効成分を交互に投与するか、あるいは１つを引き続き投与した後、他の１つを投与することも可能である。
【００３２】
本発明において組成物は、Ｌ１ＣＡＭの活性または発現を抑制する物質、および抗癌剤を有効成分として含有していれば良く、どのような形態の薬剤でも可能である。例えば、２つの有効成分を含んだ合剤を構成しても良く、それぞれ単剤として構成されても良い。ここで、合剤とは、１つの製剤に２種類以上の有効成分を配合したものをいい、単剤とは、１つの製剤に１つの有効成分を含有したものをいい、この時、前記の有効成分は、それぞれの薬理、薬動学的特性に応じてそれぞれ異なる剤型で製造されて合されることもある。本発明において、２つの有効成分が単剤である場合の治療剤は、それぞれ単一で利用できる単剤を組み合わせて利用する薬剤を意味する。２つの有効成分が単剤である場合は、２つの成分を一度に備えた形態であるキットの形態でもある。
【００３３】
また、本発明の抗癌用組成物は、毎日投与または、間歇的に投与することもでき、１日当りの投与回数は、１回または、数回に分けて投与することが可能である。２つの有効成分がそれぞれ単剤である場合の投与回数は、同回数であることも、異なる回数であることもある。
【００３４】
本発明の抗癌用組成物は、それらだけ、あるいは以下で説明するような適当な薬剤学的に許容される担体または賦形剤と共に公知の方法によって製剤化することができる。このような剤型の具体的な例としては、軟質カプセル剤、硬質カプセル剤、錠剤、シロップ剤などの経口剤、注射剤または、外用剤が挙げられる。
【００３５】
薬剤学的に許容される担体には、滅菌溶液、錠剤、コーティング錠およびカプセルのような公知の剤型に使用される標準の製薬学的担体のうちいずれも含まれる。典型的にこのような担体は、ポリビニルピロリドン、デキストリン、澱粉、牛乳、糖、特定種類の粘土、ゼラチン、ステアリン酸、タルク、植物性油（例えば、食用油、綿実油、ココナッツ油、アーモンド油、落花生油が挙げられる）、中性脂肪酸グリセリドなどの油状エステル、鉱物油、ワセリン、動物油脂、セルロース誘導体（例えば、結晶性セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロースが挙げられる）等の賦形剤、または、その他の公知の賦形剤を含む。このような担体には、また、酸化防止剤、湿潤剤、粘度安定剤、風味剤、色素添加剤および他の添加剤が含まれ得る。このような担体を含有する組成物は、周知の方法によって剤型化され得る。
【００３６】
また、本発明の薬学的組成物は、癌治療のために薬学的有効量で投与され得る。典型的な投与量レベル並びに（ａ）および（ｂ）物質の比率は、標準臨床的技術を使用して最適化することができる。
【００３７】
また他の１つの態様として、本発明は、前記の抗癌用組成物を用いて癌を治療する方法に関するものである。
【００３８】
具体的に、本発明の治療方法は、前記抗癌用組成物を薬学的有効量で人体内に投与することを含む。前記抗癌用組成物は、非経口、皮下、腹腔内、肺内、および鼻腔内で投与されることができ、局所的治療のために、必要ならば、病変内投与を含む適合した方法によって投与される。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内または、皮下投与が含まれる。好ましい投与方式は、静脈注射、皮下注射、血内注射剤、筋肉注射および点滴注射である。
【００３９】
前述したように、前記物質の投与量は様々な要素によって変わることもでき、その投与経路もまた、患者の年齢、投与期間、体重、疾患の重症度、患者の意識可否、併用薬物の種類などのような様々な要素によって、経口または非経口の多様な投与経路を使用することができる。また、それぞれを個別に同時または連鎖的に、あるいは時間を置いて個別に投与することも可能である。
【００４０】
また他の１つの態様として、本発明は、癌治療用医薬を製造するための前記抗癌用組成物の用途に関するものである。
【００４１】
具体的に、前記癌には、本組成物によって治療される癌が制限なく含まれ得るが、その例として、胆道癌、子宮内膜癌、子宮頸部癌、乳癌、大腸癌、卵巣癌、黒色腫、神経芽細胞腫、肺癌または、膵臓癌が挙げられる。
【００４２】
前記癌治療用医薬の製造は、前述した方法だけでなく、当該技術分野における周知または公知の技術によって製造され得る。
【００４３】
また他の１つの態様として、本発明は、前記抗癌用組成物の癌治療のための用途に関するものである。
【００４４】
具体的に、前記癌には、本組成物によって治療される癌が制限なく含まれ得るが、その例として、胆道癌、子宮内膜癌、子宮頸部癌、乳癌、大腸癌、卵巣癌、黒色腫、神経芽細胞腫、肺癌または、膵臓癌が挙げられる。
【００４５】
本発明の具体的な一実施例において、本発明者は、Ｌ１ＣＡＭを発現する癌細胞に抗Ｌ１ＣＡＭ抗体と抗癌剤を併用投与時、それぞれを単独で投与した時よりも効果的に癌細胞増殖が抑制されるのかを調べるために、Ｌ１ＣＡＭの作用を阻害する単クローン抗体のＡ１０−Ａ３と、シスプラチン(cisplatin)、ゲムシタビンおよび５−フルオロウラシルを併用投与した結果、最大８０％まで癌細胞の増殖を抑制するということを確認することによって、それぞれの単独投与時よりも卓越した上昇効果を示すということを確認した。また、Ｌ１ＣＡＭを発現する胆道癌細胞株においてＬ１ＣＡＭの発現をノックダウン(knockdown)させるために、Ｌ１ＣＡＭに対する特異的なｓｉＲＮＡを形質導入して培養した後に細胞増殖実験と細胞死滅実験とを行った結果、胆道癌細胞主株でＬ１ＣＡＭの発現を抑制させた時、シスプラチン(cisplatin)による増殖阻害効果および細胞死滅誘導の上昇効果があるということを確認した。
【００４６】
このような本発明によるＬ１ＣＡＭの活性または発現を抑制する物質および抗癌剤を含む組成物を投与する場合、これらのそれぞれを単独で投与した時よりも卓越した相乗的な治療効果を示して、癌の治療、特にＬ１ＣＡＭを発現する癌腫として知られている卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頸部癌、乳癌、大腸癌、黒色腫、神経芽細胞腫、胆道癌、肺癌および膵臓癌のような様々な癌に対して効果的である。
【実施例】
【００４７】
以下、本発明を実施例によってより詳細に説明する。
但し、下記の実施例は、本発明を例示するものだけであり、本発明の内容が下記の実施例に限定されるものではない。
【００４８】
実施例１．癌細胞の培養
癌細胞株は、いずれも１０％牛胎児血清(Gibco社)を含有する次のような培地を用いて５％二酸化炭素が維持される３７℃恒温培養器で培養した。ＳＣＫ(胆道癌細胞株)、ＳＫ−ＯＶ３(卵巣癌細胞株)は、ＤＭＥＭ(Well GENE社)培地を用いた。ＳＣＫ細胞株は、キム・テゴン博士(大韓民国全北大学校医科大学)から得、卵巣癌の癌細胞株は、ＡＴＣＣから購入した。
【００４９】
実施例２．Ｌ１ＣＡＭに対する抗体とシスプラチン(cisplatin)との併用投与による癌細胞増殖阻害および癌細胞死滅の上昇効果分析
Ｌ１ＣＡＭを発現する癌細胞にＬ１ＣＡＭの作用を阻害する単クローン抗体のＡ１０−Ａ３とシスプラチン(cisplatin)とを併用投与時、それぞれを単独で投与した時よりも効果的に細胞増殖が抑制されるのかを調べるために、細胞増殖実験を行った。
【００５０】
抗Ｌ１ＣＡＭ抗体として使用したＡ１０−Ａ３抗体は、大韓民国公開特許第１０−２００８−００１８１４９号に開示された方法によって製造した。
【００５１】
それぞれの癌細胞を３ｍｌの培地内に２×１０５cellsずつ計数して６ウェルプレート(well plate)で培養し、シスプラチン(cisplatin)およびＡ１０−Ａ３(10μg/ml)で単独あるいは併用処理した後、細胞を３７℃ＣＯ２反応器で７２時間培養した。そして、細胞を回収して０．２％トリパンブルー(Tryphan Blue)溶液で死んだ細胞と生きている細胞とを計数し、全体細胞中の生きている細胞を百分率で計算した。その結果、シスプラチン(cisplatin)およびＡ１０−Ａ３ (10μg/ml)で単独で処理した群から、これらの癌細胞の増殖が３０−５０％阻害されることを確認することができ、併用処理時には最大８０％程度の細胞増殖が抑制される上昇効果を確認することができた（図１の（Ａ））。
【００５２】
また、Ｌ１ＣＡＭに対するＡ１０−Ａ３とシスプラチン(cisplatin)の併用投与時に、より効果的に細胞死滅が誘導されるのかを調べてみるために、細胞死滅実験を行った。本実験は、細胞が死滅を起こすと、ＤＮＡが小さく割れる原理を利用した。それぞれの癌細胞株を１００μｌの培地内に２×１０４cellsずつ計数して９６ウェルプレートで培養し、シスプラチン(cisplatin)およびＡ１０−Ａ３(10μg/ml)で単独あるいは併用処理した後、２４時間培養した。２４時間後、培地を除去してＰＢＳ緩衝溶液で洗浄した後、細胞溶解液(RIPA buffer)を３７℃で３０分間反応させた。このように溶解した細胞液にＤＮＡ特異的なビオチン(biotin)を結合させ、ストレプトアビジン(streptavidin)が結合されている９６ウェルプレートに２０μｌを移した後、ここに８０μｌの免疫試薬(immunoreagent)を反応させてＯＤ４０５ｎｍで吸光度を確認した。その結果、Ａ１０−Ａ３とシスプラチン(cisplatin)とで併用処理した時、単独で処理した群に比べて細胞死滅が明確に増加したことを確認することができた（図１の（Ｂ））。
【００５３】
前記の結果は、Ｌ１ＣＡＭに対する抗体とシスプラチン(cisplatin)との併用投与時、癌細胞の治療効能を増加させ得ることを提示している。
【００５４】
実施例３．ハツカネズミ動物モデルにおけるＡ１０−Ａ３とシスプラチン(cisplatin)との併用投与による癌成長阻害効果分析
ヌードマウスＢａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕを大韓民国中央実験動物（株）を介して日本エスエルシー株式会社で購入した。週齢および体重は、６〜８週齢および１８〜２２ｇで、韓国生命工学研究院で１週間順化させた。その後、４０匹の皮下に１×１０７cellsのＳＣＫ細胞を移植し、１週間後、腫瘍容積が１００−２００ｍｍ３になった時、ランダムで１０匹ずつ４つの群に分離した。そして、Ａ１０−Ａ３では、１０ｍｇ／ｋｇ濃度で１週間に３回ずつ処理し、シスプラチン(cisplatin)では、３ｍｇ／ｋｇ濃度で１週間に２回ずつ処理した。対照群は、Ａ１０−Ａ３の代わりに同量のｍＩｇＧで処理し、シスプラチン(cisplatin)の代わりに同量の食塩水で処理した。ヌードマウスの質量と腫瘍重さを１週間に３回ずつ測定した。その結果、Ａ１０−Ａ３とシスプラチン(cisplatin)で単独で処理した群では約３０％程度の増殖阻害効果を確認することができた一方、併用投与した群では７０％以上の明確な阻害効果を確認することができた（図２）。
【００５５】
実施例４．Ｌ１ＣＡＭに対する抗体とゲムシタビン(gemcitabine)との併用投与による癌細胞増殖阻害効果分析
前記＜実施例２＞の方法と同様にＡ１０−Ａ３とゲムシタビン(gemcitabine)とを併用投与時、それぞれを単独で投与した時よりも効果的に細胞増殖が抑制されるのかを分析した。その結果、ゲムシタビンおよびＡ１０−Ａ３(10μg/ml)で単独で処理した群で、これらの癌細胞の増殖が２０−２５％ (胆道癌、ＳＣＫ)あるいは２０−４０％(卵巣癌、ＳＫ−ＯＶ３)阻害されることを確認することができ、併用処理時には４０−６０％程度の細胞増殖が抑制される上昇効果を確認することができた（図３の（Ａ））。
前記の結果は、Ｌ１ＣＡＭに対する抗体とゲムシタビンとの併用投与時、癌細胞の治療効能を増加させ得ることを提示している。
【００５６】
実施例５．Ｌ１ＣＡＭに対する抗体と５−フルオロウラシル(5-fluorouracil)との併用投与による癌細胞増殖阻害効果分析
前記＜実施例２＞の方法と同様にＡ１０−Ａ３と５−フルオロウラシル(5-fluorouracil)とを併用投与時、それぞれを単独で投与した時よりも効果的に細胞増殖が抑制されるのかを分析した。その結果、５−フルオロウラシル(5-fluorouracil)およびＡ１０−Ａ３(10μg/ml)で単独で処理した群で、これらの癌細胞の増殖が２０−４０％(胆道癌、ＳＣＫ)あるいは２０−３０％(卵巣癌、ＳＫ−ＯＶ３)阻害されることを確認することができ、併用処理時には４０−５０％程度の細胞増殖が抑制される上昇効果を確認することができた（図４）。
前記の結果は、Ｌ１ＣＡＭに対する抗体と５−フルオロウラシル(5-fluorouracil)との併用投与時、癌細胞の治療効能を増加させ得ることを提示している。
【００５７】
実施例６−１．逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)によるＬ１ＣＡＭのｍＲＮＡ発現確認
胆道癌細胞株ＳＣＫにおいてＬ１ＣＡＭの発現をノックダウン(knockdown)させるために、Ｌ１ＣＡＭに対する特異的なｓｉＲＮＡ(5’-GCCAATGCCTACATCTACGTT-3’、配列番号１)と非特異的なｓｉＲＮＡ(5’-CAGTCGCGTTTGCGACTGG-3’、配列番号２)とをそれぞれ形質導入した後、７２時間培養した。培養された胆道癌細胞の全体ＲＮＡを分離するために、１ｍｌトリゾール試薬(Trizol reagent、Invitrogen社)で常温で５分間処理した。これを、０．２ｍｌクロロホルム(chloroform)で処理して１５回程度強く揺らした後、常温で３分間反応させた。４℃で１４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上層の透明部分４００μｌを他のチューブに移して同量のイソプロパノールで処理した後、常温で１０分間反応させた。再び、４℃で１４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上層液を捨てて７５％エタノールで洗浄した。このように抽出したＲＮＡ ２ｕｇにｏｌｉｇｏ（ｄ）Ｔ、ｄＮＴＰ、ＲＮａｓｅ阻害剤と逆転写酵素を入れて４２℃で１時間反応させてｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡにＬ１ＣＡＭプライマー、ｄＮＴＰ、Ｔａｑポリメラーゼを用いて３０秒／９５℃、３０秒／５６℃ および３０秒／７２℃で３０回ポリメラーゼ連鎖反応をさせ、７２℃で１０分間重合反応を行った。その結果、Ｌ１ＣＡＭに対する非特異的なｓｉＲＮＡで処理した対照群に比べて特異的なｓｉＲＮＡで処理した群でＬ１ＣＡＭの全体発現量が減少するということを確認した(図５の（Ａ）の上側図面)。
【００５８】
実施例６−２．ウエスタンブロッティング(Western blotting)によるＬ１ＣＡＭの蛋白質発現確認
胆道癌細胞株ＳＣＫにおいてＬ１ＣＡＭの発現をノックダウン(knockdown)させるために、Ｌ１ＣＡＭに対する特異的なｓｉＲＮＡ(5’-GCCAATGCCTACATCTACGTT-3’、配列番号１)と非特異的なsｉＲＮＡ(5’-CAGTCGCGTTTGCGACTGG-3’、配列番号２)とをそれぞれ形質導入して７２時間培養した後、ウエスタンブロッティングを用いて蛋白質レベルでＬ１ＣＡＭの発現を確認した。ｓｉＲＮＡで処理した細胞株の全体蛋白質を分離するために、５００μｌ細胞溶解液(RIPA buffer)で処理した後、ここで得られた蛋白質を１０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース膜に移してウエスタンブロッティングを行った。ニトロセルロース膜を５％脱脂乳(skim milk)が含有されたＰＢＳＴ(PBS+0.1% Tween 20)緩衝溶液で１時間反応させた後、前記ＰＢＳＴ緩衝溶液で２回以上洗浄した。前記反応したニトロセルロース膜を公知の抗Ｌ１ＣＡＭ抗体Ａ１０−Ａ３を１次抗体として添加して２時間反応させた。前記ＰＢＳＴ緩衝溶液で５回の洗浄後、抗マウスＩｇＧのＨＲＰ(horseradish peroxidase)ｃｏｎｊｕｇａｔｅ(1:5000 Sigma)と１時間反応させた。再び、ＰＢＳＴ緩衝溶液で５回の洗浄後、ＥＣＬ検出試薬(Amersham biosciences)で発色させた。その結果、Ｌ１ＣＡＭに対する非特異的なｓｉＲＮＡで処理した対照群に比べて特異的なｓｉＲＮＡで処理した群でＬ１ＣＡＭの全体蛋白質発現量が減少したことを確認した（図５の（Ａ）の下側図面）。
【００５９】
実施例６−３．Ｌ１ＣＡＭの発現を抑制するｓｉＲＮＡと抗癌剤併用投与による細胞増殖抑制効能および細胞死滅誘導効果分析
Ｌ１ＣＡＭを発現する胆道癌細胞株ＳＣＫにおいてＬ１ＣＡＭの発現をノックダウン(knockdown)させるために、Ｌ１ＣＡＭに対する特異的なｓｉＲＮＡ(5’-GCCAATGCCTACATCTACGTT-3’、配列番号１)と非特異的なｓｉＲＮＡ(5’-CAGTCGCGTTTGCGACTGG-3’、配列番号２)とをそれぞれ形質導入して７２時間培養した。その後、＜実施例２＞で行った方法で細胞増殖実験と細胞死滅実験とを行った。図５の（Ｂ）および（Ｃ）に示されたように、胆道癌細胞株ＳＣＫにおいてＬ１ＣＡＭの発現を抑制させた時、シスプラチン(cisplatin)による増殖阻害効果および細胞死滅誘導効果が増加することを確認することができた。前記の結果は、Ｌ１ＣＡＭの作用を抑制する抗体だけでなく、発現を抑制するｓｉＲＮＡと抗癌剤とを併用投与した時にも癌治療上昇効能があるということを提示している。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明によるＬ１ＣＡＭの活性または発現を抑制する物質および抗癌剤を含む抗癌用組成物を投与する場合、それに含まれるＬ１ＣＡＭの活性または発現を抑制する物質および抗癌剤を、同時に、個別にまたは、順次に併用することによって、これらの物質単独で処理したそれぞれの薬理学的効果に比べてはるかに強力ながらも有意的な癌細胞成長および死滅効果を示して、癌の治療、特にＬ１ＣＡＭを発現する癌腫として知られている卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頸部癌、乳癌、大腸癌、黒色腫、神経芽細胞腫、胆道癌、肺癌および膵臓癌のような様々な癌に対して非常に有用である。
【００６１】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ１ＣＡＭの活性または発現を抑制する物質および抗癌剤を含む抗癌用組成物に関し、より詳細には、Ｌ１ＣＡＭの活性を抑制する物質としてＬ１ＣＡＭに特異的な抗Ｌ１ＣＡＭ抗体、Ｌ１ＣＡＭの発現を抑制する物質としてＬ１ＣＡＭの発明を抑制するオリゴヌクレオチド、および抗癌剤としてシスプラチン、ゲムシタビン(gemcitabine)、５−フルオロウラシルおよびタキソールから選択される物質を含むことを特徴とする、前記２つの物質を単独で投与した時よりも相乗的な治療効果を示し、癌、特にＬ１ＣＡＭを発現する癌を効果的に治療する抗癌用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ１ＣＡＭ(L1 cell adhesion molecule)は、細胞の表面上で細胞間接着(cell-to-cell adhesion)を仲介する免疫グロブリンスーパーファミリー細胞接着蛋白質(immunoglobulin superfamily cell adhesion molecules，ＣＡＭｓ)に属する内在性膜糖蛋白質(integral membrane glycoprotein)の１つであって、その分子量は２２０ｋＤａに達する。Ｌ１ＣＡＭは元々ニューロンなどから発見され、その機能はニューロンの移動、神経突起の成長および細胞移動と知られている。Ｌ１ＣＡＭは、神経組織の他にもいくつかの正常組織で発現するものとして知られており、最近では様々な癌細胞でも発見され始めている。
【０００３】
Ｌ１ＣＡＭと癌との関連性は、Ｌ１ＣＡＭが黒色腫(melanoma)、神経芽細胞腫 (neuroblastoma)、卵巣癌および大腸癌などの様々な癌で発現されることが報告され(Takeda,et al.，J. Neurochem. 66:2338-2349，1996；Thies et al，Eur. J. Cancer，38：1708-1716，2002；Arlt et al.，Cancer Res. 66：936-943，2006；Gavert et al.，J. Cell Biol. 168：633-642，2005)、膜結合型(membrane bound form)の他にも、切断された産物(cleavage product)が細胞外に分泌されることが発見された(Gutwein et al.，FASEP J. 17(2)：292-4，2003)。そして、最近、癌細胞の成長に重要な役割を果たす分子の１つとして探索されることによって(Primiano，et al.，Cancer Cell. 4(1)：41-53 2003)、癌治療の新しいターゲットとして浮上した(US2004/0115206 A1出願2004.6.17)。最近、Ｌ１ＣＡＭに対する抗体が卵巣癌細胞の成長と転移を抑制するということが明らかになった(Arlt，et al.，Cancer Res. 66：936-943.2006)。
【０００４】
ヨーロッパ特許出願ＥＰ１１７２６５４および米国特許出願ＵＳ２００４／０２５９０８４号は、Ｌ１ＣＡＭが卵巣癌、子宮内膜癌または、そのような癌の素因の存在に対する標識になるという前提下に、卵巣癌または子宮内膜癌の診断および予後のために、患者のサンプルからＬ１ＣＡＭの抗体を介してＬ１ＣＡＭレベルを決めることを特徴とする手段および細胞毒性を有した薬物とＬ１ＣＡＭ抗体およびその部分を結合させて十分な量で患者に投与して癌を治療する方法に関して開示している。しかし、この文献は単にＬ１ＣＡＭ蛋白質が体液または組織で卵巣癌または子宮内膜癌の非常に特異的なマーカーであることを記載しているだけである。
【０００５】
米国特許出願ＵＳ２００４／０１１５２０６号は、Ｌ１ＣＡＭに特異的に結合する抗体を使用して乳癌、大腸癌、子宮頸部癌などの癌細胞死滅を誘導する製剤、細胞死滅のために前記の抗体を使用する手段およびＬ１ＣＡＭ抗体が含まれた薬剤学的組成物に関して開示しながら、癌細胞で細胞成長を阻害し、細胞死を誘導できる有効量の抗Ｌ１ＣＡＭ抗体を細胞に接触(contacting)させることによって、細胞の成長を抑制し、細胞死滅を誘導することを開示している。
【０００６】
また、国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００８１４８号は、卵巣および子宮内膜癌で過発現されるＬ１ＣＡＭ蛋白質およびそれらの発現を阻害する組成物並びに、これを用いて卵巣および子宮内膜癌を予防および治療する方法を提供する。この文献は、Ｌ１ＣＡＭ蛋白質の機能を阻害するＬ１ＣＡＭ抗体およびその誘導体を含む組成物が卵巣癌および子宮内膜癌の機能を抑制して癌細胞の移動および進展を阻止して癌の治療が可能であると記載している。
【０００７】
最近、大韓民国特許出願第１０−２００７−００８４８６８号では、胆道癌細胞株でハツカネズミを免疫して単クローン抗体(A10-A3)を得、Ａ１０−Ａ３抗体がＬ１ＣＡＭを特異的に認識するということを確認し、前記Ａ１０−Ａ３抗体を用いてＬ１ＣＡＭが胆道癌細胞の表面に発現するということを確認し、胆道癌患者のＬ１ＣＡＭの発現率と生存率との関係に対する統計学的分析結果から、Ｌ１ＣＡＭ発現率の高いグループの死亡率がＬ１ＣＡＭ発現率の低いグループの死亡率より確かに高いことを確認してＬ１ＣＡＭが胆道癌の悪い予後因子(poor prognositic factor)として作用するということを記載し、インビトロ(in vitro)とインビボ(in vivo)の動物実験を介してＬ１ＣＡＭに対する抗体が胆道癌細胞の成長、移動または、浸潤を抑制する効果があるということを明らかにすることによって、Ｌ１ＣＡＭが胆道癌に対する卓越した診断または、治療効果を有することができることを記載している。
【０００８】
最近の研究によれば、Ｌ１ＣＡＭがＣ２−セラミド(C2-ceramide)、スタウロスポリン(staurosporine)、シスプラチン(cisplatin)、そして、ハイポキシア(hypoxia)による卵巣癌の細胞死を抑制する機能が報告されており(Stoeck A. et al Gynecol Oncol. 2007；104(2)：461-469)、シスプラチン(cisplatin)で処理した卵巣癌、膵臓癌細胞でＬ１ＣＡＭが増加することが報告されている。
【０００９】
しかし、前記のどの文献もＬ１ＣＡＭの作用を阻害する抗体と抗癌剤の併用投与時の相乗的な癌治療効能を観察したことに関しては記載していない。
【００１０】
抗癌剤とは、癌細胞の各種代謝経路に作用して癌細胞に対して細胞毒性(cytotoxicity)や成長抑制効果(cytostatic effects)を示す薬剤を総称し、今まで開発された抗癌剤は、その作用機序と化学構造により代謝拮抗剤、植物性アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤(topoisomerase inhibitor)、アルキル化剤、抗癌性抗生物質、ホルモン剤およびその他薬剤に分類することができる。抗癌剤は、薬剤により細胞内標的が多様であるが、細胞のＤＮＡ複製、転写および翻訳過程を遮断したり、細胞生存に重要な蛋白質の作用を邪魔し、このような細胞内標的への影響は、以後、ネクローシス(necrosis)やアポトーシス(apoptosis)の過程を介して細胞を死滅させる。このような抗癌剤が作用する代謝経路は、癌細胞のみに特異的ではなく、正常細胞にも同様であるから、抗癌剤投与時、正常組織の損傷、即ち、毒性は不可避であるといえる。しかし、癌細胞と正常細胞との代謝の間には、量的な差が存在し、これによって抗癌剤は癌組織により大きい毒性を示すようになるところ、このような抗癌剤の選択的毒性(selective toxicity)を用いて臨床的に抗癌化学療法が可能であり、治療指数(therapeutic index)が大きいほど正常組織の毒性は避けながら癌細胞をなくすことができるため、安全な抗癌剤といえる。
【００１１】
今まで５０余個以上の抗癌剤が開発され、癌の種類および特性により使用される抗癌剤も違いがあり、単独あるいは他の抗癌療法と併用して癌治療に用いられている。最も一般的に使用される抗癌剤としては、ＤＮＡアルキル化剤(シクロホスファミド(cyclophosphamide)、イホスファミド(ifosfamide))、代謝拮抗剤(メトトレキサート(methotrexate)、葉酸塩(folate)阻害剤、５−フルオロウラシル(5-fluorouracil)、ピリミジン阻害剤)、微小管(microtubule)阻害剤(ビンクリスチン(vincristine)、ビンブラスチン(vinblastine)、パクリタキセル (paclitaxel))、ＤＮＡインターカレーター(intercalators)(ドキソルビシン(doxorubicin)、シスプラチン(cisplatin))、そして、ホルモン治療剤(タモキシフェン(tamoxifen)、フルタミド(flutamide))などが開発された。
【００１２】
シスプラチン(Cisplatin)は、１９６８年に細胞毒性を有した抗癌剤として開発され、ＤＮＡの二重鎖に結合して隣合ったＤＮＡを互いに連結させてＤＮＡ鎖の分離を阻害することによって細胞分裂(cell division)を抑制すると知られている。シスプラチンは、最も広範囲に使用される抗癌剤であり、特に卵巣癌、睾丸癌および頭頸部癌のような固形癌治療に使用されている。しかし、内在的あるいは外来的要因でシスプラチンに対して耐性を獲得した癌においてはその使用が制限的である(Andrews，P.A. and Howell,SB.(1990) Cancer cells.；Kelley，s.l. and Rozencweig，M (1989) Eur. J. Clin. Oncol. 25：1135-1140；Perez，R.P. et al. (1990) pharmacol. Ther. 48：19-27；and Timmer-Bosscha，H. et al. (1992) Br. J. Cancer 66：227-238)。したがって、耐性を誘導する因子に対する阻害剤と併用投与を介する治療が要求されている。
【００１３】
ゲムシタビン(Gemcitabine)(2’-デオキシ-2’,2’-ジフルオロシチジン)は、ヌクレオシド類似体であって、ＤＮＡの合成を介して細胞増殖を抑制する抗癌剤として膀胱癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、胆道癌、および膵臓癌のような固形癌治療に用いられている。ゲムシタビンは、臨床学的にその効能は非常に優れているが、貧血、白血球および好中球減少症、肝での酵素増加、嘔吐、および高熱のような副作用が深刻であるため使用される濃度が極めて制限的である。したがって、ゲムシタビンの濃度を減少させながら治療効能は増加させ得る併用治療剤開発が要求されている。
【００１４】
５−フルオロウラシル(5-fluorouracil)は、細胞毒性を有した代謝拮抗剤であって、胃腸癌、乳癌、そして頭頸部癌などの固形癌治療に用いられている抗癌剤であり、特に他の抗癌剤との併用投与で広く用いられている。特にロイコボリン(leucovorin)、そして、フォリン酸(folinic acid)のカルシウム塩と併用投与時、固形癌治療に非常に効果的であると知られている(Malet-martino M et al. Clinical studies of three oral prodrugs of 5-fluorouracil(Capecitabine，UFT，S-1)：A review. Oncologist 2002；4(4)228-323)。しかし、経口投与による細胞毒性と低い生体利用率によって静脈投与のみ可能であるという短所があり、静脈投与時８５％以上がＤＰＤ(dihydropyrimidine dehydrogenase)酵素によって不活性されるため、ＤＰＤの強い活性を示す患者を治療するにあたっては制限的である。したがって、５−フルオロウラシル(5-fluorouracil)の効能を増加させるためには他の抗癌剤との併用投与が要求されている(Malet-martino M et al.)。
【００１５】
ドセタキセル(Docetaxel，Taxol)とそれの誘導体であるパクリタキセル (paclitaxel)は、固形癌や転移性の強い悪性腫瘍を治療するのに使用される抗癌剤であって、ヨーロッパ特許ＥＰ０２５３７３８号と国際公開特許ＷＯ９２／０９５８９号は、ドセタキセルの製造方法に関して開示している。ドセタキセルの使用量は６０−３００ｍｇ／ｍ２であり、患者により極めて異なり、一般的に静脈投与経路を介して６０−１００ｍｇ／ｍ２の濃度で３週間１時間以上注入される(Texbook of Medical Oncology，Franco Cavelli et al.，Martin Dunitz Ltd.，p.4623(1997))。多くの臨床学的研究のうち、特に乳癌治療においてドセタキセルの効能が検証され、一般的にその効能は１−２治療後に見ることができると知られている。ドセタキセルの作用機序は微小管(microtuble)の会合(assembly)を増加させ、チューブリン(tubulin)の脱重合(depolymerization)を抑制することであると明らかになった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明者らは、抗癌剤として卓越した効果を有する有効な成分を研究している間に、それぞれ単一製剤として利用できるＬ１ＣＡＭの活性または発現を抑制する物質と既存の抗癌剤とを併用することによって、顕著に効果が優れた抗癌剤を提供できることを確認して本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の目的は、Ｌ１ＣＡＭの活性または発現を抑制する物質および抗癌剤を含むが、前記２つの物質を単独で投与した時よりも相乗的な治療効果を示し、癌、特にＬ１ＣＡＭを発現する癌を効果的に治療する抗癌用組成物を提供することにある。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によるＬ１ＣＡＭの活性または発現を抑制する物質および抗癌剤を含む抗癌用組成物を投与する場合、それに含まれるＬ１ＣＡＭの活性または発現を抑制する物質および抗癌剤を同時に、個別にまたは、順次に併用することによって、これらの物質単独で処理したそれぞれの薬理学的効果に比べてはるかに強力でありながら有意的な癌細胞成長および死滅効果を示し、癌の治療、特にＬ１ＣＡＭを発現する癌腫として知られている卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頸部癌、乳癌、大腸癌、黒色腫、神経芽細胞腫、胆道癌、肺癌および膵臓癌のような様々な癌に対して非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１の（Ａ）は、Ｌ１ＣＡＭを発現する胆道癌細胞株(SCK)にＬ１ＣＡＭに対する抗体Ａ１０−Ａ３とシスプラチンをそれぞれ、あるいは併用投与した後、細胞増殖抑制効果を分析した結果であり、図１の（Ｂ）は、Ｌ１ＣＡＭを発現する胆道癌細胞株(SCK)にＬ１ＣＡＭに対する抗体Ａ１０−Ａ３とシスプラチンをそれぞれ、あるいは併用投与した後、細胞死滅誘導効果を分析した結果である。
【図２】図２は、Ｌ１ＣＡＭを発現する胆道癌細胞株(SCK)を移植したマウス(xenograft)モデルにおいてｍＩｇＧ、Ｌ１ＣＡＭに対する抗体Ａ１０−Ａ３、シスプラチン、あるいはＡ１０−Ａ３とシスプラチンとを併用投与したマウス群（各１０匹）において癌の成長程度を示した結果である。
【図３】図３の（Ａ）および（Ｂ）は、Ｌ１ＣＡＭを発現する胆道癌細胞株(SCK)と卵巣癌細胞株(SK-OV3)にＬ１ＣＡＭに対する抗体Ａ１０−Ａ３とゲムシタビンとを、それぞれ、あるいは併用投与した後、細胞増殖抑制効果を分析した結果である。
【図４】図４の（Ａ）と（Ｂ）は、Ｌ１ＣＡＭを発現する胆道癌細胞株(SCK)と卵巣癌細胞株(SK-OV3)にＬ１ＣＡＭに対する抗体Ａ１０−Ａ３と５−フルオロウラシルとをそれぞれ、あるいは併用投与した後、細胞増殖抑制効果を分析した結果である。
【図５】図５の（Ａ）は、Ｌ１ＣＡＭを発現する胆道癌細胞株(SCK)にＬ１ＣＡＭに対する特異的ｓｉＲＮＡを用いてＬ１ＣＡＭの発現を阻害させた細胞株と対照群細胞株においてＬ１ＣＡＭのｍＲＮＡおよび蛋白質の発現量を比較した結果であり、図５の（Ｂ）は、Ｌ１ＣＡＭを発現する胆道癌細胞株(SCK)にＬ１ＣＡＭに対する特異的ｓｉＲＮＡを用いてＬ１ＣＡＭの発現を阻害させた細胞株と対照群細胞株においてシスプラチンの併用投与による細胞増殖阻害効果を示した結果であり、図５の（Ｃ）は、Ｌ１ＣＡＭを発現する胆道癌細胞株(SCK)にＬ１ＣＡＭに対する特異的ｓｉＲＮＡを用いてＬ１ＣＡＭの発現を阻害させた細胞株と対照群細胞株においてシスプラチンの併用投与による細胞死滅誘導効果を示した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
前記のような目的を達成するための１つの態様として、本発明は（ａ）Ｌ１ＣＡＭの活性または発現を抑制する物質および（ｂ）抗癌剤を、同時に、個別にまたは、順次に併用するために有効成分として含む抗癌用組成物に関するものである。
【００２１】
具体的な一態様として、本発明の組成物は、前記の（ａ）として、Ｌ１ＣＡＭの活性を抑制する物質を含むことができる。好ましくは、前記の活性抑制物質は、癌細胞表面抗原または、分泌された表面抗原として知られているＬ１ＣＡＭを特異的に認識する抗Ｌ１ＣＡＭ抗体である。このような抗体には、単クローン抗体およびこれに対するキメラ(Chimeric)抗体およびヒト化抗体が全て含まれ、新規の抗体の他にすでに当該技術分野において公知の抗体も含まれることができ、これらは当該分野において良く知られている方法によって製造することができる。例えば、本発明の組成物に含まれる抗体は公知の単クローン抗体製造技術およびこのような単クローン抗体をキメラ化、ヒト化する公知の方法によって容易に製造され得る。例えば、単クローン抗体を製造する方法は、免疫された動物から得たＢリンパ球を使用してハイブリドーマを製造することによって行えるし(Koeher and Milstein，1976，Nature，256：495)、ファージディスプレイ(phage display)技術を用いることによって行えるが、これらに制限されない。
【００２２】
ファージディスプレイ技術を用いた抗体ライブラリーは、ハイブリドーマを製作せず、すぐにＢリンパ球から抗体遺伝子を得てファージ(phage)表面に抗体を発現させる方法である。ファージディスプレイ技術を用いると、Ｂ細胞不死化(immortalization)により単クローン抗体を生成するのに関する既存の多くの困難さが克服され得る。一般的なファージディスプレイ技術は１）ファージの外皮蛋白質(coat protein)ｐＩＩＩ（または、ｐＩＶ）のＮ末端に該当する遺伝子部位にランダム配列のオリゴヌクレオチド(oligonucleotide)を挿入する段階；２）天然型の外皮蛋白質の一部と前記ランダム配列のオリゴヌクレオチドによってコーディングされるポリペプチドとの融合蛋白質を発現させる段階；３）前記オリゴヌクレオチドによってコーディングされたポリペプチドと結合できる受容体物質で処理する段階；４）受容体に結合されたペプチド−ファージ粒子を低いｐＨや結合競合力のある分子を用いて溶出させる段階；５）パニング(panning)によって溶出されたファージを宿主細胞内で増幅させる段階；６）所望の量を得るために前記方法を繰り返す段階；および７）パニングによって選別されたファージクローンのＤＮＡ配列から活性のあるペプチドの配列を決定する段階から構成される。
【００２３】
したがって、Ｌ１ＣＡＭ特異的な抗Ｌ１ＣＡＭの製造方法は、例えば、ヒト抗体ライブラリーからＬ１ＣＡＭに結合する抗体をパニングによって選び出すファージディスプレイ方法によるとか、Ｌ１ＣＡＭ蛋白質でハツカネズミを免疫してライブラリーを製造するとか、ハイブリドーマを製造してＬ１ＣＡＭに結合する抗体を製造する方法によることができる。より好ましくは、前記抗体は、大韓民国登録特許第１０−０７５６０５１号および／または大韓民国公開特許第１０−２００８−００１８１４９号に記載された抗Ｌ１ＣＡＭ抗体であるＡ１０−Ａ３であり、このようなＡ１０−Ａ３抗体は、前記の公知文献に記載されたような方法によって生産されることができ、好ましくは、受託番号ＫＣＴＣ１０９０９ＢＰによって分泌されて生産される。
【００２４】
前記の抗Ｌ１ＣＡＭ抗体は、Ｌ１ＣＡＭを特異的に認識する結合特性を有する限り、２つの重鎖と２つの軽鎖の全長を有する完全な形態だけでなく、抗体分子の機能的な抗原性断片を含む。抗体分子の機能的な抗原性断片とは、少なくとも抗原結合機能を保有している断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖなどがある。
【００２５】
また他の具体的な一態様として、前記の抗癌用組成物は、前記（ａ）としてＬ１ＣＡＭの発現を抑制する物質を含むことができる。Ｌ１ＣＡＭを発現する癌細胞においてＬ１ＣＡＭの発現を抑制する物質などを用いてＬ１ＣＡＭの発現を抑制させると、癌細胞の成長と転移の役割をするＬ１ＣＡＭの作用が減って癌治療が可能である。好ましくは、前記Ｌ１ＣＡＭの発現を抑制する物質は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド(antisense oligonucleotide)からなる群より選択され、より好ましくは、５’−ＧＣＣＡＡＴＧＣＣＴＡＣＡＴＣＴＡＣＧＴＴ−３’配列(配列番号１)を含むｓｉＲＮＡである。
【００２６】
用語“ｓｉＲＮＡ”は、ＲＮＡ干渉または、遺伝子サイレンシング(silencing)を媒介できる約２０ヌクレオチドサイズの小さい核酸分子を意味し、“ｓｈＲＮＡ”は、ｓｉＲＮＡターゲット配列のセンスおよびアンチセンス配列が５−９個の塩基から構成されたループ(loop)を間に置いて位置した短いヘアピンＲＮＡ(short hairpin RNA)を意味する。最近の遺伝子レベルで蛋白質の発現を調節するための方法として、ＲＮＡ干渉(RNA interference，RNAi)現象を用いた方法が研究されており、一般的にｓｉＲＮＡは、相補的な配列を有するｍＲＮＡに特異的に結合して蛋白質発現を抑制するものとして明らかになった。
【００２７】
本発明の組成物に含まれるｓｉＲＮＡを製造する方法には、ｓｉＲＮＡを直接化学的に合成する方法(Sui Gら，(2002) Proc Natl Acad Sci USA 99：5515-5520)、インビトロ転写を用いたｓｉＲＮＡの合成法(Brummelkamp TRら、(2002) Science 296：550-553)などがあるが、これらに限定されない。また、ｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡの高価な生合成費用、低い細胞形質感染効率によるＲＮＡ干渉効果の短時間維持などの短所を克服するためのものであって、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのプロモーターからアデノウイルス、レンチウイルスおよびプラスミド発現ベクターシステムを用いてこれを細胞内へ導入して発現させることができ、このようなｓｈＲＮＡは、細胞内に存在するｓｉＲＮＡプロセシング酵素(Dicer or Rnase ＩＩＩ)により正確な構造を有するｓｉＲＮＡに転換されて目的遺伝子のサイレンシングを誘導することが広く知られている。
【００２８】
用語“アンチセンス”は、アンチセンスオリゴマーがワトソン−クリック塩基対形成によってＲＮＡ内の標的配列と混成化され、標的配列内で、典型的にｍＲＮＡとのＲＮＡ：オリゴマーヘテロダイマーの形成を許容する、ヌクレオチド塩基の配列およびサブユニット間バックボーンを有するオリゴマーを指し示す。オリゴマーは、標的配列に対する正確な配列相補性または近似相補性を有することができる。このアンチセンスオリゴマーは、ｍＲＮＡの翻訳を遮断または阻害して、ｍＲＮＡのスプライス変異体を生産するｍＲＮＡのプロセシング過程を変化させ得る。したがって、本発明のアンチセンスオリゴマーは、Ｌ１ＣＡＭ遺伝子のｍＲＮＡに相補的なアンチセンスオリゴマーである。
【００２９】
また、本発明の組成物は、前記（ｂ）として抗癌剤を（ａ）と併用投与するために含む。
【００３０】
用語“抗癌剤”とは、癌細胞の各腫代謝経路に作用して癌細胞に対し細胞毒性(cytotoxicity)や成長抑制効果(cytostatic effects)を示す既存の癌治療に使用される公知の薬剤を総称するものであり、今まで開発された代謝拮抗剤、植物性アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤(topoisomerase inhibitor)、アルキル化剤、抗癌性抗生物質、ホルモン剤およびその他薬剤を全て含むものである。 本発明による組成物に含まれてＬ１ＣＡＭの活性または発現を抑制する物質と、特に上昇効果を示す抗癌剤としては、シスプラチン、カルボプラチンおよびヘプタプラチンのようなシスプラチン(cisplatin)類、ゲムシタビン、５−フルオロウラシル(5-fluorouracil)、およびドセタキセル並びにその誘導体であるパクリタキセルのようなタキソール類が好ましく、特に好ましい抗癌剤は、シスプラチンである。このような抗癌剤は、公知の方法によって製造するとか、あるいは市販品を使用することができる。
【００３１】
本発明において、前記Ｌ１ＣＡＭの活性または発現を抑制する物質と、抗癌剤は、混合して同時に投与することも可能であるが、それぞれを個別に同時または、連鎖的に、あるいは時間を置いて個別に投与することも可能である。同時に投与することではない場合は、例えば、２つの有効成分を交互に投与するか、あるいは１つを引き続き投与した後、他の１つを投与することも可能である。
【００３２】
本発明において組成物は、Ｌ１ＣＡＭの活性または発現を抑制する物質、および抗癌剤を有効成分として含有していれば良く、どのような形態の薬剤でも可能である。例えば、２つの有効成分を含んだ合剤を構成しても良く、それぞれ単剤として構成されても良い。ここで、合剤とは、１つの製剤に２種類以上の有効成分を配合したものをいい、単剤とは、１つの製剤に１つの有効成分を含有したものをいい、この時、前記の有効成分は、それぞれの薬理、薬動学的特性に応じてそれぞれ異なる剤型で製造されて合されることもある。本発明において、２つの有効成分が単剤である場合の治療剤は、それぞれ単一で利用できる単剤を組み合わせて利用する薬剤を意味する。２つの有効成分が単剤である場合は、２つの成分を一度に備えた形態であるキットの形態でもある。
【００３３】
また、本発明の抗癌用組成物は、毎日投与または、間歇的に投与することもでき、１日当りの投与回数は、１回または、数回に分けて投与することが可能である。２つの有効成分がそれぞれ単剤である場合の投与回数は、同回数であることも、異なる回数であることもある。
【００３４】
本発明の抗癌用組成物は、それらだけ、あるいは以下で説明するような適当な薬剤学的に許容される担体または賦形剤と共に公知の方法によって製剤化することができる。このような剤型の具体的な例としては、軟質カプセル剤、硬質カプセル剤、錠剤、シロップ剤などの経口剤、注射剤または、外用剤が挙げられる。
【００３５】
薬剤学的に許容される担体には、滅菌溶液、錠剤、コーティング錠およびカプセルのような公知の剤型に使用される標準の製薬学的担体のうちいずれも含まれる。典型的にこのような担体は、ポリビニルピロリドン、デキストリン、澱粉、牛乳、糖、特定種類の粘土、ゼラチン、ステアリン酸、タルク、植物性油（例えば、食用油、綿実油、ココナッツ油、アーモンド油、落花生油が挙げられる）、中性脂肪酸グリセリドなどの油状エステル、鉱物油、ワセリン、動物油脂、セルロース誘導体（例えば、結晶性セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロースが挙げられる）等の賦形剤、または、その他の公知の賦形剤を含む。このような担体には、また、酸化防止剤、湿潤剤、粘度安定剤、風味剤、色素添加剤および他の添加剤が含まれ得る。このような担体を含有する組成物は、周知の方法によって剤型化され得る。
【００３６】
また、本発明の薬学的組成物は、癌治療のために薬学的有効量で投与され得る。典型的な投与量レベル並びに（ａ）および（ｂ）物質の比率は、標準臨床的技術を使用して最適化することができる。
【００３７】
また他の１つの態様として、本発明は、前記の抗癌用組成物を用いて癌を治療する方法に関するものである。
【００３８】
具体的に、本発明の治療方法は、前記抗癌用組成物を薬学的有効量で人体内に投与することを含む。前記抗癌用組成物は、非経口、皮下、腹腔内、肺内、および鼻腔内で投与されることができ、局所的治療のために、必要ならば、病変内投与を含む適合した方法によって投与される。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内または、皮下投与が含まれる。好ましい投与方式は、静脈注射、皮下注射、血内注射剤、筋肉注射および点滴注射である。
【００３９】
前述したように、前記物質の投与量は様々な要素によって変わることもでき、その投与経路もまた、患者の年齢、投与期間、体重、疾患の重症度、患者の意識可否、併用薬物の種類などのような様々な要素によって、経口または非経口の多様な投与経路を使用することができる。また、それぞれを個別に同時または連鎖的に、あるいは時間を置いて個別に投与することも可能である。
【００４０】
また他の１つの態様として、本発明は、癌治療用医薬を製造するための前記抗癌用組成物の用途に関するものである。
【００４１】
具体的に、前記癌には、本組成物によって治療される癌が制限なく含まれ得るが、その例として、胆道癌、子宮内膜癌、子宮頸部癌、乳癌、大腸癌、卵巣癌、黒色腫、神経芽細胞腫、肺癌または、膵臓癌が挙げられる。
【００４２】
前記癌治療用医薬の製造は、前述した方法だけでなく、当該技術分野における周知または公知の技術によって製造され得る。
【００４３】
また他の１つの態様として、本発明は、前記抗癌用組成物の癌治療のための用途に関するものである。
【００４４】
具体的に、前記癌には、本組成物によって治療される癌が制限なく含まれ得るが、その例として、胆道癌、子宮内膜癌、子宮頸部癌、乳癌、大腸癌、卵巣癌、黒色腫、神経芽細胞腫、肺癌または、膵臓癌が挙げられる。
【００４５】
本発明の具体的な一実施例において、本発明者は、Ｌ１ＣＡＭを発現する癌細胞に抗Ｌ１ＣＡＭ抗体と抗癌剤を併用投与時、それぞれを単独で投与した時よりも効果的に癌細胞増殖が抑制されるのかを調べるために、Ｌ１ＣＡＭの作用を阻害する単クローン抗体のＡ１０−Ａ３と、シスプラチン(cisplatin)、ゲムシタビンおよび５−フルオロウラシルを併用投与した結果、最大８０％まで癌細胞の増殖を抑制するということを確認することによって、それぞれの単独投与時よりも卓越した上昇効果を示すということを確認した。また、Ｌ１ＣＡＭを発現する胆道癌細胞株においてＬ１ＣＡＭの発現をノックダウン(knockdown)させるために、Ｌ１ＣＡＭに対する特異的なｓｉＲＮＡを形質導入して培養した後に細胞増殖実験と細胞死滅実験とを行った結果、胆道癌細胞主株でＬ１ＣＡＭの発現を抑制させた時、シスプラチン(cisplatin)による増殖阻害効果および細胞死滅誘導の上昇効果があるということを確認した。
【００４６】
このような本発明によるＬ１ＣＡＭの活性または発現を抑制する物質および抗癌剤を含む組成物を投与する場合、これらのそれぞれを単独で投与した時よりも卓越した相乗的な治療効果を示して、癌の治療、特にＬ１ＣＡＭを発現する癌腫として知られている卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頸部癌、乳癌、大腸癌、黒色腫、神経芽細胞腫、胆道癌、肺癌および膵臓癌のような様々な癌に対して効果的である。
【実施例】
【００４７】
以下、本発明を実施例によってより詳細に説明する。
但し、下記の実施例は、本発明を例示するものだけであり、本発明の内容が下記の実施例に限定されるものではない。
【００４８】
実施例１．癌細胞の培養
癌細胞株は、いずれも１０％牛胎児血清(Gibco社)を含有する次のような培地を用いて５％二酸化炭素が維持される３７℃恒温培養器で培養した。ＳＣＫ(胆道癌細胞株)、ＳＫ−ＯＶ３(卵巣癌細胞株)は、ＤＭＥＭ(Well GENE社)培地を用いた。ＳＣＫ細胞株は、キム・テゴン博士(大韓民国全北大学校医科大学)から得、卵巣癌の癌細胞株は、ＡＴＣＣから購入した。
【００４９】
実施例２．Ｌ１ＣＡＭに対する抗体とシスプラチン(cisplatin)との併用投与による癌細胞増殖阻害および癌細胞死滅の上昇効果分析
Ｌ１ＣＡＭを発現する癌細胞にＬ１ＣＡＭの作用を阻害する単クローン抗体のＡ１０−Ａ３とシスプラチン(cisplatin)とを併用投与時、それぞれを単独で投与した時よりも効果的に細胞増殖が抑制されるのかを調べるために、細胞増殖実験を行った。
【００５０】
抗Ｌ１ＣＡＭ抗体として使用したＡ１０−Ａ３抗体は、大韓民国公開特許第１０−２００８−００１８１４９号に開示された方法によって製造した。
【００５１】
それぞれの癌細胞を３ｍｌの培地内に２×１０５cellsずつ計数して６ウェルプレート(well plate)で培養し、シスプラチン(cisplatin)およびＡ１０−Ａ３(10μg/ml)で単独あるいは併用処理した後、細胞を３７℃ＣＯ２反応器で７２時間培養した。そして、細胞を回収して０．２％トリパンブルー(Tryphan Blue)溶液で死んだ細胞と生きている細胞とを計数し、全体細胞中の生きている細胞を百分率で計算した。その結果、シスプラチン(cisplatin)およびＡ１０−Ａ３ (10μg/ml)で単独で処理した群から、これらの癌細胞の増殖が３０−５０％阻害されることを確認することができ、併用処理時には最大８０％程度の細胞増殖が抑制される上昇効果を確認することができた（図１の（Ａ））。
【００５２】
また、Ｌ１ＣＡＭに対するＡ１０−Ａ３とシスプラチン(cisplatin)の併用投与時に、より効果的に細胞死滅が誘導されるのかを調べてみるために、細胞死滅実験を行った。本実験は、細胞が死滅を起こすと、ＤＮＡが小さく割れる原理を利用した。それぞれの癌細胞株を１００μｌの培地内に２×１０４cellsずつ計数して９６ウェルプレートで培養し、シスプラチン(cisplatin)およびＡ１０−Ａ３(10μg/ml)で単独あるいは併用処理した後、２４時間培養した。２４時間後、培地を除去してＰＢＳ緩衝溶液で洗浄した後、細胞溶解液(RIPA buffer)を３７℃で３０分間反応させた。このように溶解した細胞液にＤＮＡ特異的なビオチン(biotin)を結合させ、ストレプトアビジン(streptavidin)が結合されている９６ウェルプレートに２０μｌを移した後、ここに８０μｌの免疫試薬(immunoreagent)を反応させてＯＤ４０５ｎｍで吸光度を確認した。その結果、Ａ１０−Ａ３とシスプラチン(cisplatin)とで併用処理した時、単独で処理した群に比べて細胞死滅が明確に増加したことを確認することができた（図１の（Ｂ））。
【００５３】
前記の結果は、Ｌ１ＣＡＭに対する抗体とシスプラチン(cisplatin)との併用投与時、癌細胞の治療効能を増加させ得ることを提示している。
【００５４】
実施例３．ハツカネズミ動物モデルにおけるＡ１０−Ａ３とシスプラチン(cisplatin)との併用投与による癌成長阻害効果分析
ヌードマウスＢａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕを大韓民国中央実験動物（株）を介して日本エスエルシー株式会社で購入した。週齢および体重は、６〜８週齢および１８〜２２ｇで、韓国生命工学研究院で１週間順化させた。その後、４０匹の皮下に１×１０７cellsのＳＣＫ細胞を移植し、１週間後、腫瘍容積が１００−２００ｍｍ３になった時、ランダムで１０匹ずつ４つの群に分離した。そして、Ａ１０−Ａ３では、１０ｍｇ／ｋｇ濃度で１週間に３回ずつ処理し、シスプラチン(cisplatin)では、３ｍｇ／ｋｇ濃度で１週間に２回ずつ処理した。対照群は、Ａ１０−Ａ３の代わりに同量のｍＩｇＧで処理し、シスプラチン(cisplatin)の代わりに同量の食塩水で処理した。ヌードマウスの質量と腫瘍重さを１週間に３回ずつ測定した。その結果、Ａ１０−Ａ３とシスプラチン(cisplatin)で単独で処理した群では約３０％程度の増殖阻害効果を確認することができた一方、併用投与した群では７０％以上の明確な阻害効果を確認することができた（図２）。
【００５５】
実施例４．Ｌ１ＣＡＭに対する抗体とゲムシタビン(gemcitabine)との併用投与による癌細胞増殖阻害効果分析
前記＜実施例２＞の方法と同様にＡ１０−Ａ３とゲムシタビン(gemcitabine)とを併用投与時、それぞれを単独で投与した時よりも効果的に細胞増殖が抑制されるのかを分析した。その結果、ゲムシタビンおよびＡ１０−Ａ３(10μg/ml)で単独で処理した群で、これらの癌細胞の増殖が２０−２５％ (胆道癌、ＳＣＫ)あるいは２０−４０％(卵巣癌、ＳＫ−ＯＶ３)阻害されることを確認することができ、併用処理時には４０−６０％程度の細胞増殖が抑制される上昇効果を確認することができた（図３の（Ａ））。
前記の結果は、Ｌ１ＣＡＭに対する抗体とゲムシタビンとの併用投与時、癌細胞の治療効能を増加させ得ることを提示している。
【００５６】
実施例５．Ｌ１ＣＡＭに対する抗体と５−フルオロウラシル(5-fluorouracil)との併用投与による癌細胞増殖阻害効果分析
前記＜実施例２＞の方法と同様にＡ１０−Ａ３と５−フルオロウラシル(5-fluorouracil)とを併用投与時、それぞれを単独で投与した時よりも効果的に細胞増殖が抑制されるのかを分析した。その結果、５−フルオロウラシル(5-fluorouracil)およびＡ１０−Ａ３(10μg/ml)で単独で処理した群で、これらの癌細胞の増殖が２０−４０％(胆道癌、ＳＣＫ)あるいは２０−３０％(卵巣癌、ＳＫ−ＯＶ３)阻害されることを確認することができ、併用処理時には４０−５０％程度の細胞増殖が抑制される上昇効果を確認することができた（図４）。
前記の結果は、Ｌ１ＣＡＭに対する抗体と５−フルオロウラシル(5-fluorouracil)との併用投与時、癌細胞の治療効能を増加させ得ることを提示している。
【００５７】
実施例６−１．逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)によるＬ１ＣＡＭのｍＲＮＡ発現確認
胆道癌細胞株ＳＣＫにおいてＬ１ＣＡＭの発現をノックダウン(knockdown)させるために、Ｌ１ＣＡＭに対する特異的なｓｉＲＮＡ(5’-GCCAATGCCTACATCTACGTT-3’、配列番号１)と非特異的なｓｉＲＮＡ(5’-CAGTCGCGTTTGCGACTGG-3’、配列番号２)とをそれぞれ形質導入した後、７２時間培養した。培養された胆道癌細胞の全体ＲＮＡを分離するために、１ｍｌトリゾール試薬(Trizol reagent、Invitrogen社)で常温で５分間処理した。これを、０．２ｍｌクロロホルム(chloroform)で処理して１５回程度強く揺らした後、常温で３分間反応させた。４℃で１４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上層の透明部分４００μｌを他のチューブに移して同量のイソプロパノールで処理した後、常温で１０分間反応させた。再び、４℃で１４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上層液を捨てて７５％エタノールで洗浄した。このように抽出したＲＮＡ ２ｕｇにｏｌｉｇｏ（ｄ）Ｔ、ｄＮＴＰ、ＲＮａｓｅ阻害剤と逆転写酵素を入れて４２℃で１時間反応させてｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡにＬ１ＣＡＭプライマー、ｄＮＴＰ、Ｔａｑポリメラーゼを用いて３０秒／９５℃、３０秒／５６℃ および３０秒／７２℃で３０回ポリメラーゼ連鎖反応をさせ、７２℃で１０分間重合反応を行った。その結果、Ｌ１ＣＡＭに対する非特異的なｓｉＲＮＡで処理した対照群に比べて特異的なｓｉＲＮＡで処理した群でＬ１ＣＡＭの全体発現量が減少するということを確認した(図５の（Ａ）の上側図面)。
【００５８】
実施例６−２．ウエスタンブロッティング(Western blotting)によるＬ１ＣＡＭの蛋白質発現確認
胆道癌細胞株ＳＣＫにおいてＬ１ＣＡＭの発現をノックダウン(knockdown)させるために、Ｌ１ＣＡＭに対する特異的なｓｉＲＮＡ(5’-GCCAATGCCTACATCTACGTT-3’、配列番号１)と非特異的なsｉＲＮＡ(5’-CAGTCGCGTTTGCGACTGG-3’、配列番号２)とをそれぞれ形質導入して７２時間培養した後、ウエスタンブロッティングを用いて蛋白質レベルでＬ１ＣＡＭの発現を確認した。ｓｉＲＮＡで処理した細胞株の全体蛋白質を分離するために、５００μｌ細胞溶解液(RIPA buffer)で処理した後、ここで得られた蛋白質を１０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース膜に移してウエスタンブロッティングを行った。ニトロセルロース膜を５％脱脂乳(skim milk)が含有されたＰＢＳＴ(PBS+0.1% Tween 20)緩衝溶液で１時間反応させた後、前記ＰＢＳＴ緩衝溶液で２回以上洗浄した。前記反応したニトロセルロース膜を公知の抗Ｌ１ＣＡＭ抗体Ａ１０−Ａ３を１次抗体として添加して２時間反応させた。前記ＰＢＳＴ緩衝溶液で５回の洗浄後、抗マウスＩｇＧのＨＲＰ(horseradish peroxidase)ｃｏｎｊｕｇａｔｅ(1:5000 Sigma)と１時間反応させた。再び、ＰＢＳＴ緩衝溶液で５回の洗浄後、ＥＣＬ検出試薬(Amersham biosciences)で発色させた。その結果、Ｌ１ＣＡＭに対する非特異的なｓｉＲＮＡで処理した対照群に比べて特異的なｓｉＲＮＡで処理した群でＬ１ＣＡＭの全体蛋白質発現量が減少したことを確認した（図５の（Ａ）の下側図面）。
【００５９】
実施例６−３．Ｌ１ＣＡＭの発現を抑制するｓｉＲＮＡと抗癌剤併用投与による細胞増殖抑制効能および細胞死滅誘導効果分析
Ｌ１ＣＡＭを発現する胆道癌細胞株ＳＣＫにおいてＬ１ＣＡＭの発現をノックダウン(knockdown)させるために、Ｌ１ＣＡＭに対する特異的なｓｉＲＮＡ(5’-GCCAATGCCTACATCTACGTT-3’、配列番号１)と非特異的なｓｉＲＮＡ(5’-CAGTCGCGTTTGCGACTGG-3’、配列番号２)とをそれぞれ形質導入して７２時間培養した。その後、＜実施例２＞で行った方法で細胞増殖実験と細胞死滅実験とを行った。図５の（Ｂ）および（Ｃ）に示されたように、胆道癌細胞株ＳＣＫにおいてＬ１ＣＡＭの発現を抑制させた時、シスプラチン(cisplatin)による増殖阻害効果および細胞死滅誘導効果が増加することを確認することができた。前記の結果は、Ｌ１ＣＡＭの作用を抑制する抗体だけでなく、発現を抑制するｓｉＲＮＡと抗癌剤とを併用投与した時にも癌治療上昇効能があるということを提示している。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明によるＬ１ＣＡＭの活性または発現を抑制する物質および抗癌剤を含む抗癌用組成物を投与する場合、それに含まれるＬ１ＣＡＭの活性または発現を抑制する物質および抗癌剤を、同時に、個別にまたは、順次に併用することによって、これらの物質単独で処理したそれぞれの薬理学的効果に比べてはるかに強力ながらも有意的な癌細胞成長および死滅効果を示して、癌の治療、特にＬ１ＣＡＭを発現する癌腫として知られている卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頸部癌、乳癌、大腸癌、黒色腫、神経芽細胞腫、胆道癌、肺癌および膵臓癌のような様々な癌に対して非常に有用である。
【００６１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）Ｌ１ＣＡＭの活性または発現を抑制する物質および（ｂ）抗癌剤を、同時に、個別にまたは、順次に併用するために有効成分として含む抗癌用組成物であって、
ここで、前記Ｌ１ＣＡＭの活性を抑制する物質は、Ｌ１ＣＡＭ特異的な抗Ｌ１ＣＡＭ抗体、その抗原性結合断片、および抗Ｌ１ＣＡＭ抗体またはその抗原性結合断片の変異体からなる群より選択されるものであり、Ｌ１ＣＡＭの発現を抑制する物質は、Ｌ１ＣＡＭの発現を抑制するオリゴヌクレオチドであり、前記抗癌剤は、シスプラチン、ゲムシタビン、５−フルオロウラシル、ドセタキセルおよびパクリタキセルから選択されることを特徴とする抗癌用組成物。
【請求項２】
Ｌ１ＣＡＭの発現を抑制するオリゴヌクレオチドは、Ｌ１ＣＡＭをコード化する遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡからなる群より選択されるものである請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記抗Ｌ１ＣＡＭ抗体が受託番号ＫＣＴＣ １０９０９ＢＰのハイブリドーマによって分泌されるＡ１０−Ａ３抗体である請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ｓｉＲＮＡは、配列番号１で定義される配列から構成されるものである請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記抗癌剤は、シスプラチンである請求項１乃至４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
癌細胞の成長を抑制したり、癌細胞を死滅させることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記癌は、胆道癌、子宮内膜癌、子宮頸部癌、乳癌、大腸癌、卵巣癌、黒色腫、神経芽細胞腫、肺癌および膵臓癌からなる群より選択されるものである請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記抗癌用組成物は、前記（ａ）および（ｂ）をそれぞれ含む独立した単剤の形態で剤型化されたものであることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
請求項１の抗癌用組成物を投与する段階を含む癌の治療方法。
【請求項１０】
前記癌は、胆道癌、子宮内膜癌、子宮頸部癌、乳癌、大腸癌、卵巣癌、黒色腫、神経芽細胞腫、肺癌および膵臓癌からなる群より選択されるものである請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
癌治療用医薬を製造するための請求項１の組成物の用途。
【請求項１２】
前記癌は、胆道癌、子宮内膜癌、子宮頸部癌、乳癌、大腸癌、卵巣癌、黒色腫、神経芽細胞腫、肺癌および膵臓癌からなる群より選択されるものである請求項１１に記載の用途。
【請求項１３】
胆道癌、子宮内膜癌、子宮頸部癌、乳癌、大腸癌、卵巣癌、黒色腫、神経芽細胞腫、肺癌または、膵臓癌の治療のための請求項１の組成物の用途。
【請求項１】
（ａ）Ｌ１ＣＡＭの活性または発現を抑制する物質および（ｂ）抗癌剤を、同時に、個別にまたは、順次に併用するために有効成分として含む抗癌用組成物であって、
ここで、前記Ｌ１ＣＡＭの活性を抑制する物質は、Ｌ１ＣＡＭ特異的な抗Ｌ１ＣＡＭ抗体、その抗原性結合断片、および抗Ｌ１ＣＡＭ抗体またはその抗原性結合断片の変異体からなる群より選択されるものであり、Ｌ１ＣＡＭの発現を抑制する物質は、Ｌ１ＣＡＭの発現を抑制するオリゴヌクレオチドであり、前記抗癌剤は、シスプラチン、ゲムシタビン、５−フルオロウラシル、ドセタキセルおよびパクリタキセルから選択されることを特徴とする抗癌用組成物。
【請求項２】
Ｌ１ＣＡＭの発現を抑制するオリゴヌクレオチドは、Ｌ１ＣＡＭをコード化する遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡからなる群より選択されるものである請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記抗Ｌ１ＣＡＭ抗体が受託番号ＫＣＴＣ １０９０９ＢＰのハイブリドーマによって分泌されるＡ１０−Ａ３抗体である請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ｓｉＲＮＡは、配列番号１で定義される配列から構成されるものである請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記抗癌剤は、シスプラチンである請求項１乃至４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
癌細胞の成長を抑制したり、癌細胞を死滅させることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記癌は、胆道癌、子宮内膜癌、子宮頸部癌、乳癌、大腸癌、卵巣癌、黒色腫、神経芽細胞腫、肺癌および膵臓癌からなる群より選択されるものである請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記抗癌用組成物は、前記（ａ）および（ｂ）をそれぞれ含む独立した単剤の形態で剤型化されたものであることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
請求項１の抗癌用組成物を投与する段階を含む癌の治療方法。
【請求項１０】
前記癌は、胆道癌、子宮内膜癌、子宮頸部癌、乳癌、大腸癌、卵巣癌、黒色腫、神経芽細胞腫、肺癌および膵臓癌からなる群より選択されるものである請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
癌治療用医薬を製造するための請求項１の組成物の用途。
【請求項１２】
前記癌は、胆道癌、子宮内膜癌、子宮頸部癌、乳癌、大腸癌、卵巣癌、黒色腫、神経芽細胞腫、肺癌および膵臓癌からなる群より選択されるものである請求項１１に記載の用途。
【請求項１３】
胆道癌、子宮内膜癌、子宮頸部癌、乳癌、大腸癌、卵巣癌、黒色腫、神経芽細胞腫、肺癌または、膵臓癌の治療のための請求項１の組成物の用途。
【図１】
【図３】
【図４】
【図２】
【図５】
【図３】
【図４】
【図２】
【図５】
【公表番号】特表２０１２−５０９９３５（Ｐ２０１２−５０９９３５Ａ）
【公表日】平成２４年４月２６日（２０１２．４．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３８５５３（Ｐ２０１１−５３８５５３）
【出願日】平成２１年１１月２７日（２００９．１１．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００９／００７０５６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０６２１４３
【国際公開日】平成２２年６月３日（２０１０．６．３）
【出願人】（５０１２４５９９７）コリア リサーチ インスティテュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジー (15)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年４月２６日（２０１２．４．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１１月２７日（２００９．１１．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００９／００７０５６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０６２１４３
【国際公開日】平成２２年６月３日（２０１０．６．３）
【出願人】（５０１２４５９９７）コリア リサーチ インスティテュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジー (15)
【Ｆターム（参考）】
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