アマチャヅル抽出物の製造方法、及びその代謝疾患改善治療用アマチャヅル抽出物、代謝疾患改善用機能食品、代謝疾患改善治療用薬理組成物
【課題】アマチャヅル抽出物から新規化合物を分離し、それを用いて有効な代謝疾患改善治療用アマチャヅル抽出物、代謝疾患改善用機能食品、代謝疾患改善治療用薬理組成物を提供すること。
【解決手段】アマチャヅル葉エタノール抽出物濃縮液に、４０〜１２５℃、１．２〜１１００気圧の高温高圧または高圧反応を、０．１〜２４時間処理して、アマチャヅル葉抽出物濃縮液の乾燥粉末におけるダムリンＡ含有量を０．７〜７％（ｗ／ｗ）、ダムリンＢの含有量を０．５〜６％（ｗ／ｗ）に増加させて、アマチャヅル抽出物を得る。
【解決手段】アマチャヅル葉エタノール抽出物濃縮液に、４０〜１２５℃、１．２〜１１００気圧の高温高圧または高圧反応を、０．１〜２４時間処理して、アマチャヅル葉抽出物濃縮液の乾燥粉末におけるダムリンＡ含有量を０．７〜７％（ｗ／ｗ）、ダムリンＢの含有量を０．５〜６％（ｗ／ｗ）に増加させて、アマチャヅル抽出物を得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アマチャヅル抽出物を高温・高圧で処理して、ＡＭＰＫ活性化有効成分であるダムリンＡ及びダムリンＢの含有量を増加させた新たな組成のアマチャヅル抽出物を製造する方法、並びに、それを用いた代謝疾患改善治療用アマチャヅル抽出物、代謝疾患改善用機能食品、代謝疾患改善治療用薬理組成物に関する。
【０００２】
また、本発明は、ダムリンＡ及びダムリンＢの含有量が増加した新たな組成の新規アマチャヅル抽出物を、肥満、糖尿、高脂血症などを含む代謝疾患の効率的な治療及び改善用途に使用する手段に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＡＭＰＫ（AMP-activated protein kinase）はα、β、γのサブユニットで構成されたヘテロトリマー（heterotrimer）たんぱく質であって、主として筋肉細胞にたくさん存在し、その他にも脳、心臓、脂肪組織、及び肝にも存在する酵素であって、ＡＭＰＫの作用は細胞内でエネルギー準位を感知する重要センサであり、またこの結果に従い、食欲調節、体重調節、血糖調節、及び血中脂質代謝調節などに核心役目をする。
【０００４】
ＡＭＰＫの活性化は、強度の高い運動や長期間飢えた時に現れるＡＴＰ消耗に従うＡＭＰ濃度の増加によりＡＭＰがＡＭＰＫのγ−サブユニットに結合して起こる。実質的な活性化はＬＫＢ１またはＣａＭＫＫという上位燐酸化酵素により、ＡＭＰＫ αサブユニットのスレオニン（threonine）（Ｔｈｒ）−１７２残基に対する燐酸化を通じて現れるようになる。
【０００５】
燐酸化形態のＡＭＰＫは、ＡＴＰを消費する生化学反応である脂肪酸及びコレステロールの合成を抑制するようになり、反対にＡＴＰを生成する脂肪酸のベータ酸化（β-oxidation）と過程と、解糖作用（glycolysis）を活性化させるようになる。それだけでなく、細胞膜の葡萄糖吸収通路であるグルコーストランスポーター４（glucose transporter 4、ＧＬＵＴ４）の量を増加させるようになる。
一方、ＡＭＰＫの活性化は、インスリンの作用に従うＰＩ３Ｋ信号伝達機作に関わらず、細胞内の葡萄糖吸収通路であるＧＬＵＴ４の細胞膜移動を増加させるようになる。また、ＡＭＰＫが燐酸化により活性化されれば、更に他の下位たんぱく質であるコレステロール合成の核心酵素であるＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素（hydroxymethylglutaryl -CoA reductase）に対する燐酸化が起こる。この結果、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の不活性化が起こるようになって、コレステロール合成が低下するので、血中コレステロールが減少する。
【０００６】
また、燐酸化が起こって活性化された形態のＡＭＰＫ酵素は、その下位作用たんぱく質として脂肪酸合成の核心酵素であるＡＣＣ（acetyl-CoA carboxylase）のセリン（Ｓｅｒ）−７９残基に対する燐酸化を起こして、このＡＣＣ酵素の活性を抑制するようになる。この結果、ＡＭＰＫの活性化により脂肪酸の合成に核心代謝産物であるマロニル−ＣｏＡ（malonyl-CoA）の生成が低下して脂肪酸の合成が抑制されるようになる。
ＡＭＰＫ活性化によりマロニル−ＣｏＡの減少が起これば、ミトコンドリア内に脂肪酸であるロングチェーンアシル−ＣｏＡ（long chain acyl-CoA）が流入してベータ酸化が促進される。高濃度のマロニル−ＣｏＡ存在状態ではロングチェーンアシル−ＣｏＡをミトコンドリアに伝達するＣＰＴ１（carnitine palmitoyl-CoA transferase）が抑制されているが、ＡＭＰＫの活性化によりマロニル−ＣｏＡの濃度が低下するようになって、この阻害作用が解除されながらミトコンドリア内にロングチェーンアシル−ＣｏＡ形態の脂肪酸の流入が増加しながらベータ酸化が増加するので、体脂肪及び血中中性脂質の減少が起こるようになる。
【０００７】
一方、ＡＭＰＫの活性化は、ＰＧＣ−１α（Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1α）に対する燐酸化を起こし、またヒストンデアセチラーゼ（histone deacetylase）の一種であるＳＩＲＴ１（Silent Information Regulatory T1）を活性化させる。その結果、ＡＭＰＫとＳＩＴＲ１によるＰＧＣ−１αの燐酸化及び脱アセチル化によりミトコンドリア代謝が活発に起こって、糖尿及び肥満の改善効果が現れるようになる（非特許文献１〜２）。
したがって、ＡＭＰＫ活性化は体内脂肪酸及びコレステロールの合成抑制、そして体脂肪のベータ酸化及び血中葡萄糖の細胞吸収促進などの作用を促進するため、ＡＭＰＫを活性化する物質は、肥満、糖尿、及び高脂血症の改善や治療に非常に効果的に使われることができる。
【０００８】
アマチャヅル（Gynostemma pentaphyllum）はフクベ科（Cucurbitaceae）に属する多年生つる性植物である。山や野の森の中で自活し、根葉脈は横に伸びて節に白毛があり、縺れながら育つが、巻き鬚により這い登ることもする。アマチャヅル葉を乾かして作ったお茶は主として蔓茶とも呼ばれて、円形脱毛症をなくし、種々の臓器の機能を回復させ、健康な皮膚を維持するようにする。抗ストレス効果、弛緩性、及び痙攣性便泌抑制効果、下痢止め効果などがあり、気管支喘息、老人性慢性気管支炎などに効果がある。また、鎮咳、去痰作用があり、ストレス性潰瘍にも効果があり、肝炎、動脈硬化予防、陣痛作用などがあるとも知られている。
【０００９】
特許文献１には、アマチャヅル抽出物がAMP-activated protein kinase（ＡＭＰＫ）の活性を増大させてインスリン抵抗性、肥満、そして高脂血症などを含む代謝疾患を改善させることができることを示唆するが、具体的な有効成分については開示がない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】韓国公開特許２００８−０００３９３１
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Canto and Auwerx、Curr.Opin.Lipidol. 20、98-105、2009
【非特許文献２】Cantoら、Nature 458、1056-1060、2009
【非特許文献３】Hwangら、Biochem.Biophys.Res.Commun.371,289-293,2008
【非特許文献４】Hwangら、Biochem.Biophys.Res.Commun.377,1253-1258
【非特許文献５】Hardieら、FEBS Lett.546、113-120,2003
【非特許文献６】Carlingら、Trends.Biochem.Sci.29,18-24、2004
【非特許文献７】Kahnら、Cell Metab.1、15-25,2005
【非特許文献８】Coolら、Cell Metab.3.403-416,2006
【非特許文献９】Leeら、Diabetes,55,2256-2264,2006
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
そこで、本発明は、アマチャヅル抽出物から新規化合物を分離し、それを用いて有効な代謝疾患改善治療用アマチャヅル抽出物、代謝疾患改善用機能食品、代謝疾患改善治療用薬理組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記課題を解決するため、アマチャヅル抽出物の成分を分析した結果、ダムリンＡとダムリンＢという物質がアマチャヅル抽出物でＡＭＰＫの活性に影響を与えることと確認された。また、本発明の技術を用いて製造したダムリンＡ及びダムリンＢの含有量が増加した新たな組成の新規アマチャヅル抽出物は既存のアマチャヅル抽出物に比べてＡＭＰＫの燐酸化能力増加及び酵素活性化能力が増加したことと確認された。これらの知見を基に本発明に至った。
【００１４】
本発明では、アマチャヅル抽出物から新規のダマラン系サポニン物質であるAMP-activated protein kinase（ＡＭＰＫ）酵素活性化能力を持つダムリンＡ(damulinA)と命名された2α,3β,12β-trihydroxydammar-20(22)-E,24-diene-3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→)-β-D-glucopyrano side]、及びダムリンＢ(damulinB)と命名された2α,3β,12β-trihydroxydammara-20,24-diene-3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→)-β-D-glucopyranoside]をＨＰＬＣ及びＮＭＲ方法を用いて分離及び分析した。
その構造は下式の通りである。
【００１５】
【化１】
【００１６】
ダムリンを分離するためのアマチャヅル葉抽出物を製造するためには、先に乾燥されたアマチャヅル葉を１０〜２０倍体積のエタノール水溶液（好ましくは、２０〜８０％エタノール水溶液）を抽出した後、１次上層液を回収する。残ったアマチャヅル葉残留浸漬物にまたエタノール水溶液（好ましくは、２０〜８０％エタノール水溶液）を６〜２０倍加え、６５〜９５℃で１〜８時間抽出して２次上層液を得て、１次及び２次上層液を合わせた後、ガーゼを用いて濾過させ、得られた液をまた８００〜１，５００ｘＧで遠心分離して浮遊物を除去する。得られた抽出液を減圧濃縮して４０〜７０ブリックス（Brix）に濃縮した後、得られたアマチャヅル抽出物濃縮液（以下、“ＴＧ１０２２”と称する）をまた高温高圧条件でダムリンの含有量が高まった新規アマチャヅル抽出物濃縮液（以下、“ＴＧ１０２２Ｆ”と称する）を得ることができる。
【００１７】
ダムリン含有量が高まった新規アマチャヅル抽出物（ＴＧ１０２２Ｆ）を得るためには、高温及び高圧の維持が必要であるが、このために商業的に用いられる一般的な高温・高圧または高温高圧殺菌装置が取り付けられた発酵槽及び抽出器を利用できる。
【００１８】
上記新規アマチャヅル抽出物は、温度が高くない超高圧状態でも生成できるが、超高圧状態を維持するために商業的に販売されている超高圧反応器を利用することもできる。例えば、日本東洋高圧社のＤＦＳ−２Ｌなどを使用することができる。上記新規アマチャヅル抽出物を製造するための好ましい温度は４０〜１２５℃であり、好ましい圧力は１．２〜１１００気圧である。反応時間は、好ましくは０．１〜２４時間である。その他のアマチャヅル抽出物でダムリンＡとダムリンＢの含有量を高めることができる方法には、高圧及び高温条件の以外にも超高周波レンジやオーブンを利用することもできる。
【００１９】
ダムリンＡ及びダムリンＢの分離及び分析は、アマチャヅル抽出物を陰イオン交換樹脂が充填されたコラムに通過させるステップ、５〜１５倍の精製水で洗浄するステップ、５〜１５倍の５０％メタノールを通過させて洗浄するステップ、及び５〜１５倍のアセトン、ノルマルヘキサン、エチルアセテート、ノルマルブタノールにステップ別に抽出するステップ、上記分画別抽出物のうち、ＡＭＰＫの活性の高い分画でＨＰＬＣを用いてダムリンＡ及びダムリンＢを分離するステップを経て確認することができる。
【００２０】
本発明のアマチャヅル抽出物に高温及び高圧を加えた新規アマチャヅル抽出物は、ダムリンＡ及びダムリンＢが増加して糖尿病、肥満、体脂肪減少、そして血中中性脂肪及びコレステロールを減少させる効果が格段に向上するが、このような代謝疾患に対する治療、改善、または予防効果のために、ダムリンＡ及びダムリンＢの含有量が乾燥重量当たり各々本発明の新たな組成の新規アマチャヅル抽出物の乾燥固形分のうち、有効指標成分であるダムリンＡの含有量は０．５％から１０％内の範囲であり、有用には０．７％から７％範囲であり、ダムリンＢの含有量は０．３％から８％内の範囲であり、有用には０．５％から６％範囲である。
【００２１】
新規アマチャヅル抽出物または粉末化前の液状形態（固形分に換算してダムリンＡまたはダムリンＢが各々０．５〜１０％及び０．３〜８％以上含まれた）の一日投与量は、適切には固形分を基準にして１ｍｇ〜１００ｇで、他の添加物及び賦形剤と共に投与できる。
【００２２】
本発明の製剤は、ダムリンＡあるいはダムリンＢを有効成分として含有したアマチャヅル抽出物の含有量が全組成物の０．０１％から１００％範囲内で組成できる。
【００２３】
また、本発明の組成物を含んだ食品は、抗肥満、抗糖尿、そして抗高脂血症の効験が阻害されない組成の範囲内で、どの種類の媒介物とも共に使われることができる。
本発明の組成物は、温泉水、濾過された水、蒸溜水、炭酸水、ジュース、ヨーグルト、牛乳、食用油、食品添加剤、アイスクリーム、ハンバーグ、シリアル、クッキー、パン、ビスケット、加工肉、豆乳、禅食、栄養補助剤、加工実、及び果物汁等に添加されることができ、この組成物が含まれた食品には、増量剤、防腐剤、甘味料、彩色剤、湿性乳化剤などが含まれることができる。
【００２４】
疾患の臨床的状態に従って、投与は認められた多様な投与経路を選択することができる。例としては、経口または非経口投与法が使用できる。非経口投与法としては、静脈注射、筋肉注射、皮下脂肪注射、鼻腔を通じた投与法であって、その剤形は固形、半固形、あるいは液質型でも可能である。また、坐薬、クリーム、ジェル、パッチ、膣坐薬、エアロソルなどの形態であって、定量を投入できる全ての形態が含まれる。薬理的組成として伝統的な媒介物及び免疫補強剤などが含まれる。本発明の媒介物として薬理学的に認められた媒介物であれば全て可能であり、賦形剤あるいは安定剤は細胞と哺乳動物に露出時、無毒性を表すものを全て含む。薬理学的に認められた媒介物にはｐＨバッファー水溶液、燐酸、クエン酸、及びアスコルブ酸などを含むことができる。水溶性重合体であるポリビニルピロリドン、グライシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、あるいはライシンのようなアミノ酸、そして葡萄糖、マンノース、デキストリンのような炭水化物も媒介物になることができる。ＥＤＴＡのようなキレート剤、マンニトール、ソルビトール、そして非極性界面活性剤であるツイーン（TWEEN）、ＰＥＧ（polyethylene glycol）、そしてプルロニックス（PLURONICS）も媒介物に含まれることができる。
薬理学的に認められた媒介物と希釈剤には、全ての種類の溶液、分散剤、抗細菌及び抗真菌剤、等張剤、そして吸収遅延剤などを含む。薬理的活性物質のためのこのような製剤の利用法は一般的な技術に記録された通りである。薬理的活性物質と合わない製剤を除外した全ての製剤を含む。この組成に補完的な成分も添加できる。また、本発明の組成物にクロミウム、マンガン、亜鉛、ニアシン、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２などを含むことができ、ここに現在肥満に効能があることと知らされたＨＣＡ（hydroxycitric acid）及びＣＬＡ（conjugated linoleic acid）等も含むことができる。
【００２５】
経口投与時にも、薬理的に認められた無毒性の賦形剤と共に組成できる。賦形剤としては、マンニトール、ポリデキストロース、マルトデキストロース、澱粉、ラクトーズ、ステアル酸マグネシウム、サッカリン、タルク、セルロース、葡萄糖、ゼラチン、砂糖、炭酸マグネシウムなどを含む。このような組成は、溶液、懸濁、タブレット、丸薬、カプセル、粉末形態になることができ、薬理的に認められた無毒性の賦形剤と共に組成できる。
【００２６】
タブレット、丸薬、及びカプセルは次のような製剤を含有できる。トレガカンスガム、アカシア、とうもろこし澱粉、及びゼラチンのような接着剤、燐酸カルシウムのような賦形剤、とうもろこし澱粉、ジャガイモ澱粉、及びアルギン酸のような分解剤、ステアルサンマグネシウムのような潤滑剤、砂糖、ラックトーズのような甘味剤、ペパーミント、ウィントグリーン、そしてチェリーなどから抽出された芳香剤も添加できる。単位容量がカプセル型の場合、上記提示された製剤の他に、液型媒介物も含むことができる。シロップとエリサの場合、有効成分と共に砂糖のような甘味剤と防腐剤としてメチルあるいはプロピルパラベンを含むことができ、着色剤と芳香剤としてチェリーとオレンジ芳香剤も添加できる。単位容量を調剤する時に使われた全ての製剤は純粋で、かつ無毒性でなければならない。このような剤形で、ラックトーズ、砂糖、燐酸カルシウムなどの希釈剤とステアルサンマグネシウムのような潤滑剤、澱粉、ポリビニルピロリドン、アカシアガム、ゼラチン、セルロースのような接合剤も共に組成できる。
【発明の効果】
【００２７】
ダムリンＡ及びダムリンＢの含有量が増加した新規アマチャヅル抽出物は、既存のアマチャヅル抽出物に比べてＡＭＰＫの燐酸化能力増加及び酵素活性化能力を格段に増加させられる。
【００２８】
ＡＭＰＫの下部ターゲットたんぱく質で、かつ脂肪酸生合成の核心酵素であるＡＣＣ（acetyl-CoA carboxylase）の燐酸化を格段に増加させることができるので、この結果、ＡＣＣの酵素活性を低下させる能力も格段に強く表すようになる。したがって、窮極的にはダムリンの含有量を増加させた新規アマチャヅル抽出物（ＴＧ１０２２Ｆ）は、ダムリン含有量を増加させない元のアマチャヅル抽出物（ＴＧ１０２２）に比べて体脂肪合成抑制能力、脂肪酸のベータ酸化促進能力、コレステロール生合成抑制能力、高脂血症治療及び改善効果、肥満の治療及び改善効果があり、インスリン非依存的に細胞葡萄糖運搬体であるＧＬＵＴ４の細胞膜移動能力を格段に増加させるによって、糖尿病患者の血糖を効率の良く低下させることができる。
結果的に、既存のアマチャヅル抽出物に比べて本発明の方法を用いて製造したダムリンＡとダムリンＢの含有量の高い新規アマチャヅル抽出物が肥満、糖尿、高脂血症などの代謝疾患の改善または治療効果が格段に優れている。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】ＡＭＰＫ活性を増大させる有効成分である新規ダマラン系サポニンに分離及び精製されたダムリンＡ成分のＨＰＬＣスペクトル分析結果を示すグラフ
【図２】ＡＭＰＫ活性を増大させる有効成分である新規ダマラン系サポニンに分離及び精製されたダムリンＢ成分のＨＰＬＣスペクトル分析結果を示すグラフ
【図３】Ｌ６筋肉細胞から純粋分離されたダムリンＡ化合物の濃度依存的ＡＭＰＫ（Ａ）及びＡＣＣ（Ｂ）燐酸化能力の増加を示す写真
【図４】Ｌ６筋肉細胞から純粋分離されたダムリンＢの化合物の濃度依存的ＡＭＰＫ（Ａ）及びＡＣＣ（Ｂ）燐酸化能力の増加を示す写真
【図５】ダムリンＡ及びダムリンＢの脂肪酸ベータ酸化増加に対する効果を示グラフ
【図６】ダムリンＡ及びダムリンＢの細胞内の葡萄糖吸収が増加する効果を示すグラフ
【図７】ダムリンＡ及びダムリンＢの含有量が各々０．８９％及び０．６８％に増加した新たな組成の新規アマチャヅル抽出物乾燥物（ＴＧ１０２２Ｆ）の濃度依存的なＡＭＰＫ及びＡＣＣ酵素蛋白質燐酸化能力の増加を示す写真
【図８】ダムリンＡ及びダムリンＢの含有量が各々０．８９％及び０．６８％に増加した新たな組成の新規アマチャヅル抽出物乾燥物（ＴＧ１０２２Ｆ）の投与に従う肥満マウス筋肉（Soleus muscle）でＡＭＰＫ及びＡＣＣ燐酸化増加の変化を示す写真
【図９】アマチャヅル抽出物及びダムリンＡ及びダムリンＢの含有量を増加させた新規アマチャヅル抽出物の製造方法を示すフローチャート
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下に、本発明の実施形態を説述する。なお、下記の実施形態は本発明の実施例に過ぎず、本発明の趣旨から逸脱しない範囲で従来公知の技術を援用して適宜変容可能である。
【実施例１】
【００３１】
アマチャヅル抽出物からＡＭＰＫ活性物質であるダムリンの分離：
乾燥されたアマチャヅル葉５ｋｇを５０lの５０％エタノールに浸漬させた後、９０℃で６時間１次抽出した後、１次上層液を回収した。残ったアマチャヅル葉残留浸漬物にまた５０％エタノール５０lを加え、９０℃で６時間抽出して２次上層液を得た。１次及び２次上層液を合わせた後、ガーゼで濾過して得られた液をまた１，０００ｘｇで遠心分離して浮遊物を除去した。得られた抽出液を減圧濃縮して５０ブリックス（Brix）に濃縮した後、これをＡＭＰＫ活性物質であるダムリンの分離に用いた。
【００３２】
ダムリンの純粋分離のために５０ブリックスに濃縮されたアマチャヅル抽出物をＨＰ−２０陰イオン交換樹脂（Mitsubishi Chemical Corporation）が充填されたコラム（２０ｘ６５ｃｍ）を通過させた後、一次的に１０lの水で洗浄し、その後、１０lの５０％メタノールを通過させて洗浄した後、また１０lのアセトンを通過させてアセトン分画を得て濃縮した。以後、濃縮液に水を１．５l混ぜて懸濁させた後、また１．５lノルマルヘキサンを使用して各３回抽出したヘキサン層（２００ｇ）、１．５lエチルアセテートで各３回抽出したエチルアセテート層（２００ｇ）、そして１．５lのノルマルブタノールで各３回抽出したブタノール層（２００ｇ）を得た。
【００３３】
これらのうち、Ｌ６筋肉細胞（L6 myotube cells）でＡＭＰＫ燐酸化増加に従う活性能力が最も高いブタノール分離層（１００ｇ）をシリカゲル（Merck社）コラム（１５ｘ６５ｃｍ；６３−２００μｍ粒子サイズ）に初期溶媒混合組成割合をクロロホルム：メタノール：水＝５：１：０．１から始めて最終溶媒混合割合がクロロホルム：メタノール：水＝０：１：０．１の濃度勾配で物質を分離して全５個の分画（Ｂ．１−Ｂ．５）を得た。
【００３４】
これら分画をＨＰＬＣ分析を通じて確認した結果、Ｂ．３とＢ．４は含まれた物質が非常に類似してこれら２つの分画を合わせてＢ３４分画を新しく作ったし、これらをまたＯＤＳ−Ａシリカゲル（Merck社）コラム（６．５ｘ６５ｃｍ；１２ｎｍ−１５０μｍ粒子サイズ）に通過させ、物質分離のための溶媒として水とメタノール混合割合が初期には１：１から最終０：１になるように段階的な濃度勾配を使用して６個の分画を得た（Ｂ．３４−１からＢ．３４−６）。
【００３５】
これらのうち、Ｌ６細胞でＡＭＰＫ燐酸化増加に従う活性化能力が最も高いＢ３４−５分画をＨＰＬＣを用いて紫外線測定器（２０５ｍｍ）を使用して再度物質を分離した。このために、セミ−プリパレーティブコラム（semi-preparative column, RP-C18 Package column, 10×250mm, 10 particle size;RS Tech大韓民国）を使用したし、試料の流速は分当り２ｍl、溶媒は初期には０．１％フォルム酸（formic acid）が含まれた７５％メタノールを使用して７５分分離後、また１００％メタノール溶媒で１５分分離したし、この結果、１４ｍｇのダムリンＡ及び１０ｍｇのダムリンＢが各々分離された。
【００３６】
分離されたダムリンＡ及びダムリンＢの精製程度を確認するために、ＨＰＬＣ分析［機器：Gilson 321Pump / GX271 liquid handler、検出器：UV/VIS 155 Detector（205nm）、コラム：Optimapak C18（250x4.6mm、RS tech）、流速：0.8mL/min、溶媒：A-H2O/B-MeCN、溶媒濃度勾配：B20%(0-2分)/20-62%(2-33分)/62-100%(33-39分)/100%(39-48分)/100-20%(48-53分)/20%(53-60分)］を実施した。このために、ダムリンＡは８ｍｇ／ｍlの濃度でメタノールに溶かした後、２０μｌの試料を適切なＨＰＬＣ分析条件で分析用コラムを使用して紫外線測定器で２０５ｎｍで吸光度分析を実施した。ダムリンＢは４ｍｇ／ｍl濃度で５％のＤＭＳＯを含有したメタノールに溶かした後、２０μｌの試料をダムリンＡと同一な条件下で分析を実施した。
その結果、図１及び２に提示されたように、分離精製されたダムリンＡ及びダムリンＢは全て単一ピークに各々検出されたし、これらの純度は少なくとも９７％以上ずつになることを確認した。
【実施例２】
【００３７】
分離精製されたダムリンの構造結晶：
化合物ダムリンの構造を確認するためにＦＡＢ Ｍａｓｓ分析を通じて［Ｍ＋Ｎａ］＋ピークを８０５．４７１７（ｃａｃｌｄ．８０５．４７１４）で観察した。１Ｈ ＮＭＲ、１３Ｃ ＮＭＲ、及びＨＭＢＣ（heteronuclear multiple-bonding correlation）等のスペクトルを測定して分離精製物の構造を確認した。
【００３８】
１Ｈ ＮＭＲスペクトルで７個のアングラーメチルグループ（angular methyl groups）が単一ピークに表れたし、１３Ｃ−ＮＭＲで表れた特徴的なδＣ １２４．４、１２４．７、１３２．３、１４０．５ｐｐｍから二重結合の炭素ピークを確認することができた。また、５．０８と５．２６ｐｐｍのプロトンピークからこの化合物に２個の糖が結合されていることを確認することができた。１Ｈ ＮＭＲスペクトルデータからδＨ３．０２、３．６３、３．７５ｐｐｍで表れたプロトンピークとδＣ６８．３、７４．１、及び９６．８ｐｐｍの炭素ピークからハイドロキシルグループ（hydroxyl group）が３個置換されていることが分かった。また、２番と３番のプロトンカップリング定数から２ハイドロキシルグループが２α、３βのダイイコートリアル（diequatorial）形態で存在することが分かった。各種物理化学的性状及び１３Ｃ ＮＭＲデータを他の文献と比較してダムリンが新規化合物であることを同定したし、この化合物の構造を確証するために、ＨＭＢＣスペクトルを測定した。この結果、１Ｈから１３Ｃ ＮＭＲピークからの連結点からこの化合物は糖が３番位置に２個の結合されたことを確認したし、各位置の１Ｈ、１３Ｃ ＮＭＲ構造確認結果、新規化合物である2α、3β、12β-trihydroxydammar-20(22)-E、24-diene-3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→)-β-D- glucopyranoside]であることを確認し、ダムリンＡと命名した。
【００３９】
ダムリンＢは無定形のパウダーであって、１３Ｃ ＮＭＲとＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳで実測値がm/z783.4905([M+H]+calcd. 783.4895)で、分子式はC42H70O13に同定した。ダムリンＡと化合物２の１Ｈ ａｎｄ １３Ｃ ＮＭＲスペクトルとを比較して同一なアグリコン成分（aglycone moiety）を持つということが分かる。ダムリンＡとダムリンＢの主な差はダムリンＡのアグリコンにある３次構造のＣＨ３グループがダムリンＢ末端ＣＨ２グループに置換されているという点である。そして、Ｃ−２２のオレフィニックメチングループの二重結合がＣ−２０（δＣ１４０．５）の４次構造炭素に置換されている。１Ｈ ＮＭＲスペクトルでダムリンＡのメチル信号（δ１．６３、３Ｈ、ｓ）の代りにダムリンＢに２個の広い単一ピーク（δ４．６９ａｎｄ４．８８、ｅａｃｈ １Ｈ、ｂｒ、ｓ）が表れ、ダムリンＡで見えない典型的なオレフィニックプロトン信号がδ５．２６（１Ｈ、ｂｒ、ｔ ｌｉｋｅ、Ｊ＝６．９Ｈｚ）で現れる。
【００４０】
ダムリンＢとダムリンＡの１３Ｃ ＮＭＲスペクトルを比較して見ると、ダムリンＡのオレフィニック炭素信号（δＣ１２４．７、Ｃ−２２）とメチル信号（δＣ１３．１、Ｃ−２１）がダムリンＢのメチレン信号（δＣ３５．１）と末端メチリンピーク（δＣ１０８．７）に各々代替されている。更に他の差異点に、ダムリンＡの４次構造炭素（δＣ１４０．５、Ｃ−２０）がダムリンＢで低磁場（δＣ１５６．３）側に化学的転移が移動したことを見ることができる。ダムリンＢの加水分解でもやはりＣ−Ｇｌｕｃｏｓｅが生成される。
１Ｈ、１３Ｃ ＮＭＲデータ（表１）と１Ｈ−１Ｈ ＣＯＳＹ、ｇＨＳＱＣ、１Ｈ−１３Ｃ ＨＭＢＣスペクトロスコピックデータのような２次元ＮＭＲ（表１）を通じてダムリンＢの２個の糖を同定した。ダムリンＡの１Ｈ、１３Ｃ ＮＭＲスペクトルでの化学的転移、カップリング定数などを比較してダムリンＢやはりβ−構成形態の２個のグルコシルユニット（glucosyl units）があることが分かる。δ４．４５（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、Ｈ−１’ｏｆ ｇｌｃ’）；δＣ１０５．０（Ｃ−１’ｏｆ ｇｌｃ’）とδ４．７５（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、Ｈ−１"ｏｆ ｇｌｃ"）；δＣ１０４．５（Ｃ−１"ｏｆ ｇｌｃ"）のアノメリックプロトンがこのような結論を裏付ける。２個の糖とアグリコンとの連結部品はＨＭＢＣ結果（表１）を通じて決定した。
上記の結果に基づいて、ダムリンＢの構造を3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→)-β-D-glucopyranosyl]-2α,3β,12β-trihydroxydammara-20, 24-dieneに同定した。＜表１＞はＣＤ３０Ｄ上でダムリンＡ及びダムリンＢの構造分析のための１Ｈ（５００ＭＨｚ）及び１３Ｃ（１００ＭＨｚ）ＮＭＲ結果である。
【００４１】
【表１】
【実施例３】
【００４２】
ダムリンＡ及びダムリンＢのＡＭＰＫとＡＣＣの燐酸化増加効果：
ＡＭＰＫの燐酸化により起こる活性化は、ＡＣＣとＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素に対して燐酸化増加を起こして、この結果、ＡＣＣとＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の活性を阻害する（Henin、１９９５）。これによって、ＡＭＰＫ燐酸化により脂肪酸生合成は抑制されるようになり、ミトコンドリアでベータ酸化が増加し、肝組織では脂肪及びコレステロールの合成が阻害される。ＡＭＰＫの活性はアミノ酸１７２番のスレオニン残基に燐酸化が増加したか否かにより判断できる。
【００４３】
ＡＣＣは肝と筋肉組織で脂質代謝を調節する重要な酵素である。この酵素はアセチル−ＣｏＡをカルボキシル化させてマロニル−ＣｏＡを生成するようにする。マロニル−ＣｏＡはミトコンドリア内で脂肪酸のベータ酸化を調節する最も重要な因子であって、マロニル−ＣｏＡの濃度が増加すれば、ミトコンドリア膜のＣＰＴ−１（carnitine palmitoyl-CoA transferase）の活性が減少して脂肪酸のベータ酸化が抑制されるようになり、反対にマロニル−ＣｏＡ濃度が減少すれば、ベータ酸化は増加して体脂肪減少が促進される。ＡＣＣはＡＭＰＫ活性の下位ターゲットたんぱく質であって、ＡＭＰＫの活性化はＡＣＣを燐酸化してＡＣＣ酵素の不活性化を促進してマロニル−ＣｏＡの濃度が減少するようになって、この結果、ミトコンドリア膜のＣＰＴ−１の活性が増加するので脂肪酸のベータ酸化が増加するようになる。
【００４４】
したがって、単一物質に分離されたダムリンＡを１０、３０、６０ug／ｍl濃度に、ダムリンＢは１、５、１０ug／ｍl濃度に各々分化されたＬ６筋肉細胞（L6 myotube cells）に２時間ずつ処理した後、ＡＭＰＫ αサブユニットのスレオニン−１７２残基及びＡＣＣ酵素蛋白質の７９番目のセリン残基に対する燐酸化増加程度をファンなど（非特許文献３）の方法によってウエスタンブロット分析を通じて確認した。
この結果、ダムリンＡ及びダムリンＢの処理によりＬ６筋肉細胞内のＡＭＰＫ及びＡＣＣの燐酸化が対照群に比べて濃度依存的に各々増加されることを確認したし（図３及び４）、ダムリンＡ及びダムリンＢ両方ともＡＭＰＫの燐酸化を起こして活性化され、ＡＣＣは燐酸化されて活性阻害を起こす有効物質であることを確認することができた。
【実施例４】
【００４５】
ダムリンＡ及びダムリンＢの脂肪酸ベータ酸化促進を通じた脂肪減少効果：
ＡＭＰＫを活性化させれば、ＡＣＣの活性が減少するようになって、ミトコンドリア内のマロニル−ＣｏＡの濃度が減少するようになる。これによって、ミトコンドリア内に脂肪酸流入が増加してベータ酸化が増加するようになるので、体脂肪減少に従う肥満抑制効果が現れるようになる。培養されたＬ６筋肉細胞に純粋分離したダムリンＡとダムリンＢを処理してファンなどの方法（非特許文献４）に従い脂肪酸のベータ酸化増進効果を調べた。
【００４６】
その結果、ダムリンＡ（３０μｇ／ｍl）及びダムリンＢ（５μｇ／ｍl）により各々脂肪酸のベータ酸化が各々１．８倍と２．６倍増加されることが観察された（図５）。
また、ダムリンＡ及びダムリンＢは体脂肪減少促進を通じた肥満抑制または治療効能が高い物質であることを確認した。
【実施例５】
【００４７】
ダムリンＡ及びダムリンＢの細胞内葡萄糖吸収促進効果：
ＡＭＰＫの活性化はまた細胞内に葡萄糖吸収が増加を起こして血糖低下効果を表すことがよく知られている（非特許文献３、５〜９）。したがって、ダムリンＡとダムリンＢをＬ６筋肉細胞に処理して細胞内葡萄糖吸収能力に対する影響を調べた。
【００４８】
培養されたＬ６筋肉細胞をファンなどの方法（非特許文献４）に従い高濃度の葡萄糖と共に、細胞内では分解が起こらない放射線同位元素である2-DG(2-deoxy-[3H]D-glucose)を添加した後、ダムリンＡ（３０μｇ／ｍl）とダムリンＢ（５μｇ／ｍl）による細胞内の２―ＤＧ吸収促進程度を調べた。この結果、ダムリンＡを処理した細胞では糖吸収能力が平均的に４２％、そしてダムリンＢが処理された細胞では７９％程度の糖吸収が増加した（図６）。この結果、ダムリンＡ及びダムリンＢは全て血糖低下を通じた抗糖尿効果が優れることを確認した。
【実施例６】
【００４９】
高温及び高圧処理によりダムリン含有量が増加したアマチャヅル抽出物の製造：
上記実施形態４及び５で確認されたように、新規化合物であるダムリンＡとダムリンＢはＡＭＰＫ活性化及びこれに従うＡＣＣ活性阻害を起こす有効物質と明かされた。しかしながら、単純アマチャヅル抽出物（ＴＧ１０２２）にはダムリンＡ及びダムリンＢの含有量が有効効果を表す程度に高いほうでなかった。したがって、ダムリンＡ及びダムリンＢの含有量を増加させた新規組成の新たなアマチャヅル抽出物（ＴＧ１０２２Ｆ）を製造したし、上記新規アマチャヅル抽出物（ＴＧ１０２２Ｆ）が強力なＡＭＰＫ活性化能力を有することを確認することができた。
【００５０】
上記新規アマチャヅル抽出物濃縮液（ＴＧ１０２２Ｆ）は、単純常温常圧アマチャヅルエタノール抽出物（ＴＧ１０２２）に高温及び高圧反応あるいは超高圧反応などを通じて製造した。
【００５１】
高温高圧反応は一般的な高温高圧滅菌器あるいは超高圧反応器（ＤＦＳ−２Ｌ、東洋高圧、日本）を使用してアマチャヅルの単純抽出物濃縮液３０ｍlに高温高圧条件を維持するようにした。
【００５２】
新規アマチャヅル抽出物濃縮液（ＴＧ１０２２Ｆ）を乾燥させて得られた乾燥物内のダムリンＡ及びダムリンＢの含有量はＨＰＬＣを使用して分析した。この時、図１に表れた純度を持つ分離されたダムリンＡ及びダムリンＢを標準品に使用して濃度別定量標準曲線を作成して試料の各ピーク面積比から含有量を計算した。この結果、高温及び高圧あるいは時間を異にした条件で新規アマチャヅル抽出物濃縮液（ＴＧ１０２２Ｆ）でダムリンＡとダムリンＢの含有量は各々温度、圧力、時間などに比例して増加した（表２）。したがって、本発明ではアマチャヅル抽出物濃縮液を高温及び高圧を共に使用した処理条件で加工すれば、処理時間に比例してダムリンＡ及びダムリンＢの含有量が格段に増加した新たなアマチャヅル抽出物濃縮液（ＴＧ１０２２Ｆ）を製造できる。＜表２＞は高温、高圧条件でアマチャヅル抽出物に含まれたダムリンの含有量増加を表す表である。
【００５３】
【表２】
【実施例７】
【００５４】
ダムリン含有量が増加した新規アマチャヅル抽出物のＡＭＰＫ及びＡＣＣの燐酸化増加に対する効果：
実施形態６の方法により製造されたダムリンＡ及びダムリンＢの含有量を各々０．８９％及び０．６８％に増加させた新たな組成のアマチャヅル抽出物（ＴＧ１０２２Ｆ）のＡＭＰＫ信号伝達系の活性化増進能力に対する濃度依存性をＬ６筋肉細胞で調べた。
その結果、図７に表れたように、単純なアマチャヅル抽出物であるＴＧ１０２２は１２０ug／ｍlの濃度で処理しても非処理対照群と類似するように全くＡＭＰＫ及びＡＣＣの燐酸化を起こすことができなかった。しかしながら、ダムリンＡ及びダムリンＢの含有量が各々０．８９％及び０．６８％に増加するように製造されたＴＧ１０２２Ｆは、６０ug／ｍlの処理濃度でもＡＭＰＫ及びＡＣＣの燐酸化を強く促進させたし、９０ug／ｍl及び１２０ug／ｍlに処理濃度を増加させた時、濃度依存的にＡＭＰＫ及びＡＣＣの燐酸化を増加させた。特に、高温・高圧処理しない単純なアマチャヅル酒精抽出物濃縮液であるＴＧ１０２２（ダムリンＡ含有量０．３７％、ダムリンＢ含有量０．２８％）と１２１℃、１．２気圧、１時間反応条件で高温・高圧処理したＴＧ１０２２Ｆ（ダムリンＡ含有量０．８９％、ダムリンＢ含有量０．６８％）を同一な濃度に処理し、これらの効果を比較した結果、ダムリン含有量を増加させたＴＧ１０２２ＦのＡＭＰＫ及びＡＣＣの燐酸化能力がダムリン含有量が増加されないＴＧ１０２２に比べて格段に優れることを確認した。
【実施例８】
【００５５】
肥満動物モデルにおける新規アマチャヅル抽出物を用いた体重減少効果：
レプチン遺伝子突然変異によって肥満、高血糖、そしてインスリン抵抗性動物モデルとして使われるｏｂ／ｏｂマウスを使用してダムリンが増加したアマチャヅル抽出物の抗肥満効果を調べた。このために実施形態６の方法によりダムリンＡ及びダムリンＢの含有量が各々０．８９％及び０．６８％に増加した新規アマチャヅル抽出物（ＴＧ１０２２Ｆ）を一日１５０ｍｇ／ｋｇと３００ｍｇ／ｋｇで各々毎日８週間経口投与したし、この時、対照群としては生理食塩水を投与したグループを使用したし、単純アマチャヅル抽出物であるＴＧ１０２２を３００ｍｇ／ｋｇとも比較した。
【００５６】
この際、動物は各投与グループ当たり雄８頭ずつを使用した。得られた結果として表５に表したように、ＴＧ１０２２Ｆ（ダムリンＡ含有量０．８９％、ダムリンＢ含有量０．６８％）を一日１５０ｍｇ／ｋｇと３００ｍｇ／ｋｇで投与したグループでは８週後に体重が生理食塩水対照群に比べて２．９５ｇ及び４．５８ｇ減少した（表３）。しかしながら、この時ＴＧ１０２２を３００ｍｇ／ｋｇで投与したグループでは生理食塩水対照群に比較時、留意性ある体重変化が表れなかった。一方、全ての投与グループの間に食餌摂取量の変化はないことと表れて、ダムリンＡ及びダムリンＢの含有量が増加したＴＧ１０２２Ｆによる体重減少効果は食餌摂取量の減少によるものではないことが分かった（表３）。
【００５７】
表３は、肥満マウス（ｏｂ／ｏｂ）でダムリンＡ及びダムリンＢの含有量が増加した新たな組成の新規アマチャヅル抽出物ＴＧ１０２２Ｆ（ダムリンＡ含有量０．８９％、ダムリンＢ含有量０．６８％）投与による体重減少効果を表す表である。
【００５８】
【表３】
【実施例９】
【００５９】
新規アマチャヅル抽出物の動物筋肉におけるＡＭＰＫ及びＡＣＣ燐酸化増加効果：
上記実施例８で得られた体重減少効果がＡＭＰＫ及びＡＣＣの燐酸化増加に従う結果なのかを確認するために、ＴＧ１０２２Ｆ（ダムリンＡ及びダムリンＢの含有量が各々０．８９％及び０．６８％に増加した抽出物）を投与したマウスでふくらはぎ筋肉を分離した後、ウエスタンブロット方法を用いてＡＭＰＫ及びＡＣＣの燐酸化程度を確認した。
その結果、図８に示した結果のように、生理食塩水対照群及び単純アマチャヅル抽出物であるＴＧ１０２２に比べてダムリンＡ及びダムリンＢの含有量が増加したＴＧ１０２２Ｆを投与したグループでＡＭＰＫ及びＡＣＣの燐酸化が強くなされていることを確認することができた。この結果、上記実施形態８に表れたダムリン含有量が増加したＴＧ１０２２Ｆの体重減少効果はＴＧ１０２２Ｆが動物筋肉のＡＭＰＫ活性化及びこれに伴うＡＣＣの不活性化を効率的に起こして表れた結果であることを再確認した。
【実施例１０】
【００６０】
新規アマチャヅル抽出物の人体体重及び腰回り減少に対する効果：
年齢が２１歳から７１歳の間の成人男子及び女子に単純なアマチャヅル抽出物であるＴＧ１０２２とダムリンＡ及びダムリンＢの含有量が各々０．８９％及び０．６８％に増加したＴＧ１０２２Ｆを毎日各々３００ｍｇずつ１２週間経口投与した。この際、ＴＧ１０２２は男女各々１０人を対象に経口投与し、ＴＧ１０２２Ｆも男女各々１０人を対象に経口投与した。体重は体重計を用いて測定したし、腰回りは１０番目のあばら骨の下と掌骨の間の中間部位の回りを測定した。
【００６１】
この結果、表４に表れたように、ダムリン含有量が増加したＴＧ１０２２Ｆ投与群では男と女の試験群全てで体重は各々平均４．３ｋｇと２．１ｋｇずつ減少したし、腰回りは各々平均５．４ｃｍ及び５．８ｃｍずつ減少した。一方、ＴＧ１０２２を投与した男子と女子の試験群で体重は平均０．６ｋｇ及び０．４ｋｇずつ各々減少したし、腰回りは平均０．７ｃｍと０．８ｃｍずつ減少した（表７）。この結果に従い、ダムリンＡ及びダムリンＢの含有量を増加させた新たな組成のＴＧ１０２２Ｆは単純アマチャヅル抽出物であるＴＧ１０２２に比べて格段に優れる体重及び体脂肪減少効果があることを確認した。
表４は、人体でダムリンＡ及びダムリンＢの含有量が増加した新規アマチャヅル抽出物ＴＧ１０２２Ｆの体重及び腰回り減少効果を表す表である。
【００６２】
【表４】
【実施例１１】
【００６３】
新規アマチャヅル抽出物の血中脂質減少に対する効果：
新規アマチャヅル抽出物の血中脂質減少に対する効果を確認するために、上記実施形態１０で実施された被試験者の血中中性脂肪とコレステロール含有量の変化を調べた。
【００６４】
その結果、表８に表れたように、ダムリン含有量を増加させたＴＧ１０２２Ｆ投与群では男と女の試験群で中性脂質は各々平均２３．７ｍｇ／ｄｌと２８．４ｍｇ／ｄｌずつ減少したし、総コレステロールは各々平均２６．３ｍｇ／ｄｌと２１．５ｍｇ／ｄｌずつ減少した。一方、単純アマチャヅル抽出物であるＴＧ１０２２を投与した男子と女子の試験群で中性脂質は各々平均３．７ｍｇ／ｄｌと４．８ｍｇ／ｄｌずつ減少したし、総コレステロールは各々平均３．１ｍｇ／ｄｌと２．５ｍｇ／ｄｌずつ減少した（表８）。
この結果に従い、ダムリンＡ及びダムリンＢの含有量を増加させた新規アマチャヅル抽出物であるＴＧ１０２２Ｆは単純アマチャヅル抽出物であるＴＧ１０２２に比べて血中中性脂質及び総コレステロールに対する減少効果が格段に優れることを確認した。
表５は、人体でダムリンＡ及びダムリンＢの含有量が増加した新たな組成の新規アマチャヅル抽出物ＴＧ１０２２Ｆ（ダムリンＡ含有量０．８９％、ダムリンＢ含有量０．６８％）の血中脂質減少効果を表す表である。
【００６５】
【表５】
【実施例１２】
【００６６】
新規アマチャヅル抽出物の血糖減少効果：
次に新規アマチャヅル抽出物の血糖減少効果を測定するために、上記実施形態１０で実施された被試験者の空腹血糖変化を調べた。
【００６７】
この結果は表８に表れたように、ダムリンＡ及びダムリンＢの含有量を各々ダムリンＡ含有量０．８９％、ダムリンＢ含有量０．６８％に増加させたＴＧ１０２２Ｆ投与群では、男子と女子の試験群で空腹血糖は各々平均２６．４ｍｇ／ｄｌと２１．５ｍｇ／ｄｌずつ減少した。一方、単純アマチャヅル抽出物であるＴＧ１０２２を投与した男子と女子の試験群で空腹血糖は各々平均３．１ｍｇ／ｄｌと２．５ｍｇ／ｄｌずつ減少した。この結果に従い、ダムリンＡ及びダムリンＢの含有量が増加した新規アマチャヅル抽出物ＴＧ１０２２Ｆは単純なアマチャヅル抽出物であるＴＧ１０２２に比べて血糖減少効果が格段に優れることを確認した。
表６は、人体でダムリンＡ及びダムリンＢの含有量が増加した新規アマチャヅル抽出物ＴＧ１０２２Ｆの血糖減少効果を表す表である。
【００６８】
【表６】
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明によると、アマチャヅル抽出されるＡＭＰＫ活性化物質のダムリンＡ及びダムリンＢにより、肥満、糖尿、高脂血症を含む代謝疾患の改善及び治療に有効であり、産業上有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アマチャヅル抽出物を高温・高圧で処理して、ＡＭＰＫ活性化有効成分であるダムリンＡ及びダムリンＢの含有量を増加させた新たな組成のアマチャヅル抽出物を製造する方法、並びに、それを用いた代謝疾患改善治療用アマチャヅル抽出物、代謝疾患改善用機能食品、代謝疾患改善治療用薬理組成物に関する。
【０００２】
また、本発明は、ダムリンＡ及びダムリンＢの含有量が増加した新たな組成の新規アマチャヅル抽出物を、肥満、糖尿、高脂血症などを含む代謝疾患の効率的な治療及び改善用途に使用する手段に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＡＭＰＫ（AMP-activated protein kinase）はα、β、γのサブユニットで構成されたヘテロトリマー（heterotrimer）たんぱく質であって、主として筋肉細胞にたくさん存在し、その他にも脳、心臓、脂肪組織、及び肝にも存在する酵素であって、ＡＭＰＫの作用は細胞内でエネルギー準位を感知する重要センサであり、またこの結果に従い、食欲調節、体重調節、血糖調節、及び血中脂質代謝調節などに核心役目をする。
【０００４】
ＡＭＰＫの活性化は、強度の高い運動や長期間飢えた時に現れるＡＴＰ消耗に従うＡＭＰ濃度の増加によりＡＭＰがＡＭＰＫのγ−サブユニットに結合して起こる。実質的な活性化はＬＫＢ１またはＣａＭＫＫという上位燐酸化酵素により、ＡＭＰＫ αサブユニットのスレオニン（threonine）（Ｔｈｒ）−１７２残基に対する燐酸化を通じて現れるようになる。
【０００５】
燐酸化形態のＡＭＰＫは、ＡＴＰを消費する生化学反応である脂肪酸及びコレステロールの合成を抑制するようになり、反対にＡＴＰを生成する脂肪酸のベータ酸化（β-oxidation）と過程と、解糖作用（glycolysis）を活性化させるようになる。それだけでなく、細胞膜の葡萄糖吸収通路であるグルコーストランスポーター４（glucose transporter 4、ＧＬＵＴ４）の量を増加させるようになる。
一方、ＡＭＰＫの活性化は、インスリンの作用に従うＰＩ３Ｋ信号伝達機作に関わらず、細胞内の葡萄糖吸収通路であるＧＬＵＴ４の細胞膜移動を増加させるようになる。また、ＡＭＰＫが燐酸化により活性化されれば、更に他の下位たんぱく質であるコレステロール合成の核心酵素であるＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素（hydroxymethylglutaryl -CoA reductase）に対する燐酸化が起こる。この結果、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の不活性化が起こるようになって、コレステロール合成が低下するので、血中コレステロールが減少する。
【０００６】
また、燐酸化が起こって活性化された形態のＡＭＰＫ酵素は、その下位作用たんぱく質として脂肪酸合成の核心酵素であるＡＣＣ（acetyl-CoA carboxylase）のセリン（Ｓｅｒ）−７９残基に対する燐酸化を起こして、このＡＣＣ酵素の活性を抑制するようになる。この結果、ＡＭＰＫの活性化により脂肪酸の合成に核心代謝産物であるマロニル−ＣｏＡ（malonyl-CoA）の生成が低下して脂肪酸の合成が抑制されるようになる。
ＡＭＰＫ活性化によりマロニル−ＣｏＡの減少が起これば、ミトコンドリア内に脂肪酸であるロングチェーンアシル−ＣｏＡ（long chain acyl-CoA）が流入してベータ酸化が促進される。高濃度のマロニル−ＣｏＡ存在状態ではロングチェーンアシル−ＣｏＡをミトコンドリアに伝達するＣＰＴ１（carnitine palmitoyl-CoA transferase）が抑制されているが、ＡＭＰＫの活性化によりマロニル−ＣｏＡの濃度が低下するようになって、この阻害作用が解除されながらミトコンドリア内にロングチェーンアシル−ＣｏＡ形態の脂肪酸の流入が増加しながらベータ酸化が増加するので、体脂肪及び血中中性脂質の減少が起こるようになる。
【０００７】
一方、ＡＭＰＫの活性化は、ＰＧＣ−１α（Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1α）に対する燐酸化を起こし、またヒストンデアセチラーゼ（histone deacetylase）の一種であるＳＩＲＴ１（Silent Information Regulatory T1）を活性化させる。その結果、ＡＭＰＫとＳＩＴＲ１によるＰＧＣ−１αの燐酸化及び脱アセチル化によりミトコンドリア代謝が活発に起こって、糖尿及び肥満の改善効果が現れるようになる（非特許文献１〜２）。
したがって、ＡＭＰＫ活性化は体内脂肪酸及びコレステロールの合成抑制、そして体脂肪のベータ酸化及び血中葡萄糖の細胞吸収促進などの作用を促進するため、ＡＭＰＫを活性化する物質は、肥満、糖尿、及び高脂血症の改善や治療に非常に効果的に使われることができる。
【０００８】
アマチャヅル（Gynostemma pentaphyllum）はフクベ科（Cucurbitaceae）に属する多年生つる性植物である。山や野の森の中で自活し、根葉脈は横に伸びて節に白毛があり、縺れながら育つが、巻き鬚により這い登ることもする。アマチャヅル葉を乾かして作ったお茶は主として蔓茶とも呼ばれて、円形脱毛症をなくし、種々の臓器の機能を回復させ、健康な皮膚を維持するようにする。抗ストレス効果、弛緩性、及び痙攣性便泌抑制効果、下痢止め効果などがあり、気管支喘息、老人性慢性気管支炎などに効果がある。また、鎮咳、去痰作用があり、ストレス性潰瘍にも効果があり、肝炎、動脈硬化予防、陣痛作用などがあるとも知られている。
【０００９】
特許文献１には、アマチャヅル抽出物がAMP-activated protein kinase（ＡＭＰＫ）の活性を増大させてインスリン抵抗性、肥満、そして高脂血症などを含む代謝疾患を改善させることができることを示唆するが、具体的な有効成分については開示がない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】韓国公開特許２００８−０００３９３１
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Canto and Auwerx、Curr.Opin.Lipidol. 20、98-105、2009
【非特許文献２】Cantoら、Nature 458、1056-1060、2009
【非特許文献３】Hwangら、Biochem.Biophys.Res.Commun.371,289-293,2008
【非特許文献４】Hwangら、Biochem.Biophys.Res.Commun.377,1253-1258
【非特許文献５】Hardieら、FEBS Lett.546、113-120,2003
【非特許文献６】Carlingら、Trends.Biochem.Sci.29,18-24、2004
【非特許文献７】Kahnら、Cell Metab.1、15-25,2005
【非特許文献８】Coolら、Cell Metab.3.403-416,2006
【非特許文献９】Leeら、Diabetes,55,2256-2264,2006
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
そこで、本発明は、アマチャヅル抽出物から新規化合物を分離し、それを用いて有効な代謝疾患改善治療用アマチャヅル抽出物、代謝疾患改善用機能食品、代謝疾患改善治療用薬理組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記課題を解決するため、アマチャヅル抽出物の成分を分析した結果、ダムリンＡとダムリンＢという物質がアマチャヅル抽出物でＡＭＰＫの活性に影響を与えることと確認された。また、本発明の技術を用いて製造したダムリンＡ及びダムリンＢの含有量が増加した新たな組成の新規アマチャヅル抽出物は既存のアマチャヅル抽出物に比べてＡＭＰＫの燐酸化能力増加及び酵素活性化能力が増加したことと確認された。これらの知見を基に本発明に至った。
【００１４】
本発明では、アマチャヅル抽出物から新規のダマラン系サポニン物質であるAMP-activated protein kinase（ＡＭＰＫ）酵素活性化能力を持つダムリンＡ(damulinA)と命名された2α,3β,12β-trihydroxydammar-20(22)-E,24-diene-3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→)-β-D-glucopyrano side]、及びダムリンＢ(damulinB)と命名された2α,3β,12β-trihydroxydammara-20,24-diene-3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→)-β-D-glucopyranoside]をＨＰＬＣ及びＮＭＲ方法を用いて分離及び分析した。
その構造は下式の通りである。
【００１５】
【化１】
【００１６】
ダムリンを分離するためのアマチャヅル葉抽出物を製造するためには、先に乾燥されたアマチャヅル葉を１０〜２０倍体積のエタノール水溶液（好ましくは、２０〜８０％エタノール水溶液）を抽出した後、１次上層液を回収する。残ったアマチャヅル葉残留浸漬物にまたエタノール水溶液（好ましくは、２０〜８０％エタノール水溶液）を６〜２０倍加え、６５〜９５℃で１〜８時間抽出して２次上層液を得て、１次及び２次上層液を合わせた後、ガーゼを用いて濾過させ、得られた液をまた８００〜１，５００ｘＧで遠心分離して浮遊物を除去する。得られた抽出液を減圧濃縮して４０〜７０ブリックス（Brix）に濃縮した後、得られたアマチャヅル抽出物濃縮液（以下、“ＴＧ１０２２”と称する）をまた高温高圧条件でダムリンの含有量が高まった新規アマチャヅル抽出物濃縮液（以下、“ＴＧ１０２２Ｆ”と称する）を得ることができる。
【００１７】
ダムリン含有量が高まった新規アマチャヅル抽出物（ＴＧ１０２２Ｆ）を得るためには、高温及び高圧の維持が必要であるが、このために商業的に用いられる一般的な高温・高圧または高温高圧殺菌装置が取り付けられた発酵槽及び抽出器を利用できる。
【００１８】
上記新規アマチャヅル抽出物は、温度が高くない超高圧状態でも生成できるが、超高圧状態を維持するために商業的に販売されている超高圧反応器を利用することもできる。例えば、日本東洋高圧社のＤＦＳ−２Ｌなどを使用することができる。上記新規アマチャヅル抽出物を製造するための好ましい温度は４０〜１２５℃であり、好ましい圧力は１．２〜１１００気圧である。反応時間は、好ましくは０．１〜２４時間である。その他のアマチャヅル抽出物でダムリンＡとダムリンＢの含有量を高めることができる方法には、高圧及び高温条件の以外にも超高周波レンジやオーブンを利用することもできる。
【００１９】
ダムリンＡ及びダムリンＢの分離及び分析は、アマチャヅル抽出物を陰イオン交換樹脂が充填されたコラムに通過させるステップ、５〜１５倍の精製水で洗浄するステップ、５〜１５倍の５０％メタノールを通過させて洗浄するステップ、及び５〜１５倍のアセトン、ノルマルヘキサン、エチルアセテート、ノルマルブタノールにステップ別に抽出するステップ、上記分画別抽出物のうち、ＡＭＰＫの活性の高い分画でＨＰＬＣを用いてダムリンＡ及びダムリンＢを分離するステップを経て確認することができる。
【００２０】
本発明のアマチャヅル抽出物に高温及び高圧を加えた新規アマチャヅル抽出物は、ダムリンＡ及びダムリンＢが増加して糖尿病、肥満、体脂肪減少、そして血中中性脂肪及びコレステロールを減少させる効果が格段に向上するが、このような代謝疾患に対する治療、改善、または予防効果のために、ダムリンＡ及びダムリンＢの含有量が乾燥重量当たり各々本発明の新たな組成の新規アマチャヅル抽出物の乾燥固形分のうち、有効指標成分であるダムリンＡの含有量は０．５％から１０％内の範囲であり、有用には０．７％から７％範囲であり、ダムリンＢの含有量は０．３％から８％内の範囲であり、有用には０．５％から６％範囲である。
【００２１】
新規アマチャヅル抽出物または粉末化前の液状形態（固形分に換算してダムリンＡまたはダムリンＢが各々０．５〜１０％及び０．３〜８％以上含まれた）の一日投与量は、適切には固形分を基準にして１ｍｇ〜１００ｇで、他の添加物及び賦形剤と共に投与できる。
【００２２】
本発明の製剤は、ダムリンＡあるいはダムリンＢを有効成分として含有したアマチャヅル抽出物の含有量が全組成物の０．０１％から１００％範囲内で組成できる。
【００２３】
また、本発明の組成物を含んだ食品は、抗肥満、抗糖尿、そして抗高脂血症の効験が阻害されない組成の範囲内で、どの種類の媒介物とも共に使われることができる。
本発明の組成物は、温泉水、濾過された水、蒸溜水、炭酸水、ジュース、ヨーグルト、牛乳、食用油、食品添加剤、アイスクリーム、ハンバーグ、シリアル、クッキー、パン、ビスケット、加工肉、豆乳、禅食、栄養補助剤、加工実、及び果物汁等に添加されることができ、この組成物が含まれた食品には、増量剤、防腐剤、甘味料、彩色剤、湿性乳化剤などが含まれることができる。
【００２４】
疾患の臨床的状態に従って、投与は認められた多様な投与経路を選択することができる。例としては、経口または非経口投与法が使用できる。非経口投与法としては、静脈注射、筋肉注射、皮下脂肪注射、鼻腔を通じた投与法であって、その剤形は固形、半固形、あるいは液質型でも可能である。また、坐薬、クリーム、ジェル、パッチ、膣坐薬、エアロソルなどの形態であって、定量を投入できる全ての形態が含まれる。薬理的組成として伝統的な媒介物及び免疫補強剤などが含まれる。本発明の媒介物として薬理学的に認められた媒介物であれば全て可能であり、賦形剤あるいは安定剤は細胞と哺乳動物に露出時、無毒性を表すものを全て含む。薬理学的に認められた媒介物にはｐＨバッファー水溶液、燐酸、クエン酸、及びアスコルブ酸などを含むことができる。水溶性重合体であるポリビニルピロリドン、グライシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、あるいはライシンのようなアミノ酸、そして葡萄糖、マンノース、デキストリンのような炭水化物も媒介物になることができる。ＥＤＴＡのようなキレート剤、マンニトール、ソルビトール、そして非極性界面活性剤であるツイーン（TWEEN）、ＰＥＧ（polyethylene glycol）、そしてプルロニックス（PLURONICS）も媒介物に含まれることができる。
薬理学的に認められた媒介物と希釈剤には、全ての種類の溶液、分散剤、抗細菌及び抗真菌剤、等張剤、そして吸収遅延剤などを含む。薬理的活性物質のためのこのような製剤の利用法は一般的な技術に記録された通りである。薬理的活性物質と合わない製剤を除外した全ての製剤を含む。この組成に補完的な成分も添加できる。また、本発明の組成物にクロミウム、マンガン、亜鉛、ニアシン、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２などを含むことができ、ここに現在肥満に効能があることと知らされたＨＣＡ（hydroxycitric acid）及びＣＬＡ（conjugated linoleic acid）等も含むことができる。
【００２５】
経口投与時にも、薬理的に認められた無毒性の賦形剤と共に組成できる。賦形剤としては、マンニトール、ポリデキストロース、マルトデキストロース、澱粉、ラクトーズ、ステアル酸マグネシウム、サッカリン、タルク、セルロース、葡萄糖、ゼラチン、砂糖、炭酸マグネシウムなどを含む。このような組成は、溶液、懸濁、タブレット、丸薬、カプセル、粉末形態になることができ、薬理的に認められた無毒性の賦形剤と共に組成できる。
【００２６】
タブレット、丸薬、及びカプセルは次のような製剤を含有できる。トレガカンスガム、アカシア、とうもろこし澱粉、及びゼラチンのような接着剤、燐酸カルシウムのような賦形剤、とうもろこし澱粉、ジャガイモ澱粉、及びアルギン酸のような分解剤、ステアルサンマグネシウムのような潤滑剤、砂糖、ラックトーズのような甘味剤、ペパーミント、ウィントグリーン、そしてチェリーなどから抽出された芳香剤も添加できる。単位容量がカプセル型の場合、上記提示された製剤の他に、液型媒介物も含むことができる。シロップとエリサの場合、有効成分と共に砂糖のような甘味剤と防腐剤としてメチルあるいはプロピルパラベンを含むことができ、着色剤と芳香剤としてチェリーとオレンジ芳香剤も添加できる。単位容量を調剤する時に使われた全ての製剤は純粋で、かつ無毒性でなければならない。このような剤形で、ラックトーズ、砂糖、燐酸カルシウムなどの希釈剤とステアルサンマグネシウムのような潤滑剤、澱粉、ポリビニルピロリドン、アカシアガム、ゼラチン、セルロースのような接合剤も共に組成できる。
【発明の効果】
【００２７】
ダムリンＡ及びダムリンＢの含有量が増加した新規アマチャヅル抽出物は、既存のアマチャヅル抽出物に比べてＡＭＰＫの燐酸化能力増加及び酵素活性化能力を格段に増加させられる。
【００２８】
ＡＭＰＫの下部ターゲットたんぱく質で、かつ脂肪酸生合成の核心酵素であるＡＣＣ（acetyl-CoA carboxylase）の燐酸化を格段に増加させることができるので、この結果、ＡＣＣの酵素活性を低下させる能力も格段に強く表すようになる。したがって、窮極的にはダムリンの含有量を増加させた新規アマチャヅル抽出物（ＴＧ１０２２Ｆ）は、ダムリン含有量を増加させない元のアマチャヅル抽出物（ＴＧ１０２２）に比べて体脂肪合成抑制能力、脂肪酸のベータ酸化促進能力、コレステロール生合成抑制能力、高脂血症治療及び改善効果、肥満の治療及び改善効果があり、インスリン非依存的に細胞葡萄糖運搬体であるＧＬＵＴ４の細胞膜移動能力を格段に増加させるによって、糖尿病患者の血糖を効率の良く低下させることができる。
結果的に、既存のアマチャヅル抽出物に比べて本発明の方法を用いて製造したダムリンＡとダムリンＢの含有量の高い新規アマチャヅル抽出物が肥満、糖尿、高脂血症などの代謝疾患の改善または治療効果が格段に優れている。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】ＡＭＰＫ活性を増大させる有効成分である新規ダマラン系サポニンに分離及び精製されたダムリンＡ成分のＨＰＬＣスペクトル分析結果を示すグラフ
【図２】ＡＭＰＫ活性を増大させる有効成分である新規ダマラン系サポニンに分離及び精製されたダムリンＢ成分のＨＰＬＣスペクトル分析結果を示すグラフ
【図３】Ｌ６筋肉細胞から純粋分離されたダムリンＡ化合物の濃度依存的ＡＭＰＫ（Ａ）及びＡＣＣ（Ｂ）燐酸化能力の増加を示す写真
【図４】Ｌ６筋肉細胞から純粋分離されたダムリンＢの化合物の濃度依存的ＡＭＰＫ（Ａ）及びＡＣＣ（Ｂ）燐酸化能力の増加を示す写真
【図５】ダムリンＡ及びダムリンＢの脂肪酸ベータ酸化増加に対する効果を示グラフ
【図６】ダムリンＡ及びダムリンＢの細胞内の葡萄糖吸収が増加する効果を示すグラフ
【図７】ダムリンＡ及びダムリンＢの含有量が各々０．８９％及び０．６８％に増加した新たな組成の新規アマチャヅル抽出物乾燥物（ＴＧ１０２２Ｆ）の濃度依存的なＡＭＰＫ及びＡＣＣ酵素蛋白質燐酸化能力の増加を示す写真
【図８】ダムリンＡ及びダムリンＢの含有量が各々０．８９％及び０．６８％に増加した新たな組成の新規アマチャヅル抽出物乾燥物（ＴＧ１０２２Ｆ）の投与に従う肥満マウス筋肉（Soleus muscle）でＡＭＰＫ及びＡＣＣ燐酸化増加の変化を示す写真
【図９】アマチャヅル抽出物及びダムリンＡ及びダムリンＢの含有量を増加させた新規アマチャヅル抽出物の製造方法を示すフローチャート
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下に、本発明の実施形態を説述する。なお、下記の実施形態は本発明の実施例に過ぎず、本発明の趣旨から逸脱しない範囲で従来公知の技術を援用して適宜変容可能である。
【実施例１】
【００３１】
アマチャヅル抽出物からＡＭＰＫ活性物質であるダムリンの分離：
乾燥されたアマチャヅル葉５ｋｇを５０lの５０％エタノールに浸漬させた後、９０℃で６時間１次抽出した後、１次上層液を回収した。残ったアマチャヅル葉残留浸漬物にまた５０％エタノール５０lを加え、９０℃で６時間抽出して２次上層液を得た。１次及び２次上層液を合わせた後、ガーゼで濾過して得られた液をまた１，０００ｘｇで遠心分離して浮遊物を除去した。得られた抽出液を減圧濃縮して５０ブリックス（Brix）に濃縮した後、これをＡＭＰＫ活性物質であるダムリンの分離に用いた。
【００３２】
ダムリンの純粋分離のために５０ブリックスに濃縮されたアマチャヅル抽出物をＨＰ−２０陰イオン交換樹脂（Mitsubishi Chemical Corporation）が充填されたコラム（２０ｘ６５ｃｍ）を通過させた後、一次的に１０lの水で洗浄し、その後、１０lの５０％メタノールを通過させて洗浄した後、また１０lのアセトンを通過させてアセトン分画を得て濃縮した。以後、濃縮液に水を１．５l混ぜて懸濁させた後、また１．５lノルマルヘキサンを使用して各３回抽出したヘキサン層（２００ｇ）、１．５lエチルアセテートで各３回抽出したエチルアセテート層（２００ｇ）、そして１．５lのノルマルブタノールで各３回抽出したブタノール層（２００ｇ）を得た。
【００３３】
これらのうち、Ｌ６筋肉細胞（L6 myotube cells）でＡＭＰＫ燐酸化増加に従う活性能力が最も高いブタノール分離層（１００ｇ）をシリカゲル（Merck社）コラム（１５ｘ６５ｃｍ；６３−２００μｍ粒子サイズ）に初期溶媒混合組成割合をクロロホルム：メタノール：水＝５：１：０．１から始めて最終溶媒混合割合がクロロホルム：メタノール：水＝０：１：０．１の濃度勾配で物質を分離して全５個の分画（Ｂ．１−Ｂ．５）を得た。
【００３４】
これら分画をＨＰＬＣ分析を通じて確認した結果、Ｂ．３とＢ．４は含まれた物質が非常に類似してこれら２つの分画を合わせてＢ３４分画を新しく作ったし、これらをまたＯＤＳ−Ａシリカゲル（Merck社）コラム（６．５ｘ６５ｃｍ；１２ｎｍ−１５０μｍ粒子サイズ）に通過させ、物質分離のための溶媒として水とメタノール混合割合が初期には１：１から最終０：１になるように段階的な濃度勾配を使用して６個の分画を得た（Ｂ．３４−１からＢ．３４−６）。
【００３５】
これらのうち、Ｌ６細胞でＡＭＰＫ燐酸化増加に従う活性化能力が最も高いＢ３４−５分画をＨＰＬＣを用いて紫外線測定器（２０５ｍｍ）を使用して再度物質を分離した。このために、セミ−プリパレーティブコラム（semi-preparative column, RP-C18 Package column, 10×250mm, 10 particle size;RS Tech大韓民国）を使用したし、試料の流速は分当り２ｍl、溶媒は初期には０．１％フォルム酸（formic acid）が含まれた７５％メタノールを使用して７５分分離後、また１００％メタノール溶媒で１５分分離したし、この結果、１４ｍｇのダムリンＡ及び１０ｍｇのダムリンＢが各々分離された。
【００３６】
分離されたダムリンＡ及びダムリンＢの精製程度を確認するために、ＨＰＬＣ分析［機器：Gilson 321Pump / GX271 liquid handler、検出器：UV/VIS 155 Detector（205nm）、コラム：Optimapak C18（250x4.6mm、RS tech）、流速：0.8mL/min、溶媒：A-H2O/B-MeCN、溶媒濃度勾配：B20%(0-2分)/20-62%(2-33分)/62-100%(33-39分)/100%(39-48分)/100-20%(48-53分)/20%(53-60分)］を実施した。このために、ダムリンＡは８ｍｇ／ｍlの濃度でメタノールに溶かした後、２０μｌの試料を適切なＨＰＬＣ分析条件で分析用コラムを使用して紫外線測定器で２０５ｎｍで吸光度分析を実施した。ダムリンＢは４ｍｇ／ｍl濃度で５％のＤＭＳＯを含有したメタノールに溶かした後、２０μｌの試料をダムリンＡと同一な条件下で分析を実施した。
その結果、図１及び２に提示されたように、分離精製されたダムリンＡ及びダムリンＢは全て単一ピークに各々検出されたし、これらの純度は少なくとも９７％以上ずつになることを確認した。
【実施例２】
【００３７】
分離精製されたダムリンの構造結晶：
化合物ダムリンの構造を確認するためにＦＡＢ Ｍａｓｓ分析を通じて［Ｍ＋Ｎａ］＋ピークを８０５．４７１７（ｃａｃｌｄ．８０５．４７１４）で観察した。１Ｈ ＮＭＲ、１３Ｃ ＮＭＲ、及びＨＭＢＣ（heteronuclear multiple-bonding correlation）等のスペクトルを測定して分離精製物の構造を確認した。
【００３８】
１Ｈ ＮＭＲスペクトルで７個のアングラーメチルグループ（angular methyl groups）が単一ピークに表れたし、１３Ｃ−ＮＭＲで表れた特徴的なδＣ １２４．４、１２４．７、１３２．３、１４０．５ｐｐｍから二重結合の炭素ピークを確認することができた。また、５．０８と５．２６ｐｐｍのプロトンピークからこの化合物に２個の糖が結合されていることを確認することができた。１Ｈ ＮＭＲスペクトルデータからδＨ３．０２、３．６３、３．７５ｐｐｍで表れたプロトンピークとδＣ６８．３、７４．１、及び９６．８ｐｐｍの炭素ピークからハイドロキシルグループ（hydroxyl group）が３個置換されていることが分かった。また、２番と３番のプロトンカップリング定数から２ハイドロキシルグループが２α、３βのダイイコートリアル（diequatorial）形態で存在することが分かった。各種物理化学的性状及び１３Ｃ ＮＭＲデータを他の文献と比較してダムリンが新規化合物であることを同定したし、この化合物の構造を確証するために、ＨＭＢＣスペクトルを測定した。この結果、１Ｈから１３Ｃ ＮＭＲピークからの連結点からこの化合物は糖が３番位置に２個の結合されたことを確認したし、各位置の１Ｈ、１３Ｃ ＮＭＲ構造確認結果、新規化合物である2α、3β、12β-trihydroxydammar-20(22)-E、24-diene-3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→)-β-D- glucopyranoside]であることを確認し、ダムリンＡと命名した。
【００３９】
ダムリンＢは無定形のパウダーであって、１３Ｃ ＮＭＲとＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳで実測値がm/z783.4905([M+H]+calcd. 783.4895)で、分子式はC42H70O13に同定した。ダムリンＡと化合物２の１Ｈ ａｎｄ １３Ｃ ＮＭＲスペクトルとを比較して同一なアグリコン成分（aglycone moiety）を持つということが分かる。ダムリンＡとダムリンＢの主な差はダムリンＡのアグリコンにある３次構造のＣＨ３グループがダムリンＢ末端ＣＨ２グループに置換されているという点である。そして、Ｃ−２２のオレフィニックメチングループの二重結合がＣ−２０（δＣ１４０．５）の４次構造炭素に置換されている。１Ｈ ＮＭＲスペクトルでダムリンＡのメチル信号（δ１．６３、３Ｈ、ｓ）の代りにダムリンＢに２個の広い単一ピーク（δ４．６９ａｎｄ４．８８、ｅａｃｈ １Ｈ、ｂｒ、ｓ）が表れ、ダムリンＡで見えない典型的なオレフィニックプロトン信号がδ５．２６（１Ｈ、ｂｒ、ｔ ｌｉｋｅ、Ｊ＝６．９Ｈｚ）で現れる。
【００４０】
ダムリンＢとダムリンＡの１３Ｃ ＮＭＲスペクトルを比較して見ると、ダムリンＡのオレフィニック炭素信号（δＣ１２４．７、Ｃ−２２）とメチル信号（δＣ１３．１、Ｃ−２１）がダムリンＢのメチレン信号（δＣ３５．１）と末端メチリンピーク（δＣ１０８．７）に各々代替されている。更に他の差異点に、ダムリンＡの４次構造炭素（δＣ１４０．５、Ｃ−２０）がダムリンＢで低磁場（δＣ１５６．３）側に化学的転移が移動したことを見ることができる。ダムリンＢの加水分解でもやはりＣ−Ｇｌｕｃｏｓｅが生成される。
１Ｈ、１３Ｃ ＮＭＲデータ（表１）と１Ｈ−１Ｈ ＣＯＳＹ、ｇＨＳＱＣ、１Ｈ−１３Ｃ ＨＭＢＣスペクトロスコピックデータのような２次元ＮＭＲ（表１）を通じてダムリンＢの２個の糖を同定した。ダムリンＡの１Ｈ、１３Ｃ ＮＭＲスペクトルでの化学的転移、カップリング定数などを比較してダムリンＢやはりβ−構成形態の２個のグルコシルユニット（glucosyl units）があることが分かる。δ４．４５（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、Ｈ−１’ｏｆ ｇｌｃ’）；δＣ１０５．０（Ｃ−１’ｏｆ ｇｌｃ’）とδ４．７５（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、Ｈ−１"ｏｆ ｇｌｃ"）；δＣ１０４．５（Ｃ−１"ｏｆ ｇｌｃ"）のアノメリックプロトンがこのような結論を裏付ける。２個の糖とアグリコンとの連結部品はＨＭＢＣ結果（表１）を通じて決定した。
上記の結果に基づいて、ダムリンＢの構造を3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→)-β-D-glucopyranosyl]-2α,3β,12β-trihydroxydammara-20, 24-dieneに同定した。＜表１＞はＣＤ３０Ｄ上でダムリンＡ及びダムリンＢの構造分析のための１Ｈ（５００ＭＨｚ）及び１３Ｃ（１００ＭＨｚ）ＮＭＲ結果である。
【００４１】
【表１】
【実施例３】
【００４２】
ダムリンＡ及びダムリンＢのＡＭＰＫとＡＣＣの燐酸化増加効果：
ＡＭＰＫの燐酸化により起こる活性化は、ＡＣＣとＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素に対して燐酸化増加を起こして、この結果、ＡＣＣとＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の活性を阻害する（Henin、１９９５）。これによって、ＡＭＰＫ燐酸化により脂肪酸生合成は抑制されるようになり、ミトコンドリアでベータ酸化が増加し、肝組織では脂肪及びコレステロールの合成が阻害される。ＡＭＰＫの活性はアミノ酸１７２番のスレオニン残基に燐酸化が増加したか否かにより判断できる。
【００４３】
ＡＣＣは肝と筋肉組織で脂質代謝を調節する重要な酵素である。この酵素はアセチル−ＣｏＡをカルボキシル化させてマロニル−ＣｏＡを生成するようにする。マロニル−ＣｏＡはミトコンドリア内で脂肪酸のベータ酸化を調節する最も重要な因子であって、マロニル−ＣｏＡの濃度が増加すれば、ミトコンドリア膜のＣＰＴ−１（carnitine palmitoyl-CoA transferase）の活性が減少して脂肪酸のベータ酸化が抑制されるようになり、反対にマロニル−ＣｏＡ濃度が減少すれば、ベータ酸化は増加して体脂肪減少が促進される。ＡＣＣはＡＭＰＫ活性の下位ターゲットたんぱく質であって、ＡＭＰＫの活性化はＡＣＣを燐酸化してＡＣＣ酵素の不活性化を促進してマロニル−ＣｏＡの濃度が減少するようになって、この結果、ミトコンドリア膜のＣＰＴ−１の活性が増加するので脂肪酸のベータ酸化が増加するようになる。
【００４４】
したがって、単一物質に分離されたダムリンＡを１０、３０、６０ug／ｍl濃度に、ダムリンＢは１、５、１０ug／ｍl濃度に各々分化されたＬ６筋肉細胞（L6 myotube cells）に２時間ずつ処理した後、ＡＭＰＫ αサブユニットのスレオニン−１７２残基及びＡＣＣ酵素蛋白質の７９番目のセリン残基に対する燐酸化増加程度をファンなど（非特許文献３）の方法によってウエスタンブロット分析を通じて確認した。
この結果、ダムリンＡ及びダムリンＢの処理によりＬ６筋肉細胞内のＡＭＰＫ及びＡＣＣの燐酸化が対照群に比べて濃度依存的に各々増加されることを確認したし（図３及び４）、ダムリンＡ及びダムリンＢ両方ともＡＭＰＫの燐酸化を起こして活性化され、ＡＣＣは燐酸化されて活性阻害を起こす有効物質であることを確認することができた。
【実施例４】
【００４５】
ダムリンＡ及びダムリンＢの脂肪酸ベータ酸化促進を通じた脂肪減少効果：
ＡＭＰＫを活性化させれば、ＡＣＣの活性が減少するようになって、ミトコンドリア内のマロニル−ＣｏＡの濃度が減少するようになる。これによって、ミトコンドリア内に脂肪酸流入が増加してベータ酸化が増加するようになるので、体脂肪減少に従う肥満抑制効果が現れるようになる。培養されたＬ６筋肉細胞に純粋分離したダムリンＡとダムリンＢを処理してファンなどの方法（非特許文献４）に従い脂肪酸のベータ酸化増進効果を調べた。
【００４６】
その結果、ダムリンＡ（３０μｇ／ｍl）及びダムリンＢ（５μｇ／ｍl）により各々脂肪酸のベータ酸化が各々１．８倍と２．６倍増加されることが観察された（図５）。
また、ダムリンＡ及びダムリンＢは体脂肪減少促進を通じた肥満抑制または治療効能が高い物質であることを確認した。
【実施例５】
【００４７】
ダムリンＡ及びダムリンＢの細胞内葡萄糖吸収促進効果：
ＡＭＰＫの活性化はまた細胞内に葡萄糖吸収が増加を起こして血糖低下効果を表すことがよく知られている（非特許文献３、５〜９）。したがって、ダムリンＡとダムリンＢをＬ６筋肉細胞に処理して細胞内葡萄糖吸収能力に対する影響を調べた。
【００４８】
培養されたＬ６筋肉細胞をファンなどの方法（非特許文献４）に従い高濃度の葡萄糖と共に、細胞内では分解が起こらない放射線同位元素である2-DG(2-deoxy-[3H]D-glucose)を添加した後、ダムリンＡ（３０μｇ／ｍl）とダムリンＢ（５μｇ／ｍl）による細胞内の２―ＤＧ吸収促進程度を調べた。この結果、ダムリンＡを処理した細胞では糖吸収能力が平均的に４２％、そしてダムリンＢが処理された細胞では７９％程度の糖吸収が増加した（図６）。この結果、ダムリンＡ及びダムリンＢは全て血糖低下を通じた抗糖尿効果が優れることを確認した。
【実施例６】
【００４９】
高温及び高圧処理によりダムリン含有量が増加したアマチャヅル抽出物の製造：
上記実施形態４及び５で確認されたように、新規化合物であるダムリンＡとダムリンＢはＡＭＰＫ活性化及びこれに従うＡＣＣ活性阻害を起こす有効物質と明かされた。しかしながら、単純アマチャヅル抽出物（ＴＧ１０２２）にはダムリンＡ及びダムリンＢの含有量が有効効果を表す程度に高いほうでなかった。したがって、ダムリンＡ及びダムリンＢの含有量を増加させた新規組成の新たなアマチャヅル抽出物（ＴＧ１０２２Ｆ）を製造したし、上記新規アマチャヅル抽出物（ＴＧ１０２２Ｆ）が強力なＡＭＰＫ活性化能力を有することを確認することができた。
【００５０】
上記新規アマチャヅル抽出物濃縮液（ＴＧ１０２２Ｆ）は、単純常温常圧アマチャヅルエタノール抽出物（ＴＧ１０２２）に高温及び高圧反応あるいは超高圧反応などを通じて製造した。
【００５１】
高温高圧反応は一般的な高温高圧滅菌器あるいは超高圧反応器（ＤＦＳ−２Ｌ、東洋高圧、日本）を使用してアマチャヅルの単純抽出物濃縮液３０ｍlに高温高圧条件を維持するようにした。
【００５２】
新規アマチャヅル抽出物濃縮液（ＴＧ１０２２Ｆ）を乾燥させて得られた乾燥物内のダムリンＡ及びダムリンＢの含有量はＨＰＬＣを使用して分析した。この時、図１に表れた純度を持つ分離されたダムリンＡ及びダムリンＢを標準品に使用して濃度別定量標準曲線を作成して試料の各ピーク面積比から含有量を計算した。この結果、高温及び高圧あるいは時間を異にした条件で新規アマチャヅル抽出物濃縮液（ＴＧ１０２２Ｆ）でダムリンＡとダムリンＢの含有量は各々温度、圧力、時間などに比例して増加した（表２）。したがって、本発明ではアマチャヅル抽出物濃縮液を高温及び高圧を共に使用した処理条件で加工すれば、処理時間に比例してダムリンＡ及びダムリンＢの含有量が格段に増加した新たなアマチャヅル抽出物濃縮液（ＴＧ１０２２Ｆ）を製造できる。＜表２＞は高温、高圧条件でアマチャヅル抽出物に含まれたダムリンの含有量増加を表す表である。
【００５３】
【表２】
【実施例７】
【００５４】
ダムリン含有量が増加した新規アマチャヅル抽出物のＡＭＰＫ及びＡＣＣの燐酸化増加に対する効果：
実施形態６の方法により製造されたダムリンＡ及びダムリンＢの含有量を各々０．８９％及び０．６８％に増加させた新たな組成のアマチャヅル抽出物（ＴＧ１０２２Ｆ）のＡＭＰＫ信号伝達系の活性化増進能力に対する濃度依存性をＬ６筋肉細胞で調べた。
その結果、図７に表れたように、単純なアマチャヅル抽出物であるＴＧ１０２２は１２０ug／ｍlの濃度で処理しても非処理対照群と類似するように全くＡＭＰＫ及びＡＣＣの燐酸化を起こすことができなかった。しかしながら、ダムリンＡ及びダムリンＢの含有量が各々０．８９％及び０．６８％に増加するように製造されたＴＧ１０２２Ｆは、６０ug／ｍlの処理濃度でもＡＭＰＫ及びＡＣＣの燐酸化を強く促進させたし、９０ug／ｍl及び１２０ug／ｍlに処理濃度を増加させた時、濃度依存的にＡＭＰＫ及びＡＣＣの燐酸化を増加させた。特に、高温・高圧処理しない単純なアマチャヅル酒精抽出物濃縮液であるＴＧ１０２２（ダムリンＡ含有量０．３７％、ダムリンＢ含有量０．２８％）と１２１℃、１．２気圧、１時間反応条件で高温・高圧処理したＴＧ１０２２Ｆ（ダムリンＡ含有量０．８９％、ダムリンＢ含有量０．６８％）を同一な濃度に処理し、これらの効果を比較した結果、ダムリン含有量を増加させたＴＧ１０２２ＦのＡＭＰＫ及びＡＣＣの燐酸化能力がダムリン含有量が増加されないＴＧ１０２２に比べて格段に優れることを確認した。
【実施例８】
【００５５】
肥満動物モデルにおける新規アマチャヅル抽出物を用いた体重減少効果：
レプチン遺伝子突然変異によって肥満、高血糖、そしてインスリン抵抗性動物モデルとして使われるｏｂ／ｏｂマウスを使用してダムリンが増加したアマチャヅル抽出物の抗肥満効果を調べた。このために実施形態６の方法によりダムリンＡ及びダムリンＢの含有量が各々０．８９％及び０．６８％に増加した新規アマチャヅル抽出物（ＴＧ１０２２Ｆ）を一日１５０ｍｇ／ｋｇと３００ｍｇ／ｋｇで各々毎日８週間経口投与したし、この時、対照群としては生理食塩水を投与したグループを使用したし、単純アマチャヅル抽出物であるＴＧ１０２２を３００ｍｇ／ｋｇとも比較した。
【００５６】
この際、動物は各投与グループ当たり雄８頭ずつを使用した。得られた結果として表５に表したように、ＴＧ１０２２Ｆ（ダムリンＡ含有量０．８９％、ダムリンＢ含有量０．６８％）を一日１５０ｍｇ／ｋｇと３００ｍｇ／ｋｇで投与したグループでは８週後に体重が生理食塩水対照群に比べて２．９５ｇ及び４．５８ｇ減少した（表３）。しかしながら、この時ＴＧ１０２２を３００ｍｇ／ｋｇで投与したグループでは生理食塩水対照群に比較時、留意性ある体重変化が表れなかった。一方、全ての投与グループの間に食餌摂取量の変化はないことと表れて、ダムリンＡ及びダムリンＢの含有量が増加したＴＧ１０２２Ｆによる体重減少効果は食餌摂取量の減少によるものではないことが分かった（表３）。
【００５７】
表３は、肥満マウス（ｏｂ／ｏｂ）でダムリンＡ及びダムリンＢの含有量が増加した新たな組成の新規アマチャヅル抽出物ＴＧ１０２２Ｆ（ダムリンＡ含有量０．８９％、ダムリンＢ含有量０．６８％）投与による体重減少効果を表す表である。
【００５８】
【表３】
【実施例９】
【００５９】
新規アマチャヅル抽出物の動物筋肉におけるＡＭＰＫ及びＡＣＣ燐酸化増加効果：
上記実施例８で得られた体重減少効果がＡＭＰＫ及びＡＣＣの燐酸化増加に従う結果なのかを確認するために、ＴＧ１０２２Ｆ（ダムリンＡ及びダムリンＢの含有量が各々０．８９％及び０．６８％に増加した抽出物）を投与したマウスでふくらはぎ筋肉を分離した後、ウエスタンブロット方法を用いてＡＭＰＫ及びＡＣＣの燐酸化程度を確認した。
その結果、図８に示した結果のように、生理食塩水対照群及び単純アマチャヅル抽出物であるＴＧ１０２２に比べてダムリンＡ及びダムリンＢの含有量が増加したＴＧ１０２２Ｆを投与したグループでＡＭＰＫ及びＡＣＣの燐酸化が強くなされていることを確認することができた。この結果、上記実施形態８に表れたダムリン含有量が増加したＴＧ１０２２Ｆの体重減少効果はＴＧ１０２２Ｆが動物筋肉のＡＭＰＫ活性化及びこれに伴うＡＣＣの不活性化を効率的に起こして表れた結果であることを再確認した。
【実施例１０】
【００６０】
新規アマチャヅル抽出物の人体体重及び腰回り減少に対する効果：
年齢が２１歳から７１歳の間の成人男子及び女子に単純なアマチャヅル抽出物であるＴＧ１０２２とダムリンＡ及びダムリンＢの含有量が各々０．８９％及び０．６８％に増加したＴＧ１０２２Ｆを毎日各々３００ｍｇずつ１２週間経口投与した。この際、ＴＧ１０２２は男女各々１０人を対象に経口投与し、ＴＧ１０２２Ｆも男女各々１０人を対象に経口投与した。体重は体重計を用いて測定したし、腰回りは１０番目のあばら骨の下と掌骨の間の中間部位の回りを測定した。
【００６１】
この結果、表４に表れたように、ダムリン含有量が増加したＴＧ１０２２Ｆ投与群では男と女の試験群全てで体重は各々平均４．３ｋｇと２．１ｋｇずつ減少したし、腰回りは各々平均５．４ｃｍ及び５．８ｃｍずつ減少した。一方、ＴＧ１０２２を投与した男子と女子の試験群で体重は平均０．６ｋｇ及び０．４ｋｇずつ各々減少したし、腰回りは平均０．７ｃｍと０．８ｃｍずつ減少した（表７）。この結果に従い、ダムリンＡ及びダムリンＢの含有量を増加させた新たな組成のＴＧ１０２２Ｆは単純アマチャヅル抽出物であるＴＧ１０２２に比べて格段に優れる体重及び体脂肪減少効果があることを確認した。
表４は、人体でダムリンＡ及びダムリンＢの含有量が増加した新規アマチャヅル抽出物ＴＧ１０２２Ｆの体重及び腰回り減少効果を表す表である。
【００６２】
【表４】
【実施例１１】
【００６３】
新規アマチャヅル抽出物の血中脂質減少に対する効果：
新規アマチャヅル抽出物の血中脂質減少に対する効果を確認するために、上記実施形態１０で実施された被試験者の血中中性脂肪とコレステロール含有量の変化を調べた。
【００６４】
その結果、表８に表れたように、ダムリン含有量を増加させたＴＧ１０２２Ｆ投与群では男と女の試験群で中性脂質は各々平均２３．７ｍｇ／ｄｌと２８．４ｍｇ／ｄｌずつ減少したし、総コレステロールは各々平均２６．３ｍｇ／ｄｌと２１．５ｍｇ／ｄｌずつ減少した。一方、単純アマチャヅル抽出物であるＴＧ１０２２を投与した男子と女子の試験群で中性脂質は各々平均３．７ｍｇ／ｄｌと４．８ｍｇ／ｄｌずつ減少したし、総コレステロールは各々平均３．１ｍｇ／ｄｌと２．５ｍｇ／ｄｌずつ減少した（表８）。
この結果に従い、ダムリンＡ及びダムリンＢの含有量を増加させた新規アマチャヅル抽出物であるＴＧ１０２２Ｆは単純アマチャヅル抽出物であるＴＧ１０２２に比べて血中中性脂質及び総コレステロールに対する減少効果が格段に優れることを確認した。
表５は、人体でダムリンＡ及びダムリンＢの含有量が増加した新たな組成の新規アマチャヅル抽出物ＴＧ１０２２Ｆ（ダムリンＡ含有量０．８９％、ダムリンＢ含有量０．６８％）の血中脂質減少効果を表す表である。
【００６５】
【表５】
【実施例１２】
【００６６】
新規アマチャヅル抽出物の血糖減少効果：
次に新規アマチャヅル抽出物の血糖減少効果を測定するために、上記実施形態１０で実施された被試験者の空腹血糖変化を調べた。
【００６７】
この結果は表８に表れたように、ダムリンＡ及びダムリンＢの含有量を各々ダムリンＡ含有量０．８９％、ダムリンＢ含有量０．６８％に増加させたＴＧ１０２２Ｆ投与群では、男子と女子の試験群で空腹血糖は各々平均２６．４ｍｇ／ｄｌと２１．５ｍｇ／ｄｌずつ減少した。一方、単純アマチャヅル抽出物であるＴＧ１０２２を投与した男子と女子の試験群で空腹血糖は各々平均３．１ｍｇ／ｄｌと２．５ｍｇ／ｄｌずつ減少した。この結果に従い、ダムリンＡ及びダムリンＢの含有量が増加した新規アマチャヅル抽出物ＴＧ１０２２Ｆは単純なアマチャヅル抽出物であるＴＧ１０２２に比べて血糖減少効果が格段に優れることを確認した。
表６は、人体でダムリンＡ及びダムリンＢの含有量が増加した新規アマチャヅル抽出物ＴＧ１０２２Ｆの血糖減少効果を表す表である。
【００６８】
【表６】
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明によると、アマチャヅル抽出されるＡＭＰＫ活性化物質のダムリンＡ及びダムリンＢにより、肥満、糖尿、高脂血症を含む代謝疾患の改善及び治療に有効であり、産業上有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アマチャヅルの抽出物を製造する方法であって、
アマチャヅル葉エタノール抽出物濃縮液に、４０〜１２５℃、１．２〜１１００気圧の高温高圧または高圧反応を、０．１〜２４時間処理して、
アマチャヅル葉抽出物濃縮液の乾燥粉末におけるダムリンＡの含有量を０．７〜７％（ｗ／ｗ）、ダムリンＢの含有量を０．５〜６％（ｗ／ｗ）に増加させる
ことを特徴とするアマチャヅル抽出物の製造方法。
【請求項２】
肥満、糖尿、高脂血症を示す代謝疾患の改善、治療のためのアマチャヅル抽出物であって、
アマチャヅル葉エタノール抽出物濃縮液を、４０〜１２５℃、１．２〜１１００気圧、０．１〜２４時間、高温高圧反応させて製造される抽出物であって、
有効成分として、ダムリンＡを０．７〜７％（ｗ／ｗ）、ダムリンＢを０．５〜６％（ｗ／ｗ）含有する
ことを特徴とする代謝疾患改善治療用アマチャヅル抽出物。
【請求項３】
アマチャヅル抽出物を含む機能食品であって、
請求項２に記載のアマチャヅル抽出物を含む
ことを特徴とする代謝疾患改善用機能食品。
【請求項４】
機能食品が、温泉水、濾過水、蒸溜水、炭酸水、ジュース、ヨーグルト、牛乳、食用油のいずれかを含む
請求項３に記載の代謝疾患改善用機能食品。
【請求項５】
アマチャヅル抽出物を含む薬理組成物であって、
請求項２のアマチャヅル抽出物を含む
ことを特徴とする代謝疾患改善治療用薬理組成物。
【請求項６】
薬理組成物が、AMP-activated protein kinase（ＡＭＰＫ）酵素の活性を増大させる
請求項５に記載の代謝疾患改善治療用薬理組成物。
【請求項７】
下式の構造のダムリンＡまたはダムリンＢの化合物のうち、少なくとも一方を含有する
請求項２ないし６のいずれかに記載の代謝疾患改善治療用アマチャヅル抽出物、代謝疾患改善用機能食品、代謝疾患改善治療用薬理組成物。
（化１）
【請求項１】
アマチャヅルの抽出物を製造する方法であって、
アマチャヅル葉エタノール抽出物濃縮液に、４０〜１２５℃、１．２〜１１００気圧の高温高圧または高圧反応を、０．１〜２４時間処理して、
アマチャヅル葉抽出物濃縮液の乾燥粉末におけるダムリンＡの含有量を０．７〜７％（ｗ／ｗ）、ダムリンＢの含有量を０．５〜６％（ｗ／ｗ）に増加させる
ことを特徴とするアマチャヅル抽出物の製造方法。
【請求項２】
肥満、糖尿、高脂血症を示す代謝疾患の改善、治療のためのアマチャヅル抽出物であって、
アマチャヅル葉エタノール抽出物濃縮液を、４０〜１２５℃、１．２〜１１００気圧、０．１〜２４時間、高温高圧反応させて製造される抽出物であって、
有効成分として、ダムリンＡを０．７〜７％（ｗ／ｗ）、ダムリンＢを０．５〜６％（ｗ／ｗ）含有する
ことを特徴とする代謝疾患改善治療用アマチャヅル抽出物。
【請求項３】
アマチャヅル抽出物を含む機能食品であって、
請求項２に記載のアマチャヅル抽出物を含む
ことを特徴とする代謝疾患改善用機能食品。
【請求項４】
機能食品が、温泉水、濾過水、蒸溜水、炭酸水、ジュース、ヨーグルト、牛乳、食用油のいずれかを含む
請求項３に記載の代謝疾患改善用機能食品。
【請求項５】
アマチャヅル抽出物を含む薬理組成物であって、
請求項２のアマチャヅル抽出物を含む
ことを特徴とする代謝疾患改善治療用薬理組成物。
【請求項６】
薬理組成物が、AMP-activated protein kinase（ＡＭＰＫ）酵素の活性を増大させる
請求項５に記載の代謝疾患改善治療用薬理組成物。
【請求項７】
下式の構造のダムリンＡまたはダムリンＢの化合物のうち、少なくとも一方を含有する
請求項２ないし６のいずれかに記載の代謝疾患改善治療用アマチャヅル抽出物、代謝疾患改善用機能食品、代謝疾患改善治療用薬理組成物。
（化１）
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２０１１−２０９９５（Ｐ２０１１−２０９９５Ａ）
【公開日】平成２３年２月３日（２０１１．２．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１５０２０（Ｐ２０１０−１５０２０）
【出願日】平成２２年１月２７日（２０１０．１．２７）
【出願人】（５１００２４９９４）ティ ジー バイオテク コーポレート リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年２月３日（２０１１．２．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１月２７日（２０１０．１．２７）
【出願人】（５１００２４９９４）ティ ジー バイオテク コーポレート リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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