ストレスタンパク質を含む組成物を使用する免疫応答
【課題】ウイルスに関連する抗原に対する、より効果的なワクチンを提供すること；および腫瘍に関連する抗原に対する、より効果的なワクチンを提供すること。
【解決手段】哺乳動物において抗原に対する細胞媒介細胞溶解性免疫応答を誘導するためのワクチンであって、上記抗原、およびストレスタンパク質の全てもしくは一部、または上記抗原に対する免疫応答を誘導するのに上記ストレスタンパク質のアミノ酸配列に対して十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質の全てもしくは一部を含む、ワクチン。
【解決手段】哺乳動物において抗原に対する細胞媒介細胞溶解性免疫応答を誘導するためのワクチンであって、上記抗原、およびストレスタンパク質の全てもしくは一部、または上記抗原に対する免疫応答を誘導するのに上記ストレスタンパク質のアミノ酸配列に対して十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質の全てもしくは一部を含む、ワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、１９９６年１１月２６日に出願された米国特許出願第０８／７５６，６２１号の一部継続出願であり、その全体の教示は参考として本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
インフルエンザを引き起こすウイルスは、インフルエンザＡ、Ｂ、およびＣ型として任意に命名されている。これらの型は、抗原的に異なるウイルスを定義する。各型は、いくつかの異なるサブタイプを有する。１つの型内のウイルスは、２つの異なるサブタイプで感染した細胞が、両方のサブタイプからの成分を含む混合されたウイルスを組み立て得る意味で、遺伝的に適合可能である。インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルスとして分類される。ウイルスは、８０と１２０ｎｍの間の直径の粒子を形成する。インフルエンザウイルスは、エンベロープを有するウイルスであり、すなわち、その外表面は宿主細胞膜に由来する。２つの主要なウイルスがコードするタンパク質、ヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）は、エンベロープに挿入されそして突出する。インフルエンザウイルスは、非メッセンジャーＲＮＡ極性の８ＲＮＡセグメントから構成されるゲノムを含む、マイナス鎖ＲＮＡウイルスである。ゲノムＲＮＡセグメントは、ウイルスがコードする核タンパク質（ＮＰ）とともにＲＮＰ複合体に組み立てられる。宿主細胞の感染後、ゲノムＲＮＡセグメントは、第１に、ゲノムＲＮＡを産生するために後に逆転写されるメッセンジャーＲＮＡ極性を有するＲＮＡに転写される。これらの工程に寄与し得る転写酵素活性は、校正能力を欠く。したがって、転写および逆転写中に作成される誤りは修復されず、ウイルスゲノムの高頻度の変異を生じる。すべてのウイルス遺伝子は同じ変異プロセスを受けるが、外部タンパク質ＨＡおよびＮＡについての遺伝子は、その宿主において免疫検出を逃れる変異形態へ進化させる強い選択プロセスを特に受ける。宿主には、ヒトだけでなく、ニワトリ、七面鳥、ブタ、およびウマのような動物も含まれる。
【０００３】
インフルエンザは、伝統的に、ヒトの死亡の主要な原因の１つである。インフルエンザの臨床的徴候は、無症候から致死的感染までの範囲で可変である。代表的には、病気の開始は、急速および衰弱性であり、そしてほとんど変わらずに咳、不快、頭痛、および筋痛を伴う。鼻感冒、咽喉炎、および普通ほとんどない胸骨下痛もまた、感染の一次部位が呼吸器系であることを示す。しかし、代表的には、発熱および全身症状が優勢である。代表的には、回復は急速である。病気の重篤度は、非常に宿主依存的であり、そして年齢、生理学的状態、および感染または免疫接種による前免疫接種に関連する。重篤な合併症は肺炎である。易感染性の個体は、肺炎を引き起こす細菌病原体での二次感染を受けることが証明されている。インフルエンザ後に死亡するほとんどの患者は、細菌性肺炎で死亡する。インフルエンザウイルスＡおよびＢ型でのマイナーな抗原変更は毎年起こり、地域的流行を引き起こす。このような毎年の流行からの毎年の死亡率は、米国単独において２０，０００に近づき得る。１０年と３０年との間の可変間隔で、全世界的流行病は、毎年の流行をはるかに越える死亡者数を生じる。これらの流行病は、おそらく、ヒトおよび動物インフルエンザＡウイルスからの成分の遺伝子再取り合わせによって引き起こされ、ヒト実験とは全体的に全く別の表面構造を有する新しいウイルスを生じる。１９１８〜１９年の流行病の死亡者数は、約５００，０００のアメリカ人を殺した。（一般的参考文献として：Ｊｏｓｈｕａ Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２（Ｄ−Ｌ）：５０５−５２０，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ ９２１０１ （１９９２））。
【０００４】
現在認可されたワクチンは、不活性化した精製されたウイルスを含む。ワクチンは、三価であり、そして２つの普及したＡサブタイプ、Ｈ３Ｎ２およびＨ１Ｎｉの代表的株、ならびに単一のＢ型株を含む。弱毒化生ウイルスワクチンはまた、特に旧ソビエト連邦において、いくらかの成功をともなって使用されてきた。ＨＡおよびＮＡを含むサブユニットワクチンが開発されている（ｓｐｌｉｔ ｆｌｕワクチン；Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ Ｌａｂ．）。これらのワクチンは、防御免疫を提供することに完全には効果的ではない。一般的に、インフルエンザワクチンが、主としてウイルス表面タンパク質ＨＡおよびＮＡに対する抗体応答を誘導することによって、防御免疫を生じると認められている。これは、ワクチンが単に完全に効果的ではない理由を説明し得；これは、これらの表面タンパク質における連続的抗原変更を受けやすい。
【０００５】
腫瘍細胞と正常細胞との間の差についての検索は、多くのいわゆる腫瘍関連抗原の単離および特徴づけを導いている（非特許文献１）。これらの抗原は、十分に分化した細胞において、必ずしもすべてではなくまたは少なくとも大量でもなく、腫瘍細胞によって発現される。これらの腫瘍抗原をコードする配列は、ウイルス由来であるか、または宿主のゲノムに正常に存在するかのいずれかである。ウイルス由来腫瘍関連抗原の例は、ほとんどのヒト頸部腫瘍に存在するヒトパピローマウイルストランスフォーミングタンパク質Ｅ７である。代表的な宿主ゲノム由来の腫瘍関連抗原は、ｇｐ１００であり、これはｐＭｅｌ−１７ともいい、多くのヒト黒色腫で発現される。腫瘍関連抗原は、宿主免疫応答を誘導することが公知であるが、応答は、代表的には、治療に効果的であるには不十分である。この応答を刺激するためにアプローチの必要がある。
【０００６】
単特異的細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）クローンを使用して、少なくとも５つの腫瘍関連抗原（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥと命名される）の発現は、マウスＰ８１５肥満細胞腫腫瘍細胞において同定されている。Ｐ１Ａと命名されたこれらの抗原の１つは、ＣＴＬクローンによって認識される単一エピトープを発現する。分子アプローチを使用して、Ｐ１Ａの遺伝子をクローニングし、そして正常細胞に存在する非変異遺伝子であるが形質転換された細胞でのみ転写されそして翻訳されることを見いだした（非特許文献２）。さらに、Ｐ１Ａ抗原発現をなくしたＰ８１５細胞の改変体の実験によって、Ｐ１ＡのＭＨＣクラスＩ（Ｌｄ）−制限した最小ＣＴＬエピトープの配列を同定することが可能であった（非特許文献３）。
【非特許文献１】Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ａ．およびＦｉｎｎ，Ｏ．Ｊ．，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９６）６２：２１７−２５６
【非特許文献２】Ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｙｎｄｅら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９１），１７３：１３７３
【非特許文献３】Ｌｅｔｈｅら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２），２２：２２８３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、ウイルスおよび腫瘍に関連する抗原に対する、より効果的なワクチンについての必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の要旨
本発明は、哺乳動物において抗原に対する細胞媒介する細胞溶解性免疫応答（細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答）を誘導するためのワクチンに関し、これは、抗原、および、ストレスタンパク質（または熱ショックタンパク質（ｈｓｐ））のすべてもしくは一部、または抗原に対する免疫応答を誘導するためにストレスタンパク質のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質のすべてもしくは一部を含む。１つの実施態様では、抗原は、インフルエンザウイルスの抗原である。他の実施態様では、抗原は、腫瘍関連抗原である。本発明における使用のためのストレスタンパク質は、例えば、マイコバクテリアストレスタンパク質（例えば、ｈｓｐ６５、ｈｓｐ７１）または投与される哺乳動物において抗原に対する免疫応答を誘導するためにマイコバクテリアストレスタンパク質のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質であり得る。本発明のワクチンの抗原およびストレスタンパク質は、化学結合によってまたは融合タンパク質として連結され得る。哺乳動物において抗原に対する細胞媒介性の細胞溶解性免疫応答を誘導するためのワクチンはまた、哺乳動物において抗原およびストレスタンパク質配列をコードしその発現を指示するポリヌクレオチドを含み得る。ポリヌクレオチドは、融合タンパク質として抗原およびストレスタンパク質を発現し得る。
【０００９】
本発明はまた、哺乳動物においてインフルエンザウイルスに対する細胞媒介する細胞溶解性免疫応答を誘導するためのワクチンに関し、これは、インフルエンザウイルスの抗原、およびストレスタンパク質のすべてもしくは一部、または抗原に対する免疫応答を誘導するためにストレスタンパク質のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質のすべてもしくは一部を含む。１つの実施態様では、本発明は、哺乳動物においてインフルエンザウイルスの抗原に対する細胞媒介する細胞溶解性免疫応答を誘導するためのワクチンに関し、これは、哺乳動物においてインフルエンザウイルスの抗原およびストレスタンパク質の発現を指示するポリヌクレオチドを含む。本発明で使用され得るインフルエンザウイルスの抗原には、例えば、ヘマグルチニン、核タンパク質、ノイラミニダーゼ、Ｍ１、Ｍ２、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、およびその組み合わせが含まれる。
【００１０】
１つの実施態様では、哺乳動物においてインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導するためのワクチンは、ストレスタンパク質のすべてもしくは一部、または抗原に対する免疫応答を誘導するためにストレスタンパク質のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質のすべてもしくは一部に結合した、インフルエンザウイルスの抗原である。
【００１１】
他の実施態様では、哺乳動物においてインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導するためのワクチンは、ストレスタンパク質のすべてもしくは一部、または抗原に対する免疫応答を誘導するためにストレスタンパク質のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質のすべてもしくは一部に融合した、インフルエンザウイルスの抗原を含む組換え融合タンパク質である。
【００１２】
本発明はまた、ストレスタンパク質およびインフルエンザウイルスの抗原を含む組成物に関する。１つの実施態様では、組成物は、インフルエンザウイルスの抗原に連結されたストレスタンパク質を含む結合体である。他の実施態様では、組成物は、インフルエンザウイルスの抗原に融合されたストレスタンパク質を含む融合タンパク質（ｐＥＴ６５ＭＰ／ＮＰ−ＢおよびｐＥＴ６５Ｍ／ＮＰ−Ｄ）である。
【００１３】
本発明はまた、哺乳動物においてインフルエンザウイルスを予防または処置するための組成物の使用に関する。
【００１４】
本発明はまた、哺乳動物において腫瘍関連抗原に対する細胞媒介する細胞溶解性免疫応答を誘導するためのワクチンに関し、このワクチンは、ストレスタンパク質のすべてもしくは一部、または抗原に対する免疫応答を誘導するためにストレスタンパク質のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質のすべてもしくは一部に連結した腫瘍関連抗原を含む。本発明で使用され得る抗原は、当該技術分野で現在公知のものを含む任意の哺乳動物の腫瘍関連抗原を含む。ＣＴＬエピトープを含むこれらの抗原のフラグメントをも含む。
【００１５】
１つの実施態様では、哺乳動物において腫瘍関連抗原に対する細胞媒介する細胞溶解性免疫応答を誘導するためのワクチンは、ストレスタンパク質のすべてもしくは一部、または抗原に対する免疫応答を誘導するためにストレスタンパク質のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質のすべてもしくは一部に化学的に結合した腫瘍関連抗原である。
【００１６】
他の実施態様では、哺乳動物において腫瘍関連抗原に対する細胞媒介する細胞溶解性免疫応答を誘導するためのワクチンは、腫瘍関連抗原、および、ストレスタンパク質のすべてもしくは一部、または抗原に対する免疫応答を誘導するためにストレスタンパク質のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質のすべてもしくは一部を含む組換え融合タンパク質である。
【００１７】
さらなる実施態様では、哺乳動物において腫瘍関連抗原に対する細胞媒介する細胞溶解性免疫応答を誘導するためのワクチンは、腫瘍関連抗原、およびストレスタンパク質のすべてもしくは一部、または抗原に対する免疫応答を誘導するためにストレスタンパク質のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質のすべてもしくは一部をコードする配列を発現可能形態で含むポリヌクレオチドである。
【００１８】
さらに他の実施態様では、哺乳動物において腫瘍関連抗原に対する細胞媒介する細胞溶解性免疫応答を誘導するためのワクチンはまた、腫瘍関連抗原、およびストレスタンパク質のすべてもしくは一部、または抗原に対する免疫応答を誘導するためにストレスタンパク質のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質のすべてもしくは一部を含む組換え融合タンパク質をポリヌクレオチドであり得る。
【００１９】
本発明はまた、哺乳動物において天然または人工的抗原（アレルゲン）に対するアレルギー性免疫応答を抑制するためのワクチンに関し、このワクチンは、アレルゲン、およびストレスタンパク質のすべてもしくは一部、またはアレルギー応答を抑制するためにストレスタンパク質のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質のすべてもしくは一部を含む。ペプチド性であるかどうかにかかわりなく、任意のアレルゲンが使用され得る。
【００２０】
１つの実施態様では、哺乳動物において天然または人工的抗原（アレルゲン）に対するアレルギー性免疫応答を抑制するためのワクチンは、ストレスタンパク質のすべてもしくは一部、またはアレルギー応答を抑制するためにストレスタンパク質のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質のすべてもしくは一部に化学的に結合したアレルゲンである。
【００２１】
他の実施態様では、哺乳動物において天然または人工的抗原（アレルゲン）に対するアレルギー性免疫応答を抑制するためのワクチンは、アレルゲン、およびストレスタンパク質のすべてもしくは一部、またはアレルギー応答を抑制するためにストレスタンパク質のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質のすべてもしくは一部を含む組換え融合タンパク質である。
【００２２】
さらなる実施態様では、哺乳動物において天然または人工的抗原（アレルゲン）に対するアレルギー性免疫応答を抑制するためのワクチンは、ペプチド性アレルゲン、およびストレスタンパク質のすべてもしくは一部、またはアレルギー応答を抑制するためにストレスタンパク質のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質のすべてもしくは一部をコードする配列を発現可能形態で含むポリヌクレオチドである。
【００２３】
さらに他の実施態様では、哺乳動物において天然または人工的抗原（アレルゲン）に対するアレルギー性免疫応答を抑制するためのワクチンはまた、ペプチド性アレルゲン、およびストレスタンパク質のすべてもしくは一部、またはアレルギー応答を抑制するためにストレスタンパク質のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質のすべてもしくは一部を含む組換え融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドである。
【００２４】
本発明はまた、哺乳動物において抗原に対するＴｈ２応答を抑制するための組成物に関し、これは、抗原、およびストレスタンパク質のすべてもしくは一部、または抗原に対するＴｈ２応答を抑制するためにストレスタンパク質のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質のすべてもしくは一部を含む。この組成物は、ワクチン、結合体、または融合タンパク質であり得る。
・本発明はさらに、以下を提供し得る：
・（項目１） 哺乳動物において抗原に対する細胞媒介細胞溶解性免疫応答を誘導するためのワクチンであって、上記抗原、およびストレスタンパク質の全てもしくは一部、または上記抗原に対する免疫応答を誘導するのに上記ストレスタンパク質のアミノ酸配列に対して十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質の全てもしくは一部を含む、ワクチン。
・（項目２） 項目１に記載のワクチンであって、ストレスタンパク質が、マイコバクテリアストレスタンパク質、または上記ワクチンが投与される上記哺乳動物において上記抗原に対する免疫応答を誘導するのに上記マイコバクテリアストレスタンパク質のアミノ酸配列に対して十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質である、ワクチン。
・（項目３） 上記ストレスタンパク質が、ｈｓｐ６５およびｈｓｐ７１からなる群より選択される、項目１に記載のワクチン。
・（項目４） 上記抗原および上記ストレスタンパク質が化学結合により連結される、項目１に記載のワクチン。
・（項目５） 上記抗原および上記ストレスタンパク質が融合タンパク質として連結される、項目１に記載のワクチン。
・（項目６） 哺乳動物において抗原に対する細胞媒介細胞溶解性免疫応答を誘導するためのワクチンであって、上記哺乳動物において抗原およびストレスタンパク質配列をコードし、そして上記抗原および上記ストレスタンパク質配列の発現を指向するポリヌクレオチドを含む、ワクチン。
・（項目７） 上記抗原および上記ストレスタンパク質が融合タンパク質として発現される、項目６に記載のワクチン。
・（項目８） 項目６に記載のワクチンであって、上記ストレスタンパク質配列が、マイコバクテリアストレスタンパク質、または上記ワクチンが投与される上記哺乳動物において上記抗原に対する免疫応答を誘導するのに上記マイコバクテリアストレスタンパク質のアミノ酸配列に対して十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質に由来する、ワクチン。
・（項目９） 上記ストレスタンパク質が、ｈｓｐ６５およびｈｓｐ７１からなる群より選択される、項目６に記載のワクチン。
・（項目１０） 哺乳動物においてインフルエンザウイルスの抗原に対する細胞媒介細胞溶解性免疫応答を誘導するためのワクチンであって、上記インフルエンザウイルスの抗原およびストレスタンパク質の上記哺乳動物における発現を指向するポリヌクレオチドを含む、ワクチン。
・（項目１１） 項目１０に記載のワクチンであって、上記ストレスタンパク質が、マイコバクテリアストレスタンパク質、または上記ワクチンが投与される上記哺乳動物において上記抗原に対する免疫応答を誘導するのに上記マイコバクテリアストレスタンパク質のアミノ酸配列に対して十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質である、ワクチン。
・（項目１２） 上記ストレスタンパク質配列が、ｈｓｐ６５およびｈｓｐ７１からなる群より選択される、項目１０に記載のワクチン。
・（項目１３） 哺乳動物においてインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導するためのワクチンであって、上記インフルエンザウイルスの抗原、およびストレスタンパク質の全てもしくは一部、または上記抗原に対する免疫応答を誘導するのに上記ストレスタンパク質のアミノ酸配列に対して十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質の全てもしくは一部を含む、ワクチン。
・（項目１４） 項目１３に記載のワクチンであって、上記ストレスタンパク質配列が、マイコバクテリアストレスタンパク質、または上記ワクチンが投与される上記哺乳動物において上記抗原に対する免疫応答を誘導するのに上記マイコバクテリアストレスタンパク質のアミノ酸配列に対して十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質である、ワクチン。
・（項目１５） 上記インフルエンザの抗原が、赤血球凝集素、核タンパク質、ノイラミニダーゼ、Ｍ１、Ｍ２、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、およびその組み合わせからなる群より選択される、項目１３に記載のワクチン。
・（項目１６） 上記免疫応答が細胞溶解性Ｔ細胞応答である、項目１３に記載のワクチン。
・（項目１７） 上記ストレスタンパク質が、ｈｓｐ６５およびｈｓｐ７１からなる群より選択される、項目１３に記載のワクチン。
・（項目１８） 哺乳動物においてインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導するワクチンであって、ストレスタンパク質の全てもしくは一部、または上記抗原に対する免疫応答を誘導するのに上記ストレスタンパク質のアミノ酸配列に対して十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質の全てもしくは一部に結合された上記インフルエンザウイルスの抗原を含む、ワクチン。
・（項目１９） 項目１８に記載のワクチンであって、上記ストレスタンパク質が、マイコバクテリアストレスタンパク質、または上記ワクチンが投与される個体において免疫応答を誘導するのに上記マイコバクテリアストレスタンパク質のアミノ酸配列に対して十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質である、ワクチン。
・（項目２０） 上記インフルエンザウイルスの抗原が、赤血球凝集素、核タンパク質、ノイラミニダーゼ、Ｍ１、Ｍ２、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、およびその組み合わせからなる群より選択される、項目１８に記載のワクチン。
・（項目２１） 上記免疫応答が細胞溶解性Ｔ細胞応答である、項目１８に記載のワクチン。
・（項目２２） 上記ストレスタンパク質が、ｈｓｐ６５およびｈｓｐ７１からなる群より選択される、項目１８に記載のワクチン。
・（項目２３） 哺乳動物においてインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導することにおける使用のためのワクチンであって、ストレスタンパク質の全てもしくは一部、または上記抗原に対する免疫応答を誘導するのに上記ストレスタンパク質のアミノ酸配列に対して十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質の全てもしくは一部に融合された上記インフルエンザウイルスの抗原を含む、組換え融合タンパク質を含む、ワクチン。
・（項目２４） 項目２３に記載のワクチンであって、上記ストレスタンパク質が、マイコバクテリアストレスタンパク質、または上記ワクチンが投与される個体において免疫応答を誘導するのに上記マイコバクテリアストレスタンパク質のアミノ酸配列に対して十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質である、ワクチン。
・（項目２５） 上記インフルエンザウイルスの抗原が、赤血球凝集素、核タンパク質、ノイラミニダーゼ、Ｍ１、Ｍ２、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、およびその組み合わせからなる群より選択される、項目２３に記載のワクチン。
・（項目２６） 上記免疫応答が細胞溶解性Ｔ細胞応答である、項目２３に記載のワクチン。
・（項目２７） 上記ストレスタンパク質が、ｈｓｐ６５およびｈｓｐ７１からなる群より選択される、項目２３に記載のワクチン。
・（項目２８） ストレスタンパク質およびインフルエンザウイルスの抗原を含む組成物。
・（項目２９） 項目２８に記載の組成物であって、上記ストレスタンパク質が、マイコバクテリアストレスタンパク質、または上記組成物が投与される個体において免疫応答を誘導するのに上記マイコバクテリアストレスタンパク質のアミノ酸配列に対して十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質である、組成物。
・（項目３０） 上記インフルエンザウイルスの抗原が、赤血球凝集素、核タンパク質、ノイラミニダーゼ、Ｍ１、Ｍ２、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、およびその組み合わせからなる群より選択される、項目２８に記載の組成物。
・（項目３１） 上記ストレスタンパク質が、ｈｓｐ６５およびｈｓｐ７１からなる群より選択される、項目２８に記載の組成物。
・（項目３２） インフルエンザウイルスの抗原と結合されたストレスタンパク質を含む結合体。
・（項目３３） 項目３２に記載の結合体であって、上記ストレスタンパク質が、マイコバクテリアストレスタンパク質、または上記結合体が投与される個体において免疫応答を誘導するのに上記マイコバクテリアストレスタンパク質のアミノ酸配列に対して十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質である、結合体。
・（項目３４） 上記インフルエンザウイルスの抗原が、赤血球凝集素、核タンパク質、ノイラミニダーゼ、Ｍ１、Ｍ２、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、およびその組み合わせからなる群より選択される、項目３２に記載の結合体。
・（項目３５） 上記ストレスタンパク質が、ｈｓｐ６５およびｈｓｐ７１からなる群より選択される、項目３２に記載の結合体。
・（項目３６） インフルエンザウイルスの抗原に融合されたストレスタンパク質を含む融合タンパク質。
・（項目３７） 項目３６に記載の融合タンパク質であって、上記ストレスタンパク質が、マイコバクテリアストレスタンパク質、または上記融合タンパク質が投与される個体において免疫応答を誘導するのに上記マイコバクテリアストレスタンパク質のアミノ酸配列に対して十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質である、融合タンパク質。
・（項目３８） 上記インフルエンザウイルスの抗原が、赤血球凝集素、核タンパク質、ノイラミニダーゼ、Ｍ１、Ｍ２、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、およびその組み合わせからなる群より選択される、項目３６に記載の融合タンパク質。
・（項目３９） 上記ストレスタンパク質が、ｈｓｐ６５およびｈｓｐ７１からなる群より選択される、項目３６に記載の融合タンパク質。
・（項目４０） ｐＥＴ６５ＭＰ／ＮＰ−ＢおよびｐＥＴ６５Ｍ／ＮＰ−Ｄからなる群より選択される融合タンパク質。
・（項目４１） 上記抗原が細胞溶解性Ｔ細胞エピトープを含む、項目１に記載のワクチン。
・（項目４２） 上記インフルエンザウイルスの抗原が細胞溶解性Ｔ細胞エピトープを含む、項目１０に記載のワクチン。
・（項目４３） 上記インフルエンザウイルスの抗原が細胞溶解性Ｔ細胞エピトープを含む、項目１５に記載のワクチン。
・（項目４４） 上記インフルエンザウイルスの抗原が細胞溶解性Ｔ細胞エピトープを含む、項目２８に記載の組成物。
・（項目４５） 上記インフルエンザウイルスの抗原が細胞溶解性Ｔ細胞エピトープを含む、項目３２に記載の結合体。
・（項目４６） 上記インフルエンザウイルスの抗原が細胞溶解性Ｔ細胞エピトープを含む、項目３６に記載の融合タンパク質。
・（項目４７） 上記抗原が、ウイルス抗原、腫瘍関連抗原、およびアレルゲンからなる群より選択される、項目１に記載のワクチン。
・（項目４８） 上記抗原が、ウイルス抗原、腫瘍関連抗原、およびアレルゲンからなる群より選択される、項目３２に記載の結合体。
・（項目４９） 上記抗原が、ウイルス抗原、腫瘍関連抗原、およびアレルゲンからなる群より選択される、項目３６に記載の融合タンパク質。
・（項目５０） 哺乳動物においてアレルゲン性抗原に対するＴｈ２応答を抑制するためのワクチンであって、上記抗原、およびストレスタンパク質の全てもしくは一部、または上記抗原に対するＴｈ２応答を抑制するのに上記ストレスタンパク質のアミノ酸配列に対して十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質の全てもしくは一部を含む、ワクチン。
・（項目５１） 哺乳動物においてアレルゲン性抗原に対するＴｈ２応答を抑制するための組成物であって、上記抗原、およびストレスタンパク質の全てもしくは一部、または上記抗原に対するＴｈ２応答を抑制するのに上記ストレスタンパク質のアミノ酸配列に対して十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質の全てもしくは一部を含む、組成物。
・（項目５２） 哺乳動物においてアレルゲン性抗原に対するＴｈ２応答を抑制するための結合体であって、上記抗原、およびストレスタンパク質の全てもしくは一部、または上記抗原に対するＴｈ２応答を抑制するのに上記ストレスタンパク質のアミノ酸配列に対して十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質の全てもしくは一部を含む、結合体。
・（項目５３） 哺乳動物においてアレルゲン性抗原に対するＴｈ２応答を抑制するための融合タンパク質であって、上記抗原、およびストレスタンパク質の全てもしくは一部、または上記抗原に対するＴｈ２応答を抑制するのに上記ストレスタンパク質のアミノ酸配列に対して十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質の全てもしくは一部を含む、融合タンパク質。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
発明の詳細な説明
本発明は、抗原（１つ以上）、およびストレスタンパク質または熱ショックタンパク質（１つ以上）のすべてもしくは一部、または抗原に対する免疫応答を誘導するためにストレスタンパク質に十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質のすべてもしくは一部を含む、哺乳動物（例えば、ヒト）において抗原に対する免疫応答を誘導する、ワクチンおよび組成物に関する。特定の実施態様では、本発明は、抗原（１つ以上）、およびストレスタンパク質（１つ以上）のすべてもしくは一部、または抗原に対する免疫応答を誘導するためにストレスタンパク質に十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質のすべてもしくは一部を含む、哺乳動物において細胞媒介性免疫応答を誘導する、ワクチンおよび組成物に関する。
【００２６】
特定の実施態様では、本発明は、インフルエンザウイルスの抗原、およびストレスタンパク質のすべてもしくは一部、または抗原に対する免疫応答を誘導するためにストレスタンパク質のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質のすべてもしくは一部を含む、哺乳動物においてインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導する、ワクチンおよび組成物に関する。本明細書中で記載される場合、インフルエンザ抗原（例えば、ＣＴＬエピトープを含むＮＰ配列）、および少なくとも１つのストレスタンパク質を、インフルエンザ抗原とストレスタンパク質との混合物の形態で、インフルエンザ抗原とストレスタンパク質との結合体として、もしくはインフルエンザ抗原およびストレスタンパク質配列を含む融合タンパク質としてのいずれかで含む組成物は、哺乳動物において使用されるインフルエンザ抗原に対する特異的免疫応答（例えば、細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答、Ｔ細胞ヘルパー応答、Ｂ細胞応答）を刺激することに効果的である。例えば、実施例で証明されるように、本明細書に記載のワクチンでの宿主（脊椎動物（例えば、哺乳動物））の免疫は、インフルエンザ抗原（例えば、ＮＰ）を提示する細胞に対する特異的ＣＴＬ活性の刺激を生じ得る。あるいは、個々のインフルエンザ抗原およびストレスタンパク質は、連続的に投与され得る。
【００２７】
さらなる実施態様では、本発明は、腫瘍関連抗原に対する細胞媒介性免疫応答を誘導するワクチンに関し、特定のタイプの予め存在する腫瘍に対する免疫のためまたはこのような腫瘍の発生を予防するために適切な腫瘍関連抗原、およびストレスタンパク質のすべてもしくは一部、または抗原に対する免疫応答を誘導するためにストレスタンパク質のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質のすべてもしくは部分を含む。これまでの実施態様と類似して、少なくとも１つの腫瘍関連抗原および１つのストレスタンパク質を、腫瘍関連抗原とストレスタンパク質との混合物、腫瘍関連抗原とストレスタンパク質との結合体、または腫瘍関連抗原およびストレスタンパク質配列を含む融合タンパク質の形態のいずれかで含むワクチンは、哺乳動物において腫瘍関連抗原に対する細胞媒介性細胞溶解性免疫応答を刺激し得る。あるいは、抗原およびストレスタンパク質は、継続的に投与され得る。実施例で示されるように、この型のワクチン、最小Ｐ１Ａ肥満細胞腫抗原およびストレスタンパク質を含む融合タンパク質は、Ｐ１Ａ抗原を提示する細胞に対して細胞媒介性細胞溶解性応答を誘導する。さらに、ワクチンで免疫した哺乳動物は、Ｐ１Ａ抗原を発現する腫瘍細胞でのその後のチャレンジに対して免疫性である。
【００２８】
本発明では、組成物は２つの部分から構成される：ストレスタンパク質、および免疫応答が所望されるものに対する抗原。２つの部分は、混合、結合、または連結され、そして単一の単位を形成し得る。結合は、当業者に公知の化学的手段によって（例えば、ストレスタンパク質と第２の部分との間の共有結合を介して；還元的アミノ化）、または組換え技法によって、達成され得る。組換え技法が２つの部分を連結または結合するために使用されるならば、その結果は、単一分子におけるストレスタンパク質および抗原を含む組換え融合タンパク質である。これは、ワクチン産生プロセスにおいて単一組換え分子を産生および精製することを可能にする。ストレスタンパク質は、細胞媒介細胞溶解性免疫応答が所望されるものに対する任意の抗原に、あるいは投与される個体における免疫応答を誘導するために十分な抗原の一部に、結合され得る。
【００２９】
本明細書中で定義されるように、用語「ワクチン」は、予防的または治療的ワクチンとして使用され得る組成物を含む。１つの実施態様では、ワクチン組成物は、抗原およびストレスタンパク質をコードする１つ以上の核酸である。本発明はまた、哺乳動物において、抗原（例えば、腫瘍抗原）、または抗原を含む病原体（例えば、細菌、ウイルス、寄生虫）の存在に関連するまたはこれによって引き起こされる病気もしくは症状を予防または処置するための、ストレスタンパク質および／または抗原をコードする核酸である組成物の使用に関する。例えば、本明細書中に記載される組成物は、ウイルスに感染されていない哺乳動物においてインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導するために使用され得る。さらに、本明細書中に記載のワクチンまたは組成物は、インフルエンザウイルスに感染した哺乳動物においてインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導するために使用され得、そして哺乳動物において感染しているインフルエンザウイルスによって引き起こされる病態の回復または除去を生じ得る。本明細書中で使用される場合、「免疫応答の誘導」とは、増加した免疫応答（検出不能より大または以前より大）；または比較可能な条件下で抗原単独での免疫によって達成可能な応答よりも優れた応答を意味する。
【００３０】
本明細書中に記載のように、抗原（ストレスタンパク質当たり１つ以上）は、好ましくは、ペプチドの種類（すなわち、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドである）である。抗原およびストレスタンパク質が混合または化学結合される適用では、抗原はまた、炭水化物、脂質、糖脂質、または有機分子もしくは無機分子であり得る。本明細書中で使用される場合、「抗原」は、少なくとも１つのＣＴＬエピトープを含むペプチドまたはポリペプチドを含む。ＣＴＬエピトープは、Ｉ型制限Ｔ細胞エピトープ、またはＩＩ型制限Ｔ細胞エピトープのいずれかとして定義される。本発明における使用のための抗原は、単離、精製（本質的に純粋）、化学合成、または組換え産生され得る。本発明の組成物に有用な他の適切な抗原は、当業者によって決定され得る。
【００３１】
ワクチンまたは組成物が、インフルエンザウイルスに対する細胞媒介細胞溶解性免疫応答を誘導する実施態様では、インフルエンザウイルスの抗原は、赤血球凝集素、ウイルス全体（例えば、不活性化または生の弱毒化ウイルス全体）、インフルエンザウイルスの抗原性部分、および組換え産生したウイルスもしくはその一部を含むが、これらに限定されない。インフルエンザウイルスの抗原は、少なくとも１つのＢ細胞および／またはＴ細胞（例えば、Ｔヘルパー細胞、細胞溶解性Ｔ細胞）エピトープを含むペプチドまたはポリペプチドを含む。例えば、インフルエンザウイルスの抗原は、赤血球凝集素（ＨＡ（例えば、ＨＡ１、ＨＡ７））、核タンパク質（例えば、ＮＰ（例えば、実施例に記載のＮＰ−ｂおよびＮＰ−Ｄ））、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、Ｍ１、Ｍ２、ＰＢ１、ＰＢ２、およびＰＡを含むが、これらに限定されない。本発明の組成物に使用され得るインフルエンザウイルスの他の抗原は、当業者によって決定され得る。
【００３２】
ワクチンまたは組成物が腫瘍関連抗原に対する細胞媒介細胞溶解性免疫応答を誘導する実施態様では、抗原は、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ３、ＢＡＧＥ、およびＧＡＧＥを含むが、これらに限定されない。これらのタンパク質は、正常には精巣で発現される。エピトープ発現は、黒色腫を含む種々の腫瘍を生じる。メラニン形成細胞分化抗原チロシナーゼ、ＭＡＲＴ−１／ＭＥＬＡＮ−１、およびｇｐ １００／ｐＭｅ１１７、ならびにチロシナーゼ関連タンパク質ｐｇ７５およびＭＵＭ−１はまた、このリストに含まれ、そのすべては黒色腫に関連する。他の有用な腫瘍関連抗原は、乳ガンおよび卵巣ガンで見られるＨＥＲ２／ｎｅｕ、上皮細胞腫瘍で見られるＭＵＣ−１、ならびに頸ガンと強く関連するヒトパピローマウイルスタンパク質Ｅ６およびＥ７である。さらに、抗原は、ＧｎＴ−Ｖ、β−カテニン、ＣＤＫ４、およびｐ１５を含む。これらのすべての腫瘍関連抗原は、Ｔ細胞によって認識される。（Ｗａｎｇ，Ｒ．−Ｆ．およびＲｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ，６０：２９６−３０９ （１９９６）；Ｈｏｕｇｈｔｏｎ，Ａ．Ｎ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８０：１−４ （１９９４）；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ａ．およびＦｉｎｎ，Ｏ．Ｊ．，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６２：２１７−２５６）。
【００３３】
アレルギー性（アトピー性）疾患および喘息疾患における重要な担い手は、好酸球の浸潤に支配されるＩｇＥおよび局所的炎症反応である。慢性炎症による非特異的刺激に対する肺の過剰反応は、喘息の最近の定義である。この炎症は、ＩｇＥによって媒介される天然抗原または人工的抗原に対する異常なアレルギー性応答によって引き起こされ、そして好酸球と呼ばれる顆粒細胞の慢性細胞性炎症を導き得る。常駐の肥満細胞ならびに補充された好塩基球および好酸球からのメディエーターの放出は、炎症およびその後の過剰反応性の原因であると考えられる。ヒトでは、他の種におけるように、何らかの炎症性反応が局所的過剰反応性を生じる。しかし、喘息では、炎症は慢性的であり、適切に処置されなければ、生命を脅かす過剰反応性を導く。現在の処置は、炎症を減少させるためのコルチコステロイドおよび迅速な症候の緩和のためのアルブテロール（βアゴニスト）のような気管支拡張薬の使用を含む。
【００３４】
ヒトでは、マウスにおけるように、サイトカイン分泌の２つの異なるパターンが、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞クローンの中で定義されている（ｄｅｌ Ｐｒｅｔｅ，Ｇ．，Ａｌｌｅｒｇｙ，４７：４５０−４５５ （１９９２））。ヒト１型ヘルパー（Ｔｈ１）細胞（２型ヘルパー（Ｔｈ２）細胞ではない）は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、γインターフェロン、および腫瘍壊死因子βを産生する。Ｔｈ１ではなくＴｈ２細胞は、ＩＬ−４およびＩＬ−５を分泌するがＩＬ−２またはγインターフェロンを分泌しない。ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、または腫瘍壊死因子αのような他のサイトカインは、Ｔｈ１およびＴｈ２細胞の両方によって産生される。異なるサイトカインパターンは、種々の機能に関連する。一般に、Ｔｈ２細胞は、特にＩｇＥクラスの、Ｂ細胞抗体産生についての優れたヘルパー機能を提供する。Ｔｈ１細胞は、遅延した過敏性反応を担い、そしてＢ細胞を含む自己抗原提示細胞に対して細胞溶解性である。ほとんどのアレルゲン特異的または蠕虫抗原特異的ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞クローンはＴｈ２表現型を示すが、細菌抗原に特異的なほとんどのクローンはＴｈ１プロフィールを示す。アレルゲン特異的Ｔｈ２細胞は、アトピーで重要な役割を果たすようである。これらの細胞は、ＩＬ−４によってＩｇＥ産生を誘導し、そしてＩＬ−５によって好酸球の増殖、分化、および活性化を好んで行う。さらに、Ｔｈ２由来のＩＬ−３、ＩＬ−４、およびＩＬ−１３は、少なくともインビトロで、相乗的に作用する肥満細胞増殖因子である。アレルゲン特異的Ｔｈ２細胞が、アレルギー性喘息を有するヒトの気管支粘膜のような、アレルギー性炎症によって提供を受ける組織に、選択的に豊富であるという証拠がある。
【００３５】
発展途上国での幼児における抗体の使用の増加につれて、（アレルギー性）喘息の徴候およびこれによる死亡が上昇している。以下の論議は、ストレスタンパク質を含む細菌抗原への慎重な曝露がアレルギー性応答を弱めるという概念を支持するために、ストレスタンパク質を含む細菌タンパク質についての曝露およびＴ細胞記憶の欠如に、アレルギー性反応の増加した徴候および重篤度を結び付ける、この情報を使用している。
【００３６】
多くの科学者らは、環境抗原に対する抵抗性または感受性の発生が、乳児および幼児において初期抗原遭遇中に生成した免疫学的記憶の性質に依存すると考える（Ｈｏｌｔ Ｐ．Ｇ．，Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｌｅｔｔ．，８６：２０５−２１０）。このプロセスは、抗原由来であるようである。選択は、吸入した抗原に対する個体の免疫応答（気道の流通を奪う、局部リンパ節で生じるプロセス）における特異的Ｔｈ１対Ｔｈ２様記憶細胞についてである。この選択は、抗原特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞によって産生される種々のサイトカインによって調節されるようである。このＴ細胞選択プロセスは、理論的には、感染性薬剤によって影響を受け得る：気道粘膜における感染は、局部リンパ節に遊走し、そしてＩＬ−１２およびα−インターフェロンのようなＴｈ２阻害サイトカインを分泌する局所組織（肺胞）マクロファージを移動および活性化し得る。さらに、これらは、ナチュラルキラー細胞の活性化によって環境中のγ−インターフェロンレベルに加えられ得る。正味の結果は、ＣＴＬ（これは主としてＣＤ８＋細胞である）の産生である。γ−インターフェロンは、Ｔｈ２細胞の生成、したがって、体液性（ＩｇＥ）および細胞性（好酸球、好塩基球、および肥満細胞）アレルギー性応答の産生に重要なサイトカインであるＩＬ−４およびＩＬ−５の産生を阻害する（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｇ．Ｐ．およびＣｏｙｌｅ，Ａ．Ｊ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，１５：３２４−３３２ （１９９５）；Ｓｔａｍ，Ｗ．Ｂ．，ｖａｎ Ｏｏｓｔｅｒｈｏｕｔ，Ａ．Ｊ．およびＮｉｊｋａｍｐ，Ｆ．Ｐ．，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．，５３：１９２１−１９３４ （１９９３９））。
【００３７】
哺乳動物において、ストレスタンパク質は、体液性および細胞性免疫応答を誘導することが示されている。本明細書中の実施例で示すように、ストレスタンパク質と混合した、ストレスタンパク質に化学結合した、またはストレスタンパク質に融合した可溶性抗原が、哺乳動物に投与される場合、細胞媒介細胞溶解性免疫応答は実質的に増強される。これらの応答は、大部分は、ＣＤ８＋Ｔ細胞による。したがって、それ自体による抗原に対するＣＤ４＋応答の、ストレスタンパク質と混合または結合した抗原に対する応答との比較は、予測されたプロフィールを与える：ストレスタンパク質と混合または連結された可溶性抗原は、前記のＴｈ１経路の刺激の尺度であるＣＴＬ（主としてＣＤ８＋Ｔ細胞）の高い割合を得る。なぜなら、これらのＣＴＬは、Ｔｈ１型の抗原特異的Ｔ細胞の誘導の結果として生じたからである。これらのＴｈ１細胞は、γ−インターフェロンを産生し、このサイトカインはＴｈ２細胞を阻害する。したがって、Ｔｈ２サイトカインであるＩＬ−４およびＩＬ−５は、ＩｇＥおよび好酸球の産生を支持するためにもはや利用可能ではない。ＩｇＥの力価の減少につれて、肥満細胞および好塩基性細胞の直接的抗原性刺激は衰える。さらに、減少したＩＬ−５産生は、好酸球の減少した産生、分化、および活性化を導く。このパターンは、関連した組織の減少した炎症を引き起こし、そして過剰反応性（喘息）事象をあまり生じない。
【００３８】
したがって、公知のアレルギー性抗原（アレルゲン）とストレスタンパク質との混合物、またはストレスタンパク質に化学結合もしくは融合したアレルゲンを含む組成物の投与は、アトピー性患者においてＴｈ１対Ｔｈ２比に影響を及ぼすばずであり、より正常な平衡を回復させそして減少したアレルギーまたは喘息を導く。このような組成物に使用されるストレスタンパク質は、好ましくは、細菌起源またはマイコプラズマ起源である。アレルゲン−ストレスタンパク質融合タンパク質に使用されるアレルゲンは、必然的にペプチド性質であり；非ペプチド性アレルゲンは、アレルゲンとストレスタンパク質とを含む結合体、またはアレルゲンとストレスタンパク質との混合物で使用され得る。アレルゲンについての非限定的な例には、Ｆｅｌ ｄ １ （ネコ）；Ａｍｂ ａ １（抗原Ｅ）、Ａｍｂ ａ ２（抗原Ｋ）（ブタクサ）；Ｄｅｒ ｆ ２、Ｄｅｒ ｐ １、Ｄｅｒ ｐ ９、Ｄｅｒ ｆ １ （ダニ）；Ｂｌａ ｇ １、Ｂｌａ ｇ ２ （ゴキブリ）；Ｂｅｔ ｖ １ （カバノキ）；Ｒａｔ ｎ １ （ラット）；Ｃｈａ ｏ １ （ヒノキ）；Ｈｅｖ ｂ ５ （ラテックス）；ｇｐ４０ （ヤマスギ（ｍｏｕｎｔａｉｎ ｃｅｄａｒ））が挙げられる。刊行時までのアレルゲンの適切な包括的なリストについては、Ｋｉｎｇ，Ｔ．Ｐ．ら，Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０５：２２４−２３３ （１９９４）を参照のこと。
【００３９】
共有結合したまたは混合されたアレルゲンおよびストレスタンパク質を含む組成物が、過敏性反応の処置の必要な患者に、皮下または筋肉内注射のような適切な経路によって投与されるか、あるいはさらに吸入によって与えられる場合、これらは、例えば、喘息における古典的過剰反応性試験によって測定されるようなアレルギー性症候の減少を生じるべきである。処置後、患者は、非特異的反応性をほとんど示さない。喘息では、または喘息の動物モデルでは、過剰反応性は、気管支狭窄応答を誘導する吸入されたメタコリンの用量を決定することによって測定される。過剰反応性を導く慢性炎症性状態を有する哺乳動物は、メタコリンチャレンジに対してより大きな感受性を示す。これらは、「正常」哺乳動物よりも低い用量で気管支狭窄する。適切なストレスタンパク質含有組成物での処置後、メタコリンに対する用量応答は、あまり感受性でなくなる。
【００４０】
任意の適切なストレスタンパク質（熱ショックタンパク質（ｈｓｐ））は、本発明の組成物において使用され得る。例えば、実施例に記載のように、ｈｓｐ６５および／またはｈｓｐ７１が使用され得る。ストレスタンパク質に向かって、一般的に、細胞は、普通ストレス遺伝子または熱ショック遺伝子といわれる遺伝子群の発現を増加させることによって、ストレッサー（代表的には、熱ショック処置）に応答する。熱ショック処置は、細胞が適応する温度より数℃上までの温度への、細胞または生物の曝露を包含する。このような遺伝子の誘導と同調して、対応するストレスタンパク質のレベルは、ストレスを受けた細胞で増加する。本明細書中で使用される場合、「ストレスタンパク質」は、「熱ショックタンパク質」または「Ｈｓｐ」としても公知であり、これは、ストレス遺伝子によってコードされるタンパク質であり、したがって、代表的には生物に対するストレッサーの接触または曝露の際に顕著により大量に産生されるタンパク質である。「熱ショック遺伝子」としても公知である「ストレス遺伝子」は、本明細書中で、熱ショックまたはグルコースの誘導もしくは追加のような、ストレッサーに対する生物（遺伝子を含む）の接触または曝露によって、活性化されるまたは他の検出可能に調節されない遺伝子として、使用される。「ストレス遺伝子」はまた、このような相同遺伝子が、それ自体ストレッサーによって誘導されなくても、Ｈｓｐ７０およびＨｓｐ９０ストレス遺伝子ファミリー内の特定の遺伝子のような、公知のストレス遺伝子ファミリー内の相同遺伝子を含む。本明細書中で使用される場合、用語ストレス遺伝子およびストレスタンパク質のそれぞれは、内容が他に指示されない限り、他のものを含み得る。Ｈｓｐの増加した発現の他に、細胞は、特定の他の遺伝子をダウンレギュレートし、シグナル伝達に関与するいくつかのキナーゼを活性化し、特定のタンパク質の細胞内位置を変化し、そしていくつかの状況では、細胞骨格レベルの変化ならびに一過性増殖阻止を経験し得る。
【００４１】
特定の実施態様において、本発明における使用のためのストレスタンパク質は、単離されたストレスタンパク質であり、これはストレスタンパク質が、それが産生される宿主細胞から選択および分離されていることを意味する。このような単離は、本明細書中に記載されるように、および当該分野において公知のタンパク質単離の日常的な方法を用いて、行われ得る。（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８２；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９））。単離されたストレスタンパク質はまた、さらに、方法、特に界面活性剤精製法に従って、（本質的に純粋に）精製され得る。
【００４２】
細菌において、優勢なストレスタンパク質は、それぞれ、約７０ｋＤａおよび約６０ｋＤａの分子量サイズを有するタンパク質であり、これはそれぞれ、Ｈｓｐ７０およびＨｓｐ６０として称される。これらのおよび他の特定のストレスタンパク質、およびそれらをコードする遺伝子は、以下にさらに考察される。細菌において、Ｈｓｐ７０およびＨｓｐ６０は、典型的に、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動および染料クマシーブルーを用いる染色パターンに基づいて、細胞タンパク質の約１〜３％を示すが、ストレスの多い条件下で２５％程の高レベルまで蓄積する。ストレスタンパク質は、重要な細胞プロセス（例えば、タンパク質合成、細胞内輸送、ならびにタンパク質複合体のアセンブリおよび脱アセンブリ（ｄｉｓａｓｓｅｍｂｌｙ））に関与するようである。ストレスの間に合成される増加される量のストレスタンパク質は、誘導されたタンパク質がほどける（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）結果を最小にするために主として作用するようである。実際、ストレスタンパク質の合成を誘導する中程度にストレスが多い条件への細胞の予めの曝露は、細胞に対して、その後のより極度のストレスの有害な影響からの防御を与える。
【００４３】
主要なストレスタンパク質は、今までのところ、試験されたあらゆる生物および組織タイプにおいて発現されるようである。また、ストレスタンパク質は、今日までに同定されたタンパク質の最も高度に保存された群を表すようである。例えば、広範に多様な生物におけるストレスタンパク質が比較される場合、Ｈｓｐ９０およびＨｓｐ７０は、アミノ酸レベルで５０％以上の同一性を示し、そして非同一性の位置で多くの類似性を共有する。
【００４４】
ストレスタンパク質をコードする遺伝子は、細胞または生物のゲノムにおいて、単一のコピー、または複数の、非同一性のコピーで存在し得る。例えば、ヒトゲノムは、少なくとも１つのコピーのＨｓｐ１００遺伝子、少なくとも２つの異なるＨｓｐ９０遺伝子、少なくともいくつかが非同一性のコピーである、最大１０までのＨｓｐ７０遺伝子、いくつかのＴ複合体遺伝子（Ｔｃｐ遺伝子）、および関連のミトコンドリアタンパク質Ｈｓｐ６０をコードする少なくとも１つの遺伝子、ならびに２０〜３０ｋＤａの範囲の分子量サイズのタンパク質をコードする、少なくとも３コピーの小Ｈｓｐ遺伝子を含むことが示されている。ストレス遺伝子のほとんどの群において、その発現レベルが比較的高く、および完全に構成的であるか、またはわずかに中程度に熱ショック誘導性であるかのいずれかである少なくとも１つの遺伝子が存在する。さらに、ストレス遺伝子のいくつかの群は、熱によってアップレギュレートされないが、他のきっかけ（例えば、増加されるカルシウムレベルなど）によってアップレギュレートされるメンバーを含む。
【００４５】
ストレスタンパク質、特に、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ２０〜３０、およびＨｓｐ１０は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅによる感染に対する免疫応答において、宿主免疫系によって認識される主要な決定因子の中の１つである。Ｙｏｕｎｇ，Ｒ．Ａ．およびＥｌｌｉｏｔｔ，Ｔ．Ｊ．、ストレスタンパク質、感染、および免疫監視、Ｃｅｌｌ ５０：５−８（１９８９）。さらに、いくつかのラットのａｒｔｈｒｉｔｏｇｅｎｉｃＴ細胞は、Ｈｓｐ６０エピトープを認識する。Ｖａｎ Ｅｄｅｎ、Ｗ．、Ｔｈｏｌｅ，Ｊ．、ｖａｎ ｄｅｒ Ｚｅｅ，Ｒ．、Ｎｏｏｒｄｚｉｊ，Ａ．、ｖａｎ Ｅｍｂｄｅｎ，Ｊ．、Ｈｅｎｓｅｎ，Ｅ．、およびＣｏｈｅｎ，Ｉ．、Ｎａｔｕｒｅ ３３１：１７１−１７３，（１９８８）。しかし、マイコバクテリア感染または自己免疫疾患の病歴を有しない、個体（健常な個体を含む）はまた、細菌およびヒトのＨｓｐ６０エピトープの両方を認識するＴ細胞を保有し；γ−ΔＴ細胞レセプターの発現によって特徴付けられる健常な個体におけるＴ細胞のかなりの画分は、自己のおよび外来性のストレスタンパク質の両方を認識する。Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｒ．、Ｈａｐｐ，Ｍ．、Ｄａｌｌａｓ，Ａ．、Ｐａｌｍｅｒ，Ｅ．Ｋｕｂｏ，Ｒ．、およびＢｏｒｎ，Ｗ．、Ｃｅｌｌ ５７：６４４−６７４（１９８９）。従って、個体は、健常な個体であっても、外来のおよび自己のストレスタンパク質エピトープの両方を認識するＴ細胞集団を保有する。
【００４６】
ストレスタンパク質エピトープを認識するこの系は、侵入する生物に対する「初期防衛系」を構成する。この系は、宿主細胞にそれら自身のストレス遺伝子をアップレギュレートさせる、細菌およびウイルスによる頻繁な刺激によって維持され得る。しかし、自己応答性Ｔ細胞の存在は、正常な健常性と適合性であり、自己免疫疾患を引き起こさない；これはまた、個体内のストレスタンパク質の安全性を実証する。ストレスタンパク質の安全性は、ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ、Ｍｙｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓの株）ワクチン接種（これは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｒｎ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに対してもまた防御的であるストレスタンパク質に対する、免疫応答を誘導する）の成功および比較的な安全性によって、さらに実証されている。
【００４７】
本発明における使用のためのストレス遺伝子およびタンパク質は、当該分野において周知であり、そして例えば、Ｈｓｐ１００−２００、Ｈｓｐ１００、Ｈｓｐ９０、Ｌｏｎ、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ６０、ＴＦ５５、Ｈｓｐ４０、ＦＫＢＰ、シクロフィリン、Ｈｓｐ２０−３０、Ｃ１ｐＰ、ＧｒｐＥ、Ｈｓｐ１０、ユビキチン、カルネキシン、およびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼを含む。Ｍａｃａｒｉｏ，Ａ．Ｊ．Ｌ．、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｒｅｓ．２５：５９−７０ １９９５；Ｐａｒｓｅｌｌ，Ｄ．Ａ．，＆ Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ，Ｓ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２７：４３７−４９６（１９９３）；米国特許第５，２３２，８３３号（Ｓａｎｄｅｒｓら）。ストレスタンパク質の特定の群は、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ２０−３０、およびユビキチン、さらに好ましくはＨｓｐ７０およびＨｓｐ６０を含む。
【００４８】
本発明の方法および組成物におけるストレスタンパク質は、好ましくは、細胞外的な抗原提示ストレスタンパク質から、またはプロセシングされたストレスタンパク質から、好ましくは選択され、そして得られたペプチドフラグメントは、それが細胞外抗原提示タンパク質であるように細胞の表面上に提示される。さらに、本発明における使用のための選択されるストレス遺伝子またはタンパク質は、好ましくは、ストレス遺伝子またはタンパク質が、少なくとも１つの発現（好ましくは、細菌またはヒト）において、１つ以上の形態のストレスに応じて調節されないように選択される。さらに好ましくは、選択されるストレス遺伝子またはタンパク質は、ヒトにおいて調節されない（上記されるようなストレッサー、または形質転換によって調節されないことを含む）。
【００４９】
Ｈｓｐ１００−２００の例は、Ｇｒｐ１７０（グルコース調節性のタンパク質について）、プレゴルジ区画における小胞体のルーメンにおけるＧｒｐ１７０残基を含み、そして免疫グロブリンの折り畳みおよびアセンブリにおいて役割を果たし得る。
【００５０】
Ｈｓｐ１００の例は、哺乳動物Ｈｓｐ１１０、酵母Ｈｓｐ１０４、ｃ１ｐＡ、ｃ１ｐＢ、ｃ１ｐＣ、ｃ１ｐＸ、およびｃ１ｐＹを含む。酵母Ｈｓｐ１０４およびＥ．ｃｏｌｉ ｃ１ｐＡは、ヘキサマーの粒子、およびそのアセンブリがアデニンヌクレオチド結合を必要とするようであるテトラマーの粒子であるＥ．ｃｏｌｉ ｃ１ｐＢを形成する。Ｃ１ｐプロテアーゼは、Ｃ１ｐＰ（タンパク質分解性のサブユニット）およびＣ１ｐＡからなる７５０ｋＤａのヘテロオリゴマーを提供する。Ｃ１ｐＢ−Ｙは、Ｃ１ｐＡに構造的に関連するが、Ｃ１ｐＡとは異なり、Ｃ１ｐＰと複合体化しないようである。
【００５１】
Ｈｓｐ９０の例は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＨｔｐＧ、酵母におけるＨｓｐ８３およびＨｓｃ８３、ならびにヒトにおけるＨｓｐ９０α、Ｈｓｐ９０β、およびＧｒｐ９４を含む。Ｈｓｐ９０は、タンパク質の群に結合し、このタンパク質は、ステロイドホルモンレセプター（例えば、糖質コルチコイド、エストロゲン、プロゲステロン、およびテストステロン）、転写因子、ならびにシグナル伝達機構において役割を果たすプロテインキナーゼのような代表的には細胞調節分子である。Ｈｓｐ９０タンパク質はまた、他のストレスタンパク質を含む大きな豊富なタンパク質複合体の形成に関与する。
【００５２】
Ｌｏｎは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてネイティブでないタンパク質を分解する、ＡＴＰ−依存性プロテアーゼとして機能する、テトラマーのタンパク質である。
【００５３】
Ｈｓｐ７０の例は、哺乳動物細胞からのＨｓｐ７２およびＨｓｐ７３、細菌、特にマイコバクテリア（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ（例えば、Ｂａｃｉｌｌｅ−Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ））からのＤｎａＫ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、酵母、および他の原核生物からのＤｎａＫ、ならびにＢｉｐおよびＧｒｐ７８を含む。
【００５４】
Ｈｓｐ７０は、ＡＴＰ、ならびにほどけたポリぺプチドおよびペプチドに特異的に結合し得、それによってタンパク質の折り畳みおよび脱折り畳み（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）、ならびにタンパク質複合体のアセンブリおよび脱アセンブリに関与する。
【００５５】
Ｈｓｐ６０の例は、マイコバクテリアからのＨｓｐ６５を含む。細菌Ｈｓｐ６０はまた、一般に、ＧｒｏＥＬ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉからのＧｒｏＥＬ）としても知られる。Ｈｓｐ６０は、大きな、ホモオリゴマーの複合体を形成し、およびタンパク質折り畳みにおいて重要な役割を果たすようである。Ｈｓｐ６０相同体は、真核生物のミトコンドリアおよび葉緑体に存在する。
【００５６】
ＴＦ５５の例には、Ｔｃｐ１、ＴＲｉＣ、およびサーモソーム（ｔｈｅｒｍｏｓｏｍｅ）が含まれる。このタンパク質は、代表的には、真核生物の細胞質およびいくつかの始原細菌において生じ、そして多員環を形成して、タンパク質折り畳みを促進する。これらはまた、Ｈｓｐ６０に低度に相同性である。
【００５７】
Ｈｓｐ４０の例は、Ｅ．ｃｏｌｉおよびマイコバクテリアのような原核生物からのＤｎａＪ、およびＨＳＪ１、ＨＤＪ１、ならびにＨｓｐ４０を含む。Ｈｓｐ４０は、細胞活性の中でとりわけ、タンパク質合成、熱耐性、およびＤＮＡ複製における分子シャペロンとしての役割を果たす。
【００５８】
ＦＫＢＰの例は、ＦＫＢＰ１２、ＦＫＢＰ１３、ＦＫＢＰ２５、ならびにＦＫＢＰ５９、Ｆｐｒ１およびＮｅｐ１を含む。これらのタンパク質は、代表的には、ぺプチジル−プロリルイソメラーゼ活性を有し、および免疫抑制薬（例えば、ＦＫ５０６およびラパマイシン）と相互作用する。これらのタンパク質は、代表的には、細胞質および小胞体において、見出される。
【００５９】
シクロフィリンの例には、シクロフィリンＡ、Ｂ、およびＣが含まれる。タンパク質は、ぺプチジル−プロリルイソメラーゼ活性を有し、そして免疫抑制薬のシクロスポリンＡと相互作用する。タンパク質シクロスポリンＡは、カルシニューリン（タンパク質ホスファターゼ）に結合する。Ｈｓｐ２０−３０の例には、α−クリスタリンが含まれ、そしてＨｓｐ２０−３０はまた、小Ｈｓｐと称される。Ｈｓｐ２０−３０は、代表的には、大きなホモオリゴマーの複合体において見出され、またはヘテロオリゴマーの複合体（ここでは、生物または細胞タイプは、いくつかの異なるタイプの小Ｈｓｐを発現する）において見出されることもあり得る。Ｈｓｐ２０−３０は、細胞骨格構造と相互作用し、そしてアクチンの重合／解重合において調節的な役割を果たし得る。Ｈｓｐ２０−３０は、ストレスにより、または静止細胞の増殖因子への曝露の際に、迅速にリン酸化される。
【００６０】
Ｃ１ｐＰは、異常なタンパク質の分解に関与するＥ．ｃｏｌｉプロテアーゼである。Ｃ１ｐＰの相同体は、葉緑体において見出される。Ｃ１ｐＰは、Ｃ１ｐＡとヘテロオリゴマーの複合体を形成する。
【００６１】
ＧｒｐＥは、ストレスで障害されたタンパク質の救済、および障害されたタンパク質の分解の両方に関与する約２０ｋＤａのＥ．ｃｏｌｉタンパク質である。ＧｒｐＥは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてストレス遺伝子の発現の調節において役割を果たす。Ｈｓｐ１０の例は、ＧｒｏＥＳおよびＣｐｎ１０を含む。Ｈｓｐ１０は、代表的には、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、ならびに真核生物細胞のミトコンドリアおよび葉緑体において見出される。Ｈｓｐ１０は、Ｈｓｐ６０オリゴマーと会合する七員環を形成する。Ｈｓｐ１０はまた、タンパク質折り畳みに関与する。
【００６２】
ユビキチンは、ＡＴＰ−依存性の細胞質ゾルのプロテアーゼのタンパク質分解除去と協調して、タンパク質を結合することが見出されている。
【００６３】
特定の実施態様において、本発明のストレスタンパク質は、腸内細菌、マイコバクテリア（特に、Ｍ．ｌｅｐｒａｅ、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、およびＭ．ｂｏｖｉｓ、Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母、ショウジョウバエ、脊椎動物、鳥類、ニワトリ、哺乳動物、ラット、マウス、霊長類、またはヒトから得られる。
【００６４】
ストレスタンパク質は、酸性もしくは塩基性の塩の形態、または中性の形態であり得る。さらに、個々のアミノ酸残基は、酸化または還元によって修飾され得る。さらに、種々の置換、欠失、または付加が、アミノ酸または核酸配列に対してなされ得、その正味の効果は、変異体の増加された生物学的活性を保持すること、またはさらに増強することである。コード縮退に起因して、例えば、同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列においてかなりの変化が存在し得る。本発明はまた、ストレスタンパク質から得られる、ストレスタンパク質のフラグメントまたはペプチドを用いる使用に適切である（但し、このようなフラグメントまたはペプチドは、選択される抗原に対する免疫応答を増強することに関与する立体配座エピトープを含む）。ストレスタンパク質フラグメントは、プロテイナーゼを用いるフラグメント化により、または組換え法（例えば、ストレスタンパク質をコードするヌクレオチド配列の一部の発現（単独でまたは別のタンパク質との融合としてのいずれか））によって得ることができる。ペプチドはまた、このような方法、または化学合成によって生成され得る。本発明はまた、第２のタンパク質に融合または結合されるストレスタンパク質を用いる使用に適切であり、第２のタンパク質は、ストレスタンパク質であってもなくてもよい。ストレスタンパク質は、多様な公知の技術によって、特定の遺伝子座で導入された変異を含み得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９； ＤｒｉｎｋｗａｔｅｒおよびＫｌｉｎｅｄｉｎｓｔ、ＰＮＡＳ ８３：３４０２−３４０６、１９８６；ＬｉａｏおよびＷｉｓｅ Ｇｅｎｅ ８８：１０７−１１１、１９９０’）； Ｈｏｒｗｉｔｚら、Ｇｅｎｏｍｅ ３：１１２−１１７、１９８９を参照のこと。
【００６５】
用語「ストレスタンパク質のアミノ酸配列に十分に相同性である」とは、タンパク質またはポリぺプチドのアミノ酸配列が、一般に、ストレスタンパク質アミノ酸配列と少なくとも４０％の同一性を示すことを意味する；いくつかの場合において、機能的に等価なアミノ酸配列は、ストレスタンパク質のアミノ酸配列と約５０％の同一性を示す。
【００６６】
ストレス遺伝子またはタンパク質としての考慮のもとに、遺伝子またはタンパク質を同定する方法は、当該分野において周知である。例えば、特定のストレスタンパク質群の遺伝子およびタンパク質の保存は、周知のストレス遺伝子（例えば、ＤｎａＫ、ＧｒｏＥＬ、またはＤｎａＪ）を考慮して、例えば、核酸ハイブリダイゼーション、または核酸もしくはアミノ酸配列決定、その後のコンピューター比較解析によって、遺伝子／タンパク質のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の比較を可能にする。Ｖｏｅｌｌｍｙ，Ｒ．，ら、ＰＮＡＳ ８２：４９４９−４９５３（１９８５）。あるいは、アッセイは、選択されたストレスタンパク質の本質的な構造特徴および／または機能的特性とを、同定および／または区別するために使用され得る。例えば、発現ライブラリーは、抗Ｈｓｐ抗体および当該分野において周知の他のアッセイを使用して、スクリーニングされ得る。Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（編）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、（１９８８）。さらに、所定のストレスタンパク質群の生物学的活性が開発され得る。Ｇｕｉｄｏｎ，Ｐ．Ｔ．、およびＨｉｇｈｔｏｗｅｒ，Ｌ．Ｅ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５：３２３１−３２３９（１９８６）。例えば、Ｈｓｐ７０は、タンパク質複合体のアセンブリにおいて、ＡＴＰ、ならびに折り畳まれていないポリぺプチドおよびペプチドに特異的に結合し得る。従って、適切なポリぺプチド、ペプチド、またはＡＴＰを含むサンプルを考慮してタンパク質を混合した後の、タンパク質−タンパク質またはタンパク質−核酸複合体の生成の存在または不在の決定は、Ｈｓｐ７０遺伝子またはタンパク質の明白な存在または不在を示し、この存在または不在は、抗体ベースのアッセイのような他のアッセイを利用して確認され得る。
【００６７】
ストレスタンパク質、またはストレスタンパク質に結合した物質（例えば、タンパク質もしくはオリゴ糖）に対する特異的な細胞性または体液性の免疫を誘発するための、ワクチンとしての、本発明のストレスタンパク質の有効な投薬量は、１回の注入あたり０．１〜１０００μｇ ｈｓｐの範囲であり、ストレスタンパク質が投与される個体に依存する（Ｌｕｓｓｏｗ，Ａ．Ｒ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．，２１：２２９７−２３０２（１９９１）；Ｂａｒｒｉｏｓ，Ｃ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．，２２：１３６５−１３７２（１９９２））。各個体についてのストレスタンパク質の適切な投薬量は、例えば、投与される特定のストレスタンパク質、ストレスタンパク質が投与される個体のタイプ、個体の年齢および大きさ、処置または予防される状態、ならびに状態の重篤度を考慮して決定される。当業者は、日常的な実験だけを使用して、個体に投与するための適切な投薬量を決定し得る。
【００６８】
ワクチンに存在する、ストレスタンパク質、ストレスタンパク質の部分、ストレスタンパク質の機能的等価物、およびストレスタンパク質が混合、融合、または結合される抗原は、公知の技術を用いて生成され得るか、または得ることができる。例えば、インフルエンザウイルスのストレスタンパク質および／または抗原は、それらが天然に生じる供給源から得られ（単離され）得るか、所望のストレスタンパク質もしくは抗原をコードする遺伝子をクローニングおよび発現することによって生成され得るか、または化学的もしくは機械的に合成され得る。
【００６９】
本明細書中に記載される組成物は、多様な病原体（例えば、細菌、ウイルス、寄生虫）に対する免疫応答を誘導するために使用され得る。インフルエンザウイルスの抗原、および１つ以上のストレスタンパク質の全体もしくは部分、または抗原に対する免疫応答を誘導ためのストレスタンパク質のアミノ酸配列に十分相同であるアミノ酸配列を有するタンパク質の全体もしくは部分は、インフルエンザウイルスに感受性の任意の脊椎動物（例えば、哺乳動物、家禽）において、インフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導するために使用され得る。例えば、組成物は、霊長類（例えば、ヒト）、ウマ、ブタ、シチメンチョウ、およびニワトリにおいて、インフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導するために使用され得る。
【００７０】
本明細書中に記載される組成物は、種々の様式で宿主に投与され得る。投与の経路としては、皮内、経皮（例えば、遅延放出ポリマー）、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経口、硬膜外、および鼻腔内の経路が挙げられる。任意の他の投与の都合の良い経路（例えば、注入もしくはボーラス注射）、または上皮のもしくは粘膜皮膚の内層を介する吸収が使用され得る。さらに、本明細書中で記載される組成物は、他の成分または生物学的に活性な薬剤（例えば、ミョウバン）、薬学的に受容可能な界面活性剤（例えば、グリセリド）、賦形剤（例えば、ラクトース）、キャリア、希釈剤、およびビヒクルとともに投与され得る。
【００７１】
さらに、ストレスタンパク質および／またはペプチド（ｐｅｐｔｉｄｉｃ）抗原は、これらをコードするポリヌクレオチドのインビボ発現によって、哺乳動物被験体に投与され得る。すなわち、ベクターが、抗原およびストレスタンパク質をコードする核酸、または抗原およびストレスタンパク質配列を含む融合タンパク質をコードする核酸を送達するために使用され得る。例えば、ストレスタンパク質および／または抗原は、生きたベクターを用いて宿主（哺乳動物）に投与され得、ここでストレスタンパク質および抗原の核酸配列を含む生きたベクターは、抗原および／またはストレスタンパク質がインビボで発現される条件下で投与される。例えば、哺乳動物は、タンパク質もしくはペプチドの形態でのストレスタンパク質と組合わせて、またはストレスタンパク質をコードし、そしてこれをインビボで発現するベクターと組合わせて、抗原をコードし、そしてインビボでこれを発現するベクターを用いて、注入され得る。あるいは、宿主は、ペプチドもしくはタンパク質の形態での抗原と組合わせて、または抗原をコードし、そしてこれをインビボで発現するベクターと組合わせて、ストレスタンパク質をコードし、そしてこれをインビボで発現するベクターを用いて、注入され得る。タンパク質（ペプチド）抗原をコードする配列を含む単一のベクターはまた、本発明の組成物のために使用され得る。
【００７２】
いくつかの発現ベクター系が、市販されているか、または組換えＤＮＡおよび細胞培養技術に従って再生され得る。例えば、酵母もしくはワクシニアウイルスの発現系のようなベクター系、またはウイルスベクターは、本発明の方法および組成物において使用され得る（Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．、Ａ Ｊ．ｏｆ Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，２：２２１−２３６（１９９０））。裸のプラスミドまたはＤＮＡ、および標的化リポソームにおいてもしくは赤血球ゴーストにおいてカプセル化されているクローン化遺伝子を使用する他の技術は、ストレスタンパク質および／または抗原ポリヌクレオチドを宿主に導入するために使用され得る（Ｆｒｅｉｄｍａｎ，Ｔ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１２７５−１２８１（１９９）；Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈ，Ｎ．Ｒ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６５：１４０１−１４０４（１９９４））。発現ベクターの構築、ならびにベクターおよび核酸の種々の宿主細胞への移入は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＢｉｏｌｏｇｙにおけるＭｏｌｅｃｕｌａｒ ＣｌｏｎｉｎｇおよびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（これらは、本明細書によって参考として援用される）のような手引書に記載されるように、または、市販のキットを使用することによって、遺伝子操作技術を用いて達成され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、１９８９））。
【００７３】
本発明の組成物におけるストレスタンパク質および／または抗原の量は、宿主（哺乳動物のような脊椎動物）において有効な免疫刺激応答を生成する量である。有効量は、投与される場合、投与されない場合の免疫応答に比べて増強された免疫応答を生じるような量である。すなわち、有効量は、抗原またはストレスタンパク質単独の類似の量よりも明白な免疫応答を提供する量である。さらに、宿主に投与されるストレスタンパク質および／または抗原の量は、多様な因子に依存して変化し、これは用いられる抗原、宿主の大きさ、年齢、体重、全体の健常度、性別、および食餌、ならびに投与の時間、持続時間、またはインフルエンザウイルスの特定の特質を含む。確立された用量範囲の調整および操作は、当業者の能力の十分な範囲内である。例えば、ストレスタンパク質および抗原の量は、約１００μｇ〜約１ｇ、好ましくは約１ｍｇ〜約１ｇ、および約１ｍｇ〜約１００ｍｇであり得る。
【００７４】
本発明は、ストレスタンパク質の存在が、抗原に対する細胞媒介性の細胞溶解応答を非常に刺激することを教示する。腫瘍関連抗原は同定されているが、これらの抗原に対する免疫応答単独は、治療学的に有効ではない。混合物中での、または抗原に連結されるかのいずれかでの、ストレスタンパク質の同時投与による、これらの抗原に対する細胞応答の増強は、ガン治療において有益である。この予測は、本発明の組成物が、その後の腫瘍チャレンジに対して哺乳動物を免疫するという実施例に詳述される観察によって、支持される。抗原に対する、細胞媒介性の、細胞溶解応答の増強は、同じ抗原に対する、先存の（Ｔｈ２媒介性の）体液性応答のダウンレギュレーションを生じることが予測される。それゆえ、本発明はまた、アレルギー性応答を抑制するために有用である。最後に、Ｔ細胞媒介性免疫はまた、ウイルス、原生動物、および特定の細胞内細菌（例えば、マイコバクテリア）によって引き起こされる感染に対する哺乳動物宿主防御において、重要なエレメントであることが考慮される。実施例において示されるように、ストレスタンパク質およびインフルエンザウイルス抗原を含む本発明の組成物（混合物、結合体、および融合タンパク質）は、ウイルス抗原を発現する哺乳動物細胞に対して、実質的な細胞媒介性の細胞溶解応答を誘発するにおいて有効である。
【００７５】
本発明は、以下の実施例によって説明され、これはいかようにも限定されることを意図されない。
【実施例】
【００７６】
実施例
実施例１：組換えストレスタンパク質の単離
Ａ．組換えマイコバクテリアＨｓｐ７０。プラスミドＹ３１１１は、発現制御配列の間に機能的に挿入されたＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈｓｐ７０遺伝子を含む。（Ｍｅｈｌｅｒｔ，Ａ．およびＹｏｕｎｇ，Ｄ．Ｂ．、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３：１２５−１３０（１９８９））。短縮型Ｈｓｐ７０遺伝子を含むＥ．ｃｏｌｉ株ＣＧ２０２７（Ｃ．Ｇｅｏｒｇｏｐｏｕｌｏｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから得た）を、標準的な手順によって、プラスミドＹ３１１１で形質転換した。（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８２））。
【００７７】
プラスミドＹ３１１１を含有する細菌を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地（１リットル当たり、２０ｇトリプトン、１０ｇ酵母抽出物、１０ｇ ＮａＣｌ）中で、３７℃で、撹拌しながら（２５０ｒｐｍ）、一晩、増殖させた。１０％グリセロールストックを、この培養液から調製し、そして−７０℃で保存した。凍結したグリセロールストックからのいくつかの削片を、大量培養物を接種するために使用し、これを約４８時間になる前まで、インキュベートした。５９０ｎｍでの光学密度が、２．５〜３．５に達した場合、細胞を遠心分離によって回収した。
【００７８】
以下の工程を、４℃で行った。細胞ペレットを、１ｇ当たり３ｍｌの溶解緩衝液中に再懸濁した。溶解緩衝液の組成は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、５ｍＭ β−メルカプトエタノール、１０μｇ／ｍｌアプロチニン、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、および１μｇ／ｍｌペプスタチンであった。リゾチームを、０．１４ｍｇ／ｍｌの最終濃度になるまで、細胞懸濁液に添加した。次いで、懸濁液を、−７０℃で凍結した。
【００７９】
細胞懸濁液を解凍し、そして細胞を、超音波処理によって破壊した。超音波処理物を、１７，０００ｒｐｍで、３０分間の遠心分離に供した。（ＪＡ−１７ローター、Ｂｅｃｋｍａｎｎ）。固体の（ＮＨ４）２ＳＯ４を、上清溶液が（ＮＨ４）２ＳＯ４で６５％飽和されるまで、上清溶液に添加した。インキュベーションの３０分後、混合液を以前のように遠心分離した。ペレットを、Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ緩衝液Ａに溶解した。この溶液に、１０μｇ／ｍｌアプロチン、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、および１μｇ／ｍｌペプスタチンを添加し、そして溶液を６５容量のＱ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ緩衝液Ａに対して、一晩、透析した。Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ緩衝液Ａは、３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ β−メルカプトエタノールを含んだ。透析した溶液を、以前に記載のように、遠心分離によって澄明化した。
【００８０】
透析した溶液を、Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ緩衝液Ａ中で平衡化したＱ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にアプライした。カラムを、２容量の同じ緩衝液で洗浄した。溶出は、０〜６００ｍＭ ＮａＣｌ勾配を伴った。画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルー染色によって、主要な７１ｋＤａポリぺプチド（すなわち、組換えＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈｓｐ７０タンパク質）の存在について試験した。ポリぺプチドを含む画分をプールし、そしてこのプールを、固体の（ＮＨ４）２ＳＯ４の添加によって６５％飽和にさせた。混合液を、以前に記載のように遠心分離し、ペレットをＡＴＰ開始緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１５ｍＭ β−メルカプトエタノール、および０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解し、そして得られたタンパク質溶液を、一晩、６５容量の同じ緩衝液に対して透析し、そして遠心分離によって澄明化した。
【００８１】
次いで、透析したタンパク質溶液を、ＡＴＰ開始緩衝液中で平衡化したＡＴＰ−アガロースカラム（Ｆｌｕｋａ）にアプライした。カラムを１Ｍ ＮａＣｌを含有する１カラム容量のＡＴＰ開始緩衝液で洗浄した。溶出を、１０ｍＭ ＡＴＰを補充したＡＴＰ開始緩衝液を用いて達成した。溶出物を、（ＮＨ４）２ＳＯ４で６５％飽和にさせ、そして沈殿したタンパク質を、以前に記載のように回収した。遠心分離ペレットを、溶解し、そして２００容量のＢｌｕｅ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ緩衝液（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭβ−メルカプトエタノール）に対して透析した。
【００８２】
最後の工程からの透析したタンパク質溶液を、Ｂｌｕｅ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ緩衝液中で平衡化したＢｌｕｅ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にアプライした。カラムを、１．５カラム容量の同じ緩衝液で洗浄した。溶出し、そして画分を、単一のプールとして回収した。
【００８３】
最終調製物の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルー染色によって、マイコバクテリアのＨｓｐ７０およびＥ．ｃｏｌｉ Ｈｓｐ７０にそれぞれ特異的なマウスモノクローナル抗体を用いて、ウエスタンブロット分析によって（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８２）；（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９８９）を参照のこと））、ならびにＡＴＰアーゼ活性のアッセイによって、評価した。調製物は、クマシーブルー染色されたゲル中の調製物の染色パターンに基づいて、代表的に、９０％を超えて純粋であり、そして好ましくは９５％を超えて純粋であり、ならびに１％未満のＥ．ｃｏｌｉ Ｈｓｐ６０を含み、そして検出可能なＥ．ｃｏｌｉ Ｈｓｐ７０を含まなかった。
【００８４】
Ｂ．マイコバクテリアのＨｓｐ６０
プラスミドＲＩＢ１３００は、発現制御配列の間に機能的に挿入されたＭ．ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ Ｈｓｐ６０遺伝子を含む。（Ｔｈｏｌｅ，Ｊ．Ｅ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７８：３４３−３４８（１９９３））。Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｍ１５４６を、標準的な手順を用いて、プラスミドＲＩＢ１３００（Ｔｈｏｌｅら、Ｊ．Ｅ．Ｒ．、上述）で形質転換した。Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８２））。
【００８５】
プラスミドＲＩＢ１３００を含有する細菌の接種物を、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＮＣＺＹＭ培地（１リットル当たり１０ｇ Ｎ−Ｚ アミンＡ、５ｇ Ｂａｃｔｏ 酵母抽出物、１ｇ カサミノ酸（Ｃａｓａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）、５ｇ ＮａＣｌ、２ｇ （ＮＨ４）２ＳＯ４−７Ｈ２Ｏ））において、２８℃で、および撹拌下、飽和に増殖させた。この培養物を、大量培養を接種するために使用し、これを接種培養と同じ条件下で、５９０ｎｍの光学密度での培養物の光学密度が０．３〜０．６の間になるまで増殖した。組換えタンパク質の生成を、熱水浴におけるインキュベーションによって、培養物の温度を４２℃に急速に上昇することによって、開始した。培養を、この温度で、３時間、維持した。次いで、細菌を遠心分離によって回収し、そして細菌ペレットの１重量あたり６容量の溶解緩衝液に再懸濁した。溶解緩衝液は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＪＣＬ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、０．１ｍＭ ＰＭＳＦ、および０．１％ ＲＩＶＭ ＢＡ（５０ｍｌあたり、０．１０４ｇ ４−アミノ−ベンズアミジン−２ＨＣｌ、０．０６６ｇ ε−アミノカプロン酸）を含んだ。リゾチームを、０．１ｍｇ／ｍｌの濃度に添加し、そして懸濁液を−７０℃で凍結した。
【００８６】
細菌懸濁液を解凍し、そして４℃に置いた。以下の操作をこの温度で行った。細菌の完全な溶解を、超音波処理によって達成した。超音波処理物を、１７，０００ｒｐｍで、３０分間、ＪＡ−７０ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ）において遠心分離した。飽和化（ＮＨ４）２ＳＯ４を、２０％飽和が達成されるまで、上清溶液に添加した。沈殿物を、遠心分離（上述を参照のこと）によって回収し、そして破棄した。上清溶液を、飽和化（ＮＨ４）２ＳＯ４の添加によって、５５％飽和にさせた。上清の遠心分離によって得られるペレットを、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５ｍＭ β−メルカプトエタノール、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に溶解した。次いで、ＴＥ中のタンパク質溶液を、５０容量のＴＥ緩衝液に対して透析した。
【００８７】
沈殿された物質を除去するための遠心分離後（上述のように）、透析したタンパク質溶液を、ＤＥＡＥ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムにアプライした。ＴＥ緩衝液での洗浄後、タンパク質をＴＥ緩衝液中の０〜３００ｍＭ ＮａＣｌ勾配で溶出した。Ｍ．ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ Ｈｓｐ６０（実際の見かけの分子量は、６５ｋＤａに等しい）を含む画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルー染色によって同定し、そしてプールした。１０μｇ／ｍｌアプロチニン、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、および１μｇ／ｍｌペプスタチンを、このプールに添加し、次いでこれを、ＹＭ３０メンブレンを用いてＡｍｉｃｏｎセルに濃縮した。
【００８８】
濃縮したプールを、Ｓ２００緩衝液（１０ｍＭ ＮａＨＰＯ４（ｐＨ６．８）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、および１５ｍＭβ−メルカプトエタノール）で平衡化したＳ−２００ ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムにアプライした。溶出は、同じ緩衝液を用いてであった。画分を、以前のようにマイコバクテリアのＨｓｐ６０の存在について試験し、そして高度に精製されたタンパク質を含有するポジティブな画分をプールし、そしてＨＡＰ緩衝液（１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ６．８）、１５ｍＭβ−メルカプトエタノール）に対して、一晩、透析した。
【００８９】
透析したプールを、ＨＡＰ緩衝液中で平衡化したヒドロキシアパタイト（Ｂｉｏ−Ｒａｄ；Ｂｉｏ−Ｇｅｌ ＨＴＰ Ｇｅｌ）カラムにアプライした。カラムを、３カラム容量の１ｍＮ ＭｇＣｌ２および１５ｍＭβ−メルカプトエタノール、次いで１ｍＭ ＮａＨＰＯ４（ｐＨ６．８）および１５ｍＭβ−メルカプトエタノールで洗浄した。タンパク質を、１０〜６０ｍＭ リン酸勾配で溶出した。画分を、以前のように試験し、そしてポジティブな画分をプールし、濃縮し、そしてＰＤ１０を介するゲル濾過によって０．８５％ ＮａＣｌに交換した。マイコバクテリアのＨｓｐ６０の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルー染色によって、ならびにＥ．ｃｏｌｉ Ｈｓｐ７０およびＨｓｐ６０に特異的な抗体を使用するウエスタンブロット分析によって、評価した。調製物は、代表的に、９０％を超える純度であり、ならびにそれぞれ、０．５％を超えないＥ．ｃｏｌｉ ＨＳＰ６０および０．１〜０．２％のＥ．ｃｏｌｉ Ｈｓｐ７０を含んだ。
【００９０】
ＨＳＰ調製物は、ＤｅｔｏｘｉＧｅｌ樹脂に対するアフィニティークロマトグラフィーによって、ポリミキシンＢを添加して、または（あまり好ましくないが）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４のような界面活性剤を用いる溶出によってのいずれかで、脱発熱化し得る（ｄｅｐｙｒｏｇｅｎａｔｅ）。
【００９１】
実施例２：ＮＰペプチドおよびｈｓｐ７０の混合物を含有する組成物に対するＣＴＬ応答
ａ．ｈｓｐ７０タンパク質およびＮＰペプチドの調製 Ｈｓｐ７０（ここでは、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｈｓｐ７１）を、実施例１に記載のように調製した。完全なＮＰにおける３６３−３７４残基に対応するアミノ酸配列ＶＱＬＡＳＮＥＮＭＥＴＭ（配列番号１）を有し、そして公知のＣＴＬエピトープ（Ｈ−２ｂ制限される）を含む、ＮＰペプチド（本明細書中でＮＰ．Ｂとして称される；Ｍｏｔａｌ，Ｕ．Ｍ．Ａ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２５：１１２１−１１２４（１９９５）およびそこにおける参考文献）を、αアミノ保護基としてＦｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）を用い、および固相支持体としてＨＭＰ（Ｗａｎｇ）樹脂を用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｍｏｄｅｌ ４３１Ａ ペプチド合成機において、合成的に生成した（０．２５ｍＭスケール）。全てのアミノ酸および合成化学薬品は、Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した。
【００９２】
ＮＰ．Ｂを、支持体から切断し、そして連続的な撹拌下で、３時間、１０ｍｌトリフルオロ酢酸、０．５ｍｌ 水、０．７５ｇ結晶性フェノール、０．２５ｍｌ エタンジチオール、および０．５ｍｌ トリアニソールを混合することによって調製した２ｍｌの混合物中で、ＮＰ．Ｂ−樹脂をインキュベートすることによって、側鎖の保護基を除去した。切断混合物を、４０ｍｌの氷冷ジエチルエーテルに濾過した。不溶性の物質を、５０００×ｇで、８分間の遠心分離によって回収した。エーテルをデカントし、そしてペレットを、冷却ジエチルエーテルにおける再懸濁、次いで遠心分離によって、３回洗浄した。最後の洗浄後、ペレットを風乾し、蒸留水中にとり、そして凍結乾燥した。
【００９３】
ｂ．マウスの免疫およびエフェクター細胞の調製
ＮＰ．Ｂペプチドを、小容量のダルベッコＰＢＳ（ＤＰＢＳ；２．７ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、４．３ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、２．７ｍＭ ＫＣｌ、０．１３７Ｍ ＮａＣｌ）に溶解した。ペプチドＮＰ．Ｂの、それぞれ、１．８９、１８．９または１８９μｇのアリコートを、ＤＰＢＳ中のｈｓｐ７１の１００μｇのアリコートと混合し、それぞれ、１、１０、または１００のペプチド：ｈｓｐのモル比を有する組成物を得た。株Ｃ５７ＢＬ／６の４匹の雌性マウスの群は、免疫されないままであるか（コントロール）または３つの異なるＮＰ．Ｂ−ｈｓｐ７１混合物で、頸部の首筋に皮下注射されたかのいずれかであった。７日後、マウスを頸部脱臼によって安楽死させ、それらの脾臓を取り出した。プールした脾臓の単一の細胞懸濁液を調製し、そして「完全培地」（これは、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５０μＭ ２−メルカプトエタノール、および５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン硫酸を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地であった）中で、１回洗浄した。０．１μｍｏｌ濃度でのＮＰ．Ｂ．ペプチドとともに、５日間、２５×１０６個の生存細胞を培養することによって、リンパ様細胞を再刺激した。培養物を、直立の２５ｃｍ２フラスコ中で、１０ｍｌ 完全培地とともに、３７℃および５％ ＣＯ２で、インキュベートした。次いで、培養物（エフェクター細胞）を、下記のＣＴＬ活性アッセイにおいて使用した。
【００９４】
ｃ．ＣＴＬ活性アッセイ
ＥＬ４細胞（Ｈ−２ｂ）を、標的細胞として使用した。細胞を、１０６細胞当たり１５０μＣｉ Ｎａ２ＣｒＯ４および１０μｇＮＰ．Ｂペプチドとともに、９０分間インキュベートした。大量に洗浄して過剰な放射標識を除去した後、１０４標識化標的細胞を、再刺激したエフェクター細胞とともに、種々のエフェクター：標的細胞比で、同時培養した。インキュベーションの４〜５時間後、培養プレートを、５分間、２００×ｇで遠心分離し、そして細胞から放出された放射標識を含む上清液の１００μｌアリコートを、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｒｅａｄｙ Ｃａｐｓに回収した。放射能を、液体シンチレーションカウンティングによって測定した。自発的に放出された放射能、および放出可能な全放射能を測定するために、標的細胞のみを含む培養物からの上清液、またはＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の添加によって溶解された標的細胞からの上清液を回収し、そして放射能を以前のように測定した。結果は、特異的溶解％として表され、以下の式に基づいて算定された：
特異的溶解パーセント＝１００×（ｃｐｍ試験−ｃｐｍ自発）／（ｃｐｍ全体−ｃｐｍ自発）、
ここでｃｐｍ試験は、特定の同時培養から放出された放射能であり、ｃｐｍ自発は、標的細胞培養物の自発的に放出された放射能であり、およびｃｐｍ全体は、標的細胞のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶解によって放出される放射能である。ＣＴＬアッセイを、３連で行い、そして平均値を提供した。
【００９５】
実験の結果を図１に示す。コントロール反応（すなわち、標的細胞と、免疫されていないマウスから調製されたエフェクター細胞との同時培養のクロミウム放出のアッセイ）は、１００のエフェクター：標的細胞比で、約１０％の溶解についてのバックグラウンド値を提供する。１：１または１０：１のＮＰ．Ｂ−ｈｓｐ７１混合物で免疫したマウスからのエフェクター細胞を用いて、バックグラウンドを超える、ＣＴＬ活性の増強は、何も観察されなかった。非常に増強された溶解は、ＮＰ．Ｂペプチドおよびｈｓｐ７１の１００：１の混合物で免疫したマウスからのエフェクター細胞を用いて見出され、これはＮＰ．Ｂのようなペプチドと、ｈｓｐ７１のようなｈｓｐとの同時免疫は、ペプチドを提示する細胞に対してＣＴＬ活性を、強烈に刺激し得ることを実証する。当該分野において周知であるように、ＤＰＢＳ中のＮＰ．Ｂペプチド単独での免疫は、ＣＴＬ活性を刺激しないことに注目のこと。
【００９６】
実施例３：ＮＰペプチドとｈｓｐ７０との化学結合体を含む組成物に対するＣＴＬ応答
ａ．ｈｓｐ７０およびＮＰペプチドの調製
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｈｓｐ７１を、実施例１に記載のように調製した。ＮＰ．Ｂペプチドを、ペプチドが過剰のアミノ末端システイン残基を含み、従ってアミノ酸配列ＣＶＱＩＡＳＮＥＮＭＥＴＭ（配列番号２）を有した以外は、実施例２で議論したように合成した。
【００９７】
ｂ．ｈｓｐ７０およびジフテリアトキソイドへのＮｐ．Ｂペプチドの化学結合
結合を、ｈｓｐ７０、およびＣＴＬ活性特異的刺激の効力の比較のための標準を提供する、一般的に使用されるキャリアタンパク質ジフテリアトキソイド（ＤＴと省略する；ＤＴを商業的供給源から得た）の両方を用いて行った。
【００９８】
ｂ．１．Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｈｓｐ７１およびＤＴキャリアタンパク質の活性化
９ｍｇのｈｓｐ７１を、４．５ｍｌの０．１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した。スルホ−ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル）（１００μｌジメチルスルホキサミン中２．３ｍｇ）をタンパク質に添加し、そして反応混合物を、室温で１時間インキュベートした。次いで、ｐＨを６．０に調整し、そして反応混合物を、４℃で一晩、１リットルの２０ｍＭリン酸ナトリウムおよび１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ５．６）に対して透析した。ＤＴを同様に処理した。
【００９９】
ｂ．２．結合のためのＮＰ．Ｂペプチドの調製
各結合反応のために、３ｍｇのペプチドを、１００μｌの０．１Ｍβ−メルカプトエタノールに溶解した。ペプチドの還元を可能にする１時間のインキュベーション後、還元剤を、反応混合物をＳｐｅｅｄＶａｃ遠心分離器において乾燥することにより除去した。ペプチドを０．５ｍｌ蒸留水に再溶解し、これに１Ｎ ＮａＯＨの５μｌアリコートを、ペプチドが完全に溶解するまで添加した。ＤＴとの結合実験のために、６ｍｇのペプチドを還元し、次いで１ｍｌの水に再溶解した。
【０１００】
ｂ．３．結合体形成
活性化キャリアタンパク質溶液のｐＨを、０．１Ｎ ＮａＯＨを用いて６．８に調整した。３ｍｇの活性化キャリアタンパク質を含む溶液を、連続的に混合しながら室温で３時間、０．５ｍｌの還元されたペプチド溶液（または、ＤＴとの結合体の調製については１ｍｌの還元されたペプチド溶液）と反応させた。未反応ペプチドを除去するために、得られた結合体含有溶液を、４℃で一晩、１リットルの２０ｍＭリン酸ナトリウムおよび１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７）に対して透析した。タンパク質濃度をＢＣＡアッセイにより決定した。この手順により達成された結合効率は、放射性標識されたＮＰ．Ｂペプチドを用いる前予備実験（ｐｒｉｏｒ ｐｉｌｏｔ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）において決定した。ペプチド：タンパク質比は、ＮＰ．Ｂ−ｈｓｐ７１結合体（７１．ＮＰ）については１７．５、そしてＮＰ．Ｂ−ＤＴ（ＤＴ．ＮＰ）については１０．１であると見出された。
【０１０１】
ｃ．マウスの免疫化およびエフェクター細胞の調製
１〜１００μｇの７１．ＮＰおよびＤＴ．ＮＰ結合体での免疫化ならびにエフェクター細胞の調製を、実施例２に記載のように行った。
【０１０２】
ｄ．ＣＴＬ活性アッセイ
アッセイを実施例２に記載のように行った。
【０１０３】
結果
得られた結果を図２に示す。ＤＰＢＳまたは１もしくは１０μｇのＤＴ．ＮＰ結合体を注射したマウスに由来するエフェクター細胞を用いたＣＴＬ活性アッセイは、ネガティブな結果を与えた（図２の最も下の線）。１００μｇのＤＴ．ＮＰを注射したエフェクター細胞のみが、１μｇの７１．ＮＰで免疫化したマウスに由来するエフェクター細胞のＣＴＬ活性に匹敵する、測定可能な（エフェクター：標的細胞比１００で５〜１０％溶解）ＣＴＬ活性を生じた。１０または１００μｇの７１．ＮＰ結合体で免疫化したマウスに由来するエフェクター細胞を用いたアッセイは、実質的に、より大きなＣＴＬ活性（すなわち、エフェクター：標的細胞比１００で１５〜２５％の標的細胞溶解）を示した。この実験は、ＮＰ．Ｂペプチドおよびｈｓｐ７１の例について、ペプチド−ｈｓｐ結合体での免疫化が、このペプチドを提示する細胞に対して指向される特異的ＣＴＬ活性を刺激することを証明する。
【０１０４】
実施例４：ｈｓｐ−ＮＰ融合タンパク質を含む組成物に対するＣＴＬ応答
ａ．ｈｓｐ−ＮＰ融合タンパク質の調製
ａ．１．マイコバクテリアｈｓｐ６５カルボキシ末端にＮＰ ＣＴＬエピトープを含む融合タンパク質をコードする発現プラスミドの調製
ｈｓｐ６５融合タンパク質の一部として、Ｈ−２ｂ ＣＴＬエピトープＮＰ．Ｂ（上記を参照のこと）またはＨ−２ｄ ＣＴＬエピトープＮＰ．Ｄ（ＮＰの残基１４７〜１５５；Ｌｅｖｉ，Ｒ．およびＡｒｎｏｎ，Ｒ．，Ｖａｃｃｉｎｅｓ，１４：８５−９２（１９９６）ならびに本明細書中の参考文献）を含むインフルエンザウイルスＮＰ配列を発現するプラスミドを構築した。
【０１０５】
ｐＥＴ系プラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ）に由来し、そして完全Ｍ．ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ ｈｓｐ６５遺伝子およびｈｓｐ６５遺伝子のカルボキシ末端でのさらなるコード配列の挿入に有用な制限部位を含む、発現ベクターｐＥＴ６５ｍｐを、予め構築した。このベクターの模式図を図３に提供する。
【０１０６】
プラスミドｐｃＤＮＡ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により提供されるサイトメガロウイルスプロモーターの制御下でインフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４株のＮＰのオープンリーディングフレームを含む構築物ｐＮＰ／ｃＡを、Ｐｅｔｅｒ Ｐａｌｅｓｅ博士（Ｄｅｐｔ．Ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｏｕｎｔ Ｓｉｎａｉ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）から得た。
【０１０７】
ＮＰ．ＢおよびＮＰ．Ｄエピトープを含むフラグメントの増幅のための２つのプライマー対を、自動化オリゴヌクレオチド合成機において合成し、そして日常的な手順を用いて精製した。正方向プライマーは、ＮＰ配列に相補的な適切な配列に加えてＥｃｏＲＩ制限部位を含み、そして逆方向プライマーはＳｐｅＩ制限部位を含んでいた。ＮＰ．Ｄフラグメントについての正方向プライマーは、配列５’ＡＡＡＧＡＡＧＡＡＴＴＣＡＧＧＣＧＡＡＴＣ（配列番号３）を有し、そして逆方向プライマーは、配列５’ＧＴＴＣＣＧＡＴＣＡＣＴＡＧＴＣＣＣＡＣＧ（配列番号４）を有した。この対は、ＮＰ残基１１７〜２００を含むフラグメントを増幅するように設計された。ＮＰ．Ｂフラグメントについての正方向プライマーは、配列５’ＣＴＧＣＴＴＧＡＡＴＴＣＡＧＣＣＡＡＧＴＧ（配列番号５）を有し、そして逆方向プライマーは、配列５’ＣＴＧＴＴＧＡＣＴＡＧＴＧＴＴＴＣＣＴＣＣ（配列番号６）を有した。後者の対は、ＮＰ残基３１０〜３９５を含むフラグメントを生成するように設計された。
【０１０８】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、上記のプライマー対およびＤＮＡテンプレートとしてｐＮＰ／ｃＡを用いて行った。ＰＣＲフラグメントを、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＳｐｅＩで２重消化し、そして日常的なサブクローニング手順（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９））を用いてＥｃｏＲＩ／ＳｐｅＩ切断ｐＥＴ６５ｍｐに連結した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α株の形質転換コンピテント細胞を連結混合物で形質転換し、そして１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む寒天にプレートした。形質転換された細胞のコロニーを単離し、そしてプラスミドＤＮＡを調製し、そして制限地図作成およびヌクレオチド配列決定により適切なｈｓｐ６５−ＮＰ．ＢまたはＤ融合遺伝子配列の存在について分析した。ｈｓｐ６５−ＮＰ．Ｂ（ｐＥＴ６５ｍｐ／Ｂ）およびｈｓｐ６５−ＮＰ．Ｄ（ｐＥＴ６５ｍｐ／Ｄ）融合タンパク質をコードする適切な構築物を同定し、そして細菌における融合タンパク質の発現およびそれらの精製がねらいの後の操作において使用した。融合タンパク質遺伝子構築物（それぞれ、ｐＥＴ６５ＭＰ／ＮＰ−ＢおよびｐＥＴ６５ＭＰ／ＮＰ−Ｄ）の模式図については図４Ａ〜４Ｂを参照のこと。
【０１０９】
ａ．２．ｈｓｐ６５−ＮＰ融合タンパク質の発現および精製
融合タンパク質構築物をＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１株（ＤＥ３；Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換し、そして融合タンパク質を、供給者の示唆したプロトコルに密接に類似したプロトコルを用いて、後者の株の６リットル培養物において発現させた。細胞を遠心分離により採集し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、および５ｍＭ β−メルカプトエタノール（ｐＨ７．５）に懸濁し、そして超音波処理により溶解した。不溶性物質を遠心分離により除去した後、硫酸アンモニウムを２０％飽和まで添加し、そして沈殿タンパク質を遠心分離により収集した。硫酸アンモニウムペレット中の融合タンパク質の存在を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてクマシーブルー染色により確認した。同じアッセイを使用して、後の全ての精製工程をモニターした。タンパク質を、３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、および５ｍＭ β−メルカプトエタノール（ｐＨ７．５）に再溶解し、そして溶液を、同じ緩衝液中で平衡化されたＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ファーストフロー（ｆａｓｔ ｆｌｏｗ）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）カラムに適用する前に、同じ緩衝液に対して徹底的に透析した。フロースルー画分（非結合タンパク質）を収集し、これは代表的に約９０ｍｇのタンパク質を含んでいた。ｈｓｐ６５−ＮＰ．Ｂ融合タンパク質をさらに精製するために、６０ｍｇの後者の画分を、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）に対して透析し、次いで、同じ緩衝液中で平衡化されたヒドロキシアパタイト（ＢＩＯＲＡＤ）カラムに適用した。溶出を、０〜６００ｍＭリン酸カリウム勾配を用いて行った。この手順は、約５ｍｇのタンパク質の回収しかもたらさなかった。次いで、カラムを４Ｍ 塩酸グアニジンでさらに溶出し、これによりさらに１５ｍｇのタンパク質が取り出された。この画分をＤＰＢＳに対して透析し、そしてフロースルー発熱物質除去（ｄｅｐｙｒｏｇｅｎａｔｉｏｎ）のためにＤｅｔｏｘｉｅｌカラムに適用する前に、Ａｍｉｃｏｎ限外濾過デバイスを用いて濃縮した。ｈｓｐ６５−ＮＰ．Ｄ融合タンパク質をさらに精製するために、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅフロースルー画分を、３０ｍＭ酢酸ナトリウム、２ｍＭ ＥＤＴＡ、および５ｍＭ β−メルカプトエタノール（ｐＨ５．８〜７．５）に対して透析し、次いで、同じ緩衝液中で平衡化されたＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ファーストフロー、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）カラムに適用した。溶出は、０〜６００ｍＭ ＮａＣｌ勾配を用いた。溶出されたｈｓｐ６５−ＮＰ．Ｄ融合タンパク質を、ｈｓｐ６５−ＮＰ．Ｂ融合タンパク質について記載されたように処理した。これらの手順により精製された融合タンパク質は、染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから評価されたように９０％を超えて純粋であり、そして実質的に発熱物質を含まなかった。
【０１１０】
ｂ．マウスの免疫化およびエフェクター細胞の調製
Ｃ５７ＢＬ／６マウスをｈｓｐ６５−ＮＰ．Ｂを用いた実験において使用し、そしてＢＡＬＢ／ｃマウスをｈｓｐ６５−ＮＰ．Ｄを用いた実験において使用したことを除いて、ＤＰＢＳ（図５および６において０μｇ ６５−ＮＰと呼ぶ）または１〜１００μｇのｈｓｐ６５−ＮＰ．Ｂもしくはｈｓｐ６５−ＮＰ．Ｄ融合タンパク質を用いた免疫化、ならびにエフェクター細胞の調製を、本質的に実施例２に記載のように行った。インビトロ再刺激を、（一般的に、Ｔ細胞増殖を刺激するために）３Ｕ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−２の非存在下または存在下のいずれかで７日間の期間にわたって行った。
【０１１１】
ｃ．ＣＴＬアッセイ
ＥＬ４（Ｈ−２ｂ）標的細胞をｈｓｐ６５−ＮＰ．Ｂ融合タンパク質を用いた実験において使用し、そしてＰ８１５（Ｈ−２ｄ）標的細胞をｈｓｐ６５−ＮＰ．Ｄ融合タンパク質を用いた実験に使用したことを除いて、アッセイを本質的に実施例２に記載のように行った。ＣＴＬ応答の特異性についてのさらなるコントロールを提供するために、標的細胞を、適切なＮＰペプチドでパルスしたか（図５Ａ〜５Ｂおよび図６Ａ〜６Ｂの黒記号）、ＨＰＶ１６Ｅ７タンパク質の配列に由来する無関係な残基４９〜５７ペプチドでパルスしたか（図５Ａ〜５Ｂの白記号）、またはパルスしなかった（図６Ａ〜６Ｂの白記号）。
【０１１２】
ｈｓｐ６５−ＮＰ．Ｂ融合タンパク質（６５−Ｐ．ｂと標識された）を用いた実験の結果を、図５Ａ〜５Ｂに示す。図５Ａは、エフェクター細胞をＩＬ２の非存在下で再刺激した実験を指し、そして図５Ｂは、エフェクター細胞をＩＬ２の存在下で再刺激した実験を指す。図５Ａから明らかなように、ｈｓｐ６５−ＮＰ．Ｂ融合タンパク質を用いた免疫化は、エフェクター：標的細胞比１００で標的細胞の約２０〜４０％溶解の範囲にわたる、ＮＰ．Ｂペプチドを提示する標的細胞に対して指向される特異的ＣＴＬ活性の劇的な刺激をもたらす。本質的に、特異的な溶解は、ＤＰＢＳ「免疫化」動物に由来するエフェクター細胞で観察されなかった。また、Ｅ７ペプチドでパルスされた細胞の有意な溶解は明らかでなかった。ＩＬ２の存在下で再刺激されたエフェクター細胞を用いる実験において、さらにより高いレベルの標的細胞溶解が、ｈｓｐ６５−ＮＰ．Ｂ融合タンパク質免疫化マウスに由来するエフェクター細胞で観察された。レベルは、融合タンパク質用量に依存して、エフェクター：標的細胞比１００で約２５〜６０％の範囲にわたった。これらの値は、ＤＰＢＳ注射マウスに由来するエフェクター細胞で観察された１０〜１５％溶解を大いに越えた。さらに、Ｅ７ペプチドでパルスされた標的細胞の有意な（ＤＰＢＳ「免疫化」マウスに由来するエフェクター細胞で観察された特異的溶解より大きな）特異的溶解は観察されなかった。
【０１１３】
ｈｓｐ６５−ＮＰ．Ｄ融合タンパク質（６５−ＮＰ．Ｄと標識された）を用いた実験の結果を、図６Ａ〜６Ｂに示す。一般的に、これらの結果は、ｈｓｐ６５−ＮＰ．Ｂ融合タンパク質を用いた実験において得られた結果に類似する。ｈｓｐ６５−ＮＰ．Ｂを用いた以前の実験とは異なり、免疫化に使用されたｈｓｐ６５−ＮＰ．Ｄペプチドの用量への明らかな依存がこの実験において観察されたことに留意のこと。全体として、例としてｈｓｐ６５−ＮＰ融合タンパク質を使用するこれらの実験は、ｈｓｐ外来ペプチド／ポリペプチド融合タンパク質を用いる免疫化が、外来ペプチド／ポリペプチド融合パートナーに含まれるエピトープを提示する適切な標的細胞に対して指向されるＣＴＬ活性の激烈な刺激をもたらすことを証明する。
【０１１４】
実施例５．ｈｓｐ−Ｐ１Ａ融合タンパク質に対するＣＴＬ応答
上記の実施例において使用された手順に類似した手順を用いて、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓストレスタンパク質ｈｓｐ７１の完全コード配列、およびｈｓｐ７１配列のカルボキシ末端に付加された、腫瘍関連抗原Ｐ１Ａの最小ＣＴＬエピトープ（ＬＰＹＬＧＷＬＶＰ（配列番号７）；この配列を本実施例においてＰ１Ａと呼ぶ）をコードする合成配列の４つのタンデムに配置されたコピーを含む融合遺伝子のＥ．ｃｏｌｉにおける発現を可能にする、プラスミドを構築した。Ｈｓｐ７１−Ｐ１Ａ融合タンパク質（図７Ａ、７Ｂ、８Ａ、８Ｂ、および９において７１−Ｐ１Ａ（４）と呼ぶ）を発現させ、そして上記の実施例において使用された方法に類似した標準的な生化学的方法を用いて精製した。
【０１１５】
ＢＡＬＢ／ｃまたはＤＢＡ／２（Ｈ−２ｄ）マウスを、塩酸ケタミンの腹腔内注射により麻酔した。次いで、マウスを、０、５、５０、または５００μｇのｈｓｐ７１−Ｐ１Ａ融合タンパク質を用いて首の項部に皮下免疫化した。免疫原を、アジュバントを伴わずにＤＰＢＳ中で投与した。１週間後、１群あたり４つのプールされた脾臓に由来する単細胞懸濁物を調製し、そして合成ペプチドＣＫＫＫＬＰＹＬＧＷＬＶＰ（配列番号８）（１μＭ）を用いて７日間インビトロで再刺激した。ＣＫＫＫ残基はＰ１Ａ ９量体の水性溶解度（ａｑｕｅｏｕｓ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）を増強するために添加されたことに留意のこと。次いで、再刺激されたエフェクター細胞を、５１Ｃｒ標識標的細胞と共に４〜５時間培養した。標的は、エフェクター：標的比１００、３３、または１１：１で、Ｐ８１５肥満細胞腫のＰ１Ａ抗原発現クローンＰ１（Ｈ−２ｄ）細胞、または（ＣＫＫＫ）Ｐ１ＡでパルスされたＬ１２１０細胞（Ｈ−２ｄ）、あるいはコントロール標的としてのパルスされていないＬ１２１０細胞であった。標的細胞の特異的溶解を、実施例２に記載のように決定した。これらの実験の結果を、図７Ａ〜７Ｂ（ＢＡＬＢ／ｃマウス）および図８Ａ〜８Ｂ（ＤＢＡ／２マウス）に示す。これらの実験におけるバックグラウンド溶解は、無関係な標的細胞（パルスされていないＬ１２１０細胞）に対して観察された溶解活性により示されるように、５％未満であった。非免疫化マウス（０μｇ）に由来する再刺激細胞は、Ｐ１標的細胞（図７Ａ、８Ａ）に対してもＣＫＫＫ（Ｐ１Ａ）パルスＬ１２１０細胞（図７Ｂ、８Ｂ）に対しても溶解活性を示さなかった。５μｇほどの少ないｈｓｐ７１−Ｐ１Ａ融合タンパク質で免疫化したマウスに由来する細胞は、測定可能な溶解活性を示し、最大応答は、５０〜５００μｇで免疫化したマウスに由来する細胞において見られた。
【０１１６】
実施例６：ｈｓｐ７１−Ｐ１Ａ融合タンパク質で免疫化したマウスの腫瘍抗原投与
３回の注射を２週間間隔で与えた以外は、マウスを上記の実施例のように免疫化した。最後の注射の２週間後、１０００個の生存可能なＰ１腫瘍細胞の腹腔内注射により、マウスに抗原投与した。２６日後、マウスを安楽死させ、秤量し、そして腹部内容物の全ての塊を解剖し、そして秤量した。この実験の結果を図９に示す。ｈｓｐ７１−Ｐ１Ａ融合タンパク質を用いた３回の５０μｇ免疫化を与えたマウスでは、総体重のパーセントとして表される腹部内容物の質量は、非免疫化マウス（０μｇ、Ｐ＜０．０３）において見出された質量より有意に少なく、そして腫瘍細胞を注射しなかったマウス（コントロール）において観察された質量と同様であったことが観察された。
【０１１７】
全体として、実施例５および６における実験は、例としてｈｓｐ７１−Ｐ１Ａを用いた、ｈｓｐ−腫瘍関連抗原を用いた免疫化が、無関係なＭＨＣクラスＩ拘束エピトープを提示する細胞に対して指向されるＣＴＬ活性の実質的な刺激をもたらすことを証明する。さらに、このような免疫化は、関連したエフェクター機能の発現、すなわち免疫化された抗原を発現する腫瘍を用いた抗原投与に対する免疫を導く。
【０１１８】
等価物
当業者は、本明細書中に記載された本発明の特定の実施態様に対する多くの等価物がわかるか、または単に日常的実験を用いてこれらを確かめ得る。これらおよび他の全ての等価物は、以下の請求の範囲に含まれることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】図１は、エフェクター：標的比対％特異的細胞溶解のグラフであり、核タンパク質（ＮＰ）ペプチドおよび熱ショックタンパク質７０（ｈｓｐ７０）を含む混合物に対するマウスにおける細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答を示す。
【図２】図２は、エフェクター：標的比対％特異的細胞溶解のグラフであり、ＮＰペプチドおよびｈｓｐ７０の化学結合体を含む組成物に対するマウスにおけるＣＴＬ応答を示す。
【図３】図３は、ベクターｐＥＴ６５ＭＰの模式図である。
【図４Ａ】図４Ａは、ベクターｐＥＴ６５ＭＰ／ＮＰ−Ｂの模式図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ベクターｐＥＴ６５ＭＰ／ＮＰ−Ｄの模式図である。
【図５】図５Ａ〜５Ｂは、エフェクター：標的比対％特異的細胞溶解のグラフであり、ｈｓｐ−ＮＰ融合タンパク質のｈｓｐ６５−ＮＰ．Ｂに対するマウスにおけるＣＴＬ応答を示し、ここでエフェクター細胞をＩＬ−２の不在下（図５Ａ）およびＩＬ−２の存在下（図５Ｂ）において再刺激した。
【図６】図６Ａ〜６Ｂは、エフェクター：標的比対％特異的細胞溶解のグラフであり、ｈｓｐ−ＮＰ融合タンパク質のｈｓｐ６５−ＮＰ．Ｄに対するマウスにおけるＣＴＬ応答を示し、ここでエフェクター細胞をＩＬ−２の不在下（図６Ａ）およびＩＬ−２の存在下（図６Ｂ）において再刺激した。
【図７】図７Ａ〜７Ｂは、エフェクター：標的比対％特異的細胞溶解のグラフであり、ｈｓｐ−Ｐ１Ａ融合タンパク質で免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＣＴＬ応答を示す。
【図８】図８Ａ〜８Ｂは、エフェクター：標的比対％特異的細胞溶解のグラフであり、ｈｓｐ−Ｐ１Ａ融合タンパク質で免疫したＤＢＡ／２（Ｈ−２ｄ）マウスにおけるＣＴＬ応答を示す。
【図９】図９は、ｈｓｐ−腫瘍関連抗原のｈｓｐ７１−Ｐ１Ａでの免疫が、関連のＭＨＣクラス１拘束されたエピトープを提示する細胞に対するＣＴＬ活性の刺激を生じることを示す棒グラフである。
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、１９９６年１１月２６日に出願された米国特許出願第０８／７５６，６２１号の一部継続出願であり、その全体の教示は参考として本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
インフルエンザを引き起こすウイルスは、インフルエンザＡ、Ｂ、およびＣ型として任意に命名されている。これらの型は、抗原的に異なるウイルスを定義する。各型は、いくつかの異なるサブタイプを有する。１つの型内のウイルスは、２つの異なるサブタイプで感染した細胞が、両方のサブタイプからの成分を含む混合されたウイルスを組み立て得る意味で、遺伝的に適合可能である。インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルスとして分類される。ウイルスは、８０と１２０ｎｍの間の直径の粒子を形成する。インフルエンザウイルスは、エンベロープを有するウイルスであり、すなわち、その外表面は宿主細胞膜に由来する。２つの主要なウイルスがコードするタンパク質、ヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）は、エンベロープに挿入されそして突出する。インフルエンザウイルスは、非メッセンジャーＲＮＡ極性の８ＲＮＡセグメントから構成されるゲノムを含む、マイナス鎖ＲＮＡウイルスである。ゲノムＲＮＡセグメントは、ウイルスがコードする核タンパク質（ＮＰ）とともにＲＮＰ複合体に組み立てられる。宿主細胞の感染後、ゲノムＲＮＡセグメントは、第１に、ゲノムＲＮＡを産生するために後に逆転写されるメッセンジャーＲＮＡ極性を有するＲＮＡに転写される。これらの工程に寄与し得る転写酵素活性は、校正能力を欠く。したがって、転写および逆転写中に作成される誤りは修復されず、ウイルスゲノムの高頻度の変異を生じる。すべてのウイルス遺伝子は同じ変異プロセスを受けるが、外部タンパク質ＨＡおよびＮＡについての遺伝子は、その宿主において免疫検出を逃れる変異形態へ進化させる強い選択プロセスを特に受ける。宿主には、ヒトだけでなく、ニワトリ、七面鳥、ブタ、およびウマのような動物も含まれる。
【０００３】
インフルエンザは、伝統的に、ヒトの死亡の主要な原因の１つである。インフルエンザの臨床的徴候は、無症候から致死的感染までの範囲で可変である。代表的には、病気の開始は、急速および衰弱性であり、そしてほとんど変わらずに咳、不快、頭痛、および筋痛を伴う。鼻感冒、咽喉炎、および普通ほとんどない胸骨下痛もまた、感染の一次部位が呼吸器系であることを示す。しかし、代表的には、発熱および全身症状が優勢である。代表的には、回復は急速である。病気の重篤度は、非常に宿主依存的であり、そして年齢、生理学的状態、および感染または免疫接種による前免疫接種に関連する。重篤な合併症は肺炎である。易感染性の個体は、肺炎を引き起こす細菌病原体での二次感染を受けることが証明されている。インフルエンザ後に死亡するほとんどの患者は、細菌性肺炎で死亡する。インフルエンザウイルスＡおよびＢ型でのマイナーな抗原変更は毎年起こり、地域的流行を引き起こす。このような毎年の流行からの毎年の死亡率は、米国単独において２０，０００に近づき得る。１０年と３０年との間の可変間隔で、全世界的流行病は、毎年の流行をはるかに越える死亡者数を生じる。これらの流行病は、おそらく、ヒトおよび動物インフルエンザＡウイルスからの成分の遺伝子再取り合わせによって引き起こされ、ヒト実験とは全体的に全く別の表面構造を有する新しいウイルスを生じる。１９１８〜１９年の流行病の死亡者数は、約５００，０００のアメリカ人を殺した。（一般的参考文献として：Ｊｏｓｈｕａ Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２（Ｄ−Ｌ）：５０５−５２０，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ ９２１０１ （１９９２））。
【０００４】
現在認可されたワクチンは、不活性化した精製されたウイルスを含む。ワクチンは、三価であり、そして２つの普及したＡサブタイプ、Ｈ３Ｎ２およびＨ１Ｎｉの代表的株、ならびに単一のＢ型株を含む。弱毒化生ウイルスワクチンはまた、特に旧ソビエト連邦において、いくらかの成功をともなって使用されてきた。ＨＡおよびＮＡを含むサブユニットワクチンが開発されている（ｓｐｌｉｔ ｆｌｕワクチン；Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ Ｌａｂ．）。これらのワクチンは、防御免疫を提供することに完全には効果的ではない。一般的に、インフルエンザワクチンが、主としてウイルス表面タンパク質ＨＡおよびＮＡに対する抗体応答を誘導することによって、防御免疫を生じると認められている。これは、ワクチンが単に完全に効果的ではない理由を説明し得；これは、これらの表面タンパク質における連続的抗原変更を受けやすい。
【０００５】
腫瘍細胞と正常細胞との間の差についての検索は、多くのいわゆる腫瘍関連抗原の単離および特徴づけを導いている（非特許文献１）。これらの抗原は、十分に分化した細胞において、必ずしもすべてではなくまたは少なくとも大量でもなく、腫瘍細胞によって発現される。これらの腫瘍抗原をコードする配列は、ウイルス由来であるか、または宿主のゲノムに正常に存在するかのいずれかである。ウイルス由来腫瘍関連抗原の例は、ほとんどのヒト頸部腫瘍に存在するヒトパピローマウイルストランスフォーミングタンパク質Ｅ７である。代表的な宿主ゲノム由来の腫瘍関連抗原は、ｇｐ１００であり、これはｐＭｅｌ−１７ともいい、多くのヒト黒色腫で発現される。腫瘍関連抗原は、宿主免疫応答を誘導することが公知であるが、応答は、代表的には、治療に効果的であるには不十分である。この応答を刺激するためにアプローチの必要がある。
【０００６】
単特異的細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）クローンを使用して、少なくとも５つの腫瘍関連抗原（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥと命名される）の発現は、マウスＰ８１５肥満細胞腫腫瘍細胞において同定されている。Ｐ１Ａと命名されたこれらの抗原の１つは、ＣＴＬクローンによって認識される単一エピトープを発現する。分子アプローチを使用して、Ｐ１Ａの遺伝子をクローニングし、そして正常細胞に存在する非変異遺伝子であるが形質転換された細胞でのみ転写されそして翻訳されることを見いだした（非特許文献２）。さらに、Ｐ１Ａ抗原発現をなくしたＰ８１５細胞の改変体の実験によって、Ｐ１ＡのＭＨＣクラスＩ（Ｌｄ）−制限した最小ＣＴＬエピトープの配列を同定することが可能であった（非特許文献３）。
【非特許文献１】Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ａ．およびＦｉｎｎ，Ｏ．Ｊ．，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９６）６２：２１７−２５６
【非特許文献２】Ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｙｎｄｅら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９１），１７３：１３７３
【非特許文献３】Ｌｅｔｈｅら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２），２２：２２８３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、ウイルスおよび腫瘍に関連する抗原に対する、より効果的なワクチンについての必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の要旨
本発明は、哺乳動物において抗原に対する細胞媒介する細胞溶解性免疫応答（細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答）を誘導するためのワクチンに関し、これは、抗原、および、ストレスタンパク質（または熱ショックタンパク質（ｈｓｐ））のすべてもしくは一部、または抗原に対する免疫応答を誘導するためにストレスタンパク質のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質のすべてもしくは一部を含む。１つの実施態様では、抗原は、インフルエンザウイルスの抗原である。他の実施態様では、抗原は、腫瘍関連抗原である。本発明における使用のためのストレスタンパク質は、例えば、マイコバクテリアストレスタンパク質（例えば、ｈｓｐ６５、ｈｓｐ７１）または投与される哺乳動物において抗原に対する免疫応答を誘導するためにマイコバクテリアストレスタンパク質のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質であり得る。本発明のワクチンの抗原およびストレスタンパク質は、化学結合によってまたは融合タンパク質として連結され得る。哺乳動物において抗原に対する細胞媒介性の細胞溶解性免疫応答を誘導するためのワクチンはまた、哺乳動物において抗原およびストレスタンパク質配列をコードしその発現を指示するポリヌクレオチドを含み得る。ポリヌクレオチドは、融合タンパク質として抗原およびストレスタンパク質を発現し得る。
【０００９】
本発明はまた、哺乳動物においてインフルエンザウイルスに対する細胞媒介する細胞溶解性免疫応答を誘導するためのワクチンに関し、これは、インフルエンザウイルスの抗原、およびストレスタンパク質のすべてもしくは一部、または抗原に対する免疫応答を誘導するためにストレスタンパク質のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質のすべてもしくは一部を含む。１つの実施態様では、本発明は、哺乳動物においてインフルエンザウイルスの抗原に対する細胞媒介する細胞溶解性免疫応答を誘導するためのワクチンに関し、これは、哺乳動物においてインフルエンザウイルスの抗原およびストレスタンパク質の発現を指示するポリヌクレオチドを含む。本発明で使用され得るインフルエンザウイルスの抗原には、例えば、ヘマグルチニン、核タンパク質、ノイラミニダーゼ、Ｍ１、Ｍ２、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、およびその組み合わせが含まれる。
【００１０】
１つの実施態様では、哺乳動物においてインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導するためのワクチンは、ストレスタンパク質のすべてもしくは一部、または抗原に対する免疫応答を誘導するためにストレスタンパク質のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質のすべてもしくは一部に結合した、インフルエンザウイルスの抗原である。
【００１１】
他の実施態様では、哺乳動物においてインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導するためのワクチンは、ストレスタンパク質のすべてもしくは一部、または抗原に対する免疫応答を誘導するためにストレスタンパク質のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質のすべてもしくは一部に融合した、インフルエンザウイルスの抗原を含む組換え融合タンパク質である。
【００１２】
本発明はまた、ストレスタンパク質およびインフルエンザウイルスの抗原を含む組成物に関する。１つの実施態様では、組成物は、インフルエンザウイルスの抗原に連結されたストレスタンパク質を含む結合体である。他の実施態様では、組成物は、インフルエンザウイルスの抗原に融合されたストレスタンパク質を含む融合タンパク質（ｐＥＴ６５ＭＰ／ＮＰ−ＢおよびｐＥＴ６５Ｍ／ＮＰ−Ｄ）である。
【００１３】
本発明はまた、哺乳動物においてインフルエンザウイルスを予防または処置するための組成物の使用に関する。
【００１４】
本発明はまた、哺乳動物において腫瘍関連抗原に対する細胞媒介する細胞溶解性免疫応答を誘導するためのワクチンに関し、このワクチンは、ストレスタンパク質のすべてもしくは一部、または抗原に対する免疫応答を誘導するためにストレスタンパク質のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質のすべてもしくは一部に連結した腫瘍関連抗原を含む。本発明で使用され得る抗原は、当該技術分野で現在公知のものを含む任意の哺乳動物の腫瘍関連抗原を含む。ＣＴＬエピトープを含むこれらの抗原のフラグメントをも含む。
【００１５】
１つの実施態様では、哺乳動物において腫瘍関連抗原に対する細胞媒介する細胞溶解性免疫応答を誘導するためのワクチンは、ストレスタンパク質のすべてもしくは一部、または抗原に対する免疫応答を誘導するためにストレスタンパク質のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質のすべてもしくは一部に化学的に結合した腫瘍関連抗原である。
【００１６】
他の実施態様では、哺乳動物において腫瘍関連抗原に対する細胞媒介する細胞溶解性免疫応答を誘導するためのワクチンは、腫瘍関連抗原、および、ストレスタンパク質のすべてもしくは一部、または抗原に対する免疫応答を誘導するためにストレスタンパク質のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質のすべてもしくは一部を含む組換え融合タンパク質である。
【００１７】
さらなる実施態様では、哺乳動物において腫瘍関連抗原に対する細胞媒介する細胞溶解性免疫応答を誘導するためのワクチンは、腫瘍関連抗原、およびストレスタンパク質のすべてもしくは一部、または抗原に対する免疫応答を誘導するためにストレスタンパク質のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質のすべてもしくは一部をコードする配列を発現可能形態で含むポリヌクレオチドである。
【００１８】
さらに他の実施態様では、哺乳動物において腫瘍関連抗原に対する細胞媒介する細胞溶解性免疫応答を誘導するためのワクチンはまた、腫瘍関連抗原、およびストレスタンパク質のすべてもしくは一部、または抗原に対する免疫応答を誘導するためにストレスタンパク質のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質のすべてもしくは一部を含む組換え融合タンパク質をポリヌクレオチドであり得る。
【００１９】
本発明はまた、哺乳動物において天然または人工的抗原（アレルゲン）に対するアレルギー性免疫応答を抑制するためのワクチンに関し、このワクチンは、アレルゲン、およびストレスタンパク質のすべてもしくは一部、またはアレルギー応答を抑制するためにストレスタンパク質のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質のすべてもしくは一部を含む。ペプチド性であるかどうかにかかわりなく、任意のアレルゲンが使用され得る。
【００２０】
１つの実施態様では、哺乳動物において天然または人工的抗原（アレルゲン）に対するアレルギー性免疫応答を抑制するためのワクチンは、ストレスタンパク質のすべてもしくは一部、またはアレルギー応答を抑制するためにストレスタンパク質のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質のすべてもしくは一部に化学的に結合したアレルゲンである。
【００２１】
他の実施態様では、哺乳動物において天然または人工的抗原（アレルゲン）に対するアレルギー性免疫応答を抑制するためのワクチンは、アレルゲン、およびストレスタンパク質のすべてもしくは一部、またはアレルギー応答を抑制するためにストレスタンパク質のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質のすべてもしくは一部を含む組換え融合タンパク質である。
【００２２】
さらなる実施態様では、哺乳動物において天然または人工的抗原（アレルゲン）に対するアレルギー性免疫応答を抑制するためのワクチンは、ペプチド性アレルゲン、およびストレスタンパク質のすべてもしくは一部、またはアレルギー応答を抑制するためにストレスタンパク質のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質のすべてもしくは一部をコードする配列を発現可能形態で含むポリヌクレオチドである。
【００２３】
さらに他の実施態様では、哺乳動物において天然または人工的抗原（アレルゲン）に対するアレルギー性免疫応答を抑制するためのワクチンはまた、ペプチド性アレルゲン、およびストレスタンパク質のすべてもしくは一部、またはアレルギー応答を抑制するためにストレスタンパク質のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質のすべてもしくは一部を含む組換え融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドである。
【００２４】
本発明はまた、哺乳動物において抗原に対するＴｈ２応答を抑制するための組成物に関し、これは、抗原、およびストレスタンパク質のすべてもしくは一部、または抗原に対するＴｈ２応答を抑制するためにストレスタンパク質のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質のすべてもしくは一部を含む。この組成物は、ワクチン、結合体、または融合タンパク質であり得る。
・本発明はさらに、以下を提供し得る：
・（項目１） 哺乳動物において抗原に対する細胞媒介細胞溶解性免疫応答を誘導するためのワクチンであって、上記抗原、およびストレスタンパク質の全てもしくは一部、または上記抗原に対する免疫応答を誘導するのに上記ストレスタンパク質のアミノ酸配列に対して十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質の全てもしくは一部を含む、ワクチン。
・（項目２） 項目１に記載のワクチンであって、ストレスタンパク質が、マイコバクテリアストレスタンパク質、または上記ワクチンが投与される上記哺乳動物において上記抗原に対する免疫応答を誘導するのに上記マイコバクテリアストレスタンパク質のアミノ酸配列に対して十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質である、ワクチン。
・（項目３） 上記ストレスタンパク質が、ｈｓｐ６５およびｈｓｐ７１からなる群より選択される、項目１に記載のワクチン。
・（項目４） 上記抗原および上記ストレスタンパク質が化学結合により連結される、項目１に記載のワクチン。
・（項目５） 上記抗原および上記ストレスタンパク質が融合タンパク質として連結される、項目１に記載のワクチン。
・（項目６） 哺乳動物において抗原に対する細胞媒介細胞溶解性免疫応答を誘導するためのワクチンであって、上記哺乳動物において抗原およびストレスタンパク質配列をコードし、そして上記抗原および上記ストレスタンパク質配列の発現を指向するポリヌクレオチドを含む、ワクチン。
・（項目７） 上記抗原および上記ストレスタンパク質が融合タンパク質として発現される、項目６に記載のワクチン。
・（項目８） 項目６に記載のワクチンであって、上記ストレスタンパク質配列が、マイコバクテリアストレスタンパク質、または上記ワクチンが投与される上記哺乳動物において上記抗原に対する免疫応答を誘導するのに上記マイコバクテリアストレスタンパク質のアミノ酸配列に対して十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質に由来する、ワクチン。
・（項目９） 上記ストレスタンパク質が、ｈｓｐ６５およびｈｓｐ７１からなる群より選択される、項目６に記載のワクチン。
・（項目１０） 哺乳動物においてインフルエンザウイルスの抗原に対する細胞媒介細胞溶解性免疫応答を誘導するためのワクチンであって、上記インフルエンザウイルスの抗原およびストレスタンパク質の上記哺乳動物における発現を指向するポリヌクレオチドを含む、ワクチン。
・（項目１１） 項目１０に記載のワクチンであって、上記ストレスタンパク質が、マイコバクテリアストレスタンパク質、または上記ワクチンが投与される上記哺乳動物において上記抗原に対する免疫応答を誘導するのに上記マイコバクテリアストレスタンパク質のアミノ酸配列に対して十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質である、ワクチン。
・（項目１２） 上記ストレスタンパク質配列が、ｈｓｐ６５およびｈｓｐ７１からなる群より選択される、項目１０に記載のワクチン。
・（項目１３） 哺乳動物においてインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導するためのワクチンであって、上記インフルエンザウイルスの抗原、およびストレスタンパク質の全てもしくは一部、または上記抗原に対する免疫応答を誘導するのに上記ストレスタンパク質のアミノ酸配列に対して十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質の全てもしくは一部を含む、ワクチン。
・（項目１４） 項目１３に記載のワクチンであって、上記ストレスタンパク質配列が、マイコバクテリアストレスタンパク質、または上記ワクチンが投与される上記哺乳動物において上記抗原に対する免疫応答を誘導するのに上記マイコバクテリアストレスタンパク質のアミノ酸配列に対して十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質である、ワクチン。
・（項目１５） 上記インフルエンザの抗原が、赤血球凝集素、核タンパク質、ノイラミニダーゼ、Ｍ１、Ｍ２、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、およびその組み合わせからなる群より選択される、項目１３に記載のワクチン。
・（項目１６） 上記免疫応答が細胞溶解性Ｔ細胞応答である、項目１３に記載のワクチン。
・（項目１７） 上記ストレスタンパク質が、ｈｓｐ６５およびｈｓｐ７１からなる群より選択される、項目１３に記載のワクチン。
・（項目１８） 哺乳動物においてインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導するワクチンであって、ストレスタンパク質の全てもしくは一部、または上記抗原に対する免疫応答を誘導するのに上記ストレスタンパク質のアミノ酸配列に対して十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質の全てもしくは一部に結合された上記インフルエンザウイルスの抗原を含む、ワクチン。
・（項目１９） 項目１８に記載のワクチンであって、上記ストレスタンパク質が、マイコバクテリアストレスタンパク質、または上記ワクチンが投与される個体において免疫応答を誘導するのに上記マイコバクテリアストレスタンパク質のアミノ酸配列に対して十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質である、ワクチン。
・（項目２０） 上記インフルエンザウイルスの抗原が、赤血球凝集素、核タンパク質、ノイラミニダーゼ、Ｍ１、Ｍ２、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、およびその組み合わせからなる群より選択される、項目１８に記載のワクチン。
・（項目２１） 上記免疫応答が細胞溶解性Ｔ細胞応答である、項目１８に記載のワクチン。
・（項目２２） 上記ストレスタンパク質が、ｈｓｐ６５およびｈｓｐ７１からなる群より選択される、項目１８に記載のワクチン。
・（項目２３） 哺乳動物においてインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導することにおける使用のためのワクチンであって、ストレスタンパク質の全てもしくは一部、または上記抗原に対する免疫応答を誘導するのに上記ストレスタンパク質のアミノ酸配列に対して十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質の全てもしくは一部に融合された上記インフルエンザウイルスの抗原を含む、組換え融合タンパク質を含む、ワクチン。
・（項目２４） 項目２３に記載のワクチンであって、上記ストレスタンパク質が、マイコバクテリアストレスタンパク質、または上記ワクチンが投与される個体において免疫応答を誘導するのに上記マイコバクテリアストレスタンパク質のアミノ酸配列に対して十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質である、ワクチン。
・（項目２５） 上記インフルエンザウイルスの抗原が、赤血球凝集素、核タンパク質、ノイラミニダーゼ、Ｍ１、Ｍ２、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、およびその組み合わせからなる群より選択される、項目２３に記載のワクチン。
・（項目２６） 上記免疫応答が細胞溶解性Ｔ細胞応答である、項目２３に記載のワクチン。
・（項目２７） 上記ストレスタンパク質が、ｈｓｐ６５およびｈｓｐ７１からなる群より選択される、項目２３に記載のワクチン。
・（項目２８） ストレスタンパク質およびインフルエンザウイルスの抗原を含む組成物。
・（項目２９） 項目２８に記載の組成物であって、上記ストレスタンパク質が、マイコバクテリアストレスタンパク質、または上記組成物が投与される個体において免疫応答を誘導するのに上記マイコバクテリアストレスタンパク質のアミノ酸配列に対して十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質である、組成物。
・（項目３０） 上記インフルエンザウイルスの抗原が、赤血球凝集素、核タンパク質、ノイラミニダーゼ、Ｍ１、Ｍ２、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、およびその組み合わせからなる群より選択される、項目２８に記載の組成物。
・（項目３１） 上記ストレスタンパク質が、ｈｓｐ６５およびｈｓｐ７１からなる群より選択される、項目２８に記載の組成物。
・（項目３２） インフルエンザウイルスの抗原と結合されたストレスタンパク質を含む結合体。
・（項目３３） 項目３２に記載の結合体であって、上記ストレスタンパク質が、マイコバクテリアストレスタンパク質、または上記結合体が投与される個体において免疫応答を誘導するのに上記マイコバクテリアストレスタンパク質のアミノ酸配列に対して十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質である、結合体。
・（項目３４） 上記インフルエンザウイルスの抗原が、赤血球凝集素、核タンパク質、ノイラミニダーゼ、Ｍ１、Ｍ２、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、およびその組み合わせからなる群より選択される、項目３２に記載の結合体。
・（項目３５） 上記ストレスタンパク質が、ｈｓｐ６５およびｈｓｐ７１からなる群より選択される、項目３２に記載の結合体。
・（項目３６） インフルエンザウイルスの抗原に融合されたストレスタンパク質を含む融合タンパク質。
・（項目３７） 項目３６に記載の融合タンパク質であって、上記ストレスタンパク質が、マイコバクテリアストレスタンパク質、または上記融合タンパク質が投与される個体において免疫応答を誘導するのに上記マイコバクテリアストレスタンパク質のアミノ酸配列に対して十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質である、融合タンパク質。
・（項目３８） 上記インフルエンザウイルスの抗原が、赤血球凝集素、核タンパク質、ノイラミニダーゼ、Ｍ１、Ｍ２、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、およびその組み合わせからなる群より選択される、項目３６に記載の融合タンパク質。
・（項目３９） 上記ストレスタンパク質が、ｈｓｐ６５およびｈｓｐ７１からなる群より選択される、項目３６に記載の融合タンパク質。
・（項目４０） ｐＥＴ６５ＭＰ／ＮＰ−ＢおよびｐＥＴ６５Ｍ／ＮＰ−Ｄからなる群より選択される融合タンパク質。
・（項目４１） 上記抗原が細胞溶解性Ｔ細胞エピトープを含む、項目１に記載のワクチン。
・（項目４２） 上記インフルエンザウイルスの抗原が細胞溶解性Ｔ細胞エピトープを含む、項目１０に記載のワクチン。
・（項目４３） 上記インフルエンザウイルスの抗原が細胞溶解性Ｔ細胞エピトープを含む、項目１５に記載のワクチン。
・（項目４４） 上記インフルエンザウイルスの抗原が細胞溶解性Ｔ細胞エピトープを含む、項目２８に記載の組成物。
・（項目４５） 上記インフルエンザウイルスの抗原が細胞溶解性Ｔ細胞エピトープを含む、項目３２に記載の結合体。
・（項目４６） 上記インフルエンザウイルスの抗原が細胞溶解性Ｔ細胞エピトープを含む、項目３６に記載の融合タンパク質。
・（項目４７） 上記抗原が、ウイルス抗原、腫瘍関連抗原、およびアレルゲンからなる群より選択される、項目１に記載のワクチン。
・（項目４８） 上記抗原が、ウイルス抗原、腫瘍関連抗原、およびアレルゲンからなる群より選択される、項目３２に記載の結合体。
・（項目４９） 上記抗原が、ウイルス抗原、腫瘍関連抗原、およびアレルゲンからなる群より選択される、項目３６に記載の融合タンパク質。
・（項目５０） 哺乳動物においてアレルゲン性抗原に対するＴｈ２応答を抑制するためのワクチンであって、上記抗原、およびストレスタンパク質の全てもしくは一部、または上記抗原に対するＴｈ２応答を抑制するのに上記ストレスタンパク質のアミノ酸配列に対して十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質の全てもしくは一部を含む、ワクチン。
・（項目５１） 哺乳動物においてアレルゲン性抗原に対するＴｈ２応答を抑制するための組成物であって、上記抗原、およびストレスタンパク質の全てもしくは一部、または上記抗原に対するＴｈ２応答を抑制するのに上記ストレスタンパク質のアミノ酸配列に対して十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質の全てもしくは一部を含む、組成物。
・（項目５２） 哺乳動物においてアレルゲン性抗原に対するＴｈ２応答を抑制するための結合体であって、上記抗原、およびストレスタンパク質の全てもしくは一部、または上記抗原に対するＴｈ２応答を抑制するのに上記ストレスタンパク質のアミノ酸配列に対して十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質の全てもしくは一部を含む、結合体。
・（項目５３） 哺乳動物においてアレルゲン性抗原に対するＴｈ２応答を抑制するための融合タンパク質であって、上記抗原、およびストレスタンパク質の全てもしくは一部、または上記抗原に対するＴｈ２応答を抑制するのに上記ストレスタンパク質のアミノ酸配列に対して十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質の全てもしくは一部を含む、融合タンパク質。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
発明の詳細な説明
本発明は、抗原（１つ以上）、およびストレスタンパク質または熱ショックタンパク質（１つ以上）のすべてもしくは一部、または抗原に対する免疫応答を誘導するためにストレスタンパク質に十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質のすべてもしくは一部を含む、哺乳動物（例えば、ヒト）において抗原に対する免疫応答を誘導する、ワクチンおよび組成物に関する。特定の実施態様では、本発明は、抗原（１つ以上）、およびストレスタンパク質（１つ以上）のすべてもしくは一部、または抗原に対する免疫応答を誘導するためにストレスタンパク質に十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質のすべてもしくは一部を含む、哺乳動物において細胞媒介性免疫応答を誘導する、ワクチンおよび組成物に関する。
【００２６】
特定の実施態様では、本発明は、インフルエンザウイルスの抗原、およびストレスタンパク質のすべてもしくは一部、または抗原に対する免疫応答を誘導するためにストレスタンパク質のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質のすべてもしくは一部を含む、哺乳動物においてインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導する、ワクチンおよび組成物に関する。本明細書中で記載される場合、インフルエンザ抗原（例えば、ＣＴＬエピトープを含むＮＰ配列）、および少なくとも１つのストレスタンパク質を、インフルエンザ抗原とストレスタンパク質との混合物の形態で、インフルエンザ抗原とストレスタンパク質との結合体として、もしくはインフルエンザ抗原およびストレスタンパク質配列を含む融合タンパク質としてのいずれかで含む組成物は、哺乳動物において使用されるインフルエンザ抗原に対する特異的免疫応答（例えば、細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答、Ｔ細胞ヘルパー応答、Ｂ細胞応答）を刺激することに効果的である。例えば、実施例で証明されるように、本明細書に記載のワクチンでの宿主（脊椎動物（例えば、哺乳動物））の免疫は、インフルエンザ抗原（例えば、ＮＰ）を提示する細胞に対する特異的ＣＴＬ活性の刺激を生じ得る。あるいは、個々のインフルエンザ抗原およびストレスタンパク質は、連続的に投与され得る。
【００２７】
さらなる実施態様では、本発明は、腫瘍関連抗原に対する細胞媒介性免疫応答を誘導するワクチンに関し、特定のタイプの予め存在する腫瘍に対する免疫のためまたはこのような腫瘍の発生を予防するために適切な腫瘍関連抗原、およびストレスタンパク質のすべてもしくは一部、または抗原に対する免疫応答を誘導するためにストレスタンパク質のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質のすべてもしくは部分を含む。これまでの実施態様と類似して、少なくとも１つの腫瘍関連抗原および１つのストレスタンパク質を、腫瘍関連抗原とストレスタンパク質との混合物、腫瘍関連抗原とストレスタンパク質との結合体、または腫瘍関連抗原およびストレスタンパク質配列を含む融合タンパク質の形態のいずれかで含むワクチンは、哺乳動物において腫瘍関連抗原に対する細胞媒介性細胞溶解性免疫応答を刺激し得る。あるいは、抗原およびストレスタンパク質は、継続的に投与され得る。実施例で示されるように、この型のワクチン、最小Ｐ１Ａ肥満細胞腫抗原およびストレスタンパク質を含む融合タンパク質は、Ｐ１Ａ抗原を提示する細胞に対して細胞媒介性細胞溶解性応答を誘導する。さらに、ワクチンで免疫した哺乳動物は、Ｐ１Ａ抗原を発現する腫瘍細胞でのその後のチャレンジに対して免疫性である。
【００２８】
本発明では、組成物は２つの部分から構成される：ストレスタンパク質、および免疫応答が所望されるものに対する抗原。２つの部分は、混合、結合、または連結され、そして単一の単位を形成し得る。結合は、当業者に公知の化学的手段によって（例えば、ストレスタンパク質と第２の部分との間の共有結合を介して；還元的アミノ化）、または組換え技法によって、達成され得る。組換え技法が２つの部分を連結または結合するために使用されるならば、その結果は、単一分子におけるストレスタンパク質および抗原を含む組換え融合タンパク質である。これは、ワクチン産生プロセスにおいて単一組換え分子を産生および精製することを可能にする。ストレスタンパク質は、細胞媒介細胞溶解性免疫応答が所望されるものに対する任意の抗原に、あるいは投与される個体における免疫応答を誘導するために十分な抗原の一部に、結合され得る。
【００２９】
本明細書中で定義されるように、用語「ワクチン」は、予防的または治療的ワクチンとして使用され得る組成物を含む。１つの実施態様では、ワクチン組成物は、抗原およびストレスタンパク質をコードする１つ以上の核酸である。本発明はまた、哺乳動物において、抗原（例えば、腫瘍抗原）、または抗原を含む病原体（例えば、細菌、ウイルス、寄生虫）の存在に関連するまたはこれによって引き起こされる病気もしくは症状を予防または処置するための、ストレスタンパク質および／または抗原をコードする核酸である組成物の使用に関する。例えば、本明細書中に記載される組成物は、ウイルスに感染されていない哺乳動物においてインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導するために使用され得る。さらに、本明細書中に記載のワクチンまたは組成物は、インフルエンザウイルスに感染した哺乳動物においてインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導するために使用され得、そして哺乳動物において感染しているインフルエンザウイルスによって引き起こされる病態の回復または除去を生じ得る。本明細書中で使用される場合、「免疫応答の誘導」とは、増加した免疫応答（検出不能より大または以前より大）；または比較可能な条件下で抗原単独での免疫によって達成可能な応答よりも優れた応答を意味する。
【００３０】
本明細書中に記載のように、抗原（ストレスタンパク質当たり１つ以上）は、好ましくは、ペプチドの種類（すなわち、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドである）である。抗原およびストレスタンパク質が混合または化学結合される適用では、抗原はまた、炭水化物、脂質、糖脂質、または有機分子もしくは無機分子であり得る。本明細書中で使用される場合、「抗原」は、少なくとも１つのＣＴＬエピトープを含むペプチドまたはポリペプチドを含む。ＣＴＬエピトープは、Ｉ型制限Ｔ細胞エピトープ、またはＩＩ型制限Ｔ細胞エピトープのいずれかとして定義される。本発明における使用のための抗原は、単離、精製（本質的に純粋）、化学合成、または組換え産生され得る。本発明の組成物に有用な他の適切な抗原は、当業者によって決定され得る。
【００３１】
ワクチンまたは組成物が、インフルエンザウイルスに対する細胞媒介細胞溶解性免疫応答を誘導する実施態様では、インフルエンザウイルスの抗原は、赤血球凝集素、ウイルス全体（例えば、不活性化または生の弱毒化ウイルス全体）、インフルエンザウイルスの抗原性部分、および組換え産生したウイルスもしくはその一部を含むが、これらに限定されない。インフルエンザウイルスの抗原は、少なくとも１つのＢ細胞および／またはＴ細胞（例えば、Ｔヘルパー細胞、細胞溶解性Ｔ細胞）エピトープを含むペプチドまたはポリペプチドを含む。例えば、インフルエンザウイルスの抗原は、赤血球凝集素（ＨＡ（例えば、ＨＡ１、ＨＡ７））、核タンパク質（例えば、ＮＰ（例えば、実施例に記載のＮＰ−ｂおよびＮＰ−Ｄ））、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、Ｍ１、Ｍ２、ＰＢ１、ＰＢ２、およびＰＡを含むが、これらに限定されない。本発明の組成物に使用され得るインフルエンザウイルスの他の抗原は、当業者によって決定され得る。
【００３２】
ワクチンまたは組成物が腫瘍関連抗原に対する細胞媒介細胞溶解性免疫応答を誘導する実施態様では、抗原は、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ３、ＢＡＧＥ、およびＧＡＧＥを含むが、これらに限定されない。これらのタンパク質は、正常には精巣で発現される。エピトープ発現は、黒色腫を含む種々の腫瘍を生じる。メラニン形成細胞分化抗原チロシナーゼ、ＭＡＲＴ−１／ＭＥＬＡＮ−１、およびｇｐ １００／ｐＭｅ１１７、ならびにチロシナーゼ関連タンパク質ｐｇ７５およびＭＵＭ−１はまた、このリストに含まれ、そのすべては黒色腫に関連する。他の有用な腫瘍関連抗原は、乳ガンおよび卵巣ガンで見られるＨＥＲ２／ｎｅｕ、上皮細胞腫瘍で見られるＭＵＣ−１、ならびに頸ガンと強く関連するヒトパピローマウイルスタンパク質Ｅ６およびＥ７である。さらに、抗原は、ＧｎＴ−Ｖ、β−カテニン、ＣＤＫ４、およびｐ１５を含む。これらのすべての腫瘍関連抗原は、Ｔ細胞によって認識される。（Ｗａｎｇ，Ｒ．−Ｆ．およびＲｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ，６０：２９６−３０９ （１９９６）；Ｈｏｕｇｈｔｏｎ，Ａ．Ｎ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８０：１−４ （１９９４）；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ａ．およびＦｉｎｎ，Ｏ．Ｊ．，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６２：２１７−２５６）。
【００３３】
アレルギー性（アトピー性）疾患および喘息疾患における重要な担い手は、好酸球の浸潤に支配されるＩｇＥおよび局所的炎症反応である。慢性炎症による非特異的刺激に対する肺の過剰反応は、喘息の最近の定義である。この炎症は、ＩｇＥによって媒介される天然抗原または人工的抗原に対する異常なアレルギー性応答によって引き起こされ、そして好酸球と呼ばれる顆粒細胞の慢性細胞性炎症を導き得る。常駐の肥満細胞ならびに補充された好塩基球および好酸球からのメディエーターの放出は、炎症およびその後の過剰反応性の原因であると考えられる。ヒトでは、他の種におけるように、何らかの炎症性反応が局所的過剰反応性を生じる。しかし、喘息では、炎症は慢性的であり、適切に処置されなければ、生命を脅かす過剰反応性を導く。現在の処置は、炎症を減少させるためのコルチコステロイドおよび迅速な症候の緩和のためのアルブテロール（βアゴニスト）のような気管支拡張薬の使用を含む。
【００３４】
ヒトでは、マウスにおけるように、サイトカイン分泌の２つの異なるパターンが、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞クローンの中で定義されている（ｄｅｌ Ｐｒｅｔｅ，Ｇ．，Ａｌｌｅｒｇｙ，４７：４５０−４５５ （１９９２））。ヒト１型ヘルパー（Ｔｈ１）細胞（２型ヘルパー（Ｔｈ２）細胞ではない）は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、γインターフェロン、および腫瘍壊死因子βを産生する。Ｔｈ１ではなくＴｈ２細胞は、ＩＬ−４およびＩＬ−５を分泌するがＩＬ−２またはγインターフェロンを分泌しない。ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、または腫瘍壊死因子αのような他のサイトカインは、Ｔｈ１およびＴｈ２細胞の両方によって産生される。異なるサイトカインパターンは、種々の機能に関連する。一般に、Ｔｈ２細胞は、特にＩｇＥクラスの、Ｂ細胞抗体産生についての優れたヘルパー機能を提供する。Ｔｈ１細胞は、遅延した過敏性反応を担い、そしてＢ細胞を含む自己抗原提示細胞に対して細胞溶解性である。ほとんどのアレルゲン特異的または蠕虫抗原特異的ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞クローンはＴｈ２表現型を示すが、細菌抗原に特異的なほとんどのクローンはＴｈ１プロフィールを示す。アレルゲン特異的Ｔｈ２細胞は、アトピーで重要な役割を果たすようである。これらの細胞は、ＩＬ−４によってＩｇＥ産生を誘導し、そしてＩＬ−５によって好酸球の増殖、分化、および活性化を好んで行う。さらに、Ｔｈ２由来のＩＬ−３、ＩＬ−４、およびＩＬ−１３は、少なくともインビトロで、相乗的に作用する肥満細胞増殖因子である。アレルゲン特異的Ｔｈ２細胞が、アレルギー性喘息を有するヒトの気管支粘膜のような、アレルギー性炎症によって提供を受ける組織に、選択的に豊富であるという証拠がある。
【００３５】
発展途上国での幼児における抗体の使用の増加につれて、（アレルギー性）喘息の徴候およびこれによる死亡が上昇している。以下の論議は、ストレスタンパク質を含む細菌抗原への慎重な曝露がアレルギー性応答を弱めるという概念を支持するために、ストレスタンパク質を含む細菌タンパク質についての曝露およびＴ細胞記憶の欠如に、アレルギー性反応の増加した徴候および重篤度を結び付ける、この情報を使用している。
【００３６】
多くの科学者らは、環境抗原に対する抵抗性または感受性の発生が、乳児および幼児において初期抗原遭遇中に生成した免疫学的記憶の性質に依存すると考える（Ｈｏｌｔ Ｐ．Ｇ．，Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｌｅｔｔ．，８６：２０５−２１０）。このプロセスは、抗原由来であるようである。選択は、吸入した抗原に対する個体の免疫応答（気道の流通を奪う、局部リンパ節で生じるプロセス）における特異的Ｔｈ１対Ｔｈ２様記憶細胞についてである。この選択は、抗原特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞によって産生される種々のサイトカインによって調節されるようである。このＴ細胞選択プロセスは、理論的には、感染性薬剤によって影響を受け得る：気道粘膜における感染は、局部リンパ節に遊走し、そしてＩＬ−１２およびα−インターフェロンのようなＴｈ２阻害サイトカインを分泌する局所組織（肺胞）マクロファージを移動および活性化し得る。さらに、これらは、ナチュラルキラー細胞の活性化によって環境中のγ−インターフェロンレベルに加えられ得る。正味の結果は、ＣＴＬ（これは主としてＣＤ８＋細胞である）の産生である。γ−インターフェロンは、Ｔｈ２細胞の生成、したがって、体液性（ＩｇＥ）および細胞性（好酸球、好塩基球、および肥満細胞）アレルギー性応答の産生に重要なサイトカインであるＩＬ−４およびＩＬ−５の産生を阻害する（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｇ．Ｐ．およびＣｏｙｌｅ，Ａ．Ｊ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，１５：３２４−３３２ （１９９５）；Ｓｔａｍ，Ｗ．Ｂ．，ｖａｎ Ｏｏｓｔｅｒｈｏｕｔ，Ａ．Ｊ．およびＮｉｊｋａｍｐ，Ｆ．Ｐ．，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．，５３：１９２１−１９３４ （１９９３９））。
【００３７】
哺乳動物において、ストレスタンパク質は、体液性および細胞性免疫応答を誘導することが示されている。本明細書中の実施例で示すように、ストレスタンパク質と混合した、ストレスタンパク質に化学結合した、またはストレスタンパク質に融合した可溶性抗原が、哺乳動物に投与される場合、細胞媒介細胞溶解性免疫応答は実質的に増強される。これらの応答は、大部分は、ＣＤ８＋Ｔ細胞による。したがって、それ自体による抗原に対するＣＤ４＋応答の、ストレスタンパク質と混合または結合した抗原に対する応答との比較は、予測されたプロフィールを与える：ストレスタンパク質と混合または連結された可溶性抗原は、前記のＴｈ１経路の刺激の尺度であるＣＴＬ（主としてＣＤ８＋Ｔ細胞）の高い割合を得る。なぜなら、これらのＣＴＬは、Ｔｈ１型の抗原特異的Ｔ細胞の誘導の結果として生じたからである。これらのＴｈ１細胞は、γ−インターフェロンを産生し、このサイトカインはＴｈ２細胞を阻害する。したがって、Ｔｈ２サイトカインであるＩＬ−４およびＩＬ−５は、ＩｇＥおよび好酸球の産生を支持するためにもはや利用可能ではない。ＩｇＥの力価の減少につれて、肥満細胞および好塩基性細胞の直接的抗原性刺激は衰える。さらに、減少したＩＬ−５産生は、好酸球の減少した産生、分化、および活性化を導く。このパターンは、関連した組織の減少した炎症を引き起こし、そして過剰反応性（喘息）事象をあまり生じない。
【００３８】
したがって、公知のアレルギー性抗原（アレルゲン）とストレスタンパク質との混合物、またはストレスタンパク質に化学結合もしくは融合したアレルゲンを含む組成物の投与は、アトピー性患者においてＴｈ１対Ｔｈ２比に影響を及ぼすばずであり、より正常な平衡を回復させそして減少したアレルギーまたは喘息を導く。このような組成物に使用されるストレスタンパク質は、好ましくは、細菌起源またはマイコプラズマ起源である。アレルゲン−ストレスタンパク質融合タンパク質に使用されるアレルゲンは、必然的にペプチド性質であり；非ペプチド性アレルゲンは、アレルゲンとストレスタンパク質とを含む結合体、またはアレルゲンとストレスタンパク質との混合物で使用され得る。アレルゲンについての非限定的な例には、Ｆｅｌ ｄ １ （ネコ）；Ａｍｂ ａ １（抗原Ｅ）、Ａｍｂ ａ ２（抗原Ｋ）（ブタクサ）；Ｄｅｒ ｆ ２、Ｄｅｒ ｐ １、Ｄｅｒ ｐ ９、Ｄｅｒ ｆ １ （ダニ）；Ｂｌａ ｇ １、Ｂｌａ ｇ ２ （ゴキブリ）；Ｂｅｔ ｖ １ （カバノキ）；Ｒａｔ ｎ １ （ラット）；Ｃｈａ ｏ １ （ヒノキ）；Ｈｅｖ ｂ ５ （ラテックス）；ｇｐ４０ （ヤマスギ（ｍｏｕｎｔａｉｎ ｃｅｄａｒ））が挙げられる。刊行時までのアレルゲンの適切な包括的なリストについては、Ｋｉｎｇ，Ｔ．Ｐ．ら，Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０５：２２４−２３３ （１９９４）を参照のこと。
【００３９】
共有結合したまたは混合されたアレルゲンおよびストレスタンパク質を含む組成物が、過敏性反応の処置の必要な患者に、皮下または筋肉内注射のような適切な経路によって投与されるか、あるいはさらに吸入によって与えられる場合、これらは、例えば、喘息における古典的過剰反応性試験によって測定されるようなアレルギー性症候の減少を生じるべきである。処置後、患者は、非特異的反応性をほとんど示さない。喘息では、または喘息の動物モデルでは、過剰反応性は、気管支狭窄応答を誘導する吸入されたメタコリンの用量を決定することによって測定される。過剰反応性を導く慢性炎症性状態を有する哺乳動物は、メタコリンチャレンジに対してより大きな感受性を示す。これらは、「正常」哺乳動物よりも低い用量で気管支狭窄する。適切なストレスタンパク質含有組成物での処置後、メタコリンに対する用量応答は、あまり感受性でなくなる。
【００４０】
任意の適切なストレスタンパク質（熱ショックタンパク質（ｈｓｐ））は、本発明の組成物において使用され得る。例えば、実施例に記載のように、ｈｓｐ６５および／またはｈｓｐ７１が使用され得る。ストレスタンパク質に向かって、一般的に、細胞は、普通ストレス遺伝子または熱ショック遺伝子といわれる遺伝子群の発現を増加させることによって、ストレッサー（代表的には、熱ショック処置）に応答する。熱ショック処置は、細胞が適応する温度より数℃上までの温度への、細胞または生物の曝露を包含する。このような遺伝子の誘導と同調して、対応するストレスタンパク質のレベルは、ストレスを受けた細胞で増加する。本明細書中で使用される場合、「ストレスタンパク質」は、「熱ショックタンパク質」または「Ｈｓｐ」としても公知であり、これは、ストレス遺伝子によってコードされるタンパク質であり、したがって、代表的には生物に対するストレッサーの接触または曝露の際に顕著により大量に産生されるタンパク質である。「熱ショック遺伝子」としても公知である「ストレス遺伝子」は、本明細書中で、熱ショックまたはグルコースの誘導もしくは追加のような、ストレッサーに対する生物（遺伝子を含む）の接触または曝露によって、活性化されるまたは他の検出可能に調節されない遺伝子として、使用される。「ストレス遺伝子」はまた、このような相同遺伝子が、それ自体ストレッサーによって誘導されなくても、Ｈｓｐ７０およびＨｓｐ９０ストレス遺伝子ファミリー内の特定の遺伝子のような、公知のストレス遺伝子ファミリー内の相同遺伝子を含む。本明細書中で使用される場合、用語ストレス遺伝子およびストレスタンパク質のそれぞれは、内容が他に指示されない限り、他のものを含み得る。Ｈｓｐの増加した発現の他に、細胞は、特定の他の遺伝子をダウンレギュレートし、シグナル伝達に関与するいくつかのキナーゼを活性化し、特定のタンパク質の細胞内位置を変化し、そしていくつかの状況では、細胞骨格レベルの変化ならびに一過性増殖阻止を経験し得る。
【００４１】
特定の実施態様において、本発明における使用のためのストレスタンパク質は、単離されたストレスタンパク質であり、これはストレスタンパク質が、それが産生される宿主細胞から選択および分離されていることを意味する。このような単離は、本明細書中に記載されるように、および当該分野において公知のタンパク質単離の日常的な方法を用いて、行われ得る。（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８２；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９））。単離されたストレスタンパク質はまた、さらに、方法、特に界面活性剤精製法に従って、（本質的に純粋に）精製され得る。
【００４２】
細菌において、優勢なストレスタンパク質は、それぞれ、約７０ｋＤａおよび約６０ｋＤａの分子量サイズを有するタンパク質であり、これはそれぞれ、Ｈｓｐ７０およびＨｓｐ６０として称される。これらのおよび他の特定のストレスタンパク質、およびそれらをコードする遺伝子は、以下にさらに考察される。細菌において、Ｈｓｐ７０およびＨｓｐ６０は、典型的に、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動および染料クマシーブルーを用いる染色パターンに基づいて、細胞タンパク質の約１〜３％を示すが、ストレスの多い条件下で２５％程の高レベルまで蓄積する。ストレスタンパク質は、重要な細胞プロセス（例えば、タンパク質合成、細胞内輸送、ならびにタンパク質複合体のアセンブリおよび脱アセンブリ（ｄｉｓａｓｓｅｍｂｌｙ））に関与するようである。ストレスの間に合成される増加される量のストレスタンパク質は、誘導されたタンパク質がほどける（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）結果を最小にするために主として作用するようである。実際、ストレスタンパク質の合成を誘導する中程度にストレスが多い条件への細胞の予めの曝露は、細胞に対して、その後のより極度のストレスの有害な影響からの防御を与える。
【００４３】
主要なストレスタンパク質は、今までのところ、試験されたあらゆる生物および組織タイプにおいて発現されるようである。また、ストレスタンパク質は、今日までに同定されたタンパク質の最も高度に保存された群を表すようである。例えば、広範に多様な生物におけるストレスタンパク質が比較される場合、Ｈｓｐ９０およびＨｓｐ７０は、アミノ酸レベルで５０％以上の同一性を示し、そして非同一性の位置で多くの類似性を共有する。
【００４４】
ストレスタンパク質をコードする遺伝子は、細胞または生物のゲノムにおいて、単一のコピー、または複数の、非同一性のコピーで存在し得る。例えば、ヒトゲノムは、少なくとも１つのコピーのＨｓｐ１００遺伝子、少なくとも２つの異なるＨｓｐ９０遺伝子、少なくともいくつかが非同一性のコピーである、最大１０までのＨｓｐ７０遺伝子、いくつかのＴ複合体遺伝子（Ｔｃｐ遺伝子）、および関連のミトコンドリアタンパク質Ｈｓｐ６０をコードする少なくとも１つの遺伝子、ならびに２０〜３０ｋＤａの範囲の分子量サイズのタンパク質をコードする、少なくとも３コピーの小Ｈｓｐ遺伝子を含むことが示されている。ストレス遺伝子のほとんどの群において、その発現レベルが比較的高く、および完全に構成的であるか、またはわずかに中程度に熱ショック誘導性であるかのいずれかである少なくとも１つの遺伝子が存在する。さらに、ストレス遺伝子のいくつかの群は、熱によってアップレギュレートされないが、他のきっかけ（例えば、増加されるカルシウムレベルなど）によってアップレギュレートされるメンバーを含む。
【００４５】
ストレスタンパク質、特に、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ２０〜３０、およびＨｓｐ１０は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅによる感染に対する免疫応答において、宿主免疫系によって認識される主要な決定因子の中の１つである。Ｙｏｕｎｇ，Ｒ．Ａ．およびＥｌｌｉｏｔｔ，Ｔ．Ｊ．、ストレスタンパク質、感染、および免疫監視、Ｃｅｌｌ ５０：５−８（１９８９）。さらに、いくつかのラットのａｒｔｈｒｉｔｏｇｅｎｉｃＴ細胞は、Ｈｓｐ６０エピトープを認識する。Ｖａｎ Ｅｄｅｎ、Ｗ．、Ｔｈｏｌｅ，Ｊ．、ｖａｎ ｄｅｒ Ｚｅｅ，Ｒ．、Ｎｏｏｒｄｚｉｊ，Ａ．、ｖａｎ Ｅｍｂｄｅｎ，Ｊ．、Ｈｅｎｓｅｎ，Ｅ．、およびＣｏｈｅｎ，Ｉ．、Ｎａｔｕｒｅ ３３１：１７１−１７３，（１９８８）。しかし、マイコバクテリア感染または自己免疫疾患の病歴を有しない、個体（健常な個体を含む）はまた、細菌およびヒトのＨｓｐ６０エピトープの両方を認識するＴ細胞を保有し；γ−ΔＴ細胞レセプターの発現によって特徴付けられる健常な個体におけるＴ細胞のかなりの画分は、自己のおよび外来性のストレスタンパク質の両方を認識する。Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｒ．、Ｈａｐｐ，Ｍ．、Ｄａｌｌａｓ，Ａ．、Ｐａｌｍｅｒ，Ｅ．Ｋｕｂｏ，Ｒ．、およびＢｏｒｎ，Ｗ．、Ｃｅｌｌ ５７：６４４−６７４（１９８９）。従って、個体は、健常な個体であっても、外来のおよび自己のストレスタンパク質エピトープの両方を認識するＴ細胞集団を保有する。
【００４６】
ストレスタンパク質エピトープを認識するこの系は、侵入する生物に対する「初期防衛系」を構成する。この系は、宿主細胞にそれら自身のストレス遺伝子をアップレギュレートさせる、細菌およびウイルスによる頻繁な刺激によって維持され得る。しかし、自己応答性Ｔ細胞の存在は、正常な健常性と適合性であり、自己免疫疾患を引き起こさない；これはまた、個体内のストレスタンパク質の安全性を実証する。ストレスタンパク質の安全性は、ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ、Ｍｙｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓの株）ワクチン接種（これは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｒｎ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに対してもまた防御的であるストレスタンパク質に対する、免疫応答を誘導する）の成功および比較的な安全性によって、さらに実証されている。
【００４７】
本発明における使用のためのストレス遺伝子およびタンパク質は、当該分野において周知であり、そして例えば、Ｈｓｐ１００−２００、Ｈｓｐ１００、Ｈｓｐ９０、Ｌｏｎ、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ６０、ＴＦ５５、Ｈｓｐ４０、ＦＫＢＰ、シクロフィリン、Ｈｓｐ２０−３０、Ｃ１ｐＰ、ＧｒｐＥ、Ｈｓｐ１０、ユビキチン、カルネキシン、およびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼを含む。Ｍａｃａｒｉｏ，Ａ．Ｊ．Ｌ．、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｒｅｓ．２５：５９−７０ １９９５；Ｐａｒｓｅｌｌ，Ｄ．Ａ．，＆ Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ，Ｓ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２７：４３７−４９６（１９９３）；米国特許第５，２３２，８３３号（Ｓａｎｄｅｒｓら）。ストレスタンパク質の特定の群は、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ２０−３０、およびユビキチン、さらに好ましくはＨｓｐ７０およびＨｓｐ６０を含む。
【００４８】
本発明の方法および組成物におけるストレスタンパク質は、好ましくは、細胞外的な抗原提示ストレスタンパク質から、またはプロセシングされたストレスタンパク質から、好ましくは選択され、そして得られたペプチドフラグメントは、それが細胞外抗原提示タンパク質であるように細胞の表面上に提示される。さらに、本発明における使用のための選択されるストレス遺伝子またはタンパク質は、好ましくは、ストレス遺伝子またはタンパク質が、少なくとも１つの発現（好ましくは、細菌またはヒト）において、１つ以上の形態のストレスに応じて調節されないように選択される。さらに好ましくは、選択されるストレス遺伝子またはタンパク質は、ヒトにおいて調節されない（上記されるようなストレッサー、または形質転換によって調節されないことを含む）。
【００４９】
Ｈｓｐ１００−２００の例は、Ｇｒｐ１７０（グルコース調節性のタンパク質について）、プレゴルジ区画における小胞体のルーメンにおけるＧｒｐ１７０残基を含み、そして免疫グロブリンの折り畳みおよびアセンブリにおいて役割を果たし得る。
【００５０】
Ｈｓｐ１００の例は、哺乳動物Ｈｓｐ１１０、酵母Ｈｓｐ１０４、ｃ１ｐＡ、ｃ１ｐＢ、ｃ１ｐＣ、ｃ１ｐＸ、およびｃ１ｐＹを含む。酵母Ｈｓｐ１０４およびＥ．ｃｏｌｉ ｃ１ｐＡは、ヘキサマーの粒子、およびそのアセンブリがアデニンヌクレオチド結合を必要とするようであるテトラマーの粒子であるＥ．ｃｏｌｉ ｃ１ｐＢを形成する。Ｃ１ｐプロテアーゼは、Ｃ１ｐＰ（タンパク質分解性のサブユニット）およびＣ１ｐＡからなる７５０ｋＤａのヘテロオリゴマーを提供する。Ｃ１ｐＢ−Ｙは、Ｃ１ｐＡに構造的に関連するが、Ｃ１ｐＡとは異なり、Ｃ１ｐＰと複合体化しないようである。
【００５１】
Ｈｓｐ９０の例は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＨｔｐＧ、酵母におけるＨｓｐ８３およびＨｓｃ８３、ならびにヒトにおけるＨｓｐ９０α、Ｈｓｐ９０β、およびＧｒｐ９４を含む。Ｈｓｐ９０は、タンパク質の群に結合し、このタンパク質は、ステロイドホルモンレセプター（例えば、糖質コルチコイド、エストロゲン、プロゲステロン、およびテストステロン）、転写因子、ならびにシグナル伝達機構において役割を果たすプロテインキナーゼのような代表的には細胞調節分子である。Ｈｓｐ９０タンパク質はまた、他のストレスタンパク質を含む大きな豊富なタンパク質複合体の形成に関与する。
【００５２】
Ｌｏｎは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてネイティブでないタンパク質を分解する、ＡＴＰ−依存性プロテアーゼとして機能する、テトラマーのタンパク質である。
【００５３】
Ｈｓｐ７０の例は、哺乳動物細胞からのＨｓｐ７２およびＨｓｐ７３、細菌、特にマイコバクテリア（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ（例えば、Ｂａｃｉｌｌｅ−Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ））からのＤｎａＫ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、酵母、および他の原核生物からのＤｎａＫ、ならびにＢｉｐおよびＧｒｐ７８を含む。
【００５４】
Ｈｓｐ７０は、ＡＴＰ、ならびにほどけたポリぺプチドおよびペプチドに特異的に結合し得、それによってタンパク質の折り畳みおよび脱折り畳み（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）、ならびにタンパク質複合体のアセンブリおよび脱アセンブリに関与する。
【００５５】
Ｈｓｐ６０の例は、マイコバクテリアからのＨｓｐ６５を含む。細菌Ｈｓｐ６０はまた、一般に、ＧｒｏＥＬ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉからのＧｒｏＥＬ）としても知られる。Ｈｓｐ６０は、大きな、ホモオリゴマーの複合体を形成し、およびタンパク質折り畳みにおいて重要な役割を果たすようである。Ｈｓｐ６０相同体は、真核生物のミトコンドリアおよび葉緑体に存在する。
【００５６】
ＴＦ５５の例には、Ｔｃｐ１、ＴＲｉＣ、およびサーモソーム（ｔｈｅｒｍｏｓｏｍｅ）が含まれる。このタンパク質は、代表的には、真核生物の細胞質およびいくつかの始原細菌において生じ、そして多員環を形成して、タンパク質折り畳みを促進する。これらはまた、Ｈｓｐ６０に低度に相同性である。
【００５７】
Ｈｓｐ４０の例は、Ｅ．ｃｏｌｉおよびマイコバクテリアのような原核生物からのＤｎａＪ、およびＨＳＪ１、ＨＤＪ１、ならびにＨｓｐ４０を含む。Ｈｓｐ４０は、細胞活性の中でとりわけ、タンパク質合成、熱耐性、およびＤＮＡ複製における分子シャペロンとしての役割を果たす。
【００５８】
ＦＫＢＰの例は、ＦＫＢＰ１２、ＦＫＢＰ１３、ＦＫＢＰ２５、ならびにＦＫＢＰ５９、Ｆｐｒ１およびＮｅｐ１を含む。これらのタンパク質は、代表的には、ぺプチジル−プロリルイソメラーゼ活性を有し、および免疫抑制薬（例えば、ＦＫ５０６およびラパマイシン）と相互作用する。これらのタンパク質は、代表的には、細胞質および小胞体において、見出される。
【００５９】
シクロフィリンの例には、シクロフィリンＡ、Ｂ、およびＣが含まれる。タンパク質は、ぺプチジル−プロリルイソメラーゼ活性を有し、そして免疫抑制薬のシクロスポリンＡと相互作用する。タンパク質シクロスポリンＡは、カルシニューリン（タンパク質ホスファターゼ）に結合する。Ｈｓｐ２０−３０の例には、α−クリスタリンが含まれ、そしてＨｓｐ２０−３０はまた、小Ｈｓｐと称される。Ｈｓｐ２０−３０は、代表的には、大きなホモオリゴマーの複合体において見出され、またはヘテロオリゴマーの複合体（ここでは、生物または細胞タイプは、いくつかの異なるタイプの小Ｈｓｐを発現する）において見出されることもあり得る。Ｈｓｐ２０−３０は、細胞骨格構造と相互作用し、そしてアクチンの重合／解重合において調節的な役割を果たし得る。Ｈｓｐ２０−３０は、ストレスにより、または静止細胞の増殖因子への曝露の際に、迅速にリン酸化される。
【００６０】
Ｃ１ｐＰは、異常なタンパク質の分解に関与するＥ．ｃｏｌｉプロテアーゼである。Ｃ１ｐＰの相同体は、葉緑体において見出される。Ｃ１ｐＰは、Ｃ１ｐＡとヘテロオリゴマーの複合体を形成する。
【００６１】
ＧｒｐＥは、ストレスで障害されたタンパク質の救済、および障害されたタンパク質の分解の両方に関与する約２０ｋＤａのＥ．ｃｏｌｉタンパク質である。ＧｒｐＥは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてストレス遺伝子の発現の調節において役割を果たす。Ｈｓｐ１０の例は、ＧｒｏＥＳおよびＣｐｎ１０を含む。Ｈｓｐ１０は、代表的には、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、ならびに真核生物細胞のミトコンドリアおよび葉緑体において見出される。Ｈｓｐ１０は、Ｈｓｐ６０オリゴマーと会合する七員環を形成する。Ｈｓｐ１０はまた、タンパク質折り畳みに関与する。
【００６２】
ユビキチンは、ＡＴＰ−依存性の細胞質ゾルのプロテアーゼのタンパク質分解除去と協調して、タンパク質を結合することが見出されている。
【００６３】
特定の実施態様において、本発明のストレスタンパク質は、腸内細菌、マイコバクテリア（特に、Ｍ．ｌｅｐｒａｅ、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、およびＭ．ｂｏｖｉｓ、Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母、ショウジョウバエ、脊椎動物、鳥類、ニワトリ、哺乳動物、ラット、マウス、霊長類、またはヒトから得られる。
【００６４】
ストレスタンパク質は、酸性もしくは塩基性の塩の形態、または中性の形態であり得る。さらに、個々のアミノ酸残基は、酸化または還元によって修飾され得る。さらに、種々の置換、欠失、または付加が、アミノ酸または核酸配列に対してなされ得、その正味の効果は、変異体の増加された生物学的活性を保持すること、またはさらに増強することである。コード縮退に起因して、例えば、同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列においてかなりの変化が存在し得る。本発明はまた、ストレスタンパク質から得られる、ストレスタンパク質のフラグメントまたはペプチドを用いる使用に適切である（但し、このようなフラグメントまたはペプチドは、選択される抗原に対する免疫応答を増強することに関与する立体配座エピトープを含む）。ストレスタンパク質フラグメントは、プロテイナーゼを用いるフラグメント化により、または組換え法（例えば、ストレスタンパク質をコードするヌクレオチド配列の一部の発現（単独でまたは別のタンパク質との融合としてのいずれか））によって得ることができる。ペプチドはまた、このような方法、または化学合成によって生成され得る。本発明はまた、第２のタンパク質に融合または結合されるストレスタンパク質を用いる使用に適切であり、第２のタンパク質は、ストレスタンパク質であってもなくてもよい。ストレスタンパク質は、多様な公知の技術によって、特定の遺伝子座で導入された変異を含み得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９； ＤｒｉｎｋｗａｔｅｒおよびＫｌｉｎｅｄｉｎｓｔ、ＰＮＡＳ ８３：３４０２−３４０６、１９８６；ＬｉａｏおよびＷｉｓｅ Ｇｅｎｅ ８８：１０７−１１１、１９９０’）； Ｈｏｒｗｉｔｚら、Ｇｅｎｏｍｅ ３：１１２−１１７、１９８９を参照のこと。
【００６５】
用語「ストレスタンパク質のアミノ酸配列に十分に相同性である」とは、タンパク質またはポリぺプチドのアミノ酸配列が、一般に、ストレスタンパク質アミノ酸配列と少なくとも４０％の同一性を示すことを意味する；いくつかの場合において、機能的に等価なアミノ酸配列は、ストレスタンパク質のアミノ酸配列と約５０％の同一性を示す。
【００６６】
ストレス遺伝子またはタンパク質としての考慮のもとに、遺伝子またはタンパク質を同定する方法は、当該分野において周知である。例えば、特定のストレスタンパク質群の遺伝子およびタンパク質の保存は、周知のストレス遺伝子（例えば、ＤｎａＫ、ＧｒｏＥＬ、またはＤｎａＪ）を考慮して、例えば、核酸ハイブリダイゼーション、または核酸もしくはアミノ酸配列決定、その後のコンピューター比較解析によって、遺伝子／タンパク質のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の比較を可能にする。Ｖｏｅｌｌｍｙ，Ｒ．，ら、ＰＮＡＳ ８２：４９４９−４９５３（１９８５）。あるいは、アッセイは、選択されたストレスタンパク質の本質的な構造特徴および／または機能的特性とを、同定および／または区別するために使用され得る。例えば、発現ライブラリーは、抗Ｈｓｐ抗体および当該分野において周知の他のアッセイを使用して、スクリーニングされ得る。Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（編）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、（１９８８）。さらに、所定のストレスタンパク質群の生物学的活性が開発され得る。Ｇｕｉｄｏｎ，Ｐ．Ｔ．、およびＨｉｇｈｔｏｗｅｒ，Ｌ．Ｅ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５：３２３１−３２３９（１９８６）。例えば、Ｈｓｐ７０は、タンパク質複合体のアセンブリにおいて、ＡＴＰ、ならびに折り畳まれていないポリぺプチドおよびペプチドに特異的に結合し得る。従って、適切なポリぺプチド、ペプチド、またはＡＴＰを含むサンプルを考慮してタンパク質を混合した後の、タンパク質−タンパク質またはタンパク質−核酸複合体の生成の存在または不在の決定は、Ｈｓｐ７０遺伝子またはタンパク質の明白な存在または不在を示し、この存在または不在は、抗体ベースのアッセイのような他のアッセイを利用して確認され得る。
【００６７】
ストレスタンパク質、またはストレスタンパク質に結合した物質（例えば、タンパク質もしくはオリゴ糖）に対する特異的な細胞性または体液性の免疫を誘発するための、ワクチンとしての、本発明のストレスタンパク質の有効な投薬量は、１回の注入あたり０．１〜１０００μｇ ｈｓｐの範囲であり、ストレスタンパク質が投与される個体に依存する（Ｌｕｓｓｏｗ，Ａ．Ｒ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．，２１：２２９７−２３０２（１９９１）；Ｂａｒｒｉｏｓ，Ｃ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．，２２：１３６５−１３７２（１９９２））。各個体についてのストレスタンパク質の適切な投薬量は、例えば、投与される特定のストレスタンパク質、ストレスタンパク質が投与される個体のタイプ、個体の年齢および大きさ、処置または予防される状態、ならびに状態の重篤度を考慮して決定される。当業者は、日常的な実験だけを使用して、個体に投与するための適切な投薬量を決定し得る。
【００６８】
ワクチンに存在する、ストレスタンパク質、ストレスタンパク質の部分、ストレスタンパク質の機能的等価物、およびストレスタンパク質が混合、融合、または結合される抗原は、公知の技術を用いて生成され得るか、または得ることができる。例えば、インフルエンザウイルスのストレスタンパク質および／または抗原は、それらが天然に生じる供給源から得られ（単離され）得るか、所望のストレスタンパク質もしくは抗原をコードする遺伝子をクローニングおよび発現することによって生成され得るか、または化学的もしくは機械的に合成され得る。
【００６９】
本明細書中に記載される組成物は、多様な病原体（例えば、細菌、ウイルス、寄生虫）に対する免疫応答を誘導するために使用され得る。インフルエンザウイルスの抗原、および１つ以上のストレスタンパク質の全体もしくは部分、または抗原に対する免疫応答を誘導ためのストレスタンパク質のアミノ酸配列に十分相同であるアミノ酸配列を有するタンパク質の全体もしくは部分は、インフルエンザウイルスに感受性の任意の脊椎動物（例えば、哺乳動物、家禽）において、インフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導するために使用され得る。例えば、組成物は、霊長類（例えば、ヒト）、ウマ、ブタ、シチメンチョウ、およびニワトリにおいて、インフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導するために使用され得る。
【００７０】
本明細書中に記載される組成物は、種々の様式で宿主に投与され得る。投与の経路としては、皮内、経皮（例えば、遅延放出ポリマー）、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経口、硬膜外、および鼻腔内の経路が挙げられる。任意の他の投与の都合の良い経路（例えば、注入もしくはボーラス注射）、または上皮のもしくは粘膜皮膚の内層を介する吸収が使用され得る。さらに、本明細書中で記載される組成物は、他の成分または生物学的に活性な薬剤（例えば、ミョウバン）、薬学的に受容可能な界面活性剤（例えば、グリセリド）、賦形剤（例えば、ラクトース）、キャリア、希釈剤、およびビヒクルとともに投与され得る。
【００７１】
さらに、ストレスタンパク質および／またはペプチド（ｐｅｐｔｉｄｉｃ）抗原は、これらをコードするポリヌクレオチドのインビボ発現によって、哺乳動物被験体に投与され得る。すなわち、ベクターが、抗原およびストレスタンパク質をコードする核酸、または抗原およびストレスタンパク質配列を含む融合タンパク質をコードする核酸を送達するために使用され得る。例えば、ストレスタンパク質および／または抗原は、生きたベクターを用いて宿主（哺乳動物）に投与され得、ここでストレスタンパク質および抗原の核酸配列を含む生きたベクターは、抗原および／またはストレスタンパク質がインビボで発現される条件下で投与される。例えば、哺乳動物は、タンパク質もしくはペプチドの形態でのストレスタンパク質と組合わせて、またはストレスタンパク質をコードし、そしてこれをインビボで発現するベクターと組合わせて、抗原をコードし、そしてインビボでこれを発現するベクターを用いて、注入され得る。あるいは、宿主は、ペプチドもしくはタンパク質の形態での抗原と組合わせて、または抗原をコードし、そしてこれをインビボで発現するベクターと組合わせて、ストレスタンパク質をコードし、そしてこれをインビボで発現するベクターを用いて、注入され得る。タンパク質（ペプチド）抗原をコードする配列を含む単一のベクターはまた、本発明の組成物のために使用され得る。
【００７２】
いくつかの発現ベクター系が、市販されているか、または組換えＤＮＡおよび細胞培養技術に従って再生され得る。例えば、酵母もしくはワクシニアウイルスの発現系のようなベクター系、またはウイルスベクターは、本発明の方法および組成物において使用され得る（Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．、Ａ Ｊ．ｏｆ Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，２：２２１−２３６（１９９０））。裸のプラスミドまたはＤＮＡ、および標的化リポソームにおいてもしくは赤血球ゴーストにおいてカプセル化されているクローン化遺伝子を使用する他の技術は、ストレスタンパク質および／または抗原ポリヌクレオチドを宿主に導入するために使用され得る（Ｆｒｅｉｄｍａｎ，Ｔ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１２７５−１２８１（１９９）；Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈ，Ｎ．Ｒ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６５：１４０１−１４０４（１９９４））。発現ベクターの構築、ならびにベクターおよび核酸の種々の宿主細胞への移入は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＢｉｏｌｏｇｙにおけるＭｏｌｅｃｕｌａｒ ＣｌｏｎｉｎｇおよびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（これらは、本明細書によって参考として援用される）のような手引書に記載されるように、または、市販のキットを使用することによって、遺伝子操作技術を用いて達成され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、１９８９））。
【００７３】
本発明の組成物におけるストレスタンパク質および／または抗原の量は、宿主（哺乳動物のような脊椎動物）において有効な免疫刺激応答を生成する量である。有効量は、投与される場合、投与されない場合の免疫応答に比べて増強された免疫応答を生じるような量である。すなわち、有効量は、抗原またはストレスタンパク質単独の類似の量よりも明白な免疫応答を提供する量である。さらに、宿主に投与されるストレスタンパク質および／または抗原の量は、多様な因子に依存して変化し、これは用いられる抗原、宿主の大きさ、年齢、体重、全体の健常度、性別、および食餌、ならびに投与の時間、持続時間、またはインフルエンザウイルスの特定の特質を含む。確立された用量範囲の調整および操作は、当業者の能力の十分な範囲内である。例えば、ストレスタンパク質および抗原の量は、約１００μｇ〜約１ｇ、好ましくは約１ｍｇ〜約１ｇ、および約１ｍｇ〜約１００ｍｇであり得る。
【００７４】
本発明は、ストレスタンパク質の存在が、抗原に対する細胞媒介性の細胞溶解応答を非常に刺激することを教示する。腫瘍関連抗原は同定されているが、これらの抗原に対する免疫応答単独は、治療学的に有効ではない。混合物中での、または抗原に連結されるかのいずれかでの、ストレスタンパク質の同時投与による、これらの抗原に対する細胞応答の増強は、ガン治療において有益である。この予測は、本発明の組成物が、その後の腫瘍チャレンジに対して哺乳動物を免疫するという実施例に詳述される観察によって、支持される。抗原に対する、細胞媒介性の、細胞溶解応答の増強は、同じ抗原に対する、先存の（Ｔｈ２媒介性の）体液性応答のダウンレギュレーションを生じることが予測される。それゆえ、本発明はまた、アレルギー性応答を抑制するために有用である。最後に、Ｔ細胞媒介性免疫はまた、ウイルス、原生動物、および特定の細胞内細菌（例えば、マイコバクテリア）によって引き起こされる感染に対する哺乳動物宿主防御において、重要なエレメントであることが考慮される。実施例において示されるように、ストレスタンパク質およびインフルエンザウイルス抗原を含む本発明の組成物（混合物、結合体、および融合タンパク質）は、ウイルス抗原を発現する哺乳動物細胞に対して、実質的な細胞媒介性の細胞溶解応答を誘発するにおいて有効である。
【００７５】
本発明は、以下の実施例によって説明され、これはいかようにも限定されることを意図されない。
【実施例】
【００７６】
実施例
実施例１：組換えストレスタンパク質の単離
Ａ．組換えマイコバクテリアＨｓｐ７０。プラスミドＹ３１１１は、発現制御配列の間に機能的に挿入されたＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈｓｐ７０遺伝子を含む。（Ｍｅｈｌｅｒｔ，Ａ．およびＹｏｕｎｇ，Ｄ．Ｂ．、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３：１２５−１３０（１９８９））。短縮型Ｈｓｐ７０遺伝子を含むＥ．ｃｏｌｉ株ＣＧ２０２７（Ｃ．Ｇｅｏｒｇｏｐｏｕｌｏｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから得た）を、標準的な手順によって、プラスミドＹ３１１１で形質転換した。（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８２））。
【００７７】
プラスミドＹ３１１１を含有する細菌を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地（１リットル当たり、２０ｇトリプトン、１０ｇ酵母抽出物、１０ｇ ＮａＣｌ）中で、３７℃で、撹拌しながら（２５０ｒｐｍ）、一晩、増殖させた。１０％グリセロールストックを、この培養液から調製し、そして−７０℃で保存した。凍結したグリセロールストックからのいくつかの削片を、大量培養物を接種するために使用し、これを約４８時間になる前まで、インキュベートした。５９０ｎｍでの光学密度が、２．５〜３．５に達した場合、細胞を遠心分離によって回収した。
【００７８】
以下の工程を、４℃で行った。細胞ペレットを、１ｇ当たり３ｍｌの溶解緩衝液中に再懸濁した。溶解緩衝液の組成は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、５ｍＭ β−メルカプトエタノール、１０μｇ／ｍｌアプロチニン、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、および１μｇ／ｍｌペプスタチンであった。リゾチームを、０．１４ｍｇ／ｍｌの最終濃度になるまで、細胞懸濁液に添加した。次いで、懸濁液を、−７０℃で凍結した。
【００７９】
細胞懸濁液を解凍し、そして細胞を、超音波処理によって破壊した。超音波処理物を、１７，０００ｒｐｍで、３０分間の遠心分離に供した。（ＪＡ−１７ローター、Ｂｅｃｋｍａｎｎ）。固体の（ＮＨ４）２ＳＯ４を、上清溶液が（ＮＨ４）２ＳＯ４で６５％飽和されるまで、上清溶液に添加した。インキュベーションの３０分後、混合液を以前のように遠心分離した。ペレットを、Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ緩衝液Ａに溶解した。この溶液に、１０μｇ／ｍｌアプロチン、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、および１μｇ／ｍｌペプスタチンを添加し、そして溶液を６５容量のＱ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ緩衝液Ａに対して、一晩、透析した。Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ緩衝液Ａは、３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ β−メルカプトエタノールを含んだ。透析した溶液を、以前に記載のように、遠心分離によって澄明化した。
【００８０】
透析した溶液を、Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ緩衝液Ａ中で平衡化したＱ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にアプライした。カラムを、２容量の同じ緩衝液で洗浄した。溶出は、０〜６００ｍＭ ＮａＣｌ勾配を伴った。画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルー染色によって、主要な７１ｋＤａポリぺプチド（すなわち、組換えＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈｓｐ７０タンパク質）の存在について試験した。ポリぺプチドを含む画分をプールし、そしてこのプールを、固体の（ＮＨ４）２ＳＯ４の添加によって６５％飽和にさせた。混合液を、以前に記載のように遠心分離し、ペレットをＡＴＰ開始緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１５ｍＭ β−メルカプトエタノール、および０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解し、そして得られたタンパク質溶液を、一晩、６５容量の同じ緩衝液に対して透析し、そして遠心分離によって澄明化した。
【００８１】
次いで、透析したタンパク質溶液を、ＡＴＰ開始緩衝液中で平衡化したＡＴＰ−アガロースカラム（Ｆｌｕｋａ）にアプライした。カラムを１Ｍ ＮａＣｌを含有する１カラム容量のＡＴＰ開始緩衝液で洗浄した。溶出を、１０ｍＭ ＡＴＰを補充したＡＴＰ開始緩衝液を用いて達成した。溶出物を、（ＮＨ４）２ＳＯ４で６５％飽和にさせ、そして沈殿したタンパク質を、以前に記載のように回収した。遠心分離ペレットを、溶解し、そして２００容量のＢｌｕｅ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ緩衝液（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭβ−メルカプトエタノール）に対して透析した。
【００８２】
最後の工程からの透析したタンパク質溶液を、Ｂｌｕｅ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ緩衝液中で平衡化したＢｌｕｅ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にアプライした。カラムを、１．５カラム容量の同じ緩衝液で洗浄した。溶出し、そして画分を、単一のプールとして回収した。
【００８３】
最終調製物の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルー染色によって、マイコバクテリアのＨｓｐ７０およびＥ．ｃｏｌｉ Ｈｓｐ７０にそれぞれ特異的なマウスモノクローナル抗体を用いて、ウエスタンブロット分析によって（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８２）；（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９８９）を参照のこと））、ならびにＡＴＰアーゼ活性のアッセイによって、評価した。調製物は、クマシーブルー染色されたゲル中の調製物の染色パターンに基づいて、代表的に、９０％を超えて純粋であり、そして好ましくは９５％を超えて純粋であり、ならびに１％未満のＥ．ｃｏｌｉ Ｈｓｐ６０を含み、そして検出可能なＥ．ｃｏｌｉ Ｈｓｐ７０を含まなかった。
【００８４】
Ｂ．マイコバクテリアのＨｓｐ６０
プラスミドＲＩＢ１３００は、発現制御配列の間に機能的に挿入されたＭ．ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ Ｈｓｐ６０遺伝子を含む。（Ｔｈｏｌｅ，Ｊ．Ｅ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７８：３４３−３４８（１９９３））。Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｍ１５４６を、標準的な手順を用いて、プラスミドＲＩＢ１３００（Ｔｈｏｌｅら、Ｊ．Ｅ．Ｒ．、上述）で形質転換した。Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８２））。
【００８５】
プラスミドＲＩＢ１３００を含有する細菌の接種物を、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＮＣＺＹＭ培地（１リットル当たり１０ｇ Ｎ−Ｚ アミンＡ、５ｇ Ｂａｃｔｏ 酵母抽出物、１ｇ カサミノ酸（Ｃａｓａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）、５ｇ ＮａＣｌ、２ｇ （ＮＨ４）２ＳＯ４−７Ｈ２Ｏ））において、２８℃で、および撹拌下、飽和に増殖させた。この培養物を、大量培養を接種するために使用し、これを接種培養と同じ条件下で、５９０ｎｍの光学密度での培養物の光学密度が０．３〜０．６の間になるまで増殖した。組換えタンパク質の生成を、熱水浴におけるインキュベーションによって、培養物の温度を４２℃に急速に上昇することによって、開始した。培養を、この温度で、３時間、維持した。次いで、細菌を遠心分離によって回収し、そして細菌ペレットの１重量あたり６容量の溶解緩衝液に再懸濁した。溶解緩衝液は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＪＣＬ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、０．１ｍＭ ＰＭＳＦ、および０．１％ ＲＩＶＭ ＢＡ（５０ｍｌあたり、０．１０４ｇ ４−アミノ−ベンズアミジン−２ＨＣｌ、０．０６６ｇ ε−アミノカプロン酸）を含んだ。リゾチームを、０．１ｍｇ／ｍｌの濃度に添加し、そして懸濁液を−７０℃で凍結した。
【００８６】
細菌懸濁液を解凍し、そして４℃に置いた。以下の操作をこの温度で行った。細菌の完全な溶解を、超音波処理によって達成した。超音波処理物を、１７，０００ｒｐｍで、３０分間、ＪＡ−７０ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ）において遠心分離した。飽和化（ＮＨ４）２ＳＯ４を、２０％飽和が達成されるまで、上清溶液に添加した。沈殿物を、遠心分離（上述を参照のこと）によって回収し、そして破棄した。上清溶液を、飽和化（ＮＨ４）２ＳＯ４の添加によって、５５％飽和にさせた。上清の遠心分離によって得られるペレットを、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５ｍＭ β−メルカプトエタノール、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に溶解した。次いで、ＴＥ中のタンパク質溶液を、５０容量のＴＥ緩衝液に対して透析した。
【００８７】
沈殿された物質を除去するための遠心分離後（上述のように）、透析したタンパク質溶液を、ＤＥＡＥ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムにアプライした。ＴＥ緩衝液での洗浄後、タンパク質をＴＥ緩衝液中の０〜３００ｍＭ ＮａＣｌ勾配で溶出した。Ｍ．ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ Ｈｓｐ６０（実際の見かけの分子量は、６５ｋＤａに等しい）を含む画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルー染色によって同定し、そしてプールした。１０μｇ／ｍｌアプロチニン、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、および１μｇ／ｍｌペプスタチンを、このプールに添加し、次いでこれを、ＹＭ３０メンブレンを用いてＡｍｉｃｏｎセルに濃縮した。
【００８８】
濃縮したプールを、Ｓ２００緩衝液（１０ｍＭ ＮａＨＰＯ４（ｐＨ６．８）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、および１５ｍＭβ−メルカプトエタノール）で平衡化したＳ−２００ ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムにアプライした。溶出は、同じ緩衝液を用いてであった。画分を、以前のようにマイコバクテリアのＨｓｐ６０の存在について試験し、そして高度に精製されたタンパク質を含有するポジティブな画分をプールし、そしてＨＡＰ緩衝液（１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ６．８）、１５ｍＭβ−メルカプトエタノール）に対して、一晩、透析した。
【００８９】
透析したプールを、ＨＡＰ緩衝液中で平衡化したヒドロキシアパタイト（Ｂｉｏ−Ｒａｄ；Ｂｉｏ−Ｇｅｌ ＨＴＰ Ｇｅｌ）カラムにアプライした。カラムを、３カラム容量の１ｍＮ ＭｇＣｌ２および１５ｍＭβ−メルカプトエタノール、次いで１ｍＭ ＮａＨＰＯ４（ｐＨ６．８）および１５ｍＭβ−メルカプトエタノールで洗浄した。タンパク質を、１０〜６０ｍＭ リン酸勾配で溶出した。画分を、以前のように試験し、そしてポジティブな画分をプールし、濃縮し、そしてＰＤ１０を介するゲル濾過によって０．８５％ ＮａＣｌに交換した。マイコバクテリアのＨｓｐ６０の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルー染色によって、ならびにＥ．ｃｏｌｉ Ｈｓｐ７０およびＨｓｐ６０に特異的な抗体を使用するウエスタンブロット分析によって、評価した。調製物は、代表的に、９０％を超える純度であり、ならびにそれぞれ、０．５％を超えないＥ．ｃｏｌｉ ＨＳＰ６０および０．１〜０．２％のＥ．ｃｏｌｉ Ｈｓｐ７０を含んだ。
【００９０】
ＨＳＰ調製物は、ＤｅｔｏｘｉＧｅｌ樹脂に対するアフィニティークロマトグラフィーによって、ポリミキシンＢを添加して、または（あまり好ましくないが）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４のような界面活性剤を用いる溶出によってのいずれかで、脱発熱化し得る（ｄｅｐｙｒｏｇｅｎａｔｅ）。
【００９１】
実施例２：ＮＰペプチドおよびｈｓｐ７０の混合物を含有する組成物に対するＣＴＬ応答
ａ．ｈｓｐ７０タンパク質およびＮＰペプチドの調製 Ｈｓｐ７０（ここでは、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｈｓｐ７１）を、実施例１に記載のように調製した。完全なＮＰにおける３６３−３７４残基に対応するアミノ酸配列ＶＱＬＡＳＮＥＮＭＥＴＭ（配列番号１）を有し、そして公知のＣＴＬエピトープ（Ｈ−２ｂ制限される）を含む、ＮＰペプチド（本明細書中でＮＰ．Ｂとして称される；Ｍｏｔａｌ，Ｕ．Ｍ．Ａ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２５：１１２１−１１２４（１９９５）およびそこにおける参考文献）を、αアミノ保護基としてＦｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）を用い、および固相支持体としてＨＭＰ（Ｗａｎｇ）樹脂を用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｍｏｄｅｌ ４３１Ａ ペプチド合成機において、合成的に生成した（０．２５ｍＭスケール）。全てのアミノ酸および合成化学薬品は、Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した。
【００９２】
ＮＰ．Ｂを、支持体から切断し、そして連続的な撹拌下で、３時間、１０ｍｌトリフルオロ酢酸、０．５ｍｌ 水、０．７５ｇ結晶性フェノール、０．２５ｍｌ エタンジチオール、および０．５ｍｌ トリアニソールを混合することによって調製した２ｍｌの混合物中で、ＮＰ．Ｂ−樹脂をインキュベートすることによって、側鎖の保護基を除去した。切断混合物を、４０ｍｌの氷冷ジエチルエーテルに濾過した。不溶性の物質を、５０００×ｇで、８分間の遠心分離によって回収した。エーテルをデカントし、そしてペレットを、冷却ジエチルエーテルにおける再懸濁、次いで遠心分離によって、３回洗浄した。最後の洗浄後、ペレットを風乾し、蒸留水中にとり、そして凍結乾燥した。
【００９３】
ｂ．マウスの免疫およびエフェクター細胞の調製
ＮＰ．Ｂペプチドを、小容量のダルベッコＰＢＳ（ＤＰＢＳ；２．７ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、４．３ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、２．７ｍＭ ＫＣｌ、０．１３７Ｍ ＮａＣｌ）に溶解した。ペプチドＮＰ．Ｂの、それぞれ、１．８９、１８．９または１８９μｇのアリコートを、ＤＰＢＳ中のｈｓｐ７１の１００μｇのアリコートと混合し、それぞれ、１、１０、または１００のペプチド：ｈｓｐのモル比を有する組成物を得た。株Ｃ５７ＢＬ／６の４匹の雌性マウスの群は、免疫されないままであるか（コントロール）または３つの異なるＮＰ．Ｂ−ｈｓｐ７１混合物で、頸部の首筋に皮下注射されたかのいずれかであった。７日後、マウスを頸部脱臼によって安楽死させ、それらの脾臓を取り出した。プールした脾臓の単一の細胞懸濁液を調製し、そして「完全培地」（これは、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５０μＭ ２−メルカプトエタノール、および５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン硫酸を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地であった）中で、１回洗浄した。０．１μｍｏｌ濃度でのＮＰ．Ｂ．ペプチドとともに、５日間、２５×１０６個の生存細胞を培養することによって、リンパ様細胞を再刺激した。培養物を、直立の２５ｃｍ２フラスコ中で、１０ｍｌ 完全培地とともに、３７℃および５％ ＣＯ２で、インキュベートした。次いで、培養物（エフェクター細胞）を、下記のＣＴＬ活性アッセイにおいて使用した。
【００９４】
ｃ．ＣＴＬ活性アッセイ
ＥＬ４細胞（Ｈ−２ｂ）を、標的細胞として使用した。細胞を、１０６細胞当たり１５０μＣｉ Ｎａ２ＣｒＯ４および１０μｇＮＰ．Ｂペプチドとともに、９０分間インキュベートした。大量に洗浄して過剰な放射標識を除去した後、１０４標識化標的細胞を、再刺激したエフェクター細胞とともに、種々のエフェクター：標的細胞比で、同時培養した。インキュベーションの４〜５時間後、培養プレートを、５分間、２００×ｇで遠心分離し、そして細胞から放出された放射標識を含む上清液の１００μｌアリコートを、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｒｅａｄｙ Ｃａｐｓに回収した。放射能を、液体シンチレーションカウンティングによって測定した。自発的に放出された放射能、および放出可能な全放射能を測定するために、標的細胞のみを含む培養物からの上清液、またはＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の添加によって溶解された標的細胞からの上清液を回収し、そして放射能を以前のように測定した。結果は、特異的溶解％として表され、以下の式に基づいて算定された：
特異的溶解パーセント＝１００×（ｃｐｍ試験−ｃｐｍ自発）／（ｃｐｍ全体−ｃｐｍ自発）、
ここでｃｐｍ試験は、特定の同時培養から放出された放射能であり、ｃｐｍ自発は、標的細胞培養物の自発的に放出された放射能であり、およびｃｐｍ全体は、標的細胞のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶解によって放出される放射能である。ＣＴＬアッセイを、３連で行い、そして平均値を提供した。
【００９５】
実験の結果を図１に示す。コントロール反応（すなわち、標的細胞と、免疫されていないマウスから調製されたエフェクター細胞との同時培養のクロミウム放出のアッセイ）は、１００のエフェクター：標的細胞比で、約１０％の溶解についてのバックグラウンド値を提供する。１：１または１０：１のＮＰ．Ｂ−ｈｓｐ７１混合物で免疫したマウスからのエフェクター細胞を用いて、バックグラウンドを超える、ＣＴＬ活性の増強は、何も観察されなかった。非常に増強された溶解は、ＮＰ．Ｂペプチドおよびｈｓｐ７１の１００：１の混合物で免疫したマウスからのエフェクター細胞を用いて見出され、これはＮＰ．Ｂのようなペプチドと、ｈｓｐ７１のようなｈｓｐとの同時免疫は、ペプチドを提示する細胞に対してＣＴＬ活性を、強烈に刺激し得ることを実証する。当該分野において周知であるように、ＤＰＢＳ中のＮＰ．Ｂペプチド単独での免疫は、ＣＴＬ活性を刺激しないことに注目のこと。
【００９６】
実施例３：ＮＰペプチドとｈｓｐ７０との化学結合体を含む組成物に対するＣＴＬ応答
ａ．ｈｓｐ７０およびＮＰペプチドの調製
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｈｓｐ７１を、実施例１に記載のように調製した。ＮＰ．Ｂペプチドを、ペプチドが過剰のアミノ末端システイン残基を含み、従ってアミノ酸配列ＣＶＱＩＡＳＮＥＮＭＥＴＭ（配列番号２）を有した以外は、実施例２で議論したように合成した。
【００９７】
ｂ．ｈｓｐ７０およびジフテリアトキソイドへのＮｐ．Ｂペプチドの化学結合
結合を、ｈｓｐ７０、およびＣＴＬ活性特異的刺激の効力の比較のための標準を提供する、一般的に使用されるキャリアタンパク質ジフテリアトキソイド（ＤＴと省略する；ＤＴを商業的供給源から得た）の両方を用いて行った。
【００９８】
ｂ．１．Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｈｓｐ７１およびＤＴキャリアタンパク質の活性化
９ｍｇのｈｓｐ７１を、４．５ｍｌの０．１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した。スルホ−ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル）（１００μｌジメチルスルホキサミン中２．３ｍｇ）をタンパク質に添加し、そして反応混合物を、室温で１時間インキュベートした。次いで、ｐＨを６．０に調整し、そして反応混合物を、４℃で一晩、１リットルの２０ｍＭリン酸ナトリウムおよび１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ５．６）に対して透析した。ＤＴを同様に処理した。
【００９９】
ｂ．２．結合のためのＮＰ．Ｂペプチドの調製
各結合反応のために、３ｍｇのペプチドを、１００μｌの０．１Ｍβ−メルカプトエタノールに溶解した。ペプチドの還元を可能にする１時間のインキュベーション後、還元剤を、反応混合物をＳｐｅｅｄＶａｃ遠心分離器において乾燥することにより除去した。ペプチドを０．５ｍｌ蒸留水に再溶解し、これに１Ｎ ＮａＯＨの５μｌアリコートを、ペプチドが完全に溶解するまで添加した。ＤＴとの結合実験のために、６ｍｇのペプチドを還元し、次いで１ｍｌの水に再溶解した。
【０１００】
ｂ．３．結合体形成
活性化キャリアタンパク質溶液のｐＨを、０．１Ｎ ＮａＯＨを用いて６．８に調整した。３ｍｇの活性化キャリアタンパク質を含む溶液を、連続的に混合しながら室温で３時間、０．５ｍｌの還元されたペプチド溶液（または、ＤＴとの結合体の調製については１ｍｌの還元されたペプチド溶液）と反応させた。未反応ペプチドを除去するために、得られた結合体含有溶液を、４℃で一晩、１リットルの２０ｍＭリン酸ナトリウムおよび１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７）に対して透析した。タンパク質濃度をＢＣＡアッセイにより決定した。この手順により達成された結合効率は、放射性標識されたＮＰ．Ｂペプチドを用いる前予備実験（ｐｒｉｏｒ ｐｉｌｏｔ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）において決定した。ペプチド：タンパク質比は、ＮＰ．Ｂ−ｈｓｐ７１結合体（７１．ＮＰ）については１７．５、そしてＮＰ．Ｂ−ＤＴ（ＤＴ．ＮＰ）については１０．１であると見出された。
【０１０１】
ｃ．マウスの免疫化およびエフェクター細胞の調製
１〜１００μｇの７１．ＮＰおよびＤＴ．ＮＰ結合体での免疫化ならびにエフェクター細胞の調製を、実施例２に記載のように行った。
【０１０２】
ｄ．ＣＴＬ活性アッセイ
アッセイを実施例２に記載のように行った。
【０１０３】
結果
得られた結果を図２に示す。ＤＰＢＳまたは１もしくは１０μｇのＤＴ．ＮＰ結合体を注射したマウスに由来するエフェクター細胞を用いたＣＴＬ活性アッセイは、ネガティブな結果を与えた（図２の最も下の線）。１００μｇのＤＴ．ＮＰを注射したエフェクター細胞のみが、１μｇの７１．ＮＰで免疫化したマウスに由来するエフェクター細胞のＣＴＬ活性に匹敵する、測定可能な（エフェクター：標的細胞比１００で５〜１０％溶解）ＣＴＬ活性を生じた。１０または１００μｇの７１．ＮＰ結合体で免疫化したマウスに由来するエフェクター細胞を用いたアッセイは、実質的に、より大きなＣＴＬ活性（すなわち、エフェクター：標的細胞比１００で１５〜２５％の標的細胞溶解）を示した。この実験は、ＮＰ．Ｂペプチドおよびｈｓｐ７１の例について、ペプチド−ｈｓｐ結合体での免疫化が、このペプチドを提示する細胞に対して指向される特異的ＣＴＬ活性を刺激することを証明する。
【０１０４】
実施例４：ｈｓｐ−ＮＰ融合タンパク質を含む組成物に対するＣＴＬ応答
ａ．ｈｓｐ−ＮＰ融合タンパク質の調製
ａ．１．マイコバクテリアｈｓｐ６５カルボキシ末端にＮＰ ＣＴＬエピトープを含む融合タンパク質をコードする発現プラスミドの調製
ｈｓｐ６５融合タンパク質の一部として、Ｈ−２ｂ ＣＴＬエピトープＮＰ．Ｂ（上記を参照のこと）またはＨ−２ｄ ＣＴＬエピトープＮＰ．Ｄ（ＮＰの残基１４７〜１５５；Ｌｅｖｉ，Ｒ．およびＡｒｎｏｎ，Ｒ．，Ｖａｃｃｉｎｅｓ，１４：８５−９２（１９９６）ならびに本明細書中の参考文献）を含むインフルエンザウイルスＮＰ配列を発現するプラスミドを構築した。
【０１０５】
ｐＥＴ系プラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ）に由来し、そして完全Ｍ．ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ ｈｓｐ６５遺伝子およびｈｓｐ６５遺伝子のカルボキシ末端でのさらなるコード配列の挿入に有用な制限部位を含む、発現ベクターｐＥＴ６５ｍｐを、予め構築した。このベクターの模式図を図３に提供する。
【０１０６】
プラスミドｐｃＤＮＡ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により提供されるサイトメガロウイルスプロモーターの制御下でインフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４株のＮＰのオープンリーディングフレームを含む構築物ｐＮＰ／ｃＡを、Ｐｅｔｅｒ Ｐａｌｅｓｅ博士（Ｄｅｐｔ．Ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｏｕｎｔ Ｓｉｎａｉ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）から得た。
【０１０７】
ＮＰ．ＢおよびＮＰ．Ｄエピトープを含むフラグメントの増幅のための２つのプライマー対を、自動化オリゴヌクレオチド合成機において合成し、そして日常的な手順を用いて精製した。正方向プライマーは、ＮＰ配列に相補的な適切な配列に加えてＥｃｏＲＩ制限部位を含み、そして逆方向プライマーはＳｐｅＩ制限部位を含んでいた。ＮＰ．Ｄフラグメントについての正方向プライマーは、配列５’ＡＡＡＧＡＡＧＡＡＴＴＣＡＧＧＣＧＡＡＴＣ（配列番号３）を有し、そして逆方向プライマーは、配列５’ＧＴＴＣＣＧＡＴＣＡＣＴＡＧＴＣＣＣＡＣＧ（配列番号４）を有した。この対は、ＮＰ残基１１７〜２００を含むフラグメントを増幅するように設計された。ＮＰ．Ｂフラグメントについての正方向プライマーは、配列５’ＣＴＧＣＴＴＧＡＡＴＴＣＡＧＣＣＡＡＧＴＧ（配列番号５）を有し、そして逆方向プライマーは、配列５’ＣＴＧＴＴＧＡＣＴＡＧＴＧＴＴＴＣＣＴＣＣ（配列番号６）を有した。後者の対は、ＮＰ残基３１０〜３９５を含むフラグメントを生成するように設計された。
【０１０８】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、上記のプライマー対およびＤＮＡテンプレートとしてｐＮＰ／ｃＡを用いて行った。ＰＣＲフラグメントを、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＳｐｅＩで２重消化し、そして日常的なサブクローニング手順（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９））を用いてＥｃｏＲＩ／ＳｐｅＩ切断ｐＥＴ６５ｍｐに連結した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α株の形質転換コンピテント細胞を連結混合物で形質転換し、そして１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む寒天にプレートした。形質転換された細胞のコロニーを単離し、そしてプラスミドＤＮＡを調製し、そして制限地図作成およびヌクレオチド配列決定により適切なｈｓｐ６５−ＮＰ．ＢまたはＤ融合遺伝子配列の存在について分析した。ｈｓｐ６５−ＮＰ．Ｂ（ｐＥＴ６５ｍｐ／Ｂ）およびｈｓｐ６５−ＮＰ．Ｄ（ｐＥＴ６５ｍｐ／Ｄ）融合タンパク質をコードする適切な構築物を同定し、そして細菌における融合タンパク質の発現およびそれらの精製がねらいの後の操作において使用した。融合タンパク質遺伝子構築物（それぞれ、ｐＥＴ６５ＭＰ／ＮＰ−ＢおよびｐＥＴ６５ＭＰ／ＮＰ−Ｄ）の模式図については図４Ａ〜４Ｂを参照のこと。
【０１０９】
ａ．２．ｈｓｐ６５−ＮＰ融合タンパク質の発現および精製
融合タンパク質構築物をＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１株（ＤＥ３；Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換し、そして融合タンパク質を、供給者の示唆したプロトコルに密接に類似したプロトコルを用いて、後者の株の６リットル培養物において発現させた。細胞を遠心分離により採集し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、および５ｍＭ β−メルカプトエタノール（ｐＨ７．５）に懸濁し、そして超音波処理により溶解した。不溶性物質を遠心分離により除去した後、硫酸アンモニウムを２０％飽和まで添加し、そして沈殿タンパク質を遠心分離により収集した。硫酸アンモニウムペレット中の融合タンパク質の存在を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてクマシーブルー染色により確認した。同じアッセイを使用して、後の全ての精製工程をモニターした。タンパク質を、３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、および５ｍＭ β−メルカプトエタノール（ｐＨ７．５）に再溶解し、そして溶液を、同じ緩衝液中で平衡化されたＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ファーストフロー（ｆａｓｔ ｆｌｏｗ）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）カラムに適用する前に、同じ緩衝液に対して徹底的に透析した。フロースルー画分（非結合タンパク質）を収集し、これは代表的に約９０ｍｇのタンパク質を含んでいた。ｈｓｐ６５−ＮＰ．Ｂ融合タンパク質をさらに精製するために、６０ｍｇの後者の画分を、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）に対して透析し、次いで、同じ緩衝液中で平衡化されたヒドロキシアパタイト（ＢＩＯＲＡＤ）カラムに適用した。溶出を、０〜６００ｍＭリン酸カリウム勾配を用いて行った。この手順は、約５ｍｇのタンパク質の回収しかもたらさなかった。次いで、カラムを４Ｍ 塩酸グアニジンでさらに溶出し、これによりさらに１５ｍｇのタンパク質が取り出された。この画分をＤＰＢＳに対して透析し、そしてフロースルー発熱物質除去（ｄｅｐｙｒｏｇｅｎａｔｉｏｎ）のためにＤｅｔｏｘｉｅｌカラムに適用する前に、Ａｍｉｃｏｎ限外濾過デバイスを用いて濃縮した。ｈｓｐ６５−ＮＰ．Ｄ融合タンパク質をさらに精製するために、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅフロースルー画分を、３０ｍＭ酢酸ナトリウム、２ｍＭ ＥＤＴＡ、および５ｍＭ β−メルカプトエタノール（ｐＨ５．８〜７．５）に対して透析し、次いで、同じ緩衝液中で平衡化されたＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ファーストフロー、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）カラムに適用した。溶出は、０〜６００ｍＭ ＮａＣｌ勾配を用いた。溶出されたｈｓｐ６５−ＮＰ．Ｄ融合タンパク質を、ｈｓｐ６５−ＮＰ．Ｂ融合タンパク質について記載されたように処理した。これらの手順により精製された融合タンパク質は、染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから評価されたように９０％を超えて純粋であり、そして実質的に発熱物質を含まなかった。
【０１１０】
ｂ．マウスの免疫化およびエフェクター細胞の調製
Ｃ５７ＢＬ／６マウスをｈｓｐ６５−ＮＰ．Ｂを用いた実験において使用し、そしてＢＡＬＢ／ｃマウスをｈｓｐ６５−ＮＰ．Ｄを用いた実験において使用したことを除いて、ＤＰＢＳ（図５および６において０μｇ ６５−ＮＰと呼ぶ）または１〜１００μｇのｈｓｐ６５−ＮＰ．Ｂもしくはｈｓｐ６５−ＮＰ．Ｄ融合タンパク質を用いた免疫化、ならびにエフェクター細胞の調製を、本質的に実施例２に記載のように行った。インビトロ再刺激を、（一般的に、Ｔ細胞増殖を刺激するために）３Ｕ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−２の非存在下または存在下のいずれかで７日間の期間にわたって行った。
【０１１１】
ｃ．ＣＴＬアッセイ
ＥＬ４（Ｈ−２ｂ）標的細胞をｈｓｐ６５−ＮＰ．Ｂ融合タンパク質を用いた実験において使用し、そしてＰ８１５（Ｈ−２ｄ）標的細胞をｈｓｐ６５−ＮＰ．Ｄ融合タンパク質を用いた実験に使用したことを除いて、アッセイを本質的に実施例２に記載のように行った。ＣＴＬ応答の特異性についてのさらなるコントロールを提供するために、標的細胞を、適切なＮＰペプチドでパルスしたか（図５Ａ〜５Ｂおよび図６Ａ〜６Ｂの黒記号）、ＨＰＶ１６Ｅ７タンパク質の配列に由来する無関係な残基４９〜５７ペプチドでパルスしたか（図５Ａ〜５Ｂの白記号）、またはパルスしなかった（図６Ａ〜６Ｂの白記号）。
【０１１２】
ｈｓｐ６５−ＮＰ．Ｂ融合タンパク質（６５−Ｐ．ｂと標識された）を用いた実験の結果を、図５Ａ〜５Ｂに示す。図５Ａは、エフェクター細胞をＩＬ２の非存在下で再刺激した実験を指し、そして図５Ｂは、エフェクター細胞をＩＬ２の存在下で再刺激した実験を指す。図５Ａから明らかなように、ｈｓｐ６５−ＮＰ．Ｂ融合タンパク質を用いた免疫化は、エフェクター：標的細胞比１００で標的細胞の約２０〜４０％溶解の範囲にわたる、ＮＰ．Ｂペプチドを提示する標的細胞に対して指向される特異的ＣＴＬ活性の劇的な刺激をもたらす。本質的に、特異的な溶解は、ＤＰＢＳ「免疫化」動物に由来するエフェクター細胞で観察されなかった。また、Ｅ７ペプチドでパルスされた細胞の有意な溶解は明らかでなかった。ＩＬ２の存在下で再刺激されたエフェクター細胞を用いる実験において、さらにより高いレベルの標的細胞溶解が、ｈｓｐ６５−ＮＰ．Ｂ融合タンパク質免疫化マウスに由来するエフェクター細胞で観察された。レベルは、融合タンパク質用量に依存して、エフェクター：標的細胞比１００で約２５〜６０％の範囲にわたった。これらの値は、ＤＰＢＳ注射マウスに由来するエフェクター細胞で観察された１０〜１５％溶解を大いに越えた。さらに、Ｅ７ペプチドでパルスされた標的細胞の有意な（ＤＰＢＳ「免疫化」マウスに由来するエフェクター細胞で観察された特異的溶解より大きな）特異的溶解は観察されなかった。
【０１１３】
ｈｓｐ６５−ＮＰ．Ｄ融合タンパク質（６５−ＮＰ．Ｄと標識された）を用いた実験の結果を、図６Ａ〜６Ｂに示す。一般的に、これらの結果は、ｈｓｐ６５−ＮＰ．Ｂ融合タンパク質を用いた実験において得られた結果に類似する。ｈｓｐ６５−ＮＰ．Ｂを用いた以前の実験とは異なり、免疫化に使用されたｈｓｐ６５−ＮＰ．Ｄペプチドの用量への明らかな依存がこの実験において観察されたことに留意のこと。全体として、例としてｈｓｐ６５−ＮＰ融合タンパク質を使用するこれらの実験は、ｈｓｐ外来ペプチド／ポリペプチド融合タンパク質を用いる免疫化が、外来ペプチド／ポリペプチド融合パートナーに含まれるエピトープを提示する適切な標的細胞に対して指向されるＣＴＬ活性の激烈な刺激をもたらすことを証明する。
【０１１４】
実施例５．ｈｓｐ−Ｐ１Ａ融合タンパク質に対するＣＴＬ応答
上記の実施例において使用された手順に類似した手順を用いて、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓストレスタンパク質ｈｓｐ７１の完全コード配列、およびｈｓｐ７１配列のカルボキシ末端に付加された、腫瘍関連抗原Ｐ１Ａの最小ＣＴＬエピトープ（ＬＰＹＬＧＷＬＶＰ（配列番号７）；この配列を本実施例においてＰ１Ａと呼ぶ）をコードする合成配列の４つのタンデムに配置されたコピーを含む融合遺伝子のＥ．ｃｏｌｉにおける発現を可能にする、プラスミドを構築した。Ｈｓｐ７１−Ｐ１Ａ融合タンパク質（図７Ａ、７Ｂ、８Ａ、８Ｂ、および９において７１−Ｐ１Ａ（４）と呼ぶ）を発現させ、そして上記の実施例において使用された方法に類似した標準的な生化学的方法を用いて精製した。
【０１１５】
ＢＡＬＢ／ｃまたはＤＢＡ／２（Ｈ−２ｄ）マウスを、塩酸ケタミンの腹腔内注射により麻酔した。次いで、マウスを、０、５、５０、または５００μｇのｈｓｐ７１−Ｐ１Ａ融合タンパク質を用いて首の項部に皮下免疫化した。免疫原を、アジュバントを伴わずにＤＰＢＳ中で投与した。１週間後、１群あたり４つのプールされた脾臓に由来する単細胞懸濁物を調製し、そして合成ペプチドＣＫＫＫＬＰＹＬＧＷＬＶＰ（配列番号８）（１μＭ）を用いて７日間インビトロで再刺激した。ＣＫＫＫ残基はＰ１Ａ ９量体の水性溶解度（ａｑｕｅｏｕｓ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）を増強するために添加されたことに留意のこと。次いで、再刺激されたエフェクター細胞を、５１Ｃｒ標識標的細胞と共に４〜５時間培養した。標的は、エフェクター：標的比１００、３３、または１１：１で、Ｐ８１５肥満細胞腫のＰ１Ａ抗原発現クローンＰ１（Ｈ−２ｄ）細胞、または（ＣＫＫＫ）Ｐ１ＡでパルスされたＬ１２１０細胞（Ｈ−２ｄ）、あるいはコントロール標的としてのパルスされていないＬ１２１０細胞であった。標的細胞の特異的溶解を、実施例２に記載のように決定した。これらの実験の結果を、図７Ａ〜７Ｂ（ＢＡＬＢ／ｃマウス）および図８Ａ〜８Ｂ（ＤＢＡ／２マウス）に示す。これらの実験におけるバックグラウンド溶解は、無関係な標的細胞（パルスされていないＬ１２１０細胞）に対して観察された溶解活性により示されるように、５％未満であった。非免疫化マウス（０μｇ）に由来する再刺激細胞は、Ｐ１標的細胞（図７Ａ、８Ａ）に対してもＣＫＫＫ（Ｐ１Ａ）パルスＬ１２１０細胞（図７Ｂ、８Ｂ）に対しても溶解活性を示さなかった。５μｇほどの少ないｈｓｐ７１−Ｐ１Ａ融合タンパク質で免疫化したマウスに由来する細胞は、測定可能な溶解活性を示し、最大応答は、５０〜５００μｇで免疫化したマウスに由来する細胞において見られた。
【０１１６】
実施例６：ｈｓｐ７１−Ｐ１Ａ融合タンパク質で免疫化したマウスの腫瘍抗原投与
３回の注射を２週間間隔で与えた以外は、マウスを上記の実施例のように免疫化した。最後の注射の２週間後、１０００個の生存可能なＰ１腫瘍細胞の腹腔内注射により、マウスに抗原投与した。２６日後、マウスを安楽死させ、秤量し、そして腹部内容物の全ての塊を解剖し、そして秤量した。この実験の結果を図９に示す。ｈｓｐ７１−Ｐ１Ａ融合タンパク質を用いた３回の５０μｇ免疫化を与えたマウスでは、総体重のパーセントとして表される腹部内容物の質量は、非免疫化マウス（０μｇ、Ｐ＜０．０３）において見出された質量より有意に少なく、そして腫瘍細胞を注射しなかったマウス（コントロール）において観察された質量と同様であったことが観察された。
【０１１７】
全体として、実施例５および６における実験は、例としてｈｓｐ７１−Ｐ１Ａを用いた、ｈｓｐ−腫瘍関連抗原を用いた免疫化が、無関係なＭＨＣクラスＩ拘束エピトープを提示する細胞に対して指向されるＣＴＬ活性の実質的な刺激をもたらすことを証明する。さらに、このような免疫化は、関連したエフェクター機能の発現、すなわち免疫化された抗原を発現する腫瘍を用いた抗原投与に対する免疫を導く。
【０１１８】
等価物
当業者は、本明細書中に記載された本発明の特定の実施態様に対する多くの等価物がわかるか、または単に日常的実験を用いてこれらを確かめ得る。これらおよび他の全ての等価物は、以下の請求の範囲に含まれることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】図１は、エフェクター：標的比対％特異的細胞溶解のグラフであり、核タンパク質（ＮＰ）ペプチドおよび熱ショックタンパク質７０（ｈｓｐ７０）を含む混合物に対するマウスにおける細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答を示す。
【図２】図２は、エフェクター：標的比対％特異的細胞溶解のグラフであり、ＮＰペプチドおよびｈｓｐ７０の化学結合体を含む組成物に対するマウスにおけるＣＴＬ応答を示す。
【図３】図３は、ベクターｐＥＴ６５ＭＰの模式図である。
【図４Ａ】図４Ａは、ベクターｐＥＴ６５ＭＰ／ＮＰ−Ｂの模式図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ベクターｐＥＴ６５ＭＰ／ＮＰ−Ｄの模式図である。
【図５】図５Ａ〜５Ｂは、エフェクター：標的比対％特異的細胞溶解のグラフであり、ｈｓｐ−ＮＰ融合タンパク質のｈｓｐ６５−ＮＰ．Ｂに対するマウスにおけるＣＴＬ応答を示し、ここでエフェクター細胞をＩＬ−２の不在下（図５Ａ）およびＩＬ−２の存在下（図５Ｂ）において再刺激した。
【図６】図６Ａ〜６Ｂは、エフェクター：標的比対％特異的細胞溶解のグラフであり、ｈｓｐ−ＮＰ融合タンパク質のｈｓｐ６５−ＮＰ．Ｄに対するマウスにおけるＣＴＬ応答を示し、ここでエフェクター細胞をＩＬ−２の不在下（図６Ａ）およびＩＬ−２の存在下（図６Ｂ）において再刺激した。
【図７】図７Ａ〜７Ｂは、エフェクター：標的比対％特異的細胞溶解のグラフであり、ｈｓｐ−Ｐ１Ａ融合タンパク質で免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＣＴＬ応答を示す。
【図８】図８Ａ〜８Ｂは、エフェクター：標的比対％特異的細胞溶解のグラフであり、ｈｓｐ−Ｐ１Ａ融合タンパク質で免疫したＤＢＡ／２（Ｈ−２ｄ）マウスにおけるＣＴＬ応答を示す。
【図９】図９は、ｈｓｐ−腫瘍関連抗原のｈｓｐ７１−Ｐ１Ａでの免疫が、関連のＭＨＣクラス１拘束されたエピトープを提示する細胞に対するＣＴＬ活性の刺激を生じることを示す棒グラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載されるような、組成物。
【請求項１】
本明細書に記載されるような、組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２００８−２１４３６０（Ｐ２００８−２１４３６０Ａ）
【公開日】平成２０年９月１８日（２００８．９．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１２２７８７（Ｐ２００８−１２２７８７）
【出願日】平成２０年５月８日（２００８．５．８）
【分割の表示】特願平１０−５２４０８１の分割
【原出願日】平成９年１１月２５日（１９９７．１１．２５）
【出願人】（５０８１３８０６９）ヌベンタ バイオファーマスティカル コーポレイション (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年９月１８日（２００８．９．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月８日（２００８．５．８）
【分割の表示】特願平１０−５２４０８１の分割
【原出願日】平成９年１１月２５日（１９９７．１１．２５）
【出願人】（５０８１３８０６９）ヌベンタ バイオファーマスティカル コーポレイション (1)
【Ｆターム（参考）】
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