ＰＩＶ−５およびＰＩＶ−２のＦタンパク質の突然変異タンパク質
本発明は、5型PIV (PIV-5またはPIV5) および2型PIV (PIV-2またはPIV2) として現在表示されるパラインフルエンザウイルス (PIV) の融合タンパク質 (Ｆタンパク質) の突然変異タンパク質に関する。本発明は、それらに由来する生成物、たとえば、核酸、ベクター、細胞；抗体、アプタマー、干渉RNAの融合阻害剤；骨髄腫、ハイブリドーマ；幹細胞および前駆細胞などに関する。また本発明は、医学的および生物工学的適用において使用するための、前記突然変異タンパク質およびそれらに由来する生成物に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、現在、５型PIV（PIV-5又はPIV5）及び２型PIV（PIV-2又はPIV2）として表示されているパラインフルエンザウイルス（PIV）の融合タンパク質（Ｆタンパク質）の突然変異タンパク質に関する。
【０００２】
本願は、それらに由来する生成物、たとえば：
・核酸、ベクター、細胞；
・抗体、アプタマー、干渉ＲＮＡタイプの融合阻害剤；
・骨髄腫、ハイブリドーマ；
・幹細胞及び前駆細胞
に関する。
【０００３】
本願はまた、医学的及び生物工学的な適用において使用するための、これらの突然変異タンパク質及びそれらに由来する生成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
現在、５型PIV（PIV-5又はPIV5）として表示されているパラインフルエンザウイルス（PIV）は、パラミクソウイルス科のルブラウイルス属のエンベロープに包まれたウイルスである。PIV-5は、最初にサル細胞の初代培養物から単離されたため、従来はSV5（シミアンウイルス５）という名で知られていた。しかしながら、PIV-5の自然なホストはイヌであると思われ、イヌにおいてケンネルコフとして知られる咳を引き起こす。
【０００５】
その後に、幾つかのPIV-5単離体が、ヒトから収集されたが動物細胞で培養されたサンプルから得られた。さらに、ヒトにおいては、何の症状又は疾病もPIV-5に付随しなかった。このように、ヒトが実際にPIV-5のホストであるかどうかという問題は今なお熱く討論されている。
【０００６】
何れにせよ、PIV-5ウイルスは現在、動物ウイルスであると考えられている。
【０００７】
２型PIV（PIV-2又はPIV2）として現在表示されているパラインフルエンザウイルス（PIV）もまた、パラミクソウイルス科のルブラウイルス属のエンベロープに包まれたウイルスである。
【０００８】
現在、PIV-2のヒト単離体のみが同定されており（hPIV-2）、そのため、PIV-2はヒトウイルスであると考えられている。
【０００９】
PIV-5及びPIV-2ウイルスは、核酸配列、タンパク質配列、組織、構造及び形態の点から互いに極めて類似している。
【００１０】
ヒトパラインフルエンザウイルスのなかで、PIV-2は、ヒトにおいて発見されたPIV-5に最も近いウイルスである。
【００１１】
PIV-2は、PIV-5のヒト同等物であると考えることができ、少なくとも本発明者らによってそのように考えられている。
【００１２】
PIV-5又はPIV-2による感染は、シンシチウムとして知られる多核性構造体の形成を導き、これは、感染したホスト由来の細胞が融合した結果である。
【００１３】
PIV-5及びPIV-2ウイルスは、ウイルスエンベロープと細胞膜との融合によってホスト細胞へ入る。
【００１４】
この融合は、赤血球凝集素ノイラミニダーゼ結合タンパク質（ＨＮ）及び融合タンパク質（Ｆ）の二つのウイルス糖タンパク質を関与させる。
【００１５】
PIV-5及びPIV-2の融合タンパク質Ｆは、単純な前駆体（Ｆ０）の形態で合成され、グリコシル化ホモトリマーの形態である。PIV-5及びPIV-2の融合タンパク質Ｆは、ジスルフィド架橋を介して連結した二つのサブユニット（大カルボキシ末端サブユニットＦ１及び小アミノ末端サブユニットＦ２）からなる「前活性化」形態を生成するために、ホストのフューリン（furines）によるタンパク分解性の切断を必要とする。
【００１６】
サブユニットＦ１は、疎水性融合ペプチド（ＦＰ）並びにコイルドコイル型のコンフォメーションを有する二つの７アミノ酸繰り返しドメイン（heptade repeat domains）（ＨＲ−１及びＨＲ−２）で構成される。ＨＮによる活性化の後、融合タンパク質は、一連のコンフォメーション変化を起こし、結果として、融合ペプチドの標的細胞膜への挿入を生じる。次に、ＨＲ−１及びＨＲ−２ドメイン間の相互作用が生じ、ウイルスエンベロープを細胞膜に近づける（Russell et al, 2006）。これらのドメインは、三つのＨＲ−１ドメインが三つのＨＲ−２ドメインに非平行配向で連結された三量体コイルドコイル構造で構成された６らせん体の極めて安定な束を形成することが知られている。このコンフォメーションは、Ｆタンパク質の融合後形態を表す（Baker et al, 1999, Sergel-Germano et al, 2000, West et al, 2005）。
【００１７】
PIV-5及びPIV-2の融合タンパク質Ｆは、融合の促進のために、同じウイルス型に由来するＨＮタンパク質を必要とする(Yao et al, 1997)。しかしながら、ＦとＨＮの間に存在する相互作用の詳細な性質は未だに正しく知られていない。
【００１８】
しかし、幾つかの研究が、PIV-5及びPIV-2のある株が、融合を引き起こすためのＨＮの必要性において相違していることを示している。
【００１９】
例として、Ito et al（1997）は、そのＦタンパク質が３つのアミノ酸（残基22、443及び516）によってのみ相違している「SV5」（PIV-5）の二つの株、即ち、Ｗ３Ａ及びＷＲを開示している。Ｗ３Ａ株のＦタンパク質は、自律的な（autonomous）様式で、即ち、ＨＮタンパク質の非存在下で融合を誘導することができ、一方、ＷＲ株のＦタンパク質はその能力を有していない。
【００２０】
Ito et al（1997）は、ＷＲ株のＦタンパク質の膜融合（fusogenic）活性が、このタンパク質の22位のアミノ酸をアミノ酸プロリンで置換することによって回復され得ることを示している。
【００２１】
Ito et al（2000）は、Ｗ３Ａ及びＷＲ株のＦタンパク質の132位のアミノ酸Ｅ及び290位のアミノ酸Ａが、これらの株のＦタンパク質がＨＮタンパク質に自律的である能力に関与し得ることを示唆している。
【００２２】
Paterson et al（2000）は、Ｗ３Ａ株のＦタンパク質の22位のアミノ酸プロリンの存在、及びＷＲ株のＦタンパク質のアミノ酸443の存在が、これらのウイルス株の膜融合能力を上昇させ得ることを示している。
【００２３】
Russell et al（2003）は、Ｗ３Ａ株のＦタンパク質の残基Ｌ４４７及びＩ４４９を芳香族アミノ酸によって置換することにより、このウイルス株のＦタンパク質の膜融合活性が上昇され得ることを示している。
【００２４】
Gardner及びDutch（2007）は、野生型「ＳＶ５」（ＰＩＶ−５）ウイルスのＦタンパク質の突然変異Ｉ４９Ａが、膜融合促進効果（pro-fusogenic effect）を有するであろうことを示している。
【００２５】
Gardner et al（2007）は、野生型「SV5」（PIV-5）ウイルスのＦタンパク質の突然変異Ｖ４０２Ａが、膜融合促進効果を有するであろうことを示している。
【００２６】
タンパク質PIV-2に関しては、このウイルスのＦタンパク質の配列に突然変異を導入し、それによって自律性及び膜融合能力を上昇させるタイプの試みを記載した従来技術文献は見当たらない。
【００２７】
さらに、インフルエンザタンパク質ＨＡ１／ＨＡ２、ラブドウイルスＧタンパク質、又はＨＩＶのｇｐ４１／ｇｐ１２０タンパク質など、融合能力を有するウイルスタンパク質が他に多くある。
【００２８】
これらの種々のウイルスタンパク質の膜融合性能力及び自律性に関する現在の知識は、今なお極めて限られている。
【００２９】
いずれにせよ、ウイルス融合タンパク質に関する現在の知識は、有効な医学的及び／又は生物工学的適用を構想するのに十分な技術的ノウハウを提供しない。
【発明の概要】
【００３０】
本発明者らは、高い膜融合性であり、かつその融合能力における実質的な自律性を示す融合タンパク質を利用可能にすることが、幾つかの医学的及び生物工学的な状況の解決を提供し得ると考えた。
【００３１】
本発明者らは、従って、例えばインフルエンザのＨＡ１／ＨＡ２タンパク質、ラブドウイルスのＧタンパク質、又はＨＩＶのｇｐ４１／ｇｐ１２０タンパク質などの、他の一連のウイルス融合タンパク質から、PIV-5及び／又はPIV-2のＦタンパク質を精選して選択した。
【００３２】
次いで、本発明者らは、ＨＮタンパク質の非存在下において膜融合能力を有する突然変異Ｆタンパク質を構築及び生産した。
【００３３】
本発明の突然変異タンパク質は、高い膜融合能力と高い自律性を有することが証明された。それらは、細胞融合を誘導するためにＨＮタンパク質の存在を必要とせず、また、シンシチウムの形成を必要としなかった。
【００３４】
また、本発明者らは、これらの突然変異タンパク質に、Ｆタンパク質が天然の状態で示しているものとは異なる切断サイト、より具体的には組織特異的切断サイトを導入することが可能であることを示した。
【００３５】
また、本発明者らは、本発明の突然変異タンパク質及び／又はそれらに由来するか又はそれらから得られる生成物の医学的適用（治療的、予防的、緩和的、また診断的)及び／又は生物工学的適用を提案する。
【００３６】
より具体的には、本発明者らは、癌（より具体的には転移性の癌、好ましくは転移性黒色腫）又は胎盤の発達不全などの、シンシチウムの形成を誘導または増加することが望まれる疾病又は機能障害を生体内で又は生体外で治療、予防又は緩和するための、本発明の突然変異タンパク質又はそれらをコードする核酸の使用を提案する。
【００３７】
本発明者らはさらに、エンベロープに包まれたウイルスの感染、アレルギー、自己免疫疾患又は移植片拒絶などの、シンシチウムの形成を阻害又はブロックすることが望まれる疾病又は機能障害を生体内で又は生体外で治療、予防又は緩和するための、抗体、組換え樹状細胞、アンチセンス、siRNA、核酸アプタマーなどの、ＰＩＶ−５及び／又はＰＩＶ−２のＦタンパク質をブロッキングする薬剤を提案する。
【００３８】
本発明者らはさらに、シンシチウムの過剰な形成、又は反対に不十分な形成を検出するための診断手段を提案する。
【００３９】
本発明者らはさらに、他の生物工学的手段、特に、シンシチウムの形成を減少させることができる活性成分をスクリーニングするための手段を提案する。
【００４０】
本発明者らはさらに、本発明の突然変異タンパク質を含む、癌細胞、より具体的には骨髄腫を提案する。本発明者らはさらに、本発明の突然変異タンパク質を含むハイブリドーマを提案する。本発明の癌細胞、より具体的には骨髄腫は、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)も、エレクトロポレーションも、他のいずれの融合誘導手段も用いることなく、別の細胞と、より具体的にはＢリンパ球と融合することができる。本発明の癌細胞、より具体的には骨髄腫は、自律的な融合能力を有する。
【００４１】
本発明のハイブリドーマは、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)も、エレクトロポレーションも、他のいずれの融合誘導手段も必要とせずに、（Ｂリンパ球の骨髄腫への)融合によって生産され得る。本発明のハイブリドーマは、本発明の少なくとも一つの癌細胞、より具体的には少なくとも一つの骨髄腫を用いることによって実際に生産され得る。
【００４２】
本発明者らはさらに、本発明の突然変異タンパク質を発現する組換え幹細胞又は前駆細胞、及び、筋繊維の生産におけるそれらの適用を提案する。
【００４３】
本発明の他の側面は、下記の「詳細な説明」の項において説明される。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
ファイルされた出願の図面セットは、カラーでファイルされた。これは、特許庁でファイルを閲覧することによりアクセスすることができる。
【図１Ａ】図１Ａ：PIV-5のＦタンパク質の基準配列 (配列番号31；WR単離体のＦタンパク質の配列) および対応するCDS配列 (配列番号30；配列番号31のタンパク質をコードする核酸配列)。配列番号31の配列において、ボールドで下線付きの文字は、以下の位置のアミノ酸を示す： - 22 (L)、 - 49 (I)、 - 132 (E、この単離体に予め存在する突然変異)、 - 147 (T)、 - 158 (T)、 - 290 (A、この単離体に予め存在する突然変異)、 - 402 (V)、 - 443 (P、この単離体に理論的に予め存在する突然変異)、 - 447 (L)、 - 449 (I)、および - 463 (A)。
【図１Ｂ】図１Ｂ：PIV-2のＦタンパク質の基準配列 (配列番号33；Greer単離体のＦタンパク質の配列) および対応するCDS配列 (配列番号32；配列番号33のタンパク質をコードする核酸配列)。配列番号33の配列において、ボールドで下線付きの文字は、以下の位置のアミノ酸を示す： - 24 (I)、 - 53 (I)、 - 133 (K)、 - 151 (T)、 - 162 (S)、 - 294 (I)、 - 406 (A)、 - 428 (S)、 - 439 (S)、 - 445 (I)、 - 474 (S)。
【図２Ａ】図２Ａ：PIV-2のＦタンパク質 (配列番号33のアミノ酸8〜533) に対するPIV-5のＦタンパク質 (配列番号31のアミノ酸4〜529) のアラインメント：これら2つのタンパク質の間で、タンパク質同一性は47.7%である。このアラインメントから得られるコンセンサス配列は、配列番号34として参照される。
【図２Ｂ】図２Ｂ：PIV-5のＦタンパク質のアミノ酸および突然変異に対応する、PIV-2のＦタンパク質のアミノ酸および突然変異。
【図３】図３：PIV-5のＦタンパク質の天然の切断サイト (配列番号23) の、組織特異的切断サイト、この場合、転移性腫瘍組織により特異的に発現される酵素、すなわちマトリクス金属プロテアーゼ9 (MMP-9) のサイトによる置換の図解。 MMP-9サイトのコンセンサスサイト：配列番号27の配列 (PXXhyS/Tサイト、ここで、X = 任意のアミノ酸、およびHy = 任意の疎水性アミノ酸、すなわちF、M、V、L、Iから選択される任意のアミノ酸)。 MMP-9サイトの例示的配列：配列番号28の配列、配列番号29の配列。
【図４】図４：PIV-5のＦタンパク質をコードする配列がクローニングされているプラスミドpcDNA3.1の構造。 Amp：アンピシリン耐性遺伝子 pCMV：サイトメガロウイルスプロモーター MCS：マルチプルクローニングサイト F PIV5：PIV-5のＦタンパク質 BGHpolyA：ウシ成長ホルモンpolyA。
【図５−１】図５Ａ、５Ｂ：PIV-5のＦタンパク質において本発明者らにより作成された突然変異の視覚化。
【図５−２】図５Ｃ、５Ｄ：PIV-5のＦタンパク質において本発明者らにより作成された突然変異の視覚化。
【図６Ａ】図６Ａ：半定量的融合テストの間に行われた顕微鏡観察の写真 (本発明者らにより作成された突然変異体の大きな一群)。
【図６Ｂ】図６Ｂ：半定量的融合テストの後に得られた融合スコアを示す図 (本発明者らにより作成された突然変異体の大きな一群)。
【図７】図７Ａ：半定量的融合テストの間に行われた顕微鏡観察の写真 (本発明者らにより作成された突然変異体の選択物)。 図７Ｂ：半定量的融合テストの後に得られた融合スコアを示す図 (本発明者らにより作成された突然変異体の選択物)。
【詳細な説明】
【００４５】
本出願において、「タンパク質」という用語は、「糖タンパク質」という用語をその範囲に包含する。これは特に、実際に糖タンパク質であるＦタンパク質及びＨＮタンパク質の場合である。
【００４６】
PIV-5及びPIV-2のＦタンパク質（非突然変異タンパク質）：
PIV-5のＦタンパク質の配列を図１Ａに示す（配列番号31のタンパク質配列；配列番号30のコーディング核酸配列）。これは、サル単離体であるＷＲ単離体の配列である。これらの配列は、ジーンバンク(Genbank)データベースから受入れ番号ＡＢ０２１９６２により入手可能なものである。
【００４７】
本発明者らがATCCから入手し、下記の実施例に記載した突然変異タンパク質の構築及び生産に用いたＷＲ単離体のサンプルは、しかしながら、Ｆタンパク質の443位において、（ジーンバンクから入手可能な配列の点から見て予想されるものとは対照的に）アミノ酸Ｐを有しておらず、アミノ酸Ｓを有している。従って、ＷＲ単離体のＦタンパク質の代替配列は、443位のアミノ酸がＳでありＰではないことを除いて、配列番号31の配列と同一である。簡略化のために、ここではこの代替配列を「443にＳを有する配列番号31」と記載する。
【００４８】
配列番号31の配列及び代替配列「443にＳを有する配列番号31」、好ましくは代替配列「443にＳを有する配列番号31」は、本特許出願の文脈においては、PIV-5のＦタンパク質の基準配列として作用する。
【００４９】
しかしながら、ＷＲ単離体以外の単離体、特に、
・例えばＷ３Ａ単離体などの他のサル単離体；
・他の非ヒト動物からの単離体、例えば、
○イヌ単離体、例えば、イヌ単離体ＣＰＩ＋、ＣＰＩ−、Ｈ２２１、７８５２４、Ｔｌ；
○ブタ単離体、例えば、ブタ単離体ＳＥＲ；
・ヒトから採取されたサンプルに由来するが、動物細胞で培養された（上記導入部分を参照）「ヒト」単離体と名付けられた単離体、例えば、ＭＩＬ単離体、ＤＥＮ単離体、ＬＮ単離体、ＭＥＬ単離体、及びWO 02 077211において「クリプトウイルス(cryptovirus)」と記載されている単離体
が明らかに存在する。
【００５０】
これらの種々のPIV-5単離体のＦタンパク質の配列における変異は極めてわずかである。
【００５１】
これらの変異の記述は、Chatziandreou et al,（2004）（その内容並びに特に表３及びこの論文中でそれに付随するコメントは、参照により本特許出願に組み込まれる）によって与えられる。
【００５２】
この論文の表３をここに再現する：
【表Ａ】
【表Ｂ】
【表Ｃ】
【表Ｄ】
【００５３】
上記の表１において、空欄は、関係するＦタンパク質が、左側のカラムに示されているＷ３Ａ株のＦタンパク質と同じアミノ酸を有することを示す。その位置がこの表に明記されていないアミノ酸ももちろん、Ｗ３ＡのＦタンパク質の配列中におけるそれらに対応するものと同じである。これらのアミノ酸自体は、ＷＲ単離体のＦタンパク質の配列中におけるそれらに対応するものと同じである（配列番号31の配列を参照）。
【００５４】
それ故、配列番号35〜46の配列は、これら配列の各々について、表１に示された配列番号31のアミノ酸の配列における置換（及び、適切な場合、示された配列番号31のアミノ酸の配列のＣ−末端部分における付加）により得られる配列である。
【００５５】
Ｗ３Ａ単離体のＦタンパク質、並びに上記の他の単離体のＦタンパク質は、
・147位における、アミノ酸Ｔ；
・158位における、アミノ酸Ｔ；
・447位における、アミノ酸Ｌ；及び
・449位における、アミノ酸Ｉ
を有する。
【００５６】
このように、Ｗ３Ａ及びＷＲ単離体は、他の単離体において529位を超えて伸長する細胞質伸長（cytoplasmic extension）を有していないことが分かる。関係する単離体に依存して、この細胞質伸長は、２から７のアミノ酸を含有する。
【００５７】
また、これらの単離体のＦタンパク質の配列は、ＷＲ株のＦタンパク質の配列と比較して５％未満（より具体的には、最大３％）だけ変化していることが分かる（細胞質伸長を考慮にいれない、即ち、このパーセンテージはＷＲのＦタンパク質の長さから算出される）；Chatziandreou et al.（2004）による論文の第85頁の終わりを参照されたい。
【００５８】
PIV-5のＦタンパク質は、従って、
・配列番号31の配列、又は前記代替配列「443にＳを有する配列番号31」；又は
・配列番号31の前記配列又は前記代替配列「443にＳを有する配列番号31」の変異配列であって、
○配列番号31の配列と同じサイズであるか、又は配列番号31の配列より最大で７アミノ酸だけ小さいサイズであるか、又は配列番号31の配列より最大で７アミノ酸だけ大きいサイズであり［前記代替配列「443にＳを有する配列番号31」は、配列番号31の配列と同じサイズである］、好ましくは配列番号31の配列と同じサイズを有し、又は配列番号31の配列より最大で７アミノ酸だけ大きいサイズを有し；及び
○配列番号31の配列又は前記代替配列「443にＳを有する配列番号31」に対して、95％を超える配列同一性、好ましくは少なくとも96％、より好ましくは少なくとも97％の配列同一性を有する（この同一性は、配列番号31の配列の長さ又は適切な場合には前記代替配列「443にＳを有する配列番号31」の配列の長さを用いて算出される)
として定義され得る変異配列
からなっていてもよい。
【００５９】
配列番号31のPIV-5のＦタンパク質の変異配列は、特に、上記の単離体Ｗ３Ａ、ＭＩＬ、ＤＥＮ、ＬＮ、ＭＥＬ、クリプトウイルス、ＣＰＩ＋、ＣＰＩ−、Ｈ２２１、７８５２４、Ｔｌ及びＳＥＲのＦタンパク質の配列を含む（上記表１及びChatziandreou et al,（2004）の論文を参照されたい）。
【００６０】
同様に、本願においてPIV-2 Ｆタンパク質のための基準として作用する配列は、図１Ｂに提示されたGreer株の配列である（配列番号33のタンパク質配列、配列番号32のコーディング核酸配列）。
【００６１】
例えばＶ９８、Ｖ９４ Toshiba 単離体などのGreer単離体以外のPIV-2 単離体が明らかに存在する。
【００６２】
これらの他のPIV-2単離体のＦタンパク質の配列は、Greer単離体のものと極めて近いが、単離体間の変異である幾つかの小さい変異を有する。
【００６３】
それ故、PIV-2 Ｆタンパク質は、
・配列番号33の配列；又は
・配列番号33の前記配列の変異配列であって、
○配列番号33の配列と同じサイズであるか、又は配列番号33の配列より最大で２アミノ酸だけ小さいサイズであるか、又は配列番号33の配列より最大で２アミノ酸だけ大きいサイズであり、好ましくは配列番号33の配列と同じサイズを有し、好ましくは配列番号33の配列とサイズが同じであり；及び
○配列番号33の配列に対して、95％を超える配列同一性、好ましくは少なくとも96％、より好ましくは少なくとも97％の配列同一性を有する（この同一性は、配列番号33の配列の長さを用いて算出される）
として定義され得る変異配列
からなっていてもよい。
【００６４】
PIV-5のＦタンパク質の配列(配列番号31)をPIV-2のもの(配列番号33)に対してアラインメントした結果のコンセンサス配列(配列番号34)は、以下の通りであり、図２Ａに見出される。このコンセンサス配列は、以下のように書き換えられる。
【化１】
【００６５】
シンボル「-」は、PIV-5のＦタンパク質とPIV-2のＦタンパク質がこの位置において異なるアミノ酸を有することを示す。
【００６６】
このコンセンサス配列は、以下のように形式化することもできる：
【化２】
【００６７】
PIV-5のＷＲ単離体のＦタンパク質の配列は、Ｎ−末端においてアミノ酸ＭＧＴにより先行される配列番号34の配列である（図１Ａ及び２Ａを参照）。
【００６８】
PIV-2のGreer単離体のＦタンパク質の配列は、Ｎ−末端においてアミノ酸ＭＨＨＬＨＰＭ（配列番号86）により先行され、Ｃ−末端においてアミノ酸ＥＮＰＡＦＦＳＫＮＮＨＧＮＩＹＧＩＳ（配列番号87）が続く配列番号34の配列である（図１Ｂ及び２Ａを参照）。
【００６９】
PIV-5及びPIV-2のＦタンパク質の配列は、配列番号34の配列を含む配列であり、好ましくは配列番号34の配列を含むＰＩＶウイルスのＦタンパク質の配列であると考えられ得る。より具体的には、PIV-5及びPIV-2のＦタンパク質の配列は、以下のように考えられ得る：
a) 配列番号34の配列であって、
・Ｎ−末端において3〜７のアミノ酸によって先行され、より具体的にはＮ−末端において３アミノ酸（例えばＭＧＴ）又は７アミノ酸（例えばＭＨＨＬＨＰＭ）によって先行され；及び
・任意に、Ｃ−末端において１８アミノ酸が続き、より具体的にはＣ−末端においてアミノ酸ＥＮＰＡＦＦＳＫＮＮＨＧＮＩＹＧＩＳが続く
配列；又は
b) 上記a）で記載された配列の変異配列であって、
・下記の何れか:
i. 配列番号31の配列と同じサイズを有するか、又は配列番号31の配列より最大で７アミノ酸だけ小さいサイズであるか、又は配列番号31の配列より最大で７アミノ酸だけ大きいサイズであり；好ましくは配列番号31の配列と同じサイズを有し、又は配列番号31の配列より最大で７アミノ酸だけ大きいサイズであり;及び
ii. 配列番号31の配列又は前記代替配列「443にＳを有する配列番号31」に対して、95％を超える配列同一性、好ましくは少なくとも96％、より好ましくは少なくとも97％の配列同一性を有する（この同一性は、配列番号31の配列の長さ又は適切な場合には前記代替配列「443にＳを有する配列番号31」の長さを用いて算出される）；
・又は
i. 配列番号33の配列と同じサイズを有するか、又は配列番号33の配列より最大で２アミノ酸だけ小さいサイズであるか、又は配列番号33の配列より最大で２アミノ酸だけ大きいサイズであるか、好ましくは配列番号33の配列と同じサイズを有し；及び
ii. 配列番号33の配列に対して、95％を超える配列同一性、好ましくは少なくとも96％、より好ましくは少なくとも97％の配列同一性を有する（この同一性は、配列番号33の配列の長さを用いて算出される）
である変異配列。
【００７０】
本発明の突然変異タンパク質：
本願は、突然変異タンパク質であって、そのアミノ酸配列が、
・置換：
○前記PIV-5 Ｆタンパク質の配列中の22位のアミノ酸、又は、前記PIV-2 Ｆタンパク質の配列中の24位のアミノ酸の、アミノ酸Ｐによる置換(PIV-5のＦにおける突然変異２２Ｐ；PIV-2のＦにおける突然変異２４Ｐ)；及び
○前記PIV-5 Ｆタンパク質の配列中の132位のアミノ酸、又は、前記PIV-2 Ｆタンパク質の配列中の133位のアミノ酸の、アミノ酸Ｅによる置換（PIV-5のＦにおける突然変異１３２Ｅ；PIV-2のＦにおける突然変異１３３Ｅ）；及び
○前記PIV-5 Ｆタンパク質の配列中の290位のアミノ酸、又は、前記PIV-2 Ｆタンパク質の配列中の294位のアミノ酸の、アミノ酸Ａによる置換（PIV-5のＦにおける突然変異２９０Ａ；PIV-2のＦにおける突然変異２９４Ａ）；及び
○前記PIV-5 Ｆタンパク質の配列中の447位のアミノ酸、又は、前記PIV-2 Ｆタンパク質の配列中の445位のアミノ酸の、アミノ酸Ｐによる置換（PIV-5のＦにおける突然変異４４７Ｐ；PIV-2のＦにおいける突然変異４４５Ｐ）；
・並びに、置換：
○前記PIV-5 Ｆタンパク質の配列中の147位のアミノ酸、又は、前記PIV-2 Ｆタンパク質の配列中の151位のアミノ酸の、Ｖ、Ｉ、Ｌから選択される疎水性アミノ酸、好ましくはＶによる置換（PIV-5のＦにおける突然変異１４７Ｈｙ；PIV-2のＦにおける突然変異１５１Ｈｙ）；及び/又は
○前記PIV-5 Ｆタンパク質の配列中の158位のアミノ酸、又は、前記PIV-2 Ｆタンパク質の配列中の162位のアミノ酸の、Ｖ、Ｉ、Ｌから選択される疎水性アミノ酸、好ましくはＶによる置換（PIV-5のＦにおける突然変異１５８Ｈｙ；PIV-2のＦにおける突然変異１６２Ｈｙ）；
・並びに、任意に：
○前記Ｆタンパク質の天然の（又は自然の）切断サイトの、別の酵素的切断サイトによる置換、及び／又は、前記Ｆタンパク質の天然の（又は自然の）切断サイト以外の酵素的切断サイトの、前記Ｆタンパク質への挿入；及び／又は
○前記Ｆタンパク質のＣ−末端部分であって、前記タンパク質のＣ−末端にある最後のアミノ酸からＮ−末端方向に伸張するが、前記Ｆタンパク質のＨＲ２ドメインを超えては伸張しないＣ−末端部分の欠失
によって、PIV-5又はPIV-2ウイルスのＦタンパク質の配列から導き出される（derivable）配列を含む突然変異タンパク質に関する。
【００７１】
前記アミノ酸の位置は、前記Ｆタンパク質の前駆体形態（Ｆ０）の配列（即ち、切断前のＦタンパク質の配列）に対して算出され、その位置はＮ−末端からＣ−末端へカウントされる。
【００７２】
PIV-2 Ｆタンパク質において示された位置は、PIV-5のＦタンパク質において示されたものと対応する位置である（位置の対応の表を示す図２Ｂを参照されたい）。
【００７３】
PIV-5又はPIV-2ウイルスの前記Ｆタンパク質の配列は、上記で定義されたとおりである。よって、それは、特に配列番号34の配列（PIV-5及びPIV-2のＦタンパク質のコンセンサス配列）を含むと定義され得る。
【００７４】
PIV-5 Ｆタンパク質の突然変異タンパク質：
本発明の一つの側面に従って、本発明の突然変異タンパク質は、下記のPIV-5ウイルスのＦタンパク質の配列から導き出される配列を含む：
・配列番号31の配列（図１Ａに示されたPIV-5のＷＲ単離体のＦタンパク質の配列）、又は前記代替配列「443にＳを有する配列番号31」の配列；又は
・配列番号31の前記配列又は前記代替配列「443にＳを有する配列番号31」の変異配列であって、
○配列番号31の配列と同じサイズであるか（即ち、529アミノ酸からなる)、又は配列番号31の配列より最大で７アミノ酸だけ大きいサイズであるか（即ち、530、531、532、533、534、535又は536アミノ酸からなる)、又は配列番号31の配列より最大で７アミノ酸だけ小さいサイズであり（即ち、522、523、524、525、526、527又は528アミノ酸からなる)；及び
○配列番号31の配列又は前記代替配列「443にＳを有する配列番号31」に対して、95％を超える配列同一性、好ましくは少なくとも96％、より好ましくは少なくとも97％の配列同一性を有し、この同一性は、配列番号31の配列の長さ又は（適切な場合には）前記代替配列「443にＳを有する配列番号31」の長さを用いて算出される、変異配列。
【００７５】
好ましくは、PIV-5の前記Ｆタンパク質の配列は、以下からなる：
・配列番号31の配列（図１Ａに示されたPIV-5のＷＲ単離体のＦタンパク質の配列）、又は前記代替配列「443にＳを有する配列番号31」の配列；又は
・配列番号31の前記配列又は前記代替配列「443にＳを有する配列番号31」の変異配列であって、
○配列番号31の配列と同じサイズであるか（即ち、529アミノ酸からなる)、又は配列番号31の配列より最大で７アミノ酸だけ大きいサイズである（即ち、530、531、532、533、534、535又は536アミノ酸からなる)；及び
○配列番号31の配列又は前記代替配列「443にＳを有する配列番号31」に対して、95％を超える配列同一性、好ましくは少なくとも96％、より好ましくは少なくとも97％の配列同一性を有し、この同一性は、配列番号31の配列の長さ又は適切な場合には前記代替配列「443にＳを有する配列番号31」の長さを用いて算出される、変異配列。
【００７６】
そのような変異配列の具体的な例は、本願の表１に示されているＷ３Ａ、ＭＩＬ、ＤＥＮ、ＬＮ、ＭＥＬ、クリプトウイルス、ＣＰＩ＋、ＣＰＩ−、Ｈ２２１、７８５２４、Ｔｌ及びＳＥＲの単離体の一つのＦタンパク質の配列（上記を参照）、即ち、配列番号35〜46の配列の一つを含む。
【００７７】
好ましくは、PIV-5の前記Ｆタンパク質の配列は、配列番号31の配列（図１Ａに示されたPIV-5のＷＲ単離体のＦタンパク質の配列）、又は、前記代替配列「443にＳを有する配列番号31」からなり、特に好ましくは、前記代替配列「443にＳを有する配列番号31」からなる。
【００７８】
好ましくは、PIV-5の前記Ｆタンパク質の配列から導き出される前記配列は、このＦタンパク質配列から、少なくとも上記の突然変異２２Ｐ、１３２Ｅ、２９０Ａ、４４７Ｐおよび１５８Ｈｙによって導き出される。
【００７９】
好ましくは、PIV-5の前記Ｆタンパク質の配列から導き出される前記配列は、このＦタンパク質配列から、少なくとも上記の突然変異２２Ｐ、１３２Ｅ、２９０Ａ、４４７Ｐおよび１４７Ｈｙによって導き出される。
【００８０】
好ましくは、PIV-5の前記Ｆタンパク質の配列から導き出される前記配列は、このＦタンパク質配列から、少なくとも上記の突然変異２２Ｐ、１３２Ｅ、２９０Ａ、４４７Ｐ、１４７Ｈｙおよび１５８Ｈｙによって導き出される。
【００８１】
PIV-5のＦタンパク質の配列から導き出される前記配列は、PIV-5の前記Ｆタンパク質配列に対して、上記の突然変異２２Ｐ、１３２Ｅ、２９０Ａ、４４７Ｐおよび１４７Ｈｙ/１５８Ｈｙ以外の突然変異を含まなくてもよい。
【００８２】
あるいは、PIV-5のＦタンパク質の配列から導き出される前記配列は、上記の突然変異２２Ｐ、１３２Ｅ、２９０Ａ、４４７Ｐおよび１４７Ｈｙ/１５８Ｈｙによって、及び、上記の突然変異２２Ｐ、１３２Ｅ、２９０Ａ、４４７Ｐ以外の少なくとも一つの突然変異によって、好ましくは、
・以下から選択される少なくとも一つの融合前（pre-fusion）突然変異：
○49位のアミノ酸のアミノ酸Ａによる置換；
○402位のアミノ酸のアミノ酸Ａによる置換；
○443位のアミノ酸のアミノ酸Ｐによる置換；
○449位のアミノ酸のアミノ酸Ｐによる置換；
及び／又は
・以下から選択される少なくとも一つの融合後（post-fusion）突然変異：
○463位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換
によって、このＦタンパク質配列から導き出され得る。
【００８３】
好ましくは、PIV-5の前記Ｆタンパク質の配列から導き出される前記配列は、上記の突然変異２２Ｐ、１３２Ｅ、２９０Ａ、４４７Ｐおよび１４７Ｈｙ/１５８Ｈｙによって、及び、
・以下から選択される少なくとも一つの融合前突然変異：
○49位のアミノ酸のアミノ酸Ａによる置換；
○402位のアミノ酸のアミノ酸Ａによる置換；
及び／又は
・以下から選択される少なくとも一つの融合後突然変異：
○463位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換
によって、このＦタンパク質配列から導き出される。
【００８４】
好ましくは、PIV-5の前記Ｆタンパク質の配列から導き出される前記配列は、上記の突然変異２２Ｐ、１３２Ｅ、２９０Ａ、４４７Ｐおよび１４７Ｈｙ/１５８Ｈｙによって、及び、
・以下から選択される少なくとも一つの融合後突然変異：
○463位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換
によって、このＦタンパク質配列から導き出される。
【００８５】
463位のアミノ酸を置換するために選択される前記疎水性アミノ酸は、有利にはＶ、Ｉ、Ｌから選択され、好ましくはＶである。
【表Ｅ】
【００８６】
表４に示した突然変異は、任意のPIV-5単離体、即ち、ＷＲ単離体又は変異単離体のＦタンパク質に導入され得る。より具体的には、それらは、図１Ａに示された配列番号31のＦタンパク質配列（ジーンバンクデータベースから受入れ番号AB021962で入手可能なＷＲのＦタンパク質）に導入され得る。
【００８７】
しかしながら、上記のように、本発明者らがATCCから受領し、下記の実施例に記載した突然変異タンパク質の構築及び生産に用いたＷＲ単離体のサンプルは、（ジーンバンクから入手可能な配列の点から見て予想されるものとは対照的に）Ｆタンパク質の443位にアミノ酸Ｐを有しておらず、アミノ酸Ｓを有していた。従って、表４に示した突然変異は、前記代替配列「443にＳを有する配列番号31」（配列番号62、63、64）に導入され得る。
【００８８】
PIV-2 Ｆタンパク質の突然変異タンパク質：
本発明の別の側面に従って、本発明の突然変異タンパク質は、PIV-2ウイルスのＦタンパク質の配列から導き出される配列を含む。
【００８９】
前記PIV-2 Ｆタンパク質の配列は、上記で定義されたとおりである。特にそれは、
・配列番号33の配列（図１Ｂに示したPIV-2のGreer単離体のＦタンパク質の配列）；又は
・配列番号33の配列の変異配列であって、
○配列番号33の配列と同じサイズであるか（即ち、551アミノ酸からなる)、又は配列番号33の配列より最大で２アミノ酸だけ大きいサイズであるか（即ち、552又は553アミノ酸からなる)、又は配列番号33の配列より最大で２アミノ酸だけ小さいサイズであり（即ち、549又は550アミノ酸からなる)；及び
○配列番号33の配列に対して、95％を超える配列同一性、好ましくは少なくとも96％、より好ましくは少なくとも97％の配列同一性を有し、この同一性は、配列番号33の配列の長さを用いて算出される、変異配列
からなっていてもよい。
【００９０】
好ましくは、PIV-2の前記Ｆタンパク質の配列は、
・配列番号33の配列（図１Ｂに示したPIV-2のGreer単離体のＦタンパク質の配列）；又は
・配列番号33の配列の変異配列であって、
○配列番号33の配列と同じサイズであるか（即ち、551アミノ酸からなる)、又は配列番号33の配列より最大で２アミノ酸だけ大きいサイズであり（即ち、552又は553アミノ酸からなる)；及び
○配列番号33の配列に対して、95％を超える配列同一性、好ましくは少なくとも96％、より好ましくは少なくとも97％の配列同一性を有し、この同一性は、配列番号33の配列の長さを用いて算出される、変異配列
からなる。
【００９１】
さらに好ましくは、PIV-2の前記Ｆタンパク質の配列は、
・配列番号33の配列（図１Ｂに示したPIV-2のGreer単離体のＦタンパク質の配列）；又は
・配列番号33の配列の変異配列であって、
○配列番号33の配列と同じサイズであり（即ち、551アミノ酸からなる)；及び
○配列番号33の配列に対して、95％を超える配列同一性、好ましくは少なくとも96％、より好ましくは少なくとも97％の配列同一性を有し、この同一性は、配列番号33の配列の長さを用いて算出される、変異配列
からなる。
【００９２】
特に好ましくは、前記Ｆタンパク質の配列は、配列番号33の配列（図１Ｂに示したPIV-2のGreer単離体のＦタンパク質の配列）からなる。
【００９３】
好ましくは、前記PIV-2のＦタンパク質の配列から導き出される前記配列は、このＦタンパク質配列から、少なくとも上記の突然変異２４Ｐ、１３３Ｅ、２９４Ａ、４４５Ｐおよび１６２Ｈｙによって導き出される。
【００９４】
好ましくは、PIV-2の前記Ｆタンパク質の配列から導き出される前記配列は、このＦタンパク質配列から、少なくとも上記の突然変異２４Ｐ、１３３Ｅ、２９４Ａ、４４５Ｐおよび１５１Ｈｙによって導き出される。
【００９５】
好ましくは、PIV-2の前記Ｆタンパク質の配列から導き出される前記配列は、このＦタンパク質配列から、少なくとも上記の突然変異２４Ｐ、１３３Ｅ、２９４Ａ、４４５Ｐ、１６２Ｈｙおよび１５１Ｈｙによって導き出される。
【００９６】
PIV-5のＦタンパク質の配列から導き出される前記配列は、PIV-2の前記Ｆタンパク質配列に対して、上記の突然変異２４Ｐ、１３３Ｅ、２９４Ａ、４４５Ｐおよび１５１Ｈｙ/１６２Ｈｙ以外の突然変異を含まなくてもよい。
【００９７】
あるいは、PIV-2のＦタンパク質の配列から導き出される前記配列は、上記の突然変異２４Ｐ、１３３Ｅ、２９４Ａ、４４５Ｐおよび１５１Ｈｙ/１６２Ｈｙによって、及び上記の突然変異２４Ｐ、１３３Ｅ、２９４Ａ、４４５Ｐ以外の少なくとも一つの突然変異によって、好ましくは、
・以下から選択される少なくとも一つの融合前突然変異：
○53位アミノ酸のアミノ酸Ａによる置換；
○406位のアミノ酸のアミノ酸Ａによる置換；
○428位のアミノ酸のアミノ酸Ｐによる置換；
○439位のアミノ酸のアミノ酸Ｐによる置換；
及び／又は
・以下から選択される少なくとも一つの融合後突然変異：
○474位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換
によって、このＦタンパク質配列から導き出され得る。
【００９８】
好ましくは、PIV-2の前記Ｆタンパク質の配列から導き出される前記配列は、上記の突然変異２４Ｐ、１３３Ｅ、２９４Ａ、４４５Ｐおよび１５１Ｈｙ/１６２Ｈｙによって、及び、
・以下から選択される少なくとも一つの融合前突然変異：
○53位アミノ酸のアミノ酸Ａによる置換；
○406位のアミノ酸のアミノ酸Ａによる置換；
及び／又は
・以下から選択される少なくとも一つの融合後突然変異：
○474位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換
によって、このＦタンパク質配列から導き出される。
【００９９】
好ましくは、PIV-2の前記Ｆタンパク質の配列から導き出される前記配列は、上記の突然変異２４Ｐ、１３３Ｅ、２９４Ａ、４４５Ｐおよび１５１Ｈｙ/１６２Ｈｙによって、および
・474位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換
から選択される少なくとも一つの融合後突然変異によって、このＦタンパク質配列から導き出される。
【０１００】
474位のアミノ酸置換において選択される前記疎水性アミノ酸は、有利にはＶ、Ｉ、Ｌから選択され、好ましくはＶである。
【表Ｆ】
【０１０１】
表５に示した突然変異は、任意のPIV-2単離体、即ち、Greer単離体又は変異単離体のＦタンパク質に導入され得る。よって、より具体的には、それらは、図１Ｂに示された配列番号33のＦタンパク質配列（GreerのＦタンパク質；配列番号88〜90）に導入され得る。
【表Ｇ】
【０１０２】
切断サイト：
本発明に従って、本発明の突然変異タンパク質は、
・上述の突然変異；および更に
・前記Ｆタンパク質の天然の切断サイトの、別の酵素的切断サイトによる置換、および/または前記Ｆタンパク質の天然の切断サイト以外の酵素的切断サイトの前記Ｆタンパク質への挿入、好ましくは、前記Ｆタンパク質の天然の切断サイトの、別の酵素的切断サイトによる置換
によって、PIV-5またはPIV-2ウイルスのＦタンパク質の配列から導き出される配列を含み得る。
【０１０３】
PIV-5またはPIV-2のＦタンパク質の切断サイトは、このＦタンパク質の2つのサブユニット（Ｆ１およびＦ２）の切断サイトである。
【０１０４】
PIV-5およびPIV-2のＦタンパク質の天然型において、この切断サイトは、フューリン（furines）により切断されるサイトである。
【０１０５】
PIV-5のＦタンパク質の天然型において、この切断サイトは、配列RRRRR (配列番号23) からなる。これは、PIV-5のＦタンパク質の天然型の98〜102位にある (図１Ａ参照)。PIV-5のＦタンパク質の天然（または自然）の切断サイトを含むPIV-5のＦタンパク質配列の断片の例は、以下のとおりである：
IGENLETIRNQLIPTRRRRRFAGVVIGL (配列番号24)。
【０１０６】
PIV-2のＦタンパク質の天然型において、切断サイトは、配列KTRQKR (配列番号25) からなる。これは、PIV-2のＦタンパク質の天然型の101〜106位にある (図１Ｂ参照)。PIV-2のＦタンパク質の天然（または自然）の切断サイトを含むPIV-2のＦタンパク質配列の断片の例は、LTPLIENLSKISTVTDTKTRQKRFAGVVVGLAALGVA (配列番号26) である。
【０１０７】
好ましくは、天然の切断サイト以外の前記切断サイトは、組織特異的切断サイトである。
【０１０８】
好ましくは、天然の切断サイト以外の前記切断サイトは、一または複数の腫瘍組織によって特異的に発現される酵素の切断サイトであり、更に好ましくは、一または複数の転移性組織によって酵素特異的に発現される酵素の切断サイトである。
【０１０９】
一例として、天然の切断サイト以外の前記切断サイトは、金属プロテアーゼの切断サイト、たとえばマトリクス金属プロテアーゼ9 (MMP-9) の切断部位であり得る；下記の例２を参照。
【０１１０】
マトリクス金属プロテアーゼ9 (MMP-9) の切断サイトは、配列PXXHy S/T (配列番号27)｛ここでＸ = 任意のアミノ酸、Ｈｙ = 任意の疎水性アミノ酸 (すなわち、Ｆ、Ｍ、Ｖ、Ｌ、Ｉから選択される任意のアミノ酸)｝を含んでいてもよいし、この配列からなっていてもよい。
【０１１１】
一例として、マトリクス金属プロテアーゼ9 (MMP-9) の切断サイトは、配列PRRIT (配列番号28) および/または配列
IGENLETIRNQLIPTPRRITFAGVVIGL (配列番号29)
を含んでいてもよいし、この配列からなっていてもよい。
【０１１２】
本発明の核酸：
また本出願は、本発明による突然変異タンパク質をコードする核酸、DNAまたはRNA (普遍的な遺伝暗号に従って、この遺伝暗号の縮重を許容する)、並びにかかる核酸の相補的核酸（同じ長さの完全に相補的な核酸）に関する。
【０１１３】
かかる核酸は、配列番号30の配列 (天然のPIV-5 Ｆタンパク質をコードする配列)、または前記代替配列“443にSを有する配列番号31”をコードする代替配列、または変異Ｆタンパク質をコードする変異配列、あるいは、配列番号32の配列 (天然のPIV-2 Ｆタンパク質をコードする配列)、または変異Ｆタンパク質をコードする変異配列から導き出される。
【０１１４】
本発明のベクター：
また本出願は、本発明による少なくとも一つの核酸を含む核酸ベクター、より具体的には、トランスフェクション、形質導入または形質転換ベクターに関する。
【０１１５】
有利には、かかるベクターは、発現ベクターであり得る。
【０１１６】
好ましくは、これは、動物細胞 (非ヒト動物細胞および/またはヒト細胞) において、より好ましくは、
・ヒト細胞、有利には病的なヒト細胞、より具体的にはヒト腫瘍細胞、より好ましくは転移性黒色腫細胞において；または
・胎盤細胞において、
前記少なくとも一つの核酸の発現を許容するベクターである。
【０１１７】
かかる発現ベクターは、有利には、アデノウイルスベクターであり得る。
【０１１８】
前記アデノウイルスベクターは、前記核酸の発現を調節するためのエレメント、好ましくはプロモーターを含んでいてもよく、腫瘍細胞、好ましくは転移性細胞、より好ましくは転移性黒色腫細胞において前記核酸の発現を許容する。
【０１１９】
好ましくは、この発現は特異的である。有利には、この発現は、非腫瘍 (または非転移性) 細胞において有意な発現は存在しないが、前記腫瘍細胞または転移性細胞において前記核酸の発現を許容するように十分に特異的である。
【０１２０】
有利には、かかるアデノウイルスベクターは、腫瘍崩壊性アデノウイルスベクターである。
【０１２１】
有利には、本発明の発現ベクターは、前記核酸の発現を調節するためのエレメント、好ましくはプロモーターを含み、胎盤細胞、好ましくは不十分な膜融合性 (fusogenicity) を有する病的な胎盤細胞において前記核酸の発現を許容する、アデノウイルスベクターであり得る。
【０１２２】
好ましくは、この発現は特異的である。有利には、この発現は、非胎盤細胞において有意な発現は存在しないが、前記胎盤細胞において前記核酸の発現を許容するように十分に特異的である。
【０１２３】
本発明のベクターは、択一的または補足的に、動物細胞 (非ヒト動物細胞および/またはヒト細胞)、より好ましくはヒト細胞、有利には病的なヒト細胞、より具体的にはヒト腫瘍細胞、好ましくは転移性ヒト細胞、より好ましくは転移性黒色腫細胞のゲノムへの、前記少なくとも一つの核酸の挿入を許容するベクターであり得る。かかるベクターは、より具体的には、腫瘍、具体的には転移性腫瘍、より具体的には転移性黒色腫の遺伝子治療のために向けられる。
【０１２４】
また本出願は、本発明の少なくとも一つの核酸を含み、動物細胞 (非ヒト動物細胞および/またはヒト細胞)、より好ましくはヒト細胞、有利には胎盤細胞、好ましくはヒトの胎盤細胞のゲノムへの、前記少なくとも一つの核酸の挿入を許容する、ベクターに関する。かかるベクターは、より具体的には、不完全な胎盤の発達を伴う疾病または状態の遺伝子治療のために向けられる。
【０１２５】
本発明の細胞：
また本出願は、本発明による少なくとも一つの突然変異タンパク質、および/または本発明による少なくとも一つの核酸、DNAまたはRNA、および/または本発明による少なくとも一つのベクターを含む細胞に関する。
【０１２６】
かかる細胞は、ヒト細胞または非ヒト動物細胞であり得る。
【０１２７】
好ましくは、かかる細胞は、腫瘍細胞、好ましくは転移性細胞、より好ましくは転移性黒色腫細胞である。
【０１２８】
かかる細胞は、後述されるとおり、シンシチウムの形成を誘導することができる膜融合 (fusogenic) 能力を備えた細胞としての適用を見出す。
【０１２９】
あるいは、本発明の細胞は、ヒトまたは非ヒト動物の免疫系の非腫瘍細胞、好ましくは非腫瘍性のヒトまたは非ヒト動物の樹状細胞であってもよく、前記細胞は、本発明による少なくとも一つの突然変異タンパク質をその表面で発現している。かかる細胞は、後述されるとおり、たとえば活性な免疫処置により、細胞融合阻害剤の産生を誘導することができる薬剤としての適用を見出す。
【０１３０】
医学的適用 (融合促進(pro-fusion))：
本発明の突然変異タンパク質、および/または本発明の核酸、DNAまたはRNA、および/または本発明のベクター、および/または本発明の細胞は、病的な細胞および/または生物の健康に好ましくない細胞の存在および/または増殖を伴う疾病または状態の治療および/または予防および/または緩和において、より具体的には、不十分な細胞の膜融合性 (cellular fusogenicity) を伴う疾病または状態の治療および/または予防および/または緩和において、好ましくは疾病または腫瘍形成状態、たとえば腫瘍、転移性腫瘍、有利には転移性黒色腫の治療および/または予防および/または緩和において使用され得る。
【０１３１】
かかる疾病または状態は、これらの病的な細胞および/または好ましくない細胞の低減または除去により、治療および/または予防および/または緩和され得る。
【０１３２】
かかる細胞の表面で発現される本発明の突然変異タンパク質は、これら細胞の融合を誘導し、その結果、シンシチウムの形成を誘導し、これら細胞の破壊（または少なくとも数の減少）につながる。
【０１３３】
本発明の突然変異タンパク質、および/または本発明の核酸、DNAまたはRNA、および/または本発明のベクター、および/または本発明の細胞は、胎盤の発達不全を伴う疾病または状態の治療および/または予防および/または緩和において使用され得る。
【０１３４】
かかる疾病または状態は、胎盤細胞の融合の誘導または刺激により、治療および/または予防および/または緩和され得る。
【０１３５】
よって、本出願はまた、本発明の少なくとも一つの突然変異タンパク質、および/または本発明の少なくとも一つの核酸、DNAまたはRNA、および/または本発明の少なくとも一つのベクター、および/または本発明の細胞を含む、薬学的組成物または薬に関する。
【０１３６】
かかる薬学的組成物またはかかる薬は、上述のような病的な細胞および/または生物の健康に好ましくない細胞の存在および/または増殖を伴う疾病または状態 (例として、腫瘍、転移性腫瘍、転移性黒色腫) の治療および/または予防および/または緩和、あるいは不十分な細胞の膜融合性 (cellular fusogenicity) を伴う疾病または状態 (例として、胎盤の発達不全) の治療および/または予防および/または緩和に向けられてもよい。
【０１３７】
かかる薬学的組成物またはかかる薬は、少なくとも一つの薬学的および/または生理学的に許容可能な賦形剤を更に含んでもよい。
【０１３８】
本発明の突然変異タンパク質 (または本発明の核酸、DNA、RNA、または発現ベクター) は、ヒト細胞または非ヒト動物細胞により発現されるように、好ましくはかかる細胞の表面で発現されるように使用され得る。
【０１３９】
この細胞は、病的な細胞、好ましくは腫瘍細胞、より好ましくは転移性細胞、より好ましくは転移性黒色腫細胞であってもよいし、非腫瘍細胞、たとえば健康な細胞であってもよい。
【０１４０】
より具体的には、ヒト患者または病気の非ヒト動物被検体から取り出された病的な細胞を、本発明の少なくとも一つの突然変異タンパク質、および/または本発明の少なくとも一つの核酸、DNAまたはRNA、および/または本発明の少なくとも一つの発現ベクターと、本発明の突然変異タンパク質を発現させるように接触させることにより、エクスビボで(ex vivo)(またはインビトロで) 処理してもよい。
【０１４１】
択一的または補足的に、患者または被検体の病的な細胞の近くに局在するが病的でない細胞を取り出して、当該処理を行ってもよい。
【０１４２】
このようにエクスビボで(またはインビトロで)処理された細胞は、その後、前記患者または被検体に再投与するように向けられてもよい。
【０１４３】
かかる細胞は、前記患者または被検体が冒されている病状、たとえば腫瘍、転移性腫瘍、転移性黒色腫の治療および/または予防および/または緩和のために有用である。
【０１４４】
あるいは、この細胞は、胎盤の細胞、より具体的には、不十分な膜融合性(fusogenicity)に罹患している胎盤の細胞であり得る。かかる細胞は、本発明の突然変異タンパク質をその表面で発現させることにより一旦処理されると、胎盤の発達不全の治療および/または予防および/または緩和に向けられてもよい。
【０１４５】
よって本出願は、より具体的には、疾病または腫瘍形成状態、好ましくは腫瘍、より好ましくは転移性腫瘍、更に好ましくは転移性黒色腫の治療および/または予防および/または緩和において使用するための、本発明による突然変異タンパク質、本発明による核酸、DNAまたはRNA、本発明によるベクター、本発明による細胞に関する。
【０１４６】
また本出願は、より具体的には、胎盤の発達不全の治療および/または予防および/または緩和において使用するための、本発明による突然変異タンパク質、本発明による核酸、DNAまたはRNA、本発明によるベクター、本発明による細胞に関する。
【０１４７】
本発明による融合阻害剤：
また本出願は、細胞融合を減少させるかまたは遮断する能力を有する生成物に関する。これら生成物は、本発明の一または複数の突然変異タンパク質の阻害剤である。
【０１４８】
かかる阻害剤は、過剰な細胞の膜融合性（cellular fusogenicity）を伴う疾病または状態の治療および/または予防および/または緩和において、好ましくはエンベロープに包まれたウイルスの感染（たとえばHIV、インフルエンザ、パラインフルエンザまたはラブドウイルスの感染）、アレルギー、自己免疫疾患または移植片拒絶の治療および/または予防および/または緩和において使用され得る。
【０１４９】
好ましくは、本発明による阻害剤は、以下のとおりである：
・本発明による突然変異タンパク質に対する抗体、またはかかる抗体のFabもしくはF(ab’)2断片；または
・本発明による少なくとも一つの突然変異タンパク質に、または本発明による核酸、DNA、RNAに、特異的に結合する核酸アプタマーまたはペプチドアプタマー；または
・本発明による少なくとも一つの突然変異タンパク質をその表面で発現する、組換え免疫系細胞、好ましくは組換え樹状細胞；または
・本発明による核酸のアンチセンス核酸；または
・19〜22のヌクレオチドを含有する二本鎖ＲＮＡを含み、かつ本発明による核酸に結合する（ハイブリダイズする）ことができる、低分子干渉（small interfering）RNA、siRNA。
【０１５０】
よって、本出願はまた、ヒトまたは非ヒト動物の免疫系の非腫瘍細胞、好ましくはヒトまたは非ヒト動物の樹状細胞であって、本発明による少なくとも一つの突然変異タンパク質をその表面で発現する細胞に関するとともに、過剰な細胞の膜融合性（cellular fusogenicity）を伴う疾病または状態の治療および/または予防および/または緩和における、好ましくはエンベロープに包まれたウイルスの感染（たとえばHIV、インフルエンザ、パラインフルエンザまたはラブドウイルスの感染）、アレルギー、自己免疫疾患または移植片拒絶の治療および/または予防および/または緩和における、この細胞の使用に関する。
【０１５１】
また本出願は、本発明による突然変異タンパク質または本発明の幾つかの突然変異タンパク質に対する抗体に関する。好ましくは、この抗体は、本発明の前記突然変異タンパク質に特異的な抗体である。有利には、この抗体はモノクローナル抗体である。本発明の阻害剤は、かかる抗体の保存された断片、たとえばFabまたはF(ab')2断片であり得る。
【０１５２】
かかる抗体または抗体断片は、たとえば、それを必要とする患者または被検体に前記抗体または抗体断片を投与することにより、細胞融合メカニズムを遮断または阻害するように向けられてもよい。
【０１５３】
択一的または補足的に、本発明の突然変異タンパク質は、このタンパク質に対して活性な免疫化を誘導するために、すなわち、前記患者または被検体による抗−突然変異タンパク質抗体の産生を誘導するために、前記患者または被検体にそれ自体投与するように向けられてもよい。必要な場合または所望の場合、一または複数のワクチンアジュバントが、前記突然変異タンパク質の一または複数と一緒に、または異なる時間で投与されてもよい。
【０１５４】
よって、本出願はまた、免疫原性剤としての本発明の少なくとも一つの突然変異タンパク質、および有利には少なくとも一つの免疫化アジュバントを含む、治療用および/または予防用および/または緩和用ワクチンに関する。かかるワクチンは、過剰な細胞の膜融合性（cellular fusogenicity）を伴う疾病または状態の治療および/または予防および/または緩和のため、好ましくは、エンベロープに包まれたウイルスの感染（たとえば、HIV、インフルエンザ、パラインフルエンザまたはラブドウイルスの感染）、アレルギー、自己免疫疾患または移植片拒絶の治療および/または予防および/または緩和のために向けられてもよい。
【０１５５】
また本出願は、以下のものに関する：
・本発明の少なくとも一つの突然変異タンパク質に、または本発明の核酸、DNA、RNAに、特異的に結合する核酸アプタマーまたはペプチドアプタマー；
・本発明の少なくとも一つの突然変異タンパク質をその表面で発現する、組換え免疫系細胞、好ましくは組換え樹状細胞；
・本発明の核酸のアンチセンス核酸；
・19〜22のヌクレオチドを含有する二本鎖ＲＮＡを含み、かつ本発明の核酸に結合する（ハイブリダイズする）ことができ、有利には前記核酸の転写を遮断または阻害することができる、低分子干渉（small interfering）RNA、siRNA。
【０１５６】
また、かかる生成物は、本発明の阻害剤でもある。よって、これらは、上述のような過剰な細胞の膜融合性（cellular fusogenicity）を伴う疾病または状態の治療および/または予防および/または緩和のために向けられてもよい。より具体的には、これらは、Ｆタンパク質の発現または過剰発現について少なくとも一つの遺伝子を伴う疾病または状態の治療および/または予防および/または緩和のために向けられる。
【０１５７】
よって、本出願はまた、本発明の少なくとも一つの阻害剤を含む薬学的組成物または薬に関する。
【０１５８】
かかる薬学的組成物または薬は、とりわけ、上述のような過剰な細胞の膜融合性（cellular fusogenicity）を伴う疾病または状態の治療および/または予防および/または緩和のために向けられてもよい。
【０１５９】
かかる薬学的組成物または薬は、少なくとも一つの薬学的および/または生理学的に許容可能な賦形剤を更に含んでもよい。
【０１６０】
本出願は、より具体的には、過剰な細胞の膜融合性（cellular fusogenicity）を伴う疾病または状態の治療および/または予防および/または緩和において使用するための本発明による阻害剤であって、前記疾病または状態が、エンベロープに包まれたウイルスの感染（好ましくは、HIVおよび/またはインフルエンザおよび/またはパラインフルエンザおよび/またはラブドウイルスの感染）、アレルギー、自己免疫疾患または移植片拒絶である阻害剤に関する。
【０１６１】
本出願は、より具体的には、過剰な細胞の膜融合性（cellular fusogenicity）を伴う疾病または状態の治療および/または予防および/または緩和において免疫原性剤として使用するための本発明による突然変異タンパク質であって、前記疾病または状態が、エンベロープに包まれたウイルスの感染（好ましくは、HIVおよび/またはインフルエンザおよび/またはパラインフルエンザおよび/またはラブドウイルスの感染）、アレルギー、自己免疫疾患または移植片拒絶である突然変異タンパク質に関する。
【０１６２】
本出願は、より具体的には、ワクチンまたはワクチン組成物、より具体的には、過剰な細胞の膜融合性（cellular fusogenicity）を伴う疾病または状態の治療および/または予防および/または緩和のために向けられたワクチンまたはワクチン組成物であって、前記疾病または状態が、エンベロープに包まれたウイルスの感染（好ましくは、HIVおよび/またはインフルエンザおよび/またはパラインフルエンザおよび/またはラブドウイルスの感染）、アレルギー、自己免疫疾患または移植片拒絶であるワクチンまたはワクチン組成物に関する。かかるワクチンまたはワクチン組成物は、少なくとも本発明による突然変異タンパク質を含み、少なくとも一つの生理学的に許容可能なアジュバントを任意に含む。
【０１６３】
診断および予後の適用：
また本出願は、
・不十分なシンシチウムの形成、たとえば、腫瘍、転移性腫瘍、転移性黒色腫または胎盤の発達不全；あるいは対照的に
・過剰なシンシチウムの形成、たとえば、エンベロープに包まれたウイルスの感染（好ましくは、HIVおよび/またはインフルエンザおよび/またはパラインフルエンザおよび/またはラブドウイルスの感染）、アレルギー、自己免疫疾患または移植片拒絶
を伴う疾病または状態の診断または予後のための方法、より具体的にはインビトロでの方法に関する。
【０１６４】
本発明の診断または予後の方法は、たとえば、診断または予後を受ける患者または被検体から採取された生物学的サンプルなどの生物学的サンプルにおいて、本発明による少なくとも一つの突然変異タンパク質または本発明による少なくとも一つの核酸を検出することを含む。
【０１６５】
この検出は、たとえば、前記サンプル中に含有されるタンパク質または核酸の配列を決定することにより行ってもよい。
【０１６６】
この検出は、たとえば、前記少なくとも一つの突然変異タンパク質に結合する抗体、ペプチドアプタマーまたはオリゴヌクレオチドアプタマーを用いて、より具体的には、本発明の抗体、ペプチドアプタマーまたはオリゴヌクレオチドアプタマーを用いて、本発明の前記少なくとも一つの突然変異タンパク質を検出することにより行ってもよい。
【０１６７】
この検出は、たとえば、前記少なくとも一つの核酸に結合する核酸、ペプチドアプタマーまたはオリゴヌクレオチドアプタマーを用いて、より具体的には、本発明の核酸に相補的な核酸、本発明のペプチドアプタマーまたはオリゴヌクレオチドアプタマーを用いて、本発明の前記少なくとも一つの核酸を検出することにより行ってもよい。
【０１６８】
また本出願は、不十分なシンシチウムの形成または対照的に過剰なシンシチウムの形成の診断または予後のための方法で使用するための、前記抗体、ペプチドアプタマー、オリゴヌクレオチドアプタマー、相補的な核酸に関する。
【０１６９】
生物工学的適用 (スクリーニング)：
また本出願は、シンシチウムの形成を減少させるかまたは遮断することができる化合物をスクリーニングするための方法、より具体的にはインビトロでの方法に関する。本発明の方法は、(たとえば、候補化合物の存在下で達成される融合度を、その非存在下で達成される融合度と比較することにより) 候補化合物が前記細胞の融合を減少させるかまたは遮断するかどうかを決定するために、候補化合物を、本発明の少なくとも一つの突然変異タンパク質を発現する細胞と接触させることを含む。
【０１７０】
かかる化合物は、過剰な細胞の膜融合性（cellular fusogenicity）を伴う疾病または状態、たとえば、エンベロープに包まれたウイルスの感染、アレルギー、自己免疫疾患または移植片拒絶の治療および/または予防および/または緩和のための有効成分候補である。
【０１７１】
生物工学的適用 (骨髄腫、ハイブリドーマ)：
また本出願は、本発明による少なくとも一つの突然変異タンパク質を含む、好ましくは少なくとも一つのかかる突然変異タンパク質をその表面に含む、および/または本発明による少なくとも一つの核酸を含む、および/または本発明による少なくとも一つのベクター、より具体的には本発明による発現ベクターを含む、腫瘍細胞、より具体的には骨髄腫に関する。
【０１７２】
かかる腫瘍細胞、より具体的にはかかる骨髄腫は、とりわけ、(この腫瘍細胞とBリンパ球との融合による)ハイブリドーマの産生、より具体的には抗体産生ハイブリドーマの産生に使用され得る。
【０１７３】
また本出願は、本発明による少なくとも一つの突然変異タンパク質、および/または本発明による少なくとも一つの核酸、および/または本発明による少なくとも一つのベクターを含む、ハイブリドーマ、より具体的には抗体産生ハイブリドーマに関する。かかるハイブリドーマは、とりわけ、本発明による少なくとも一つの突然変異タンパク質を含む、好ましくは少なくとも一つのかかる突然変異タンパク質をその表面に含む、および/または本発明による少なくとも一つの核酸を含む、および/または本発明による少なくとも一つのベクターを含む、少なくとも一つの腫瘍細胞、より具体的には骨髄腫と、少なくとも一つのBリンパ球を接触させることにより産生され得る。かかる腫瘍細胞は、固有の膜融合 (fusogenic) 能力を有する：よって、かかる腫瘍細胞は、従来技術においてハイブリドーマの産生を目的として腫瘍細胞とBリンパ球との融合を誘導するために慣用的に使用されるポリエチレングリコール(PEG)またはエレクトロポレーション法または任意の他の方法を使用することなく、前記少なくとも一つのBリンパ球と融合することができる。
【０１７４】
生物工学的適用 (幹細胞または前駆細胞)：
また本出願は、本発明による少なくとも一つの突然変異タンパク質を含む、好ましくは少なくとも一つのかかる突然変異タンパク質をその表面に含む、および/または本発明による少なくとも一つの核酸を含む、および/または本発明による少なくとも一つのベクター、より具体的には本発明による発現ベクターを含む、幹細胞または前駆細胞に関する。
【０１７５】
かかる幹細胞または前駆細胞は、固有の膜融合 (fusogenic) 能力を有する：よって、かかる幹細胞または前駆細胞は、融合によりシンシチウムを形成することができる。
【０１７６】
この幹細胞または前駆細胞が、筋細胞への分化能力を有している場合、(細胞の融合およびシンシチウムの形成により) 筋繊維を形成することができる。
【０１７７】
よって、本出願はまた、筋繊維の産生、たとえばインビトロでの産生において使用するための、かかる幹細胞または前駆細胞に関する。
【０１７８】
この産生は、たとえば、複数の前記幹細胞または前駆細胞を、互いに接触させて、幹細胞、または適切な場合には前駆細胞の増殖を許容する培地上または培地中に置くことにより行ってもよく、その結果、前記幹細胞または前駆細胞の膜融合(fusogenic)能力が発揮され、これによりシンシチウム、より具体的には筋繊維の形成を誘導することができる。幹細胞、または適切な場合には前駆細胞の増殖を許容し、かつ筋細胞、より具体的には筋繊維への可能な分化能力の発現に適している培地の例は、当業者に公知であり；一例は、MCDB培地である。
【０１７９】
幹細胞または前駆細胞の、筋細胞、より具体的には筋繊維への分化を観察することを許容する細胞マーカーの例は、当業者に公知であり、たとえばCD56である。
【０１８０】
本出願において、“含む(comprising)”の用語は、“包含する(including)”または“含有する(containing)”と同義であり、明示的に指摘されない一または複数の追加のエレメント、成分または工程の存在を除外しないオープンな用語であり、一方、“からなる(consisting)”または“構成される(constituted)”の用語は、明示的に開示されない任意の他の追加のエレメント、工程または成分の存在を除外するクローズした用語である。“から本質的になる(essentially consisting of)”または“により本質的に構成される(essentially constituted by)”の用語は、追加のエレメント、成分または工程が、発明に基づいて特徴に重大な影響を及ぼさない限り、一または複数の追加のエレメント、成分または工程の存在を除外しない部分的にオープンな用語である。
【０１８１】
その結果、“含む(comprising)”(または“comprise(s)”)の用語は、“からなる(consisting of)”、“により構成される（constituted by）”の用語、並びに“から本質的になる(essentially consisting of)”および“により本質的に構成される(essentially constituted by)”の用語を包含する。
【０１８２】
本出願で引用される文献および参照文献の内容は、参照により組み込まれる。
【０１８３】
以下の実施例は、例示のために純粋に記載され、本発明を何ら限定するものではない。
【実施例】
【０１８４】
例１：突然変異体の構築およびそれらの膜融合性（fusogenicity）の測定
材料および方法および：
細胞およびウイルス
細胞株LLC-MK2 (Macaca mulatta腎臓細胞株) は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション (American Type Culture Collection (ATCC)) から受入れ番号CCL-7で入手可能である。
【０１８５】
細胞株A549 (ヒト肺癌細胞株) は、ATCCから受入れ番号CCL-185で入手可能である。
【０１８６】
組換え株HuH7-Tat (ヒト肝癌細胞株) は、HIV-1 TatによるHuH-7株の細胞の形質導入により入手可能である。
【０１８７】
HuH-7株は、ジャパニーズ・コレクション・オブ・リサーチ・バイオリソース（Japanese Collection of Research Bioresources）からリファレンス番号JCRB0403で入手可能である。
【０１８８】
HIV-TatによるHuH-7株の形質導入は、レトロウイルスベクターLXSN-tatを用いて行い、Tatプラスミドを形質導入した。
【０１８９】
細胞LLC-MK2、A549およびHuH7-Tatは、5%ウシ胎仔血清を含むEMEM (イーグル最小必須培地) またはDMEM (ダルベッコ/フォークト改変イーグル最小必須培地) で培養した。
【０１９０】
PIV-5 WR株は、ATCC (ATCC番号VR-288) から入手し、Terrier et al, 2008に記載されるとおりLLC-MK2細胞上で培養した。
【０１９１】
RNAの抽出、RT-PCRおよびクローニング
ウイルスRNAは、PIV-5によるLLC-MK2細胞の感染から得られた上清から、Absolutely RNA(登録商標) Microprep Kit (Stratagene, USA) を用いて、供給業者により提供される説明書に従って抽出した。逆転写は、pd(N)6ランダムヘキサマー (Amersham Biosciences, GB) および鳥類骨髄芽球症ウイルスAMVの逆転写酵素 (Reverse Transcriptase; RT) (Promega から入手可能なAMV-RT逆転写酵素) を用いて行った。
【０１９２】
PIV-5 Ｆの全配列の増幅は、データベースから入手可能なPIV-5のヌクレオチド配列 (GenBank受入れ番号AB021962) から設計されたプライマー対を用いて行った。
【０１９３】
使用されたプライマー対は、以下のとおりであった：
センスプライマー (配列番号 1)：
5' TTGCGGCCGCATGGGTACTATAA 3'
アンチセンスプライマー (配列番号 2)：
5' CCGCTCGAGTTATGATAAACAAAATTCTCC 3'。
【０１９４】
増幅は、以下のプロトコールに従って行った：95℃で2 min、その後39サイクル (95℃/30s、55℃/1 min、72℃/3 min)、および72℃で10 minの最後の伸長。
【０１９５】
PIV-5 Ｆの相補的DNAは、マルチプルクローニングサイトにあるNotIおよびXhoIサイトで、発現プラスミドpcDNA3.1(+) にクローニングした (図４参照)。
【０１９６】
PCR産物およびプラスミドは、それぞれ、Nucleospin(登録商標) ExtractIIキットおよびNucleospin(登録商標) プラスミドキット (Macherey Nagel, Germany) を用いて、供給業者により提供される説明書に従って精製した。
【０１９７】
この研究における配列決定のシリーズは、MWG Biotech (Ebersberg, Germany) により実行した。
【０１９８】
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いた指定突然変異誘発
PIV-5のＦタンパク質の突然変異タンパク質は、PIV-5 Ｆ融合タンパク質をコードするプラスミドpcDNA3.1において、指定突然変異により産生した。突然変異は、供給業者により提供されるプロトコール (Stratageneから入手可能なQuickChange(登録商標) Site-Directed Mutagenesis System) に従って、相補的プライマーを用いたPCRにより作成した。使用されたプライマーのリストは、下記表２に示す。プラスミドのアセンブリは、配列決定により確認した。
【表Ｈ】
【表Ｉ】
【０１９９】
突然変異443Pは、理論的には、WR単離体のＦタンパク質に予め存在する。しかし、発明者らがATCCから受領したこの単離体のサンプルに、この突然変異は実際に存在しなかった。このため、発明者らはそれを導入しなければならなかった。
【０２００】
細胞のトランスフェクション
試薬ExGen500 (Fermentas) を用いて、供給業者により提供される説明書に従って、細胞をプラスミドによりトランスフェクトした。1〜3マイクログラムのプラスミドDNAを、48hの間、細胞 (70〜80% コンフルエンス) に添加した。トランスフェクションの効率は、緑色蛍光タンパク質GFPをコードするプラスミドを用いて評価した。
【０２０１】
共焦点顕微鏡による免疫蛍光法
トランスフェクトされた細胞は、リン酸緩衝生理食塩水PBS中のパラホルムアルデヒド (1% v/v) を用いて固定し、その後、2回洗浄した。PBSで1/10に希釈された、PIV-5 Ｆタンパク質に対するモノクローナル抗体の存在下で、この場合、Randall et al, 1987に記載されるモノクローナル抗体F1aの存在下で、細胞マットを3hの間インキュベートした。モノクローナル抗体F1aは、PIV-5の単離体 (この場合、LN単離体) に対するマウスの免疫処置、ハイブリドーマの調製、および特異的な抗Ｆ抗体の選択により得た。
【０２０２】
その後、細胞マットを洗浄し、PBSで1/200に希釈された抗マウスIgG-Alexa Fluor(登録商標) 633二次抗体 (Invitrogen) とともに30分間インキュベートした。細胞を、すすいだ後、1/1000のDapi (4',6'-ジアミジノ-2-フェニルインドール) とともに、リン酸緩衝生理食塩水PBS中1/200の、Alexa Fluor(登録商標) 488に結合した小麦胚凝集素 (WGA) (Invitrogenから入手可能なWGA-Alexa Fluor(登録商標)) と混合するか、または混合せずに、10分間インキュベートした。TCS SP2共焦点顕微鏡 (Leica) を用いて、画像を取得した。
【０２０３】
フローサイトメトリー
フローサイトメトリーは、文献 (Horvat and Lamb 1992) に記載されるとおり行った。A549細胞を、種々のFusをコードするプラスミドによりトランスフェクトし、氷上に置いた。細胞マットを、1 %のアジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水PBSですすいだ。その後、そのマットに、抗PIV-5 Ｆタンパク質モノクローナル抗体 (この場合、モノクローナル抗体F1a) を添加し (1% ウシ胎仔血清を含む1/500 PBSリン酸緩衝液)、4℃で30分間インキュベートした。その後、そのマットをすすぎ、1/1000のAlexa Fluor(登録商標) 488 に結合した抗マウス二次抗体 (Invitrogen) の存在下でインキュベートした。細胞を、すすいだ後、500μLのPBSリン酸緩衝液、EDTA (エチレンジアミンジアミン四酢酸) 中0.5mMを用いて穏やかに引き離した。細胞を、500μLの1 %パラホルムアルデヒド溶液を含有する専用のフローサイトメトリー管に移した。5000細胞の蛍光強度を、蛍光活性化細胞ソーティングFACSを用いて、この場合、Becton DickinsonからのFACSVantageTM SEフローを用いて測定した。
【０２０４】
半定量的融合テスト (シンシチウムのサイズおよび核の数の関数として確立した融合スコア)
種々のFus発現プラスミドによりトランスフェクトし、免疫蛍光法で観察したマットに、半定量的分析を行った。この分析は、以下の基準を用いて突然変異体の各々について融合スコアを決定することから構成される：
・融合または融合なし (単純な集合)、-/+で表示;
・シンシチウムのサイズ、1〜5のスケールで表示;
・核の数、1〜5のスケールで表示。
【０２０５】
これにより計算されるスコアを、2つの点数を足すことにより得た：このため、最大の理論的点数は、10であり、最大数の核をもつ最大サイズのシンシチウムに相当する。
【０２０６】
定量的融合テスト (ルシフェラーゼ活性の測定)
細胞−細胞融合を定量するために、“ドナー”A549細胞 (6ウェルプレートのウェルあたり2.5百万の細胞) を、種々のFus突然変異タンパク質をコードする2μgのプラスミドpcDNA3.1、並びに長い末端反復配列LTRに依存してルシフェラーゼを発現する50 ngのプラスミドで、同時トランスフェクトした (Lavillette et al, 2007)。
【０２０７】
ネガティブコントロールは、2μgの空のプラスミドpcDNA3.1で同時トランスフェクトした細胞により提供した。
【０２０８】
トランスフェクションから12時間後、“ドナー”細胞を、リン酸緩衝液 (PBS)、EDTA中0.5 mMを用いて引き離し、カウントした後に、新たな6ウェルプレート(105細胞/ウェル)に置き換えた。“インジケーター”HuH7-Tat細胞 (4 × 105細胞/ウェル) を、PBS-EDTA緩衝液を用いて引き離し、その後、すすいで“ドナー”細胞に添加した。
【０２０９】
ルシフェラーゼ活性は、共培養 (co-culture) の72時間後に、ルシフェラーゼ活性測定キットを用いて、この場合、PromegaからのLuciferase Assay System (E1500) キットを用いて、供給業者により提供される指示書に従って測定した。
【０２１０】
結果：
本発明者らにより構築され産生された突然変異タンパク質は、上記表３に示される。
【０２１１】
この表３において、本発明者らは、種々の突然変異を、それらが属する機能に従ってまとめた。すなわち、
・HNに対する自律性の機能への関与： PIV-5のＦタンパク質の22、132および290位；
・融合前の機能への関与：PIV-5のＦタンパク質の49、402、443、447および449位；
・融合後の機能への関与：PIV-5のＦタンパク質の147、158および463位。
【０２１２】
図５Ａ、５Ｂ、５Ｃおよび５Ｄは、表３の突然変異の位置を図示する。
【０２１３】
このように、本発明者らは、突然変異タンパク質を構築し、産生し、試験した。
【表Ｊ】
【表Ｋ】
【表Ｌ】
【表Ｍ】
【表Ｎ】
【表Ｏ】
【表Ｐ】
【０２１４】
これら突然変異タンパク質の構築および産生の間に使用されたPIV-5のＦタンパク質配列は、WR単離体の代替Ｆタンパク質配列であった。この代替配列は、443位のアミノ酸がPでなくSであることを除いて、配列番号31の配列 (Genbank配列) と同じであった (代替配列“443にSを有する配列番号31”)。
【０２１５】
このため、配列番号47〜79の配列は、前述の代替配列“443にSを有する配列番号31”内におけるアミノ酸の置換から得られる配列であり、このアミノ酸の置換は、上記表３に、これら配列の各々について示される。
【０２１６】
半定量的融合テストの間に顕微鏡下で行われた観察の写真を、図６Ａに示す。
【０２１７】
半定量的融合テストの最後に得られたスコアを、図６Ｂに示す。
【０２１８】
突然変異タンパク質Fus 6、Fus 6.1、Fus 6.2およびFus 6.3は、多くの細胞の凝集という結果につながったが、細胞融合という結果につながらなかった。
【０２１９】
突然変異タンパク質Fus 3.3、Fus 3.1、Fus 2、Fus 1.1、Fus 1.2およびFus 1は、ゼロの融合スコアを得た。
【０２２０】
突然変異タンパク質Fus 9、Fus 7、Fus 3、Fus 5およびFus 4は、低い融合スコアを得た。
【０２２１】
Fus 4の融合スコアを超えて、有意な融合スコアを有する一連の突然変異タンパク質が分離した。すなわち、
・自律性の3つの突然変異および融合前の突然変異449Pを共通に含む突然変異タンパク質のグループ、たとえば、突然変異タンパク質Fus8、Fus10、Fus10.4、Fus10.5、Fus11、Fus8.l、Fus8.2、Fus8.4、Fus8.5、Fus8.6、Fus8.7、Fus10.l、Fus10.2、Fus10.3；および
・自律性の3つの突然変異、融合前の突然変異447P、および少なくとも一つの融合後の突然変異 (147Vまたは158V) を共通に含む突然変異タンパク質のグループ、たとえば、Fus7.1、Fus7.2またはFus7.3。
【０２２２】
図７Ａおよび７Ｂは、テストされた突然変異タンパク質の選択物について、顕微鏡観察の写真を示し、融合スコアを示す。すなわち、
・自律性の3つの突然変異；
・融合前の突然変異447P；および
・147および/または158位における少なくとも一つの融合後の突然変異であって、この/これらの位置に疎水性アミノ酸、たとえばV、IまたはLを提示する突然変異、たとえば融合後の突然変異147Vおよび/または融合後の突然変異158V
を共通に含む突然変異タンパク質のグループ、たとえば突然変異タンパク質Fus7.1、Fus7.2およびFus7.3。
【０２２３】
例２：転移性腫瘍組織により特異的に発現される酵素のサイトによる天然の切断サイトの置換
本発明の突然変異タンパク質、およびとりわけ上記表１に記載されるものは、天然のＦタンパク質の天然の切断サイトの置換により、たとえば、それを組織特異的な切断サイトで置換することにより、予め改変された。
【０２２４】
例として、PIV-5のＦタンパク質の天然の切断サイトは、転移性腫瘍組織により特異的に発現される酵素、すなわちマトリクス金属プロテアーゼ9 (MMP-9) のサイトにより置換された。
【０２２５】
PIV-5のＦタンパク質の天然の切断サイトは、以下のとおりである：
RRRRR (配列番号 23)。
【０２２６】
PIV-5のＦタンパク質の天然の切断サイトを含むＦタンパク質配列の断片の例は、以下のとおりである：
IGENLETIRNQLIPTRRRRRFAGVVIGL (配列番号 24)。
【０２２７】
MMP-9切断サイトのコンセンサス配列は、以下のとおりである：
PXXHyS/T (配列番号 27)
ここでX = 任意のアミノ酸、および
ここでHy = 任意の疎水性アミノ酸 (すなわち、F、M、V、L、Iから選択される任意のアミノ酸)。
【０２２８】
MMP-9切断サイトの例は、以下のとおりである：
PRRIT (配列番号 28)。
【０２２９】
MMP-9切断サイトを含む本発明の突然変異Ｆタンパク質配列の断片の例は、以下のとおりである：
IGENLETIRNQLIPTPRRITFAGVVIGL (配列番号 29)。
【０２３０】
材料および方法：
PIV-5のＦタンパク質の突然変異タンパク質は、上記例１に記載されるとおり産生した。
【０２３１】
選択された切断サイト、この場合、配列番号28のMMP-9切断サイトによる天然の切断サイトの置換は、以下のとおり行った：
切断サイトの置換は、融合タンパク質Ｆ PIV-5をコードするプラスミドpcDNA3.1において、3つの連続的な指定突然変異誘発により行った。突然変異は、供給業者により提供されるプロトコール (Stratageneから入手可能なQuickChange(登録商標) Site-Directed Mutagenesis System) に従って、相補的プライマーを用いたPCRにより作成した。プラスミドのアセンブリは、配列決定により確認した。
【０２３２】
1st 突然変異 R98P
センス 5' CCAGTTGATTCCAACTCCGAGGAGACGCCGGTTTGC 3' (配列番号80)
アンチセンス 5' GCAAACCGGCGTCTCCTCGGAGTTGGAATCAACTGG 3' (配列番号81)
2nd 突然変異 R101I
センス 5 ' GATTCCAACTCCGAGGAGAATCCGGTTTGCAGGAGTGGTG 3 ' (配列番号82)
アンチセンス 5 ' CACCACTCCTGCAAACCGGATTCTCCTCGGAGTTGGAATC 3' (配列番号83)
3rd 突然変異 R102T
センス 5' GATTCCAACTCCGAGGAGAATCACGTTTGCAGGAGTGGTGATTGG 3' (配列番号84)
アンチセンス 5' CCAATCACCACTCCTGCAAACGTGATTCTCCTCGGAGTTGGAATC 3' (配列番号85)。
【０２３３】
細胞のトランスフェクション
試薬ExGen500 (Fermentas) を用いて、供給業者により提供される説明書に従って、細胞をプラスミドによりトランスフェクトした。1〜3マイクログラムのプラスミドDNAを、48hの間、細胞 (70〜80% コンフルエンス) に添加した。トランスフェクションの効率は、緑色蛍光タンパク質GFPをコードするプラスミドを用いて評価した。
【０２３４】
共焦点顕微鏡による免疫蛍光法
トランスフェクトされた細胞は、リン酸緩衝生理食塩水PBS中のパラホルムアルデヒド (1% v/v) を用いて固定し、その後、2回洗浄した。PBSで1/10に希釈された、融合タンパク質PIV-5 Ｆに対するモノクローナル抗体の存在下で、この場合、Randall et al, 1987に記載されるモノクローナル抗体F1aの存在下で、細胞マットを3hの間インキュベートした。モノクローナル抗体F1aは、PIV-5の単離体 (この場合、LN単離体) に対するマウスの免疫処置、ハイブリドーマの調製、および特異的な抗Ｆ抗体の選択により得た。
【０２３５】
その後、細胞マットを洗浄し、PBSで1/200に希釈された抗マウスIgG-Alexa Fluor(登録商標) 633二次抗体 (Invitrogen) とともに30分間インキュベートした。細胞を、すすいだ後、1/1000のDapi (4',6'-ジアミジノ-2-フェニルインドール) とともに、リン酸緩衝生理食塩水PBS中1/200の、Alexa Fluor(登録商標) 488に結合した小麦胚凝集素 (WGA) (Invitrogenから入手可能なWGA-Alexa Fluor(登録商標)) と混合するか、または混合せずに、10分間インキュベートした。TCS SP2共焦点顕微鏡 (Leica) を用いて、画像を取得した。
【０２３６】
参照文献
Baker et al, 1999, Mol Cell. 3(3):309-19.
Chatziandreou et al, 2004, Journal of General Virology 85: 3007-3016.
Horvat and Lamb 1992, J. Virol. 66(4): 2443-2455.
Ito et al 1997, J Virol. 71(12): 9855-9858.
Ito et al, 2000, J Gen Virol. 81(Pt 3):719-727.
Gardner and Dutch 2007, J. Virol. 81(15):8303-14.
Gardner et al, 2007, Biochemistry 46(17):5094-5105.
Lavillette D. et al, 2007, J. Virol. 81(16): 8752-8765
Paterson et al, 2000, Virology 270(l):17-30.
Randall et al, 1987, J . Gen. Virol. 68(Pt 1l): 2769-2780
Russell et al, 2003, J. Cell Biol. 163(2):363-74.
Terrier et al, 2008, Journal of Clinical Virology, 2008, 43(1): 86-92.
West et al, 2005, J Virol. 79(3):1543-1551.
【技術分野】
【０００１】
本願は、現在、５型PIV（PIV-5又はPIV5）及び２型PIV（PIV-2又はPIV2）として表示されているパラインフルエンザウイルス（PIV）の融合タンパク質（Ｆタンパク質）の突然変異タンパク質に関する。
【０００２】
本願は、それらに由来する生成物、たとえば：
・核酸、ベクター、細胞；
・抗体、アプタマー、干渉ＲＮＡタイプの融合阻害剤；
・骨髄腫、ハイブリドーマ；
・幹細胞及び前駆細胞
に関する。
【０００３】
本願はまた、医学的及び生物工学的な適用において使用するための、これらの突然変異タンパク質及びそれらに由来する生成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
現在、５型PIV（PIV-5又はPIV5）として表示されているパラインフルエンザウイルス（PIV）は、パラミクソウイルス科のルブラウイルス属のエンベロープに包まれたウイルスである。PIV-5は、最初にサル細胞の初代培養物から単離されたため、従来はSV5（シミアンウイルス５）という名で知られていた。しかしながら、PIV-5の自然なホストはイヌであると思われ、イヌにおいてケンネルコフとして知られる咳を引き起こす。
【０００５】
その後に、幾つかのPIV-5単離体が、ヒトから収集されたが動物細胞で培養されたサンプルから得られた。さらに、ヒトにおいては、何の症状又は疾病もPIV-5に付随しなかった。このように、ヒトが実際にPIV-5のホストであるかどうかという問題は今なお熱く討論されている。
【０００６】
何れにせよ、PIV-5ウイルスは現在、動物ウイルスであると考えられている。
【０００７】
２型PIV（PIV-2又はPIV2）として現在表示されているパラインフルエンザウイルス（PIV）もまた、パラミクソウイルス科のルブラウイルス属のエンベロープに包まれたウイルスである。
【０００８】
現在、PIV-2のヒト単離体のみが同定されており（hPIV-2）、そのため、PIV-2はヒトウイルスであると考えられている。
【０００９】
PIV-5及びPIV-2ウイルスは、核酸配列、タンパク質配列、組織、構造及び形態の点から互いに極めて類似している。
【００１０】
ヒトパラインフルエンザウイルスのなかで、PIV-2は、ヒトにおいて発見されたPIV-5に最も近いウイルスである。
【００１１】
PIV-2は、PIV-5のヒト同等物であると考えることができ、少なくとも本発明者らによってそのように考えられている。
【００１２】
PIV-5又はPIV-2による感染は、シンシチウムとして知られる多核性構造体の形成を導き、これは、感染したホスト由来の細胞が融合した結果である。
【００１３】
PIV-5及びPIV-2ウイルスは、ウイルスエンベロープと細胞膜との融合によってホスト細胞へ入る。
【００１４】
この融合は、赤血球凝集素ノイラミニダーゼ結合タンパク質（ＨＮ）及び融合タンパク質（Ｆ）の二つのウイルス糖タンパク質を関与させる。
【００１５】
PIV-5及びPIV-2の融合タンパク質Ｆは、単純な前駆体（Ｆ０）の形態で合成され、グリコシル化ホモトリマーの形態である。PIV-5及びPIV-2の融合タンパク質Ｆは、ジスルフィド架橋を介して連結した二つのサブユニット（大カルボキシ末端サブユニットＦ１及び小アミノ末端サブユニットＦ２）からなる「前活性化」形態を生成するために、ホストのフューリン（furines）によるタンパク分解性の切断を必要とする。
【００１６】
サブユニットＦ１は、疎水性融合ペプチド（ＦＰ）並びにコイルドコイル型のコンフォメーションを有する二つの７アミノ酸繰り返しドメイン（heptade repeat domains）（ＨＲ−１及びＨＲ−２）で構成される。ＨＮによる活性化の後、融合タンパク質は、一連のコンフォメーション変化を起こし、結果として、融合ペプチドの標的細胞膜への挿入を生じる。次に、ＨＲ−１及びＨＲ−２ドメイン間の相互作用が生じ、ウイルスエンベロープを細胞膜に近づける（Russell et al, 2006）。これらのドメインは、三つのＨＲ−１ドメインが三つのＨＲ−２ドメインに非平行配向で連結された三量体コイルドコイル構造で構成された６らせん体の極めて安定な束を形成することが知られている。このコンフォメーションは、Ｆタンパク質の融合後形態を表す（Baker et al, 1999, Sergel-Germano et al, 2000, West et al, 2005）。
【００１７】
PIV-5及びPIV-2の融合タンパク質Ｆは、融合の促進のために、同じウイルス型に由来するＨＮタンパク質を必要とする(Yao et al, 1997)。しかしながら、ＦとＨＮの間に存在する相互作用の詳細な性質は未だに正しく知られていない。
【００１８】
しかし、幾つかの研究が、PIV-5及びPIV-2のある株が、融合を引き起こすためのＨＮの必要性において相違していることを示している。
【００１９】
例として、Ito et al（1997）は、そのＦタンパク質が３つのアミノ酸（残基22、443及び516）によってのみ相違している「SV5」（PIV-5）の二つの株、即ち、Ｗ３Ａ及びＷＲを開示している。Ｗ３Ａ株のＦタンパク質は、自律的な（autonomous）様式で、即ち、ＨＮタンパク質の非存在下で融合を誘導することができ、一方、ＷＲ株のＦタンパク質はその能力を有していない。
【００２０】
Ito et al（1997）は、ＷＲ株のＦタンパク質の膜融合（fusogenic）活性が、このタンパク質の22位のアミノ酸をアミノ酸プロリンで置換することによって回復され得ることを示している。
【００２１】
Ito et al（2000）は、Ｗ３Ａ及びＷＲ株のＦタンパク質の132位のアミノ酸Ｅ及び290位のアミノ酸Ａが、これらの株のＦタンパク質がＨＮタンパク質に自律的である能力に関与し得ることを示唆している。
【００２２】
Paterson et al（2000）は、Ｗ３Ａ株のＦタンパク質の22位のアミノ酸プロリンの存在、及びＷＲ株のＦタンパク質のアミノ酸443の存在が、これらのウイルス株の膜融合能力を上昇させ得ることを示している。
【００２３】
Russell et al（2003）は、Ｗ３Ａ株のＦタンパク質の残基Ｌ４４７及びＩ４４９を芳香族アミノ酸によって置換することにより、このウイルス株のＦタンパク質の膜融合活性が上昇され得ることを示している。
【００２４】
Gardner及びDutch（2007）は、野生型「ＳＶ５」（ＰＩＶ−５）ウイルスのＦタンパク質の突然変異Ｉ４９Ａが、膜融合促進効果（pro-fusogenic effect）を有するであろうことを示している。
【００２５】
Gardner et al（2007）は、野生型「SV5」（PIV-5）ウイルスのＦタンパク質の突然変異Ｖ４０２Ａが、膜融合促進効果を有するであろうことを示している。
【００２６】
タンパク質PIV-2に関しては、このウイルスのＦタンパク質の配列に突然変異を導入し、それによって自律性及び膜融合能力を上昇させるタイプの試みを記載した従来技術文献は見当たらない。
【００２７】
さらに、インフルエンザタンパク質ＨＡ１／ＨＡ２、ラブドウイルスＧタンパク質、又はＨＩＶのｇｐ４１／ｇｐ１２０タンパク質など、融合能力を有するウイルスタンパク質が他に多くある。
【００２８】
これらの種々のウイルスタンパク質の膜融合性能力及び自律性に関する現在の知識は、今なお極めて限られている。
【００２９】
いずれにせよ、ウイルス融合タンパク質に関する現在の知識は、有効な医学的及び／又は生物工学的適用を構想するのに十分な技術的ノウハウを提供しない。
【発明の概要】
【００３０】
本発明者らは、高い膜融合性であり、かつその融合能力における実質的な自律性を示す融合タンパク質を利用可能にすることが、幾つかの医学的及び生物工学的な状況の解決を提供し得ると考えた。
【００３１】
本発明者らは、従って、例えばインフルエンザのＨＡ１／ＨＡ２タンパク質、ラブドウイルスのＧタンパク質、又はＨＩＶのｇｐ４１／ｇｐ１２０タンパク質などの、他の一連のウイルス融合タンパク質から、PIV-5及び／又はPIV-2のＦタンパク質を精選して選択した。
【００３２】
次いで、本発明者らは、ＨＮタンパク質の非存在下において膜融合能力を有する突然変異Ｆタンパク質を構築及び生産した。
【００３３】
本発明の突然変異タンパク質は、高い膜融合能力と高い自律性を有することが証明された。それらは、細胞融合を誘導するためにＨＮタンパク質の存在を必要とせず、また、シンシチウムの形成を必要としなかった。
【００３４】
また、本発明者らは、これらの突然変異タンパク質に、Ｆタンパク質が天然の状態で示しているものとは異なる切断サイト、より具体的には組織特異的切断サイトを導入することが可能であることを示した。
【００３５】
また、本発明者らは、本発明の突然変異タンパク質及び／又はそれらに由来するか又はそれらから得られる生成物の医学的適用（治療的、予防的、緩和的、また診断的)及び／又は生物工学的適用を提案する。
【００３６】
より具体的には、本発明者らは、癌（より具体的には転移性の癌、好ましくは転移性黒色腫）又は胎盤の発達不全などの、シンシチウムの形成を誘導または増加することが望まれる疾病又は機能障害を生体内で又は生体外で治療、予防又は緩和するための、本発明の突然変異タンパク質又はそれらをコードする核酸の使用を提案する。
【００３７】
本発明者らはさらに、エンベロープに包まれたウイルスの感染、アレルギー、自己免疫疾患又は移植片拒絶などの、シンシチウムの形成を阻害又はブロックすることが望まれる疾病又は機能障害を生体内で又は生体外で治療、予防又は緩和するための、抗体、組換え樹状細胞、アンチセンス、siRNA、核酸アプタマーなどの、ＰＩＶ−５及び／又はＰＩＶ−２のＦタンパク質をブロッキングする薬剤を提案する。
【００３８】
本発明者らはさらに、シンシチウムの過剰な形成、又は反対に不十分な形成を検出するための診断手段を提案する。
【００３９】
本発明者らはさらに、他の生物工学的手段、特に、シンシチウムの形成を減少させることができる活性成分をスクリーニングするための手段を提案する。
【００４０】
本発明者らはさらに、本発明の突然変異タンパク質を含む、癌細胞、より具体的には骨髄腫を提案する。本発明者らはさらに、本発明の突然変異タンパク質を含むハイブリドーマを提案する。本発明の癌細胞、より具体的には骨髄腫は、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)も、エレクトロポレーションも、他のいずれの融合誘導手段も用いることなく、別の細胞と、より具体的にはＢリンパ球と融合することができる。本発明の癌細胞、より具体的には骨髄腫は、自律的な融合能力を有する。
【００４１】
本発明のハイブリドーマは、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)も、エレクトロポレーションも、他のいずれの融合誘導手段も必要とせずに、（Ｂリンパ球の骨髄腫への)融合によって生産され得る。本発明のハイブリドーマは、本発明の少なくとも一つの癌細胞、より具体的には少なくとも一つの骨髄腫を用いることによって実際に生産され得る。
【００４２】
本発明者らはさらに、本発明の突然変異タンパク質を発現する組換え幹細胞又は前駆細胞、及び、筋繊維の生産におけるそれらの適用を提案する。
【００４３】
本発明の他の側面は、下記の「詳細な説明」の項において説明される。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
ファイルされた出願の図面セットは、カラーでファイルされた。これは、特許庁でファイルを閲覧することによりアクセスすることができる。
【図１Ａ】図１Ａ：PIV-5のＦタンパク質の基準配列 (配列番号31；WR単離体のＦタンパク質の配列) および対応するCDS配列 (配列番号30；配列番号31のタンパク質をコードする核酸配列)。配列番号31の配列において、ボールドで下線付きの文字は、以下の位置のアミノ酸を示す： - 22 (L)、 - 49 (I)、 - 132 (E、この単離体に予め存在する突然変異)、 - 147 (T)、 - 158 (T)、 - 290 (A、この単離体に予め存在する突然変異)、 - 402 (V)、 - 443 (P、この単離体に理論的に予め存在する突然変異)、 - 447 (L)、 - 449 (I)、および - 463 (A)。
【図１Ｂ】図１Ｂ：PIV-2のＦタンパク質の基準配列 (配列番号33；Greer単離体のＦタンパク質の配列) および対応するCDS配列 (配列番号32；配列番号33のタンパク質をコードする核酸配列)。配列番号33の配列において、ボールドで下線付きの文字は、以下の位置のアミノ酸を示す： - 24 (I)、 - 53 (I)、 - 133 (K)、 - 151 (T)、 - 162 (S)、 - 294 (I)、 - 406 (A)、 - 428 (S)、 - 439 (S)、 - 445 (I)、 - 474 (S)。
【図２Ａ】図２Ａ：PIV-2のＦタンパク質 (配列番号33のアミノ酸8〜533) に対するPIV-5のＦタンパク質 (配列番号31のアミノ酸4〜529) のアラインメント：これら2つのタンパク質の間で、タンパク質同一性は47.7%である。このアラインメントから得られるコンセンサス配列は、配列番号34として参照される。
【図２Ｂ】図２Ｂ：PIV-5のＦタンパク質のアミノ酸および突然変異に対応する、PIV-2のＦタンパク質のアミノ酸および突然変異。
【図３】図３：PIV-5のＦタンパク質の天然の切断サイト (配列番号23) の、組織特異的切断サイト、この場合、転移性腫瘍組織により特異的に発現される酵素、すなわちマトリクス金属プロテアーゼ9 (MMP-9) のサイトによる置換の図解。 MMP-9サイトのコンセンサスサイト：配列番号27の配列 (PXXhyS/Tサイト、ここで、X = 任意のアミノ酸、およびHy = 任意の疎水性アミノ酸、すなわちF、M、V、L、Iから選択される任意のアミノ酸)。 MMP-9サイトの例示的配列：配列番号28の配列、配列番号29の配列。
【図４】図４：PIV-5のＦタンパク質をコードする配列がクローニングされているプラスミドpcDNA3.1の構造。 Amp：アンピシリン耐性遺伝子 pCMV：サイトメガロウイルスプロモーター MCS：マルチプルクローニングサイト F PIV5：PIV-5のＦタンパク質 BGHpolyA：ウシ成長ホルモンpolyA。
【図５−１】図５Ａ、５Ｂ：PIV-5のＦタンパク質において本発明者らにより作成された突然変異の視覚化。
【図５−２】図５Ｃ、５Ｄ：PIV-5のＦタンパク質において本発明者らにより作成された突然変異の視覚化。
【図６Ａ】図６Ａ：半定量的融合テストの間に行われた顕微鏡観察の写真 (本発明者らにより作成された突然変異体の大きな一群)。
【図６Ｂ】図６Ｂ：半定量的融合テストの後に得られた融合スコアを示す図 (本発明者らにより作成された突然変異体の大きな一群)。
【図７】図７Ａ：半定量的融合テストの間に行われた顕微鏡観察の写真 (本発明者らにより作成された突然変異体の選択物)。 図７Ｂ：半定量的融合テストの後に得られた融合スコアを示す図 (本発明者らにより作成された突然変異体の選択物)。
【詳細な説明】
【００４５】
本出願において、「タンパク質」という用語は、「糖タンパク質」という用語をその範囲に包含する。これは特に、実際に糖タンパク質であるＦタンパク質及びＨＮタンパク質の場合である。
【００４６】
PIV-5及びPIV-2のＦタンパク質（非突然変異タンパク質）：
PIV-5のＦタンパク質の配列を図１Ａに示す（配列番号31のタンパク質配列；配列番号30のコーディング核酸配列）。これは、サル単離体であるＷＲ単離体の配列である。これらの配列は、ジーンバンク(Genbank)データベースから受入れ番号ＡＢ０２１９６２により入手可能なものである。
【００４７】
本発明者らがATCCから入手し、下記の実施例に記載した突然変異タンパク質の構築及び生産に用いたＷＲ単離体のサンプルは、しかしながら、Ｆタンパク質の443位において、（ジーンバンクから入手可能な配列の点から見て予想されるものとは対照的に）アミノ酸Ｐを有しておらず、アミノ酸Ｓを有している。従って、ＷＲ単離体のＦタンパク質の代替配列は、443位のアミノ酸がＳでありＰではないことを除いて、配列番号31の配列と同一である。簡略化のために、ここではこの代替配列を「443にＳを有する配列番号31」と記載する。
【００４８】
配列番号31の配列及び代替配列「443にＳを有する配列番号31」、好ましくは代替配列「443にＳを有する配列番号31」は、本特許出願の文脈においては、PIV-5のＦタンパク質の基準配列として作用する。
【００４９】
しかしながら、ＷＲ単離体以外の単離体、特に、
・例えばＷ３Ａ単離体などの他のサル単離体；
・他の非ヒト動物からの単離体、例えば、
○イヌ単離体、例えば、イヌ単離体ＣＰＩ＋、ＣＰＩ−、Ｈ２２１、７８５２４、Ｔｌ；
○ブタ単離体、例えば、ブタ単離体ＳＥＲ；
・ヒトから採取されたサンプルに由来するが、動物細胞で培養された（上記導入部分を参照）「ヒト」単離体と名付けられた単離体、例えば、ＭＩＬ単離体、ＤＥＮ単離体、ＬＮ単離体、ＭＥＬ単離体、及びWO 02 077211において「クリプトウイルス(cryptovirus)」と記載されている単離体
が明らかに存在する。
【００５０】
これらの種々のPIV-5単離体のＦタンパク質の配列における変異は極めてわずかである。
【００５１】
これらの変異の記述は、Chatziandreou et al,（2004）（その内容並びに特に表３及びこの論文中でそれに付随するコメントは、参照により本特許出願に組み込まれる）によって与えられる。
【００５２】
この論文の表３をここに再現する：
【表Ａ】
【表Ｂ】
【表Ｃ】
【表Ｄ】
【００５３】
上記の表１において、空欄は、関係するＦタンパク質が、左側のカラムに示されているＷ３Ａ株のＦタンパク質と同じアミノ酸を有することを示す。その位置がこの表に明記されていないアミノ酸ももちろん、Ｗ３ＡのＦタンパク質の配列中におけるそれらに対応するものと同じである。これらのアミノ酸自体は、ＷＲ単離体のＦタンパク質の配列中におけるそれらに対応するものと同じである（配列番号31の配列を参照）。
【００５４】
それ故、配列番号35〜46の配列は、これら配列の各々について、表１に示された配列番号31のアミノ酸の配列における置換（及び、適切な場合、示された配列番号31のアミノ酸の配列のＣ−末端部分における付加）により得られる配列である。
【００５５】
Ｗ３Ａ単離体のＦタンパク質、並びに上記の他の単離体のＦタンパク質は、
・147位における、アミノ酸Ｔ；
・158位における、アミノ酸Ｔ；
・447位における、アミノ酸Ｌ；及び
・449位における、アミノ酸Ｉ
を有する。
【００５６】
このように、Ｗ３Ａ及びＷＲ単離体は、他の単離体において529位を超えて伸長する細胞質伸長（cytoplasmic extension）を有していないことが分かる。関係する単離体に依存して、この細胞質伸長は、２から７のアミノ酸を含有する。
【００５７】
また、これらの単離体のＦタンパク質の配列は、ＷＲ株のＦタンパク質の配列と比較して５％未満（より具体的には、最大３％）だけ変化していることが分かる（細胞質伸長を考慮にいれない、即ち、このパーセンテージはＷＲのＦタンパク質の長さから算出される）；Chatziandreou et al.（2004）による論文の第85頁の終わりを参照されたい。
【００５８】
PIV-5のＦタンパク質は、従って、
・配列番号31の配列、又は前記代替配列「443にＳを有する配列番号31」；又は
・配列番号31の前記配列又は前記代替配列「443にＳを有する配列番号31」の変異配列であって、
○配列番号31の配列と同じサイズであるか、又は配列番号31の配列より最大で７アミノ酸だけ小さいサイズであるか、又は配列番号31の配列より最大で７アミノ酸だけ大きいサイズであり［前記代替配列「443にＳを有する配列番号31」は、配列番号31の配列と同じサイズである］、好ましくは配列番号31の配列と同じサイズを有し、又は配列番号31の配列より最大で７アミノ酸だけ大きいサイズを有し；及び
○配列番号31の配列又は前記代替配列「443にＳを有する配列番号31」に対して、95％を超える配列同一性、好ましくは少なくとも96％、より好ましくは少なくとも97％の配列同一性を有する（この同一性は、配列番号31の配列の長さ又は適切な場合には前記代替配列「443にＳを有する配列番号31」の配列の長さを用いて算出される)
として定義され得る変異配列
からなっていてもよい。
【００５９】
配列番号31のPIV-5のＦタンパク質の変異配列は、特に、上記の単離体Ｗ３Ａ、ＭＩＬ、ＤＥＮ、ＬＮ、ＭＥＬ、クリプトウイルス、ＣＰＩ＋、ＣＰＩ−、Ｈ２２１、７８５２４、Ｔｌ及びＳＥＲのＦタンパク質の配列を含む（上記表１及びChatziandreou et al,（2004）の論文を参照されたい）。
【００６０】
同様に、本願においてPIV-2 Ｆタンパク質のための基準として作用する配列は、図１Ｂに提示されたGreer株の配列である（配列番号33のタンパク質配列、配列番号32のコーディング核酸配列）。
【００６１】
例えばＶ９８、Ｖ９４ Toshiba 単離体などのGreer単離体以外のPIV-2 単離体が明らかに存在する。
【００６２】
これらの他のPIV-2単離体のＦタンパク質の配列は、Greer単離体のものと極めて近いが、単離体間の変異である幾つかの小さい変異を有する。
【００６３】
それ故、PIV-2 Ｆタンパク質は、
・配列番号33の配列；又は
・配列番号33の前記配列の変異配列であって、
○配列番号33の配列と同じサイズであるか、又は配列番号33の配列より最大で２アミノ酸だけ小さいサイズであるか、又は配列番号33の配列より最大で２アミノ酸だけ大きいサイズであり、好ましくは配列番号33の配列と同じサイズを有し、好ましくは配列番号33の配列とサイズが同じであり；及び
○配列番号33の配列に対して、95％を超える配列同一性、好ましくは少なくとも96％、より好ましくは少なくとも97％の配列同一性を有する（この同一性は、配列番号33の配列の長さを用いて算出される）
として定義され得る変異配列
からなっていてもよい。
【００６４】
PIV-5のＦタンパク質の配列(配列番号31)をPIV-2のもの(配列番号33)に対してアラインメントした結果のコンセンサス配列(配列番号34)は、以下の通りであり、図２Ａに見出される。このコンセンサス配列は、以下のように書き換えられる。
【化１】
【００６５】
シンボル「-」は、PIV-5のＦタンパク質とPIV-2のＦタンパク質がこの位置において異なるアミノ酸を有することを示す。
【００６６】
このコンセンサス配列は、以下のように形式化することもできる：
【化２】
【００６７】
PIV-5のＷＲ単離体のＦタンパク質の配列は、Ｎ−末端においてアミノ酸ＭＧＴにより先行される配列番号34の配列である（図１Ａ及び２Ａを参照）。
【００６８】
PIV-2のGreer単離体のＦタンパク質の配列は、Ｎ−末端においてアミノ酸ＭＨＨＬＨＰＭ（配列番号86）により先行され、Ｃ−末端においてアミノ酸ＥＮＰＡＦＦＳＫＮＮＨＧＮＩＹＧＩＳ（配列番号87）が続く配列番号34の配列である（図１Ｂ及び２Ａを参照）。
【００６９】
PIV-5及びPIV-2のＦタンパク質の配列は、配列番号34の配列を含む配列であり、好ましくは配列番号34の配列を含むＰＩＶウイルスのＦタンパク質の配列であると考えられ得る。より具体的には、PIV-5及びPIV-2のＦタンパク質の配列は、以下のように考えられ得る：
a) 配列番号34の配列であって、
・Ｎ−末端において3〜７のアミノ酸によって先行され、より具体的にはＮ−末端において３アミノ酸（例えばＭＧＴ）又は７アミノ酸（例えばＭＨＨＬＨＰＭ）によって先行され；及び
・任意に、Ｃ−末端において１８アミノ酸が続き、より具体的にはＣ−末端においてアミノ酸ＥＮＰＡＦＦＳＫＮＮＨＧＮＩＹＧＩＳが続く
配列；又は
b) 上記a）で記載された配列の変異配列であって、
・下記の何れか:
i. 配列番号31の配列と同じサイズを有するか、又は配列番号31の配列より最大で７アミノ酸だけ小さいサイズであるか、又は配列番号31の配列より最大で７アミノ酸だけ大きいサイズであり；好ましくは配列番号31の配列と同じサイズを有し、又は配列番号31の配列より最大で７アミノ酸だけ大きいサイズであり;及び
ii. 配列番号31の配列又は前記代替配列「443にＳを有する配列番号31」に対して、95％を超える配列同一性、好ましくは少なくとも96％、より好ましくは少なくとも97％の配列同一性を有する（この同一性は、配列番号31の配列の長さ又は適切な場合には前記代替配列「443にＳを有する配列番号31」の長さを用いて算出される）；
・又は
i. 配列番号33の配列と同じサイズを有するか、又は配列番号33の配列より最大で２アミノ酸だけ小さいサイズであるか、又は配列番号33の配列より最大で２アミノ酸だけ大きいサイズであるか、好ましくは配列番号33の配列と同じサイズを有し；及び
ii. 配列番号33の配列に対して、95％を超える配列同一性、好ましくは少なくとも96％、より好ましくは少なくとも97％の配列同一性を有する（この同一性は、配列番号33の配列の長さを用いて算出される）
である変異配列。
【００７０】
本発明の突然変異タンパク質：
本願は、突然変異タンパク質であって、そのアミノ酸配列が、
・置換：
○前記PIV-5 Ｆタンパク質の配列中の22位のアミノ酸、又は、前記PIV-2 Ｆタンパク質の配列中の24位のアミノ酸の、アミノ酸Ｐによる置換(PIV-5のＦにおける突然変異２２Ｐ；PIV-2のＦにおける突然変異２４Ｐ)；及び
○前記PIV-5 Ｆタンパク質の配列中の132位のアミノ酸、又は、前記PIV-2 Ｆタンパク質の配列中の133位のアミノ酸の、アミノ酸Ｅによる置換（PIV-5のＦにおける突然変異１３２Ｅ；PIV-2のＦにおける突然変異１３３Ｅ）；及び
○前記PIV-5 Ｆタンパク質の配列中の290位のアミノ酸、又は、前記PIV-2 Ｆタンパク質の配列中の294位のアミノ酸の、アミノ酸Ａによる置換（PIV-5のＦにおける突然変異２９０Ａ；PIV-2のＦにおける突然変異２９４Ａ）；及び
○前記PIV-5 Ｆタンパク質の配列中の447位のアミノ酸、又は、前記PIV-2 Ｆタンパク質の配列中の445位のアミノ酸の、アミノ酸Ｐによる置換（PIV-5のＦにおける突然変異４４７Ｐ；PIV-2のＦにおいける突然変異４４５Ｐ）；
・並びに、置換：
○前記PIV-5 Ｆタンパク質の配列中の147位のアミノ酸、又は、前記PIV-2 Ｆタンパク質の配列中の151位のアミノ酸の、Ｖ、Ｉ、Ｌから選択される疎水性アミノ酸、好ましくはＶによる置換（PIV-5のＦにおける突然変異１４７Ｈｙ；PIV-2のＦにおける突然変異１５１Ｈｙ）；及び/又は
○前記PIV-5 Ｆタンパク質の配列中の158位のアミノ酸、又は、前記PIV-2 Ｆタンパク質の配列中の162位のアミノ酸の、Ｖ、Ｉ、Ｌから選択される疎水性アミノ酸、好ましくはＶによる置換（PIV-5のＦにおける突然変異１５８Ｈｙ；PIV-2のＦにおける突然変異１６２Ｈｙ）；
・並びに、任意に：
○前記Ｆタンパク質の天然の（又は自然の）切断サイトの、別の酵素的切断サイトによる置換、及び／又は、前記Ｆタンパク質の天然の（又は自然の）切断サイト以外の酵素的切断サイトの、前記Ｆタンパク質への挿入；及び／又は
○前記Ｆタンパク質のＣ−末端部分であって、前記タンパク質のＣ−末端にある最後のアミノ酸からＮ−末端方向に伸張するが、前記Ｆタンパク質のＨＲ２ドメインを超えては伸張しないＣ−末端部分の欠失
によって、PIV-5又はPIV-2ウイルスのＦタンパク質の配列から導き出される（derivable）配列を含む突然変異タンパク質に関する。
【００７１】
前記アミノ酸の位置は、前記Ｆタンパク質の前駆体形態（Ｆ０）の配列（即ち、切断前のＦタンパク質の配列）に対して算出され、その位置はＮ−末端からＣ−末端へカウントされる。
【００７２】
PIV-2 Ｆタンパク質において示された位置は、PIV-5のＦタンパク質において示されたものと対応する位置である（位置の対応の表を示す図２Ｂを参照されたい）。
【００７３】
PIV-5又はPIV-2ウイルスの前記Ｆタンパク質の配列は、上記で定義されたとおりである。よって、それは、特に配列番号34の配列（PIV-5及びPIV-2のＦタンパク質のコンセンサス配列）を含むと定義され得る。
【００７４】
PIV-5 Ｆタンパク質の突然変異タンパク質：
本発明の一つの側面に従って、本発明の突然変異タンパク質は、下記のPIV-5ウイルスのＦタンパク質の配列から導き出される配列を含む：
・配列番号31の配列（図１Ａに示されたPIV-5のＷＲ単離体のＦタンパク質の配列）、又は前記代替配列「443にＳを有する配列番号31」の配列；又は
・配列番号31の前記配列又は前記代替配列「443にＳを有する配列番号31」の変異配列であって、
○配列番号31の配列と同じサイズであるか（即ち、529アミノ酸からなる)、又は配列番号31の配列より最大で７アミノ酸だけ大きいサイズであるか（即ち、530、531、532、533、534、535又は536アミノ酸からなる)、又は配列番号31の配列より最大で７アミノ酸だけ小さいサイズであり（即ち、522、523、524、525、526、527又は528アミノ酸からなる)；及び
○配列番号31の配列又は前記代替配列「443にＳを有する配列番号31」に対して、95％を超える配列同一性、好ましくは少なくとも96％、より好ましくは少なくとも97％の配列同一性を有し、この同一性は、配列番号31の配列の長さ又は（適切な場合には）前記代替配列「443にＳを有する配列番号31」の長さを用いて算出される、変異配列。
【００７５】
好ましくは、PIV-5の前記Ｆタンパク質の配列は、以下からなる：
・配列番号31の配列（図１Ａに示されたPIV-5のＷＲ単離体のＦタンパク質の配列）、又は前記代替配列「443にＳを有する配列番号31」の配列；又は
・配列番号31の前記配列又は前記代替配列「443にＳを有する配列番号31」の変異配列であって、
○配列番号31の配列と同じサイズであるか（即ち、529アミノ酸からなる)、又は配列番号31の配列より最大で７アミノ酸だけ大きいサイズである（即ち、530、531、532、533、534、535又は536アミノ酸からなる)；及び
○配列番号31の配列又は前記代替配列「443にＳを有する配列番号31」に対して、95％を超える配列同一性、好ましくは少なくとも96％、より好ましくは少なくとも97％の配列同一性を有し、この同一性は、配列番号31の配列の長さ又は適切な場合には前記代替配列「443にＳを有する配列番号31」の長さを用いて算出される、変異配列。
【００７６】
そのような変異配列の具体的な例は、本願の表１に示されているＷ３Ａ、ＭＩＬ、ＤＥＮ、ＬＮ、ＭＥＬ、クリプトウイルス、ＣＰＩ＋、ＣＰＩ−、Ｈ２２１、７８５２４、Ｔｌ及びＳＥＲの単離体の一つのＦタンパク質の配列（上記を参照）、即ち、配列番号35〜46の配列の一つを含む。
【００７７】
好ましくは、PIV-5の前記Ｆタンパク質の配列は、配列番号31の配列（図１Ａに示されたPIV-5のＷＲ単離体のＦタンパク質の配列）、又は、前記代替配列「443にＳを有する配列番号31」からなり、特に好ましくは、前記代替配列「443にＳを有する配列番号31」からなる。
【００７８】
好ましくは、PIV-5の前記Ｆタンパク質の配列から導き出される前記配列は、このＦタンパク質配列から、少なくとも上記の突然変異２２Ｐ、１３２Ｅ、２９０Ａ、４４７Ｐおよび１５８Ｈｙによって導き出される。
【００７９】
好ましくは、PIV-5の前記Ｆタンパク質の配列から導き出される前記配列は、このＦタンパク質配列から、少なくとも上記の突然変異２２Ｐ、１３２Ｅ、２９０Ａ、４４７Ｐおよび１４７Ｈｙによって導き出される。
【００８０】
好ましくは、PIV-5の前記Ｆタンパク質の配列から導き出される前記配列は、このＦタンパク質配列から、少なくとも上記の突然変異２２Ｐ、１３２Ｅ、２９０Ａ、４４７Ｐ、１４７Ｈｙおよび１５８Ｈｙによって導き出される。
【００８１】
PIV-5のＦタンパク質の配列から導き出される前記配列は、PIV-5の前記Ｆタンパク質配列に対して、上記の突然変異２２Ｐ、１３２Ｅ、２９０Ａ、４４７Ｐおよび１４７Ｈｙ/１５８Ｈｙ以外の突然変異を含まなくてもよい。
【００８２】
あるいは、PIV-5のＦタンパク質の配列から導き出される前記配列は、上記の突然変異２２Ｐ、１３２Ｅ、２９０Ａ、４４７Ｐおよび１４７Ｈｙ/１５８Ｈｙによって、及び、上記の突然変異２２Ｐ、１３２Ｅ、２９０Ａ、４４７Ｐ以外の少なくとも一つの突然変異によって、好ましくは、
・以下から選択される少なくとも一つの融合前（pre-fusion）突然変異：
○49位のアミノ酸のアミノ酸Ａによる置換；
○402位のアミノ酸のアミノ酸Ａによる置換；
○443位のアミノ酸のアミノ酸Ｐによる置換；
○449位のアミノ酸のアミノ酸Ｐによる置換；
及び／又は
・以下から選択される少なくとも一つの融合後（post-fusion）突然変異：
○463位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換
によって、このＦタンパク質配列から導き出され得る。
【００８３】
好ましくは、PIV-5の前記Ｆタンパク質の配列から導き出される前記配列は、上記の突然変異２２Ｐ、１３２Ｅ、２９０Ａ、４４７Ｐおよび１４７Ｈｙ/１５８Ｈｙによって、及び、
・以下から選択される少なくとも一つの融合前突然変異：
○49位のアミノ酸のアミノ酸Ａによる置換；
○402位のアミノ酸のアミノ酸Ａによる置換；
及び／又は
・以下から選択される少なくとも一つの融合後突然変異：
○463位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換
によって、このＦタンパク質配列から導き出される。
【００８４】
好ましくは、PIV-5の前記Ｆタンパク質の配列から導き出される前記配列は、上記の突然変異２２Ｐ、１３２Ｅ、２９０Ａ、４４７Ｐおよび１４７Ｈｙ/１５８Ｈｙによって、及び、
・以下から選択される少なくとも一つの融合後突然変異：
○463位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換
によって、このＦタンパク質配列から導き出される。
【００８５】
463位のアミノ酸を置換するために選択される前記疎水性アミノ酸は、有利にはＶ、Ｉ、Ｌから選択され、好ましくはＶである。
【表Ｅ】
【００８６】
表４に示した突然変異は、任意のPIV-5単離体、即ち、ＷＲ単離体又は変異単離体のＦタンパク質に導入され得る。より具体的には、それらは、図１Ａに示された配列番号31のＦタンパク質配列（ジーンバンクデータベースから受入れ番号AB021962で入手可能なＷＲのＦタンパク質）に導入され得る。
【００８７】
しかしながら、上記のように、本発明者らがATCCから受領し、下記の実施例に記載した突然変異タンパク質の構築及び生産に用いたＷＲ単離体のサンプルは、（ジーンバンクから入手可能な配列の点から見て予想されるものとは対照的に）Ｆタンパク質の443位にアミノ酸Ｐを有しておらず、アミノ酸Ｓを有していた。従って、表４に示した突然変異は、前記代替配列「443にＳを有する配列番号31」（配列番号62、63、64）に導入され得る。
【００８８】
PIV-2 Ｆタンパク質の突然変異タンパク質：
本発明の別の側面に従って、本発明の突然変異タンパク質は、PIV-2ウイルスのＦタンパク質の配列から導き出される配列を含む。
【００８９】
前記PIV-2 Ｆタンパク質の配列は、上記で定義されたとおりである。特にそれは、
・配列番号33の配列（図１Ｂに示したPIV-2のGreer単離体のＦタンパク質の配列）；又は
・配列番号33の配列の変異配列であって、
○配列番号33の配列と同じサイズであるか（即ち、551アミノ酸からなる)、又は配列番号33の配列より最大で２アミノ酸だけ大きいサイズであるか（即ち、552又は553アミノ酸からなる)、又は配列番号33の配列より最大で２アミノ酸だけ小さいサイズであり（即ち、549又は550アミノ酸からなる)；及び
○配列番号33の配列に対して、95％を超える配列同一性、好ましくは少なくとも96％、より好ましくは少なくとも97％の配列同一性を有し、この同一性は、配列番号33の配列の長さを用いて算出される、変異配列
からなっていてもよい。
【００９０】
好ましくは、PIV-2の前記Ｆタンパク質の配列は、
・配列番号33の配列（図１Ｂに示したPIV-2のGreer単離体のＦタンパク質の配列）；又は
・配列番号33の配列の変異配列であって、
○配列番号33の配列と同じサイズであるか（即ち、551アミノ酸からなる)、又は配列番号33の配列より最大で２アミノ酸だけ大きいサイズであり（即ち、552又は553アミノ酸からなる)；及び
○配列番号33の配列に対して、95％を超える配列同一性、好ましくは少なくとも96％、より好ましくは少なくとも97％の配列同一性を有し、この同一性は、配列番号33の配列の長さを用いて算出される、変異配列
からなる。
【００９１】
さらに好ましくは、PIV-2の前記Ｆタンパク質の配列は、
・配列番号33の配列（図１Ｂに示したPIV-2のGreer単離体のＦタンパク質の配列）；又は
・配列番号33の配列の変異配列であって、
○配列番号33の配列と同じサイズであり（即ち、551アミノ酸からなる)；及び
○配列番号33の配列に対して、95％を超える配列同一性、好ましくは少なくとも96％、より好ましくは少なくとも97％の配列同一性を有し、この同一性は、配列番号33の配列の長さを用いて算出される、変異配列
からなる。
【００９２】
特に好ましくは、前記Ｆタンパク質の配列は、配列番号33の配列（図１Ｂに示したPIV-2のGreer単離体のＦタンパク質の配列）からなる。
【００９３】
好ましくは、前記PIV-2のＦタンパク質の配列から導き出される前記配列は、このＦタンパク質配列から、少なくとも上記の突然変異２４Ｐ、１３３Ｅ、２９４Ａ、４４５Ｐおよび１６２Ｈｙによって導き出される。
【００９４】
好ましくは、PIV-2の前記Ｆタンパク質の配列から導き出される前記配列は、このＦタンパク質配列から、少なくとも上記の突然変異２４Ｐ、１３３Ｅ、２９４Ａ、４４５Ｐおよび１５１Ｈｙによって導き出される。
【００９５】
好ましくは、PIV-2の前記Ｆタンパク質の配列から導き出される前記配列は、このＦタンパク質配列から、少なくとも上記の突然変異２４Ｐ、１３３Ｅ、２９４Ａ、４４５Ｐ、１６２Ｈｙおよび１５１Ｈｙによって導き出される。
【００９６】
PIV-5のＦタンパク質の配列から導き出される前記配列は、PIV-2の前記Ｆタンパク質配列に対して、上記の突然変異２４Ｐ、１３３Ｅ、２９４Ａ、４４５Ｐおよび１５１Ｈｙ/１６２Ｈｙ以外の突然変異を含まなくてもよい。
【００９７】
あるいは、PIV-2のＦタンパク質の配列から導き出される前記配列は、上記の突然変異２４Ｐ、１３３Ｅ、２９４Ａ、４４５Ｐおよび１５１Ｈｙ/１６２Ｈｙによって、及び上記の突然変異２４Ｐ、１３３Ｅ、２９４Ａ、４４５Ｐ以外の少なくとも一つの突然変異によって、好ましくは、
・以下から選択される少なくとも一つの融合前突然変異：
○53位アミノ酸のアミノ酸Ａによる置換；
○406位のアミノ酸のアミノ酸Ａによる置換；
○428位のアミノ酸のアミノ酸Ｐによる置換；
○439位のアミノ酸のアミノ酸Ｐによる置換；
及び／又は
・以下から選択される少なくとも一つの融合後突然変異：
○474位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換
によって、このＦタンパク質配列から導き出され得る。
【００９８】
好ましくは、PIV-2の前記Ｆタンパク質の配列から導き出される前記配列は、上記の突然変異２４Ｐ、１３３Ｅ、２９４Ａ、４４５Ｐおよび１５１Ｈｙ/１６２Ｈｙによって、及び、
・以下から選択される少なくとも一つの融合前突然変異：
○53位アミノ酸のアミノ酸Ａによる置換；
○406位のアミノ酸のアミノ酸Ａによる置換；
及び／又は
・以下から選択される少なくとも一つの融合後突然変異：
○474位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換
によって、このＦタンパク質配列から導き出される。
【００９９】
好ましくは、PIV-2の前記Ｆタンパク質の配列から導き出される前記配列は、上記の突然変異２４Ｐ、１３３Ｅ、２９４Ａ、４４５Ｐおよび１５１Ｈｙ/１６２Ｈｙによって、および
・474位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換
から選択される少なくとも一つの融合後突然変異によって、このＦタンパク質配列から導き出される。
【０１００】
474位のアミノ酸置換において選択される前記疎水性アミノ酸は、有利にはＶ、Ｉ、Ｌから選択され、好ましくはＶである。
【表Ｆ】
【０１０１】
表５に示した突然変異は、任意のPIV-2単離体、即ち、Greer単離体又は変異単離体のＦタンパク質に導入され得る。よって、より具体的には、それらは、図１Ｂに示された配列番号33のＦタンパク質配列（GreerのＦタンパク質；配列番号88〜90）に導入され得る。
【表Ｇ】
【０１０２】
切断サイト：
本発明に従って、本発明の突然変異タンパク質は、
・上述の突然変異；および更に
・前記Ｆタンパク質の天然の切断サイトの、別の酵素的切断サイトによる置換、および/または前記Ｆタンパク質の天然の切断サイト以外の酵素的切断サイトの前記Ｆタンパク質への挿入、好ましくは、前記Ｆタンパク質の天然の切断サイトの、別の酵素的切断サイトによる置換
によって、PIV-5またはPIV-2ウイルスのＦタンパク質の配列から導き出される配列を含み得る。
【０１０３】
PIV-5またはPIV-2のＦタンパク質の切断サイトは、このＦタンパク質の2つのサブユニット（Ｆ１およびＦ２）の切断サイトである。
【０１０４】
PIV-5およびPIV-2のＦタンパク質の天然型において、この切断サイトは、フューリン（furines）により切断されるサイトである。
【０１０５】
PIV-5のＦタンパク質の天然型において、この切断サイトは、配列RRRRR (配列番号23) からなる。これは、PIV-5のＦタンパク質の天然型の98〜102位にある (図１Ａ参照)。PIV-5のＦタンパク質の天然（または自然）の切断サイトを含むPIV-5のＦタンパク質配列の断片の例は、以下のとおりである：
IGENLETIRNQLIPTRRRRRFAGVVIGL (配列番号24)。
【０１０６】
PIV-2のＦタンパク質の天然型において、切断サイトは、配列KTRQKR (配列番号25) からなる。これは、PIV-2のＦタンパク質の天然型の101〜106位にある (図１Ｂ参照)。PIV-2のＦタンパク質の天然（または自然）の切断サイトを含むPIV-2のＦタンパク質配列の断片の例は、LTPLIENLSKISTVTDTKTRQKRFAGVVVGLAALGVA (配列番号26) である。
【０１０７】
好ましくは、天然の切断サイト以外の前記切断サイトは、組織特異的切断サイトである。
【０１０８】
好ましくは、天然の切断サイト以外の前記切断サイトは、一または複数の腫瘍組織によって特異的に発現される酵素の切断サイトであり、更に好ましくは、一または複数の転移性組織によって酵素特異的に発現される酵素の切断サイトである。
【０１０９】
一例として、天然の切断サイト以外の前記切断サイトは、金属プロテアーゼの切断サイト、たとえばマトリクス金属プロテアーゼ9 (MMP-9) の切断部位であり得る；下記の例２を参照。
【０１１０】
マトリクス金属プロテアーゼ9 (MMP-9) の切断サイトは、配列PXXHy S/T (配列番号27)｛ここでＸ = 任意のアミノ酸、Ｈｙ = 任意の疎水性アミノ酸 (すなわち、Ｆ、Ｍ、Ｖ、Ｌ、Ｉから選択される任意のアミノ酸)｝を含んでいてもよいし、この配列からなっていてもよい。
【０１１１】
一例として、マトリクス金属プロテアーゼ9 (MMP-9) の切断サイトは、配列PRRIT (配列番号28) および/または配列
IGENLETIRNQLIPTPRRITFAGVVIGL (配列番号29)
を含んでいてもよいし、この配列からなっていてもよい。
【０１１２】
本発明の核酸：
また本出願は、本発明による突然変異タンパク質をコードする核酸、DNAまたはRNA (普遍的な遺伝暗号に従って、この遺伝暗号の縮重を許容する)、並びにかかる核酸の相補的核酸（同じ長さの完全に相補的な核酸）に関する。
【０１１３】
かかる核酸は、配列番号30の配列 (天然のPIV-5 Ｆタンパク質をコードする配列)、または前記代替配列“443にSを有する配列番号31”をコードする代替配列、または変異Ｆタンパク質をコードする変異配列、あるいは、配列番号32の配列 (天然のPIV-2 Ｆタンパク質をコードする配列)、または変異Ｆタンパク質をコードする変異配列から導き出される。
【０１１４】
本発明のベクター：
また本出願は、本発明による少なくとも一つの核酸を含む核酸ベクター、より具体的には、トランスフェクション、形質導入または形質転換ベクターに関する。
【０１１５】
有利には、かかるベクターは、発現ベクターであり得る。
【０１１６】
好ましくは、これは、動物細胞 (非ヒト動物細胞および/またはヒト細胞) において、より好ましくは、
・ヒト細胞、有利には病的なヒト細胞、より具体的にはヒト腫瘍細胞、より好ましくは転移性黒色腫細胞において；または
・胎盤細胞において、
前記少なくとも一つの核酸の発現を許容するベクターである。
【０１１７】
かかる発現ベクターは、有利には、アデノウイルスベクターであり得る。
【０１１８】
前記アデノウイルスベクターは、前記核酸の発現を調節するためのエレメント、好ましくはプロモーターを含んでいてもよく、腫瘍細胞、好ましくは転移性細胞、より好ましくは転移性黒色腫細胞において前記核酸の発現を許容する。
【０１１９】
好ましくは、この発現は特異的である。有利には、この発現は、非腫瘍 (または非転移性) 細胞において有意な発現は存在しないが、前記腫瘍細胞または転移性細胞において前記核酸の発現を許容するように十分に特異的である。
【０１２０】
有利には、かかるアデノウイルスベクターは、腫瘍崩壊性アデノウイルスベクターである。
【０１２１】
有利には、本発明の発現ベクターは、前記核酸の発現を調節するためのエレメント、好ましくはプロモーターを含み、胎盤細胞、好ましくは不十分な膜融合性 (fusogenicity) を有する病的な胎盤細胞において前記核酸の発現を許容する、アデノウイルスベクターであり得る。
【０１２２】
好ましくは、この発現は特異的である。有利には、この発現は、非胎盤細胞において有意な発現は存在しないが、前記胎盤細胞において前記核酸の発現を許容するように十分に特異的である。
【０１２３】
本発明のベクターは、択一的または補足的に、動物細胞 (非ヒト動物細胞および/またはヒト細胞)、より好ましくはヒト細胞、有利には病的なヒト細胞、より具体的にはヒト腫瘍細胞、好ましくは転移性ヒト細胞、より好ましくは転移性黒色腫細胞のゲノムへの、前記少なくとも一つの核酸の挿入を許容するベクターであり得る。かかるベクターは、より具体的には、腫瘍、具体的には転移性腫瘍、より具体的には転移性黒色腫の遺伝子治療のために向けられる。
【０１２４】
また本出願は、本発明の少なくとも一つの核酸を含み、動物細胞 (非ヒト動物細胞および/またはヒト細胞)、より好ましくはヒト細胞、有利には胎盤細胞、好ましくはヒトの胎盤細胞のゲノムへの、前記少なくとも一つの核酸の挿入を許容する、ベクターに関する。かかるベクターは、より具体的には、不完全な胎盤の発達を伴う疾病または状態の遺伝子治療のために向けられる。
【０１２５】
本発明の細胞：
また本出願は、本発明による少なくとも一つの突然変異タンパク質、および/または本発明による少なくとも一つの核酸、DNAまたはRNA、および/または本発明による少なくとも一つのベクターを含む細胞に関する。
【０１２６】
かかる細胞は、ヒト細胞または非ヒト動物細胞であり得る。
【０１２７】
好ましくは、かかる細胞は、腫瘍細胞、好ましくは転移性細胞、より好ましくは転移性黒色腫細胞である。
【０１２８】
かかる細胞は、後述されるとおり、シンシチウムの形成を誘導することができる膜融合 (fusogenic) 能力を備えた細胞としての適用を見出す。
【０１２９】
あるいは、本発明の細胞は、ヒトまたは非ヒト動物の免疫系の非腫瘍細胞、好ましくは非腫瘍性のヒトまたは非ヒト動物の樹状細胞であってもよく、前記細胞は、本発明による少なくとも一つの突然変異タンパク質をその表面で発現している。かかる細胞は、後述されるとおり、たとえば活性な免疫処置により、細胞融合阻害剤の産生を誘導することができる薬剤としての適用を見出す。
【０１３０】
医学的適用 (融合促進(pro-fusion))：
本発明の突然変異タンパク質、および/または本発明の核酸、DNAまたはRNA、および/または本発明のベクター、および/または本発明の細胞は、病的な細胞および/または生物の健康に好ましくない細胞の存在および/または増殖を伴う疾病または状態の治療および/または予防および/または緩和において、より具体的には、不十分な細胞の膜融合性 (cellular fusogenicity) を伴う疾病または状態の治療および/または予防および/または緩和において、好ましくは疾病または腫瘍形成状態、たとえば腫瘍、転移性腫瘍、有利には転移性黒色腫の治療および/または予防および/または緩和において使用され得る。
【０１３１】
かかる疾病または状態は、これらの病的な細胞および/または好ましくない細胞の低減または除去により、治療および/または予防および/または緩和され得る。
【０１３２】
かかる細胞の表面で発現される本発明の突然変異タンパク質は、これら細胞の融合を誘導し、その結果、シンシチウムの形成を誘導し、これら細胞の破壊（または少なくとも数の減少）につながる。
【０１３３】
本発明の突然変異タンパク質、および/または本発明の核酸、DNAまたはRNA、および/または本発明のベクター、および/または本発明の細胞は、胎盤の発達不全を伴う疾病または状態の治療および/または予防および/または緩和において使用され得る。
【０１３４】
かかる疾病または状態は、胎盤細胞の融合の誘導または刺激により、治療および/または予防および/または緩和され得る。
【０１３５】
よって、本出願はまた、本発明の少なくとも一つの突然変異タンパク質、および/または本発明の少なくとも一つの核酸、DNAまたはRNA、および/または本発明の少なくとも一つのベクター、および/または本発明の細胞を含む、薬学的組成物または薬に関する。
【０１３６】
かかる薬学的組成物またはかかる薬は、上述のような病的な細胞および/または生物の健康に好ましくない細胞の存在および/または増殖を伴う疾病または状態 (例として、腫瘍、転移性腫瘍、転移性黒色腫) の治療および/または予防および/または緩和、あるいは不十分な細胞の膜融合性 (cellular fusogenicity) を伴う疾病または状態 (例として、胎盤の発達不全) の治療および/または予防および/または緩和に向けられてもよい。
【０１３７】
かかる薬学的組成物またはかかる薬は、少なくとも一つの薬学的および/または生理学的に許容可能な賦形剤を更に含んでもよい。
【０１３８】
本発明の突然変異タンパク質 (または本発明の核酸、DNA、RNA、または発現ベクター) は、ヒト細胞または非ヒト動物細胞により発現されるように、好ましくはかかる細胞の表面で発現されるように使用され得る。
【０１３９】
この細胞は、病的な細胞、好ましくは腫瘍細胞、より好ましくは転移性細胞、より好ましくは転移性黒色腫細胞であってもよいし、非腫瘍細胞、たとえば健康な細胞であってもよい。
【０１４０】
より具体的には、ヒト患者または病気の非ヒト動物被検体から取り出された病的な細胞を、本発明の少なくとも一つの突然変異タンパク質、および/または本発明の少なくとも一つの核酸、DNAまたはRNA、および/または本発明の少なくとも一つの発現ベクターと、本発明の突然変異タンパク質を発現させるように接触させることにより、エクスビボで(ex vivo)(またはインビトロで) 処理してもよい。
【０１４１】
択一的または補足的に、患者または被検体の病的な細胞の近くに局在するが病的でない細胞を取り出して、当該処理を行ってもよい。
【０１４２】
このようにエクスビボで(またはインビトロで)処理された細胞は、その後、前記患者または被検体に再投与するように向けられてもよい。
【０１４３】
かかる細胞は、前記患者または被検体が冒されている病状、たとえば腫瘍、転移性腫瘍、転移性黒色腫の治療および/または予防および/または緩和のために有用である。
【０１４４】
あるいは、この細胞は、胎盤の細胞、より具体的には、不十分な膜融合性(fusogenicity)に罹患している胎盤の細胞であり得る。かかる細胞は、本発明の突然変異タンパク質をその表面で発現させることにより一旦処理されると、胎盤の発達不全の治療および/または予防および/または緩和に向けられてもよい。
【０１４５】
よって本出願は、より具体的には、疾病または腫瘍形成状態、好ましくは腫瘍、より好ましくは転移性腫瘍、更に好ましくは転移性黒色腫の治療および/または予防および/または緩和において使用するための、本発明による突然変異タンパク質、本発明による核酸、DNAまたはRNA、本発明によるベクター、本発明による細胞に関する。
【０１４６】
また本出願は、より具体的には、胎盤の発達不全の治療および/または予防および/または緩和において使用するための、本発明による突然変異タンパク質、本発明による核酸、DNAまたはRNA、本発明によるベクター、本発明による細胞に関する。
【０１４７】
本発明による融合阻害剤：
また本出願は、細胞融合を減少させるかまたは遮断する能力を有する生成物に関する。これら生成物は、本発明の一または複数の突然変異タンパク質の阻害剤である。
【０１４８】
かかる阻害剤は、過剰な細胞の膜融合性（cellular fusogenicity）を伴う疾病または状態の治療および/または予防および/または緩和において、好ましくはエンベロープに包まれたウイルスの感染（たとえばHIV、インフルエンザ、パラインフルエンザまたはラブドウイルスの感染）、アレルギー、自己免疫疾患または移植片拒絶の治療および/または予防および/または緩和において使用され得る。
【０１４９】
好ましくは、本発明による阻害剤は、以下のとおりである：
・本発明による突然変異タンパク質に対する抗体、またはかかる抗体のFabもしくはF(ab’)2断片；または
・本発明による少なくとも一つの突然変異タンパク質に、または本発明による核酸、DNA、RNAに、特異的に結合する核酸アプタマーまたはペプチドアプタマー；または
・本発明による少なくとも一つの突然変異タンパク質をその表面で発現する、組換え免疫系細胞、好ましくは組換え樹状細胞；または
・本発明による核酸のアンチセンス核酸；または
・19〜22のヌクレオチドを含有する二本鎖ＲＮＡを含み、かつ本発明による核酸に結合する（ハイブリダイズする）ことができる、低分子干渉（small interfering）RNA、siRNA。
【０１５０】
よって、本出願はまた、ヒトまたは非ヒト動物の免疫系の非腫瘍細胞、好ましくはヒトまたは非ヒト動物の樹状細胞であって、本発明による少なくとも一つの突然変異タンパク質をその表面で発現する細胞に関するとともに、過剰な細胞の膜融合性（cellular fusogenicity）を伴う疾病または状態の治療および/または予防および/または緩和における、好ましくはエンベロープに包まれたウイルスの感染（たとえばHIV、インフルエンザ、パラインフルエンザまたはラブドウイルスの感染）、アレルギー、自己免疫疾患または移植片拒絶の治療および/または予防および/または緩和における、この細胞の使用に関する。
【０１５１】
また本出願は、本発明による突然変異タンパク質または本発明の幾つかの突然変異タンパク質に対する抗体に関する。好ましくは、この抗体は、本発明の前記突然変異タンパク質に特異的な抗体である。有利には、この抗体はモノクローナル抗体である。本発明の阻害剤は、かかる抗体の保存された断片、たとえばFabまたはF(ab')2断片であり得る。
【０１５２】
かかる抗体または抗体断片は、たとえば、それを必要とする患者または被検体に前記抗体または抗体断片を投与することにより、細胞融合メカニズムを遮断または阻害するように向けられてもよい。
【０１５３】
択一的または補足的に、本発明の突然変異タンパク質は、このタンパク質に対して活性な免疫化を誘導するために、すなわち、前記患者または被検体による抗−突然変異タンパク質抗体の産生を誘導するために、前記患者または被検体にそれ自体投与するように向けられてもよい。必要な場合または所望の場合、一または複数のワクチンアジュバントが、前記突然変異タンパク質の一または複数と一緒に、または異なる時間で投与されてもよい。
【０１５４】
よって、本出願はまた、免疫原性剤としての本発明の少なくとも一つの突然変異タンパク質、および有利には少なくとも一つの免疫化アジュバントを含む、治療用および/または予防用および/または緩和用ワクチンに関する。かかるワクチンは、過剰な細胞の膜融合性（cellular fusogenicity）を伴う疾病または状態の治療および/または予防および/または緩和のため、好ましくは、エンベロープに包まれたウイルスの感染（たとえば、HIV、インフルエンザ、パラインフルエンザまたはラブドウイルスの感染）、アレルギー、自己免疫疾患または移植片拒絶の治療および/または予防および/または緩和のために向けられてもよい。
【０１５５】
また本出願は、以下のものに関する：
・本発明の少なくとも一つの突然変異タンパク質に、または本発明の核酸、DNA、RNAに、特異的に結合する核酸アプタマーまたはペプチドアプタマー；
・本発明の少なくとも一つの突然変異タンパク質をその表面で発現する、組換え免疫系細胞、好ましくは組換え樹状細胞；
・本発明の核酸のアンチセンス核酸；
・19〜22のヌクレオチドを含有する二本鎖ＲＮＡを含み、かつ本発明の核酸に結合する（ハイブリダイズする）ことができ、有利には前記核酸の転写を遮断または阻害することができる、低分子干渉（small interfering）RNA、siRNA。
【０１５６】
また、かかる生成物は、本発明の阻害剤でもある。よって、これらは、上述のような過剰な細胞の膜融合性（cellular fusogenicity）を伴う疾病または状態の治療および/または予防および/または緩和のために向けられてもよい。より具体的には、これらは、Ｆタンパク質の発現または過剰発現について少なくとも一つの遺伝子を伴う疾病または状態の治療および/または予防および/または緩和のために向けられる。
【０１５７】
よって、本出願はまた、本発明の少なくとも一つの阻害剤を含む薬学的組成物または薬に関する。
【０１５８】
かかる薬学的組成物または薬は、とりわけ、上述のような過剰な細胞の膜融合性（cellular fusogenicity）を伴う疾病または状態の治療および/または予防および/または緩和のために向けられてもよい。
【０１５９】
かかる薬学的組成物または薬は、少なくとも一つの薬学的および/または生理学的に許容可能な賦形剤を更に含んでもよい。
【０１６０】
本出願は、より具体的には、過剰な細胞の膜融合性（cellular fusogenicity）を伴う疾病または状態の治療および/または予防および/または緩和において使用するための本発明による阻害剤であって、前記疾病または状態が、エンベロープに包まれたウイルスの感染（好ましくは、HIVおよび/またはインフルエンザおよび/またはパラインフルエンザおよび/またはラブドウイルスの感染）、アレルギー、自己免疫疾患または移植片拒絶である阻害剤に関する。
【０１６１】
本出願は、より具体的には、過剰な細胞の膜融合性（cellular fusogenicity）を伴う疾病または状態の治療および/または予防および/または緩和において免疫原性剤として使用するための本発明による突然変異タンパク質であって、前記疾病または状態が、エンベロープに包まれたウイルスの感染（好ましくは、HIVおよび/またはインフルエンザおよび/またはパラインフルエンザおよび/またはラブドウイルスの感染）、アレルギー、自己免疫疾患または移植片拒絶である突然変異タンパク質に関する。
【０１６２】
本出願は、より具体的には、ワクチンまたはワクチン組成物、より具体的には、過剰な細胞の膜融合性（cellular fusogenicity）を伴う疾病または状態の治療および/または予防および/または緩和のために向けられたワクチンまたはワクチン組成物であって、前記疾病または状態が、エンベロープに包まれたウイルスの感染（好ましくは、HIVおよび/またはインフルエンザおよび/またはパラインフルエンザおよび/またはラブドウイルスの感染）、アレルギー、自己免疫疾患または移植片拒絶であるワクチンまたはワクチン組成物に関する。かかるワクチンまたはワクチン組成物は、少なくとも本発明による突然変異タンパク質を含み、少なくとも一つの生理学的に許容可能なアジュバントを任意に含む。
【０１６３】
診断および予後の適用：
また本出願は、
・不十分なシンシチウムの形成、たとえば、腫瘍、転移性腫瘍、転移性黒色腫または胎盤の発達不全；あるいは対照的に
・過剰なシンシチウムの形成、たとえば、エンベロープに包まれたウイルスの感染（好ましくは、HIVおよび/またはインフルエンザおよび/またはパラインフルエンザおよび/またはラブドウイルスの感染）、アレルギー、自己免疫疾患または移植片拒絶
を伴う疾病または状態の診断または予後のための方法、より具体的にはインビトロでの方法に関する。
【０１６４】
本発明の診断または予後の方法は、たとえば、診断または予後を受ける患者または被検体から採取された生物学的サンプルなどの生物学的サンプルにおいて、本発明による少なくとも一つの突然変異タンパク質または本発明による少なくとも一つの核酸を検出することを含む。
【０１６５】
この検出は、たとえば、前記サンプル中に含有されるタンパク質または核酸の配列を決定することにより行ってもよい。
【０１６６】
この検出は、たとえば、前記少なくとも一つの突然変異タンパク質に結合する抗体、ペプチドアプタマーまたはオリゴヌクレオチドアプタマーを用いて、より具体的には、本発明の抗体、ペプチドアプタマーまたはオリゴヌクレオチドアプタマーを用いて、本発明の前記少なくとも一つの突然変異タンパク質を検出することにより行ってもよい。
【０１６７】
この検出は、たとえば、前記少なくとも一つの核酸に結合する核酸、ペプチドアプタマーまたはオリゴヌクレオチドアプタマーを用いて、より具体的には、本発明の核酸に相補的な核酸、本発明のペプチドアプタマーまたはオリゴヌクレオチドアプタマーを用いて、本発明の前記少なくとも一つの核酸を検出することにより行ってもよい。
【０１６８】
また本出願は、不十分なシンシチウムの形成または対照的に過剰なシンシチウムの形成の診断または予後のための方法で使用するための、前記抗体、ペプチドアプタマー、オリゴヌクレオチドアプタマー、相補的な核酸に関する。
【０１６９】
生物工学的適用 (スクリーニング)：
また本出願は、シンシチウムの形成を減少させるかまたは遮断することができる化合物をスクリーニングするための方法、より具体的にはインビトロでの方法に関する。本発明の方法は、(たとえば、候補化合物の存在下で達成される融合度を、その非存在下で達成される融合度と比較することにより) 候補化合物が前記細胞の融合を減少させるかまたは遮断するかどうかを決定するために、候補化合物を、本発明の少なくとも一つの突然変異タンパク質を発現する細胞と接触させることを含む。
【０１７０】
かかる化合物は、過剰な細胞の膜融合性（cellular fusogenicity）を伴う疾病または状態、たとえば、エンベロープに包まれたウイルスの感染、アレルギー、自己免疫疾患または移植片拒絶の治療および/または予防および/または緩和のための有効成分候補である。
【０１７１】
生物工学的適用 (骨髄腫、ハイブリドーマ)：
また本出願は、本発明による少なくとも一つの突然変異タンパク質を含む、好ましくは少なくとも一つのかかる突然変異タンパク質をその表面に含む、および/または本発明による少なくとも一つの核酸を含む、および/または本発明による少なくとも一つのベクター、より具体的には本発明による発現ベクターを含む、腫瘍細胞、より具体的には骨髄腫に関する。
【０１７２】
かかる腫瘍細胞、より具体的にはかかる骨髄腫は、とりわけ、(この腫瘍細胞とBリンパ球との融合による)ハイブリドーマの産生、より具体的には抗体産生ハイブリドーマの産生に使用され得る。
【０１７３】
また本出願は、本発明による少なくとも一つの突然変異タンパク質、および/または本発明による少なくとも一つの核酸、および/または本発明による少なくとも一つのベクターを含む、ハイブリドーマ、より具体的には抗体産生ハイブリドーマに関する。かかるハイブリドーマは、とりわけ、本発明による少なくとも一つの突然変異タンパク質を含む、好ましくは少なくとも一つのかかる突然変異タンパク質をその表面に含む、および/または本発明による少なくとも一つの核酸を含む、および/または本発明による少なくとも一つのベクターを含む、少なくとも一つの腫瘍細胞、より具体的には骨髄腫と、少なくとも一つのBリンパ球を接触させることにより産生され得る。かかる腫瘍細胞は、固有の膜融合 (fusogenic) 能力を有する：よって、かかる腫瘍細胞は、従来技術においてハイブリドーマの産生を目的として腫瘍細胞とBリンパ球との融合を誘導するために慣用的に使用されるポリエチレングリコール(PEG)またはエレクトロポレーション法または任意の他の方法を使用することなく、前記少なくとも一つのBリンパ球と融合することができる。
【０１７４】
生物工学的適用 (幹細胞または前駆細胞)：
また本出願は、本発明による少なくとも一つの突然変異タンパク質を含む、好ましくは少なくとも一つのかかる突然変異タンパク質をその表面に含む、および/または本発明による少なくとも一つの核酸を含む、および/または本発明による少なくとも一つのベクター、より具体的には本発明による発現ベクターを含む、幹細胞または前駆細胞に関する。
【０１７５】
かかる幹細胞または前駆細胞は、固有の膜融合 (fusogenic) 能力を有する：よって、かかる幹細胞または前駆細胞は、融合によりシンシチウムを形成することができる。
【０１７６】
この幹細胞または前駆細胞が、筋細胞への分化能力を有している場合、(細胞の融合およびシンシチウムの形成により) 筋繊維を形成することができる。
【０１７７】
よって、本出願はまた、筋繊維の産生、たとえばインビトロでの産生において使用するための、かかる幹細胞または前駆細胞に関する。
【０１７８】
この産生は、たとえば、複数の前記幹細胞または前駆細胞を、互いに接触させて、幹細胞、または適切な場合には前駆細胞の増殖を許容する培地上または培地中に置くことにより行ってもよく、その結果、前記幹細胞または前駆細胞の膜融合(fusogenic)能力が発揮され、これによりシンシチウム、より具体的には筋繊維の形成を誘導することができる。幹細胞、または適切な場合には前駆細胞の増殖を許容し、かつ筋細胞、より具体的には筋繊維への可能な分化能力の発現に適している培地の例は、当業者に公知であり；一例は、MCDB培地である。
【０１７９】
幹細胞または前駆細胞の、筋細胞、より具体的には筋繊維への分化を観察することを許容する細胞マーカーの例は、当業者に公知であり、たとえばCD56である。
【０１８０】
本出願において、“含む(comprising)”の用語は、“包含する(including)”または“含有する(containing)”と同義であり、明示的に指摘されない一または複数の追加のエレメント、成分または工程の存在を除外しないオープンな用語であり、一方、“からなる(consisting)”または“構成される(constituted)”の用語は、明示的に開示されない任意の他の追加のエレメント、工程または成分の存在を除外するクローズした用語である。“から本質的になる(essentially consisting of)”または“により本質的に構成される(essentially constituted by)”の用語は、追加のエレメント、成分または工程が、発明に基づいて特徴に重大な影響を及ぼさない限り、一または複数の追加のエレメント、成分または工程の存在を除外しない部分的にオープンな用語である。
【０１８１】
その結果、“含む(comprising)”(または“comprise(s)”)の用語は、“からなる(consisting of)”、“により構成される（constituted by）”の用語、並びに“から本質的になる(essentially consisting of)”および“により本質的に構成される(essentially constituted by)”の用語を包含する。
【０１８２】
本出願で引用される文献および参照文献の内容は、参照により組み込まれる。
【０１８３】
以下の実施例は、例示のために純粋に記載され、本発明を何ら限定するものではない。
【実施例】
【０１８４】
例１：突然変異体の構築およびそれらの膜融合性（fusogenicity）の測定
材料および方法および：
細胞およびウイルス
細胞株LLC-MK2 (Macaca mulatta腎臓細胞株) は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション (American Type Culture Collection (ATCC)) から受入れ番号CCL-7で入手可能である。
【０１８５】
細胞株A549 (ヒト肺癌細胞株) は、ATCCから受入れ番号CCL-185で入手可能である。
【０１８６】
組換え株HuH7-Tat (ヒト肝癌細胞株) は、HIV-1 TatによるHuH-7株の細胞の形質導入により入手可能である。
【０１８７】
HuH-7株は、ジャパニーズ・コレクション・オブ・リサーチ・バイオリソース（Japanese Collection of Research Bioresources）からリファレンス番号JCRB0403で入手可能である。
【０１８８】
HIV-TatによるHuH-7株の形質導入は、レトロウイルスベクターLXSN-tatを用いて行い、Tatプラスミドを形質導入した。
【０１８９】
細胞LLC-MK2、A549およびHuH7-Tatは、5%ウシ胎仔血清を含むEMEM (イーグル最小必須培地) またはDMEM (ダルベッコ/フォークト改変イーグル最小必須培地) で培養した。
【０１９０】
PIV-5 WR株は、ATCC (ATCC番号VR-288) から入手し、Terrier et al, 2008に記載されるとおりLLC-MK2細胞上で培養した。
【０１９１】
RNAの抽出、RT-PCRおよびクローニング
ウイルスRNAは、PIV-5によるLLC-MK2細胞の感染から得られた上清から、Absolutely RNA(登録商標) Microprep Kit (Stratagene, USA) を用いて、供給業者により提供される説明書に従って抽出した。逆転写は、pd(N)6ランダムヘキサマー (Amersham Biosciences, GB) および鳥類骨髄芽球症ウイルスAMVの逆転写酵素 (Reverse Transcriptase; RT) (Promega から入手可能なAMV-RT逆転写酵素) を用いて行った。
【０１９２】
PIV-5 Ｆの全配列の増幅は、データベースから入手可能なPIV-5のヌクレオチド配列 (GenBank受入れ番号AB021962) から設計されたプライマー対を用いて行った。
【０１９３】
使用されたプライマー対は、以下のとおりであった：
センスプライマー (配列番号 1)：
5' TTGCGGCCGCATGGGTACTATAA 3'
アンチセンスプライマー (配列番号 2)：
5' CCGCTCGAGTTATGATAAACAAAATTCTCC 3'。
【０１９４】
増幅は、以下のプロトコールに従って行った：95℃で2 min、その後39サイクル (95℃/30s、55℃/1 min、72℃/3 min)、および72℃で10 minの最後の伸長。
【０１９５】
PIV-5 Ｆの相補的DNAは、マルチプルクローニングサイトにあるNotIおよびXhoIサイトで、発現プラスミドpcDNA3.1(+) にクローニングした (図４参照)。
【０１９６】
PCR産物およびプラスミドは、それぞれ、Nucleospin(登録商標) ExtractIIキットおよびNucleospin(登録商標) プラスミドキット (Macherey Nagel, Germany) を用いて、供給業者により提供される説明書に従って精製した。
【０１９７】
この研究における配列決定のシリーズは、MWG Biotech (Ebersberg, Germany) により実行した。
【０１９８】
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いた指定突然変異誘発
PIV-5のＦタンパク質の突然変異タンパク質は、PIV-5 Ｆ融合タンパク質をコードするプラスミドpcDNA3.1において、指定突然変異により産生した。突然変異は、供給業者により提供されるプロトコール (Stratageneから入手可能なQuickChange(登録商標) Site-Directed Mutagenesis System) に従って、相補的プライマーを用いたPCRにより作成した。使用されたプライマーのリストは、下記表２に示す。プラスミドのアセンブリは、配列決定により確認した。
【表Ｈ】
【表Ｉ】
【０１９９】
突然変異443Pは、理論的には、WR単離体のＦタンパク質に予め存在する。しかし、発明者らがATCCから受領したこの単離体のサンプルに、この突然変異は実際に存在しなかった。このため、発明者らはそれを導入しなければならなかった。
【０２００】
細胞のトランスフェクション
試薬ExGen500 (Fermentas) を用いて、供給業者により提供される説明書に従って、細胞をプラスミドによりトランスフェクトした。1〜3マイクログラムのプラスミドDNAを、48hの間、細胞 (70〜80% コンフルエンス) に添加した。トランスフェクションの効率は、緑色蛍光タンパク質GFPをコードするプラスミドを用いて評価した。
【０２０１】
共焦点顕微鏡による免疫蛍光法
トランスフェクトされた細胞は、リン酸緩衝生理食塩水PBS中のパラホルムアルデヒド (1% v/v) を用いて固定し、その後、2回洗浄した。PBSで1/10に希釈された、PIV-5 Ｆタンパク質に対するモノクローナル抗体の存在下で、この場合、Randall et al, 1987に記載されるモノクローナル抗体F1aの存在下で、細胞マットを3hの間インキュベートした。モノクローナル抗体F1aは、PIV-5の単離体 (この場合、LN単離体) に対するマウスの免疫処置、ハイブリドーマの調製、および特異的な抗Ｆ抗体の選択により得た。
【０２０２】
その後、細胞マットを洗浄し、PBSで1/200に希釈された抗マウスIgG-Alexa Fluor(登録商標) 633二次抗体 (Invitrogen) とともに30分間インキュベートした。細胞を、すすいだ後、1/1000のDapi (4',6'-ジアミジノ-2-フェニルインドール) とともに、リン酸緩衝生理食塩水PBS中1/200の、Alexa Fluor(登録商標) 488に結合した小麦胚凝集素 (WGA) (Invitrogenから入手可能なWGA-Alexa Fluor(登録商標)) と混合するか、または混合せずに、10分間インキュベートした。TCS SP2共焦点顕微鏡 (Leica) を用いて、画像を取得した。
【０２０３】
フローサイトメトリー
フローサイトメトリーは、文献 (Horvat and Lamb 1992) に記載されるとおり行った。A549細胞を、種々のFusをコードするプラスミドによりトランスフェクトし、氷上に置いた。細胞マットを、1 %のアジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水PBSですすいだ。その後、そのマットに、抗PIV-5 Ｆタンパク質モノクローナル抗体 (この場合、モノクローナル抗体F1a) を添加し (1% ウシ胎仔血清を含む1/500 PBSリン酸緩衝液)、4℃で30分間インキュベートした。その後、そのマットをすすぎ、1/1000のAlexa Fluor(登録商標) 488 に結合した抗マウス二次抗体 (Invitrogen) の存在下でインキュベートした。細胞を、すすいだ後、500μLのPBSリン酸緩衝液、EDTA (エチレンジアミンジアミン四酢酸) 中0.5mMを用いて穏やかに引き離した。細胞を、500μLの1 %パラホルムアルデヒド溶液を含有する専用のフローサイトメトリー管に移した。5000細胞の蛍光強度を、蛍光活性化細胞ソーティングFACSを用いて、この場合、Becton DickinsonからのFACSVantageTM SEフローを用いて測定した。
【０２０４】
半定量的融合テスト (シンシチウムのサイズおよび核の数の関数として確立した融合スコア)
種々のFus発現プラスミドによりトランスフェクトし、免疫蛍光法で観察したマットに、半定量的分析を行った。この分析は、以下の基準を用いて突然変異体の各々について融合スコアを決定することから構成される：
・融合または融合なし (単純な集合)、-/+で表示;
・シンシチウムのサイズ、1〜5のスケールで表示;
・核の数、1〜5のスケールで表示。
【０２０５】
これにより計算されるスコアを、2つの点数を足すことにより得た：このため、最大の理論的点数は、10であり、最大数の核をもつ最大サイズのシンシチウムに相当する。
【０２０６】
定量的融合テスト (ルシフェラーゼ活性の測定)
細胞−細胞融合を定量するために、“ドナー”A549細胞 (6ウェルプレートのウェルあたり2.5百万の細胞) を、種々のFus突然変異タンパク質をコードする2μgのプラスミドpcDNA3.1、並びに長い末端反復配列LTRに依存してルシフェラーゼを発現する50 ngのプラスミドで、同時トランスフェクトした (Lavillette et al, 2007)。
【０２０７】
ネガティブコントロールは、2μgの空のプラスミドpcDNA3.1で同時トランスフェクトした細胞により提供した。
【０２０８】
トランスフェクションから12時間後、“ドナー”細胞を、リン酸緩衝液 (PBS)、EDTA中0.5 mMを用いて引き離し、カウントした後に、新たな6ウェルプレート(105細胞/ウェル)に置き換えた。“インジケーター”HuH7-Tat細胞 (4 × 105細胞/ウェル) を、PBS-EDTA緩衝液を用いて引き離し、その後、すすいで“ドナー”細胞に添加した。
【０２０９】
ルシフェラーゼ活性は、共培養 (co-culture) の72時間後に、ルシフェラーゼ活性測定キットを用いて、この場合、PromegaからのLuciferase Assay System (E1500) キットを用いて、供給業者により提供される指示書に従って測定した。
【０２１０】
結果：
本発明者らにより構築され産生された突然変異タンパク質は、上記表３に示される。
【０２１１】
この表３において、本発明者らは、種々の突然変異を、それらが属する機能に従ってまとめた。すなわち、
・HNに対する自律性の機能への関与： PIV-5のＦタンパク質の22、132および290位；
・融合前の機能への関与：PIV-5のＦタンパク質の49、402、443、447および449位；
・融合後の機能への関与：PIV-5のＦタンパク質の147、158および463位。
【０２１２】
図５Ａ、５Ｂ、５Ｃおよび５Ｄは、表３の突然変異の位置を図示する。
【０２１３】
このように、本発明者らは、突然変異タンパク質を構築し、産生し、試験した。
【表Ｊ】
【表Ｋ】
【表Ｌ】
【表Ｍ】
【表Ｎ】
【表Ｏ】
【表Ｐ】
【０２１４】
これら突然変異タンパク質の構築および産生の間に使用されたPIV-5のＦタンパク質配列は、WR単離体の代替Ｆタンパク質配列であった。この代替配列は、443位のアミノ酸がPでなくSであることを除いて、配列番号31の配列 (Genbank配列) と同じであった (代替配列“443にSを有する配列番号31”)。
【０２１５】
このため、配列番号47〜79の配列は、前述の代替配列“443にSを有する配列番号31”内におけるアミノ酸の置換から得られる配列であり、このアミノ酸の置換は、上記表３に、これら配列の各々について示される。
【０２１６】
半定量的融合テストの間に顕微鏡下で行われた観察の写真を、図６Ａに示す。
【０２１７】
半定量的融合テストの最後に得られたスコアを、図６Ｂに示す。
【０２１８】
突然変異タンパク質Fus 6、Fus 6.1、Fus 6.2およびFus 6.3は、多くの細胞の凝集という結果につながったが、細胞融合という結果につながらなかった。
【０２１９】
突然変異タンパク質Fus 3.3、Fus 3.1、Fus 2、Fus 1.1、Fus 1.2およびFus 1は、ゼロの融合スコアを得た。
【０２２０】
突然変異タンパク質Fus 9、Fus 7、Fus 3、Fus 5およびFus 4は、低い融合スコアを得た。
【０２２１】
Fus 4の融合スコアを超えて、有意な融合スコアを有する一連の突然変異タンパク質が分離した。すなわち、
・自律性の3つの突然変異および融合前の突然変異449Pを共通に含む突然変異タンパク質のグループ、たとえば、突然変異タンパク質Fus8、Fus10、Fus10.4、Fus10.5、Fus11、Fus8.l、Fus8.2、Fus8.4、Fus8.5、Fus8.6、Fus8.7、Fus10.l、Fus10.2、Fus10.3；および
・自律性の3つの突然変異、融合前の突然変異447P、および少なくとも一つの融合後の突然変異 (147Vまたは158V) を共通に含む突然変異タンパク質のグループ、たとえば、Fus7.1、Fus7.2またはFus7.3。
【０２２２】
図７Ａおよび７Ｂは、テストされた突然変異タンパク質の選択物について、顕微鏡観察の写真を示し、融合スコアを示す。すなわち、
・自律性の3つの突然変異；
・融合前の突然変異447P；および
・147および/または158位における少なくとも一つの融合後の突然変異であって、この/これらの位置に疎水性アミノ酸、たとえばV、IまたはLを提示する突然変異、たとえば融合後の突然変異147Vおよび/または融合後の突然変異158V
を共通に含む突然変異タンパク質のグループ、たとえば突然変異タンパク質Fus7.1、Fus7.2およびFus7.3。
【０２２３】
例２：転移性腫瘍組織により特異的に発現される酵素のサイトによる天然の切断サイトの置換
本発明の突然変異タンパク質、およびとりわけ上記表１に記載されるものは、天然のＦタンパク質の天然の切断サイトの置換により、たとえば、それを組織特異的な切断サイトで置換することにより、予め改変された。
【０２２４】
例として、PIV-5のＦタンパク質の天然の切断サイトは、転移性腫瘍組織により特異的に発現される酵素、すなわちマトリクス金属プロテアーゼ9 (MMP-9) のサイトにより置換された。
【０２２５】
PIV-5のＦタンパク質の天然の切断サイトは、以下のとおりである：
RRRRR (配列番号 23)。
【０２２６】
PIV-5のＦタンパク質の天然の切断サイトを含むＦタンパク質配列の断片の例は、以下のとおりである：
IGENLETIRNQLIPTRRRRRFAGVVIGL (配列番号 24)。
【０２２７】
MMP-9切断サイトのコンセンサス配列は、以下のとおりである：
PXXHyS/T (配列番号 27)
ここでX = 任意のアミノ酸、および
ここでHy = 任意の疎水性アミノ酸 (すなわち、F、M、V、L、Iから選択される任意のアミノ酸)。
【０２２８】
MMP-9切断サイトの例は、以下のとおりである：
PRRIT (配列番号 28)。
【０２２９】
MMP-9切断サイトを含む本発明の突然変異Ｆタンパク質配列の断片の例は、以下のとおりである：
IGENLETIRNQLIPTPRRITFAGVVIGL (配列番号 29)。
【０２３０】
材料および方法：
PIV-5のＦタンパク質の突然変異タンパク質は、上記例１に記載されるとおり産生した。
【０２３１】
選択された切断サイト、この場合、配列番号28のMMP-9切断サイトによる天然の切断サイトの置換は、以下のとおり行った：
切断サイトの置換は、融合タンパク質Ｆ PIV-5をコードするプラスミドpcDNA3.1において、3つの連続的な指定突然変異誘発により行った。突然変異は、供給業者により提供されるプロトコール (Stratageneから入手可能なQuickChange(登録商標) Site-Directed Mutagenesis System) に従って、相補的プライマーを用いたPCRにより作成した。プラスミドのアセンブリは、配列決定により確認した。
【０２３２】
1st 突然変異 R98P
センス 5' CCAGTTGATTCCAACTCCGAGGAGACGCCGGTTTGC 3' (配列番号80)
アンチセンス 5' GCAAACCGGCGTCTCCTCGGAGTTGGAATCAACTGG 3' (配列番号81)
2nd 突然変異 R101I
センス 5 ' GATTCCAACTCCGAGGAGAATCCGGTTTGCAGGAGTGGTG 3 ' (配列番号82)
アンチセンス 5 ' CACCACTCCTGCAAACCGGATTCTCCTCGGAGTTGGAATC 3' (配列番号83)
3rd 突然変異 R102T
センス 5' GATTCCAACTCCGAGGAGAATCACGTTTGCAGGAGTGGTGATTGG 3' (配列番号84)
アンチセンス 5' CCAATCACCACTCCTGCAAACGTGATTCTCCTCGGAGTTGGAATC 3' (配列番号85)。
【０２３３】
細胞のトランスフェクション
試薬ExGen500 (Fermentas) を用いて、供給業者により提供される説明書に従って、細胞をプラスミドによりトランスフェクトした。1〜3マイクログラムのプラスミドDNAを、48hの間、細胞 (70〜80% コンフルエンス) に添加した。トランスフェクションの効率は、緑色蛍光タンパク質GFPをコードするプラスミドを用いて評価した。
【０２３４】
共焦点顕微鏡による免疫蛍光法
トランスフェクトされた細胞は、リン酸緩衝生理食塩水PBS中のパラホルムアルデヒド (1% v/v) を用いて固定し、その後、2回洗浄した。PBSで1/10に希釈された、融合タンパク質PIV-5 Ｆに対するモノクローナル抗体の存在下で、この場合、Randall et al, 1987に記載されるモノクローナル抗体F1aの存在下で、細胞マットを3hの間インキュベートした。モノクローナル抗体F1aは、PIV-5の単離体 (この場合、LN単離体) に対するマウスの免疫処置、ハイブリドーマの調製、および特異的な抗Ｆ抗体の選択により得た。
【０２３５】
その後、細胞マットを洗浄し、PBSで1/200に希釈された抗マウスIgG-Alexa Fluor(登録商標) 633二次抗体 (Invitrogen) とともに30分間インキュベートした。細胞を、すすいだ後、1/1000のDapi (4',6'-ジアミジノ-2-フェニルインドール) とともに、リン酸緩衝生理食塩水PBS中1/200の、Alexa Fluor(登録商標) 488に結合した小麦胚凝集素 (WGA) (Invitrogenから入手可能なWGA-Alexa Fluor(登録商標)) と混合するか、または混合せずに、10分間インキュベートした。TCS SP2共焦点顕微鏡 (Leica) を用いて、画像を取得した。
【０２３６】
参照文献
Baker et al, 1999, Mol Cell. 3(3):309-19.
Chatziandreou et al, 2004, Journal of General Virology 85: 3007-3016.
Horvat and Lamb 1992, J. Virol. 66(4): 2443-2455.
Ito et al 1997, J Virol. 71(12): 9855-9858.
Ito et al, 2000, J Gen Virol. 81(Pt 3):719-727.
Gardner and Dutch 2007, J. Virol. 81(15):8303-14.
Gardner et al, 2007, Biochemistry 46(17):5094-5105.
Lavillette D. et al, 2007, J. Virol. 81(16): 8752-8765
Paterson et al, 2000, Virology 270(l):17-30.
Randall et al, 1987, J . Gen. Virol. 68(Pt 1l): 2769-2780
Russell et al, 2003, J. Cell Biol. 163(2):363-74.
Terrier et al, 2008, Journal of Clinical Virology, 2008, 43(1): 86-92.
West et al, 2005, J Virol. 79(3):1543-1551.
【特許請求の範囲】
【請求項１】
突然変異タンパク質であって、そのアミノ酸配列が、
・置換：
○前記PIV-5 Ｆタンパク質の配列における22位のアミノ酸または前記PIV-2 Ｆタンパク質の配列における24位のアミノ酸の、アミノ酸Ｐによる置換；および
○前記PIV-5 Ｆタンパク質の配列における132位のアミノ酸または前記PIV-2 Ｆタンパク質の配列における133位のアミノ酸の、アミノ酸Ｅによる置換；および
○前記PIV-5 Ｆタンパク質の配列における290位のアミノ酸または前記PIV-2 Ｆタンパク質の配列における294位のアミノ酸の、アミノ酸Ａによる置換；および
○前記PIV-5 Ｆタンパク質の配列における447位のアミノ酸または前記PIV-2 Ｆタンパク質の配列における445位のアミノ酸の、アミノ酸Ｐによる置換；
・並びに、置換：
○前記PIV-5 Ｆタンパク質の配列における147位のアミノ酸または前記PIV-2 Ｆタンパク質の配列における151位のアミノ酸の、Ｖ、Ｉ、Ｌから選択される疎水性アミノ酸、好ましくはＶによる置換；および/または
○前記PIV-5 Ｆタンパク質の配列における158位のアミノ酸または前記PIV-2 Ｆタンパク質の配列における162位のアミノ酸の、Ｖ、Ｉ、Ｌから選択される疎水性アミノ酸、好ましくはＶによる置換；
・並びに、任意に：
○前記Ｆタンパク質の天然の切断サイトの、別の酵素的切断サイトによる置換、および/または前記Ｆタンパク質の天然の切断サイト以外の酵素的切断サイトの、前記Ｆタンパク質への挿入；および/または
○前記Ｆタンパク質のＣ-末端部分であって、前記タンパク質のＣ-末端にある最後のアミノ酸からＮ-末端方向に伸張するが、前記Ｆタンパク質のHR2ドメインを超えては伸張しないＣ-末端部分の欠失
によって、PIV-5またはPIV-2ウイルスのＦタンパク質の配列から導き出される配列を含む突然変異タンパク質。
【請求項２】
PIV-5またはPIV-2ウイルスの前記Ｆタンパク質の配列が、配列番号34の配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の突然変異タンパク質。
【請求項３】
前記Ｆタンパク質の配列が、PIV-5のＦタンパク質であることを特徴とする、請求項１または２に記載の突然変異タンパク質。
【請求項４】
前記Ｆタンパク質の配列が、
・配列番号31の配列、または443位のアミノ酸が、この代替配列では（配列番号31のＰの代わりに）Ｓであることを除いて、配列番号31の配列と同じである代替配列；または
・配列番号31の前記配列または前記代替配列の変異配列であって、
○配列番号31の配列と同じサイズであるか、または配列番号31の配列より最大で７アミノ酸だけ大きいサイズであるか、または配列番号31の配列より最大で７アミノ酸だけ小さいサイズであり；
○配列番号31の配列または前記代替配列に対して、95％を超える配列同一性、好ましくは少なくとも96%、より好ましくは少なくとも97％の配列同一性を有し、この同一性は、配列番号31の配列の長さまたは適切な場合には前記代替配列の長さを用いて算出される、変異配列
からなることを特徴とする、請求項３に記載の突然変異タンパク質。
【請求項５】
前記Ｆタンパク質が、配列番号35〜46の配列の一つからなることを特徴とする、請求項４に記載の突然変異タンパク質。
【請求項６】
そのアミノ酸配列が、前記PIV-5 Ｆタンパク質配列に対して他の突然変異を含まないことを特徴とする、請求項３〜５の何れか一項に記載の突然変異タンパク質。
【請求項７】
前記Ｆタンパク質の配列から導き出される前記配列が、配列番号62、63または64の配列である、請求項６に記載の突然変異タンパク質。
【請求項８】
前記Ｆタンパク質の配列から導き出される前記配列が、
○49位のアミノ酸のアミノ酸Ａによる置換；
○402位のアミノ酸のアミノ酸Ａによる置換；
○443位のアミノ酸のアミノ酸Ｐによる置換；
○449位のアミノ酸のアミノ酸Ｐによる置換
から選択される少なくとも一つの融合前の突然変異；および／または
○463位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換
から選択される少なくとも一つの融合後の突然変異
によって、前記Ｆタンパク質配列から更に導き出されることを特徴とする、請求項３〜５の何れか一項に記載の突然変異タンパク質。
【請求項９】
前記Ｆタンパク質の配列から導き出される前記配列が、
○49位のアミノ酸のアミノ酸Ａによる置換；
○402位のアミノ酸のアミノ酸Ａによる置換
から選択される少なくとも一つの融合前の突然変異：および/または
○463位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換
から選択される少なくとも一つの融合後の突然変異
によって、前記Ｆタンパク質配列から更に導き出されることを特徴とする、請求項３〜５および８の何れか一項に記載の突然変異タンパク質。
【請求項１０】
前記Ｆタンパク質の配列から導き出される前記配列が、463位のアミノ酸を疎水性アミノ酸によって置換することにより前記Ｆタンパク質配列から更に導き出されることを特徴とする、請求項３〜５、８および９のに記載の何れか一項に記載の突然変異タンパク質。
【請求項１１】
463位のアミノ酸を置換するために選択される前記疎水性アミノ酸が、Ｖ、Ｉ、Ｌから選択され、好ましくはＶであることを特徴とする、請求項８〜１０の何れか一項に記載の突然変異タンパク質。
【請求項１２】
PIV-5ウイルスのＦタンパク質の配列から導き出される前記配列が、前記PIV-5 Ｆタンパクス質の配列における158位のアミノ酸の、Ｖ、Ｉ、Ｌから選択される疎水性アミノ酸、好ましくはＶによる置換を含むことを特徴とする、請求項３〜１１の何れか一項に記載の突然変異タンパク質。
【請求項１３】
PIV-5ウイルスのＦタンパク質の配列から導き出される前記配列が、前記PIV-5 Ｆタンパクス質の配列における147位のアミノ酸の、Ｖ、Ｉ、Ｌから選択される疎水性アミノ酸、好ましくはＶによる置換を含むことを特徴とする、請求項３〜１１の何れか一項に記載の突然変異タンパク質。
【請求項１４】
前記Ｆタンパク質の配列が、PIV-2のＦタンパク質であることを特徴とする、請求項１または２に記載の突然変異タンパク質。
【請求項１５】
前記Ｆタンパク質の配列が、
・配列番号33の配列；または
・配列番号33の前記配列の変異配列であって、
○配列番号33の配列と同じサイズであるか、または配列番号33の配列より最大で２アミノ酸だけ大きいサイズであるか、または配列番号33の配列より最大で２アミノ酸だけ小さいサイズであり；
○配列番号33の配列に対して、95％を超える配列同一性、好ましくは少なくとも96%、より好ましくは少なくとも97％の配列同一性を有し、この同一性は、配列番号33の配列の長さを用いて算出される、変異配列
からなることを特徴とする、請求項１４に記載の突然変異タンパク質。
【請求項１６】
そのアミノ酸配列が、前記PIV-2 Ｆタンパク質配列に対して他の突然変異を含まないことを特徴とする、請求項１４または１５に記載の突然変異タンパク質。
【請求項１７】
前記Ｆタンパク質の配列から導き出される前記配列が、配列番号88、89、90の配列であることを特徴とする、請求項１６に記載の突然変異タンパク質。
【請求項１８】
前記Ｆタンパク質の配列から導き出される前記配列が、
○53位のアミノ酸のアミノ酸Ａによる置換；
○406位のアミノ酸のアミノ酸Ａによる置換；
○428位のアミノ酸のアミノ酸Ｐによる置換；
○439位のアミノ酸のアミノ酸Ｐによる置換
から選択される少なくとも一つの融合前の突然変異；および/または
○474位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換
から選択される少なくとも一つの融合後の突然変異
によって、前記Ｆタンパク質配列から更に導き出されることを特徴とする、請求項１４または１５に記載の突然変異タンパク質。
【請求項１９】
前記Ｆタンパク質の配列から導き出される前記配列が、
○53位のアミノ酸のアミノ酸Ａによる置換；
○406位のアミノ酸のアミノ酸Ａによる置換
から選択される少なくとも一つの融合前の突然変異；および/または
○474位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換；
から選択される少なくとも一つの融合後の突然変異
によって、前記Ｆタンパク質配列から更に導き出されることを特徴とする、請求項１４、１５、１８の何れか一項に記載の突然変異タンパク質。
【請求項２０】
474位のアミノ酸を置換するために選択される前記疎水性アミノ酸が、Ｖ、Ｉ、Ｌから選択され、好ましくはＶであることを特徴とする、請求項１８または１９に記載の突然変異タンパク質。
【請求項２１】
PIV-2ウイルスのＦタンパク質の配列から導き出される前記配列が、前記PIV-2 Ｆタンパクス質の配列における162位のアミノ酸の、Ｖ、Ｉ、Ｌから選択される疎水性アミノ酸、好ましくはＶによる置換を含むことを特徴とする、請求項１４〜２０の何れか一項に記載の突然変異タンパク質。
【請求項２２】
PIV-2ウイルスのＦタンパク質の配列から導き出される前記配列が、前記PIV-2 Ｆタンパクス質の配列における151位のアミノ酸の、Ｖ、Ｉ、Ｌから選択される疎水性アミノ酸、好ましくはＶによる置換を含むことを特徴とする、請求項１４〜２０の何れか一項に記載の突然変異タンパク質。
【請求項２３】
請求項１〜２２の何れか一項に記載の突然変異タンパク質であって、前記Ｆタンパク質の天然の切断サイトの、別の酵素的切断サイトによる置換により、および/または前記Ｆタンパク質の天然の切断サイト以外の酵素的切断サイトの、前記Ｆタンパク質への挿入により、PIV-5またはPIV-2ウイルスのＦタンパク質の配列から導き出される配列を含むことを特徴とする、突然変異タンパク質。
【請求項２４】
天然の切断サイト以外の前記切断サイトが、組織特異的切断サイトであることを特徴とする、請求項２３に記載の突然変異タンパク質。
【請求項２５】
天然の切断サイト以外の前記切断サイトが、一または複数の腫瘍組織によって酵素特異的に発現される酵素の切断サイトであることを特徴とする、請求項２３または２４に記載の突然変異タンパク質。
【請求項２６】
天然の切断サイト以外の前記切断サイトが、一または複数の転移性組織によって酵素特異的に発現される酵素の切断サイトであることを特徴とする、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の突然変異タンパク質。
【請求項２７】
天然の切断サイト以外の前記切断サイトが、金属プロテアーゼの切断サイトであることを特徴とする、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の突然変異タンパク質。
【請求項２８】
天然の切断サイト以外の前記切断サイトが、マトリクス金属プロテアーゼ９（MMP-9）の切断サイトであることを特徴とする、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の突然変異タンパク質。
【請求項２９】
天然の切断サイト以外の前記切断サイトが、配列ＰＸＸＨｙＳ/Ｔ（配列番号27）を含み、ここで、Ｘ＝任意のアミノ酸であり、Ｈｙ＝Ｆ、Ｍ、Ｖ、Ｌ、Ｉから選択される任意のアミノ酸であることを特徴とする、請求項２３〜２８のいずれか一項に記載の突然変異タンパク質。
【請求項３０】
天然の切断サイト以外の前記切断サイトが、配列PRRIT（配列番号28）および/または配列IGENLETIRNQLIPTPRRITFAGVVIGL（配列番号29）を含むことを特徴とする、請求項２３〜２９のいずれか一項に記載の突然変異タンパク質。
【請求項３１】
請求項１〜３０の何れか一項に記載の突然変異タンパク質をコードする核酸、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、または該核酸の相補的核酸。
【請求項３２】
請求項３１に記載の少なくとも一つの核酸を含む、トランスフェクション、形質導入または形質転換ベクター。
【請求項３３】
発現ベクターであることを特徴とする、請求項３２に記載のベクター。
【請求項３４】
アデノウイルスベクターであることを特徴とする、請求項３３に記載の発現ベクター。
【請求項３５】
前記核酸の発現を調節するためのエレメントを含み、腫瘍細胞、好ましくは転移性細胞、より好ましくは転移性黒色腫細胞において前記核酸の発現を可能にする、アデノウイルスベクターであることを特徴とする、請求項３３または３４に記載の発現ベクター。
【請求項３６】
腫瘍崩壊性のアデノウイルスベクターであることを特徴とする、請求項３３〜３５の何れか一項に記載の発現ベクター。
【請求項３７】
動物細胞、好ましくはヒト細胞、特にヒト腫瘍細胞、好ましくは転移性ヒト細胞のゲノムへの、より好ましくは転移性黒色腫細胞への、前記少なくとも一つの核酸の挿入を可能にするベクターであることを特徴とする、請求項３２に記載のベクター。
【請求項３８】
請求項１〜３０の何れか一項に記載の少なくとも一つの突然変異タンパク質、および/または請求項３１に記載の少なくとも一つの核酸、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、および/または請求項３２〜３７の何れか一項に記載の少なくとも一つのベクターを含むことを特徴とする細胞。
【請求項３９】
ヒト細胞または非ヒト動物細胞であることを特徴とする、請求項３８に記載の細胞。
【請求項４０】
腫瘍細胞、好ましくは転移性細胞、より好ましくは転移性黒色腫細胞であることを特徴とする、請求項３８または３９に記載の細胞。
【請求項４１】
疾病または腫瘍形成状態、好ましくは転移性腫瘍、好ましくは転移性黒色腫の治療および/または予防および/または緩和において使用するための、請求項１〜３０の何れか一項に記載の突然変異タンパク質、請求項３１に記載の核酸、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、請求項３２〜３７の何れか一項に記載のベクター、請求項３８〜４０の何れか一項に記載の細胞。
【請求項４２】
胎盤の発達不全の治療および/または予防および/または緩和において使用するための、請求項１〜３０の何れか一項に記載の突然変異タンパク質、請求項３１に記載の核酸、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、請求項３２〜３７の何れか一項に記載のベクター、請求項３８〜４０の何れか一項に記載の細胞。
【請求項４３】
細胞融合阻害剤であって、
・請求項１〜３０の何れか一項に記載の突然変異タンパク質に対する抗体、または該抗体のＦａｂもしくはＦ（ａｂ’）２断片；
・請求項１〜３０の何れか一項に記載の少なくとも一つの突然変異タンパク質に、または請求項３１に記載の核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡに、特異的に結合する核酸アプタマーまたはペプチドアプタマー；
・請求項１〜３０の何れか一項に記載の少なくとも一つの突然変異タンパク質をその表面で発現する、組換え免疫系細胞、好ましくは組換え樹状細胞；
・請求項３１に記載の核酸のアンチセンス核酸；
・19〜22のヌクレオチドを含有する二本鎖ＲＮＡを含み、かつ請求項３１に記載の核酸に結合できる、低分子干渉（small interfering）ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ
であることを特徴とする細胞融合阻害剤。
【請求項４４】
請求項４３の細胞であって、ヒトまたは非ヒト動物の免疫系細胞、好ましくはヒトまたは非ヒト動物の樹状細胞であり、請求項１〜３０の何れか一項に記載の少なくとも一つの突然変異タンパク質をその表面で発現する細胞。
【請求項４５】
過剰な細胞の膜融合性（cellular fusogenicity）を伴う疾病または状態の治療および/または予防および/または緩和において使用するための、請求項４３の細胞融合阻害剤であって、前記疾病または状態が、エンベロープに包まれたウイルスの感染（好ましくはＨＩＶおよび/またはインフルエンザおよび/またはパラインフルエンザおよび/またはラブドウイルスの感染）、アレルギー、自己免疫疾患または移植片拒絶である、細胞融合阻害剤。
【請求項４６】
過剰な細胞の膜融合性（cellular fusogenicity）を伴う疾病または状態の治療および/または予防および/または緩和において免疫原性剤として使用するための、請求項１〜３０の何れか一項に記載の突然変異タンパク質であって、前記疾病または状態が、エンベロープに包まれたウイルスの感染（好ましくはＨＩＶおよび/またはインフルエンザおよび/またはパラインフルエンザおよび/またはラブドウイルスの感染）、アレルギー、自己免疫疾患または移植片拒絶である、突然変異タンパク質。
【請求項４７】
過剰な細胞の膜融合性（cellular fusogenicity）を伴う疾病または状態の治療および/または予防および/または緩和のためのワクチンであって、前記疾病または状態が、エンベロープに包まれたウイルスの感染（好ましくはＨＩＶおよび/またはインフルエンザおよび/またはパラインフルエンザおよび/またはラブドウイルスの感染）、アレルギー、自己免疫疾患または移植片拒絶であり、請求項１〜３０の何れか一項に記載の突然変異タンパク質を少なくとも含むことを特徴とするワクチン。
【請求項４８】
不十分な又は対照的に過剰なシンシチウムの形成を伴う疾病の診断または予後のためのインビトロでの方法であって、生物学的サンプルにおいて、請求項１〜３０の何れか一項に記載の少なくとも一つの突然変異タンパク質または請求項３１に記載の少なくとも一つの核酸を検出することを含むことを特徴とするインビトロでの方法。
【請求項４９】
シンシチウムの形成を減少させるかまたは遮断することができる化合物をスクリーニングするためのインビトロでの方法であって、候補化合物が前記細胞の融合を減少させるかまたは遮断するかどうかを決定するために、候補化合物を請求項１〜３０の何れか一項に記載の少なくとも一つの突然変異タンパク質と接触させることを含むことを特徴とするインビトロでの方法。
【請求項５０】
請求項１〜３０の何れか一項に記載の少なくとも一つの突然変異タンパク質を含み、好ましくは少なくとも一つの該突然変異タンパク質をその表面に含み、および/または請求項３１に記載の少なくとも一つの核酸を含み、および/または請求項３２、３７の何れか一項に記載の少なくとも一つのベクターを含む、腫瘍細胞、特に骨髄腫。
【請求項５１】
ハイブリドーマの産生において使用するための、請求項５０に記載の腫瘍細胞、特に骨髄腫。
【請求項５２】
請求項１〜３０の何れか一項に記載の少なくとも一つの突然変異タンパク質、および/または請求項３１に記載の少なくとも一つの核酸、および/または請求項３２、３７の何れか一項に記載の少なくとも一つのベクターを含むことを特徴とするハイブリドーマ。
【請求項５３】
筋細胞への分化の能力を有する幹細胞または前駆細胞であって、請求項１〜３０の何れか一項に記載の少なくとも一つの突然変異タンパク質を含み、好ましくは少なくとも一つの該突然変異タンパク質をその表面に含み、および/または請求項３１に記載の少なくとも一つの核酸を含み、および/または請求項３２、３７の何れか一項に記載の少なくとも一つのベクターを含むことを特徴とし、前記細胞はヒト胚細胞ではない、幹細胞または前駆細胞。
【請求項５４】
筋繊維幹細胞または前駆細胞としての使用のための、請求項５３の幹細胞または前駆細胞。
【請求項１】
突然変異タンパク質であって、そのアミノ酸配列が、
・置換：
○前記PIV-5 Ｆタンパク質の配列における22位のアミノ酸または前記PIV-2 Ｆタンパク質の配列における24位のアミノ酸の、アミノ酸Ｐによる置換；および
○前記PIV-5 Ｆタンパク質の配列における132位のアミノ酸または前記PIV-2 Ｆタンパク質の配列における133位のアミノ酸の、アミノ酸Ｅによる置換；および
○前記PIV-5 Ｆタンパク質の配列における290位のアミノ酸または前記PIV-2 Ｆタンパク質の配列における294位のアミノ酸の、アミノ酸Ａによる置換；および
○前記PIV-5 Ｆタンパク質の配列における447位のアミノ酸または前記PIV-2 Ｆタンパク質の配列における445位のアミノ酸の、アミノ酸Ｐによる置換；
・並びに、置換：
○前記PIV-5 Ｆタンパク質の配列における147位のアミノ酸または前記PIV-2 Ｆタンパク質の配列における151位のアミノ酸の、Ｖ、Ｉ、Ｌから選択される疎水性アミノ酸、好ましくはＶによる置換；および/または
○前記PIV-5 Ｆタンパク質の配列における158位のアミノ酸または前記PIV-2 Ｆタンパク質の配列における162位のアミノ酸の、Ｖ、Ｉ、Ｌから選択される疎水性アミノ酸、好ましくはＶによる置換；
・並びに、任意に：
○前記Ｆタンパク質の天然の切断サイトの、別の酵素的切断サイトによる置換、および/または前記Ｆタンパク質の天然の切断サイト以外の酵素的切断サイトの、前記Ｆタンパク質への挿入；および/または
○前記Ｆタンパク質のＣ-末端部分であって、前記タンパク質のＣ-末端にある最後のアミノ酸からＮ-末端方向に伸張するが、前記Ｆタンパク質のHR2ドメインを超えては伸張しないＣ-末端部分の欠失
によって、PIV-5またはPIV-2ウイルスのＦタンパク質の配列から導き出される配列を含む突然変異タンパク質。
【請求項２】
PIV-5またはPIV-2ウイルスの前記Ｆタンパク質の配列が、配列番号34の配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の突然変異タンパク質。
【請求項３】
前記Ｆタンパク質の配列が、PIV-5のＦタンパク質であることを特徴とする、請求項１または２に記載の突然変異タンパク質。
【請求項４】
前記Ｆタンパク質の配列が、
・配列番号31の配列、または443位のアミノ酸が、この代替配列では（配列番号31のＰの代わりに）Ｓであることを除いて、配列番号31の配列と同じである代替配列；または
・配列番号31の前記配列または前記代替配列の変異配列であって、
○配列番号31の配列と同じサイズであるか、または配列番号31の配列より最大で７アミノ酸だけ大きいサイズであるか、または配列番号31の配列より最大で７アミノ酸だけ小さいサイズであり；
○配列番号31の配列または前記代替配列に対して、95％を超える配列同一性、好ましくは少なくとも96%、より好ましくは少なくとも97％の配列同一性を有し、この同一性は、配列番号31の配列の長さまたは適切な場合には前記代替配列の長さを用いて算出される、変異配列
からなることを特徴とする、請求項３に記載の突然変異タンパク質。
【請求項５】
前記Ｆタンパク質が、配列番号35〜46の配列の一つからなることを特徴とする、請求項４に記載の突然変異タンパク質。
【請求項６】
そのアミノ酸配列が、前記PIV-5 Ｆタンパク質配列に対して他の突然変異を含まないことを特徴とする、請求項３〜５の何れか一項に記載の突然変異タンパク質。
【請求項７】
前記Ｆタンパク質の配列から導き出される前記配列が、配列番号62、63または64の配列である、請求項６に記載の突然変異タンパク質。
【請求項８】
前記Ｆタンパク質の配列から導き出される前記配列が、
○49位のアミノ酸のアミノ酸Ａによる置換；
○402位のアミノ酸のアミノ酸Ａによる置換；
○443位のアミノ酸のアミノ酸Ｐによる置換；
○449位のアミノ酸のアミノ酸Ｐによる置換
から選択される少なくとも一つの融合前の突然変異；および／または
○463位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換
から選択される少なくとも一つの融合後の突然変異
によって、前記Ｆタンパク質配列から更に導き出されることを特徴とする、請求項３〜５の何れか一項に記載の突然変異タンパク質。
【請求項９】
前記Ｆタンパク質の配列から導き出される前記配列が、
○49位のアミノ酸のアミノ酸Ａによる置換；
○402位のアミノ酸のアミノ酸Ａによる置換
から選択される少なくとも一つの融合前の突然変異：および/または
○463位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換
から選択される少なくとも一つの融合後の突然変異
によって、前記Ｆタンパク質配列から更に導き出されることを特徴とする、請求項３〜５および８の何れか一項に記載の突然変異タンパク質。
【請求項１０】
前記Ｆタンパク質の配列から導き出される前記配列が、463位のアミノ酸を疎水性アミノ酸によって置換することにより前記Ｆタンパク質配列から更に導き出されることを特徴とする、請求項３〜５、８および９のに記載の何れか一項に記載の突然変異タンパク質。
【請求項１１】
463位のアミノ酸を置換するために選択される前記疎水性アミノ酸が、Ｖ、Ｉ、Ｌから選択され、好ましくはＶであることを特徴とする、請求項８〜１０の何れか一項に記載の突然変異タンパク質。
【請求項１２】
PIV-5ウイルスのＦタンパク質の配列から導き出される前記配列が、前記PIV-5 Ｆタンパクス質の配列における158位のアミノ酸の、Ｖ、Ｉ、Ｌから選択される疎水性アミノ酸、好ましくはＶによる置換を含むことを特徴とする、請求項３〜１１の何れか一項に記載の突然変異タンパク質。
【請求項１３】
PIV-5ウイルスのＦタンパク質の配列から導き出される前記配列が、前記PIV-5 Ｆタンパクス質の配列における147位のアミノ酸の、Ｖ、Ｉ、Ｌから選択される疎水性アミノ酸、好ましくはＶによる置換を含むことを特徴とする、請求項３〜１１の何れか一項に記載の突然変異タンパク質。
【請求項１４】
前記Ｆタンパク質の配列が、PIV-2のＦタンパク質であることを特徴とする、請求項１または２に記載の突然変異タンパク質。
【請求項１５】
前記Ｆタンパク質の配列が、
・配列番号33の配列；または
・配列番号33の前記配列の変異配列であって、
○配列番号33の配列と同じサイズであるか、または配列番号33の配列より最大で２アミノ酸だけ大きいサイズであるか、または配列番号33の配列より最大で２アミノ酸だけ小さいサイズであり；
○配列番号33の配列に対して、95％を超える配列同一性、好ましくは少なくとも96%、より好ましくは少なくとも97％の配列同一性を有し、この同一性は、配列番号33の配列の長さを用いて算出される、変異配列
からなることを特徴とする、請求項１４に記載の突然変異タンパク質。
【請求項１６】
そのアミノ酸配列が、前記PIV-2 Ｆタンパク質配列に対して他の突然変異を含まないことを特徴とする、請求項１４または１５に記載の突然変異タンパク質。
【請求項１７】
前記Ｆタンパク質の配列から導き出される前記配列が、配列番号88、89、90の配列であることを特徴とする、請求項１６に記載の突然変異タンパク質。
【請求項１８】
前記Ｆタンパク質の配列から導き出される前記配列が、
○53位のアミノ酸のアミノ酸Ａによる置換；
○406位のアミノ酸のアミノ酸Ａによる置換；
○428位のアミノ酸のアミノ酸Ｐによる置換；
○439位のアミノ酸のアミノ酸Ｐによる置換
から選択される少なくとも一つの融合前の突然変異；および/または
○474位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換
から選択される少なくとも一つの融合後の突然変異
によって、前記Ｆタンパク質配列から更に導き出されることを特徴とする、請求項１４または１５に記載の突然変異タンパク質。
【請求項１９】
前記Ｆタンパク質の配列から導き出される前記配列が、
○53位のアミノ酸のアミノ酸Ａによる置換；
○406位のアミノ酸のアミノ酸Ａによる置換
から選択される少なくとも一つの融合前の突然変異；および/または
○474位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換；
から選択される少なくとも一つの融合後の突然変異
によって、前記Ｆタンパク質配列から更に導き出されることを特徴とする、請求項１４、１５、１８の何れか一項に記載の突然変異タンパク質。
【請求項２０】
474位のアミノ酸を置換するために選択される前記疎水性アミノ酸が、Ｖ、Ｉ、Ｌから選択され、好ましくはＶであることを特徴とする、請求項１８または１９に記載の突然変異タンパク質。
【請求項２１】
PIV-2ウイルスのＦタンパク質の配列から導き出される前記配列が、前記PIV-2 Ｆタンパクス質の配列における162位のアミノ酸の、Ｖ、Ｉ、Ｌから選択される疎水性アミノ酸、好ましくはＶによる置換を含むことを特徴とする、請求項１４〜２０の何れか一項に記載の突然変異タンパク質。
【請求項２２】
PIV-2ウイルスのＦタンパク質の配列から導き出される前記配列が、前記PIV-2 Ｆタンパクス質の配列における151位のアミノ酸の、Ｖ、Ｉ、Ｌから選択される疎水性アミノ酸、好ましくはＶによる置換を含むことを特徴とする、請求項１４〜２０の何れか一項に記載の突然変異タンパク質。
【請求項２３】
請求項１〜２２の何れか一項に記載の突然変異タンパク質であって、前記Ｆタンパク質の天然の切断サイトの、別の酵素的切断サイトによる置換により、および/または前記Ｆタンパク質の天然の切断サイト以外の酵素的切断サイトの、前記Ｆタンパク質への挿入により、PIV-5またはPIV-2ウイルスのＦタンパク質の配列から導き出される配列を含むことを特徴とする、突然変異タンパク質。
【請求項２４】
天然の切断サイト以外の前記切断サイトが、組織特異的切断サイトであることを特徴とする、請求項２３に記載の突然変異タンパク質。
【請求項２５】
天然の切断サイト以外の前記切断サイトが、一または複数の腫瘍組織によって酵素特異的に発現される酵素の切断サイトであることを特徴とする、請求項２３または２４に記載の突然変異タンパク質。
【請求項２６】
天然の切断サイト以外の前記切断サイトが、一または複数の転移性組織によって酵素特異的に発現される酵素の切断サイトであることを特徴とする、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の突然変異タンパク質。
【請求項２７】
天然の切断サイト以外の前記切断サイトが、金属プロテアーゼの切断サイトであることを特徴とする、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の突然変異タンパク質。
【請求項２８】
天然の切断サイト以外の前記切断サイトが、マトリクス金属プロテアーゼ９（MMP-9）の切断サイトであることを特徴とする、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の突然変異タンパク質。
【請求項２９】
天然の切断サイト以外の前記切断サイトが、配列ＰＸＸＨｙＳ/Ｔ（配列番号27）を含み、ここで、Ｘ＝任意のアミノ酸であり、Ｈｙ＝Ｆ、Ｍ、Ｖ、Ｌ、Ｉから選択される任意のアミノ酸であることを特徴とする、請求項２３〜２８のいずれか一項に記載の突然変異タンパク質。
【請求項３０】
天然の切断サイト以外の前記切断サイトが、配列PRRIT（配列番号28）および/または配列IGENLETIRNQLIPTPRRITFAGVVIGL（配列番号29）を含むことを特徴とする、請求項２３〜２９のいずれか一項に記載の突然変異タンパク質。
【請求項３１】
請求項１〜３０の何れか一項に記載の突然変異タンパク質をコードする核酸、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、または該核酸の相補的核酸。
【請求項３２】
請求項３１に記載の少なくとも一つの核酸を含む、トランスフェクション、形質導入または形質転換ベクター。
【請求項３３】
発現ベクターであることを特徴とする、請求項３２に記載のベクター。
【請求項３４】
アデノウイルスベクターであることを特徴とする、請求項３３に記載の発現ベクター。
【請求項３５】
前記核酸の発現を調節するためのエレメントを含み、腫瘍細胞、好ましくは転移性細胞、より好ましくは転移性黒色腫細胞において前記核酸の発現を可能にする、アデノウイルスベクターであることを特徴とする、請求項３３または３４に記載の発現ベクター。
【請求項３６】
腫瘍崩壊性のアデノウイルスベクターであることを特徴とする、請求項３３〜３５の何れか一項に記載の発現ベクター。
【請求項３７】
動物細胞、好ましくはヒト細胞、特にヒト腫瘍細胞、好ましくは転移性ヒト細胞のゲノムへの、より好ましくは転移性黒色腫細胞への、前記少なくとも一つの核酸の挿入を可能にするベクターであることを特徴とする、請求項３２に記載のベクター。
【請求項３８】
請求項１〜３０の何れか一項に記載の少なくとも一つの突然変異タンパク質、および/または請求項３１に記載の少なくとも一つの核酸、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、および/または請求項３２〜３７の何れか一項に記載の少なくとも一つのベクターを含むことを特徴とする細胞。
【請求項３９】
ヒト細胞または非ヒト動物細胞であることを特徴とする、請求項３８に記載の細胞。
【請求項４０】
腫瘍細胞、好ましくは転移性細胞、より好ましくは転移性黒色腫細胞であることを特徴とする、請求項３８または３９に記載の細胞。
【請求項４１】
疾病または腫瘍形成状態、好ましくは転移性腫瘍、好ましくは転移性黒色腫の治療および/または予防および/または緩和において使用するための、請求項１〜３０の何れか一項に記載の突然変異タンパク質、請求項３１に記載の核酸、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、請求項３２〜３７の何れか一項に記載のベクター、請求項３８〜４０の何れか一項に記載の細胞。
【請求項４２】
胎盤の発達不全の治療および/または予防および/または緩和において使用するための、請求項１〜３０の何れか一項に記載の突然変異タンパク質、請求項３１に記載の核酸、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、請求項３２〜３７の何れか一項に記載のベクター、請求項３８〜４０の何れか一項に記載の細胞。
【請求項４３】
細胞融合阻害剤であって、
・請求項１〜３０の何れか一項に記載の突然変異タンパク質に対する抗体、または該抗体のＦａｂもしくはＦ（ａｂ’）２断片；
・請求項１〜３０の何れか一項に記載の少なくとも一つの突然変異タンパク質に、または請求項３１に記載の核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡに、特異的に結合する核酸アプタマーまたはペプチドアプタマー；
・請求項１〜３０の何れか一項に記載の少なくとも一つの突然変異タンパク質をその表面で発現する、組換え免疫系細胞、好ましくは組換え樹状細胞；
・請求項３１に記載の核酸のアンチセンス核酸；
・19〜22のヌクレオチドを含有する二本鎖ＲＮＡを含み、かつ請求項３１に記載の核酸に結合できる、低分子干渉（small interfering）ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ
であることを特徴とする細胞融合阻害剤。
【請求項４４】
請求項４３の細胞であって、ヒトまたは非ヒト動物の免疫系細胞、好ましくはヒトまたは非ヒト動物の樹状細胞であり、請求項１〜３０の何れか一項に記載の少なくとも一つの突然変異タンパク質をその表面で発現する細胞。
【請求項４５】
過剰な細胞の膜融合性（cellular fusogenicity）を伴う疾病または状態の治療および/または予防および/または緩和において使用するための、請求項４３の細胞融合阻害剤であって、前記疾病または状態が、エンベロープに包まれたウイルスの感染（好ましくはＨＩＶおよび/またはインフルエンザおよび/またはパラインフルエンザおよび/またはラブドウイルスの感染）、アレルギー、自己免疫疾患または移植片拒絶である、細胞融合阻害剤。
【請求項４６】
過剰な細胞の膜融合性（cellular fusogenicity）を伴う疾病または状態の治療および/または予防および/または緩和において免疫原性剤として使用するための、請求項１〜３０の何れか一項に記載の突然変異タンパク質であって、前記疾病または状態が、エンベロープに包まれたウイルスの感染（好ましくはＨＩＶおよび/またはインフルエンザおよび/またはパラインフルエンザおよび/またはラブドウイルスの感染）、アレルギー、自己免疫疾患または移植片拒絶である、突然変異タンパク質。
【請求項４７】
過剰な細胞の膜融合性（cellular fusogenicity）を伴う疾病または状態の治療および/または予防および/または緩和のためのワクチンであって、前記疾病または状態が、エンベロープに包まれたウイルスの感染（好ましくはＨＩＶおよび/またはインフルエンザおよび/またはパラインフルエンザおよび/またはラブドウイルスの感染）、アレルギー、自己免疫疾患または移植片拒絶であり、請求項１〜３０の何れか一項に記載の突然変異タンパク質を少なくとも含むことを特徴とするワクチン。
【請求項４８】
不十分な又は対照的に過剰なシンシチウムの形成を伴う疾病の診断または予後のためのインビトロでの方法であって、生物学的サンプルにおいて、請求項１〜３０の何れか一項に記載の少なくとも一つの突然変異タンパク質または請求項３１に記載の少なくとも一つの核酸を検出することを含むことを特徴とするインビトロでの方法。
【請求項４９】
シンシチウムの形成を減少させるかまたは遮断することができる化合物をスクリーニングするためのインビトロでの方法であって、候補化合物が前記細胞の融合を減少させるかまたは遮断するかどうかを決定するために、候補化合物を請求項１〜３０の何れか一項に記載の少なくとも一つの突然変異タンパク質と接触させることを含むことを特徴とするインビトロでの方法。
【請求項５０】
請求項１〜３０の何れか一項に記載の少なくとも一つの突然変異タンパク質を含み、好ましくは少なくとも一つの該突然変異タンパク質をその表面に含み、および/または請求項３１に記載の少なくとも一つの核酸を含み、および/または請求項３２、３７の何れか一項に記載の少なくとも一つのベクターを含む、腫瘍細胞、特に骨髄腫。
【請求項５１】
ハイブリドーマの産生において使用するための、請求項５０に記載の腫瘍細胞、特に骨髄腫。
【請求項５２】
請求項１〜３０の何れか一項に記載の少なくとも一つの突然変異タンパク質、および/または請求項３１に記載の少なくとも一つの核酸、および/または請求項３２、３７の何れか一項に記載の少なくとも一つのベクターを含むことを特徴とするハイブリドーマ。
【請求項５３】
筋細胞への分化の能力を有する幹細胞または前駆細胞であって、請求項１〜３０の何れか一項に記載の少なくとも一つの突然変異タンパク質を含み、好ましくは少なくとも一つの該突然変異タンパク質をその表面に含み、および/または請求項３１に記載の少なくとも一つの核酸を含み、および/または請求項３２、３７の何れか一項に記載の少なくとも一つのベクターを含むことを特徴とし、前記細胞はヒト胚細胞ではない、幹細胞または前駆細胞。
【請求項５４】
筋繊維幹細胞または前駆細胞としての使用のための、請求項５３の幹細胞または前駆細胞。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５−１】
【図５−２】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５−１】
【図５−２】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【公表番号】特表２０１２−５０９０７６（Ｐ２０１２−５０９０７６Ａ）
【公表日】平成２４年４月１９日（２０１２．４．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３６９１８（Ｐ２０１１−５３６９１８）
【出願日】平成２１年１１月１７日（２００９．１１．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００９／００１３１７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０５８０９９
【国際公開日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【出願人】（５００１７４６６１）サントル・ナショナル・ドゥ・ラ・レシェルシュ・サイエンティフィーク−セ・エン・エール・エス− (54)
【出願人】（５１１１２３６８１）ウニベルジテ・クロード・ベルナール・ドゥ・リヨン １ (2)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＣＬＡＵＤＥ ＢＥＲＮＡＲＤ ＤＥ ＬＹＯＮ １
【住所又は居所原語表記】４３， Ｂｄ ｄｕ １１ Ｎｏｖｅｍｂｒｅ １９１８， ６９６２２ ＶＩＬＬＥＵＲＢＡＮＮＥ ＣＥＤＥＸ， Ｆｒａｎｃｅ
【出願人】（５１００１７４９１）
【氏名又は名称原語表記】ＬＥＳ ＨＯＳＰＩＣＥＳ ＣＩＶＩＬＳ ＤＥ ＬＹＯＮ
【住所又は居所原語表記】１６２， ａｖｅｎｕｅ Ｌａｃａｓｓａｇｎｅ−Ｂａｔｉｍｅｎｔ Ａ， ６９４２４ ＬＹＯＮ ＣＥＤＥＸ ０３， Ｆｒａｎｃｅ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年４月１９日（２０１２．４．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１１月１７日（２００９．１１．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００９／００１３１７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０５８０９９
【国際公開日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【出願人】（５００１７４６６１）サントル・ナショナル・ドゥ・ラ・レシェルシュ・サイエンティフィーク−セ・エン・エール・エス− (54)
【出願人】（５１１１２３６８１）ウニベルジテ・クロード・ベルナール・ドゥ・リヨン １ (2)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＣＬＡＵＤＥ ＢＥＲＮＡＲＤ ＤＥ ＬＹＯＮ １
【住所又は居所原語表記】４３， Ｂｄ ｄｕ １１ Ｎｏｖｅｍｂｒｅ １９１８， ６９６２２ ＶＩＬＬＥＵＲＢＡＮＮＥ ＣＥＤＥＸ， Ｆｒａｎｃｅ
【出願人】（５１００１７４９１）
【氏名又は名称原語表記】ＬＥＳ ＨＯＳＰＩＣＥＳ ＣＩＶＩＬＳ ＤＥ ＬＹＯＮ
【住所又は居所原語表記】１６２， ａｖｅｎｕｅ Ｌａｃａｓｓａｇｎｅ−Ｂａｔｉｍｅｎｔ Ａ， ６９４２４ ＬＹＯＮ ＣＥＤＥＸ ０３， Ｆｒａｎｃｅ
【Ｆターム（参考）】
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