スーパーオキシドジスムターゼをコードするＡＡＶベクター
本発明は、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）をコードするアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、ＳＯＤ遺伝子を標的細胞に送達させるために用いられ得るベクターに関する。標的細胞は、ＳＯＤの標的細胞への送達が対象に対して治療上の利点および／または治療上の効果をもたらす、疾患または状態を有する対象内であってもよい。別の態様において、本発明は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の処置における有効性について化合物をスクリーニングするためのモデル系に関する。モデル系は、ＳＯＤ遺伝子をコードするＡＡＶベクターを用いて形質導入された複数の細胞を含んでいてもよく、形質導入された細胞は、ＡＬＳと関連する表現型変化を示してもよい。本発明のモデル系を用いて、ＡＬＳの処置における有効性について化合物がスクリーニングされ得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下、２００５年７月７日に出願された米国仮出願番号第６０／６９７，４５０（その内容は、引用により本明細書に取り込まれる）に基づく優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の処置における有効性について化合物をスクリーニングするためのインビトロモデルに関する。本発明はまた、遺伝子治療ベクターおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
神経変性疾患は主要な公衆の健康問題を提起する。例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、運動ニューロンの選択的死滅に伴って生じる、容赦なく進行する致命的な疾患である。ＡＬＳに関するさらなる情報を、Online Mendelian Inheritance in Man（ＯＭＩＭ）エントリー番号１０５４００、およびRowland and Shneider (2001) Amyotrophic lateral sclerosis, New Eng. J. Med. 344: 1688-1700（これらの開示内容は全体として引用により本明細書に取り込まれる）において見出すことができる。
【０００４】
スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）をコードする遺伝子における変異は、ＡＬＳと関連する。ＳＯＤの３種類の変異体が哺乳類において存在することが知られている。細胞質ＳＯＤは、ＳＯＤ１によりコードされる銅亜鉛酵素（Ｃｕ／Ｚｎ ＳＯＤ）である（Weisiger and Fridovich (1973) J. Biol. Chem. 248, 4793-4796）。後述の通り、ＳＯＤ１における遺伝子欠損は、家族性筋萎縮性側索硬化症（ｆＡＬＳ）と関連する。ミトコンドリアＳＯＤ（ＭｎＳＯＤ）はマンガンと関連し、ＳＯＤ２によりコードされる。Ｌｉ等（(1995) Nature Genetics 11, 376-381）は、ＳＯＤ２をコードする遺伝子が不活性化されている変異体マウスを記載している。ＳＯＤ３によりコードされ（Carlsson et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 6264-6268）、かつ銅および亜鉛を含有する第３の哺乳類ＳＯＤは、主として細胞外に位置する。この遺伝子の不活性化は、明白な表現型をもたらさない。
【０００５】
約２０％のｆＡＬＳがＳＯＤ１遺伝子における変異と結び付けられる（Julien, J.P., Cell (2001) 104: 581-591）。グリシン９３がアラニンに変異している（Ｇ９３Ａ）、変異体ＳＯＤ１遺伝子を過剰発現するトランスジェニックマウスは、ｆＡＬＳの臨床的特徴および病理学的特徴の多くを有する優性遺伝性成人発症麻痺性障害を発症する（Gurney et al., Science (1994) 264: 1772-1775）。しかしながら、これまでに、ＡＬＳおよび大抵の運動ニューロン疾患において運動ニューロン変性を導く分子機序は依然ほとんど分からないままであり、ＡＬＳを予防または治癒するのに利用可能な治療は現在存在しない。
【０００６】
ＡＬＳを処置する際に有効な化合物のスクリーニング方法は効率的でなく、多大な労力を要し、薬物の発見を妨げるものである。上述のＡＬＳトランスジェニックマウスは、候補化合物の有効性を評価するための有用なインビボ方法を表すが、マウスを用いた実験は、比較的高価であり、時間のかかるものであり、ハイスループットスクリーニングにあまり適さない。他の実験は、死後のヒト試料における遺伝子発現の研究に頼ったものであり、そしてそれは十分でなく、制御された実験的操作に従わない。
【０００７】
ＡＬＳの効率的なインビトロモデルは、可能性のある治療用化合物の迅速スクリーニングを促進するだろう。インビトロで有益な効果を示す化合物は、次に、さらなる試験、例えば、上述のトランスジェニックマウスを用いてさらに確認され得る。しかしながら、既存のインビトロ方法は、ハイスループットスクリーニングに適していない。例えば、ある方法では、初代培養中の個々の細胞に変異体ＳＯＤ１遺伝子（例えば、Ｇ９３Ａ）をコードするプラスミドを用いてマイクロインジェクションし、ＡＬＳにおける同じ変異体遺伝子の過剰発現の効果を模倣する。次に、かかる細胞を目的の化合物で処理して、該化合物が、凝集体または封入体の形成などのＳＯＤ１の過剰発現と関連する表現型効果（複数を含む）を逆転させることができるかどうかを決定することができる。しかしながら、マイクロインジェクションは多大な労力を要し、かつ制限された数の細胞のみに行うことができる。そしてそのことが、統計上確かな結果を得ることを難しくする。
【０００８】
ＡＬＳの効果を逆転させるか、あるいは改善する際の有効性について化合物をスクリーニングするためのモデル系の必要が存在し、そしてモデルは、ハイスループットスクリーニングに従い、統計上有意な数の細胞の評価により目的の化合物の有効性を決定することを可能にするべきである。
【０００９】
野生型ＳＯＤ（変異体ではない）は、治療剤として有用であるかもしれない。多くの障害は、酸化的ストレス、すなわち、スーパーオキシドなどの細胞において有害な反応性酸素種（ＲＯＳ）が存在することの結果である。例えば、Cash et al. (2004) Med. CheO. Rev. 1: 19-23を参照されたい。スーパーオキシドジスムターゼは、スーパーオキシドの過酸化水素および分子酸素への変換を触媒する。ＳＯＤにより生成される過酸化水素は、続いて、カタラーゼにより分子酵素および水に変換され、スーパーオキシドのより反応性の低い、従ってより損傷を与えない形態の酸素への変換が完了する。
【００１０】
ビタミンＡ、ビタミンＣ、グルタチオン、ビタミンＥ、カロチン、リポ酸およびコエンザイムＱ１０などの酸化防止剤を投与して、かかる種の生成および蓄積を低減することができるが、かかる剤は、全身投与されたとき、細胞内で有効なレベルまで蓄積することができない。代替物として、酵素ＳＯＤのかかる細胞への徐放性送達が、スーパーオキシド蓄積の有害な効果を低減することを助けるかもしれない。
【００１１】
ＳＯＤ活性の恩恵を受け得る対象の細胞にＳＯＤ遺伝子を送達することができる治療ベクターおよび方法の必要が存在する。かかる対象は、スーパーオキシドの過剰生成または蓄積を引き起こす障害に罹患しているもの、過剰スーパーオキシド生成または蓄積を引き起こす環境条件にさらされたもの、および正常な加齢と関連する累積酸化的損傷に従うものでさえも含む。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
１の態様において、本発明は、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）をコードするアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに関する。１つの実施態様において、ＳＯＤはＳＯＤ１である。別の実施態様において、ＳＯＤ１遺伝子は、Ｇｌｙ９３ＡｌａなどのＡＬＳと関連する変異を含有する。
【００１３】
１つの実施態様において、ＳＯＤをコードするＡＡＶベクター（ＡＡＶ−ＳＯＤ）を用いて、ＳＯＤ遺伝子が標的細胞に送達される。１つの実施態様において、標的細胞は、ＳＯＤの標的細胞への送達が治療上の利点をもたらす、疾患または状態を有する対象内にある。ある実施態様において、ＳＯＤの送達は対象に対して治療効果をもたらす。他の実施態様において、疾患または状態は、パーキンソン病、ハンチントン病、変性性眼疾患（例えば、黄斑変性症、網膜色素変性症）、アルツハイマー病、関節リウマチ、クローン病、ペイロニー病、潰瘍性大腸炎、脳虚血（脳卒中）、心筋梗塞（心臓発作）、脳損傷および／または脊髄損傷、再かん流傷害、ＡＬＳ、ダウン症、白内障、統合失調症、てんかん、ヒト白血病および他の癌、ならびに糖尿病からなる群より選択される。
【００１４】
別の態様において、本発明は、Ｇｌｙ９３ＡｌａなどのＡＬＳと関連する変異を含有するＳＯＤ１遺伝子をコードするＡＡＶベクターを用いて形質導入された複数の細胞を含む、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の処置における有効性について化合物をスクリーニングするためのモデル系に関する。種々の実施態様において、本発明のＡＡＶベクターは、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−５またはＡＡＶ−６に由来する。
【００１５】
１つの実施態様において、ＡＡＶベクターを用いて形質導入された複数の細胞は、それらが見出される集団、例えば、齧歯類脊髄由来細胞の初代培養物における少なくとも８０％の細胞を含む。
【００１６】
ある実施態様において、形質導入された細胞は、ＡＬＳと関連する表現型変化を示す。他の実施態様において、１種類以上のスクリーニングされた化合物が、この表現型変化を低減するか、あるいは改善する。
【００１７】
なお別の実施態様において、本発明は、本発明のモデル系を用いて、ＡＬＳの処置における有効性について化合物をスクリーニングする方法に関する。
【００１８】
図面の簡単な説明
図１は、ｐＶｍ−Ｇ９３ＡＳＯＤと称される、ｈＳＯＤ１−Ｇｌｙ９３Ａｌａの送達用ｒＡＡＶベクターの概略図である。ｈＳＯＤ１−Ｇｌｙ９３Ａｌａの発現は、ニワトリβ−アクチンプロモーターによりもたらされる。発現カセットは、２つのＡＡＶ−２ ＩＴＲ配列の間に位置する。ＳＯＤ１−Ｇｌｙ９３Ａｌａは、本明細書において「変異体」ＳＯＤとも称される。
【００１９】
図２は、ｐＶｍ−ＷＴＳＯＤと称される、野生型ヒトＳＯＤ１の送達用ｒＡＡＶベクターの概略図である。ｗｔＳＯＤ１の発現は、ニワトリβ−アクチンプロモーターによりもたらされる。発現カセットは、２つのＡＡＶ−２ ＩＴＲ配列の間に位置する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明の実施は、特に示さない限り、ウイルス学、微生物学、細胞および分子生物学、ならびに組換えＤＮＡ技術の当業者において通常の方法を利用する。かかる技術は文献において十分に説明されている。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Current Edition)；DNA Cloning: A Practical Approach, Vol. I & II (D. Glover, ed.)；Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., Current Edition)； Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., Current Edition)；Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., Current Edition)；CRC Handbook of Parvoviruses, vol. I & II （P. Tijssen, ed.）；Fundamental Virology, 2nd Edition, vol. I & II (BN. Fields and D.M. Knipe, eds.)；Freshney, Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique (Wiley-Liss, Third Edition）；およびAusubel et al. (1991) Current Protocols in Molecular Biology（Wiley Interscience, NY）を参照されたい。
【００２１】
本明細書において引用される全ての刊行物、特許、特許出願およびデータベース入力（ＯＭＩＭ入力を含む）は、全体として引用により本明細書に取り込まれる。
【００２２】
本発明は、ＡＬＳのインビトロモデル系を作成するために用いられ得るか、あるいは治療剤として用いられ得るＳＯＤをコードするＡＡＶベクターに関する。
【００２３】
ＡＬＳと関連するＳＯＤ１変異
ＡＬＳモデル系に関する本発明の態様において、ＡＡＶベクターによりコードされるＳＯＤ遺伝子は、ＡＬＳと関連する変異を含む。本明細書で用いられる「ＡＬＳと関連する変異」は、ＡＬＳを有さない対象においてより、ＡＬＳを有する対象において高い頻度で生じるＳＯＤ遺伝子における変異をいう。ｗｔＳＯＤ１のアミノ酸配列を表１にて示す。ＳＯＤ１における既知の変異は、Ａｌａ４Ｓｅｒ、Ａｌａ４Ｔｈｒ、Ａｌａ４Ｖａｌ（Ａ４Ｖ；１４７４５０．００１２）、Ｃｙｓ６Ｇｌｙ、Ｃｙｓ６Ｐｈｅ、Ｖａｌ７Ｇｌｕ、Ｌｅｕ８Ｖａｌ、Ｌｅｕ８Ｇｌｎ、Ｇｌｙ１０Ｖａｌ、Ｇｌｙ１２Ａｒｇ、Ｖａｌ１４Ｍｅｔ、Ｖａｌ１４Ｇｌｙ、Ｇｌｙ１６Ａｌａ、Ｇｌｙ１６Ｓｅｒ、Ａｓｎ１９Ｓｅｒ、Ｐｈｅ２０Ｃｙｓ、Ｇｌｕ２ｌＧｌｙ、Ｇｌｕ２１Ｌｙｓ、Ｇｌｎ２２Ｌｅｕ、Ｇｌｙ３７Ａｒｇ（Ｇ３７Ｒ；１４７４５０．０００１）、Ｌｅｕ３８Ａｒｇ、Ｌｅｕ３８Ｖａｌ（Ｌ３８Ｖ；１４７４５０．０００２）、Ｇｌｙ４１Ａｓｐ（Ｇ４１Ｄ；１４７４５０．０００４）、Ｇｌｙ４１Ｓｅｒ、Ｈｉｓ４３Ａｒｇ、Ｐｈｅ４５Ｃｙｓ、Ｈｉｓ４６Ａｒｇ（Ｈ４６Ｒ；１４７４５０．００１３）、Ｖａｌ４７Ｐｈｅ、Ｈｉｓ４８Ａｒｇ、Ｈｉｓ４８Ｇｌｎ、Ｇｌｕ４９Ｌｙｓ、Ｔｈｒ５４Ａｒｇ、Ｃｙｓ５７Ａｒｇ、Ｓｅｒ５９Ｉｌｅ、Ａｓｎ６５Ｓｅｒ、Ｌｅｕ６７Ａｒｇ、Ｇｌｙ７２Ｃｙｓ、Ｇｌｙ７２Ｓｅｒ、Ａｓｐ７６Ｔｙｒ、Ａｓｐ７６Ｖａｌ、Ｈｉｓ８０Ａｌａ、Ｈｉｓ８０Ａｒｇ、Ｌｅｕ８４Ｖａｌ、Ｇｌｙ８５Ａｒｇ、Ａｓｎ８６Ａｓｐ、Ａｓｎ８６Ｓｅｒ、Ｖａｌ８７Ｍｅｔ、Ｖａｌ８７Ａｌａ、Ａｌａ８９Ｔｈｒ、Ａｌａ８９Ｖａｌ、Ａｓｐ９０Ａｌａ、Ａｓｐ９０Ｖａｌ、Ｇｌｙ９３Ａｌａ（Ｇ９３Ａ；１４７４５０．０００８）、Ｇｌｙ９３Ａｒｇ、Ｇｌｙ９３Ａｓｐ、Ｇｌｙ９３Ｃｙｓ（Ｇ９３Ｃ；１４７４５０．０００７）、Ｇｌｙ９３Ｓｅｒ、Ｇｌｙ９３Ｖａｌ、Ａｌａ９５Ｔｈｒ、Ａｓｐ９６Ａｓｎ、Ｖａｌ９７Ｍｅｔ、Ｇｌｕ１００Ｇｌｙ、Ｇｌｕ１００Ｌｙｓ、Ａｓｐ１０１Ａｓｎ、Ａｓｐ１０１Ｇｌｙ、Ａｓｐ１０１Ｈｉｓ、Ｉｌｅ１０４Ｐｈｅ、Ｌｅｕ１０６Ｖａｌ、Ｉｌｅ１１３Ｔｈｒ（Ｉ１１３Ｔ；１４７４５０．００１１）、Ｌｅｕｌ２６Ｔｅｒ、Ｓｅｒ１３４Ａｓｎ、Ｌｅｕｌ４４Ｓｅｒ、およびＡｌａｌ４５Ｔｈｒを含む。変異の後に数字が存在する場合、それらの変異のＯＭＩＭ参照番号を表す。ＳＯＤ１変異は、Rosen et al., (1993) Mutations in Cu/Zn superoxide dismutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis, Nature 362: 59-62；Cudkowic et al., (1997) Epidemiology of mutations in superoxide dismutase in amyotrophic lateral sclerosis, Ann. Neurol. 41: 210-221；Belleroche et al., (1995) Familial amyotrophic lateral sclerosis/motor neuron disease (FALS): a review of current developments, J. Med. Genet. 32: 841-847においても開示されている。ＳＯＤ１における多数の変異が本明細書において開示されているが、これらの変異体の全てがＡＬＳの疾患モデルを作成する際に有用であるわけではない。
【００２４】
表１：ｗｔＳＯＤ１のアミノ酸配列
【表１】
【００２５】
アデノ随伴ウイルスベクター
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、遺伝子治療用遺伝子を送達するために首尾よく用いられており、ヒトでの臨床試験は、かなり有望であることを示している（例えば、Kay et al., Nat. Genet. (2000) 24: 257-261を参照）。単に、非病原性かつ複製欠損ウイルスに基づくウイルスベクター系として、組換えＡＡＶビリオンは、検出可能な免疫応答または毒性なしで、種々の組織において増殖細胞および最終分化細胞の両方の効率的かつ徐放性の遺伝子伝達を確立するために首尾よく用いられてきた（Bueler, H., Biol. Chem. (1999) 380: 613-622）。
【００２６】
ＡＡＶゲノムは、約４６８１個のヌクレオチドを含有する直鎖状の１本鎖ＤＮＡ分子である。ＡＡＶゲノムは、一般に、逆方向末端反復（ＩＴＲ）により各末端上で隣接される内部非反復ゲノムを含む。ＩＴＲは、およそ１４５塩基対（ｂｐ）の長さである。ＩＴＲは、ＤＮＡ複製開始点としての機能、およびウイルスゲノムのパッケージングシグナルとしての機能を含む、複数の機能を有する。ゲノムの内部非反復部分は、ＡＡＶ複製（ｒｅｐ）およびキャプシド（ｃａｐ）遺伝子として知られている２つの巨大なオープンリーディングフレームを含む。ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、ウイルスが複製され、ビリオンにパッケージングされることを可能にするウイルスタンパク質をコードする。特に、少なくとも４種類のウイルスタンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、およびＲｅｐ４０（それらの見かけ分子量に従い命名）のファミリーは、ＡＡＶｒｅｐ領域から発現する。ＡＡＶｃａｐ領域は、少なくとも３種類のタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３をコードする。
【００２７】
ＡＡＶは、ＡＡＶゲノムの内部非反復部分（すなわち、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子）を欠損させ、ＩＴＲ間に異種遺伝子を挿入することにより、目的の遺伝子を送達するように操作されている。異種遺伝子は、典型的には、適当な条件下で患者の標的細胞において遺伝子発現をもたらすことができる異種プロモーター（恒常的、細胞特異的、または誘導可能）に機能的に結合される。ポリアデニル化部位などの終結シグナルも含まれ得る。
【００２８】
ＡＡＶはヘルパー依存性ウイルスである。すなわち、それは、野生でＡＡＶビリオンを形成するために、ヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、またはワクシニア）との共感染を必要とする。ヘルパーウイルスとの共感染がない場合、ＡＡＶは、ウイルスゲノムは宿主細胞の染色体に挿入されているが、感染性ビリオンは生成されない、潜伏状態を確立する。後のヘルパーウイルスによる感染が、組み込まれたゲノムを「レスキューし」、ゲノムを複製し、そのゲノムを感染性ＡＡＶビリオンにパッケージングすることを可能にする。ＡＡＶは異なる種由来の細胞に感染することができ、ヘルパーウイルスは宿主細胞と同じ種のものでなければならない。従って、例えば、ヒトＡＡＶは、イヌアデノウイルスに共感染したイヌ細胞において複製する。
【００２９】
本発明の好ましい実施態様において、三重トランスフェクション法（全体として引用により本明細書に取り込まれる、米国特許第６，００１，６５０号において詳細に記載）を用いて、ｒＡＡＶビリオンを生成する。なぜならこの方法は感染性ヘルパーウイルスの使用を必要とせず、ｒＡＡＶビリオンが検出可能なヘルパーウイルスが全く存在することなく生成されることを可能にするからである。これは、ｒＡＡＶビリオン生成用の３種類のベクター：ＡＡＶヘルパー機能ベクター、補助機能ベクター、およびｒＡＡＶ発現ベクターを用いることにより成し遂げられる。当業者は、これらのベクターによりコードされる核酸配列が、種々の組み合わせの２種類以上のベクター上でもたらされ得ることを理解する。
【００３０】
ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、ＡＡＶヘルパー機能配列（すなわち、ｒｅｐおよびｃａｐ）をコードし、そしてそれは増殖性ＡＡＶ複製およびキャプシド形成のためトランスに機能する。好ましくは、ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、機能的ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含有する検出可能なＡＡＶビリオンを全く作成することなく、効率的なＡＡＶベクター生成を支持する。かかるベクターの一例であるｐＨＬＰ１９が、米国特許第６，００１，６５０号（全体として引用により本明細書に取り込まれる）に記載されている。ＡＡＶヘルパー機能ベクターのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、上で説明された既知のＡＡＶ血清型のいずれかに由来し得る。例えば、ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、ＡＡＶ−２由来のｒｅｐ遺伝子、およびＡＡＶ−６由来のｃａｐ遺伝子を有していてもよい。当業者は、他のｒｅｐとｃａｐ遺伝子の組み合わせが可能であることを理解し、決定的特徴はｒＡＡＶビリオンの生成を支持することができることである。
【００３１】
補助機能ベクターは、本明細書において補助機能と称される、ＡＡＶが複製のため依存する非ＡＡＶ由来ウイルスおよび／または細胞機能のヌクレオチド配列をコードする。補助機能はＡＡＶ複製に必要とされるそれらの機能を含み、そしてそれは、ＡＡＶ遺伝子転写、ステージ特異的ＡＡＶ ｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶ ＤＮＡ複製、ｃａｐ発現産物の合成、およびＡＡＶキャプシド構築の活性化に関与する部分を含むが、これらに限定されない。ウイルスベースの補助機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス１型以外）、およびワクシニアウイルスなどの周知のヘルパーウイルスのいずれかに由来し得る。好ましい実施態様において、補助機能プラスミドｐＬａｄｅｎｏ５が用いられる。ｐＬａｄｅｎｏ５に関する詳細は、米国特許第６，００４，７９７号（全体として引用により本明細書に取り込まれる）において記載されている。このプラスミドは、ＡＡＶベクター生成のためのアデノウイルス補助機能の完全なセットを提供するが、複製コンピテントアデノウイルスを形成するのに必要な要素を欠く。
【００３２】
組換えＡＡＶ発現ベクター
組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）発現ベクターは、制御エレメント（転写開始領域を含む）、目的のＳＯＤコードポリヌクレオチド、および転写終結領域を含む、作動可能に結合した要素を提供するよう、既知の技術を用いて構築される。得られたコンストラクトは、機能性ＡＡＶ ＩＴＲ配列と（５’および３’）結合した作動可能に結合した成分を含有する。
【００３３】
ＡＬＳ研究用のモデル系を対象とする実施態様において、哺乳類神経細胞において機能する制御エレメントが選択される。治療上使用するためのＡＡＶ−ＳＯＤベクターを対象とする実施態様において、目的の標的細胞または組織において機能的である制御エレメントが選択される。本発明のある実施態様において、組織特異的かつ調節可能な制御エレメントが望まれるが、他の実施態様は、恒常的プロモーターの使用を含む。
【００３４】
ＡＡＶ ＩＴＲ領域のヌクレオチド配列は知られている。例えば、ＡＡＶ−２配列について、Kotin, R.M. (1994) Human Gene Therapy 5: 793-801；Berns, K.I. "Parvoviridae and their Replication" in Fundamental Virology, 2nd Edition, (B.N. Fields and D.M. Knipe, eds.)を参照されたい。本発明のベクターにおいて用いられるＡＡＶ ＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列を有する必要はなく、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失または置換により変化していてもよい。加えて、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７およびＡＡＶ−８などを含むが、これらに限定されない、いくつかのＡＡＶ血清型のいずれかに由来してもよい。ＡＡＶ ＩＴＲはまた、例えば、マウス、ヤギ、またはウシ供給源から単離されたＡＡＶ変異体に由来してもよい。さらに、意図された通り機能する、すなわち、宿主細胞ゲノムまたはベクターから目的の配列を切除し、レスキューすることを可能にし、かつＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子産物が細胞に存在するとき、レシピエント細胞ゲノムへのＤＮＡ分子の組み込みを可能にする限り、ＡＡＶ発現ベクターにおいて選択されたヌクレオチド配列に隣接する５’および３’ＩＴＲは、同じＡＡＶ血清型または単離物と同一であるか、あるいはそれに由来することは必ずしも必要としない。
【００３５】
異なるＡＡＶ血清型を用いて、異なる細胞種類を特異的に標的にすることができる。例えば、種々の実施態様において、本発明のベクターは、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−５およびＡＡＶ−６に由来する。例えば、初代ラット運動ニューロン培養物において、ＡＡＶ−６由来ベクターは、主としてニューロンにおいてＳＯＤ発現を指令し、ＡＡＶ−２由来ベクターは、ニューロンとグリアの両方においてＳＯＤ発現を指令し、そしてＡＡＶ−５由来ベクターは、主としてグリアにおいてＳＯＤ発現を指令する。ｈＳＯＤ１−Ｇｌｙ９３Ａｌａは、ＡＡＶ−２由来ベクターを用いて送達されたとき、病変と関連する運動ニューロンにおける形態学的変化を引き起こすが、ＡＡＶ−５由来ベクターを用いて送達されたとき、運動ニューロンにおいて病変を引き起こさない。
【００３６】
ＡＡＶ−ＳＯＤの治療上の使用
ｒＡＡＶ−ＳＯＤの治療上の使用に関する本発明の種々の実施態様において、ｒＡＡＶベクターを用いて、ＳＯＤ１、ＳＯＤ２もしくはＳＯＤ３遺伝子、またはそれらの任意の組み合わせを送達させる。特定の実施態様において、ＳＯＤ１が送達される。
【００３７】
本明細書に記載のベクターを用いて、望ましくないレベルのＲＯＳおよびフリーラジカル、または酸化的ストレスと一般的に関連する疾患または状態を処置または予防し得る。ＲＯＳは、いくつかの治療薬物の有害な副作用としても生じる。例えば、Chan et al. (1996) Adv. Neurol 71: 271-279；DiGuiseppi and Fridovich (1984) Crit. Rev. Toxicol. 12: 315-342を参照されたい。本発明のＡＡＶ−ＳＯＤベクターを用いて処置され得る状態は、パーキンソン病、ハンチントン病、変性性眼疾患（例えば、黄斑変性症、網膜色素変性症）、アルツハイマー病、関節リウマチ、クローン病、ペイロニー病、潰瘍性大腸炎、脳虚血（脳卒中）、心筋梗塞（心臓発作）、脳損傷および／または脊髄損傷、再かん流傷害、ＡＬＳ、ダウン症、白内障、統合失調症、てんかん、ヒト白血病および他の癌、ならびに糖尿病を含む。
【００３８】
加齢と関連する正常な酸化的損傷に罹患しているにすぎない対象でさえ、本発明のベクターおよび方法から利益を享受し得る。ＲＯＳおよびフリーラジカルの形成による酸化的ストレスの漸進的上昇は加齢中に生じ（例えば、Mecocci, P. et al. (2000) Free Radio. Biol. Med, 28: 1243-1248を参照）、このことは、ラット組織（Erdincler, D. S., et al. (1997) Clin. Chim. Acta, 265: 77-84）および高齢ヒト患者の血液細胞（Congi, F., et al. (1995) Presse. Med., 24: 1115-1118）における脂質過酸化物（lipid peroxidate）形成の増加により証明されている。最近のレビュー（Niki, E., Intern. Med. (2000) 39: 324-326）によると、ＲＯＳおよびフリーラジカルによる組織損傷の増加の原因は、加齢中に生じる抗酸化酵素ＳＯＤおよびＣＡＴのレベルの低下にあり得ることが報告されている。例えば、余分なＳＯＤ遺伝子をマウスのゲノムに挿入することにより作成されたトランスジェニック動物は、低減したレベルのＲＯＳおよびフリーラジカル損傷を有することが見出された。かかる動物は、寿命の延びも有していた。より最近の証拠によると、ＳＯＤ活性を模倣する小マンガンポルフィリン化合物の投与は、線虫セノラブディティス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）の寿命の４４％の延びを導くことが示された（S. Melow, et al. (2000) Science, 289: 1567-1569）。従って、本発明のベクターおよび方法は、加齢プロセスに付随するＲＯＳおよびフリーラジカルレベルの上昇により引き起こされる組織損傷の増大および平均余命の低下を予防し、および／または打ち消し得る。
【００３９】
本明細書において用いられるＡＬＳの「処置」は、治療上所望の結果である、既存の損傷の逆転、さらなる損傷の予防、および損傷の進行の遅延を含む。本発明の治療用ｒＡＡＶ−ＳＯＤベクターまたはインビトロＡＬＳモデル系を用いて発見された化合物は、治療上有効と考えられるべき既存の損傷の逆転を必要としない。対象においてＡＬＳの進行を少なくとも遅延させる任意の処置が、治療上有効であると考えられ得る。
【００４０】
治療用化合物についてスクリーニングするためのＡＬＳのインビトロモデル系
実施例においてより詳細に記載される通り、本発明のＡＡＶ−ＳＯＤベクターを用いて、ＡＬＳの処置または予防における有効性について化合物をスクリーニングするために用いられ得るＡＬＳのインビトロモデル系を作成することができる。１つの実施態様において、ＡＬＳと関連する既知の変異体ＳＯＤ１（ＳＯＤ１−Ｇｌｙ９３Ａｌａ）が、ＡＡＶベクターにクローン化され、組換えビリオン（ｒＡＡＶ−ＳＯＤ１−Ｇｌｙ９３Ａｌａ）が生成される。次に、ｒＡＡＶ−ＳＯＤ１−Ｇｌｙ９３Ａｌａを用いて、ラット脊髄またはラット脳などの代表的組織由来の初代培養物を形質導入する。次に、トランスフェクションの３〜５日後に培養物を調べ、培養物中のニューロンの幾つかが、ＳＯＤ凝集体の形成または空胞形成などのＡＬＳと関連する形態学的変化を示すことを確認する。かかる細胞は、本明細書において「ＡＬＳ様細胞」と称される。かかる凝集体は、免疫細胞化学により可視化され得る。好ましい実施態様において、培養物中のＡＬＳ様細胞の割合は高く、例えば、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または９５％またはそれ以上である。培養物中のＡＬＳ様細胞の割合が高ければ高いほど、培養細胞を用いて、スクリーニングされ得る化合物の数が多くなるか、あるいは個々の化合物それぞれの複製数が多くなる。
【００４１】
１種類以上の目的の化合物にＡＬＳ様細胞をさらし、続いてＡＬＳ様細胞の表現型が、ＳＯＤ凝集体の低減などＡＬＳ特徴の改善を反映する方法で変化するかどうかを決定することにより、スクリーニングは行われる。ある実施態様において、化合物は、個々のボトル、ディッシュ、プレートまたはマルチウェルプレートのウェル中の培養物などのＡＬＳ様細胞の単離培養物に個別に添加される。他の実施態様において、化合物は、いくつかの化合物の混合物として添加される。ある実施態様において、化合物は、化合物のコンビナトリアルライブラリーまたはサブライブラリーとして添加される。ある実施態様において、化合物の混合物内での活性な化合物の同一性は、化合物の重複サブライブラリーを用いて得られたデータのデコンボリューションにより決定される。他の実施態様において、活性な化合物の同一性は、活性な混合物中において別々に、あるいは小グループにおいて個々の化合物をスクリーニングすることにより決定される。化合物の混合物またはライブラリーにおける活性な化合物の検出方法は、本発明の重要な態様ではない。
【００４２】
実施例１において示される通り、変異体ＳＯＤ遺伝子としてのＳＯＤ１−Ｇｌｙ９３Ａｌａの使用は、形質導入されたラット脊髄運動ニューロンおよびグリア細胞内でのＳＯＤ凝集体の形成、およびラット脳由来の線状体ニューロンおよびグリア細胞の空胞形成を引き起こす。形態学的特徴は、免疫細胞化学により視覚的に観察され得、例えば、形質導入細胞が可能性のある治療剤または処置を用いて処理されたとき、かかる形態学的特徴の任意の逆転が観察され得る。他の実施態様において、ＡＬＳ様表現型の観察は、例えば、ヒトが介入することなく、凝集または空胞形成を検出することができるコンピューター支援画像解析により自動化される。かかるコンピューター支援画像解析は、多数の可能性のある治療剤または処置のスクリーニングにおいて特に好ましい。なお別の実施態様において、Ｇｌｙ９３Ａｌａ以外のＳＯＤ１変異体が用いられ、これらの他の変異体ＳＯＤ１遺伝子を用いて形質導入された細胞の表現型は、ＳＯＤ１Ｇｌｙ９３Ａｌａ形質導入と関連する表現型と異なっていてもよい。変異体ＳＯＤ形質導入と関連する任意の検出可能な表現型変化を用いて、細胞がＡＬＳ様表現型に対して形質導入されているかどうか、および可能性のある治療剤または処置がＡＬＳ様表現型を逆転させる際に有効であるかどうかの両方を評価することができる。
【００４３】
スクリーニングされ得る化合物は、ＡＬＳ様細胞の培養物において提供され得る任意の化合物を含む。これらの化合物は、天然物（粗混合物または高度精製成分のいずれか）、合成化合物、コンビナトリアルライブラリー、および既知の治療上活性な化合物のライブラリーを含むが、これらに限定されない。合成化合物は、ランダムに選択されるか、あるいは合理的薬物設計を用いてＡＬＳの処置において用いられるため特異的に合成され得る。コンビナトリアルライブラリーは、小分子のコンビナトリアル合成に由来するか、あるいはオリゴヌクレオチド、オリゴ糖またはペプチドなどの高分子のコンビナトリアル合成に由来し得る。本発明のＡＬＳのインビトロモデル系を用いてスクリーニングされるべきライブラリーは、１０、５０、１００、５００、１０００、１０，０００、１００，０００から１，０００，０００またはそれ以上を含む任意の数の個々の化合物を含んでいてもよい。本明細書で用いられる「ハイスループットスクリーニング」は、トランスジェニックマウスＳＯＤ１−Ｇｌｙ９３Ａｌａモデルなどのアッセイを用いて同じ時間および労力をかけて可能であるものより、単位時間当たり（例えば、１日当たり）より多くの化合物をスクリーニングすることをいう。種々の実施態様において、ハイスループットスクリーニングは、１日当たり１０、２０、５０、１００、５００、１０００、２０００、５０００またはそれ以上の種類の化合物のスクリーニングをいう。本発明のモデル系を用いて、ＡＬＳ様表現型を逆転するか、または予防するための処置能力について、剤の添加を含まない処置もスクリーニングすることができる。
【００４４】
本発明のインビトロアッセイにおいて有効性を示す化合物は、次に、例えば、他のインビトロアッセイ、インビボアッセイ（例えば、上述のＡＬＳマウス）、または臨床試験においてさらに研究され得る。かかる後続の試験は、本発明のインビトロモデル系より比較的多大な労力を要し、時間がかかり、かつ高価であり、従って、かかる多大な労力を要する試験を用いて多数の化合物をスクリーニングすることは現実的ではない。本発明のインビトロＡＬＳモデルを用いて、かかる多大な労力を要する試験を現実的なものにするために、候補化合物の数を十分に減らすことが可能である。このようにして、本発明のインビトロアッセイは、先行技術のスクリーニング方法を用いて実際に可能であるものよりも多くの化合物のスクリーニングを可能にし、従って、ＡＬＳの処置または予防のための有効なリード化合物を発見する可能性が増す。
【００４５】
ＡＬＳのインビトロモデル系の基礎研究使用
本発明のＡＬＳモデル系は、ハイスループットスクリーニングのための効率的な方法を提供するだけでなく、疾患の病原を研究するため、およびＡＬＳにおける運動ニューロンの選択的脆弱性の根拠を明確にするための価値ある実験系も提供する。例えば、初代培養細胞は、ＡＬＳと関連する変異体ＳＯＤ１をコードするＡＡＶビリオンを用いて形質導入され、形質導入の４時間から４日後の時点で形質導入された細胞から、ＲＮＡが回収され得る。ＲＮＡは、ｗｔＳＯＤ１をコードするＡＡＶビリオンを用いて形質導入された対照細胞またはビリオンを用いて形質導入されていない細胞からも得られる。次に、ＲＮＡ試料は、Affymetrix Gene Chip（登録商標）での遺伝子発現分析の対象とされ、対照と比較してＡＬＳモデル細胞においてどの遺伝子が過剰発現し、どの遺伝子が低発現しているかが決定される。差次的発現を示す遺伝子は、治療的介入のための魅力的な手段を表すかもしれない。
【００４６】
治療用化合物についてスクリーニングするためのＡＬＳのインビボ（動物）モデル系
ＳＯＤの変異体形態をコードする組換えＡＡＶベクターを用いて、ＡＬＳの新規動物モデルを作成することもできる。動物に、ＡＬＳ様表現型を生み出すために変異体ＳＯＤ１遺伝子をコードするｒＡＡＶベクター（例えば、ｒＡＡＶビリオン）を投与することができる。次に、ＡＬＳの症状を模倣した表現型を含む変化した表現型を示す動物を、可能性のある治療用化合物または処置の有効性を試験するための実験において用いる。次に、ＡＬＳ様表現型における逆転を引き起こす化合物を、治療剤として開発するためにさらに研究することができる。かかるＡＬＳモデルにおいて用いられ得る動物は、マウス、ラットおよび非ヒト霊長類を含むが、これらに限定されない。
【００４７】
本発明の特定の実施態様の例を以下に提供する。説明の目的のみのため実施例を提供し、決して本発明の範囲を制限することを意図するものではない。
【実施例１】
【００４８】
初代ラット運動ニューロン培養物におけるＡＬＳのインビトロモデル
ＡＬＳのインビトロモデル系を以下のように構築する。ＳＯＤ遺伝子の発現がニワトリβ−アクチンプロモーターにより指令されるように、ヒトＳＯＤ１野生型遺伝子（ｈＳＯＤ１ｗｔ）または変異体ＳＯＤ１遺伝子（ｈＳＯＤ１−Ｇｌｙ９３Ａｌａ）のいずれかを、２つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含むＡＡＶ−２由来ベクターにクローニングすることにより、２種類のＡＡＶベクターを作成する。
【００４９】
次に、得られたｒＡＡＶ２−ＳＯＤ１−Ｇｌｙ９３ＡｌａベクターをＡＡＶ−２ビリオンにパッケージングし（例えば、米国特許第６，００１，６５０号および第６，００４，７９７号を参照）、これを用いて、初代ラット運動ニューロン培養物を形質導入する。形質導入の３〜５日後の蛍光顕微鏡検査により、形質導入した細胞が、多くの変異体ＳＯＤ発現運動ニューロンにおける点状凝集体での変異体ＳＯＤタンパク質の異常分布、神経細胞体の細胞質の拡大および運動神経プロセスの膨張、運動ニューロンのアポトーシス、および星状細胞の活性化などのＡＬＳの特徴的病理学的変化を示すことを明らかにする。ｒＡＡＶ２−ＳＯＤ１ｗｔを本発明のＡＬＳモデルにおける対照として用いる。なぜなら、このベクターを用いた形質導入は、標的細胞においてＡＬＳ関連表現型変化を全く引き起こさないからである。
【００５０】
それぞれｐＶｍ−ＷＴＳＯＤまたはｐＶｍ−Ｇ９３ＡＳＯＤをコードするＡＡＶ２ベクターを用いた形質導入の約３〜５日後のラット脊髄由来の初代培養物において、運動ニューロンにおけるＳＯＤの存在を免疫組織化学により可視化した。マウス抗ＳＯＤ１ ＩｇＧ １次抗体およびＡｌｅｘａ−５９４−標識ヤギ抗マウスＩｇＧ ２次抗体を用いて、免疫組織化学を行った。ｐＶｍ−Ｇ９３ＡＳＯＤを用いて形質導入したニューロンは、ｐＶｍ−ＷＴＳＯＤを用いて形質導入したニューロンでは観察しない凝集したＳＯＤ１を示す。
【００５１】
それぞれｐＶｍ−ＷＴＳＯＤまたはｐＶｍ−Ｇ９３ＡＳＯＤをコードするＡＡＶ２ベクターでの形質導入の約３〜５日後のラット脊髄由来の初代培養物において、グリア細胞におけるＳＯＤの存在を免疫組織化学により可視化した。ｐＶｍ−Ｇ９３ＡＳＯＤを用いて形質導入したグリア細胞は、ｐＶｍ−ＷＴＳＯＤを用いて形質導入したグリア細胞では観察しない凝集したＳＯＤ１を示す。
【００５２】
ＡＡＶ−５およびＡＡＶ−６由来のＡＡＶベクター、すなわち、ＩＴＲがそれぞれＡＡＶ−５およびＡＡＶ−６に由来するＡＡＶベクターを用いる以外、上述のものを用いて同じようにして別の実験を行う。次に、それぞれＡＡＶ−５またはＡＡＶ−６キャプシドタンパク質遺伝子を用いるパッケージングシステムを用いて、ｒＡＡＶ−５およびｒＡＡＶ−６ビリオンを生成する。
【００５３】
ｐＶｍ−ＷＴＳＯＤまたはｐＶｍＧ９３ＡＳＯＤをコードするＡＡＶ−６ベクターを用いた形質導入の約３〜５日後のラット脊髄由来の初代培養物において、運動ニューロンにおけるＳＯＤの存在を免疫組織化学により可視化した。ｐＶｍ−Ｇ９３ＡＳＯＤを用いて形質導入したニューロンは、ｗｔＳＯＤ１を用いて形質導入したニューロンでは観察しない凝集したＳＯＤ１を示す。
【００５４】
結果は、ｒＡＡＶ−６ビリオンを用いて送達した遺伝子がニュローンにおいて主に発現する一方、ｒＡＡＶ−２ビリオンを用いて送達した遺伝子は（上で考察した通り）ニューロンおよびグリアの両方において発現することを示す。ｒＡＡＶ−５ビリオンを用いて送達した遺伝子はグリアにおいてのみ発現し、ｒＡＡＶ−５ビリオン形質導入は、運動ニューロンにおいて病変を引き起こさなかった。
【００５５】
運動ニューロンに対するｒＡＡＶ２−ＳＯＤ形質導入の表現型効果を、形質導入の６〜７日後および１２日後に再び測定する。結果は、形質導入の１２日後において、細胞死を導く経時的な凝集の進行を示す。ｐＶｍ−Ｇ９３ＡＳＯＤをコードするＡＡＶ２ベクターを用いた形質導入の約６〜７日後のラット脊髄由来の初代培養物において、運動ニューロンにおけるＳＯＤの存在を免疫組織化学により可視化した。ｐＶｍ−Ｇ９３ＡＳＯＤを用いて形質導入したニューロンにおけるＳＯＤ１の凝集は、形質導入の３〜５日後のものより広範であり、このことは、経時的な損傷の進行を説明している。ｐＶｍ−Ｇ９３ＡＳＯＤをコードするＡＡＶ２ベクターを用いた形質導入の約１２日後のラットの脊髄由来の初代培養物において、運動ニューロンにおけるＳＯＤの存在を免疫組織化学により可視化した。結果は、ＳＯＤ１−Ｇｌｙ９３Ａｌａが細胞にとって有毒であること、およびＳＯＤ１−Ｇｌｙ９３Ａｌａが最終的には細胞を殺傷することを示す。
【００５６】
ｒＡＡＶ−ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａを用いた形質導入の６〜７日後の運動ニューロンの形態を評価し、ＡＬＳ患者由来の運動ニューロンの形態と比較した。ｐＶｍ−Ｇ９３ＡＳＯＤをコードするＡＡＶ２ベクターを用いた形質導入の約６〜７日後のラット脊髄由来の初代培養物において、ＳＯＤの存在を免疫組織化学により可視化する。培養中のｒＡＡＶ−ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ形質導入細胞は、ＡＬＳ運動ニューロンの局所的な軸索膨張特徴を同じく示し、このことは、本発明のインビトロＡＬＳモデル系が疾患状態を模倣することを示唆している。ｐＶｍ−Ｇ９３ＡＳＯＤを用いて形質導入したニューロンは、６〜７日目において、ＡＬＳ患者由来の運動ニューロンにおいて見られるものと類似する神経細胞体の細胞質の拡大および運動ニューロンプロセスの膨張を示す。
【００５７】
ラット脊髄培養物（上記）を形質導入するために用いたのと同じビリオンをまた用いて、初代ラット脳培養物の線状体ニューロンを形質導入する。形質導入の３〜５日後の形質導入細胞の免疫細胞化学は、線状体ニューロンが、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａを発現するベクターを用いて形質導入したとき、空胞形成を示すことを示す。ラット脳初代培養物由来のグリア細胞をＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ発現ＡＡＶベクターを用いて形質導入したとき、同様の表現型を観察する。脳由来のグリア細胞は、（上で考察した）脊髄グリア細胞の同様の処置を用いて観察した凝集と対照的に、ｐＶｍ−Ｇ９３ＡＳＯＤを用いて形質導入したとき、空胞形成を示す。脳で観察したこの表現型は、形質導入した脊髄運動ニューロンおよびグリアにおいて観察したＳＯＤ１凝集体形成と対照をなす。
【００５８】
ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ発現細胞が実際に運動ニューロンであることを実験により確認する。ｒＡＡＶ−ＳＯＤ１ｗｔまたはｒＡＡＶ−ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａを用いた形質導入の約５〜６日後のラット脊髄の初代培養細胞において、免疫細胞化学を行った。第１の実験は、ＳＯＤおよび神経フィラメント光（ＮＦ−Ｌ）両方の免疫細胞化学検出を含むものであった。それぞれｐＶｍ−ＷＴＳＯＤまたはｐＶｍ−Ｇ９３ＡＳＯＤをコードするＡＡＶ−２ベクターを用いた形質導入の約３〜５日後のラット脊髄由来の初代培養物において、運動ニューロンにおけるＳＯＤおよびニューロフィラメント光（ＮＦ−Ｌ）の両方を検出した。ＮＦ−Ｌは特異的な神経マーカーである。同じ細胞におけるＳＯＤおよびＮＦ−Ｌ両方の染色により、細胞がニューロンであることを確認する。第２の実験は、ＳＯＤおよびコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）両方の免疫細胞化学検出を含むものである。それぞれｐＶｍ−ＷＴＳＯＤまたはｐＶｍ−Ｇ９３ＡＳＯＤをコードするＡＡＶ−２ベクターを用いた形質導入の約３〜５日後のラット脊髄由来の初代培養物において、運動ニューロンにおけるＳＯＤおよびコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）の両方を検出した。ＣｈＡＴは運動ニューロンの特異的マーカーである。同じ細胞におけるＳＯＤおよびＣｈＡＴ両方の染色により、細胞が運動ニューロンであることを確認する。これらの実験は、運動ニューロンの特徴であるタンパク質を発現する細胞内でのＳＯＤ発現を示す。
【００５９】
蛍光顕微鏡検査により、初代ラット運動ニューロン培養物における全細胞の約９０％を形質導入したことを示す。ｒＡＡＶ−ＳＯＤ１−Ｇｌｙ９３Ａｌａを用いた形質導入の高い効率は、単純に、適当な数のウイルス粒子を添加し、インキュベートすることにより、比較的少ない労力でアッセイにおいて使用するのに適した多数の細胞を提供する。本実施例において、１個の細胞当たり１００，０００個のｒＡＡＶ−ＳＯＤ１−Ｇｌｙ９３Ａｌａ粒子を用いて、細胞を形質導入する。すなわち、感染の多重度（ＭＯＩ）は１０５である。他の実験（示していない）は、１０００までのＭＯＩが、最大（９０％）形質導入をもたらす際に同等に有効であることを示している。多数の形質導入細胞は、統計上有意な数の異なる細胞において目的の任意の所定の化合物の効果を観察することを可能にし、従って、統計上確かな結果を与える。このことは、実際にハイスループットスクリーニングのため統計上意味のある数の細胞を提供することができない、変異体ＳＯＤコードプラスミドの個々の細胞へのマイクロインジェクションに関する従来の方法と対照をなす。
【００６０】
多数の運動ニューロンおよび他の細胞を同時に形質導入するウイルスベクターを利用するこのエピジェネティックモデルは、ＡＬＳの分子病理学、ＡＬＳの新たな動物モデルの作成、およびＡＬＳ薬物についてのスクリーニングの研究を促進し得る。
【００６１】
実施例１の材料および方法は以下の通りである。
ｐＶｍ−ｗｔＳＯＤおよびｐＶｍ−Ｇ９３ＡＳＯＤプラスミドの構築
組み込みＨｉｎｄＩＩＩ部位を含有するフォワードプライマー、および組み込みＮｏｔＩ部位を有するリバースプライマーを用いたＰＣＲにより、野生型およびＧ９３Ａ変異体のヒトＳＯＤ遺伝子を増幅する。
５’−ＡＧＣＴＡＡＧＣＴＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＡＣＧＡＡＧＧＣＣＧＴＧＴＧ−３’（ＨＣ番号１４６）（配列番号２）
５’−ＡＴＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＧＧＣＧＡＴＣＣＣＡＡＴＩＡＣＡＣＣＡ−３’（ＨＣ番号１４７）（配列番号３）
【００６２】
ＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩ制限酵素を用いて消化し、プラスミドＦ１０１のＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩ部位にクローン化し、そして遺伝子をニワトリβ−アクチンプロモーターの制御下におき、両ＡＡＶ ＩＴＲに隣接させて、プラスミドＦ１０１−ｗｔＳＯＤおよびＦ１０１−Ｇ９３Ａを作成する。ｗｔＳＯＤおよびＧ９３Ａをニワトリβ−アクチンプロモーターと共に、ＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩを用いてＦ１０１−ｗｔＳＯＤおよびＦ１０１−Ｇ９３Ａから切り出し、ＳｐｈＩ−ＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩ−ＮｃｏＩリンカーを用いてｐＶｍ−ＬａｃＺのＳｐｈＩおよびＮｃｏＩ部位にクローン化する。配列決定分析によりコンストラクトを確かめ、ｐＶｍ−ｗｔＳＯＤ（図２）およびｐＶｍ−Ｇ９３ＡＳＯＤ（図１）と命名する。次に、プラスミドを増幅し、これを用いて２９３細胞をトランスフェクトして、ＡＡＶベクターを生成する。
【００６３】
初代神経培養物
ｄａｙ１５のスプラーグドーリーラット胚から、解離脊髄または脳の初代培養物を調製する。解離線状体または脊髄組織を小片に切り刻み、トリプシンと３０分間インキュベートする。解離後、組織をパスツールピペットを通して粉砕し、ポリ−Ｄ−リジン（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）でコートした円形ガラス１８ｍｍカバースリップ（Fisher Scientific, Chicago, IL）を含有する１２ウェル培養ディッシュ（Fisher Scientific, Chicago, IL）において、１ウェル当たり３５０，０００個（線状体ニューロン）または７００，０００個（脊髄ニューロン）の細胞密度で細胞を蒔く。線状体培養物用の培地は、２％ Ｂ−２７、０．５ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび２５ｍＭ Ｌ−グルタミン酸を添加したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（lnvitrogen, Chicago, IL）である。細胞を維持するために、１週間に１回培養物に栄養を与える。脊髄培養物用の培地は、２．５ｇ Ｄ−グルコースを強化し、かつ２％ ウマ血清、５％ ウシ胎児血清、１％ ペニシリン・ストレプトマイシン（penstrep）および成長因子を添加したイーグルの最小必須培地（ＥＭＥＭ）（ATCC, Manassas, Virginia）である。最適な細胞成長および安定性を得るために、１週間に２回、培養物に栄養を与える。４〜６日目に１．４μｇ／ｍｌ シトシン−Ｂ−Ｄ−アラビノシド（Calbiochem）を用いて培養物を処理することにより、非神経細胞をできるだけ少なくする。培養物を３７℃、５％ ＣＯ２にて維持する。運動ニューロンの成長および他のニューロンからの分化を可能にするために、解離の２〜３週後の実験において細胞を用いる。
【００６４】
培養物の処理
線状体培養物および脊髄培養物をＡＡＶ−ｈＳＯＤｗｔまたはＡＡＶ−ｈＧ９３Ａ（１個の細胞当たり１０５ベクターゲノム（ｖｇ））とインキュベートし、ベクターの最大発現を達成する。
【００６５】
免疫細胞化学
ガラスカバースリップ上で成長した線状体および脊髄細胞を、４％ パラホルムアルデヒドを用いて固定し、０．０５％ ＮＰ−４０により透過処理する。１×ＰＢＳ、３％ ＢＳＡ、および２％ ヤギ血清を含有するブロッキング溶液を用いる。以下の抗体：神経フィラメント−Ｌ（ＮＦ−Ｌ；ＡＢ１９８３，１：１００，Chemicon Inc.）、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ；ＡＢ１４３およびＭＡＢ３０５，１：１０，Chemicon Inc）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ；５２，１：３００，Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ：ＡＢ５８０４，１：５００，Chemicon Inc）を用いて、免疫細胞化学を行う。全ての抗体をブロッキング溶液にて希釈する。１：２００希釈した２次抗体：Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（緑）またはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４（赤）結合抗マウス／抗ウサギ／抗ラットＩｇＧ（Molecular Probes）とのインキュベーション後、落射蛍光顕微鏡検査により抗体分布を可視化する。
【実施例２】
【００６６】
ＡＬＳの処置用候補物質としてのＩＬ−１０ペプチドの評価
ＡＬＳに対するＩＬ−１０由来ペプチドの効果を評価するためのアッセイにより、本発明の実施例１のインビトロＡＬＳモデル系の価値を明らかにする。
【００６７】
当業者に既知の固相合成方法により、オリゴペプチドの製造を達成する。合成したオリゴペプチドの分析は、エレクトロスプレー質量分析、高速液体クロマトグラフィー、および精製生成物の外観を含む。オリゴペプチド（複数を含む）を１ｍｇ／ｍｌでの注入用に水中に調製する。適当なＩＬ−１０由来ペプチド（米国特許第６，１５９，９３７号）および「スクランブル」対照ペプチドの例を表２において供する。慣習的なＮ末端からＣ末端方向でペプチド配列を供する。３文字表記を用いて、アミノ酸を指定する。
【００６８】
【表２】
【００６９】
典型的なペプチド配列を表２において供するが、神経障害性疼痛または神経変性疾患の処置におけるペプチドの有効性を保持し、おそらくは改良するか、あるいはその薬理学的特性を改良する種々の修飾または置換を、列挙した配列に対して成し得ることは、当業者にとって明らかである。かかる配列変異体を以下の実施例において記載する１種類以上のモデルにおいて試験して、それらの治療上の有効性を評価することができる。
【００７０】
例えば、非ヒト種由来のＩＬ−１０配列を用いて、ヒト由来ＩＬ−１０ペプチドと異なるＩＬ−１０由来ペプチド配列を得ることができ、そして非ヒトＩＬ−１０由来ペプチドは、ヒト由来の配列と比較して改良した特性を示すかもしれない。あるいは、治療用ペプチドの当業者によく知られた既知の経験的パラメーターを用いた調査により、変異体を設計することができる。加えて、合理的薬物設計を用いて、有効性の増大を示すことが予測される配列変異体を設計することができ、そして合理的薬物設計は、ＩＬ−１０、ＩＬ−１０レセプター、またはＩＬ−１０のレセプターとの複合体の３次元構造の分析に基づき得る。
【００７１】
ラット脊髄の初代培養物をｒＡＡＶ２−ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａビリオンと共にインキュベートし、１種類以上の、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａを発現する形質導入運動ニューロン細胞を含む細胞培養物を生成する。上記のＩＬ−１０およびスクランブルペプチドを、ｒＡＡＶ−ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ形質導入細胞の培養物を含有する組織培養プレートに形質導入後種々の時間で添加する（トリプリケート）。形質導入細胞の対照プレートはいずれのペプチドでも処理しない。ペプチド添加後時間の関数として、ＳＯＤ免疫細胞化学を行い、Ｉｌ−１０ペプチド、スクランブルペプチド、または両方が、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ発現の表現型効果（すなわち、細胞内ＳＯＤ凝集体形成または細胞死）を改善するかどうかを決定する。
【００７２】
いずれかのペプチドまたは両方のペプチドを用いて処理した培養物において、凝集または細胞死の低減を観察すると、本発明のインビトロアッセイにおいてポジティブな結果となるペプチドを次により広範な研究（例えば、ＡＬＳマウスにおけるインビボ研究）の対象とする。本発明のインビトロアッセイにおけるポジティブな結果は、ＳＯＤ凝集体形成または細胞死の１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９８％またはそれ以上の低減を含む。最後にヒト対象における臨床試験を通じて、ＡＬＳの処置および予防における有効性を確認する。
【００７３】
他の実験において、上で示したＩＬ−１０ペプチドの５００種類の配列変異体を合成し、ｒＡＡＶ−ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ形質導入運動ニューロンにおいてＡＬＳ様表現型を低減する際の活性についてアッセイする。より高い活性を示すペプチドをＡＬＳの処置または予防における有効性についてさらに研究する。
【００７４】
本発明と共に用いるための他のＩＬ−１０配列の代表的な非限定的な例は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＭ０００５７２、Ｕ６３０１５、ＡＦ４１８２７１、ＡＦ２４７６０３、ＡＦ２４７６０４、ＡＦ２４７６０６、ＡＦ２４７６０５、ＡＹ０２９１７１、ＵＬ１６７２０（全てヒト配列）、ＮＭ０１２８５４、Ｌ０２９２６、Ｘ６０６７５（ラット）；ＮＭ０１０５４８、ＡＦ３０７０１２、Ｍ３７８９７、Ｍ８４３４０（全てマウス配列）、Ｕ３８２００（ウマ）；Ｕ３９５６９、ＡＦ０６０５２０（ネコ配列）；Ｕ００７９９（ウシ）；Ｕｌ１４２１、Ｚ２９３６２（ヒツジ配列）；Ｌ２６０３１、Ｌ２６０２９（マカク配列）；ＡＦ２９４７５８（サル）；Ｕ３３８４３（イヌ）；ＡＦ０８８８８７、ＡＦ０６８０５８（ウサギ配列）；ＡＦ０１２９０９、ＡＦ１２００３０（マーモット配列）；ＡＦ０２６２７７（フクロネズミ）；ＡＦ０９７５１０（モルモット）；Ｕ１１７６７（シカ）；Ｌ３７７８１（スナネズミ）；ＡＢ１０７６４９（ラマおよびラクダ）において記載の配列を含む。
【実施例３】
【００７５】
ＡＬＳの処置用候補物質としてのＧＤＮＦペプチドの評価
ＡＬＳに対するグリア細胞由来神経栄養因子（ＧＮＤＦ）ペプチドの効果を評価するためのアッセイにより、本発明の実施例１のインビトロＡＬＳモデル系の価値をさらに明らかにする。ＩＬ−１０よりむしろＧＤＮＦ由来ペプチドおよびそのスクランブルバージョンを用意する以外、本質的には実施例２に記載の通り実験を行った。ＧＤＮＦペプチドがアッセイにおいてポジティブな結果を示すと（すなわち、ペプチドでの処理後、形質導入運動ニューロンのＡＬＳ様表現型特徴が低減していると）、このペプチドをさらに研究してＡＬＳの処置または予防における有効性を確認することができる。
【００７６】
他の実験において、５００種類の異なるＧＤＮＦ由来ペプチドを合成し、ｒＡＡＶ−ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ形質導入運動ニューロンにおいてＡＬＳ様表現型を低減する際の活性についてアッセイする。より高い活性を示すペプチドをＡＬＳの処置または予防における有効性についてさらに研究する。
【００７７】
本発明において用いるためのＧＤＮＦペプチドは、多数の既知のＧＤＮＦ配列に由来してもよく、それは、米国特許第６，２２１，３７６号および第６，３６３，３１９号（全体として引用により本明細書に取り込まれる）、およびラットおよびヒト配列について、Lin et al., Science (1993) 260: 1130-1132、ならびにヒト配列について、ＮＣＢＩ受入番号ＡＹ０５２８３２、ＡＪ００１８９６、ＡＦ０５３７４８、ＡＦ０６３５８６およびＬ１９０６３；ラット配列について、ＮＣＢＩ受入番号ＡＦ１８４９２２、ＡＦ４９７６３４、Ｘ９２４９５、ＮＭ０１９１３９；ジャイアントパンダ配列について、ＮＣＢＩ受入番号ＡＦ５１６７６７；マウス配列について、ＮＣＢＩ受入番号ＸＭ１２２８０４、ＮＭ０１０２７５、Ｄ８８３５１Ｓ１、Ｄ４９９２１、Ｕ３６４４９、Ｕ３７４５９、Ｕ６６１９５；ニッポニア・ニッポン（Ｎｉｐｐｏｎｉａ ｎｉｐｐｏｎ）配列について、ＮＣＢＩ受入番号ＡＦ４６９６６５；アカゲザル配列について、ＮＣＢＩ受入番号ＡＦ１０６６７８；およびゼブラフィッシュ配列について、ＮＣＢＩ受入番号ＮＭ１３１７３２およびＡＦ３２９８５３において開示されているものを含む。ＧＤＮＦ配列は、米国特許出願番号第２００３／０１６１８１４号においても開示されている。
【００７８】
本発明のこれらの実施態様および他の実施態様は、本明細書における開示に照らして、当業者にとって容易に思い浮かぶものであるだろう。本発明の好ましい実施態様は詳細に記載されているが、本明細書において定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、バリエーションが作られ得ることが理解される。本明細書において引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、全体として引用により本明細書に取り込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】図１は、ｐＶｍ−Ｇ９３ＡＳＯＤと称される、ｈＳＯＤ１−Ｇｌｙ９３Ａｌａの送達用ｒＡＡＶベクターの概略図である。ｈＳＯＤ１−Ｇｌｙ９３Ａｌａの発現は、ニワトリβ−アクチンプロモーターによりもたらされる。発現カセットは、２つのＡＡＶ−２ ＩＴＲ配列の間に位置する。ＳＯＤ１−Ｇｌｙ９３Ａｌａは、本明細書において「変異体」ＳＯＤとも称される。
【図２】図２は、ｐＶｍ−ＷＴＳＯＤと称される、野生型ヒトＳＯＤ１の送達用ｒＡＡＶベクターの概略図である。ｗｔＳＯＤ１の発現は、ニワトリβ−アクチンプロモーターによりもたらされる。発現カセットは、２つのＡＡＶ−２ ＩＴＲ配列の間に位置する。
【技術分野】
【０００１】
本願は、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下、２００５年７月７日に出願された米国仮出願番号第６０／６９７，４５０（その内容は、引用により本明細書に取り込まれる）に基づく優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の処置における有効性について化合物をスクリーニングするためのインビトロモデルに関する。本発明はまた、遺伝子治療ベクターおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
神経変性疾患は主要な公衆の健康問題を提起する。例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、運動ニューロンの選択的死滅に伴って生じる、容赦なく進行する致命的な疾患である。ＡＬＳに関するさらなる情報を、Online Mendelian Inheritance in Man（ＯＭＩＭ）エントリー番号１０５４００、およびRowland and Shneider (2001) Amyotrophic lateral sclerosis, New Eng. J. Med. 344: 1688-1700（これらの開示内容は全体として引用により本明細書に取り込まれる）において見出すことができる。
【０００４】
スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）をコードする遺伝子における変異は、ＡＬＳと関連する。ＳＯＤの３種類の変異体が哺乳類において存在することが知られている。細胞質ＳＯＤは、ＳＯＤ１によりコードされる銅亜鉛酵素（Ｃｕ／Ｚｎ ＳＯＤ）である（Weisiger and Fridovich (1973) J. Biol. Chem. 248, 4793-4796）。後述の通り、ＳＯＤ１における遺伝子欠損は、家族性筋萎縮性側索硬化症（ｆＡＬＳ）と関連する。ミトコンドリアＳＯＤ（ＭｎＳＯＤ）はマンガンと関連し、ＳＯＤ２によりコードされる。Ｌｉ等（(1995) Nature Genetics 11, 376-381）は、ＳＯＤ２をコードする遺伝子が不活性化されている変異体マウスを記載している。ＳＯＤ３によりコードされ（Carlsson et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 6264-6268）、かつ銅および亜鉛を含有する第３の哺乳類ＳＯＤは、主として細胞外に位置する。この遺伝子の不活性化は、明白な表現型をもたらさない。
【０００５】
約２０％のｆＡＬＳがＳＯＤ１遺伝子における変異と結び付けられる（Julien, J.P., Cell (2001) 104: 581-591）。グリシン９３がアラニンに変異している（Ｇ９３Ａ）、変異体ＳＯＤ１遺伝子を過剰発現するトランスジェニックマウスは、ｆＡＬＳの臨床的特徴および病理学的特徴の多くを有する優性遺伝性成人発症麻痺性障害を発症する（Gurney et al., Science (1994) 264: 1772-1775）。しかしながら、これまでに、ＡＬＳおよび大抵の運動ニューロン疾患において運動ニューロン変性を導く分子機序は依然ほとんど分からないままであり、ＡＬＳを予防または治癒するのに利用可能な治療は現在存在しない。
【０００６】
ＡＬＳを処置する際に有効な化合物のスクリーニング方法は効率的でなく、多大な労力を要し、薬物の発見を妨げるものである。上述のＡＬＳトランスジェニックマウスは、候補化合物の有効性を評価するための有用なインビボ方法を表すが、マウスを用いた実験は、比較的高価であり、時間のかかるものであり、ハイスループットスクリーニングにあまり適さない。他の実験は、死後のヒト試料における遺伝子発現の研究に頼ったものであり、そしてそれは十分でなく、制御された実験的操作に従わない。
【０００７】
ＡＬＳの効率的なインビトロモデルは、可能性のある治療用化合物の迅速スクリーニングを促進するだろう。インビトロで有益な効果を示す化合物は、次に、さらなる試験、例えば、上述のトランスジェニックマウスを用いてさらに確認され得る。しかしながら、既存のインビトロ方法は、ハイスループットスクリーニングに適していない。例えば、ある方法では、初代培養中の個々の細胞に変異体ＳＯＤ１遺伝子（例えば、Ｇ９３Ａ）をコードするプラスミドを用いてマイクロインジェクションし、ＡＬＳにおける同じ変異体遺伝子の過剰発現の効果を模倣する。次に、かかる細胞を目的の化合物で処理して、該化合物が、凝集体または封入体の形成などのＳＯＤ１の過剰発現と関連する表現型効果（複数を含む）を逆転させることができるかどうかを決定することができる。しかしながら、マイクロインジェクションは多大な労力を要し、かつ制限された数の細胞のみに行うことができる。そしてそのことが、統計上確かな結果を得ることを難しくする。
【０００８】
ＡＬＳの効果を逆転させるか、あるいは改善する際の有効性について化合物をスクリーニングするためのモデル系の必要が存在し、そしてモデルは、ハイスループットスクリーニングに従い、統計上有意な数の細胞の評価により目的の化合物の有効性を決定することを可能にするべきである。
【０００９】
野生型ＳＯＤ（変異体ではない）は、治療剤として有用であるかもしれない。多くの障害は、酸化的ストレス、すなわち、スーパーオキシドなどの細胞において有害な反応性酸素種（ＲＯＳ）が存在することの結果である。例えば、Cash et al. (2004) Med. CheO. Rev. 1: 19-23を参照されたい。スーパーオキシドジスムターゼは、スーパーオキシドの過酸化水素および分子酸素への変換を触媒する。ＳＯＤにより生成される過酸化水素は、続いて、カタラーゼにより分子酵素および水に変換され、スーパーオキシドのより反応性の低い、従ってより損傷を与えない形態の酸素への変換が完了する。
【００１０】
ビタミンＡ、ビタミンＣ、グルタチオン、ビタミンＥ、カロチン、リポ酸およびコエンザイムＱ１０などの酸化防止剤を投与して、かかる種の生成および蓄積を低減することができるが、かかる剤は、全身投与されたとき、細胞内で有効なレベルまで蓄積することができない。代替物として、酵素ＳＯＤのかかる細胞への徐放性送達が、スーパーオキシド蓄積の有害な効果を低減することを助けるかもしれない。
【００１１】
ＳＯＤ活性の恩恵を受け得る対象の細胞にＳＯＤ遺伝子を送達することができる治療ベクターおよび方法の必要が存在する。かかる対象は、スーパーオキシドの過剰生成または蓄積を引き起こす障害に罹患しているもの、過剰スーパーオキシド生成または蓄積を引き起こす環境条件にさらされたもの、および正常な加齢と関連する累積酸化的損傷に従うものでさえも含む。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
１の態様において、本発明は、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）をコードするアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに関する。１つの実施態様において、ＳＯＤはＳＯＤ１である。別の実施態様において、ＳＯＤ１遺伝子は、Ｇｌｙ９３ＡｌａなどのＡＬＳと関連する変異を含有する。
【００１３】
１つの実施態様において、ＳＯＤをコードするＡＡＶベクター（ＡＡＶ−ＳＯＤ）を用いて、ＳＯＤ遺伝子が標的細胞に送達される。１つの実施態様において、標的細胞は、ＳＯＤの標的細胞への送達が治療上の利点をもたらす、疾患または状態を有する対象内にある。ある実施態様において、ＳＯＤの送達は対象に対して治療効果をもたらす。他の実施態様において、疾患または状態は、パーキンソン病、ハンチントン病、変性性眼疾患（例えば、黄斑変性症、網膜色素変性症）、アルツハイマー病、関節リウマチ、クローン病、ペイロニー病、潰瘍性大腸炎、脳虚血（脳卒中）、心筋梗塞（心臓発作）、脳損傷および／または脊髄損傷、再かん流傷害、ＡＬＳ、ダウン症、白内障、統合失調症、てんかん、ヒト白血病および他の癌、ならびに糖尿病からなる群より選択される。
【００１４】
別の態様において、本発明は、Ｇｌｙ９３ＡｌａなどのＡＬＳと関連する変異を含有するＳＯＤ１遺伝子をコードするＡＡＶベクターを用いて形質導入された複数の細胞を含む、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の処置における有効性について化合物をスクリーニングするためのモデル系に関する。種々の実施態様において、本発明のＡＡＶベクターは、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−５またはＡＡＶ−６に由来する。
【００１５】
１つの実施態様において、ＡＡＶベクターを用いて形質導入された複数の細胞は、それらが見出される集団、例えば、齧歯類脊髄由来細胞の初代培養物における少なくとも８０％の細胞を含む。
【００１６】
ある実施態様において、形質導入された細胞は、ＡＬＳと関連する表現型変化を示す。他の実施態様において、１種類以上のスクリーニングされた化合物が、この表現型変化を低減するか、あるいは改善する。
【００１７】
なお別の実施態様において、本発明は、本発明のモデル系を用いて、ＡＬＳの処置における有効性について化合物をスクリーニングする方法に関する。
【００１８】
図面の簡単な説明
図１は、ｐＶｍ−Ｇ９３ＡＳＯＤと称される、ｈＳＯＤ１−Ｇｌｙ９３Ａｌａの送達用ｒＡＡＶベクターの概略図である。ｈＳＯＤ１−Ｇｌｙ９３Ａｌａの発現は、ニワトリβ−アクチンプロモーターによりもたらされる。発現カセットは、２つのＡＡＶ−２ ＩＴＲ配列の間に位置する。ＳＯＤ１−Ｇｌｙ９３Ａｌａは、本明細書において「変異体」ＳＯＤとも称される。
【００１９】
図２は、ｐＶｍ−ＷＴＳＯＤと称される、野生型ヒトＳＯＤ１の送達用ｒＡＡＶベクターの概略図である。ｗｔＳＯＤ１の発現は、ニワトリβ−アクチンプロモーターによりもたらされる。発現カセットは、２つのＡＡＶ−２ ＩＴＲ配列の間に位置する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明の実施は、特に示さない限り、ウイルス学、微生物学、細胞および分子生物学、ならびに組換えＤＮＡ技術の当業者において通常の方法を利用する。かかる技術は文献において十分に説明されている。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Current Edition)；DNA Cloning: A Practical Approach, Vol. I & II (D. Glover, ed.)；Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., Current Edition)； Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., Current Edition)；Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., Current Edition)；CRC Handbook of Parvoviruses, vol. I & II （P. Tijssen, ed.）；Fundamental Virology, 2nd Edition, vol. I & II (BN. Fields and D.M. Knipe, eds.)；Freshney, Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique (Wiley-Liss, Third Edition）；およびAusubel et al. (1991) Current Protocols in Molecular Biology（Wiley Interscience, NY）を参照されたい。
【００２１】
本明細書において引用される全ての刊行物、特許、特許出願およびデータベース入力（ＯＭＩＭ入力を含む）は、全体として引用により本明細書に取り込まれる。
【００２２】
本発明は、ＡＬＳのインビトロモデル系を作成するために用いられ得るか、あるいは治療剤として用いられ得るＳＯＤをコードするＡＡＶベクターに関する。
【００２３】
ＡＬＳと関連するＳＯＤ１変異
ＡＬＳモデル系に関する本発明の態様において、ＡＡＶベクターによりコードされるＳＯＤ遺伝子は、ＡＬＳと関連する変異を含む。本明細書で用いられる「ＡＬＳと関連する変異」は、ＡＬＳを有さない対象においてより、ＡＬＳを有する対象において高い頻度で生じるＳＯＤ遺伝子における変異をいう。ｗｔＳＯＤ１のアミノ酸配列を表１にて示す。ＳＯＤ１における既知の変異は、Ａｌａ４Ｓｅｒ、Ａｌａ４Ｔｈｒ、Ａｌａ４Ｖａｌ（Ａ４Ｖ；１４７４５０．００１２）、Ｃｙｓ６Ｇｌｙ、Ｃｙｓ６Ｐｈｅ、Ｖａｌ７Ｇｌｕ、Ｌｅｕ８Ｖａｌ、Ｌｅｕ８Ｇｌｎ、Ｇｌｙ１０Ｖａｌ、Ｇｌｙ１２Ａｒｇ、Ｖａｌ１４Ｍｅｔ、Ｖａｌ１４Ｇｌｙ、Ｇｌｙ１６Ａｌａ、Ｇｌｙ１６Ｓｅｒ、Ａｓｎ１９Ｓｅｒ、Ｐｈｅ２０Ｃｙｓ、Ｇｌｕ２ｌＧｌｙ、Ｇｌｕ２１Ｌｙｓ、Ｇｌｎ２２Ｌｅｕ、Ｇｌｙ３７Ａｒｇ（Ｇ３７Ｒ；１４７４５０．０００１）、Ｌｅｕ３８Ａｒｇ、Ｌｅｕ３８Ｖａｌ（Ｌ３８Ｖ；１４７４５０．０００２）、Ｇｌｙ４１Ａｓｐ（Ｇ４１Ｄ；１４７４５０．０００４）、Ｇｌｙ４１Ｓｅｒ、Ｈｉｓ４３Ａｒｇ、Ｐｈｅ４５Ｃｙｓ、Ｈｉｓ４６Ａｒｇ（Ｈ４６Ｒ；１４７４５０．００１３）、Ｖａｌ４７Ｐｈｅ、Ｈｉｓ４８Ａｒｇ、Ｈｉｓ４８Ｇｌｎ、Ｇｌｕ４９Ｌｙｓ、Ｔｈｒ５４Ａｒｇ、Ｃｙｓ５７Ａｒｇ、Ｓｅｒ５９Ｉｌｅ、Ａｓｎ６５Ｓｅｒ、Ｌｅｕ６７Ａｒｇ、Ｇｌｙ７２Ｃｙｓ、Ｇｌｙ７２Ｓｅｒ、Ａｓｐ７６Ｔｙｒ、Ａｓｐ７６Ｖａｌ、Ｈｉｓ８０Ａｌａ、Ｈｉｓ８０Ａｒｇ、Ｌｅｕ８４Ｖａｌ、Ｇｌｙ８５Ａｒｇ、Ａｓｎ８６Ａｓｐ、Ａｓｎ８６Ｓｅｒ、Ｖａｌ８７Ｍｅｔ、Ｖａｌ８７Ａｌａ、Ａｌａ８９Ｔｈｒ、Ａｌａ８９Ｖａｌ、Ａｓｐ９０Ａｌａ、Ａｓｐ９０Ｖａｌ、Ｇｌｙ９３Ａｌａ（Ｇ９３Ａ；１４７４５０．０００８）、Ｇｌｙ９３Ａｒｇ、Ｇｌｙ９３Ａｓｐ、Ｇｌｙ９３Ｃｙｓ（Ｇ９３Ｃ；１４７４５０．０００７）、Ｇｌｙ９３Ｓｅｒ、Ｇｌｙ９３Ｖａｌ、Ａｌａ９５Ｔｈｒ、Ａｓｐ９６Ａｓｎ、Ｖａｌ９７Ｍｅｔ、Ｇｌｕ１００Ｇｌｙ、Ｇｌｕ１００Ｌｙｓ、Ａｓｐ１０１Ａｓｎ、Ａｓｐ１０１Ｇｌｙ、Ａｓｐ１０１Ｈｉｓ、Ｉｌｅ１０４Ｐｈｅ、Ｌｅｕ１０６Ｖａｌ、Ｉｌｅ１１３Ｔｈｒ（Ｉ１１３Ｔ；１４７４５０．００１１）、Ｌｅｕｌ２６Ｔｅｒ、Ｓｅｒ１３４Ａｓｎ、Ｌｅｕｌ４４Ｓｅｒ、およびＡｌａｌ４５Ｔｈｒを含む。変異の後に数字が存在する場合、それらの変異のＯＭＩＭ参照番号を表す。ＳＯＤ１変異は、Rosen et al., (1993) Mutations in Cu/Zn superoxide dismutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis, Nature 362: 59-62；Cudkowic et al., (1997) Epidemiology of mutations in superoxide dismutase in amyotrophic lateral sclerosis, Ann. Neurol. 41: 210-221；Belleroche et al., (1995) Familial amyotrophic lateral sclerosis/motor neuron disease (FALS): a review of current developments, J. Med. Genet. 32: 841-847においても開示されている。ＳＯＤ１における多数の変異が本明細書において開示されているが、これらの変異体の全てがＡＬＳの疾患モデルを作成する際に有用であるわけではない。
【００２４】
表１：ｗｔＳＯＤ１のアミノ酸配列
【表１】
【００２５】
アデノ随伴ウイルスベクター
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、遺伝子治療用遺伝子を送達するために首尾よく用いられており、ヒトでの臨床試験は、かなり有望であることを示している（例えば、Kay et al., Nat. Genet. (2000) 24: 257-261を参照）。単に、非病原性かつ複製欠損ウイルスに基づくウイルスベクター系として、組換えＡＡＶビリオンは、検出可能な免疫応答または毒性なしで、種々の組織において増殖細胞および最終分化細胞の両方の効率的かつ徐放性の遺伝子伝達を確立するために首尾よく用いられてきた（Bueler, H., Biol. Chem. (1999) 380: 613-622）。
【００２６】
ＡＡＶゲノムは、約４６８１個のヌクレオチドを含有する直鎖状の１本鎖ＤＮＡ分子である。ＡＡＶゲノムは、一般に、逆方向末端反復（ＩＴＲ）により各末端上で隣接される内部非反復ゲノムを含む。ＩＴＲは、およそ１４５塩基対（ｂｐ）の長さである。ＩＴＲは、ＤＮＡ複製開始点としての機能、およびウイルスゲノムのパッケージングシグナルとしての機能を含む、複数の機能を有する。ゲノムの内部非反復部分は、ＡＡＶ複製（ｒｅｐ）およびキャプシド（ｃａｐ）遺伝子として知られている２つの巨大なオープンリーディングフレームを含む。ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、ウイルスが複製され、ビリオンにパッケージングされることを可能にするウイルスタンパク質をコードする。特に、少なくとも４種類のウイルスタンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、およびＲｅｐ４０（それらの見かけ分子量に従い命名）のファミリーは、ＡＡＶｒｅｐ領域から発現する。ＡＡＶｃａｐ領域は、少なくとも３種類のタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３をコードする。
【００２７】
ＡＡＶは、ＡＡＶゲノムの内部非反復部分（すなわち、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子）を欠損させ、ＩＴＲ間に異種遺伝子を挿入することにより、目的の遺伝子を送達するように操作されている。異種遺伝子は、典型的には、適当な条件下で患者の標的細胞において遺伝子発現をもたらすことができる異種プロモーター（恒常的、細胞特異的、または誘導可能）に機能的に結合される。ポリアデニル化部位などの終結シグナルも含まれ得る。
【００２８】
ＡＡＶはヘルパー依存性ウイルスである。すなわち、それは、野生でＡＡＶビリオンを形成するために、ヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、またはワクシニア）との共感染を必要とする。ヘルパーウイルスとの共感染がない場合、ＡＡＶは、ウイルスゲノムは宿主細胞の染色体に挿入されているが、感染性ビリオンは生成されない、潜伏状態を確立する。後のヘルパーウイルスによる感染が、組み込まれたゲノムを「レスキューし」、ゲノムを複製し、そのゲノムを感染性ＡＡＶビリオンにパッケージングすることを可能にする。ＡＡＶは異なる種由来の細胞に感染することができ、ヘルパーウイルスは宿主細胞と同じ種のものでなければならない。従って、例えば、ヒトＡＡＶは、イヌアデノウイルスに共感染したイヌ細胞において複製する。
【００２９】
本発明の好ましい実施態様において、三重トランスフェクション法（全体として引用により本明細書に取り込まれる、米国特許第６，００１，６５０号において詳細に記載）を用いて、ｒＡＡＶビリオンを生成する。なぜならこの方法は感染性ヘルパーウイルスの使用を必要とせず、ｒＡＡＶビリオンが検出可能なヘルパーウイルスが全く存在することなく生成されることを可能にするからである。これは、ｒＡＡＶビリオン生成用の３種類のベクター：ＡＡＶヘルパー機能ベクター、補助機能ベクター、およびｒＡＡＶ発現ベクターを用いることにより成し遂げられる。当業者は、これらのベクターによりコードされる核酸配列が、種々の組み合わせの２種類以上のベクター上でもたらされ得ることを理解する。
【００３０】
ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、ＡＡＶヘルパー機能配列（すなわち、ｒｅｐおよびｃａｐ）をコードし、そしてそれは増殖性ＡＡＶ複製およびキャプシド形成のためトランスに機能する。好ましくは、ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、機能的ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含有する検出可能なＡＡＶビリオンを全く作成することなく、効率的なＡＡＶベクター生成を支持する。かかるベクターの一例であるｐＨＬＰ１９が、米国特許第６，００１，６５０号（全体として引用により本明細書に取り込まれる）に記載されている。ＡＡＶヘルパー機能ベクターのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、上で説明された既知のＡＡＶ血清型のいずれかに由来し得る。例えば、ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、ＡＡＶ−２由来のｒｅｐ遺伝子、およびＡＡＶ−６由来のｃａｐ遺伝子を有していてもよい。当業者は、他のｒｅｐとｃａｐ遺伝子の組み合わせが可能であることを理解し、決定的特徴はｒＡＡＶビリオンの生成を支持することができることである。
【００３１】
補助機能ベクターは、本明細書において補助機能と称される、ＡＡＶが複製のため依存する非ＡＡＶ由来ウイルスおよび／または細胞機能のヌクレオチド配列をコードする。補助機能はＡＡＶ複製に必要とされるそれらの機能を含み、そしてそれは、ＡＡＶ遺伝子転写、ステージ特異的ＡＡＶ ｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶ ＤＮＡ複製、ｃａｐ発現産物の合成、およびＡＡＶキャプシド構築の活性化に関与する部分を含むが、これらに限定されない。ウイルスベースの補助機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス１型以外）、およびワクシニアウイルスなどの周知のヘルパーウイルスのいずれかに由来し得る。好ましい実施態様において、補助機能プラスミドｐＬａｄｅｎｏ５が用いられる。ｐＬａｄｅｎｏ５に関する詳細は、米国特許第６，００４，７９７号（全体として引用により本明細書に取り込まれる）において記載されている。このプラスミドは、ＡＡＶベクター生成のためのアデノウイルス補助機能の完全なセットを提供するが、複製コンピテントアデノウイルスを形成するのに必要な要素を欠く。
【００３２】
組換えＡＡＶ発現ベクター
組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）発現ベクターは、制御エレメント（転写開始領域を含む）、目的のＳＯＤコードポリヌクレオチド、および転写終結領域を含む、作動可能に結合した要素を提供するよう、既知の技術を用いて構築される。得られたコンストラクトは、機能性ＡＡＶ ＩＴＲ配列と（５’および３’）結合した作動可能に結合した成分を含有する。
【００３３】
ＡＬＳ研究用のモデル系を対象とする実施態様において、哺乳類神経細胞において機能する制御エレメントが選択される。治療上使用するためのＡＡＶ−ＳＯＤベクターを対象とする実施態様において、目的の標的細胞または組織において機能的である制御エレメントが選択される。本発明のある実施態様において、組織特異的かつ調節可能な制御エレメントが望まれるが、他の実施態様は、恒常的プロモーターの使用を含む。
【００３４】
ＡＡＶ ＩＴＲ領域のヌクレオチド配列は知られている。例えば、ＡＡＶ−２配列について、Kotin, R.M. (1994) Human Gene Therapy 5: 793-801；Berns, K.I. "Parvoviridae and their Replication" in Fundamental Virology, 2nd Edition, (B.N. Fields and D.M. Knipe, eds.)を参照されたい。本発明のベクターにおいて用いられるＡＡＶ ＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列を有する必要はなく、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失または置換により変化していてもよい。加えて、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７およびＡＡＶ−８などを含むが、これらに限定されない、いくつかのＡＡＶ血清型のいずれかに由来してもよい。ＡＡＶ ＩＴＲはまた、例えば、マウス、ヤギ、またはウシ供給源から単離されたＡＡＶ変異体に由来してもよい。さらに、意図された通り機能する、すなわち、宿主細胞ゲノムまたはベクターから目的の配列を切除し、レスキューすることを可能にし、かつＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子産物が細胞に存在するとき、レシピエント細胞ゲノムへのＤＮＡ分子の組み込みを可能にする限り、ＡＡＶ発現ベクターにおいて選択されたヌクレオチド配列に隣接する５’および３’ＩＴＲは、同じＡＡＶ血清型または単離物と同一であるか、あるいはそれに由来することは必ずしも必要としない。
【００３５】
異なるＡＡＶ血清型を用いて、異なる細胞種類を特異的に標的にすることができる。例えば、種々の実施態様において、本発明のベクターは、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−５およびＡＡＶ−６に由来する。例えば、初代ラット運動ニューロン培養物において、ＡＡＶ−６由来ベクターは、主としてニューロンにおいてＳＯＤ発現を指令し、ＡＡＶ−２由来ベクターは、ニューロンとグリアの両方においてＳＯＤ発現を指令し、そしてＡＡＶ−５由来ベクターは、主としてグリアにおいてＳＯＤ発現を指令する。ｈＳＯＤ１−Ｇｌｙ９３Ａｌａは、ＡＡＶ−２由来ベクターを用いて送達されたとき、病変と関連する運動ニューロンにおける形態学的変化を引き起こすが、ＡＡＶ−５由来ベクターを用いて送達されたとき、運動ニューロンにおいて病変を引き起こさない。
【００３６】
ＡＡＶ−ＳＯＤの治療上の使用
ｒＡＡＶ−ＳＯＤの治療上の使用に関する本発明の種々の実施態様において、ｒＡＡＶベクターを用いて、ＳＯＤ１、ＳＯＤ２もしくはＳＯＤ３遺伝子、またはそれらの任意の組み合わせを送達させる。特定の実施態様において、ＳＯＤ１が送達される。
【００３７】
本明細書に記載のベクターを用いて、望ましくないレベルのＲＯＳおよびフリーラジカル、または酸化的ストレスと一般的に関連する疾患または状態を処置または予防し得る。ＲＯＳは、いくつかの治療薬物の有害な副作用としても生じる。例えば、Chan et al. (1996) Adv. Neurol 71: 271-279；DiGuiseppi and Fridovich (1984) Crit. Rev. Toxicol. 12: 315-342を参照されたい。本発明のＡＡＶ−ＳＯＤベクターを用いて処置され得る状態は、パーキンソン病、ハンチントン病、変性性眼疾患（例えば、黄斑変性症、網膜色素変性症）、アルツハイマー病、関節リウマチ、クローン病、ペイロニー病、潰瘍性大腸炎、脳虚血（脳卒中）、心筋梗塞（心臓発作）、脳損傷および／または脊髄損傷、再かん流傷害、ＡＬＳ、ダウン症、白内障、統合失調症、てんかん、ヒト白血病および他の癌、ならびに糖尿病を含む。
【００３８】
加齢と関連する正常な酸化的損傷に罹患しているにすぎない対象でさえ、本発明のベクターおよび方法から利益を享受し得る。ＲＯＳおよびフリーラジカルの形成による酸化的ストレスの漸進的上昇は加齢中に生じ（例えば、Mecocci, P. et al. (2000) Free Radio. Biol. Med, 28: 1243-1248を参照）、このことは、ラット組織（Erdincler, D. S., et al. (1997) Clin. Chim. Acta, 265: 77-84）および高齢ヒト患者の血液細胞（Congi, F., et al. (1995) Presse. Med., 24: 1115-1118）における脂質過酸化物（lipid peroxidate）形成の増加により証明されている。最近のレビュー（Niki, E., Intern. Med. (2000) 39: 324-326）によると、ＲＯＳおよびフリーラジカルによる組織損傷の増加の原因は、加齢中に生じる抗酸化酵素ＳＯＤおよびＣＡＴのレベルの低下にあり得ることが報告されている。例えば、余分なＳＯＤ遺伝子をマウスのゲノムに挿入することにより作成されたトランスジェニック動物は、低減したレベルのＲＯＳおよびフリーラジカル損傷を有することが見出された。かかる動物は、寿命の延びも有していた。より最近の証拠によると、ＳＯＤ活性を模倣する小マンガンポルフィリン化合物の投与は、線虫セノラブディティス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）の寿命の４４％の延びを導くことが示された（S. Melow, et al. (2000) Science, 289: 1567-1569）。従って、本発明のベクターおよび方法は、加齢プロセスに付随するＲＯＳおよびフリーラジカルレベルの上昇により引き起こされる組織損傷の増大および平均余命の低下を予防し、および／または打ち消し得る。
【００３９】
本明細書において用いられるＡＬＳの「処置」は、治療上所望の結果である、既存の損傷の逆転、さらなる損傷の予防、および損傷の進行の遅延を含む。本発明の治療用ｒＡＡＶ−ＳＯＤベクターまたはインビトロＡＬＳモデル系を用いて発見された化合物は、治療上有効と考えられるべき既存の損傷の逆転を必要としない。対象においてＡＬＳの進行を少なくとも遅延させる任意の処置が、治療上有効であると考えられ得る。
【００４０】
治療用化合物についてスクリーニングするためのＡＬＳのインビトロモデル系
実施例においてより詳細に記載される通り、本発明のＡＡＶ−ＳＯＤベクターを用いて、ＡＬＳの処置または予防における有効性について化合物をスクリーニングするために用いられ得るＡＬＳのインビトロモデル系を作成することができる。１つの実施態様において、ＡＬＳと関連する既知の変異体ＳＯＤ１（ＳＯＤ１−Ｇｌｙ９３Ａｌａ）が、ＡＡＶベクターにクローン化され、組換えビリオン（ｒＡＡＶ−ＳＯＤ１−Ｇｌｙ９３Ａｌａ）が生成される。次に、ｒＡＡＶ−ＳＯＤ１−Ｇｌｙ９３Ａｌａを用いて、ラット脊髄またはラット脳などの代表的組織由来の初代培養物を形質導入する。次に、トランスフェクションの３〜５日後に培養物を調べ、培養物中のニューロンの幾つかが、ＳＯＤ凝集体の形成または空胞形成などのＡＬＳと関連する形態学的変化を示すことを確認する。かかる細胞は、本明細書において「ＡＬＳ様細胞」と称される。かかる凝集体は、免疫細胞化学により可視化され得る。好ましい実施態様において、培養物中のＡＬＳ様細胞の割合は高く、例えば、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または９５％またはそれ以上である。培養物中のＡＬＳ様細胞の割合が高ければ高いほど、培養細胞を用いて、スクリーニングされ得る化合物の数が多くなるか、あるいは個々の化合物それぞれの複製数が多くなる。
【００４１】
１種類以上の目的の化合物にＡＬＳ様細胞をさらし、続いてＡＬＳ様細胞の表現型が、ＳＯＤ凝集体の低減などＡＬＳ特徴の改善を反映する方法で変化するかどうかを決定することにより、スクリーニングは行われる。ある実施態様において、化合物は、個々のボトル、ディッシュ、プレートまたはマルチウェルプレートのウェル中の培養物などのＡＬＳ様細胞の単離培養物に個別に添加される。他の実施態様において、化合物は、いくつかの化合物の混合物として添加される。ある実施態様において、化合物は、化合物のコンビナトリアルライブラリーまたはサブライブラリーとして添加される。ある実施態様において、化合物の混合物内での活性な化合物の同一性は、化合物の重複サブライブラリーを用いて得られたデータのデコンボリューションにより決定される。他の実施態様において、活性な化合物の同一性は、活性な混合物中において別々に、あるいは小グループにおいて個々の化合物をスクリーニングすることにより決定される。化合物の混合物またはライブラリーにおける活性な化合物の検出方法は、本発明の重要な態様ではない。
【００４２】
実施例１において示される通り、変異体ＳＯＤ遺伝子としてのＳＯＤ１−Ｇｌｙ９３Ａｌａの使用は、形質導入されたラット脊髄運動ニューロンおよびグリア細胞内でのＳＯＤ凝集体の形成、およびラット脳由来の線状体ニューロンおよびグリア細胞の空胞形成を引き起こす。形態学的特徴は、免疫細胞化学により視覚的に観察され得、例えば、形質導入細胞が可能性のある治療剤または処置を用いて処理されたとき、かかる形態学的特徴の任意の逆転が観察され得る。他の実施態様において、ＡＬＳ様表現型の観察は、例えば、ヒトが介入することなく、凝集または空胞形成を検出することができるコンピューター支援画像解析により自動化される。かかるコンピューター支援画像解析は、多数の可能性のある治療剤または処置のスクリーニングにおいて特に好ましい。なお別の実施態様において、Ｇｌｙ９３Ａｌａ以外のＳＯＤ１変異体が用いられ、これらの他の変異体ＳＯＤ１遺伝子を用いて形質導入された細胞の表現型は、ＳＯＤ１Ｇｌｙ９３Ａｌａ形質導入と関連する表現型と異なっていてもよい。変異体ＳＯＤ形質導入と関連する任意の検出可能な表現型変化を用いて、細胞がＡＬＳ様表現型に対して形質導入されているかどうか、および可能性のある治療剤または処置がＡＬＳ様表現型を逆転させる際に有効であるかどうかの両方を評価することができる。
【００４３】
スクリーニングされ得る化合物は、ＡＬＳ様細胞の培養物において提供され得る任意の化合物を含む。これらの化合物は、天然物（粗混合物または高度精製成分のいずれか）、合成化合物、コンビナトリアルライブラリー、および既知の治療上活性な化合物のライブラリーを含むが、これらに限定されない。合成化合物は、ランダムに選択されるか、あるいは合理的薬物設計を用いてＡＬＳの処置において用いられるため特異的に合成され得る。コンビナトリアルライブラリーは、小分子のコンビナトリアル合成に由来するか、あるいはオリゴヌクレオチド、オリゴ糖またはペプチドなどの高分子のコンビナトリアル合成に由来し得る。本発明のＡＬＳのインビトロモデル系を用いてスクリーニングされるべきライブラリーは、１０、５０、１００、５００、１０００、１０，０００、１００，０００から１，０００，０００またはそれ以上を含む任意の数の個々の化合物を含んでいてもよい。本明細書で用いられる「ハイスループットスクリーニング」は、トランスジェニックマウスＳＯＤ１−Ｇｌｙ９３Ａｌａモデルなどのアッセイを用いて同じ時間および労力をかけて可能であるものより、単位時間当たり（例えば、１日当たり）より多くの化合物をスクリーニングすることをいう。種々の実施態様において、ハイスループットスクリーニングは、１日当たり１０、２０、５０、１００、５００、１０００、２０００、５０００またはそれ以上の種類の化合物のスクリーニングをいう。本発明のモデル系を用いて、ＡＬＳ様表現型を逆転するか、または予防するための処置能力について、剤の添加を含まない処置もスクリーニングすることができる。
【００４４】
本発明のインビトロアッセイにおいて有効性を示す化合物は、次に、例えば、他のインビトロアッセイ、インビボアッセイ（例えば、上述のＡＬＳマウス）、または臨床試験においてさらに研究され得る。かかる後続の試験は、本発明のインビトロモデル系より比較的多大な労力を要し、時間がかかり、かつ高価であり、従って、かかる多大な労力を要する試験を用いて多数の化合物をスクリーニングすることは現実的ではない。本発明のインビトロＡＬＳモデルを用いて、かかる多大な労力を要する試験を現実的なものにするために、候補化合物の数を十分に減らすことが可能である。このようにして、本発明のインビトロアッセイは、先行技術のスクリーニング方法を用いて実際に可能であるものよりも多くの化合物のスクリーニングを可能にし、従って、ＡＬＳの処置または予防のための有効なリード化合物を発見する可能性が増す。
【００４５】
ＡＬＳのインビトロモデル系の基礎研究使用
本発明のＡＬＳモデル系は、ハイスループットスクリーニングのための効率的な方法を提供するだけでなく、疾患の病原を研究するため、およびＡＬＳにおける運動ニューロンの選択的脆弱性の根拠を明確にするための価値ある実験系も提供する。例えば、初代培養細胞は、ＡＬＳと関連する変異体ＳＯＤ１をコードするＡＡＶビリオンを用いて形質導入され、形質導入の４時間から４日後の時点で形質導入された細胞から、ＲＮＡが回収され得る。ＲＮＡは、ｗｔＳＯＤ１をコードするＡＡＶビリオンを用いて形質導入された対照細胞またはビリオンを用いて形質導入されていない細胞からも得られる。次に、ＲＮＡ試料は、Affymetrix Gene Chip（登録商標）での遺伝子発現分析の対象とされ、対照と比較してＡＬＳモデル細胞においてどの遺伝子が過剰発現し、どの遺伝子が低発現しているかが決定される。差次的発現を示す遺伝子は、治療的介入のための魅力的な手段を表すかもしれない。
【００４６】
治療用化合物についてスクリーニングするためのＡＬＳのインビボ（動物）モデル系
ＳＯＤの変異体形態をコードする組換えＡＡＶベクターを用いて、ＡＬＳの新規動物モデルを作成することもできる。動物に、ＡＬＳ様表現型を生み出すために変異体ＳＯＤ１遺伝子をコードするｒＡＡＶベクター（例えば、ｒＡＡＶビリオン）を投与することができる。次に、ＡＬＳの症状を模倣した表現型を含む変化した表現型を示す動物を、可能性のある治療用化合物または処置の有効性を試験するための実験において用いる。次に、ＡＬＳ様表現型における逆転を引き起こす化合物を、治療剤として開発するためにさらに研究することができる。かかるＡＬＳモデルにおいて用いられ得る動物は、マウス、ラットおよび非ヒト霊長類を含むが、これらに限定されない。
【００４７】
本発明の特定の実施態様の例を以下に提供する。説明の目的のみのため実施例を提供し、決して本発明の範囲を制限することを意図するものではない。
【実施例１】
【００４８】
初代ラット運動ニューロン培養物におけるＡＬＳのインビトロモデル
ＡＬＳのインビトロモデル系を以下のように構築する。ＳＯＤ遺伝子の発現がニワトリβ−アクチンプロモーターにより指令されるように、ヒトＳＯＤ１野生型遺伝子（ｈＳＯＤ１ｗｔ）または変異体ＳＯＤ１遺伝子（ｈＳＯＤ１−Ｇｌｙ９３Ａｌａ）のいずれかを、２つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含むＡＡＶ−２由来ベクターにクローニングすることにより、２種類のＡＡＶベクターを作成する。
【００４９】
次に、得られたｒＡＡＶ２−ＳＯＤ１−Ｇｌｙ９３ＡｌａベクターをＡＡＶ−２ビリオンにパッケージングし（例えば、米国特許第６，００１，６５０号および第６，００４，７９７号を参照）、これを用いて、初代ラット運動ニューロン培養物を形質導入する。形質導入の３〜５日後の蛍光顕微鏡検査により、形質導入した細胞が、多くの変異体ＳＯＤ発現運動ニューロンにおける点状凝集体での変異体ＳＯＤタンパク質の異常分布、神経細胞体の細胞質の拡大および運動神経プロセスの膨張、運動ニューロンのアポトーシス、および星状細胞の活性化などのＡＬＳの特徴的病理学的変化を示すことを明らかにする。ｒＡＡＶ２−ＳＯＤ１ｗｔを本発明のＡＬＳモデルにおける対照として用いる。なぜなら、このベクターを用いた形質導入は、標的細胞においてＡＬＳ関連表現型変化を全く引き起こさないからである。
【００５０】
それぞれｐＶｍ−ＷＴＳＯＤまたはｐＶｍ−Ｇ９３ＡＳＯＤをコードするＡＡＶ２ベクターを用いた形質導入の約３〜５日後のラット脊髄由来の初代培養物において、運動ニューロンにおけるＳＯＤの存在を免疫組織化学により可視化した。マウス抗ＳＯＤ１ ＩｇＧ １次抗体およびＡｌｅｘａ−５９４−標識ヤギ抗マウスＩｇＧ ２次抗体を用いて、免疫組織化学を行った。ｐＶｍ−Ｇ９３ＡＳＯＤを用いて形質導入したニューロンは、ｐＶｍ−ＷＴＳＯＤを用いて形質導入したニューロンでは観察しない凝集したＳＯＤ１を示す。
【００５１】
それぞれｐＶｍ−ＷＴＳＯＤまたはｐＶｍ−Ｇ９３ＡＳＯＤをコードするＡＡＶ２ベクターでの形質導入の約３〜５日後のラット脊髄由来の初代培養物において、グリア細胞におけるＳＯＤの存在を免疫組織化学により可視化した。ｐＶｍ−Ｇ９３ＡＳＯＤを用いて形質導入したグリア細胞は、ｐＶｍ−ＷＴＳＯＤを用いて形質導入したグリア細胞では観察しない凝集したＳＯＤ１を示す。
【００５２】
ＡＡＶ−５およびＡＡＶ−６由来のＡＡＶベクター、すなわち、ＩＴＲがそれぞれＡＡＶ−５およびＡＡＶ−６に由来するＡＡＶベクターを用いる以外、上述のものを用いて同じようにして別の実験を行う。次に、それぞれＡＡＶ−５またはＡＡＶ−６キャプシドタンパク質遺伝子を用いるパッケージングシステムを用いて、ｒＡＡＶ−５およびｒＡＡＶ−６ビリオンを生成する。
【００５３】
ｐＶｍ−ＷＴＳＯＤまたはｐＶｍＧ９３ＡＳＯＤをコードするＡＡＶ−６ベクターを用いた形質導入の約３〜５日後のラット脊髄由来の初代培養物において、運動ニューロンにおけるＳＯＤの存在を免疫組織化学により可視化した。ｐＶｍ−Ｇ９３ＡＳＯＤを用いて形質導入したニューロンは、ｗｔＳＯＤ１を用いて形質導入したニューロンでは観察しない凝集したＳＯＤ１を示す。
【００５４】
結果は、ｒＡＡＶ−６ビリオンを用いて送達した遺伝子がニュローンにおいて主に発現する一方、ｒＡＡＶ−２ビリオンを用いて送達した遺伝子は（上で考察した通り）ニューロンおよびグリアの両方において発現することを示す。ｒＡＡＶ−５ビリオンを用いて送達した遺伝子はグリアにおいてのみ発現し、ｒＡＡＶ−５ビリオン形質導入は、運動ニューロンにおいて病変を引き起こさなかった。
【００５５】
運動ニューロンに対するｒＡＡＶ２−ＳＯＤ形質導入の表現型効果を、形質導入の６〜７日後および１２日後に再び測定する。結果は、形質導入の１２日後において、細胞死を導く経時的な凝集の進行を示す。ｐＶｍ−Ｇ９３ＡＳＯＤをコードするＡＡＶ２ベクターを用いた形質導入の約６〜７日後のラット脊髄由来の初代培養物において、運動ニューロンにおけるＳＯＤの存在を免疫組織化学により可視化した。ｐＶｍ−Ｇ９３ＡＳＯＤを用いて形質導入したニューロンにおけるＳＯＤ１の凝集は、形質導入の３〜５日後のものより広範であり、このことは、経時的な損傷の進行を説明している。ｐＶｍ−Ｇ９３ＡＳＯＤをコードするＡＡＶ２ベクターを用いた形質導入の約１２日後のラットの脊髄由来の初代培養物において、運動ニューロンにおけるＳＯＤの存在を免疫組織化学により可視化した。結果は、ＳＯＤ１−Ｇｌｙ９３Ａｌａが細胞にとって有毒であること、およびＳＯＤ１−Ｇｌｙ９３Ａｌａが最終的には細胞を殺傷することを示す。
【００５６】
ｒＡＡＶ−ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａを用いた形質導入の６〜７日後の運動ニューロンの形態を評価し、ＡＬＳ患者由来の運動ニューロンの形態と比較した。ｐＶｍ−Ｇ９３ＡＳＯＤをコードするＡＡＶ２ベクターを用いた形質導入の約６〜７日後のラット脊髄由来の初代培養物において、ＳＯＤの存在を免疫組織化学により可視化する。培養中のｒＡＡＶ−ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ形質導入細胞は、ＡＬＳ運動ニューロンの局所的な軸索膨張特徴を同じく示し、このことは、本発明のインビトロＡＬＳモデル系が疾患状態を模倣することを示唆している。ｐＶｍ−Ｇ９３ＡＳＯＤを用いて形質導入したニューロンは、６〜７日目において、ＡＬＳ患者由来の運動ニューロンにおいて見られるものと類似する神経細胞体の細胞質の拡大および運動ニューロンプロセスの膨張を示す。
【００５７】
ラット脊髄培養物（上記）を形質導入するために用いたのと同じビリオンをまた用いて、初代ラット脳培養物の線状体ニューロンを形質導入する。形質導入の３〜５日後の形質導入細胞の免疫細胞化学は、線状体ニューロンが、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａを発現するベクターを用いて形質導入したとき、空胞形成を示すことを示す。ラット脳初代培養物由来のグリア細胞をＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ発現ＡＡＶベクターを用いて形質導入したとき、同様の表現型を観察する。脳由来のグリア細胞は、（上で考察した）脊髄グリア細胞の同様の処置を用いて観察した凝集と対照的に、ｐＶｍ−Ｇ９３ＡＳＯＤを用いて形質導入したとき、空胞形成を示す。脳で観察したこの表現型は、形質導入した脊髄運動ニューロンおよびグリアにおいて観察したＳＯＤ１凝集体形成と対照をなす。
【００５８】
ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ発現細胞が実際に運動ニューロンであることを実験により確認する。ｒＡＡＶ−ＳＯＤ１ｗｔまたはｒＡＡＶ−ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａを用いた形質導入の約５〜６日後のラット脊髄の初代培養細胞において、免疫細胞化学を行った。第１の実験は、ＳＯＤおよび神経フィラメント光（ＮＦ−Ｌ）両方の免疫細胞化学検出を含むものであった。それぞれｐＶｍ−ＷＴＳＯＤまたはｐＶｍ−Ｇ９３ＡＳＯＤをコードするＡＡＶ−２ベクターを用いた形質導入の約３〜５日後のラット脊髄由来の初代培養物において、運動ニューロンにおけるＳＯＤおよびニューロフィラメント光（ＮＦ−Ｌ）の両方を検出した。ＮＦ−Ｌは特異的な神経マーカーである。同じ細胞におけるＳＯＤおよびＮＦ−Ｌ両方の染色により、細胞がニューロンであることを確認する。第２の実験は、ＳＯＤおよびコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）両方の免疫細胞化学検出を含むものである。それぞれｐＶｍ−ＷＴＳＯＤまたはｐＶｍ−Ｇ９３ＡＳＯＤをコードするＡＡＶ−２ベクターを用いた形質導入の約３〜５日後のラット脊髄由来の初代培養物において、運動ニューロンにおけるＳＯＤおよびコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）の両方を検出した。ＣｈＡＴは運動ニューロンの特異的マーカーである。同じ細胞におけるＳＯＤおよびＣｈＡＴ両方の染色により、細胞が運動ニューロンであることを確認する。これらの実験は、運動ニューロンの特徴であるタンパク質を発現する細胞内でのＳＯＤ発現を示す。
【００５９】
蛍光顕微鏡検査により、初代ラット運動ニューロン培養物における全細胞の約９０％を形質導入したことを示す。ｒＡＡＶ−ＳＯＤ１−Ｇｌｙ９３Ａｌａを用いた形質導入の高い効率は、単純に、適当な数のウイルス粒子を添加し、インキュベートすることにより、比較的少ない労力でアッセイにおいて使用するのに適した多数の細胞を提供する。本実施例において、１個の細胞当たり１００，０００個のｒＡＡＶ−ＳＯＤ１−Ｇｌｙ９３Ａｌａ粒子を用いて、細胞を形質導入する。すなわち、感染の多重度（ＭＯＩ）は１０５である。他の実験（示していない）は、１０００までのＭＯＩが、最大（９０％）形質導入をもたらす際に同等に有効であることを示している。多数の形質導入細胞は、統計上有意な数の異なる細胞において目的の任意の所定の化合物の効果を観察することを可能にし、従って、統計上確かな結果を与える。このことは、実際にハイスループットスクリーニングのため統計上意味のある数の細胞を提供することができない、変異体ＳＯＤコードプラスミドの個々の細胞へのマイクロインジェクションに関する従来の方法と対照をなす。
【００６０】
多数の運動ニューロンおよび他の細胞を同時に形質導入するウイルスベクターを利用するこのエピジェネティックモデルは、ＡＬＳの分子病理学、ＡＬＳの新たな動物モデルの作成、およびＡＬＳ薬物についてのスクリーニングの研究を促進し得る。
【００６１】
実施例１の材料および方法は以下の通りである。
ｐＶｍ−ｗｔＳＯＤおよびｐＶｍ−Ｇ９３ＡＳＯＤプラスミドの構築
組み込みＨｉｎｄＩＩＩ部位を含有するフォワードプライマー、および組み込みＮｏｔＩ部位を有するリバースプライマーを用いたＰＣＲにより、野生型およびＧ９３Ａ変異体のヒトＳＯＤ遺伝子を増幅する。
５’−ＡＧＣＴＡＡＧＣＴＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＡＣＧＡＡＧＧＣＣＧＴＧＴＧ−３’（ＨＣ番号１４６）（配列番号２）
５’−ＡＴＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＧＧＣＧＡＴＣＣＣＡＡＴＩＡＣＡＣＣＡ−３’（ＨＣ番号１４７）（配列番号３）
【００６２】
ＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩ制限酵素を用いて消化し、プラスミドＦ１０１のＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩ部位にクローン化し、そして遺伝子をニワトリβ−アクチンプロモーターの制御下におき、両ＡＡＶ ＩＴＲに隣接させて、プラスミドＦ１０１−ｗｔＳＯＤおよびＦ１０１−Ｇ９３Ａを作成する。ｗｔＳＯＤおよびＧ９３Ａをニワトリβ−アクチンプロモーターと共に、ＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩを用いてＦ１０１−ｗｔＳＯＤおよびＦ１０１−Ｇ９３Ａから切り出し、ＳｐｈＩ−ＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩ−ＮｃｏＩリンカーを用いてｐＶｍ−ＬａｃＺのＳｐｈＩおよびＮｃｏＩ部位にクローン化する。配列決定分析によりコンストラクトを確かめ、ｐＶｍ−ｗｔＳＯＤ（図２）およびｐＶｍ−Ｇ９３ＡＳＯＤ（図１）と命名する。次に、プラスミドを増幅し、これを用いて２９３細胞をトランスフェクトして、ＡＡＶベクターを生成する。
【００６３】
初代神経培養物
ｄａｙ１５のスプラーグドーリーラット胚から、解離脊髄または脳の初代培養物を調製する。解離線状体または脊髄組織を小片に切り刻み、トリプシンと３０分間インキュベートする。解離後、組織をパスツールピペットを通して粉砕し、ポリ−Ｄ−リジン（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）でコートした円形ガラス１８ｍｍカバースリップ（Fisher Scientific, Chicago, IL）を含有する１２ウェル培養ディッシュ（Fisher Scientific, Chicago, IL）において、１ウェル当たり３５０，０００個（線状体ニューロン）または７００，０００個（脊髄ニューロン）の細胞密度で細胞を蒔く。線状体培養物用の培地は、２％ Ｂ−２７、０．５ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび２５ｍＭ Ｌ−グルタミン酸を添加したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（lnvitrogen, Chicago, IL）である。細胞を維持するために、１週間に１回培養物に栄養を与える。脊髄培養物用の培地は、２．５ｇ Ｄ−グルコースを強化し、かつ２％ ウマ血清、５％ ウシ胎児血清、１％ ペニシリン・ストレプトマイシン（penstrep）および成長因子を添加したイーグルの最小必須培地（ＥＭＥＭ）（ATCC, Manassas, Virginia）である。最適な細胞成長および安定性を得るために、１週間に２回、培養物に栄養を与える。４〜６日目に１．４μｇ／ｍｌ シトシン−Ｂ−Ｄ−アラビノシド（Calbiochem）を用いて培養物を処理することにより、非神経細胞をできるだけ少なくする。培養物を３７℃、５％ ＣＯ２にて維持する。運動ニューロンの成長および他のニューロンからの分化を可能にするために、解離の２〜３週後の実験において細胞を用いる。
【００６４】
培養物の処理
線状体培養物および脊髄培養物をＡＡＶ−ｈＳＯＤｗｔまたはＡＡＶ−ｈＧ９３Ａ（１個の細胞当たり１０５ベクターゲノム（ｖｇ））とインキュベートし、ベクターの最大発現を達成する。
【００６５】
免疫細胞化学
ガラスカバースリップ上で成長した線状体および脊髄細胞を、４％ パラホルムアルデヒドを用いて固定し、０．０５％ ＮＰ−４０により透過処理する。１×ＰＢＳ、３％ ＢＳＡ、および２％ ヤギ血清を含有するブロッキング溶液を用いる。以下の抗体：神経フィラメント−Ｌ（ＮＦ−Ｌ；ＡＢ１９８３，１：１００，Chemicon Inc.）、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ；ＡＢ１４３およびＭＡＢ３０５，１：１０，Chemicon Inc）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ；５２，１：３００，Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ：ＡＢ５８０４，１：５００，Chemicon Inc）を用いて、免疫細胞化学を行う。全ての抗体をブロッキング溶液にて希釈する。１：２００希釈した２次抗体：Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（緑）またはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４（赤）結合抗マウス／抗ウサギ／抗ラットＩｇＧ（Molecular Probes）とのインキュベーション後、落射蛍光顕微鏡検査により抗体分布を可視化する。
【実施例２】
【００６６】
ＡＬＳの処置用候補物質としてのＩＬ−１０ペプチドの評価
ＡＬＳに対するＩＬ−１０由来ペプチドの効果を評価するためのアッセイにより、本発明の実施例１のインビトロＡＬＳモデル系の価値を明らかにする。
【００６７】
当業者に既知の固相合成方法により、オリゴペプチドの製造を達成する。合成したオリゴペプチドの分析は、エレクトロスプレー質量分析、高速液体クロマトグラフィー、および精製生成物の外観を含む。オリゴペプチド（複数を含む）を１ｍｇ／ｍｌでの注入用に水中に調製する。適当なＩＬ−１０由来ペプチド（米国特許第６，１５９，９３７号）および「スクランブル」対照ペプチドの例を表２において供する。慣習的なＮ末端からＣ末端方向でペプチド配列を供する。３文字表記を用いて、アミノ酸を指定する。
【００６８】
【表２】
【００６９】
典型的なペプチド配列を表２において供するが、神経障害性疼痛または神経変性疾患の処置におけるペプチドの有効性を保持し、おそらくは改良するか、あるいはその薬理学的特性を改良する種々の修飾または置換を、列挙した配列に対して成し得ることは、当業者にとって明らかである。かかる配列変異体を以下の実施例において記載する１種類以上のモデルにおいて試験して、それらの治療上の有効性を評価することができる。
【００７０】
例えば、非ヒト種由来のＩＬ−１０配列を用いて、ヒト由来ＩＬ−１０ペプチドと異なるＩＬ−１０由来ペプチド配列を得ることができ、そして非ヒトＩＬ−１０由来ペプチドは、ヒト由来の配列と比較して改良した特性を示すかもしれない。あるいは、治療用ペプチドの当業者によく知られた既知の経験的パラメーターを用いた調査により、変異体を設計することができる。加えて、合理的薬物設計を用いて、有効性の増大を示すことが予測される配列変異体を設計することができ、そして合理的薬物設計は、ＩＬ−１０、ＩＬ−１０レセプター、またはＩＬ−１０のレセプターとの複合体の３次元構造の分析に基づき得る。
【００７１】
ラット脊髄の初代培養物をｒＡＡＶ２−ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａビリオンと共にインキュベートし、１種類以上の、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａを発現する形質導入運動ニューロン細胞を含む細胞培養物を生成する。上記のＩＬ−１０およびスクランブルペプチドを、ｒＡＡＶ−ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ形質導入細胞の培養物を含有する組織培養プレートに形質導入後種々の時間で添加する（トリプリケート）。形質導入細胞の対照プレートはいずれのペプチドでも処理しない。ペプチド添加後時間の関数として、ＳＯＤ免疫細胞化学を行い、Ｉｌ−１０ペプチド、スクランブルペプチド、または両方が、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ発現の表現型効果（すなわち、細胞内ＳＯＤ凝集体形成または細胞死）を改善するかどうかを決定する。
【００７２】
いずれかのペプチドまたは両方のペプチドを用いて処理した培養物において、凝集または細胞死の低減を観察すると、本発明のインビトロアッセイにおいてポジティブな結果となるペプチドを次により広範な研究（例えば、ＡＬＳマウスにおけるインビボ研究）の対象とする。本発明のインビトロアッセイにおけるポジティブな結果は、ＳＯＤ凝集体形成または細胞死の１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９８％またはそれ以上の低減を含む。最後にヒト対象における臨床試験を通じて、ＡＬＳの処置および予防における有効性を確認する。
【００７３】
他の実験において、上で示したＩＬ−１０ペプチドの５００種類の配列変異体を合成し、ｒＡＡＶ−ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ形質導入運動ニューロンにおいてＡＬＳ様表現型を低減する際の活性についてアッセイする。より高い活性を示すペプチドをＡＬＳの処置または予防における有効性についてさらに研究する。
【００７４】
本発明と共に用いるための他のＩＬ−１０配列の代表的な非限定的な例は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＭ０００５７２、Ｕ６３０１５、ＡＦ４１８２７１、ＡＦ２４７６０３、ＡＦ２４７６０４、ＡＦ２４７６０６、ＡＦ２４７６０５、ＡＹ０２９１７１、ＵＬ１６７２０（全てヒト配列）、ＮＭ０１２８５４、Ｌ０２９２６、Ｘ６０６７５（ラット）；ＮＭ０１０５４８、ＡＦ３０７０１２、Ｍ３７８９７、Ｍ８４３４０（全てマウス配列）、Ｕ３８２００（ウマ）；Ｕ３９５６９、ＡＦ０６０５２０（ネコ配列）；Ｕ００７９９（ウシ）；Ｕｌ１４２１、Ｚ２９３６２（ヒツジ配列）；Ｌ２６０３１、Ｌ２６０２９（マカク配列）；ＡＦ２９４７５８（サル）；Ｕ３３８４３（イヌ）；ＡＦ０８８８８７、ＡＦ０６８０５８（ウサギ配列）；ＡＦ０１２９０９、ＡＦ１２００３０（マーモット配列）；ＡＦ０２６２７７（フクロネズミ）；ＡＦ０９７５１０（モルモット）；Ｕ１１７６７（シカ）；Ｌ３７７８１（スナネズミ）；ＡＢ１０７６４９（ラマおよびラクダ）において記載の配列を含む。
【実施例３】
【００７５】
ＡＬＳの処置用候補物質としてのＧＤＮＦペプチドの評価
ＡＬＳに対するグリア細胞由来神経栄養因子（ＧＮＤＦ）ペプチドの効果を評価するためのアッセイにより、本発明の実施例１のインビトロＡＬＳモデル系の価値をさらに明らかにする。ＩＬ−１０よりむしろＧＤＮＦ由来ペプチドおよびそのスクランブルバージョンを用意する以外、本質的には実施例２に記載の通り実験を行った。ＧＤＮＦペプチドがアッセイにおいてポジティブな結果を示すと（すなわち、ペプチドでの処理後、形質導入運動ニューロンのＡＬＳ様表現型特徴が低減していると）、このペプチドをさらに研究してＡＬＳの処置または予防における有効性を確認することができる。
【００７６】
他の実験において、５００種類の異なるＧＤＮＦ由来ペプチドを合成し、ｒＡＡＶ−ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ形質導入運動ニューロンにおいてＡＬＳ様表現型を低減する際の活性についてアッセイする。より高い活性を示すペプチドをＡＬＳの処置または予防における有効性についてさらに研究する。
【００７７】
本発明において用いるためのＧＤＮＦペプチドは、多数の既知のＧＤＮＦ配列に由来してもよく、それは、米国特許第６，２２１，３７６号および第６，３６３，３１９号（全体として引用により本明細書に取り込まれる）、およびラットおよびヒト配列について、Lin et al., Science (1993) 260: 1130-1132、ならびにヒト配列について、ＮＣＢＩ受入番号ＡＹ０５２８３２、ＡＪ００１８９６、ＡＦ０５３７４８、ＡＦ０６３５８６およびＬ１９０６３；ラット配列について、ＮＣＢＩ受入番号ＡＦ１８４９２２、ＡＦ４９７６３４、Ｘ９２４９５、ＮＭ０１９１３９；ジャイアントパンダ配列について、ＮＣＢＩ受入番号ＡＦ５１６７６７；マウス配列について、ＮＣＢＩ受入番号ＸＭ１２２８０４、ＮＭ０１０２７５、Ｄ８８３５１Ｓ１、Ｄ４９９２１、Ｕ３６４４９、Ｕ３７４５９、Ｕ６６１９５；ニッポニア・ニッポン（Ｎｉｐｐｏｎｉａ ｎｉｐｐｏｎ）配列について、ＮＣＢＩ受入番号ＡＦ４６９６６５；アカゲザル配列について、ＮＣＢＩ受入番号ＡＦ１０６６７８；およびゼブラフィッシュ配列について、ＮＣＢＩ受入番号ＮＭ１３１７３２およびＡＦ３２９８５３において開示されているものを含む。ＧＤＮＦ配列は、米国特許出願番号第２００３／０１６１８１４号においても開示されている。
【００７８】
本発明のこれらの実施態様および他の実施態様は、本明細書における開示に照らして、当業者にとって容易に思い浮かぶものであるだろう。本発明の好ましい実施態様は詳細に記載されているが、本明細書において定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、バリエーションが作られ得ることが理解される。本明細書において引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、全体として引用により本明細書に取り込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】図１は、ｐＶｍ−Ｇ９３ＡＳＯＤと称される、ｈＳＯＤ１−Ｇｌｙ９３Ａｌａの送達用ｒＡＡＶベクターの概略図である。ｈＳＯＤ１−Ｇｌｙ９３Ａｌａの発現は、ニワトリβ−アクチンプロモーターによりもたらされる。発現カセットは、２つのＡＡＶ−２ ＩＴＲ配列の間に位置する。ＳＯＤ１−Ｇｌｙ９３Ａｌａは、本明細書において「変異体」ＳＯＤとも称される。
【図２】図２は、ｐＶｍ−ＷＴＳＯＤと称される、野生型ヒトＳＯＤ１の送達用ｒＡＡＶベクターの概略図である。ｗｔＳＯＤ１の発現は、ニワトリβ−アクチンプロモーターによりもたらされる。発現カセットは、２つのＡＡＶ−２ ＩＴＲ配列の間に位置する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列およびスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）をコードする遺伝子を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター。
【請求項２】
ＳＯＤがＳＯＤ１である、請求項１記載のベクター。
【請求項３】
ＳＯＤ１がＡＬＳと関連する変異を含有する、請求項２記載のベクター。
【請求項４】
ＳＯＤ１がＧｌｙ９３Ａｌａ変異を含有する、請求項３記載のベクター。
【請求項５】
ＡＡＶベクターがプラスミドである、請求項１記載のベクター。
【請求項６】
ＡＡＶベクターがＡＡＶビリオンである、請求項１記載のベクター。
【請求項７】
ＡＡＶビリオンがＡＡＶ−２に由来する、請求項６記載のベクター。
【請求項８】
ＡＡＶビリオンがＡＡＶ−５に由来する、請求項６記載のベクター。
【請求項９】
ＡＡＶビリオンがＡＡＶ−６に由来する、請求項６記載のベクター。
【請求項１０】
対象にＳＯＤをコードするＡＡＶベクターを投与することを含む、対象の処置方法。
【請求項１１】
対象が、ＡＬＳ、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、ダウン症、関節リウマチ、クローン病、ペイロニー病、潰瘍性大腸炎、黄斑変性症、網膜色素変性症、白内障、脳虚血、心筋梗塞、脳損傷、脊髄損傷、再かん流傷害、統合失調症、てんかん、ヒト白血病、および糖尿病からなる群より選択される障害を有する、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の処置または予防における有効性について化合物をスクリーニングする方法であって、
ＡＬＳと関連する変異を含有するＳＯＤ１をコードするＡＡＶベクターを用いて細胞を形質導入して、ＡＬＳと関連する表現型特徴を示す形質導入細胞を生産すること；
該形質導入細胞を目的の化合物にさらすこと；
目的の化合物にさらされた形質導入細胞がＡＬＳと関連する表現型特徴の減少を示すかどうかを決定することを含む、方法。
【請求項１３】
ＡＬＳの処置における有効性について化合物をスクリーニングするためのインビトロモデルであって、
ＡＬＳと関連する変異を含有するＳＯＤをコードするＡＡＶベクターを用いて形質導入された複数の細胞を含む、モデル。
【請求項１４】
変異がＧｌｙ９３Ａｌａである、請求項１２または１３記載のモデル。
【請求項１５】
ＡＡＶベクターを用いて形質導入された複数の細胞が、培養中の細胞集団における全細胞の少なくとも８０％を含む、請求項１３記載のモデル。
【請求項１】
少なくとも１つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列およびスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）をコードする遺伝子を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター。
【請求項２】
ＳＯＤがＳＯＤ１である、請求項１記載のベクター。
【請求項３】
ＳＯＤ１がＡＬＳと関連する変異を含有する、請求項２記載のベクター。
【請求項４】
ＳＯＤ１がＧｌｙ９３Ａｌａ変異を含有する、請求項３記載のベクター。
【請求項５】
ＡＡＶベクターがプラスミドである、請求項１記載のベクター。
【請求項６】
ＡＡＶベクターがＡＡＶビリオンである、請求項１記載のベクター。
【請求項７】
ＡＡＶビリオンがＡＡＶ−２に由来する、請求項６記載のベクター。
【請求項８】
ＡＡＶビリオンがＡＡＶ−５に由来する、請求項６記載のベクター。
【請求項９】
ＡＡＶビリオンがＡＡＶ−６に由来する、請求項６記載のベクター。
【請求項１０】
対象にＳＯＤをコードするＡＡＶベクターを投与することを含む、対象の処置方法。
【請求項１１】
対象が、ＡＬＳ、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、ダウン症、関節リウマチ、クローン病、ペイロニー病、潰瘍性大腸炎、黄斑変性症、網膜色素変性症、白内障、脳虚血、心筋梗塞、脳損傷、脊髄損傷、再かん流傷害、統合失調症、てんかん、ヒト白血病、および糖尿病からなる群より選択される障害を有する、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の処置または予防における有効性について化合物をスクリーニングする方法であって、
ＡＬＳと関連する変異を含有するＳＯＤ１をコードするＡＡＶベクターを用いて細胞を形質導入して、ＡＬＳと関連する表現型特徴を示す形質導入細胞を生産すること；
該形質導入細胞を目的の化合物にさらすこと；
目的の化合物にさらされた形質導入細胞がＡＬＳと関連する表現型特徴の減少を示すかどうかを決定することを含む、方法。
【請求項１３】
ＡＬＳの処置における有効性について化合物をスクリーニングするためのインビトロモデルであって、
ＡＬＳと関連する変異を含有するＳＯＤをコードするＡＡＶベクターを用いて形質導入された複数の細胞を含む、モデル。
【請求項１４】
変異がＧｌｙ９３Ａｌａである、請求項１２または１３記載のモデル。
【請求項１５】
ＡＡＶベクターを用いて形質導入された複数の細胞が、培養中の細胞集団における全細胞の少なくとも８０％を含む、請求項１３記載のモデル。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２００９−５０１００９（Ｐ２００９−５０１００９Ａ）
【公表日】平成２１年１月１５日（２００９．１．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５２０３３０（Ｐ２００８−５２０３３０）
【出願日】平成１８年６月３０日（２００６．６．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２５９８０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／００８４８６
【国際公開日】平成１９年１月１８日（２００７．１．１８）
【出願人】（５００５７９８８８）ジェンザイム・コーポレーション (34)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１月１５日（２００９．１．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年６月３０日（２００６．６．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２５９８０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／００８４８６
【国際公開日】平成１９年１月１８日（２００７．１．１８）
【出願人】（５００５７９８８８）ジェンザイム・コーポレーション (34)
【Ｆターム（参考）】
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