Ｏ−デスメチルベンラファキシンの単離されたヒドロキシおよびＮ−オキシド代謝産物および誘導体および治療方法
本発明は、ヒドロキシ−ＤＶ代謝産物、ヒドロキシ−ＤＶ−グルクロニド代謝産物、Ｎ−オキシド−ＤＶ代謝産物、およびベンジル−ヒドロキシ−ＤＶ代謝産物を含む、デスメチルベンラファキシンの代謝産物または誘導体として特徴付けられる新規な単離された化合物を提供する。本発明は、本発明のいずれかの代謝産物または誘導体と、医薬上許容される担体または賦形剤とを組み合わせて含む、医薬組成物を包含する。本発明はまた、哺乳動物における少なくとも１種の中枢神経系障害を治療する方法であって、その必要とする哺乳動物に、有効量の本発明の化合物を提供することを含む、方法を包含する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、出典明示によりその全内容を本願明細書の一部とする、２００６年１０月２５日付出願の米国仮出願番号第６０／８５４０６３号について優先権を主張するものである。
本発明はＤＶ（Ｏ−デスメチルベンラファキシン）の代謝産物または誘導体により特徴付けられる単離された化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
化学名が１−［２−（ジメチルアミノ）−１−（４−メトキシフェニル）エチル］シクロヘキサノールであるベンラファキシンは、モノアミン神経伝達物質の取り込み、すなわち、臨床的な抗うつ活性に付随する作用機序での強力な阻害剤であることが解っている。その新規な構造から、ベンラファキシンは入手可能な他の抗うつ薬、例えば三環式抗うつ薬、デシプラミン、ノストリプチリン、プロトリプチリン、イミプラミン、アミトリプチリン、トリミプラミンおよびドキセピンとは関係のない作用機序を有する。
【０００３】
ベンラファキシンの作用機序は、モノアミン神経伝達物質である、セロトニンおよびノルエピネフリンの取り込みを強力に阻害することと関連付けられると、考えられる。それほどではないとしても、ベンラファキシンはまた、ドパミン取り込みを阻害するも、モノアミンオキシダーゼに対する阻害活性を有しない。ヒトにおけるベンラファキシンの主たる代謝産物であるＯ−デスメチルベンラファキシンは同じような薬理特性を示す。ベンラファキシンのノルエピネフリンおよびセロトニン（５−ＨＴ）取り込みの阻害能は、三環式抗うつ薬の阻害能に匹敵あるいは凌ぐと予測されている。Montgomery, S.A.、Venlafaxine：A New Dimension in Antidepressant Pharmacotherapy、J. Clin. Psychiatry, ５４（３）：１１９ （１９９３）。
【０００４】
伝統的な三環式抗うつ薬とは反対に、ベンラファキシンは、インビトロにてムスカリン性、ヒスタミン作動性またはアドレナリン作動性受容体に対する親和性を実質的に有しない。これら受容体との薬理活性は、三環式抗うつ薬に認められる種々の抗コリン作動性、鎮痛性および心血管性作用と関連付けられる。
【０００５】
ベンラファキシンは米国特許第４５３５１８６号（Husbandsら）に開示されており、以前に抗うつ薬として有用であると報告されている。
【０００６】
化学的に１−［２−（ジメチルアミノ）−１−（４−フェノール）エチル］シクロヘキサノールと称されるＯ−デスメチルベンラファキシン（「ＤＶ」）はベンラファキシンの主な代謝産物であり、ノルエピネフリンおよびセロトニンの取り込みを阻害することが知られている。Klamerus, K. J.ら、“Introduction of the Composite Parameter to the Pharmacokinetics of Venlafaxine and its Active O−Desmethyl Metabolite”、J. Clin. Pharmacol. ３２：７１６−７２４（１９９２）。独特な特性を有するＯ−デスメチルベンラファキシンの特に有用な新規な塩の形態、すなわちＯ−デスメチルベンラファキシンコハク酸塩（「ＤＶＳ」）が米国特許第６６７３８３８号に開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第４５３５１８６号
【特許文献２】米国特許第６６７３８３８号
【非特許文献】
【０００８】
Montgomery, S.A.、Venlafaxine：A New Dimension in Antidepressant Pharmacotherapy、J. Clin. Psychiatry, ５４（３）：１１９ （１９９３）
【非特許文献１】Klamerus, K. J.ら、“Introduction of the Composite Parameter to the Pharmacokinetics of Venlafaxine and its Active O−Desmethyl Metabolite”、J. Clin. Pharmacol. ３２：７１６−７２４（１９９２）
【非特許文献２】Howell, S.R.ら、“Metabolic Disposition of 14C−Venlafaxine in Mouse, Rat, Dog, Rhesus Monkey and Man,” Xenobiotica ２３（４）：３４９３５９（１９９３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従来は、その遊離塩基であるか、塩であるかのいずれかの形態である、ベンラファキシンより形成される代謝産物の限定された理解だけが存在した。したがって、ベンラファキシンの代謝産物について、ある程度の情報が知られていたが（Howell, S.R.ら、“Metabolic Disposition of 14C−Venlafaxine in Mouse, Rat, Dog, Rhesus Monkey and Man,” Xenobiotica ２３（４）：３４９３５９（１９９３）を参照のこと）、従来技術では代謝性生成物すべての完全な理解を欠いており、したがってその活性の完全な理解を欠くものであった。本発明者らは、この度、生成される代謝産物およびその最終用途をさらに詳細に理解したものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、ＤＶの代謝産物または誘導体として特徴付けられる新規な単離された化合物、その対応する医薬組成物および治療方法を提供する。
【００１１】
具体的には、本発明は、式：
【化１】
［式中：
ヒドロキシ基は、点線の四角で示されるように、シクロヘキシル環の２−位（オルト位）または３−位（メタ位）に結合している］
で示される、単離されたヒドロキシ−ＤＶ代謝産物または誘導体、あるいはその医薬上許容される塩を包含する。一の実施形態において、その単離されたＤＶ代謝産物は２−ヒドロキシ−ＤＶ代謝産物である。もう一つ別の実施形態において、単離されたＤＶ代謝産物は３−ヒドロキシ−ＤＶ代謝産物である。
【００１２】
本発明はまた、式：
【化２】
［式中：
ヒドロキシ基は、点線の四角で示されるように、シクロヘキシル環の２−位（オルト）、３−位（メタ）または４−位（パラ）に結合している］
で示される、単離されたヒドロキシ−ＤＶグルクロニド代謝産物または誘導体、あるいはその医薬上許容される塩を包含する。一の実施形態において、その単離されたＤＶ代謝産物は２−ヒドロキシ−ＤＶグルクロニド代謝産物である。もう一つ別の実施形態において、単離されたＤＶ代謝産物は３−ヒドロキシ−ＤＶグルクロニド代謝産物である。第三の実施形態において、単離されたＤＶ代謝産物は４−ヒドロキシ−ＤＶグルクロニド代謝産物である。
【００１３】
本発明はさらには、式：
【化３】
で示される、単離されたＮ−オキシドＤＶ代謝産物または誘導体、あるいはその医薬上許容される塩を包含する。
【００１４】
本発明はさらには、式：
【化４】
［式中、ヒドロキシ基は、ベンジルの２−位または３−位に結合している］
で示される、単離されたベンジルヒドロキシ−ＤＶ代謝産物または誘導体、あるいはその医薬上許容される塩を包含する。一の実施形態において、その単離されたＤＶ代謝産物は２−ベンジルヒドロキシ−ＤＶである。もう一つ別の実施形態において、単離されたＤＶ代謝産物は３−ベンジルヒドロキシ−ＤＶである。
【００１５】
同様に、本発明は、本発明の代謝産物または誘導体のいずれかと、医薬上許容される担体または賦形剤とを組み合わせて含む、医薬組成物を包含する。本発明は、哺乳動物における少なくとも１種の中枢神経系障害を治療する方法であって、その必要とする哺乳動物に有効量の本発明の化合物を提供することを含む方法を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＤＶＳの代謝産物として特徴付けられる新規な単離された化合物を示す。図１（Ａ）は独特なヒドロキシル−ＤＶ化合物を示す。シクロヘキサノール環上のＯＨ基は点線の四角内に示されるいずれの位置にあってもよい。図１（Ｂ）は独特なヒドロキシル−ＤＶグルクロニドを示す。シクロヘキサノール環上のＯＨ基は点線の四角内に示されるいずれの位置にあってもよい。図１（Ｃ）はＮ−オキシドＤＶ化合物を示す。図１（Ｄ）はベンジルヒドロキシ−ＤＶ化合物を示す。ベンジル環上のＯＨ基は点線の四角内に示されるいずれの位置にあってもよい。
【図２】２−ヒドロキシＤＶ化合物の合成方法を示す。
【図３】２−ヒドロキシ−ＤＶグルクロニドの合成方法を提供する。
【図４】Ｎ−オキシドＤＶ化合物の合成方法を示す。
【図５】ベンジルヒドロキシ−ＤＶの合成方法を示す。
【図６】ＤＶＳをラットに単回経口投与（２０ｍｇ／ｋｇ）した後の代表的なラジオクロマトグラムを提供する。図６（Ａ）は投与から１時間経過後の雄の血漿を示す。図６（Ｂ）は投与から０−８時間経過後に採集した雄の尿を示す。図６（Ｃ）は投与から０−８時間経過後に採集した雄の糞便を示す。
【図７】ｍ／ｚ２６４のＤＶＳについての分解スキーム案およびその生成物のイオンスペクトルを示す。
【図８】ラットにおけるｍ／ｚ２８０のＭ６についての分解スキーム案およびその生成物のイオンスペクトルを示す。明細書および図面を通して、数字の前にある文字「Ｍ」は本明細書に記載される代謝産物をいう。
【図９】ラットにおけるｍ／ｚ４４０のＭ７についての分解スキーム案およびその生成物のイオンスペクトルを示す。
【図１０】ラットにおけるｍ／ｚ２５０のＭ１０についての分解スキーム案およびその生成物のイオンスペクトルを示す。
【図１１】［ｍ＋ｈ］＋（ｍ／ｚ２５０）の合成Ｎ，Ｏ−ジデスメチルベンラファキシンについての分解スキーム案およびその生成物のイオンスペクトルを示す。
【図１２】ラットにおけるｍ／ｚ４２６のＭ１３についての分解スキーム案およびその生成物のイオンスペクトルを提供する。
【図１３】ラットにおけるｍ／ｚ２８０のＮ−オキシドＤＶについての分解スキーム案およびその生成物のイオンスペクトルを提供する。
【図１４】ＤＶＳをイヌに単回経口投与（３０ｍｇ／ｋｇ）した後の代表的なラジオクロマトグラム代謝産物プロファイル、（ａ）投与１時間後の血漿、（ｂ）投与８−２４時間後に採集した尿、および（ｃ）投与０−２４時間後に採集した糞便を示す。
【図１５】イヌにおけるｍ／ｚ２８０のＭ６についての分解スキーム案およびその生成物のイオンスペクトルを提供する。
【図１６】イヌにおけるｍ／ｚ４４０のＭ７についての分解スキーム案およびその生成物のイオンスペクトルを示す。
【図１７】イヌにおけるｍ／ｚ２８０のＭ９についての分解スキーム案およびその生成物のイオンスペクトルを示す。
【図１８】イヌにおけるｍ／ｚ２５０のＭ１０についての分解スキーム案およびその生成物のイオンスペクトルを提供する。
【図１９】イヌにおけるｍ／ｚ４５６のＭ１２についての分解スキーム案およびその生成物のイオンスペクトルを示す。
【図２０】イヌにおけるｍ／ｚ４２６のＭ１３についての分解スキーム案およびその生成物のイオンスペクトルを示す。
【図２１】ｍ／ｚ２３６のＭ１４についての分解スキーム案およびその生成物のイオンスペクトルを提供する。
【図２２】［ｍ＋ｈ］＋（ｍ／ｚ２３６）の合成Ｎ，Ｎ，Ｏ−トリデスメチルベンラファキシンについての分解スキーム案およびその生成物を示す。
【図２３】イヌにおけるｍ／ｚ２８０のＮ−オキシドＤＶについての分解スキーム案およびその生成物のイオンスペクトルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
Ｉ．本発明の化合物
Ａ．単離されているＤＶ代謝産物または誘導体
【００１８】
本発明は、有益な特性があると期待される、ＤＶの新たに同定された代謝産物および誘導体に関する。該化合物のいくつかは天然の代謝産物（体内にて、またはそのための実験モデルにて、酵素反応により、あるいは他の反応により産生されるもの）であるが、他は実質的に同様の活性を示すと考えられる関連する構造物（誘導体）である。図１はこれら化合物の構造を示す。
【００１９】
図１（Ａ）に示されるように、（２または３）−ヒドロキシ−ＤＶ化合物は、ヒドロキシル基がシクロヘキシル環の２−位または３−位の炭素の一つと結合したヒドロキシル化ＤＶ誘導体である。２−および３−位の炭素は図１（Ａ）の点線の四角内の炭素である。２−および３−位の炭素で可能性として合計８個の結合部位があるが、対称であるため、環の２−位と２−位の炭素の組で４種の異なる化合物が生じる。したがって、ヒドロキシ基は２−位の炭素の２つの位置のいずれか、あるいは３−位の炭素のいずれかの位置に結合しうる。
【００２０】
シクロヘキシル環の２−、３−または４−位のいずれかがヒドロキシル化されているＤＶ代謝産物をグルクロニド化操作に付し、図１（Ｂ）に示されるシクロヘキシルヒドロキシ−ＤＶグルクロニドを形成してもよい。このヒドロキシ基は点線の四角内のいずれの炭素に結合してもよい。
【００２１】
図１（Ｃ）はＮ−オキシドＤＶ、すなわちジメチルアミン基の窒素に酸素が付いたＤＶＳ誘導体を示す。
【００２２】
図１（Ｄ）はベンジルヒドロキシＤＶ、すなわちベンジル環の２−位または３−位のいずれかの炭素にヒドロキシ基が結合したＤＶＳ代謝産物または誘導体を示す。
【００２３】
本願は各化合物の構造、ＤＶの代謝性生成物としての化合物に対する情報、単離および／または合成、ならびに各化合物について考えられる活性を示す図面を提供する。
１．インビボにおけるラット実験より特徴付けられる化合物
【００２４】
ＤＶＳの代謝作用を、ラットにて、２０ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基の量で計算）のものを単回経口投与して調査した。ＤＶＳは広くかつ迅速にラットにて主にＯ−デスメチルベンラファキシンＯ−グルクロニド（ＤＶグルクロニド）に代謝された。ＤＶグルクロニドは分析したすべての血漿および尿のサンプルにて優勢的な薬物関連の化合物であった。
【００２５】
Ｍ１−Ｍ６の６種の異なるヒドロキシ代謝産物をＬＣ／ＭＳで検出し、あるサンプルはラジオクロマトグラフィーで検出した。これらの代謝産物において、ヒドロキシル基はシクロヘキサノール環の２−、３−および４−位に結合し、６個の異なる化合物、Ｍ１−Ｍ６を生成する。これらのヒドロキシＤＶ代謝産物のグルクロニドはラットにて観察されなかった。Ｎ−オキシドＤＶがＬＣ／ＭＳを介してラットの血漿、尿および糞便中で観察された。さらなる代謝産物も観察された。
２．インビボのイヌ実験より特徴付けられる化合物
【００２６】
ＤＶＳのビーグル犬での代謝を、３０ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基）を単回経口投与することで測定した。ＤＶＳは広くかつ迅速にイヌにて代謝された。ＤＶグルクロニドは尿および血漿サンプルをラジオクロマトグラフィーに付して検出された最も豊富な代謝産物であった。
【００２７】
化合物Ｍ１−Ｍ６をＬＣ／ＭＳを介して血漿、尿および糞便にて観察した。化合物Ｍ１１およびＭ１２を（ラジオクロマトグラフィーおよびＬＣ／ＭＳを介して）尿にて観察した。Ｎ−オキシドＤＶを（ＬＣ／ＭＳを介して）血漿にて、（ＬＣ／ＭＳを介して）尿にて、（ラジオクロマトグラフィーおよびＬＣ／ＭＳを介して）糞便にて観察した。さらなる代謝産物も観察した。
【００２８】
要約すれば、ＤＶＳはイヌにおいて迅速かつ広範に多くの代謝産物に代謝された。検出された最も豊富な代謝産物がＤＶＯ−グルクロニドであった。最新の研究で観察された代謝産物は、経口投与した後のラットの血漿、尿、および糞便にて観察されたものと類似するものであり、ビーグル犬ではより多くの代謝産物が観察されている。
Ｂ．活性
【００２９】
本発明の化合物は代謝産物またはＤＳＶの誘導体として検出され、ベンラファキシンおよびＤＶＳの活性と同様の型の活性を示すと考えられている。ヒドロキシ−ＤＶグルクロニドは、グルクロニドが活性の前にインビボにて切断される、プロドラッグとして作用すると考えられている。グルクロニドの切断は、胃腸管にて特に活性であり得るβ−グルクロニダーゼの作用を介するか、あるいは胃中の条件などの酸性条件下で起こりうる。ヒドロキシル−ＤＶおよびＮ−オキシドＤＶ化合物はその現行の形態で活性であると考えられている。本発明の化合物は、当該分野にて周知である、受容体アッセイ結合試験ならびにインビボ代謝および効能試験を用いて特異的生物活性について試験してもよい。実施例５を参照のこと。
Ｃ．合成
１．遊離塩基化合物の合成
【００３０】
本発明の化合物は、有機合成の分野にて公知の合成方法と一緒に、または当業者がこれらの方法を変形しながら、以下に記載の方法を用いて調製することができる。一般に、Comprehensive Organic Synthesis, “Selectivity, Strategy & Efficiency in Modern Organic Chemistry”, I. Fleming, Pergamon Press, New York編（1991）；Comprehensive Organic Chemistry, “The Synthesis and Reactions of Organic Compounds”, J.F. Stoddard, Pergamon Press, New York編（1979）を参照のこと。適当な方法として、限定されるものではないが、後記する方法が挙げられる。
【００３１】
図２は本発明の２−ヒドロキシＤＶ化合物を合成する一の方法を提供する。この合成の第一の工程にて、４−（ジメチルカルバモイルメチル）フェノールをベンジル基で保護する。臭化ベンジル保護基は、その最終工程の間に除去するのが容易であるから、本発明の化合物の合成方法に用いるのに最適である。しかしながら、他の保護基を用いることもできる。
【００３２】
第二の工程にて、リチウムジイソプロピルアミドを試薬として用いて、保護された２−ヒドロキシシクロヘキサノン（そのヒドロキシで保護されている）の酸性溶液を適宜添加する。適当な保護基は当該分野にて知られており、ベンジル−、トリメチルシリル−、またはｔｅｒｔ−ブチル−ジメチルシリル基が挙げられる。
【００３３】
第三の工程にて、水素化アルミニウムリチウムを用いてケトンを除去する。別法として、ホウ水素化ナトリウムを用いてケトンを除去してもよい。最終工程は保護基の除去を示す。適宜保護された３−置換シクロヘキサノンを用い、同様の方法を使用して３−ヒドロキシＤＶ化合物を合成することができる。加えて、この方法を利用し、適宜保護された４−置換シクロヘキサノンを用いて、４−ヒドロキシＤＶ化合物を調製しうる。
【００３４】
図３はヒドロキシＤＶグルクロニドを合成する一の方法を提供する。この方法では、図示されるように、適当なヒドロキシ−ＤＶ化合物をグルクロニドのトリクロロイミダートとカップリングさせる。
【００３５】
図４はＮ−オキシドＤＶ化合物を合成する一の方法を提供する。この方法では、Ｏ−デスメチルベンラファキシンを３−クロロペルオキシ安息香酸（ＭＣＰＢＡ）で酸化することでＮ−オキシドＤＶが調製される。
【００３６】
ベンジルヒドロキシＤＶ化合物は、Yardley, JPら、「2-phenyl-2-(hydroxycycloalkyl）ethylamine Derivatives：Synthesis and Antidepressant Activity」、Journal of Medicinal Chemistry、３３（１０）：２８９９−９０５（１９９０）に記載の操作に従って調製され得る。当業者は合成スキームをYardleyにて記載されている他の構造物の調製に適合させ、２−ベンジルヒドロキシＤＶ化合物および３−ヒドロキシＤＶ化合物が望ましいとする本発明の知見を考慮して、その両方の化合物を合成することもできる。例えば、（３,４−ビス−ベンジルオキシ−フェニル）−酢酸で出発し、図５に示されるように、３−置換ベンジルヒドロキシＤＶを調製し得る。もう一つ別の例として、（２,４−ビス−ベンジルオキシ−フェニル）−酢酸を用い、２−置換ベンジルヒドロキシＤＶ化合物を調製し得る。別法として、Yardleyの操作に従って、（２,４−ビス−ベンジルオキシ−フェニル）−アセトニトリルおよび（３,４−ビス−ベンジルオキシ−フェニル）−アセトニトリルを用い、対応する２−および３−置換ベンジルヒドロキシＤＶ化合物を調製することができる。
２．塩の合成
【００３７】
本発明の化合物はその遊離塩基および塩の形態の両方で有用性を有する。本発明の塩基性化合物の医薬上許容される酸付加塩は、遊離塩基を、非毒性の塩を形成する当量の酸と反応させることにより一般に形成される。具体的な酸は無機または有機のいずれかの酸であり、塩酸、臭化水素酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、硫酸、リン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、シュウ酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、エタンスルホン酸、グルコン酸、グルタミン酸、イセチオン酸、乳酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、粘液酸、硝酸、パーモ酸、パントテン酸、ｐ−トルエンスルホン酸およびその同様の酸を包含する。非経口投与の場合には水溶性の塩が用いられるが、遊離塩基または医薬上許容される塩のいずれも、本発明の化合物の経口または非経口投与に適用可能である。
３．立体化学
【００３８】
本発明の化合物はエナンチオマーとして存在し、特記しない限り、本発明はラセミ混合物ならびに本発明の化合物の立体化学的に純粋な形態（Ｒ−エナンチオマーおよびＳ−エナンチオマーの両方の形態）を包含する。
Ｄ．単離
【００３９】
また、本発明の化合物は、該化合物を含有する血漿、尿または糞便から、あるいは該化合物を含有するインビトロシステムより、当該分野にて公知の方法を用いて単離することもできる。具体的には、個々の代謝産物の分離に導く条件下で、例えば、２種の移動相ＡおよびＢの直線的勾配を利用し、ここで実施例１−２に記載されるように、移動相Ａは１０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ５．５であり、移動相Ｂはアセトニトリルであり、分離をもたらす流速で利用する、分取用ＨＰＬＣ（prep-HPLC）を用いて単離され得る。
【００４０】
かかる単離された化合物は、純粋な形態であっても、あるいは実質的に純粋な形態であってもよく、天然の環境から分離されていることを意味する。実質的に純粋な化合物としては、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％の純度を有することが挙げられる。
Ｅ．医薬剤形
【００４１】
本発明の化合物を含有する医薬組成物は、本発明の付加的な態様を提供する。活性成分は、錠剤、カプセル、ならびに種々の着色剤、フレーバ、安定化剤および風味マスキング物質を含有するエリキシルおよび懸濁液などの液体製剤を含む、通常のいずれの経口用剤形に組み合わせることもできる。経口用剤形を構成する場合、活性成分を、澱粉、炭酸カルシウム、ラクトース、シュークロースまたはリン酸二カルシウムと混合し、打錠またはカプセル化工程を助成することができる。添加剤としてのステアリン酸マグネシウムは、必要ならば、有用な滑剤機能を提供する。活性成分は医薬上許容される滅菌液体担体、例えば滅菌水、滅菌有機溶媒あるいは両者の混合液に溶解または懸濁させることができる。液体担体は非経口用注射に適する担体である。活性成分が充分に可溶性である場合、担体としての生理食塩水に溶かすことができ；仮にあまりに溶けない場合、時に、適当な有機溶媒、例えば水性プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール溶液に溶かすこともできる。一般に、１０ないし７５重量％のグリコールを含有する水性プロピレングリコールが適している。他の例として、細分割した活性成分を水性澱粉またはカルボキシメチルセルロースナトリウム溶液に、あるいは適当な油、例えばアラキス油に分散させることにより他の組成物を製造することができる。滅菌溶液または懸濁液である液体医薬組成物は、筋肉内、腹腔内または皮下注射により利用することができる。
【００４２】
本発明の化合物を、慣用的な製薬技法に従って、医薬担体または賦形剤（例えば、医薬上許容される担体または賦形剤）と組み合わせ、医薬組成物または剤形を形成することができる。適当な医薬上許容される担体または賦形剤として、限定されるものではないが、Remington’s, The Science and Practice of Pharmacy（Gennaro, A.R.編、第１９版、１９９５、Mack Pub. Co.）に記載のものが挙げられる。「医薬上許容される」なる語は、動物、例えば哺乳動物（例えば、ヒト）に投与した場合、生理学的に耐容でき、典型的には、アレルギーまたは異常高進、眩暈などの同じような予期せぬ反応を惹起しない添加物または組成物をいう。経口用液体医薬組成物の場合、医薬担体または賦形剤は、限定されるものではないが、水、グリコール、油、アルコール、矯味矯臭剤、保存剤、着色剤等を包含し得る。経口用固体医薬組成物は、限定されるものではないが、澱粉、糖類、微結晶セルロース、希釈剤、造粒剤、滑沢剤、結合剤および崩壊剤を包含してもよい。医薬組成物および剤形はまた、ベンラファキシン、Ｏ−デスメチルベンラファキシンあるいはその上記した塩を含んでもよい。
【００４３】
剤形は、限定されるものではないが、錠剤、トローチ、ロゼンジ、分散液、懸濁液、坐剤、軟膏、湿布、ペースト、散剤、クリーム、液剤、カプセル（カプセル化球体を含む）またはパッチを包含する。剤形はまた、即時放出製剤ならびに放出を制御、持続、拡張または遅延させるのに適する製剤を包含しうる。錠剤および球体は、要すれば、標準的水性または非水性技法により被覆されていてもよい。
【００４４】
医薬組成物は、例えば錠剤またはカプセルのように、単位剤形であってもよい。かかる形態において、組成物を適量の活性成分を含有する単位用量に細分割してもよく；単位剤形を包装した組成物、例えば包装散剤またはバイアルもしくはアンプルとすることができる。単位剤形は、カプセル、カシェまたは錠剤そのものとすることができ、あるいはパッケージの中に適当な数の単位剤形を入れることもできる。単位用量の組成物中の活性成分の量は、個々の要求および活性成分の活性に応じて、変更しても、あるいは調整してもよい。
ＩＩ．治療方法
Ａ．治療され得る疾患
【００４５】
本発明の方法は、その必要とする哺乳動物に、有効量の１つ、または複数の本発明の化合物を投与することを含む。
【００４６】
本発明の化合物はベンラファキシンおよびＯ−デスメチルベンラファキシンの活性と同様の型の活性を有すると考えられる。ヒドロキシ−ＤＶグルクロニドは、インビボにてグルクロニド付加物を失い、対応するヒドロキシル−ＤＶ化合物を形成する、プロドラッグとして作用し得る。グルクロニドの切断は、胃腸管にて特に活性である、β−グルクロニダーゼの作用を介するか、あるいは胃の中での条件のような酸性条件下で起こりうる。残りの化合物は、その現行の形態で活性であると考えられている。
【００４７】
Reviews in Contemporary Pharmacology、第９巻（５）、２９３−３０２頁（１９９８）に記載されるように、Ｏ−デスメチル−ベンラファキシンは、表１に示される薬理特性を有する。
【表１】
【００４８】
かくして、本発明の化合物、組成物および方法は、限定されるものではないが、うつ病（限定されるものではないが、大うつ病性障害、双極性障害および気分変調を包含する）、線維筋痛、不安、パニック障害、広場恐怖症、心的外傷後ストレス障害、月経前不快気分障害（月経前症候群としても知られている）、注意力欠如障害（過活動と共にまたは無し）、強迫性障害（抜毛癖を含む）、社会不安障害、全般性不安障害、自閉症、統合失調症、肥満、神経性無食欲症、神経性過食症、ジル・デュ・ラ・トゥレット症候群、血管運動フラッシング、コカインおよびアルコール依存症、性機能不全（早漏を含む）、境界型人格障害、慢性疲労症候群、失禁（便失禁、溢流性尿失禁、受動失禁、反射性尿失禁、腹圧性尿失禁、急迫性尿失禁、労作性尿失禁および尿失禁を含む）、疼痛（限定されるものではないが、片頭痛、慢性腰痛、幻肢痛、中心性疼痛、神経因性疼痛、例えば、糖尿病性神経障害およびヘルペス後神経障害を包含する）、シャイ・ドレーガー症候群、レイノー症候群、パーキンソン病、てんかん等を含む、少なくとも１つの中枢神経系障害を患っている、あるいは罹患しやすい患者を治療するのに用いることができる。本発明の化合物および組成物はまた、以前にうつ病であって、今は回復の状態にある患者を継続して治療することを含め、うつ病のぶり返し、再発の防止に、認知障害の治療に、認識促進の誘発に、および／または老年性認知症、アルツハイマー病、記憶障害、健忘症、健忘症候群を患っている患者における気分の高揚に、ならびに喫煙または他のタバコ使用の中断の計画に用いることもできる。加えて、本発明の化合物および組成物はうつ状態およびうつ状態でない女性の視床下部性無月経の治療に用いることもできる。
Ｂ．投与および用量
【００４９】
本発明は、ヒトを含む哺乳動物における上記した疾病を治療、予防、阻害または緩和する方法であって、有効量の本発明の化合物をその必要とする哺乳動物に投与することを含む方法を提供する。有効量は上記した病態の１または複数の徴候を予防、阻害または緩和するのに十分な量である。
【００５０】
上記した病態を治療、予防または緩和するのに有効な用量は治療すべき病態の重篤度および投与経路で変化するであろう。用量および投与頻度もまた、個々のヒト患者の年齢、体重、応答および過去の病歴に応じて変化するであろう。一般に、本明細書中に記載される病態について推奨される一日用量の範囲は、本発明の化合物を一日に１０ｍｇないし１０００ｍｇとするものである。他の適当な用量として、５０ｍｇないし８００ｍｇ／日、７５ｍｇないし６００ｍｇ／日、１００ｍｇないし５００ｍｇ／日、および１５０ｍｇないし３００ｍｇ／日、ならびに２００ｍｇ／日が挙げられる。特定の用量として、上記したすべての端点を包含する。用量は遊離塩基を単位として記載されており、特定の医薬上許容される塩を単位として記載されていない。患者を管理するにおいて、治療は低用量で開始され、必要ならば増加させる。したがって、ヒト以外の患者の用量は当業者により調節されうる。
【００５１】
本発明の化合物はまた、ベンラファキシン、Ｏ−デスメチルベンラファキシン、ＤＶＳまたは他のその医薬上許容される塩と組み合わせて提供されてもよい。本発明の化合物はまた、他の既知の精神学的に活性な化合物、例えば、他の抗うつ剤または抗不安剤、ホルモン治療剤、疼痛用医薬および他の治療剤と一緒に提供されてもよい。
【００５２】
有効量の目的の化合物を患者に提供するのにいずれの適当な投与経路も利用しうる。例えば、経口、経粘膜（例えば、経鼻、舌下、口腔、経直腸または経膣）、非経口（例えば、静脈内または筋肉内）、経皮および皮下投与を利用しうる。
【００５３】
以下の実施例は例示であり、本発明を限定することを意図とするものではない。
実施例
実施例１． 単回経口投与した後のスプレーグドーリーラットでの［１４Ｃ］ＤＶＳの代謝作用
【００５４】
６個のヒドロキシＤＶ化合物およびＮ−オキシドＤＶ化合物、ならびに他の化合物を、以下のように、雌雄のラットに単回強制経口投与した後に尿、糞便および血漿中の［１４Ｃ］ＤＶＳに対する代謝特性にて検出した。
【００５５】
放射性標識の［１４Ｃ］ＤＶＳ（バッチ番号ＣＦＱ１３００３、［シクロヘキシル−１−１４Ｃ］ＤＶＳ）をAmersham Biosciences（バッキンガムシャ、ＵＫ）より購入した。非標識ＤＶＳ（バッチＲＢ１６３６；遊離塩基６５.２％）をWyeth Research、ローゼス・ポイント、ニューヨーク州より入手した。ＤＶＳの平均分子量は３８１.５であり、Ｏ−デスメチルベンラファキシンが６９.０重量％を占める。［１４Ｃ］ＤＶＳ（バルクドラッグ）の比活性は１４４μＣｉ／ｍｇ（遊離塩基では２０９μＣｉ／ｍｇ）であり、ＨＰＬＣにより放射性検出法を用いて測定した場合、遊離塩基の放射性純度（radiopurity）は９９.３％であった。
【００５６】
経口投与用液剤の調製用水をEM Science（ギブスタウン、ニュージャージ州）より入手した。メチルセルロースおよびポリソルベート８０を、各々、Sigma Chemical Co.（セントルイス、ミズーリー州）およびMallinckrodt Baker（フィリップスバーグ、ニュージャージ州）から購入した。尿および血漿サンプル、糞便ホモジネート抽出物および投薬液剤アリコート中の放射活性を計数するのに使用する液体シンチレーションカクテルはUltima Gold（登録商標）（Perkin Elmer、ウェルズリー、マサチューセッツ州）であった。
【００５７】
Oximate８０Robotic Automatic Sampler（Perkin Elmer）を備えたModel 307 Tri Carb Sample Oxidizerを血液および糞便サンプルを燃焼するのに使用した。PermaFluor（登録商標）Ｅ＋液体シンチレーションカクテル（Perkin Elmer）、Carbosorb（登録商標）Ｅ（Perkin Elmer）二酸化炭素吸収装置およびＨＰＬＣ等級水を用いて、該オキシダイザーにてサンプルを燃焼することで発生した放射活性二酸化炭素をトラップした。糞便ホモジネートおよび血液サンプルを燃焼のためコンバスト・コーン（combusto cone）およびカバーパッド（Perkin Elmer）に移した。
【００５８】
投与の際に、雄で体重が０.３１１と０.３４５ｋｇの間にあり、雌で０.２６３と０.３１１ｋｇの間にあるスプレーグドーリーラット（雄１２匹、雌６匹）を用いた。動物は自由に食物および水を摂取した。報告を容易にするため、動物を雄ラットで００１Ｍから０１２Ｍの番号を付し、雌ラットで００１Ｆから００６Ｆの番号を付した。尿および糞便を採集するのに、最終時点で、性別に、３匹の動物を個々に代謝ケージに収容した。他の動物は、個々に、標準ケージに収容した。
【００５９】
経口投薬液剤を８６.４ｍＬの３.０ｍｇ／ｍＬ（２.０ｍｇ／ｍＬ、遊離塩基）の非標識ＤＶＳ溶液を３.６ｍＬの４.３ｍｇ／ｍＬ（３.０ｍｇ／ｍＬ、遊離塩基）の［１４Ｃ］ＤＶＳ溶液と組み合わせることで調製した。液剤を水中０.２５％ポリソルベート８０、０.５％メチルセルロースで調製した。［１４Ｃ］ＤＶＳ（バルクドラッグおよび投薬液剤）の放射性化学純度、比活性および濃度を放射性検出装置を備えたＨＰＬＣを用いて測定した。投薬液剤のアリコートを、投薬液剤の比活性および放射活性濃度を測定するために投薬前、投薬中および投薬後に採取した。
【００６０】
各動物の標的用量は、強制経口投与を介して、３０ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基；３.０ｍｇ／ｍＬ、１０ｍＬ／ｋｇ、２５０μＣｉ／ｋｇ）［１４Ｃ］Ｏ−デスメチルベンラファキシンであった。
【００６１】
全血（約５ｍＬ）を、心穿刺により、適当な時点（雄ラットで１、４、８および２４時間、雌ラットで１および８時間、各時点で性別毎にＮ＝３）でヘパリン処理した試験管に採集した。全血の３部構成のアリコート（２００μＬ）をコンバスト・コーンに入れ、秤量し、風乾させた。これらのサンプルを酸化させた。残りの血液を５０００ｘｇ、４℃で１０分間（Model Legend RT centrifuge, Sorvall）遠心分離に付した。得られた血清を新たな試験管に移し、３部構成のアリコート（１００ｍＬ）を放射活性含量について分析した。残りの血漿を代謝産物の分析まで−７０℃で貯蔵した。
【００６２】
尿および糞便を性別で３匹の動物から別々にドライアイス上で採集した。雄ラットで０−８および８−２４時間、雌ラットで０−８時間で採集した。糞便サンプルを約５倍容量（ｖ／ｗ）の水で均質化した。約０.４グラムのホモジネートのアリコートをコンバスト・コーンに入れ、秤量し、風乾させた。ついで、これらのサンプルを酸化させた。残りの尿サンプルおよび糞便ホモジネートを代謝産物の分析まで−７０℃で貯蔵した。
【００６３】
血液サンプルおよび糞便ホモジネートを、捕獲剤としてCarbosorb（登録商標）E（６ｍＬ）およびシンチラントとしてPermaFluor（登録商標） E＋（１０ｍＬ）を用い、Model 307 Tri Carb sample oxidizerにて酸化した。酸化効率を１４Ｃ Spec Chec（Perkin Elmer）、既知の放射活性の標体を酸化することで測定し、９８.７％であると決定した。各サンプルの読取値から基底読取値（対照血液または糞便サンプルの平均値）を差し引いた。尿および血漿のアリコートを１０ｍＬのUltima Gold（登録商標）シンチレーション流体を添加した直後に分析した。
【００６４】
すべての放射活性測定を、Tri Carb Model 3100 TR液体シンチレーション計数器（Perkin Elmer）と、Ultima Gold（登録商標）またはトルエン標準曲線とを一緒に用いて行った。１分当たりのカウント（ＣＰＭ）を、既知の放射活性の外部標体を用いることで１分当たりの崩壊（ＤＰＭ）に変換した。各標体のクエンチを外部放射活性標体の変換スペクトル指数（ｔＳＩＥ）により測定した。検出下限を基底値の２倍と規定した。
血漿の代謝産物サンプル
【００６５】
投薬の１、４および８時間後に採集した血漿サンプルを代謝産物プロファイルについて分析した。０.５ｍＬの血漿のアリコートを等容量のアセトニトリルと混合し、約１０分間氷上に置き、ついで３５００ｒｐｍ、４℃でSorvall Super ２１遠心分離機を用いて１０分間遠心分離に付した。上澄の流体を新たな試験管に移した。上澄を放射活性について分析した。その上澄をTurbo Vap （Zymark、ホピントン、マサチューセッツ州）中、窒素流の下で濃縮し、アセトニトリルを除去した。水性残渣のアリコートをＨＰＬＣで分析し、代謝産物をプロファイルした。選択されたサンプルはＬＣ／ＭＳでも分析し、その放射活性ピークを特徴付けた。
【００６６】
ラットの血漿中の［１４Ｃ］ＤＶＳの安定性を測定した。［１４Ｃ］ＤＶＳ（０.０１ｍｇ／ｍＬ、最終濃度）を対照となるラットの血漿に添加し、３７℃に設定した振盪水浴にてインキュベートした。アリコート（０.５ｍＬ）を０、１、４、８および２４時間で取り出した。サンプルを上記のように抽出し、ＨＰＬＣ分析により放射性純度をアッセイした。
尿の代謝産物サンプル
【００６７】
すべての尿サンプルを代謝産物プロファイルについて分析した。０.５ｍＬの尿のアリコートを３５００ｐｍ、４℃でSorvall Super ２１遠心分離機を用いて１０分間遠心分離に付した。上澄を新たな試験管に移し、放射活性含量をＨＰＬＣで分析してプロファイルした。選択されたサンプルはＬＣ／ＭＳでも分析し、その放射活性ピークを特徴付けた。
【００６８】
ラットの尿中の［１４Ｃ］ＤＶＳの安定性を測定した。［１４Ｃ］ＤＶＳ（０.１３ｍｇ／ｍＬ、最終濃度）を対照となるラットの尿に添加し、３７℃に設定した振盪水浴にてインキュベートした。アリコート（０.５ｍＬ）を０、１、４、８および２４時間で取り出した。サンプルを上記のように抽出し、ＨＰＬＣ分析により放射性純度をアッセイした。
糞便の代謝産物サンプル
【００６９】
投薬後８時間と２４時間の間に雄のラットより採集した糞便ホモジネートを代謝産物プロファイルについて分析した。約１グラムの糞便ホモジネートのアリコートを３５００ｒｐｍ、４℃でSorvall Super ２１遠心分離機を用いて１０分間遠心分離に付した。上澄を新たな試験管に移した。残渣を１ｍＬの水：アセトニトリル（１：１、ｖ：ｖ）に再び懸濁させ、上記したように遠心分離に付した。得られた上澄を最初の上澄と合し、残渣を１ｍＬのアセトニトリルに再び懸濁させた。懸濁液を上記しように遠心分離に付し、上澄を合し、放射活性について分析した。ついで、上澄をTurbo Vapにて窒素流下で濃縮し、アセトニトリルを除去した。水性残渣のアリコートをプロファイルについてＨＰＬＣで分析した。選択されたサンプルはＬＣ／ＭＳでも分析し、その放射活性ピークを特徴付けた。
サンプル分析
【００７０】
Waters Alliance model 2690 HPLCシステム（Waters Corp.、ミルフォード、マサチューセッツ州）を用いてクロマトグラフィー分析を行った。該装置はビルトイン型自動サンプラーを備えており、２２５ｎｍでモニター観察するように設定されたModel 248 TunableＵＶ検出装置、および２５０μＬ LQTRフローセルを含むFloOneβModel 525放射活性フロー検出装置（Perkin Elmer）とインラインに設置された。Ultima Flow Mシンチレーション流体の流速は１ｍＬ／分であり、シンチレーションカクテルは移動相に対して５：１の混合割合を提供した。代謝産物のピークの分離を、２種の移動相、ＡおよびＢの線状勾配を用い、Phenomenex Luna C18（2）カラム、１５０ｘ２.０ｍｍ、５ミクロン（Phenomenex、トランス、カリフォルニア州）で行った。移動相Ａは１０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ６.０であり、移動相Ｂはアセトニトリルであった。流速は０.２ｍＬ／分であった。移動相を表２に示すように流した。
【表２】
【００７１】
自動サンプラーおよびダイオードアレイＵＶ検出装置を含む、Agilent Model 1100 HPLCシステム（Agilent Technologies、ウィルミントン、デラウェア州）をＬＣ／ＭＳ分析に用いた。ＵＶ検出装置は２００ないし４００ｎｍをモニター観察するように設定された。分離を５ミクロンPhenomenex Luna C18（2）カラム、１５０ｘ２.０ｍｍ（Phenomenex）で達成した。カラム温度は２５℃であった。移動相および勾配プログラムは以下のとおりであった。
【００７２】
代謝産物の特徴化に用いたマススペクトロメータはMicromass Q−TOF−2 四極子飛行時間ハイブリッドマススペクトロメータ（Micromass, Inc., ベバリー、マサチューセッツ州）であった。該マススペクトロメータはエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）インターフェースを備えており、陽イオン化モードにて操作された。該マススペクトロメータのセッティングを表３に列挙する。
【表３】
【００７３】
放射活性ピークのデータ収集および解析には、FloOne分析ソフトウェア（version 3.65、Packard BioScience、ボストン、マサチューセッツ州）を利用した。コンピュータプログラムMicrosoft Excel（登録商標）97を用いて平均値および標準偏差を計算した。MassLynxソフトウェア（version 3.5）を用いてＬＣ／ＭＳデータを分析した。
結果
【００７４】
放射分析検出装置を備えたＨＰＬＣによって測定した［１４Ｃ］ＤＶＳ（バルク化合物）の放射化学純度および比活性は、各々、９９．３％および２０９μＣｉ／ｍｇ（遊離塩基）であった。投薬溶液中の［１４Ｃ］Ｏ−デスメチルベンラファキシンの濃度、放射純度および比活性は、各々、２.０５ｍｇ／ｍＬ、９７.８％および１１.７μＣｉ／ｍｇであった。投薬溶液の投与前、中および後のアリコートは同様の濃度および純度を有した。［１４Ｃ］ＤＶＳの平均投与用量は１９.９±０.２４ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基）であった。この用量は３０ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基）の標的用量から逸脱した。というのも、投与製剤の最初の秤量がＤＶＳがＯ−デスメチルベンラファキシン（遊離塩基）のコハク酸塩であることを考慮しなかったからである。
対照ラットの尿および血漿中の［１４Ｃ］ＤＶＳの安定性
【００７５】
［１４Ｃ］ＤＶＳは対照ラットの尿および血漿の両方で３７℃で２４時間まで安定であった。ラット血漿の［１４Ｃ］ＤＶＳの放射純度はいずれの時点でも９８．９％よりも大きく、その一方でラット尿では放射純度はいずれの時点でも９９．５％よりも大きかった。
血液の血漿への分配
【００７６】
血液および血漿中の放射活性の濃度、ならびに血液の血漿への分配を表４に示す。雄と雌のラットの間の血液または血漿にて検出される放射活性の濃度にて有意な違いはなかった。雄ラットの放射活性全体の平均血漿中濃度は、投薬後１、４、８および２４時間後で、各々、１１.０、１.４８、０.８９および０.０７μｇ当量／ｍＬであった。雌ラットの場合、放射活性全体の平均血漿中濃度は、投薬後１および８時間後で、各々、９.９０および０.９２μｇ当量／ｍＬであった。１、４および８時間の時点で、血液の血漿に対する放射活性の割合は、両方の性で０.５９と０.６７の間の範囲にあり、２４時間の時点で雄ラットでは０.９９であった。
【表４】
【００７７】
血漿からの放射活性の平均抽出効率は９８.７±１３.０％であった（データは示さず）。投薬１時間後に雄ラットより採集したラット血漿の代表的なラジオクロマトグラムを図６（Ａ）に示す。投薬後１時間および４時間では、ＤＶグルクロニド（表４にてＭ７として列挙されている）がラジオクロマトグラフィーで検出される顕著なピークであった。投薬後１時間および４時間、雄ラットで、各々、血漿中放射活性の８８.７および９３.６％がＤＶグルクロニドピークと関連付けられた。雌ラットにおいては、ＤＶグルクロニドが投薬後１時間で血漿中放射活性の８６.６％を占めた。８時間および２４時間のサンプルはラジオクロマトグラフィーにより分析されるのに十分な放射活性を有しなかった。血漿サンプルで唯一の別の主たるラジオクロマトグラフィーのピークが未変換ＤＶＳであり、それを検出すると、血漿中放射活性の２.６と１０％の間を占めた。いくつかの血漿サンプルで検出された別の従たる代謝産物がとして、シクロヘキサン環でヒドロキシル化された代謝産物が挙げられる（Ｍ１−Ｍ６、ヒドロキシＤＶ化合物）。Ｍ１−Ｍ６は、個々に、各時点で血漿中、放射活性の２％未満を占めた。
【００７８】
ラジオクロマトグラムでは存在しないさらに従たる代謝産物をラット血漿にて検出し、ＬＣ／ＭＳで特徴付けた（表５）。これらの代謝産物はＮ−オキシドＤＶ、Ｎ，Ｏ−ジデスメチルベンラファキシン（Ｍ１０）、Ｎ，Ｏ−ジデスメチルベンラファキシンＯ−グルクロニド（Ｍ１３）を包含する。
【表５】
尿の代謝産物プロファイル
【００７９】
尿が主たる排泄経路であり、５０％以上の放射活性用量が投薬後の最初の８時間以内の尿サンプルにて回収され、８５％が投薬後２４時間以内に回収された。尿中で検出された放射活性濃度を、ラジオクロマトグラフィー分析に付した後の放射活性の％分布として、表６に示す。投薬後０−８時間に集めたラット尿の代表的なラジオクロマトグラムを図６（Ｂ）に示す。分析したすべてのサンプルにて検出された優勢的な放射活性ピークはＤＶグルクロニド（Ｍ７）であり、それは各時点のすべての尿サンプル中で検出された放射活性ピークの約７５％を占めた。未変換［１４Ｃ］ＤＶＳは尿中に検出された放射活性の９ないし２０％を占めた。ラジオクロマトグラフィーにより尿中に少量の２種のヒドロキシル−ＤＶ化合物が検出された。このうちの一つがこれらの代謝産物の最も豊富なＭ２を含むものであり、尿中の放射活性の７．５％までを占める。
【表６】
【００８０】
ラジオクロマトグラムでは存在しないさらに従たる代謝産物を尿にて検出し、ＬＣ／ＭＳで特徴付けた（表５）。これらの代謝産物はＭ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｍ６、Ｎ−オキシドＤＶ、Ｎ，Ｏ−ジデスメチルベンラファキシン（Ｍ１０）、Ｎ，Ｏ−ジデスメチルベンラファキシンＯ−グルクロニド（Ｍ１３）を包含する。
糞便の代謝産物プロファイル
【００８１】
ラジオクロマトグラフィー分析に付す前の８−２４時間糞便サンプルからの放射活性の抽出効率は７４.９±１.９％であった（データは示さず）。少しの割合の放射活性用量（約１０％）だけが投薬の２４時間以内に糞便にて排泄された。０．１％未満の放射活性用量が０−８時間の糞便サンプルにて排泄された。個々のラットからの糞便中の回収％およびラジオクロマトグラフィー分析に付した放射活性の分布を図７に示す。投薬後８−２４時間で集めたラット糞便の抽出物の代表的なラジオクロマトグラムを図６（Ｃ）に示す。ラジオクロマトグラフィーにより検出された最も顕著なピークがＮ，Ｏ−ジデスメチルベンラファキシン（Ｍ１０）であり、糞便中の放射活性の３４％を占めた。糞便中の放射活性の約２１％は未変換ＤＶＳであった。Ｎ−オキシドＤＶは糞便中の放射活性の７％を占めた。ヒドロキシル化代謝産物Ｍ１−Ｍ６を合わせると、糞便中の放射活性の約３８．６％を占め、個々の代謝産物は糞便中の放射活性の１．７ないし１２．２％の範囲にあった。少量のＯ−デスメチルベンラファキシンＯ−グルクロニド（Ｍ７）がＬＣ／ＭＳによってのみ糞便中で観察された。
【表７】
【００８２】
ラット血漿、尿および糞便中のＤＶＳおよびその代謝産物に対するマススペクトルをＬＣ／ＭＳおよびＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析により得た。ラットのＤＶＳ代謝産物の構造的特徴化を表５に要約する。ＬＣ／ＭＳデータはＤＶＳのグルクロニド（Ｍ７）、Ｎ，Ｏ−ジデスメチルベンラファキシン（Ｍ１０）およびヒドロキシル化生成物（Ｍ１−Ｍ６）への代謝反応を示した。これら代謝産物、ＤＶＳ、Ｎ−オキシドＤＶおよび従たる代謝産物（Ｍ１３）のマススペクトルの特徴化を後記する。
ＤＶＳ
【００８３】
ＤＶＳ標体のマススペクトルの特徴を代謝産物との比較のために分析した。ＤＶＳのＬＣ／ＭＳスペクトルにおいて、プロトン化分子イオン、［Ｍ＋Ｈ］＋はｍ／ｚ２６４で観察された。図７は、衝突誘起解離（ＣＩＤ）より得られたＤＶＳのｍ／ｚ２６４のマススペクトルの生成物、および分解スキームの提案を示す。分子イオンからＨ２Ｏが喪失すると、ｍ／ｚ２４６の生成物イオンが得られる。さらにジメチルアミノ基が喪失すると、ｍ／ｚ２０１の生成物イオンが得られる。シクロヘキサノール基がＤＶＳから喪失することでｍ／ｚ１６４の生成物イオンが示された。ｍ／ｚ５８の生成物イオンは（ＣＨ３）２ＮＣＨ２＋によるものであった。加えて、ｍ／ｚ１０７、１３３、１４５、１５９および１７３の生成物イオンは、各々、ＤＶＳ分子のメチル、プロピル、ブチル、ペンチルおよびヘキシル−フェノール部分に相当する。したがって、これらのイオンを用いてジメチルアミノ、ヒドロキシベンジルおよびシクロヘキサノール基に局在化される代謝作用の部位を検出することができた。
代謝産物Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５およびＭ６（ヒドロキシＤＶ化合物）
【００８４】
代謝産物Ｍ１ないしＭ６はｍ／ｚ２８０の［Ｍ＋Ｈ］＋を生成し、それはＤＶＳよりも１６Ｄａ大きく、ヒドロキシル化またはＮ−酸化を示唆した。図８はＭ６についてｍ／ｚ２８０スペクトルの生成物を示す。代謝産物Ｍ１ないしＭ６についてのマススペクトルデータは類似していた。分子イオンからのＨ２Ｏの喪失でｍ／ｚ２６２の生成物イオンが得られた。代謝産物についてｍ／ｚ５８、１０７および２１７の生成物イオンと、ＤＶＳについてｍ／ｚ５８、１０７および２０１とを対比して、シクロヘキサン環が代謝作用の部位であることが分かる。したがって、代謝産物Ｍ１ないしＭ６は、シクロヘキサン環を酸化部位として有するヒドロキシＤＶＳ代謝産物であると提案された。
代謝産物Ｍ７（Ｏ−デスメチルベンラファキシンＯ−グルクロニド、ＤＶグルクロニド）
【００８５】
この代謝産物の［Ｍ＋Ｈ］＋はｍ／ｚ４４０で観察され、それは分子量が４３９であることを示した。図９はＭ７についてｍ／ｚ４４０スペクトルの生成物を示す。該分子イオンから１７６Ｄａを喪失すると、ｍ／ｚ２８０のイオンが得られ、それはこの分子がグルクロニドであることを示した。ｍ／ｚ２４６、２０１、１５９、１４５、１３３、１０７および５８の生成物イオンもまた、ＤＶＳで観察された。マススペクトルデータはコンジュゲーションの部位を示さなかった。しかしながら、ＤＶＳは同じようにＨ２Ｏを喪失しており、ｍ／ｚ２４６で［ＭＨ−Ｈ２Ｏ］＋を生成する（図７）。これらのＨ２Ｏの喪失はシクロヘキサノール基より生じた。このことはシクロヘキサノールよりもむしろフェノールがグルクロニド化の部位であることを示すものである。加えて、フェノール基はコンジュゲーションの点からより代謝的に適当な部位であった。したがって、Ｍ７はフェノール基をコンジュゲーションの部位として有するＤＶＳのＯ−グルクロニドであると同定された。
代謝産物Ｍ１０（Ｎ，Ｏ−ジデスメチルベンラファキシン）
【００８６】
Ｍ１０についての［Ｍ＋Ｈ］＋がｍ／ｚ２５０で観察された。図１０はＭ１０についてｍ／ｚ２５０スペクトルの生成物を示す。Ｈ２Ｏがｍ／ｚ２５０の分子イオンから喪失すると、ｍ／ｚ２３２の生成物が生成された。その後でメチルアミンがｍ／ｚ２３２から喪失すると、ｍ／ｚ２０１の特徴的な生成物が得られた。このこと、およびｍ／ｚ５８の生成物イオンの欠如は、ＤＶＳのジメチルアミノ基がＮ−デメチル化によりメチルアミノ基に変換されたことを示した。Ｍ１０のｍ／ｚ２５０マススペクトルの生成物は、合成Ｎ,Ｏ−ジデスメチルベンラファキシンのｍ／ｚ２５０マススペクトルの生成物と適合した。図１１は合成Ｎ,Ｏ−ジデスメチルベンラファキシンのｍ／ｚ２５０マススペクトルの生成物を示す。したがって、Ｍ１０はＮ,Ｏ−ジデスメチルベンラファキシンであると同定された。
代謝産物Ｍ１３（Ｎ,Ｏ−ジデスメチルベンラファキシンＯ−グルクロニド）
【００８７】
この代謝産物の［Ｍ＋Ｈ］＋をｍ／ｚ４２６で観察し、それは分子量が４２５であることを示した。図１２はＭ１３の生成物イオンスペクトルを示す。ｍ／ｚ４２６から１７６Ｄａの喪失により、ｍ／ｚ２５０のイオンが得られる。シクロヘキサノール基からＨ２Ｏが喪失すると、ｍ／ｚ４０８のベースピークが生じる。ｍ／ｚ４０８のイオンから１７６Ｄａの喪失はｍ／ｚ２３２のＭ１０の特徴的な生成物をもたらした。その後、ｍ／ｚ２３２からメチルアミンが喪失し、ｍ／ｚ２０１の生成物イオンが得られた。従って、Ｍ１３はグルクロニド化の部位としてのフェノール基を有するＮ,Ｏ−ジデスメチルベンラファキシンＯ−グルクロニドであると提案された。
Ｎ−オキシドＤＶ
【００８８】
このＤＶＳ関連の成分についての［Ｍ＋Ｈ］＋をｍ／ｚ２８０で観察し、それはヒドロキシル化またはＮ−酸化を示した。図１３はこの関連する化合物のｍ／ｚ２８０マススペクトルの生成物を示す。［Ｍ＋Ｈ］＋イオンから６１Ｄａの喪失はｍ／ｚ２１９の生成物イオンをもたらした。このことはＮ−オキシドと一致するジメチルヒドロキシアミンの喪失に相当した。したがって、この代謝産物はＤＶＳのＮ−オキシドであると同定された。
実施例２ 単回経口投与したビーグル犬における［１４Ｃ］Ｏ−デスメチルベンラファキシンの代謝作用
【００８９】
（２または３）−ヒドロキシＤＶ化合物、ヒドロキシＤＶグルクロニド、Ｎ−オキシドＤＶ化合物ならびに他の化合物およびベンジルヒドロキシ化合物を、以下のように、雄のビーグル犬に単回強制経口投与した後に尿、糞便および血漿中の［１４Ｃ］ＤＶＳに対する代謝特性にて検出した。
材料および方法
【００９０】
放射性標識の［１４Ｃ］ＤＶＳ（バッチ番号ＣＦＱ１３００３、［シクロヘキシル−１−１４Ｃ］ＤＶＳ）をAmersham Biosciences（バッキンガムシャ、ＵＫ）より購入した。非標識ＤＶＳ（バッチＲＢ１６３６；遊離塩基６５.２％）をWyeth Research、ローゼス・ポイント、ニューヨーク州より入手した。ＤＶＳの平均分子量は３８１.５であり、遊離塩基でのＯ−デスメチルベンラファキシンが６９.０重量％を占める。［１４Ｃ］ＤＶＳ（バルクドラッグ）の比活性は１４４μＣｉ／ｍｇ（遊離塩基では２０９μＣｉ／ｍｇ）であり、ＨＰＬＣにより放射性検出法を用いて測定した場合、遊離塩基の放射性純度は９９.３％であった。
【００９１】
経口投与用液剤の調製用水をEM Science（ギブスタウン、ニュージャージ州）より入手した。メチルセルロースおよびポリソルベート８０を、各々、Sigma Chemical Co.（セントルイス、ミズーリー州）およびMallinckrodt Baker（フィリップスバーグ、ニュージャージ州）から購入した。尿および血漿サンプル、糞便ホモジネート抽出物および投薬液剤アリコート中の放射活性を計数するのに使用する液体シンチレーションカクテルはUltima Gold（登録商標）（Perkin Elmer、ウェルズリー、マサチューセッツ州）であった。
【００９２】
Oximate−８０Robotic Automatic Sampler（Perkin Elmer）を備えたModel 307 Tri−Carb Sample Oxidizerを血液および糞便サンプルを燃焼するのに使用した。PermaFluor（登録商標）Ｅ＋液体シンチレーションカクテル（Perkin Elmer）、Carbosorb（登録商標）Ｅ（Perkin Elmer）二酸化炭素吸収装置およびＨＰＬＣ等級水を用いて、該オキシダイザーにてサンプルを燃焼することで発生した放射活性二酸化炭素をトラップした。糞便ホモジネートおよび血液サンプルを燃焼のためのコンバスト・コーンおよびカバーパッド（Perkin Elmer）に移した。
動物
【００９３】
投与の際に、体重が１４．４と１６．２ｋｇの間にある雄のビーグル犬（ｎ＝４）（インハウスコロニーより調達）を用いた。報告を容易にするため、動物に番号５ないし８と番号付けした。投薬調製、動物の投薬およびサンプル採集は、Wyeth Research、パールリバー、ニューヨーク州でなされた。
投薬調製、投薬および分析
【００９４】
１９．０ｍｇの［１４Ｃ］ＤＶＳと４１６８．３ｍｇの非標識ＤＶＳを２７０ｍＬのビヒクル（水中０．２５％ポリソルベート８０、０．５％メチルセルロース）に懸濁させることで経口用投薬液剤を調製した。［１４Ｃ］ＤＶＳ（バルクドラッグおよび投薬液剤）の放射性化学純度、比活性および濃度を放射性検出装置を備えたＨＰＬＣを用いて測定した。投薬液剤の２部構成のアリコートを、投薬液剤の比活性および放射活性濃度を測定するために投薬前、投薬中および投薬後に採取した。
【００９５】
各動物の標的用量は、強制経口投与を介して、３０ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基；１０ｍｇ／ｍＬ、３ｍＬ／ｋｇ、３０μＣｉ／ｋｇ）［１４Ｃ］ＤＶＳであった。この標的用量は、かかる用量が以前の薬物動態学的研究にて用いられたため、選択された。加えて、この用量を皮下的に投与すると、雄スプレーグドーリーラットの脳中のノルエピネフリンレベルを有意に増大させた。
採血および分析
【００９６】
投薬の１、４、８および２４時間後にヘパリン処理した試験管に採集した全血（約１０ｍＬ）（各時点でＮ＝４）を分析した。１ｍＬの血液を放射活性濃度を測定するのに用いられる新たな試験管に移した。採血の２時間以内に４℃で遠心分離に付すことで血漿を得た。血漿および全血サンプルを分析のためにドライアイスに乗せてWyeth Research, Biotransformation Division（カレッジビル、ペンシルベニア州）に運んだ。全血の３部構成のアリコート（２００μＬ）をコンバスト・コーンに入れ、風乾させた。ついで、これらのサンプルを酸化させ、放射活性含量について分析した。残りの血漿を代謝産物の分析まで−７０℃で貯蔵した。
【００９７】
イヌ毎に、尿および糞便を別々に集め、尿はドライアイス上で、糞便は室温で採集した。尿は０−８および８−２４時間で、糞便は０−２４時間で採集した。尿および糞便サンプルを分析のためにドライアイスに乗せてWyeth Research, Biotransformation Division（カレッジビル、ペンシルベニア州）に運んだ。糞便サンプルを約５倍容量（ｖ／ｗ）の水で均質化した。約０.２グラムのホモジネートのアリコートをコンバスト・コーンに入れ、秤量し、風乾させた。ついで、これらのサンプルを酸化させ、放射活性含量を測定した。残りの尿サンプルおよび糞便ホモジネートを代謝産物の分析まで−７０℃で貯蔵した。
【００９８】
血液サンプルおよび糞便ホモジネートを、捕獲剤としてCarbosorb（登録商標）E（６ｍＬ）およびシンチラントとしてPermaFluor（登録商標）E＋（１０ｍＬ）を用い、Model 307 Tri Carb sample oxidizerにて酸化した。各サンプルの読取値から基底読取値（対照血液または糞便サンプルの平均値）を差し引いた。尿および血漿のアリコートを１０ｍＬのUltima Gold（登録商標）シンチレーション流体を添加した直後に分析した。
【００９９】
すべての放射活性測定を、Tri Carb Model 3100 TR液体シンチレーション計数器（Packard BioScience、ボストン、マサチューセッツ州）と、Ultima Gold（登録商標）またはトルエン標準曲線とを一緒に用いて行った。１分当たりのカウント（ＣＰＭ）を、既知の放射活性の外部標体を用いることで１分当たりの崩壊（ＤＰＭ）に変換した。各標体のクエンチを外部放射活性標体の変換スペクトル指数（ｔＳＩＥ）により測定した。検出下限を基底値の２倍と規定した。
血漿の代謝産物サンプル
【０１００】
投薬の１および４時間後に採集した血漿サンプルを代謝産物プロファイルについて分析した。１ｍＬの血漿のアリコートを等容量のアセトニトリルと混合し、少なくとも１０分間氷上に置き、ついでEppendorf Model 5415C遠心分離機を用い、１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離に付した。上澄の流体を新たな試験管に移した。上澄を放射活性について分析した。その上澄をTurbo Vap（Zymark、ホピントン、マサチューセッツ州）中、窒素流の下で濃縮し、アセトニトリルを除去した。水性残渣のアリコートをＨＰＬＣで分析し、プロファイルした。選択されたサンプルはＬＣ／ＭＳでも分析し、その放射活性ピークを特徴付けた。
【０１０１】
イヌの血漿中の［１４Ｃ］ＤＶＳの安定性を測定した。［１４Ｃ］ＤＶＳ（０.０１２ｍｇ／ｍＬ、最終濃度）を対照となるイヌの血漿に添加し、３７℃に設定した振盪水浴にてインキュベートした。２部構成のアリコート（１ｍＬ）を０、１、４、８および２４時間で取り出した。サンプルを上記のように抽出し、ＨＰＬＣ分析により放射性純度をアッセイした。
尿の代謝産物サンプル
【０１０２】
投薬後の８時間と２４時間の間に採集した尿サンプルを代謝産物プロファイルについて分析した。尿のアリコートをEppendorf Model 5415C遠心分離機を用い、１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離に付した。上澄を新たな試験管に移し、放射活性含量についてＨＰＬＣにより分析し、代謝産物をプロファイルした。選択されたサンプルはＬＣ／ＭＳでも分析し、その放射活性ピークを特徴付けた。
【０１０３】
イヌの尿中の［１４Ｃ］ＤＶＳの安定性を測定した。［１４Ｃ］ＤＶＳ（０.０２５ｍｇ／ｍＬ、最終濃度）を対照となるイヌの尿に添加し、３７℃に設定した振盪水浴にてインキュベートした。アリコート（１ｍＬ）を０、１、４、８および２４時間で取り出した。サンプルを上記のように抽出し、ＨＰＬＣ分析により放射性純度をアッセイした。
糞便の代謝産物サンプル
【０１０４】
投薬後２４時間までに採集した糞便ホモジネートを代謝産物プロファイルについて分析した。約２グラムの糞便ホモジネートのアリコートを新たな試験管に移し、等容量のアセトニトリル（ｖ／ｗ）を加え、該試験管を攪拌させた。ついで、サンプルをEppendorf Model 5415C遠心分離機を用い、１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離に付した。上澄を新たな試験管に移した。残渣を１ｍＬのアセトニトリルに再び懸濁させ、上記したように遠心分離に付した。得られた上澄を最初の上澄と合し、放射活性について分析した。ついで、上澄をTurbo Vapにて窒素流下で濃縮し、アセトニトリルを除去した。水性残渣のアリコートをＨＰＬＣで分析し、プロファイルした。選択されたサンプルはＬＣ／ＭＳでも分析し、その放射活性ピークを特徴付けた。
サンプル分析
【０１０５】
Waters Alliance model 2690 HPLCシステム（Waters Corp.、ミルフォード、マサチューセッツ州）を用いてクロマトグラフィー分析を行った。該装置はビルトイン型自動サンプラーを備えており、２２５ｎｍでモニター観察するように設定されたModel 2487 TunableＵＶ検出装置、および２５０μＬ LQTRフローセルを含むFloOne β Model 515放射活性フロー検出装置（Perkin Elmer）とインラインに設置された。Ultima Flow Mシンチレーション流体の流速は３ｍＬ／分であり、シンチレーションカクテルは移動相に対して３：１の混合割合を提供した。代謝産物のピークの分離を、２種の移動相、ＡおよびＢの線状勾配を用い、Phenomenex Luna C18（2）カラム、２５０ｘ４.６ｍｍ、５ミクロン（Phenomenex、トランス、カリフォルニア州）で行った。移動相Ａは１０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ５.５であり、移動相Ｂはアセトニトリルであった。流速は１ｍＬ／分であった。移動相を表８に示すように流した。
【表８】
【０１０６】
自動サンプラーおよびダイオードアレイＵＶ検出装置を含む、Agilent Model 1100 HPLCシステム（Agilent Technologies、ウィルミントン、デラウェア州）をＬＣ／ＭＳ分析に用いた。ＵＶ検出装置は２００ないし４００ｎｍをモニター観察するように設定された。分離を５ミクロンPhenomenex Luna C18（2）カラム、１５０ｘ２ｍｍ（Phenomenex）で達成した。カラム温度は２５℃であった。移動相および勾配プログラムを表２に列挙する。ＬＣ／ＭＳ分析操作を選択する場合、固体シンチレーションフローセルを備えたβ-RAM Model 3 放射活性フロー検出装置（IN/US Systems Inc.、タンパ、フロリダ州）を用いる必要があった。
【０１０７】
代謝産物の特徴化に用いたマススペクトロメータはMicromass Q−TOF−2 四極子飛行時間ハイブリッドマススペクトロメータ（Micromass, Inc.、ベバリー、マサチューセッツ州）およびFinnigan LCQ Decaイオントラップマススペクトロメータ（ThermoFinnigan、サンノゼ、カリフォルニア州）であった。該マススペクトロメータはエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）インターフェースを備えており、陽イオン化モードにて操作された。該マススペクトロメータのセッティングを表９および８表１０に列挙する。
【表９】
【表１０】
【０１０８】
ＤＶＳのグルクロニド化の部位を確認するのに、イヌ肝臓ミクロソームを用いてインキュベーションを行った。これらのインキュベーションでは、ＤＶＳとベンラファキシンのグルクロニド化を比較した。簡単に言えば、ベンラファキシンまたはＤＶＳ（１００μＭ）をイヌ肝臓ミクロソーム（１ｍｇ／ｍＫ）およびＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）と一緒に０．１Ｍリン酸ナトリウム／カリウム緩衝液中でインキュベートした。サンプルを３７℃に設定した振盪水浴にて２分間プレインキュベートした。ＵＤＰＧＡ（最終濃度１ｍＭ）を添加することで反応を開始させた。付加的な一連のインキュベーションをベンラファキシンについてＵＤＰＧＡおよびＮＡＤＰＨ生成システムを用いて行った。インキュベーション容量は全体で５００μＬであり、インキュベーションの長さは合計で３０分であった。５００μＬのアセトニトリルを添加して反応を停止させ、上記のように処理した。サンプルをＬＣ／ＭＳにより分析した。
【０１０９】
放射活性ピークを積分するのに、FloOne分析ソフトウェア（version 3.65、Packard BioScience）を利用した。コンピュータプログラムMicrosoft Excel（登録商標）97を用いて平均値および標準偏差を計算した。MassLynxソフトウェア（version 3.5）を用いてＬＣ／ＭＳデータを分析した。
結果
【０１１０】
放射分析検出装置を備えたＨＰＬＣによって測定した［１４Ｃ］ＤＶＳ（バルク化合物）の放射化学純度および比活性は、各々、９９．３％および２０９μＣｉ／ｍｇ（遊離塩基）であった。投薬溶液中の［１４Ｃ］Ｏ−デスメチルベンラファキシンの濃度、放射純度および比活性は、各々、１０.３ｍｇ／ｍＬ、９８.３％および１.０３７μＣｉ／ｍｇであった。投薬溶液の投与前、中および後のアリコートは同様の濃度および純度を有した（データは示さず）。［１４Ｃ］ＤＶＳの平均投与用量は３１.０±０.１８ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基）であった。
【０１１１】
［１４Ｃ］ＤＶＳは対照イヌの尿および対照イヌの血漿中、３７℃で２４時間まで安定であった。２４時間まで、および２４時間を含め、いずれの時点でも有意な分解生成物はラジオクロマトグラフィーで検出されなかった。
【０１１２】
酸化効率を１４C−Spec-Chec（Perkin Elmer）、既知の放射活性の標体を酸化することで決定し、９９．１％であると決定された。各時点での血液および血漿中の放射活性の濃度、ならびに血液の血漿への分配を表１１に示す。雄イヌの放射活性全体の平均血漿中濃度は、投薬後１、４、８および２４時間後で、各々、１３.３、１６.９、７.４３および０.８１μｇ当量／ｍＬであった。各時点で、血液の血漿に対する放射活性の割合は、０.５１と０.６４の間の範囲にあった。
【表１１】
血漿の代謝産物プロファイル
【０１１３】
血漿からの放射活性の平均抽出効率は８７.６±１０.１％であった（データは示さず）。投薬１時間後に採集したイヌ血漿の代表的なラジオクロマトグラムを図１４（Ａ）に示す。ＤＶグルクロニド（Ｍ７）が検出される顕著なピークであった。投薬後１時間および４時間では、血漿中に検出される放射活性の７７．５および９６．４％がＭ７ピークと関連付けられた。８時間および２４時間のサンプルはラジオクロマトグラフィーにより分析されるのに十分な放射活性を有しなかった。血漿中で検出される唯一別の放射活性成分が未変換ＤＶＳであった。
【０１１４】
イヌの血漿中の９種の付加的な従たる代謝産物をＬＣ／ＭＳで特徴付けた（表１２）。これらの代謝産物はシクロヘキサノール環上でヒドロキシル化されている６種の代謝産物（Ｍ１−Ｍ６、ヒドロキシＤＶ化合物）、Ｎ，Ｏ−ジデスメチルベンラファキシン（Ｍ１０）、Ｎ，Ｏ−ジデスメチルベンラファキシンＯ−グルクロニド（Ｍ１３）、およびＮ−オキシドＤＶを包含する。
【表１２】
尿の代謝産物プロファイル
【０１１５】
尿が主たる排泄経路であり、平均７５％の放射活性用量が投薬後２４時間以内の尿サンプルにて回収された。尿中で検出された放射活性濃度を、ラジオクロマトグラフィー分析に付した後の放射活性の％分布として、表１３に示す。投薬後８−２４時間に集めたイヌの尿の代表的なラジオクロマトグラムを図１４（Ｂ）に示す。分析したすべての尿のサンプルにて検出された優勢的な放射活性ピークはＯ−デスメチルベンラファキシンＯ−グルクロニド（Ｍ７、ＤＶグルクロニド）であり、尿中で検出された放射活性ピークの約８５％を占めた。Ｎ,Ｏ−ジデスメチルベンラファキシンＯ−グルクロニド（Ｍ１３）は尿中で検出された薬物関連のピークの約４％を占めた。未変換［１４Ｃ］ＤＶＳは尿中で検出された放射活性の４ないし８％を占めた。代謝産物Ｍ１１およびＭ１２（シクロヘキサン環上でヒドロキシル化されている代謝産物のグルクロニドコンジュゲート、「ヒドロキシＤＶグルクロニド」）は、各々、尿中で検出される放射活性の平均２および４％を占めた。Ｍ１１ピークは、各々がＬＣ／ＭＳによりシクロヘキサン環上でヒドロキシル化されている代謝産物のグルクロニドコンジュゲートであると同定されている、一緒に溶出する代謝産物を含有した。
【表１３】
【０１１６】
１０種のさらに従たる代謝産物を尿のＬＣ／ＭＳ分析で特徴付けた。これらの従たる代謝産物はＭ１−Ｍ６、ベンジル基上でヒドロキシル化されている代謝産物（Ｍ９）、Ｎ，Ｏ−ジデスメチルベンラファキシン（Ｍ１０）、Ｎ，Ｎ，Ｏ−トリデスメチルベンラファキシン（Ｍ１４）、およびＮ−オキシドＤＶ（表１２）を包含する。
糞便の代謝産物プロファイル
【０１１７】
ラジオクロマトグラフィー分析に付す前の０−２４時間糞便サンプルからの放射活性の抽出効率は７６.８±６.２％であった（データは示さず）。糞便中の回収％およびラジオクロマトグラフィーに付した後の放射活性の分布を表１４に示す。少しの割合の放射活性用量（約３％）だけが投薬の２４時間以内に糞便中に排泄された。投薬後０−２４時間で集めたイヌの糞便の抽出物の代表的なラジオクロマトグラムを図１４（Ｃ）に示す。４つの放射活性ピークが検出され、未変換ＤＶＳが各クロマトグラムにて検出された優勢的なピークであり、糞便中の放射活性の平均７６％を占めた。次に豊富な放射活性ピークがＭ１０であり、糞便に排泄された放射活性の約１２％を占めた。Ｎ−オキシドＤＶおよびＮ，Ｎ，Ｏ−トリデスメチルベンラファキシン（Ｍ１４）もまた、糞便抽出物のラジオクロマトグラム中に存在し、各々、約７および５％を占めた。
【表１４】
【０１１８】
ラジオクロマトグラムでは検出されなかった８種の付加的な従たる代謝産物が、糞便抽出物をＬＣ／ＭＳ分析に付すことで特徴付けられた。これらの代謝産物は、Ｍ１−Ｍ６、Ｍ７およびＭ９を包含した（表１２）。
液体クロマトグラフィー／質量分析による代謝産物の特徴化
【０１１９】
イヌ血漿、尿および糞便中のＤＶＳおよびその代謝産物に対するマススペクトルをＬＣ／ＭＳおよびＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析により得た。イヌのＤＶＳ代謝産物の構造的特徴化を表１２に要約する。ＬＣ／ＭＳデータはＤＶＳのグルクロニド（Ｍ７）、Ｎ−デスメチルＤＶＳ（Ｍ１０）およびモノ酸化生成物への代謝反応を示した。ＤＶＳおよび１４種の代謝産物のマススペクトルの特徴化を後記する。
ＤＶＳ
【０１２０】
ＤＶＳ標体のマススペクトルの特徴を代謝産物との比較のために分析した。ＤＶＳのＬＣ／ＭＳスペクトルにおいて、プロトン化分子イオン、［Ｍ＋Ｈ］＋はｍ／ｚ２６４で観察された。図７は、衝突誘起解離（ＣＩＤ）より得られたＤＶＳのｍ／ｚ２６４のマススペクトルの生成物、および分解スキームの提案を示す。分子イオンからＨ２Ｏが喪失すると、ｍ／ｚ２４６の生成物イオンが得られる。さらにジメチルアミノ基が喪失すると、ｍ／ｚ２０１の生成物イオンが得られる。シクロヘキサノール基がＤＶＳから喪失することでｍ／ｚ１６４の生成物イオンが示された。ｍ／ｚ５８の生成物イオンは（ＣＨ３）２ＮＣＨ２＋によるものであった。加えて、ｍ／ｚ１０７、１３３、１４５、１５９および１７３の生成物イオンは、各々、ＤＶＳ分子のメチル、プロピル、ブチル、ペンチルおよびヘキシル−フェノール部分に相当する。したがって、これらのイオンを用いてジメチルアミノ、ヒドロキシベンジルおよびシクロヘキサノール基に局在化される代謝作用の部位を検出することができた。
【０１２１】
代謝産物Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５およびＭ６（ヒドロキシＤＶ化合物）はｍ／ｚ２８０の［Ｍ＋Ｈ］＋を生成し、それはＤＶＳよりも１６Ｄａ大きく、ヒドロキシル化またはＮ−酸化を示唆した。図１５はＭ６についてｍ／ｚ２８０スペクトルの生成物を示す。代謝産物Ｍ１ないしＭ６についてのマススペクトルデータは類似していた。分子イオンからのＨ２Ｏの喪失でｍ／ｚ２６２の生成物イオンが得られた。代謝産物についてｍ／ｚ５８、１０７および２１７の生成物イオンと、ＤＶＳについてｍ／ｚ５８、１０７および２０１とを対比して、シクロヘキサン環が代謝作用の部位であることが分かる。したがって、代謝産物Ｍ１ないしＭ６は、シクロヘキサン環を酸化部位として有するヒドロキシＤＶ代謝産物であると提案された。
【０１２２】
代謝産物Ｍ７（Ｏ−デスメチルベンラファキシンＯ−グルクロニド、ＤＶグルクロニド）
この代謝産物の［Ｍ＋Ｈ］＋はｍ／ｚ４４０で観察され、それは分子量が４３９であることを示した。図１６はＭ７についてｍ／ｚ４４０スペクトルの生成物を示す。該分子イオンから１７６Ｄａを喪失すると、ｍ／ｚ２６４の生成物イオンが得られ、それはこの代謝産物がＤＶＳのグルクロニドであることを示した。マススペクトルデータはコンジュゲーションの部位を示さなかった。イヌ肝臓ミクロソームとＤＶＳまたはベンラファキシンと共に行われるインキュベーションを利用してグルクロニド化の部位を測定した。ＵＤＰＧＡのみ存在する場合、ベンラファキシンではなく、ＤＶＳのグルクロニド化が観察された。ベンラファキシンのグルクロニド化はＵＤＰＧＡとＮＡＤＰＨの両方の存在において観察されるに過ぎない。ベンラファキシンより形成されるグルクロニドは、Ｍ７と同じ［Ｍ＋Ｈ］＋および保持時間を有し、それはＯ−デスメチル化が起こり、つづいてフェノール性ヒドロキシル基のグルクロニド化が生じた結果であった。ＤＶＳとベンラファキシンの間の構造的な違いは、ＤＶＳのフェノール性ヒドロキシル基がベンラファキシン上でメチル化されているということである。これにより、ＤＶＳ関連の化合物のグルクロニド化にはフェノール基が必要とされることが明らかになった。したがって、Ｍ７はコンジュゲーション部位としてフェノール基を有するＤＶのＯ−グルクロニドであることが提案された。
代謝産物Ｍ９
【０１２３】
代謝産物Ｍ９はｍ／ｚ２８０の［Ｍ＋Ｈ］＋を生成し、それはＤＶＳよりも１６Ｄａ大きく、ヒドロキシル化またはＮ−酸化を示唆した。図１７はＭ９についてｍ／ｚスペクトルの生成物を示す。ｍ／ｚ１２３、１４９および１６１の生成物イオンは、各々、ｍ／ｚ１０７、１３３および１４５の対応するＤＶＳ生成物イオンよりも分子量が１６Ｄａ大きく、それはベンジル基のヒドロキシル化を意味する。したがって、Ｍ９は酸化部位としてベンジル基を有するヒドロキシＤＶであった。
代謝産物Ｍ１０
【０１２４】
Ｍ１０についての［Ｍ＋Ｈ］＋がｍ／ｚ２５０で観察された。図１８はＭ１０についてｍ／ｚ２５０スペクトルの生成物を示す。Ｈ２Ｏのｍ／ｚ２５０の分子イオンからの喪失はｍ／ｚ２３２の特徴的な生成物を生成させた。その後でメチルアミンがｍ／ｚ２３２から喪失すると、ｍ／ｚ２０１の生成物が得られた。このこと、およびｍ／ｚ５８の生成物イオンの欠如は、ＤＶのジメチルアミノ基がＮ−デメチル化によりメチルアミノ基に変換されたことを示した。加えて、Ｍ１０のｍ／ｚ２５０マススペクトルの生成物は、合成Ｎ,Ｏ−ジデスメチルベンラファキシンのｍ／ｚ２５０マススペクトルの生成物と適合した。したがって、Ｍ１０はＮ,Ｏ−ジデスメチルベンラファキシンであると同定された。
代謝産物Ｍ１１ａ、Ｍ１１ｂ、Ｍ１１ｃおよびＭ１２（ヒドロキシＤＶグルクロニド）
【０１２５】
Ｍ１１ａ、Ｍ１１ｂ、Ｍ１１ｃおよびＭ１２についての［Ｍ＋Ｈ］＋をｍ／ｚ４５６で観察し、それは分子量が４５５であることを示した。図１９はＭ１２のｍ／ｚ４５６スペクトルの生成物を示す。Ｍ１１ａ、Ｍ１１ｂ、Ｍ１１ｃおよびＭ１２のマススペクトルデータは類似していた。該分子イオンから１７６Ｄａの分子量が喪失すると、ｍ／ｚが２８０のイオンが得られ、それはヒドロキシＤＶ代謝産物の［Ｍ＋Ｈ］＋であった。マススペクトルデータはコンジュゲーション部位を示さなかった。代謝産物Ｍ７にて検討されたＤＶＳとベンラファキシンとのインビトロにおけるグルクロニド化実験の結果に基づき、フェノール基がコンジュゲーション部位として提案された。代謝産物についてｍ／ｚ５８、１０７および２１７の生成物イオンと、ＤＶＳについてｍ／ｚ５８、１０７および２０１とを対比すると、シクロヘキサン環がヒドロキシル化されていることが分かる。したがって、Ｍ１１ａ、Ｍ１１ｂ、Ｍ１１ｃおよびＭ１２はヒドロキシＤＶＳ代謝産物のＯ−グルクロニドであると提案された。
【０１２６】
代謝産物Ｍ１３（Ｎ,Ｏ−ジデスメチルベンラファキシンＯ−グルクロニド）
この代謝産物の［Ｍ＋Ｈ］＋をｍ／ｚ４２６で観察し、それは分子量が４２５であることを示した。図２０はＭ１３の生成物イオンスペクトルを示す。ｍ／ｚ４２６から１７６Ｄａの喪失により、ｍ／ｚ２５０のイオンが得られる。シクロヘキサノール基からＨ２Ｏが喪失すると、ｍ／ｚ４０８のベースピークが生じる。ｍ／ｚ４０８のイオンから１７６Ｄａの喪失はｍ／ｚ２３２のＭ１０の特徴的な生成物をもたらした。その後、ｍ／ｚ２３２からメチルアミンが喪失し、ｍ／ｚ２０１の生成物イオンが得られた。従って、Ｍ１３はグルクロニド化の部位としてのフェノール基を有するＮ,Ｏ−ジデスメチルベンラファキシンＯ−グルクロニドであると提案された。
【０１２７】
代謝産物Ｍ１４はｍ／ｚ２３６の［Ｍ＋Ｈ］＋を生成した。図２１はＭ１４についてｍ／ｚ２３６スペクトルの生成物を示す。該分子イオンからＨ２ＯおよびＮＨ３が喪失すると、ｍ／ｚ２０１の生成物を生成した。このこと、およびｍ／ｚ５８の生成物イオンの欠如はＮ−ジデメチル化を示す。ｍ／ｚ１０７、１３３、１４５、１５９および１７３の生成物イオンもまた、ＤＶＳで観察された。Ｍ１４のｍ／ｚ２３６マススペクトルの生成物は、図２２に示される合成Ｎ，Ｎ，Ｏ−トリデスメチルベンラファキシンのマススペクトルと一致した。したがって、Ｍ１４はＮ，Ｎ，Ｏ−トリデスメチルベンラファキシンであると同定された。
Ｎ−オキシドＤＶ
【０１２８】
このＤＶＳ関連の成分についての［Ｍ＋Ｈ］＋をｍ／ｚ２８０で観察し、それはヒドロキシル化またはＮ−酸化を示した。図２３はこの関連する化合物のｍ／ｚ２８０マススペクトルの生成物を示す。［Ｍ＋Ｈ］＋イオンから６１Ｄａの喪失はｍ／ｚ２１９の生成物イオンをもたらした。このことはＮ−オキシドと一致するジメチルヒドロキシアミンの喪失に相当した。したがって、この代謝産物はＮ−オキシドＤＶであると同定された。
実施例３．２−ヒドロキシ−ＤＶ化合物の合成
【０１２９】
本発明の２−ヒドロキシ−ＤＶ化合物を以下の方法を用いて製造してもよい。ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の４−（ジメチルカルバモイルメチル）フェノールをＫ２ＣＯ３で、つづいて臭化ベンジルで処理した。該混合物を室温で攪拌し、つづいて６０℃で１時間攪拌した。該混合物を濃縮し、ＤＭＦを除去し、ＥｔＯＡｃで希釈し、水で洗浄した。ＭｇＳＯ４を加えて乾燥させ、該混合物を濾過し、低容量に濃縮する。ヘキサンを加えてケタール中間生成物を沈殿させる。固体を濾過により集め、乾燥させる。
【０１３０】
２−ベンジルオキシ−シクロヘキサノンのＴＨＴ／ＭｅＯＨ（１００ｍＬ／５０ｍＬ）中溶液を酸（例えば、ＨＣｌ）で処理し、ついで室温で攪拌させる。該反応物を飽和Ｋ２ＣＯ３でクエンチし、ＥｔＯＡｃで抽出し、油にまで濃縮する。生成物を熱ＥｔＯＡｃ／ヘキサンから結晶化させ、図２に示されるようにケトン中間体を得る。
【０１３１】
ケトンのＴＨＦ中溶液を水素化アルミニウムリチウム（ＬＡＨ）ペレットのＴＨＦ中懸濁液に−７８℃で添加した。該混合物を室温にまで加温し、少なくとも３時間攪拌する。該反応物をＭｅＯＨで、つづいて１０％ＮａＯＨでクエンチし、少なくとも３時間攪拌する。固体を濾過で除去し、洗浄（例えば、ＴＨＦで洗浄）し、濃縮して固体を得る。得られた固体をＥｔＯＡｃ／ヘキサンで再結晶し、対応するベンジルエーテルを得る。
【０１３２】
Ｐｄ／Ｃと一緒に１００ｍＬのエタノール中で攪拌し、加圧下で一夜水素化することで両方のベンジル保護基を除去してもよい。該固体を濾過で、つづいてエタノールで洗浄することで精製する。固体に濃縮し、ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで結晶化させて最終生成物を得る。
実施例４ ２−ヒドロキシＤＶグルクロニド化合物の合成
【０１３３】
２−ヒドロキシＤＶグルクロニド化合物は以下のように合成してもよい。２−ヒドロキシＤＶ（１．０ｇ、３．６ミリモル）および２．０５ｇ（４．３ミリモル）のトリクロロイミデートの塩化メチレン（１５ｍＬ）中溶液に、ＢＦ３ＯＥｔ２（０．５４ｍＬ、４．４ミリモル）を５分間にわたって滴下する。反応物を窒素雰囲気下で一夜攪拌する。ついで、該反応混合物をＮａＨＣＯ３（飽和）に注ぎ、塩化メチレンで抽出する。有機層を分離し、乾燥させて真空下で濃縮する。該粗残渣をショートシリカカラムに通し、塩化メチレン−メタノールで溶出する。濾液を濃縮し、保護２−ヒドロキシＤＶＯ−グルクロニドを得る（図３を参照）。
【０１３４】
保護２−ヒドロキシＤＶグルクロニド（トリアセチルメチルエステル）（１．０ｇ、１．７ミリモル）をジオキサン−ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ（２：１：１）８ｍＬの混合液に溶かし、ＬｉＯＨ（０．４ｇ、１７ミリモル）を加え、得られた溶液を６０℃で１時間加熱する。ついで、該反応混合物を冷却し、酢酸で希釈する。該混合物を真空下で濃縮し、残渣を塩化メチレン−メタノールと共にシリカ上に注ぎ、２−ヒドロキシＤＶグルクロニドを得ることができる。
実施例５ Ｎ−オキシドＤＶの合成
【０１３５】
Ｎ−オキシドＤＶを以下のような化学合成法を用いて調製した。図４に示されるＮ−オキシドＤＶ Ｉを調製するのに：ＯＤＶ（１．０ｇ、３．８ミリモル）をクロロホルム（４５ｍＬ）に溶かし、０℃に冷却した。ついで、ＭＣＰＢＡ（０．７８６ｇ、４．５６ミリモル）／クロロホルム（１５ｍＬ）を該反応混合物に滴下した。該反応物を窒素雰囲気下で一夜攪拌させた。温度をこの間に室温にまで加温させた。ついで、該反応混合物をクロロホルムでプレパックされている塩基性アルミナカラム（４０ｇ）上に注いだ。反応混合物をアルミナカラム上に吸着させ、ついでクロロホルム（１５０ｍＬ）を該カラムに（加圧なしで）通した。次に、メタノール：クロロホルムの混合液（１：３）を該カラムに通し、所望の生成物を溶出させた。生成物を含有するフラクションを濃縮し、得られた固体をクロロホルムに溶かし、セライトパッドを通過させた。濾液を濃縮し、所望のＮ−オキシド（１．２６ｇ、＞１００％）を白色固体として得た。融点１７１−１７３℃。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：０.６８−１.６４（ｍ,１０Ｈ）、２.９５（ｓ,３Ｈ）、３.１４（ｓ,３Ｈ）、３.１９（ｄ,Ｊ＝５.７Ｈｚ,１Ｈ）、３.５４（ｄ,Ｊ＝１２.７Ｈｚ,１Ｈ）、 ３.８９（ｄｄ,Ｊ＝７.５Ｈｚおよび７.３Ｈｚ,１Ｈ）、６.６７（ｄ,Ｊ＝８.４Ｈｚ,２Ｈ）、６.９８（ｄ,Ｊ＝８.４Ｈｚ,２Ｈ）、９.５１（ｓ,１Ｈ）；（Ｍ＋Ｈ）＋ ２８０；（Ｍ−Ｈ）− ２７８；元素分析 Ｃ１６Ｈ２５ＮＯ３として：Ｃ, ６８.７９；Ｈ, ９.０２；Ｎ, ５.０１；測定値：Ｃ, ５７.６４；Ｈ, ７.３６；Ｎ, ３.７３；分析ＨＰＬＣ（５−９５％アセトニトリル／水）；２１０ｎＭで９８.４％；２３０ｎＭで９９.３％
【０１３６】
図４に示されるＮ−オキシドＤＶ ＩＩ［（Ｓ）− ４−［２−ジメチルアミノ−１−（１−ヒドロキシ−シクロヘキシル）−エチル］−フェノールのＮ−オキシド］を化合物Ｉとして調製した。該化合物は白色固体である（１.０３ｇ、９７.３％）。融点１７５−１７６℃。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：０.６８−１.６４（ｍ,１０Ｈ）、２.９５（ｓ,３Ｈ）、３.１４（ｓ,３Ｈ）、３.１９（ｄ,Ｊ＝５.７Ｈｚ,１Ｈ）、３.５４（ｄ,Ｊ＝１２.７Ｈｚ,１Ｈ）、３.８９（ｄｄ,Ｊ＝７.５Ｈｚおよび７.３Ｈｚ,１Ｈ）、６.６７（ｄ,Ｊ＝８.４Ｈｚ, ２Ｈ）、６.９８（ｄ,Ｊ＝８.４Ｈｚ,２Ｈ）、９.５１（ｓ,１Ｈ）；（Ｍ＋Ｈ）＋ ２８０；（Ｍ−Ｈ）− ２７８；元素分析 Ｃ１６Ｈ２５ＮＯ３として：Ｃ, ６８.７９；Ｈ, ９.０２；Ｎ, ５.０１；測定値 Ｃ, ６０.６２；Ｈ, ７.８４；Ｎ, ４.０２；分析ＨＰＬＣ（５−９５％アセトニトリル／水）；２１０ｎＭで９８.０％、２３０ｎＭで９９.０％；旋光度；−１５.４９（クロロホルム不純物について修正）。
【０１３７】
（Ｒ）− ４−［２−ジメチルアミノ−１−（１−ヒドロキシ−シクロヘキシル）−エチル］−フェノールのＮ−オキシド（ＩＩＩ）を化合物ＩおよびＩＩのように調製した（図４を参照）。このＮ−オキシドＤＶは白色粉末である（０.８８ｇ、８２.９％）。融点１８１−１８２℃；１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：０.６８−１.６４（ｍ,１０Ｈ）、２.９５（ｓ,３Ｈ）、３.１４（ｓ,３Ｈ）、３.１９（ｄ,Ｊ＝５.７Ｈｚ,１Ｈ）、３.５４（ｄ,Ｊ＝１２.７Ｈｚ,１Ｈ）、３.８９（ｄｄ,Ｊ＝７.５Ｈｚおよび７.３Ｈｚ,１Ｈ）、６.６７（ｄ,Ｊ＝８.４Ｈｚ,２Ｈ）、６.９８（ｄ,Ｊ＝８.４Ｈｚ,２Ｈ）、９.５１（ｓ,１Ｈ）；（Ｍ＋Ｈ）＋ ２８０；（Ｍ−Ｈ）− ２７８；元素分析 Ｃ１６Ｈ２５ＮＯ３として：Ｃ, ６８.７９；Ｈ, ９.０２；Ｎ, ５.０１；測定値：Ｃ, ６７.１０；Ｈ, ８.９２；Ｎ, ４.７７；旋光度；＋１９.０７（クロロホルム不純物について修正）
実施例６ 活性を測定するための受容体結合実験
【０１３８】
本発明の化合物を受容体アッセイ結合実験を用いて生物学的活性について試験した。これらの実験は以下の刊行物に記載されており、メリーランド州、ハノーバー、Novascreenからも入手可能である。使用可能な受容体結合アッセイは、限定されるものではないが、アドレナリン作動性α−２Ａ（ヒト）結合アッセイ（D.B. Bylundら、J Pharmacol & Exp Ther, 245（2）：600-607（1988）；JA Totaroら、Life Sciences, 44：459-467（1989））；ドーパミン輸送体結合アッセイ（Madrasら、Mol. Pharmacol., 36：518-524；JJ Javitchら、Mol Pharmacol, 26：35-44（1984））；ヒスタミンＨ１結合アッセイ（Changら、J Neurochem, 32：1658-1663（1979）；JI Martinez−Mirら、Brain Res, 526：322-327（1990）；EEJ Haaksmaら、Pharmacol Ther, 47：73-104（1990））；イミダゾリン結合アッセイ（CM Brownら、Brit. J Pharmacol, 99（4）：803-809（1990）；ムスカリン性Ｍ５（ヒト組換え体）結合アッセイ（NJ Buckleyら、Mol Pharmacol, 35：469-476（1989）；ノルエピネフリン輸送体（ヒト組換え体）結合アッセイ（R. Raismanら、Eur J Pharmacol, 78：345-351（1982）；S.Z. Raismanら、Eur J Pharmacol, 72：423（1981））；セロトニン輸送体（ヒト）結合アッセイ（RJ・D’Amatoら、J Pharmacol & Exp Ther, 242：364-371（1987）；NL Brownら、Eur J Pharmacol, 123：161-165（1986））を包含する。細胞機能アッセイは、ノルエピネフリン輸送体（ＮＥＴ−Ｔ）ヒト（A. Galliら、J Exp Biol, 198：2197-2212（1995）；およびセロトニン輸送体（ヒト）アッセイ（D’Amatoら、前掲およびNL Brownら、Eur J Pharmacol, 123：161-165（1986））を包含する。結果は受容体の阻害％として測定され得る。
実施例７ 微小透析実験における本発明の化合物のインビボ効能
【０１３９】
本発明の化合物は、例えば、雄のスプレーグドーリラットでの微小透析実験にて評価されてもよい。MT Taberら、「Differential effects of coadministration of fluoxetine and WAY-100635 on serotonergic neurotransmission in vivo：sensitivity to sequence of injections,” Synapse, 38(1)：17-26（Oct. 2000）を参照のこと。この技法は自由行動囓歯動物の脳における化合物の神経化学の作用を捕獲しうる。該作用はラットの背外側前頭皮質、うつ病と因果関係がある、および／またはうつ病の治療に関与していると考えられる脳の領域にて実験されてもよい。セロトニンに対するどのような作用が観察され得るかを知るために、本発明の化合物（３０ｍｇ／ｋｇの用量、皮下）を選択的５−ＨＴ１Ａアンタゴニスト、Ｎ−［２−［４−（２−メトキシフェニル）−１−ピペラジニル］エチル］−Ｎ−（２−ピリジニル）シクロヘキサンカルボキシアミドと組み合わせて試験してもよい。このことを行う根拠は、５−ＨＴ放出を制御するソマトデンドリティック（somatodendritic）５−ＨＴ１Ａ自己受容体を遮断することにある。この操作により、５−ＨＴ１Ａ受容体を脱感作するために、化合物単独での長期（１４日）神経化学実験を行う必要性が排除される。適当な実験の条件を以下に列挙する：
動物：雄のスプレーグドーリラット（２８０−３５ｇ）
脳領域：背外側（ＤＬ）前頭皮質（Ａ／Ｐ＋３．２ｍｍ、Ｍ／Ｌ±３．５ｍｍ、Ｄ／Ｖ−１．５ｍｍ）
投与：手術回復の２４時間後
プローブ挿入から平衡で３時間経過後
１時間４０分のベースライン
１−［２−ジメチルアミノ−１−（４−フェノール）エチル］−シス−１,４−
シクロヘキサンジオール（３０ｍｇ／ｋｇ、経口）の２０分前に５−ＨＴ１Ａ
アンタゴニスト、Ｎ−［２−［４−（２−メトキシフェニル）−１−ピペラジ
ニル］エチル］−Ｎ−（２−ピリジニル）シクロヘキサンカルボキシアミド
（０.３ｍｇ／ｋｇ、皮下）を投与する
サンプル収集：注射後３時間２分の間サンプルを収集する
分析：ＨＰＬＣ−ＥＣＤで５−ＨＴレベルを定量する
【０１４０】
これらの条件下で、インビボ神経化学作用が観察されてもよい。比較のために、ベンラファキシンおよびフルオキセチンのような他のＳＮＲＩおよびＳＳＲＩと、５−ＨＴ１Ａアンタゴニストとの組み合わせのインビボ神経化学作用を観察してもよい。
【０１４１】
明細書は、完全には、該明細書にて引用されている参考文献の教示を考慮して理解される。明細書の実施形態は発明の実施形態の例示を提供するものであり、発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。当業者は、他の実施形態が本発明により包含されることを容易に理解する。この明細書に引用されている刊行物および特許はすべて出典明示によりその全体を本明細書の一部とする。引用文献により本明細書の一部とされた事項が本明細書の記載と矛盾する、または一致しない場合、本明細書の記載がそのような事項に優先する。本明細書の参考文献の引用は、かかる参考文献が本発明の先行文献であるとすることを認めるものではない。
【０１４２】
特記しない限り、特許請求の範囲を含め、本明細書中で使用される成分量、反応条件等を表す数値はすべて、あらゆる場合で、「約」なる語により修飾されるものと認識されるべきである。したがって、逆に特記しない限り、数値パラメーターは近似値であり、本発明が得ることを目的とする所望の特性に応じて変化しうる。最低限でも、特許請求の範囲と均等である原理を適用することを制限するものではなく、各数値パラメーターは有意な桁の数字、通常の四捨五入などの方法を考慮して解釈されるべきである。
【０１４３】
特記しない限り、一連の要素の前にある「少なくとも」なる語は、その一連のすべての要素をいうと理解されるべきである。当業者であれば、単なる慣用的な実験を行うことで、本明細書に記載の発明の具体的な実施形態と均等な範囲を理解あるいは解明することができるであろう。かかる均等な範囲は添付する特許請求の範囲により包含されるものである。
実施例８ デスベンラファキシンの付加的な代謝産物
【０１４４】
本発明の付加的な実施形態として、以下のデスベンラファキシン代謝産物が挙げられる：
【化５−１】
【化５−２】
【化５−３】
【技術分野】
【０００１】
本願は、出典明示によりその全内容を本願明細書の一部とする、２００６年１０月２５日付出願の米国仮出願番号第６０／８５４０６３号について優先権を主張するものである。
本発明はＤＶ（Ｏ−デスメチルベンラファキシン）の代謝産物または誘導体により特徴付けられる単離された化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
化学名が１−［２−（ジメチルアミノ）−１−（４−メトキシフェニル）エチル］シクロヘキサノールであるベンラファキシンは、モノアミン神経伝達物質の取り込み、すなわち、臨床的な抗うつ活性に付随する作用機序での強力な阻害剤であることが解っている。その新規な構造から、ベンラファキシンは入手可能な他の抗うつ薬、例えば三環式抗うつ薬、デシプラミン、ノストリプチリン、プロトリプチリン、イミプラミン、アミトリプチリン、トリミプラミンおよびドキセピンとは関係のない作用機序を有する。
【０００３】
ベンラファキシンの作用機序は、モノアミン神経伝達物質である、セロトニンおよびノルエピネフリンの取り込みを強力に阻害することと関連付けられると、考えられる。それほどではないとしても、ベンラファキシンはまた、ドパミン取り込みを阻害するも、モノアミンオキシダーゼに対する阻害活性を有しない。ヒトにおけるベンラファキシンの主たる代謝産物であるＯ−デスメチルベンラファキシンは同じような薬理特性を示す。ベンラファキシンのノルエピネフリンおよびセロトニン（５−ＨＴ）取り込みの阻害能は、三環式抗うつ薬の阻害能に匹敵あるいは凌ぐと予測されている。Montgomery, S.A.、Venlafaxine：A New Dimension in Antidepressant Pharmacotherapy、J. Clin. Psychiatry, ５４（３）：１１９ （１９９３）。
【０００４】
伝統的な三環式抗うつ薬とは反対に、ベンラファキシンは、インビトロにてムスカリン性、ヒスタミン作動性またはアドレナリン作動性受容体に対する親和性を実質的に有しない。これら受容体との薬理活性は、三環式抗うつ薬に認められる種々の抗コリン作動性、鎮痛性および心血管性作用と関連付けられる。
【０００５】
ベンラファキシンは米国特許第４５３５１８６号（Husbandsら）に開示されており、以前に抗うつ薬として有用であると報告されている。
【０００６】
化学的に１−［２−（ジメチルアミノ）−１−（４−フェノール）エチル］シクロヘキサノールと称されるＯ−デスメチルベンラファキシン（「ＤＶ」）はベンラファキシンの主な代謝産物であり、ノルエピネフリンおよびセロトニンの取り込みを阻害することが知られている。Klamerus, K. J.ら、“Introduction of the Composite Parameter to the Pharmacokinetics of Venlafaxine and its Active O−Desmethyl Metabolite”、J. Clin. Pharmacol. ３２：７１６−７２４（１９９２）。独特な特性を有するＯ−デスメチルベンラファキシンの特に有用な新規な塩の形態、すなわちＯ−デスメチルベンラファキシンコハク酸塩（「ＤＶＳ」）が米国特許第６６７３８３８号に開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第４５３５１８６号
【特許文献２】米国特許第６６７３８３８号
【非特許文献】
【０００８】
Montgomery, S.A.、Venlafaxine：A New Dimension in Antidepressant Pharmacotherapy、J. Clin. Psychiatry, ５４（３）：１１９ （１９９３）
【非特許文献１】Klamerus, K. J.ら、“Introduction of the Composite Parameter to the Pharmacokinetics of Venlafaxine and its Active O−Desmethyl Metabolite”、J. Clin. Pharmacol. ３２：７１６−７２４（１９９２）
【非特許文献２】Howell, S.R.ら、“Metabolic Disposition of 14C−Venlafaxine in Mouse, Rat, Dog, Rhesus Monkey and Man,” Xenobiotica ２３（４）：３４９３５９（１９９３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従来は、その遊離塩基であるか、塩であるかのいずれかの形態である、ベンラファキシンより形成される代謝産物の限定された理解だけが存在した。したがって、ベンラファキシンの代謝産物について、ある程度の情報が知られていたが（Howell, S.R.ら、“Metabolic Disposition of 14C−Venlafaxine in Mouse, Rat, Dog, Rhesus Monkey and Man,” Xenobiotica ２３（４）：３４９３５９（１９９３）を参照のこと）、従来技術では代謝性生成物すべての完全な理解を欠いており、したがってその活性の完全な理解を欠くものであった。本発明者らは、この度、生成される代謝産物およびその最終用途をさらに詳細に理解したものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、ＤＶの代謝産物または誘導体として特徴付けられる新規な単離された化合物、その対応する医薬組成物および治療方法を提供する。
【００１１】
具体的には、本発明は、式：
【化１】
［式中：
ヒドロキシ基は、点線の四角で示されるように、シクロヘキシル環の２−位（オルト位）または３−位（メタ位）に結合している］
で示される、単離されたヒドロキシ−ＤＶ代謝産物または誘導体、あるいはその医薬上許容される塩を包含する。一の実施形態において、その単離されたＤＶ代謝産物は２−ヒドロキシ−ＤＶ代謝産物である。もう一つ別の実施形態において、単離されたＤＶ代謝産物は３−ヒドロキシ−ＤＶ代謝産物である。
【００１２】
本発明はまた、式：
【化２】
［式中：
ヒドロキシ基は、点線の四角で示されるように、シクロヘキシル環の２−位（オルト）、３−位（メタ）または４−位（パラ）に結合している］
で示される、単離されたヒドロキシ−ＤＶグルクロニド代謝産物または誘導体、あるいはその医薬上許容される塩を包含する。一の実施形態において、その単離されたＤＶ代謝産物は２−ヒドロキシ−ＤＶグルクロニド代謝産物である。もう一つ別の実施形態において、単離されたＤＶ代謝産物は３−ヒドロキシ−ＤＶグルクロニド代謝産物である。第三の実施形態において、単離されたＤＶ代謝産物は４−ヒドロキシ−ＤＶグルクロニド代謝産物である。
【００１３】
本発明はさらには、式：
【化３】
で示される、単離されたＮ−オキシドＤＶ代謝産物または誘導体、あるいはその医薬上許容される塩を包含する。
【００１４】
本発明はさらには、式：
【化４】
［式中、ヒドロキシ基は、ベンジルの２−位または３−位に結合している］
で示される、単離されたベンジルヒドロキシ−ＤＶ代謝産物または誘導体、あるいはその医薬上許容される塩を包含する。一の実施形態において、その単離されたＤＶ代謝産物は２−ベンジルヒドロキシ−ＤＶである。もう一つ別の実施形態において、単離されたＤＶ代謝産物は３−ベンジルヒドロキシ−ＤＶである。
【００１５】
同様に、本発明は、本発明の代謝産物または誘導体のいずれかと、医薬上許容される担体または賦形剤とを組み合わせて含む、医薬組成物を包含する。本発明は、哺乳動物における少なくとも１種の中枢神経系障害を治療する方法であって、その必要とする哺乳動物に有効量の本発明の化合物を提供することを含む方法を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＤＶＳの代謝産物として特徴付けられる新規な単離された化合物を示す。図１（Ａ）は独特なヒドロキシル−ＤＶ化合物を示す。シクロヘキサノール環上のＯＨ基は点線の四角内に示されるいずれの位置にあってもよい。図１（Ｂ）は独特なヒドロキシル−ＤＶグルクロニドを示す。シクロヘキサノール環上のＯＨ基は点線の四角内に示されるいずれの位置にあってもよい。図１（Ｃ）はＮ−オキシドＤＶ化合物を示す。図１（Ｄ）はベンジルヒドロキシ−ＤＶ化合物を示す。ベンジル環上のＯＨ基は点線の四角内に示されるいずれの位置にあってもよい。
【図２】２−ヒドロキシＤＶ化合物の合成方法を示す。
【図３】２−ヒドロキシ−ＤＶグルクロニドの合成方法を提供する。
【図４】Ｎ−オキシドＤＶ化合物の合成方法を示す。
【図５】ベンジルヒドロキシ−ＤＶの合成方法を示す。
【図６】ＤＶＳをラットに単回経口投与（２０ｍｇ／ｋｇ）した後の代表的なラジオクロマトグラムを提供する。図６（Ａ）は投与から１時間経過後の雄の血漿を示す。図６（Ｂ）は投与から０−８時間経過後に採集した雄の尿を示す。図６（Ｃ）は投与から０−８時間経過後に採集した雄の糞便を示す。
【図７】ｍ／ｚ２６４のＤＶＳについての分解スキーム案およびその生成物のイオンスペクトルを示す。
【図８】ラットにおけるｍ／ｚ２８０のＭ６についての分解スキーム案およびその生成物のイオンスペクトルを示す。明細書および図面を通して、数字の前にある文字「Ｍ」は本明細書に記載される代謝産物をいう。
【図９】ラットにおけるｍ／ｚ４４０のＭ７についての分解スキーム案およびその生成物のイオンスペクトルを示す。
【図１０】ラットにおけるｍ／ｚ２５０のＭ１０についての分解スキーム案およびその生成物のイオンスペクトルを示す。
【図１１】［ｍ＋ｈ］＋（ｍ／ｚ２５０）の合成Ｎ，Ｏ−ジデスメチルベンラファキシンについての分解スキーム案およびその生成物のイオンスペクトルを示す。
【図１２】ラットにおけるｍ／ｚ４２６のＭ１３についての分解スキーム案およびその生成物のイオンスペクトルを提供する。
【図１３】ラットにおけるｍ／ｚ２８０のＮ−オキシドＤＶについての分解スキーム案およびその生成物のイオンスペクトルを提供する。
【図１４】ＤＶＳをイヌに単回経口投与（３０ｍｇ／ｋｇ）した後の代表的なラジオクロマトグラム代謝産物プロファイル、（ａ）投与１時間後の血漿、（ｂ）投与８−２４時間後に採集した尿、および（ｃ）投与０−２４時間後に採集した糞便を示す。
【図１５】イヌにおけるｍ／ｚ２８０のＭ６についての分解スキーム案およびその生成物のイオンスペクトルを提供する。
【図１６】イヌにおけるｍ／ｚ４４０のＭ７についての分解スキーム案およびその生成物のイオンスペクトルを示す。
【図１７】イヌにおけるｍ／ｚ２８０のＭ９についての分解スキーム案およびその生成物のイオンスペクトルを示す。
【図１８】イヌにおけるｍ／ｚ２５０のＭ１０についての分解スキーム案およびその生成物のイオンスペクトルを提供する。
【図１９】イヌにおけるｍ／ｚ４５６のＭ１２についての分解スキーム案およびその生成物のイオンスペクトルを示す。
【図２０】イヌにおけるｍ／ｚ４２６のＭ１３についての分解スキーム案およびその生成物のイオンスペクトルを示す。
【図２１】ｍ／ｚ２３６のＭ１４についての分解スキーム案およびその生成物のイオンスペクトルを提供する。
【図２２】［ｍ＋ｈ］＋（ｍ／ｚ２３６）の合成Ｎ，Ｎ，Ｏ−トリデスメチルベンラファキシンについての分解スキーム案およびその生成物を示す。
【図２３】イヌにおけるｍ／ｚ２８０のＮ−オキシドＤＶについての分解スキーム案およびその生成物のイオンスペクトルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
Ｉ．本発明の化合物
Ａ．単離されているＤＶ代謝産物または誘導体
【００１８】
本発明は、有益な特性があると期待される、ＤＶの新たに同定された代謝産物および誘導体に関する。該化合物のいくつかは天然の代謝産物（体内にて、またはそのための実験モデルにて、酵素反応により、あるいは他の反応により産生されるもの）であるが、他は実質的に同様の活性を示すと考えられる関連する構造物（誘導体）である。図１はこれら化合物の構造を示す。
【００１９】
図１（Ａ）に示されるように、（２または３）−ヒドロキシ−ＤＶ化合物は、ヒドロキシル基がシクロヘキシル環の２−位または３−位の炭素の一つと結合したヒドロキシル化ＤＶ誘導体である。２−および３−位の炭素は図１（Ａ）の点線の四角内の炭素である。２−および３−位の炭素で可能性として合計８個の結合部位があるが、対称であるため、環の２−位と２−位の炭素の組で４種の異なる化合物が生じる。したがって、ヒドロキシ基は２−位の炭素の２つの位置のいずれか、あるいは３−位の炭素のいずれかの位置に結合しうる。
【００２０】
シクロヘキシル環の２−、３−または４−位のいずれかがヒドロキシル化されているＤＶ代謝産物をグルクロニド化操作に付し、図１（Ｂ）に示されるシクロヘキシルヒドロキシ−ＤＶグルクロニドを形成してもよい。このヒドロキシ基は点線の四角内のいずれの炭素に結合してもよい。
【００２１】
図１（Ｃ）はＮ−オキシドＤＶ、すなわちジメチルアミン基の窒素に酸素が付いたＤＶＳ誘導体を示す。
【００２２】
図１（Ｄ）はベンジルヒドロキシＤＶ、すなわちベンジル環の２−位または３−位のいずれかの炭素にヒドロキシ基が結合したＤＶＳ代謝産物または誘導体を示す。
【００２３】
本願は各化合物の構造、ＤＶの代謝性生成物としての化合物に対する情報、単離および／または合成、ならびに各化合物について考えられる活性を示す図面を提供する。
１．インビボにおけるラット実験より特徴付けられる化合物
【００２４】
ＤＶＳの代謝作用を、ラットにて、２０ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基の量で計算）のものを単回経口投与して調査した。ＤＶＳは広くかつ迅速にラットにて主にＯ−デスメチルベンラファキシンＯ−グルクロニド（ＤＶグルクロニド）に代謝された。ＤＶグルクロニドは分析したすべての血漿および尿のサンプルにて優勢的な薬物関連の化合物であった。
【００２５】
Ｍ１−Ｍ６の６種の異なるヒドロキシ代謝産物をＬＣ／ＭＳで検出し、あるサンプルはラジオクロマトグラフィーで検出した。これらの代謝産物において、ヒドロキシル基はシクロヘキサノール環の２−、３−および４−位に結合し、６個の異なる化合物、Ｍ１−Ｍ６を生成する。これらのヒドロキシＤＶ代謝産物のグルクロニドはラットにて観察されなかった。Ｎ−オキシドＤＶがＬＣ／ＭＳを介してラットの血漿、尿および糞便中で観察された。さらなる代謝産物も観察された。
２．インビボのイヌ実験より特徴付けられる化合物
【００２６】
ＤＶＳのビーグル犬での代謝を、３０ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基）を単回経口投与することで測定した。ＤＶＳは広くかつ迅速にイヌにて代謝された。ＤＶグルクロニドは尿および血漿サンプルをラジオクロマトグラフィーに付して検出された最も豊富な代謝産物であった。
【００２７】
化合物Ｍ１−Ｍ６をＬＣ／ＭＳを介して血漿、尿および糞便にて観察した。化合物Ｍ１１およびＭ１２を（ラジオクロマトグラフィーおよびＬＣ／ＭＳを介して）尿にて観察した。Ｎ−オキシドＤＶを（ＬＣ／ＭＳを介して）血漿にて、（ＬＣ／ＭＳを介して）尿にて、（ラジオクロマトグラフィーおよびＬＣ／ＭＳを介して）糞便にて観察した。さらなる代謝産物も観察した。
【００２８】
要約すれば、ＤＶＳはイヌにおいて迅速かつ広範に多くの代謝産物に代謝された。検出された最も豊富な代謝産物がＤＶＯ−グルクロニドであった。最新の研究で観察された代謝産物は、経口投与した後のラットの血漿、尿、および糞便にて観察されたものと類似するものであり、ビーグル犬ではより多くの代謝産物が観察されている。
Ｂ．活性
【００２９】
本発明の化合物は代謝産物またはＤＳＶの誘導体として検出され、ベンラファキシンおよびＤＶＳの活性と同様の型の活性を示すと考えられている。ヒドロキシ−ＤＶグルクロニドは、グルクロニドが活性の前にインビボにて切断される、プロドラッグとして作用すると考えられている。グルクロニドの切断は、胃腸管にて特に活性であり得るβ−グルクロニダーゼの作用を介するか、あるいは胃中の条件などの酸性条件下で起こりうる。ヒドロキシル−ＤＶおよびＮ−オキシドＤＶ化合物はその現行の形態で活性であると考えられている。本発明の化合物は、当該分野にて周知である、受容体アッセイ結合試験ならびにインビボ代謝および効能試験を用いて特異的生物活性について試験してもよい。実施例５を参照のこと。
Ｃ．合成
１．遊離塩基化合物の合成
【００３０】
本発明の化合物は、有機合成の分野にて公知の合成方法と一緒に、または当業者がこれらの方法を変形しながら、以下に記載の方法を用いて調製することができる。一般に、Comprehensive Organic Synthesis, “Selectivity, Strategy & Efficiency in Modern Organic Chemistry”, I. Fleming, Pergamon Press, New York編（1991）；Comprehensive Organic Chemistry, “The Synthesis and Reactions of Organic Compounds”, J.F. Stoddard, Pergamon Press, New York編（1979）を参照のこと。適当な方法として、限定されるものではないが、後記する方法が挙げられる。
【００３１】
図２は本発明の２−ヒドロキシＤＶ化合物を合成する一の方法を提供する。この合成の第一の工程にて、４−（ジメチルカルバモイルメチル）フェノールをベンジル基で保護する。臭化ベンジル保護基は、その最終工程の間に除去するのが容易であるから、本発明の化合物の合成方法に用いるのに最適である。しかしながら、他の保護基を用いることもできる。
【００３２】
第二の工程にて、リチウムジイソプロピルアミドを試薬として用いて、保護された２−ヒドロキシシクロヘキサノン（そのヒドロキシで保護されている）の酸性溶液を適宜添加する。適当な保護基は当該分野にて知られており、ベンジル−、トリメチルシリル−、またはｔｅｒｔ−ブチル−ジメチルシリル基が挙げられる。
【００３３】
第三の工程にて、水素化アルミニウムリチウムを用いてケトンを除去する。別法として、ホウ水素化ナトリウムを用いてケトンを除去してもよい。最終工程は保護基の除去を示す。適宜保護された３−置換シクロヘキサノンを用い、同様の方法を使用して３−ヒドロキシＤＶ化合物を合成することができる。加えて、この方法を利用し、適宜保護された４−置換シクロヘキサノンを用いて、４−ヒドロキシＤＶ化合物を調製しうる。
【００３４】
図３はヒドロキシＤＶグルクロニドを合成する一の方法を提供する。この方法では、図示されるように、適当なヒドロキシ−ＤＶ化合物をグルクロニドのトリクロロイミダートとカップリングさせる。
【００３５】
図４はＮ−オキシドＤＶ化合物を合成する一の方法を提供する。この方法では、Ｏ−デスメチルベンラファキシンを３−クロロペルオキシ安息香酸（ＭＣＰＢＡ）で酸化することでＮ−オキシドＤＶが調製される。
【００３６】
ベンジルヒドロキシＤＶ化合物は、Yardley, JPら、「2-phenyl-2-(hydroxycycloalkyl）ethylamine Derivatives：Synthesis and Antidepressant Activity」、Journal of Medicinal Chemistry、３３（１０）：２８９９−９０５（１９９０）に記載の操作に従って調製され得る。当業者は合成スキームをYardleyにて記載されている他の構造物の調製に適合させ、２−ベンジルヒドロキシＤＶ化合物および３−ヒドロキシＤＶ化合物が望ましいとする本発明の知見を考慮して、その両方の化合物を合成することもできる。例えば、（３,４−ビス−ベンジルオキシ−フェニル）−酢酸で出発し、図５に示されるように、３−置換ベンジルヒドロキシＤＶを調製し得る。もう一つ別の例として、（２,４−ビス−ベンジルオキシ−フェニル）−酢酸を用い、２−置換ベンジルヒドロキシＤＶ化合物を調製し得る。別法として、Yardleyの操作に従って、（２,４−ビス−ベンジルオキシ−フェニル）−アセトニトリルおよび（３,４−ビス−ベンジルオキシ−フェニル）−アセトニトリルを用い、対応する２−および３−置換ベンジルヒドロキシＤＶ化合物を調製することができる。
２．塩の合成
【００３７】
本発明の化合物はその遊離塩基および塩の形態の両方で有用性を有する。本発明の塩基性化合物の医薬上許容される酸付加塩は、遊離塩基を、非毒性の塩を形成する当量の酸と反応させることにより一般に形成される。具体的な酸は無機または有機のいずれかの酸であり、塩酸、臭化水素酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、硫酸、リン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、シュウ酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、エタンスルホン酸、グルコン酸、グルタミン酸、イセチオン酸、乳酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、粘液酸、硝酸、パーモ酸、パントテン酸、ｐ−トルエンスルホン酸およびその同様の酸を包含する。非経口投与の場合には水溶性の塩が用いられるが、遊離塩基または医薬上許容される塩のいずれも、本発明の化合物の経口または非経口投与に適用可能である。
３．立体化学
【００３８】
本発明の化合物はエナンチオマーとして存在し、特記しない限り、本発明はラセミ混合物ならびに本発明の化合物の立体化学的に純粋な形態（Ｒ−エナンチオマーおよびＳ−エナンチオマーの両方の形態）を包含する。
Ｄ．単離
【００３９】
また、本発明の化合物は、該化合物を含有する血漿、尿または糞便から、あるいは該化合物を含有するインビトロシステムより、当該分野にて公知の方法を用いて単離することもできる。具体的には、個々の代謝産物の分離に導く条件下で、例えば、２種の移動相ＡおよびＢの直線的勾配を利用し、ここで実施例１−２に記載されるように、移動相Ａは１０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ５．５であり、移動相Ｂはアセトニトリルであり、分離をもたらす流速で利用する、分取用ＨＰＬＣ（prep-HPLC）を用いて単離され得る。
【００４０】
かかる単離された化合物は、純粋な形態であっても、あるいは実質的に純粋な形態であってもよく、天然の環境から分離されていることを意味する。実質的に純粋な化合物としては、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％の純度を有することが挙げられる。
Ｅ．医薬剤形
【００４１】
本発明の化合物を含有する医薬組成物は、本発明の付加的な態様を提供する。活性成分は、錠剤、カプセル、ならびに種々の着色剤、フレーバ、安定化剤および風味マスキング物質を含有するエリキシルおよび懸濁液などの液体製剤を含む、通常のいずれの経口用剤形に組み合わせることもできる。経口用剤形を構成する場合、活性成分を、澱粉、炭酸カルシウム、ラクトース、シュークロースまたはリン酸二カルシウムと混合し、打錠またはカプセル化工程を助成することができる。添加剤としてのステアリン酸マグネシウムは、必要ならば、有用な滑剤機能を提供する。活性成分は医薬上許容される滅菌液体担体、例えば滅菌水、滅菌有機溶媒あるいは両者の混合液に溶解または懸濁させることができる。液体担体は非経口用注射に適する担体である。活性成分が充分に可溶性である場合、担体としての生理食塩水に溶かすことができ；仮にあまりに溶けない場合、時に、適当な有機溶媒、例えば水性プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール溶液に溶かすこともできる。一般に、１０ないし７５重量％のグリコールを含有する水性プロピレングリコールが適している。他の例として、細分割した活性成分を水性澱粉またはカルボキシメチルセルロースナトリウム溶液に、あるいは適当な油、例えばアラキス油に分散させることにより他の組成物を製造することができる。滅菌溶液または懸濁液である液体医薬組成物は、筋肉内、腹腔内または皮下注射により利用することができる。
【００４２】
本発明の化合物を、慣用的な製薬技法に従って、医薬担体または賦形剤（例えば、医薬上許容される担体または賦形剤）と組み合わせ、医薬組成物または剤形を形成することができる。適当な医薬上許容される担体または賦形剤として、限定されるものではないが、Remington’s, The Science and Practice of Pharmacy（Gennaro, A.R.編、第１９版、１９９５、Mack Pub. Co.）に記載のものが挙げられる。「医薬上許容される」なる語は、動物、例えば哺乳動物（例えば、ヒト）に投与した場合、生理学的に耐容でき、典型的には、アレルギーまたは異常高進、眩暈などの同じような予期せぬ反応を惹起しない添加物または組成物をいう。経口用液体医薬組成物の場合、医薬担体または賦形剤は、限定されるものではないが、水、グリコール、油、アルコール、矯味矯臭剤、保存剤、着色剤等を包含し得る。経口用固体医薬組成物は、限定されるものではないが、澱粉、糖類、微結晶セルロース、希釈剤、造粒剤、滑沢剤、結合剤および崩壊剤を包含してもよい。医薬組成物および剤形はまた、ベンラファキシン、Ｏ−デスメチルベンラファキシンあるいはその上記した塩を含んでもよい。
【００４３】
剤形は、限定されるものではないが、錠剤、トローチ、ロゼンジ、分散液、懸濁液、坐剤、軟膏、湿布、ペースト、散剤、クリーム、液剤、カプセル（カプセル化球体を含む）またはパッチを包含する。剤形はまた、即時放出製剤ならびに放出を制御、持続、拡張または遅延させるのに適する製剤を包含しうる。錠剤および球体は、要すれば、標準的水性または非水性技法により被覆されていてもよい。
【００４４】
医薬組成物は、例えば錠剤またはカプセルのように、単位剤形であってもよい。かかる形態において、組成物を適量の活性成分を含有する単位用量に細分割してもよく；単位剤形を包装した組成物、例えば包装散剤またはバイアルもしくはアンプルとすることができる。単位剤形は、カプセル、カシェまたは錠剤そのものとすることができ、あるいはパッケージの中に適当な数の単位剤形を入れることもできる。単位用量の組成物中の活性成分の量は、個々の要求および活性成分の活性に応じて、変更しても、あるいは調整してもよい。
ＩＩ．治療方法
Ａ．治療され得る疾患
【００４５】
本発明の方法は、その必要とする哺乳動物に、有効量の１つ、または複数の本発明の化合物を投与することを含む。
【００４６】
本発明の化合物はベンラファキシンおよびＯ−デスメチルベンラファキシンの活性と同様の型の活性を有すると考えられる。ヒドロキシ−ＤＶグルクロニドは、インビボにてグルクロニド付加物を失い、対応するヒドロキシル−ＤＶ化合物を形成する、プロドラッグとして作用し得る。グルクロニドの切断は、胃腸管にて特に活性である、β−グルクロニダーゼの作用を介するか、あるいは胃の中での条件のような酸性条件下で起こりうる。残りの化合物は、その現行の形態で活性であると考えられている。
【００４７】
Reviews in Contemporary Pharmacology、第９巻（５）、２９３−３０２頁（１９９８）に記載されるように、Ｏ−デスメチル−ベンラファキシンは、表１に示される薬理特性を有する。
【表１】
【００４８】
かくして、本発明の化合物、組成物および方法は、限定されるものではないが、うつ病（限定されるものではないが、大うつ病性障害、双極性障害および気分変調を包含する）、線維筋痛、不安、パニック障害、広場恐怖症、心的外傷後ストレス障害、月経前不快気分障害（月経前症候群としても知られている）、注意力欠如障害（過活動と共にまたは無し）、強迫性障害（抜毛癖を含む）、社会不安障害、全般性不安障害、自閉症、統合失調症、肥満、神経性無食欲症、神経性過食症、ジル・デュ・ラ・トゥレット症候群、血管運動フラッシング、コカインおよびアルコール依存症、性機能不全（早漏を含む）、境界型人格障害、慢性疲労症候群、失禁（便失禁、溢流性尿失禁、受動失禁、反射性尿失禁、腹圧性尿失禁、急迫性尿失禁、労作性尿失禁および尿失禁を含む）、疼痛（限定されるものではないが、片頭痛、慢性腰痛、幻肢痛、中心性疼痛、神経因性疼痛、例えば、糖尿病性神経障害およびヘルペス後神経障害を包含する）、シャイ・ドレーガー症候群、レイノー症候群、パーキンソン病、てんかん等を含む、少なくとも１つの中枢神経系障害を患っている、あるいは罹患しやすい患者を治療するのに用いることができる。本発明の化合物および組成物はまた、以前にうつ病であって、今は回復の状態にある患者を継続して治療することを含め、うつ病のぶり返し、再発の防止に、認知障害の治療に、認識促進の誘発に、および／または老年性認知症、アルツハイマー病、記憶障害、健忘症、健忘症候群を患っている患者における気分の高揚に、ならびに喫煙または他のタバコ使用の中断の計画に用いることもできる。加えて、本発明の化合物および組成物はうつ状態およびうつ状態でない女性の視床下部性無月経の治療に用いることもできる。
Ｂ．投与および用量
【００４９】
本発明は、ヒトを含む哺乳動物における上記した疾病を治療、予防、阻害または緩和する方法であって、有効量の本発明の化合物をその必要とする哺乳動物に投与することを含む方法を提供する。有効量は上記した病態の１または複数の徴候を予防、阻害または緩和するのに十分な量である。
【００５０】
上記した病態を治療、予防または緩和するのに有効な用量は治療すべき病態の重篤度および投与経路で変化するであろう。用量および投与頻度もまた、個々のヒト患者の年齢、体重、応答および過去の病歴に応じて変化するであろう。一般に、本明細書中に記載される病態について推奨される一日用量の範囲は、本発明の化合物を一日に１０ｍｇないし１０００ｍｇとするものである。他の適当な用量として、５０ｍｇないし８００ｍｇ／日、７５ｍｇないし６００ｍｇ／日、１００ｍｇないし５００ｍｇ／日、および１５０ｍｇないし３００ｍｇ／日、ならびに２００ｍｇ／日が挙げられる。特定の用量として、上記したすべての端点を包含する。用量は遊離塩基を単位として記載されており、特定の医薬上許容される塩を単位として記載されていない。患者を管理するにおいて、治療は低用量で開始され、必要ならば増加させる。したがって、ヒト以外の患者の用量は当業者により調節されうる。
【００５１】
本発明の化合物はまた、ベンラファキシン、Ｏ−デスメチルベンラファキシン、ＤＶＳまたは他のその医薬上許容される塩と組み合わせて提供されてもよい。本発明の化合物はまた、他の既知の精神学的に活性な化合物、例えば、他の抗うつ剤または抗不安剤、ホルモン治療剤、疼痛用医薬および他の治療剤と一緒に提供されてもよい。
【００５２】
有効量の目的の化合物を患者に提供するのにいずれの適当な投与経路も利用しうる。例えば、経口、経粘膜（例えば、経鼻、舌下、口腔、経直腸または経膣）、非経口（例えば、静脈内または筋肉内）、経皮および皮下投与を利用しうる。
【００５３】
以下の実施例は例示であり、本発明を限定することを意図とするものではない。
実施例
実施例１． 単回経口投与した後のスプレーグドーリーラットでの［１４Ｃ］ＤＶＳの代謝作用
【００５４】
６個のヒドロキシＤＶ化合物およびＮ−オキシドＤＶ化合物、ならびに他の化合物を、以下のように、雌雄のラットに単回強制経口投与した後に尿、糞便および血漿中の［１４Ｃ］ＤＶＳに対する代謝特性にて検出した。
【００５５】
放射性標識の［１４Ｃ］ＤＶＳ（バッチ番号ＣＦＱ１３００３、［シクロヘキシル−１−１４Ｃ］ＤＶＳ）をAmersham Biosciences（バッキンガムシャ、ＵＫ）より購入した。非標識ＤＶＳ（バッチＲＢ１６３６；遊離塩基６５.２％）をWyeth Research、ローゼス・ポイント、ニューヨーク州より入手した。ＤＶＳの平均分子量は３８１.５であり、Ｏ−デスメチルベンラファキシンが６９.０重量％を占める。［１４Ｃ］ＤＶＳ（バルクドラッグ）の比活性は１４４μＣｉ／ｍｇ（遊離塩基では２０９μＣｉ／ｍｇ）であり、ＨＰＬＣにより放射性検出法を用いて測定した場合、遊離塩基の放射性純度（radiopurity）は９９.３％であった。
【００５６】
経口投与用液剤の調製用水をEM Science（ギブスタウン、ニュージャージ州）より入手した。メチルセルロースおよびポリソルベート８０を、各々、Sigma Chemical Co.（セントルイス、ミズーリー州）およびMallinckrodt Baker（フィリップスバーグ、ニュージャージ州）から購入した。尿および血漿サンプル、糞便ホモジネート抽出物および投薬液剤アリコート中の放射活性を計数するのに使用する液体シンチレーションカクテルはUltima Gold（登録商標）（Perkin Elmer、ウェルズリー、マサチューセッツ州）であった。
【００５７】
Oximate８０Robotic Automatic Sampler（Perkin Elmer）を備えたModel 307 Tri Carb Sample Oxidizerを血液および糞便サンプルを燃焼するのに使用した。PermaFluor（登録商標）Ｅ＋液体シンチレーションカクテル（Perkin Elmer）、Carbosorb（登録商標）Ｅ（Perkin Elmer）二酸化炭素吸収装置およびＨＰＬＣ等級水を用いて、該オキシダイザーにてサンプルを燃焼することで発生した放射活性二酸化炭素をトラップした。糞便ホモジネートおよび血液サンプルを燃焼のためコンバスト・コーン（combusto cone）およびカバーパッド（Perkin Elmer）に移した。
【００５８】
投与の際に、雄で体重が０.３１１と０.３４５ｋｇの間にあり、雌で０.２６３と０.３１１ｋｇの間にあるスプレーグドーリーラット（雄１２匹、雌６匹）を用いた。動物は自由に食物および水を摂取した。報告を容易にするため、動物を雄ラットで００１Ｍから０１２Ｍの番号を付し、雌ラットで００１Ｆから００６Ｆの番号を付した。尿および糞便を採集するのに、最終時点で、性別に、３匹の動物を個々に代謝ケージに収容した。他の動物は、個々に、標準ケージに収容した。
【００５９】
経口投薬液剤を８６.４ｍＬの３.０ｍｇ／ｍＬ（２.０ｍｇ／ｍＬ、遊離塩基）の非標識ＤＶＳ溶液を３.６ｍＬの４.３ｍｇ／ｍＬ（３.０ｍｇ／ｍＬ、遊離塩基）の［１４Ｃ］ＤＶＳ溶液と組み合わせることで調製した。液剤を水中０.２５％ポリソルベート８０、０.５％メチルセルロースで調製した。［１４Ｃ］ＤＶＳ（バルクドラッグおよび投薬液剤）の放射性化学純度、比活性および濃度を放射性検出装置を備えたＨＰＬＣを用いて測定した。投薬液剤のアリコートを、投薬液剤の比活性および放射活性濃度を測定するために投薬前、投薬中および投薬後に採取した。
【００６０】
各動物の標的用量は、強制経口投与を介して、３０ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基；３.０ｍｇ／ｍＬ、１０ｍＬ／ｋｇ、２５０μＣｉ／ｋｇ）［１４Ｃ］Ｏ−デスメチルベンラファキシンであった。
【００６１】
全血（約５ｍＬ）を、心穿刺により、適当な時点（雄ラットで１、４、８および２４時間、雌ラットで１および８時間、各時点で性別毎にＮ＝３）でヘパリン処理した試験管に採集した。全血の３部構成のアリコート（２００μＬ）をコンバスト・コーンに入れ、秤量し、風乾させた。これらのサンプルを酸化させた。残りの血液を５０００ｘｇ、４℃で１０分間（Model Legend RT centrifuge, Sorvall）遠心分離に付した。得られた血清を新たな試験管に移し、３部構成のアリコート（１００ｍＬ）を放射活性含量について分析した。残りの血漿を代謝産物の分析まで−７０℃で貯蔵した。
【００６２】
尿および糞便を性別で３匹の動物から別々にドライアイス上で採集した。雄ラットで０−８および８−２４時間、雌ラットで０−８時間で採集した。糞便サンプルを約５倍容量（ｖ／ｗ）の水で均質化した。約０.４グラムのホモジネートのアリコートをコンバスト・コーンに入れ、秤量し、風乾させた。ついで、これらのサンプルを酸化させた。残りの尿サンプルおよび糞便ホモジネートを代謝産物の分析まで−７０℃で貯蔵した。
【００６３】
血液サンプルおよび糞便ホモジネートを、捕獲剤としてCarbosorb（登録商標）E（６ｍＬ）およびシンチラントとしてPermaFluor（登録商標） E＋（１０ｍＬ）を用い、Model 307 Tri Carb sample oxidizerにて酸化した。酸化効率を１４Ｃ Spec Chec（Perkin Elmer）、既知の放射活性の標体を酸化することで測定し、９８.７％であると決定した。各サンプルの読取値から基底読取値（対照血液または糞便サンプルの平均値）を差し引いた。尿および血漿のアリコートを１０ｍＬのUltima Gold（登録商標）シンチレーション流体を添加した直後に分析した。
【００６４】
すべての放射活性測定を、Tri Carb Model 3100 TR液体シンチレーション計数器（Perkin Elmer）と、Ultima Gold（登録商標）またはトルエン標準曲線とを一緒に用いて行った。１分当たりのカウント（ＣＰＭ）を、既知の放射活性の外部標体を用いることで１分当たりの崩壊（ＤＰＭ）に変換した。各標体のクエンチを外部放射活性標体の変換スペクトル指数（ｔＳＩＥ）により測定した。検出下限を基底値の２倍と規定した。
血漿の代謝産物サンプル
【００６５】
投薬の１、４および８時間後に採集した血漿サンプルを代謝産物プロファイルについて分析した。０.５ｍＬの血漿のアリコートを等容量のアセトニトリルと混合し、約１０分間氷上に置き、ついで３５００ｒｐｍ、４℃でSorvall Super ２１遠心分離機を用いて１０分間遠心分離に付した。上澄の流体を新たな試験管に移した。上澄を放射活性について分析した。その上澄をTurbo Vap （Zymark、ホピントン、マサチューセッツ州）中、窒素流の下で濃縮し、アセトニトリルを除去した。水性残渣のアリコートをＨＰＬＣで分析し、代謝産物をプロファイルした。選択されたサンプルはＬＣ／ＭＳでも分析し、その放射活性ピークを特徴付けた。
【００６６】
ラットの血漿中の［１４Ｃ］ＤＶＳの安定性を測定した。［１４Ｃ］ＤＶＳ（０.０１ｍｇ／ｍＬ、最終濃度）を対照となるラットの血漿に添加し、３７℃に設定した振盪水浴にてインキュベートした。アリコート（０.５ｍＬ）を０、１、４、８および２４時間で取り出した。サンプルを上記のように抽出し、ＨＰＬＣ分析により放射性純度をアッセイした。
尿の代謝産物サンプル
【００６７】
すべての尿サンプルを代謝産物プロファイルについて分析した。０.５ｍＬの尿のアリコートを３５００ｐｍ、４℃でSorvall Super ２１遠心分離機を用いて１０分間遠心分離に付した。上澄を新たな試験管に移し、放射活性含量をＨＰＬＣで分析してプロファイルした。選択されたサンプルはＬＣ／ＭＳでも分析し、その放射活性ピークを特徴付けた。
【００６８】
ラットの尿中の［１４Ｃ］ＤＶＳの安定性を測定した。［１４Ｃ］ＤＶＳ（０.１３ｍｇ／ｍＬ、最終濃度）を対照となるラットの尿に添加し、３７℃に設定した振盪水浴にてインキュベートした。アリコート（０.５ｍＬ）を０、１、４、８および２４時間で取り出した。サンプルを上記のように抽出し、ＨＰＬＣ分析により放射性純度をアッセイした。
糞便の代謝産物サンプル
【００６９】
投薬後８時間と２４時間の間に雄のラットより採集した糞便ホモジネートを代謝産物プロファイルについて分析した。約１グラムの糞便ホモジネートのアリコートを３５００ｒｐｍ、４℃でSorvall Super ２１遠心分離機を用いて１０分間遠心分離に付した。上澄を新たな試験管に移した。残渣を１ｍＬの水：アセトニトリル（１：１、ｖ：ｖ）に再び懸濁させ、上記したように遠心分離に付した。得られた上澄を最初の上澄と合し、残渣を１ｍＬのアセトニトリルに再び懸濁させた。懸濁液を上記しように遠心分離に付し、上澄を合し、放射活性について分析した。ついで、上澄をTurbo Vapにて窒素流下で濃縮し、アセトニトリルを除去した。水性残渣のアリコートをプロファイルについてＨＰＬＣで分析した。選択されたサンプルはＬＣ／ＭＳでも分析し、その放射活性ピークを特徴付けた。
サンプル分析
【００７０】
Waters Alliance model 2690 HPLCシステム（Waters Corp.、ミルフォード、マサチューセッツ州）を用いてクロマトグラフィー分析を行った。該装置はビルトイン型自動サンプラーを備えており、２２５ｎｍでモニター観察するように設定されたModel 248 TunableＵＶ検出装置、および２５０μＬ LQTRフローセルを含むFloOneβModel 525放射活性フロー検出装置（Perkin Elmer）とインラインに設置された。Ultima Flow Mシンチレーション流体の流速は１ｍＬ／分であり、シンチレーションカクテルは移動相に対して５：１の混合割合を提供した。代謝産物のピークの分離を、２種の移動相、ＡおよびＢの線状勾配を用い、Phenomenex Luna C18（2）カラム、１５０ｘ２.０ｍｍ、５ミクロン（Phenomenex、トランス、カリフォルニア州）で行った。移動相Ａは１０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ６.０であり、移動相Ｂはアセトニトリルであった。流速は０.２ｍＬ／分であった。移動相を表２に示すように流した。
【表２】
【００７１】
自動サンプラーおよびダイオードアレイＵＶ検出装置を含む、Agilent Model 1100 HPLCシステム（Agilent Technologies、ウィルミントン、デラウェア州）をＬＣ／ＭＳ分析に用いた。ＵＶ検出装置は２００ないし４００ｎｍをモニター観察するように設定された。分離を５ミクロンPhenomenex Luna C18（2）カラム、１５０ｘ２.０ｍｍ（Phenomenex）で達成した。カラム温度は２５℃であった。移動相および勾配プログラムは以下のとおりであった。
【００７２】
代謝産物の特徴化に用いたマススペクトロメータはMicromass Q−TOF−2 四極子飛行時間ハイブリッドマススペクトロメータ（Micromass, Inc., ベバリー、マサチューセッツ州）であった。該マススペクトロメータはエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）インターフェースを備えており、陽イオン化モードにて操作された。該マススペクトロメータのセッティングを表３に列挙する。
【表３】
【００７３】
放射活性ピークのデータ収集および解析には、FloOne分析ソフトウェア（version 3.65、Packard BioScience、ボストン、マサチューセッツ州）を利用した。コンピュータプログラムMicrosoft Excel（登録商標）97を用いて平均値および標準偏差を計算した。MassLynxソフトウェア（version 3.5）を用いてＬＣ／ＭＳデータを分析した。
結果
【００７４】
放射分析検出装置を備えたＨＰＬＣによって測定した［１４Ｃ］ＤＶＳ（バルク化合物）の放射化学純度および比活性は、各々、９９．３％および２０９μＣｉ／ｍｇ（遊離塩基）であった。投薬溶液中の［１４Ｃ］Ｏ−デスメチルベンラファキシンの濃度、放射純度および比活性は、各々、２.０５ｍｇ／ｍＬ、９７.８％および１１.７μＣｉ／ｍｇであった。投薬溶液の投与前、中および後のアリコートは同様の濃度および純度を有した。［１４Ｃ］ＤＶＳの平均投与用量は１９.９±０.２４ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基）であった。この用量は３０ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基）の標的用量から逸脱した。というのも、投与製剤の最初の秤量がＤＶＳがＯ−デスメチルベンラファキシン（遊離塩基）のコハク酸塩であることを考慮しなかったからである。
対照ラットの尿および血漿中の［１４Ｃ］ＤＶＳの安定性
【００７５】
［１４Ｃ］ＤＶＳは対照ラットの尿および血漿の両方で３７℃で２４時間まで安定であった。ラット血漿の［１４Ｃ］ＤＶＳの放射純度はいずれの時点でも９８．９％よりも大きく、その一方でラット尿では放射純度はいずれの時点でも９９．５％よりも大きかった。
血液の血漿への分配
【００７６】
血液および血漿中の放射活性の濃度、ならびに血液の血漿への分配を表４に示す。雄と雌のラットの間の血液または血漿にて検出される放射活性の濃度にて有意な違いはなかった。雄ラットの放射活性全体の平均血漿中濃度は、投薬後１、４、８および２４時間後で、各々、１１.０、１.４８、０.８９および０.０７μｇ当量／ｍＬであった。雌ラットの場合、放射活性全体の平均血漿中濃度は、投薬後１および８時間後で、各々、９.９０および０.９２μｇ当量／ｍＬであった。１、４および８時間の時点で、血液の血漿に対する放射活性の割合は、両方の性で０.５９と０.６７の間の範囲にあり、２４時間の時点で雄ラットでは０.９９であった。
【表４】
【００７７】
血漿からの放射活性の平均抽出効率は９８.７±１３.０％であった（データは示さず）。投薬１時間後に雄ラットより採集したラット血漿の代表的なラジオクロマトグラムを図６（Ａ）に示す。投薬後１時間および４時間では、ＤＶグルクロニド（表４にてＭ７として列挙されている）がラジオクロマトグラフィーで検出される顕著なピークであった。投薬後１時間および４時間、雄ラットで、各々、血漿中放射活性の８８.７および９３.６％がＤＶグルクロニドピークと関連付けられた。雌ラットにおいては、ＤＶグルクロニドが投薬後１時間で血漿中放射活性の８６.６％を占めた。８時間および２４時間のサンプルはラジオクロマトグラフィーにより分析されるのに十分な放射活性を有しなかった。血漿サンプルで唯一の別の主たるラジオクロマトグラフィーのピークが未変換ＤＶＳであり、それを検出すると、血漿中放射活性の２.６と１０％の間を占めた。いくつかの血漿サンプルで検出された別の従たる代謝産物がとして、シクロヘキサン環でヒドロキシル化された代謝産物が挙げられる（Ｍ１−Ｍ６、ヒドロキシＤＶ化合物）。Ｍ１−Ｍ６は、個々に、各時点で血漿中、放射活性の２％未満を占めた。
【００７８】
ラジオクロマトグラムでは存在しないさらに従たる代謝産物をラット血漿にて検出し、ＬＣ／ＭＳで特徴付けた（表５）。これらの代謝産物はＮ−オキシドＤＶ、Ｎ，Ｏ−ジデスメチルベンラファキシン（Ｍ１０）、Ｎ，Ｏ−ジデスメチルベンラファキシンＯ−グルクロニド（Ｍ１３）を包含する。
【表５】
尿の代謝産物プロファイル
【００７９】
尿が主たる排泄経路であり、５０％以上の放射活性用量が投薬後の最初の８時間以内の尿サンプルにて回収され、８５％が投薬後２４時間以内に回収された。尿中で検出された放射活性濃度を、ラジオクロマトグラフィー分析に付した後の放射活性の％分布として、表６に示す。投薬後０−８時間に集めたラット尿の代表的なラジオクロマトグラムを図６（Ｂ）に示す。分析したすべてのサンプルにて検出された優勢的な放射活性ピークはＤＶグルクロニド（Ｍ７）であり、それは各時点のすべての尿サンプル中で検出された放射活性ピークの約７５％を占めた。未変換［１４Ｃ］ＤＶＳは尿中に検出された放射活性の９ないし２０％を占めた。ラジオクロマトグラフィーにより尿中に少量の２種のヒドロキシル−ＤＶ化合物が検出された。このうちの一つがこれらの代謝産物の最も豊富なＭ２を含むものであり、尿中の放射活性の７．５％までを占める。
【表６】
【００８０】
ラジオクロマトグラムでは存在しないさらに従たる代謝産物を尿にて検出し、ＬＣ／ＭＳで特徴付けた（表５）。これらの代謝産物はＭ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｍ６、Ｎ−オキシドＤＶ、Ｎ，Ｏ−ジデスメチルベンラファキシン（Ｍ１０）、Ｎ，Ｏ−ジデスメチルベンラファキシンＯ−グルクロニド（Ｍ１３）を包含する。
糞便の代謝産物プロファイル
【００８１】
ラジオクロマトグラフィー分析に付す前の８−２４時間糞便サンプルからの放射活性の抽出効率は７４.９±１.９％であった（データは示さず）。少しの割合の放射活性用量（約１０％）だけが投薬の２４時間以内に糞便にて排泄された。０．１％未満の放射活性用量が０−８時間の糞便サンプルにて排泄された。個々のラットからの糞便中の回収％およびラジオクロマトグラフィー分析に付した放射活性の分布を図７に示す。投薬後８−２４時間で集めたラット糞便の抽出物の代表的なラジオクロマトグラムを図６（Ｃ）に示す。ラジオクロマトグラフィーにより検出された最も顕著なピークがＮ，Ｏ−ジデスメチルベンラファキシン（Ｍ１０）であり、糞便中の放射活性の３４％を占めた。糞便中の放射活性の約２１％は未変換ＤＶＳであった。Ｎ−オキシドＤＶは糞便中の放射活性の７％を占めた。ヒドロキシル化代謝産物Ｍ１−Ｍ６を合わせると、糞便中の放射活性の約３８．６％を占め、個々の代謝産物は糞便中の放射活性の１．７ないし１２．２％の範囲にあった。少量のＯ−デスメチルベンラファキシンＯ−グルクロニド（Ｍ７）がＬＣ／ＭＳによってのみ糞便中で観察された。
【表７】
【００８２】
ラット血漿、尿および糞便中のＤＶＳおよびその代謝産物に対するマススペクトルをＬＣ／ＭＳおよびＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析により得た。ラットのＤＶＳ代謝産物の構造的特徴化を表５に要約する。ＬＣ／ＭＳデータはＤＶＳのグルクロニド（Ｍ７）、Ｎ，Ｏ−ジデスメチルベンラファキシン（Ｍ１０）およびヒドロキシル化生成物（Ｍ１−Ｍ６）への代謝反応を示した。これら代謝産物、ＤＶＳ、Ｎ−オキシドＤＶおよび従たる代謝産物（Ｍ１３）のマススペクトルの特徴化を後記する。
ＤＶＳ
【００８３】
ＤＶＳ標体のマススペクトルの特徴を代謝産物との比較のために分析した。ＤＶＳのＬＣ／ＭＳスペクトルにおいて、プロトン化分子イオン、［Ｍ＋Ｈ］＋はｍ／ｚ２６４で観察された。図７は、衝突誘起解離（ＣＩＤ）より得られたＤＶＳのｍ／ｚ２６４のマススペクトルの生成物、および分解スキームの提案を示す。分子イオンからＨ２Ｏが喪失すると、ｍ／ｚ２４６の生成物イオンが得られる。さらにジメチルアミノ基が喪失すると、ｍ／ｚ２０１の生成物イオンが得られる。シクロヘキサノール基がＤＶＳから喪失することでｍ／ｚ１６４の生成物イオンが示された。ｍ／ｚ５８の生成物イオンは（ＣＨ３）２ＮＣＨ２＋によるものであった。加えて、ｍ／ｚ１０７、１３３、１４５、１５９および１７３の生成物イオンは、各々、ＤＶＳ分子のメチル、プロピル、ブチル、ペンチルおよびヘキシル−フェノール部分に相当する。したがって、これらのイオンを用いてジメチルアミノ、ヒドロキシベンジルおよびシクロヘキサノール基に局在化される代謝作用の部位を検出することができた。
代謝産物Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５およびＭ６（ヒドロキシＤＶ化合物）
【００８４】
代謝産物Ｍ１ないしＭ６はｍ／ｚ２８０の［Ｍ＋Ｈ］＋を生成し、それはＤＶＳよりも１６Ｄａ大きく、ヒドロキシル化またはＮ−酸化を示唆した。図８はＭ６についてｍ／ｚ２８０スペクトルの生成物を示す。代謝産物Ｍ１ないしＭ６についてのマススペクトルデータは類似していた。分子イオンからのＨ２Ｏの喪失でｍ／ｚ２６２の生成物イオンが得られた。代謝産物についてｍ／ｚ５８、１０７および２１７の生成物イオンと、ＤＶＳについてｍ／ｚ５８、１０７および２０１とを対比して、シクロヘキサン環が代謝作用の部位であることが分かる。したがって、代謝産物Ｍ１ないしＭ６は、シクロヘキサン環を酸化部位として有するヒドロキシＤＶＳ代謝産物であると提案された。
代謝産物Ｍ７（Ｏ−デスメチルベンラファキシンＯ−グルクロニド、ＤＶグルクロニド）
【００８５】
この代謝産物の［Ｍ＋Ｈ］＋はｍ／ｚ４４０で観察され、それは分子量が４３９であることを示した。図９はＭ７についてｍ／ｚ４４０スペクトルの生成物を示す。該分子イオンから１７６Ｄａを喪失すると、ｍ／ｚ２８０のイオンが得られ、それはこの分子がグルクロニドであることを示した。ｍ／ｚ２４６、２０１、１５９、１４５、１３３、１０７および５８の生成物イオンもまた、ＤＶＳで観察された。マススペクトルデータはコンジュゲーションの部位を示さなかった。しかしながら、ＤＶＳは同じようにＨ２Ｏを喪失しており、ｍ／ｚ２４６で［ＭＨ−Ｈ２Ｏ］＋を生成する（図７）。これらのＨ２Ｏの喪失はシクロヘキサノール基より生じた。このことはシクロヘキサノールよりもむしろフェノールがグルクロニド化の部位であることを示すものである。加えて、フェノール基はコンジュゲーションの点からより代謝的に適当な部位であった。したがって、Ｍ７はフェノール基をコンジュゲーションの部位として有するＤＶＳのＯ−グルクロニドであると同定された。
代謝産物Ｍ１０（Ｎ，Ｏ−ジデスメチルベンラファキシン）
【００８６】
Ｍ１０についての［Ｍ＋Ｈ］＋がｍ／ｚ２５０で観察された。図１０はＭ１０についてｍ／ｚ２５０スペクトルの生成物を示す。Ｈ２Ｏがｍ／ｚ２５０の分子イオンから喪失すると、ｍ／ｚ２３２の生成物が生成された。その後でメチルアミンがｍ／ｚ２３２から喪失すると、ｍ／ｚ２０１の特徴的な生成物が得られた。このこと、およびｍ／ｚ５８の生成物イオンの欠如は、ＤＶＳのジメチルアミノ基がＮ−デメチル化によりメチルアミノ基に変換されたことを示した。Ｍ１０のｍ／ｚ２５０マススペクトルの生成物は、合成Ｎ,Ｏ−ジデスメチルベンラファキシンのｍ／ｚ２５０マススペクトルの生成物と適合した。図１１は合成Ｎ,Ｏ−ジデスメチルベンラファキシンのｍ／ｚ２５０マススペクトルの生成物を示す。したがって、Ｍ１０はＮ,Ｏ−ジデスメチルベンラファキシンであると同定された。
代謝産物Ｍ１３（Ｎ,Ｏ−ジデスメチルベンラファキシンＯ−グルクロニド）
【００８７】
この代謝産物の［Ｍ＋Ｈ］＋をｍ／ｚ４２６で観察し、それは分子量が４２５であることを示した。図１２はＭ１３の生成物イオンスペクトルを示す。ｍ／ｚ４２６から１７６Ｄａの喪失により、ｍ／ｚ２５０のイオンが得られる。シクロヘキサノール基からＨ２Ｏが喪失すると、ｍ／ｚ４０８のベースピークが生じる。ｍ／ｚ４０８のイオンから１７６Ｄａの喪失はｍ／ｚ２３２のＭ１０の特徴的な生成物をもたらした。その後、ｍ／ｚ２３２からメチルアミンが喪失し、ｍ／ｚ２０１の生成物イオンが得られた。従って、Ｍ１３はグルクロニド化の部位としてのフェノール基を有するＮ,Ｏ−ジデスメチルベンラファキシンＯ−グルクロニドであると提案された。
Ｎ−オキシドＤＶ
【００８８】
このＤＶＳ関連の成分についての［Ｍ＋Ｈ］＋をｍ／ｚ２８０で観察し、それはヒドロキシル化またはＮ−酸化を示した。図１３はこの関連する化合物のｍ／ｚ２８０マススペクトルの生成物を示す。［Ｍ＋Ｈ］＋イオンから６１Ｄａの喪失はｍ／ｚ２１９の生成物イオンをもたらした。このことはＮ−オキシドと一致するジメチルヒドロキシアミンの喪失に相当した。したがって、この代謝産物はＤＶＳのＮ−オキシドであると同定された。
実施例２ 単回経口投与したビーグル犬における［１４Ｃ］Ｏ−デスメチルベンラファキシンの代謝作用
【００８９】
（２または３）−ヒドロキシＤＶ化合物、ヒドロキシＤＶグルクロニド、Ｎ−オキシドＤＶ化合物ならびに他の化合物およびベンジルヒドロキシ化合物を、以下のように、雄のビーグル犬に単回強制経口投与した後に尿、糞便および血漿中の［１４Ｃ］ＤＶＳに対する代謝特性にて検出した。
材料および方法
【００９０】
放射性標識の［１４Ｃ］ＤＶＳ（バッチ番号ＣＦＱ１３００３、［シクロヘキシル−１−１４Ｃ］ＤＶＳ）をAmersham Biosciences（バッキンガムシャ、ＵＫ）より購入した。非標識ＤＶＳ（バッチＲＢ１６３６；遊離塩基６５.２％）をWyeth Research、ローゼス・ポイント、ニューヨーク州より入手した。ＤＶＳの平均分子量は３８１.５であり、遊離塩基でのＯ−デスメチルベンラファキシンが６９.０重量％を占める。［１４Ｃ］ＤＶＳ（バルクドラッグ）の比活性は１４４μＣｉ／ｍｇ（遊離塩基では２０９μＣｉ／ｍｇ）であり、ＨＰＬＣにより放射性検出法を用いて測定した場合、遊離塩基の放射性純度は９９.３％であった。
【００９１】
経口投与用液剤の調製用水をEM Science（ギブスタウン、ニュージャージ州）より入手した。メチルセルロースおよびポリソルベート８０を、各々、Sigma Chemical Co.（セントルイス、ミズーリー州）およびMallinckrodt Baker（フィリップスバーグ、ニュージャージ州）から購入した。尿および血漿サンプル、糞便ホモジネート抽出物および投薬液剤アリコート中の放射活性を計数するのに使用する液体シンチレーションカクテルはUltima Gold（登録商標）（Perkin Elmer、ウェルズリー、マサチューセッツ州）であった。
【００９２】
Oximate−８０Robotic Automatic Sampler（Perkin Elmer）を備えたModel 307 Tri−Carb Sample Oxidizerを血液および糞便サンプルを燃焼するのに使用した。PermaFluor（登録商標）Ｅ＋液体シンチレーションカクテル（Perkin Elmer）、Carbosorb（登録商標）Ｅ（Perkin Elmer）二酸化炭素吸収装置およびＨＰＬＣ等級水を用いて、該オキシダイザーにてサンプルを燃焼することで発生した放射活性二酸化炭素をトラップした。糞便ホモジネートおよび血液サンプルを燃焼のためのコンバスト・コーンおよびカバーパッド（Perkin Elmer）に移した。
動物
【００９３】
投与の際に、体重が１４．４と１６．２ｋｇの間にある雄のビーグル犬（ｎ＝４）（インハウスコロニーより調達）を用いた。報告を容易にするため、動物に番号５ないし８と番号付けした。投薬調製、動物の投薬およびサンプル採集は、Wyeth Research、パールリバー、ニューヨーク州でなされた。
投薬調製、投薬および分析
【００９４】
１９．０ｍｇの［１４Ｃ］ＤＶＳと４１６８．３ｍｇの非標識ＤＶＳを２７０ｍＬのビヒクル（水中０．２５％ポリソルベート８０、０．５％メチルセルロース）に懸濁させることで経口用投薬液剤を調製した。［１４Ｃ］ＤＶＳ（バルクドラッグおよび投薬液剤）の放射性化学純度、比活性および濃度を放射性検出装置を備えたＨＰＬＣを用いて測定した。投薬液剤の２部構成のアリコートを、投薬液剤の比活性および放射活性濃度を測定するために投薬前、投薬中および投薬後に採取した。
【００９５】
各動物の標的用量は、強制経口投与を介して、３０ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基；１０ｍｇ／ｍＬ、３ｍＬ／ｋｇ、３０μＣｉ／ｋｇ）［１４Ｃ］ＤＶＳであった。この標的用量は、かかる用量が以前の薬物動態学的研究にて用いられたため、選択された。加えて、この用量を皮下的に投与すると、雄スプレーグドーリーラットの脳中のノルエピネフリンレベルを有意に増大させた。
採血および分析
【００９６】
投薬の１、４、８および２４時間後にヘパリン処理した試験管に採集した全血（約１０ｍＬ）（各時点でＮ＝４）を分析した。１ｍＬの血液を放射活性濃度を測定するのに用いられる新たな試験管に移した。採血の２時間以内に４℃で遠心分離に付すことで血漿を得た。血漿および全血サンプルを分析のためにドライアイスに乗せてWyeth Research, Biotransformation Division（カレッジビル、ペンシルベニア州）に運んだ。全血の３部構成のアリコート（２００μＬ）をコンバスト・コーンに入れ、風乾させた。ついで、これらのサンプルを酸化させ、放射活性含量について分析した。残りの血漿を代謝産物の分析まで−７０℃で貯蔵した。
【００９７】
イヌ毎に、尿および糞便を別々に集め、尿はドライアイス上で、糞便は室温で採集した。尿は０−８および８−２４時間で、糞便は０−２４時間で採集した。尿および糞便サンプルを分析のためにドライアイスに乗せてWyeth Research, Biotransformation Division（カレッジビル、ペンシルベニア州）に運んだ。糞便サンプルを約５倍容量（ｖ／ｗ）の水で均質化した。約０.２グラムのホモジネートのアリコートをコンバスト・コーンに入れ、秤量し、風乾させた。ついで、これらのサンプルを酸化させ、放射活性含量を測定した。残りの尿サンプルおよび糞便ホモジネートを代謝産物の分析まで−７０℃で貯蔵した。
【００９８】
血液サンプルおよび糞便ホモジネートを、捕獲剤としてCarbosorb（登録商標）E（６ｍＬ）およびシンチラントとしてPermaFluor（登録商標）E＋（１０ｍＬ）を用い、Model 307 Tri Carb sample oxidizerにて酸化した。各サンプルの読取値から基底読取値（対照血液または糞便サンプルの平均値）を差し引いた。尿および血漿のアリコートを１０ｍＬのUltima Gold（登録商標）シンチレーション流体を添加した直後に分析した。
【００９９】
すべての放射活性測定を、Tri Carb Model 3100 TR液体シンチレーション計数器（Packard BioScience、ボストン、マサチューセッツ州）と、Ultima Gold（登録商標）またはトルエン標準曲線とを一緒に用いて行った。１分当たりのカウント（ＣＰＭ）を、既知の放射活性の外部標体を用いることで１分当たりの崩壊（ＤＰＭ）に変換した。各標体のクエンチを外部放射活性標体の変換スペクトル指数（ｔＳＩＥ）により測定した。検出下限を基底値の２倍と規定した。
血漿の代謝産物サンプル
【０１００】
投薬の１および４時間後に採集した血漿サンプルを代謝産物プロファイルについて分析した。１ｍＬの血漿のアリコートを等容量のアセトニトリルと混合し、少なくとも１０分間氷上に置き、ついでEppendorf Model 5415C遠心分離機を用い、１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離に付した。上澄の流体を新たな試験管に移した。上澄を放射活性について分析した。その上澄をTurbo Vap（Zymark、ホピントン、マサチューセッツ州）中、窒素流の下で濃縮し、アセトニトリルを除去した。水性残渣のアリコートをＨＰＬＣで分析し、プロファイルした。選択されたサンプルはＬＣ／ＭＳでも分析し、その放射活性ピークを特徴付けた。
【０１０１】
イヌの血漿中の［１４Ｃ］ＤＶＳの安定性を測定した。［１４Ｃ］ＤＶＳ（０.０１２ｍｇ／ｍＬ、最終濃度）を対照となるイヌの血漿に添加し、３７℃に設定した振盪水浴にてインキュベートした。２部構成のアリコート（１ｍＬ）を０、１、４、８および２４時間で取り出した。サンプルを上記のように抽出し、ＨＰＬＣ分析により放射性純度をアッセイした。
尿の代謝産物サンプル
【０１０２】
投薬後の８時間と２４時間の間に採集した尿サンプルを代謝産物プロファイルについて分析した。尿のアリコートをEppendorf Model 5415C遠心分離機を用い、１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離に付した。上澄を新たな試験管に移し、放射活性含量についてＨＰＬＣにより分析し、代謝産物をプロファイルした。選択されたサンプルはＬＣ／ＭＳでも分析し、その放射活性ピークを特徴付けた。
【０１０３】
イヌの尿中の［１４Ｃ］ＤＶＳの安定性を測定した。［１４Ｃ］ＤＶＳ（０.０２５ｍｇ／ｍＬ、最終濃度）を対照となるイヌの尿に添加し、３７℃に設定した振盪水浴にてインキュベートした。アリコート（１ｍＬ）を０、１、４、８および２４時間で取り出した。サンプルを上記のように抽出し、ＨＰＬＣ分析により放射性純度をアッセイした。
糞便の代謝産物サンプル
【０１０４】
投薬後２４時間までに採集した糞便ホモジネートを代謝産物プロファイルについて分析した。約２グラムの糞便ホモジネートのアリコートを新たな試験管に移し、等容量のアセトニトリル（ｖ／ｗ）を加え、該試験管を攪拌させた。ついで、サンプルをEppendorf Model 5415C遠心分離機を用い、１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離に付した。上澄を新たな試験管に移した。残渣を１ｍＬのアセトニトリルに再び懸濁させ、上記したように遠心分離に付した。得られた上澄を最初の上澄と合し、放射活性について分析した。ついで、上澄をTurbo Vapにて窒素流下で濃縮し、アセトニトリルを除去した。水性残渣のアリコートをＨＰＬＣで分析し、プロファイルした。選択されたサンプルはＬＣ／ＭＳでも分析し、その放射活性ピークを特徴付けた。
サンプル分析
【０１０５】
Waters Alliance model 2690 HPLCシステム（Waters Corp.、ミルフォード、マサチューセッツ州）を用いてクロマトグラフィー分析を行った。該装置はビルトイン型自動サンプラーを備えており、２２５ｎｍでモニター観察するように設定されたModel 2487 TunableＵＶ検出装置、および２５０μＬ LQTRフローセルを含むFloOne β Model 515放射活性フロー検出装置（Perkin Elmer）とインラインに設置された。Ultima Flow Mシンチレーション流体の流速は３ｍＬ／分であり、シンチレーションカクテルは移動相に対して３：１の混合割合を提供した。代謝産物のピークの分離を、２種の移動相、ＡおよびＢの線状勾配を用い、Phenomenex Luna C18（2）カラム、２５０ｘ４.６ｍｍ、５ミクロン（Phenomenex、トランス、カリフォルニア州）で行った。移動相Ａは１０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ５.５であり、移動相Ｂはアセトニトリルであった。流速は１ｍＬ／分であった。移動相を表８に示すように流した。
【表８】
【０１０６】
自動サンプラーおよびダイオードアレイＵＶ検出装置を含む、Agilent Model 1100 HPLCシステム（Agilent Technologies、ウィルミントン、デラウェア州）をＬＣ／ＭＳ分析に用いた。ＵＶ検出装置は２００ないし４００ｎｍをモニター観察するように設定された。分離を５ミクロンPhenomenex Luna C18（2）カラム、１５０ｘ２ｍｍ（Phenomenex）で達成した。カラム温度は２５℃であった。移動相および勾配プログラムを表２に列挙する。ＬＣ／ＭＳ分析操作を選択する場合、固体シンチレーションフローセルを備えたβ-RAM Model 3 放射活性フロー検出装置（IN/US Systems Inc.、タンパ、フロリダ州）を用いる必要があった。
【０１０７】
代謝産物の特徴化に用いたマススペクトロメータはMicromass Q−TOF−2 四極子飛行時間ハイブリッドマススペクトロメータ（Micromass, Inc.、ベバリー、マサチューセッツ州）およびFinnigan LCQ Decaイオントラップマススペクトロメータ（ThermoFinnigan、サンノゼ、カリフォルニア州）であった。該マススペクトロメータはエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）インターフェースを備えており、陽イオン化モードにて操作された。該マススペクトロメータのセッティングを表９および８表１０に列挙する。
【表９】
【表１０】
【０１０８】
ＤＶＳのグルクロニド化の部位を確認するのに、イヌ肝臓ミクロソームを用いてインキュベーションを行った。これらのインキュベーションでは、ＤＶＳとベンラファキシンのグルクロニド化を比較した。簡単に言えば、ベンラファキシンまたはＤＶＳ（１００μＭ）をイヌ肝臓ミクロソーム（１ｍｇ／ｍＫ）およびＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）と一緒に０．１Ｍリン酸ナトリウム／カリウム緩衝液中でインキュベートした。サンプルを３７℃に設定した振盪水浴にて２分間プレインキュベートした。ＵＤＰＧＡ（最終濃度１ｍＭ）を添加することで反応を開始させた。付加的な一連のインキュベーションをベンラファキシンについてＵＤＰＧＡおよびＮＡＤＰＨ生成システムを用いて行った。インキュベーション容量は全体で５００μＬであり、インキュベーションの長さは合計で３０分であった。５００μＬのアセトニトリルを添加して反応を停止させ、上記のように処理した。サンプルをＬＣ／ＭＳにより分析した。
【０１０９】
放射活性ピークを積分するのに、FloOne分析ソフトウェア（version 3.65、Packard BioScience）を利用した。コンピュータプログラムMicrosoft Excel（登録商標）97を用いて平均値および標準偏差を計算した。MassLynxソフトウェア（version 3.5）を用いてＬＣ／ＭＳデータを分析した。
結果
【０１１０】
放射分析検出装置を備えたＨＰＬＣによって測定した［１４Ｃ］ＤＶＳ（バルク化合物）の放射化学純度および比活性は、各々、９９．３％および２０９μＣｉ／ｍｇ（遊離塩基）であった。投薬溶液中の［１４Ｃ］Ｏ−デスメチルベンラファキシンの濃度、放射純度および比活性は、各々、１０.３ｍｇ／ｍＬ、９８.３％および１.０３７μＣｉ／ｍｇであった。投薬溶液の投与前、中および後のアリコートは同様の濃度および純度を有した（データは示さず）。［１４Ｃ］ＤＶＳの平均投与用量は３１.０±０.１８ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基）であった。
【０１１１】
［１４Ｃ］ＤＶＳは対照イヌの尿および対照イヌの血漿中、３７℃で２４時間まで安定であった。２４時間まで、および２４時間を含め、いずれの時点でも有意な分解生成物はラジオクロマトグラフィーで検出されなかった。
【０１１２】
酸化効率を１４C−Spec-Chec（Perkin Elmer）、既知の放射活性の標体を酸化することで決定し、９９．１％であると決定された。各時点での血液および血漿中の放射活性の濃度、ならびに血液の血漿への分配を表１１に示す。雄イヌの放射活性全体の平均血漿中濃度は、投薬後１、４、８および２４時間後で、各々、１３.３、１６.９、７.４３および０.８１μｇ当量／ｍＬであった。各時点で、血液の血漿に対する放射活性の割合は、０.５１と０.６４の間の範囲にあった。
【表１１】
血漿の代謝産物プロファイル
【０１１３】
血漿からの放射活性の平均抽出効率は８７.６±１０.１％であった（データは示さず）。投薬１時間後に採集したイヌ血漿の代表的なラジオクロマトグラムを図１４（Ａ）に示す。ＤＶグルクロニド（Ｍ７）が検出される顕著なピークであった。投薬後１時間および４時間では、血漿中に検出される放射活性の７７．５および９６．４％がＭ７ピークと関連付けられた。８時間および２４時間のサンプルはラジオクロマトグラフィーにより分析されるのに十分な放射活性を有しなかった。血漿中で検出される唯一別の放射活性成分が未変換ＤＶＳであった。
【０１１４】
イヌの血漿中の９種の付加的な従たる代謝産物をＬＣ／ＭＳで特徴付けた（表１２）。これらの代謝産物はシクロヘキサノール環上でヒドロキシル化されている６種の代謝産物（Ｍ１−Ｍ６、ヒドロキシＤＶ化合物）、Ｎ，Ｏ−ジデスメチルベンラファキシン（Ｍ１０）、Ｎ，Ｏ−ジデスメチルベンラファキシンＯ−グルクロニド（Ｍ１３）、およびＮ−オキシドＤＶを包含する。
【表１２】
尿の代謝産物プロファイル
【０１１５】
尿が主たる排泄経路であり、平均７５％の放射活性用量が投薬後２４時間以内の尿サンプルにて回収された。尿中で検出された放射活性濃度を、ラジオクロマトグラフィー分析に付した後の放射活性の％分布として、表１３に示す。投薬後８−２４時間に集めたイヌの尿の代表的なラジオクロマトグラムを図１４（Ｂ）に示す。分析したすべての尿のサンプルにて検出された優勢的な放射活性ピークはＯ−デスメチルベンラファキシンＯ−グルクロニド（Ｍ７、ＤＶグルクロニド）であり、尿中で検出された放射活性ピークの約８５％を占めた。Ｎ,Ｏ−ジデスメチルベンラファキシンＯ−グルクロニド（Ｍ１３）は尿中で検出された薬物関連のピークの約４％を占めた。未変換［１４Ｃ］ＤＶＳは尿中で検出された放射活性の４ないし８％を占めた。代謝産物Ｍ１１およびＭ１２（シクロヘキサン環上でヒドロキシル化されている代謝産物のグルクロニドコンジュゲート、「ヒドロキシＤＶグルクロニド」）は、各々、尿中で検出される放射活性の平均２および４％を占めた。Ｍ１１ピークは、各々がＬＣ／ＭＳによりシクロヘキサン環上でヒドロキシル化されている代謝産物のグルクロニドコンジュゲートであると同定されている、一緒に溶出する代謝産物を含有した。
【表１３】
【０１１６】
１０種のさらに従たる代謝産物を尿のＬＣ／ＭＳ分析で特徴付けた。これらの従たる代謝産物はＭ１−Ｍ６、ベンジル基上でヒドロキシル化されている代謝産物（Ｍ９）、Ｎ，Ｏ−ジデスメチルベンラファキシン（Ｍ１０）、Ｎ，Ｎ，Ｏ−トリデスメチルベンラファキシン（Ｍ１４）、およびＮ−オキシドＤＶ（表１２）を包含する。
糞便の代謝産物プロファイル
【０１１７】
ラジオクロマトグラフィー分析に付す前の０−２４時間糞便サンプルからの放射活性の抽出効率は７６.８±６.２％であった（データは示さず）。糞便中の回収％およびラジオクロマトグラフィーに付した後の放射活性の分布を表１４に示す。少しの割合の放射活性用量（約３％）だけが投薬の２４時間以内に糞便中に排泄された。投薬後０−２４時間で集めたイヌの糞便の抽出物の代表的なラジオクロマトグラムを図１４（Ｃ）に示す。４つの放射活性ピークが検出され、未変換ＤＶＳが各クロマトグラムにて検出された優勢的なピークであり、糞便中の放射活性の平均７６％を占めた。次に豊富な放射活性ピークがＭ１０であり、糞便に排泄された放射活性の約１２％を占めた。Ｎ−オキシドＤＶおよびＮ，Ｎ，Ｏ−トリデスメチルベンラファキシン（Ｍ１４）もまた、糞便抽出物のラジオクロマトグラム中に存在し、各々、約７および５％を占めた。
【表１４】
【０１１８】
ラジオクロマトグラムでは検出されなかった８種の付加的な従たる代謝産物が、糞便抽出物をＬＣ／ＭＳ分析に付すことで特徴付けられた。これらの代謝産物は、Ｍ１−Ｍ６、Ｍ７およびＭ９を包含した（表１２）。
液体クロマトグラフィー／質量分析による代謝産物の特徴化
【０１１９】
イヌ血漿、尿および糞便中のＤＶＳおよびその代謝産物に対するマススペクトルをＬＣ／ＭＳおよびＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析により得た。イヌのＤＶＳ代謝産物の構造的特徴化を表１２に要約する。ＬＣ／ＭＳデータはＤＶＳのグルクロニド（Ｍ７）、Ｎ−デスメチルＤＶＳ（Ｍ１０）およびモノ酸化生成物への代謝反応を示した。ＤＶＳおよび１４種の代謝産物のマススペクトルの特徴化を後記する。
ＤＶＳ
【０１２０】
ＤＶＳ標体のマススペクトルの特徴を代謝産物との比較のために分析した。ＤＶＳのＬＣ／ＭＳスペクトルにおいて、プロトン化分子イオン、［Ｍ＋Ｈ］＋はｍ／ｚ２６４で観察された。図７は、衝突誘起解離（ＣＩＤ）より得られたＤＶＳのｍ／ｚ２６４のマススペクトルの生成物、および分解スキームの提案を示す。分子イオンからＨ２Ｏが喪失すると、ｍ／ｚ２４６の生成物イオンが得られる。さらにジメチルアミノ基が喪失すると、ｍ／ｚ２０１の生成物イオンが得られる。シクロヘキサノール基がＤＶＳから喪失することでｍ／ｚ１６４の生成物イオンが示された。ｍ／ｚ５８の生成物イオンは（ＣＨ３）２ＮＣＨ２＋によるものであった。加えて、ｍ／ｚ１０７、１３３、１４５、１５９および１７３の生成物イオンは、各々、ＤＶＳ分子のメチル、プロピル、ブチル、ペンチルおよびヘキシル−フェノール部分に相当する。したがって、これらのイオンを用いてジメチルアミノ、ヒドロキシベンジルおよびシクロヘキサノール基に局在化される代謝作用の部位を検出することができた。
【０１２１】
代謝産物Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５およびＭ６（ヒドロキシＤＶ化合物）はｍ／ｚ２８０の［Ｍ＋Ｈ］＋を生成し、それはＤＶＳよりも１６Ｄａ大きく、ヒドロキシル化またはＮ−酸化を示唆した。図１５はＭ６についてｍ／ｚ２８０スペクトルの生成物を示す。代謝産物Ｍ１ないしＭ６についてのマススペクトルデータは類似していた。分子イオンからのＨ２Ｏの喪失でｍ／ｚ２６２の生成物イオンが得られた。代謝産物についてｍ／ｚ５８、１０７および２１７の生成物イオンと、ＤＶＳについてｍ／ｚ５８、１０７および２０１とを対比して、シクロヘキサン環が代謝作用の部位であることが分かる。したがって、代謝産物Ｍ１ないしＭ６は、シクロヘキサン環を酸化部位として有するヒドロキシＤＶ代謝産物であると提案された。
【０１２２】
代謝産物Ｍ７（Ｏ−デスメチルベンラファキシンＯ−グルクロニド、ＤＶグルクロニド）
この代謝産物の［Ｍ＋Ｈ］＋はｍ／ｚ４４０で観察され、それは分子量が４３９であることを示した。図１６はＭ７についてｍ／ｚ４４０スペクトルの生成物を示す。該分子イオンから１７６Ｄａを喪失すると、ｍ／ｚ２６４の生成物イオンが得られ、それはこの代謝産物がＤＶＳのグルクロニドであることを示した。マススペクトルデータはコンジュゲーションの部位を示さなかった。イヌ肝臓ミクロソームとＤＶＳまたはベンラファキシンと共に行われるインキュベーションを利用してグルクロニド化の部位を測定した。ＵＤＰＧＡのみ存在する場合、ベンラファキシンではなく、ＤＶＳのグルクロニド化が観察された。ベンラファキシンのグルクロニド化はＵＤＰＧＡとＮＡＤＰＨの両方の存在において観察されるに過ぎない。ベンラファキシンより形成されるグルクロニドは、Ｍ７と同じ［Ｍ＋Ｈ］＋および保持時間を有し、それはＯ−デスメチル化が起こり、つづいてフェノール性ヒドロキシル基のグルクロニド化が生じた結果であった。ＤＶＳとベンラファキシンの間の構造的な違いは、ＤＶＳのフェノール性ヒドロキシル基がベンラファキシン上でメチル化されているということである。これにより、ＤＶＳ関連の化合物のグルクロニド化にはフェノール基が必要とされることが明らかになった。したがって、Ｍ７はコンジュゲーション部位としてフェノール基を有するＤＶのＯ−グルクロニドであることが提案された。
代謝産物Ｍ９
【０１２３】
代謝産物Ｍ９はｍ／ｚ２８０の［Ｍ＋Ｈ］＋を生成し、それはＤＶＳよりも１６Ｄａ大きく、ヒドロキシル化またはＮ−酸化を示唆した。図１７はＭ９についてｍ／ｚスペクトルの生成物を示す。ｍ／ｚ１２３、１４９および１６１の生成物イオンは、各々、ｍ／ｚ１０７、１３３および１４５の対応するＤＶＳ生成物イオンよりも分子量が１６Ｄａ大きく、それはベンジル基のヒドロキシル化を意味する。したがって、Ｍ９は酸化部位としてベンジル基を有するヒドロキシＤＶであった。
代謝産物Ｍ１０
【０１２４】
Ｍ１０についての［Ｍ＋Ｈ］＋がｍ／ｚ２５０で観察された。図１８はＭ１０についてｍ／ｚ２５０スペクトルの生成物を示す。Ｈ２Ｏのｍ／ｚ２５０の分子イオンからの喪失はｍ／ｚ２３２の特徴的な生成物を生成させた。その後でメチルアミンがｍ／ｚ２３２から喪失すると、ｍ／ｚ２０１の生成物が得られた。このこと、およびｍ／ｚ５８の生成物イオンの欠如は、ＤＶのジメチルアミノ基がＮ−デメチル化によりメチルアミノ基に変換されたことを示した。加えて、Ｍ１０のｍ／ｚ２５０マススペクトルの生成物は、合成Ｎ,Ｏ−ジデスメチルベンラファキシンのｍ／ｚ２５０マススペクトルの生成物と適合した。したがって、Ｍ１０はＮ,Ｏ−ジデスメチルベンラファキシンであると同定された。
代謝産物Ｍ１１ａ、Ｍ１１ｂ、Ｍ１１ｃおよびＭ１２（ヒドロキシＤＶグルクロニド）
【０１２５】
Ｍ１１ａ、Ｍ１１ｂ、Ｍ１１ｃおよびＭ１２についての［Ｍ＋Ｈ］＋をｍ／ｚ４５６で観察し、それは分子量が４５５であることを示した。図１９はＭ１２のｍ／ｚ４５６スペクトルの生成物を示す。Ｍ１１ａ、Ｍ１１ｂ、Ｍ１１ｃおよびＭ１２のマススペクトルデータは類似していた。該分子イオンから１７６Ｄａの分子量が喪失すると、ｍ／ｚが２８０のイオンが得られ、それはヒドロキシＤＶ代謝産物の［Ｍ＋Ｈ］＋であった。マススペクトルデータはコンジュゲーション部位を示さなかった。代謝産物Ｍ７にて検討されたＤＶＳとベンラファキシンとのインビトロにおけるグルクロニド化実験の結果に基づき、フェノール基がコンジュゲーション部位として提案された。代謝産物についてｍ／ｚ５８、１０７および２１７の生成物イオンと、ＤＶＳについてｍ／ｚ５８、１０７および２０１とを対比すると、シクロヘキサン環がヒドロキシル化されていることが分かる。したがって、Ｍ１１ａ、Ｍ１１ｂ、Ｍ１１ｃおよびＭ１２はヒドロキシＤＶＳ代謝産物のＯ−グルクロニドであると提案された。
【０１２６】
代謝産物Ｍ１３（Ｎ,Ｏ−ジデスメチルベンラファキシンＯ−グルクロニド）
この代謝産物の［Ｍ＋Ｈ］＋をｍ／ｚ４２６で観察し、それは分子量が４２５であることを示した。図２０はＭ１３の生成物イオンスペクトルを示す。ｍ／ｚ４２６から１７６Ｄａの喪失により、ｍ／ｚ２５０のイオンが得られる。シクロヘキサノール基からＨ２Ｏが喪失すると、ｍ／ｚ４０８のベースピークが生じる。ｍ／ｚ４０８のイオンから１７６Ｄａの喪失はｍ／ｚ２３２のＭ１０の特徴的な生成物をもたらした。その後、ｍ／ｚ２３２からメチルアミンが喪失し、ｍ／ｚ２０１の生成物イオンが得られた。従って、Ｍ１３はグルクロニド化の部位としてのフェノール基を有するＮ,Ｏ−ジデスメチルベンラファキシンＯ−グルクロニドであると提案された。
【０１２７】
代謝産物Ｍ１４はｍ／ｚ２３６の［Ｍ＋Ｈ］＋を生成した。図２１はＭ１４についてｍ／ｚ２３６スペクトルの生成物を示す。該分子イオンからＨ２ＯおよびＮＨ３が喪失すると、ｍ／ｚ２０１の生成物を生成した。このこと、およびｍ／ｚ５８の生成物イオンの欠如はＮ−ジデメチル化を示す。ｍ／ｚ１０７、１３３、１４５、１５９および１７３の生成物イオンもまた、ＤＶＳで観察された。Ｍ１４のｍ／ｚ２３６マススペクトルの生成物は、図２２に示される合成Ｎ，Ｎ，Ｏ−トリデスメチルベンラファキシンのマススペクトルと一致した。したがって、Ｍ１４はＮ，Ｎ，Ｏ−トリデスメチルベンラファキシンであると同定された。
Ｎ−オキシドＤＶ
【０１２８】
このＤＶＳ関連の成分についての［Ｍ＋Ｈ］＋をｍ／ｚ２８０で観察し、それはヒドロキシル化またはＮ−酸化を示した。図２３はこの関連する化合物のｍ／ｚ２８０マススペクトルの生成物を示す。［Ｍ＋Ｈ］＋イオンから６１Ｄａの喪失はｍ／ｚ２１９の生成物イオンをもたらした。このことはＮ−オキシドと一致するジメチルヒドロキシアミンの喪失に相当した。したがって、この代謝産物はＮ−オキシドＤＶであると同定された。
実施例３．２−ヒドロキシ−ＤＶ化合物の合成
【０１２９】
本発明の２−ヒドロキシ−ＤＶ化合物を以下の方法を用いて製造してもよい。ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の４−（ジメチルカルバモイルメチル）フェノールをＫ２ＣＯ３で、つづいて臭化ベンジルで処理した。該混合物を室温で攪拌し、つづいて６０℃で１時間攪拌した。該混合物を濃縮し、ＤＭＦを除去し、ＥｔＯＡｃで希釈し、水で洗浄した。ＭｇＳＯ４を加えて乾燥させ、該混合物を濾過し、低容量に濃縮する。ヘキサンを加えてケタール中間生成物を沈殿させる。固体を濾過により集め、乾燥させる。
【０１３０】
２−ベンジルオキシ−シクロヘキサノンのＴＨＴ／ＭｅＯＨ（１００ｍＬ／５０ｍＬ）中溶液を酸（例えば、ＨＣｌ）で処理し、ついで室温で攪拌させる。該反応物を飽和Ｋ２ＣＯ３でクエンチし、ＥｔＯＡｃで抽出し、油にまで濃縮する。生成物を熱ＥｔＯＡｃ／ヘキサンから結晶化させ、図２に示されるようにケトン中間体を得る。
【０１３１】
ケトンのＴＨＦ中溶液を水素化アルミニウムリチウム（ＬＡＨ）ペレットのＴＨＦ中懸濁液に−７８℃で添加した。該混合物を室温にまで加温し、少なくとも３時間攪拌する。該反応物をＭｅＯＨで、つづいて１０％ＮａＯＨでクエンチし、少なくとも３時間攪拌する。固体を濾過で除去し、洗浄（例えば、ＴＨＦで洗浄）し、濃縮して固体を得る。得られた固体をＥｔＯＡｃ／ヘキサンで再結晶し、対応するベンジルエーテルを得る。
【０１３２】
Ｐｄ／Ｃと一緒に１００ｍＬのエタノール中で攪拌し、加圧下で一夜水素化することで両方のベンジル保護基を除去してもよい。該固体を濾過で、つづいてエタノールで洗浄することで精製する。固体に濃縮し、ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで結晶化させて最終生成物を得る。
実施例４ ２−ヒドロキシＤＶグルクロニド化合物の合成
【０１３３】
２−ヒドロキシＤＶグルクロニド化合物は以下のように合成してもよい。２−ヒドロキシＤＶ（１．０ｇ、３．６ミリモル）および２．０５ｇ（４．３ミリモル）のトリクロロイミデートの塩化メチレン（１５ｍＬ）中溶液に、ＢＦ３ＯＥｔ２（０．５４ｍＬ、４．４ミリモル）を５分間にわたって滴下する。反応物を窒素雰囲気下で一夜攪拌する。ついで、該反応混合物をＮａＨＣＯ３（飽和）に注ぎ、塩化メチレンで抽出する。有機層を分離し、乾燥させて真空下で濃縮する。該粗残渣をショートシリカカラムに通し、塩化メチレン−メタノールで溶出する。濾液を濃縮し、保護２−ヒドロキシＤＶＯ−グルクロニドを得る（図３を参照）。
【０１３４】
保護２−ヒドロキシＤＶグルクロニド（トリアセチルメチルエステル）（１．０ｇ、１．７ミリモル）をジオキサン−ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ（２：１：１）８ｍＬの混合液に溶かし、ＬｉＯＨ（０．４ｇ、１７ミリモル）を加え、得られた溶液を６０℃で１時間加熱する。ついで、該反応混合物を冷却し、酢酸で希釈する。該混合物を真空下で濃縮し、残渣を塩化メチレン−メタノールと共にシリカ上に注ぎ、２−ヒドロキシＤＶグルクロニドを得ることができる。
実施例５ Ｎ−オキシドＤＶの合成
【０１３５】
Ｎ−オキシドＤＶを以下のような化学合成法を用いて調製した。図４に示されるＮ−オキシドＤＶ Ｉを調製するのに：ＯＤＶ（１．０ｇ、３．８ミリモル）をクロロホルム（４５ｍＬ）に溶かし、０℃に冷却した。ついで、ＭＣＰＢＡ（０．７８６ｇ、４．５６ミリモル）／クロロホルム（１５ｍＬ）を該反応混合物に滴下した。該反応物を窒素雰囲気下で一夜攪拌させた。温度をこの間に室温にまで加温させた。ついで、該反応混合物をクロロホルムでプレパックされている塩基性アルミナカラム（４０ｇ）上に注いだ。反応混合物をアルミナカラム上に吸着させ、ついでクロロホルム（１５０ｍＬ）を該カラムに（加圧なしで）通した。次に、メタノール：クロロホルムの混合液（１：３）を該カラムに通し、所望の生成物を溶出させた。生成物を含有するフラクションを濃縮し、得られた固体をクロロホルムに溶かし、セライトパッドを通過させた。濾液を濃縮し、所望のＮ−オキシド（１．２６ｇ、＞１００％）を白色固体として得た。融点１７１−１７３℃。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：０.６８−１.６４（ｍ,１０Ｈ）、２.９５（ｓ,３Ｈ）、３.１４（ｓ,３Ｈ）、３.１９（ｄ,Ｊ＝５.７Ｈｚ,１Ｈ）、３.５４（ｄ,Ｊ＝１２.７Ｈｚ,１Ｈ）、 ３.８９（ｄｄ,Ｊ＝７.５Ｈｚおよび７.３Ｈｚ,１Ｈ）、６.６７（ｄ,Ｊ＝８.４Ｈｚ,２Ｈ）、６.９８（ｄ,Ｊ＝８.４Ｈｚ,２Ｈ）、９.５１（ｓ,１Ｈ）；（Ｍ＋Ｈ）＋ ２８０；（Ｍ−Ｈ）− ２７８；元素分析 Ｃ１６Ｈ２５ＮＯ３として：Ｃ, ６８.７９；Ｈ, ９.０２；Ｎ, ５.０１；測定値：Ｃ, ５７.６４；Ｈ, ７.３６；Ｎ, ３.７３；分析ＨＰＬＣ（５−９５％アセトニトリル／水）；２１０ｎＭで９８.４％；２３０ｎＭで９９.３％
【０１３６】
図４に示されるＮ−オキシドＤＶ ＩＩ［（Ｓ）− ４−［２−ジメチルアミノ−１−（１−ヒドロキシ−シクロヘキシル）−エチル］−フェノールのＮ−オキシド］を化合物Ｉとして調製した。該化合物は白色固体である（１.０３ｇ、９７.３％）。融点１７５−１７６℃。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：０.６８−１.６４（ｍ,１０Ｈ）、２.９５（ｓ,３Ｈ）、３.１４（ｓ,３Ｈ）、３.１９（ｄ,Ｊ＝５.７Ｈｚ,１Ｈ）、３.５４（ｄ,Ｊ＝１２.７Ｈｚ,１Ｈ）、３.８９（ｄｄ,Ｊ＝７.５Ｈｚおよび７.３Ｈｚ,１Ｈ）、６.６７（ｄ,Ｊ＝８.４Ｈｚ, ２Ｈ）、６.９８（ｄ,Ｊ＝８.４Ｈｚ,２Ｈ）、９.５１（ｓ,１Ｈ）；（Ｍ＋Ｈ）＋ ２８０；（Ｍ−Ｈ）− ２７８；元素分析 Ｃ１６Ｈ２５ＮＯ３として：Ｃ, ６８.７９；Ｈ, ９.０２；Ｎ, ５.０１；測定値 Ｃ, ６０.６２；Ｈ, ７.８４；Ｎ, ４.０２；分析ＨＰＬＣ（５−９５％アセトニトリル／水）；２１０ｎＭで９８.０％、２３０ｎＭで９９.０％；旋光度；−１５.４９（クロロホルム不純物について修正）。
【０１３７】
（Ｒ）− ４−［２−ジメチルアミノ−１−（１−ヒドロキシ−シクロヘキシル）−エチル］−フェノールのＮ−オキシド（ＩＩＩ）を化合物ＩおよびＩＩのように調製した（図４を参照）。このＮ−オキシドＤＶは白色粉末である（０.８８ｇ、８２.９％）。融点１８１−１８２℃；１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：０.６８−１.６４（ｍ,１０Ｈ）、２.９５（ｓ,３Ｈ）、３.１４（ｓ,３Ｈ）、３.１９（ｄ,Ｊ＝５.７Ｈｚ,１Ｈ）、３.５４（ｄ,Ｊ＝１２.７Ｈｚ,１Ｈ）、３.８９（ｄｄ,Ｊ＝７.５Ｈｚおよび７.３Ｈｚ,１Ｈ）、６.６７（ｄ,Ｊ＝８.４Ｈｚ,２Ｈ）、６.９８（ｄ,Ｊ＝８.４Ｈｚ,２Ｈ）、９.５１（ｓ,１Ｈ）；（Ｍ＋Ｈ）＋ ２８０；（Ｍ−Ｈ）− ２７８；元素分析 Ｃ１６Ｈ２５ＮＯ３として：Ｃ, ６８.７９；Ｈ, ９.０２；Ｎ, ５.０１；測定値：Ｃ, ６７.１０；Ｈ, ８.９２；Ｎ, ４.７７；旋光度；＋１９.０７（クロロホルム不純物について修正）
実施例６ 活性を測定するための受容体結合実験
【０１３８】
本発明の化合物を受容体アッセイ結合実験を用いて生物学的活性について試験した。これらの実験は以下の刊行物に記載されており、メリーランド州、ハノーバー、Novascreenからも入手可能である。使用可能な受容体結合アッセイは、限定されるものではないが、アドレナリン作動性α−２Ａ（ヒト）結合アッセイ（D.B. Bylundら、J Pharmacol & Exp Ther, 245（2）：600-607（1988）；JA Totaroら、Life Sciences, 44：459-467（1989））；ドーパミン輸送体結合アッセイ（Madrasら、Mol. Pharmacol., 36：518-524；JJ Javitchら、Mol Pharmacol, 26：35-44（1984））；ヒスタミンＨ１結合アッセイ（Changら、J Neurochem, 32：1658-1663（1979）；JI Martinez−Mirら、Brain Res, 526：322-327（1990）；EEJ Haaksmaら、Pharmacol Ther, 47：73-104（1990））；イミダゾリン結合アッセイ（CM Brownら、Brit. J Pharmacol, 99（4）：803-809（1990）；ムスカリン性Ｍ５（ヒト組換え体）結合アッセイ（NJ Buckleyら、Mol Pharmacol, 35：469-476（1989）；ノルエピネフリン輸送体（ヒト組換え体）結合アッセイ（R. Raismanら、Eur J Pharmacol, 78：345-351（1982）；S.Z. Raismanら、Eur J Pharmacol, 72：423（1981））；セロトニン輸送体（ヒト）結合アッセイ（RJ・D’Amatoら、J Pharmacol & Exp Ther, 242：364-371（1987）；NL Brownら、Eur J Pharmacol, 123：161-165（1986））を包含する。細胞機能アッセイは、ノルエピネフリン輸送体（ＮＥＴ−Ｔ）ヒト（A. Galliら、J Exp Biol, 198：2197-2212（1995）；およびセロトニン輸送体（ヒト）アッセイ（D’Amatoら、前掲およびNL Brownら、Eur J Pharmacol, 123：161-165（1986））を包含する。結果は受容体の阻害％として測定され得る。
実施例７ 微小透析実験における本発明の化合物のインビボ効能
【０１３９】
本発明の化合物は、例えば、雄のスプレーグドーリラットでの微小透析実験にて評価されてもよい。MT Taberら、「Differential effects of coadministration of fluoxetine and WAY-100635 on serotonergic neurotransmission in vivo：sensitivity to sequence of injections,” Synapse, 38(1)：17-26（Oct. 2000）を参照のこと。この技法は自由行動囓歯動物の脳における化合物の神経化学の作用を捕獲しうる。該作用はラットの背外側前頭皮質、うつ病と因果関係がある、および／またはうつ病の治療に関与していると考えられる脳の領域にて実験されてもよい。セロトニンに対するどのような作用が観察され得るかを知るために、本発明の化合物（３０ｍｇ／ｋｇの用量、皮下）を選択的５−ＨＴ１Ａアンタゴニスト、Ｎ−［２−［４−（２−メトキシフェニル）−１−ピペラジニル］エチル］−Ｎ−（２−ピリジニル）シクロヘキサンカルボキシアミドと組み合わせて試験してもよい。このことを行う根拠は、５−ＨＴ放出を制御するソマトデンドリティック（somatodendritic）５−ＨＴ１Ａ自己受容体を遮断することにある。この操作により、５−ＨＴ１Ａ受容体を脱感作するために、化合物単独での長期（１４日）神経化学実験を行う必要性が排除される。適当な実験の条件を以下に列挙する：
動物：雄のスプレーグドーリラット（２８０−３５ｇ）
脳領域：背外側（ＤＬ）前頭皮質（Ａ／Ｐ＋３．２ｍｍ、Ｍ／Ｌ±３．５ｍｍ、Ｄ／Ｖ−１．５ｍｍ）
投与：手術回復の２４時間後
プローブ挿入から平衡で３時間経過後
１時間４０分のベースライン
１−［２−ジメチルアミノ−１−（４−フェノール）エチル］−シス−１,４−
シクロヘキサンジオール（３０ｍｇ／ｋｇ、経口）の２０分前に５−ＨＴ１Ａ
アンタゴニスト、Ｎ−［２−［４−（２−メトキシフェニル）−１−ピペラジ
ニル］エチル］−Ｎ−（２−ピリジニル）シクロヘキサンカルボキシアミド
（０.３ｍｇ／ｋｇ、皮下）を投与する
サンプル収集：注射後３時間２分の間サンプルを収集する
分析：ＨＰＬＣ−ＥＣＤで５−ＨＴレベルを定量する
【０１４０】
これらの条件下で、インビボ神経化学作用が観察されてもよい。比較のために、ベンラファキシンおよびフルオキセチンのような他のＳＮＲＩおよびＳＳＲＩと、５−ＨＴ１Ａアンタゴニストとの組み合わせのインビボ神経化学作用を観察してもよい。
【０１４１】
明細書は、完全には、該明細書にて引用されている参考文献の教示を考慮して理解される。明細書の実施形態は発明の実施形態の例示を提供するものであり、発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。当業者は、他の実施形態が本発明により包含されることを容易に理解する。この明細書に引用されている刊行物および特許はすべて出典明示によりその全体を本明細書の一部とする。引用文献により本明細書の一部とされた事項が本明細書の記載と矛盾する、または一致しない場合、本明細書の記載がそのような事項に優先する。本明細書の参考文献の引用は、かかる参考文献が本発明の先行文献であるとすることを認めるものではない。
【０１４２】
特記しない限り、特許請求の範囲を含め、本明細書中で使用される成分量、反応条件等を表す数値はすべて、あらゆる場合で、「約」なる語により修飾されるものと認識されるべきである。したがって、逆に特記しない限り、数値パラメーターは近似値であり、本発明が得ることを目的とする所望の特性に応じて変化しうる。最低限でも、特許請求の範囲と均等である原理を適用することを制限するものではなく、各数値パラメーターは有意な桁の数字、通常の四捨五入などの方法を考慮して解釈されるべきである。
【０１４３】
特記しない限り、一連の要素の前にある「少なくとも」なる語は、その一連のすべての要素をいうと理解されるべきである。当業者であれば、単なる慣用的な実験を行うことで、本明細書に記載の発明の具体的な実施形態と均等な範囲を理解あるいは解明することができるであろう。かかる均等な範囲は添付する特許請求の範囲により包含されるものである。
実施例８ デスベンラファキシンの付加的な代謝産物
【０１４４】
本発明の付加的な実施形態として、以下のデスベンラファキシン代謝産物が挙げられる：
【化５−１】
【化５−２】
【化５−３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
【化１】
［式中：
ヒドロキシ基はシクロヘキシル環上の２−位または３−位の一つの炭素に結合する］
で示される単離されたＤＶ代謝産物または誘導体、あるいはその医薬上許容される塩。
【請求項２】
ヒドロキシ基がシクロヘキシル環上の２−位の炭素に結合している、請求項１記載の単離されたＤＶ代謝産物または誘導体。
【請求項３】
ヒドロキシ基がシクロヘキシル環上の３−位の炭素に結合している、請求項１記載の単離されたＤＶ代謝産物または誘導体。
【請求項４】
式：
【化２】
［式中：
ヒドロキシ基はシクロヘキシル環上の２−位、３−位または４−位の一つの炭素に結合する］
で示される単離されたＤＶ代謝産物または誘導体、あるいはその医薬上許容される塩。
【請求項５】
ヒドロキシ基がシクロヘキシル環上の２−位の炭素に結合している、請求項４記載の単離されたＤＶ代謝産物。
【請求項６】
ヒドロキシ基がシクロヘキシル環上の３−位の炭素に結合している、請求項４記載の単離されたＤＶ代謝産物。
【請求項７】
ヒドロキシ基がシクロヘキシル環上の４−位の炭素に結合している、請求項４記載の単離されたＤＶ代謝産物。
【請求項８】
式：
【化３】
で示される単離されたＤＶ代謝産物または誘導体、あるいはその医薬上許容される塩。
【請求項９】
式：
【化４】
［式中：
ヒドロキシ基はベンジル上の２−位または３−位の一つの炭素に結合する］
で示される単離されたＤＶ代謝産物または誘導体、あるいはその医薬上許容される塩。
【請求項１０】
ヒドロキシ基がベンジル上の２−位の炭素に結合している、請求項９記載の単離されたＤＶ代謝産物。
【請求項１１】
ヒドロキシ基がベンジル上の３−位の炭素に結合している、請求項９記載の単離されたＤＶ代謝産物。
【請求項１２】
請求項１、請求項４、請求項８または請求項９に記載の化合物および医薬上許容される担体または賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１３】
１つまたは複数のベンラファキシン、Ｏ−デスメチルベンラファキシンまたはＯ−デスメチルベンラファキシンコハク酸塩、あるいはその医薬上許容される塩をさらに含む、請求項１２記載の医薬組成物。
【請求項１４】
哺乳動物における少なくとも１種の中枢神経系障害を治療する方法であって、その必要とする哺乳動物に、有効量の請求項１、請求項４、請求項８または請求項９に記載の化合物を提供することを含む、方法。
【請求項１５】
化合物が経口投与される、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
【化５−１】
【化５−２】
【化５−３】
より選択される単離されたＤＶ代謝産物またはその誘導体。
【請求項１】
式：
【化１】
［式中：
ヒドロキシ基はシクロヘキシル環上の２−位または３−位の一つの炭素に結合する］
で示される単離されたＤＶ代謝産物または誘導体、あるいはその医薬上許容される塩。
【請求項２】
ヒドロキシ基がシクロヘキシル環上の２−位の炭素に結合している、請求項１記載の単離されたＤＶ代謝産物または誘導体。
【請求項３】
ヒドロキシ基がシクロヘキシル環上の３−位の炭素に結合している、請求項１記載の単離されたＤＶ代謝産物または誘導体。
【請求項４】
式：
【化２】
［式中：
ヒドロキシ基はシクロヘキシル環上の２−位、３−位または４−位の一つの炭素に結合する］
で示される単離されたＤＶ代謝産物または誘導体、あるいはその医薬上許容される塩。
【請求項５】
ヒドロキシ基がシクロヘキシル環上の２−位の炭素に結合している、請求項４記載の単離されたＤＶ代謝産物。
【請求項６】
ヒドロキシ基がシクロヘキシル環上の３−位の炭素に結合している、請求項４記載の単離されたＤＶ代謝産物。
【請求項７】
ヒドロキシ基がシクロヘキシル環上の４−位の炭素に結合している、請求項４記載の単離されたＤＶ代謝産物。
【請求項８】
式：
【化３】
で示される単離されたＤＶ代謝産物または誘導体、あるいはその医薬上許容される塩。
【請求項９】
式：
【化４】
［式中：
ヒドロキシ基はベンジル上の２−位または３−位の一つの炭素に結合する］
で示される単離されたＤＶ代謝産物または誘導体、あるいはその医薬上許容される塩。
【請求項１０】
ヒドロキシ基がベンジル上の２−位の炭素に結合している、請求項９記載の単離されたＤＶ代謝産物。
【請求項１１】
ヒドロキシ基がベンジル上の３−位の炭素に結合している、請求項９記載の単離されたＤＶ代謝産物。
【請求項１２】
請求項１、請求項４、請求項８または請求項９に記載の化合物および医薬上許容される担体または賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１３】
１つまたは複数のベンラファキシン、Ｏ−デスメチルベンラファキシンまたはＯ−デスメチルベンラファキシンコハク酸塩、あるいはその医薬上許容される塩をさらに含む、請求項１２記載の医薬組成物。
【請求項１４】
哺乳動物における少なくとも１種の中枢神経系障害を治療する方法であって、その必要とする哺乳動物に、有効量の請求項１、請求項４、請求項８または請求項９に記載の化合物を提供することを含む、方法。
【請求項１５】
化合物が経口投与される、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
【化５−１】
【化５−２】
【化５−３】
より選択される単離されたＤＶ代謝産物またはその誘導体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７−１】
【図７−２】
【図８−１】
【図８−２】
【図９−１】
【図９−２】
【図１０−１】
【図１０−２】
【図１１−１】
【図１１−２】
【図１２−１】
【図１２−２】
【図１３−１】
【図１３−２】
【図１４】
【図１５−１】
【図１５−２】
【図１６−１】
【図１６−２】
【図１７−１】
【図１７−２】
【図１８−１】
【図１８−２】
【図１９−１】
【図１９−２】
【図２０−１】
【図２０−２】
【図２１−１】
【図２１−２】
【図２２−１】
【図２２−２】
【図２３−１】
【図２３−２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７−１】
【図７−２】
【図８−１】
【図８−２】
【図９−１】
【図９−２】
【図１０−１】
【図１０−２】
【図１１−１】
【図１１−２】
【図１２−１】
【図１２−２】
【図１３−１】
【図１３−２】
【図１４】
【図１５−１】
【図１５−２】
【図１６−１】
【図１６−２】
【図１７−１】
【図１７−２】
【図１８−１】
【図１８−２】
【図１９−１】
【図１９−２】
【図２０−１】
【図２０−２】
【図２１−１】
【図２１−２】
【図２２−１】
【図２２−２】
【図２３−１】
【図２３−２】
【公表番号】特表２０１０−５０７６６７（Ｐ２０１０−５０７６６７Ａ）
【公表日】平成２２年３月１１日（２０１０．３．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５３４６３１（Ｐ２００９−５３４６３１）
【出願日】平成１９年１０月２４日（２００７．１０．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０２２５２５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０５１５５８
【国際公開日】平成２０年５月２日（２００８．５．２）
【出願人】（５９１０１１５０２）ワイス エルエルシー (573)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年３月１１日（２０１０．３．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１０月２４日（２００７．１０．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０２２５２５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０５１５５８
【国際公開日】平成２０年５月２日（２００８．５．２）
【出願人】（５９１０１１５０２）ワイス エルエルシー (573)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]