サザンカ花部から得られる抗アレルギー剤、脂肪分解阻害剤、抗酸化剤及びヒト線維芽細胞増殖促進剤、並びに新規サポニン化合物
【課題】サザンカ花部由来の、抗アレルギー剤、脂肪分解阻害剤、抗酸化剤及びヒト線維芽細胞増殖促進剤、並びに、サザンカ花部の抽出液から分離、精製して得られる新規なサポニン化合物を提供する。
【解決手段】サザンカ花部、サザンカ花部の抽出液、サザンカ花部の抽出液から分離、精製して得られるサポニン化合物を、活性成分として含むことを特徴とする抗アレルギー剤、脂肪分解阻害剤、抗酸化剤及びヒト線維芽細胞増殖促進剤、並びに、サザンカ花部の抽出液から分離、精製して得られる新規なサポニン化合物。
【解決手段】サザンカ花部、サザンカ花部の抽出液、サザンカ花部の抽出液から分離、精製して得られるサポニン化合物を、活性成分として含むことを特徴とする抗アレルギー剤、脂肪分解阻害剤、抗酸化剤及びヒト線維芽細胞増殖促進剤、並びに、サザンカ花部の抽出液から分離、精製して得られる新規なサポニン化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ツバキ科の植物であるサザンカ(Camellia sasanqua)の花部（サザンカ花部又は山茶花。以後、サザンカ花部と表す。）、サザンカ花部の抽出液、又はその抽出液から得られるサポニン化合物を活性成分として含有する抗アレルギー剤、脂肪分解阻害剤、抗酸化剤、及びヒト線維芽細胞増殖促進剤に関する。又、本発明は、サザンカ花部の抽出液から分離、精製して得られる新規なサポニン化合物（トリテルペン化合物）に関する。
【背景技術】
【０００２】
サザンカは日本を原産とする常緑広葉樹の一種で、日本、朝鮮、中国の海岸近くの山地に広く分布する。日本では古くから観賞用として栽培しているほか、種子から得られる油脂は（中国等では）「サザンカ油」として知られ、頭髪油、食用、機械油、軟膏基材等として広く用いられている。しかしながら、その含有成分や生物活性についての検討はほとんど行われていなかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、サザンカ花部に含有される成分の薬剤としての作用についての研究に基づいてなされたもので、サザンカ花部由来の、抗アレルギー剤、脂肪分解阻害剤、抗酸化剤及びヒト線維芽細胞増殖促進剤を提供することを課題とする。本発明は、又、サザンカ花部の抽出液から分離、精製して得られ、抗アレルギー剤、ヒト線維芽細胞増殖促進剤等として用いられる新規なサポニン化合物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者は、サザンカ花部、サザンカ花部の抽出液について、次に示す１）〜４）の検討を行った。
１）抗アレルギー剤の活性評価の指標として、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞における抗原刺激による脱顆粒抑制作用。
２）脂肪分解阻害剤の活性評価の指標として、膵リパーゼ阻害作用。
３）抗糖尿病剤やしわとり等のための美容素材としての用途が考えられる抗酸化剤の活性評価の指標として、ＤＰＰＨラジカル消去作用及びスーパーオキサイドディスムターゼ（ＳＯＤ）様作用。
４）創傷治癒剤やヒト線維芽細胞増殖促進剤の活性評価の指標として、ヒト線維芽細胞増殖促進作用。
【０００５】
又、本発明者は、前記抽出液から分離、精製して得られるサポニン化合物についても、前記の１）〜４）の検討を行った。
【０００６】
その結果、サザンカ花部、その抽出液、及び抽出液から分離、精製して得られるサポニン化合物が、脱顆粒抑制（抗アレルギー）作用、膵リパーゼ阻害作用、ＤＰＰＨラジカル消去作用やスーパーオキサイドディスムターゼ（ＳＯＤ）様作用、及びヒト線維芽細胞増殖促進作用を示すことを見出し、以下に示す態様の発明を完成した。
【０００７】
本発明は、その第１の態様として、サザンカ花部、及び／又は、サザンカ花部の抽出液を活性成分として含むことを特徴とする抗アレルギー剤（請求項１）を提供する。この抗アレルギー剤は、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞における抗原刺激による脱顆粒を抑制する作用を示し、ヒト又は動物に投与することによりアレルギーの発症を抑制する作用を奏する。なお、サザンカ花部の抽出液とは、サザンカ花部を、水、低級脂肪族アルコール、グリコール、低級脂肪族アルコールやグリコールの含水物等の抽出溶媒により抽出した液を言うが、この明細書では、さらに、その抽出した液を濃縮して得られるエキスや、その抽出した液を分配処理して得られる分配移行液（ｆｒａｃｔｉｏｎ）等も含む意味で用いる。
【０００８】
又、本発明は、その第２の態様として、サザンカ花部、及び／又は、サザンカ花部の抽出液を活性成分として含むことを特徴とする脂肪分解阻害剤（請求項２）を提供する。この脂肪分解阻害剤は膵リパーゼ阻害作用を示し、これをヒト又は動物に投与することにより膵リパーゼによる脂肪の分解を阻害する。食事中の脂肪は、膵リパーゼによって分解され、モノグリセライドと脂肪酸となって吸収されるので、この脂肪の分解を阻害することにより、肥満を抑制できると期待される。
【０００９】
さらに、本発明は、その第３の態様として、サザンカ花部、及び／又は、サザンカ花部の抽出液を活性成分として含むことを特徴とする抗酸化剤（請求項３）を提供する。この抗酸化剤は、ＤＰＰＨラジカル消去作用及びスーパーオキサイドディスムターゼ（ＳＯＤ）様作用を示し、ヒト又は動物に投与することにより、生活習慣病や老化等の原因となる活性酸素の生成を抑制し又活性酸素を消去する等の作用が期待される。従って、糖尿病の発症の抑制、心臓病や脳卒中の予防、抗がん等の効果が期待されるとともに、しわとり等の老化防止の効果も期待され、美容素材としての用途も考えられる。
【００１０】
さらに又、本発明は、その第４の態様として、サザンカ花部、及び／又は、サザンカ花部の抽出液を活性成分として含むことを特徴とするヒト線維芽細胞増殖促進剤（請求項４）を提供する。このヒト線維芽細胞増殖促進剤は、ヒト線維芽細胞増殖促進作用を示し、ヒト又は動物に投与することにより、ヒト線維芽細胞の増殖を促進する。従って、創傷治癒剤等としての用途が考えられる。
【００１１】
本発明者は、さらに又、前記の抽出液を分離、精製し、含有成分の詳細な探索等を行い、さらにその含有成分の生物活性について検討を行ったところ、前記の抽出液中には、下記の式（１）、式（２）、式（３）、式（４）又は式（５）で表される化合物等、種々のサポニン化合物が含まれており、式（１）、式（２）、式（３）、式（４）又は式（５）で表されるサポニン化合物は、脱顆粒抑制作用及び／又はヒト線維芽細胞増殖促進作用を示し、抗アレルギー剤及び／又はヒト線維芽細胞増殖促進剤として用いられることを見出した。
【００１２】
そこで、本発明は、その第５の態様として、下記式（１）で表されるサポニン化合物：
【００１３】
【化１】
【００１４】
下記式（２）で表されるサポニン化合物：
【００１５】
【化２】
【００１６】
下記式（３）で表されるサポニン化合物：
【００１７】
【化３】
【００１８】
及び、下記式（５）で表されるサポニン化合物：
【００１９】
【化４】
【００２０】
からなる群より選ばれる１種以上のサポニン化合物を、活性成分として含むことを特徴とする抗アレルギー剤（請求項５）を提供する。この抗アレルギー剤は、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞における抗原刺激による脱顆粒を抑制する作用を示し、ヒト又は動物に投与することによりアレルギーの発症を抑制する作用を奏する。
【００２１】
又、本発明は、その第６の態様として、下記式（１）で表されるサポニン化合物：
【００２２】
【化５】
【００２３】
下記式（２）で表されるサポニン化合物：
【００２４】
【化６】
【００２５】
下記式（３）で表されるサポニン化合物：
【００２６】
【化７】
【００２７】
下記式（４）で表されるサポニン化合物：
【００２８】
【化８】
【００２９】
及び、下記式（５）で表されるサポニン化合物：
【００３０】
【化９】
【００３１】
からなる群より選ばれる１種以上のサポニン化合物を、活性成分として含むことを特徴とするヒト線維芽細胞増殖促進剤（請求項６）を提供する。このヒト線維芽細胞増殖促進剤は、ヒト線維芽細胞増殖促進作用を示し、ヒト又は動物に投与することにより、ヒト線維芽細胞の増殖を促進する。従って、創傷治癒剤等としての用途が考えられる。
【００３２】
ヒト線維芽細胞増殖促進剤としては、式（１）、式（２）、式（３）、式（４）、又は式（５）で表される化合物の中でも、式（１）、式（２）、又は式（３）で表される化合物を用いるものが好ましく、特に好ましくは、式（１）又は式（２）で表される化合物を用いるものである。
【００３３】
前記の第１の態様又は第５の態様の抗アレルギー剤、第２の態様の脂肪分解阻害剤、第３の態様の抗酸化剤、第４の態様又は第６の態様のヒト線維芽細胞増殖促進剤は、ヒト又は動物に投与することにより前記の作用を奏するので、ヒト又は動物用の医薬や医薬組成物（以後、医薬組成物を含めて医薬と言う。）等として用いることができる。
【００３４】
本発明者は、さらに、サザンカ花部の抽出液の分離、精製により得られた化合物について構造の解析を行ったところ、前記式（２）で表されるサポニン化合物、前記式（４）で表されるサポニン化合物、及び前記式（５）で表されるサポニン化合物は、新規なサポニン化合物であることを見出した。即ち本発明は第７の態様として、以下に示す新規なサポニン化合物を提供する。
【００３５】
下記の式（２）で表されるサポニン化合物（請求項７）。
【００３６】
【化１０】
【００３７】
下記の式（４）で表されるサポニン化合物（請求項８）。
【００３８】
【化１１】
【００３９】
下記の式（５）で表されるサポニン化合物（請求項９）。
【００４０】
【化１２】
【００４１】
請求項７又は請求項９で表されるサポニン化合物は、脱顆粒抑制作用を示し、抗アレルギー剤の活性成分として用いることができる。又、請求項７、請求項８又は請求項９で表されるサポニン化合物は、ヒト線維芽細胞増殖促進作用を示し、ヒト線維芽細胞増殖促進剤の活性成分として用いることができる。
【発明の効果】
【００４２】
本発明の抗アレルギー剤（第１の態様及び第５の態様）は、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞における抗原刺激による脱顆粒抑制（抗アレルギー）作用を示し、ヒト又は動物のアレルギーの発症を抑制する効果がある。本発明の脂肪分解阻害剤（第２の態様）は、膵リパーゼ阻害作用を示し、ヒト又は動物の肥満を抑制する効果がある。本発明の抗酸化剤（第３の態様）は、ＤＰＰＨラジカル消去作用及びスーパーオキサイドディスムターゼ（ＳＯＤ）様作用を示し、生活習慣病や老化等の原因となる活性酸素の生成を抑制し又活性酸素を消去する等の作用が期待される。従って、糖尿病発症抑制剤、心臓病や脳卒中の予防剤、しわとり等の老化防止の効果を有する美容素材としての用途が考えられる。本発明のヒト線維芽細胞増殖促進剤（第４の態様及び第６の態様）は、ヒト線維芽細胞の増殖を促進する作用を有し、創傷治癒剤としての用途が考えられる。
【００４３】
本発明の新規サポニン化合物（第７の態様）は、脱顆粒抑制及び／又はヒト線維芽細胞増殖促進作用を示し、抗アレルギー剤及び／又はヒト線維芽細胞増殖促進剤として用いることができる。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
次に、本発明を実施するための最良の形態について説明するが、本発明の範囲はこの実施の形態のみに限定されるものではない。
【００４５】
本発明の、第１の態様の抗アレルギー剤、第２の態様の脂肪分解阻害剤、第３の態様の抗酸化剤、第４の態様のヒト線維芽細胞増殖促進剤としては、
１）サザンカ花部を（抽出等の処理を行わずに）活性成分として用いるもの、
２）サザンカ花部を、水、低級脂肪族アルコール、グリコール又は低級脂肪族アルコールやグリコールの含水物等により抽出した抽出液を濃縮して得られる抽出エキスを活性成分として用いるもの、を例示することができる。サザンカ花部を用いる場合は、サザンカ花部をそのまま用いることができるし、又は、粉砕、破砕、切断、すりつぶし等による形状変化を行ったもの、もしくは、乾燥等の調製を行ったものを用いることもできる。
【００４６】
抽出液は、サザンカ花部をそのまま、又は、粉砕、破砕、切断、すりつぶし等による形状変化を行ったものを、水、低級脂肪族アルコール、グリコール、又は低級脂肪族アルコールやグリコールの含水物等の抽出溶媒により抽出して得ることができる。抽出効率の点からは、粉砕、破砕、切断、すりつぶし等による形状変化を行ったものを用いる方法が望ましい。
【００４７】
抽出溶媒として用いられるアルコールとしては、炭素数１〜４の低級アルコール類が挙げられ、具体的には、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｔ−ブタノール又はこれらの混液等が挙げられる。グリコールとしては、エチレングリコール、プロピレングリコール等が挙げられる。抽出溶媒としては、好ましくはこれらのアルコールやグリコール、又はこれらのアルコールやグリコールに３０容量％までの水を含有する含水アルコールや含水グリコールが用いられる。前記のアルコールやグリコールの中でもメタノール又はエタノールが好ましい。これらの抽出溶媒は、抽出材料に対して、１〜５０倍（重量）程度、好ましくは１０〜３０倍程度用いられる。
【００４８】
抽出温度は、室温〜溶媒の沸点の間で任意に設定できるが、５０℃〜抽出溶媒の沸点の温度が好ましい。抽出は、振盪下もしくは非振盪下又は還流下に、前記の抽出材料、即ち、サザンカ花部そのもの、又は、それを粉砕、破砕、切断、すりつぶし等による形状変化を行ったもの等を、前記の抽出溶媒に浸漬することによって行うのが適当である。
【００４９】
好ましい抽出時間は、抽出温度や抽出の際の振盪の有無等により変動し、特に限定されない。例えば、抽出材料を振盪下に浸漬する場合には、３０分間〜１０時間程度行うのが適当であり、非振盪下に浸漬する場合には、１時間〜２０日間程度行うのが適当である。又、抽出溶媒の還流下に抽出するときは、３０分間〜数時間加熱還流するのが好ましい。なお、５０℃より低い温度で浸漬して抽出することも可能であるが、その場合には、前記の時間よりも長時間浸漬するのが好ましい。抽出操作は、同一材料について１回だけ行ってもよいが、複数回、例えば２〜５回程度繰り返すのが好ましい。
【００５０】
前記の抽出工程により得られた抽出液には、サザンカ花部の含有成分が溶出されている。本発明の、第１の態様の抗アレルギー剤、第２の態様の脂肪分解阻害剤、第３の態様の抗酸化剤、第４の態様のヒト線維芽細胞増殖促進剤としては、このようにして得られた抽出液を濃縮して用いてもよい。又、このようにして得られた抽出液に分配処理を施し、得られた分配移行液を用いてもよい。濃縮は、低温で減圧下に行うのが好ましい。濃縮する前に濾過して濾液を濃縮してもよい。なお、濃縮等の操作を行わず抽出液をそのまま用いても、抗アレルギー剤、脂肪分解阻害剤、抗酸化剤、ヒト線維芽細胞増殖促進剤としての作用を奏する。
【００５１】
又、濃縮は乾固するまで行ってもよく、粉末状又は凍結乾燥品等として用いてもよい。濃縮する方法、粉末状及び凍結乾燥品とする方法は当該分野での公知の方法を用いることができる。
【００５２】
このようにして得られる抽出液（さらに濃縮したもの、分配により得られる分配移行液等を含む意味である。）は、精製処理に付し、含有される各成分に分離することができる。前記の、式（１）〜（５）のいずれかで表される化合物は、この精製、分離により得ることができる。そして、この精製、分離により得られた式（１）、式（２）、式（３）、又は式（５）で表される化合物も、抗アレルギー剤として用いることができ（本発明の第５の態様）、又、式（１）、式（２）、式（３）、式（４）、又は式（５）で表される化合物も、ヒト線維芽細胞増殖促進剤として用いることができる（本発明の第６の態様）。
【００５３】
精製処理は、例えば、クロマトグラフ法、イオン交換樹脂を使用する溶離法、溶媒による分配抽出等を単独、又は組み合わせて採用することができる。クロマトグラフ法としては、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、遠心液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等を挙げることができ、これらのいずれか、又はそれらを組み合わせて行う方法が挙げられる。この際の担体、溶出溶媒等の精製条件は、各種クロマトグラフィーに対応して適宜選択することができる。
【００５４】
前記のように、本発明の第１の態様の抗アレルギー剤、第２の態様の脂肪分解阻害剤、第３の態様の抗酸化剤、又は第４の態様のヒト線維芽細胞増殖促進剤を含有させることにより、ヒト又は動物用の医薬を製造することができる。本発明の抗アレルギー剤、脂肪分解阻害剤、抗酸化剤、ヒト線維芽細胞増殖促進剤が、ヒト又は動物用の医薬として用いられる場合は、サザンカ花部そのもの、サザンカ花部の抽出液、もしくは前記式（１）、式（２）、式（３）、式（４）、又は式（５）で表される化合物を、そのままの状態で又は適当な媒体で希釈して、医薬品等の製造分野における公知の方法により、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤又は液剤等の種々の形態にして用いられる。
【００５５】
これらの形態においては、適当な媒体を添加してもよい。適当な媒体としては、医薬的に許容される賦形剤、例えば結合剤（例えばシロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビトール、トラガント又はポリビニルピロリドン）、充填剤（例えば乳糖、砂糖、トウモロコシ澱粉、リン酸カルシウム、ソルビトール又はグリシン）、錠剤用滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール又はシリカ）、崩壊剤（例えば馬鈴薯澱粉）又は湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）等が挙げられる。
【００５６】
錠剤とする場合は、通常の製薬における周知の方法でコートしてもよい。液体製剤とする場合は、例えば水性又は油性の懸濁液、溶液、エマルジョン、シロップ又はエリキシルの形態であってもよい。又、使用前に水や他の適切な賦形剤と混合する乾燥製品として提供してもよい。
【００５７】
こうした液体製剤は、通常の添加剤、例えば、ソルビトール、シロップ、メチルセルロース、グルコースシロップ、ゼラチン水添加食用脂等の懸濁化剤、レシチン、ソルビタンモノオレエート、アラビアゴム等の乳化剤（食用脂を含んでもよい）、アーモンド油、分画ココヤシ油又はグリセリン、プロピレングリコールやエチレングリコールのような油性エステル等の非水性賦形剤、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピル又はソルビン酸等の保存剤を含んでもよく、さらに所望により着色剤又は香料等を含んでもよい。
【００５８】
本発明の医薬における、抽出液、前記式（１）、式（２）、式（３）、式（４）、又は式（５）で表される化合物の使用量は、濃縮、精製の程度、活性の強さ等、使用目的、対象疾患や自覚症状の程度、使用者の体重、年齢等によって適宜調整される。例えば、医薬として成人について使用する場合は、１回の投与毎に、抽出液の場合では、１ｍｇ〜２０ｇ程度の範囲で使用し、この範囲内で精製度や水分含量等に応じて調整することが適当な場合が多い。又、前記式（１）、式（２）、式（３）、式（４）、又は式（５）で表される化合物を使用する場合は、１ｍｇ〜１ｇ程度が適当な場合が多い。
【実施例】
【００５９】
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、実施例は本発明の範囲を限定するものではない。なお、以下の実施例では、特に記載がない限り、以下に示す各種溶媒、濾紙、クロマトグラフィー用担体及びＨＰＬＣカラムを用いた。又、特に明記しない試薬については、和光純薬工業社製試薬（特級）を用いた。
【００６０】
実施例１
日本京都産サザンカ花部（４．０ｋｇ）をメタノール（ＭｅＯＨ：ナカライテスク社製、試薬一級）で熱時抽出（３時間）し、抽出液を濾取した。残渣にメタノールを加え、同様の抽出操作を計３回行った。得られたメタノール抽出液を合わせ、減圧下溶媒を留去し、ＭｅＯＨ抽出エキス（収量４１７．７ｇ、収率１０．４％）（以下、括弧内で収量及び／又は収率を表す場合は、「収量」、「収率」を略して示す。なお、「収率」とは、サザンカ花部からの単離収率である。）を得た。
【００６１】
このＭｅＯＨ抽出エキス（４００ｇ）を、酢酸エチル（ＡｃＯＥｔ）と水（１：１）で分配し、ＡｃＯＥｔ移行部（５７．９ｇ、１．５％）とＨ２Ｏ移行部を得た。さらにこのＨ２Ｏ移行部を、ｎ−ブタノール（ｎ−ＢｕＯＨ）と水（１：１）で分配し、ｎ−ＢｕＯＨ移行部（１４９．５ｇ、３．９％）とＨ２Ｏ移行部（１９１．７ｇ、５．０％）を得た。得られたｎ−ＢｕＯＨ移行部について、ＨＰ−２０カラムクロマトグラフィー（Ｈ２Ｏ→ＭｅＯＨ→アセトン）に付し、各溶出部を減圧下溶媒留去することにより、Ｈ２Ｏ溶出部（０．９ｇ、０．０２５％）、ＭｅＯＨ溶出部（５４．１ｇ、１．４７％）、アセトン溶出部（８８．２ｇ、２．４０％）を得た。
【００６２】
実施例２ ＲＢＬ−２Ｈ３細胞を用いた抗原刺激時における脱顆粒抑制（抗アレルギー）作用（β−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ遊離阻害率の測定）
【００６３】
実施例１で得られたサザンカ花部のＭｅＯＨ抽出エキス、ＡｃＯＥｔ移行部、ｎ−ＢｕＯＨ移行部、Ｈ２Ｏ移行部について、脱顆粒抑制（アレルギーの抑制）活性の検討を行った。具体的には、肥満細胞のモデル細胞であるラット好塩基球性白血病細胞（ＲＢＬ−２Ｈ３細胞）を用い、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞が抗原刺激によって脱顆粒を起こした際にヒスタミン等と共に放出されるβ−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅの遊離率を以下に示す方法により求め、その結果より被験物質のβ−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ遊離阻害率を求め、それを、脱顆粒の指標とし抗アレルギー作用成分の探索を行った。表１に示すように、ＭｅＯＨ抽出エキス、ＡｃＯＥｔ移行部及びｎ−ＢｕＯＨ移行部に有意な抑制活性（脱顆粒抑制作用）が見られた．特にｎ−ＢｕＯＨ移行部に強い抑制活性が認められた。
【００６４】
［β−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅの遊離率、被験物質のβ−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ遊離阻害率］
ヒューマンサイエンス研究資源バンクから購入したＲＢＬ−２Ｈ３細胞を、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）、１００ｕｎｉｔ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン含有Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ（ＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ社製）で培養（５％ＣＯ２、３７°Ｃ）した。次に細胞培養用２４ウェル平底マイクロプレートに、２．０×１０５ｃｅｌｌｓ（４００μｌ ｍｅｄｉｕｍ／ｗｅｌｌ）ずつ播種し、１時間培養した後、マウスモノクローナル抗ＤＮＰ ＩｇＥ抗体（Ｓｉｇｍａ社製）を培養液に加え（終濃度：０．４５μｇ／ｍｌ）、２４時間培養（５％ＣＯ２、３７°Ｃ）することによって細胞を感作させた。その後、感作した細胞を５００μｌのｓｉｒａｇａｎｉａｎ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．２：１１９ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、０．４ｍＭのＭｇＣｌ２、２５ｍＭのピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルフォン酸）（ＰＩＰＥＳ）、４０ｍＭのＮａＯＨ）で２回洗浄し、１６０μｌの５．６ｍＭのグルコース、１ｍＭのＣａＣｌ２、０．１％ＢＳＡ含有ｓｉｒａｇａｎｉａｎ ｂｕｆｆｅｒを加えて１０分間予備加温（５％ＣＯ２、３７°Ｃ）した。
【００６５】
次に、２０μｌの被験物質溶液（ＤＭＳＯ終濃度：０．１％）を加え、１０分後に抗原（ＤＮＰ−ＢＳＡ、終濃度：１０μｇ／ｍｌ）を加えて１０分間インキュベートして細胞を刺激した。１０分間氷冷して反応を止めた後、上清５０μｌを９６ウェル平底マイクロプレートに移し、０．１Ｍｃｉｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒに溶解した１ｍＭのｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄｅ（ＰＮＡＧ）５０μｌを加えて混和後３７°Ｃで１時間反応させた。反応溶液に２００μｌのｓｔｏｐ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ１０．０：０．１ＭのＮａＨＣＯ３／Ｎａ２ＣＯ３）を加えて混和し、マイクロプレートリーダー（ｍｏｄｅｌ５５０、ＢＩＯ−ＲＡＤ社）にて吸光度（測定波長：４０５ｎｍ、参照波長：６５５ｎｍ）を測定し、この吸光度の測定値に基づき、以下の式により遊離率を求めた。又、被験物質のみの吸光度も併せて測定し補正した。細胞内全β−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅの測定には、超音波破砕機で破砕した細胞を遠心分離した上清を用いた。このときの吸光度を吸光度Ａとする。
【００６６】
【数１】
【００６７】
被験物質のβ−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ遊離阻害率は以下の式により求めた．
【００６８】
【数２】
【００６９】
実験結果を表１に示す。なお、実験はＮ＝４で行った。表中の数値は、その平均±標準誤差を表す。対照群との平均値の有意差の検定にはＤｕｎｎｅｔｔの方法を用い、ｐ値が０．０５以下のものを有意とみなした。ｐ値が０．０５以下のものには、表中の数値に＊を示した。特に、ｐ値が０．０１以下のものには、表中の数値に＊＊を示した。これは、以下に示す他の測定、他の表においても同様である。
【００７０】
【表１】
【００７１】
実施例３ 膵リパーゼ阻害作用試験
実施例１で得られたサザンカ花部のＭｅＯＨ抽出エキス、ＡｃＯＥｔ移行部、ｎ-ＢｕＯＨ移行部、Ｈ２Ｏ移行部について、膵リパーゼ阻害作用の検討を行った。具体的には、次に示す方法により膵リパーゼ阻害作用を求めた。表２に示す結果より明らかなように、ＭｅＯＨ抽出エキス、ＡｃＯＥｔ移行部及びｎ−ＢｕＯＨ移行部に有意な阻害活性（膵リパーゼ阻害作用）が認められた。
【００７２】
［膵リパーゼ阻害作用の測定］
基質としてトリオレイン溶液［トリオレイン８０ｍｇ、ホスファチジルコリン１０ｍｇ及びタウロコール酸５ｍｇに０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．０：０．１ＭのＮａＣｌ含有）９ｍｌを加え、１０分間超音波処理を行った溶液］１００μｌに、被験サンプル溶液５μｌを加え、さらに０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．０）９５μｌを加え、全量を２００μｌとした。３７℃で３分間予備加温したのち、ブタ膵臓由来のリパーゼ溶液５０μｌを加えて３０分間反応させ、その後２分間沸騰水浴（９０〜１００℃）に入れて反応を停止させた。別に、各サンプルにつきリパーゼ溶液に代えてトリス緩衝液を５０μｌ加え、同様の操作を行ったものを盲検として調製した。生成したオレイン酸の濃度をＮＥＦＡ Ｃ−テストワコー（和光純薬社）により測定した。なお、リパーゼはトリス緩衝液に溶解し、本実験条件下で約０．７ｍｅｑ／Ｌのオレイン酸が生成する濃度に調製した。被験サンプルはＤＭＳＯを用いて溶解し希釈した。比較対照薬としてｏｒｌｉｓｔａｔを用いた。このようにして測定したオレイン酸量に基づき、以下の式により阻害率（％）を算出し、その値を表２に示した。
【００７３】
阻害率（％）＝
｛１−（サンプル添加時のオレイン酸量−サンプル添加時［盲検］のオレイン酸量）／
（サンプル非添加時（対照）のオレイン酸量−（対照）［盲検］のオレイン酸量）｝×１００
【００７４】
【表２】
【００７５】
肥満は脂肪の合成が分解を上回ることによって発症する。したがって肥満の予防には食事に含まれる脂肪の吸収を遅らせなければならない。食事中の脂肪は膵リパーゼによって分解され、モノグリセライドと脂肪酸となって吸収される。そこで、膵リパーゼによる脂肪の分解を阻害することで、カイロミクロンを低下させ、肥満を予防できると期待される。表２に示すように、ＭｅＯＨ抽出エキス、ＡｃＯＥｔ移行部及びｎ−ＢｕＯＨ移行部に有意な膵リパーゼ阻害活性が認められるので、これらは脂肪分解阻害剤として使用でき、肥満の予防に効果があると期待される。
【００７６】
実施例４ ＤＰＰＨラジカル捕捉試験
実施例１で得られたサザンカ花部のＭｅＯＨ抽出エキス、ＡｃＯＥｔ移行部、ｎ−ＢｕＯＨ移行部、Ｈ２Ｏ移行部について、次に示す方法によりＤＰＰＨラジカル捕捉試験を行った。
【００７７】
［ＤＰＰＨラジカル捕捉試験］
９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに、エタノールと０．１Ｍ酢酸−酢酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ５．５）混合物（１：２）を１２０μｌ、被検物質のエタノール溶液を４０μｌ、及び２．５×１０−４ＭのＤＰＰＨエタノール溶液を４０μｌ加えた。撹拌後、室温にて３０分間静置した後、マイクロプレートリーダーＳＨ−１０００（コロナ電気）により吸光度を測定した（測定波長５１７ｎｍ、参照波長６５５ｎｍ）。測定値に基づき以下の式によりラジカル捕捉率を算出し、さらに５０％阻害濃度（ＥＣ５０）を求めた。このようにして得たラジカル捕捉率及びＥＣ５０値を表３に示す。
【００７８】
ラジカル補足率（％）＝
｛１−（被験物質添加時の吸光度）／（被験物質非添加時［対照］の吸光度）｝×１００
【００７９】
【表３】
【００８０】
実施例５ ＤＰＰＨラジカル消去作用、スーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）様作用試験
実施例１で得られたサザンカ花部のＭｅＯＨ抽出エキス、ＡｃＯＥｔ移行部、ｎ−ＢｕＯＨ移行部、Ｈ２Ｏ移行部について、次に示す方法によりスーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）様作用試験を行った。
【００８１】
［ＤＰＰＨラジカル消去作用、スーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）様作用試験］
１００μＭのキサンチン、１００μＭのＥＤＴＡ、２５μＭのＷＳＴ−１（同仁化学研究所製試薬）を含む５０ｍＭの炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．２）、及び被験サンプルを含む反応液２．９ｍｌを、３７℃で１０分間予備加温し、５８ｍＵ／ｍｌのキサンチンオキシダーゼ１００μを加えて２０分間インキュベーションした。インキュベーション後、２Ｍ塩酸１００μｌを加えて反応を止め、Ｏ２−により還元されて生成したＷＳＴ−１ホルマザンの吸光度を測定した（測定波長：４５０ｎｍ）。測定値に基づき以下の式によりＳｃａｖｅｎｇｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ（％）を算出し、さらに５０％阻害濃度（ＥＣ５０）を求めた。このようにして得たＳｃａｖｅｎｇｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ（％）及びＥＣ５０値を表４に示す。
【００８２】
Ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ（％）＝
｛１−（被験物質添加時の吸光度）／（被験物質非添加時［対照］の吸光度）｝×１００
【００８３】
【表４】
【００８４】
表３及び表４に示す結果より明らかなように、サザンカ花部のＭｅＯＨ抽出エキス、ＡｃＯＥｔ移行部及びｎ−ＢｕＯＨ移行部に有意なＤＰＰＨラジカル消去作用、ＳＯＤ様作用が認められた。
【００８５】
実施例６ サザンカ花部の含有成分の単離
実施例１で得られたＭｅＯＨ溶出部を、逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィー［５４．１ｇ、ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝Ｈ２Ｏ→（１０：９０）→（２０：８０）→（３０：７０）→（４０：６０）→（５０：５０）→（６０：４０）→（７０：３０）→（８０：２０）→（９０：１０）→ＭｅＯＨ］にて分画し、画分１（０．８３ｇ）、画分２（３．２８ｇ）、画分３（２７．９６ｇ）、画分４（６．１４ｇ）、画分５（９．５６ｇ）、画分６（０．８８ｇ）、画分７（０．６４ｇ）を得た。
【００８６】
画分５（８．８９ｇ）を、逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィー［３４７．９ｇ、ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝（５０：５０）→（５５：４５）→（６０：４０）→（６５：３５）→（７０：３０）→（７５：２５）→（８０：２０）→（８５：１５）→（９０：１０）→（９５：５）→ＭｅＯＨ］にて分画し、画分５−１（１６．１ｍｇ）、画分５−２（２２６．２ｍｇ）、画分５−３（３８９．５ｇ）、画分５−４（９４５．２ｍｇ）、画分５−５（３．６９ｇ）、画分５−６（３．０５ｇ）、画分５−７（３２９．４ｍｇ）、画分．５−８（３１９．０ｍｇ）を得た。さらに画分５−５について、ＨＰＬＣ［カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＭＳ−ＩＩ、溶離液：６８％ａｑ．ＭｅＯＨ ｉｎ １％酢酸］を用いて分離精製した結果、化合物６（２７．８ｍｇ）、化合物２（１０８．５ｍｇ、０．０１４５％）、化合物３（４２．３ｍｇ、０．００５７％）を単離した。
【００８７】
又、画分５−６について、ＨＰＬＣ［カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＭＳ−ＩＩ、溶離液：７３％ａｑ．ＭｅＯＨ ｉｎ １％酢酸］を用いて分画・単離し、画分５−６−１（１８．４ｍｇ）、画分．５−６−２（９２．４ｍｇ）、画分５−６−３（化合物５、２２．６ｍｇ、０．００５７％）、画分５−６−４（１９２．５ｍｇ）、画分５−６−５（化合物１、５７．３ｍｇ、０．００３２％）、画分５−６−６（１００．４ｍｇ）、画分５−６−７（３６７．４ｍｇ）を得た。さらに、画分５−６−２についてＨＰＬＣ［カラム： ＣＯＳＭＯＳＩＬ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒ Ｗａｔｅｒｓ、溶離液：７３％ａｑ．ＭｅＯＨ ｉｎ １％酢酸］で分離精製し、化合物４（１７．９ｍｇ、０．００１０％）を得た。
【００８８】
上記のようにして得られた化合物１〜５について、１Ｈ-ＮＭＲ、１３Ｃ-ＮＭＲ、質量分析（ＭＳスペクトル）、旋光度、ＩＲスペクトル等の測定を行い、その測定結果に基づき構造決定や同定を行ったところ、化合物１は、前記式（１）で表されるサポニン化合物（新規トリテルペン配糖体：Ｓａｓａｎｑｕａｓａｐｏｎｉｎ Ｉと命名する。）、化合物２は、前記式（２）で表される新規サポニン化合物（Ｓａｓａｎｑｕａｓａｐｏｎｉｎ IIと命名する。）、化合物３は、前記式（３）で表されるサポニン化合物（Ｓａｓａｎｑｕａｓａｐｏｎｉｎ IIIと命名する。）、化合物４は、前記式（４）で表される新規サポニン化合物（Ｓａｓａｎｑｕａｓａｐｏｎｉｎ ＩＶと命名する。）、化合物５は、前記式（５）で表される新規サポニン化合物（Ｓａｓａｎｑｕａｓａｐｏｎｉｎ Ｖと命名する。）であることが確認された。
【００８９】
なお、旋光度［α］Ｄ、質量分析、ＵＶスペクトル、ＩＲスペクトル及び１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲ等は、以下に示す測定装置、条件により行った。
【００９０】
［旋光度］［α］Ｄ 堀場高感度ＳＥＰＡ−３００デジタルポラリメーター（ｌ＝０．５）を用いて測定した。
［質量分析］
高分解能質量分析（高分解能ＦＡＢ−ＭＳ、ＥＩ−ＭＳ）及び質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ、ＥＩ−ＭＳ）は、日本電子社製ＪＭＳ−ＳＸ １０２及びＪＭＳ−ＧＣＭＡＴＥ型質量分析装置を用いて測定した。
［ＩＲスペクトル］ Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＦＴ−ＩＲ ＤＲ−８０００ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを用いて測定した。
［ＵＶスペクトル］ ＳｈｉｍａｄｚｕＵＶ−１６００を用いて測定した。
［核磁気共鳴スペクトル］ １Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲは、日本電子社製 ＪＮＭ−ＥＸ ２７０（２７０ＭＨｚ）、ＪＮＭ−ＬＡ ５００（５００ＭＨｚ）及びＪＮＭ−ＥＣＡ ６００（６００ＭＨｚ）を用い、テトラメチルシラン（ＴＭＳ）を内部標準として用いて測定した。
［高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）］ ポンプはＳｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ−６ＡＤを、示差屈折計検出器はＳｈｉｍａｄｚｕ ＲＩＤ−１０Ａを、紫外可視分光光度計検出器はＳｈｉｍａｄｚｕ ＳＰＤ−１０Ａを用いた。
【００９１】
以下、実施例６で得られた化合物１〜５についての、外観、旋光度［α］Ｄ、質量分析、ＵＶスペクトル、ＩＲスペクトル、１Ｈ−ＮＭＲの測定結果を示す。
【００９２】
［化合物１：Ｓａｓａｎｑｕａｓａｐｏｎｉｎ Ｉ］
・性状：無色微粉末結晶
・ｍｐ．： ２１３．０-２１５．０°Ｃ
・旋光度：［α］Ｄ２０−２４．６°（ｃ＝０．８５、ＭｅＯＨ）
ＩＲスペクトル（ＫＢｒ）：νｍａｘ ３３７０、１７２０、１６９８、１０７５、１０４７ｃｍ−１
・１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ピリジン−ｄ５）δ ０．７９、１．０１、１．０５、１．０７、１．１２、１．２７、１．８７（ａｌｌ ｓ、２５、２６、２９、２４、２３、３０、２７−Ｈ３）、０．８４（ｔ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、６'''''−Ｈ３）、１．３５（ｍ、５'''''−Ｈ２）、２．７１、２．７８（ｂｏｔｈ ｍ、４'''''−Ｈ２）、３．２１（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝５．０、１２．０Ｈｚ、３−Ｈ）、３．５９、３．７６（ｂｏｔｈ ｄ、Ｊ＝１０．３Ｈｚ、２８−Ｈ２）、４．２４（１Ｈ、ｄ−ｌｉｋｅ、１５−Ｈ）、４．８４（ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、１'−Ｈ）、５．４９（１Ｈ、ｂｒ ｓ、１２−Ｈ）、５．７９（ｄ、Ｊ＝１１．０Ｈｚ、２'''''−Ｈ）、５．９４（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、１''−Ｈ）、６．０９（ｔｄ、Ｊ＝７．６、１１．０Ｈｚ、３'''''−Ｈ）、６．１８（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝５．５、１１．７Ｈｚ、２２−Ｈ）、６．２４（１Ｈ、ｂｒ ｓ、１''''−Ｈ）、６．２６（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、１'''−Ｈ）
【００９３】
［化合物２：Ｓａｓａｎｑｕａｓａｐｏｎｉｎ ＩＩ］
・性状：無色微粉末結晶
・ｍｐ．： ２１９．５-２２１．０°Ｃ
・旋光度：［α］Ｄ２９−１８．２°（ｃ＝０．４３、ＭｅＯＨ）
・ＩＲスペクトル（ＫＢｒ）：νｍａｘ ３３７０、１７２０、１６８４、１０７５、１０４５ｃｍ−１
・１Ｈ−ＮＭＲ （６００ ＭＨｚ、ピリジン−ｄ５）δ ０．８０、１．０２、１．０６、１．０６、１．１４、１．２８、１．８７（ａｌｌ ｓ、２５、２６、２９、２４、２３、３０、２７−Ｈ３）、１．４３（３Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．９Ｈｚ、Ｔｉｇ−４−Ｈ３）、１．７８（３Ｈ、ｓ、Ｔｉｇ−５−Ｈ３）、３．１９（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝５．０、１１．０Ｈｚ、３−Ｈ）、３．６１、３．７７（ｂｏｔｈ ｄ、Ｊ＝１０．３Ｈｚ、２８-Ｈ２）、４．２４（１Ｈ、ｄ−ｌｉｋｅ、１５−Ｈ）、４．８４（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、１’−Ｈ）、５．４７（１Ｈ、ｂｒ ｓ、１２−Ｈ）、５．９２（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、１''−Ｈ）、６．１７（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝５．５、１１．７Ｈｚ、２２−Ｈ）、６．２１（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、１'''−Ｈ）、６．２５（１Ｈ、ｂｒ ｓ、１''''−Ｈ）、６．８４（１Ｈ、ｑ、Ｊ＝６．９Ｈｚ、Ｔｉｇ−３−Ｈ）
・ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｉｏｎ ＦＡＢ−ＭＳ： ｍ／ｚ １２４１ （Ｍ＋Ｎａ）＋
・高分解能ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｉｏｎ ＦＡＢ−ＭＳ： ｍ／ｚ １２４１．５９２３［Ｃ59Ｈ94Ｏ２６Ｎａの計算値： （Ｍ＋Ｎａ）＋：ｍ／ｚ １２４１．５９３１］。
【００９４】
［化合物３：Ｓａｓａｎｑｕａｓａｐｏｎｉｎ ＩＩＩ］
・性状：無色微粉末結晶
・ｍｐ．： ２２７．０-２２９．０°Ｃ
・旋光度：［α］Ｄ２１−１８．５°（ｃ＝０．７２、ＭｅＯＨ）
・ＩＲスペクトル（ＫＢｒ）：νｍａｘ ３３７０、１７２０、１６９９、１０７６、１０４３ｃｍ−１
・１Ｈ−ＮＭＲ （６００ ＭＨｚ、 ピリジン−ｄ５）δ ０．７９、１．００、１．０５、１．０６、１．１２、１．２８、１．８６（ａｌｌ ｓ、２５、２６、２９、２４、２３、３０、２７−Ｈ３）、１．８２（３Ｈ、ｓ、Ａｎｇ−５−Ｈ３）、２．０２（３Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．９Ｈｚ、Ａｎｇ−４−Ｈ３）、３．１８（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝５．０、１１．０Ｈｚ、３−Ｈ）、３．６３、３．７９（１Ｈ ｅａｃｈ、ｂｏｔｈ ｄ、Ｊ＝１０．３Ｈｚ、２８-Ｈ２）、４．２５（１Ｈ、ｄ−ｌｉｋｅ、１５−Ｈ）、４．８９（ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、１’-Ｈ）、５．４６（１Ｈ、ｂｒ ｓ、１２−Ｈ）、５．８３（１Ｈ、ｑ、Ｊ＝６．９Ｈｚ、Ａｎｇ−３−Ｈ）、５．９３（ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、１''−Ｈ）、６．１９（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝５．５、１１．７Ｈｚ、２２−Ｈ）、６．２２（ｄ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、１'''−Ｈ）、６．２５（ｂｒ ｓ、１''''−Ｈ）
【００９５】
［化合物４：Ｓａｓａｎｑｕａｓａｐｏｎｉｎ ＩＶ］
・性状：無色微粉末結晶
・ｍｐ．： ２１５．０-２１７．０°Ｃ
・旋光度：［α］Ｄ２１−３１．９° （ｃ＝０。１７、ＭｅＯＨ）
・ＩＲスペクトル（ＫＢｒ）：νｍａｘ ３３７０、１７１６、１６９７、１０７８、１０４５ｃｍ−１
・１Ｈ−ＮＭＲ （６００ ＭＨｚ、 ピリジン−ｄ５）δ ０．７９、１．０５、１．０９、１．１２、１．１５、１．２１、１．８７（ａｌｌ ｓ、２５、２４、２９、２３、２６、３０、２７-Ｈ３）、１．６０（３Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、Ｔｉｇ−４−Ｈ３）、１．８４（３Ｈ、ｓ、Ｔｉｇ−５−Ｈ３）、３．１９（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝５．０、１１．７Ｈｚ、３−Ｈ）、４．３８、４．６１（１Ｈ ｅａｃｈ、ｂｏｔｈ ｄ、Ｊ＝１１．０Ｈｚ、２８−Ｈ２）、４．３５（１Ｈ、ｄ−ｌｉｋｅ、１５−Ｈ）、４．５９（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝５．５、１１．７Ｈｚ、２２−Ｈ）、４．９１（ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、１’-Ｈ）、５．５２（１Ｈ、ｂｒ ｓ、１２−Ｈ）、５．９４（ｄ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、１''−Ｈ）、６．２５（ｄ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、１'''−Ｈ）、６．２６（ｂｒ ｓ、１''''−Ｈ）、７．００（１Ｈ、ｑ、Ｊ＝６．９Ｈｚ、Ｔｉｇ−３−Ｈ）
・ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｉｏｎ ＦＡＢ−ＭＳ： ｍ／ｚ １２４１ （Ｍ＋Ｎａ）＋
・高分解能ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｉｏｎ ＦＡＢ−ＭＳ： ｍ／ｚ １２４１．５９２３［Ｃ59Ｈ94Ｏ２６Ｎａの計算値： （Ｍ＋Ｎａ）＋：ｍ／ｚ １２４１．５９３１］。
【００９６】
［化合物５：Ｓａｓａｎｑｕａｓａｐｏｎｉｎ Ｖ］
・性状：無色微粉末結晶
・ｍｐ．： ２２４．０-２２６．０°Ｃ
・旋光度：［α］Ｄ２１−３２．４° （ｃ＝０．３１、ＭｅＯＨ）
・ＩＲスペクトル（ＫＢｒ）：νｍａｘ ３３７０、１７３０、１７１７、１０７８、１０４７ｃｍ−１
・１Ｈ−ＮＭＲ （６００ ＭＨｚ、 ピリジン−ｄ５）δ ０．７５、０．７８、１．０５、１．１０、１．１２、１．１６、１．５４（ａｌｌ ｓ、２５、２６、２４、２９、３０、２３、２７-Ｈ３）、１．００（３Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、４'''''−Ｈ３）、１．３０（３Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．９Ｈｚ、５'''''−Ｈ３）、１．６３、１．９４（１Ｈ ｅａｃｈ、ｂｏｔｈ ｍ、３'''''−Ｈ２）、２．５９（１Ｈ、 ｍ、２'''''−Ｈ）、３．１７（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝４．９、１１．１Ｈｚ、３−Ｈ）、３．６６、４．０４（１Ｈ ｅａｃｈ、ｂｏｔｈ ｄ、Ｊ＝１０．３Ｈｚ、２８-Ｈ２）、４．０９（１Ｈ、ｄｄ ｌｉｋｅ、２２−Ｈ）、４．９０（ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、１’-Ｈ）、５．３２（１Ｈ、ｂｒ ｓ、１２−Ｈ）、５．９４（ｄ、Ｊ＝７．７Ｈｚ、１''−Ｈ）、６．２２（ｍ、１６−Ｈ）、６．２２（ｄ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、１'''−Ｈ）、６．２５（ｂｒ ｓ、１''''−Ｈ）
・ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｉｏｎ ＦＡＢ−ＭＳ： ｍ／ｚ １２２７ （Ｍ＋Ｎａ）＋
・高分解能ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｉｏｎ ＦＡＢ−ＭＳ： ｍ／ｚ １２２７．６１４３
［Ｃ59Ｈ96Ｏ25Ｎａの計算値： （Ｍ＋Ｎａ）＋：ｍ／ｚ １２２７．６１３８］。
【００９７】
化合物２、化合物４、化合物５についての、１３Ｃ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ピリジン−ｄ５）の測定結果を、それぞれ以下の表５、表６、表７に示す。なお、表５〜７中、Ａｃｙｌは、ｃｉｓ−２−ヘキセノイルを、Ｔｉｇは、チグロイルを、Ａｎｇはアンゲロイルを、ＧｌｃＡはβ−Ｄ−グルクロノピラノシルを、Ｇｌｃはβ−Ｄ−グルコピラノシル、Ｇａｌはβ−Ｄ−ガラクトピラノシル、Ｒｈａはα−Ｌ−ラムノピラノシルを表す。
【００９８】
【表５】
【００９９】
【表６】
【０１００】
【表７】
【０１０１】
実施例７ サポニン成分の脱顆粒抑制 （抗アレルギー） 作用
実施例６で得られた化合物１〜５について、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞を用いた抗原刺激時における脱顆粒抑制（抗アレルギー）作用の検討を実施例２と同様な方法で行った。その結果を表８に示すが、その結果より明らかなように、化合物１（Ｓａｓａｎｑｕａｓａｐｏｎｉｎ Ｉ）、化合物２（Ｓａｓａｎｑｕａｓａｐｏｎｉｎ II）、化合物３（Ｓａｓａｎｑｕａｓａｐｏｎｉｎ III）及び化合物５（Ｓａｓａｎｑｕａｓａｐｏｎｉｎ V）に有意な抑制活性が認められた。その活性は、医薬品であるｔｒａｎｉｌａｓｔやｋｅｔｏｔｉｆｅｎ ｆｕｍａｒａｔｅよりも強い。一方、化合物４（Ｓａｓａｎｑｕａｓａｐｏｎｉｎ IV）には活性は認められなかった。
【０１０２】
【表８】
【０１０３】
実施例８ サポニン成分のヒト線維芽細胞増殖促進作用
実施例１で得られたサザンカ花部のＭｅＯＨ抽出エキス、及び実施例６で得られた化合物１〜５について、次に示す方法によりヒト線維芽細胞増殖促進作用の検討を行った。その結果を表９に示すが、表９より明らかなように、ＭｅＯＨ抽出エキス及び化合物１〜５（Ｓａｓａｎｑｕａｓａｐｏｎｉｎ Ｉ〜V）にヒト線維芽細胞増殖促進作用が認められた。中でも、ＭｅＯＨ抽出エキス及び化合物１、２、３（Ｓａｓａｎｑｕａｓａｐｏｎｉｎ Ｉ、II、III）は、有意なヒト線維芽細胞増殖促進作用を示しており、特に、ＭｅＯＨ抽出エキス及び化合物１、２（Ｓａｓａｎｑｕａｓａｐｏｎｉｎ Ｉ、III）は優れたヒト線維芽細胞増殖促進作用を示している。
【０１０４】
［ヒト線維芽細胞増殖促進作用の測定］
ヒト新生児線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ，ＴＯＹＯＢＯ）５ｘ１０５個／ｍＬ ｉｎ Ｄ−ＭＥＭ［１０％ＦＢＳ，ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ），ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（１００μｇ／ｍＬ），ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎＢ（０．２５ｍｇ／ｍＬ）］を９６穴プレートに１００μＬずつ播種した（５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）。
【０１０５】
サザンカ花部の抽出エキス及び被験物質は、ＤＭＳＯに溶解後、Ｄ−ＭＥＭで１０００倍に希釈し、１００μＬの被験体を添加後、ＣＯ２インキュベーターで培養を開始した。４４時間後，ＰＢＳで２回洗浄後，Ｄ−ＭＥＭ１００μＬ及びＭＴＴ試薬（３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ ５ ｍｇ／ｍＬ ＰＢＳ）を１０μＬ加え，４時間培養した後、０．０４ＮＨＣｌ含有２−ｐｒｏｐａｎｏｌ １００μＬで溶解し、マイクロプレートリーダーＳＨ−１０００（コロナ電気）によりＯ．Ｄ．を測定した（測定波長５７０ｎｍ、参照波長６５５ｎｍ）。
【０１０６】
このようにして得たＯ．Ｄ．測定値の「平均値±標準誤差」を表９に示した。又、Ｃｏｎｔｒｏｌ群のＯ．Ｄ．を１００にしたときの、各Ｏ．Ｄ．の比（％：相対値）を表９の相対値（％）の欄に示した。
【０１０７】
【表９】
【０１０８】
表９の結果より明らかなように、ＭｅＯＨ抽出エキス、化合物１〜５にヒト線維芽細胞増殖促進作用が認められ、中でもＭｅＯＨ抽出エキス、化合物１〜３に有意な効果が認められる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ツバキ科の植物であるサザンカ(Camellia sasanqua)の花部（サザンカ花部又は山茶花。以後、サザンカ花部と表す。）、サザンカ花部の抽出液、又はその抽出液から得られるサポニン化合物を活性成分として含有する抗アレルギー剤、脂肪分解阻害剤、抗酸化剤、及びヒト線維芽細胞増殖促進剤に関する。又、本発明は、サザンカ花部の抽出液から分離、精製して得られる新規なサポニン化合物（トリテルペン化合物）に関する。
【背景技術】
【０００２】
サザンカは日本を原産とする常緑広葉樹の一種で、日本、朝鮮、中国の海岸近くの山地に広く分布する。日本では古くから観賞用として栽培しているほか、種子から得られる油脂は（中国等では）「サザンカ油」として知られ、頭髪油、食用、機械油、軟膏基材等として広く用いられている。しかしながら、その含有成分や生物活性についての検討はほとんど行われていなかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、サザンカ花部に含有される成分の薬剤としての作用についての研究に基づいてなされたもので、サザンカ花部由来の、抗アレルギー剤、脂肪分解阻害剤、抗酸化剤及びヒト線維芽細胞増殖促進剤を提供することを課題とする。本発明は、又、サザンカ花部の抽出液から分離、精製して得られ、抗アレルギー剤、ヒト線維芽細胞増殖促進剤等として用いられる新規なサポニン化合物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者は、サザンカ花部、サザンカ花部の抽出液について、次に示す１）〜４）の検討を行った。
１）抗アレルギー剤の活性評価の指標として、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞における抗原刺激による脱顆粒抑制作用。
２）脂肪分解阻害剤の活性評価の指標として、膵リパーゼ阻害作用。
３）抗糖尿病剤やしわとり等のための美容素材としての用途が考えられる抗酸化剤の活性評価の指標として、ＤＰＰＨラジカル消去作用及びスーパーオキサイドディスムターゼ（ＳＯＤ）様作用。
４）創傷治癒剤やヒト線維芽細胞増殖促進剤の活性評価の指標として、ヒト線維芽細胞増殖促進作用。
【０００５】
又、本発明者は、前記抽出液から分離、精製して得られるサポニン化合物についても、前記の１）〜４）の検討を行った。
【０００６】
その結果、サザンカ花部、その抽出液、及び抽出液から分離、精製して得られるサポニン化合物が、脱顆粒抑制（抗アレルギー）作用、膵リパーゼ阻害作用、ＤＰＰＨラジカル消去作用やスーパーオキサイドディスムターゼ（ＳＯＤ）様作用、及びヒト線維芽細胞増殖促進作用を示すことを見出し、以下に示す態様の発明を完成した。
【０００７】
本発明は、その第１の態様として、サザンカ花部、及び／又は、サザンカ花部の抽出液を活性成分として含むことを特徴とする抗アレルギー剤（請求項１）を提供する。この抗アレルギー剤は、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞における抗原刺激による脱顆粒を抑制する作用を示し、ヒト又は動物に投与することによりアレルギーの発症を抑制する作用を奏する。なお、サザンカ花部の抽出液とは、サザンカ花部を、水、低級脂肪族アルコール、グリコール、低級脂肪族アルコールやグリコールの含水物等の抽出溶媒により抽出した液を言うが、この明細書では、さらに、その抽出した液を濃縮して得られるエキスや、その抽出した液を分配処理して得られる分配移行液（ｆｒａｃｔｉｏｎ）等も含む意味で用いる。
【０００８】
又、本発明は、その第２の態様として、サザンカ花部、及び／又は、サザンカ花部の抽出液を活性成分として含むことを特徴とする脂肪分解阻害剤（請求項２）を提供する。この脂肪分解阻害剤は膵リパーゼ阻害作用を示し、これをヒト又は動物に投与することにより膵リパーゼによる脂肪の分解を阻害する。食事中の脂肪は、膵リパーゼによって分解され、モノグリセライドと脂肪酸となって吸収されるので、この脂肪の分解を阻害することにより、肥満を抑制できると期待される。
【０００９】
さらに、本発明は、その第３の態様として、サザンカ花部、及び／又は、サザンカ花部の抽出液を活性成分として含むことを特徴とする抗酸化剤（請求項３）を提供する。この抗酸化剤は、ＤＰＰＨラジカル消去作用及びスーパーオキサイドディスムターゼ（ＳＯＤ）様作用を示し、ヒト又は動物に投与することにより、生活習慣病や老化等の原因となる活性酸素の生成を抑制し又活性酸素を消去する等の作用が期待される。従って、糖尿病の発症の抑制、心臓病や脳卒中の予防、抗がん等の効果が期待されるとともに、しわとり等の老化防止の効果も期待され、美容素材としての用途も考えられる。
【００１０】
さらに又、本発明は、その第４の態様として、サザンカ花部、及び／又は、サザンカ花部の抽出液を活性成分として含むことを特徴とするヒト線維芽細胞増殖促進剤（請求項４）を提供する。このヒト線維芽細胞増殖促進剤は、ヒト線維芽細胞増殖促進作用を示し、ヒト又は動物に投与することにより、ヒト線維芽細胞の増殖を促進する。従って、創傷治癒剤等としての用途が考えられる。
【００１１】
本発明者は、さらに又、前記の抽出液を分離、精製し、含有成分の詳細な探索等を行い、さらにその含有成分の生物活性について検討を行ったところ、前記の抽出液中には、下記の式（１）、式（２）、式（３）、式（４）又は式（５）で表される化合物等、種々のサポニン化合物が含まれており、式（１）、式（２）、式（３）、式（４）又は式（５）で表されるサポニン化合物は、脱顆粒抑制作用及び／又はヒト線維芽細胞増殖促進作用を示し、抗アレルギー剤及び／又はヒト線維芽細胞増殖促進剤として用いられることを見出した。
【００１２】
そこで、本発明は、その第５の態様として、下記式（１）で表されるサポニン化合物：
【００１３】
【化１】
【００１４】
下記式（２）で表されるサポニン化合物：
【００１５】
【化２】
【００１６】
下記式（３）で表されるサポニン化合物：
【００１７】
【化３】
【００１８】
及び、下記式（５）で表されるサポニン化合物：
【００１９】
【化４】
【００２０】
からなる群より選ばれる１種以上のサポニン化合物を、活性成分として含むことを特徴とする抗アレルギー剤（請求項５）を提供する。この抗アレルギー剤は、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞における抗原刺激による脱顆粒を抑制する作用を示し、ヒト又は動物に投与することによりアレルギーの発症を抑制する作用を奏する。
【００２１】
又、本発明は、その第６の態様として、下記式（１）で表されるサポニン化合物：
【００２２】
【化５】
【００２３】
下記式（２）で表されるサポニン化合物：
【００２４】
【化６】
【００２５】
下記式（３）で表されるサポニン化合物：
【００２６】
【化７】
【００２７】
下記式（４）で表されるサポニン化合物：
【００２８】
【化８】
【００２９】
及び、下記式（５）で表されるサポニン化合物：
【００３０】
【化９】
【００３１】
からなる群より選ばれる１種以上のサポニン化合物を、活性成分として含むことを特徴とするヒト線維芽細胞増殖促進剤（請求項６）を提供する。このヒト線維芽細胞増殖促進剤は、ヒト線維芽細胞増殖促進作用を示し、ヒト又は動物に投与することにより、ヒト線維芽細胞の増殖を促進する。従って、創傷治癒剤等としての用途が考えられる。
【００３２】
ヒト線維芽細胞増殖促進剤としては、式（１）、式（２）、式（３）、式（４）、又は式（５）で表される化合物の中でも、式（１）、式（２）、又は式（３）で表される化合物を用いるものが好ましく、特に好ましくは、式（１）又は式（２）で表される化合物を用いるものである。
【００３３】
前記の第１の態様又は第５の態様の抗アレルギー剤、第２の態様の脂肪分解阻害剤、第３の態様の抗酸化剤、第４の態様又は第６の態様のヒト線維芽細胞増殖促進剤は、ヒト又は動物に投与することにより前記の作用を奏するので、ヒト又は動物用の医薬や医薬組成物（以後、医薬組成物を含めて医薬と言う。）等として用いることができる。
【００３４】
本発明者は、さらに、サザンカ花部の抽出液の分離、精製により得られた化合物について構造の解析を行ったところ、前記式（２）で表されるサポニン化合物、前記式（４）で表されるサポニン化合物、及び前記式（５）で表されるサポニン化合物は、新規なサポニン化合物であることを見出した。即ち本発明は第７の態様として、以下に示す新規なサポニン化合物を提供する。
【００３５】
下記の式（２）で表されるサポニン化合物（請求項７）。
【００３６】
【化１０】
【００３７】
下記の式（４）で表されるサポニン化合物（請求項８）。
【００３８】
【化１１】
【００３９】
下記の式（５）で表されるサポニン化合物（請求項９）。
【００４０】
【化１２】
【００４１】
請求項７又は請求項９で表されるサポニン化合物は、脱顆粒抑制作用を示し、抗アレルギー剤の活性成分として用いることができる。又、請求項７、請求項８又は請求項９で表されるサポニン化合物は、ヒト線維芽細胞増殖促進作用を示し、ヒト線維芽細胞増殖促進剤の活性成分として用いることができる。
【発明の効果】
【００４２】
本発明の抗アレルギー剤（第１の態様及び第５の態様）は、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞における抗原刺激による脱顆粒抑制（抗アレルギー）作用を示し、ヒト又は動物のアレルギーの発症を抑制する効果がある。本発明の脂肪分解阻害剤（第２の態様）は、膵リパーゼ阻害作用を示し、ヒト又は動物の肥満を抑制する効果がある。本発明の抗酸化剤（第３の態様）は、ＤＰＰＨラジカル消去作用及びスーパーオキサイドディスムターゼ（ＳＯＤ）様作用を示し、生活習慣病や老化等の原因となる活性酸素の生成を抑制し又活性酸素を消去する等の作用が期待される。従って、糖尿病発症抑制剤、心臓病や脳卒中の予防剤、しわとり等の老化防止の効果を有する美容素材としての用途が考えられる。本発明のヒト線維芽細胞増殖促進剤（第４の態様及び第６の態様）は、ヒト線維芽細胞の増殖を促進する作用を有し、創傷治癒剤としての用途が考えられる。
【００４３】
本発明の新規サポニン化合物（第７の態様）は、脱顆粒抑制及び／又はヒト線維芽細胞増殖促進作用を示し、抗アレルギー剤及び／又はヒト線維芽細胞増殖促進剤として用いることができる。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
次に、本発明を実施するための最良の形態について説明するが、本発明の範囲はこの実施の形態のみに限定されるものではない。
【００４５】
本発明の、第１の態様の抗アレルギー剤、第２の態様の脂肪分解阻害剤、第３の態様の抗酸化剤、第４の態様のヒト線維芽細胞増殖促進剤としては、
１）サザンカ花部を（抽出等の処理を行わずに）活性成分として用いるもの、
２）サザンカ花部を、水、低級脂肪族アルコール、グリコール又は低級脂肪族アルコールやグリコールの含水物等により抽出した抽出液を濃縮して得られる抽出エキスを活性成分として用いるもの、を例示することができる。サザンカ花部を用いる場合は、サザンカ花部をそのまま用いることができるし、又は、粉砕、破砕、切断、すりつぶし等による形状変化を行ったもの、もしくは、乾燥等の調製を行ったものを用いることもできる。
【００４６】
抽出液は、サザンカ花部をそのまま、又は、粉砕、破砕、切断、すりつぶし等による形状変化を行ったものを、水、低級脂肪族アルコール、グリコール、又は低級脂肪族アルコールやグリコールの含水物等の抽出溶媒により抽出して得ることができる。抽出効率の点からは、粉砕、破砕、切断、すりつぶし等による形状変化を行ったものを用いる方法が望ましい。
【００４７】
抽出溶媒として用いられるアルコールとしては、炭素数１〜４の低級アルコール類が挙げられ、具体的には、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｔ−ブタノール又はこれらの混液等が挙げられる。グリコールとしては、エチレングリコール、プロピレングリコール等が挙げられる。抽出溶媒としては、好ましくはこれらのアルコールやグリコール、又はこれらのアルコールやグリコールに３０容量％までの水を含有する含水アルコールや含水グリコールが用いられる。前記のアルコールやグリコールの中でもメタノール又はエタノールが好ましい。これらの抽出溶媒は、抽出材料に対して、１〜５０倍（重量）程度、好ましくは１０〜３０倍程度用いられる。
【００４８】
抽出温度は、室温〜溶媒の沸点の間で任意に設定できるが、５０℃〜抽出溶媒の沸点の温度が好ましい。抽出は、振盪下もしくは非振盪下又は還流下に、前記の抽出材料、即ち、サザンカ花部そのもの、又は、それを粉砕、破砕、切断、すりつぶし等による形状変化を行ったもの等を、前記の抽出溶媒に浸漬することによって行うのが適当である。
【００４９】
好ましい抽出時間は、抽出温度や抽出の際の振盪の有無等により変動し、特に限定されない。例えば、抽出材料を振盪下に浸漬する場合には、３０分間〜１０時間程度行うのが適当であり、非振盪下に浸漬する場合には、１時間〜２０日間程度行うのが適当である。又、抽出溶媒の還流下に抽出するときは、３０分間〜数時間加熱還流するのが好ましい。なお、５０℃より低い温度で浸漬して抽出することも可能であるが、その場合には、前記の時間よりも長時間浸漬するのが好ましい。抽出操作は、同一材料について１回だけ行ってもよいが、複数回、例えば２〜５回程度繰り返すのが好ましい。
【００５０】
前記の抽出工程により得られた抽出液には、サザンカ花部の含有成分が溶出されている。本発明の、第１の態様の抗アレルギー剤、第２の態様の脂肪分解阻害剤、第３の態様の抗酸化剤、第４の態様のヒト線維芽細胞増殖促進剤としては、このようにして得られた抽出液を濃縮して用いてもよい。又、このようにして得られた抽出液に分配処理を施し、得られた分配移行液を用いてもよい。濃縮は、低温で減圧下に行うのが好ましい。濃縮する前に濾過して濾液を濃縮してもよい。なお、濃縮等の操作を行わず抽出液をそのまま用いても、抗アレルギー剤、脂肪分解阻害剤、抗酸化剤、ヒト線維芽細胞増殖促進剤としての作用を奏する。
【００５１】
又、濃縮は乾固するまで行ってもよく、粉末状又は凍結乾燥品等として用いてもよい。濃縮する方法、粉末状及び凍結乾燥品とする方法は当該分野での公知の方法を用いることができる。
【００５２】
このようにして得られる抽出液（さらに濃縮したもの、分配により得られる分配移行液等を含む意味である。）は、精製処理に付し、含有される各成分に分離することができる。前記の、式（１）〜（５）のいずれかで表される化合物は、この精製、分離により得ることができる。そして、この精製、分離により得られた式（１）、式（２）、式（３）、又は式（５）で表される化合物も、抗アレルギー剤として用いることができ（本発明の第５の態様）、又、式（１）、式（２）、式（３）、式（４）、又は式（５）で表される化合物も、ヒト線維芽細胞増殖促進剤として用いることができる（本発明の第６の態様）。
【００５３】
精製処理は、例えば、クロマトグラフ法、イオン交換樹脂を使用する溶離法、溶媒による分配抽出等を単独、又は組み合わせて採用することができる。クロマトグラフ法としては、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、遠心液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等を挙げることができ、これらのいずれか、又はそれらを組み合わせて行う方法が挙げられる。この際の担体、溶出溶媒等の精製条件は、各種クロマトグラフィーに対応して適宜選択することができる。
【００５４】
前記のように、本発明の第１の態様の抗アレルギー剤、第２の態様の脂肪分解阻害剤、第３の態様の抗酸化剤、又は第４の態様のヒト線維芽細胞増殖促進剤を含有させることにより、ヒト又は動物用の医薬を製造することができる。本発明の抗アレルギー剤、脂肪分解阻害剤、抗酸化剤、ヒト線維芽細胞増殖促進剤が、ヒト又は動物用の医薬として用いられる場合は、サザンカ花部そのもの、サザンカ花部の抽出液、もしくは前記式（１）、式（２）、式（３）、式（４）、又は式（５）で表される化合物を、そのままの状態で又は適当な媒体で希釈して、医薬品等の製造分野における公知の方法により、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤又は液剤等の種々の形態にして用いられる。
【００５５】
これらの形態においては、適当な媒体を添加してもよい。適当な媒体としては、医薬的に許容される賦形剤、例えば結合剤（例えばシロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビトール、トラガント又はポリビニルピロリドン）、充填剤（例えば乳糖、砂糖、トウモロコシ澱粉、リン酸カルシウム、ソルビトール又はグリシン）、錠剤用滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール又はシリカ）、崩壊剤（例えば馬鈴薯澱粉）又は湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）等が挙げられる。
【００５６】
錠剤とする場合は、通常の製薬における周知の方法でコートしてもよい。液体製剤とする場合は、例えば水性又は油性の懸濁液、溶液、エマルジョン、シロップ又はエリキシルの形態であってもよい。又、使用前に水や他の適切な賦形剤と混合する乾燥製品として提供してもよい。
【００５７】
こうした液体製剤は、通常の添加剤、例えば、ソルビトール、シロップ、メチルセルロース、グルコースシロップ、ゼラチン水添加食用脂等の懸濁化剤、レシチン、ソルビタンモノオレエート、アラビアゴム等の乳化剤（食用脂を含んでもよい）、アーモンド油、分画ココヤシ油又はグリセリン、プロピレングリコールやエチレングリコールのような油性エステル等の非水性賦形剤、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピル又はソルビン酸等の保存剤を含んでもよく、さらに所望により着色剤又は香料等を含んでもよい。
【００５８】
本発明の医薬における、抽出液、前記式（１）、式（２）、式（３）、式（４）、又は式（５）で表される化合物の使用量は、濃縮、精製の程度、活性の強さ等、使用目的、対象疾患や自覚症状の程度、使用者の体重、年齢等によって適宜調整される。例えば、医薬として成人について使用する場合は、１回の投与毎に、抽出液の場合では、１ｍｇ〜２０ｇ程度の範囲で使用し、この範囲内で精製度や水分含量等に応じて調整することが適当な場合が多い。又、前記式（１）、式（２）、式（３）、式（４）、又は式（５）で表される化合物を使用する場合は、１ｍｇ〜１ｇ程度が適当な場合が多い。
【実施例】
【００５９】
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、実施例は本発明の範囲を限定するものではない。なお、以下の実施例では、特に記載がない限り、以下に示す各種溶媒、濾紙、クロマトグラフィー用担体及びＨＰＬＣカラムを用いた。又、特に明記しない試薬については、和光純薬工業社製試薬（特級）を用いた。
【００６０】
実施例１
日本京都産サザンカ花部（４．０ｋｇ）をメタノール（ＭｅＯＨ：ナカライテスク社製、試薬一級）で熱時抽出（３時間）し、抽出液を濾取した。残渣にメタノールを加え、同様の抽出操作を計３回行った。得られたメタノール抽出液を合わせ、減圧下溶媒を留去し、ＭｅＯＨ抽出エキス（収量４１７．７ｇ、収率１０．４％）（以下、括弧内で収量及び／又は収率を表す場合は、「収量」、「収率」を略して示す。なお、「収率」とは、サザンカ花部からの単離収率である。）を得た。
【００６１】
このＭｅＯＨ抽出エキス（４００ｇ）を、酢酸エチル（ＡｃＯＥｔ）と水（１：１）で分配し、ＡｃＯＥｔ移行部（５７．９ｇ、１．５％）とＨ２Ｏ移行部を得た。さらにこのＨ２Ｏ移行部を、ｎ−ブタノール（ｎ−ＢｕＯＨ）と水（１：１）で分配し、ｎ−ＢｕＯＨ移行部（１４９．５ｇ、３．９％）とＨ２Ｏ移行部（１９１．７ｇ、５．０％）を得た。得られたｎ−ＢｕＯＨ移行部について、ＨＰ−２０カラムクロマトグラフィー（Ｈ２Ｏ→ＭｅＯＨ→アセトン）に付し、各溶出部を減圧下溶媒留去することにより、Ｈ２Ｏ溶出部（０．９ｇ、０．０２５％）、ＭｅＯＨ溶出部（５４．１ｇ、１．４７％）、アセトン溶出部（８８．２ｇ、２．４０％）を得た。
【００６２】
実施例２ ＲＢＬ−２Ｈ３細胞を用いた抗原刺激時における脱顆粒抑制（抗アレルギー）作用（β−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ遊離阻害率の測定）
【００６３】
実施例１で得られたサザンカ花部のＭｅＯＨ抽出エキス、ＡｃＯＥｔ移行部、ｎ−ＢｕＯＨ移行部、Ｈ２Ｏ移行部について、脱顆粒抑制（アレルギーの抑制）活性の検討を行った。具体的には、肥満細胞のモデル細胞であるラット好塩基球性白血病細胞（ＲＢＬ−２Ｈ３細胞）を用い、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞が抗原刺激によって脱顆粒を起こした際にヒスタミン等と共に放出されるβ−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅの遊離率を以下に示す方法により求め、その結果より被験物質のβ−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ遊離阻害率を求め、それを、脱顆粒の指標とし抗アレルギー作用成分の探索を行った。表１に示すように、ＭｅＯＨ抽出エキス、ＡｃＯＥｔ移行部及びｎ−ＢｕＯＨ移行部に有意な抑制活性（脱顆粒抑制作用）が見られた．特にｎ−ＢｕＯＨ移行部に強い抑制活性が認められた。
【００６４】
［β−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅの遊離率、被験物質のβ−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ遊離阻害率］
ヒューマンサイエンス研究資源バンクから購入したＲＢＬ−２Ｈ３細胞を、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）、１００ｕｎｉｔ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン含有Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ（ＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ社製）で培養（５％ＣＯ２、３７°Ｃ）した。次に細胞培養用２４ウェル平底マイクロプレートに、２．０×１０５ｃｅｌｌｓ（４００μｌ ｍｅｄｉｕｍ／ｗｅｌｌ）ずつ播種し、１時間培養した後、マウスモノクローナル抗ＤＮＰ ＩｇＥ抗体（Ｓｉｇｍａ社製）を培養液に加え（終濃度：０．４５μｇ／ｍｌ）、２４時間培養（５％ＣＯ２、３７°Ｃ）することによって細胞を感作させた。その後、感作した細胞を５００μｌのｓｉｒａｇａｎｉａｎ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．２：１１９ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、０．４ｍＭのＭｇＣｌ２、２５ｍＭのピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルフォン酸）（ＰＩＰＥＳ）、４０ｍＭのＮａＯＨ）で２回洗浄し、１６０μｌの５．６ｍＭのグルコース、１ｍＭのＣａＣｌ２、０．１％ＢＳＡ含有ｓｉｒａｇａｎｉａｎ ｂｕｆｆｅｒを加えて１０分間予備加温（５％ＣＯ２、３７°Ｃ）した。
【００６５】
次に、２０μｌの被験物質溶液（ＤＭＳＯ終濃度：０．１％）を加え、１０分後に抗原（ＤＮＰ−ＢＳＡ、終濃度：１０μｇ／ｍｌ）を加えて１０分間インキュベートして細胞を刺激した。１０分間氷冷して反応を止めた後、上清５０μｌを９６ウェル平底マイクロプレートに移し、０．１Ｍｃｉｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒに溶解した１ｍＭのｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄｅ（ＰＮＡＧ）５０μｌを加えて混和後３７°Ｃで１時間反応させた。反応溶液に２００μｌのｓｔｏｐ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ１０．０：０．１ＭのＮａＨＣＯ３／Ｎａ２ＣＯ３）を加えて混和し、マイクロプレートリーダー（ｍｏｄｅｌ５５０、ＢＩＯ−ＲＡＤ社）にて吸光度（測定波長：４０５ｎｍ、参照波長：６５５ｎｍ）を測定し、この吸光度の測定値に基づき、以下の式により遊離率を求めた。又、被験物質のみの吸光度も併せて測定し補正した。細胞内全β−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅの測定には、超音波破砕機で破砕した細胞を遠心分離した上清を用いた。このときの吸光度を吸光度Ａとする。
【００６６】
【数１】
【００６７】
被験物質のβ−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ遊離阻害率は以下の式により求めた．
【００６８】
【数２】
【００６９】
実験結果を表１に示す。なお、実験はＮ＝４で行った。表中の数値は、その平均±標準誤差を表す。対照群との平均値の有意差の検定にはＤｕｎｎｅｔｔの方法を用い、ｐ値が０．０５以下のものを有意とみなした。ｐ値が０．０５以下のものには、表中の数値に＊を示した。特に、ｐ値が０．０１以下のものには、表中の数値に＊＊を示した。これは、以下に示す他の測定、他の表においても同様である。
【００７０】
【表１】
【００７１】
実施例３ 膵リパーゼ阻害作用試験
実施例１で得られたサザンカ花部のＭｅＯＨ抽出エキス、ＡｃＯＥｔ移行部、ｎ-ＢｕＯＨ移行部、Ｈ２Ｏ移行部について、膵リパーゼ阻害作用の検討を行った。具体的には、次に示す方法により膵リパーゼ阻害作用を求めた。表２に示す結果より明らかなように、ＭｅＯＨ抽出エキス、ＡｃＯＥｔ移行部及びｎ−ＢｕＯＨ移行部に有意な阻害活性（膵リパーゼ阻害作用）が認められた。
【００７２】
［膵リパーゼ阻害作用の測定］
基質としてトリオレイン溶液［トリオレイン８０ｍｇ、ホスファチジルコリン１０ｍｇ及びタウロコール酸５ｍｇに０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．０：０．１ＭのＮａＣｌ含有）９ｍｌを加え、１０分間超音波処理を行った溶液］１００μｌに、被験サンプル溶液５μｌを加え、さらに０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．０）９５μｌを加え、全量を２００μｌとした。３７℃で３分間予備加温したのち、ブタ膵臓由来のリパーゼ溶液５０μｌを加えて３０分間反応させ、その後２分間沸騰水浴（９０〜１００℃）に入れて反応を停止させた。別に、各サンプルにつきリパーゼ溶液に代えてトリス緩衝液を５０μｌ加え、同様の操作を行ったものを盲検として調製した。生成したオレイン酸の濃度をＮＥＦＡ Ｃ−テストワコー（和光純薬社）により測定した。なお、リパーゼはトリス緩衝液に溶解し、本実験条件下で約０．７ｍｅｑ／Ｌのオレイン酸が生成する濃度に調製した。被験サンプルはＤＭＳＯを用いて溶解し希釈した。比較対照薬としてｏｒｌｉｓｔａｔを用いた。このようにして測定したオレイン酸量に基づき、以下の式により阻害率（％）を算出し、その値を表２に示した。
【００７３】
阻害率（％）＝
｛１−（サンプル添加時のオレイン酸量−サンプル添加時［盲検］のオレイン酸量）／
（サンプル非添加時（対照）のオレイン酸量−（対照）［盲検］のオレイン酸量）｝×１００
【００７４】
【表２】
【００７５】
肥満は脂肪の合成が分解を上回ることによって発症する。したがって肥満の予防には食事に含まれる脂肪の吸収を遅らせなければならない。食事中の脂肪は膵リパーゼによって分解され、モノグリセライドと脂肪酸となって吸収される。そこで、膵リパーゼによる脂肪の分解を阻害することで、カイロミクロンを低下させ、肥満を予防できると期待される。表２に示すように、ＭｅＯＨ抽出エキス、ＡｃＯＥｔ移行部及びｎ−ＢｕＯＨ移行部に有意な膵リパーゼ阻害活性が認められるので、これらは脂肪分解阻害剤として使用でき、肥満の予防に効果があると期待される。
【００７６】
実施例４ ＤＰＰＨラジカル捕捉試験
実施例１で得られたサザンカ花部のＭｅＯＨ抽出エキス、ＡｃＯＥｔ移行部、ｎ−ＢｕＯＨ移行部、Ｈ２Ｏ移行部について、次に示す方法によりＤＰＰＨラジカル捕捉試験を行った。
【００７７】
［ＤＰＰＨラジカル捕捉試験］
９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに、エタノールと０．１Ｍ酢酸−酢酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ５．５）混合物（１：２）を１２０μｌ、被検物質のエタノール溶液を４０μｌ、及び２．５×１０−４ＭのＤＰＰＨエタノール溶液を４０μｌ加えた。撹拌後、室温にて３０分間静置した後、マイクロプレートリーダーＳＨ−１０００（コロナ電気）により吸光度を測定した（測定波長５１７ｎｍ、参照波長６５５ｎｍ）。測定値に基づき以下の式によりラジカル捕捉率を算出し、さらに５０％阻害濃度（ＥＣ５０）を求めた。このようにして得たラジカル捕捉率及びＥＣ５０値を表３に示す。
【００７８】
ラジカル補足率（％）＝
｛１−（被験物質添加時の吸光度）／（被験物質非添加時［対照］の吸光度）｝×１００
【００７９】
【表３】
【００８０】
実施例５ ＤＰＰＨラジカル消去作用、スーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）様作用試験
実施例１で得られたサザンカ花部のＭｅＯＨ抽出エキス、ＡｃＯＥｔ移行部、ｎ−ＢｕＯＨ移行部、Ｈ２Ｏ移行部について、次に示す方法によりスーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）様作用試験を行った。
【００８１】
［ＤＰＰＨラジカル消去作用、スーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）様作用試験］
１００μＭのキサンチン、１００μＭのＥＤＴＡ、２５μＭのＷＳＴ−１（同仁化学研究所製試薬）を含む５０ｍＭの炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．２）、及び被験サンプルを含む反応液２．９ｍｌを、３７℃で１０分間予備加温し、５８ｍＵ／ｍｌのキサンチンオキシダーゼ１００μを加えて２０分間インキュベーションした。インキュベーション後、２Ｍ塩酸１００μｌを加えて反応を止め、Ｏ２−により還元されて生成したＷＳＴ−１ホルマザンの吸光度を測定した（測定波長：４５０ｎｍ）。測定値に基づき以下の式によりＳｃａｖｅｎｇｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ（％）を算出し、さらに５０％阻害濃度（ＥＣ５０）を求めた。このようにして得たＳｃａｖｅｎｇｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ（％）及びＥＣ５０値を表４に示す。
【００８２】
Ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ（％）＝
｛１−（被験物質添加時の吸光度）／（被験物質非添加時［対照］の吸光度）｝×１００
【００８３】
【表４】
【００８４】
表３及び表４に示す結果より明らかなように、サザンカ花部のＭｅＯＨ抽出エキス、ＡｃＯＥｔ移行部及びｎ−ＢｕＯＨ移行部に有意なＤＰＰＨラジカル消去作用、ＳＯＤ様作用が認められた。
【００８５】
実施例６ サザンカ花部の含有成分の単離
実施例１で得られたＭｅＯＨ溶出部を、逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィー［５４．１ｇ、ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝Ｈ２Ｏ→（１０：９０）→（２０：８０）→（３０：７０）→（４０：６０）→（５０：５０）→（６０：４０）→（７０：３０）→（８０：２０）→（９０：１０）→ＭｅＯＨ］にて分画し、画分１（０．８３ｇ）、画分２（３．２８ｇ）、画分３（２７．９６ｇ）、画分４（６．１４ｇ）、画分５（９．５６ｇ）、画分６（０．８８ｇ）、画分７（０．６４ｇ）を得た。
【００８６】
画分５（８．８９ｇ）を、逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィー［３４７．９ｇ、ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝（５０：５０）→（５５：４５）→（６０：４０）→（６５：３５）→（７０：３０）→（７５：２５）→（８０：２０）→（８５：１５）→（９０：１０）→（９５：５）→ＭｅＯＨ］にて分画し、画分５−１（１６．１ｍｇ）、画分５−２（２２６．２ｍｇ）、画分５−３（３８９．５ｇ）、画分５−４（９４５．２ｍｇ）、画分５−５（３．６９ｇ）、画分５−６（３．０５ｇ）、画分５−７（３２９．４ｍｇ）、画分．５−８（３１９．０ｍｇ）を得た。さらに画分５−５について、ＨＰＬＣ［カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＭＳ−ＩＩ、溶離液：６８％ａｑ．ＭｅＯＨ ｉｎ １％酢酸］を用いて分離精製した結果、化合物６（２７．８ｍｇ）、化合物２（１０８．５ｍｇ、０．０１４５％）、化合物３（４２．３ｍｇ、０．００５７％）を単離した。
【００８７】
又、画分５−６について、ＨＰＬＣ［カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＭＳ−ＩＩ、溶離液：７３％ａｑ．ＭｅＯＨ ｉｎ １％酢酸］を用いて分画・単離し、画分５−６−１（１８．４ｍｇ）、画分．５−６−２（９２．４ｍｇ）、画分５−６−３（化合物５、２２．６ｍｇ、０．００５７％）、画分５−６−４（１９２．５ｍｇ）、画分５−６−５（化合物１、５７．３ｍｇ、０．００３２％）、画分５−６−６（１００．４ｍｇ）、画分５−６−７（３６７．４ｍｇ）を得た。さらに、画分５−６−２についてＨＰＬＣ［カラム： ＣＯＳＭＯＳＩＬ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒ Ｗａｔｅｒｓ、溶離液：７３％ａｑ．ＭｅＯＨ ｉｎ １％酢酸］で分離精製し、化合物４（１７．９ｍｇ、０．００１０％）を得た。
【００８８】
上記のようにして得られた化合物１〜５について、１Ｈ-ＮＭＲ、１３Ｃ-ＮＭＲ、質量分析（ＭＳスペクトル）、旋光度、ＩＲスペクトル等の測定を行い、その測定結果に基づき構造決定や同定を行ったところ、化合物１は、前記式（１）で表されるサポニン化合物（新規トリテルペン配糖体：Ｓａｓａｎｑｕａｓａｐｏｎｉｎ Ｉと命名する。）、化合物２は、前記式（２）で表される新規サポニン化合物（Ｓａｓａｎｑｕａｓａｐｏｎｉｎ IIと命名する。）、化合物３は、前記式（３）で表されるサポニン化合物（Ｓａｓａｎｑｕａｓａｐｏｎｉｎ IIIと命名する。）、化合物４は、前記式（４）で表される新規サポニン化合物（Ｓａｓａｎｑｕａｓａｐｏｎｉｎ ＩＶと命名する。）、化合物５は、前記式（５）で表される新規サポニン化合物（Ｓａｓａｎｑｕａｓａｐｏｎｉｎ Ｖと命名する。）であることが確認された。
【００８９】
なお、旋光度［α］Ｄ、質量分析、ＵＶスペクトル、ＩＲスペクトル及び１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲ等は、以下に示す測定装置、条件により行った。
【００９０】
［旋光度］［α］Ｄ 堀場高感度ＳＥＰＡ−３００デジタルポラリメーター（ｌ＝０．５）を用いて測定した。
［質量分析］
高分解能質量分析（高分解能ＦＡＢ−ＭＳ、ＥＩ−ＭＳ）及び質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ、ＥＩ−ＭＳ）は、日本電子社製ＪＭＳ−ＳＸ １０２及びＪＭＳ−ＧＣＭＡＴＥ型質量分析装置を用いて測定した。
［ＩＲスペクトル］ Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＦＴ−ＩＲ ＤＲ−８０００ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを用いて測定した。
［ＵＶスペクトル］ ＳｈｉｍａｄｚｕＵＶ−１６００を用いて測定した。
［核磁気共鳴スペクトル］ １Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲは、日本電子社製 ＪＮＭ−ＥＸ ２７０（２７０ＭＨｚ）、ＪＮＭ−ＬＡ ５００（５００ＭＨｚ）及びＪＮＭ−ＥＣＡ ６００（６００ＭＨｚ）を用い、テトラメチルシラン（ＴＭＳ）を内部標準として用いて測定した。
［高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）］ ポンプはＳｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ−６ＡＤを、示差屈折計検出器はＳｈｉｍａｄｚｕ ＲＩＤ−１０Ａを、紫外可視分光光度計検出器はＳｈｉｍａｄｚｕ ＳＰＤ−１０Ａを用いた。
【００９１】
以下、実施例６で得られた化合物１〜５についての、外観、旋光度［α］Ｄ、質量分析、ＵＶスペクトル、ＩＲスペクトル、１Ｈ−ＮＭＲの測定結果を示す。
【００９２】
［化合物１：Ｓａｓａｎｑｕａｓａｐｏｎｉｎ Ｉ］
・性状：無色微粉末結晶
・ｍｐ．： ２１３．０-２１５．０°Ｃ
・旋光度：［α］Ｄ２０−２４．６°（ｃ＝０．８５、ＭｅＯＨ）
ＩＲスペクトル（ＫＢｒ）：νｍａｘ ３３７０、１７２０、１６９８、１０７５、１０４７ｃｍ−１
・１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ピリジン−ｄ５）δ ０．７９、１．０１、１．０５、１．０７、１．１２、１．２７、１．８７（ａｌｌ ｓ、２５、２６、２９、２４、２３、３０、２７−Ｈ３）、０．８４（ｔ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、６'''''−Ｈ３）、１．３５（ｍ、５'''''−Ｈ２）、２．７１、２．７８（ｂｏｔｈ ｍ、４'''''−Ｈ２）、３．２１（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝５．０、１２．０Ｈｚ、３−Ｈ）、３．５９、３．７６（ｂｏｔｈ ｄ、Ｊ＝１０．３Ｈｚ、２８−Ｈ２）、４．２４（１Ｈ、ｄ−ｌｉｋｅ、１５−Ｈ）、４．８４（ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、１'−Ｈ）、５．４９（１Ｈ、ｂｒ ｓ、１２−Ｈ）、５．７９（ｄ、Ｊ＝１１．０Ｈｚ、２'''''−Ｈ）、５．９４（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、１''−Ｈ）、６．０９（ｔｄ、Ｊ＝７．６、１１．０Ｈｚ、３'''''−Ｈ）、６．１８（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝５．５、１１．７Ｈｚ、２２−Ｈ）、６．２４（１Ｈ、ｂｒ ｓ、１''''−Ｈ）、６．２６（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、１'''−Ｈ）
【００９３】
［化合物２：Ｓａｓａｎｑｕａｓａｐｏｎｉｎ ＩＩ］
・性状：無色微粉末結晶
・ｍｐ．： ２１９．５-２２１．０°Ｃ
・旋光度：［α］Ｄ２９−１８．２°（ｃ＝０．４３、ＭｅＯＨ）
・ＩＲスペクトル（ＫＢｒ）：νｍａｘ ３３７０、１７２０、１６８４、１０７５、１０４５ｃｍ−１
・１Ｈ−ＮＭＲ （６００ ＭＨｚ、ピリジン−ｄ５）δ ０．８０、１．０２、１．０６、１．０６、１．１４、１．２８、１．８７（ａｌｌ ｓ、２５、２６、２９、２４、２３、３０、２７−Ｈ３）、１．４３（３Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．９Ｈｚ、Ｔｉｇ−４−Ｈ３）、１．７８（３Ｈ、ｓ、Ｔｉｇ−５−Ｈ３）、３．１９（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝５．０、１１．０Ｈｚ、３−Ｈ）、３．６１、３．７７（ｂｏｔｈ ｄ、Ｊ＝１０．３Ｈｚ、２８-Ｈ２）、４．２４（１Ｈ、ｄ−ｌｉｋｅ、１５−Ｈ）、４．８４（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、１’−Ｈ）、５．４７（１Ｈ、ｂｒ ｓ、１２−Ｈ）、５．９２（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、１''−Ｈ）、６．１７（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝５．５、１１．７Ｈｚ、２２−Ｈ）、６．２１（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、１'''−Ｈ）、６．２５（１Ｈ、ｂｒ ｓ、１''''−Ｈ）、６．８４（１Ｈ、ｑ、Ｊ＝６．９Ｈｚ、Ｔｉｇ−３−Ｈ）
・ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｉｏｎ ＦＡＢ−ＭＳ： ｍ／ｚ １２４１ （Ｍ＋Ｎａ）＋
・高分解能ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｉｏｎ ＦＡＢ−ＭＳ： ｍ／ｚ １２４１．５９２３［Ｃ59Ｈ94Ｏ２６Ｎａの計算値： （Ｍ＋Ｎａ）＋：ｍ／ｚ １２４１．５９３１］。
【００９４】
［化合物３：Ｓａｓａｎｑｕａｓａｐｏｎｉｎ ＩＩＩ］
・性状：無色微粉末結晶
・ｍｐ．： ２２７．０-２２９．０°Ｃ
・旋光度：［α］Ｄ２１−１８．５°（ｃ＝０．７２、ＭｅＯＨ）
・ＩＲスペクトル（ＫＢｒ）：νｍａｘ ３３７０、１７２０、１６９９、１０７６、１０４３ｃｍ−１
・１Ｈ−ＮＭＲ （６００ ＭＨｚ、 ピリジン−ｄ５）δ ０．７９、１．００、１．０５、１．０６、１．１２、１．２８、１．８６（ａｌｌ ｓ、２５、２６、２９、２４、２３、３０、２７−Ｈ３）、１．８２（３Ｈ、ｓ、Ａｎｇ−５−Ｈ３）、２．０２（３Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．９Ｈｚ、Ａｎｇ−４−Ｈ３）、３．１８（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝５．０、１１．０Ｈｚ、３−Ｈ）、３．６３、３．７９（１Ｈ ｅａｃｈ、ｂｏｔｈ ｄ、Ｊ＝１０．３Ｈｚ、２８-Ｈ２）、４．２５（１Ｈ、ｄ−ｌｉｋｅ、１５−Ｈ）、４．８９（ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、１’-Ｈ）、５．４６（１Ｈ、ｂｒ ｓ、１２−Ｈ）、５．８３（１Ｈ、ｑ、Ｊ＝６．９Ｈｚ、Ａｎｇ−３−Ｈ）、５．９３（ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、１''−Ｈ）、６．１９（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝５．５、１１．７Ｈｚ、２２−Ｈ）、６．２２（ｄ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、１'''−Ｈ）、６．２５（ｂｒ ｓ、１''''−Ｈ）
【００９５】
［化合物４：Ｓａｓａｎｑｕａｓａｐｏｎｉｎ ＩＶ］
・性状：無色微粉末結晶
・ｍｐ．： ２１５．０-２１７．０°Ｃ
・旋光度：［α］Ｄ２１−３１．９° （ｃ＝０。１７、ＭｅＯＨ）
・ＩＲスペクトル（ＫＢｒ）：νｍａｘ ３３７０、１７１６、１６９７、１０７８、１０４５ｃｍ−１
・１Ｈ−ＮＭＲ （６００ ＭＨｚ、 ピリジン−ｄ５）δ ０．７９、１．０５、１．０９、１．１２、１．１５、１．２１、１．８７（ａｌｌ ｓ、２５、２４、２９、２３、２６、３０、２７-Ｈ３）、１．６０（３Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、Ｔｉｇ−４−Ｈ３）、１．８４（３Ｈ、ｓ、Ｔｉｇ−５−Ｈ３）、３．１９（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝５．０、１１．７Ｈｚ、３−Ｈ）、４．３８、４．６１（１Ｈ ｅａｃｈ、ｂｏｔｈ ｄ、Ｊ＝１１．０Ｈｚ、２８−Ｈ２）、４．３５（１Ｈ、ｄ−ｌｉｋｅ、１５−Ｈ）、４．５９（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝５．５、１１．７Ｈｚ、２２−Ｈ）、４．９１（ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、１’-Ｈ）、５．５２（１Ｈ、ｂｒ ｓ、１２−Ｈ）、５．９４（ｄ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、１''−Ｈ）、６．２５（ｄ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、１'''−Ｈ）、６．２６（ｂｒ ｓ、１''''−Ｈ）、７．００（１Ｈ、ｑ、Ｊ＝６．９Ｈｚ、Ｔｉｇ−３−Ｈ）
・ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｉｏｎ ＦＡＢ−ＭＳ： ｍ／ｚ １２４１ （Ｍ＋Ｎａ）＋
・高分解能ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｉｏｎ ＦＡＢ−ＭＳ： ｍ／ｚ １２４１．５９２３［Ｃ59Ｈ94Ｏ２６Ｎａの計算値： （Ｍ＋Ｎａ）＋：ｍ／ｚ １２４１．５９３１］。
【００９６】
［化合物５：Ｓａｓａｎｑｕａｓａｐｏｎｉｎ Ｖ］
・性状：無色微粉末結晶
・ｍｐ．： ２２４．０-２２６．０°Ｃ
・旋光度：［α］Ｄ２１−３２．４° （ｃ＝０．３１、ＭｅＯＨ）
・ＩＲスペクトル（ＫＢｒ）：νｍａｘ ３３７０、１７３０、１７１７、１０７８、１０４７ｃｍ−１
・１Ｈ−ＮＭＲ （６００ ＭＨｚ、 ピリジン−ｄ５）δ ０．７５、０．７８、１．０５、１．１０、１．１２、１．１６、１．５４（ａｌｌ ｓ、２５、２６、２４、２９、３０、２３、２７-Ｈ３）、１．００（３Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、４'''''−Ｈ３）、１．３０（３Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．９Ｈｚ、５'''''−Ｈ３）、１．６３、１．９４（１Ｈ ｅａｃｈ、ｂｏｔｈ ｍ、３'''''−Ｈ２）、２．５９（１Ｈ、 ｍ、２'''''−Ｈ）、３．１７（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝４．９、１１．１Ｈｚ、３−Ｈ）、３．６６、４．０４（１Ｈ ｅａｃｈ、ｂｏｔｈ ｄ、Ｊ＝１０．３Ｈｚ、２８-Ｈ２）、４．０９（１Ｈ、ｄｄ ｌｉｋｅ、２２−Ｈ）、４．９０（ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、１’-Ｈ）、５．３２（１Ｈ、ｂｒ ｓ、１２−Ｈ）、５．９４（ｄ、Ｊ＝７．７Ｈｚ、１''−Ｈ）、６．２２（ｍ、１６−Ｈ）、６．２２（ｄ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、１'''−Ｈ）、６．２５（ｂｒ ｓ、１''''−Ｈ）
・ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｉｏｎ ＦＡＢ−ＭＳ： ｍ／ｚ １２２７ （Ｍ＋Ｎａ）＋
・高分解能ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｉｏｎ ＦＡＢ−ＭＳ： ｍ／ｚ １２２７．６１４３
［Ｃ59Ｈ96Ｏ25Ｎａの計算値： （Ｍ＋Ｎａ）＋：ｍ／ｚ １２２７．６１３８］。
【００９７】
化合物２、化合物４、化合物５についての、１３Ｃ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ピリジン−ｄ５）の測定結果を、それぞれ以下の表５、表６、表７に示す。なお、表５〜７中、Ａｃｙｌは、ｃｉｓ−２−ヘキセノイルを、Ｔｉｇは、チグロイルを、Ａｎｇはアンゲロイルを、ＧｌｃＡはβ−Ｄ−グルクロノピラノシルを、Ｇｌｃはβ−Ｄ−グルコピラノシル、Ｇａｌはβ−Ｄ−ガラクトピラノシル、Ｒｈａはα−Ｌ−ラムノピラノシルを表す。
【００９８】
【表５】
【００９９】
【表６】
【０１００】
【表７】
【０１０１】
実施例７ サポニン成分の脱顆粒抑制 （抗アレルギー） 作用
実施例６で得られた化合物１〜５について、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞を用いた抗原刺激時における脱顆粒抑制（抗アレルギー）作用の検討を実施例２と同様な方法で行った。その結果を表８に示すが、その結果より明らかなように、化合物１（Ｓａｓａｎｑｕａｓａｐｏｎｉｎ Ｉ）、化合物２（Ｓａｓａｎｑｕａｓａｐｏｎｉｎ II）、化合物３（Ｓａｓａｎｑｕａｓａｐｏｎｉｎ III）及び化合物５（Ｓａｓａｎｑｕａｓａｐｏｎｉｎ V）に有意な抑制活性が認められた。その活性は、医薬品であるｔｒａｎｉｌａｓｔやｋｅｔｏｔｉｆｅｎ ｆｕｍａｒａｔｅよりも強い。一方、化合物４（Ｓａｓａｎｑｕａｓａｐｏｎｉｎ IV）には活性は認められなかった。
【０１０２】
【表８】
【０１０３】
実施例８ サポニン成分のヒト線維芽細胞増殖促進作用
実施例１で得られたサザンカ花部のＭｅＯＨ抽出エキス、及び実施例６で得られた化合物１〜５について、次に示す方法によりヒト線維芽細胞増殖促進作用の検討を行った。その結果を表９に示すが、表９より明らかなように、ＭｅＯＨ抽出エキス及び化合物１〜５（Ｓａｓａｎｑｕａｓａｐｏｎｉｎ Ｉ〜V）にヒト線維芽細胞増殖促進作用が認められた。中でも、ＭｅＯＨ抽出エキス及び化合物１、２、３（Ｓａｓａｎｑｕａｓａｐｏｎｉｎ Ｉ、II、III）は、有意なヒト線維芽細胞増殖促進作用を示しており、特に、ＭｅＯＨ抽出エキス及び化合物１、２（Ｓａｓａｎｑｕａｓａｐｏｎｉｎ Ｉ、III）は優れたヒト線維芽細胞増殖促進作用を示している。
【０１０４】
［ヒト線維芽細胞増殖促進作用の測定］
ヒト新生児線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ，ＴＯＹＯＢＯ）５ｘ１０５個／ｍＬ ｉｎ Ｄ−ＭＥＭ［１０％ＦＢＳ，ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ），ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（１００μｇ／ｍＬ），ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎＢ（０．２５ｍｇ／ｍＬ）］を９６穴プレートに１００μＬずつ播種した（５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）。
【０１０５】
サザンカ花部の抽出エキス及び被験物質は、ＤＭＳＯに溶解後、Ｄ−ＭＥＭで１０００倍に希釈し、１００μＬの被験体を添加後、ＣＯ２インキュベーターで培養を開始した。４４時間後，ＰＢＳで２回洗浄後，Ｄ−ＭＥＭ１００μＬ及びＭＴＴ試薬（３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ ５ ｍｇ／ｍＬ ＰＢＳ）を１０μＬ加え，４時間培養した後、０．０４ＮＨＣｌ含有２−ｐｒｏｐａｎｏｌ １００μＬで溶解し、マイクロプレートリーダーＳＨ−１０００（コロナ電気）によりＯ．Ｄ．を測定した（測定波長５７０ｎｍ、参照波長６５５ｎｍ）。
【０１０６】
このようにして得たＯ．Ｄ．測定値の「平均値±標準誤差」を表９に示した。又、Ｃｏｎｔｒｏｌ群のＯ．Ｄ．を１００にしたときの、各Ｏ．Ｄ．の比（％：相対値）を表９の相対値（％）の欄に示した。
【０１０７】
【表９】
【０１０８】
表９の結果より明らかなように、ＭｅＯＨ抽出エキス、化合物１〜５にヒト線維芽細胞増殖促進作用が認められ、中でもＭｅＯＨ抽出エキス、化合物１〜３に有意な効果が認められる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サザンカ花部、及び／又は、サザンカ花部の抽出液を活性成分として含むことを特徴とする抗アレルギー剤。
【請求項２】
サザンカ花部、及び／又は、サザンカ花部の抽出液を活性成分として含むことを特徴とする脂肪分解阻害剤。
【請求項３】
サザンカ花部、及び／又は、サザンカ花部の抽出液を活性成分として含むことを特徴とする抗酸化剤。
【請求項４】
サザンカ花部、及び／又は、サザンカ花部の抽出液を活性成分として含むことを特徴とするヒト線維芽細胞増殖促進剤。
【請求項５】
下記式（１）で表されるサポニン化合物：
【化１】
下記式（２）で表されるサポニン化合物：
【化２】
下記式（３）で表されるサポニン化合物：
【化３】
及び、下記式（５）で表されるサポニン化合物：
【化４】
からなる群より選ばれる１種以上のサポニン化合物を、活性成分として含むことを特徴とする抗アレルギー剤。
【請求項６】
下記式（１）で表されるサポニン化合物：
【化５】
下記式（２）で表されるサポニン化合物：
【化６】
下記式（３）で表されるサポニン化合物：
【化７】
下記式（４）で表されるサポニン化合物：
【化８】
及び、下記式（５）で表されるサポニン化合物：
【化９】
からなる群より選ばれる１種以上のサポニン化合物を、活性成分として含むことを特徴とするヒト線維芽細胞増殖促進剤。
【請求項７】
下記の式（２）で表されるサポニン化合物。
【化１０】
【請求項８】
下記の式（４）で表されるサポニン化合物。
【化１１】
【請求項９】
下記の式（５）で表されるサポニン化合物。
【化１２】
【請求項１】
サザンカ花部、及び／又は、サザンカ花部の抽出液を活性成分として含むことを特徴とする抗アレルギー剤。
【請求項２】
サザンカ花部、及び／又は、サザンカ花部の抽出液を活性成分として含むことを特徴とする脂肪分解阻害剤。
【請求項３】
サザンカ花部、及び／又は、サザンカ花部の抽出液を活性成分として含むことを特徴とする抗酸化剤。
【請求項４】
サザンカ花部、及び／又は、サザンカ花部の抽出液を活性成分として含むことを特徴とするヒト線維芽細胞増殖促進剤。
【請求項５】
下記式（１）で表されるサポニン化合物：
【化１】
下記式（２）で表されるサポニン化合物：
【化２】
下記式（３）で表されるサポニン化合物：
【化３】
及び、下記式（５）で表されるサポニン化合物：
【化４】
からなる群より選ばれる１種以上のサポニン化合物を、活性成分として含むことを特徴とする抗アレルギー剤。
【請求項６】
下記式（１）で表されるサポニン化合物：
【化５】
下記式（２）で表されるサポニン化合物：
【化６】
下記式（３）で表されるサポニン化合物：
【化７】
下記式（４）で表されるサポニン化合物：
【化８】
及び、下記式（５）で表されるサポニン化合物：
【化９】
からなる群より選ばれる１種以上のサポニン化合物を、活性成分として含むことを特徴とするヒト線維芽細胞増殖促進剤。
【請求項７】
下記の式（２）で表されるサポニン化合物。
【化１０】
【請求項８】
下記の式（４）で表されるサポニン化合物。
【化１１】
【請求項９】
下記の式（５）で表されるサポニン化合物。
【化１２】
【公開番号】特開２０１２−５１８５２（Ｐ２０１２−５１８５２Ａ）
【公開日】平成２４年３月１５日（２０１２．３．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１９７０４２（Ｐ２０１０−１９７０４２）
【出願日】平成２２年９月２日（２０１０．９．２）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 研究集会名 ：京都薬科大学「修士論文発表会」 主催者名 ：京都薬科大学 開催日 ：２０１０年３月３日 研究集会名 ：日本薬学会第１３０年会 主催者名 ：社団法人 日本薬学会 開催日 ：平成２２年３月２９日
【出願人】（３０４０２６１８０）株式会社ダイアベティム (12)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月１５日（２０１２．３．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月２日（２０１０．９．２）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 研究集会名 ：京都薬科大学「修士論文発表会」 主催者名 ：京都薬科大学 開催日 ：２０１０年３月３日 研究集会名 ：日本薬学会第１３０年会 主催者名 ：社団法人 日本薬学会 開催日 ：平成２２年３月２９日
【出願人】（３０４０２６１８０）株式会社ダイアベティム (12)
【Ｆターム（参考）】
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