アニオン性置換基を有する物質の捕捉剤
【課題】 一定条件下で、アニオン性置換基（例えばリン酸基）と結合する性質を有すると共に、全体として溶媒難溶性（好ましくは溶媒不溶性）を示す、アニオン性置換基（例えばリン酸基）を有する物質を捕捉することができ、且つ、容易に分離精製可能なポリマー担体の提供。
【解決手段】 所定の亜鉛錯体基が直接又はスペーサーを介して共有結合したポリマー担体。
【解決手段】 所定の亜鉛錯体基が直接又はスペーサーを介して共有結合したポリマー担体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アニオン性置換基（例えばリン酸基）を有する物質を分離精製するために有用な、所定の亜鉛錯体基が結合したポリマー担体、そのポリマー担体を含有する、アニオン性置換基（例えばリン酸基）を有する物質の捕捉剤、更に、この捕捉剤を充填した捕捉器具及びその捕捉方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リン酸基を有する物質、例えばリン酸化された生体物質等を分析するための方法としては、従来より、酵素免疫法（ＥＬＩＳＡ）による方法や放射性同位元素を用いる方法が知られている。
【０００３】
酵素免疫法は、抗体（又は抗原でもよい）が目標物質と特異的に結合する原理を利用している。そのため、目的物質固有の抗体を作製するのに、目的物質を多量に精製し入手する必要があるという問題点がある。更に、抗体の作製には動物の免疫反応を用いるため、抗体の作製に時間がかかるという問題点がある。また、数ｋＤａ（ダルトン）以下の分子構造中のリン酸化部位に対する抗体を作製することができないため、そのような分子構造を持つリン酸化された生体物質を酵素免疫法によって分析することができないという問題点がある。
【０００４】
また、放射性同位元素を用いる方法は、放射性同位元素３２Ｐを用いる。そのため、実験室の放射線の管理及び廃液の管理に手間がかかるという問題点がある。
【０００５】
排水中のリン酸濃度を下げるための方法として、特開平１１−５７６９５号公報には、複合金属水酸化物を用いる方法が開示されている。一方、医薬の分野では、高リン血症の治療に用いられるものとして、特表平８−５０６８４６号公報に記載のグアニジノ基が結合したポリマーがある。しかし、複合金属水酸化物及びグアニジノ基が結合したポリマーは、リン酸基に対する結合力が弱い。そのため、一定量のリン酸を捕捉するためには、多量のリン酸基結合基質としての複合金属水酸化物又はグアニジノ基が結合したポリマーを用いなければならないという問題点がある。
【０００６】
一方、リン酸基と強く結合する化合物として、ジャーナル オブ ザ アメリカン ケミカル ソサエティー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ），（米国），１９９１年，第１１３巻，第２３号，ｐ．８９３５−８９４１に記載の大環状ポリアミン亜鉛錯体がある。しかし、大環状ポリアミン亜鉛錯体は溶剤に可溶である。そのため、溶液中で、大環状ポリアミン亜鉛錯体と結合したリン酸基を有する物質の分離精製が非常に困難であるという問題点がある。
【０００７】
したがって、リン酸化された生体物質等のリン酸基を有する物質を分離精製するためには、一定条件下において、アニオン性置換基の一つであるリン酸基と強く結合する性質及び分離精製が容易であるという性質を兼ね備え、且つ安全で安価な捕捉剤が望まれている。
【０００８】
本発明の目的は、一定条件下において、アニオン性置換基（例えばリン酸基）と結合すると共に、該置換基を有する物質の分離精製が容易な、安全で安価な捕捉剤並びにこの捕捉剤を充填した簡便な捕捉器具及びその迅速且つ容易な捕捉方法を提供することにある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、前記従来技術の問題点を解決すべく鋭意検討の結果、ポリマー担体に特定の亜鉛錯体基を結合させると、該ポリマー担体が、アニオン性置換基（例えばリン酸基）と強く結合する性質を有すると共に、全体として溶媒難溶性（好ましくは溶媒不溶性）を示すので、分離精製が極めて容易となること、即ち、該置換基を有する物質の有用な捕捉剤になり得ることを見い出した。更に、この捕捉剤を充填した該物質の捕捉器具及びこの捕捉剤を用いた該物質の捕捉方法も確立し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち、本発明（１）は、一般式（１）：
【化２】
｛式中、Ｒは、相互に同一又は異なっていてもよく、水素原子；炭素数が１〜１６であるアルキル基；アシル基、アルコキシカルボニル基、アシルアルキル基、アルコキシカルボニルアルキル基、カルボキシアルキル基、カルバモイルアルキル基、シアノアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アミノアルキル基又はハロアルキル基（ここで、これらの基のアルキル部分の炭素数は、１〜１６である）；カルボキシル基；カルバモイル基；シアノ基；ヒドロキシル基；アミノ基；或いはハロゲノ基である｝で示される亜鉛錯体基が直接又はスペーサーを介して結合したポリマー担体である。
【００１１】
また、本発明（２）は、前記発明（１）のポリマー担体又は一般式（２）
【化３】
で示される亜鉛錯体基が直接又はスペーサーを介して結合したポリマー担体を含有する、アニオン性置換基を有する物質の捕捉剤である。
【００１２】
更に、本発明（３）は、アニオン性置換基がリン酸基である、前記発明（２）の捕捉剤である。
【００１３】
また、本発明（４）は、捕捉剤がビーズの形態である、前記発明（２）又は（３）の捕捉剤である。
【００１４】
更に、本発明（５）は、捕捉剤がプレートの形態である、前記発明（２）又は（３）の捕捉剤である。
【００１５】
また、本発明（６）は、捕捉剤が繊維の形態である、前記発明（２）又は（３）の捕捉剤である。
【００１６】
更に、本発明（７）は、前記発明（２）〜（４）又は（６）のいずれか一つの捕捉剤を充填し、フィルターで濾別する機能を持つ、アニオン性置換基を有する物質の捕捉器具である。
【００１７】
また、本発明（８）は、アニオン性置換基を有する物質を、前記発明（２）〜（６）のいずれか一つの捕捉剤に結合させることによって捕捉する工程を含む、アニオン性置換基を有する物質の捕捉方法である。
更に、本発明（９）は、該捕捉工程の後、アニオン性置換基を有する物質を捕捉剤から解離させる工程を更に含む、前記発明（８）の方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
まず、一般式（１）又は一般式（２）で示される亜鉛錯体基が結合しているポリマー担体について説明する。「ポリマー担体」とは、該基と結合可能なポリマーであり、且つ、「担体」乃至は「支持体」として機能する限り、特に限定されない。但し、ポリマー担体が用いられる際に使用される溶剤や試薬に対して耐性を有し、且つ、濾過及び洗浄を行う際に必要な物理的強度をも備えていることが好適である。また、アニオン性置換基を有する物質の捕捉に無影響であるものが好適である。具体例を例示すると、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアセチレン（ポリイン）、ポリ塩化ビニル、ポリビニルエステル、ポリビニルエーテル、ポリアクリル酸エステル、ポリアクリル酸、ポリアクリロニトリル、ポリアクリルアミド、ポリメタクリル酸エステル、ポリメタクリル酸、ポリメタクリロニトリル、ポリメタクリルアミド、ポリエーテル、ポリアセタール、ポリエステル、ポリエチレンテレフタレート（ポリテレフタル酸エチレン）、ポリカーボネート、ポリアミド、ナイロン、ポリウレタン、ポリ尿素、ポリイミド、ポリイミダゾール、ポリオキサゾール、ポリスルフィド、ポリスルホン、ポリスルホンアミド、ポリマーアロイ、セルロース、デキストラン、アガロース、キトサン、シリカ等を挙げることができる。また、更なる物理的強度を確保するために架橋（橋かけ）構造をもつポリマー担体であってもよく、架橋（橋かけ）剤の具体例を例示すると、ジビニルベンゼン、エピクロロヒドリン、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、ジイソシアン酸４，４’−ジフェニルメタン等を挙げることができる。
【００１９】
このポリマー担体は、一般式（１）又は一般式（２）で示される亜鉛錯体基と直接又はスペーサーを介して結合している。ここで、スペーサーとは、ポリマー担体から亜鉛錯体基を離すことによって、亜鉛錯体基への捕捉物質との結合を促す目的及び溶剤への膨潤度を増す目的で導入されたポリマーであり、具体例を例示すると、ポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド、ポリエチレン、ポリアミド、ポリエステル等を挙げることができる。また、亜鉛錯体基とポリマー担体又はスペーサーとの結合様式の具体例を例示すると、炭素−炭素結合、エステル結合、カルボニル結合、アミド結合、エーテル結合、スルフィド結合、アミノ結合、イミノ結合等の共有結合を挙げることができる。
【００２０】
本発明に係る、一般式（１）で示される亜鉛錯体基が結合したポリマー担体の具体例を例示すると、Ｚｎ２＋２−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス［（２−ピリジル）メチル］−１，３−ジアミノ−２−プロポキシド基が結合したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）：
【化４】
や、Ｚｎ２＋２−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス［（２−ピリジル）メチル］−１，３−ジアミノ−２−プロポキシド基が結合したＡｒｇｏＧｅｌ（登録商標）：
【化５】
や、Ｚｎ２＋２−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス［（２−ピリジル）メチル］−１，３−ジアミノ−２−プロポキシド基が結合したＴＳＫｇｅｌ（登録商標）：
【化６】
や、Ｚｎ２＋２−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス［（２−ピリジル）メチル］−１，３−ジアミノ−２−プロポキシド基が結合したＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）：
【化７】
等を挙げることができる。
【００２１】
本発明に係る、一般式（２）で示される亜鉛錯体基が結合したポリマー担体の具体例を例示すると、Ｚｎ２＋−サイクレン基が結合したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）：
【化８】
や、Ｚｎ２＋−サイクレン基が結合したＡｒｇｏＧｅｌ（登録商標）：
【化９】
や、Ｚｎ２＋−サイクレン基を結合したＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）：
【化１０】
等を挙げることができる。
【００２２】
アニオン性置換基とは、負の電荷を持つ置換基であり、アニオンの具体例を例示すると、２価のリン酸モノエステルアニオン（−ＯＰＯ３２−）、１価のリン酸ジエステルアニオン（（−Ｏ）２ＰＯ２−）、２価のホスホン酸アニオン（−ＰＯ３２−）、１価のホスホン酸アニオン（（−）２ＰＯ２−）、１価の炭酸エステルアニオン（−ＯＣＯ２−）、１価のカルボン酸アニオン（−ＣＯ２−）、１価の硫酸エステルアニオン（−ＯＳＯ３−）、１価のスルホン酸アニオン（−ＳＯ３−）等を挙げることができる。
【００２３】
リン酸基を有する物質とは、２価のリン酸モノエステルアニオン（−ＯＰＯ３２−）を有する物質であり、該物質の具体例を例示すると、リン酸化されたアミノ酸、リン酸化されたアミノ酸残基、リン酸化されたアミノ酸残基を有するタンパク質（リン酸化タンパク質）、リン酸化されたアミノ酸残基を有するポリペプチド（リン酸化ポリペプチド）、リン酸化されたアミノ酸残基を有するオリゴペプチド（リン酸化オリゴペプチド）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リン脂質、リン酸化された糖類、血中のリン酸成分、排水中のリン酸成分等を挙げることができる。
【００２４】
一般式（１）又は一般式（２）で示される亜鉛錯体基自体は、使用される溶剤との関係では、通常可溶である。しかし、これをポリマー担体と結合させることにより、該溶剤との関係で難溶（好ましくは不溶）となる。そのため、本発明に係るポリマー担体は、好適条件下では、溶液中のアニオン性置換基（例えばリン酸基）を有する物質が捕捉可能であると共に、溶剤からの濾過や洗浄も可能となるので、迅速且つ容易に、溶液から該物質の分離精製が行えるようになる。更に、該物質の定量に捕捉剤を使用することも可能である。
【００２５】
ビーズの形態として利用する捕捉剤における用途の具体例を例示すると、金属固定化アフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）カラムなどのカラム担体、リン酸化タンパク質又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）等のリン酸基を有する物質の精製又は濃縮を行うカラムの充填剤、リン酸基を有する物質の分離又は精製を行う磁性ビーズ、高リン血症の治療に用いる血中のリン酸成分を捕捉する製剤等を挙げることができる。
【００２６】
プレートの形態として利用する捕捉剤における用途の具体例を例示すると、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）に用いる試料基板、タンパク質又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）等の精製又は検出を行うチップ等を挙げることができる。
【００２７】
繊維の形態として利用する捕捉剤における用途の具体例を例示すると、リン酸基を有する物質とリン酸基を有さない物質との分離に用いる分離膜、中空糸膜フィルター等を挙げることができる。
【００２８】
本発明のアニオン性置換基（例えばリン酸基）を有する物質の捕捉器具は、前記ポリマー担体を含有する捕捉剤又はビーズ若しくは繊維の形態である捕捉剤を充填し、フィルターで濾別する機能を持つ。ここで、フィルターとは、これらの捕捉剤及びこれらの捕捉剤に結合した該置換基を有する物質とこれらの捕捉剤に結合しない該置換基を有さない物質が溶解した溶液、或いは、こららの捕捉剤とこれらの捕捉剤から解離した該置換基を有する物質が溶解した溶液を、簡便な個液分離により濾別する目的で導入された分離材であり、具体例を例示すると、ガラスフィルター、金属焼結フィルター、メンブランフィルター、限外濾過膜、石綿、グラスウール、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエーテルスルホン、セルロース等を挙げることができる。また、このフィルターは、これらの捕捉剤の下だけでなく上下にあってもよく、２つのフィルターでこれらの捕捉剤を挟むことによって、これらの捕捉剤の流動範囲を抑制する効果も併せ持つ。
【００２９】
本発明に係るアニオン性置換基（特にリン酸基）を有する物質の捕捉器具の具体例を例示すると、Ｚｎ２＋２−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス［（２−ピリジル）メチル］−１，３−ジアミノ−２−プロポキシド基が結合したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）カラム、Ｚｎ２＋２−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス［（２−ピリジル）メチル］−１，３−ジアミノ−２−プロポキシド基が結合したＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）カラム、Ｚｎ２＋−サイクレン基が結合したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）カラム、Ｚｎ２＋２−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス［（２−ピリジル）メチル］−１，３−ジアミノ−２−プロポキシド基が結合したＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）遠心式フィルターユニット等を挙げることができる。
【００３０】
本発明のアニオン性置換基（例えばリン酸基）を有する物質の捕捉方法は、ポリマー担体に結合した亜鉛錯体基が、該物質と結合する、という原理を利用している。尚、該物質を捕捉するときの規模又は形態に応じ、例えば、ビーズ、プレート、繊維等のポリマー担体を選択することで、用途別に対応した該物質の捕捉を行うことができる。
【００３１】
また、本発明のアニオン性置換基（例えばリン酸基）を有する物質の捕捉方法は、例えば、生理条件である中性条件下等で該物質と本発明に係るポリマー担体とを結合させ、次いで、例えば、溶液のｐＨ、緩衝作用を有する酸とその塩又は塩基とその塩の種類、緩衝液又は溶液に含まれる塩の濃度等を変化させることで、結合した該物質を本発明に係るポリマー担体から解離させるものである。該物質を捕捉し、更に捕捉した該物質を放出できるのは、該物質と本発明に係るポリマー担体との結合が、例えば、溶液のｐＨ、緩衝作用を有する酸とその塩又は塩基とその塩の種類、緩衝液又は溶液に含まれる塩の濃度等により変化するからである。
【００３２】
更に、本発明のアニオン性置換基（例えばリン酸基）を有する物質の捕捉方法は、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート化剤を添加することで、結合した該物質を本発明に係るポリマー担体から解離させるものも含む。捕捉した該物質を放出できるのは、該物質と本発明に係るポリマー担体との結合から、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート化剤が亜鉛イオンを引き抜くことにより、結合していた該物質が解離するからである。
【００３３】
これらにより、迅速且つ容易な捕捉方法を用いたアニオン性置換基（例えばリン酸基）を有する物質の分離精製及び回収が、例えば、溶液のｐＨ、緩衝作用を有する酸とその塩又は塩基とその塩の種類、緩衝液又は溶液に含まれる塩の濃度等を変化させること、或いは、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート化剤を添加することにより、自在に行うことができる。
【実施例】
【００３４】
以下に、実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明するが、本発明は、下記に記載する実施例に限定されるものではない。尚、これらの例中の亜鉛イオン（Ｚｎ２＋）担持量（単位 ｍｍｏｌ Ｚｎ２＋／ｇ又はμｍｏｌ Ｚｎ２＋／ｍＬ）は、亜鉛錯体基が結合したポリマー担体全体量に対する、亜鉛イオン含有量を表す値である。
【００３５】
実施例１
ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標） ＡＦ−Ｅｐｏｘｙ−６５０Ｍ １０ｇとサイクレン６．９ｇと炭酸カリウム２．２ｇのエタノール溶液７５ｍＬを、４０℃で４日間撹拌した。反応液を濾過洗浄した後、得られたビーズと硝酸亜鉛六水和物１２ｇの水溶液７５ｍＬを、４０℃で２日間撹拌した。反応液を濾過洗浄した後、減圧乾燥を行うと、Ｚｎ２＋−サイクレン基が結合したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）１２ｇ（０．３ｍｍｏｌ Ｚｎ２＋／ｇ）が得られた。
【００３６】
実施例２
ポリエチレン製のフィルターが付いたカラムに、Ｚｎ２＋−サイクレン基が結合したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）１００ｍｇ（０．３ｍｍｏｌ Ｚｎ２＋／ｇ）を充填して、Ｚｎ２＋−サイクレン基が結合したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）カラムを作製した。
【００３７】
実施例３
Ｚｎ２＋−サイクレン基が結合したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）カラムを、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ７．０）で膨潤させた。カラムに５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ７．０）で調整した１０ｍＭ ４−ニトロ安息香酸ナトリウム溶液１．０ｍＬを添加し、その後５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ７．０）２．０ｍＬを添加し流出させた。流出液を収集し、紫外可視分光光度計を用いて流出液から１価の４−ニトロ安息香酸アニオンの捕捉率を測定したところ、１００％であった。
【００３８】
実施例４
Ｚｎ２＋−サイクレン基が結合したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）カラムを、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ７．０）で膨潤させた。カラムに５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ７．０）で調整した１０ｍＭ ４−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム溶液１．０ｍＬを添加し、その後５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ７．０）２．０ｍＬを添加し流出させた。流出液を収集し、紫外可視分光光度計を用いて流出液から２価の４−ニトロフェニルリン酸アニオンの捕捉率を測定したところ、９８％であった。
【００３９】
実施例５
１，３−ジアミノ−２−プロパノール３３ｇと２−ピリジンカルボキシアルデヒド１１６ｇとシアノトリヒドロほう酸ナトリウム５０ｇのメタノール溶液５００ｍＬを、室温で３日間撹拌した。後処理をした後、カラムクロマトグラフィーで精製すると、合成中間体３４ｇが得られた。
【００４０】
合成中間体１８ｇと６−ブロモメチルニコチン酸メチル１２ｇと炭酸カリウム１４ｇのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液２２５ｍＬを、５０℃で１時間撹拌した。後処理をした後、カラムクロマトグラフィーで精製すると、メチルエステル体２２ｇが得られた。
【００４１】
メチルエステル体１７ｇと１．０Ｍ水酸化ナトリウム水溶液８３ｍＬのメタノール溶液４０ｍＬを、室温で１時間撹拌した。中和した後、カラムクロマトグラフィーで精製すると、Ｎ−（５−カルボキシ−２−ピリジル）メチル−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−トリス［（２−ピリジル）メチル］−１，３−ジアミノ−２−プロパノール１３ｇが得られた。
【００４２】
実施例６
ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標） ＡＦ−Ａｍｉｎｏ−６５０Ｍ １．２ｇとＮ−（５−カルボキシ−２−ピリジル）メチル−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−トリス［（２−ピリジル）メチル］−１，３−ジアミノ−２−プロパノール４５０ｍｇとジシクロヘキシルカルボジイミド２１０ｍｇと１−ヒドロキシベンゾトリアゾール１５０ｍｇのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液１０ｍＬを、４０℃で１８時間撹拌した。反応液を濾過洗浄した後、得られたビーズと酢酸亜鉛二水和物４８０ｍｇと１０Ｍ水酸化ナトリウム水溶液０．１０ｍＬのエタノール溶液７．０ｍＬを、４０℃で１８時間撹拌した。反応液を濾過洗浄した後、得られたビーズと１．０Ｍ過塩素酸ナトリウム水溶液３．０ｍＬの水溶液７．０ｍＬを、４０℃で１８時間撹拌した。反応液を濾過洗浄した後、減圧乾燥を行うと、Ｚｎ２＋２−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス［（２−ピリジル）メチル］−１，３−ジアミノ−２−プロポキシド基が結合したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）１．０ｇ（０．５ｍｍｏｌ Ｚｎ２＋／ｇ）が得られた。
【００４３】
実施例７
ポリエチレン製のフィルターが付いたカラムに、Ｚｎ２＋２−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス［（２−ピリジル）メチル］−１，３−ジアミノ−２−プロポキシド基が結合したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）１００ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ Ｚｎ２＋／ｇ）を充填して、Ｚｎ２＋２−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス［（２−ピリジル）メチル］−１，３−ジアミノ−２−プロポキシド基が結合したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）カラムを作製した。
【００４４】
実施例８
Ｚｎ２＋２−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス［（２−ピリジル）メチル］−１，３−ジアミノ−２−プロポキシド基が結合したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）カラムを、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ７．０）／アセトニトリル（１／１）溶液で膨潤させた。カラムに５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ７．０）／アセトニトリル（１／１）溶液で調整した１０ｍＭ ４−ニトロ安息香酸ナトリウム溶液１．０ｍＬを添加し、その後５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ７．０）／アセトニトリル（１／１）溶液２．０ｍＬを添加し流出させた。流出液を収集し、紫外可視分光光度計を用いて流出液から１価の４−ニトロ安息香酸アニオンの捕捉率を測定したところ、１００％であった。続いて、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ３．０）／アセトニトリル（１／１）溶液５０ｍＬを添加し流出させた。流出液を収集し、紫外可視分光光度計を用いて流出液から１価の４−ニトロ安息香酸アニオンの回収率を測定したところ、１００％であった。
【００４５】
実施例９
Ｚｎ２＋２−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス［（２−ピリジル）メチル］−１，３−ジアミノ−２−プロポキシド基が結合したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）カラムを、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ７．０）で膨潤させた。カラムに５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ７．０）で調整した１０ｍＭ ４−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム溶液１．０ｍＬを添加し、その後５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ７．０）２．０ｍＬを添加し流出させた。流出液を収集し、紫外可視分光光度計を用いて流出液から２価の４−ニトロフェニルリン酸アニオンの捕捉率を測定したところ、１００％であった。続いて、溶離液として５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ３．０）５０ｍＬを添加し流出させ、流出液を収集し、紫外可視分光光度計を用いて流出液から２価の４−ニトロフェニルリン酸アニオンの回収率を測定したところ、８９％であったが、溶離液として５０ｍＭトリス−塩酸酸緩衝液（ｐＨ ７．０）５０ｍＬを添加し流出させ、流出液を収集し、紫外可視分光光度計を用いて流出液から２価の４−ニトロフェニルリン酸アニオンの回収率を測定したところ、０％であった。
【００４６】
実施例１０
１，３−ジアミノ−２−プロパノール３３ｇと２−ピリジンカルボキシアルデヒド１１６ｇとシアノトリヒドロほう酸ナトリウム５０ｇのメタノール溶液５００ｍＬを、室温で３日間撹拌した。後処理をした後、カラムクロマトグラフィーで精製すると、合成中間体３４ｇが得られた。
合成中間体１８ｇと６−ブロモメチルニコチン酸メチル１２ｇと炭酸カリウム１４ｇのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液２２５ｍＬを、５０℃で１時間撹拌した。後処理をした後、カラムクロマトグラフィーで精製すると、メチルエステル体２２ｇが得られた。
メチルエステル体１０ｇとエチレンジアミン２３ｇのメタノール溶液１００ｍＬを、室温で３日間撹拌した。後処理をした後、カラムクロマトグラフィーで精製すると、Ｎ−｛５−［Ｎ−（２−アミノ）エチル］カルバモイル−２−ピリジル｝メチル−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−トリス［（２−ピリジル）メチル］−１，３−ジアミノ−２−プロパノール１０ｇが得られた。
【００４７】
実施例１１
ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標） ４ＦＦの２０ｍＭアセトニトリル溶液５．０ｍＬとＮ−｛５−［Ｎ−（２−アミノ）エチル］カルバモイル−２−ピリジル｝メチル−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−トリス［（２−ピリジル）メチル］−１，３−ジアミノ−２−プロパノールの５．０ｍＭアセトニトリル溶液５．０ｍＬを、５０℃で１時間撹拌した。反応液を濾過洗浄した後、２０ｍＭ炭酸ナトリウム水溶液で洗浄すると、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス［（２−ピリジル）メチル］−１，３−ジアミノ−２−プロパノール基が結合したＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）５．０ｍＬが得られた。
【００４８】
実施例１２
ポリプロピレン製のフィルターが付いたカラムにＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス［（２−ピリジル）メチル］−１，３−ジアミノ−２−プロパノール基が結合したＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）１．０ｍＬを充填し、１００ｍＭ ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ６．０）と２０ｍＭ酢酸亜鉛水溶液の混合溶液５．０ｍＬ、１００ｍＭ ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ６．０）と０．１ｍＭ酢酸亜鉛水溶液の混合溶液５．０ｍＬ、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ７．０）と０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液の混合溶液５．０ｍＬで平衡化させて、Ｚｎ２＋２−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス［（２−ピリジル）メチル］−１，３−ジアミノ−２−プロポキシド基が結合したＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）カラムを作製した。
【００４９】
実施例１３
Ｚｎ２＋２−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス［（２−ピリジル）メチル］−１，３−ジアミノ−２−プロポキシド基が結合したＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）カラムに、ウシ血清アルブミン（分子量６６，０００ リン酸化セリン残基×０）５０μｇとニワトリ卵白アルブミン（分子量４５，０００ リン酸化セリン残基×２）５０μｇとウシαＳ１−カゼイン（分子量２４，０００ リン酸化セリン残基×８）５０μｇとウシαＳ１−カゼイン非リン酸化型（分子量２４，０００ リン酸化セリン残基×０）５０μｇとウシβ−カゼイン（分子量２５，０００ リン酸化セリン残基×５）５０μｇを添加した。続いて、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ７．０）と０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液の混合溶液１．０ｍＬを２回、トリス−酢酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬを４回、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、１５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、３５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、４５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、６０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、７０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、８０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、９０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、４００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、５００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬの順に添加し流出させた。流出液を濃縮した後にスポットし、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分離した後、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色した。電気泳動図の前半を図１、後半を図２に示す。図１及び図２において、始めにリン酸化セリン残基を有さないウシ血清アルブミン、続いてリン酸化セリン残基の数が少ない順に、ニワトリ卵白アルブミン、ウシβ−カゼイン、ウシαＳ１−カゼインの流出が確認できた。
【００５０】
実施例１４
マイクロピペットチップにセルロース製のフィルターを詰め、Ｚｎ２＋２−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス［（２−ピリジル）メチル］−１，３−ジアミノ−２−プロポキシド基が結合したＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）カラムから取り出した、Ｚｎ２＋２−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス［（２−ピリジル）メチル］−１，３−ジアミノ−２−プロポキシド基が結合したＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）１０μＬを充填し、その後セルロース製のフィルターで蓋をして、Ｚｎ２＋２−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス［（２−ピリジル）メチル］−１，３−ジアミノ−２−プロポキシド基が結合したＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）チップを作製した。
【００５１】
実施例１５
Ｚｎ２＋２−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス［（２−ピリジル）メチル］−１，３−ジアミノ−２−プロポキシド基が結合したＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）チップを取りつけたマイクロピペットで、０．５０Ｍ硝酸ナトリウム含有１００ｍＭトリス−酢酸緩衝液（ｐＨ７．４）で調整した０．２２ｍＭ ｐ６０ｃ−ｓｒｃペプチド５２１−５３３と０．１８ｍＭリン酸化ｐ６０ｃ−ｓｒｃペプチド５２１−５３３の混合溶液１０μＬを吸入し、５分間平衡化させた後、吐き出した。その後、０．５０Ｍ硝酸ナトリウム含有１００ｍＭトリス−酢酸緩衝液（ｐＨ７．４）１０μＬで５回洗浄した。続いて、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１０μＬで６回洗浄し、洗液を収集して、高速液体クロマトグラフィーを用いて純度を測定したところ、リン酸化ｐ６０ｃ−ｓｒｃペプチド５２１−５３３が１００％、ｐ６０ｃ−ｓｒｃペプチド５２１−５３３が０％であった。
【００５２】
実施例１６
ＰＳ２０ ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標） Ａｒｒａｙに、１００ｍＭ炭酸水素ナトリウム水溶液／アセトニトリル（１／３）溶液で調整した０．３８Ｍ Ｎ−｛５−［Ｎ−（２−アミノ）エチル］カルバモイル−２−ピリジル｝メチル−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−トリス［（２−ピリジル）メチル］−１，３−ジアミノ−２−プロパノール溶液３．０μＬを載せ、室温で４時間反応した。更に、１００ｍＭ炭酸水素ナトリウム水溶液で調整した０．５０Ｍ ２−アミノエタノール溶液３．０μＬを載せ、室温で４時間反応した。洗浄した後、１００ｍＭ ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ６．０）で調整した０．５０Ｍ酢酸亜鉛溶液で洗浄すると、Ｚｎ２＋２−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス［（２−ピリジル）メチル］−１，３−ジアミノ−２−プロポキシド基が結合したＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標） Ａｒｒａｙが得られた。
【００５３】
実施例１７
Ｚｎ２＋２−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス［（２−ピリジル）メチル］−１，３−ジアミノ−２−プロポキシド基が結合したＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標） Ａｒｒａｙに、１００ｍＭトリス−酢酸緩衝液（ｐＨ７．４）で調整した０．９４ｍＭ ４−メチルウンベリフェリルリン酸二ナトリウム溶液３．０μＬを載せ、室温で１時間平衡化させた後、回収した。回収液を収集し、紫外可視分光光度計を用いて回収液から２価の４−メチルウンベリフェリルリン酸アニオンの捕捉率を測定したところ、１６％であった。
【００５４】
比較例１
ポリエチレン製のフィルターが付いたカラムにＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標） ＡＦ−Ｅｐｏｘｙ−６５０Ｍ １００ｍｇを充填し、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ７．０）で膨潤させた。カラムに５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ７．０）で調整した１０ｍＭ ４−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム溶液１．０ｍＬを添加し、その後５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ７．０）２．０ｍＬを添加し流出させた。流出液を収集し、紫外可視分光光度計を用いて流出液から２価の４−ニトロフェニルリン酸アニオンの捕捉率を測定したところ、０．５％であった。
【００５５】
比較例２
ポリプロピレン製のフィルターが付いたカラムにＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス［（２−ピリジル）メチル］−１，３−ジアミノ−２−プロパノール基が結合したＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）１．０ｍＬを充填し、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ７．０）と０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液の混合溶液５．０ｍＬで平衡化させた。カラムにウシ血清アルブミン（分子量６６，０００ リン酸化セリン残基×０）５０μｇとニワトリ卵白アルブミン（分子量４５，０００ リン酸化セリン残基×２）５０μｇとウシαＳ１−カゼイン（分子量２４，０００ リン酸化セリン残基×８）５０μｇとウシαＳ１−カゼイン非リン酸化型（分子量２４，０００ リン酸化セリン残基×０）５０μｇとウシβ−カゼイン（分子量２５，０００ リン酸化セリン残基×５）５０μｇを添加した。続いて、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ７．０）と０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液の混合溶液１．０ｍＬを２回、トリス−酢酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬを４回、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、１５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、３５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、４５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、６０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、７０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、８０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、９０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、４００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、５００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬの順に添加し流出させた。流出液を濃縮した後にスポットし、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分離した後、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色した。電気泳動図の前半を図３、後半を図４に示す。図３及び図４において、始めからウシ血清アルブミン、ニワトリ卵白アルブミン、ウシβ−カゼイン、ウシαＳ１−カゼインの流出が確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明に係る、所定の亜鉛錯体基が結合したポリマー担体は、一定条件下で、アニオン性置換基（例えばリン酸基）と結合すると共に、全体として溶媒難溶性（好ましくは溶媒不溶性）であるので、該置換基を有する物質の分離精製が容易な、安全で安価な捕捉剤となる。更に、このポリマー担体を用いることにより、フィルターで簡便な分離精製が可能となる捕捉器具及び中性条件下で結合させ、次いで、一定条件下で解離させる迅速且つ容易な捕捉方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１は、亜鉛錯体基が結合したポリマー担体を含有する捕捉剤を用いたドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）図の前半である。
【図２】図２は、亜鉛錯体基が結合したポリマー担体を含有する捕捉剤を用いたドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）図の後半である。
【図３】図３は、亜鉛を含まない錯体基が結合したポリマー担体を含有する捕捉剤を用いたドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）図の前半である。
【図４】図４は、亜鉛を含まない錯体基が結合したポリマー担体を含有する捕捉剤を用いたドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）図の後半である。尚、これら図中、１はウシ血清アルブミン、２はニワトリ卵白アルブミン、３はウシβ−カゼイン、４はウシαＳ１−カゼイン非リン酸化型、５はウシαＳ１−カゼイン、６はトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ７．０）と０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液の混合溶液１回目、７はトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ７．０）と０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液の混合溶液２回目、８はトリス−酢酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１回目、９はトリス−酢酸緩衝液（ｐＨ ７．０）２回目、１０はトリス−酢酸緩衝液（ｐＨ ７．０）３回目、１１はトリス−酢酸緩衝液（ｐＨ ７．０）４回目、１２は１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）、１３は１５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）、１４は２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）、１５は２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）、１６は３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）、１７は３５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）、１８は４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）、１９は４５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）、２０は５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）、２１は６０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）、２２は７０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）、２３は８０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）、２４は９０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）、２５は１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）、２６は２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）、２７は３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）、２８は４００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）、２９は５００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）のラインを示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アニオン性置換基（例えばリン酸基）を有する物質を分離精製するために有用な、所定の亜鉛錯体基が結合したポリマー担体、そのポリマー担体を含有する、アニオン性置換基（例えばリン酸基）を有する物質の捕捉剤、更に、この捕捉剤を充填した捕捉器具及びその捕捉方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リン酸基を有する物質、例えばリン酸化された生体物質等を分析するための方法としては、従来より、酵素免疫法（ＥＬＩＳＡ）による方法や放射性同位元素を用いる方法が知られている。
【０００３】
酵素免疫法は、抗体（又は抗原でもよい）が目標物質と特異的に結合する原理を利用している。そのため、目的物質固有の抗体を作製するのに、目的物質を多量に精製し入手する必要があるという問題点がある。更に、抗体の作製には動物の免疫反応を用いるため、抗体の作製に時間がかかるという問題点がある。また、数ｋＤａ（ダルトン）以下の分子構造中のリン酸化部位に対する抗体を作製することができないため、そのような分子構造を持つリン酸化された生体物質を酵素免疫法によって分析することができないという問題点がある。
【０００４】
また、放射性同位元素を用いる方法は、放射性同位元素３２Ｐを用いる。そのため、実験室の放射線の管理及び廃液の管理に手間がかかるという問題点がある。
【０００５】
排水中のリン酸濃度を下げるための方法として、特開平１１−５７６９５号公報には、複合金属水酸化物を用いる方法が開示されている。一方、医薬の分野では、高リン血症の治療に用いられるものとして、特表平８−５０６８４６号公報に記載のグアニジノ基が結合したポリマーがある。しかし、複合金属水酸化物及びグアニジノ基が結合したポリマーは、リン酸基に対する結合力が弱い。そのため、一定量のリン酸を捕捉するためには、多量のリン酸基結合基質としての複合金属水酸化物又はグアニジノ基が結合したポリマーを用いなければならないという問題点がある。
【０００６】
一方、リン酸基と強く結合する化合物として、ジャーナル オブ ザ アメリカン ケミカル ソサエティー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ），（米国），１９９１年，第１１３巻，第２３号，ｐ．８９３５−８９４１に記載の大環状ポリアミン亜鉛錯体がある。しかし、大環状ポリアミン亜鉛錯体は溶剤に可溶である。そのため、溶液中で、大環状ポリアミン亜鉛錯体と結合したリン酸基を有する物質の分離精製が非常に困難であるという問題点がある。
【０００７】
したがって、リン酸化された生体物質等のリン酸基を有する物質を分離精製するためには、一定条件下において、アニオン性置換基の一つであるリン酸基と強く結合する性質及び分離精製が容易であるという性質を兼ね備え、且つ安全で安価な捕捉剤が望まれている。
【０００８】
本発明の目的は、一定条件下において、アニオン性置換基（例えばリン酸基）と結合すると共に、該置換基を有する物質の分離精製が容易な、安全で安価な捕捉剤並びにこの捕捉剤を充填した簡便な捕捉器具及びその迅速且つ容易な捕捉方法を提供することにある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、前記従来技術の問題点を解決すべく鋭意検討の結果、ポリマー担体に特定の亜鉛錯体基を結合させると、該ポリマー担体が、アニオン性置換基（例えばリン酸基）と強く結合する性質を有すると共に、全体として溶媒難溶性（好ましくは溶媒不溶性）を示すので、分離精製が極めて容易となること、即ち、該置換基を有する物質の有用な捕捉剤になり得ることを見い出した。更に、この捕捉剤を充填した該物質の捕捉器具及びこの捕捉剤を用いた該物質の捕捉方法も確立し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち、本発明（１）は、一般式（１）：
【化２】
｛式中、Ｒは、相互に同一又は異なっていてもよく、水素原子；炭素数が１〜１６であるアルキル基；アシル基、アルコキシカルボニル基、アシルアルキル基、アルコキシカルボニルアルキル基、カルボキシアルキル基、カルバモイルアルキル基、シアノアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アミノアルキル基又はハロアルキル基（ここで、これらの基のアルキル部分の炭素数は、１〜１６である）；カルボキシル基；カルバモイル基；シアノ基；ヒドロキシル基；アミノ基；或いはハロゲノ基である｝で示される亜鉛錯体基が直接又はスペーサーを介して結合したポリマー担体である。
【００１１】
また、本発明（２）は、前記発明（１）のポリマー担体又は一般式（２）
【化３】
で示される亜鉛錯体基が直接又はスペーサーを介して結合したポリマー担体を含有する、アニオン性置換基を有する物質の捕捉剤である。
【００１２】
更に、本発明（３）は、アニオン性置換基がリン酸基である、前記発明（２）の捕捉剤である。
【００１３】
また、本発明（４）は、捕捉剤がビーズの形態である、前記発明（２）又は（３）の捕捉剤である。
【００１４】
更に、本発明（５）は、捕捉剤がプレートの形態である、前記発明（２）又は（３）の捕捉剤である。
【００１５】
また、本発明（６）は、捕捉剤が繊維の形態である、前記発明（２）又は（３）の捕捉剤である。
【００１６】
更に、本発明（７）は、前記発明（２）〜（４）又は（６）のいずれか一つの捕捉剤を充填し、フィルターで濾別する機能を持つ、アニオン性置換基を有する物質の捕捉器具である。
【００１７】
また、本発明（８）は、アニオン性置換基を有する物質を、前記発明（２）〜（６）のいずれか一つの捕捉剤に結合させることによって捕捉する工程を含む、アニオン性置換基を有する物質の捕捉方法である。
更に、本発明（９）は、該捕捉工程の後、アニオン性置換基を有する物質を捕捉剤から解離させる工程を更に含む、前記発明（８）の方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
まず、一般式（１）又は一般式（２）で示される亜鉛錯体基が結合しているポリマー担体について説明する。「ポリマー担体」とは、該基と結合可能なポリマーであり、且つ、「担体」乃至は「支持体」として機能する限り、特に限定されない。但し、ポリマー担体が用いられる際に使用される溶剤や試薬に対して耐性を有し、且つ、濾過及び洗浄を行う際に必要な物理的強度をも備えていることが好適である。また、アニオン性置換基を有する物質の捕捉に無影響であるものが好適である。具体例を例示すると、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアセチレン（ポリイン）、ポリ塩化ビニル、ポリビニルエステル、ポリビニルエーテル、ポリアクリル酸エステル、ポリアクリル酸、ポリアクリロニトリル、ポリアクリルアミド、ポリメタクリル酸エステル、ポリメタクリル酸、ポリメタクリロニトリル、ポリメタクリルアミド、ポリエーテル、ポリアセタール、ポリエステル、ポリエチレンテレフタレート（ポリテレフタル酸エチレン）、ポリカーボネート、ポリアミド、ナイロン、ポリウレタン、ポリ尿素、ポリイミド、ポリイミダゾール、ポリオキサゾール、ポリスルフィド、ポリスルホン、ポリスルホンアミド、ポリマーアロイ、セルロース、デキストラン、アガロース、キトサン、シリカ等を挙げることができる。また、更なる物理的強度を確保するために架橋（橋かけ）構造をもつポリマー担体であってもよく、架橋（橋かけ）剤の具体例を例示すると、ジビニルベンゼン、エピクロロヒドリン、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、ジイソシアン酸４，４’−ジフェニルメタン等を挙げることができる。
【００１９】
このポリマー担体は、一般式（１）又は一般式（２）で示される亜鉛錯体基と直接又はスペーサーを介して結合している。ここで、スペーサーとは、ポリマー担体から亜鉛錯体基を離すことによって、亜鉛錯体基への捕捉物質との結合を促す目的及び溶剤への膨潤度を増す目的で導入されたポリマーであり、具体例を例示すると、ポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド、ポリエチレン、ポリアミド、ポリエステル等を挙げることができる。また、亜鉛錯体基とポリマー担体又はスペーサーとの結合様式の具体例を例示すると、炭素−炭素結合、エステル結合、カルボニル結合、アミド結合、エーテル結合、スルフィド結合、アミノ結合、イミノ結合等の共有結合を挙げることができる。
【００２０】
本発明に係る、一般式（１）で示される亜鉛錯体基が結合したポリマー担体の具体例を例示すると、Ｚｎ２＋２−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス［（２−ピリジル）メチル］−１，３−ジアミノ−２−プロポキシド基が結合したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）：
【化４】
や、Ｚｎ２＋２−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス［（２−ピリジル）メチル］−１，３−ジアミノ−２−プロポキシド基が結合したＡｒｇｏＧｅｌ（登録商標）：
【化５】
や、Ｚｎ２＋２−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス［（２−ピリジル）メチル］−１，３−ジアミノ−２−プロポキシド基が結合したＴＳＫｇｅｌ（登録商標）：
【化６】
や、Ｚｎ２＋２−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス［（２−ピリジル）メチル］−１，３−ジアミノ−２−プロポキシド基が結合したＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）：
【化７】
等を挙げることができる。
【００２１】
本発明に係る、一般式（２）で示される亜鉛錯体基が結合したポリマー担体の具体例を例示すると、Ｚｎ２＋−サイクレン基が結合したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）：
【化８】
や、Ｚｎ２＋−サイクレン基が結合したＡｒｇｏＧｅｌ（登録商標）：
【化９】
や、Ｚｎ２＋−サイクレン基を結合したＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）：
【化１０】
等を挙げることができる。
【００２２】
アニオン性置換基とは、負の電荷を持つ置換基であり、アニオンの具体例を例示すると、２価のリン酸モノエステルアニオン（−ＯＰＯ３２−）、１価のリン酸ジエステルアニオン（（−Ｏ）２ＰＯ２−）、２価のホスホン酸アニオン（−ＰＯ３２−）、１価のホスホン酸アニオン（（−）２ＰＯ２−）、１価の炭酸エステルアニオン（−ＯＣＯ２−）、１価のカルボン酸アニオン（−ＣＯ２−）、１価の硫酸エステルアニオン（−ＯＳＯ３−）、１価のスルホン酸アニオン（−ＳＯ３−）等を挙げることができる。
【００２３】
リン酸基を有する物質とは、２価のリン酸モノエステルアニオン（−ＯＰＯ３２−）を有する物質であり、該物質の具体例を例示すると、リン酸化されたアミノ酸、リン酸化されたアミノ酸残基、リン酸化されたアミノ酸残基を有するタンパク質（リン酸化タンパク質）、リン酸化されたアミノ酸残基を有するポリペプチド（リン酸化ポリペプチド）、リン酸化されたアミノ酸残基を有するオリゴペプチド（リン酸化オリゴペプチド）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リン脂質、リン酸化された糖類、血中のリン酸成分、排水中のリン酸成分等を挙げることができる。
【００２４】
一般式（１）又は一般式（２）で示される亜鉛錯体基自体は、使用される溶剤との関係では、通常可溶である。しかし、これをポリマー担体と結合させることにより、該溶剤との関係で難溶（好ましくは不溶）となる。そのため、本発明に係るポリマー担体は、好適条件下では、溶液中のアニオン性置換基（例えばリン酸基）を有する物質が捕捉可能であると共に、溶剤からの濾過や洗浄も可能となるので、迅速且つ容易に、溶液から該物質の分離精製が行えるようになる。更に、該物質の定量に捕捉剤を使用することも可能である。
【００２５】
ビーズの形態として利用する捕捉剤における用途の具体例を例示すると、金属固定化アフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）カラムなどのカラム担体、リン酸化タンパク質又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）等のリン酸基を有する物質の精製又は濃縮を行うカラムの充填剤、リン酸基を有する物質の分離又は精製を行う磁性ビーズ、高リン血症の治療に用いる血中のリン酸成分を捕捉する製剤等を挙げることができる。
【００２６】
プレートの形態として利用する捕捉剤における用途の具体例を例示すると、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）に用いる試料基板、タンパク質又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）等の精製又は検出を行うチップ等を挙げることができる。
【００２７】
繊維の形態として利用する捕捉剤における用途の具体例を例示すると、リン酸基を有する物質とリン酸基を有さない物質との分離に用いる分離膜、中空糸膜フィルター等を挙げることができる。
【００２８】
本発明のアニオン性置換基（例えばリン酸基）を有する物質の捕捉器具は、前記ポリマー担体を含有する捕捉剤又はビーズ若しくは繊維の形態である捕捉剤を充填し、フィルターで濾別する機能を持つ。ここで、フィルターとは、これらの捕捉剤及びこれらの捕捉剤に結合した該置換基を有する物質とこれらの捕捉剤に結合しない該置換基を有さない物質が溶解した溶液、或いは、こららの捕捉剤とこれらの捕捉剤から解離した該置換基を有する物質が溶解した溶液を、簡便な個液分離により濾別する目的で導入された分離材であり、具体例を例示すると、ガラスフィルター、金属焼結フィルター、メンブランフィルター、限外濾過膜、石綿、グラスウール、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエーテルスルホン、セルロース等を挙げることができる。また、このフィルターは、これらの捕捉剤の下だけでなく上下にあってもよく、２つのフィルターでこれらの捕捉剤を挟むことによって、これらの捕捉剤の流動範囲を抑制する効果も併せ持つ。
【００２９】
本発明に係るアニオン性置換基（特にリン酸基）を有する物質の捕捉器具の具体例を例示すると、Ｚｎ２＋２−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス［（２−ピリジル）メチル］−１，３−ジアミノ−２−プロポキシド基が結合したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）カラム、Ｚｎ２＋２−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス［（２−ピリジル）メチル］−１，３−ジアミノ−２−プロポキシド基が結合したＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）カラム、Ｚｎ２＋−サイクレン基が結合したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）カラム、Ｚｎ２＋２−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス［（２−ピリジル）メチル］−１，３−ジアミノ−２−プロポキシド基が結合したＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）遠心式フィルターユニット等を挙げることができる。
【００３０】
本発明のアニオン性置換基（例えばリン酸基）を有する物質の捕捉方法は、ポリマー担体に結合した亜鉛錯体基が、該物質と結合する、という原理を利用している。尚、該物質を捕捉するときの規模又は形態に応じ、例えば、ビーズ、プレート、繊維等のポリマー担体を選択することで、用途別に対応した該物質の捕捉を行うことができる。
【００３１】
また、本発明のアニオン性置換基（例えばリン酸基）を有する物質の捕捉方法は、例えば、生理条件である中性条件下等で該物質と本発明に係るポリマー担体とを結合させ、次いで、例えば、溶液のｐＨ、緩衝作用を有する酸とその塩又は塩基とその塩の種類、緩衝液又は溶液に含まれる塩の濃度等を変化させることで、結合した該物質を本発明に係るポリマー担体から解離させるものである。該物質を捕捉し、更に捕捉した該物質を放出できるのは、該物質と本発明に係るポリマー担体との結合が、例えば、溶液のｐＨ、緩衝作用を有する酸とその塩又は塩基とその塩の種類、緩衝液又は溶液に含まれる塩の濃度等により変化するからである。
【００３２】
更に、本発明のアニオン性置換基（例えばリン酸基）を有する物質の捕捉方法は、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート化剤を添加することで、結合した該物質を本発明に係るポリマー担体から解離させるものも含む。捕捉した該物質を放出できるのは、該物質と本発明に係るポリマー担体との結合から、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート化剤が亜鉛イオンを引き抜くことにより、結合していた該物質が解離するからである。
【００３３】
これらにより、迅速且つ容易な捕捉方法を用いたアニオン性置換基（例えばリン酸基）を有する物質の分離精製及び回収が、例えば、溶液のｐＨ、緩衝作用を有する酸とその塩又は塩基とその塩の種類、緩衝液又は溶液に含まれる塩の濃度等を変化させること、或いは、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート化剤を添加することにより、自在に行うことができる。
【実施例】
【００３４】
以下に、実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明するが、本発明は、下記に記載する実施例に限定されるものではない。尚、これらの例中の亜鉛イオン（Ｚｎ２＋）担持量（単位 ｍｍｏｌ Ｚｎ２＋／ｇ又はμｍｏｌ Ｚｎ２＋／ｍＬ）は、亜鉛錯体基が結合したポリマー担体全体量に対する、亜鉛イオン含有量を表す値である。
【００３５】
実施例１
ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標） ＡＦ−Ｅｐｏｘｙ−６５０Ｍ １０ｇとサイクレン６．９ｇと炭酸カリウム２．２ｇのエタノール溶液７５ｍＬを、４０℃で４日間撹拌した。反応液を濾過洗浄した後、得られたビーズと硝酸亜鉛六水和物１２ｇの水溶液７５ｍＬを、４０℃で２日間撹拌した。反応液を濾過洗浄した後、減圧乾燥を行うと、Ｚｎ２＋−サイクレン基が結合したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）１２ｇ（０．３ｍｍｏｌ Ｚｎ２＋／ｇ）が得られた。
【００３６】
実施例２
ポリエチレン製のフィルターが付いたカラムに、Ｚｎ２＋−サイクレン基が結合したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）１００ｍｇ（０．３ｍｍｏｌ Ｚｎ２＋／ｇ）を充填して、Ｚｎ２＋−サイクレン基が結合したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）カラムを作製した。
【００３７】
実施例３
Ｚｎ２＋−サイクレン基が結合したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）カラムを、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ７．０）で膨潤させた。カラムに５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ７．０）で調整した１０ｍＭ ４−ニトロ安息香酸ナトリウム溶液１．０ｍＬを添加し、その後５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ７．０）２．０ｍＬを添加し流出させた。流出液を収集し、紫外可視分光光度計を用いて流出液から１価の４−ニトロ安息香酸アニオンの捕捉率を測定したところ、１００％であった。
【００３８】
実施例４
Ｚｎ２＋−サイクレン基が結合したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）カラムを、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ７．０）で膨潤させた。カラムに５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ７．０）で調整した１０ｍＭ ４−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム溶液１．０ｍＬを添加し、その後５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ７．０）２．０ｍＬを添加し流出させた。流出液を収集し、紫外可視分光光度計を用いて流出液から２価の４−ニトロフェニルリン酸アニオンの捕捉率を測定したところ、９８％であった。
【００３９】
実施例５
１，３−ジアミノ−２−プロパノール３３ｇと２−ピリジンカルボキシアルデヒド１１６ｇとシアノトリヒドロほう酸ナトリウム５０ｇのメタノール溶液５００ｍＬを、室温で３日間撹拌した。後処理をした後、カラムクロマトグラフィーで精製すると、合成中間体３４ｇが得られた。
【００４０】
合成中間体１８ｇと６−ブロモメチルニコチン酸メチル１２ｇと炭酸カリウム１４ｇのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液２２５ｍＬを、５０℃で１時間撹拌した。後処理をした後、カラムクロマトグラフィーで精製すると、メチルエステル体２２ｇが得られた。
【００４１】
メチルエステル体１７ｇと１．０Ｍ水酸化ナトリウム水溶液８３ｍＬのメタノール溶液４０ｍＬを、室温で１時間撹拌した。中和した後、カラムクロマトグラフィーで精製すると、Ｎ−（５−カルボキシ−２−ピリジル）メチル−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−トリス［（２−ピリジル）メチル］−１，３−ジアミノ−２−プロパノール１３ｇが得られた。
【００４２】
実施例６
ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標） ＡＦ−Ａｍｉｎｏ−６５０Ｍ １．２ｇとＮ−（５−カルボキシ−２−ピリジル）メチル−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−トリス［（２−ピリジル）メチル］−１，３−ジアミノ−２−プロパノール４５０ｍｇとジシクロヘキシルカルボジイミド２１０ｍｇと１−ヒドロキシベンゾトリアゾール１５０ｍｇのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液１０ｍＬを、４０℃で１８時間撹拌した。反応液を濾過洗浄した後、得られたビーズと酢酸亜鉛二水和物４８０ｍｇと１０Ｍ水酸化ナトリウム水溶液０．１０ｍＬのエタノール溶液７．０ｍＬを、４０℃で１８時間撹拌した。反応液を濾過洗浄した後、得られたビーズと１．０Ｍ過塩素酸ナトリウム水溶液３．０ｍＬの水溶液７．０ｍＬを、４０℃で１８時間撹拌した。反応液を濾過洗浄した後、減圧乾燥を行うと、Ｚｎ２＋２−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス［（２−ピリジル）メチル］−１，３−ジアミノ−２−プロポキシド基が結合したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）１．０ｇ（０．５ｍｍｏｌ Ｚｎ２＋／ｇ）が得られた。
【００４３】
実施例７
ポリエチレン製のフィルターが付いたカラムに、Ｚｎ２＋２−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス［（２−ピリジル）メチル］−１，３−ジアミノ−２−プロポキシド基が結合したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）１００ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ Ｚｎ２＋／ｇ）を充填して、Ｚｎ２＋２−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス［（２−ピリジル）メチル］−１，３−ジアミノ−２−プロポキシド基が結合したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）カラムを作製した。
【００４４】
実施例８
Ｚｎ２＋２−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス［（２−ピリジル）メチル］−１，３−ジアミノ−２−プロポキシド基が結合したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）カラムを、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ７．０）／アセトニトリル（１／１）溶液で膨潤させた。カラムに５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ７．０）／アセトニトリル（１／１）溶液で調整した１０ｍＭ ４−ニトロ安息香酸ナトリウム溶液１．０ｍＬを添加し、その後５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ７．０）／アセトニトリル（１／１）溶液２．０ｍＬを添加し流出させた。流出液を収集し、紫外可視分光光度計を用いて流出液から１価の４−ニトロ安息香酸アニオンの捕捉率を測定したところ、１００％であった。続いて、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ３．０）／アセトニトリル（１／１）溶液５０ｍＬを添加し流出させた。流出液を収集し、紫外可視分光光度計を用いて流出液から１価の４−ニトロ安息香酸アニオンの回収率を測定したところ、１００％であった。
【００４５】
実施例９
Ｚｎ２＋２−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス［（２−ピリジル）メチル］−１，３−ジアミノ−２−プロポキシド基が結合したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）カラムを、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ７．０）で膨潤させた。カラムに５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ７．０）で調整した１０ｍＭ ４−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム溶液１．０ｍＬを添加し、その後５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ７．０）２．０ｍＬを添加し流出させた。流出液を収集し、紫外可視分光光度計を用いて流出液から２価の４−ニトロフェニルリン酸アニオンの捕捉率を測定したところ、１００％であった。続いて、溶離液として５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ３．０）５０ｍＬを添加し流出させ、流出液を収集し、紫外可視分光光度計を用いて流出液から２価の４−ニトロフェニルリン酸アニオンの回収率を測定したところ、８９％であったが、溶離液として５０ｍＭトリス−塩酸酸緩衝液（ｐＨ ７．０）５０ｍＬを添加し流出させ、流出液を収集し、紫外可視分光光度計を用いて流出液から２価の４−ニトロフェニルリン酸アニオンの回収率を測定したところ、０％であった。
【００４６】
実施例１０
１，３−ジアミノ−２−プロパノール３３ｇと２−ピリジンカルボキシアルデヒド１１６ｇとシアノトリヒドロほう酸ナトリウム５０ｇのメタノール溶液５００ｍＬを、室温で３日間撹拌した。後処理をした後、カラムクロマトグラフィーで精製すると、合成中間体３４ｇが得られた。
合成中間体１８ｇと６−ブロモメチルニコチン酸メチル１２ｇと炭酸カリウム１４ｇのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液２２５ｍＬを、５０℃で１時間撹拌した。後処理をした後、カラムクロマトグラフィーで精製すると、メチルエステル体２２ｇが得られた。
メチルエステル体１０ｇとエチレンジアミン２３ｇのメタノール溶液１００ｍＬを、室温で３日間撹拌した。後処理をした後、カラムクロマトグラフィーで精製すると、Ｎ−｛５−［Ｎ−（２−アミノ）エチル］カルバモイル−２−ピリジル｝メチル−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−トリス［（２−ピリジル）メチル］−１，３−ジアミノ−２−プロパノール１０ｇが得られた。
【００４７】
実施例１１
ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標） ４ＦＦの２０ｍＭアセトニトリル溶液５．０ｍＬとＮ−｛５−［Ｎ−（２−アミノ）エチル］カルバモイル−２−ピリジル｝メチル−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−トリス［（２−ピリジル）メチル］−１，３−ジアミノ−２−プロパノールの５．０ｍＭアセトニトリル溶液５．０ｍＬを、５０℃で１時間撹拌した。反応液を濾過洗浄した後、２０ｍＭ炭酸ナトリウム水溶液で洗浄すると、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス［（２−ピリジル）メチル］−１，３−ジアミノ−２−プロパノール基が結合したＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）５．０ｍＬが得られた。
【００４８】
実施例１２
ポリプロピレン製のフィルターが付いたカラムにＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス［（２−ピリジル）メチル］−１，３−ジアミノ−２−プロパノール基が結合したＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）１．０ｍＬを充填し、１００ｍＭ ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ６．０）と２０ｍＭ酢酸亜鉛水溶液の混合溶液５．０ｍＬ、１００ｍＭ ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ６．０）と０．１ｍＭ酢酸亜鉛水溶液の混合溶液５．０ｍＬ、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ７．０）と０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液の混合溶液５．０ｍＬで平衡化させて、Ｚｎ２＋２−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス［（２−ピリジル）メチル］−１，３−ジアミノ−２−プロポキシド基が結合したＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）カラムを作製した。
【００４９】
実施例１３
Ｚｎ２＋２−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス［（２−ピリジル）メチル］−１，３−ジアミノ−２−プロポキシド基が結合したＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）カラムに、ウシ血清アルブミン（分子量６６，０００ リン酸化セリン残基×０）５０μｇとニワトリ卵白アルブミン（分子量４５，０００ リン酸化セリン残基×２）５０μｇとウシαＳ１−カゼイン（分子量２４，０００ リン酸化セリン残基×８）５０μｇとウシαＳ１−カゼイン非リン酸化型（分子量２４，０００ リン酸化セリン残基×０）５０μｇとウシβ−カゼイン（分子量２５，０００ リン酸化セリン残基×５）５０μｇを添加した。続いて、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ７．０）と０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液の混合溶液１．０ｍＬを２回、トリス−酢酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬを４回、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、１５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、３５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、４５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、６０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、７０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、８０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、９０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、４００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、５００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬの順に添加し流出させた。流出液を濃縮した後にスポットし、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分離した後、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色した。電気泳動図の前半を図１、後半を図２に示す。図１及び図２において、始めにリン酸化セリン残基を有さないウシ血清アルブミン、続いてリン酸化セリン残基の数が少ない順に、ニワトリ卵白アルブミン、ウシβ−カゼイン、ウシαＳ１−カゼインの流出が確認できた。
【００５０】
実施例１４
マイクロピペットチップにセルロース製のフィルターを詰め、Ｚｎ２＋２−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス［（２−ピリジル）メチル］−１，３−ジアミノ−２−プロポキシド基が結合したＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）カラムから取り出した、Ｚｎ２＋２−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス［（２−ピリジル）メチル］−１，３−ジアミノ−２−プロポキシド基が結合したＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）１０μＬを充填し、その後セルロース製のフィルターで蓋をして、Ｚｎ２＋２−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス［（２−ピリジル）メチル］−１，３−ジアミノ−２−プロポキシド基が結合したＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）チップを作製した。
【００５１】
実施例１５
Ｚｎ２＋２−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス［（２−ピリジル）メチル］−１，３−ジアミノ−２−プロポキシド基が結合したＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）チップを取りつけたマイクロピペットで、０．５０Ｍ硝酸ナトリウム含有１００ｍＭトリス−酢酸緩衝液（ｐＨ７．４）で調整した０．２２ｍＭ ｐ６０ｃ−ｓｒｃペプチド５２１−５３３と０．１８ｍＭリン酸化ｐ６０ｃ−ｓｒｃペプチド５２１−５３３の混合溶液１０μＬを吸入し、５分間平衡化させた後、吐き出した。その後、０．５０Ｍ硝酸ナトリウム含有１００ｍＭトリス−酢酸緩衝液（ｐＨ７．４）１０μＬで５回洗浄した。続いて、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１０μＬで６回洗浄し、洗液を収集して、高速液体クロマトグラフィーを用いて純度を測定したところ、リン酸化ｐ６０ｃ−ｓｒｃペプチド５２１−５３３が１００％、ｐ６０ｃ−ｓｒｃペプチド５２１−５３３が０％であった。
【００５２】
実施例１６
ＰＳ２０ ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標） Ａｒｒａｙに、１００ｍＭ炭酸水素ナトリウム水溶液／アセトニトリル（１／３）溶液で調整した０．３８Ｍ Ｎ−｛５−［Ｎ−（２−アミノ）エチル］カルバモイル−２−ピリジル｝メチル−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−トリス［（２−ピリジル）メチル］−１，３−ジアミノ−２−プロパノール溶液３．０μＬを載せ、室温で４時間反応した。更に、１００ｍＭ炭酸水素ナトリウム水溶液で調整した０．５０Ｍ ２−アミノエタノール溶液３．０μＬを載せ、室温で４時間反応した。洗浄した後、１００ｍＭ ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ６．０）で調整した０．５０Ｍ酢酸亜鉛溶液で洗浄すると、Ｚｎ２＋２−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス［（２−ピリジル）メチル］−１，３−ジアミノ−２−プロポキシド基が結合したＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標） Ａｒｒａｙが得られた。
【００５３】
実施例１７
Ｚｎ２＋２−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス［（２−ピリジル）メチル］−１，３−ジアミノ−２−プロポキシド基が結合したＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標） Ａｒｒａｙに、１００ｍＭトリス−酢酸緩衝液（ｐＨ７．４）で調整した０．９４ｍＭ ４−メチルウンベリフェリルリン酸二ナトリウム溶液３．０μＬを載せ、室温で１時間平衡化させた後、回収した。回収液を収集し、紫外可視分光光度計を用いて回収液から２価の４−メチルウンベリフェリルリン酸アニオンの捕捉率を測定したところ、１６％であった。
【００５４】
比較例１
ポリエチレン製のフィルターが付いたカラムにＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標） ＡＦ−Ｅｐｏｘｙ−６５０Ｍ １００ｍｇを充填し、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ７．０）で膨潤させた。カラムに５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ７．０）で調整した１０ｍＭ ４−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム溶液１．０ｍＬを添加し、その後５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ７．０）２．０ｍＬを添加し流出させた。流出液を収集し、紫外可視分光光度計を用いて流出液から２価の４−ニトロフェニルリン酸アニオンの捕捉率を測定したところ、０．５％であった。
【００５５】
比較例２
ポリプロピレン製のフィルターが付いたカラムにＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス［（２−ピリジル）メチル］−１，３−ジアミノ−２−プロパノール基が結合したＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）１．０ｍＬを充填し、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ７．０）と０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液の混合溶液５．０ｍＬで平衡化させた。カラムにウシ血清アルブミン（分子量６６，０００ リン酸化セリン残基×０）５０μｇとニワトリ卵白アルブミン（分子量４５，０００ リン酸化セリン残基×２）５０μｇとウシαＳ１−カゼイン（分子量２４，０００ リン酸化セリン残基×８）５０μｇとウシαＳ１−カゼイン非リン酸化型（分子量２４，０００ リン酸化セリン残基×０）５０μｇとウシβ−カゼイン（分子量２５，０００ リン酸化セリン残基×５）５０μｇを添加した。続いて、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ７．０）と０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液の混合溶液１．０ｍＬを２回、トリス−酢酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬを４回、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、１５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、３５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、４５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、６０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、７０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、８０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、９０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、４００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬ、５００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１．０ｍＬの順に添加し流出させた。流出液を濃縮した後にスポットし、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分離した後、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色した。電気泳動図の前半を図３、後半を図４に示す。図３及び図４において、始めからウシ血清アルブミン、ニワトリ卵白アルブミン、ウシβ−カゼイン、ウシαＳ１−カゼインの流出が確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明に係る、所定の亜鉛錯体基が結合したポリマー担体は、一定条件下で、アニオン性置換基（例えばリン酸基）と結合すると共に、全体として溶媒難溶性（好ましくは溶媒不溶性）であるので、該置換基を有する物質の分離精製が容易な、安全で安価な捕捉剤となる。更に、このポリマー担体を用いることにより、フィルターで簡便な分離精製が可能となる捕捉器具及び中性条件下で結合させ、次いで、一定条件下で解離させる迅速且つ容易な捕捉方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１は、亜鉛錯体基が結合したポリマー担体を含有する捕捉剤を用いたドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）図の前半である。
【図２】図２は、亜鉛錯体基が結合したポリマー担体を含有する捕捉剤を用いたドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）図の後半である。
【図３】図３は、亜鉛を含まない錯体基が結合したポリマー担体を含有する捕捉剤を用いたドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）図の前半である。
【図４】図４は、亜鉛を含まない錯体基が結合したポリマー担体を含有する捕捉剤を用いたドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）図の後半である。尚、これら図中、１はウシ血清アルブミン、２はニワトリ卵白アルブミン、３はウシβ−カゼイン、４はウシαＳ１−カゼイン非リン酸化型、５はウシαＳ１−カゼイン、６はトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ７．０）と０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液の混合溶液１回目、７はトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ７．０）と０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液の混合溶液２回目、８はトリス−酢酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１回目、９はトリス−酢酸緩衝液（ｐＨ ７．０）２回目、１０はトリス−酢酸緩衝液（ｐＨ ７．０）３回目、１１はトリス−酢酸緩衝液（ｐＨ ７．０）４回目、１２は１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）、１３は１５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）、１４は２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）、１５は２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）、１６は３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）、１７は３５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）、１８は４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）、１９は４５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）、２０は５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）、２１は６０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）、２２は７０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）、２３は８０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）、２４は９０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）、２５は１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）、２６は２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）、２７は３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）、２８は４００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）、２９は５００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）のラインを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（２）：
【化１】
で示される亜鉛錯体基が直接又はスペーサーを介して結合したポリマー担体を含有する、アニオン性置換基を有する物質の捕捉剤。
【請求項２】
アニオン性置換基がリン酸基である、請求項１記載の捕捉剤。
【請求項３】
捕捉剤がビーズの形態である、請求項１記載又は請求項２記載の捕捉剤。
【請求項４】
捕捉剤がプレートの形態である、請求項１記載又は２記載の捕捉剤。
【請求項５】
捕捉剤が繊維の形態である、請求項１記載又は請求項２記載の捕捉剤。
【請求項６】
請求項１〜請求項３又は請求項５のいずれか一項記載の捕捉剤を充填し、フィルターで濾別する機能を持つ、アニオン性置換基を有する物質の捕捉器具。
【請求項７】
アニオン性置換基を有する物質を、請求項１〜請求項５のいずれか一項記載の捕捉剤に結合させることによって捕捉する工程を含む、アニオン性置換基を有する物質の捕捉方法。
【請求項８】
該捕捉工程の後、アニオン性置換基を有する物質を捕捉剤から解離させる工程を更に含む、請求項７記載の方法。
【請求項１】
一般式（２）：
【化１】
で示される亜鉛錯体基が直接又はスペーサーを介して結合したポリマー担体を含有する、アニオン性置換基を有する物質の捕捉剤。
【請求項２】
アニオン性置換基がリン酸基である、請求項１記載の捕捉剤。
【請求項３】
捕捉剤がビーズの形態である、請求項１記載又は請求項２記載の捕捉剤。
【請求項４】
捕捉剤がプレートの形態である、請求項１記載又は２記載の捕捉剤。
【請求項５】
捕捉剤が繊維の形態である、請求項１記載又は請求項２記載の捕捉剤。
【請求項６】
請求項１〜請求項３又は請求項５のいずれか一項記載の捕捉剤を充填し、フィルターで濾別する機能を持つ、アニオン性置換基を有する物質の捕捉器具。
【請求項７】
アニオン性置換基を有する物質を、請求項１〜請求項５のいずれか一項記載の捕捉剤に結合させることによって捕捉する工程を含む、アニオン性置換基を有する物質の捕捉方法。
【請求項８】
該捕捉工程の後、アニオン性置換基を有する物質を捕捉剤から解離させる工程を更に含む、請求項７記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００８−２００６７８（Ｐ２００８−２００６７８Ａ）
【公開日】平成２０年９月４日（２００８．９．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１０２１４９（Ｐ２００８−１０２１４９）
【出願日】平成２０年４月１０日（２００８．４．１０）
【分割の表示】特願２００５−５０３０９６（Ｐ２００５−５０３０９６）の分割
【原出願日】平成１６年３月４日（２００４．３．４）
【出願人】（０００１１３７８０）マナック株式会社 (40)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年９月４日（２００８．９．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年４月１０日（２００８．４．１０）
【分割の表示】特願２００５−５０３０９６（Ｐ２００５−５０３０９６）の分割
【原出願日】平成１６年３月４日（２００４．３．４）
【出願人】（０００１１３７８０）マナック株式会社 (40)
【Ｆターム（参考）】
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