ＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤
Ｎ−メチルピロール単位（以下Ｐｙとも言う）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（以下Ｉｍとも言う）及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ヒトトランスフォーミング成長因子β１（以下ｈＴＧＦ−β１とも言う）プロモーターの以下に示す塩基配列−５５７〜−５３６ ＴＡＡＡＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＴＣＴＴＡＣＡＧの一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域と言う）の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ−Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含んでなるＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はトランスフォーミング増殖因子ＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤、ＴＧＦ−β関連疾患の治療薬、及び新規なピロールイミダゾールポリアミドに関する。より詳細には特定の構造を有するピロールイミダゾールポリアミドを含んでなるＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
本態性高血圧症は脳卒中、虚血性心疾患及び腎硬化症等の重篤な合併症を引き起こすが、これらの合併症は、基本的には血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）の過剰増殖による血管障害と関連しており、高血圧症の治療の対象となっている。また、狭心症、心筋梗塞の治療のために行われる経皮的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）後の約４割に冠動脈の再狭窄が起こるが、今のところこれに対する有効な薬物療法がなく、循環器領域で大きな問題となっている。病理組織的には、高血圧症性血管疾患のような動脈増殖性疾患、血管形成術後の新生内膜形成及びアテローム性動脈硬化には、ＴＧＦ−βが関連していることが知られている。かかる病態における細胞増殖は種々の作用機構によって抑制することができると考えられるが、そのうちの１つが、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）発現を抑制することである。
【０００３】
ＴＧＦは当初、Ｍｏｌｏｎｙ肉腫ウイルス（ＭＳＶ）によりトランスフォームされたマウス３Ｔ３細胞が正常細胞を悪性に変える因子として見出され、主としてＴＧＦ−αとＴＧＦ−βに大別される。ＴＧＦ−βは、前駆体として合成された３９０〜４１２個のアミノ酸からなる分子量約４０，０００のタンパク質のＣ末端側の１１２個のアミノ酸からなる部分が、ジスルフィド結合を介して二量体（２５ｋＤａ）を構成して活性を持ったものである。
【０００４】
ＴＧＦ−βは、細胞の成長と発生を調節する蛋白質の一つのファミリーを構成し（非特許文献１）、血管、血小板、肝臓、腎臓、心筋、肺、膵臓、皮膚、胎盤、骨髄などの種々の組織で産生され、細胞の増殖、細胞外マトリックスの形成、免疫能の調節作用をもつ。
【０００５】
ＴＧＦ−βは殆んどの細胞に対して増殖抑制に働くが、線維芽細胞、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）などの間葉系細胞に対しては二相性増殖作用をもつ。つまりこれらの細胞では通常状態では増殖抑制に働くが、炎症、機械的ストレスなどが加わると増殖刺激に働く。これらのことから、ＴＧＦ−βはＶＳＭＣ増殖と細胞外マトリクス形成を促進することにより血管傷害後の新生内膜形成に関与している。ＴＧＦ−βはまた、動脈硬化症の病巣の形成にも関与している。このような情報に基づいて、ＴＧＦ−βの効果を調節することに向けられた局所血管療法が上記の血管増殖性疾患の軽減に有効と考えられる。
【０００６】
また、ＴＧＦ−βは経皮的腎動脈形成術後の腎動脈の再狭窄にも関与していると考えられている。これらの事実から、本発明のＴＧＦ−β特異的発現抑制薬は、上記の各種血管増殖・狭搾性疾患に対する治療薬として有効である。
【０００７】
また、肝臓の繊維化の過程で、肝星細胞は細胞外マトリックス産生において重要な役割を果たしている（非特許文献２）。星細胞の活性化はＴＧＦ−β１により行われ、更に活性化星細胞により、障害肝では炎症細胞からのＴＧＦ−β１の分泌が引き起こされる。同時に活性化星細胞のＴＧＦ−β１受容体発現が亢進し、ＴＧＦ−β１によるオートクライン機序により細胞外マトリックス蛋白を増加させる（非特許文献３）。これらの事実から、本発明のＴＧＦ−β１特異的発現抑制薬は、上記の各種肝疾患に対する治療薬としても有効であると合理的に考えることができる。
【０００８】
また、ＩｇＡ腎症、巣状糸球体硬化症、半月体形成性腎炎、巣状硬化型ループス腎炎、びまん性増殖性ループス腎炎、糖尿病性腎症、高血圧性腎硬化症等の腎疾患のモデル動物、又は糸球体腎炎や糖尿病性腎症患者の腎生検組織でＴＧＦ−βの発現が細胞外基質と並行して増加している（非特許文献４、非特許文献５）また同時にＢｏｒｄｅｒらは、抗ＴＧＦ−βをＴｈｙ−１腎炎ラットに投与すると、腎糸球体の細胞外基質の蓄積を抑制することを報告した（非特許文献５）。これらの事実から、本発明のＴＧＦ−β１特異的発現抑制薬は、上記の各種腎疾患に対する治療薬としても有効であると合理的に考えることができる。
【０００９】
また、動物の心筋梗塞モデルにおいては、瘢痕形成期の梗塞巣で、ＴＧＦ−βの発現が持続的に亢進し、心筋繊維化の促進に関与している（非特許文献６）。これらの事実から、本発明のＴＧＦ−β１特異的発現抑制薬は、心筋梗塞後の心筋繊維化に対する治療薬としても有効であると合理的に考えることができる。
【００１０】
また、肺繊維症モデル動物に抗ＴＧＦ−β抗体やＴＧＦ−β可溶性レセプターを投与することにより肺繊維症が改善する（非特許文献７）。これらの事実から、本発明のＴＧＦ−β１特異的発現抑制薬は、肺繊維症に対する治療薬としても有効であると合理的に考えることができる。
【００１１】
また、ヒト慢性膵炎におけるＴＧＦ−β１の高発現については多数報告されているが、再発性急性膵炎のモデル動物に組換えＴＧＦ−βを投与すると、膵の炎症部分の繊維化やフィブロネクチンｍＲＮＡの高発現を引き起こし、逆に膵炎のモデル作成時にＴＧＦ−β１の中和抗体を投与すると、細胞外マトリックスの産生及びＩ・ＩＩＩ型コラーゲンやフィブロネクチンのｍＲＮＡ発現が抑制されることが明らかにされている（非特許文献８）。これらの事実から、本発明のＴＧＦ−β１特異的発現抑制薬は、慢性膵炎における繊維化に対する治療薬としても有効であると合理的に考えることができる。
【００１２】
また、強皮症の原因としＴＧＦ−βが提唱され、森らは皮膚繊維化モデルマウスにおいて、ＴＧＦ−βが皮膚繊維化を誘導することを報告した（非特許文献９）。これらの事実から、本発明のＴＧＦ−β１特異的発現抑制薬は、各種皮膚繊維化疾患に対する治療薬としても有効であると合理的に考えることができる。
【００１３】
また、骨髄繊維症の患者の巨核球ではＴＧＦ−β ｍＲＮＡの発現が亢進しており（非特許文献１０）、血小板内ＴＧＦ−β濃度は高値（非特許文献１１）で、患者の血漿中ＴＧＦ−β濃度は有意に高い（非特許文献１２）と報告されている。Ｒａｍｅｓｈｗａｒらによると骨髄繊維症の患者の単球は粘着によってＮＦ−ｋが活性化してＩＬ−１産生を誘導し、ＩＬ−１はＴＧＦ−β産生を亢進させて骨髄の繊維化を惹起している（非特許文献１３）。これらの事実から、本発明のＴＧＦ−β１特異的発現抑制薬は、骨髄繊維症に対する治療薬としても有効であると合理的に考えることができる。
【００１４】
また、男性型前頭部脱毛患者の培養細胞系において、男性ホルモンが皮膚乳頭細胞からＴＧＦ−β１が誘導され、このＴＧＦ−β１が表皮細胞増殖を抑制させることが報告されている（非特許文献１４）。これらの事実から、本発明のＴＧＦ−β１特異的発現抑制薬は、男性型前頭部脱毛に対する治療薬としても有効であると合理的に考えることができる。
【００１５】
逆遺伝学による遺伝子機能の不活性化の手法は、ある特定の遺伝子の機能を解析するために用いられるものであるが、一方でウイルス感染、癌、及び遺伝子の異常発現に基づくその他の疾病の治療にも大きな可能性を開いている。すなわち、遺伝子機能の不活性化を、相同的組換えによりＤＮＡレベルで、又はアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドやリボザイムによりＲＮＡレベルで実施することができることが知られている。しかし、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドやリボザイムの手法は、ターゲットとする配列に制約があり、組織、細胞への移行が悪く、リボヌクレアーゼにより分解されやすいという課題があった。
【００１６】
一方、アンチセンス試薬やリボザイムのような（デオキシ）リボヌクレオチド試薬とは異なり、ピロールイミダゾールポリアミド（以下、Ｐｙ−Ｉｍポリアミドとも言う）類が、ＤＮＡの塩基配列を特異的に認識し、特定遺伝子の発現を細胞外からコントロールすることができることが報告されている。
【００１７】
ピロールイミダゾールポリアミドは一群の合成小分子であり、芳香族環であるＮ−メチルピロール単位（以下Ｐｙとも言う）及びＮ−メチルイミダゾール単位（以下Ｉｍとも言う）から構成されている（非特許文献１５−１７）。Ｐｙ及びＩｍは連続してカップリングし折りたたむことによりγ−アミノ酪酸の存在下でＵ字型のコンフォメーションを採ることができる。本発明に係るピロールイミダゾールポリアミドにおいて、Ｎ−メチルピロール単位（Ｐｙ）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（Ｉｍ）及びγ−アミノ酪酸単位（γリンカーとも言う）は互いにアミド結合（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）で連結されており、その一般構造及び製造方法は公知である（特許文献１〜３）。
【００１８】
合成ポリアミドは二重らせんＤＮＡの副溝（マイナーグルーブ）中の特定の塩基対に高い親和性と特異性を以って結合することができる。塩基対の特異的認識はＰｙとＩｍとの１対１の対形成に依存している。即ち、ＤＮＡの副溝内でのＵ字型コンフォメーションにおいて、Ｐｙ／Ｉｍ対はＣ−Ｇ塩基対を標的とし、Ｉｍ／ＰｙはＧ−Ｃ塩基対を標的とし、そしてＰｙ／ＰｙはＡ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対の両方を標的とする（非特許文献１６−１７）。最近の研究によればＡ−Ｔ縮合はＰｙ／Ｐｙ対の一つのピロール環を３−ヒドロキシピロール（Ｈｐ）で置換した結果としてＨｐ／Ｐｙが優先的にＴ／Ａ対に結合することによって克服することができることがわかっている（非特許文献１８）。
【００１９】
一般的には転写の開始が遺伝子制御の重要なポイントであると考えられている。転写の開始には遺伝子プロモータ領域において特異的な認識配列に結合する転写因子をいくつか必要とする。副溝中のポリアミドは、もし転写因子が遺伝子発現において重要であれば、転写因子の結合を遮断して遺伝子の調節に干渉する可能性がある。この仮説はインビトロ及びインビボの実験で証明されている。ジンクフィンガーの認識部位（ＴＦＩＩＩＡの結合部位）の内部に結合した８員環Ｐｙ−Ｉｍポリアミドは５ＳＲＮＡ遺伝子の転写を阻害した（非特許文献１９）。ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）プロモータ中の転写因子配列に隣接する塩基対に結合するポリアミド類は、ヒト細胞におけるＨＩＶ−１複製を阻害する。これらの配列にはＴＡＴＡボックス、リンパ系エンハンサー因子ＬＥＦ−１配列、及びＥＴＳ−１配列が包含される（非特許文献２０）。これとは対照的に、ポリアミドはまた、リプレッサー因子を遮断することによって、又は生来の転写因子を置換することによって、遺伝子発現を活性化する（非特許文献２１−２３）。ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＵＬ１２２仲介初期タンパク質２（ＩＥ８６）は、プロモータにＲＮＡポリメラーゼＩＩを補充することを遮断し、その関連遺伝子の転写を抑制する（非特許文献２１）。合成ポリアミドはＩＥ８６の抑制を遮断しその対応遺伝子の発現を開放することができる（非特許文献２２）。Ｍａｐｐらにより設計されたポリアミドは人工転写因子として作用し、遺伝子転写反応を仲介する（非特許文献２３）。
【００２０】
【特許文献１】特許第３０４５７０６号
【特許文献２】特開２００１−１３６９７４
【特許文献３】ＷＯ ０３／０００６８３ Ａ１
【非特許文献１】Ｐｉｅｋ ｅｔ ａｌ．、ＦＡＳＥＢ Ｊ，１３，２１０５−２１２４（１９９９）
【非特許文献２】Ｂａｔａｌｌｅｒ Ｒ ｅｔ ａｌ，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １１８，１１４９，２０００
【非特許文献３】渡辺久剛ら、現代医療、第３５巻（第２号）、２００３年
【非特許文献４】Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｔ ｅｔａｌ：Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ ４９：４６１，１９９６
【非特許文献５】Ｂｏｒｄｅｒ ＷＡ ｅｔａｌ：Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ ５１：１３８８，１９９７
【非特許文献６】Ｏｎｏ ｅｔ ａｌ：Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９８：１４９，１９９８
【非特許文献７】Ｇｉｒｉ ＳＮ ａｌ：Ｔｈｏｒａｘ １９９３
【非特許文献８】槙野 直彦他：現代医療Ｖｏｌ．３５，Ｎｏ．２，２００３
【非特許文献９】Ｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ：ＪＣｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ １８１：１５３，１９９９
【非特許文献１０】Ｒｅｉｌｌｙ Ｊ ｅｔａｌ：Ｃｌｉｎ Ｈａｅｍａｔｏｌ：１１７５１−７６７，１９９８
【非特許文献１１】Ｍａｒｔｙｒｅ Ｍ Ｃｅｔ ａｌ：Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ ７７：８０−８６，９９１
【非特許文献１２】Ｒａｍｅｓｈｗａｒ Ｐｅｔ ａｌ：Ａｍ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ ５９：１３３−１４２，１９９８
【非特許文献１３】Ｒａｍｅｓｈｗａｒ ｅｔａｌ：Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６５：２２７１−２２７７，２０００
【非特許文献１４】Ｓｈｉｇｅｋｉ ｅｔ ａｌ：ＦＡＳＥＢ Ｊ １６：１９６７−１９６９，２００２
【非特許文献１５】Ｔｒａｕｇｅｒ ｅｔａｌ：Ｎａｔｕｒｅ．１９９６；３８２：５５９−６１．
【非特許文献１６】Ｗｈｉｔｅ ｅｔａｌ：Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．１９９７；４：５６９−７８．
【非特許文献１７】Ｄｅｒｖａｎ：ＢｉｏｏｒｇＭｅｄ Ｃｈｅｍ．２００１；９：２２１５−３５．
【非特許文献１８】Ｗｈｉｔｅ ａｔａｌ：Ｎａｔｕｒｅ．１９９８；３９１：４６８−７１．
【非特許文献１９】Ｇｏｔｔｅｓｆｅｌｄ ｅｔａｌ：Ｎａｔｕｒｅ．１９９７；３８７：２０２−５．
【非特許文献２０】Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ｅｔａｌ：Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９８；９５：１２８９０−５
【非特許文献２１】Ｌｅｅ ｅｔａｌ：Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９６；９３：２５７０−５．
【非特許文献２２】Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ｅｔａｌ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９９；３８：１０８０１−７．
【非特許文献２３】Ｍａｐｐ ｅｔａｌ：Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０００；９７：３９３０−５．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
先に述べた、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドやリボザイムの手法は、ターゲットとする配列に制約があり、組織、細胞への移行が悪く、リボヌクレアーゼにより分解されやすいという課題があった。これまでに、ｈＴＧＦ−βの遺伝子塩基配列に結合するピロール−イミダゾールポリアミドを用いたＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤又はＴＧＦ−β関連疾患の治療薬についての報告はない。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明者らは、ヒトＴＧＦ−βのプロモータの特定の領域に特異的に結合してヒトＴＧＦ−β遺伝子の発現を阻害することができるピロールイミダゾールポリアミドの開発とその薬理効果について鋭意研究した。そこで、本発明者らは、ヒトトランスフォーミング成長因子−β１（ｈＴＧＦ−β１）遺伝子の発現を阻害することができ、且つ治療薬として役立ち得る化合物を得るべく、ｈＴＧＦ−β１プロモータの様々な断片を標的とするポリアミド類のうち、脂肪特異性配列２（ＦＳＥ２）に隣接するｈＴＧＦ−β１プロモータの−５５７〜−５３６塩基対に結合する化合物が、ｈＴＧＦ−β１プロモータの活性を有意に阻害し、培養ヒト血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）においてｈＴＧＦ−β１遺伝子の発現をダウンレギュレートすることを見出し、本発明をなすに至った。
【００２３】
即ち、本発明は以下の通りである。
（１）Ｎ−メチルピロール単位（以下Ｐｙとも言う）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（以下Ｉｍとも言う）及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ヒトトランスフォーミング成長因子β１（以下ｈＴＧＦ−β１とも言う）プロモーターの以下に示す塩基配列−５５７〜−５３６（配列番号１）
ＴＡＡＡＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＴＣＴＴＡＣＡＧ
の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域と言う）の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ−Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含んでなるＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤。
（２）更にβ−アラニン単位を含む上記（１）記載のＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤。
（３）前記標的領域がｈＴＧＦ−β１プロモーターの以下に示す塩基配列−５４８〜−５３７（配列番号２）
ＧＣＡＡＴＴＣＴＴＡＣＡ
の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である上記１又は２記載のＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤。
（４）前記標的領域がｈＴＧＦ−β１プロモーターの以下に示す塩基配列−５４４〜−５３８（配列番号３）
ＴＴＣＴＴＡＣ
の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である上記３記載のＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤。
（５）前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される上記１記載のＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤。
【化１】
（６）前記ピロールイミダゾールポリアミドの末端のカルボキシル基がアミドを形成している上記５記載のＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤。
（７）前記アミドがＮ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアミンとのアミドである上記６記載のＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤。
（８）前記ピロールイミダゾールポリアミドがＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）と共役体を形成している上記５〜７のいずれか一項記載のＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤。
（９）下式で表されるピロールイミダゾールポリアミド。
【化２】
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、遺伝子発現を特異的に抑制することができるので化学療法剤のような副作用がなく、また化合物であるのでリボヌクレアーゼにより分解されるという欠点もない、ＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明に係るピロールイミダゾールポリアミドにおいて、Ｎ−メチルピロール単位（以下Ｐｙとも言う）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（以下Ｉｍとも言う）及びγ−アミノ酪酸単位（γリンカーとも言う）は互いにアミド結合（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）で連結されており、その一般構造及び製造方法は公知である（例えば、特許文献１〜３参照）。
【００２６】
例えば、ピロールイミダゾールポリアミドはＦｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）を用いた固相法（固相Ｆｍｏｃ法）による自動合成法によって簡便に製造することができる（特許文献３）。固相Ｆｍｏｃ法によれば、ピロールイミダゾールポリアミドの末端をカルボン酸残基として固体担体から切り出すことができるので、種々の官能基を分子末端に導入してピロールイミダゾールポリアミドの誘導体を作成することもできる。例えば、デュオカルマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、ブレオマイシン、エンジイン化合物、ナイトロジェンマスタード、これらの誘導体等、ＤＮＡに対してアルキル化能を有する化合物を必要に応じて導入することもできる。固相Ｆｍｏｃ法は市販のタンパク（ペプチド）合成機を用いる自動合成法であるため、天然に存在するタンパク質や非天然タンパク質とピロールイミダゾールポリアミドとの共役体（コンジュゲート）を合成することもできる。また、Ｆｍｏｃ法はｔ−ＢＯＣ法に比べて反応条件が緩和であるため、タンパク質以外の有機化合物（酸性条件下で不安定な官能基を有する化合物をも含む）の導入も可能である。例えば、ピロールイミダゾールポリアミドとＤＮＡやＲＮＡ（又はそれらの誘導体）との共役体を自動的に合成することも可能である。
【００２７】
上記公知のＦｍｏｃ法等によれば、末端にカルボキシル基を有するピロールイミダゾールポリアミドを合成することができる。その具体例としては、例えば、末端にβ−アラニン残基（β−アミノプロピオン酸残基）やγ−アミノ酪酸残基を有するピロールイミダゾールポリアミド等が挙げられる。末端にβ−アラニン残基又はγ−アミノ酪酸残基を有するピロールイミダゾールポリアミドは、例えば、それぞれＦｍｏｃでアミノ基を保護した、アミノピロールカルボン酸、アミノイミダゾールカルボン酸、β−アラニン又はγ−アミノ酪酸を担持した固相担体を用い、ペプチド合成機を使用して固相Ｆｍｏｃ法により合成することができる。
【００２８】
アミノピロールカルボン酸の具体例としては、例えば、４−アミノ−２−ピロールカルボン酸、４−アミノ−１−メチル−２−ピロールカルボン酸、４−アミノ−１−エチル−２−ピロールカルボン酸、４−アミノ−１−プロピル−２−ピロールカルボン酸、４−アミノ−１−ブチル−２−ピロールカルボン酸等が挙げられる。アミノイミダゾールカルボン酸の具体例としては、例えば、４−アミノ−２−イミダゾールカルボン酸、４−アミノ−１−メチル−２−イミダゾールカルボン酸、４−アミノ−１−エチル−２−イミダゾールカルボン酸、４−アミノ−１−プロピル−２−イミダゾールカルボン酸、４−アミノ−１−ブチル−２−イミダゾールカルボン酸等が挙げられる。
【００２９】
固相Ｆｍｏｃ法によれば、例えば、ピロールイミダゾールポリアミドとＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）との共役体を合成することもできる。ＦＩＴＣは従来から抗体の蛍光標識試薬として知られているので、得られる共役体は、当該ピロールイミダゾールポリアミドが特定のＤＮＡ配列を認識することを証明するために用いることができる。
【００３０】
本発明のＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤は、Ｎ−メチルピロール単位（Ｐｙ）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（Ｉｍ）及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ｈＴＧＦ−β１プロモーターの以下に示す塩基配列−５５７〜−５３６（配列番号１）
ＴＡＡＡＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＴＣＴＴＡＣＡＧ
の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域と言う）の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ−Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含む。
【００３１】
通常ＤＮＡのらせんの骨格は２種類の溝をつくり、広くて深い溝を主溝（メジャーグルーブ）、狭くて浅い溝を副溝（マイナーグルーブ）と呼んでいる。ここで上記ピロールイミダゾールポリアミドは、特定の塩基対がつくる副溝（マイナーグルーブ）に高い親和性と特異性を以って非共役結合的に結合することができる。この時の結合は、副溝のＣ−Ｇ塩基対に対してはピロールイミダゾールポリアミドのＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応している。そして、ピロールイミダゾールポリアミド分子中のγ−アミノ酪酸単位の部位で分子が折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとる。
【００３２】
副溝の塩基対とピロールイミダゾールポリアミドのＰｙとＩｍの対が上述のように対応していないと、副溝とピロールイミダゾールポリアミドとの結合が不十分となる。このように、副溝の塩基対とＰｙ−Ｉｍ対が上述のように対応していないピロールイミダゾールポリアミドを本願ではミスマッチ又はミスマッチポリアミドと呼ぶ。
【００３３】
Ｐｙ−Ｉｍポリアミドはインビトロ研究では一般的な又は組織特異的な転写因子の有効な阻害剤又は活性化剤である（非特許文献１９〜２３）。特異的なポリアミドでショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）を発育させると、特に毒性もなく機能的表現型を獲得したり喪失したりするが、これはポリアミドが特異的に遺伝子発現を制御した結果である（Ｊａｎｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ：Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２０００；６：１０１３−２４；Ｊａｎｓｓｅｎ ａｔ ａｌ：Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２０００；６：９９９−１０１１．）。本発明者らはｈＴＧＦ−β１プロモータの特定の断片を標的とするＰｙ−Ｉｍポリアミド類を合成した。まさに図４に示すように、ＦＩＴＣで標識したＰｙ−Ｉｍポリアミドは自発的に細胞膜を透過し、直接培地に添加すると培養ｈＶＳＭＣの核内に高濃度で蓄積した。これらのポリアミドは核内に４８時間以上特に消失することもなく安定に滞留した。先に記載されたアンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザイム（Ｈｕ ＷＹ，Ｆｕｋｕｄａ Ｎ，Ｎａｋａｙａｍａ Ｍ，Ｋｉｓｈｉｏｋａ Ｈ，Ｋａｎｍａｔｓｕｓｅ Ｋ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｂｙ ＤＮＡ−ＲＮＡ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ ｒｉｂｏｚｙｍｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｏ ｒａｔ ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ Ａ−ｃｈａｉｎ ｍＲＮＡ．Ｊ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．２００１；１９：２０３−１２；Ｔｅｎｇ Ｊ，Ｆｕｋｕｄａ Ｎ，Ｈｕ ＷＹ，Ｎａｋａｙａｍａ Ｍ，Ｋｉｓｈｉｏｋａ Ｈ，Ｋａｎｍａｔｓｕｓｅ Ｋ．ＤＮＡ−ＲＮＡ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ ｒｉｂｏｚｙｍｅ ｔｏ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａｌ ｍＲＮＡ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｈｅ ｅｘａｇｇｅｒａｔｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ ｒａｔｓ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｒｅｓ．２０００；４８：１３８−４７）と比較して、ポリアミドは選りすぐれた透過性（低濃度、トランスフェクション媒体不要）とより高い安定性を培養ｈＶＳＭＣにおいて示した。ポリアミドの高い透過性と安定性は遺伝子治療法のための真核細胞の核への理想的な薬剤アプローチを提供するものである。
【００３４】
最近までＰｙ−Ｉｍポリアミドの開発はプロモータ配列における転写因子−ＤＮＡ複合体の構造的特性に基づいていた。ＴＡＴＡボックス含有プロモータ中の配列を標的とする効率的な方法は、ＴＡＴＡボックスに隣接する塩基対に結合するよう設計することであろう。ＴＡＴＡボックスはほとんどのタンパク質コード遺伝子において転写開始部位の上流２５〜３５塩基対に位置している。転写介在因子Ｄ（ＴＡＦＩＩＤ）はＴＡＴＡボックスに特異的に結合するＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）を含んでおり、コアプロモータにおける他の転写関与因子を採用してプレ開始コンプレックス（ＰＩＣ）を形成する。ＰＩＣは遺伝子転写を開始してアクチベータ又はサプレッサと相互作用して遺伝子発現を調節する。ＴＢＰも二重らせんＤＮＡの副溝（マイナーグルーブ）に結合するので（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ：Ｃｅｌｌ．１９９１ Ｄｅｃ ２０；６７（６）：１２４１−５０；Ｓｔａｒｒ ｅｔ ａｌ：Ｃｅｌｌ．１９９１；６７：１２３１−４０；Ｃｏｕｒｅｙ ｅｔ ａｌ：Ｃｅｌｌ．１９８８；５５：８８７−９８．）、合成ポリアミドはＴＡＴＡ結合タンパク質の結合部位を競合的に占有し、遺伝子転写に干渉する。様々なプロモータで設計したポリアミドの成功例のうちで、ＴＡＴＡボックスを標的とするものが常に機能することが知られている（非特許文献２０、２１）。
【００３５】
ＴＡＴＡボックスもイニシエーター領域（Ｉｎｒ）も含んでいない種類のプロモータもある（Ｊａｖａｈｅｒｙ ｅｔ ａｌ：Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９４；１４：１１６−２７；Ｌｏ ｅｔ ａｌ：Ｇｅｎｅ．１９９６ Ｄｅｃ ５；１８２（１−２）：１３−２２；Ｒｏｍｅｏ ｅｔ ａｌ：Ｇｅｎｅ．１９９７；１８９：２８９−９５．）。高度に発現し特化された遺伝子のプロモータはＴＡＴＡボックスを有している傾向にあるが、ハウスキーピング遺伝子のプロモータにはそれが欠如している傾向がある。ＴＡＴＡのないプロモータは、低レベルで発現される遺伝子や、増殖の間に厳密なダウンレギュレーションを要求する遺伝子にとっては必要かもしれないが、そのメカニズムはなお今後の研究を要する。ｈＴＧＦ−β１プロモータはこの種類に属する。これは転写開始部位の上流の様々な領域にいくつもの陽性及び陰性の配列を含んでいる（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ：Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９８９；２６４：４０２−８．）。転写開始部位の近傍にはいくつかのＳＰ−１配列と二つのＡＰ−１配列が存在する。様々なウイルス性及び細胞性プロモータがＳＰ−１タンパク質によって活性化されるので、プロモータがＳＰ−１により刺激されるためには単一のＳＰ−１配列で十分のようである（Ｋａｄｏｎａｇａ ｅｔ ａｌ：Ｃｅｌｌ．１９８７；５１：１０７９−９０；Ｃｏｕｒｅｙ ｅｔ ａｌ：Ｃｅｌｌ．１９８８；５５：８８７−９８．）。ＡＰ−１配列はＪｕｎホモダイマー又はＦｏｓ／Ｊｕｎヘテロダイマー複合体のいずれかからなるＡＰ−１転写因子に応答する。ＡＰ−１配列を介してＴＰＡ、ｖ−ｓｒｃ遺伝子産物及びｈＴＧＦ−β１自身のようないくつかの物質がｈＴＧＦ−β１遺伝子の発現を刺激する（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ：Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９８９；２６４：７０４１−５；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ：Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９８９；２６４：１９３７３−８．Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ：Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９０；１０：１４９２−７；Ｂｉｒｃｈｅｎａｌｌ−Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ：Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９０；１０：４９７８−８３．）。
【００３６】
ＳＰ−１及び／又はＡＰ−１配列がｈＴＧＦ−β１遺伝子発現の活性化を仲介すると仮定されている。重要なポリアミドは応答性の転写因子の結合を遮断するために、異なるＡＰ−１及びＳＰ−１配列に隣接する塩基対を標的とするように設計されている。しかし、これらのポリアミドがｈＴＧＦ−β１プロモータの活性を阻害することができるか、又は活性化することができるかを示すに十分なデータはない。これらの結果は、設計したポリアミドがＤＮＡ等の副溝（マイナーグルーブ）中で占有する位置が不適切だったためかもしれない。本発明者らは標的配列をｈＴＧＦ−β１プロモータの上流にまで拡張した。一つのポリアミドはｈＴＧＦ−β１プロモータ−５４４〜−５３８塩基対を標的としており、これはインビトロでプロモータの活性を阻害し（図５〜７）、培養ｈＶＳＭＣではｈＴＧＦ−β１ ｍＲＮＡとタンパク質を阻害する（図７、８）ことが示されている。ｈＴＧＦ−β１プロモータの−５４４〜−５３８塩基対はちょうど脂肪特異性配列（ＦＳＥ２）に隣接している（図１）。前脂肪細胞（プレアジポサイト）においてＦＳＥ２は脂肪細胞Ｐ２（ａＰ２）遺伝子の発現に対して抑制的機能を示し、前脂肪細胞は脂肪細胞よりも多くのＦＥＳ２配列結合タンパク質を含んでいる（Ｋａｄｏｎａｇａ ｅｔ ａｌ：Ｃｅｌｌ．１９８７；５１：１０７９−９０；Ｃｏｕｒｅｙ ｅｔ ａｌ：Ｃｅｌｌ．１９８８；５５：８８７−９８．）。ＴＡＴＡボックスを含むコアプロモータからは転写を抑制する転写リプレッサーは見つかってはいるが、ＴＡＴＡのないプロモータからは見つかっていない（Ａｓｏ ｅｔ ａｌ：ＥＭＢＯ Ｊ．１９９４；１３：４３５−４５；Ｍａｃｋ ｅｔ ａｌ：Ｎａｔｕｒｅ．１９９３；３６３：２８１−３；Ｍｅｒｉｎｏ ｅｔ ａｌ：Ｎａｔｕｒｅ．１９９３；３６５：２２７−３２．）。これらの転写リプレッサーはＴＢＰ−ＴＡＴＡ相互作用に干渉し、次いで遺伝子の転写を阻害すると考えられた。これらのリプレッサーのデータを組合せると、脂肪細胞におけるＦＳＥ−２配列の抑制機能はＴＡＴＡボックスによって仲介されると仮定される。ｈＴＧＦ−β１プロモータはＴＡＴＡボックスを含んでいないので、ｈＴＧＦ−β１におけるＦＳＥ２配列の機能はａＰ２遺伝子におけるそれとは異なっていると考えられる。ほとんどの哺乳類遺伝子の発現はプロモータとエンハンサー配列に結合した莫大な数のタンパク質の作用の組合せに依存している傾向が高いので、今回の結果を説明する最も簡単なモデルは、本発明のピロールイミダゾールポリアミドがＦＳＥ２配列の領域で転写因子−ＤＮＡ相互作用を遮断し、ｈＴＧＦ−β１プロモータ活性に対して阻害効果を示すということである。
【００３７】
プロモータ領域における転写因子の調節以外に、他の因子も遺伝子発現に影響を与えている可能性もある。これらの因子はクロマチンパッキング、ポリアデニレーション、スプライシング、ｍＲＮＡ安定性、翻訳開始等を包含するものである（Ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ：Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２００１；５：２６３−８；ＭｃＫｅｏｗｎ Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９２；８：１３３−５５；Ｄｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ：Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ．１９９４；１９：３３６−４０；Ｋｏｚａｋ Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９２；８：１９７−２２５．）。合成ポリアミドはヌクレオソームの位置関係から標的部位に接近することができ、特異的配列を標的とすることによりクロマチンの縮合・脱縮合構造に影響を与えている可能性がある（Ｇｏｔｔｅｓｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ：Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００２；３２１：２４９−６３；Ｇｏｔｔｅｓｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ：Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００１；３０９：６１５−２９．）。ピロールイミダゾールポリアミドがヘテロクロマチン褐色サテライトを開き、ＧＡＦの結合を可能とし、その結果ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒにおける表現型の変化を引き起こしているということが証明されている。ピロールイミダゾールポリアミドは容易に合成し、興味のある配列を標的とするように設計することができるので、ゲノムの機能研究や最終的にはｈＴＧＦ−β１遺伝子阻害や活性化のような遺伝子治療に有用である。
【００３８】
本発明に係るＰｙ−Ｉｍポリアミドは転写開始領域からは遠位の上流において設計することができ、これがｈＴＧＦ−β１遺伝子の発現に対する阻害効果を示す。
【実施例】
【００３９】
Ｉ．材料及び方法
（１）ｈＴＧＦ−β１プロモータに対応するＰｙ−Ｉｍポリアミドの設計
本実験に用いた化合物とそのミスマッチ化合物（以下、単にミスマッチともいう）の形成スキームを図１に示す。Ｐｙ−Ｉｍポリアミドは脂肪特異性配列２（ＦＳＥ２）に隣接するｈＴＧＦ−β１プロモータの−５４４〜−５３８塩基対に結合するように設計した。
【００４０】
（２）Ｆｍｏｃ法を用いたＰｙ−Ｉｍポリアミドのマシンアシスト（機械補助）自動合成
ピロールイミダゾールポリアミドのマシンアシスト自動合成を、連続フローペプチド合成機Ｐｉｏｎｅｅｒ（商標）（アプライドバイオシステムズ）を用いて０．１ｍｍｏｌスケール（２００ｍｇのＦｍｏｃ−β−アラニン−ＣＬＥＡＲ酸レジン、０．５０ｍｅｑ／ｇ、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．）で実施した。自動固相合成はＤＭＦ洗浄、Ｆｍｏｃ基の２０％ピペリジン／ＤＭＦによる除去、メタノール洗浄、ＨＡＴＵ及びＤＩＥＡ（それぞれ４当量）の存在下でのモノマーとの６０分間のカップリング、メタノール洗浄、必要に応じて無水酢酸／ピリジンによる保護、及び最終的なＤＭＦ洗浄からなっている。Ｐｙ−Ｉｍポリアミドは一般に中程度の収率（１０−３０％）で得られた。
【００４１】
ＦＩＴＣカップリング：４倍過剰のフルオレセイン（０．４０ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（ＨＡＴＵなし）をＤＭＦに溶解したものをカラムを通して６０分間フラッシュした。
【００４２】
一般的手順：Ｆｍｏｃ−β−アラニン−Ｗａｎｇ樹脂のＦｍｏｃ基を除去した後、樹脂をメタノールで連続的に洗浄した。カップリング工程をＦｍｏｃアミノ酸で実施し、次いでメタノールでの洗浄を行った。これらの工程を全配列が導入されるまで何度も繰返した。カップリング工程を終えた後、必要に応じてＮ末端アミノ基を保護するか又はＦＩＴＣでカップリングし、ＤＭＦで洗浄し、反応容器を取りはずした。
【００４３】
カルボン酸としての分解：合成ポリアミドを冷エチルエーテル沈澱により分解工程（９１％ＴＦＡ−３％／ＴＩＳ−３％ＤＭＳ−３％水の混合物５ｍｌ／樹脂０．１ｍｍｏｌ）の後に単離した。
【００４４】
アミンとしての分解：合成ポリアミドを冷エチルエーテル沈澱により分解工程（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアミン５ｍｌ／樹脂０．１ｍｍｏｌ、５０℃、一晩）の後に単離した。
【００４５】
精製：最終精製は、１０ｍｌ／ｍｉｎの流速の分析用ＲＰ−ＨＰＬＣで、緩衝液Ａ（０．１％ＡｃＯＨ／水）中Ｂ（アセトニトリル）の直線勾配を用いて、３５０ｎｍのＵＶ検出により行った。
【００４６】
以下、化合物４ａ及び４ｂにおいて、ＩはＮ−メチルイミダゾール残基、ＰはＮ−メチルピロール残基、βはβ−アラニン残基、γはγ−アミノ酪酸残基、ＤｐはＮ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアミン、Ａｃはアシル基を表す。
【００４７】
ａ）ＦＩＴＣ−β−ＩＰＰ−β−ＩＰＰ−γ−ＰＰＰ−β−ＰＰ−βＤｐ（化合物４ａ）
勾配：緩衝液Ｂ １５％〜４５％（３０分間）、流速１０ｍｌ／ｍｉｎ。収率７ｍｇ（３％）。
【００４８】
ｂ）Ａｃ−ＩＰＰ−β−ＩＰＰ−γ−ＰＰＰ−β−ＰＰ−βＣＯＯＨ（化合物４ｂ）
勾配：緩衝液Ｂ ２５％〜３５％（３０分間、６０℃）、流速１０ｍｌ／ｍｉｎ。収率２９ｍｇ（１７％）。
【００４９】
Ｐｙ−Ｉｍポリアミド（化合物４ｂ）の構造は図２Ａに、そのＴＩＣ（ｔｏｔａｌ ｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ）チャートとエレクトロスプレーイオン化質量分析スペクトルを図２Ｂに示す。なお、ミスマッチとしては、上記化合物４ｂのアシル基に隣接するＩをＰで置き換えたＡｃ−ＰＰＰ−β−ＩＰＰ−γ−ＰＰＰ−β−ＣＯＯＨの構造を有するポリアミドを用いた。
【００５０】
（３）ｈＶＳＭＣ細胞培養
ｈＶＳＭＣはＣｌｏｎｅｔｉｃｓ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から得た。ｈＶＳＭＣを１０％仔ウシ血清（Ｇｉｂｃｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、及び１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ変性Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）にて培養した。細胞をＣａ２＋フリー及びＭｇ２＋フリーのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中０．０５％トリプシン（Ｇｉｂｃｏ）でのトリプシン処理により継代し、７５−ｃｍ２組織培養フラスコで培養した。培地は４〜５日毎に交換し、５〜１０継代の間の細胞について実験を行った。
【００５１】
（４）培養ｈＶＳＭＣにおけるＦＩＴＣ−標識ポリアミド類のインキュベーション
継代ｈＶＳＭＣを１０５／ｃｍ２の密度で２４時間、２４ウェルのフラスコで培養した。ＦＩＴＣ標識ポリアミドを１０−９Ｍの濃度で培地に直接添加し、蛍光顕微鏡で１時間ごとに観察した。
【００５２】
（５）ゲルシフトアッセイ
オリゴヌクレオチドを合成し、アニーリングして、ｈＴＧＦ−β１プロモータの−５４８〜−５３７塩基対に対応する１２種の二本鎖オリゴヌクレオチドとした（図１Ａ）。二本鎖ＤＮＡを［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰを用いたＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで標識し、３７℃で１５分間、結合緩衝液（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．９，２５０ｍＭ ＮａＣｌ，２５ｍＭ ＥＤＴＡ，２５ｍＭ ＤＴＴ，１００ｍＭ ＫＣｌ）中でポリアミド又はミスマッチポリアミドとともにインキュベートした。得られた複合体を２０％ポリアクリルアミドゲルにより電気泳動し、オートラジオグラフィーで可視化した。
【００５３】
（６）ｈＴＧＦ−β１プロモータの制御下でのルシフェラーゼ遺伝子発現系の構築
プラスミドｐｈＴＢＧ １０１（非特許文献１０）由来の２．２ｋｂ ｈＴＧＦ−β１プロモータを分離し、ｐＧＬ３基本プラスミドに挿入し（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ルシフェラーゼリポーター遺伝子のコード領域の上流に置いた。正確な構築プラスミドは制限酵素スペクトル分析及び配列決定により同定された。
【００５４】
（７）インビトロ転写反応
インビトロ転写反応はＨｅＬａ核抽出物を用いてインビトロ転写系で行った（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）。２５μＬの反応液は、１００ｎｇのＤＮＡ鋳型、８ＵのＨｅＬａ核抽出物、３種類の非標識三リン酸（ＵＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ）の各々４００μＭ、２５μＭ γ−３２Ｐ−ＡＴＰ（５ｃｉ／ｍｍｏｌ、ＮＥＭ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、及び２０ｍＭのヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）を含む転写緩衝液（ｐＨ７．９）、１００ｍＭのＫＣｌ、４．０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０％グリセロール、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．６ｍＭ フェニルメチルスルホニルフルオリドからなるものであった。転写鋳型ＤＮＡはＳｐｈＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｂａｖｅｒｌｙ，ＭＡ）で切断した。転写反応液を３０℃で６０分間インキュベートした後、１７５μＭのＨｅＬａ抽出物停止溶液（０．３Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、０．３Ｍ 酢酸ナトリウム、０．５％ＳＤＳ、２．０ｍＭ ＥＤＴＡ、３μｇ／ｍｌ ｔＲＮＡ）を添加することによって反応を停止し、次いでフェノールクロロホルム−イソアミルアルコール抽出及びエタノール沈澱を行った。試料を９８％ホルムアルデヒド・ローディング色素中に再懸濁させ、９０℃で１０分間加熱してから６％、７Ｍ尿素・ポリアクリルアミドゲルで泳動した。ゲルを乾燥し、オートラジオグラフィーで可視化した。
【００５５】
（８）一時的トランスフェクションとルシフェラーゼアッセイ
ｈＶＳＭＣ細胞を１０％ＣＳの存在下で２４ウェル皿に１０−５／ｃｍ２の密度で培養した。２４時間後、ｈＴＧＦ−β１プロモータにより駆動されるレポーター遺伝子を、滅菌培地に１μｇのＤＮＡの存在下リポフェクチン試薬（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用いて、製造者の指示する方法にしたがってトランスフェクトした。細胞をＤＮＡリポソーム複合体とともに６時間インキュベートし、次いで培地を１ｍｌの新鮮な完全培地で置き換えた。トランスフェクションの２４時間後、細胞をポリアミド又はミスマッチポリアミドの存在下又は非存在下で、０．５％ＣＳを含む培地で２４時間インキュベートした。この処理の終わりに、培地を取り除き、細胞を剥がして１５０μｌのＰａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ緩衝液中に入れた。簡単に遠心分離を施した後、細胞抽出物でデュアル−ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。１００μｌのルシフェラーゼ基質を２０μｌの抽出物に添加した。混合後、反応物をルミノメーター（Ｔｕｒｎｅｒ Ｄｅｓｉｇｎｓ−Ｂｉｏｂｌｏｃｋ，Ｉｌｌｋｉｒｃｈ，Ｆｒａｎｃｅ）に置き、室温で１０秒間に発生する発光を測定した。
【００５６】
（９）ＲＮＡ抽出及び成長因子ｍＲＮＡのための逆転写反応、ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイ
培養細胞をＰＢＳで洗浄し、８００μＬのＲＮＡｚｏｌＢ（Ｂｉｏｔｅｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）に溶解し、８０μＬのクロロホルムと混合し、遠心分離を施し、無色の上部水相を等体積のイソプロパノールと混合してＲＮＡを沈澱させた。ＲＮＡペレットを５００μＬの７５％エタノールで二回洗浄し、乾燥後、１０μｌのＴＥ緩衝液に溶かした。６５℃で１５分間変性させた後、ＲＮＡ試料を室温で４５分間、０．５ｍｌのＤＮアーゼ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８．３，５０ｍＭ ＫＣｌ，２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２）中、０．５Ｕ ＤＮアーゼ（Ｇｉｂｃｏ）で処理した。ＤＮアーゼは０．５ｍＬ ０．５Ｍ ＥＤＴＡを添加し、９８℃で１０分間加熱することによって不活化した。
【００５７】
等量のＲＮＡのアリコート（１μｇ／２０μＬ）を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ デオキシＮＴＰ類、及び２．５μＭランダムヘキサマー中、２．５Ｕ／２０μＬトリ骨髄芽腫ウイルス逆転写酵素（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を用いて一本鎖ｃＤＮＡ中に逆転写させた。２μＬの希釈ｃＤＮＡ生成物を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、４ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０２５Ｕ／μＬ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）及び上流センスプライマー及び下流アンチセンスプライマーの各々０．２μＭとともに混合し合計２５μＬとした。センスプライマー（５’−ＡＴＣＡＧＡＧＣＴＣＣＧＡＧＡＡＧＣＧＧＴＡＣＣ−３’）（配列番号４）及びアンチセンスプライマー（５’−ＧＴＣＣＡＣＴＴＧＣＡＧＴＧＴＴＡＴＣＣＴＧ−３’）（配列番号５）をｈＴＧＦ−β１ ｍＲＮＡのＰＣＲ増幅に使用した。ヒト１８ＳリボゾームＲＮＡについてセンスプライマー（５’−ＴＣＡＡＧＡＡＣＧＡＡＡＧＴＣＧＧＡＣＧ−３’）（配列番号６）及びアンチセンスプライマー（５’−ＧＧＡＣＡＴＣＴＡＡＧＧＧＣＡＴＣＡＣＡ−３’）（配列番号７）を内部対照として使用した。ＰＣＲを自動熱制御器（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ，ＣＡ）で行った。ＰＣＲ条件は９４℃２分の初期変性、次いで３０サイクルの変性９４℃１分、アニーリング５８℃１分、伸張７２℃１分を行い、最後に７２℃１０分の伸張反応を行うものであった。１８ＳｒＲＮＡについてのプライマーによるＰＣＲを内部対照として各反応中に含ませた。ゲノムＤＮＡがＰＣＲによって増幅しないことを確認するために、逆転写酵素なしプライマーセットありの対照ＲＴ−ＰＣＲ実験を行った。反応のいずれにおいても生成物は増幅しなかった。ｍＲＮＡの半定量的分析のために、ＰＣＲ反応の動力学をモニターした。ＰＣＲ産物がゲル上で検出可能になったサイクル数を種々の試料間で比較した。連続した１０倍希釈のｃＤＮＡ（１００、１０及び１ｎｇ）を増幅した。ＰＣＲ産物はｃＤＮＡの量を増加していくとより早いサイクルの段階で検出可能となった。標的ｍＲＮＡの各々に対応するＰＣＲ産物の量は２０〜３５サイクルで直線的に増加した。５μＭのＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲル上の電気泳動により分離した。バンド強度をＮＩＨソフトウェアを用いてコンピュータ分析により測定した。
【００５８】
（１０）細胞の調製とウェスタンブロット分析
被験ＶＳＭＣ及び対照ＶＳＭＣを６ウェルプレートで２４時間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄し、３００μＬの溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ フェニルメチルスルホニルフルオリド、１μｇ／ｍＬ アプロチニン、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）で氷上３０分間インキュベートした。細胞を１．５ｍＬチューブ中に剥ぎ取り、遠心分離し、上澄み液を集め、タンパク質含量をＢＩＯ−ＲＡＤタンパク質アッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いたブラッドフォードタンパク質アッセイにより決定した。上澄み液は２０μｇの全タンパク質を含んでいた。これをローディング緩衝液中１００℃で３分間変性し、１０％ポリアクリルアミドゲルで泳動し、ニトロセルロース膜に転写した。膜をｈＴＧＦ−β１に特異的なマウスモノクローナル抗体（１：５００）（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）とともに室温で１時間インキュベートし、次いで抗マウスＨＲＰ共役第二抗体とともに１：２０００で室温で１時間インキュベートした後、十分に洗浄した。膜を電気化学発光基質（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）とともにインキュベートし、Ｘ線フィルムに暴露した。
【００５９】
（１１）統計解析
結果は平均値±ＳＥＭで表現した。平均値間の差の有意性はスチューデントｔ検定により評価した。０．０５未満のｐ値を有意であるとした。
【００６０】
ＩＩ．結果
（１）合成ポリアミドの二本鎖オリゴヌクレオチドへの結合
まず、合成Ｐｙ−Ｉｍポリアミド（化合物４ａ及び４ｂ）がその対応塩基対に結合するかどうかをチェックした。いずれのポリアミドも対応する１２塩基対二本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができたが（図３、レーン２〜４）、ミスマッチポリアミドはこれらのオリゴヌクレオチドには結合しなかった（図３、レーン１）。
【００６１】
（２）合成ポリアミドの細胞膜の透過と核内への取り込み
合成化合物が核内に入り生存細胞中で安定な状態にあることを示すためにＰｙ−ＩｍポリアミドをＦＩＴＣで標識した。ＦＩＴＣ標識ポリアミドを培地中１０−９Ｍの濃度で２時間インキュベートしたところ、このＦＩＴＣを培養ｈＶＳＭＣの核内で高密度で検出することができた。（図４）。核内におけるＦＩＴＣ標識ポリアミドのこの高蓄積はゲノム内の非特異的結合によるものであり、細胞質中のこの化合物の濃度ははるかに低いものであった。
【００６２】
（３）合成ポリアミドによるｈＴＧＦ−β１プロモータ活性の阻害
インビトロ転写系はＨｅＬａ核抽出物とｈＴＧＦ−β１プロモータの存在下でＤＮＡ暗号を転写する。合成ポリアミド（Ｐｏｌ）はｈＴＧＦ−β１プロモータの−５４４〜−５３８塩基対に結合するので、転写を減少させる。一方、ミスマッチポリアミド（Ｍｉｓ）は転写分子の形成に有意な効果を示さなかった（図５）。
プラスミドトランスフェクション実験において、ルシフェラーゼをコードするレポーター遺伝子はｈＴＧＦ−β１プロモータにより駆動され、培養ｈＶＳＭＣ中で発現された。１２−Ｏ−テトラデカノイルフォルボール−１３−アセチルトランスフェラーゼ（ＴＰＡ）はルシフェラーゼタンパク質の発現を刺激した。１０−９Ｍのポリアミドのインキュベーションによりルシフェラーゼの発現を有意にダウンレギュレートすることができたが、ミスマッチポリアミドはルシフェラーゼ遺伝子の発現には効果はなかった（図６）。
【００６３】
（４）合成ポリアミドによるｈＶＳＭＣ中でのｈＴＧＦ−β１ｍＲＮＡの阻害
インビボにおけるｈＴＧＦ−β１遺伝子の発現に対するポリアミドの効果を観察するために、培養ｈＶＳＭＣを１０−９Ｍポリアミドとともに２４時間インキュベートした。ｈＴＧＦ−β１ｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法を用いて分析した。ＴＰＡを陽性対照として用いた。５０ｎｇ／ｍＬ ＴＰＡはｈＴＧＦ−β１ｍＲＮＡの発現を有意に刺激した。本発明のポリアミド（ｐｏｌ）はＴＰＡにより誘導されたｈＴＧＦ−β１ｍＲＮＡの発現を有意に阻害したが、ミスマッチポリアミド（Ｍｉｓ）は阻害しなかった（図７）。
【００６４】
（５）ｈＶＳＭＣにおけるｈＴＧＦ−β１タンパク質の発現に対する合成ポリアミドの効果
本発明者らはｈＶＳＭＣにおけるｈＴＧＦ−β１タンパク質の発現に対する合成ポリアミド（ｐｏｌ）の効果をチェックした。１０−９Ｍの合成ポリアミドは２４時間のインキュベーション後にｈＴＧＦ−β１タンパク質の発現を阻害したが、ミスマッチポリアミド（Ｍｉｓ）は阻害しなかった（図８）。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明のＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤はＴＧＦ−βの産生が関与する疾病の治療薬として利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】本発明で用いられる合成Ｐｙ−Ｉｍポリアミドの構造を示す。
【図２Ａ】合成Ｐｙ−Ｉｍポリアミド（化合物４ｂ）の構造を示す。
【図２Ｂ】合成Ｐｙ−Ｉｍポリアミド（化合物４ｂ）のＴＩＣチャートとエレクトロスプレーイオン化質量分析スペクトルを示す。
【図３】合成Ｐｙ−Ｉｍポリアミドの対応二重鎖オリゴヌクレオチドへの結合によるポリアミド−オリゴヌクレオチド複合体の形成を示す。ｈＴＧＦ−β１プロモータの−５４８〜−５３７塩基対（図１）に対応する二重鎖ＤＮＡは［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰを用いてＴ４ポリヌクレオチドにより標識され、ミスマッチポリアミド（レーン０）又は漸増量のポリアミド（レーン１〜３がそれぞれ１ｎＭ、２ｎＭ、４ｎＭ）と共に、結合緩衝液中３７℃で１５分間インキュベートした。得られた複合体を２０％ポリアクリルアミドゲルにより電気泳動にかけ、オートラジオグラフィーにより可視化した。
【図４】１０−９Ｍの濃度で２時間インキュベーションした後、ＦＩＴＣ標識ポリアミドが培養ｈＶＳＭＣ細胞の核内に留まっていることを示す。ＦＩＴＣ標識ポリアミドは培養ｈＶＳＭＣ細胞の核内に４８時間よりも長い時間留まっていることができる。ＦＩＴＣ標識ポリアミドを１０−９Ｍの濃度で培地に直接添加し、蛍光顕微鏡下で観察した。
【図５】ポリアミドがインビトロ転写反応においてルシフェラーゼ遺伝子転写を阻害することを示す。１μｇのプラスミドを、８ＵＨｅＬａ核抽出物、３種類の非標識三リン酸（ＵＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ）の各々の４００ｍＭ、２５μＭ α−３２Ｐ−ＡＴＰと共に、転写緩衝液中、３０℃で６０分間インキュベートした。１７５μｌのＨｅＬａ抽出停止溶液を添加することにより反応を停止し、次いでフェノールクロロホルム−イソアミルアルコール抽出とエタノール沈澱を行った。試料を９８％ホルムアルデヒドローディング色素中に再懸濁し、６％、７Ｍ尿素−ポリアクリルアミドゲルに載せる前に９０℃で１０分間加熱した。ゲルを乾燥し、オートラジオグラフィーで可視化した。
【図６】ポリアミドがプラスミド実験においてルシフェラーゼ遺伝子（ｐＧＬ／ＴＧＦ）の発現を阻害することを示す。ＴＰＡはｈＴＧＦ−β１プロモータの活性を促進し、ポリアミド（ｐｏｌ）はプロモータの活性を低下させたが、ミスマッチポリアミド（Ｍｉｓ）は低下させなかった。ｈＴＧＦ−β１プロモータにより制御された１μｇのルシフェラーゼ遺伝子を無菌培地中リポフェクチン試薬を用いて６時間でトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を、０．５％ＣＳを含有する培地中でポリアミド又はミスマッチポリアミドの存在（非存在）下で２４時間インキュベートし、ルシフェラーゼ活性をデュアル−ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ系を用いてこれらの細胞抽出液で測定した。１００μＬのルシフェラーゼ基質を２０μＬの抽出液に加えた。混合後、反応液をルミノメータ（Ｔｕｒｎｅｒ Ｄｅｓｉｇｎｓ−Ｂｉｏｂｌｏｃｋ，Ｉｌｌｋｉｒｃｈ，Ｆｒａｎｃｅ）中に置き、室温で１０秒間に発生する光を測定した。ＰＭＡを陽性コントロールとして用いた。コントロールとの比較＊ｐ＜０．０５。
【図７】ポリアミドがｈＶＳＭＣ中でｈＴＧＦβ１ｍＲＮＡの発現を阻害することを示す。１０−９Ｍのポリアミドを培養ｈＶＳＭＣの培地に添加し、２４時間インキュベーションした。５０ｎｇ／ｍＬのＴＰＡでの処理を陽性コントロールに用いた。全ＲＮＡを細胞から抽出し、一本鎖ｃＤＮＡに逆転写し、材料と方法の部で先述したｈＴＧＦβ１と１８ＳｒＲＮＡのプライマーで増幅した。（Ａ）５μｌのＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲル上で電気泳動により分離した。（Ｂ）ＴＰＡはｈＴＧＦβ１ｍＲＮＡの発現を刺激した。ｈＴＧＦβ１ｍＲＮＡの１８ＳｒＲＮＡに対する比はポリアミド処理群（ｐｏｌ）では有意に減少したが、ミスマッチポリアミド（ｍｉｓ）はｈＴＧＦβ１の発現に影響を与えなかった。
【図８】培養ｈＶＳＭＣにおけるｈＴＧＦβ１タンパク質へのポリアミドの効果を示す。１０−９Ｍのポリアミドを培養ｈＶＳＭＣの培地に添加し、２４時間インキュベーションした。（Ａ）ｈＴＧＦβ１タンパク質の発現をウェスタンブロット解析により検討した。（Ｂ）ポリアミド（ｐｏｌ）はｈＴＧＦβ１タンパク質を培養ｈＶＳＭＣにおいて有意に阻害したが、ミスマッチ（ｍｉｓ）は阻害しなかった。
【配列表フリーテキスト】
【００６７】
配列番号４ センスプライマー
配列番号５ アンチセンスプライマー
配列番号６ センスプライマー
配列番号７ アンチセンスプライマー
【技術分野】
【０００１】
本発明はトランスフォーミング増殖因子ＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤、ＴＧＦ−β関連疾患の治療薬、及び新規なピロールイミダゾールポリアミドに関する。より詳細には特定の構造を有するピロールイミダゾールポリアミドを含んでなるＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
本態性高血圧症は脳卒中、虚血性心疾患及び腎硬化症等の重篤な合併症を引き起こすが、これらの合併症は、基本的には血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）の過剰増殖による血管障害と関連しており、高血圧症の治療の対象となっている。また、狭心症、心筋梗塞の治療のために行われる経皮的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）後の約４割に冠動脈の再狭窄が起こるが、今のところこれに対する有効な薬物療法がなく、循環器領域で大きな問題となっている。病理組織的には、高血圧症性血管疾患のような動脈増殖性疾患、血管形成術後の新生内膜形成及びアテローム性動脈硬化には、ＴＧＦ−βが関連していることが知られている。かかる病態における細胞増殖は種々の作用機構によって抑制することができると考えられるが、そのうちの１つが、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）発現を抑制することである。
【０００３】
ＴＧＦは当初、Ｍｏｌｏｎｙ肉腫ウイルス（ＭＳＶ）によりトランスフォームされたマウス３Ｔ３細胞が正常細胞を悪性に変える因子として見出され、主としてＴＧＦ−αとＴＧＦ−βに大別される。ＴＧＦ−βは、前駆体として合成された３９０〜４１２個のアミノ酸からなる分子量約４０，０００のタンパク質のＣ末端側の１１２個のアミノ酸からなる部分が、ジスルフィド結合を介して二量体（２５ｋＤａ）を構成して活性を持ったものである。
【０００４】
ＴＧＦ−βは、細胞の成長と発生を調節する蛋白質の一つのファミリーを構成し（非特許文献１）、血管、血小板、肝臓、腎臓、心筋、肺、膵臓、皮膚、胎盤、骨髄などの種々の組織で産生され、細胞の増殖、細胞外マトリックスの形成、免疫能の調節作用をもつ。
【０００５】
ＴＧＦ−βは殆んどの細胞に対して増殖抑制に働くが、線維芽細胞、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）などの間葉系細胞に対しては二相性増殖作用をもつ。つまりこれらの細胞では通常状態では増殖抑制に働くが、炎症、機械的ストレスなどが加わると増殖刺激に働く。これらのことから、ＴＧＦ−βはＶＳＭＣ増殖と細胞外マトリクス形成を促進することにより血管傷害後の新生内膜形成に関与している。ＴＧＦ−βはまた、動脈硬化症の病巣の形成にも関与している。このような情報に基づいて、ＴＧＦ−βの効果を調節することに向けられた局所血管療法が上記の血管増殖性疾患の軽減に有効と考えられる。
【０００６】
また、ＴＧＦ−βは経皮的腎動脈形成術後の腎動脈の再狭窄にも関与していると考えられている。これらの事実から、本発明のＴＧＦ−β特異的発現抑制薬は、上記の各種血管増殖・狭搾性疾患に対する治療薬として有効である。
【０００７】
また、肝臓の繊維化の過程で、肝星細胞は細胞外マトリックス産生において重要な役割を果たしている（非特許文献２）。星細胞の活性化はＴＧＦ−β１により行われ、更に活性化星細胞により、障害肝では炎症細胞からのＴＧＦ−β１の分泌が引き起こされる。同時に活性化星細胞のＴＧＦ−β１受容体発現が亢進し、ＴＧＦ−β１によるオートクライン機序により細胞外マトリックス蛋白を増加させる（非特許文献３）。これらの事実から、本発明のＴＧＦ−β１特異的発現抑制薬は、上記の各種肝疾患に対する治療薬としても有効であると合理的に考えることができる。
【０００８】
また、ＩｇＡ腎症、巣状糸球体硬化症、半月体形成性腎炎、巣状硬化型ループス腎炎、びまん性増殖性ループス腎炎、糖尿病性腎症、高血圧性腎硬化症等の腎疾患のモデル動物、又は糸球体腎炎や糖尿病性腎症患者の腎生検組織でＴＧＦ−βの発現が細胞外基質と並行して増加している（非特許文献４、非特許文献５）また同時にＢｏｒｄｅｒらは、抗ＴＧＦ−βをＴｈｙ−１腎炎ラットに投与すると、腎糸球体の細胞外基質の蓄積を抑制することを報告した（非特許文献５）。これらの事実から、本発明のＴＧＦ−β１特異的発現抑制薬は、上記の各種腎疾患に対する治療薬としても有効であると合理的に考えることができる。
【０００９】
また、動物の心筋梗塞モデルにおいては、瘢痕形成期の梗塞巣で、ＴＧＦ−βの発現が持続的に亢進し、心筋繊維化の促進に関与している（非特許文献６）。これらの事実から、本発明のＴＧＦ−β１特異的発現抑制薬は、心筋梗塞後の心筋繊維化に対する治療薬としても有効であると合理的に考えることができる。
【００１０】
また、肺繊維症モデル動物に抗ＴＧＦ−β抗体やＴＧＦ−β可溶性レセプターを投与することにより肺繊維症が改善する（非特許文献７）。これらの事実から、本発明のＴＧＦ−β１特異的発現抑制薬は、肺繊維症に対する治療薬としても有効であると合理的に考えることができる。
【００１１】
また、ヒト慢性膵炎におけるＴＧＦ−β１の高発現については多数報告されているが、再発性急性膵炎のモデル動物に組換えＴＧＦ−βを投与すると、膵の炎症部分の繊維化やフィブロネクチンｍＲＮＡの高発現を引き起こし、逆に膵炎のモデル作成時にＴＧＦ−β１の中和抗体を投与すると、細胞外マトリックスの産生及びＩ・ＩＩＩ型コラーゲンやフィブロネクチンのｍＲＮＡ発現が抑制されることが明らかにされている（非特許文献８）。これらの事実から、本発明のＴＧＦ−β１特異的発現抑制薬は、慢性膵炎における繊維化に対する治療薬としても有効であると合理的に考えることができる。
【００１２】
また、強皮症の原因としＴＧＦ−βが提唱され、森らは皮膚繊維化モデルマウスにおいて、ＴＧＦ−βが皮膚繊維化を誘導することを報告した（非特許文献９）。これらの事実から、本発明のＴＧＦ−β１特異的発現抑制薬は、各種皮膚繊維化疾患に対する治療薬としても有効であると合理的に考えることができる。
【００１３】
また、骨髄繊維症の患者の巨核球ではＴＧＦ−β ｍＲＮＡの発現が亢進しており（非特許文献１０）、血小板内ＴＧＦ−β濃度は高値（非特許文献１１）で、患者の血漿中ＴＧＦ−β濃度は有意に高い（非特許文献１２）と報告されている。Ｒａｍｅｓｈｗａｒらによると骨髄繊維症の患者の単球は粘着によってＮＦ−ｋが活性化してＩＬ−１産生を誘導し、ＩＬ−１はＴＧＦ−β産生を亢進させて骨髄の繊維化を惹起している（非特許文献１３）。これらの事実から、本発明のＴＧＦ−β１特異的発現抑制薬は、骨髄繊維症に対する治療薬としても有効であると合理的に考えることができる。
【００１４】
また、男性型前頭部脱毛患者の培養細胞系において、男性ホルモンが皮膚乳頭細胞からＴＧＦ−β１が誘導され、このＴＧＦ−β１が表皮細胞増殖を抑制させることが報告されている（非特許文献１４）。これらの事実から、本発明のＴＧＦ−β１特異的発現抑制薬は、男性型前頭部脱毛に対する治療薬としても有効であると合理的に考えることができる。
【００１５】
逆遺伝学による遺伝子機能の不活性化の手法は、ある特定の遺伝子の機能を解析するために用いられるものであるが、一方でウイルス感染、癌、及び遺伝子の異常発現に基づくその他の疾病の治療にも大きな可能性を開いている。すなわち、遺伝子機能の不活性化を、相同的組換えによりＤＮＡレベルで、又はアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドやリボザイムによりＲＮＡレベルで実施することができることが知られている。しかし、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドやリボザイムの手法は、ターゲットとする配列に制約があり、組織、細胞への移行が悪く、リボヌクレアーゼにより分解されやすいという課題があった。
【００１６】
一方、アンチセンス試薬やリボザイムのような（デオキシ）リボヌクレオチド試薬とは異なり、ピロールイミダゾールポリアミド（以下、Ｐｙ−Ｉｍポリアミドとも言う）類が、ＤＮＡの塩基配列を特異的に認識し、特定遺伝子の発現を細胞外からコントロールすることができることが報告されている。
【００１７】
ピロールイミダゾールポリアミドは一群の合成小分子であり、芳香族環であるＮ−メチルピロール単位（以下Ｐｙとも言う）及びＮ−メチルイミダゾール単位（以下Ｉｍとも言う）から構成されている（非特許文献１５−１７）。Ｐｙ及びＩｍは連続してカップリングし折りたたむことによりγ−アミノ酪酸の存在下でＵ字型のコンフォメーションを採ることができる。本発明に係るピロールイミダゾールポリアミドにおいて、Ｎ−メチルピロール単位（Ｐｙ）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（Ｉｍ）及びγ−アミノ酪酸単位（γリンカーとも言う）は互いにアミド結合（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）で連結されており、その一般構造及び製造方法は公知である（特許文献１〜３）。
【００１８】
合成ポリアミドは二重らせんＤＮＡの副溝（マイナーグルーブ）中の特定の塩基対に高い親和性と特異性を以って結合することができる。塩基対の特異的認識はＰｙとＩｍとの１対１の対形成に依存している。即ち、ＤＮＡの副溝内でのＵ字型コンフォメーションにおいて、Ｐｙ／Ｉｍ対はＣ−Ｇ塩基対を標的とし、Ｉｍ／ＰｙはＧ−Ｃ塩基対を標的とし、そしてＰｙ／ＰｙはＡ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対の両方を標的とする（非特許文献１６−１７）。最近の研究によればＡ−Ｔ縮合はＰｙ／Ｐｙ対の一つのピロール環を３−ヒドロキシピロール（Ｈｐ）で置換した結果としてＨｐ／Ｐｙが優先的にＴ／Ａ対に結合することによって克服することができることがわかっている（非特許文献１８）。
【００１９】
一般的には転写の開始が遺伝子制御の重要なポイントであると考えられている。転写の開始には遺伝子プロモータ領域において特異的な認識配列に結合する転写因子をいくつか必要とする。副溝中のポリアミドは、もし転写因子が遺伝子発現において重要であれば、転写因子の結合を遮断して遺伝子の調節に干渉する可能性がある。この仮説はインビトロ及びインビボの実験で証明されている。ジンクフィンガーの認識部位（ＴＦＩＩＩＡの結合部位）の内部に結合した８員環Ｐｙ−Ｉｍポリアミドは５ＳＲＮＡ遺伝子の転写を阻害した（非特許文献１９）。ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）プロモータ中の転写因子配列に隣接する塩基対に結合するポリアミド類は、ヒト細胞におけるＨＩＶ−１複製を阻害する。これらの配列にはＴＡＴＡボックス、リンパ系エンハンサー因子ＬＥＦ−１配列、及びＥＴＳ−１配列が包含される（非特許文献２０）。これとは対照的に、ポリアミドはまた、リプレッサー因子を遮断することによって、又は生来の転写因子を置換することによって、遺伝子発現を活性化する（非特許文献２１−２３）。ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＵＬ１２２仲介初期タンパク質２（ＩＥ８６）は、プロモータにＲＮＡポリメラーゼＩＩを補充することを遮断し、その関連遺伝子の転写を抑制する（非特許文献２１）。合成ポリアミドはＩＥ８６の抑制を遮断しその対応遺伝子の発現を開放することができる（非特許文献２２）。Ｍａｐｐらにより設計されたポリアミドは人工転写因子として作用し、遺伝子転写反応を仲介する（非特許文献２３）。
【００２０】
【特許文献１】特許第３０４５７０６号
【特許文献２】特開２００１−１３６９７４
【特許文献３】ＷＯ ０３／０００６８３ Ａ１
【非特許文献１】Ｐｉｅｋ ｅｔ ａｌ．、ＦＡＳＥＢ Ｊ，１３，２１０５−２１２４（１９９９）
【非特許文献２】Ｂａｔａｌｌｅｒ Ｒ ｅｔ ａｌ，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １１８，１１４９，２０００
【非特許文献３】渡辺久剛ら、現代医療、第３５巻（第２号）、２００３年
【非特許文献４】Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｔ ｅｔａｌ：Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ ４９：４６１，１９９６
【非特許文献５】Ｂｏｒｄｅｒ ＷＡ ｅｔａｌ：Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ ５１：１３８８，１９９７
【非特許文献６】Ｏｎｏ ｅｔ ａｌ：Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９８：１４９，１９９８
【非特許文献７】Ｇｉｒｉ ＳＮ ａｌ：Ｔｈｏｒａｘ １９９３
【非特許文献８】槙野 直彦他：現代医療Ｖｏｌ．３５，Ｎｏ．２，２００３
【非特許文献９】Ｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ：ＪＣｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ １８１：１５３，１９９９
【非特許文献１０】Ｒｅｉｌｌｙ Ｊ ｅｔａｌ：Ｃｌｉｎ Ｈａｅｍａｔｏｌ：１１７５１−７６７，１９９８
【非特許文献１１】Ｍａｒｔｙｒｅ Ｍ Ｃｅｔ ａｌ：Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ ７７：８０−８６，９９１
【非特許文献１２】Ｒａｍｅｓｈｗａｒ Ｐｅｔ ａｌ：Ａｍ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ ５９：１３３−１４２，１９９８
【非特許文献１３】Ｒａｍｅｓｈｗａｒ ｅｔａｌ：Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６５：２２７１−２２７７，２０００
【非特許文献１４】Ｓｈｉｇｅｋｉ ｅｔ ａｌ：ＦＡＳＥＢ Ｊ １６：１９６７−１９６９，２００２
【非特許文献１５】Ｔｒａｕｇｅｒ ｅｔａｌ：Ｎａｔｕｒｅ．１９９６；３８２：５５９−６１．
【非特許文献１６】Ｗｈｉｔｅ ｅｔａｌ：Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．１９９７；４：５６９−７８．
【非特許文献１７】Ｄｅｒｖａｎ：ＢｉｏｏｒｇＭｅｄ Ｃｈｅｍ．２００１；９：２２１５−３５．
【非特許文献１８】Ｗｈｉｔｅ ａｔａｌ：Ｎａｔｕｒｅ．１９９８；３９１：４６８−７１．
【非特許文献１９】Ｇｏｔｔｅｓｆｅｌｄ ｅｔａｌ：Ｎａｔｕｒｅ．１９９７；３８７：２０２−５．
【非特許文献２０】Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ｅｔａｌ：Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９８；９５：１２８９０−５
【非特許文献２１】Ｌｅｅ ｅｔａｌ：Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９６；９３：２５７０−５．
【非特許文献２２】Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ｅｔａｌ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９９；３８：１０８０１−７．
【非特許文献２３】Ｍａｐｐ ｅｔａｌ：Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０００；９７：３９３０−５．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
先に述べた、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドやリボザイムの手法は、ターゲットとする配列に制約があり、組織、細胞への移行が悪く、リボヌクレアーゼにより分解されやすいという課題があった。これまでに、ｈＴＧＦ−βの遺伝子塩基配列に結合するピロール−イミダゾールポリアミドを用いたＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤又はＴＧＦ−β関連疾患の治療薬についての報告はない。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明者らは、ヒトＴＧＦ−βのプロモータの特定の領域に特異的に結合してヒトＴＧＦ−β遺伝子の発現を阻害することができるピロールイミダゾールポリアミドの開発とその薬理効果について鋭意研究した。そこで、本発明者らは、ヒトトランスフォーミング成長因子−β１（ｈＴＧＦ−β１）遺伝子の発現を阻害することができ、且つ治療薬として役立ち得る化合物を得るべく、ｈＴＧＦ−β１プロモータの様々な断片を標的とするポリアミド類のうち、脂肪特異性配列２（ＦＳＥ２）に隣接するｈＴＧＦ−β１プロモータの−５５７〜−５３６塩基対に結合する化合物が、ｈＴＧＦ−β１プロモータの活性を有意に阻害し、培養ヒト血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）においてｈＴＧＦ−β１遺伝子の発現をダウンレギュレートすることを見出し、本発明をなすに至った。
【００２３】
即ち、本発明は以下の通りである。
（１）Ｎ−メチルピロール単位（以下Ｐｙとも言う）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（以下Ｉｍとも言う）及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ヒトトランスフォーミング成長因子β１（以下ｈＴＧＦ−β１とも言う）プロモーターの以下に示す塩基配列−５５７〜−５３６（配列番号１）
ＴＡＡＡＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＴＣＴＴＡＣＡＧ
の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域と言う）の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ−Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含んでなるＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤。
（２）更にβ−アラニン単位を含む上記（１）記載のＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤。
（３）前記標的領域がｈＴＧＦ−β１プロモーターの以下に示す塩基配列−５４８〜−５３７（配列番号２）
ＧＣＡＡＴＴＣＴＴＡＣＡ
の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である上記１又は２記載のＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤。
（４）前記標的領域がｈＴＧＦ−β１プロモーターの以下に示す塩基配列−５４４〜−５３８（配列番号３）
ＴＴＣＴＴＡＣ
の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である上記３記載のＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤。
（５）前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される上記１記載のＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤。
【化１】
（６）前記ピロールイミダゾールポリアミドの末端のカルボキシル基がアミドを形成している上記５記載のＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤。
（７）前記アミドがＮ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアミンとのアミドである上記６記載のＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤。
（８）前記ピロールイミダゾールポリアミドがＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）と共役体を形成している上記５〜７のいずれか一項記載のＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤。
（９）下式で表されるピロールイミダゾールポリアミド。
【化２】
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、遺伝子発現を特異的に抑制することができるので化学療法剤のような副作用がなく、また化合物であるのでリボヌクレアーゼにより分解されるという欠点もない、ＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明に係るピロールイミダゾールポリアミドにおいて、Ｎ−メチルピロール単位（以下Ｐｙとも言う）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（以下Ｉｍとも言う）及びγ−アミノ酪酸単位（γリンカーとも言う）は互いにアミド結合（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）で連結されており、その一般構造及び製造方法は公知である（例えば、特許文献１〜３参照）。
【００２６】
例えば、ピロールイミダゾールポリアミドはＦｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）を用いた固相法（固相Ｆｍｏｃ法）による自動合成法によって簡便に製造することができる（特許文献３）。固相Ｆｍｏｃ法によれば、ピロールイミダゾールポリアミドの末端をカルボン酸残基として固体担体から切り出すことができるので、種々の官能基を分子末端に導入してピロールイミダゾールポリアミドの誘導体を作成することもできる。例えば、デュオカルマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、ブレオマイシン、エンジイン化合物、ナイトロジェンマスタード、これらの誘導体等、ＤＮＡに対してアルキル化能を有する化合物を必要に応じて導入することもできる。固相Ｆｍｏｃ法は市販のタンパク（ペプチド）合成機を用いる自動合成法であるため、天然に存在するタンパク質や非天然タンパク質とピロールイミダゾールポリアミドとの共役体（コンジュゲート）を合成することもできる。また、Ｆｍｏｃ法はｔ−ＢＯＣ法に比べて反応条件が緩和であるため、タンパク質以外の有機化合物（酸性条件下で不安定な官能基を有する化合物をも含む）の導入も可能である。例えば、ピロールイミダゾールポリアミドとＤＮＡやＲＮＡ（又はそれらの誘導体）との共役体を自動的に合成することも可能である。
【００２７】
上記公知のＦｍｏｃ法等によれば、末端にカルボキシル基を有するピロールイミダゾールポリアミドを合成することができる。その具体例としては、例えば、末端にβ−アラニン残基（β−アミノプロピオン酸残基）やγ−アミノ酪酸残基を有するピロールイミダゾールポリアミド等が挙げられる。末端にβ−アラニン残基又はγ−アミノ酪酸残基を有するピロールイミダゾールポリアミドは、例えば、それぞれＦｍｏｃでアミノ基を保護した、アミノピロールカルボン酸、アミノイミダゾールカルボン酸、β−アラニン又はγ−アミノ酪酸を担持した固相担体を用い、ペプチド合成機を使用して固相Ｆｍｏｃ法により合成することができる。
【００２８】
アミノピロールカルボン酸の具体例としては、例えば、４−アミノ−２−ピロールカルボン酸、４−アミノ−１−メチル−２−ピロールカルボン酸、４−アミノ−１−エチル−２−ピロールカルボン酸、４−アミノ−１−プロピル−２−ピロールカルボン酸、４−アミノ−１−ブチル−２−ピロールカルボン酸等が挙げられる。アミノイミダゾールカルボン酸の具体例としては、例えば、４−アミノ−２−イミダゾールカルボン酸、４−アミノ−１−メチル−２−イミダゾールカルボン酸、４−アミノ−１−エチル−２−イミダゾールカルボン酸、４−アミノ−１−プロピル−２−イミダゾールカルボン酸、４−アミノ−１−ブチル−２−イミダゾールカルボン酸等が挙げられる。
【００２９】
固相Ｆｍｏｃ法によれば、例えば、ピロールイミダゾールポリアミドとＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）との共役体を合成することもできる。ＦＩＴＣは従来から抗体の蛍光標識試薬として知られているので、得られる共役体は、当該ピロールイミダゾールポリアミドが特定のＤＮＡ配列を認識することを証明するために用いることができる。
【００３０】
本発明のＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤は、Ｎ−メチルピロール単位（Ｐｙ）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（Ｉｍ）及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ｈＴＧＦ−β１プロモーターの以下に示す塩基配列−５５７〜−５３６（配列番号１）
ＴＡＡＡＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＴＣＴＴＡＣＡＧ
の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域と言う）の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ−Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含む。
【００３１】
通常ＤＮＡのらせんの骨格は２種類の溝をつくり、広くて深い溝を主溝（メジャーグルーブ）、狭くて浅い溝を副溝（マイナーグルーブ）と呼んでいる。ここで上記ピロールイミダゾールポリアミドは、特定の塩基対がつくる副溝（マイナーグルーブ）に高い親和性と特異性を以って非共役結合的に結合することができる。この時の結合は、副溝のＣ−Ｇ塩基対に対してはピロールイミダゾールポリアミドのＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応している。そして、ピロールイミダゾールポリアミド分子中のγ−アミノ酪酸単位の部位で分子が折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとる。
【００３２】
副溝の塩基対とピロールイミダゾールポリアミドのＰｙとＩｍの対が上述のように対応していないと、副溝とピロールイミダゾールポリアミドとの結合が不十分となる。このように、副溝の塩基対とＰｙ−Ｉｍ対が上述のように対応していないピロールイミダゾールポリアミドを本願ではミスマッチ又はミスマッチポリアミドと呼ぶ。
【００３３】
Ｐｙ−Ｉｍポリアミドはインビトロ研究では一般的な又は組織特異的な転写因子の有効な阻害剤又は活性化剤である（非特許文献１９〜２３）。特異的なポリアミドでショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）を発育させると、特に毒性もなく機能的表現型を獲得したり喪失したりするが、これはポリアミドが特異的に遺伝子発現を制御した結果である（Ｊａｎｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ：Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２０００；６：１０１３−２４；Ｊａｎｓｓｅｎ ａｔ ａｌ：Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２０００；６：９９９−１０１１．）。本発明者らはｈＴＧＦ−β１プロモータの特定の断片を標的とするＰｙ−Ｉｍポリアミド類を合成した。まさに図４に示すように、ＦＩＴＣで標識したＰｙ−Ｉｍポリアミドは自発的に細胞膜を透過し、直接培地に添加すると培養ｈＶＳＭＣの核内に高濃度で蓄積した。これらのポリアミドは核内に４８時間以上特に消失することもなく安定に滞留した。先に記載されたアンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザイム（Ｈｕ ＷＹ，Ｆｕｋｕｄａ Ｎ，Ｎａｋａｙａｍａ Ｍ，Ｋｉｓｈｉｏｋａ Ｈ，Ｋａｎｍａｔｓｕｓｅ Ｋ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｂｙ ＤＮＡ−ＲＮＡ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ ｒｉｂｏｚｙｍｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｏ ｒａｔ ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ Ａ−ｃｈａｉｎ ｍＲＮＡ．Ｊ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．２００１；１９：２０３−１２；Ｔｅｎｇ Ｊ，Ｆｕｋｕｄａ Ｎ，Ｈｕ ＷＹ，Ｎａｋａｙａｍａ Ｍ，Ｋｉｓｈｉｏｋａ Ｈ，Ｋａｎｍａｔｓｕｓｅ Ｋ．ＤＮＡ−ＲＮＡ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ ｒｉｂｏｚｙｍｅ ｔｏ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａｌ ｍＲＮＡ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｈｅ ｅｘａｇｇｅｒａｔｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ ｒａｔｓ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｒｅｓ．２０００；４８：１３８−４７）と比較して、ポリアミドは選りすぐれた透過性（低濃度、トランスフェクション媒体不要）とより高い安定性を培養ｈＶＳＭＣにおいて示した。ポリアミドの高い透過性と安定性は遺伝子治療法のための真核細胞の核への理想的な薬剤アプローチを提供するものである。
【００３４】
最近までＰｙ−Ｉｍポリアミドの開発はプロモータ配列における転写因子−ＤＮＡ複合体の構造的特性に基づいていた。ＴＡＴＡボックス含有プロモータ中の配列を標的とする効率的な方法は、ＴＡＴＡボックスに隣接する塩基対に結合するよう設計することであろう。ＴＡＴＡボックスはほとんどのタンパク質コード遺伝子において転写開始部位の上流２５〜３５塩基対に位置している。転写介在因子Ｄ（ＴＡＦＩＩＤ）はＴＡＴＡボックスに特異的に結合するＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）を含んでおり、コアプロモータにおける他の転写関与因子を採用してプレ開始コンプレックス（ＰＩＣ）を形成する。ＰＩＣは遺伝子転写を開始してアクチベータ又はサプレッサと相互作用して遺伝子発現を調節する。ＴＢＰも二重らせんＤＮＡの副溝（マイナーグルーブ）に結合するので（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ：Ｃｅｌｌ．１９９１ Ｄｅｃ ２０；６７（６）：１２４１−５０；Ｓｔａｒｒ ｅｔ ａｌ：Ｃｅｌｌ．１９９１；６７：１２３１−４０；Ｃｏｕｒｅｙ ｅｔ ａｌ：Ｃｅｌｌ．１９８８；５５：８８７−９８．）、合成ポリアミドはＴＡＴＡ結合タンパク質の結合部位を競合的に占有し、遺伝子転写に干渉する。様々なプロモータで設計したポリアミドの成功例のうちで、ＴＡＴＡボックスを標的とするものが常に機能することが知られている（非特許文献２０、２１）。
【００３５】
ＴＡＴＡボックスもイニシエーター領域（Ｉｎｒ）も含んでいない種類のプロモータもある（Ｊａｖａｈｅｒｙ ｅｔ ａｌ：Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９４；１４：１１６−２７；Ｌｏ ｅｔ ａｌ：Ｇｅｎｅ．１９９６ Ｄｅｃ ５；１８２（１−２）：１３−２２；Ｒｏｍｅｏ ｅｔ ａｌ：Ｇｅｎｅ．１９９７；１８９：２８９−９５．）。高度に発現し特化された遺伝子のプロモータはＴＡＴＡボックスを有している傾向にあるが、ハウスキーピング遺伝子のプロモータにはそれが欠如している傾向がある。ＴＡＴＡのないプロモータは、低レベルで発現される遺伝子や、増殖の間に厳密なダウンレギュレーションを要求する遺伝子にとっては必要かもしれないが、そのメカニズムはなお今後の研究を要する。ｈＴＧＦ−β１プロモータはこの種類に属する。これは転写開始部位の上流の様々な領域にいくつもの陽性及び陰性の配列を含んでいる（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ：Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９８９；２６４：４０２−８．）。転写開始部位の近傍にはいくつかのＳＰ−１配列と二つのＡＰ−１配列が存在する。様々なウイルス性及び細胞性プロモータがＳＰ−１タンパク質によって活性化されるので、プロモータがＳＰ−１により刺激されるためには単一のＳＰ−１配列で十分のようである（Ｋａｄｏｎａｇａ ｅｔ ａｌ：Ｃｅｌｌ．１９８７；５１：１０７９−９０；Ｃｏｕｒｅｙ ｅｔ ａｌ：Ｃｅｌｌ．１９８８；５５：８８７−９８．）。ＡＰ−１配列はＪｕｎホモダイマー又はＦｏｓ／Ｊｕｎヘテロダイマー複合体のいずれかからなるＡＰ−１転写因子に応答する。ＡＰ−１配列を介してＴＰＡ、ｖ−ｓｒｃ遺伝子産物及びｈＴＧＦ−β１自身のようないくつかの物質がｈＴＧＦ−β１遺伝子の発現を刺激する（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ：Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９８９；２６４：７０４１−５；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ：Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９８９；２６４：１９３７３−８．Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ：Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９０；１０：１４９２−７；Ｂｉｒｃｈｅｎａｌｌ−Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ：Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９０；１０：４９７８−８３．）。
【００３６】
ＳＰ−１及び／又はＡＰ−１配列がｈＴＧＦ−β１遺伝子発現の活性化を仲介すると仮定されている。重要なポリアミドは応答性の転写因子の結合を遮断するために、異なるＡＰ−１及びＳＰ−１配列に隣接する塩基対を標的とするように設計されている。しかし、これらのポリアミドがｈＴＧＦ−β１プロモータの活性を阻害することができるか、又は活性化することができるかを示すに十分なデータはない。これらの結果は、設計したポリアミドがＤＮＡ等の副溝（マイナーグルーブ）中で占有する位置が不適切だったためかもしれない。本発明者らは標的配列をｈＴＧＦ−β１プロモータの上流にまで拡張した。一つのポリアミドはｈＴＧＦ−β１プロモータ−５４４〜−５３８塩基対を標的としており、これはインビトロでプロモータの活性を阻害し（図５〜７）、培養ｈＶＳＭＣではｈＴＧＦ−β１ ｍＲＮＡとタンパク質を阻害する（図７、８）ことが示されている。ｈＴＧＦ−β１プロモータの−５４４〜−５３８塩基対はちょうど脂肪特異性配列（ＦＳＥ２）に隣接している（図１）。前脂肪細胞（プレアジポサイト）においてＦＳＥ２は脂肪細胞Ｐ２（ａＰ２）遺伝子の発現に対して抑制的機能を示し、前脂肪細胞は脂肪細胞よりも多くのＦＥＳ２配列結合タンパク質を含んでいる（Ｋａｄｏｎａｇａ ｅｔ ａｌ：Ｃｅｌｌ．１９８７；５１：１０７９−９０；Ｃｏｕｒｅｙ ｅｔ ａｌ：Ｃｅｌｌ．１９８８；５５：８８７−９８．）。ＴＡＴＡボックスを含むコアプロモータからは転写を抑制する転写リプレッサーは見つかってはいるが、ＴＡＴＡのないプロモータからは見つかっていない（Ａｓｏ ｅｔ ａｌ：ＥＭＢＯ Ｊ．１９９４；１３：４３５−４５；Ｍａｃｋ ｅｔ ａｌ：Ｎａｔｕｒｅ．１９９３；３６３：２８１−３；Ｍｅｒｉｎｏ ｅｔ ａｌ：Ｎａｔｕｒｅ．１９９３；３６５：２２７−３２．）。これらの転写リプレッサーはＴＢＰ−ＴＡＴＡ相互作用に干渉し、次いで遺伝子の転写を阻害すると考えられた。これらのリプレッサーのデータを組合せると、脂肪細胞におけるＦＳＥ−２配列の抑制機能はＴＡＴＡボックスによって仲介されると仮定される。ｈＴＧＦ−β１プロモータはＴＡＴＡボックスを含んでいないので、ｈＴＧＦ−β１におけるＦＳＥ２配列の機能はａＰ２遺伝子におけるそれとは異なっていると考えられる。ほとんどの哺乳類遺伝子の発現はプロモータとエンハンサー配列に結合した莫大な数のタンパク質の作用の組合せに依存している傾向が高いので、今回の結果を説明する最も簡単なモデルは、本発明のピロールイミダゾールポリアミドがＦＳＥ２配列の領域で転写因子−ＤＮＡ相互作用を遮断し、ｈＴＧＦ−β１プロモータ活性に対して阻害効果を示すということである。
【００３７】
プロモータ領域における転写因子の調節以外に、他の因子も遺伝子発現に影響を与えている可能性もある。これらの因子はクロマチンパッキング、ポリアデニレーション、スプライシング、ｍＲＮＡ安定性、翻訳開始等を包含するものである（Ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ：Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２００１；５：２６３−８；ＭｃＫｅｏｗｎ Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９２；８：１３３−５５；Ｄｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ：Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ．１９９４；１９：３３６−４０；Ｋｏｚａｋ Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９２；８：１９７−２２５．）。合成ポリアミドはヌクレオソームの位置関係から標的部位に接近することができ、特異的配列を標的とすることによりクロマチンの縮合・脱縮合構造に影響を与えている可能性がある（Ｇｏｔｔｅｓｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ：Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００２；３２１：２４９−６３；Ｇｏｔｔｅｓｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ：Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００１；３０９：６１５−２９．）。ピロールイミダゾールポリアミドがヘテロクロマチン褐色サテライトを開き、ＧＡＦの結合を可能とし、その結果ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒにおける表現型の変化を引き起こしているということが証明されている。ピロールイミダゾールポリアミドは容易に合成し、興味のある配列を標的とするように設計することができるので、ゲノムの機能研究や最終的にはｈＴＧＦ−β１遺伝子阻害や活性化のような遺伝子治療に有用である。
【００３８】
本発明に係るＰｙ−Ｉｍポリアミドは転写開始領域からは遠位の上流において設計することができ、これがｈＴＧＦ−β１遺伝子の発現に対する阻害効果を示す。
【実施例】
【００３９】
Ｉ．材料及び方法
（１）ｈＴＧＦ−β１プロモータに対応するＰｙ−Ｉｍポリアミドの設計
本実験に用いた化合物とそのミスマッチ化合物（以下、単にミスマッチともいう）の形成スキームを図１に示す。Ｐｙ−Ｉｍポリアミドは脂肪特異性配列２（ＦＳＥ２）に隣接するｈＴＧＦ−β１プロモータの−５４４〜−５３８塩基対に結合するように設計した。
【００４０】
（２）Ｆｍｏｃ法を用いたＰｙ−Ｉｍポリアミドのマシンアシスト（機械補助）自動合成
ピロールイミダゾールポリアミドのマシンアシスト自動合成を、連続フローペプチド合成機Ｐｉｏｎｅｅｒ（商標）（アプライドバイオシステムズ）を用いて０．１ｍｍｏｌスケール（２００ｍｇのＦｍｏｃ−β−アラニン−ＣＬＥＡＲ酸レジン、０．５０ｍｅｑ／ｇ、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．）で実施した。自動固相合成はＤＭＦ洗浄、Ｆｍｏｃ基の２０％ピペリジン／ＤＭＦによる除去、メタノール洗浄、ＨＡＴＵ及びＤＩＥＡ（それぞれ４当量）の存在下でのモノマーとの６０分間のカップリング、メタノール洗浄、必要に応じて無水酢酸／ピリジンによる保護、及び最終的なＤＭＦ洗浄からなっている。Ｐｙ−Ｉｍポリアミドは一般に中程度の収率（１０−３０％）で得られた。
【００４１】
ＦＩＴＣカップリング：４倍過剰のフルオレセイン（０．４０ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（ＨＡＴＵなし）をＤＭＦに溶解したものをカラムを通して６０分間フラッシュした。
【００４２】
一般的手順：Ｆｍｏｃ−β−アラニン−Ｗａｎｇ樹脂のＦｍｏｃ基を除去した後、樹脂をメタノールで連続的に洗浄した。カップリング工程をＦｍｏｃアミノ酸で実施し、次いでメタノールでの洗浄を行った。これらの工程を全配列が導入されるまで何度も繰返した。カップリング工程を終えた後、必要に応じてＮ末端アミノ基を保護するか又はＦＩＴＣでカップリングし、ＤＭＦで洗浄し、反応容器を取りはずした。
【００４３】
カルボン酸としての分解：合成ポリアミドを冷エチルエーテル沈澱により分解工程（９１％ＴＦＡ−３％／ＴＩＳ−３％ＤＭＳ−３％水の混合物５ｍｌ／樹脂０．１ｍｍｏｌ）の後に単離した。
【００４４】
アミンとしての分解：合成ポリアミドを冷エチルエーテル沈澱により分解工程（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアミン５ｍｌ／樹脂０．１ｍｍｏｌ、５０℃、一晩）の後に単離した。
【００４５】
精製：最終精製は、１０ｍｌ／ｍｉｎの流速の分析用ＲＰ−ＨＰＬＣで、緩衝液Ａ（０．１％ＡｃＯＨ／水）中Ｂ（アセトニトリル）の直線勾配を用いて、３５０ｎｍのＵＶ検出により行った。
【００４６】
以下、化合物４ａ及び４ｂにおいて、ＩはＮ−メチルイミダゾール残基、ＰはＮ−メチルピロール残基、βはβ−アラニン残基、γはγ−アミノ酪酸残基、ＤｐはＮ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアミン、Ａｃはアシル基を表す。
【００４７】
ａ）ＦＩＴＣ−β−ＩＰＰ−β−ＩＰＰ−γ−ＰＰＰ−β−ＰＰ−βＤｐ（化合物４ａ）
勾配：緩衝液Ｂ １５％〜４５％（３０分間）、流速１０ｍｌ／ｍｉｎ。収率７ｍｇ（３％）。
【００４８】
ｂ）Ａｃ−ＩＰＰ−β−ＩＰＰ−γ−ＰＰＰ−β−ＰＰ−βＣＯＯＨ（化合物４ｂ）
勾配：緩衝液Ｂ ２５％〜３５％（３０分間、６０℃）、流速１０ｍｌ／ｍｉｎ。収率２９ｍｇ（１７％）。
【００４９】
Ｐｙ−Ｉｍポリアミド（化合物４ｂ）の構造は図２Ａに、そのＴＩＣ（ｔｏｔａｌ ｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ）チャートとエレクトロスプレーイオン化質量分析スペクトルを図２Ｂに示す。なお、ミスマッチとしては、上記化合物４ｂのアシル基に隣接するＩをＰで置き換えたＡｃ−ＰＰＰ−β−ＩＰＰ−γ−ＰＰＰ−β−ＣＯＯＨの構造を有するポリアミドを用いた。
【００５０】
（３）ｈＶＳＭＣ細胞培養
ｈＶＳＭＣはＣｌｏｎｅｔｉｃｓ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から得た。ｈＶＳＭＣを１０％仔ウシ血清（Ｇｉｂｃｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、及び１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ変性Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）にて培養した。細胞をＣａ２＋フリー及びＭｇ２＋フリーのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中０．０５％トリプシン（Ｇｉｂｃｏ）でのトリプシン処理により継代し、７５−ｃｍ２組織培養フラスコで培養した。培地は４〜５日毎に交換し、５〜１０継代の間の細胞について実験を行った。
【００５１】
（４）培養ｈＶＳＭＣにおけるＦＩＴＣ−標識ポリアミド類のインキュベーション
継代ｈＶＳＭＣを１０５／ｃｍ２の密度で２４時間、２４ウェルのフラスコで培養した。ＦＩＴＣ標識ポリアミドを１０−９Ｍの濃度で培地に直接添加し、蛍光顕微鏡で１時間ごとに観察した。
【００５２】
（５）ゲルシフトアッセイ
オリゴヌクレオチドを合成し、アニーリングして、ｈＴＧＦ−β１プロモータの−５４８〜−５３７塩基対に対応する１２種の二本鎖オリゴヌクレオチドとした（図１Ａ）。二本鎖ＤＮＡを［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰを用いたＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで標識し、３７℃で１５分間、結合緩衝液（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．９，２５０ｍＭ ＮａＣｌ，２５ｍＭ ＥＤＴＡ，２５ｍＭ ＤＴＴ，１００ｍＭ ＫＣｌ）中でポリアミド又はミスマッチポリアミドとともにインキュベートした。得られた複合体を２０％ポリアクリルアミドゲルにより電気泳動し、オートラジオグラフィーで可視化した。
【００５３】
（６）ｈＴＧＦ−β１プロモータの制御下でのルシフェラーゼ遺伝子発現系の構築
プラスミドｐｈＴＢＧ １０１（非特許文献１０）由来の２．２ｋｂ ｈＴＧＦ−β１プロモータを分離し、ｐＧＬ３基本プラスミドに挿入し（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ルシフェラーゼリポーター遺伝子のコード領域の上流に置いた。正確な構築プラスミドは制限酵素スペクトル分析及び配列決定により同定された。
【００５４】
（７）インビトロ転写反応
インビトロ転写反応はＨｅＬａ核抽出物を用いてインビトロ転写系で行った（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）。２５μＬの反応液は、１００ｎｇのＤＮＡ鋳型、８ＵのＨｅＬａ核抽出物、３種類の非標識三リン酸（ＵＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ）の各々４００μＭ、２５μＭ γ−３２Ｐ−ＡＴＰ（５ｃｉ／ｍｍｏｌ、ＮＥＭ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、及び２０ｍＭのヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）を含む転写緩衝液（ｐＨ７．９）、１００ｍＭのＫＣｌ、４．０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０％グリセロール、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．６ｍＭ フェニルメチルスルホニルフルオリドからなるものであった。転写鋳型ＤＮＡはＳｐｈＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｂａｖｅｒｌｙ，ＭＡ）で切断した。転写反応液を３０℃で６０分間インキュベートした後、１７５μＭのＨｅＬａ抽出物停止溶液（０．３Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、０．３Ｍ 酢酸ナトリウム、０．５％ＳＤＳ、２．０ｍＭ ＥＤＴＡ、３μｇ／ｍｌ ｔＲＮＡ）を添加することによって反応を停止し、次いでフェノールクロロホルム−イソアミルアルコール抽出及びエタノール沈澱を行った。試料を９８％ホルムアルデヒド・ローディング色素中に再懸濁させ、９０℃で１０分間加熱してから６％、７Ｍ尿素・ポリアクリルアミドゲルで泳動した。ゲルを乾燥し、オートラジオグラフィーで可視化した。
【００５５】
（８）一時的トランスフェクションとルシフェラーゼアッセイ
ｈＶＳＭＣ細胞を１０％ＣＳの存在下で２４ウェル皿に１０−５／ｃｍ２の密度で培養した。２４時間後、ｈＴＧＦ−β１プロモータにより駆動されるレポーター遺伝子を、滅菌培地に１μｇのＤＮＡの存在下リポフェクチン試薬（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用いて、製造者の指示する方法にしたがってトランスフェクトした。細胞をＤＮＡリポソーム複合体とともに６時間インキュベートし、次いで培地を１ｍｌの新鮮な完全培地で置き換えた。トランスフェクションの２４時間後、細胞をポリアミド又はミスマッチポリアミドの存在下又は非存在下で、０．５％ＣＳを含む培地で２４時間インキュベートした。この処理の終わりに、培地を取り除き、細胞を剥がして１５０μｌのＰａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ緩衝液中に入れた。簡単に遠心分離を施した後、細胞抽出物でデュアル−ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。１００μｌのルシフェラーゼ基質を２０μｌの抽出物に添加した。混合後、反応物をルミノメーター（Ｔｕｒｎｅｒ Ｄｅｓｉｇｎｓ−Ｂｉｏｂｌｏｃｋ，Ｉｌｌｋｉｒｃｈ，Ｆｒａｎｃｅ）に置き、室温で１０秒間に発生する発光を測定した。
【００５６】
（９）ＲＮＡ抽出及び成長因子ｍＲＮＡのための逆転写反応、ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイ
培養細胞をＰＢＳで洗浄し、８００μＬのＲＮＡｚｏｌＢ（Ｂｉｏｔｅｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）に溶解し、８０μＬのクロロホルムと混合し、遠心分離を施し、無色の上部水相を等体積のイソプロパノールと混合してＲＮＡを沈澱させた。ＲＮＡペレットを５００μＬの７５％エタノールで二回洗浄し、乾燥後、１０μｌのＴＥ緩衝液に溶かした。６５℃で１５分間変性させた後、ＲＮＡ試料を室温で４５分間、０．５ｍｌのＤＮアーゼ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８．３，５０ｍＭ ＫＣｌ，２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２）中、０．５Ｕ ＤＮアーゼ（Ｇｉｂｃｏ）で処理した。ＤＮアーゼは０．５ｍＬ ０．５Ｍ ＥＤＴＡを添加し、９８℃で１０分間加熱することによって不活化した。
【００５７】
等量のＲＮＡのアリコート（１μｇ／２０μＬ）を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ デオキシＮＴＰ類、及び２．５μＭランダムヘキサマー中、２．５Ｕ／２０μＬトリ骨髄芽腫ウイルス逆転写酵素（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を用いて一本鎖ｃＤＮＡ中に逆転写させた。２μＬの希釈ｃＤＮＡ生成物を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、４ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０２５Ｕ／μＬ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）及び上流センスプライマー及び下流アンチセンスプライマーの各々０．２μＭとともに混合し合計２５μＬとした。センスプライマー（５’−ＡＴＣＡＧＡＧＣＴＣＣＧＡＧＡＡＧＣＧＧＴＡＣＣ−３’）（配列番号４）及びアンチセンスプライマー（５’−ＧＴＣＣＡＣＴＴＧＣＡＧＴＧＴＴＡＴＣＣＴＧ−３’）（配列番号５）をｈＴＧＦ−β１ ｍＲＮＡのＰＣＲ増幅に使用した。ヒト１８ＳリボゾームＲＮＡについてセンスプライマー（５’−ＴＣＡＡＧＡＡＣＧＡＡＡＧＴＣＧＧＡＣＧ−３’）（配列番号６）及びアンチセンスプライマー（５’−ＧＧＡＣＡＴＣＴＡＡＧＧＧＣＡＴＣＡＣＡ−３’）（配列番号７）を内部対照として使用した。ＰＣＲを自動熱制御器（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ，ＣＡ）で行った。ＰＣＲ条件は９４℃２分の初期変性、次いで３０サイクルの変性９４℃１分、アニーリング５８℃１分、伸張７２℃１分を行い、最後に７２℃１０分の伸張反応を行うものであった。１８ＳｒＲＮＡについてのプライマーによるＰＣＲを内部対照として各反応中に含ませた。ゲノムＤＮＡがＰＣＲによって増幅しないことを確認するために、逆転写酵素なしプライマーセットありの対照ＲＴ−ＰＣＲ実験を行った。反応のいずれにおいても生成物は増幅しなかった。ｍＲＮＡの半定量的分析のために、ＰＣＲ反応の動力学をモニターした。ＰＣＲ産物がゲル上で検出可能になったサイクル数を種々の試料間で比較した。連続した１０倍希釈のｃＤＮＡ（１００、１０及び１ｎｇ）を増幅した。ＰＣＲ産物はｃＤＮＡの量を増加していくとより早いサイクルの段階で検出可能となった。標的ｍＲＮＡの各々に対応するＰＣＲ産物の量は２０〜３５サイクルで直線的に増加した。５μＭのＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲル上の電気泳動により分離した。バンド強度をＮＩＨソフトウェアを用いてコンピュータ分析により測定した。
【００５８】
（１０）細胞の調製とウェスタンブロット分析
被験ＶＳＭＣ及び対照ＶＳＭＣを６ウェルプレートで２４時間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄し、３００μＬの溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ フェニルメチルスルホニルフルオリド、１μｇ／ｍＬ アプロチニン、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）で氷上３０分間インキュベートした。細胞を１．５ｍＬチューブ中に剥ぎ取り、遠心分離し、上澄み液を集め、タンパク質含量をＢＩＯ−ＲＡＤタンパク質アッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いたブラッドフォードタンパク質アッセイにより決定した。上澄み液は２０μｇの全タンパク質を含んでいた。これをローディング緩衝液中１００℃で３分間変性し、１０％ポリアクリルアミドゲルで泳動し、ニトロセルロース膜に転写した。膜をｈＴＧＦ−β１に特異的なマウスモノクローナル抗体（１：５００）（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）とともに室温で１時間インキュベートし、次いで抗マウスＨＲＰ共役第二抗体とともに１：２０００で室温で１時間インキュベートした後、十分に洗浄した。膜を電気化学発光基質（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）とともにインキュベートし、Ｘ線フィルムに暴露した。
【００５９】
（１１）統計解析
結果は平均値±ＳＥＭで表現した。平均値間の差の有意性はスチューデントｔ検定により評価した。０．０５未満のｐ値を有意であるとした。
【００６０】
ＩＩ．結果
（１）合成ポリアミドの二本鎖オリゴヌクレオチドへの結合
まず、合成Ｐｙ−Ｉｍポリアミド（化合物４ａ及び４ｂ）がその対応塩基対に結合するかどうかをチェックした。いずれのポリアミドも対応する１２塩基対二本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができたが（図３、レーン２〜４）、ミスマッチポリアミドはこれらのオリゴヌクレオチドには結合しなかった（図３、レーン１）。
【００６１】
（２）合成ポリアミドの細胞膜の透過と核内への取り込み
合成化合物が核内に入り生存細胞中で安定な状態にあることを示すためにＰｙ−ＩｍポリアミドをＦＩＴＣで標識した。ＦＩＴＣ標識ポリアミドを培地中１０−９Ｍの濃度で２時間インキュベートしたところ、このＦＩＴＣを培養ｈＶＳＭＣの核内で高密度で検出することができた。（図４）。核内におけるＦＩＴＣ標識ポリアミドのこの高蓄積はゲノム内の非特異的結合によるものであり、細胞質中のこの化合物の濃度ははるかに低いものであった。
【００６２】
（３）合成ポリアミドによるｈＴＧＦ−β１プロモータ活性の阻害
インビトロ転写系はＨｅＬａ核抽出物とｈＴＧＦ−β１プロモータの存在下でＤＮＡ暗号を転写する。合成ポリアミド（Ｐｏｌ）はｈＴＧＦ−β１プロモータの−５４４〜−５３８塩基対に結合するので、転写を減少させる。一方、ミスマッチポリアミド（Ｍｉｓ）は転写分子の形成に有意な効果を示さなかった（図５）。
プラスミドトランスフェクション実験において、ルシフェラーゼをコードするレポーター遺伝子はｈＴＧＦ−β１プロモータにより駆動され、培養ｈＶＳＭＣ中で発現された。１２−Ｏ−テトラデカノイルフォルボール−１３−アセチルトランスフェラーゼ（ＴＰＡ）はルシフェラーゼタンパク質の発現を刺激した。１０−９Ｍのポリアミドのインキュベーションによりルシフェラーゼの発現を有意にダウンレギュレートすることができたが、ミスマッチポリアミドはルシフェラーゼ遺伝子の発現には効果はなかった（図６）。
【００６３】
（４）合成ポリアミドによるｈＶＳＭＣ中でのｈＴＧＦ−β１ｍＲＮＡの阻害
インビボにおけるｈＴＧＦ−β１遺伝子の発現に対するポリアミドの効果を観察するために、培養ｈＶＳＭＣを１０−９Ｍポリアミドとともに２４時間インキュベートした。ｈＴＧＦ−β１ｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法を用いて分析した。ＴＰＡを陽性対照として用いた。５０ｎｇ／ｍＬ ＴＰＡはｈＴＧＦ−β１ｍＲＮＡの発現を有意に刺激した。本発明のポリアミド（ｐｏｌ）はＴＰＡにより誘導されたｈＴＧＦ−β１ｍＲＮＡの発現を有意に阻害したが、ミスマッチポリアミド（Ｍｉｓ）は阻害しなかった（図７）。
【００６４】
（５）ｈＶＳＭＣにおけるｈＴＧＦ−β１タンパク質の発現に対する合成ポリアミドの効果
本発明者らはｈＶＳＭＣにおけるｈＴＧＦ−β１タンパク質の発現に対する合成ポリアミド（ｐｏｌ）の効果をチェックした。１０−９Ｍの合成ポリアミドは２４時間のインキュベーション後にｈＴＧＦ−β１タンパク質の発現を阻害したが、ミスマッチポリアミド（Ｍｉｓ）は阻害しなかった（図８）。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明のＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤はＴＧＦ−βの産生が関与する疾病の治療薬として利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】本発明で用いられる合成Ｐｙ−Ｉｍポリアミドの構造を示す。
【図２Ａ】合成Ｐｙ−Ｉｍポリアミド（化合物４ｂ）の構造を示す。
【図２Ｂ】合成Ｐｙ−Ｉｍポリアミド（化合物４ｂ）のＴＩＣチャートとエレクトロスプレーイオン化質量分析スペクトルを示す。
【図３】合成Ｐｙ−Ｉｍポリアミドの対応二重鎖オリゴヌクレオチドへの結合によるポリアミド−オリゴヌクレオチド複合体の形成を示す。ｈＴＧＦ−β１プロモータの−５４８〜−５３７塩基対（図１）に対応する二重鎖ＤＮＡは［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰを用いてＴ４ポリヌクレオチドにより標識され、ミスマッチポリアミド（レーン０）又は漸増量のポリアミド（レーン１〜３がそれぞれ１ｎＭ、２ｎＭ、４ｎＭ）と共に、結合緩衝液中３７℃で１５分間インキュベートした。得られた複合体を２０％ポリアクリルアミドゲルにより電気泳動にかけ、オートラジオグラフィーにより可視化した。
【図４】１０−９Ｍの濃度で２時間インキュベーションした後、ＦＩＴＣ標識ポリアミドが培養ｈＶＳＭＣ細胞の核内に留まっていることを示す。ＦＩＴＣ標識ポリアミドは培養ｈＶＳＭＣ細胞の核内に４８時間よりも長い時間留まっていることができる。ＦＩＴＣ標識ポリアミドを１０−９Ｍの濃度で培地に直接添加し、蛍光顕微鏡下で観察した。
【図５】ポリアミドがインビトロ転写反応においてルシフェラーゼ遺伝子転写を阻害することを示す。１μｇのプラスミドを、８ＵＨｅＬａ核抽出物、３種類の非標識三リン酸（ＵＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ）の各々の４００ｍＭ、２５μＭ α−３２Ｐ−ＡＴＰと共に、転写緩衝液中、３０℃で６０分間インキュベートした。１７５μｌのＨｅＬａ抽出停止溶液を添加することにより反応を停止し、次いでフェノールクロロホルム−イソアミルアルコール抽出とエタノール沈澱を行った。試料を９８％ホルムアルデヒドローディング色素中に再懸濁し、６％、７Ｍ尿素−ポリアクリルアミドゲルに載せる前に９０℃で１０分間加熱した。ゲルを乾燥し、オートラジオグラフィーで可視化した。
【図６】ポリアミドがプラスミド実験においてルシフェラーゼ遺伝子（ｐＧＬ／ＴＧＦ）の発現を阻害することを示す。ＴＰＡはｈＴＧＦ−β１プロモータの活性を促進し、ポリアミド（ｐｏｌ）はプロモータの活性を低下させたが、ミスマッチポリアミド（Ｍｉｓ）は低下させなかった。ｈＴＧＦ−β１プロモータにより制御された１μｇのルシフェラーゼ遺伝子を無菌培地中リポフェクチン試薬を用いて６時間でトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を、０．５％ＣＳを含有する培地中でポリアミド又はミスマッチポリアミドの存在（非存在）下で２４時間インキュベートし、ルシフェラーゼ活性をデュアル−ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ系を用いてこれらの細胞抽出液で測定した。１００μＬのルシフェラーゼ基質を２０μＬの抽出液に加えた。混合後、反応液をルミノメータ（Ｔｕｒｎｅｒ Ｄｅｓｉｇｎｓ−Ｂｉｏｂｌｏｃｋ，Ｉｌｌｋｉｒｃｈ，Ｆｒａｎｃｅ）中に置き、室温で１０秒間に発生する光を測定した。ＰＭＡを陽性コントロールとして用いた。コントロールとの比較＊ｐ＜０．０５。
【図７】ポリアミドがｈＶＳＭＣ中でｈＴＧＦβ１ｍＲＮＡの発現を阻害することを示す。１０−９Ｍのポリアミドを培養ｈＶＳＭＣの培地に添加し、２４時間インキュベーションした。５０ｎｇ／ｍＬのＴＰＡでの処理を陽性コントロールに用いた。全ＲＮＡを細胞から抽出し、一本鎖ｃＤＮＡに逆転写し、材料と方法の部で先述したｈＴＧＦβ１と１８ＳｒＲＮＡのプライマーで増幅した。（Ａ）５μｌのＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲル上で電気泳動により分離した。（Ｂ）ＴＰＡはｈＴＧＦβ１ｍＲＮＡの発現を刺激した。ｈＴＧＦβ１ｍＲＮＡの１８ＳｒＲＮＡに対する比はポリアミド処理群（ｐｏｌ）では有意に減少したが、ミスマッチポリアミド（ｍｉｓ）はｈＴＧＦβ１の発現に影響を与えなかった。
【図８】培養ｈＶＳＭＣにおけるｈＴＧＦβ１タンパク質へのポリアミドの効果を示す。１０−９Ｍのポリアミドを培養ｈＶＳＭＣの培地に添加し、２４時間インキュベーションした。（Ａ）ｈＴＧＦβ１タンパク質の発現をウェスタンブロット解析により検討した。（Ｂ）ポリアミド（ｐｏｌ）はｈＴＧＦβ１タンパク質を培養ｈＶＳＭＣにおいて有意に阻害したが、ミスマッチ（ｍｉｓ）は阻害しなかった。
【配列表フリーテキスト】
【００６７】
配列番号４ センスプライマー
配列番号５ アンチセンスプライマー
配列番号６ センスプライマー
配列番号７ アンチセンスプライマー
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−メチルピロール単位（以下Ｐｙとも言う）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（以下Ｉｍとも言う）及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ヒトトランスフォーミング成長因子β１（以下ｈＴＧＦ−β１とも言う）プロモーターの以下に示す塩基配列−５５７〜−５３６（配列番号１）
ＴＡＡＡＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＴＣＴＴＡＣＡＧ
の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域と言う）の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ−Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含んでなるＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤。
【請求項２】
更にβ−アラニン単位を含む請求項１記載のＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤。
【請求項３】
前記標的領域がｈＴＧＦ−β１プロモーターの以下に示す塩基配列−５４８〜−５３７（配列番号２）
ＧＣＡＡＴＴＣＴＴＡＣＡ
の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である請求項１又は２記載のＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤。
【請求項４】
前記標的領域がｈＴＧＦ−β１プロモーターの以下に示す塩基配列−５４４〜−５３８（配列番号３）
ＴＴＣＴＴＡＣ
の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である請求項３記載のＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤。
【請求項５】
前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される請求項１記載のＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤。
【化１】
【請求項６】
前記ピロールイミダゾールポリアミドの末端のカルボキシル基がアミドを形成している請求項５記載のＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤。
【請求項７】
前記アミドがＮ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアミンとのアミドである請求項６記載のＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤。
【請求項８】
前記ピロールイミダゾールポリアミドがＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）と共役体を形成している請求項５〜７のいずれか一項記載のＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤。
【請求項９】
下式で表されるピロールイミダゾールポリアミド。
【化２】
【請求項１】
Ｎ−メチルピロール単位（以下Ｐｙとも言う）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（以下Ｉｍとも言う）及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ヒトトランスフォーミング成長因子β１（以下ｈＴＧＦ−β１とも言う）プロモーターの以下に示す塩基配列−５５７〜−５３６（配列番号１）
ＴＡＡＡＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＴＣＴＴＡＣＡＧ
の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域と言う）の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ−Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含んでなるＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤。
【請求項２】
更にβ−アラニン単位を含む請求項１記載のＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤。
【請求項３】
前記標的領域がｈＴＧＦ−β１プロモーターの以下に示す塩基配列−５４８〜−５３７（配列番号２）
ＧＣＡＡＴＴＣＴＴＡＣＡ
の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である請求項１又は２記載のＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤。
【請求項４】
前記標的領域がｈＴＧＦ−β１プロモーターの以下に示す塩基配列−５４４〜−５３８（配列番号３）
ＴＴＣＴＴＡＣ
の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である請求項３記載のＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤。
【請求項５】
前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される請求項１記載のＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤。
【化１】
【請求項６】
前記ピロールイミダゾールポリアミドの末端のカルボキシル基がアミドを形成している請求項５記載のＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤。
【請求項７】
前記アミドがＮ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアミンとのアミドである請求項６記載のＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤。
【請求項８】
前記ピロールイミダゾールポリアミドがＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）と共役体を形成している請求項５〜７のいずれか一項記載のＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤。
【請求項９】
下式で表されるピロールイミダゾールポリアミド。
【化２】
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０２３２４８
【国際公開日】平成１７年３月１７日（２００５．３．１７）
【発行日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１３６８３（Ｐ２００５−５１３６８３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１２８５４
【国際出願日】平成１６年９月３日（２００４．９．３）
【出願人】（８９９００００５７）学校法人日本大学 (650)
【出願人】（５０４２６５８５７）ジェンティア・バイオシステムズ株式会社 (4)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年３月１７日（２００５．３．１７）
【発行日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１２８５４
【国際出願日】平成１６年９月３日（２００４．９．３）
【出願人】（８９９００００５７）学校法人日本大学 (650)
【出願人】（５０４２６５８５７）ジェンティア・バイオシステムズ株式会社 (4)
【Ｆターム（参考）】
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