ゴマ発酵組成物およびその製造方法
【課題】ゴマ発酵組成物およびその製造方法を提供する。
【解決手段】本発明のゴマ発酵組成物は、アグリコンゴマリグナンを９５％以上含み、総抗酸化能力、ＤＨＨＰフリーラジカル消去能力、脂質抗酸化能力およびヒトＬＤＬ過酸化抑制能力が未発酵のものに比べて著しく向上する。さらに、本発明のゴマ発酵組成物は、胃癌細胞、子宮頚癌細胞、乳癌細胞、肝臓癌細胞および大腸癌細胞の増殖を抑制する能力をも備える。
【解決手段】本発明のゴマ発酵組成物は、アグリコンゴマリグナンを９５％以上含み、総抗酸化能力、ＤＨＨＰフリーラジカル消去能力、脂質抗酸化能力およびヒトＬＤＬ過酸化抑制能力が未発酵のものに比べて著しく向上する。さらに、本発明のゴマ発酵組成物は、胃癌細胞、子宮頚癌細胞、乳癌細胞、肝臓癌細胞および大腸癌細胞の増殖を抑制する能力をも備える。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リグナンの製造方法に関し、特にアグリコンゴマリグナン組成物の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ゴマ種子中には大量のリグナン(lignans)およびそのリグナン配糖体(lignan glycosides)が含まれている。このうちリグナン配糖体は、主に油除去後のゴマ粕中に存在し、セサミノールグルコシド(sesaminol glucosides)、ピノレジノールグルコシド(pinoresinol glucosides)およびセサモリノールグルコシド(sesamolinol glucosides)などからなり(K. I. Kuriyama、K. Y. TsuchiyaおよびT. Murui、「Nippon Nogeikagaku Kaishi」、１９９３年、第６７巻、ｐ．１６９３−１７００：非特許文献１参照)、その総含量は約０．２〜１％（ｗ／ｗ）で、セサミノールグルコシドが９５％以上を占める(Y. S. ShyuおよびL. S. Hwang、「Food Res.Int,.」２００２年、第３５巻、ｐ．３５７−３６５：非特許文献第２参照)。
【０００３】
天然のフェノール化合物は大部分がグリコシル化された形態で存在しているが、これら化合物は、腸内細菌の分泌する酵素によりグリコシル基が切りはなされて、アグリコンの形態とならなければ人体には吸収されず、その生体利用率は個体の腸内菌叢の種類組成による。
【０００４】
さて、目下、低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）の酸化が動脈硬化の重要な発病因子であることが既に証明されている（Y. Fukuda、M. Nagata、T. OsawaおよびM. Namiki、「Agric. Biol. Chem.,」、１９８６年、第５０巻、ｐ．８５７−８６２：非特許文献３参照）。ＬＤＬの多価不飽和脂肪酸がフリーラジカルまたは活性酸素の攻撃を受けると、酸化型ＬＤＬ（ｏｘ−ＬＤＬ）が形成される。そのｏｘ−ＬＤＬがマクロファージに貪食されることで泡沫細胞が形成され、血管に沈着して脂肪線条ができる。そして、平滑筋細胞の増殖と間質細胞の繊維化を経て徐々に硬化斑に変わってゆき、粥状動脈硬化となるのである。既に多くの抗酸化剤、例えばビタミンＥおよびブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）などに、ＬＤＬ酸化を抑える効果があることは実証されている（H. Katsuzaki、S. KawakishiおよびT. Osawa、「Phytochem., 」、１９９４年、第３５巻、ｐ．７７３−７７６：非特許文献４参照）。また同時に数多くの研究により、無糖体のセサミノールが銅イオンに誘発されるヒトのＬＤＬ酸化を抑制でき、その抑制効果はエピガロカテキンガレート（(-)-Epigallocatechin gallate,ＥＧＣＧ）、ビタミンＥおよびブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）よりも優れ、かつ濃度依存性を備えるということが示されてもいる（H. Katsuzaki、S. KawakishiおよびT. Osawa、「Phytochem., 」、１９９４年、第３５巻、ｐ．７７３−７７６；I. C. Sheih、H. Y. Wu、Y. J. LaiおよびC. F. Lin、「Food Sci. Agric. Chem.」、２０００年、第２巻、ｐ．３５−４０；S. S. Tzean、J. L. Chen、G. Y. Liou、C. C. Chenおよび W. H. Hsu、「Food Industry Research and Development Institute, Taiwan」、１９９０年、第１巻、p. ２−１６：非特許文献４、５および６参照）。
【０００５】
近年ゴマに関してなされている研究の大部分は、ゴマ種子中に含まれるリグナンとリグナン配糖体の組成およびその抗酸化作用に重点が置かれている（K. I. Kuriyama、K. Y. TsuchiyaおよびT. Murui、「Nippon Nogeikagaku Kaishi」、１９９３年、第６７巻、ｐ．１６９３−１７００；M. H. Kang、Y. Kawai、M. NaitoおよびT. Osawa、「J. Nutr.,」、１９９９年、第１２９巻、ｐ．１８８５−１８９０；Y. Fukuda、M. Nagata、T. OsawaおよびM. Namiki、「Agric. Biol. Chem.,」、１９８６年、第５０巻、ｐ．８５７−８６２：非特許文献１、７および３参照）。しかし、これまでに、ゴマ中のリグナン配糖体のグリコシル基を予め切りはなしておくことで人体に吸収されやすいリグナン製品を作り出す、ということについての開示は全くない。
【０００６】
【非特許文献１】K. I. Kuriyama、K. Y. TsuchiyaおよびT. Murui、「Nippon Nogeikagaku Kaishi」、１９９３年、第６７巻、ｐ．１６９３−１７００
【非特許文献２】Y. S. ShyuおよびL. S. Hwang、「Food Res.Int,.」２００２年、第３５巻、ｐ．３５７−３６５
【非特許文献３】Y. Fukuda、M. Nagata、T. OsawaおよびM. Namiki、「Agric. Biol. Chem.,」、１９８６年、第５０巻、ｐ．８５７−８６２
【非特許文献４】H. Katsuzaki、S. KawakishiおよびT. Osawa、「Phytochem., 」、１９９４年、第３５巻、ｐ．７７３−７７６
【非特許文献５】I. C. Sheih、H. Y. Wu、Y. J. LaiおよびC. F. Lin、「Food Sci. Agric. Chem.」、２０００年、第２巻、ｐ．３５−４０
【非特許文献６】S. S. Tzean、J. L. Chen、G. Y. Liou、C. C. Chenおよび W. H. Hsu、「Food Industry Research and Development Institute, Taiwan」、１９９０年、第１巻、p. ２−１６
【非特許文献７】M. H. Kang、Y. Kawai、M. NaitoおよびT. Osawa、「J. Nutr.,」、１９９９年、第１２９巻、ｐ．１８８５−１８９０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、ゴマ発酵組成物およびその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、セサミノールを含む油抽出後のゴマ粕廃棄物を利用し、菌株をスクリーニングして発酵を行い、セサミノール（式１）のグリコシル基を予め切りはなしておくことで、個体の腸内菌叢の種類組成の影響を受けないような、人体に吸収され易いセサミノール（式２）を形成しようとするものである。
【化１】
【化２】
【０００９】
よって本発明は、少なくとも１種のアスペルギルス菌株で発酵させ、アグリコンゴマリグナン（aglycon sesame lignans）の含量を９５％以上とさせるゴマ発酵組成物の製造方法の提供を目的としている。
【００１０】
その目的を達成するため、本発明の提供するゴマ発酵組成物の製造方法は、ゴマまたはその他ゴマリグナンを含む物質を原料とし、少なくとも１種の菌株で発酵させた後に抽出して得るという工程を含む。
【００１１】
本発明（１）は、ゴマまたはその他ゴマリグナンを含む物質を原料とし、少なくとも１種の菌株で発酵させてから抽出してゴマ発酵組成物を得る工程を含む、ゴマ発酵組成物の製造方法である。
本発明（２）は、原料が、ゴマ粕またはゴマを含む、本発明(1)の製造方法である。
本発明（３）は、ゴマ発酵組成物が、ゴマリグナン配糖体（sesame lignan glycosides）およびアグリコンゴマリグナン（aglycon sesame lignans）を含む、本発明(1)の製造方法である。
本発明（４）は、アグリコンゴマリグナンの含量が８０％以上である本発明(3)の製造方法である。
本発明（５）は、アグリコンゴマリグナンの含量が９５％以上である本発明(3)の製造方法である。
本発明（６）は、菌株が、アスペルギルス属（Aspergillus）を含む、本発明(1)の製造方法である。
本発明（７）は、アスペルギルス属（Aspergillus）が、アスペルギルスオリゼー（Aspergillus oryzae）および／またはアスペルギルスニガー（Aspergillus niger）を含む、本発明(6)の製造方法である。
本発明（８）は、アスペルギルスオリゼー（Aspergillus oryzae）が、ＡＴＣＣ１４８９５、ＡＴＣＣ２０４２３、ＡＴＣＣ１０１１、ＡＴＣＣ１１４８９およびＡＴＣＣ１４１５６からなる群より選択される、本発明(7)の製造方法である。
本発明（９）は、アスペルギルスニガー（Aspergillus niger）が、ＡＴＣＣ１６８８８、ＡＴＣＣ４２４１８、ＡＴＣＣ６２７５、ＡＴＣＣ９０２９およびＡＴＣＣ９６４２からなる群より選択される、本発明(7)の製造方法である。
本発明（１０）は、菌株が、バチルス属（Bacillus）を含む、本発明(1)の製造方法である。
本発明（１１）は、バチルス属（Bacillus）が、バチルスサーキュランス（Bacillus circulans）を含む、本発明(10)の製造方法である。
本発明（１２）は、バチルスサーキュランス(Bacillus circulans)が、ＡＴＣＣ１１５９０およびＤＳＭ５９６からなる群より選択される、本発明(11)の製造方法である。
本発明（１３）は、本発明(1)の方法によって製造されるゴマ発酵組成物であって、アグリコンゴマリグナンの含量が８０％以上であるゴマ発酵組成物である。
本発明（１４）は、アグリコンゴマリグナンを有効量含む、癌を予防または治療するために用いられる組成物である。
本発明（１５）は、ゴマリグナン配糖体およびアグリコンゴマリグナンを含む、本発明(14)の組成物である。
本発明（１６）は、アグリコンゴマリグナンの含量が８０％以上である本発明(14)の組成物である。
本発明（１７）は、アグリコンゴマリグナンの含量が９５％以上である本発明(14)の組成物である。
本発明（１８）は、癌が、子宮頚癌、肝臓癌、乳癌、胃癌および大腸癌を含む、本発明(14)の組成物である。
本発明（１９）は、経口で所要の個体に投薬される、本発明(14)の組成物である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により製造されるゴマ発酵組成物は、そのアグリコンゴマリグナンの含量が９５％以上となり、抗酸化効果、ヒト低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）酸化抑制効果および癌細胞成長抑制効果を備える。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の上述およびその他の目的、特徴ならびに長所がより明らかに理解されるよう、以下に好ましい実施例を挙げ、図面と対応させながら詳細に説明する。
【００１４】
本発明は、ゴマを搾油した後に得られるゴマ粕またはゴマリグナン配糖体（sesame lignan glycosides）を豊富に含むその他のゴマ抽出液、例えば、原料としてのゴマを蒸留水と混合したものを用いる。原料はコールドプレスを使用したゴマ粕抽出液とするのが好ましい。混合割合は１：１〜１：５とする。上記混合物を１１０℃〜１３０℃で１０分〜２０分加熱した後、少なくとも１種の菌株を加えて発酵させる。菌株としては、アスペルギルス属(Aspergillus)のアスペルギルスオリゼー(Aspergillus oryzae)および／またはアスペルギルスニガー(Aspergillus niger)を挙げることができる。アスペルギルスオリゼーとして好ましいのは、ＡＴＣＣ１４８９５、ＡＴＣＣ２０４２３、ＡＴＣＣ１０１１、ＡＴＣＣ１１４８９およびＡＴＣＣ１４１５６などの菌株であり、最も好ましいのはＡＴＣＣ２０４２３である。また、アスペルギルスニガーとして好ましいのはＡＴＣＣ１６８８８、ＡＴＣＣ４２４１８、ＡＴＣＣ６２７５、ＡＴＣＣ９０２９およびＡＴＣＣ９６４２などの菌株であり、最も好ましいのはＡＴＣＣ１６８８８である。さらに、必要に応じて、バチルス属(Bacillus)の菌株、好ましくはバチラスサーキュランス(Bacillus circulans)を追加することもでき、バチラスサーキュランスのうちで最も好ましいのは、ＡＴＣＣ１１５９０およびＤＳＭ５９６である。発酵過程においては、１種または１種よりも多い微生物を使用することができ、１種よりも多い微生物を用いる場合は順次または同時に添加する方式で発酵させる。発酵は２５℃〜３５℃の温度下、４８時間〜７２時間培養するという条件下で行われる。最後に、発酵抽出液を６０℃〜１００℃中に置き、２４時間〜４８時間加熱して乾燥させてから、加熱または照射により滅菌すれば、本発明のゴマ発酵組成物が得られる。
【００１５】
本発明のゴマ発酵組成物は、ゴマリグナン配糖体（sesame lignan glycosides）と、アグリコンゴマリグナン（aglycon sesame lignans）とを含み、アグリコンゴマリグナンの含量が８０％以上、好ましくは９５％以上であり、抗酸化効果、低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）酸化抑制効果および癌細胞成長抑制効果を備える。
【００１６】
未発酵のゴマ組成物と比較して、本発明にかかる発酵組成物は、総抗酸化能(Trolox equivalent antioxidant capacity;ＴＥＡＣ)および１,１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl；ＤＰＰＨ)消去能が共に３倍以上高く、脂質過酸化抑制能(thiobabituric acid reactive substance;ＴＢＡＲＳ)が５７％以上向上し、また、ＬＤＬ酸化のラグフェーズタイム(lag phase time)が２．８倍以上高い。このことより、本発明の発酵組成物が、フリーラジカル消去作用、ヒトＬＤＬ酸化抑制作用および細胞保護作用を備えていることがわかる。
【００１７】
さらに、本発明の発酵組成物は癌細胞成長抑制能をも備えている。本発明の発酵組成物の子宮頚癌細胞（Ｈｅｌａ）、胃腺癌細胞（ＡＧＳ）、乳癌細胞（ＭＣＦ−７）を抑制する能力は、未発酵のものの３倍〜６倍もあり、肝臓癌細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）および大腸腺癌細胞（Ｃａｃｏ−２）を抑制する能力は６０％以上の向上を示す。よって、本発明の発酵組成物は癌治療時の補充剤として使用することが可能である。
【実施例】
【００１８】
実施例１：ゴマ発酵組成物の作製
２５０ｍＬの三角フラスコに４０％〜６０％（ｗ／ｖ）のゴマ粕原料を入れ、１ｋｇ／ｃｍ２で１５分間蒸気滅菌した後、３８℃まで冷却し、０．５％（ｖ／ｗ）アスペルギルスニガー（Aspergillus niger）の胞子（１０８／ｍＬ）を接種し、３０℃下７２時間培養してから、６０℃で一晩乾燥させた。
【００１９】
実施例２：ゴマリグナンの含量分析
ゴマ粕発酵物１ｇを取り、７０％エタノール１０ｍＬを加え、室温下３時間抽出した後、ろ過し、高速液体クロマトグラフシステム(日立社製、L-7000)でサンプル中のゴマリグナンの含量を分析した。分析は、内径２５０ｍｍ×４．６ｍｍのクロマトカラム（フェノメネックス社製、C18 RP-100）を用い、波長２８０ｎｍ、流速０．８ｍｌ／分に設定した。移動相はＡ＝水およびＢ＝メタノールとし、直線濃度勾配を６０分間行い徐々にＢ溶液を９０％まで増加させると共にＡ溶液を１０％まで減少させてから、５分間でＡ溶液を９０％まで戻すことにより行った。図１ａおよび図１ｂに示されるように、未発酵ゴマ粕中には、セサミノールトリグリコシド（sesaminol triglycosides）９３％、セサミノールジグリコシド（sesaminol diglycosides）５％、セサミノールグリコシド（sesaminol glycosides）１．５％、および非糖部分のセサミノール（sesaminol）０．５％が含まれているが、特定の菌株で発酵させることによって、非糖部分のセサミノール（sesaminol）の含量を９８％まで上げることができた。
【００２０】
実施例３：抗酸化能の分析
ゴマ粕発酵物を１ｇ取り、７０％エタノール１０ｍＬを加え、室温下３時間抽出してから、減圧濃縮機により４５℃で濃縮し、乾燥した濃縮抽出物を得た。重量計量後、適量のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶剤（１０ ｍｇ／ｍＬ）を加え、下記する各抗酸化能分析をそれぞれ行った。
【００２１】
（ａ）総抗酸化能(trolox equivalent antioxidant capacity ; ＴＥＡＣ) 測定
Ａｒｔｓらの提示した方法（M. J. T. J. Arts、J. S. Dallinga、H. -P. Voss、 G. R. M. M. HaenenおよびA. Bast、「Food Chem」、88:567-570 (2004)）を参考にして発酵物を分析した。適度な濃度のゴマ粕発酵物抽出液を５μｌを取り、使用直前に調製したＡＢＴＳ＋(2,2-Azino-di-3-ethyl-benzthi-azoline sulphonate)陽イオンラジカル溶液２００μｌを加えてから均一に振盪混合し、その波長７３４ｎｍにおける吸光度を測定した。また、ゴマ粕発酵物抽出液をビタミンＥ誘導体（6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid；Ｔｒｏｌｏｘ）に置き換えて上述の実験手順を繰り返し、これを対照群とした。得られる吸光度が低いほど、その被験サンプルの水素供給能力はより優れているということを意味する。得られた実験データはビタミンＥ誘導体（Ｔｒｏｌｏｘ）に相当する濃度として表され、ビタミンＥ誘導体（Ｔｒｏｌｏｘ）濃度が高いほど、そのサンプルの抗酸化能力はより強いということを示す。なお、測定値はすべて３重測定によるものである。
【００２２】
（ｂ）１,１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）消去能の測定
Ｓｈｉｍａｄａらの提示した方法（K. Shimada、K. Fujikwa、K. YaharaおよびT. Nakamura、「J. Agric. Food Chem.,」、40: 945-948 (1992)）を参考にして発酵物の分析を行った。適度な濃度のゴマ粕発酵物抽出液を１ｍＬ取り、使用直前に調製した０．５ｍＭ ＤＰＰＨメタノール溶液０．２５ｍＬを加えてから、均一に振盪混合し、室温下で３０分静置した後、分光光度計で波長５１７ｎｍにおける吸光度を測定した。上記反応中の発酵物質をメタノールに置き換えてブランク群とした。かつ、ゴマ粕発酵物抽出液をビタミンＥ誘導体（Ｔｒｏｌｏｘ）に置き換えて上述の実験手順を繰り返し、対照群とした。得られた実験データはビタミンＥ誘導体（Ｔｒｏｌｏｘ）に相当する濃度として表され、ビタミンＥ誘導体（Ｔｒｏｌｏｘ）濃度が高いほど、そのサンプルの抗酸化能はより強いということを示す。なお、測定値はすべて３重測定によるものである。
【００２３】
（ｃ） 脂質過酸化抑制能の測定（thiobabituric acid reactive substance;ＴＢＡＲＳ）
ＴａｍｕｒａおよびＳｈｉｂａｍｏｔｏの提示した方法（H. TamuraおよびT. Shibamoto、「J. Am. Oil Chem. Soc.」、68: 941-943 (1991)）を参考にしてゴマ粕発酵物抽出液の分析を行った。レシチンを０．７５ｇ量り取り、２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）３００ｍＬを加え、Omni Mixer 2ホモナイザー（ＧＡ、ＵＳＡ）を用いてリポソーム懸濁液（２．５ｍｇ／ｍＬ）を調製した。調製したリポソーム懸濁液を２ｍＬ取り、２５ｍＭのＦｅＣｌ３０．１ｍＬと、２５ｍＭのビタミンＣ（Ｌ−（＋）−アスコルビン酸）０．１ｍＬと、２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ ７．４）１．２ｍＬおよび０．５ｍＬと、１００μＭのゴマ粕発酵物抽出液とをそれぞれ加え、遮光して３７℃下２時間反応させた。その後、さらに２０ｍｇ／ｍＬのブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）１ｍＬと、１％のターシャリーブチルアルコール（ＴＢＡ）２ｍＬと、２．８％のトリクロル酢酸（ＴＣＡ）１ｍＬとをそれぞれ加え、１００℃の湯浴で２０分加熱してから、波長５３２ｎｍにおけるその吸光度を測定した。また、ゴマ粕発酵物抽出液をビタミンＥ誘導体（Ｔｒｏｌｏｘ）に置き換えて上述の実験手順を繰り返し、これを対照群とした。波長５３２ｎｍにおける吸光度が低いほど、生成されるマロンジアルデヒド（malondialdehyde, ＭＤＡ） 生成物が少ない、つまり、サンプルの脂質過酸化抑制能が高いということを意味する。得られた実験データはビタミンＥ誘導体に相当する濃度として表され、それは脂質過酸化抑制能力を示す。なお、測定値はすべて３重測定によるものである。
【００２４】
表１を参照されたい。ゴマ粕発酵抽出液の総抗酸化能およびＤＰＰＨ消去能は、未発酵ゴマ粕のそれぞれ３．０７および３．１２倍であった。また、ゴマ粕発酵抽出液の脂質過酸化抑制能は、未発酵ゴマ粕より５７．６％向上していた。このことは、本発明のゴマ粕発酵抽出液が、フリーラジカルを消去して細胞が傷つかないよう保護することができると共に、脂質の抗酸化剤としても機能し得ることを示している。
【００２５】
（表１）発酵および未発酵ゴマ粕の総抗酸化能試験（ＴＥＡＣ）、ＤＰＰＨフリーラジカル消去能試験および脂質過酸化抑制能（ＴＢＡＲＳ）試験の比較
【００２６】
実施例４：ヒト低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）過酸化抑制の分析
ＳｈｙｕおよびＨｗａｎｇが提示した方法（Y. S. ShyuおよびL. S. Hwang, Food Res. Int., 35: 357-365 (2002)）を参考にして発酵物の分析を行った。一晩絶食した健常成人男性から血清を採取し、超高速遠心分離によりＬＤＬを分離した。分離したＬＤＬをｐＨ７．４のリン酸緩衝液（１２５ｍＭ ＮａＣｌを含む)で４℃にて一晩透析した後、電気泳動によりＬＤＬの分離効果を確認した。ＬＤＬコレステロールの濃度は、コレステロール酵素アッセイキットで検出した。さらに、上述の分離したＬＤＬコレステロール（１００μｇ／ｍＬ）を１５０μｌ取り、適度な濃度のゴマ粕発酵物抽出液２０μｌおよびＰＢＳ緩衝液６０μｌを加え、最後に、硫酸銅（ＣｕＳＯ４）溶液を加えて、最終濃度を５μＭとした。得られた混合溶液中に含まれる共役ジエンの波長２３２ｎｍにおける吸光度の変化を、分光光度計（PowerWave（登録商標））で１０分毎に連続して測定すると共に、そのＬＤＬ酸化のラグフェーズ（曲線の最大勾配と初期吸光値とのインターバル)を計算して分で表した。酸化のラグフェーズタイムが長いほど、その被験サンプルの抗酸化能は高いということを意味する。図２を参照すると分かるように、発酵させたゴマ粕抽出液のＬＤＬ酸化ラグフェーズタイム（lag phase time）（４６２±２０分）は、未発酵の酸化ラグフェーズタイム（１２０±８．６分）に比べて約２．８５倍も高まっており、ひいては１．２５μＭビタミンＥ誘導体の酸化ラグフェーズタイム（１７０±１０分）よりも長かった。このことは、本発明による発酵させたゴマ抽出液がヒトのＬＤＬ抗酸化剤となり得、動脈硬化前期の予防用補充剤としての使用が可能であることを示す。
【００２７】
実施例５：癌細胞成長抑制の分析
正常ヒト肺線維芽細胞（ＷＩ−３８）、ヒト乳癌細胞（ＭＣＦ−７）、子宮頚癌細胞 （Ｈｅｌａ）、肝臓癌細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、大腸腺癌細胞（Ｃａｃｏ−２）および胃腺癌細胞（ＡＧＳ）を、好ましい培地を含む９６穴培養プレート（３×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）中で接種し、３７℃、５%ＣＯ２の培養箱中で一日培養した。その後、適度な濃度のサンプルを２０μｌ加え７２時間作用させてから、培地を吸い取って捨て、培地１００μｌおよびＭＴＳ試剤２０μｌを加えて１時間反応させ、色が褐色に変わるのを待って、波長４９０ｎｍにおける吸光度を測定し、その細胞生存率を計算した。測定値はすべて３重測定によるものである。図３を参照すると分かるように、発酵させたゴマ組成物の子宮頚癌細胞（Ｈｅｌａ）、胃腺癌細胞（ＡＧＳ）および大腸腺癌細胞（Ｃａｃｏ−２）の増殖に対する抑制能は、それぞれ未発酵のものの３．３倍、６．３倍および４．２倍であった。肝臓癌細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）および乳癌細胞（ＭＣＦ−７）については、未発酵のゴマ粕抽出液は癌細胞抑制能力を備えず、発酵させたゴマ粕抽出液の増殖抑制能力はそれぞれ６５．４％および６３．６％向上していた。さらに、発酵させたゴマは正常ヒト肺繊維芽細胞（ＷＩ−３８）に対して細胞毒性を持たないため、癌治療の補充剤ともなり得る。
【００２８】
本発明を好ましい実施形態によって以上のように開示したが、これは本発明を限定しようとするものではなく、当業者であれば、本発明の精神と範囲を逸脱しない限りにおいて変更および修飾を施すことができる。よって、本発明の保護範囲は、添付の特許請求の範囲で定義されたものが基準とされる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１ａ】未発酵ゴマ組成物中のゴマリグナンの液体クロマトチャートである。
【図１ｂ】ゴマ発酵組成物中のゴマリグナンの液体クロマトチャートである。
【図２】未発酵ゴマ組成物と発酵させたゴマ組成物のヒトＬＤＬに対する影響を比較する図である。
【図３】未発酵ゴマ組成物と発酵させたゴマ組成物の抗癌能力を比較する図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リグナンの製造方法に関し、特にアグリコンゴマリグナン組成物の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ゴマ種子中には大量のリグナン(lignans)およびそのリグナン配糖体(lignan glycosides)が含まれている。このうちリグナン配糖体は、主に油除去後のゴマ粕中に存在し、セサミノールグルコシド(sesaminol glucosides)、ピノレジノールグルコシド(pinoresinol glucosides)およびセサモリノールグルコシド(sesamolinol glucosides)などからなり(K. I. Kuriyama、K. Y. TsuchiyaおよびT. Murui、「Nippon Nogeikagaku Kaishi」、１９９３年、第６７巻、ｐ．１６９３−１７００：非特許文献１参照)、その総含量は約０．２〜１％（ｗ／ｗ）で、セサミノールグルコシドが９５％以上を占める(Y. S. ShyuおよびL. S. Hwang、「Food Res.Int,.」２００２年、第３５巻、ｐ．３５７−３６５：非特許文献第２参照)。
【０００３】
天然のフェノール化合物は大部分がグリコシル化された形態で存在しているが、これら化合物は、腸内細菌の分泌する酵素によりグリコシル基が切りはなされて、アグリコンの形態とならなければ人体には吸収されず、その生体利用率は個体の腸内菌叢の種類組成による。
【０００４】
さて、目下、低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）の酸化が動脈硬化の重要な発病因子であることが既に証明されている（Y. Fukuda、M. Nagata、T. OsawaおよびM. Namiki、「Agric. Biol. Chem.,」、１９８６年、第５０巻、ｐ．８５７−８６２：非特許文献３参照）。ＬＤＬの多価不飽和脂肪酸がフリーラジカルまたは活性酸素の攻撃を受けると、酸化型ＬＤＬ（ｏｘ−ＬＤＬ）が形成される。そのｏｘ−ＬＤＬがマクロファージに貪食されることで泡沫細胞が形成され、血管に沈着して脂肪線条ができる。そして、平滑筋細胞の増殖と間質細胞の繊維化を経て徐々に硬化斑に変わってゆき、粥状動脈硬化となるのである。既に多くの抗酸化剤、例えばビタミンＥおよびブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）などに、ＬＤＬ酸化を抑える効果があることは実証されている（H. Katsuzaki、S. KawakishiおよびT. Osawa、「Phytochem., 」、１９９４年、第３５巻、ｐ．７７３−７７６：非特許文献４参照）。また同時に数多くの研究により、無糖体のセサミノールが銅イオンに誘発されるヒトのＬＤＬ酸化を抑制でき、その抑制効果はエピガロカテキンガレート（(-)-Epigallocatechin gallate,ＥＧＣＧ）、ビタミンＥおよびブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）よりも優れ、かつ濃度依存性を備えるということが示されてもいる（H. Katsuzaki、S. KawakishiおよびT. Osawa、「Phytochem., 」、１９９４年、第３５巻、ｐ．７７３−７７６；I. C. Sheih、H. Y. Wu、Y. J. LaiおよびC. F. Lin、「Food Sci. Agric. Chem.」、２０００年、第２巻、ｐ．３５−４０；S. S. Tzean、J. L. Chen、G. Y. Liou、C. C. Chenおよび W. H. Hsu、「Food Industry Research and Development Institute, Taiwan」、１９９０年、第１巻、p. ２−１６：非特許文献４、５および６参照）。
【０００５】
近年ゴマに関してなされている研究の大部分は、ゴマ種子中に含まれるリグナンとリグナン配糖体の組成およびその抗酸化作用に重点が置かれている（K. I. Kuriyama、K. Y. TsuchiyaおよびT. Murui、「Nippon Nogeikagaku Kaishi」、１９９３年、第６７巻、ｐ．１６９３−１７００；M. H. Kang、Y. Kawai、M. NaitoおよびT. Osawa、「J. Nutr.,」、１９９９年、第１２９巻、ｐ．１８８５−１８９０；Y. Fukuda、M. Nagata、T. OsawaおよびM. Namiki、「Agric. Biol. Chem.,」、１９８６年、第５０巻、ｐ．８５７−８６２：非特許文献１、７および３参照）。しかし、これまでに、ゴマ中のリグナン配糖体のグリコシル基を予め切りはなしておくことで人体に吸収されやすいリグナン製品を作り出す、ということについての開示は全くない。
【０００６】
【非特許文献１】K. I. Kuriyama、K. Y. TsuchiyaおよびT. Murui、「Nippon Nogeikagaku Kaishi」、１９９３年、第６７巻、ｐ．１６９３−１７００
【非特許文献２】Y. S. ShyuおよびL. S. Hwang、「Food Res.Int,.」２００２年、第３５巻、ｐ．３５７−３６５
【非特許文献３】Y. Fukuda、M. Nagata、T. OsawaおよびM. Namiki、「Agric. Biol. Chem.,」、１９８６年、第５０巻、ｐ．８５７−８６２
【非特許文献４】H. Katsuzaki、S. KawakishiおよびT. Osawa、「Phytochem., 」、１９９４年、第３５巻、ｐ．７７３−７７６
【非特許文献５】I. C. Sheih、H. Y. Wu、Y. J. LaiおよびC. F. Lin、「Food Sci. Agric. Chem.」、２０００年、第２巻、ｐ．３５−４０
【非特許文献６】S. S. Tzean、J. L. Chen、G. Y. Liou、C. C. Chenおよび W. H. Hsu、「Food Industry Research and Development Institute, Taiwan」、１９９０年、第１巻、p. ２−１６
【非特許文献７】M. H. Kang、Y. Kawai、M. NaitoおよびT. Osawa、「J. Nutr.,」、１９９９年、第１２９巻、ｐ．１８８５−１８９０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、ゴマ発酵組成物およびその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、セサミノールを含む油抽出後のゴマ粕廃棄物を利用し、菌株をスクリーニングして発酵を行い、セサミノール（式１）のグリコシル基を予め切りはなしておくことで、個体の腸内菌叢の種類組成の影響を受けないような、人体に吸収され易いセサミノール（式２）を形成しようとするものである。
【化１】
【化２】
【０００９】
よって本発明は、少なくとも１種のアスペルギルス菌株で発酵させ、アグリコンゴマリグナン（aglycon sesame lignans）の含量を９５％以上とさせるゴマ発酵組成物の製造方法の提供を目的としている。
【００１０】
その目的を達成するため、本発明の提供するゴマ発酵組成物の製造方法は、ゴマまたはその他ゴマリグナンを含む物質を原料とし、少なくとも１種の菌株で発酵させた後に抽出して得るという工程を含む。
【００１１】
本発明（１）は、ゴマまたはその他ゴマリグナンを含む物質を原料とし、少なくとも１種の菌株で発酵させてから抽出してゴマ発酵組成物を得る工程を含む、ゴマ発酵組成物の製造方法である。
本発明（２）は、原料が、ゴマ粕またはゴマを含む、本発明(1)の製造方法である。
本発明（３）は、ゴマ発酵組成物が、ゴマリグナン配糖体（sesame lignan glycosides）およびアグリコンゴマリグナン（aglycon sesame lignans）を含む、本発明(1)の製造方法である。
本発明（４）は、アグリコンゴマリグナンの含量が８０％以上である本発明(3)の製造方法である。
本発明（５）は、アグリコンゴマリグナンの含量が９５％以上である本発明(3)の製造方法である。
本発明（６）は、菌株が、アスペルギルス属（Aspergillus）を含む、本発明(1)の製造方法である。
本発明（７）は、アスペルギルス属（Aspergillus）が、アスペルギルスオリゼー（Aspergillus oryzae）および／またはアスペルギルスニガー（Aspergillus niger）を含む、本発明(6)の製造方法である。
本発明（８）は、アスペルギルスオリゼー（Aspergillus oryzae）が、ＡＴＣＣ１４８９５、ＡＴＣＣ２０４２３、ＡＴＣＣ１０１１、ＡＴＣＣ１１４８９およびＡＴＣＣ１４１５６からなる群より選択される、本発明(7)の製造方法である。
本発明（９）は、アスペルギルスニガー（Aspergillus niger）が、ＡＴＣＣ１６８８８、ＡＴＣＣ４２４１８、ＡＴＣＣ６２７５、ＡＴＣＣ９０２９およびＡＴＣＣ９６４２からなる群より選択される、本発明(7)の製造方法である。
本発明（１０）は、菌株が、バチルス属（Bacillus）を含む、本発明(1)の製造方法である。
本発明（１１）は、バチルス属（Bacillus）が、バチルスサーキュランス（Bacillus circulans）を含む、本発明(10)の製造方法である。
本発明（１２）は、バチルスサーキュランス(Bacillus circulans)が、ＡＴＣＣ１１５９０およびＤＳＭ５９６からなる群より選択される、本発明(11)の製造方法である。
本発明（１３）は、本発明(1)の方法によって製造されるゴマ発酵組成物であって、アグリコンゴマリグナンの含量が８０％以上であるゴマ発酵組成物である。
本発明（１４）は、アグリコンゴマリグナンを有効量含む、癌を予防または治療するために用いられる組成物である。
本発明（１５）は、ゴマリグナン配糖体およびアグリコンゴマリグナンを含む、本発明(14)の組成物である。
本発明（１６）は、アグリコンゴマリグナンの含量が８０％以上である本発明(14)の組成物である。
本発明（１７）は、アグリコンゴマリグナンの含量が９５％以上である本発明(14)の組成物である。
本発明（１８）は、癌が、子宮頚癌、肝臓癌、乳癌、胃癌および大腸癌を含む、本発明(14)の組成物である。
本発明（１９）は、経口で所要の個体に投薬される、本発明(14)の組成物である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により製造されるゴマ発酵組成物は、そのアグリコンゴマリグナンの含量が９５％以上となり、抗酸化効果、ヒト低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）酸化抑制効果および癌細胞成長抑制効果を備える。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の上述およびその他の目的、特徴ならびに長所がより明らかに理解されるよう、以下に好ましい実施例を挙げ、図面と対応させながら詳細に説明する。
【００１４】
本発明は、ゴマを搾油した後に得られるゴマ粕またはゴマリグナン配糖体（sesame lignan glycosides）を豊富に含むその他のゴマ抽出液、例えば、原料としてのゴマを蒸留水と混合したものを用いる。原料はコールドプレスを使用したゴマ粕抽出液とするのが好ましい。混合割合は１：１〜１：５とする。上記混合物を１１０℃〜１３０℃で１０分〜２０分加熱した後、少なくとも１種の菌株を加えて発酵させる。菌株としては、アスペルギルス属(Aspergillus)のアスペルギルスオリゼー(Aspergillus oryzae)および／またはアスペルギルスニガー(Aspergillus niger)を挙げることができる。アスペルギルスオリゼーとして好ましいのは、ＡＴＣＣ１４８９５、ＡＴＣＣ２０４２３、ＡＴＣＣ１０１１、ＡＴＣＣ１１４８９およびＡＴＣＣ１４１５６などの菌株であり、最も好ましいのはＡＴＣＣ２０４２３である。また、アスペルギルスニガーとして好ましいのはＡＴＣＣ１６８８８、ＡＴＣＣ４２４１８、ＡＴＣＣ６２７５、ＡＴＣＣ９０２９およびＡＴＣＣ９６４２などの菌株であり、最も好ましいのはＡＴＣＣ１６８８８である。さらに、必要に応じて、バチルス属(Bacillus)の菌株、好ましくはバチラスサーキュランス(Bacillus circulans)を追加することもでき、バチラスサーキュランスのうちで最も好ましいのは、ＡＴＣＣ１１５９０およびＤＳＭ５９６である。発酵過程においては、１種または１種よりも多い微生物を使用することができ、１種よりも多い微生物を用いる場合は順次または同時に添加する方式で発酵させる。発酵は２５℃〜３５℃の温度下、４８時間〜７２時間培養するという条件下で行われる。最後に、発酵抽出液を６０℃〜１００℃中に置き、２４時間〜４８時間加熱して乾燥させてから、加熱または照射により滅菌すれば、本発明のゴマ発酵組成物が得られる。
【００１５】
本発明のゴマ発酵組成物は、ゴマリグナン配糖体（sesame lignan glycosides）と、アグリコンゴマリグナン（aglycon sesame lignans）とを含み、アグリコンゴマリグナンの含量が８０％以上、好ましくは９５％以上であり、抗酸化効果、低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）酸化抑制効果および癌細胞成長抑制効果を備える。
【００１６】
未発酵のゴマ組成物と比較して、本発明にかかる発酵組成物は、総抗酸化能(Trolox equivalent antioxidant capacity;ＴＥＡＣ)および１,１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl；ＤＰＰＨ)消去能が共に３倍以上高く、脂質過酸化抑制能(thiobabituric acid reactive substance;ＴＢＡＲＳ)が５７％以上向上し、また、ＬＤＬ酸化のラグフェーズタイム(lag phase time)が２．８倍以上高い。このことより、本発明の発酵組成物が、フリーラジカル消去作用、ヒトＬＤＬ酸化抑制作用および細胞保護作用を備えていることがわかる。
【００１７】
さらに、本発明の発酵組成物は癌細胞成長抑制能をも備えている。本発明の発酵組成物の子宮頚癌細胞（Ｈｅｌａ）、胃腺癌細胞（ＡＧＳ）、乳癌細胞（ＭＣＦ−７）を抑制する能力は、未発酵のものの３倍〜６倍もあり、肝臓癌細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）および大腸腺癌細胞（Ｃａｃｏ−２）を抑制する能力は６０％以上の向上を示す。よって、本発明の発酵組成物は癌治療時の補充剤として使用することが可能である。
【実施例】
【００１８】
実施例１：ゴマ発酵組成物の作製
２５０ｍＬの三角フラスコに４０％〜６０％（ｗ／ｖ）のゴマ粕原料を入れ、１ｋｇ／ｃｍ２で１５分間蒸気滅菌した後、３８℃まで冷却し、０．５％（ｖ／ｗ）アスペルギルスニガー（Aspergillus niger）の胞子（１０８／ｍＬ）を接種し、３０℃下７２時間培養してから、６０℃で一晩乾燥させた。
【００１９】
実施例２：ゴマリグナンの含量分析
ゴマ粕発酵物１ｇを取り、７０％エタノール１０ｍＬを加え、室温下３時間抽出した後、ろ過し、高速液体クロマトグラフシステム(日立社製、L-7000)でサンプル中のゴマリグナンの含量を分析した。分析は、内径２５０ｍｍ×４．６ｍｍのクロマトカラム（フェノメネックス社製、C18 RP-100）を用い、波長２８０ｎｍ、流速０．８ｍｌ／分に設定した。移動相はＡ＝水およびＢ＝メタノールとし、直線濃度勾配を６０分間行い徐々にＢ溶液を９０％まで増加させると共にＡ溶液を１０％まで減少させてから、５分間でＡ溶液を９０％まで戻すことにより行った。図１ａおよび図１ｂに示されるように、未発酵ゴマ粕中には、セサミノールトリグリコシド（sesaminol triglycosides）９３％、セサミノールジグリコシド（sesaminol diglycosides）５％、セサミノールグリコシド（sesaminol glycosides）１．５％、および非糖部分のセサミノール（sesaminol）０．５％が含まれているが、特定の菌株で発酵させることによって、非糖部分のセサミノール（sesaminol）の含量を９８％まで上げることができた。
【００２０】
実施例３：抗酸化能の分析
ゴマ粕発酵物を１ｇ取り、７０％エタノール１０ｍＬを加え、室温下３時間抽出してから、減圧濃縮機により４５℃で濃縮し、乾燥した濃縮抽出物を得た。重量計量後、適量のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶剤（１０ ｍｇ／ｍＬ）を加え、下記する各抗酸化能分析をそれぞれ行った。
【００２１】
（ａ）総抗酸化能(trolox equivalent antioxidant capacity ; ＴＥＡＣ) 測定
Ａｒｔｓらの提示した方法（M. J. T. J. Arts、J. S. Dallinga、H. -P. Voss、 G. R. M. M. HaenenおよびA. Bast、「Food Chem」、88:567-570 (2004)）を参考にして発酵物を分析した。適度な濃度のゴマ粕発酵物抽出液を５μｌを取り、使用直前に調製したＡＢＴＳ＋(2,2-Azino-di-3-ethyl-benzthi-azoline sulphonate)陽イオンラジカル溶液２００μｌを加えてから均一に振盪混合し、その波長７３４ｎｍにおける吸光度を測定した。また、ゴマ粕発酵物抽出液をビタミンＥ誘導体（6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid；Ｔｒｏｌｏｘ）に置き換えて上述の実験手順を繰り返し、これを対照群とした。得られる吸光度が低いほど、その被験サンプルの水素供給能力はより優れているということを意味する。得られた実験データはビタミンＥ誘導体（Ｔｒｏｌｏｘ）に相当する濃度として表され、ビタミンＥ誘導体（Ｔｒｏｌｏｘ）濃度が高いほど、そのサンプルの抗酸化能力はより強いということを示す。なお、測定値はすべて３重測定によるものである。
【００２２】
（ｂ）１,１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）消去能の測定
Ｓｈｉｍａｄａらの提示した方法（K. Shimada、K. Fujikwa、K. YaharaおよびT. Nakamura、「J. Agric. Food Chem.,」、40: 945-948 (1992)）を参考にして発酵物の分析を行った。適度な濃度のゴマ粕発酵物抽出液を１ｍＬ取り、使用直前に調製した０．５ｍＭ ＤＰＰＨメタノール溶液０．２５ｍＬを加えてから、均一に振盪混合し、室温下で３０分静置した後、分光光度計で波長５１７ｎｍにおける吸光度を測定した。上記反応中の発酵物質をメタノールに置き換えてブランク群とした。かつ、ゴマ粕発酵物抽出液をビタミンＥ誘導体（Ｔｒｏｌｏｘ）に置き換えて上述の実験手順を繰り返し、対照群とした。得られた実験データはビタミンＥ誘導体（Ｔｒｏｌｏｘ）に相当する濃度として表され、ビタミンＥ誘導体（Ｔｒｏｌｏｘ）濃度が高いほど、そのサンプルの抗酸化能はより強いということを示す。なお、測定値はすべて３重測定によるものである。
【００２３】
（ｃ） 脂質過酸化抑制能の測定（thiobabituric acid reactive substance;ＴＢＡＲＳ）
ＴａｍｕｒａおよびＳｈｉｂａｍｏｔｏの提示した方法（H. TamuraおよびT. Shibamoto、「J. Am. Oil Chem. Soc.」、68: 941-943 (1991)）を参考にしてゴマ粕発酵物抽出液の分析を行った。レシチンを０．７５ｇ量り取り、２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）３００ｍＬを加え、Omni Mixer 2ホモナイザー（ＧＡ、ＵＳＡ）を用いてリポソーム懸濁液（２．５ｍｇ／ｍＬ）を調製した。調製したリポソーム懸濁液を２ｍＬ取り、２５ｍＭのＦｅＣｌ３０．１ｍＬと、２５ｍＭのビタミンＣ（Ｌ−（＋）−アスコルビン酸）０．１ｍＬと、２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ ７．４）１．２ｍＬおよび０．５ｍＬと、１００μＭのゴマ粕発酵物抽出液とをそれぞれ加え、遮光して３７℃下２時間反応させた。その後、さらに２０ｍｇ／ｍＬのブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）１ｍＬと、１％のターシャリーブチルアルコール（ＴＢＡ）２ｍＬと、２．８％のトリクロル酢酸（ＴＣＡ）１ｍＬとをそれぞれ加え、１００℃の湯浴で２０分加熱してから、波長５３２ｎｍにおけるその吸光度を測定した。また、ゴマ粕発酵物抽出液をビタミンＥ誘導体（Ｔｒｏｌｏｘ）に置き換えて上述の実験手順を繰り返し、これを対照群とした。波長５３２ｎｍにおける吸光度が低いほど、生成されるマロンジアルデヒド（malondialdehyde, ＭＤＡ） 生成物が少ない、つまり、サンプルの脂質過酸化抑制能が高いということを意味する。得られた実験データはビタミンＥ誘導体に相当する濃度として表され、それは脂質過酸化抑制能力を示す。なお、測定値はすべて３重測定によるものである。
【００２４】
表１を参照されたい。ゴマ粕発酵抽出液の総抗酸化能およびＤＰＰＨ消去能は、未発酵ゴマ粕のそれぞれ３．０７および３．１２倍であった。また、ゴマ粕発酵抽出液の脂質過酸化抑制能は、未発酵ゴマ粕より５７．６％向上していた。このことは、本発明のゴマ粕発酵抽出液が、フリーラジカルを消去して細胞が傷つかないよう保護することができると共に、脂質の抗酸化剤としても機能し得ることを示している。
【００２５】
（表１）発酵および未発酵ゴマ粕の総抗酸化能試験（ＴＥＡＣ）、ＤＰＰＨフリーラジカル消去能試験および脂質過酸化抑制能（ＴＢＡＲＳ）試験の比較
【００２６】
実施例４：ヒト低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）過酸化抑制の分析
ＳｈｙｕおよびＨｗａｎｇが提示した方法（Y. S. ShyuおよびL. S. Hwang, Food Res. Int., 35: 357-365 (2002)）を参考にして発酵物の分析を行った。一晩絶食した健常成人男性から血清を採取し、超高速遠心分離によりＬＤＬを分離した。分離したＬＤＬをｐＨ７．４のリン酸緩衝液（１２５ｍＭ ＮａＣｌを含む)で４℃にて一晩透析した後、電気泳動によりＬＤＬの分離効果を確認した。ＬＤＬコレステロールの濃度は、コレステロール酵素アッセイキットで検出した。さらに、上述の分離したＬＤＬコレステロール（１００μｇ／ｍＬ）を１５０μｌ取り、適度な濃度のゴマ粕発酵物抽出液２０μｌおよびＰＢＳ緩衝液６０μｌを加え、最後に、硫酸銅（ＣｕＳＯ４）溶液を加えて、最終濃度を５μＭとした。得られた混合溶液中に含まれる共役ジエンの波長２３２ｎｍにおける吸光度の変化を、分光光度計（PowerWave（登録商標））で１０分毎に連続して測定すると共に、そのＬＤＬ酸化のラグフェーズ（曲線の最大勾配と初期吸光値とのインターバル)を計算して分で表した。酸化のラグフェーズタイムが長いほど、その被験サンプルの抗酸化能は高いということを意味する。図２を参照すると分かるように、発酵させたゴマ粕抽出液のＬＤＬ酸化ラグフェーズタイム（lag phase time）（４６２±２０分）は、未発酵の酸化ラグフェーズタイム（１２０±８．６分）に比べて約２．８５倍も高まっており、ひいては１．２５μＭビタミンＥ誘導体の酸化ラグフェーズタイム（１７０±１０分）よりも長かった。このことは、本発明による発酵させたゴマ抽出液がヒトのＬＤＬ抗酸化剤となり得、動脈硬化前期の予防用補充剤としての使用が可能であることを示す。
【００２７】
実施例５：癌細胞成長抑制の分析
正常ヒト肺線維芽細胞（ＷＩ−３８）、ヒト乳癌細胞（ＭＣＦ−７）、子宮頚癌細胞 （Ｈｅｌａ）、肝臓癌細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、大腸腺癌細胞（Ｃａｃｏ−２）および胃腺癌細胞（ＡＧＳ）を、好ましい培地を含む９６穴培養プレート（３×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）中で接種し、３７℃、５%ＣＯ２の培養箱中で一日培養した。その後、適度な濃度のサンプルを２０μｌ加え７２時間作用させてから、培地を吸い取って捨て、培地１００μｌおよびＭＴＳ試剤２０μｌを加えて１時間反応させ、色が褐色に変わるのを待って、波長４９０ｎｍにおける吸光度を測定し、その細胞生存率を計算した。測定値はすべて３重測定によるものである。図３を参照すると分かるように、発酵させたゴマ組成物の子宮頚癌細胞（Ｈｅｌａ）、胃腺癌細胞（ＡＧＳ）および大腸腺癌細胞（Ｃａｃｏ−２）の増殖に対する抑制能は、それぞれ未発酵のものの３．３倍、６．３倍および４．２倍であった。肝臓癌細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）および乳癌細胞（ＭＣＦ−７）については、未発酵のゴマ粕抽出液は癌細胞抑制能力を備えず、発酵させたゴマ粕抽出液の増殖抑制能力はそれぞれ６５．４％および６３．６％向上していた。さらに、発酵させたゴマは正常ヒト肺繊維芽細胞（ＷＩ−３８）に対して細胞毒性を持たないため、癌治療の補充剤ともなり得る。
【００２８】
本発明を好ましい実施形態によって以上のように開示したが、これは本発明を限定しようとするものではなく、当業者であれば、本発明の精神と範囲を逸脱しない限りにおいて変更および修飾を施すことができる。よって、本発明の保護範囲は、添付の特許請求の範囲で定義されたものが基準とされる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１ａ】未発酵ゴマ組成物中のゴマリグナンの液体クロマトチャートである。
【図１ｂ】ゴマ発酵組成物中のゴマリグナンの液体クロマトチャートである。
【図２】未発酵ゴマ組成物と発酵させたゴマ組成物のヒトＬＤＬに対する影響を比較する図である。
【図３】未発酵ゴマ組成物と発酵させたゴマ組成物の抗癌能力を比較する図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゴマまたはその他ゴマリグナンを含む物質を原料とし、少なくとも１種の菌株で発酵させてから抽出してゴマ発酵組成物を得る工程を含む、ゴマ発酵組成物の製造方法。
【請求項２】
原料が、ゴマ粕またはゴマを含む、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
ゴマ発酵組成物が、ゴマリグナン配糖体（sesame lignan glycosides）およびアグリコンゴマリグナン（aglycon sesame lignans）を含む、請求項１記載の製造方法。
【請求項４】
アグリコンゴマリグナンの含量が８０％以上である請求項３記載の製造方法。
【請求項５】
アグリコンゴマリグナンの含量が９５％以上である請求項３記載の製造方法。
【請求項６】
菌株が、アスペルギルス属（Aspergillus）を含む、請求項１記載の製造方法。
【請求項７】
アスペルギルス属（Aspergillus）が、アスペルギルスオリゼー（Aspergillus oryzae）および／またはアスペルギルスニガー（Aspergillus niger）を含む、請求項６記載の製造方法。
【請求項８】
アスペルギルスオリゼー（Aspergillus oryzae）が、ＡＴＣＣ１４８９５、ＡＴＣＣ２０４２３、ＡＴＣＣ１０１１、ＡＴＣＣ１１４８９およびＡＴＣＣ１４１５６からなる群より選択される、請求項７記載の製造方法。
【請求項９】
アスペルギルスニガー（Aspergillus niger）が、ＡＴＣＣ１６８８８、ＡＴＣＣ４２４１８、ＡＴＣＣ６２７５、ＡＴＣＣ９０２９およびＡＴＣＣ９６４２からなる群より選択される、請求項７記載の製造方法。
【請求項１０】
菌株が、バチルス属（Bacillus）を含む、請求項１記載の製造方法。
【請求項１１】
バチルス属（Bacillus）が、バチルスサーキュランス（Bacillus circulans）を含む、請求項１０記載の製造方法。
【請求項１２】
バチルスサーキュランス(Bacillus circulans)が、ＡＴＣＣ１１５９０およびＤＳＭ５９６からなる群より選択される、請求項１１記載の製造方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法によって製造されるゴマ発酵組成物であって、アグリコンゴマリグナンの含量が８０％以上であるゴマ発酵組成物。
【請求項１４】
アグリコンゴマリグナンを有効量含む、癌を予防または治療するために用いられる組成物。
【請求項１５】
ゴマリグナン配糖体およびアグリコンゴマリグナンを含む、請求項１４記載の組成物。
【請求項１６】
アグリコンゴマリグナンの含量が８０％以上である請求項１４記載の組成物。
【請求項１７】
アグリコンゴマリグナンの含量が９５％以上である請求項１４記載の組成物。
【請求項１８】
癌が、子宮頚癌、肝臓癌、乳癌、胃癌および大腸癌を含む、請求項１４記載の組成物。
【請求項１９】
経口で所要の個体に投薬される、請求項１４記載の組成物。
【請求項１】
ゴマまたはその他ゴマリグナンを含む物質を原料とし、少なくとも１種の菌株で発酵させてから抽出してゴマ発酵組成物を得る工程を含む、ゴマ発酵組成物の製造方法。
【請求項２】
原料が、ゴマ粕またはゴマを含む、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
ゴマ発酵組成物が、ゴマリグナン配糖体（sesame lignan glycosides）およびアグリコンゴマリグナン（aglycon sesame lignans）を含む、請求項１記載の製造方法。
【請求項４】
アグリコンゴマリグナンの含量が８０％以上である請求項３記載の製造方法。
【請求項５】
アグリコンゴマリグナンの含量が９５％以上である請求項３記載の製造方法。
【請求項６】
菌株が、アスペルギルス属（Aspergillus）を含む、請求項１記載の製造方法。
【請求項７】
アスペルギルス属（Aspergillus）が、アスペルギルスオリゼー（Aspergillus oryzae）および／またはアスペルギルスニガー（Aspergillus niger）を含む、請求項６記載の製造方法。
【請求項８】
アスペルギルスオリゼー（Aspergillus oryzae）が、ＡＴＣＣ１４８９５、ＡＴＣＣ２０４２３、ＡＴＣＣ１０１１、ＡＴＣＣ１１４８９およびＡＴＣＣ１４１５６からなる群より選択される、請求項７記載の製造方法。
【請求項９】
アスペルギルスニガー（Aspergillus niger）が、ＡＴＣＣ１６８８８、ＡＴＣＣ４２４１８、ＡＴＣＣ６２７５、ＡＴＣＣ９０２９およびＡＴＣＣ９６４２からなる群より選択される、請求項７記載の製造方法。
【請求項１０】
菌株が、バチルス属（Bacillus）を含む、請求項１記載の製造方法。
【請求項１１】
バチルス属（Bacillus）が、バチルスサーキュランス（Bacillus circulans）を含む、請求項１０記載の製造方法。
【請求項１２】
バチルスサーキュランス(Bacillus circulans)が、ＡＴＣＣ１１５９０およびＤＳＭ５９６からなる群より選択される、請求項１１記載の製造方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法によって製造されるゴマ発酵組成物であって、アグリコンゴマリグナンの含量が８０％以上であるゴマ発酵組成物。
【請求項１４】
アグリコンゴマリグナンを有効量含む、癌を予防または治療するために用いられる組成物。
【請求項１５】
ゴマリグナン配糖体およびアグリコンゴマリグナンを含む、請求項１４記載の組成物。
【請求項１６】
アグリコンゴマリグナンの含量が８０％以上である請求項１４記載の組成物。
【請求項１７】
アグリコンゴマリグナンの含量が９５％以上である請求項１４記載の組成物。
【請求項１８】
癌が、子宮頚癌、肝臓癌、乳癌、胃癌および大腸癌を含む、請求項１４記載の組成物。
【請求項１９】
経口で所要の個体に投薬される、請求項１４記載の組成物。
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図２】
【図３】
【図１ｂ】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００７−３１９１５７（Ｐ２００７−３１９１５７Ａ）
【公開日】平成１９年１２月１３日（２００７．１２．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−３０８５１９（Ｐ２００６−３０８５１９）
【出願日】平成１８年１１月１５日（２００６．１１．１５）
【出願人】（５９６０３２６９４）財団法人食品工業発展研究所 (9)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１２月１３日（２００７．１２．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１１月１５日（２００６．１１．１５）
【出願人】（５９６０３２６９４）財団法人食品工業発展研究所 (9)
【Ｆターム（参考）】
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