アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤組成物及びその製造方法
【課題】ＡＣＥ阻害活性に優れ、抗高血圧効果を奏し、副作用・毒性などの安全性の面において問題がなく、食品に添加した場合に官能評価に優れ、調製方法が複雑でなく、大量生産が可能なＡＣＥ阻害剤組成物等を提供すること。
【解決手段】粉砕した燕麦に有機溶媒を用いて脱脂処理を施す粉末燕麦脱脂ステップ、（ａ）脱脂燕麦粉末をアミラーゼ処理した後、エタノールを加えてタンパク質画分を沈降させるタンパク質分画ステップ；又は（ｂ）脱脂燕麦粉末にアルカリ塩又はアルカリ土類塩溶液を加えてホモゲナイズし、溶出画分に脱塩処理を施すタンパク質分画ステップ；及び、燕麦タンパク質画分をペプシン及びトリプシンを用いて分解して、ＶＩＥＰＱＧＬ、ＮＩＶＱＭＳＡＴＲ、ＶＱＶＶＮＮＮＧＱＴＶＦ、ＩＶＰＱＨＦのアミノ酸配列を有するペプチドを含むペプチド画分を得る燕麦タンパク質分解ステップを順次行う。
【解決手段】粉砕した燕麦に有機溶媒を用いて脱脂処理を施す粉末燕麦脱脂ステップ、（ａ）脱脂燕麦粉末をアミラーゼ処理した後、エタノールを加えてタンパク質画分を沈降させるタンパク質分画ステップ；又は（ｂ）脱脂燕麦粉末にアルカリ塩又はアルカリ土類塩溶液を加えてホモゲナイズし、溶出画分に脱塩処理を施すタンパク質分画ステップ；及び、燕麦タンパク質画分をペプシン及びトリプシンを用いて分解して、ＶＩＥＰＱＧＬ、ＮＩＶＱＭＳＡＴＲ、ＶＱＶＶＮＮＮＧＱＴＶＦ、ＩＶＰＱＨＦのアミノ酸配列を有するペプチドを含むペプチド画分を得る燕麦タンパク質分解ステップを順次行う。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、燕麦タンパク質画分又は燕麦タンパク質由来のペプチド画分を含むアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤組成物（以下、「ＡＣＥ阻害剤組成物」という場合がある）、該ＡＣＥ阻害剤組成物の製造方法、及び該ＡＣＥ阻害剤組成物を配合した食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）は、血圧の調整においてレニン・アンジオテンシン系に作用する酵素である。レニン・アンジオテンシン系では、肝臓から分泌されるアンジオテンシノーゲンが、腎臓から分泌されるレニンによってアンジオテンシンIに変換される。アンジオテンシンIは更にＡＣＥによってアンジオテンシンIIに変換されるが、このアンジオテンシンIIは血管の収縮、血管透過性の増大などの作用があり、血圧を上昇させる。また、血管拡張作用により血圧降下作用を示すブラジキニンは、ＡＣＥにより分解されるため、このブラジキニンの分解によっても結果的に血圧が上昇する。ＡＣＥ阻害活性をもつ物質は、上記のＡＣＥの作用を阻害することから、有効な血圧降下作用をもつ成分として着目されている。
【０００３】
近年、メタボリック症候群に代表される成人病の増加により、血圧降下作用をもつ物質が着目されているが、高血圧に関連する疾病は特に食事による影響が強いと言われており、高血圧の予防効果を持つ食品素材やその抽出物に対して期待がもたれている。食品素材に含まれているＡＣＥ阻害物質としては、特に食品素材中のタンパク質の酵素分解物であるペプチドについて、ＡＣＥ阻害活性があることが報告されている。例えば、ゼラチンのコラゲナーゼ消化物（例えば、特許文献１参照）、牛由来カゼインのトリプシン分解物（参考文献２〜５参照）、ゴマの加水分解物（例えば、特許文献６参照）、トウモロコシ蛋白質のサーモライシン分解物（例えば、特許文献７参照）、海苔やヒジキのペプシン分解物（例えば、特許文献８，９参照）、米、小麦、大麦、オート麦、ゴマ等に由来する蛋白のサーモライシン分解物（例えば、特許文献１０参照）、植物種子等の加水分解物（例えば、特許文献１１参照）等、或いは、いちじく樹木もしくは果肉の固液分離液を分別して得られるペプチド（例えば、特許文献１２参照）等、多数の報告がなされている。これらのペプチドがもつＡＣＥ阻害活性効果は、ＡＣＥ阻害活性に対する強さに違いはあるものの、それぞれが特定のアミノ酸配列を持つペプチド類がもたらす効果である。
【０００４】
【特許文献１】特開昭５２−１４８６３号公報
【特許文献２】特開昭５８−１０９４２５号公報
【特許文献３】特開昭５９−４４３２３号公報
【特許文献４】特開昭５９−４４３２４号公報
【特許文献５】特開昭６１−３６２２７号公報
【特許文献６】特開平８−２３１５８８号公報
【特許文献７】特開平６−８７８８６号公報
【特許文献８】特開平１０−３６３９１号公報
【特許文献９】特開平１０−１７５９９７号公報
【特許文献１０】特表２００６−５２０８０９号公報
【特許文献１１】特表２００６−５１２３７１号公報
【特許文献１２】特開平２−２８２３９４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
前述のような食品素材由来のＡＣＥ阻害活性をもつペプチドは、副作用、毒性などの安全性の面において問題が少なく、通常の食品として摂取できるという利点があるが、原料の値段が高い、調製方法が複雑である、大量生産が難しい、体内に摂取した際に消化酵素によって分解され効果が出にくい場合がある、ＡＣＥ阻害活性を持つペプチドは苦味を伴うことが多く、食用として扱うのに難しい、等といった様々な問題を抱えている。本発明の課題は、ＡＣＥ阻害活性に優れ、抗高血圧効果を奏し、副作用・毒性などの安全性の面において問題がなく、食品に添加した場合に官能評価に優れ、調製方法が複雑でなく、大量生産が可能なＡＣＥ阻害剤組成物や、該ＡＣＥ阻害剤組成物を有効成分とする抗高血圧薬剤や、該ＡＣＥ阻害剤組成物を配合した機能性食品等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行ない、本発明者らが独自に開発した検索手法により、タンパク質データバンクに登録されている食品タンパク質のアミノ酸配列の検索と統計処理を行なった結果、主に飼料用として使用され非常に安価である燕麦のグロブリンタンパク質に強いＡＣＥ阻害活性を示す可能性のあるアミノ酸配列を有するペプチド画分の存在を予測した。５５１個のアミノ酸から構成され、分子サイズは約６１ｋＤａの燕麦グロブリンタンパク質のアミノ酸配列（配列番号５）を図３に示す。そして、図３に示す燕麦グロブリンタンパク質をペプシン及びキモトリプシンで消化した場合、図４のようなペプチドが生成されることをＢＩＯＰＥＰ解析（http://www.uwm.edu.pl/biochemia/）によって確認した。それら生成ペプチド画分は、ペプシンやトリプシンといったヒトの消化酵素による基質認識部位を持っていないことから、体内に摂取されてから胃や小腸内で消化を受け、失活することはないと判断された。そこで、燕麦タンパク質画分や該タンパク質由来のペプチド画分について、ＡＣＥ阻害活性、抗高血圧作用、副作用・毒性などの安全性、食品に添加した場合の官能評価について検討し、優れた効果を奏することを確認し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち本発明は、（１）粉砕した燕麦に有機溶媒を用いて脱脂処理を施す粉末燕麦脱脂ステップ、及び、（ａ）脱脂燕麦粉末をアミラーゼ処理した後、エタノールを加えてタンパク質画分を沈降させるタンパク質分画ステップ又は（ｂ）脱脂燕麦粉末にアルカリ塩又はアルカリ土類塩溶液を加えてホモゲナイズし、溶出画分に脱塩処理を施すタンパク質分画ステップ、のタンパク質分画ステップを順次備えたことを特徴とする燕麦タンパク質画分を含むアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤組成物の製造方法や、（２）粉砕した燕麦に有機溶媒を用いて脱脂処理を施す粉末燕麦脱脂ステップ、（ａ）脱脂燕麦粉末をアミラーゼ処理した後、エタノールを加えてタンパク質画分を沈降させるタンパク質分画ステップ又は（ｂ）脱脂燕麦粉末にアルカリ塩又はアルカリ土類塩溶液を加えてホモゲナイズし、溶出画分に脱塩処理を施すタンパク質分画ステップ、のタンパク質分画ステップ、及び燕麦タンパク質画分をペプシン及びトリプシンを用いて分解して、ＶＩＥＰＱＧＬ、ＮＩＶＱＭＳＡＴＲ、ＶＱＶＶＮＮＮＧＱＴＶＦ、ＩＶＰＱＨＦのアミノ酸配列を有するペプチドを含むペプチド画分を得る燕麦タンパク質分解ステップを順次備えたことを特徴とする燕麦タンパク質由来のペプチド画分を含むアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤組成物の製造方法や、（３）有機溶媒として、ヘキサン又はアセトンを用いることを特徴とする前記（１）又は（２）記載のＡＣＥ阻害剤組成物の製造方法や、（４）アルカリ塩又はアルカリ土類塩溶液として、塩化ナトリウム又は塩化カルシウムを用いることを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれか記載のＡＣＥ阻害剤組成物の製造方法や、（５）燕麦タンパク質分解ステップにおいて、ペプシン及びトリプシン分解処理後に、透析膜もしくは限外濾過膜を用いて分子篩処理を施してペプチド画分を得ることを特徴とする前記（２）〜（４）のいずれか記載のＡＣＥ阻害剤組成物の製造方法に関する。
【０００８】
また本発明は、（６）前記（１）、（３）又は（４）記載の製造方法により得られる燕麦タンパク質画分を含有するアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤組成物や、（７）前記（２）〜（５）の記載の製造方法により得られるＶＩＥＰＱＧＬ、ＮＩＶＱＭＳＡＴＲ、ＶＱＶＶＮＮＮＧＱＴＶＦ、ＩＶＰＱＨＦのアミノ酸配列を有するペプチドを含むペプチド画分を含有するアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤組成物に関する。
【０００９】
さらに本発明は、（８）ＶＩＥＰＱＧＬ、ＮＩＶＱＭＳＡＴＲ、ＶＱＶＶＮＮＮＧＱＴＶＦ、又はＩＶＰＱＨＦのアミノ酸配列を有するペプチドや、（９）ＶＩＥＰＱＧＬ、ＮＩＶＱＭＳＡＴＲ、ＶＱＶＶＮＮＮＧＱＴＶＦ、又はＩＶＰＱＨＦのアミノ酸配列を有するペプチドからなるアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤や、（１０）前記（６）又は（７）記載のアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤組成物を有効成分とする抗高血圧薬剤や、（１１）前記（９）記載のアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤を有効成分とする抗高血圧薬剤や、（１２）前記（６）又は（７）記載のアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤組成物を配合した食品や、（１３）前記（９）記載のアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤を配合した食品に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤組成物の製造方法によれば、食品レベルでの安全性、強いＡＣＥ阻害活性、優れた抗高血圧作用を有する燕麦タンパク質画分や燕麦タンパク質由来のペプチド画分を、燕麦より安価で、簡易に製造することができ、かつ、大量生産を可能とすることができる。かかるＡＣＥ阻害剤組成物を含む抗高血圧薬剤や食品は、飲食に適した苦味等のない風味を有するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の燕麦タンパク質画分を含むＡＣＥ阻害剤組成物の製造方法としては、粉砕した燕麦に有機溶媒を用いて脱脂処理を施す粉末燕麦脱脂ステップ、及び、（ａ）脱脂燕麦粉末をアミラーゼ処理した後、エタノールを加えてタンパク質画分を沈降させるタンパク質分画ステップ；又は（ｂ）脱脂燕麦粉末にアルカリ塩又はアルカリ土類塩溶液を加えてホモゲナイズし、溶出画分に脱塩処理を施すタンパク質分画ステップ；を順次備えたものであれば特に制限されるものではなく、また、本発明の燕麦タンパク質由来のペプチド画分を含むＡＣＥ阻害剤組成物の製造方法としては、粉砕した燕麦に有機溶媒を用いて脱脂処理を施す粉末燕麦脱脂ステップ、（ａ）脱脂燕麦粉末をアミラーゼ処理した後、エタノールを加えてタンパク質画分を沈降させるタンパク質分画ステップ；又は（ｂ）脱脂燕麦粉末にアルカリ塩又はアルカリ土類塩溶液を加えてホモゲナイズし、溶出画分に脱塩処理を施すタンパク質分画ステップ；及び、燕麦タンパク質画分をペプシン及びトリプシンを用いて分解して、ＶＩＥＰＱＧＬ（Val-Ile-Glu-Pro-Gln-Gly-Leu）（配列番号１）、ＮＩＶＱＭＳＡＴＲ（Asn-Ile-Val-Gln-Met-Ser-Ala-Thr-Arg）（配列番号２）、ＶＱＶＶＮＮＮＧＱＴＶＦ（Val-Gln-Val-Val-Asn-Asn-Asn-Gly-Gln-Thr-Val-Phe）（配列番号３）、ＩＶＰＱＨＦ（Ile-Val-Pro-Gln-His-Phe）（配列番号４）のアミノ酸配列を有するペプチドを含むペプチド画分を得る燕麦タンパク質分解ステップを順次備えたものであれば特に制限されるものではなく、上記燕麦（学名：Avena sativa）はイネ科ウシノケグサ亜科カラスムギ属に属する１年生または越年生草本の穀物であり、別名、オートムギ、オート、マカラスムギともいい、また、同属の野生種と同名でカラスムギとも呼ばれ、主成分は澱粉であるが、穀類中ではタンパク質、脂質、食物繊維も多く、アミノ酸組成はリシンが第１制限アミノ酸（必須アミノ酸のうち最も不足する）であるが、アミノ酸スコアは比較的高い。
【００１２】
上記粉末燕麦脱脂ステップにおいて、原料燕麦を、摩擦式、せん断式、衝撃式などの公知の粉砕機を用いて粉砕することにより、粉砕燕麦を得ることができる。粉砕の程度は、平均粒径が４５０μｍ以下（４０メッシュパス）、特に３００μｍ以下（６０メッシュパス）となるように粉砕することが好ましい。次に粉砕した燕麦にアルコール類、ヘキサン、アセトン等の有機溶媒を加え、ホモゲナイザーを用いてホモゲナイズを所定回数繰り返し行って、粉砕燕麦を脱脂処理して脱脂燕麦粉末を得る。脱脂処理に使用する前記有機溶媒として、ヘキサン又はアセトンを用いることが好ましく、ヘキサンがより好ましい。また脱脂に際してはソックスレー脂肪抽出装置を用いることもできる。
【００１３】
上記タンパク質分画ステップ（ａ）における脱脂燕麦粉末のアミラーゼ処理は、０．１〜０．３％、好ましくは０．２％のアミラーゼ溶液、好ましくはα−アミラーゼ溶液、特に枯草菌由来のα−アミラーゼ溶液を、脱脂燕麦粉末の５〜１５倍量、好ましくは１０倍量程度用い、使用アミラーゼ量としては、タンパク質画分に対して２〜５％、より好ましくは３％の酵素濃度で用いることができる。また、アミラーゼ処理条件は３５℃〜４０℃、５時間以上が好ましく、３７℃の条件下で６時間のアミラーゼ処理を好適に例示することができる。アミラーゼ分解処理終了後に、エタノールを加えてタンパク質画分を沈降させるタンパク質分画ステップの処理条件は、１．５〜２．５倍量のエタノールを加えて２０００〜４０００×ｇで１０〜２０分間遠心分離にかけタンパク質画分を沈降させ、より好ましくは、２倍量のエタノールを加えて３０００×ｇで１５分間遠心分離にかけるタンパク質画分沈降条件を例示することができる。沈降させたタンパク質画分はそのまま、又はフリーズドライ処理を施すことにより、本発明の燕麦タンパク質画分を含むＡＣＥ阻害剤組成物とすることができる。
【００１４】
上記タンパク質分画ステップ（ｂ）において用いられるアルカリ塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等を挙げることができ、好適には、塩化ナトリウムを例示することができ、また、アルカリ土類塩としては、カルシウム塩、マグネシウム塩等を挙げることができ、好適には、塩化カルシウムを例示することができる。脱脂燕麦粉末とアルカリ塩又はアルカリ土類塩との配合は、例えば脱脂燕麦粉末に、５〜２０倍量の０．２５〜１．０Ｍのアルカリ塩又はアルカリ土類塩の溶液が用いられ、より具体的には、１０倍量の０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液もしくは０．５Ｍ塩化カルシウム溶液が加えられる。アルカリ塩又はアルカリ土類塩の溶液を加えた後、３〜１０分間、例えば５分間程度ホモゲナイズする。また、残渣には更にアルカリ塩又はアルカリ土類塩の溶液を加えホモゲナイズを２度以上繰り返し、なるべく多くの溶出画分を集めることが好ましい。この溶出画分に透析、限外濾過等の脱塩処理、例えば、１２〜１４０００ＭＷ−ｃｕｔ−ｏｆｆの透析膜、もしくはペリコンＸＬを用いた限外濾過による脱塩処理を施す。この脱塩処理物、その濃縮処理物、フリーズドライ処理物を、本発明の燕麦タンパク質画分を含むＡＣＥ阻害剤組成物とすることができる。
【００１５】
上記燕麦タンパク質分解ステップにおいては、上記燕麦タンパク質画分のｐＨ調整後に、ペプシン及びトリプシンによるタンパク分解酵素処理が行われる。具体的には、ペプシンによる分解方法は、無機酸や有機酸の溶液を用いてｐＨ２．０に調整し、タンパク質量に対して０．１％以上の酵素濃度となるようにペプシンを加え、３７℃〜４０℃、５時間以上インキュベーションを行う。より好ましくは、ペプシン濃度が０．２％で、３７℃、６時間インキュベーションを行なう。次にトリプシンによる分解を行うが、その分解方法は、まずｐＨ調整後トリプシンによるタンパク分解を行う。具体的には、ＮａＯＨ等のアルカリを用いてｐＨ８．０に調整し、ペプシン処理時のタンパク質量に対して、トリプシン濃度０．１％以上、３７℃の条件下で５時間以上インキュベーションを行なう。より好ましくは、０．２％酵素濃度となるようにトリプシンを加え、３７℃、６時間インキュベーションを行なう。インキュベーション終了後、３５００ＭＷ−ｃｕｔ−ｏｆｆの透析膜やペリコンＸＬを用いた限外濾過を用いて分子篩にかけることが好ましい。インキュベーション終了物、好ましくはその分子篩処理物、より好ましくはそのフリーズドライ処理物を、本発明の燕麦タンパク質由来のペプチド画分を含む活性組成物とすることができる。
【００１６】
本発明において、上記（ａ）のタンパク質分画ステップを採用すると、ペプチド画分の純度は低いものの大量調製することができ、（ｂ）のタンパク質分画ステップを採用すると、ペプチド画分の純度は高いものの大量生産には不向きであることから、目的や用途に合わせて上記タンパク質分画ステップを選ぶことが望ましい。
【００１７】
本発明はまた、ＶＩＥＰＱＧＬのアミノ酸配列を有するペプチド、ＮＩＶＱＭＳＡＴＲのアミノ酸配列を有するペプチド、ＶＱＶＶＮＮＮＧＱＴＶＦのアミノ酸配列を有するペプチド、又はＩＶＰＱＨＦのアミノ酸配列を有するペプチドに関する。これら新規ペプチドは、ＡＣＥ阻害剤として有用であり、前記燕麦タンパク質由来のペプチド画分から、ＨＰＬＣ等を用いる定法により分離採取することにより、また、アミノ酸配列情報によりペプチド化学合成により得ることができる。
【００１８】
本発明の燕麦タンパク質画分を含むＡＣＥ阻害剤組成物や燕麦タンパク質由来のペプチド画分を含むＡＣＥ阻害剤組成物や、ＶＩＥＰＱＧＬ、ＮＩＶＱＭＳＡＴＲ、ＶＱＶＶＮＮＮＧＱＴＶＦ、又はＩＶＰＱＨＦのアミノ酸配列を有するペプチドからなるＡＣＥ阻害剤は、常法により錠剤、顆粒、カプセル、シロップ等製剤化して、健康サプリメントや医薬品として用いることができる。サプリメントや医薬品として用いる場合、それらの分野で通常用いられている賦形剤を配合することが好ましい。また、摂取量は、ヒトの体重、年齢、性別、症状等により異なり、特に症状に応じて１日当たりの投与量を決定するが、通常２０〜５００ｍｇ／ｋｇを目安とし、また長期にわたり服用することもできる。
【００１９】
本発明のＡＣＥ阻害剤組成物は、燕麦を原料とし上記特定の処理方法により何ら苦味や薬味を感じることのないものであり、一般食品に含有してもその食品の風味を損なうことがないので、食品に添加・配合して用いることができ、ＡＣＥ阻害作用を奏する食品を容易に提供することができる。添加される食品としては、例えば、麺類、飴、クッキー、シリアル類、菓子類（スナック類）、ふりかけ類、畜産加工品類、魚肉加工品類、缶詰類、牛乳、プレーンヨーグルト等の乳製品飲料、ジュース類、清涼飲料、栄養ドリンク剤等を挙げることができる。
【００２０】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明は、実施例で記載しているものに限定されるものではない。なお、以下の実施例において、アミラーゼとしては和光純薬工業株式会社製「αアミラーゼ，枯草菌由来，２０ｕｎｉｔｓ／ｍｇ以上」を、ペプシンとしては和光純薬工業株式会社製「ペプシン１：１０，０００，ブタ胃粘膜由来」を、トリプシンとしては和光純薬工業株式会社製「トリプシン，３０ ＵＳＰ ｕｎｉｔｓ／ｍｇ以上」を、それぞれ使用した。また、「％」は「質量％」を意味する。
【実施例１】
【００２１】
［燕麦タンパク質画分を含むＡＣＥ阻害剤組成物の製造（１）］
粉砕機（ＭｉｌｌｓｅｒＩＦＭ−６００Ｄ）を用いて燕麦を粉砕し、粉砕後６０メッシュの篩にかけて粒径３００μｍ以下の燕麦粉末を得た。次いで燕麦粉末１０ｇにヘキサン５０ｍＬを加え、脱脂燕麦粉末を得た。これに０．２％アミラーゼ溶液１００ｍＬを加え、３７℃で６時間インキュベーションしてアミラーゼ処理物を得た。このアミラーゼ処理物に２倍量のエタノールを加え、３０００×ｇ、１５分間遠心分離するエタノール沈殿処理を行い、タンパク質画分（燕麦グロブリンタンパク質ともいう）を得た。
【実施例２】
【００２２】
［燕麦タンパク質由来のペプチド画分を含むＡＣＥ阻害剤組成物の製造（１）］
実施例１で得られたタンパク質画分に１ＭのＨＣｌを用いてｐＨ２．０に調整した後、ペプシン濃度が０．２％となるようにペプシン溶液を加え、３７℃で６時間インキュベーションしてペプシン処理を行なった。その後１ＭのＮａＯＨを用いてｐＨ８．０に調整した。次いで、ｐＨ調整後のペプシン処理物に、トリプシン濃度が０．２％となるようにトリプシン溶液を加え、３７℃で６時間インキュベーションしてトリプシン処理を行った。最後に３５００ ＭＷ−ｃｕｔ−ｏｆｆの透析膜（Spectrum社製「Spectra/Por 3500，再生セルロース製」）を用いて分子篩処理した後、フリーズドライ処理をした。脱脂前の燕麦粉末に対して２３％のペプチド画分を得ることができた。このペプチド画分の窒素化合物含有量は、ケルダール法で確認したところ３０％であった。
【実施例３】
【００２３】
［燕麦タンパク質画分を含むＡＣＥ阻害剤組成物の製造（２）］
実施例１と同様の方法で得た脱脂燕麦粉末１０ｇに、１０倍量の０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液を加え、ストマッカー用ポリ袋を用いてホモゲナイザー（オルガノ製Ｌａｂ Ｂｌｅｎｄｅｒ４００）によって５分間ホモゲナイズした。また残渣には更に０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液を加えホモゲナイズを２度以上繰り返し、なるべく多くの溶出画分を集めた。この溶出画分を１２〜１４０００ＭＷ−ｃｕｔ−ｏｆｆの透析膜（Spectrum社製「Spectra/Por 12〜14,000，再生セルロース製」）にかけ、タンパク質画分を得た。
【実施例４】
【００２４】
［燕麦タンパク質由来のペプチド画分を含むＡＣＥ阻害剤組成物の製造（２）］
実施例３で得られたタンパク質画分について１ＭのＨＣｌを用いてｐＨ２．０に調整した後、ペプシン濃度が０．２％となるようにペプシン溶液を加え３７℃で６時間、インキュベーションしてペプシン処理をした。その後、ペプシン処理物に１ＭのＮａＯＨを用いてｐＨ８．０に調整した。次いで、トリプシン濃度が０．２％となるようにトリプシン溶液を加えて３７℃で６時間インキュベーションしてトリプシン処理を行った。最後に３０００ＭＷ−ｃｕｔ−ｏｆｆの透析膜を用いて分子ふるいしフリーズドライ処理をし、脱脂前の燕麦粉末に対して４％のペプチド画分を得た。このペプチド画分の窒素化合物含有量は、ケルダール法で確認した所９９％であった。
【実施例５】
【００２５】
［燕麦タンパク質由来のペプチド画分を含むＡＣＥ阻害剤組成物の製造（３）］
実施例３と同様の方法で得た０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液抽出後の溶出画分に、５０％飽和になるよう硫酸アンモニウムを加え、一夜攪拌することによって析出させたグロブリンタンパク質を３０００×ｇ、１５分間遠心分離後、沈殿物を少量の純水に溶解させ、これを１２〜１４０００ＭＷ−ｃｕｔ−ｏｆｆの透析膜（Spectrum社製「Spectra/Por 12〜14,000，再生セルロース製」）にかけ、タンパク質画分を得た。得られたタンパク質画分の純度は９８％に上昇した。ただ、塩析なしで得られた試料（実施例４）の純度は、９５％であったことから、この塩析処理は省略することもできる。また、塩化ナトリウムの代わりに塩化カルシウムを用いて調製した抽出液は、硫酸アンモニウムと反応して不溶性の硫酸カルシウムを形成するためこの精製法を利用することはできないことが明らかにされた。この実施例５によって、半飽和の硫酸アンモニウムによる塩折法を用いることなく、本発明の塩化ナトリウム溶液や塩化カルシウム溶液等を用いるのみでホモジナイズする簡易の方法で一定純度のグロブリンタンパク質を得ることが分った。
【００２６】
［比較例１］
実施例１と同様の方法で得た脱脂燕麦粉末１０ｇに、１０倍量の０．０１５ＭのＮａＯＨ溶液を加え、０．１ＭのＮａＯＨでｐＨを９．５に調整後、ストマッカー用ポリ袋を用いてホモゲナイザー（オルガノ製Ｌａｂ Ｂｌｅｎｄｅｒ ４００）によって５分間ホモゲナイズした。また残渣には更に０．０１５ＭのＮａＯＨ溶液を加えてホモゲナイズを２度以上繰り返し、なるべく多くの溶出画分を集めた。この溶出画分のｐＨを２ＭのＨＣｌによって５．５まで下げ、グロブリンタンパク質を等電点沈殿させた。得られたタンパク質画分中には、２％の灰分、０．５％の糖が残存しており、ｐＨ調整に時間がとられる割には純度が低いことが示されたのでこの方法は用いないことにした。
【実施例６】
【００２７】
［ＡＣＥ阻害活性の測定］
実施例２及び４で得られたペプチド画分等についてＡＣＥ阻害活性を調べた。ＡＣＥ阻害活性の測定は文献（Guan-Hong Li, Huan Liu, Yong-Hui Shi, Guo-Wei Le: Direct spectrophotometric measurement of angiotensin I-converting enzyme inhibitory activity for screening bioactive peptides, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 37巻，219-224ページ，2005）記載の方法に準じて行った。その結果、３５００ＭＷ−ｃｕｔ−ｏｆｆの透析膜を用いて分子ふるいしたペプチド画分は、低分子物質が除去されていることが明らかになった。得られた透析物のＡＣＥ阻害活性は、透析していないものの約３倍の阻害活性能力があることが明らかになった。約４０％が透析液中に排出され、本発明のペプチド画分約６０％が透析チューブの中に残った。ＨＰＬＣ分析（InertsilR ODS-3（４．６ｘ２５０ｍｍ＜分析用＞，１０ｘ２５０ｍｍ＜分析用＞，いずれもＧＬサイエンス社製），アセトニトリル０〜６０％の濃度勾配，流量１ｍＬ／ｍｉｎ）によって２７個のペプチドが確認され、またこれらの中では特に配列番号１〜４で示される、ＶＩＥＰＱＧＬ、ＮＩＶＱＭＳＡＴＲ、ＶＱＶＶＮＮＮＧＱＴＶＦ、ＩＶＰＱＨＦの４つのペプチドが強いＡＣＥ阻害活性を示すことが明らかになった。
【実施例７】
【００２８】
［インビトロにおけるペプチド画分のＡＣＥ阻害活性比較］
実施例２で得られたペプチド画分のＡＣＥ阻害活性を文献（前出：Guan-Hong Liら, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 37巻，219-224ページ，2005）記載の方法に準じて測定し、次に市販されている特定保健用飲料（Ｙ社の有効成分ラクトトリペプチド、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ及びＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ）のＡＣＥ阻害活性を同様に測定した。両者のペプチド濃度はほぼ同一に揃えてある。本発明のペプチド画分及び市販の特定保健用飲料のＡＣＥ阻害活性の測定結果を図１に示す。図１に示すように、本発明のペプチド画分は、市販の特定保健用飲料に比べてほぼ２倍のＡＣＥ阻害活性を示した。
【実施例８】
【００２９】
［インビボにおけるペプチド画分の抗高血圧効果］
実施例２で得られたペプチド画分について、高圧発症ラットを用いた動物実験により抗高血圧効果を調べた。すなわち、７週齢の雄ラット（SHR/NCrlCrlj、日本チャールスリバー株式会社）を入手し、１週間馴化後に実験を開始した。２２±３℃、湿度６０±１５％、換気回数１２〜１５回／時間及び照明１２時間 （７〜１９時）／日に設定した飼育室において、１匹／１ケージ（ステンレス製ケージ）で飼育した。飼料には、ＭＦ（オリエンタル酵母工業株式会社製）を、飲料水には水道水を用いてステンレス製給餌器及び給水瓶にて自由摂取させた。生理的食塩水を用いて５０ｍｇ／ｍＬの供試液を要事調製し、本発明のペプチド画分を毎朝１回、体重１ｋｇあたりペプチド含有量として１００ｍｇの投与量になるように、ラット用経口胃ゾンデを用いて強制経口投与した。ペプチド画分のかわりに生理的食塩水を投与したものを対照区とした。血圧測定には、非観血式自動血圧測定装置(BP-98A、株式会社ソフトロン)を用い、１週間に一度、ペプチド試料投与直後と６時間後に心拍数及び血圧（収縮期、拡張期、平均）を測定した。１回の測定に際しては、１匹の動物で連続５回測定し、経時的な収縮期血圧、平均血圧、拡張期血圧、心拍数の変化を追跡した。投与実験は５週間行い、最終日にはペプチド試料投与直後及びそれ以降３時間間隔で３回の合計４回の血圧測定を実施した。その結果を図２に示す。
【００３０】
図２には、投与後の収縮期（最高血圧；上の２本）と弛緩期（最低血圧；下の２本）の経時的変化が示され、◆は対照区（ｎ＝６）、■はペプチド画分供試区（ｎ＝６）を示す。図２に示されるように、体重１ｋｇあたり１００ｍｇの供試ペプチド画分を毎朝、５週間強制投与することを続けた高血圧自然発症性の雄ラット（ＳＨＲ／ＮＣｒｌＣｒｌｊ）は、５週間目において、対照区に比べ、有意（ｐ＜０．０５）に血圧を下げることが明らかにされた。
【実施例９】
【００３１】
［インビボにおける燕麦タンパク質画分の抗高血圧効果］
ブリティッシュコロンビア大学医学部の２名の医師の指導の元に、実施例１により得られた燕麦グロブリンタンパク質画分を８０歳男性高血圧症患者（体重６７ｋｇ）に対しての抗高血圧効果が試された。その結果、燕麦グロブリンタンパク質画分を５ｇ経口摂取し、投与後３時間の血圧を測定した結果、通常１８０−２００ｍｍｇの最高血圧が１３２−１３６ｍｍｇとなり、燕麦グロブリンタンパク質画分に有意（ｐ＜０．０５）に血圧を低下させる効果があることが認められた。
【実施例１０】
【００３２】
［食品衛生学的安全性試験結果］
実施例２で得られたペプチド画分の食品衛生学的な安全性を評価するために、微生物を用いた変異原性試験とマウスを用いた動物実験を行なった。変異原性試験としては、エイムズテスト及びレックアッセイを行なった。エイムズテストは、プレインキュベーション法によって行なった。すなわち、１％検液０．１ｍＬ、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）０．５ｍＬ、及び塩基対置換型突然変異株Salmonella typhimurium TA100（ｈｉｓＧ４６）あるいはフレームシフト型突然変異株S.typhimurim TA98（ｈｉｓＤ３０５２）の一夜培養液０．１ｍＬを順次滅菌試験管に加え、３７℃で２０分間振盪した後、これにトップアガー２．０ｍＬを加え混合後、最小グルコース寒天培地（Ｖｏｇｅｌ−Ｂｏｎｎｅｒ／ブドウ糖寒天培地）平板上に一様に広げ固化させ、３７℃で４８時間培養し、復帰突然変異によって出現したコロニー数をカウントすることによって行なった。出現したコロニー数が、陰性対象区と比較して２倍以下の場合に陰性と判断した。陽性対象区には２−（２−ｆｕｒｙｌ）−３−（５−ｎｉｔｒｏ−２−ｆｕｒｙｌ）ａｃｒｙ ｌａｍｉｄｅ（ＡＦ−２）を用いた。レックアッセイには、Bacillus subtilis H17株（Ｒｅｃ＋）及びB.subtilis M45株（Ｒｅｃ−）を用いた。一夜培養した供試菌液を白金耳を用いてトリプトン酵母エキス寒天平板上に中央で交わるように画線し、交点に滅菌濾紙を乗せ、試験液を１０−３０μＬ注入し、風乾後、３７℃で２４時間培養した。発育阻止帯の長さを測定し、Ｈ１７株とＭ４５株の発育阻止帯の長さの差が１．５ｍｍ以上あれば、陽性と判定した。標準変異原性物質にはＡＦ−２を用いた。動物実験は、ＯＥＣＤ化学物質毒性試験指針（１９８１）に準拠し、１０週齢のＩＣＲ系（Ｃｒｌｊ：ＣＤ１）雄マウスを用いて単純投与による急性毒性試験を行なった。１週間馴化後、投与前には４時間絶食させ、体重ｋｇあたり５ｇの試料をマウス用胃ゾンデによって強制単回投与（ｎ＝６）し、投与後、３日間引き続き飼育し、３日後に体重変化及び活動状況を観察した。対照区には生理的食塩水を用いた。その結果を表１に示す。
【００３３】
【表１】
【００３４】
表１に示すように、エイムズ法及びレックアッセイはいずれも陰性、マウスに対する急性毒性試験のＬＤ５０は、５ｇ／ｋｇ以上となり、いずれの試験においても供試ペプチドの食品衛生的な安全性が確認された。
【実施例１１】
【００３５】
［官能評価］
食品素材として用いるためには味が重要であることから、７名からなるパネリスト（男４名（平均年齢２２歳）、女３名（平均年齢２３歳））による官能検査を行なった。純水を用いて実施例２で得られたペプチド画分の１％水溶液を調整し、その甘味、塩味、苦味、酸味及び旨味についての評価を試みた。また、ペプチド画分を乳及び乳製品へ添加した際の色調、味、食感の変化に関する官能検査についても行なった。すなわち、市販の牛乳（乳脂肪分３．５％以上、乳固形分８．３％以上、１３０℃２秒間殺菌乳）及びプレーンヨーグルト（乳脂肪分３．０％、乳固形分９．５％、発酵乳）を購入し、１％濃度になるようにペプチド試料を添加し、よく混合したものを用いて、７名からなるパネリスト〔男４名（平均年齢２２歳），女３名（平均年齢２３歳）〕による官能検査を行なった。対照区には、ペプチド試料未添加のものを用い、両者間の評価結果に有意差があるか否かについて調べた。その結果、供試ペプチドの１％水溶液の甘味、塩味、苦味、酸味及び旨みについて２点嗜好評価法（二項検定）により調べたところ、純水との間に有意な差（ｐ＜０．０５）は認められなかった。そこで、ペプチド画分を用いた乳・乳製品プロトタイプの作製の可能性について検討した。すなわち、市販の牛乳及びプレーンヨーグルトに１％濃度になるように供試ペプチドを添加し、７名のパネリストによる評価を試みたところ、供試ペプチド添加のものと無添加のものとの間には、色調、味、食感において有意差（ｐ＜０．０５）がないことが示された。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏでのＡＣＥ阻害効果を示す図である。
【図２】本発明のＳＨＲラットに対する投与効果を示す図である。
【図３】１１Ｓ ｇｌｏｂｕｌｉｎ，ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ，ｏａｔ（燕麦：Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ）のアミノ酸配列を示す図である。
【図４】ＢＩＰＰＥＰ解析によるペプシン・キモトリプシン消化ペプチドマップ（および有効画分が存在することの確認）を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、燕麦タンパク質画分又は燕麦タンパク質由来のペプチド画分を含むアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤組成物（以下、「ＡＣＥ阻害剤組成物」という場合がある）、該ＡＣＥ阻害剤組成物の製造方法、及び該ＡＣＥ阻害剤組成物を配合した食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）は、血圧の調整においてレニン・アンジオテンシン系に作用する酵素である。レニン・アンジオテンシン系では、肝臓から分泌されるアンジオテンシノーゲンが、腎臓から分泌されるレニンによってアンジオテンシンIに変換される。アンジオテンシンIは更にＡＣＥによってアンジオテンシンIIに変換されるが、このアンジオテンシンIIは血管の収縮、血管透過性の増大などの作用があり、血圧を上昇させる。また、血管拡張作用により血圧降下作用を示すブラジキニンは、ＡＣＥにより分解されるため、このブラジキニンの分解によっても結果的に血圧が上昇する。ＡＣＥ阻害活性をもつ物質は、上記のＡＣＥの作用を阻害することから、有効な血圧降下作用をもつ成分として着目されている。
【０００３】
近年、メタボリック症候群に代表される成人病の増加により、血圧降下作用をもつ物質が着目されているが、高血圧に関連する疾病は特に食事による影響が強いと言われており、高血圧の予防効果を持つ食品素材やその抽出物に対して期待がもたれている。食品素材に含まれているＡＣＥ阻害物質としては、特に食品素材中のタンパク質の酵素分解物であるペプチドについて、ＡＣＥ阻害活性があることが報告されている。例えば、ゼラチンのコラゲナーゼ消化物（例えば、特許文献１参照）、牛由来カゼインのトリプシン分解物（参考文献２〜５参照）、ゴマの加水分解物（例えば、特許文献６参照）、トウモロコシ蛋白質のサーモライシン分解物（例えば、特許文献７参照）、海苔やヒジキのペプシン分解物（例えば、特許文献８，９参照）、米、小麦、大麦、オート麦、ゴマ等に由来する蛋白のサーモライシン分解物（例えば、特許文献１０参照）、植物種子等の加水分解物（例えば、特許文献１１参照）等、或いは、いちじく樹木もしくは果肉の固液分離液を分別して得られるペプチド（例えば、特許文献１２参照）等、多数の報告がなされている。これらのペプチドがもつＡＣＥ阻害活性効果は、ＡＣＥ阻害活性に対する強さに違いはあるものの、それぞれが特定のアミノ酸配列を持つペプチド類がもたらす効果である。
【０００４】
【特許文献１】特開昭５２−１４８６３号公報
【特許文献２】特開昭５８−１０９４２５号公報
【特許文献３】特開昭５９−４４３２３号公報
【特許文献４】特開昭５９−４４３２４号公報
【特許文献５】特開昭６１−３６２２７号公報
【特許文献６】特開平８−２３１５８８号公報
【特許文献７】特開平６−８７８８６号公報
【特許文献８】特開平１０−３６３９１号公報
【特許文献９】特開平１０−１７５９９７号公報
【特許文献１０】特表２００６−５２０８０９号公報
【特許文献１１】特表２００６−５１２３７１号公報
【特許文献１２】特開平２−２８２３９４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
前述のような食品素材由来のＡＣＥ阻害活性をもつペプチドは、副作用、毒性などの安全性の面において問題が少なく、通常の食品として摂取できるという利点があるが、原料の値段が高い、調製方法が複雑である、大量生産が難しい、体内に摂取した際に消化酵素によって分解され効果が出にくい場合がある、ＡＣＥ阻害活性を持つペプチドは苦味を伴うことが多く、食用として扱うのに難しい、等といった様々な問題を抱えている。本発明の課題は、ＡＣＥ阻害活性に優れ、抗高血圧効果を奏し、副作用・毒性などの安全性の面において問題がなく、食品に添加した場合に官能評価に優れ、調製方法が複雑でなく、大量生産が可能なＡＣＥ阻害剤組成物や、該ＡＣＥ阻害剤組成物を有効成分とする抗高血圧薬剤や、該ＡＣＥ阻害剤組成物を配合した機能性食品等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行ない、本発明者らが独自に開発した検索手法により、タンパク質データバンクに登録されている食品タンパク質のアミノ酸配列の検索と統計処理を行なった結果、主に飼料用として使用され非常に安価である燕麦のグロブリンタンパク質に強いＡＣＥ阻害活性を示す可能性のあるアミノ酸配列を有するペプチド画分の存在を予測した。５５１個のアミノ酸から構成され、分子サイズは約６１ｋＤａの燕麦グロブリンタンパク質のアミノ酸配列（配列番号５）を図３に示す。そして、図３に示す燕麦グロブリンタンパク質をペプシン及びキモトリプシンで消化した場合、図４のようなペプチドが生成されることをＢＩＯＰＥＰ解析（http://www.uwm.edu.pl/biochemia/）によって確認した。それら生成ペプチド画分は、ペプシンやトリプシンといったヒトの消化酵素による基質認識部位を持っていないことから、体内に摂取されてから胃や小腸内で消化を受け、失活することはないと判断された。そこで、燕麦タンパク質画分や該タンパク質由来のペプチド画分について、ＡＣＥ阻害活性、抗高血圧作用、副作用・毒性などの安全性、食品に添加した場合の官能評価について検討し、優れた効果を奏することを確認し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち本発明は、（１）粉砕した燕麦に有機溶媒を用いて脱脂処理を施す粉末燕麦脱脂ステップ、及び、（ａ）脱脂燕麦粉末をアミラーゼ処理した後、エタノールを加えてタンパク質画分を沈降させるタンパク質分画ステップ又は（ｂ）脱脂燕麦粉末にアルカリ塩又はアルカリ土類塩溶液を加えてホモゲナイズし、溶出画分に脱塩処理を施すタンパク質分画ステップ、のタンパク質分画ステップを順次備えたことを特徴とする燕麦タンパク質画分を含むアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤組成物の製造方法や、（２）粉砕した燕麦に有機溶媒を用いて脱脂処理を施す粉末燕麦脱脂ステップ、（ａ）脱脂燕麦粉末をアミラーゼ処理した後、エタノールを加えてタンパク質画分を沈降させるタンパク質分画ステップ又は（ｂ）脱脂燕麦粉末にアルカリ塩又はアルカリ土類塩溶液を加えてホモゲナイズし、溶出画分に脱塩処理を施すタンパク質分画ステップ、のタンパク質分画ステップ、及び燕麦タンパク質画分をペプシン及びトリプシンを用いて分解して、ＶＩＥＰＱＧＬ、ＮＩＶＱＭＳＡＴＲ、ＶＱＶＶＮＮＮＧＱＴＶＦ、ＩＶＰＱＨＦのアミノ酸配列を有するペプチドを含むペプチド画分を得る燕麦タンパク質分解ステップを順次備えたことを特徴とする燕麦タンパク質由来のペプチド画分を含むアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤組成物の製造方法や、（３）有機溶媒として、ヘキサン又はアセトンを用いることを特徴とする前記（１）又は（２）記載のＡＣＥ阻害剤組成物の製造方法や、（４）アルカリ塩又はアルカリ土類塩溶液として、塩化ナトリウム又は塩化カルシウムを用いることを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれか記載のＡＣＥ阻害剤組成物の製造方法や、（５）燕麦タンパク質分解ステップにおいて、ペプシン及びトリプシン分解処理後に、透析膜もしくは限外濾過膜を用いて分子篩処理を施してペプチド画分を得ることを特徴とする前記（２）〜（４）のいずれか記載のＡＣＥ阻害剤組成物の製造方法に関する。
【０００８】
また本発明は、（６）前記（１）、（３）又は（４）記載の製造方法により得られる燕麦タンパク質画分を含有するアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤組成物や、（７）前記（２）〜（５）の記載の製造方法により得られるＶＩＥＰＱＧＬ、ＮＩＶＱＭＳＡＴＲ、ＶＱＶＶＮＮＮＧＱＴＶＦ、ＩＶＰＱＨＦのアミノ酸配列を有するペプチドを含むペプチド画分を含有するアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤組成物に関する。
【０００９】
さらに本発明は、（８）ＶＩＥＰＱＧＬ、ＮＩＶＱＭＳＡＴＲ、ＶＱＶＶＮＮＮＧＱＴＶＦ、又はＩＶＰＱＨＦのアミノ酸配列を有するペプチドや、（９）ＶＩＥＰＱＧＬ、ＮＩＶＱＭＳＡＴＲ、ＶＱＶＶＮＮＮＧＱＴＶＦ、又はＩＶＰＱＨＦのアミノ酸配列を有するペプチドからなるアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤や、（１０）前記（６）又は（７）記載のアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤組成物を有効成分とする抗高血圧薬剤や、（１１）前記（９）記載のアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤を有効成分とする抗高血圧薬剤や、（１２）前記（６）又は（７）記載のアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤組成物を配合した食品や、（１３）前記（９）記載のアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤を配合した食品に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤組成物の製造方法によれば、食品レベルでの安全性、強いＡＣＥ阻害活性、優れた抗高血圧作用を有する燕麦タンパク質画分や燕麦タンパク質由来のペプチド画分を、燕麦より安価で、簡易に製造することができ、かつ、大量生産を可能とすることができる。かかるＡＣＥ阻害剤組成物を含む抗高血圧薬剤や食品は、飲食に適した苦味等のない風味を有するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の燕麦タンパク質画分を含むＡＣＥ阻害剤組成物の製造方法としては、粉砕した燕麦に有機溶媒を用いて脱脂処理を施す粉末燕麦脱脂ステップ、及び、（ａ）脱脂燕麦粉末をアミラーゼ処理した後、エタノールを加えてタンパク質画分を沈降させるタンパク質分画ステップ；又は（ｂ）脱脂燕麦粉末にアルカリ塩又はアルカリ土類塩溶液を加えてホモゲナイズし、溶出画分に脱塩処理を施すタンパク質分画ステップ；を順次備えたものであれば特に制限されるものではなく、また、本発明の燕麦タンパク質由来のペプチド画分を含むＡＣＥ阻害剤組成物の製造方法としては、粉砕した燕麦に有機溶媒を用いて脱脂処理を施す粉末燕麦脱脂ステップ、（ａ）脱脂燕麦粉末をアミラーゼ処理した後、エタノールを加えてタンパク質画分を沈降させるタンパク質分画ステップ；又は（ｂ）脱脂燕麦粉末にアルカリ塩又はアルカリ土類塩溶液を加えてホモゲナイズし、溶出画分に脱塩処理を施すタンパク質分画ステップ；及び、燕麦タンパク質画分をペプシン及びトリプシンを用いて分解して、ＶＩＥＰＱＧＬ（Val-Ile-Glu-Pro-Gln-Gly-Leu）（配列番号１）、ＮＩＶＱＭＳＡＴＲ（Asn-Ile-Val-Gln-Met-Ser-Ala-Thr-Arg）（配列番号２）、ＶＱＶＶＮＮＮＧＱＴＶＦ（Val-Gln-Val-Val-Asn-Asn-Asn-Gly-Gln-Thr-Val-Phe）（配列番号３）、ＩＶＰＱＨＦ（Ile-Val-Pro-Gln-His-Phe）（配列番号４）のアミノ酸配列を有するペプチドを含むペプチド画分を得る燕麦タンパク質分解ステップを順次備えたものであれば特に制限されるものではなく、上記燕麦（学名：Avena sativa）はイネ科ウシノケグサ亜科カラスムギ属に属する１年生または越年生草本の穀物であり、別名、オートムギ、オート、マカラスムギともいい、また、同属の野生種と同名でカラスムギとも呼ばれ、主成分は澱粉であるが、穀類中ではタンパク質、脂質、食物繊維も多く、アミノ酸組成はリシンが第１制限アミノ酸（必須アミノ酸のうち最も不足する）であるが、アミノ酸スコアは比較的高い。
【００１２】
上記粉末燕麦脱脂ステップにおいて、原料燕麦を、摩擦式、せん断式、衝撃式などの公知の粉砕機を用いて粉砕することにより、粉砕燕麦を得ることができる。粉砕の程度は、平均粒径が４５０μｍ以下（４０メッシュパス）、特に３００μｍ以下（６０メッシュパス）となるように粉砕することが好ましい。次に粉砕した燕麦にアルコール類、ヘキサン、アセトン等の有機溶媒を加え、ホモゲナイザーを用いてホモゲナイズを所定回数繰り返し行って、粉砕燕麦を脱脂処理して脱脂燕麦粉末を得る。脱脂処理に使用する前記有機溶媒として、ヘキサン又はアセトンを用いることが好ましく、ヘキサンがより好ましい。また脱脂に際してはソックスレー脂肪抽出装置を用いることもできる。
【００１３】
上記タンパク質分画ステップ（ａ）における脱脂燕麦粉末のアミラーゼ処理は、０．１〜０．３％、好ましくは０．２％のアミラーゼ溶液、好ましくはα−アミラーゼ溶液、特に枯草菌由来のα−アミラーゼ溶液を、脱脂燕麦粉末の５〜１５倍量、好ましくは１０倍量程度用い、使用アミラーゼ量としては、タンパク質画分に対して２〜５％、より好ましくは３％の酵素濃度で用いることができる。また、アミラーゼ処理条件は３５℃〜４０℃、５時間以上が好ましく、３７℃の条件下で６時間のアミラーゼ処理を好適に例示することができる。アミラーゼ分解処理終了後に、エタノールを加えてタンパク質画分を沈降させるタンパク質分画ステップの処理条件は、１．５〜２．５倍量のエタノールを加えて２０００〜４０００×ｇで１０〜２０分間遠心分離にかけタンパク質画分を沈降させ、より好ましくは、２倍量のエタノールを加えて３０００×ｇで１５分間遠心分離にかけるタンパク質画分沈降条件を例示することができる。沈降させたタンパク質画分はそのまま、又はフリーズドライ処理を施すことにより、本発明の燕麦タンパク質画分を含むＡＣＥ阻害剤組成物とすることができる。
【００１４】
上記タンパク質分画ステップ（ｂ）において用いられるアルカリ塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等を挙げることができ、好適には、塩化ナトリウムを例示することができ、また、アルカリ土類塩としては、カルシウム塩、マグネシウム塩等を挙げることができ、好適には、塩化カルシウムを例示することができる。脱脂燕麦粉末とアルカリ塩又はアルカリ土類塩との配合は、例えば脱脂燕麦粉末に、５〜２０倍量の０．２５〜１．０Ｍのアルカリ塩又はアルカリ土類塩の溶液が用いられ、より具体的には、１０倍量の０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液もしくは０．５Ｍ塩化カルシウム溶液が加えられる。アルカリ塩又はアルカリ土類塩の溶液を加えた後、３〜１０分間、例えば５分間程度ホモゲナイズする。また、残渣には更にアルカリ塩又はアルカリ土類塩の溶液を加えホモゲナイズを２度以上繰り返し、なるべく多くの溶出画分を集めることが好ましい。この溶出画分に透析、限外濾過等の脱塩処理、例えば、１２〜１４０００ＭＷ−ｃｕｔ−ｏｆｆの透析膜、もしくはペリコンＸＬを用いた限外濾過による脱塩処理を施す。この脱塩処理物、その濃縮処理物、フリーズドライ処理物を、本発明の燕麦タンパク質画分を含むＡＣＥ阻害剤組成物とすることができる。
【００１５】
上記燕麦タンパク質分解ステップにおいては、上記燕麦タンパク質画分のｐＨ調整後に、ペプシン及びトリプシンによるタンパク分解酵素処理が行われる。具体的には、ペプシンによる分解方法は、無機酸や有機酸の溶液を用いてｐＨ２．０に調整し、タンパク質量に対して０．１％以上の酵素濃度となるようにペプシンを加え、３７℃〜４０℃、５時間以上インキュベーションを行う。より好ましくは、ペプシン濃度が０．２％で、３７℃、６時間インキュベーションを行なう。次にトリプシンによる分解を行うが、その分解方法は、まずｐＨ調整後トリプシンによるタンパク分解を行う。具体的には、ＮａＯＨ等のアルカリを用いてｐＨ８．０に調整し、ペプシン処理時のタンパク質量に対して、トリプシン濃度０．１％以上、３７℃の条件下で５時間以上インキュベーションを行なう。より好ましくは、０．２％酵素濃度となるようにトリプシンを加え、３７℃、６時間インキュベーションを行なう。インキュベーション終了後、３５００ＭＷ−ｃｕｔ−ｏｆｆの透析膜やペリコンＸＬを用いた限外濾過を用いて分子篩にかけることが好ましい。インキュベーション終了物、好ましくはその分子篩処理物、より好ましくはそのフリーズドライ処理物を、本発明の燕麦タンパク質由来のペプチド画分を含む活性組成物とすることができる。
【００１６】
本発明において、上記（ａ）のタンパク質分画ステップを採用すると、ペプチド画分の純度は低いものの大量調製することができ、（ｂ）のタンパク質分画ステップを採用すると、ペプチド画分の純度は高いものの大量生産には不向きであることから、目的や用途に合わせて上記タンパク質分画ステップを選ぶことが望ましい。
【００１７】
本発明はまた、ＶＩＥＰＱＧＬのアミノ酸配列を有するペプチド、ＮＩＶＱＭＳＡＴＲのアミノ酸配列を有するペプチド、ＶＱＶＶＮＮＮＧＱＴＶＦのアミノ酸配列を有するペプチド、又はＩＶＰＱＨＦのアミノ酸配列を有するペプチドに関する。これら新規ペプチドは、ＡＣＥ阻害剤として有用であり、前記燕麦タンパク質由来のペプチド画分から、ＨＰＬＣ等を用いる定法により分離採取することにより、また、アミノ酸配列情報によりペプチド化学合成により得ることができる。
【００１８】
本発明の燕麦タンパク質画分を含むＡＣＥ阻害剤組成物や燕麦タンパク質由来のペプチド画分を含むＡＣＥ阻害剤組成物や、ＶＩＥＰＱＧＬ、ＮＩＶＱＭＳＡＴＲ、ＶＱＶＶＮＮＮＧＱＴＶＦ、又はＩＶＰＱＨＦのアミノ酸配列を有するペプチドからなるＡＣＥ阻害剤は、常法により錠剤、顆粒、カプセル、シロップ等製剤化して、健康サプリメントや医薬品として用いることができる。サプリメントや医薬品として用いる場合、それらの分野で通常用いられている賦形剤を配合することが好ましい。また、摂取量は、ヒトの体重、年齢、性別、症状等により異なり、特に症状に応じて１日当たりの投与量を決定するが、通常２０〜５００ｍｇ／ｋｇを目安とし、また長期にわたり服用することもできる。
【００１９】
本発明のＡＣＥ阻害剤組成物は、燕麦を原料とし上記特定の処理方法により何ら苦味や薬味を感じることのないものであり、一般食品に含有してもその食品の風味を損なうことがないので、食品に添加・配合して用いることができ、ＡＣＥ阻害作用を奏する食品を容易に提供することができる。添加される食品としては、例えば、麺類、飴、クッキー、シリアル類、菓子類（スナック類）、ふりかけ類、畜産加工品類、魚肉加工品類、缶詰類、牛乳、プレーンヨーグルト等の乳製品飲料、ジュース類、清涼飲料、栄養ドリンク剤等を挙げることができる。
【００２０】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明は、実施例で記載しているものに限定されるものではない。なお、以下の実施例において、アミラーゼとしては和光純薬工業株式会社製「αアミラーゼ，枯草菌由来，２０ｕｎｉｔｓ／ｍｇ以上」を、ペプシンとしては和光純薬工業株式会社製「ペプシン１：１０，０００，ブタ胃粘膜由来」を、トリプシンとしては和光純薬工業株式会社製「トリプシン，３０ ＵＳＰ ｕｎｉｔｓ／ｍｇ以上」を、それぞれ使用した。また、「％」は「質量％」を意味する。
【実施例１】
【００２１】
［燕麦タンパク質画分を含むＡＣＥ阻害剤組成物の製造（１）］
粉砕機（ＭｉｌｌｓｅｒＩＦＭ−６００Ｄ）を用いて燕麦を粉砕し、粉砕後６０メッシュの篩にかけて粒径３００μｍ以下の燕麦粉末を得た。次いで燕麦粉末１０ｇにヘキサン５０ｍＬを加え、脱脂燕麦粉末を得た。これに０．２％アミラーゼ溶液１００ｍＬを加え、３７℃で６時間インキュベーションしてアミラーゼ処理物を得た。このアミラーゼ処理物に２倍量のエタノールを加え、３０００×ｇ、１５分間遠心分離するエタノール沈殿処理を行い、タンパク質画分（燕麦グロブリンタンパク質ともいう）を得た。
【実施例２】
【００２２】
［燕麦タンパク質由来のペプチド画分を含むＡＣＥ阻害剤組成物の製造（１）］
実施例１で得られたタンパク質画分に１ＭのＨＣｌを用いてｐＨ２．０に調整した後、ペプシン濃度が０．２％となるようにペプシン溶液を加え、３７℃で６時間インキュベーションしてペプシン処理を行なった。その後１ＭのＮａＯＨを用いてｐＨ８．０に調整した。次いで、ｐＨ調整後のペプシン処理物に、トリプシン濃度が０．２％となるようにトリプシン溶液を加え、３７℃で６時間インキュベーションしてトリプシン処理を行った。最後に３５００ ＭＷ−ｃｕｔ−ｏｆｆの透析膜（Spectrum社製「Spectra/Por 3500，再生セルロース製」）を用いて分子篩処理した後、フリーズドライ処理をした。脱脂前の燕麦粉末に対して２３％のペプチド画分を得ることができた。このペプチド画分の窒素化合物含有量は、ケルダール法で確認したところ３０％であった。
【実施例３】
【００２３】
［燕麦タンパク質画分を含むＡＣＥ阻害剤組成物の製造（２）］
実施例１と同様の方法で得た脱脂燕麦粉末１０ｇに、１０倍量の０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液を加え、ストマッカー用ポリ袋を用いてホモゲナイザー（オルガノ製Ｌａｂ Ｂｌｅｎｄｅｒ４００）によって５分間ホモゲナイズした。また残渣には更に０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液を加えホモゲナイズを２度以上繰り返し、なるべく多くの溶出画分を集めた。この溶出画分を１２〜１４０００ＭＷ−ｃｕｔ−ｏｆｆの透析膜（Spectrum社製「Spectra/Por 12〜14,000，再生セルロース製」）にかけ、タンパク質画分を得た。
【実施例４】
【００２４】
［燕麦タンパク質由来のペプチド画分を含むＡＣＥ阻害剤組成物の製造（２）］
実施例３で得られたタンパク質画分について１ＭのＨＣｌを用いてｐＨ２．０に調整した後、ペプシン濃度が０．２％となるようにペプシン溶液を加え３７℃で６時間、インキュベーションしてペプシン処理をした。その後、ペプシン処理物に１ＭのＮａＯＨを用いてｐＨ８．０に調整した。次いで、トリプシン濃度が０．２％となるようにトリプシン溶液を加えて３７℃で６時間インキュベーションしてトリプシン処理を行った。最後に３０００ＭＷ−ｃｕｔ−ｏｆｆの透析膜を用いて分子ふるいしフリーズドライ処理をし、脱脂前の燕麦粉末に対して４％のペプチド画分を得た。このペプチド画分の窒素化合物含有量は、ケルダール法で確認した所９９％であった。
【実施例５】
【００２５】
［燕麦タンパク質由来のペプチド画分を含むＡＣＥ阻害剤組成物の製造（３）］
実施例３と同様の方法で得た０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液抽出後の溶出画分に、５０％飽和になるよう硫酸アンモニウムを加え、一夜攪拌することによって析出させたグロブリンタンパク質を３０００×ｇ、１５分間遠心分離後、沈殿物を少量の純水に溶解させ、これを１２〜１４０００ＭＷ−ｃｕｔ−ｏｆｆの透析膜（Spectrum社製「Spectra/Por 12〜14,000，再生セルロース製」）にかけ、タンパク質画分を得た。得られたタンパク質画分の純度は９８％に上昇した。ただ、塩析なしで得られた試料（実施例４）の純度は、９５％であったことから、この塩析処理は省略することもできる。また、塩化ナトリウムの代わりに塩化カルシウムを用いて調製した抽出液は、硫酸アンモニウムと反応して不溶性の硫酸カルシウムを形成するためこの精製法を利用することはできないことが明らかにされた。この実施例５によって、半飽和の硫酸アンモニウムによる塩折法を用いることなく、本発明の塩化ナトリウム溶液や塩化カルシウム溶液等を用いるのみでホモジナイズする簡易の方法で一定純度のグロブリンタンパク質を得ることが分った。
【００２６】
［比較例１］
実施例１と同様の方法で得た脱脂燕麦粉末１０ｇに、１０倍量の０．０１５ＭのＮａＯＨ溶液を加え、０．１ＭのＮａＯＨでｐＨを９．５に調整後、ストマッカー用ポリ袋を用いてホモゲナイザー（オルガノ製Ｌａｂ Ｂｌｅｎｄｅｒ ４００）によって５分間ホモゲナイズした。また残渣には更に０．０１５ＭのＮａＯＨ溶液を加えてホモゲナイズを２度以上繰り返し、なるべく多くの溶出画分を集めた。この溶出画分のｐＨを２ＭのＨＣｌによって５．５まで下げ、グロブリンタンパク質を等電点沈殿させた。得られたタンパク質画分中には、２％の灰分、０．５％の糖が残存しており、ｐＨ調整に時間がとられる割には純度が低いことが示されたのでこの方法は用いないことにした。
【実施例６】
【００２７】
［ＡＣＥ阻害活性の測定］
実施例２及び４で得られたペプチド画分等についてＡＣＥ阻害活性を調べた。ＡＣＥ阻害活性の測定は文献（Guan-Hong Li, Huan Liu, Yong-Hui Shi, Guo-Wei Le: Direct spectrophotometric measurement of angiotensin I-converting enzyme inhibitory activity for screening bioactive peptides, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 37巻，219-224ページ，2005）記載の方法に準じて行った。その結果、３５００ＭＷ−ｃｕｔ−ｏｆｆの透析膜を用いて分子ふるいしたペプチド画分は、低分子物質が除去されていることが明らかになった。得られた透析物のＡＣＥ阻害活性は、透析していないものの約３倍の阻害活性能力があることが明らかになった。約４０％が透析液中に排出され、本発明のペプチド画分約６０％が透析チューブの中に残った。ＨＰＬＣ分析（InertsilR ODS-3（４．６ｘ２５０ｍｍ＜分析用＞，１０ｘ２５０ｍｍ＜分析用＞，いずれもＧＬサイエンス社製），アセトニトリル０〜６０％の濃度勾配，流量１ｍＬ／ｍｉｎ）によって２７個のペプチドが確認され、またこれらの中では特に配列番号１〜４で示される、ＶＩＥＰＱＧＬ、ＮＩＶＱＭＳＡＴＲ、ＶＱＶＶＮＮＮＧＱＴＶＦ、ＩＶＰＱＨＦの４つのペプチドが強いＡＣＥ阻害活性を示すことが明らかになった。
【実施例７】
【００２８】
［インビトロにおけるペプチド画分のＡＣＥ阻害活性比較］
実施例２で得られたペプチド画分のＡＣＥ阻害活性を文献（前出：Guan-Hong Liら, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 37巻，219-224ページ，2005）記載の方法に準じて測定し、次に市販されている特定保健用飲料（Ｙ社の有効成分ラクトトリペプチド、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ及びＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ）のＡＣＥ阻害活性を同様に測定した。両者のペプチド濃度はほぼ同一に揃えてある。本発明のペプチド画分及び市販の特定保健用飲料のＡＣＥ阻害活性の測定結果を図１に示す。図１に示すように、本発明のペプチド画分は、市販の特定保健用飲料に比べてほぼ２倍のＡＣＥ阻害活性を示した。
【実施例８】
【００２９】
［インビボにおけるペプチド画分の抗高血圧効果］
実施例２で得られたペプチド画分について、高圧発症ラットを用いた動物実験により抗高血圧効果を調べた。すなわち、７週齢の雄ラット（SHR/NCrlCrlj、日本チャールスリバー株式会社）を入手し、１週間馴化後に実験を開始した。２２±３℃、湿度６０±１５％、換気回数１２〜１５回／時間及び照明１２時間 （７〜１９時）／日に設定した飼育室において、１匹／１ケージ（ステンレス製ケージ）で飼育した。飼料には、ＭＦ（オリエンタル酵母工業株式会社製）を、飲料水には水道水を用いてステンレス製給餌器及び給水瓶にて自由摂取させた。生理的食塩水を用いて５０ｍｇ／ｍＬの供試液を要事調製し、本発明のペプチド画分を毎朝１回、体重１ｋｇあたりペプチド含有量として１００ｍｇの投与量になるように、ラット用経口胃ゾンデを用いて強制経口投与した。ペプチド画分のかわりに生理的食塩水を投与したものを対照区とした。血圧測定には、非観血式自動血圧測定装置(BP-98A、株式会社ソフトロン)を用い、１週間に一度、ペプチド試料投与直後と６時間後に心拍数及び血圧（収縮期、拡張期、平均）を測定した。１回の測定に際しては、１匹の動物で連続５回測定し、経時的な収縮期血圧、平均血圧、拡張期血圧、心拍数の変化を追跡した。投与実験は５週間行い、最終日にはペプチド試料投与直後及びそれ以降３時間間隔で３回の合計４回の血圧測定を実施した。その結果を図２に示す。
【００３０】
図２には、投与後の収縮期（最高血圧；上の２本）と弛緩期（最低血圧；下の２本）の経時的変化が示され、◆は対照区（ｎ＝６）、■はペプチド画分供試区（ｎ＝６）を示す。図２に示されるように、体重１ｋｇあたり１００ｍｇの供試ペプチド画分を毎朝、５週間強制投与することを続けた高血圧自然発症性の雄ラット（ＳＨＲ／ＮＣｒｌＣｒｌｊ）は、５週間目において、対照区に比べ、有意（ｐ＜０．０５）に血圧を下げることが明らかにされた。
【実施例９】
【００３１】
［インビボにおける燕麦タンパク質画分の抗高血圧効果］
ブリティッシュコロンビア大学医学部の２名の医師の指導の元に、実施例１により得られた燕麦グロブリンタンパク質画分を８０歳男性高血圧症患者（体重６７ｋｇ）に対しての抗高血圧効果が試された。その結果、燕麦グロブリンタンパク質画分を５ｇ経口摂取し、投与後３時間の血圧を測定した結果、通常１８０−２００ｍｍｇの最高血圧が１３２−１３６ｍｍｇとなり、燕麦グロブリンタンパク質画分に有意（ｐ＜０．０５）に血圧を低下させる効果があることが認められた。
【実施例１０】
【００３２】
［食品衛生学的安全性試験結果］
実施例２で得られたペプチド画分の食品衛生学的な安全性を評価するために、微生物を用いた変異原性試験とマウスを用いた動物実験を行なった。変異原性試験としては、エイムズテスト及びレックアッセイを行なった。エイムズテストは、プレインキュベーション法によって行なった。すなわち、１％検液０．１ｍＬ、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）０．５ｍＬ、及び塩基対置換型突然変異株Salmonella typhimurium TA100（ｈｉｓＧ４６）あるいはフレームシフト型突然変異株S.typhimurim TA98（ｈｉｓＤ３０５２）の一夜培養液０．１ｍＬを順次滅菌試験管に加え、３７℃で２０分間振盪した後、これにトップアガー２．０ｍＬを加え混合後、最小グルコース寒天培地（Ｖｏｇｅｌ−Ｂｏｎｎｅｒ／ブドウ糖寒天培地）平板上に一様に広げ固化させ、３７℃で４８時間培養し、復帰突然変異によって出現したコロニー数をカウントすることによって行なった。出現したコロニー数が、陰性対象区と比較して２倍以下の場合に陰性と判断した。陽性対象区には２−（２−ｆｕｒｙｌ）−３−（５−ｎｉｔｒｏ−２−ｆｕｒｙｌ）ａｃｒｙ ｌａｍｉｄｅ（ＡＦ−２）を用いた。レックアッセイには、Bacillus subtilis H17株（Ｒｅｃ＋）及びB.subtilis M45株（Ｒｅｃ−）を用いた。一夜培養した供試菌液を白金耳を用いてトリプトン酵母エキス寒天平板上に中央で交わるように画線し、交点に滅菌濾紙を乗せ、試験液を１０−３０μＬ注入し、風乾後、３７℃で２４時間培養した。発育阻止帯の長さを測定し、Ｈ１７株とＭ４５株の発育阻止帯の長さの差が１．５ｍｍ以上あれば、陽性と判定した。標準変異原性物質にはＡＦ−２を用いた。動物実験は、ＯＥＣＤ化学物質毒性試験指針（１９８１）に準拠し、１０週齢のＩＣＲ系（Ｃｒｌｊ：ＣＤ１）雄マウスを用いて単純投与による急性毒性試験を行なった。１週間馴化後、投与前には４時間絶食させ、体重ｋｇあたり５ｇの試料をマウス用胃ゾンデによって強制単回投与（ｎ＝６）し、投与後、３日間引き続き飼育し、３日後に体重変化及び活動状況を観察した。対照区には生理的食塩水を用いた。その結果を表１に示す。
【００３３】
【表１】
【００３４】
表１に示すように、エイムズ法及びレックアッセイはいずれも陰性、マウスに対する急性毒性試験のＬＤ５０は、５ｇ／ｋｇ以上となり、いずれの試験においても供試ペプチドの食品衛生的な安全性が確認された。
【実施例１１】
【００３５】
［官能評価］
食品素材として用いるためには味が重要であることから、７名からなるパネリスト（男４名（平均年齢２２歳）、女３名（平均年齢２３歳））による官能検査を行なった。純水を用いて実施例２で得られたペプチド画分の１％水溶液を調整し、その甘味、塩味、苦味、酸味及び旨味についての評価を試みた。また、ペプチド画分を乳及び乳製品へ添加した際の色調、味、食感の変化に関する官能検査についても行なった。すなわち、市販の牛乳（乳脂肪分３．５％以上、乳固形分８．３％以上、１３０℃２秒間殺菌乳）及びプレーンヨーグルト（乳脂肪分３．０％、乳固形分９．５％、発酵乳）を購入し、１％濃度になるようにペプチド試料を添加し、よく混合したものを用いて、７名からなるパネリスト〔男４名（平均年齢２２歳），女３名（平均年齢２３歳）〕による官能検査を行なった。対照区には、ペプチド試料未添加のものを用い、両者間の評価結果に有意差があるか否かについて調べた。その結果、供試ペプチドの１％水溶液の甘味、塩味、苦味、酸味及び旨みについて２点嗜好評価法（二項検定）により調べたところ、純水との間に有意な差（ｐ＜０．０５）は認められなかった。そこで、ペプチド画分を用いた乳・乳製品プロトタイプの作製の可能性について検討した。すなわち、市販の牛乳及びプレーンヨーグルトに１％濃度になるように供試ペプチドを添加し、７名のパネリストによる評価を試みたところ、供試ペプチド添加のものと無添加のものとの間には、色調、味、食感において有意差（ｐ＜０．０５）がないことが示された。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏでのＡＣＥ阻害効果を示す図である。
【図２】本発明のＳＨＲラットに対する投与効果を示す図である。
【図３】１１Ｓ ｇｌｏｂｕｌｉｎ，ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ，ｏａｔ（燕麦：Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ）のアミノ酸配列を示す図である。
【図４】ＢＩＰＰＥＰ解析によるペプシン・キモトリプシン消化ペプチドマップ（および有効画分が存在することの確認）を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
粉砕した燕麦に有機溶媒を用いて脱脂処理を施す粉末燕麦脱脂ステップ、及び、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質分画ステップを順次備えたことを特徴とする燕麦タンパク質画分を含むアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤組成物の製造方法。
（ａ）脱脂燕麦粉末をアミラーゼ処理した後、エタノールを加えてタンパク質画分を沈降させるタンパク質分画ステップ；
（ｂ）脱脂燕麦粉末にアルカリ塩又はアルカリ土類塩溶液を加えてホモゲナイズし、溶出画分に脱塩処理を施すタンパク質分画ステップ；
【請求項２】
粉砕した燕麦に有機溶媒を用いて脱脂処理を施す粉末燕麦脱脂ステップ、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質分画ステップ、及び燕麦タンパク質画分をペプシン及びトリプシンを用いて分解して、ＶＩＥＰＱＧＬ、ＮＩＶＱＭＳＡＴＲ、ＶＱＶＶＮＮＮＧＱＴＶＦ、ＩＶＰＱＨＦのアミノ酸配列を有するペプチドを含むペプチド画分を得る燕麦タンパク質分解ステップを順次備えたことを特徴とする燕麦タンパク質由来のペプチド画分を含むアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤組成物の製造方法。
（ａ）脱脂燕麦粉末をアミラーゼ処理した後、エタノールを加えてタンパク質画分を沈降させるタンパク質分画ステップ；
（ｂ）脱脂燕麦粉末にアルカリ塩又はアルカリ土類塩溶液を加えてホモゲナイズし、溶出画分に脱塩処理を施すタンパク質分画ステップ；
【請求項３】
有機溶媒として、ヘキサン又はアセトンを用いることを特徴とする請求項１又は２記載のＡＣＥ阻害剤組成物の製造方法。
【請求項４】
アルカリ塩又はアルカリ土類塩溶液として、塩化ナトリウム又は塩化カルシウムを用いることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のＡＣＥ阻害剤組成物の製造方法。
【請求項５】
燕麦タンパク質分解ステップにおいて、ペプシン及びトリプシン分解処理後に、透析膜もしくは限外濾過膜を用いて分子篩処理を施してペプチド画分を得ることを特徴とする請求項２〜４のいずれか記載のＡＣＥ阻害剤組成物の製造方法。
【請求項６】
請求項１、３又は４記載の製造方法により得られる燕麦タンパク質画分を含有するアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤組成物。
【請求項７】
請求項２〜５の記載の製造方法により得られるＶＩＥＰＱＧＬ、ＮＩＶＱＭＳＡＴＲ、ＶＱＶＶＮＮＮＧＱＴＶＦ、ＩＶＰＱＨＦのアミノ酸配列を有するペプチドを含むペプチド画分を含有するアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤組成物。
【請求項８】
ＶＩＥＰＱＧＬ、ＮＩＶＱＭＳＡＴＲ、ＶＱＶＶＮＮＮＧＱＴＶＦ、又はＩＶＰＱＨＦのアミノ酸配列を有するペプチド。
【請求項９】
ＶＩＥＰＱＧＬ、ＮＩＶＱＭＳＡＴＲ、ＶＱＶＶＮＮＮＧＱＴＶＦ、又はＩＶＰＱＨＦのアミノ酸配列を有するペプチドからなるアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤。
【請求項１０】
請求項６又は７記載のアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤組成物を有効成分とする抗高血圧薬剤。
【請求項１１】
請求項９記載のアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤を有効成分とする抗高血圧薬剤。
【請求項１２】
請求項６又は７記載のアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤組成物を配合した食品。
【請求項１３】
請求項９記載のアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤を配合した食品。
【請求項１】
粉砕した燕麦に有機溶媒を用いて脱脂処理を施す粉末燕麦脱脂ステップ、及び、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質分画ステップを順次備えたことを特徴とする燕麦タンパク質画分を含むアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤組成物の製造方法。
（ａ）脱脂燕麦粉末をアミラーゼ処理した後、エタノールを加えてタンパク質画分を沈降させるタンパク質分画ステップ；
（ｂ）脱脂燕麦粉末にアルカリ塩又はアルカリ土類塩溶液を加えてホモゲナイズし、溶出画分に脱塩処理を施すタンパク質分画ステップ；
【請求項２】
粉砕した燕麦に有機溶媒を用いて脱脂処理を施す粉末燕麦脱脂ステップ、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質分画ステップ、及び燕麦タンパク質画分をペプシン及びトリプシンを用いて分解して、ＶＩＥＰＱＧＬ、ＮＩＶＱＭＳＡＴＲ、ＶＱＶＶＮＮＮＧＱＴＶＦ、ＩＶＰＱＨＦのアミノ酸配列を有するペプチドを含むペプチド画分を得る燕麦タンパク質分解ステップを順次備えたことを特徴とする燕麦タンパク質由来のペプチド画分を含むアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤組成物の製造方法。
（ａ）脱脂燕麦粉末をアミラーゼ処理した後、エタノールを加えてタンパク質画分を沈降させるタンパク質分画ステップ；
（ｂ）脱脂燕麦粉末にアルカリ塩又はアルカリ土類塩溶液を加えてホモゲナイズし、溶出画分に脱塩処理を施すタンパク質分画ステップ；
【請求項３】
有機溶媒として、ヘキサン又はアセトンを用いることを特徴とする請求項１又は２記載のＡＣＥ阻害剤組成物の製造方法。
【請求項４】
アルカリ塩又はアルカリ土類塩溶液として、塩化ナトリウム又は塩化カルシウムを用いることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のＡＣＥ阻害剤組成物の製造方法。
【請求項５】
燕麦タンパク質分解ステップにおいて、ペプシン及びトリプシン分解処理後に、透析膜もしくは限外濾過膜を用いて分子篩処理を施してペプチド画分を得ることを特徴とする請求項２〜４のいずれか記載のＡＣＥ阻害剤組成物の製造方法。
【請求項６】
請求項１、３又は４記載の製造方法により得られる燕麦タンパク質画分を含有するアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤組成物。
【請求項７】
請求項２〜５の記載の製造方法により得られるＶＩＥＰＱＧＬ、ＮＩＶＱＭＳＡＴＲ、ＶＱＶＶＮＮＮＧＱＴＶＦ、ＩＶＰＱＨＦのアミノ酸配列を有するペプチドを含むペプチド画分を含有するアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤組成物。
【請求項８】
ＶＩＥＰＱＧＬ、ＮＩＶＱＭＳＡＴＲ、ＶＱＶＶＮＮＮＧＱＴＶＦ、又はＩＶＰＱＨＦのアミノ酸配列を有するペプチド。
【請求項９】
ＶＩＥＰＱＧＬ、ＮＩＶＱＭＳＡＴＲ、ＶＱＶＶＮＮＮＧＱＴＶＦ、又はＩＶＰＱＨＦのアミノ酸配列を有するペプチドからなるアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤。
【請求項１０】
請求項６又は７記載のアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤組成物を有効成分とする抗高血圧薬剤。
【請求項１１】
請求項９記載のアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤を有効成分とする抗高血圧薬剤。
【請求項１２】
請求項６又は７記載のアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤組成物を配合した食品。
【請求項１３】
請求項９記載のアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤を配合した食品。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００９−７３７６５（Ｐ２００９−７３７６５Ａ）
【公開日】平成２１年４月９日（２００９．４．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２４４５２２（Ｐ２００７−２４４５２２）
【出願日】平成１９年９月２０日（２００７．９．２０）
【出願人】（３９１０４３４９１）日穀製粉株式会社 (10)
【出願人】（５０４１８０２３９）国立大学法人信州大学 (759)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年４月９日（２００９．４．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年９月２０日（２００７．９．２０）
【出願人】（３９１０４３４９１）日穀製粉株式会社 (10)
【出願人】（５０４１８０２３９）国立大学法人信州大学 (759)
【Ｆターム（参考）】
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