チロキシンを含む化合物の分析方法
本発明の教示は、アイソバリック標識および親・娘イオン遷移モニタリング（ＰＤＩＴＭ）を用いて１つ以上のサンプルにおいて１つ以上のチロキシン化合物を分析するための方法を提供する。種々の実施形態では、この方法は以下の工程を包含する：（ａ）１つ以上のチロ キシン化合物を、１セットのアイソバリックタグ由来の異なるアイソバリックタグで標識する工程と；（ｂ）このアイソバリックに標識されたチロキシン化合物の各々の少なくとも一部を合わせて、合わされたサンプルを生成する工程と；（ｃ）この合わせたサンプルの少なくとも一部をＰＤＩＴＭに供する工程と； （ｄ）伝送レポーターイオンの１つ以上のイオンシグナルを測定する工程と；（ｅ）標準化合物の１つ以上の測定されたイオンシグナルとレポーターイオンの測定されたイオンシグナルとの比較に少なくとも基づくアイソバリックに標識されたチロキシン化合物の１つ以上の濃度を決定する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２００６年２月８日に出願された、表題「Ａｍｉｎｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ」の米国出願第１１／３５０，１４７号の一部継続であり、かつその利益およびそれへの優先権を主張する。米国出願第１１／３５０，１４７号は、２００５年２月９日に出願された、表題「Ａｍｉｎｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ」の米国仮出願第６０／６５１，７３４号の利益およびそれへの優先権を主張する。これらの各々の全体の開示は、参考として本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
導入
アミン含有化合物は、重要な生物学的および医薬化合物である。アミン含有化合物の例としては、タンパク質、ペプチド、ポリアミン、アミノ酸、カテコールアミンおよびニトロフラン代謝物が挙げられる。アミン含有化合物の定量のための現在の方法としては、市外（ＵＶ）蛍光または電気化学的検出によるハイパフォーマンス液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、液体クロマトグラフィーと質量分析の組み合わせ（ＬＣ／ＭＳ）、およびタンデム型質量分析（ＭＳ／ＭＳ）が挙げられる。
【０００３】
上述の方法によるアミン含有化合物の絶対的定量は、問題があり得る。例えば、ＨＰＬＣによって多くのアミン含有化合物を分析するために、困難かつ時間を浪費する誘導体化工程は、分析を行う前に行わなければならない。さらに、ＨＰＬＣは、長い分析時間、泳動間の偏差の高さ、多重化能力の欠如、および非特異性という欠点を有する。
【０００４】
アミン含有化合物の検出および定量のためのＬＣ／ＭＳおよびＭＳ／ＭＳのさらに近年の使用によって、増大した感度および特異性、ならびに１サンプルで複数のアミン含有化合物を迅速に測定する能力という利点がもたらされる；しかし、これらの技術はまた、多重化能力を欠く。絶対的な定量を行うために、高価な同位体濃縮化合物を内部標準として用いるが、これはいくつかのタンデム質量分析法とは適合しない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
要旨
本発明の教示は、アイソバリック標識および親・娘イオン遷移モニタリング（ＰＤＩＴＭ）を用いる１つ以上のサンプル中の１つ以上のアミン含有化合物の分析のための方法を提供する。種々の局面では、本発明の教示は、１つ以上のサンプル中の１つ以上のアミン含有化合物の相対的な濃度、絶対的な濃度またはその両方を決定するための方法を提供する。種々の実施形態では、本発明の教示は、サンプル中の複数のアミン含有化合物、複数のサンプル中の１つ以上のアミン含有化合物、またはその組み合わせの相対的濃度、絶対的濃度、またはその両方が複数の方式で決定され得る方法を提供する。
【０００６】
アミン含有化合物（本発明の教示の種々の実施形態が提供され得る）は、広範な種々の供給源、例えば、生理学的な流体サンプル、細胞または組織溶解サンプル、タンパク質サンプル、細胞培養サンプル、ファーメンテーションブロス培地サンプル、農産物サンプル、畜産物サンプル、動物給餌サンプル、ヒト消費のための食品または飲料のサンプル、およびそれらの組み合わせなどから生じ得る。本発明の教示は、種々の実施形態では、限定はしないが、アミノ酸、カテコールアミン、ニトロフラン代謝物、ポリアミン、ペプチド、タンパク質、ポリペプチド、およびそれらの組み合わせを含む広範な種々の一級アミン含有化合物に適用され得る。
【０００７】
「アイソバリック標識のセット（ｓｅｔ ｏｆ ｉｓｏｂａｒｉｃ ｌａｂｅｌｓ）」、「アイソバリックタグのセット（ｓｅｔ ｏｆ ｉｓｏｂａｒｉｃ ｔａｇｓ）」という句は交換可能に用いられて、例えば、試薬または化学部分のセットであって、このセットのメンバー（すなわち、個々の「アイソバリック標識」または「アイソバリックタグ」）が実質的に同じ質量を有するが、このセットの各々のメンバーが、イオンフラグメンテーション（例えば、衝突誘起解離（ＣＩＤ）、光誘起解離（ＰＩＤ）などによる）に供される際に異なる娘イオンシグナルを生じ得るセットをいう。セットのメンバーの間を識別するために用いられ得るアイソバリックタグまたは標識の娘イオンは、アイソバリックタグまたは標識のレポーターイオンと呼ばれ得る。種々の実施形態では、１セットのアイソバリックタグは、フラグメンテーションの非存在において実質的にクロマトグラフィーとして識別可能であり、かつ実質的に識別不能な質量分析であり、ただしＣＩＤ後に強力な低質量ＭＳ／ＭＳサインのイオンを生じる、アミン誘導体化アミン含有化合物を含む。
【０００８】
「親・娘イオン遷移モニタリング」または「ＰＤＩＴＭ」という用語は、例えば、質量分析を用いる測定であって、それによって、第一の質量分離器（しばしば第一次元の質量分析と呼ばれる）の伝送質量対電荷（ｍ／ｚ）範囲は、イオン分裂器（ｆｒａｇｍｅｎｔｏｒ）（例えば、衝突セル、光解離領域など）に分子イオン（しばしば、「親イオン」または「前駆体イオン」と呼ばれる）を伝送してフラグメントイオン（しばしば「娘イオン」と呼ばれる）を生じるように選択され、第二の質量分離器（しばしば第二次元の質量分析と呼ばれる）の伝送ｍ／ｚ範囲は、検出器（これが娘イオンシグナルを測定する）に対して１つ以上の娘イオンを伝送するように選択される、測定のことをいう。モニターされた親イオンおよび娘イオンの質量の組み合わせは、モニターされた「親・娘イオン遷移」と呼ばれてもよい。モニターされる所定の親イオン−娘イオンの組み合わせについての検出器での娘イオンシグナルは、「親・娘イオン遷移シグナル」と呼ばれてもよい。本発明の教示の種々の実施形態では、親のイオンは、アイソバリックタグで標識されたアミン含有化合物であって、娘イオンは、アイソバリックタグのレポーターイオンである；従って、所定のアイソバリック標識されたアミン含有化合物親イオンについての検出器で測定されるレポーターイオンのイオンシグナルは、「アミン含有化合物−レポーターイオン遷移シグナル」と呼ばれてもよい。同様に、所定のアイソバリック標識された標準化合物についての検出器で測定されるレポーターイオンのイオンシグナルは、「標準化合物−レポーターイオン遷移シグナル」と呼ばれてもよい。
【０００９】
例えば、親・娘イオン遷移モニタリングの１実施形態は、多重反応モニタリング（ＭＥＭ）（選択反応モニタリングとも呼ばれる）である。ＭＲＭの種々の実施形態では、所定の親・娘イオン遷移のモニタリングは、目的の親イオンを伝送するために第一の質量分離器（例えば、目的の親イオンｍ／ｚに置かれた第一の四重極）として用いる工程と、目的の１つ以上の娘イオンを伝送するために第二の質量分離器（例えば、目的の娘イオンｍ／ｚに置かれた第二の四重極）を用いる工程とを包含する。種々の実施形態では、親イオンを伝送するために第一の質量分離器（例えば、目的の親イオンｍ／ｚに停留された四重極）を用いること、および目的の１つ以上の娘イオンのｍ／ｚ値を含むｍ／ｚ範囲にわたって第二の質量分離器をスキャンすることによって、ＰＤＩＴＭを行ってもよい。
【００１０】
例えば、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）装置、またはさらに一般的には、多次元質量分析（ＭＳｎ）装置を用いて、ＰＤＩＴＭ、例えば、ＭＲＭを行ってもよい。適切な質量分析システムの例としては、限定はしないが、トリプル四重極、四重極線形イオントラップ、四重極ＴＯＦおよびＴＯＦ−ＴＯＦのうちの１つ以上を含むシステムが挙げられる。
【００１１】
種々の局面では、本発明の教示は、アイソバリック標識および親・娘イオン遷移モニタリング（ＰＤＩＴＭ）を用いて１つ以上のサンプル中で１つ以上のアミン含有化合物を分析するための方法を提供する。種々の実施形態では、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）１セットのアイソバリックタグ由来の異なるアイソバリックタグで１つ以上のアミン含有化合物を標識する工程であって、アイソバリックタグのセット由来の各々のアイソバリックタグがレポーターイオン部分を含む工程と；（ｂ）このアイソバリックに標識されたアミン含有化合物の各々の少なくとも一部を合わせて、合わされたサンプルを生成する工程と；（ｃ）この合わせたサンプルの少なくとも一部を親・娘イオン遷移モニタリングに対して供する工程と；（ｄ）１つ以上の遷移されたレポーターイオンのイオンシグナルを測定する工程と；（ｅ）標準化合物の１つ以上の測定されたイオンシグナルに対する、対応するレポーターイオンの測定されたイオンシグナルの比較に少なくとも基づいた、アイソバリックに標識されたアミン含有化合物の１つ以上の濃度を決定する工程と。従って、種々の実施形態では、複数のアミン含有化合物の濃度は、多重方式で、例えば、２つ以上のアイソバリックに標識されたアミン含有化合物を合わせて、合わされたサンプルを生成すること、およびこの合わされたサンプルをＰＤＩＴＭ（ここで２つ以上のアイソバリックに標識されたアミン含有化合物の２つ以上のレポーターイオンがモニターされる）に供することによって決定され得る。
【００１２】
種々の局面では、以下の工程を含む１つ以上のサンプル中で１つ以上のアミン含有化合物を分析するための方法が提供される：（ａ）標準化合物を提供する工程と；（ｂ）１セットのアイソバリックタグ由来のアイソバリックタグでこの標準化合物を標識する工程と；（ｃ）このセットのアイソバリックタグ由来の異なるアイソバリックタグで１つ以上のチロキシン化合物を標識する工程と；（ｄ）このアイソバリックに標識された標準化合物の少なくとも一部と、このアイソバリックに標識されたアミン含有化合物の各々の少なくとも一部とを合わせて、合わされたサンプルを生成する工程と；（ｅ）この合わせたサンプルの少なくとも一部をクロマトグラフィーカラムにロードする工程と；（ｆ）このクロマトグラフィーカラムからの溶離液の少なくとも一部を親・娘イオン遷移モニタリングに対して供する工程と；（ｇ）１つ以上の伝送レポーターイオンのイオンシグナルを測定する工程と；（ｈ）アイソバリックに標識された標準化合物に対応するレポーターイオンの測定されたイオンシグナルに対する、対応するレポーターイオンの測定されたイオンシグナルの比較に少なくとも基づいた、目的のアミン含有化合物の１つ以上の濃度を決定する工程。
【００１３】
種々の局面では、以下の工程を包含する１つ以上のサンプル中で１つ以上のアミン含有化合物を分析するための方法が提供される：（ａ）１セットのアイソバリックタグ由来の種々のアイソバリックタグで１つ以上のアミン含有化合物の各々を標識する工程と；（ｂ）このアイソバリックに標識されたアミン含有化合物の各々の少なくとも一部を合わせて、合わされたサンプルを生成する工程と；（ｃ）この合わせたサンプルの少なくとも一部をクロマトグラフィーカラムにロードする工程と；（ｄ）このクロマトグラフィーカラムからの溶離液の少なくとも一部を親・娘イオン遷移モニタリングに対して供する工程と；（ｅ）１つ以上の伝送レポーターイオンのイオンシグナルを測定する工程と；（ｆ）標準化合物の濃度曲線に対する対応するレポーターイオンの測定されたイオンシグナルの比較に少なくとも基づいた、アイソバリックに標識されたアミン含有化合物の１つ以上の濃度を決定する工程。
【００１４】
種々の局面では、以下の工程を包含する１つ以上のサンプル中で１つ以上のアミン含有化合物を分析するための方法が提供される：（ａ）１セットのアイソバリックタグ由来の種々のアイソバリックタグで１つ以上のアミン含有化合物の各々を標識する工程と；（ｂ）このアイソバリックに標識されたアミン含有化合物の各々の少なくとも一部を合わせて、合わされたサンプルを生成する工程と；（ｃ）この合わせたサンプルの少なくとも一部をマトリックス支援レーザー脱離イオン化を用いる、親・娘イオン遷移モニタリングに供する工程と；（ｄ）１つ以上の伝送レポーターイオンのイオンシグナルを測定する工程と；（ｅ）標準化合物の測定されたイオンシグナルに対する対応するレポーターイオンの測定されたイオンシグナルの比較に少なくとも基づいた、アイソバリックに標識されたアミン含有化合物の１つ以上の濃度を決定する工程。
【００１５】
種々の実施形態では、標準化合物の濃度曲線は、以下の工程によって生成されてもよい：（ａ）第一の濃度を有する標準化合物を提供する工程と；（ｂ）イソバリックタグのセット由来のイソバリックタグで標準化合物を標識する工程と；（ｃ）このアイソバリックに標識された標準化合物の少なくとも一部をクロマトグラフィーカラムにロードする工程と；（ｄ）このクロマトグラフィーカラムからの溶離液の少なくとも一部を親・娘イオン遷移モニタリングに対して供する工程と；（ｅ）この伝送レポーターイオンのイオンシグナルを測定する工程と；（ｆ）１つ以上の異なる標準化合物濃度について、工程（ａ）〜（ｅ）を反復する工程と；（ｇ）２つ以上の標準化合物濃度で伝送レポーターイオンの測定されたイオンシグナルに少なくとも基づいて、標準化合物について濃度曲線を作成する工程。
【００１６】
種々の実施形態では、１つ以上のアイソバリックに標識されたアミン含有化合物の濃度を決定する工程は、アイソバリックに標識されたアミン含有化合物のうち１つ以上の絶対濃度を決定する工程を包含する。
【００１７】
例えば、同位体濃縮アミノ酸を、アミノ酸濃度の絶対値定量のための内部標準として用いてもよいが、ＭＡＬＤＩ質量分析におけるアミノ酸の安定な同位体アナログを用いることの１つの欠点は、ある場合には、マトリックス関連シグナルが、目的のアミノ酸のｍ／ｚ領域で干渉し得るということである。例えば、ほぼｍ／ｚ＝１４７でのシアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）関連シグナルは、リジンおよびその安定な同位体アナログを妨げ得、同様に、ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）関連シグナルは約ｍ／ｚ＝１７５で、アルギニンおよびその安定な同位体アナログを妨げ得る。種々の実施形態では、本発明の教示は、アイソバリックタグおよびＰＤＩＴＭを用いる方法を提供し、これによって、内部標準または目的のアミン含有化合物由来のシグナルでのマトリックス関連シグナルの妨害を軽減することが容易になる。
【００１８】
種々の実施形態では、目的の１つ以上のアミン含有化合物は、１つ以上のリジン、リジンの異性体および翻訳後修飾リジンを含み、そしてこのマトリックスは、シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）を含む。種々の実施形態では、目的の１つ以上のアミン含有化合物は、１つ以上のアルギニン、異性体またはアルギニン、翻訳後修飾アルギニンおよびそれらの組み合わせを含み、このマトリックスは、ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）を含む。
【００１９】
種々の局面では、１つ以上のサンプル中の目的のアミン含有化合物の存在を決定するように設計されたアッセイが提供される。このアッセイは、例えば、薬物開発または診断アッセイのために、種々の生化学的経路の開発を補助するために用いられるバイオマーカー・バリデーション・アッセイであってもよい。このアッセイは、例えば、疾患もしくは状態の診断、疾患もしくは状態の予後予測、またはその両方であり得る。
【００２０】
種々の局面では、本発明の教示は、コンピューター読み取り可能な媒体、例えば、限定はしないが、フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスク、光ディスク、磁気テープ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＣＤ−ＲＯＭまたはＤＶＤ−ＲＯＭ上でコンピューター読み取り可能な指示として本発明の教示の方法の機能が組み込まれる、製造業者の品目を提供する。
【００２１】
教示の前述および他の局面、実施形態および特徴は、添付の図面と組み合わせて以下の説明からより完全に理解され得る。この図面では、同様の参照文字は一般に、種々の図面全体を通じて同様の特徴および構造的要素を指す。図面は、必ずしも尺度はないが、本教示の原理を図示する際に代わりに強調される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】１つ以上のサンプル中で１つ以上のアミン含有化合物を分析する方法の種々の実施形態の模式図である。
【図２】アイソバリックタグの種々の実施形態を模式的に図示する。
【図３】複数のサンプルタイプを用いる種々の実施形態の模式図である。
【図４Ａ】ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬を用いる、アイソバリックに標識する工程の種々の実施形態を図示する。
【図４Ｂ】ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬を用いる、アイソバリックに標識する工程の種々の実施形態を図示する。
【図５】合わせたサンプル中で標準化合物を用いる種々の実施形態の模式図である。
【図６Ａ】未標識のプトレシン（ｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅ）およびｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬で標識されたプトレシンの構造を模式的に示す。
【図６Ｂ】ＰＤＩＴＭの前後のアイソバリックに標識されたプトレセン（ｐｕｔｒｅｓｃｅｎｅ）の質量スペクトルを示す。
【図６Ｃ】ＰＤＩＴＭの前後のアイソバリックに標識されたプトレセン（ｐｕｔｒｅｓｃｅｎｅ）の質量スペクトルを示す。
【図７Ａ】未標識のカドベリンおよびｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬で標識されたカドベリンの構造を模式的に示す。
【図７Ｂ】ＰＤＩＴＭの前後のアイソバリックに標識されたカドベリンの質量スペクトルを示す。
【図７Ｃ】ＰＤＩＴＭの前後のアイソバリックに標識されたカドベリンの質量スペクトルを示す。
【図８Ａ】未標識の１，７−ジアミノヘプタンおよびｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬で標識された１，７−ジアミノヘプタンの構造を模式的に示す。
【図８Ｂ】ＰＤＩＴＭの前後のアイソバリックに標識された１，７−ジアミノヘプタンの質量スペクトルを示す。
【図８Ｃ】ＰＤＩＴＭの前後のアイソバリックに標識された１，７−ジアミノヘプタンの質量スペクトルを示す。
【図９Ａ】未標識のスペルミジンおよびｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬で標識されたスペルミジンの構造を模式的に示す。
【図９Ｂ】ＰＤＩＴＭの前後のアイソバリックに標識されたスペルミジンの質量スペクトルを示す。
【図９Ｃ】ＰＤＩＴＭの前後のアイソバリックに標識されたスペルミジンの質量スペクトルを示す。
【図９Ｄ】ＰＤＩＴＭの前後のアイソバリックに標識されたスペルミジンの質量スペクトルを示す。
【図１０Ａ】未標識のスペルミンおよびｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬で標識されたスペルミンの構造を模式的に示す。
【図１０Ｂ】ＰＤＩＴＭの前後のアイソバリックに標識されたスペルミンの質量スペクトルを示す。
【図１０Ｃ】ＰＤＩＴＭの前後のアイソバリックに標識されたスペルミンの質量スペクトルを示す。
【図１０Ｄ】ＰＤＩＴＭの前後のアイソバリックに標識されたスペルミンの質量スペクトルを示す。
【図１１】１セットのアイソバリックタグ由来の種々のアイソバリックタグで各々標識された各ポリアミンの混合物の液体クロマトグラフィーを模式的に示す。
【図１２】図１２Ａは、ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬で標識されたプトレセン（ｐｕｔｒｅｓｃｅｎｅ）のクロマトグラムを模式的に示す。図１２Ｂは、ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬で標識されたカドベリンのクロマトグラムを模式的に示す。図１２Ｃは、ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬で標識された１，７−ジアミノヘプタンのクロマトグラムを模式的に示す。
【図１３】１セットのアイソバリックタグ由来の種々のアイソバリックタグで各々標識されたポリアミンの混合物のクロマトグラムを模式的に示す。
【図１４】ＡＣＮおよびＨＣＣＡを含むマトリックスのサンプルの直交ＭＡＬＤＩ（Ｏ−ＭＡＬＤＩ）バックグラウンド質量スペクトルを示す。
【図１５】ＡＣＮおよびＨＣＣＡのマトリックスにおける実施例４の４つのポリアミンのＯ−ＭＡＬＤＩ質量スペクトルを示す。
【図１６Ａ】未標識のプトレセン（ｐｕｔｒｅｓｃｅｎｅ）およびｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬で標識されたプトレセンの構造を模式的に示す。
【図１６Ｂ】ＰＤＩＴＭの後のアイソバリックに標識されたプトレセンのＯ−ＭＡＬＤＩ質量スペクトルを示す。
【図１７Ａ】未標識のカドベリンおよびｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬で標識されたカドベリンの構造を模式的に示す。
【図１７Ｂ】ＰＤＩＴＭの後のアイソバリックに標識されたカドベリンのＯ−ＭＡＬＤＩ質量スペクトルを示す。
【図１８Ａ】未標識の１，７−ジアミノヘプタンおよびｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬で標識された１，７−ジアミノヘプタンの構造を模式的に示す。
【図１８Ｂ】ＰＤＩＴＭの後のアイソバリックに標識された１，７−ジアミノヘプタンのＯ−ＭＡＬＤＩ質量スペクトルを示す。
【図１９Ａ】未標識のスペルミジンおよびｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬で標識されたスペルミジンの構造を模式的に示す。
【図１９Ｂ】ＰＤＩＴＭの後のアイソバリックに標識されたスペルミジンのＯ−ＭＡＬＤＩ質量スペクトルを示す。
【図２０Ａ】未標識のスペルミンおよびｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬で標識されたスペルミンの構造を模式的に示す。
【図２０Ｂ】ＰＤＩＴＭの後のアイソバリックに標識されたスペルミンのＯ−ＭＡＬＤＩ質量スペクトルを示す。
【図２１Ａ】未標識のスペルミンおよびｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬で標識されたスペルミンの構造を模式的に示す。
【図２１Ｂ】ＰＤＩＴＭの後のＯ−ＭＡＬＤＩ質量スペクトルを示す。
【図２１Ｃ】ＰＤＩＴＭの後のＯ−ＭＡＬＤＩ質量スペクトルを示す。
【図２２Ａ】未標識のスペルミンおよびｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬で標識されたスペルミンの構造を模式的に示す。
【図２２Ｂ】ＰＤＩＴＭの後のアイソバリックに標識されたスペルミンのＯ−ＭＡＬＤＩ質量スペクトルを示す。
【図２３】図２３は標識アミノ酸の混合物のクロマトグラムを模式的に示す。
【図２４】図２４は実施例５の標識されたアミノ酸の混合物のサンプルの総イオン電流（ＴＩＣ）クロマトグラムを模式的に示す。
【図２５Ａ】実施例５で測定した種々のアミノ酸のＰＤＩＴＭスペクトルを模式的に示す。
【図２５Ｂ】実施例５で測定した種々のアミノ酸のＰＤＩＴＭスペクトルを模式的に示す。
【図２５Ｃ】実施例５で測定した種々のアミノ酸のＰＤＩＴＭスペクトルを模式的に示す。
【図２５Ｄ】実施例５で測定した種々のアミノ酸のＰＤＩＴＭスペクトルを模式的に示す。
【図２５Ｅ】実施例５で測定した種々のアミノ酸のＰＤＩＴＭスペクトルを模式的に示す。
【図２５Ｆ】実施例５で測定した種々のアミノ酸のＰＤＩＴＭスペクトルを模式的に示す。
【図２５Ｇ】実施例５で測定した種々のアミノ酸のＰＤＩＴＭスペクトルを模式的に示す。
【図２５Ｈ】実施例５で測定した種々のアミノ酸のＰＤＩＴＭスペクトルを模式的に示す。
【図２５Ｉ】実施例５で測定した種々のアミノ酸のＰＤＩＴＭスペクトルを模式的に示す。
【図２５Ｊ】実施例５で測定した種々のアミノ酸のＰＤＩＴＭスペクトルを模式的に示す。
【図２５Ｋ】実施例５で測定した種々のアミノ酸のＰＤＩＴＭスペクトルを模式的に示す。
【図２５Ｌ】実施例５で測定した種々のアミノ酸のＰＤＩＴＭスペクトルを模式的に示す。
【図２５Ｍ】実施例５で測定した種々のアミノ酸のＰＤＩＴＭスペクトルを模式的に示す。
【図２５Ｎ】実施例５で測定した種々のアミノ酸のＰＤＩＴＭスペクトルを模式的に示す。
【図２５Ｏ】実施例５で測定した種々のアミノ酸のＰＤＩＴＭスペクトルを模式的に示す。
【図２５Ｐ】実施例５で測定した種々のアミノ酸のＰＤＩＴＭスペクトルを模式的に示す。
【図２５Ｑ】実施例５で測定した種々のアミノ酸のＰＤＩＴＭスペクトルを模式的に示す。
【図２５Ｒ】実施例５で測定した種々のアミノ酸のＰＤＩＴＭスペクトルを模式的に示す。
【図２５Ｓ】実施例５で測定した種々のアミノ酸のＰＤＩＴＭスペクトルを模式的に示す。
【図２５Ｔ】実施例５で測定した種々のアミノ酸のＰＤＩＴＭスペクトルを模式的に示す。
【図２５Ｕ】実施例５で測定した種々のアミノ酸のＰＤＩＴＭスペクトルを模式的に示す。
【図２６】図２６Ａは、理論および種々の他の測定システムに対して、実施例５の測定されたアミノ酸濃度を比較するデータを示す。図２６Ｂは、理論および種々の他の測定システムに対して、実施例５の測定されたアミノ酸濃度を比較するデータを示す。
【図２７Ａ】アミノ酸濃度の決定のための本発明の教示の種々の実施形態のダイナミック・レンジおよび応答に対するデータを示す。
【図２７Ｂ】アミノ酸濃度の決定のための本発明の教示の種々の実施形態のダイナミック・レンジおよび応答に対するデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
種々の実施形態の説明
種々の局面では、本発明の教示は、アイソバリック標識および親・娘イオン遷移モニタリング（ＰＤＩＴＭ）を用いて１つ以上のサンプル中で１つ以上のアミン含有化合物を分析するための方法を提供する。種々の実施形態では、本発明の教示は、１つ以上のアミン含有化合物の濃度を決定するための方法を提供する。例えば、図１を参照すれば、種々の実施形態では、ある方法は、１セットのアイソバリックタグ由来の異なるアイソバリックタグで１つ以上のアミン含有化合物を各々標識する工程（工程１１０）であって、アイソバリックタグのセット由来の各々のアイソバリックタグが、レポーターイオン部分を含む工程と；このアイソバリックに標識されたアミン含有化合物の各々の少なくとも一部を合わせて、合わされたサンプルを生成する工程（工程１２０）と、この合わせたサンプルの少なくとも一部を親・娘イオン遷移モニタリングに対して供する工程（ここでこの伝送親イオンｍ／ｚ範囲はこのアイソバリックに標識されたアミン含有化合物のｍ／ｚ値を含み、かつこの伝送娘イオンｍ／ｚ範囲がこのアイソバリックに標識されたアミン含有化合物のアイソバリックタグに対応するレポーターイオンのｍ／ｚ値を含む）と、この伝送レポーターイオンの１つ以上のイオンシグナルを測定する工程（工程１３０）と；次いで、標準化合物の１つ以上の測定されたイオンシグナルに対する対応するレポーターイオンの測定されたイオンシグナルの比較に少なくとも基づいた、アイソバリックに標識されたアミン含有化合物の１つ以上の濃度を決定する工程（工程１４０)と、を包含する。このイオンシグナルは、例えば、イオンピーク、イオンピークの領域、またはそれらの組み合わせの強度（平均、平均値、最大値など）に基づいてもよい。
【００２４】
種々の実施形態では、ＰＤＩＴＭは、第一の質量分離器、ならびにイオン分裂器および第二の質量分離器を備える質量分析システムで行われてもよい。ＰＤＩＴＭスキャンの伝送親イオンｍ／ｚ範囲（第一の質量分離器によって選択される）は、アイソバリックに標識されたアミン含有化合物の１つ以上のｍ／ｚ値を含むように選択し、ＰＤＩＴＭスキャンの伝送娘イオンｍ／ｚ範囲（第二の質量分離器によって選択される）は、伝送アミン含有化合物に対応するレポーターイオンの１つ以上のｍ／ｚ値を含むように選択する。
【００２５】
種々の実施形態では、１つ以上のアミン含有サンプルを、例えば、１つの実験的測定の中で以下が可能となるように１セットのアイソバリックタグから選択された１つ以上のアイソバリックタグで標識する：（ｉ）異なるサンプル（例えば、コントロール、処理サンプル）からの複数のアミン含有化合物が比較され得る；（ｉｉ）複数の濃度測定が、同じサンプル由来の同じアミン含有化合物で決定され得る；（ｉｉｉ）ガン組織の種々の単離物が、正常な組織に対して評価され得る；（ｉｖ）抗生物質の混入した食物または飲料を、抗生物質の混入していない食物または飲料に対して評価し得る；（ｖ）食物または飲料の種々のサンプルの間の香味の傾向を比較し得る；（ｖｉ）ファーメンテーションの進行がモニタリングされ得る。
【００２６】
再度図１を参照すれば、種々の実施形態では、上記の合わせたサンプルの少なくとも一部をＰＤＩＴＭに対して供する工程は、この合わせたサンプルを、例えば、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）イオン源を用いるこの合わせたサンプルの適切な溶液中に導入、この合わせたサンプルと適切なマトリックスとを混合すること、および適切なマトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）イオン源を用いてサンプルを導入することによって、質量分析システム中に直接導入する工程（ワークフロー経路１２１および工程１３０）を包含する。
【００２７】
再度図１を参照すれば、種々の実施形態では、上記の合わせたサンプルの少なくとも一部をＰＤＩＴＭに対して供する工程は、この合わせたサンプルの一部を、クロマトグラフィーカラム（例えば、ＬＣカラム、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）カラム、またはその組み合わせ）にロードする工程（ワークフロー経路１２２および工程１２５）と、このクロマトグラフィーカラムからの溶離液の少なくとも一部を親・娘イオン遷移モニタリングに対して供する工程と、１つ以上の伝送レポーターイオンのイオンシグナルを測定する工程（ワークフロー経路１２３および工程１３０）と、を包含する。
【００２８】
種々の実施形態では、この合わせたサンプルを、浄化して（例えば、干渉サンプル、緩衝液アーチファクトなどを例えば除去する；高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣ、交換分画、陽イオン交換、高分解能陽イオン交換など、およびそれらの組み合わせによって）、その後に、これを用いてレポーターイオンシグナルを測定する。
【００２９】
種々の実施形態では、アミン含有化合物の濃度は、対応するアミン含有化合物−レポーターイオン遷移の測定されたイオンシグナル（アミン含有化合物−レポーターイオン遷移シグナル）を以下のうちの１つ以上に対して比較することによって決定される：
（ｉ）標準化合物−レポーターイオン遷移についての濃度曲線；および
（ｉｉ）アミン含有化合物を含む合わせたサンプル中の標準化合物についての標準化合物−レポーターイオン遷移シグナル。
【００３０】
再度図１を参照すれば、アイソバリックに標識されたアミン含有化合物の１つ以上の濃度を決定するという工程（工程１４０）で用いられる標準化合物の１つ以上の測定されたイオンシグナルを、多くの方法で提供してもよい。種々の実施形態では、１つ以上の標準化合物を、アイソバリックタグのセット由来のアイソバリックタグで標識し、１つ以上のアイソバリックに標識された標準化合物の１つ以上の少なくとも一部を、アイソバリックに標識されたアミン含有化合物の各々の少なくとも一部と合わせて、合わせたサンプルを生成する（工程１５０）；続いて、この合わせたサンプルの少なくとも一部をＰＤＩＴＭに供し、伝送レポーターイオンのうちの１つ以上のイオンシグナルを測定する（工程１３０）。
【００３１】
次いで、この合わせたサンプル中のアイソバリックに標識された標準化合物のうち１つ以上のうちの１つ以上に対応するレポーターイオンの１つ以上の測定されたイオンシグナルを、アイソバリックに標識されたアミン含有化合物のうちの１つ以上の濃度を決定するのに用いてもよい。従って、種々の実施形態では、アイソバリックに標識されたアミン含有化合物の濃度を決定する工程は、この合わせたサンプル中のアイソバリックに標識された標準化合物の１つ以上のうちの１つ以上に対応する１つ以上のレポーターイオンの測定されたイオンシグナルに対する、対応するレポーターイオンの測定されたイオンシグナルの比較（工程１４０）に少なくとも基づいている。この合わせたサンプルの少なくとも一部をＰＤＩＴＭに対して供する工程は、例えば、質量分析システムへの直接導入（ワークフロー経路１５２および工程１３０）；この合わせたサンプルの少なくとも一部をクロマトグラフィーカラムへ最初にロードする工程（ワークフロー経路１５３および工程１２５）、続いてクロマトグラフィーカラムからの溶離液の少なくとも一部をＰＤＩＴＭに対して供する工程と、１つ以上の伝送レポーターイオンのイオンシグナルを測定する工程（ワークフロー経路１２３および工程１３０）；またはそれらの組み合わせを包含し得る。
【００３２】
種々の実施形態では、アイソバリックに標識されたアミン含有化合物の１つ以上の濃度を決定する工程（工程１４０）は、１つ以上の標準化合物の１つ以上の濃度曲線に対応する１つ以上のレポーターイオンの測定されたイオンシグナルに対する、対応するレポーターイオンの測定されたイオンシグナルの比較に少なくとも基づく。種々の実施形態では、第一の濃度を有する標準化合物が提供され（工程１６０）、アイソバリックタグのセット由来のアイソバリックタグで標識される（工程１７０）。アイソバリックに標識された標準化合物の少なくとも一部を、親・娘イオン遷移モニタリング（ここで伝送親イオンｍ／ｚ範囲は、アイソバリックに標識された標準化合物のｍ／ｚ値を含み、伝送娘イオンｍ／ｚ範囲は、アイソバリックに標識された標準化合物のアイソバリックタグに対応するレポーターイオンのｍ／ｚ値を含む）に供し、レポーターイオンのイオンシグナルが測定される（工程１８０）。標識の工程（工程１７０）およびＰＤＩＴＭの工程および伝送レポーターイオンのイオンシグナルを測定する工程（工程１８０）を、第一の濃度とは異なる少なくとも一つ以上の標準化合物濃度について繰り返して、標準化合物についての濃度曲線を作成する（工程１９０）。
【００３３】
アイソバリックに標識された標準化合物の少なくとも一部をＰＤＩＴＭに対して供する工程は、例えば、質量分析システムへの直接導入（ワークフロー経路１７１および工程１８０）（例えば、ＥＳＩイオン源を用いる適切な溶液中への合わせたサンプルの導入、この合わせたサンプルと適切なマトリックスと混合すること、および適切なＭＡＬＤＩイオン源を用いてサンプルを導入することによる）と；この合わせたサンプルの少なくとも一部をクロマトグラフィーカラムに最初にロードする工程（ワークフロー経路１７２および工程１７５）、続いてクロマトグラフィーカラムからの溶離液の少なくとも一部をＰＤＩＴＭに対して供する工程と、１つ以上の伝送レポーターイオンのイオンシグナルを測定する工程（ワークフロー経路１７３および工程１８０）；またはそれらの組み合わせを包含する。
【００３４】
種々の実施形態では、標準化合物に対するＰＤＩＴＭを、第一の質量分離器、およびイオン分裂器および第二の質量分離器を備える質量分析系で行ってもよい。ＰＤＩＴＭスキャンの伝送親イオンｍ／ｚ範囲（第一質量分離器によって選択される）を、アイソバリックに標識された標準化合物の１つ以上のｍ／ｚ値を含むように選択し、ＰＤＩＴＭスキャンの伝送娘イオンｍ／ｚ範囲（第二質量分離器によって選択される）を、伝送標準化合物に対応するレポーターイオンの１つ以上のｍ／ｚ値を含むように選択する。
【００３５】
種々の実施形態では、濃度曲線の作成には、例えば、濃度決定を促進し、注射容積における相違を説明するためなどのために、標準化合物の少なくとも一部に含まれる１つ以上の内部標準を用いてもよい。
【００３６】
種々の実施形態では、濃度曲線は、対応する標準化合物と関連するレポーターイオンのイオンシグナルを測定するためにＰＤＩＴＭを用いること、および濃度ゼロがレポーターイオンシグナルゼロに対応するような、測定された濃度の線形外挿法によって濃度曲線を作成することによって生成され得る。種々の実施形態では、濃度曲線は、ＰＤＩＴＭを用いて２つ以上の既知の濃度で対応する標準化合物と関連するレポーターイオンのイオンシグナルを測定すること、および測定されたレポーターイオンシグナルに対して関数をフィッティングさせることにより濃度曲線を作成することによって、作成してもよい。適切なフィッティング関数は、例えば、検出器の応答（例えば、検出器飽和、非線形性）に依存し得る。種々の実施形態では、このフィッティング関数は一次関数である。
【００３７】
種々の実施形態では、１つ以上のアイソバリックに標識されたアミン含有化合物の濃度を決定する工程（工程１４０）は、以下の両方に少なくとも基づく：（ｉ）１つ以上の標準化合物の１つ以上の濃度曲線に対応する１つ以上のレポーターイオンの測定されたイオンシグナルに対する、対応するレポーターイオンの測定されたイオンシグナルの比較；および（ｉｉ）アイソバリックに標識されたアミン含有化合物と合わされた１つ以上のアイソバリックに標識された標準化合物に対応する１つ以上のレポーターイオンの測定されたイオンシグナルに対する、対応するレポーターイオンの測定されたイオンシグナルの比較。種々の実施形態では、第一の濃度を有する標準化合物が提供され（工程１６０）、１つ以上のアミン含有化合物（例えば、工程１２０の）を標識するために用いられる、アイソバリックタグのセット由来のアイソバリックタグで標識される（工程１７０）。アイソバリックに標識された標準化合物の一部を、アイソバリックに標識されたアミン含有化合物の各々の少なくとも一部と合わせて、合わせたサンプルを生成し（ワークフローパス１７６および工程１５０）、次いで、この合わせたサンプルを本明細書に記載のとおりさらに分析してもよい。種々の実施形態では、合わせたサンプルを生成するために用いられる同じアイソバリックに標識された標準化合物の一部はまた、本明細書に記載のような濃度曲線を作成するのに用いられる。
【００３８】
レポーターイオンシグナルを測定するために用いられる同じ標準化合物部分、または別の部分を用いて、質量分析器について親・娘イオン遷移モニタリング条件を決定してもよい。例えば、質量分析システムが液体クロマトグラフィー（ＬＣ）構成要素を備える場合、標準化合物を用いてクロマトグラフィー保持時間を決定してもよい。種々の実施形態では、標準化合物を用いて、アミン含有化合物についてイオン源中でそのイオン化効率を、および種々の条件下においてイオン分裂器で分裂効率を決定してもよい。
【００３９】
アミン含有化合物
本発明の教示の方法は、限定はしないが、アミノ酸、カテコールアミン、ニトロフラン代謝物、ポリアミン、ペプチド、タンパク質、ポリペプチドおよびそれらの組み合わせを含む広範な種々の一級および二級アミン含有化合物に適用され得る。
【００４０】
種々の実施形態では、目的のアミン含有化合物は、アミノ酸を含む。アミノ酸の例としては限定はしないが、ロイシン、プロリン、アラニン、バリン、グリシン、セリン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、イソロイシン、トレオニン、システイン、チロシン、ヒスチジン、リジン、アルギニンおよびその異性体、ならびにその翻訳後修飾アミノ酸が挙げられる。例えば、種々の実施形態では、アミン含有化合物としては、例えば、チロキシンのようなアミノ酸誘導体が挙げられる。チロキシンは、チロシンの誘導体であって、疾患をモニターするために用いられ得る重要なクラスの化合物を含む。チロキシンの例としては限定はしないが、チロキシン（Ｔ４）、トリヨードサイロニン（Ｔ３）および「リバースＴ３」が挙げられる。
【００４１】
【化１】
種々の実施形態では、目的のアミン含有化合物は、１つ以上のカテコールアミンを含む。カテコールアミンの例としては限定はしないが、エピネフリン、ノルエピネフリン、ドーパミン、およびそれらの組み合わせが挙げられる。種々の実施形態では、目的のアミン含有化合物は、ポリアミンを含む。ポリアミンの例としては、限定はしないが、スペルミン、Ｎ−アセチルスペルミン、スペルミジン、Ｎ−アセチルスペルミジン、プトレシン（１，４−ジアミノブタン）、２−ヒドロキシプトレシン、カドベリン（１，５−ジアミノペンタン）、１，６−ジアミノヘキサン、１，７−ジアミノヘプタン、１，１０−ジアミノドデカン、およびそれらの組み合わせが挙げられる。種々の実施形態では、目的のアミノ含有化合物は、タンパク質またはポリペプチドを含む。タンパク質およびポリペプチドの例としては限定はしないが、チトクロムＰ４５０イソ型、アンギオテンシン、ならびに乳漿タンパク質および乳タンパク質、例えば、βラクトグロブリンが挙げられる。
チトクロムＰ４５０イソ型の例としては限定はしないが、Ｃｙｐｌａ２、Ｃｙｐ１ｂ１、Ｃｙｐ２ａ４、Ｃｙｐ２ａ１２、Ｃｙｐ２ｂ１０、Ｃｙｐ２ｃ２９、Ｃｙｐ２ｃ３７、Ｃｙｐ２ｃ３９、Ｃｙｐ２ｃ４０、Ｃｙｐ２ｄ９、Ｃｙｐ２ｄ２２、Ｃｙｐ２ｄ２６、Ｃｙｐ２ｊ５、Ｃｙｐ２ｅｌ、Ｃｙｐ３ａ１１、Ｃｙｐ４ａ１０、Ｃｙｐ４ａ１４、およびそれらの組み合わせが挙げられる。種々の実施形態では、目的のアミン含有化合物は、ニトロフラン代謝物を含む。ニトロフラン代謝物の例としては限定はしないが、３−アミノ−２−オキサゾリジノン（ＡＯＺ）、５−モルホリノメチル−３−アミノ−オキサゾリジノン（ＡＭＯＺ）、セミカルバジド（ＳＥＭ）、１−アミノヒダントイン（ＡＨＤ）およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【００４２】
【化２】
本発明の教示の種々の実施形態が適用され得るアミン含有化合物は、広範な種々の供給源タイプ、例えば、生理学的な流体サンプル、細胞もしくは組織溶解液サンプル、合成ペプチドサンプル、ポリペプチドサンプル、タンパク質サンプル、細胞培養サンプル、ファーメンテーションブロス培地サンプル、農産物サンプル、畜産品サンプル、動物食餌サンプル、ヒト消費のための食品もしくは飲料のサンプル、およびそれらの組み合わせに由来し得る。このサンプルは、種々の供給源、状態またはその両方に由来し得る；例えば、コントロール対実験、異なる時点由来のサンプル（例えば、配列を形成するため）、疾患対正常、実験対疾患（混入対非混入など）。生理学的液体の例としては、限定はしないが、血液、血清、血漿、汗、涙、尿、腹水、リンパ液、膣分泌物、精液、脊髄液、腹水、唾液、喀痰、乳房浸出液およびそれらの組み合わせが挙げられる。ヒト消費のための食物または飲料の例としては限定はしないが、ワイン、ハチミツ、ショウユ、家禽、ブタ肉、牛肉、魚、甲殻類およびそれらの組み合わせが挙げられる。種々の実施形態では、目的のアミン含有化合物は、アミノ酸であって、アミノ酸の供給源は、タンパク質を含み、これは、例えば、加水分解、消化されて、アミノ酸を生成する。種々の実施形態では、目的のアミン含有化合物は合成ペプチドである。
【００４３】
標準化合物
広範な種々の化合物を標準化合物として用いてもよい。種々の実施形態では、標準化合物は、目的のアミン含有化合物のうち１つを含む。種々の実施形態では、標準化合物は、１つ以上のコントロールサンプル、既知濃度のサンプル、またはそれらの組み合わせ由来である。種々の実施形態では、標準化合物は、分析物中で目的の各々のアミン含有化合物について提供される。
【００４４】
種々の実施形態では、標準化合物の濃度曲線は、２つ以上の公知の濃度で標準化合物と会合されたレポーターイオンのイオンシグナルを測定するように、ＰＤＩＴＭを用いて作成され得る。
【００４５】
アイソバリックタグ
種々の実施形態では、アイソバリックタグは、一般式（Ｉ）：
Ｒ−Ｌ−ＡＲＧ（Ｉ）
によって示され得、ここでＲは、切断可能なリンカー基（Ｌ）を通じてアミン反応性基（ＡＲＧ）に共有結合されたレポーター基（Ｒ）であって、このリンカー基は、Ｒ＋Ｌの質量がアイソバリックタグのセットの各々のアイソバリックタグについてと実質的に同じになるような重量を有するバランス基を含む。例えば、種々の実施形態では、リンカー基Lは、一般式（ＩＩ）：
Ｘ−Ｂ−Ｙ（ＩＩ）
によって示され得、ここでＸは、バランス基とレポーター基との間の結合に相当し、この結合Ｘは、中性ガスでの標識された分析物の衝突の際に壊れ（例えば、衝突誘発性の解離を介する）、Ｙは、分析物反応性基が分析物と反応されてこの分析物を標識するとき、バランス基と分析物との間の結合であって、Ｂは、バランス基である。分析物は、その分析物と式（Ｉ）の試薬、その塩、および／またはその水和物との反応によって標識されてもよい。
【００４６】
アミン反応性基
アミン反応性基の例としては、アミン官能性基と選択的に反応して、特定の部位でのアミン含有化合物との共有結合または非共有結合を形成する基が挙げられるがこれらに限定されない。このアミン反応性基は、事前に存在してもよいし、またはインサイチュで調製されてもよい。アミン反応性基のインサイチュ調製は、分析物の非存在下で進行されてもよく、または分析物の存在下で進行されてもよい。例えば、カルボン酸基は、水溶性カルボジイミド（例えば、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩；ＥＤＣ）を用いてインサイチュで修飾されて、これによってアルキルまたはアリールアミン基のような求核試薬と反応され得る求電子基が調製されてもよい。種々の実施形態では、ＥＤＣを用いた標識試薬のカルボン酸基の活性化は、分析物を含むアミン（求核試薬）の存在下で行われてもよい。種々の実施形態では、アミン（求核試薬）含有分析物はまた、ＥＤＣが行われる最初の反応後に添加されてもよい。種々の実施形態では、この反応基は、保護基のインサイチュの除去によってインサイチュで生成され得る。結果として、求核試薬および／または求電子基の反応による分析物の誘導体化をもたらし得る、任意の既存のまたは新規に作成された試薬（単数または複数）が考慮される。
【００４７】
種々の実施形態では、適切なアミン反応性基は、活性エステルを含む。活性なエステルは、ペプチド合成において周知であって、ペプチド合成において通常用いられる条件下でアミノ酸のＮ−αアミンと容易に反応する特定のエステルをいう。アミン反応性活性エステルは、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ）、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル（Ｐｆｐ）、２−ニトロフェニルエステル、４−ニトロフェニルエステル、２，４−ジニトロフェニルエステル、または２，４−ジハロフェニルエステルであってもよい。種々の実施形態では、アミン反応性基は、混合無水物であってもよい。なぜなら混合無水物は、アミン基と効率的に反応し、それによってアミド結合を生成し得るからである。
【００４８】
レポーター基
本発明の教示の種々の実施形態で用いられるアイソバリックタグ（単数または複数）のレポーター基は、決定され得る固有の質量（または質量対電荷比）を有する基であってもよい。例えば、各々のレポーターのセットは、固有の総重量を有してもよい。異なるレポーターは、その固有の質量を達成するために１つ以上の重原子同位体を含んでもよい。例えば、同位体の炭素（１２Ｃ、１３Ｃ、および１４Ｃ）、窒素（１４Ｎおよび１５Ｎ）、酸素（１６Ｏおよび１８Ｏ）または水素（水素、重水素および三重水素）が存在し、レポーター部分の多様な基の調製で用いられ得る。適切な重原子同位体の例としては限定はしないが、１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏおよび重水素が挙げられる。
【００４９】
固有のレポーターを目的のサンプルと会合させ、それによって、そのサンプルの１つまたは複数の分析物をこのレポーターで標識してもよい。この方式では、例えば、このレポーターについての情報は、このサンプルの分析物の１つまたは全てについての情報と関連され得る。しかし、このレポーターが決定される場合、このレポーターは分析物と物理的に連結される必要はない。そうではなく、レポーターの固有の総重量は、標識された分析物のイオンがフラグメント化され、それによって娘フラグメントイオンおよび検出可能なレポーターが生成された後、例えば、タンデム質量分析器の第二の質量分析で決定されてもよい。この決定されたレポーターは、決定された分析物が由来するサンプルを特定するために用いられ得る。さらに、他のレポーターまたは較正標準（例えば、特定のレポーターで標識された分析物）のいずれかの量に対する、固有のレポーターの量を用いて、サンプルまたはサンプル中の分析物の相対量または絶対量（しばしば、濃度および／または量として表現される）を決定してもよい。従って、特定のサンプル中の１つ以上の分析物の量のような情報を、各々の特定のサンプルを標識するために用いられるレポーター部分と関連させてもよい。分析物（単数または複数）の同一性がまた決定される場合、その情報を、種々のレポーターに関与する情報と関連させ、それによってサンプルの１つまたは複数における各々の標識された分析物の同一性および量の決定を促進してもよい。
【００５０】
このレポーターは、固定の電荷を含んでもよく、またはイオン化されてもよい。レポーターが固定電荷を含んでもよく、またはイオン化されてもよいので、標識試薬は、単離されてもよく、反応性の分析物を塩（または塩の混合物）または双性イオンの形態で標識するために用いられてもよい。レポーターのイオン化によって、質量分析計におけるその決定が容易になる。従って、レポーターは、時には識別イオン（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｉｏｎ）と呼ばれるイオンとして決定され得る。イオン化される場合、レポーターは、１つ以上の正味の正または負の家電を含み得る。従って、レポーターは、１つ以上の酸性基または塩基性基を含んでもよい。なぜなら、このような基は、質量分析計で容易にイオン化され得るからである。例えば、レポーターは、１つ以上の塩基性窒素原子（正の電荷）または１つ以上のイオン化可能な酸性基、例えばカルボン酸基、スルホン酸基、またはリン酸基（負の電荷）を含んでもよい。塩基性窒素を含むレポーターの非限定的な例としては、置換または非置換のモルホリン、ピペリジンまたはピペラジンが挙げられる。
【００５１】
レポーターは、置換または非置換の酢酸部分（ここにＮ−アルキル酢酸部分のカルボニル炭素を通じて分析物が連結される）とＮ−アルキル化された環窒素原子を含む５員、６員または７員の複素環であってもよく、ここで各々の異なる標識が１つ以上の重原子同位体を含む。この複素環は、置換されても非置換であってもよい。この複素環は、脂肪族であっても芳香族であってもよい。複素環部分の可能な置換基としてはアルキル、アルコキシおよびアリール基が挙げられる。この置換基は、支持体に対する分析物の連結に適切である、保護基または非保護基、例えば、アミン、ヒドロキシルまたはチオール基を含んでもよい。複素環は、さらなるヘテロ原子、例えば、１つ以上の窒素、酸素またはイオウ原子を含んでもよい。
【００５２】
レポーターは、分析物の分析のための代表的な条件下で実質的にサブフラグメントでないように選択され得る。このレポーターは、質量分析計における標識された分析物の選択されたイオンの少なくとも一部の結合ＸおよびＹの両方のフラグメンテーションを生じるように適用された解離エネルギーの条件下で実質的にサブフラグメントでないように選択され得る。「実質的にサブフラグメントでない」とは、本発明者らは、このレポーターのフラグメントは、目的の分析物の首尾よい分析に適用されるとき、バックグラウンドノイズを超えて検出することが困難または不可能であるということを意味する。レポーターの総重量は、決定しようと努める分析物、または分析物の任意の予想フラグメントと比較して異なるように意図的に選択され得る。例えば、タンパク質またはペプチドが分析物である場合、レポーターの総重量は、任意の天然に存在するアミノ酸もしくはペプチド、またはその予想フラグメントの量と比較して異なるように選択され得る。これによって、分析物の決定が容易になり得る。なぜなら、分析物次第で、同じ同時質量（ｃｏｉｎｃｉｄｅｎｔ ｍａｓｓ）を有するサンプルの潜在的な成分がなければ、任意の分析物の結果に信頼が加わり得るからである。
【００５３】
リンカー基
本教示の種々の実施形態で用いられる標識試薬（単数または複数）のリンカーは、分析物との反応が生じたか否かに依存して、分析物に対してレポーターを、または分析物反応基（ＡＲＧ）に対してレポーターを連結させる。このリンカーは、結合ＸおよびＹの両方がフラグメント化される（例えば、結合ＸおよびＹの両方のフラグメンテーションの際に中性の損失を受ける）とき中性種を生成するように選択され得る。このリンカーは、カルボニルまたはチオカルボニル基のように極めて小さくてもよい。このリンカーは、それより大きい部分であってもよい。このリンカーは、ポリマーまたはバイオポリマーであってもよい。このリンカーは、解離性エネルギーレベルに供された場合サブフラグメントになるように設計され得る；これには、リンカーの中性のフラグメントのみを生じるサブフラグメント化が挙げられる。
【００５４】
このリンカー基は、その質量が、混合物の各々の標識された分析物について、またはアイソバリック試薬のセットについてレポーターの間の総重量の相違について補償するように、１つ以上の重原子同位体を含んでもよい。さらに、レポーター／リンカーの組み合わせの総重量（すなわち、全体としてとった総重量）は、混合物の各々の標識された分析物について、または試薬のセットおよび／もしくはキットについて実質的に同じであってもよい。リンカーは、標識試薬におけるレポーターについての質量バランスとして作用し得るので、レポーター／リンカーの組み合わせの総重量は全ての試薬のセットまたはキットについて同じであり、リンカー基はまた、バランス基（Ｂ）を含むと言われる。リンカーのバランス基（Ｂ）における原子の数が多いほど、異なる異性体／アイソバリックな標識試薬のセットおよび／またはキットの可能な数が多くなる。
【００５５】
結合ＸおよびＹ
Ｘは、レポーターの原子とリンカーの原子との間の結合である。Ｙはリンカーの原子といずれかのアミン反応基の原子との間の結合であるか、または標識試薬が分析物と反応させられる場合は分析物である。標識された分析物（例えば、Ｒ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−分析物）の選択されたイオンの少なくとも一部において、十分な解離性エネルギーレベルに供されるとき、結合Ｘが破壊するように、結合Ｘは選択される。種々の実施形態では、標識された分析物（例えば、Ｒ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−分析物）の選択されたイオンの少なくとも一部において、十分な解離性エネルギーレベルに供されるとき、結合Ｙが破壊するように、結合Ｙはまた選択される。結合Ｘ，結合Ｙまたは結合ＸおよびＹの両方が、標識された分析物の選択されたイオンの少なくとも一部で破壊するように、解離性エネルギーレベルは、質量分析計において調節されてもよい。レポーターが分析物から独立して決定され得るように、結合Ｘの破壊によって分析物からレポーターを遊離させる。結合Ｘがすでに破壊されているかいないかに依存して、結合Ｙの破壊は、分析物からレポーター／リンカーの組み合わせを、または分析物からリンカーを遊離させる。種々の実施形態では、結合Ｙは結合Ｘよりも不安定であってもよく、結合Ｘは結合Ｙよりも不安定であってもよく、または結合ＸおよびＹは、実質的に同じ反応不安定性であってもよい。
【００５６】
例えば、目的の分析物がタンパク質またはペプチドである場合、結合ＸおよびＹの相対的な不安定性は、アミド（ペプチド）結合に関して調節され得る。結合Ｘ、結合Ｙまたは結合ＸおよびＹの両方は、代表的なアミド（ペプチド）結合と比較してさらに不安定であっても、等しく不安定であっても、または不安定さが少なくてもよい。例えば、解離性エネルギーの条件下で、結合Ｘおよび／または結合Ｙは、Ｚ−ｐｒｏまたはＺ−ａｓｐ二量体のペプチド結合（ここでＺは、天然のアミノ酸であり、Ｐｒｏはプロリンであり、ａｓｐはアスパラギン酸である）と比較して、破壊（フラグメンテーション）する傾向が少なくてもよい。種々の実施形態では、結合ＸおよびＹは、代表的なアミド結合とほぼ同じレベルの解離性エネルギーで破壊する。
【００５７】
結合ＸおよびＹはまた、結合Ｙの破壊が結合Ｘの破壊を生じる（逆も同様）ように存在してもよい。種々の実施形態では、実体量の分析物またはその娘フラグメントイオンが、第二の質量分析における部分的標識を含まないように、結合ＸおよびＹの両方が、本質的に同時にフラグメント化してもよい。「実体量の分析物（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ａｎａｌｙｔｅ）」とは、約２５％未満、好ましくは約１０％未満、部分的に標識された分析物がＭＳ／ＭＳスペクトルで決定され得るということを本発明者らは意味する。
【００５８】
図２Ａを参照して、アイソバリックタグの模式図を図示する。各々のタグは、各々のタグの名目上の質量が実質的に等しいように、レポーター基１２、アミン反応基２１４、およびバランス基２１８（例えば、レポーター基の間の質量の相違を相殺する）から構成される。
【００５９】
種々の実施形態では、１セットのアイソバリックタグが、アミン誘導体化アミン含有化合物（フラグメンテーションの非存在下では、実質的にはクロマトグラフィーで識別不能であり、かつ実質的には質量分析で識別不能であるが、ＣＩＤ後、強力な低質量のＭＳ／ＭＳの兆候的イオン（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｉｏｎ）を生じる）を含む。
【００６０】
種々の実施形態では、１セットのアイソバリックタグは、一般式（ＩＩＩａ）−（ＩＩＩｄ）によってそれぞれ示される、タグＱ１１４、Ｑ１１５、Ｑ１１６およびＱ１１７を含む：
【００６１】
【化３】
本発明の教示の種々の実施形態での使用に適切なレポーター基、リンカー基、バランス基、アミン反応基、アイソバリックタグおよびアイソバリックタグのセットのさらなる例は、米国特許出願公開第２００４／０２１９６８６号；同第２００４／０２２０４１２号；同第２００５０１４７９８２号；同第２００５／０１４７９８５号；同第２００５／０１４８０８７号；同第２００５／０１４８７７１号；同第２００５／０１４８７７３号；同第２００５／０１４８７７４号および同第２００５／０２０８５５０号（その全ての内容全体が参照によって本明細書に援用される）に見出され得る。
【００６２】
合わせたサンプル
任意の適切な組み合わせの１つ以上のアイソバリックに標識された標準化合物、１つ以上のアイソバリックに標識されたアミン含有化合物、またはその組み合わせを、本発明の教示の方法で用いてもよい。例えば、一般には、合わせたサンプル中の種々のアイソバリックに標識された化合物Ｎの数は、アイソバリックタグのセットにおけるアイソバリックタグの数Ｔ以下である。任意の１つの合わせたサンプルでは、可能な組み合わせのアイソバリックに標識された標準化合物、１つ以上のアイソバリックに標識されたアミン含有化合物は以下：
（Ｓ＋Ｃ）≦Ｔ（１）
のように表現されてもよく、ここでＴは、アイソバリックタグのセットにおけるアイソバリックタグの数に相当し；Ｓは、種々のアイソバリック標識でアイソバリックに標識された標準化合物の数に相当して、０〜Ｔ（包括的）におよび；Ｃは、種々のアイソバリック標識でアイソバリックに標識されたアミン含有化合物の数に相当し、０〜Ｔ（包括的）におよぶ。
【００６３】
例えば、種々の実施形態では、１つ以上のアイソバリック標識された標準化合物（例えば、コントロールサンプル由来、濃度既知のサンプル由来、など）を、目的の１つ以上のアイソバリックに標識されたアミン含有試験化合物と合わせ、この１つ以上のアイソバリックに標識された標準化合物は、１つ以上のレポーターイオンシグナルを提供し、これが例えば、内部濃度標準として機能し得る。種々の実施形態では、アイソバリックに標識された標準化合物の追加は、合わせたサンプル中の目的の１つ以上のアミン含有化合物についての内部標準として機能し得る。種々の実施形態では、種々のアイソバリックに標識された標準化合物が、合わせたサンプル中の目的の各々の異なるアミン含有化合物について付加され（例えば、Ｓ＝Ｃ）、各々の異なるアイソバリックに標識された標準化合物が、例えば、目的の種々のアミン含有化合物についての内部標準として機能する。
【００６４】
種々の実施形態では、この合わせたサンプル中で分析されるべきアミン含有化合物のうち２つ以上が、目的の同じアミン含有化合物を含む。例えば、アミン含有化合物＃１〜＃Ｘ（ここでＸ＞１）は、目的の同じアミン含有化合物を、ただし、例えば、異なるサンプル（異なるアイソバリック標識が異なるサンプル由来のアミン含有化合物について用いられている）から、含んでもよい。例えば、異なるサンプルは、同じ系（例えば、患者、場所など）の異なる時点に由来してもよく、いくつかのプロセス、例えば、疾患、ファーメンテーションなどの進行をモニターするために用いられてもよい。
【００６５】
種々の実施形態では、サンプルを、同じアミン含有化合物について用いられる異なるアイソバリックタグで処理する。例えば、サンプルを三連で処理し、ここでは異なるアイソバリックタグが、３つの部分の各々について用いられており、ここで次いで、合わせたサンプルの少なくとも一部を組み合わせる（これはまた、１つ以上の標準化合物を含み得る）；これによって、この合わせたサンプルの単一の実験分析においてアミン含有化合物の濃度の３つの測定値を得る。三連、または一般には多重の測定は、しばしば、実質的に有意な、および／または正確な結果を得るのに必要である。例えば、伝統的なアプローチを用いるアミノ酸分析結果は、代表的には、これらの伝統的な技術が通常遭遇する泳動間の変動およびバックグラウンドの干渉のせいで、同じサンプルの三連の分析に基づく。本発明の教示に種々の実施形態が、単一の実験的泳動においてアミン含有化合物の濃度の複数の測定をもたらす能力によって、このような泳動間の変動に起因する不正確性を減じることが容易になり得る。
【００６６】
種々の実施形態では、アイソバリックに標識された標準化合物は、合わせたサンプルに添加されず、種々の実施形態では、例えば、目的の１つ以上のアミン含有化合物の濃度は、標準化合物の濃度曲線に対するアミン含有化合物の対応するレポーターイオンシグナルの比較に少なくとももとづいて決定され得る。
【００６７】
種々の実施形態では、合わせたサンプルを浄化し（例えば、干渉するサンプル、干渉アーチファクト、などを除去するため；高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣ、交換分画、陽イオン交換、高解像陽イオン交換など、およびそれらの組み合わせによって）、その後にそれを用いて、レポーターイオンシグナルを測定する。
【００６８】
質量分析器
広範な種々の質量分析システムを本発明の教示で用いてＰＤＩＴＭを行ってもよい。適切な質量分析器システムは、２つの質量分析器の間のイオン飛行経路に配置されたイオン分離器を備える２つの質量分離器を包含する。適切な質量分析器の例としては、限定はしないが、四重極、ＲＦ多重極、イオントラップ、飛行時間（ＴＯＦ）、および時限イオン選別器（ｔｉｍｅｄ ｉｏｎ ｓｅｌｅｃｔｏｒ）と組み合わせたＴＯＦが挙げられる。適切なイオン分離器としては限定はしないが、以下の原理で作動するものが挙げられる：衝突誘起解離（ＣＩＤ（衝突支援解離（ＣＡＤ）とも呼ばれる））、光誘起解離（ＰＩＤ）、表面誘起解離（ＳＩＤ）、ポスト・ソース分解、またはそれらの組み合わせ。
【００６９】
質量分析器のための適切な質量分析シシステムの例としては、限定はしないが、３つ組の四重極、四重極線形イオントラップ（例えば、４０００Ｑ ＴＲＡＰ（登録商標）ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム、Ｑ ＴＲＡＰ（登録商標）ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム）、四重極ＴＯＦ（例えば、ＱＳＴＡＲ（登録商標）ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム）およびＴＯＦ−ＴＯＦのうちの１つ以上を備えるシステムが挙げられる。
【００７０】
質量分析計システムに適切なイオン源としては限定はしないが、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）、および大気圧光イオン化（ＡＰＰＩ）のイオン源が挙げられる。たとえば、ＥＳＩイオン源は、ＬＣカラムに由来するイオン化サンプルを質量分析装置へ導入するための手段として機能し得る。ＥＳＩのいくつかの所望の特徴のうちの１つは、クロマトグラフィーカラム由来の画分が、このカラムからＥＳＩイオン源へ直接進行し得るというということである。
【００７１】
種々の実施形態では、質量分析装置システムは、ＭＡＬＤＩイオン源を備える。種々の実施形態では、合わせたサンプルの少なくとも一部は、ＭＡＬＤＩマトリクス材と混合されて、ＭＡＬＤＩイオン化源を有する質量分析器を用いる親・娘イオン遷移モニタリングに供される。種々の実施形態では、合わせたサンプルの少なくとも一部をクロマトグラフィーカラム上にロードし、この溶離液の少なくとも一部をＭＡＬＤＩマトリクス材と混合して、ＭＡＬＤＩイオン源を備える質量分析器を用いる親・娘イオン遷移モニタリングに供する。ＭＡＬＤＩマトリクス材の例としては限定はしないが、表１に列挙されるものが挙げられる。
【００７２】
【表１】
種々の実施形態では、質量分析器システムは、親イオンを選択するため、およびそのフラグメント娘イオンを検出するためのトリプル四重極質量分析計を備える。種々の実施形態では、第一の四重極は、親イオンを選択する。第二の四重極は、十分に高い圧力および電圧で維持され、その結果複数の低エネルギー衝突が、親イオンのいくつかをフラグメントにさせる。第三の四重極は、選択された娘イオンを検出器に伝送するように選択される。種々の実施形態では、トリプル四重極質量分析計は、イオン源とトリプル四重極との間に位置するイオン・トラップを備え得る。このイオントラップは、イオン（例えば、全てのイオン、特定のｍ／ｚ範囲を有するイオンなど）を衝突させ得、充填時間後、この選択されたイオンを第一の四重極に対して末端電極をパルス化することによって伝送して、この選択されたイオンがイオントラップから出ることを可能にする。所望の充填時間は、例えば、イオンの数、イオントラップ内の電荷密度、種々の兆候的ペプチドの溶出の間の時間、デューティ・サイクル、励起状態の化学種の崩壊率、または多価イオン、またはそれらの組み合わせに基づいて決定され得る。
【００７３】
種々の実施形態では、三重の四重極質量分析計における１つ以上の四重極は、線形イオンとして設定可能であり得る（例えば、四重極内の実質的に細長い円柱状トラップ容積をもたらすための末端電極の付加によって）。種々の実施形態では、第一の四重極は親イオンを選択する。第二の四重極は、十分に高い衝突ガス圧および電圧で維持され、その結果複数の低エネルギー衝突が親イオンのいくつかをフラグメントにさせる。この第三の四重極は、フラグメントイオンをトラップするように、充填時間後、末端電極をパルスして、この選択された娘イオンがイオントラップを出ることを可能にすることによって、選択された娘イオンを検出器に伝送するように選択される。所望の充填時間は、例えば、フラグメントイオンの数、イオントラップ内の電荷密度、種々の兆候的ペプチドの溶出の間の時間、デューティ・サイクル、励起状態の化学種の崩壊率、または多価イオン、またはそれらの組み合わせに基づいて決定され得る。
【００７４】
種々の実施形態では、質量分析計システムは、親イオンを選択するため、およびそのフラグメント娘イオンを検出するために、２つの四重極質量分析計およびＴＯＦ質量分析計を備える。種々の実施形態では、第一の四重極は、親イオンを選択する。第二の四重極は、十分に高い圧力および電圧で維持され、その結果複数の低エネルギー衝突が、このイオンのいくつかをフラグメントにさせ、ＴＯＦ質量分析計は、例えば、質量範囲（目的の娘イオンおよび抽出された作成されたイオンクロマトグラムを包含する）にまたがってイオンをモニタリングすることによって、検出器から離れた選択されたイオンの時間ウインドウの外側に現れるイオンを偏向させることによって、選択された娘イオンの時間ウインドウに達するように検出器を時間ゲートすること、またはそれらの組み合わせによって、検出のための娘イオンを選択する。
【００７５】
種々の実施形態では、質量分析システムは、２つのＴＯＦ質量分析器およびイオン分離器（例えば、ＣＩＤまたはＳＩＤなど）を備える。種々の実施形態では、第一のＴＯＦは、イオン分裂器における導入のために親イオンを選択し（例えば、分裂器から離れて選択された親イオンの時間ウインドウの外側に出現するイオンを偏向させることによって）第二のＴＯＦ質量分析器は、検出のための娘イオンを選択する（例えば、目的の娘イオンおよび作成された抽出されたイオンクロマトグラムを包含する質量範囲にまたがってイオンをモニタリングすることによって、検出器から離れて選択された娘イオンの時間ウインドウの外側に出現するイオンを偏向させることによって、選択された娘イオンの時間ウインドウに達するように検出器を時間ゲートすることによって、またはそれらの組み合わせによって）。ＴＯＦ分析器は線形であってもよくまたは分析器を反映する。
【００７６】
種々の実施形態では、質量分析システムは、飛行時間質量分析計およびイオンレフレクターを備える。このイオンレフレクターは、ＴＯＦのフィールド・フリードリフト領域の末端に位置し、これを用いてイオンの飛行経路を改変することによって初期運動エネルギー分布の効果を補償する。種々の実施形態では、イオンレフレクターは、加速電圧よりもわずかに大きいレベルまで増大させる電位で偏向された一連のリングからなる。作動中、イオンは、レフレクターに浸透するので、それらは、その電場の方向の速度がゼロになるまで減速される。ゼロの速度ポイントで、そのイオンは方向を反転して、レフレクターを通じて加速し戻される。このイオンは、所得エネルギーと同一のエネルギーであって、ただし反対方向の速度でこのレフレクターを出る。より大きいエネルギーを有するイオンは、このレフレクターにさらに深く浸透して、結果としてさらに長時間このレフレクター内に残る。このレフレクターに用いられる電位は、イオンの飛行経路を改変するように選択され、その結果質量および電荷が同様のイオンは、実質的に同じ時間で検出器に達する。
【００７７】
種々の実施形態では、質量分析計システムは、タンデムＭＳ−ＭＳ装置を備え、この装置は、目的の親イオンを選択するための時限イオン選別器を有する第一のフィールドフリードリフト領域と、娘イオンを生じるための分裂チャンバ（またはイオン分裂器）と、検出のために選択された娘イオンを伝送するための質量分離器とを備える。種々の実施形態では、この時限イオン選別器は、パルスイオンデフレクターを備える。種々の実施形態では、このイオンデフレクターは、パルスイオンデフレクターとして用いられてもよい。この質量分離器は、イオンレフレクターを備えてもよい。種々の実施形態では、分裂チャンバは、イオンのフラグメンテーションを生じて、抽出を遅らせるように設計された衝突セルである。種々の実施形態では、この分裂チャンバはまた、飛行時間分光測定によるフラグメントイオンの分析のための遅延抽出イオン源として機能し得る。
【００７８】
種々の実施形態では、質量分析計システムは、タンデムＴＯＦ−ＭＳを備え、これはパスルイオン源によって作成される複数のイオンの経路に沿って配置された第一、第二および第三のＴＯＦ質量分離器を有する。この第一の質量分離器は、パルスイオン源によって発生される複数のイオンを受容するように配置される。この第一の質量分離器は、パルスイオン源によって発生される複数のイオンを加速して、その質量対電荷比に応じてこの複数のイオンを分離して、この複数のイオンからその質量対電荷比に基づいてイオンの第一の群を選択する。この第一の質量分離器はまた、イオンの第一の群の少なくとも一部をフラグメント化させる。この第二の質量分離器は、第一の質量分離器によって発生された第一の群のイオンおよびそのフラグメントを受容するように配置される。この第二の質量分離器は、イオンの第一の群およびそのフラグメントを加速して、その質量対電荷比に応じてこのイオンの第一の群およびそのフラグメントを分離して、その質量対電荷比に基づいてイオンの第一の群およびそのフラグメントからイオンの第二の群を選択する。この第二の質量分離器はまた、イオンの第二の群の少なくとも一部をフラグメント化させる。この第一および／または第二の質量分離器はまた、イオンガイド、イオン集束エレメント、および／またはイオンステアリングエレメントを備え得る。種々の実施形態では、第二のＴＯＦ質量分離器は、イオンの第一の群およびそのフラグメントを加速する。種々の実施形態では、第二のＴＯＦ質量分離器は、フィールド・フリー領域およびイオン選別器を備え、この選別器は実質的に第二の所定の範囲内である質量対電荷比を有するイオンを選択する。種々の実施形態では、第一および第二のＴＯＦ質量分離器のうちの少なくとも１つは、フラグメント化したイオンを選択する時限イオン選別器を備える。種々の実施形態では、第一および第二の質量分離器のうちの少なくとも１つは、イオン分離器を備える。この第三の質量分離器は、第二の質量分離器によって発生されるイオンの第二の群およびそのフラグメントを受容するように配置されている。この第三の質量分離器は、イオンの第二の群およびそのフラグメントを加速して、その質量対電荷比に応じてこのイオンの第二の群およびそのフラグメントを分離する。種々の実施形態では、この第三の質量分離器は、イオンの第二の群およびそのフラグメントを、パルス加速を用いて加速する。種々の実施形態では、イオン検出器が、イオンの第二の群およびそのフラグメントを受容するように配置される。種々の実施形態では、イオンレフレクターは、イオンの第一および第二の群ならびにそのフラグメントのうちの少なくとも１つのエネルギーを、それらがイオン検出器に達する前に補正するためにフィールド・フリー領域に配置される。
【００７９】
種々の実施形態では、質量分析計システムは、ＴＯＦ質量分析器を備え、これは複数の飛行経路、時間内に同時に行われ得る複数の作動方式、または両方を有する。このＴＯＦ質量分析器は、経路選択イオンデフレクターを備え、このイオンデフレクターは、第一のイオン経路、第二のイオン経路または第三のイオン経路のいずれかにそって質量分析器に入るサンプルイオンのポケットから選択されたイオンを指向させる。いくつかの実施形態では、さらに多くのイオン経路が使用されてもよい。種々の実施形態では、第二のイオンデフレクターを、イオンデフレクターを選択する経路として用いてもよい。時間依存性の電圧を、経路選択イオンデフレクターに加えて、利用可能なイオン経路のなかから選択し、所定の質量対電荷比の範囲内の質量対電荷比を有するイオンを、選択されたイオン経路にそって伝えることを可能にさせる。
【００８０】
例えば、複数の飛行経路を有するＴＯＦ質量分析器の作動の種々の実施形態では、第一の所定の電圧を、第一の所定の質量対電荷比の範囲に相当する第一の所定の時間間隔について経路選択イオンデフレクターに与え、これによって第一の質量対電荷比の範囲内のイオンを、第一のイオン経路にそって伝えさせる。種々の実施形態では、この第一の所定の電圧は、ゼロであって、これによって、イオンが最初の経路にそって伝え続けることが可能になる。第二の所定の電圧を、第二の所定の質量対電荷比の範囲に相当する第二の所定の時間範囲について経路選択イオンデフレクターに与え、これによって第二の質量対電荷比の範囲内のイオンを、第二のイオン経路にそって伝えさせる。さらなる時間範囲および電圧（第三、第四などを含む）を使用して、特定の測定について必要なできるだけ多くのイオン経路を適合させてもよい。第一の所定の電圧の振幅および極性を選択して、第一のイオン経路中にイオンを偏向させて、第二の所定の電圧の振幅および極性を選択して、第二のイオン経路中にイオンを偏向させる。この第一の時間間隔は、第一の所定の質量対電荷比の範囲内のイオンが経路選択イオンデフレクターを通じて伝わっている時間に相当するように選択され、この第二の時間間隔は、第二の所定の質量対電荷比の範囲内のイオンが経路選択イオンデフレクターを通じて伝わっている時間に相当するように選択される。第一のＴＯＦ質量分離器は、第一のイオン経路にそって伝わる第一の質量対電荷比の範囲内のイオンのパケットを受容するように配置されている。この第一のＴＯＦ質量分離器は、第一の質量対電荷比の範囲内のイオンをその質量に応じて分ける。第一の検出器は、第一のイオン経路にそって伝えられているイオンの第一の群を受容するように配置されている。この第二のＴＯＦ質量分離器は、第二のイオン経路にそって伝わるイオンのパケットの一部を受容するように配置されている。この第二のＴＯＦ質量分離器は、第二の質量対電荷比の範囲内のイオンをその質量に応じて分ける。第二の検出器は、第二のイオン経路にそって伝えられているイオンの第二の群を受容するように配置されている。いくつかの実施形態では、さらなる質量分離器および検出器（第三、第四などを含む）を、対応する経路にそって指向されるイオンを受容するように配置してもよい。１実施形態では、第三の所定の質量範囲内のイオンを破棄する第三のイオン経路を使用する。第一および第二の質量分離器は、任意のタイプの質量分離器であってもよい。例えば、第一および第二の質量分離器のうちの少なくとも１つは、フィールド・フリードリフト領域、イオン加速器、イオン分裂器、または時限イオン選別器を備えてもよい。この第一および第二の質量分離器はまた、複数の質量分離デバイスを備えてもよい。種々の実施形態では、イオンレフレクターが、イオンの第一の群を受容するように含まれかつ配置され、それによってイオンレフレクターは、イオンの第一の群についてＴＯＦ質量分析器の解像力を向上させる。種々の実施形態では、イオンレクレクターが、イオンの第二の群を受容するように含まれかつ配置され、それによってイオンレフレクターは、イオンの第二の群についてＴＯＦ質量分析器の解像力を向上させる。
【００８１】
本発明の教示の別の局面では、本明細書に記載される方法の機能は、一般的な目的のコンピューターでコンピューター読み取り可能な装置として実行され得る。このコンピューターは、質量分析システムから隔てられても、それから取り外し可能でも、またはそれに組み込まれてもよい。このコンピューター読み取り可能な装置は、例えば、ＦＯＲＴＲＡＮ、ＰＡＳＣＡＬ、Ｃ、Ｃ＋＋またはＢＡＳＩＣなどの多数の高レベル言語のうちのいずれか１つで書かれてもよい。さらにコンピューター読み取り可能な装置は、ＥＸＣＥＬまたはＶＩＳＵＡＬ ＢＡＳＩＣのような、市販のソフトウェアに組み込まれたスクリプト、マクロまたは機能で書かれてもよい。さらに、コンピューター読み取り可能な装置は、コンピューター上に存在するマイクロプロセッサーに指向されるアセンブリ言語で実行され得る。例えば、コンピューター読み取り可能な装置は、ＩＢＭ ＰＣまたはＰＣ単独で行うように構成されている場合、Ｉｎｔｅｌ８０×８６アセンブリ言語で実行されてもよい。１実施形態では、コンピューター読み取り可能な装置は、限定はしないが、コンピューター読み取り可能なプログラム媒体、例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスク、光学ディスク、磁気テープ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭなどを含む、製造業者の品目に組み込まれる。
【実施例】
【００８２】
本発明の教示の局面は、排他的ではなく、本発明の教示の範囲を限定するとは決して解釈されるべきではない以下の実施例に照らしてさらに理解され得る。
【００８３】
実施例１：種々のサンプルのタイプ由来の化合物
以下の実施例は、種々のサンプルタイプの使用を図示する。この実施例の教示は、排他的ではなく、かつこれらの実験または本発明の教示の範囲を限定するものではない。
【００８４】
本発明の教示の方法を用いる種々のサンプルタイプ由来の１つ以上のアミン含有化合物の分析の種々の実施形態が図示される。種々の実施形態では、目的の１つ以上のアミン含有化合物は、この実施例において、１つ以上の多様なサンプルタイプ、例えば、血漿、ワイン、タンパク質、ペプチドおよびアミノ酸に由来し得る。一般には、サンプル中の目的の化合物が、例えば、一級アミンおよび二級アミンのようなアイソバリックタグでの標識のために適切な１つ以上のアミン基を含むようにサンプルを処理してもよい。
【００８５】
図３を参照すれば、種々の実施形態では、血漿（ブロック３０５）のサンプルに含まれる１つ以上のアミン含有化合物の標識は、目的のアミン含有化合物のうちの１つ以上を沈殿させる工程（工程３２５）、続いてこの上清の遠心分離および少なくとも一部の収集（工程３４０）を包含する。広範な種々のアプローチを用いて、限定はしないが、７〜１０％のスルホサリチル酸（ＳＳＡ）溶液、エタノール、イソプロパノールおよびそれらの組み合わせを含む、目的のアミン含有化合物を沈殿させてもよい。次いで、この上清の少なくとも一部を１セットのアイソバリックタグ（例えば、ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬）由来の１つ以上のアイソバリックタグと合わせて（工程３５０）、血漿サンプルから目的のアイソバリック標識されたアミン含有化合物を調製する。
【００８６】
種々の実施形態では、ワインのサンプル（ブロック３１０）に含まれる１つ以上のアミン含有化合物の標識は、７〜１０％のＳＳＡ溶液を含む、目的のアミン含有化合物の１つ以上を沈殿させる工程（工程３３０）、続いて、この上清の少なくとも一部の遠心分離および収集（工程３４５）を包含する。次いで、この上清の少なくとも一部を１セットのアイソバリックタグ（例えば、ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬）由来の１つ以上のアイソバリックタグと合わせて（工程３５０）、ワインサンプルから目的のアイソバリック標識されたアミン含有化合物を調製する。
【００８７】
種々の実施形態では、タンパク質、ペプチドまたはポリペプチドのサンプル（ブロック３１５）に含まれる１つ以上のアミン含有化合物の標識は、サンプルの少なくとも一部を（例えば、６モル（Ｍ）の塩酸（ＨＣｌ）で）加水分解する工程、消化する工程（例えば、トリプシンで）、またはその両方（工程３２５）（例えば、ペプチドおよび／またはアミノ酸のフラグメントを生成するため）、およびこの処理されたサンプルと１セットのアイソバリックタグ（例えば、ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬）由来の１つ以上のアイソバリックタグと合わせて（工程３５０）、タンパク質、ペプチドまたはポリペプチドサンプルから目的のアイソバリック標識されたアミン含有化合物を調製する工程を包含する。
【００８８】
種々の実施形態では、このサンプルは、アミノ酸またはアミノ酸の混合物（ブロック３２０）を含み、アミノ酸のうち１つ以上が目的のアミン含有化合物を含む。種々の実施形態では、アミノ酸サンプルを、１セットのアイソバリックタグ（例えば、ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬）由来の１つ以上のアイソバリックタグと合わせて（工程３５０）、アミノ酸サンプルから目的のアイソバリック標識されたアミン含有化合物を調製してもよい。ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬を用いる種々の実施形態では、目的のアイソバリックに標識されたアミン含有化合物を、１つ以上の翻訳後修飾を実質的に変化させることなく調製し得る。
【００８９】
実施例２
サンプル調製およびｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬での標識
以下の実施例は、ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬を用いる１つ以上のアイソバリックタグで、１つ以上のタンパク質またはペプチドを含む１つ以上のサンプルを調製して標識する種々の実施形態の例を図示する。この実施例の教示は、排他的ではなく、かつこれらの実験または本発明の教示の範囲を限定するものではない。
【００９０】
タンパク質またはペプチドのサンプルの還元ならびにシステインのブロック
図４Ａを参照して、種々の実施形態では、少なくとも１つおよび最大４つのサンプル試験管の各々（各々が５〜１００μｇのタンパク質を含む）に対して、２０μＬの溶解緩衝液および１μＬの変性剤を添加し、続いてボルテックスによって混合する（工程４０５）。各々のサンプル試験管に対して、２μＬの還元試薬を添加し、続いてボルテックスによって混合し６０℃で１時間インキュベーションする（工程４１０）。各々のサンプル試験管をスピンさせた後、各々のサンプル試験管に１μＬのシステインブロック試薬を添加し、次いでボルテックスによって混合し、スピニングして、室温で１０分間インキュベーションする（工程４１５）。
【００９１】
トリプシンによるタンパク質またはペプチドのサンプルの消化
図４Ａを参照して、種々の実施形態では、少なくとも１つおよび最大２つのサンプル試験管（各々が５〜１００μｇの還元および標識されるべきシステインブロックタンパク質を含む）種々の実施形態において、１バイアルのトリプシンを２５μＬのＭｉｌｌＱ（登録商標）Ｗａｔｅｒまたはその等価物で再構成する。例えば、少なくとも１つおよび最大４つのサンプル試験管（各々が５〜１００μｇの還元および標識されるべきシステインブロックタンパク質を含む）他の実施形態では、２バイアルのトリプシンを２５μＬのＭｉｌｌＱ（登録商標）Ｗａｔｅｒまたはその等価物で再構成する。トリプシンの希釈されたバイアルの各々を、ボルテックスおよびスピニングによって混合する（工程４２０）。
【００９２】
少なくとも１つおよび最大４つのサンプル試験管（各々が５〜１００μｇの還元および標識されるべきシステインブロックタンパク質を含む）の各々に、１０μＬのトリプシン溶液を添加する。各々のサンプル試験管をボルテックスによって混合し、次いでスピンさせて、３７℃で少なくとも１２時間および最大１６時間までインキュベートする。次いで、各々のサンプル試験管中のサンプル消化液をスピンさせる（工程４２５）。
【００９３】
タンパク質またはペプチドサンプルの加水分解
種々の実施形態では、タンパク質またはペプチドのサンプルを加水分解による分析のために調製する。従って、種々の実施形態では、還元工程（例えば、工程４１０）および消化工程（例えば、工程４２０）は用いない。図４Ｂを参照、種々の実施形態では、タンパク質および／またはペプチドを含むサンプルを、例えば、酸を用いて加水分解する（工程４２７）。本発明の教示での使用に適切であるタンパク質およびペプチドの加水分解には広範な種々の技術が当該分野で利用可能である。加水分解を、例えば、強力な酸加水分解を用いて行って（例えば、減圧下で１００℃で６Ｎの塩酸を用いる処理による）、遊離のアミノ酸を生成する。いくつかの加水分解条件で、いくつかのアミド（例えば、Ａｓｎ、Ｇｌｎ）をその酸に変換し得、他のアミノ酸を分解し得ると理解される。従って、種々の実施形態では、強力な酸加水分解以外の加水分解法を用いてもよい。
【００９４】
ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬を用いるアミノ酸の標識
図４Ａおよび４Ｂを参照、種々の実施形態では、少なくとも１つのバイアルｉＴＲＡＱ（商標）ブランドのアイソバリック試薬、および最大４バイアルの種々のｉＴＲＡＱ（商標）ブランドのアイソバリック試薬を室温まで温めて、ｉＴＲＡＱ（商標）ブランドのアイソバリック試薬の各々のバイアルに、７０μＬのエタノールを添加し、続いてボルテックスによって混合し、スピニングする（工程４３０）。１つのバイアルｉＴＲＡＱ（商標）ブランドのアイソバリック試薬を、例えば、消化されたタンパク質、加水分解されたタンパク質など由来のアミノ酸の各々のサンプル試験管について用いる。
【００９５】
アミノ酸の１つのサンプル試験管に、エタノール中の１つのｉＴＲＡＱ（商標）ブランドのアイソバリック試薬を含む１バイアルの内容物を添加し、続いてボルテックスによる混合、スピニングおよび室温で１時間のインキュベーションをする（工程４３５）。種々の実施形態では、各々の標識されたアミノ酸の少なくとも一部を浄化し（工程４４０）、（例えば、干渉するサンプル、干渉アーチファクト、などを除去するため；高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣ、交換分画、陽イオン交換、高解像陽イオン交換など、およびそれらの組み合わせによって）、その後にそれを用いて、レポーターイオンシグナルを測定する。浄化された標識されたアミノ酸の少なくとも一部をクロマトグラフィーカラムにロードする（工程４４５）（例えば、ＬＣカラム、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）カラム、またはその組み合わせ）。次いで、このクロマトグラフィーカラムからの溶離液の少なくとも一部を質量分析計システムに向け（工程４５０）、１つ以上のアミン含有化合物のアミン含有化合物レポーターイオン遷移シグナルを測定する。種々の実施形態では、アミン含有化合物レポーターイオン遷移シグナルは観察されない（工程４５５）。アミン含有化合物レポーターイオン遷移シグナルが観察されない種々の実施形態では、標識されたアミノ酸のサンプルについて、アミノ酸を標識する工程を繰り返す（工程４６０）。
【００９６】
分析のためにｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬標識アミノ酸を組み合わせる
図４Ａおよび４Ｂを参照、種々の実施形態では、各々の標識されたアミノ酸サンプル試験管の全内容物を、１つの新しいサンプル試験管に移して、合わせたサンプルを得て、これをボルテックスして混合し、次いでスピンする（工程４６５）。標識された消化されたタンパク質の各々の少なくとも一部を浄化し（工程４７０）、（例えば、干渉するサンプル、干渉アーチファクト、などを除去するため；高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣ、交換分画、陽イオン交換、高解像陽イオン交換など、およびそれらの組み合わせによって）、その後にそれを用いて、レポーターイオンシグナルを測定する（工程４７５）。浄化された標識されたアミノ酸サンプルの少なくとも一部をクロマトグラフィーカラムにロードする（例えば、ＬＣカラム、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）カラム、またはその組み合わせ）。次いで、このクロマトグラフィーカラムからの溶離液の少なくとも一部を質量分析計システムに向け（工程４８０）、１つ以上のアミン含有化合物のアミン含有化合物レポーターイオン遷移シグナルを、ＰＤＩＴＭ（例えば、ＭＲＭ）を用いて測定する。次いで、合わせたサンプル中の目的の１つ以上のアミン含有化合物の濃度（例えば、相対、絶対または両方）を決定する（工程４８５）。
【００９７】
実施例３
標準化合物との組み合わせ
図５を参照、種々の実施形態では、１つ以上のサンプル中の１つ以上のアミン含有化合物の濃度の決定を、限定はしないが、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、ニトロフラン代謝物、ポリアミンおよびカテコールアミンを含む１つ以上のアミン含有化合物を得て進行させてもよい。種々の実施形態では、アイソバリックに標識された標準化合物（工程５０５）（例えば、コントロールサンプル由来の目的のアミン含有化合物、濃度が既知のサンプル由来の目的のアミン含有化合物など）を、分析されるべき２つ以上のアイソバリックに標識されたアミン含有試験化合物、例えば、試験化合物＃１（工程５１０）、試験化合物＃２（工程５２０）、および試験化合物＃３（と例えば、組み合わせて）内部標準として用いる（工程５２５）。
【００９８】
種々の実施形態では、分析されるべき２つ以上のアミン含有試験化合物は、目的の同じアミン含有化合物を含む。例えば、試験化合物＃１、試験化合物＃２、および試験化合物＃３は、目的の同じアミン含有化合物（例えば、リジン）を、ただし、３つの異なるサンプルから（例えば、時点１、時点２、時点３など、例えば、いくつかのプロセス、例えば、疾患、ファーメンテーションなどの進行をモニターするため）、同じサンプル（例えば、サンプルの１つの実験試行において三連の分析物を得るため）、またはその組み合わせを含んでもよい。
【００９９】
１つ以上のアミン含有化合物の濃度の決定は、標準化合物および各々のアミン含有試験化合物を１セットのアイソバリックタグ由来の異なるアイソバリックタグ（例えば、ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬）で標識して、進行し得る。例えば、標準化合物を、アイソバリックタグのセット由来の第一のアイソバリックタグで標識し（工程５３０）、試験化合物＃１をアイソバリックタグのセット由来の第二のアイソバリックタグで標識し（工程５３５）、試験化合物＃２をアイソバリックタグのセット由来の第三のアイソバリックタグで標識し（工程５４０）、試験化合物＃３をアイソバリックタグのセット由来の第四のアイソバリックタグで標識してもよい（工程５４５）。
【０１００】
種々の実施形態では、アイソバリックに標識された標準化合物の少なくとも一部およびアイソバリックに標識された試験化合物の一部を合わせて（工程５５０）、合わせたサンプルを生成し、この合わせたサンプルの少なくとも一部をＰＤＩＴＭに供する。
【０１０１】
種々の実施形態では、アイソバリックに標識された標準化合物を添加することで、合わせたサンプル中で目的の１つ以上のアミン含有化合物について内部標準として機能し得る。種々の実施形態では、種々のアイソバリックに標識された標準化合物を、合わせたサンプル中の目的の各々の異なるアミン含有化合物について添加して、各々の異なるアイソバリックに標識された標準化合物が、例えば、目的の種々のアミン含有化合物について内部標準として機能する。
【０１０２】
実施例４
アミン含有化合物濃度の多重決定
以下の実施例は、１セットのｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬由来のアイソバリックタグを用いる４つのポリアミンの濃度の多重決定を例示する。本実施例の教示は、排他的ではなく、かつこれらの実験または本発明の教示の範囲を限定するものではない。
【０１０３】
材料および方法：
本実施例のスペクトルは、図６Ｂ〜図１０ＤのスペクトルのＡＰＩ２０００トリプル四重極ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム、および図１１〜図１３のスペクトルについてはＨＩＬＣカラムを装備したＨＰＬＣシステムに連結されたＡＰＩ２０００トリプル四重極装置を用いて得た。このクロマトグラフィー設定は、オートサンプラー、１５０×２．１ｍｍＣ１８逆相カラムおよびカラムヒーターを装備した二成分勾配のＨＰＬＣシステムを含む。アミン含有化合物は、メタノール中にそれらを溶解すること、次いで標準的な標識プロトコールを用いてそれらをｉＴＲＡＱ試薬と反応させることによって調製した。標準のアミンをＦｌｕｋａから得た。
【０１０４】
スペクトル：
実施例４は、合わせたサンプルを用いる複数のアミン含有化合物の濃度の決定を図示する。図６Ａ〜図１０Ｄは、未標識のおよび１セットのアイソバリックタグ由来のアイソバリックで標識された両方の個々のアミン含有化合物の質量スペクトルを示す。この実施例では、アイソバリックタグは、ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬であった。図１１および図１３は、合わせたサンプルについてのクロマトグラムを示す。本実施例の合わせたサンプル中の目的のアミン含有化合物は、１，４ジアミノブタン（プトレセン（ｐｕｔｒｅｓｃｅｎｅ））、１，５ジアミノペンタン（カドベリン）、Ｎ１−（３−アミノプロピル）−ブタン−１，４−ジアミン（スペルミジン）および１，７ジアミノヘプタンであった。図１２Ａ〜図１２Ｃは、それぞれ、１，４ジアミノブタン（プトレセン（ｐｕｔｒｅｓｃｅｎｅ））、１，５ジアミノペンタン（カドベリン）、および１，７ジアミノヘプタンについてのクロマトグラムを示す。
【０１０５】
図６Ａ〜図６Ｃを参照、未標識（６０２）およびアイソバリックタグで一級アミンで標識した（６０４）両方のプトレセン（ｐｕｔｒｅｓｃｅｎｅ）の質量スペクトルを得た。本実施例では、ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬のアイソバリックタグのセット由来の１１４アイソバリックタグＱ１１４を用いて、プトレセン（ｐｕｔｒｅｓｃｅｎｅ）の一級アミンを標識した。図６Ｂは、ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬のアイソバリックタグのセット由来のアイソバリックタグＱ１１４を用いて標識したプトレセン（ｐｕｔｒｅｓｃｅｎｅ）のＥＳＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。主要なピークは、標識されたプトレセン（ｐｕｔｒｅｓｃｅｎｅ）に対応する６３５を観察した（ｍ／ｚ約３７７）が、マイナーなピークは、標識されたプトレセン（ｐｕｔｒｅｓｃｅｎｅ）−ナトリウム付加物（ｍ／ｚ約３９９）に、および溶媒６３０（ｍ／ｚ約３７５）、６１０（ｍ／ｚ約２４５）に存在する低質量不純物に相当し、ピーク６１５、６２０、６２５のクラスター（約３１９〜３２１の間のｍ／ｚ）も観察された。
【０１０６】
図６Ｃは、ＣＩＤに供された標識されたプトレセンのＥＳＩ ＴＯＦ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。観察された主要なピーク６５０は、１１４アイソバリックタグのレポーターイオンに対応したが、標識されたプトレセン（ｍ／ｚ約３７７）６７０に、およびプトレセン構造特異的なフラグメント６６０（ｍ／ｚ約２３３）に対応するピークも観察された。
【０１０７】
図７Ａ〜７Ｃを参照、カドベリンの質量スペクトル（未標識７０２およびアイソバリックタグを用いて一級アミンで標識された７０４の両方）を得た。この実施例では、ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬アイソバリックタグのセット由来の１１５アイソバリックタグＱ１１５を用いてカドベリンの一級アミンを標識した。図７Ｂは、ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬アイソバリックタグのセット由来のアイソバリックタグＱ１１５を用いて標識したカドベリンのＥＳＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。７３０で観察されるピークは、標識されたカドベリン（ｍ／ｚ約３９１）に相当したが、溶媒７１０（ｍ／ｚ約１０２）および７２５（ｍ／ｚ約２４８）のバックグラウンドに、およびｉＴＲＡＱ（商標）反応副産物７１５（ｍ／ｚ約１６３）および７２０（ｍ／ｚ約１９１）に対応するピークも観察された。
【０１０８】
図７Ｃは、ＣＩＤに供された標識されたカドベリンのＥＳＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。観察される主要ピーク７４０は、１１５アイソバリックタグのレポーターイオンに対応するが、標識カドベリン７６０（ｍ／ｚ約３９１）に、およびカドベリン構造特異的フラグメント７５０（ｍ／ｚ約２４７）に対応するピークも観察された。
【０１０９】
図８Ａ〜８Ｃを参照、１，７−ジアミノヘプタンの質量スペクトル（未標識８０２およびアイソバリックタグを用いる一級アミンでの標識８０４の両方）が得られた。この実施例では、ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬アイソバリックタグのセット由来の１１６アイソバリックタグＱ１１６を用いて１，７−ジアミノヘプタンの一級アミンを標識した。図８Ｂは、ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬アイソバリックタグのセット由来のアイソバリックタグＱ１１６を用いて標識した１，２−ジアミノヘプタンのＥＳＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。観察されるピーク８２５は、標識された１，７−ジアミノヘプタン（ｍ／ｚ約４１９）に相当したが、溶媒バックグラウンド８１０（ｍ／ｚ約１０２）に、およびｉＴＲＡＱ（商標）反応副産物８１５（ｍ／ｚ約１６３）および８２０（ｍ／ｚ約１９１）に対応するピークも観察された。
【０１１０】
図８Ｃは、ＣＩＤに供された標識された１，７−ジアミノヘプタンのＥＳＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。観察される主要ピーク８３０は、１１６アイソバリックタグのレポーターイオンに対応するが、標識された１，７−ジアミノヘプタン８５０（ｍ／ｚ約４１９）に、および構造特異的フラグメント８４０（ｍ／ｚ約２７５）に対応するピークも観察された。
【０１１１】
図９Ａ〜９Ｄを参照、スペルミジン（未標識９０２およびアイソバリックタグを用いる一級アミンでの標識９０４の両方）の質量スペクトルを得た。この実施例では、ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬アイソバリックタグのセット由来の１１４アイソバリックタグＱ１１４を用いてスペルミジンの一級アミンを標識した。図９Ｂは、ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬アイソバリックタグのセット由来のアイソバリックタグＱ１１４を用いて標識したスペルミジンのＥＳＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。観察されるピーク９２５は、標識されたスペルミジン（ｍ／ｚ約４３４）に相当したが、ｉＴＲＡＱ（商標）反応副産物９０８（ｍ／ｚ約１６３）、９１６（ｍ／ｚ約２１７）、９１８（ｍ／ｚ約２４５）、９３０（ｍ／ｚ約４５８）に、および部分的に標識された二級アミン９３５（ｍ／ｚ約５７８）に対応するピークも観察された。
【０１１２】
図９Ｃは、ＣＩＤに供された標識されたスペルミジンのＥＳＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。観察されるピーク９４５は、１１４アイソバリックタグのレポーターイオンに対応するが、標識されたスペルミジン９８０（ｍ／ｚ約４３４）、構造特異的なフラグメント９４０（ｍ／ｚ約９７）、９５５（ｍ／ｚ約２０２）、および９７０（ｍ／ｚ約２９０）に、ｉＴＲＡＱ（商標）標識９５０（ｍ／ｚ約１４５）に、および溶媒構造フラグメント９６０（ｍ／ｚ約２１６）に対応するピークも観察された。
【０１１３】
図９Ｄは、ＣＩＤに供された標識されたスペルミジンのＥＳＩ ＴＯＦ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。観察されるピーク９８５は、１１４アイソバリックタグのレポーターイオンに対応するが、標識されたスペルミジン９９５（ｍ／ｚ約４３４）に、および二次標識されたアミン９９０（ｍ／ｚ約５７８）に対応するピークも観察された。
【０１１４】
図１０Ａ〜１０Ｄを参照、スペルミジン（未標識１００２およびアイソバリックタグを用いる一級アミンでの標識１００４の両方）の質量スペクトルを得た。この実施例では、ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬アイソバリックタグのセット由来の１１７アイソバリックタグＱ１１７を用いてスペルミジンの一級アミンを標識した。図１０Ｂは、ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬アイソバリックタグのセット由来のアイソバリックタグＱ１１７を用いて標識したスペルミジンのＥＳＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。観察されるピーク１０３５は、標識されたスペルミジン（ｍ／ｚ約４９１）に相当したが、溶媒バックグラウンド１００８（ｍ／ｚ約１７７）、１０２０（ｍ／ｚ約２４８）、および１０２２（ｍ／ｚ約２４８）に、ｉＴＲＡＱ（商標）反応副産物１０１０（ｍ／ｚ約１８５）、および１０１２（ｍ／ｚ約１９１）に、ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬アイソバリックタグのセット由来のアイソバリックタグＱ１１４で標識されたスペルミジン１０３０（ｍ／ｚ約４３４）に、標準のスペルミジンにおける不純物１０４０（ｍ／ｚ約５３５）、１０４５（ｍ／ｚ約７３８）、および１０５０（ｍ／ｚ約７５４）に対応するピークも観察された。
【０１１５】
図１０Ｃは、ＣＩＤに供された標識されたスペルミンのＥＳＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。観察されるピーク１０６０は、１１７アイソバリックタグのレポーターイオンに対応するが、標識されたスペルミン１０７５（ｍ／ｚ約４９１）に、構造特異的なフラグメント１０５５（ｍ／ｚ約１００）、１０５８（ｍ／ｚ約２０２）、および１０７０（ｍ／ｚ約２７３）に対応するピークも観察された。
【０１１６】
図１０Ｄは、ＣＩＤに供された標識されたスペルミンのＥＳＩ ＴＯＦ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。観察されるピーク１０８０は、１１７アイソバリックタグのレポーターイオンに対応するが、標識されたスペルミン１０９０（ｍ／ｚ約４９１）に、一級アミンで標識を有する、構造特異的フラグメント１０８２（ｍ／ｚ約２０２）に、構造特異的フラグメント１０８５（ｍ／ｚ約２７３）に、および全てのアミンが標識されたインタクトなアミン１０９５（ｍ／ｚ約６３５）に対応するピークも観察された。
【０１１７】
図１１は、合わせたサンプルについてのクロマトグラムを示しており、これは、ＨＩＬＣカラムを装備したＨＰＬＣシステムに連結されたＡＰＩ２０００トリプル四重極装置上のＭＲＭモードで分析された、１，４ジアミノブタン（プトレセン）１１２０、１，５ジアミノペンタン（カドベリン）１１１０、および１，７ジアミノヘプタン１１０５についてのクロマトグラムを示す。
【０１１８】
図１２Ａ〜図１２Ｃを参照、アイソバリックタグを有する一級アミンで標識されたプトレセン、カドヘリンおよび１，７−ジアミノヘプタンのクロマトグラムを得た。図１２Ａは、図１１で示されるＬＣ／ＭＳ／ＭＳ試行から得られたｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬アイソバリックタグのセット由来の１１４アイソバリックタグＱ１１４で標識されたプトレセンの抽出されたイオンクロマトグラムを示す。観察されるピーク１２０５は、標識プトレセン（保持時間約８．９分）に対応する。図１２Ｂは、図１１で示されるＬＣ／ＭＳ／ＭＳ試行から得られたｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬アイソバリックタグのセット由来の１１５アイソバリックタグＱ１１５で標識されたカドベリンの抽出されたイオンクロマトグラムを示す。観察されるピーク１２１５は、標識カドベリン（保持時間約８．８分）に対応した。図１２Ｃは、図１１で示されるＬＣ／ＭＳ／ＭＳ試行から得られたｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬アイソバリックタグのセット由来の１１６アイソバリックタグＱ１１６で標識された１，７−ジアミノヘプタンの抽出されたイオンクロマトグラムを示す。観察されるピーク１２２５は、標識された１，７−ジアミノヘプタン（保持時間約８．４分）に対応した。
【０１１９】
図１３は、合わせたサンプルについてのクロマトグラムを示しており、これは、１，７−ジアミノヘプタン１３０５、カドベリン１３１０、およびプトレセン１３２０についてのクロマトグラムを示す。
【０１２０】
図１４Ａ〜図１４Ｃを参照、マトリックスシアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸を用いて９５％アセトニトリルのバックグラウンドＯ−ＭＡＬＤＩ質量スペクトルを得た。同じスペクトルの３つの質量範囲にみられるほとんどのイオンは、溶媒に由来する化学的バックグラウンドおよび４−ヒドロキシ桂皮酸由来のマトリックスイオンから生じる。
【０１２１】
図１５は、９５％アセトニトリル（ＡＣＮ）およびシアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）中のアイソバリックタグを用いて一級アミンで標識された、プトレセン、カドベリンおよび１，７−ジアミノヘプタンの混合物のＯ−ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。標識されたプトレセン１５１２（ｍ／ｚ約３７９）、標識されたカドベリン１５２０（ｍ／ｚ約３９１）、標識された１，７−ジアミノヘプタン１５２５（ｍ／ｚ約４１９）、および標識されたスペルミジン１５３０（ｍ／ｚ約４３４）に対応する観察されたピーク、ただし、標準における化学的不純物１５０２（ｍ／ｚ約３５９）、１５０４（ｍ／ｚ約３６１）、１５０８（ｍ／ｚ約３７７）、および１５１５（ｍ／ｚ約３８０）に対応するピークも観察された。
【０１２２】
図１６Ａ〜１６Ｂを参照、プトレセンの質量スペクトル（未標識１６０２およびアイソバリックタグを用いる一級アミンでの標識１６０４の両方）の質量スペクトルを得た。この実施例では、ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬アイソバリックタグのセット由来の１１４アイソバリックタグＱ１１４を用いてプトレセンの一級アミンを標識した。図１６Ｂは、ＣＩＤに供された、マトリックス４−ヒドロキシ桂皮酸中の標識されたプトレセンのＯ−ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。観察される主要なピーク１６０８は、１１４アイソバリックタグのレポーターイオンに対応するが、標識されたプトレセン１６４０（ｍ／ｚ約３７７）に、インタクトな標識１６１０（ｍ／ｚ約１４５）に、構造特異的フラグメント１６１５（ｍ／ｚ約１７２）、１６２０（ｍ／ｚ約２３３）、１６３０（ｍ／ｚ約３３１）、および１６３５（ｍ／ｚ約３５９）に対応するピークも観察された。
【０１２３】
図１７Ａ〜図１７Ｂを参照、カドベリンの質量スペクトル（未標識１７０２およびアイソバリックタグを用いる一級アミンでの標識１７０４の両方）の質量スペクトルを得た。この実施例では、ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬アイソバリックタグのセット由来の１１５アイソバリックタグＱ１１５を用いてカドベリンの一級アミンを標識した。図１７Ｂは、マトリックス４−ヒドロキシ桂皮酸中のｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬アイソバリックタグのセット由来のアイソバリックタグＱ１１５で標識されたカドベリンのＯ−ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。観察された主なピーク１７０８は、１１５アイソバリックタグのレポーターイオンに対応したが、標識されたカドベリン１７３０（ｍ／ｚ約３９１）に、インタクトな標識１７１２（ｍ／ｚ約１４５）に、および構造特異的フラグメント１７２０（ｍ／ｚ約２４７）に対応するピークも観察された。
【０１２４】
図１８Ａ〜１８Ｂを参照、１，７−ジアミノヘプタン（未標識１８０２およびアイソバリックタグを用いる一級アミンでの標識１８０４の両方）の質量スペクトルを得た。この実施例では、ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬アイソバリックタグのセット由来の１１６アイソバリックタグＱ１１６を用いてカドベリンの一級アミンを標識した。図１８Ｂは、マトリックス４−ヒドロキシ桂皮酸中のｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬アイソバリックタグのセット由来のアイソバリックタグＱ１１６を用いて標識した１，７−ジアミノヘプタンのＯ−ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。観察されるピーク１８１５は、１１６アイソバリックタグのレポーターイオンに相当したが、標識された１，７−ジアミノヘプタン１８４５（ｍ／ｚ約４１９）に、ｉＴＲＡＱ（商標）標識フラグメント１８１０（ｍ／ｚ約１０１）に、および構造特異的フラグメント１８２５（ｍ／ｚ約２７５）および１８３５（ｍ／ｚ約３８１）に対応するピークも観察された。
【０１２５】
図１９Ａ〜１９Ｂを参照、スペルミジン（未標識１９０２およびアイソバリックタグを用いる一級アミンでの標識１９０４の両方）の質量スペクトルを得た。この実施例では、ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬アイソバリックタグのセット由来の１１４アイソバリックタグＱ１１４を用いてスペルミジンの一級アミンを標識した。図１９Ｂは、マトリックス４−ヒドロキシ桂皮酸中のｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬アイソバリックタグのセット由来のアイソバリックタグＱ１１４を用いて標識したスペルミジンのＯ−ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。観察される主要なピーク１９０８は、１１４アイソバリックタグのレポーターイオンに相当したが、標識されたスペルミジン１９６５（ｍ／ｚ約４３４）に、インタクトなｉＴＲＡＱ（商標）標識１９１２（ｍ／ｚ約１４５）に、および構造特異的フラグメント１９１５（ｍ／ｚ約１５６）、１９１８（ｍ／ｚ約１７５）、１９２５（ｍ／ｚ約１８４）、１９３０（ｍ／ｚ約２０２）、１９３５（ｍ／ｚ約２２０）、１９４０（ｍ／ｚ約２７３）、１９４５（ｍ／ｚ約２９０）および１９６０（ｍ／ｚ約４１４）に対応するピークも観察された。
【０１２６】
図２０Ａ〜２０Ｂを参照、スペルミン（未標識２００２およびアイソバリックタグを用いる一級アミンでの標識２００４の両方）の質量スペクトルを得た。この実施例では、ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬アイソバリックタグのセット由来の１１７アイソバリックタグＱ１１７を用いてスペルミジンの一級アミンを標識した。図２０Ｂは、９５％アセトニトリルおよびＣＨＣＡ中のｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬アイソバリックタグのセット由来のアイソバリックタグＱ１１７を用いて標識されたスペルミンのＯ−ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。観察される主要なピーク２０１５は、標識されたスペルミン（ｍ／ｚ約４９１）に対応するが、構造特異的フラグメント２００８（ｍ／ｚ約３７９）、および２０３０（ｍ／ｚ約５３５）に対応するピークも観察された。
【０１２７】
図２１Ａ〜図２１Ｃを参照、スペルミン（未標識２１０２およびアイソバリックタグを用いる一級アミンでの標識２１０４の両方）の質量スペクトルを得た。この実施例では、ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬アイソバリックタグのセット由来の１１７アイソバリックタグＱ１１７を用いてスペルミンの一級アミンを標識した。図２１Ｂは、４−ヒドロキシ桂皮酸マトリックス中のｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬アイソバリックタグのセット由来のアイソバリックタグＱ１１４で標識されたスペルミンのＯ−ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。観察されたピーク２１１０は、１１７アイソバリックタグのレポーターイオンに対応したが、標識されたスペルミン２１４０（ｍ／ｚ約４９１）に、および構造特異的フラグメント２１２０（ｍ／ｚ約２０２）、２１３０（ｍ／ｚ約２７５）、および２１３５（ｍ／ｚ約４７３）に対応するピークも観察された。
【０１２８】
図２１Ｃは、４−ヒドロキシ桂皮酸マトリックス中のｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬アイソバリックタグのセット由来のアイソバリックタグＱ１１７で標識されたスペルミンのＯ−ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。観察されたピーク２１５０は、１１７アイソバリックタグのレポーターイオンに対応したが、標識されたスペルミン２１８０（ｍ／ｚ約４９１）に、および構造特異的フラグメント２１６０（ｍ／ｚ約２０２）、および２１７０（ｍ／ｚ約２７５）に対応するピークも観察された。
【０１２９】
図２２Ａ〜２２Ｂを参照、スペルミン（未標識２２０２およびアイソバリックタグを用いる一級アミンで標識２２０４の両方）の質量スペクトルを得た。この実施例では、ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬アイソバリックタグのセット由来の１１７アイソバリックタグＱ１１７を用いてスペルミンの一級アミンを標識した。図２２Ｂは、４−ヒドロキシ桂皮酸マトリックス中のｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬アイソバリックタグのセット由来のアイソバリックタグＱ１１７を用いて標識したスペルミンのＯ−ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。観察される主要なピーク２２１０は、１１７アイソバリックタグのレポーターイオンに相当したが、標識されたスペルミン２２５０（ｍ／ｚ約４９１）に、構造特異的フラグメント２２２０（ｍ／ｚ約２０２）、２２３０（ｍ／ｚ約２７１）、および２２３５（ｍ／ｚ約２７３）に、およびフラグメンテーションについて選択された前駆体イオン２２６０（ｍ／ｚ約６３５）に対応するピークも観察された。
【０１３０】
図２３は、種々のアミノ酸：２３１０、２３２０、２３３０、２３４０、２３５０および２３６０についてのタンパク質加水分解産物にみられるアミノ酸を含む、ｉＴＲＡＱ（商標）１１５標識アミノ酸標準のＭＲＭ分析のクロマトグラムを示す。
【０１３１】
実施例５
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）サンプル
以下の実施例は、遊離アミノ酸を生成するために加水分解に供したタンパク質サンプルのアミノ酸の濃度の決定を例示する。本実施例の教示は、排他的ではなく、これらの実験または本発明の教示の範囲を限定するものではない。
【０１３２】
材料および方法：
タンパク質またはペプチド加水分解産物を、標準的な加水分解方法によって調製する。詳細には、１μｇを含むウシ血清サンプルを６ＮのＨＣｌを用いて１１０℃で１７時間加水分解した。次いで、この加水分解したサンプルを緩衝液、イソプロパノールおよびｉＴＲＡＱブランド試薬と混合して、室温で反応させる。次いで、このサンプルを乾燥して、分析のための所望の濃度まで再溶解するかまたは直接希釈する（代表的には、０．２μｇのペプチドまたはタンパク質が各々の分析に必要）。標準（すなわち、ノルロイシン、ノバリン）を、サンプルに添加し、その後、加水分解および／または標識して、実験手順を通じてサンプルを回収する。サンプル標識の詳細はまた、プロトコール形式で表２に示す。
【０１３３】
複数のサンプルについては（内部標準を含む場合は最大４または最大３まで）、上記のように各々のサンプルを調製し、種々のｉＴＲＡＱ試薬（１１４、１１５、１１６または１１７）で標識する。標識反応後、標識されたサンプルと種々の試薬を一緒に混合する。別々のバイアル中で（ただし、異なるタグ付け試薬を用いて）アミンまたはアミノ酸標準混合物について同じプロセスを行って、標識された標準を用いて外部較正曲線を生成してもよい。標識された標準をまた、サンプルと混合してもよく、これによって各々のアミンまたはアミノ酸についての内部標準を得る（図１を参照のこと）。ＨＰＬＣ分離は、１ｍｌ／分の流速で検出器まで２００μＬ／分のスプリットで、５０℃に加熱したＣ１８カラム（１５％炭素をロードして完全末端キャップした）を用いて行う。勾配、洗浄および平衡は全部で２０分かかる。
【０１３４】
アミノ酸濃度の定量は、ＨＰＬＣ分離、続いてＭＲＭモードで作動するトリプル四重極またはＱ ＴＲＡＰ ＭＡ／ＭＳシステムのいずれかでＥＳＩ ＭＲＭ分析を用いて行う。ＭＲＭ分析のために、ＭＲＭ遷移は、アミノ酸の標識量からなり、ＭＳ／ＭＳで用いられる特定の試薬について、例えば１１７試薬について生成されるレポーターイオンのフラグメントグリシンは、２２０．１＞１１７．１の遷移を用いてモニターする。モニターするのに必要なすべてのアミノ酸についてのＭＲＭ遷移がこの方法に入る。遷移の１つはサンプル中でスパイクされる内部標準について正常には逆転される。あらゆるアミノ酸についての内部標準は、検出応答およびクロマトグラフィー分離における任意の変動について補正する。定量は、Ａｎａｌｙｓｔ（商標）ソフトウェアおよびアミノ酸分析を支持するために特に設計されたツールを用いて行う。
【０１３５】
【表２】
本実施例のデータの作成のためのサンプルホールディングおよびＬＣ／ＭＳ／ＭＳ設定のさらなる詳細は以下のとおりである。ＬＣカラム上のローディングの前に、各々のサンプルを、ｉＴＲＡＱ試薬１１４で標識した６ｐｍｏｌｅ／μＬのアミノ酸標準を含有する２５μＬの３％ギ酸を用いて再構成した。次いで５μＬの溶液を、製造業者の推奨する手順を用いてＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＭＤＳ Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ２０００ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ装置に注入した。装置の作動条件に対する詳細は、表３〜１１に示す。表３および表４の示す条件は、装置のＬＣ部分に関連し、表５〜１１に示す条件は、その装置のＭＳ／ＭＳ部分に関連した。
【０１３６】
【表３】
【０１３７】
【表４】
本実施例では、全ての遷移を施行中連続してスキャンしないように、ＭＳ／ＭＳデータ取得においては複数のピリオド（ピリオド１〜３）を用いる。あるピリオド中の遷移のみをそのピリオドの間にスキャンする。これによって、１ピークあたりより多くのデータポイントが可能になり、これでより良好な獲得が得られる。
【０１３８】
【表５】
【０１３９】
【表６】
【０１４０】
【表７】
【０１４１】
【表８】
【０１４２】
【表９】
【０１４３】
【表１０】
【０１４４】
【表１１】
スペクトルおよび結果：
本発明の実施例では、２０アミノ酸の濃度を決定した。表１２は、各々のアミノ酸（第２列に列挙）について得たデータをまとめる。第３列は、ＬＣカラム上のアミノ酸の保持時間を列挙する。第四列は、濃度が未知のサンプルのアミノ酸と関連したピークの面積を列挙しており、第五列は、アミノ酸標準サンプルと関連したピークの面積を列挙しており、第六列は、標準サンプル中のアミノ酸の濃度を列挙しており、第七列は、本発明の教示を用いるこの実施例におけるアミノ酸について決定した濃度を列挙した。未知のサンプル中のアミノ酸の濃度は、未知のサンプルのアミノ酸に関連するピークの領域を標準サンプルに関連するピークの領域で割ること、およびこの比に公知のサンプルの濃度を掛けることによって決定した。
【０１４５】
スペクトルの例を図２４、および２５Ａ〜２５Ｕに示す。
【０１４６】
図２４は、ｉＴＲＡＱ（商標）１１４標識したアミノ酸標準、および１１７標識したサンプルのＭＲＭ分析のクロマトグラムを示す。図２４に示される種々の保持時間に対応するアミノ酸を表１２に列挙する。図２５Ａ〜図２５Ｕは、測定した種々のアミノ酸についてのＭＲＭデータを模式的に示す。図２５Ａ〜図２５Ｕの各々の右パネルは、内部標準（ＩＳ）１１４標識アミノ酸のイオンシグナルを、左パネルは、１１７標識サンプルのイオンシグナルを示している。いずれか面積が由来するピークには影をつけている。Ｃｙａについて注記すべきであるが、サンプルのシグナルは検出されておらず、従って影付きのピークは、図２５Ａの左パネルにはみられない。
【０１４７】
図２６Ａ〜Ｂは、Ｂｅｃｋｍａｎでのカラム誘導体化の前後の標準アミノ酸分析方法／装置に対してアミノ酸の測定濃度を比較する。この結果は、これらの方法と極めて一致している。
【０１４８】
図２６Ａおよび図２６Ｂは、理論、およびＢｅｃｋｍａｎ Ｇｏｌｄシステムに対して代表的なタンパク質加水分解産物サンプルについて、結果を比較する。図２６Ａは、各々のアミノ酸の理論上のモルパーセント（所定のアミノ酸について最も左のバー）と、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｇｏｌｄシステムで決定したモルパーセント（所定のアミノ酸について真ん中のバー）およびＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いてこの実施例で測定したモルパーセント（所定のアミノ酸について最も右のバー）とを比較する。図２６Ｂは、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｇｏｌｄシステムで行ったタンパク質加水分解サンプルについての理論値からの変動（所定のアミノ酸について左のバー）およびＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いてこの実施例で測定した値（所定のアミノ酸について右のバー）とを比較する。本実施例からのチロシンの値（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム）は低い。なぜなら、このサンプルは、ヒドロキシルアミンでは処理されなかったからである（ヒドロキシアミンは、チロシンから望ましくない第二のｉＴＲＡＱ試薬標識を除去し得る）。
【０１４９】
【表１２】
実施例６：体液サンプル
以下の実施例は、生物学的サンプル中の遊離アミノ酸の濃度の決定を例示する。本実施例のデータは血漿サンプルに対してであるが、本発明の実施例の教示は、限定はしないが尿を含む他の体液に供され得る。本実施例の教示は、排他的ではなく、これらの実験または本発明の教示の範囲を限定するものではない。本実施例では、血漿サンプル中の４８の遊離のアミノ酸をモニターした。このモニターされたアミノ酸を表１３に列挙する。
【０１５０】
【表１３】
血漿中の１つ以上の遊離アミノ酸のモニタリングは、例えば、新生児における疾患の検出および／またはモニタリング、バイオマーカーの検出などを含むいくつかの実際的な適用を有する。例えば、新生児における特定の遊離アミノ酸は、暗示的な新生児の代謝性疾患、例えば、メチルマロン酸血症およびプロピオン酸血症などであってもよい。特定の一般的アミノ酸病（ａｍｉｎｏａｃｉｄｏｐａｔｈｉｅｓ）に関連するアミノ酸の上昇の例も表１４に列挙する。
【０１５１】
【表１４】
このような代謝性障害は、遺伝子障害のまれな群であるが、それらは、罹患した乳幼児に重篤な結果を有し得る。未処置のままであれば、これらの障害は、不可逆性の精神遅滞（軽度から重度におよぶ）、身体障害、神経学的障害、さらには致死を生じ得る。早期の検出（出生後すぐ）および正確な診断が、急速かつ有益な処置を達成するには極めて重要である。
【０１５２】
材料および方法：
体液（例えば、血漿、血清、尿）については、１部のサンプルを４部のイソプロパノールまたはエタノールと混合して、サンプル中のほとんどのタンパク質を沈殿させる。緩衝液を上清に加えて、標識反応のために塩基性ｐＨを維持する。次いで、ｉＴＲＡＱブランド試薬を添加して、室温で反応させる。次いで、このサンプルを乾燥して再溶解するか、または分析のために所望の濃度まで直接希釈する（代表的には１００ｎＬの体液が各々の分析に必要である）。サンプル標識の詳細はまた、プロトコール形式で表１５に示す。
【０１５３】
【表１５】
本実施例のデータの作成のためのサンプルホールディングおよびＬＣ／ＭＳ／ＭＳ設定のさらなる詳細は以下のとおりである。ＬＣカラム上のローディングの前に、各々のサンプルを、ｉＴＲＡＱ試薬１１７で標識した１０ｐｍｏｌｅ／μＬのアミノ酸標準を含有する４０μＬの３％ギ酸を用いて再構成した。次いで２μＬの容積を、製造業者の推奨する手順を用いてＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＭＤＭ Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ３２０００ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ装置に注入した。装置の作動条件に対する詳細は、表１６〜２６に示す。表１６および表１７の示す条件は、その装置のＬＣ部分に関連し、表１８〜２６に示す条件は、その装置のＭＳ／ＭＳ部分に関連した。
【０１５４】
【表１６】
【０１５５】
【表１７】
本実施例では、全ての遷移を施行中連続してスキャンしないように、ＭＳ／ＭＳデータ取得においては複数のピリオド（ピリオド１〜４）を用いる。あるピリオド中の遷移のみをそのピリオドの間にスキャンする。これによって、１ピークあたりより多くのデータポイントが可能になり、これでより良好な獲得が得られる。
【０１５６】
【表１８】
【０１５７】
【表１９】
【０１５８】
【表２０】
【０１５９】
【表２１】
【０１６０】
【表２２】
【０１６１】
【表２３】
【０１６２】
【表２４】
【０１６３】
【表２５】
【０１６４】
【表２６】
スペクトルおよび結果：
本実施例では、４８アミノ酸をモニターした。表２７は、各々の検出されたアミノ酸について得られたデータをまとめる。第２列は、内部標準におけるアミノ酸の量を列挙し、第３列は、外部標準スパイクにおける量、第四列は、サンプル中の測定したアミノ酸のレベルを列挙しており、第五列は、血漿コントロールの範囲を列挙する。
【０１６５】
【表２７】
実施例７；カテコールアミン
本実施例は、ｉＴＲＡＱ標識されたカテコールアミン（ＣＡＴ）のクロマトグラム分離を考察する。ＣＡＴはしばしば、尿、血漿およびＣＳＦ（脳脊髄液）のサンプルの臨床分析における目的である。血漿および尿中の慣用的な臨床分析は、例えば、腫瘍（神経芽細胞腫、フェアチトクロマ（ｐｈｅａｃｙｔｏｃｈｒｏｍａ）など）ならびにその年齢および位置を診断するために行う。ＣＡＴはまたしばしば神経伝達物質であって、ＣＳＦ中で、例えば、高血圧の薬の薬物開発における製薬産業においてモニターされる。
【０１６６】
カテコールアミンおよび関連の化合物は、重要な心血管系および代謝のエフェクターである。種々の体液中のこれらの化合物の濃度を決定することは、臨床および薬物開発の研究室において重大である。現在では、標準的な分析方法は、種々の化学的およびクロマトグラフィー干渉である傾向である。ここでは、本発明者らは、ｉＴＲＡＱ化学、１セットの４アミン反応性アイソバリック複数標識試薬を用いる単一分析におけるカテコールアミン、関連化合物およびアミノ酸の高感度の定量のための新規な方法を示す。この誘導体をＭＲＭ（複数反応モニタリング）モードにおいてＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて、分析して定量し、これによって極めて高い程度の感度および特異性を得た。
【０１６７】
本発明の実施例では、ＣＡＴ類 ヒスタミン、ノルエピネフリン、エピネフリン、メタネフリン、ドーパミンおよびセロトニンをモニターする。さらに、アミノ酸であるｇｌｕおよびｔｙｒをモニターする。
【０１６８】
材料および方法
カテコールアミン、関連の化合物およびいくつかのアミノ酸の標準混合物を調製して、標準的なプロトコールを用いてｉＴＲＡＱ試薬で標識した。誘導体は、Ｃ１８逆相カラムで、揮発性イオン対合試薬を含む水−アセトニトリル勾配を用いて、１ｍＬ／分の流速で分離した。誘導体化された標準の一連の希釈物を注入して、ＬＯＤ（検出限界）および較正曲線を種々の成分について決定した。体液サンプル（尿、ＣＳＦ、血漿）（標準の添加は有無）を、公開されたプロトコールに従って調製して、標識して分析し、この方法の感度および正確性に対するマトリクス効果を決定した。サンプルを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＭＤＳ ＳＣＩＥＸ ＡＰＩ−４０００トリプル四重極質量分析計、ＥＳＩ＋、ＭＲＭモードで分析した。
【０１６９】
結果
この結果は、以下のカテコールアミン、関連化合物およびアミノ酸を標識および定量する実現可能性を示す：ドーパ（３，４−ジヒドロキシ−ＤＬ−フェニルアラニン）、ドーパミン、エピネフリン、ノルエピネフリン、メタネフリン、ノルメタネフリン、メチルドーパ、３−メトキシチラミン、セラトニン（Ｓｅｒａｔｏｎｉｎ）、ヒスタミン、ＡＢＡ（アミノ酪酸）、チロシンおよびグルタミン酸。ＬＯＤは、抽出物提出の時点で０．００４ピコモル／μＬである。種々のサンプルについての直線性は、（Ｒ＝０．９０００〜０．９９９８）におよぶ。正確性および精度に取り組む。ベースラインの分離が、カテコールアミン異性体のドーパ（３４２／１１７）およびメタネフリン（３４２／１１７）について、ならびにエピネフリン（３２８／１１７）およびノルメタネフリン（３２８／１１７）について達成されている。
【０１７０】
実施例８
ドーパミン範囲
図２７Ａおよび図２７Ｂは、アミノ酸濃度の決定のための本発明の教示の種々の実施形態の動的な範囲および応答に対するデータを示す。図２７Ａは、約１０〜約９９０ピコモル（ｐｍｏｌｅ）というノルバリンの濃度についての応答に対するデータを示す。各々の実験（データポイント）は、３０ｐｍｏｌｅの内部標準および３通りの注射を用いる。漸増量のアミノ酸をＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムに注射して、それらの応答に対してプロットした。図２７Ａによって、その応答は、３ケタの大きさの濃度について線形であるということが示される。
【０１７１】
図２７Ｂは、約１０〜約９９０ピコモル（ｐｍｏｌｅ）というロイシンの濃度についての応答に対するデータを示す。各々の実験（データポイント）は、３０ｐｍｏｌｅの内部標準および３通りの注射を用いる。漸増量のアミノ酸をＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムに注射して、それらの応答に対してプロットした。図２９Ｂによって、その応答は、３ケタの大きさの濃度について線形であるということが示される。
【０１７２】
実施例９
生理学的な流体中のチロキシンおよび構造的に関連する甲状腺ホルモンの多重の絶対的および相対的な定量
以下の実施例は、ｉＴＲＡＱブランド試薬のセット由来のアイソバリックタグを用いるチロキシンの定量のための方法を例示する。本実施例の方法では、チロキシンは、一般式ＩＶ：
【０１７３】
【化４】
によって示され得、ここで各々のＲ１は独立してヨウ素または水素であり；かつ
Ｒ２はカルボキシル、ヒドロキシルまたはメチルである。
【０１７４】
チロキシン化合物は、甲状腺ホルモンであってもよく、それらの血中の値は、例えば、疾患の診断および予測指標として機能し得る。例えば、以下の３つのチロキシン化合物（式（ＩＶａ）−（ＩＶｃ））がしばしば疾患状態をモニタリングするために用いられる：
【０１７５】
【化５】
本実施例は、本教示の場合種々の実施形態を用いてサンプル中のチロキシンを分析するための方法を例示する。例えば、提供され得る分析物としては、限定はしないが以下が挙げられる：
１．外部較正曲線を用いる１サンプル中のチロキシンの絶対的定量。例えば、チロキシンは、ｉＴＲＡＱブランド試薬のセット由来の１１４、１１５または１１６アイソバリックタグで別々に標識されてもよく、アミノ酸標準で作成された外部較正は、ｉＴＲＡＱブランド試薬のセット由来の１１７アイソバリックタグで標識されてもよい。
【０１７６】
２．（１）において上で記載されたような外部較正曲線、ならびにｉＴＲＡＱブランド試薬のセット由来の１１７アイソバリックタグで標識されたチロキシンからなる内部標準および分析されるべきサンプルに直接添加された標識された標準を用いる１サンプル中のチロキシンの絶対的定量。
【０１７７】
３．外部較正曲線を用いる２つの異なるサンプル中のチロキシンの絶対的定量。各々のチロキシンサンプルは例えば、ｉＴＲＡＱブランド試薬のセット由来の１１４、１１５、または１１６アイソバリックタグで別々に標識されてもよい。ｉＴＲＡＱブランド試薬のセット由来の１１７アイソバリックタグで標識されたチロキシン標準を用いて、外部較正曲線を作成してもよい。２つのサンプルは、例えば、同じであって、二連のサンプルで処理されても、または異なるサンプルでもよい。
【０１７８】
４．外部較正および内部標準を用いる２つの異なるサンプル中のチロキシンの絶対的定量。チロキシン標準は、ｉＴＲＡＱブランド試薬のセット由来の１１７アイソバリックタグで標識されて、内部標準としてサンプルに添加されてもよい。２つのサンプルは、例えば、同じであって、二連のサンプルで処理されても、または異なるサンプルであってもよい。
【０１７９】
５．外部較正を用いる３つのサンプル中のチロキシンの絶対的定量。各々のチロキシンサンプルは、ｉＴＲＡＱブランド試薬のセット由来の１１７アイソバリックタグで標識されたチロキシン標準を用いて、ｉＴＲＡＱブランド試薬のセット由来の１１４、１１５、または１１６アイソバリックタグで別々に標識されてもよい。この３つのサンプルは、例えば、同じであって、三連のサンプルで処理されても、または３つのサンプルのうち２つが同じであって二連で処理されても、２つ以上の異なるサンプルであっても、またはその組み合わせでもよい。
【０１８０】
６．外部較正および内部標準を用いる３つのサンプル中のチロキシンの絶対的定量。チロキシン標準は、ｉＴＲＡＱブランド試薬のセット由来の１１７アイソバリックタグで標識されて、このサンプルに直接添加されてもよい。この３つのサンプルは、例えば、同じであって、三連で処理されても、または３つのサンプルのうち２つが同じであって二連で処置されても、２つ以上の異なるサンプルであっても、またはその組み合わせでもよい。
【０１８１】
７．外部較正曲線を用いる４つのサンプル中のチロキシンの絶対的定量。各々のチロキシンサンプルは、ｉＴＲＡＱブランド試薬のセット由来の１１４、１１５、１１６または１１７アイソバリックタグで別々に標識されてもよい。この４つのサンプルは、例えば、同じであって、四連で処理されても、または４つのサンプルのうち３つが同じであって三連で処理されても、３つのサンプルのうち２つが同じであって二連で処理されても、２つ以上の異なるサンプルであっても、またはその組み合わせでもよい。
【０１８２】
８．ｉＴＲＡＱブランド試薬のセット由来の１１４、１１５、１１６または１１７アイソバリックタグで標識された最大４つのサンプルにおけるチロキシンの相対的定量。この４つのサンプルは、例えば、同じであって、四連で処理されても、４つのサンプルのうち３つが同じであって三連で処理されても、３つのサンプルのうち２つが同じであって二連で処理されても、２つ以上の異なるサンプルであっても、またはその組み合わせでもよい。
【０１８３】
材料および方法
以下の構成要素が、生理学的な流体中でチロキシン（ＩＶａ）の絶対的定量を決定するのに用いられ得る：チロキシン標準、ｉＴＲＡＱブランド試薬のセット由来の１〜４アイソバリックタグ、オートサンプラーおよびカラムヒーター、１５０×２．１ｍｍのＣ１８逆相カラム、トリプル四重極またはＱ Ｔｒａｐテクノロジーに基づくＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムを装備したバイナリーＨＰＬＣシステム。
【０１８４】
チロキシン標準サンプルを、塩基性緩衝液（０．５Ｍの重炭酸トリエチルアンモニウムまたはホウ酸ナトリウム、ｐＨ８．５）に溶解し、ここにエタノールに溶解されたｉＴＲＡＱブランド試薬セット由来のアイソバリックタグのうちの１つを添加する（例えば、１１７アイソバリックタグ）。目的のサンプルを、塩基性緩衝液に添加して、ｉＴＲＡＱブランド試薬セット由来の異なるアイソバリックタグ（例えば、１１４、１１５または１１６アイソバリックタグ）をこのサンプルに添加する。サンプル中の総アミン含量よりも約３倍〜５倍過剰のｉＴＲＡＱブランド試薬を用いる。両方のサンプルをそれぞれのｉＴＲＡＱ試薬と３０分間、室温で反応させ、その後に適切な溶媒（例えば、０．１％ギ酸＋１０ｍＭのトルエンスルホン酸または１０ｍＭのトルエンスルホン酸または１０ｍＭのスルホン酸水素ナトリウム）に希釈して、ＰＤＩＴＭ（例えば、ＭＲＭ分析）に供する。
【０１８５】
サンプルの絶対定量は、例えば、１１７アイソバリックタグで標識された標準を用いる、較正曲線を作成するための、外部標準の使用、内部標準を得るために目的のサンプルに添加された１１７アイソバリックタグで標識された標準サンプルの使用、またはその両方によって提供され得る。
【０１８６】
ＬＣ−ＭＲＭ分析
本明細書に考察されるとおり、広範な種々の装置を用いてもよい。例えば、種々の実施形態では、実験設定は、バイナリーＨＰＬＣポンプ、オートサンプラー、カラムヒーターおよびＣ１８カラムを備える。ＨＰＬＣは、勾配条件下で２００μｌ／ｍｌの流速で作動させて、チロキシンおよび誘導体のベースライン解像を得る。ＨＰＬＣは、トリプル四重極または線形イオントラップ質量分析計のいずれかと、ＭＲＭ方式で干渉して、サンプル中のチロキシンのＰＤＴＩＭおよび定量が得られる。
【０１８７】
限定はしないが、特許、特許出願、記事、本、論文およびウェブページを含む本出願に引用される全ての文献および同様の資料は、このような文献および同様の資料の形式にかかわらず、その全体が参照によって明らかに援用される。組み込まれる文献および同様の資料のうちの１つ以上が、限定はしないが規定される用語、用語の用法、記載される技術などを含む本出願と異なるかまたは矛盾する事象では、本出願が支配する。
【０１８８】
本明細書に用いられる見出しは、組織化の目的に過ぎず、記載される主題を限定するとは決して解釈されるべきではない。
【０１８９】
本発明の教示は、種々の実施形態および実施例と組み合わせて記載してきたが、本発明の教示は、このような実施形態または実施例に限定されるものではない。逆に、本教示は、当業者によって理解されるとおり、種々の代替、改変および等価物を包含する。
【０１９０】
本教示は、特定の例示的実施例を参照して特に示されかつ記載されてきたが、形態および詳細における種々の変化が、本教示の趣旨および範囲から逸脱することなくなされ得るということが理解されるべきである。例えば、任意の開示された工程を、任意の他の開示された工程と組み合わせて、本発明の種々の実施形態に従ってアミン含有化合物を分析する方法を得てもよい。従って、本教示の趣旨および範囲内の全ての実施形態、ならびにその等価物が特許請求される。本教示の方法、システムおよびアッセイの説明および図表は、その効果について言及するのでない限り、構成要素の記載された順序を限定すると判断されるべきではない。
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２００６年２月８日に出願された、表題「Ａｍｉｎｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ」の米国出願第１１／３５０，１４７号の一部継続であり、かつその利益およびそれへの優先権を主張する。米国出願第１１／３５０，１４７号は、２００５年２月９日に出願された、表題「Ａｍｉｎｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ」の米国仮出願第６０／６５１，７３４号の利益およびそれへの優先権を主張する。これらの各々の全体の開示は、参考として本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
導入
アミン含有化合物は、重要な生物学的および医薬化合物である。アミン含有化合物の例としては、タンパク質、ペプチド、ポリアミン、アミノ酸、カテコールアミンおよびニトロフラン代謝物が挙げられる。アミン含有化合物の定量のための現在の方法としては、市外（ＵＶ）蛍光または電気化学的検出によるハイパフォーマンス液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、液体クロマトグラフィーと質量分析の組み合わせ（ＬＣ／ＭＳ）、およびタンデム型質量分析（ＭＳ／ＭＳ）が挙げられる。
【０００３】
上述の方法によるアミン含有化合物の絶対的定量は、問題があり得る。例えば、ＨＰＬＣによって多くのアミン含有化合物を分析するために、困難かつ時間を浪費する誘導体化工程は、分析を行う前に行わなければならない。さらに、ＨＰＬＣは、長い分析時間、泳動間の偏差の高さ、多重化能力の欠如、および非特異性という欠点を有する。
【０００４】
アミン含有化合物の検出および定量のためのＬＣ／ＭＳおよびＭＳ／ＭＳのさらに近年の使用によって、増大した感度および特異性、ならびに１サンプルで複数のアミン含有化合物を迅速に測定する能力という利点がもたらされる；しかし、これらの技術はまた、多重化能力を欠く。絶対的な定量を行うために、高価な同位体濃縮化合物を内部標準として用いるが、これはいくつかのタンデム質量分析法とは適合しない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
要旨
本発明の教示は、アイソバリック標識および親・娘イオン遷移モニタリング（ＰＤＩＴＭ）を用いる１つ以上のサンプル中の１つ以上のアミン含有化合物の分析のための方法を提供する。種々の局面では、本発明の教示は、１つ以上のサンプル中の１つ以上のアミン含有化合物の相対的な濃度、絶対的な濃度またはその両方を決定するための方法を提供する。種々の実施形態では、本発明の教示は、サンプル中の複数のアミン含有化合物、複数のサンプル中の１つ以上のアミン含有化合物、またはその組み合わせの相対的濃度、絶対的濃度、またはその両方が複数の方式で決定され得る方法を提供する。
【０００６】
アミン含有化合物（本発明の教示の種々の実施形態が提供され得る）は、広範な種々の供給源、例えば、生理学的な流体サンプル、細胞または組織溶解サンプル、タンパク質サンプル、細胞培養サンプル、ファーメンテーションブロス培地サンプル、農産物サンプル、畜産物サンプル、動物給餌サンプル、ヒト消費のための食品または飲料のサンプル、およびそれらの組み合わせなどから生じ得る。本発明の教示は、種々の実施形態では、限定はしないが、アミノ酸、カテコールアミン、ニトロフラン代謝物、ポリアミン、ペプチド、タンパク質、ポリペプチド、およびそれらの組み合わせを含む広範な種々の一級アミン含有化合物に適用され得る。
【０００７】
「アイソバリック標識のセット（ｓｅｔ ｏｆ ｉｓｏｂａｒｉｃ ｌａｂｅｌｓ）」、「アイソバリックタグのセット（ｓｅｔ ｏｆ ｉｓｏｂａｒｉｃ ｔａｇｓ）」という句は交換可能に用いられて、例えば、試薬または化学部分のセットであって、このセットのメンバー（すなわち、個々の「アイソバリック標識」または「アイソバリックタグ」）が実質的に同じ質量を有するが、このセットの各々のメンバーが、イオンフラグメンテーション（例えば、衝突誘起解離（ＣＩＤ）、光誘起解離（ＰＩＤ）などによる）に供される際に異なる娘イオンシグナルを生じ得るセットをいう。セットのメンバーの間を識別するために用いられ得るアイソバリックタグまたは標識の娘イオンは、アイソバリックタグまたは標識のレポーターイオンと呼ばれ得る。種々の実施形態では、１セットのアイソバリックタグは、フラグメンテーションの非存在において実質的にクロマトグラフィーとして識別可能であり、かつ実質的に識別不能な質量分析であり、ただしＣＩＤ後に強力な低質量ＭＳ／ＭＳサインのイオンを生じる、アミン誘導体化アミン含有化合物を含む。
【０００８】
「親・娘イオン遷移モニタリング」または「ＰＤＩＴＭ」という用語は、例えば、質量分析を用いる測定であって、それによって、第一の質量分離器（しばしば第一次元の質量分析と呼ばれる）の伝送質量対電荷（ｍ／ｚ）範囲は、イオン分裂器（ｆｒａｇｍｅｎｔｏｒ）（例えば、衝突セル、光解離領域など）に分子イオン（しばしば、「親イオン」または「前駆体イオン」と呼ばれる）を伝送してフラグメントイオン（しばしば「娘イオン」と呼ばれる）を生じるように選択され、第二の質量分離器（しばしば第二次元の質量分析と呼ばれる）の伝送ｍ／ｚ範囲は、検出器（これが娘イオンシグナルを測定する）に対して１つ以上の娘イオンを伝送するように選択される、測定のことをいう。モニターされた親イオンおよび娘イオンの質量の組み合わせは、モニターされた「親・娘イオン遷移」と呼ばれてもよい。モニターされる所定の親イオン−娘イオンの組み合わせについての検出器での娘イオンシグナルは、「親・娘イオン遷移シグナル」と呼ばれてもよい。本発明の教示の種々の実施形態では、親のイオンは、アイソバリックタグで標識されたアミン含有化合物であって、娘イオンは、アイソバリックタグのレポーターイオンである；従って、所定のアイソバリック標識されたアミン含有化合物親イオンについての検出器で測定されるレポーターイオンのイオンシグナルは、「アミン含有化合物−レポーターイオン遷移シグナル」と呼ばれてもよい。同様に、所定のアイソバリック標識された標準化合物についての検出器で測定されるレポーターイオンのイオンシグナルは、「標準化合物−レポーターイオン遷移シグナル」と呼ばれてもよい。
【０００９】
例えば、親・娘イオン遷移モニタリングの１実施形態は、多重反応モニタリング（ＭＥＭ）（選択反応モニタリングとも呼ばれる）である。ＭＲＭの種々の実施形態では、所定の親・娘イオン遷移のモニタリングは、目的の親イオンを伝送するために第一の質量分離器（例えば、目的の親イオンｍ／ｚに置かれた第一の四重極）として用いる工程と、目的の１つ以上の娘イオンを伝送するために第二の質量分離器（例えば、目的の娘イオンｍ／ｚに置かれた第二の四重極）を用いる工程とを包含する。種々の実施形態では、親イオンを伝送するために第一の質量分離器（例えば、目的の親イオンｍ／ｚに停留された四重極）を用いること、および目的の１つ以上の娘イオンのｍ／ｚ値を含むｍ／ｚ範囲にわたって第二の質量分離器をスキャンすることによって、ＰＤＩＴＭを行ってもよい。
【００１０】
例えば、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）装置、またはさらに一般的には、多次元質量分析（ＭＳｎ）装置を用いて、ＰＤＩＴＭ、例えば、ＭＲＭを行ってもよい。適切な質量分析システムの例としては、限定はしないが、トリプル四重極、四重極線形イオントラップ、四重極ＴＯＦおよびＴＯＦ−ＴＯＦのうちの１つ以上を含むシステムが挙げられる。
【００１１】
種々の局面では、本発明の教示は、アイソバリック標識および親・娘イオン遷移モニタリング（ＰＤＩＴＭ）を用いて１つ以上のサンプル中で１つ以上のアミン含有化合物を分析するための方法を提供する。種々の実施形態では、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）１セットのアイソバリックタグ由来の異なるアイソバリックタグで１つ以上のアミン含有化合物を標識する工程であって、アイソバリックタグのセット由来の各々のアイソバリックタグがレポーターイオン部分を含む工程と；（ｂ）このアイソバリックに標識されたアミン含有化合物の各々の少なくとも一部を合わせて、合わされたサンプルを生成する工程と；（ｃ）この合わせたサンプルの少なくとも一部を親・娘イオン遷移モニタリングに対して供する工程と；（ｄ）１つ以上の遷移されたレポーターイオンのイオンシグナルを測定する工程と；（ｅ）標準化合物の１つ以上の測定されたイオンシグナルに対する、対応するレポーターイオンの測定されたイオンシグナルの比較に少なくとも基づいた、アイソバリックに標識されたアミン含有化合物の１つ以上の濃度を決定する工程と。従って、種々の実施形態では、複数のアミン含有化合物の濃度は、多重方式で、例えば、２つ以上のアイソバリックに標識されたアミン含有化合物を合わせて、合わされたサンプルを生成すること、およびこの合わされたサンプルをＰＤＩＴＭ（ここで２つ以上のアイソバリックに標識されたアミン含有化合物の２つ以上のレポーターイオンがモニターされる）に供することによって決定され得る。
【００１２】
種々の局面では、以下の工程を含む１つ以上のサンプル中で１つ以上のアミン含有化合物を分析するための方法が提供される：（ａ）標準化合物を提供する工程と；（ｂ）１セットのアイソバリックタグ由来のアイソバリックタグでこの標準化合物を標識する工程と；（ｃ）このセットのアイソバリックタグ由来の異なるアイソバリックタグで１つ以上のチロキシン化合物を標識する工程と；（ｄ）このアイソバリックに標識された標準化合物の少なくとも一部と、このアイソバリックに標識されたアミン含有化合物の各々の少なくとも一部とを合わせて、合わされたサンプルを生成する工程と；（ｅ）この合わせたサンプルの少なくとも一部をクロマトグラフィーカラムにロードする工程と；（ｆ）このクロマトグラフィーカラムからの溶離液の少なくとも一部を親・娘イオン遷移モニタリングに対して供する工程と；（ｇ）１つ以上の伝送レポーターイオンのイオンシグナルを測定する工程と；（ｈ）アイソバリックに標識された標準化合物に対応するレポーターイオンの測定されたイオンシグナルに対する、対応するレポーターイオンの測定されたイオンシグナルの比較に少なくとも基づいた、目的のアミン含有化合物の１つ以上の濃度を決定する工程。
【００１３】
種々の局面では、以下の工程を包含する１つ以上のサンプル中で１つ以上のアミン含有化合物を分析するための方法が提供される：（ａ）１セットのアイソバリックタグ由来の種々のアイソバリックタグで１つ以上のアミン含有化合物の各々を標識する工程と；（ｂ）このアイソバリックに標識されたアミン含有化合物の各々の少なくとも一部を合わせて、合わされたサンプルを生成する工程と；（ｃ）この合わせたサンプルの少なくとも一部をクロマトグラフィーカラムにロードする工程と；（ｄ）このクロマトグラフィーカラムからの溶離液の少なくとも一部を親・娘イオン遷移モニタリングに対して供する工程と；（ｅ）１つ以上の伝送レポーターイオンのイオンシグナルを測定する工程と；（ｆ）標準化合物の濃度曲線に対する対応するレポーターイオンの測定されたイオンシグナルの比較に少なくとも基づいた、アイソバリックに標識されたアミン含有化合物の１つ以上の濃度を決定する工程。
【００１４】
種々の局面では、以下の工程を包含する１つ以上のサンプル中で１つ以上のアミン含有化合物を分析するための方法が提供される：（ａ）１セットのアイソバリックタグ由来の種々のアイソバリックタグで１つ以上のアミン含有化合物の各々を標識する工程と；（ｂ）このアイソバリックに標識されたアミン含有化合物の各々の少なくとも一部を合わせて、合わされたサンプルを生成する工程と；（ｃ）この合わせたサンプルの少なくとも一部をマトリックス支援レーザー脱離イオン化を用いる、親・娘イオン遷移モニタリングに供する工程と；（ｄ）１つ以上の伝送レポーターイオンのイオンシグナルを測定する工程と；（ｅ）標準化合物の測定されたイオンシグナルに対する対応するレポーターイオンの測定されたイオンシグナルの比較に少なくとも基づいた、アイソバリックに標識されたアミン含有化合物の１つ以上の濃度を決定する工程。
【００１５】
種々の実施形態では、標準化合物の濃度曲線は、以下の工程によって生成されてもよい：（ａ）第一の濃度を有する標準化合物を提供する工程と；（ｂ）イソバリックタグのセット由来のイソバリックタグで標準化合物を標識する工程と；（ｃ）このアイソバリックに標識された標準化合物の少なくとも一部をクロマトグラフィーカラムにロードする工程と；（ｄ）このクロマトグラフィーカラムからの溶離液の少なくとも一部を親・娘イオン遷移モニタリングに対して供する工程と；（ｅ）この伝送レポーターイオンのイオンシグナルを測定する工程と；（ｆ）１つ以上の異なる標準化合物濃度について、工程（ａ）〜（ｅ）を反復する工程と；（ｇ）２つ以上の標準化合物濃度で伝送レポーターイオンの測定されたイオンシグナルに少なくとも基づいて、標準化合物について濃度曲線を作成する工程。
【００１６】
種々の実施形態では、１つ以上のアイソバリックに標識されたアミン含有化合物の濃度を決定する工程は、アイソバリックに標識されたアミン含有化合物のうち１つ以上の絶対濃度を決定する工程を包含する。
【００１７】
例えば、同位体濃縮アミノ酸を、アミノ酸濃度の絶対値定量のための内部標準として用いてもよいが、ＭＡＬＤＩ質量分析におけるアミノ酸の安定な同位体アナログを用いることの１つの欠点は、ある場合には、マトリックス関連シグナルが、目的のアミノ酸のｍ／ｚ領域で干渉し得るということである。例えば、ほぼｍ／ｚ＝１４７でのシアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）関連シグナルは、リジンおよびその安定な同位体アナログを妨げ得、同様に、ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）関連シグナルは約ｍ／ｚ＝１７５で、アルギニンおよびその安定な同位体アナログを妨げ得る。種々の実施形態では、本発明の教示は、アイソバリックタグおよびＰＤＩＴＭを用いる方法を提供し、これによって、内部標準または目的のアミン含有化合物由来のシグナルでのマトリックス関連シグナルの妨害を軽減することが容易になる。
【００１８】
種々の実施形態では、目的の１つ以上のアミン含有化合物は、１つ以上のリジン、リジンの異性体および翻訳後修飾リジンを含み、そしてこのマトリックスは、シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）を含む。種々の実施形態では、目的の１つ以上のアミン含有化合物は、１つ以上のアルギニン、異性体またはアルギニン、翻訳後修飾アルギニンおよびそれらの組み合わせを含み、このマトリックスは、ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）を含む。
【００１９】
種々の局面では、１つ以上のサンプル中の目的のアミン含有化合物の存在を決定するように設計されたアッセイが提供される。このアッセイは、例えば、薬物開発または診断アッセイのために、種々の生化学的経路の開発を補助するために用いられるバイオマーカー・バリデーション・アッセイであってもよい。このアッセイは、例えば、疾患もしくは状態の診断、疾患もしくは状態の予後予測、またはその両方であり得る。
【００２０】
種々の局面では、本発明の教示は、コンピューター読み取り可能な媒体、例えば、限定はしないが、フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスク、光ディスク、磁気テープ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＣＤ−ＲＯＭまたはＤＶＤ−ＲＯＭ上でコンピューター読み取り可能な指示として本発明の教示の方法の機能が組み込まれる、製造業者の品目を提供する。
【００２１】
教示の前述および他の局面、実施形態および特徴は、添付の図面と組み合わせて以下の説明からより完全に理解され得る。この図面では、同様の参照文字は一般に、種々の図面全体を通じて同様の特徴および構造的要素を指す。図面は、必ずしも尺度はないが、本教示の原理を図示する際に代わりに強調される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】１つ以上のサンプル中で１つ以上のアミン含有化合物を分析する方法の種々の実施形態の模式図である。
【図２】アイソバリックタグの種々の実施形態を模式的に図示する。
【図３】複数のサンプルタイプを用いる種々の実施形態の模式図である。
【図４Ａ】ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬を用いる、アイソバリックに標識する工程の種々の実施形態を図示する。
【図４Ｂ】ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬を用いる、アイソバリックに標識する工程の種々の実施形態を図示する。
【図５】合わせたサンプル中で標準化合物を用いる種々の実施形態の模式図である。
【図６Ａ】未標識のプトレシン（ｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅ）およびｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬で標識されたプトレシンの構造を模式的に示す。
【図６Ｂ】ＰＤＩＴＭの前後のアイソバリックに標識されたプトレセン（ｐｕｔｒｅｓｃｅｎｅ）の質量スペクトルを示す。
【図６Ｃ】ＰＤＩＴＭの前後のアイソバリックに標識されたプトレセン（ｐｕｔｒｅｓｃｅｎｅ）の質量スペクトルを示す。
【図７Ａ】未標識のカドベリンおよびｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬で標識されたカドベリンの構造を模式的に示す。
【図７Ｂ】ＰＤＩＴＭの前後のアイソバリックに標識されたカドベリンの質量スペクトルを示す。
【図７Ｃ】ＰＤＩＴＭの前後のアイソバリックに標識されたカドベリンの質量スペクトルを示す。
【図８Ａ】未標識の１，７−ジアミノヘプタンおよびｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬で標識された１，７−ジアミノヘプタンの構造を模式的に示す。
【図８Ｂ】ＰＤＩＴＭの前後のアイソバリックに標識された１，７−ジアミノヘプタンの質量スペクトルを示す。
【図８Ｃ】ＰＤＩＴＭの前後のアイソバリックに標識された１，７−ジアミノヘプタンの質量スペクトルを示す。
【図９Ａ】未標識のスペルミジンおよびｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬で標識されたスペルミジンの構造を模式的に示す。
【図９Ｂ】ＰＤＩＴＭの前後のアイソバリックに標識されたスペルミジンの質量スペクトルを示す。
【図９Ｃ】ＰＤＩＴＭの前後のアイソバリックに標識されたスペルミジンの質量スペクトルを示す。
【図９Ｄ】ＰＤＩＴＭの前後のアイソバリックに標識されたスペルミジンの質量スペクトルを示す。
【図１０Ａ】未標識のスペルミンおよびｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬で標識されたスペルミンの構造を模式的に示す。
【図１０Ｂ】ＰＤＩＴＭの前後のアイソバリックに標識されたスペルミンの質量スペクトルを示す。
【図１０Ｃ】ＰＤＩＴＭの前後のアイソバリックに標識されたスペルミンの質量スペクトルを示す。
【図１０Ｄ】ＰＤＩＴＭの前後のアイソバリックに標識されたスペルミンの質量スペクトルを示す。
【図１１】１セットのアイソバリックタグ由来の種々のアイソバリックタグで各々標識された各ポリアミンの混合物の液体クロマトグラフィーを模式的に示す。
【図１２】図１２Ａは、ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬で標識されたプトレセン（ｐｕｔｒｅｓｃｅｎｅ）のクロマトグラムを模式的に示す。図１２Ｂは、ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬で標識されたカドベリンのクロマトグラムを模式的に示す。図１２Ｃは、ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬で標識された１，７−ジアミノヘプタンのクロマトグラムを模式的に示す。
【図１３】１セットのアイソバリックタグ由来の種々のアイソバリックタグで各々標識されたポリアミンの混合物のクロマトグラムを模式的に示す。
【図１４】ＡＣＮおよびＨＣＣＡを含むマトリックスのサンプルの直交ＭＡＬＤＩ（Ｏ−ＭＡＬＤＩ）バックグラウンド質量スペクトルを示す。
【図１５】ＡＣＮおよびＨＣＣＡのマトリックスにおける実施例４の４つのポリアミンのＯ−ＭＡＬＤＩ質量スペクトルを示す。
【図１６Ａ】未標識のプトレセン（ｐｕｔｒｅｓｃｅｎｅ）およびｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬で標識されたプトレセンの構造を模式的に示す。
【図１６Ｂ】ＰＤＩＴＭの後のアイソバリックに標識されたプトレセンのＯ−ＭＡＬＤＩ質量スペクトルを示す。
【図１７Ａ】未標識のカドベリンおよびｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬で標識されたカドベリンの構造を模式的に示す。
【図１７Ｂ】ＰＤＩＴＭの後のアイソバリックに標識されたカドベリンのＯ−ＭＡＬＤＩ質量スペクトルを示す。
【図１８Ａ】未標識の１，７−ジアミノヘプタンおよびｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬で標識された１，７−ジアミノヘプタンの構造を模式的に示す。
【図１８Ｂ】ＰＤＩＴＭの後のアイソバリックに標識された１，７−ジアミノヘプタンのＯ−ＭＡＬＤＩ質量スペクトルを示す。
【図１９Ａ】未標識のスペルミジンおよびｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬で標識されたスペルミジンの構造を模式的に示す。
【図１９Ｂ】ＰＤＩＴＭの後のアイソバリックに標識されたスペルミジンのＯ−ＭＡＬＤＩ質量スペクトルを示す。
【図２０Ａ】未標識のスペルミンおよびｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬で標識されたスペルミンの構造を模式的に示す。
【図２０Ｂ】ＰＤＩＴＭの後のアイソバリックに標識されたスペルミンのＯ−ＭＡＬＤＩ質量スペクトルを示す。
【図２１Ａ】未標識のスペルミンおよびｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬で標識されたスペルミンの構造を模式的に示す。
【図２１Ｂ】ＰＤＩＴＭの後のＯ−ＭＡＬＤＩ質量スペクトルを示す。
【図２１Ｃ】ＰＤＩＴＭの後のＯ−ＭＡＬＤＩ質量スペクトルを示す。
【図２２Ａ】未標識のスペルミンおよびｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬で標識されたスペルミンの構造を模式的に示す。
【図２２Ｂ】ＰＤＩＴＭの後のアイソバリックに標識されたスペルミンのＯ−ＭＡＬＤＩ質量スペクトルを示す。
【図２３】図２３は標識アミノ酸の混合物のクロマトグラムを模式的に示す。
【図２４】図２４は実施例５の標識されたアミノ酸の混合物のサンプルの総イオン電流（ＴＩＣ）クロマトグラムを模式的に示す。
【図２５Ａ】実施例５で測定した種々のアミノ酸のＰＤＩＴＭスペクトルを模式的に示す。
【図２５Ｂ】実施例５で測定した種々のアミノ酸のＰＤＩＴＭスペクトルを模式的に示す。
【図２５Ｃ】実施例５で測定した種々のアミノ酸のＰＤＩＴＭスペクトルを模式的に示す。
【図２５Ｄ】実施例５で測定した種々のアミノ酸のＰＤＩＴＭスペクトルを模式的に示す。
【図２５Ｅ】実施例５で測定した種々のアミノ酸のＰＤＩＴＭスペクトルを模式的に示す。
【図２５Ｆ】実施例５で測定した種々のアミノ酸のＰＤＩＴＭスペクトルを模式的に示す。
【図２５Ｇ】実施例５で測定した種々のアミノ酸のＰＤＩＴＭスペクトルを模式的に示す。
【図２５Ｈ】実施例５で測定した種々のアミノ酸のＰＤＩＴＭスペクトルを模式的に示す。
【図２５Ｉ】実施例５で測定した種々のアミノ酸のＰＤＩＴＭスペクトルを模式的に示す。
【図２５Ｊ】実施例５で測定した種々のアミノ酸のＰＤＩＴＭスペクトルを模式的に示す。
【図２５Ｋ】実施例５で測定した種々のアミノ酸のＰＤＩＴＭスペクトルを模式的に示す。
【図２５Ｌ】実施例５で測定した種々のアミノ酸のＰＤＩＴＭスペクトルを模式的に示す。
【図２５Ｍ】実施例５で測定した種々のアミノ酸のＰＤＩＴＭスペクトルを模式的に示す。
【図２５Ｎ】実施例５で測定した種々のアミノ酸のＰＤＩＴＭスペクトルを模式的に示す。
【図２５Ｏ】実施例５で測定した種々のアミノ酸のＰＤＩＴＭスペクトルを模式的に示す。
【図２５Ｐ】実施例５で測定した種々のアミノ酸のＰＤＩＴＭスペクトルを模式的に示す。
【図２５Ｑ】実施例５で測定した種々のアミノ酸のＰＤＩＴＭスペクトルを模式的に示す。
【図２５Ｒ】実施例５で測定した種々のアミノ酸のＰＤＩＴＭスペクトルを模式的に示す。
【図２５Ｓ】実施例５で測定した種々のアミノ酸のＰＤＩＴＭスペクトルを模式的に示す。
【図２５Ｔ】実施例５で測定した種々のアミノ酸のＰＤＩＴＭスペクトルを模式的に示す。
【図２５Ｕ】実施例５で測定した種々のアミノ酸のＰＤＩＴＭスペクトルを模式的に示す。
【図２６】図２６Ａは、理論および種々の他の測定システムに対して、実施例５の測定されたアミノ酸濃度を比較するデータを示す。図２６Ｂは、理論および種々の他の測定システムに対して、実施例５の測定されたアミノ酸濃度を比較するデータを示す。
【図２７Ａ】アミノ酸濃度の決定のための本発明の教示の種々の実施形態のダイナミック・レンジおよび応答に対するデータを示す。
【図２７Ｂ】アミノ酸濃度の決定のための本発明の教示の種々の実施形態のダイナミック・レンジおよび応答に対するデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
種々の実施形態の説明
種々の局面では、本発明の教示は、アイソバリック標識および親・娘イオン遷移モニタリング（ＰＤＩＴＭ）を用いて１つ以上のサンプル中で１つ以上のアミン含有化合物を分析するための方法を提供する。種々の実施形態では、本発明の教示は、１つ以上のアミン含有化合物の濃度を決定するための方法を提供する。例えば、図１を参照すれば、種々の実施形態では、ある方法は、１セットのアイソバリックタグ由来の異なるアイソバリックタグで１つ以上のアミン含有化合物を各々標識する工程（工程１１０）であって、アイソバリックタグのセット由来の各々のアイソバリックタグが、レポーターイオン部分を含む工程と；このアイソバリックに標識されたアミン含有化合物の各々の少なくとも一部を合わせて、合わされたサンプルを生成する工程（工程１２０）と、この合わせたサンプルの少なくとも一部を親・娘イオン遷移モニタリングに対して供する工程（ここでこの伝送親イオンｍ／ｚ範囲はこのアイソバリックに標識されたアミン含有化合物のｍ／ｚ値を含み、かつこの伝送娘イオンｍ／ｚ範囲がこのアイソバリックに標識されたアミン含有化合物のアイソバリックタグに対応するレポーターイオンのｍ／ｚ値を含む）と、この伝送レポーターイオンの１つ以上のイオンシグナルを測定する工程（工程１３０）と；次いで、標準化合物の１つ以上の測定されたイオンシグナルに対する対応するレポーターイオンの測定されたイオンシグナルの比較に少なくとも基づいた、アイソバリックに標識されたアミン含有化合物の１つ以上の濃度を決定する工程（工程１４０)と、を包含する。このイオンシグナルは、例えば、イオンピーク、イオンピークの領域、またはそれらの組み合わせの強度（平均、平均値、最大値など）に基づいてもよい。
【００２４】
種々の実施形態では、ＰＤＩＴＭは、第一の質量分離器、ならびにイオン分裂器および第二の質量分離器を備える質量分析システムで行われてもよい。ＰＤＩＴＭスキャンの伝送親イオンｍ／ｚ範囲（第一の質量分離器によって選択される）は、アイソバリックに標識されたアミン含有化合物の１つ以上のｍ／ｚ値を含むように選択し、ＰＤＩＴＭスキャンの伝送娘イオンｍ／ｚ範囲（第二の質量分離器によって選択される）は、伝送アミン含有化合物に対応するレポーターイオンの１つ以上のｍ／ｚ値を含むように選択する。
【００２５】
種々の実施形態では、１つ以上のアミン含有サンプルを、例えば、１つの実験的測定の中で以下が可能となるように１セットのアイソバリックタグから選択された１つ以上のアイソバリックタグで標識する：（ｉ）異なるサンプル（例えば、コントロール、処理サンプル）からの複数のアミン含有化合物が比較され得る；（ｉｉ）複数の濃度測定が、同じサンプル由来の同じアミン含有化合物で決定され得る；（ｉｉｉ）ガン組織の種々の単離物が、正常な組織に対して評価され得る；（ｉｖ）抗生物質の混入した食物または飲料を、抗生物質の混入していない食物または飲料に対して評価し得る；（ｖ）食物または飲料の種々のサンプルの間の香味の傾向を比較し得る；（ｖｉ）ファーメンテーションの進行がモニタリングされ得る。
【００２６】
再度図１を参照すれば、種々の実施形態では、上記の合わせたサンプルの少なくとも一部をＰＤＩＴＭに対して供する工程は、この合わせたサンプルを、例えば、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）イオン源を用いるこの合わせたサンプルの適切な溶液中に導入、この合わせたサンプルと適切なマトリックスとを混合すること、および適切なマトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）イオン源を用いてサンプルを導入することによって、質量分析システム中に直接導入する工程（ワークフロー経路１２１および工程１３０）を包含する。
【００２７】
再度図１を参照すれば、種々の実施形態では、上記の合わせたサンプルの少なくとも一部をＰＤＩＴＭに対して供する工程は、この合わせたサンプルの一部を、クロマトグラフィーカラム（例えば、ＬＣカラム、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）カラム、またはその組み合わせ）にロードする工程（ワークフロー経路１２２および工程１２５）と、このクロマトグラフィーカラムからの溶離液の少なくとも一部を親・娘イオン遷移モニタリングに対して供する工程と、１つ以上の伝送レポーターイオンのイオンシグナルを測定する工程（ワークフロー経路１２３および工程１３０）と、を包含する。
【００２８】
種々の実施形態では、この合わせたサンプルを、浄化して（例えば、干渉サンプル、緩衝液アーチファクトなどを例えば除去する；高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣ、交換分画、陽イオン交換、高分解能陽イオン交換など、およびそれらの組み合わせによって）、その後に、これを用いてレポーターイオンシグナルを測定する。
【００２９】
種々の実施形態では、アミン含有化合物の濃度は、対応するアミン含有化合物−レポーターイオン遷移の測定されたイオンシグナル（アミン含有化合物−レポーターイオン遷移シグナル）を以下のうちの１つ以上に対して比較することによって決定される：
（ｉ）標準化合物−レポーターイオン遷移についての濃度曲線；および
（ｉｉ）アミン含有化合物を含む合わせたサンプル中の標準化合物についての標準化合物−レポーターイオン遷移シグナル。
【００３０】
再度図１を参照すれば、アイソバリックに標識されたアミン含有化合物の１つ以上の濃度を決定するという工程（工程１４０）で用いられる標準化合物の１つ以上の測定されたイオンシグナルを、多くの方法で提供してもよい。種々の実施形態では、１つ以上の標準化合物を、アイソバリックタグのセット由来のアイソバリックタグで標識し、１つ以上のアイソバリックに標識された標準化合物の１つ以上の少なくとも一部を、アイソバリックに標識されたアミン含有化合物の各々の少なくとも一部と合わせて、合わせたサンプルを生成する（工程１５０）；続いて、この合わせたサンプルの少なくとも一部をＰＤＩＴＭに供し、伝送レポーターイオンのうちの１つ以上のイオンシグナルを測定する（工程１３０）。
【００３１】
次いで、この合わせたサンプル中のアイソバリックに標識された標準化合物のうち１つ以上のうちの１つ以上に対応するレポーターイオンの１つ以上の測定されたイオンシグナルを、アイソバリックに標識されたアミン含有化合物のうちの１つ以上の濃度を決定するのに用いてもよい。従って、種々の実施形態では、アイソバリックに標識されたアミン含有化合物の濃度を決定する工程は、この合わせたサンプル中のアイソバリックに標識された標準化合物の１つ以上のうちの１つ以上に対応する１つ以上のレポーターイオンの測定されたイオンシグナルに対する、対応するレポーターイオンの測定されたイオンシグナルの比較（工程１４０）に少なくとも基づいている。この合わせたサンプルの少なくとも一部をＰＤＩＴＭに対して供する工程は、例えば、質量分析システムへの直接導入（ワークフロー経路１５２および工程１３０）；この合わせたサンプルの少なくとも一部をクロマトグラフィーカラムへ最初にロードする工程（ワークフロー経路１５３および工程１２５）、続いてクロマトグラフィーカラムからの溶離液の少なくとも一部をＰＤＩＴＭに対して供する工程と、１つ以上の伝送レポーターイオンのイオンシグナルを測定する工程（ワークフロー経路１２３および工程１３０）；またはそれらの組み合わせを包含し得る。
【００３２】
種々の実施形態では、アイソバリックに標識されたアミン含有化合物の１つ以上の濃度を決定する工程（工程１４０）は、１つ以上の標準化合物の１つ以上の濃度曲線に対応する１つ以上のレポーターイオンの測定されたイオンシグナルに対する、対応するレポーターイオンの測定されたイオンシグナルの比較に少なくとも基づく。種々の実施形態では、第一の濃度を有する標準化合物が提供され（工程１６０）、アイソバリックタグのセット由来のアイソバリックタグで標識される（工程１７０）。アイソバリックに標識された標準化合物の少なくとも一部を、親・娘イオン遷移モニタリング（ここで伝送親イオンｍ／ｚ範囲は、アイソバリックに標識された標準化合物のｍ／ｚ値を含み、伝送娘イオンｍ／ｚ範囲は、アイソバリックに標識された標準化合物のアイソバリックタグに対応するレポーターイオンのｍ／ｚ値を含む）に供し、レポーターイオンのイオンシグナルが測定される（工程１８０）。標識の工程（工程１７０）およびＰＤＩＴＭの工程および伝送レポーターイオンのイオンシグナルを測定する工程（工程１８０）を、第一の濃度とは異なる少なくとも一つ以上の標準化合物濃度について繰り返して、標準化合物についての濃度曲線を作成する（工程１９０）。
【００３３】
アイソバリックに標識された標準化合物の少なくとも一部をＰＤＩＴＭに対して供する工程は、例えば、質量分析システムへの直接導入（ワークフロー経路１７１および工程１８０）（例えば、ＥＳＩイオン源を用いる適切な溶液中への合わせたサンプルの導入、この合わせたサンプルと適切なマトリックスと混合すること、および適切なＭＡＬＤＩイオン源を用いてサンプルを導入することによる）と；この合わせたサンプルの少なくとも一部をクロマトグラフィーカラムに最初にロードする工程（ワークフロー経路１７２および工程１７５）、続いてクロマトグラフィーカラムからの溶離液の少なくとも一部をＰＤＩＴＭに対して供する工程と、１つ以上の伝送レポーターイオンのイオンシグナルを測定する工程（ワークフロー経路１７３および工程１８０）；またはそれらの組み合わせを包含する。
【００３４】
種々の実施形態では、標準化合物に対するＰＤＩＴＭを、第一の質量分離器、およびイオン分裂器および第二の質量分離器を備える質量分析系で行ってもよい。ＰＤＩＴＭスキャンの伝送親イオンｍ／ｚ範囲（第一質量分離器によって選択される）を、アイソバリックに標識された標準化合物の１つ以上のｍ／ｚ値を含むように選択し、ＰＤＩＴＭスキャンの伝送娘イオンｍ／ｚ範囲（第二質量分離器によって選択される）を、伝送標準化合物に対応するレポーターイオンの１つ以上のｍ／ｚ値を含むように選択する。
【００３５】
種々の実施形態では、濃度曲線の作成には、例えば、濃度決定を促進し、注射容積における相違を説明するためなどのために、標準化合物の少なくとも一部に含まれる１つ以上の内部標準を用いてもよい。
【００３６】
種々の実施形態では、濃度曲線は、対応する標準化合物と関連するレポーターイオンのイオンシグナルを測定するためにＰＤＩＴＭを用いること、および濃度ゼロがレポーターイオンシグナルゼロに対応するような、測定された濃度の線形外挿法によって濃度曲線を作成することによって生成され得る。種々の実施形態では、濃度曲線は、ＰＤＩＴＭを用いて２つ以上の既知の濃度で対応する標準化合物と関連するレポーターイオンのイオンシグナルを測定すること、および測定されたレポーターイオンシグナルに対して関数をフィッティングさせることにより濃度曲線を作成することによって、作成してもよい。適切なフィッティング関数は、例えば、検出器の応答（例えば、検出器飽和、非線形性）に依存し得る。種々の実施形態では、このフィッティング関数は一次関数である。
【００３７】
種々の実施形態では、１つ以上のアイソバリックに標識されたアミン含有化合物の濃度を決定する工程（工程１４０）は、以下の両方に少なくとも基づく：（ｉ）１つ以上の標準化合物の１つ以上の濃度曲線に対応する１つ以上のレポーターイオンの測定されたイオンシグナルに対する、対応するレポーターイオンの測定されたイオンシグナルの比較；および（ｉｉ）アイソバリックに標識されたアミン含有化合物と合わされた１つ以上のアイソバリックに標識された標準化合物に対応する１つ以上のレポーターイオンの測定されたイオンシグナルに対する、対応するレポーターイオンの測定されたイオンシグナルの比較。種々の実施形態では、第一の濃度を有する標準化合物が提供され（工程１６０）、１つ以上のアミン含有化合物（例えば、工程１２０の）を標識するために用いられる、アイソバリックタグのセット由来のアイソバリックタグで標識される（工程１７０）。アイソバリックに標識された標準化合物の一部を、アイソバリックに標識されたアミン含有化合物の各々の少なくとも一部と合わせて、合わせたサンプルを生成し（ワークフローパス１７６および工程１５０）、次いで、この合わせたサンプルを本明細書に記載のとおりさらに分析してもよい。種々の実施形態では、合わせたサンプルを生成するために用いられる同じアイソバリックに標識された標準化合物の一部はまた、本明細書に記載のような濃度曲線を作成するのに用いられる。
【００３８】
レポーターイオンシグナルを測定するために用いられる同じ標準化合物部分、または別の部分を用いて、質量分析器について親・娘イオン遷移モニタリング条件を決定してもよい。例えば、質量分析システムが液体クロマトグラフィー（ＬＣ）構成要素を備える場合、標準化合物を用いてクロマトグラフィー保持時間を決定してもよい。種々の実施形態では、標準化合物を用いて、アミン含有化合物についてイオン源中でそのイオン化効率を、および種々の条件下においてイオン分裂器で分裂効率を決定してもよい。
【００３９】
アミン含有化合物
本発明の教示の方法は、限定はしないが、アミノ酸、カテコールアミン、ニトロフラン代謝物、ポリアミン、ペプチド、タンパク質、ポリペプチドおよびそれらの組み合わせを含む広範な種々の一級および二級アミン含有化合物に適用され得る。
【００４０】
種々の実施形態では、目的のアミン含有化合物は、アミノ酸を含む。アミノ酸の例としては限定はしないが、ロイシン、プロリン、アラニン、バリン、グリシン、セリン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、イソロイシン、トレオニン、システイン、チロシン、ヒスチジン、リジン、アルギニンおよびその異性体、ならびにその翻訳後修飾アミノ酸が挙げられる。例えば、種々の実施形態では、アミン含有化合物としては、例えば、チロキシンのようなアミノ酸誘導体が挙げられる。チロキシンは、チロシンの誘導体であって、疾患をモニターするために用いられ得る重要なクラスの化合物を含む。チロキシンの例としては限定はしないが、チロキシン（Ｔ４）、トリヨードサイロニン（Ｔ３）および「リバースＴ３」が挙げられる。
【００４１】
【化１】
種々の実施形態では、目的のアミン含有化合物は、１つ以上のカテコールアミンを含む。カテコールアミンの例としては限定はしないが、エピネフリン、ノルエピネフリン、ドーパミン、およびそれらの組み合わせが挙げられる。種々の実施形態では、目的のアミン含有化合物は、ポリアミンを含む。ポリアミンの例としては、限定はしないが、スペルミン、Ｎ−アセチルスペルミン、スペルミジン、Ｎ−アセチルスペルミジン、プトレシン（１，４−ジアミノブタン）、２−ヒドロキシプトレシン、カドベリン（１，５−ジアミノペンタン）、１，６−ジアミノヘキサン、１，７−ジアミノヘプタン、１，１０−ジアミノドデカン、およびそれらの組み合わせが挙げられる。種々の実施形態では、目的のアミノ含有化合物は、タンパク質またはポリペプチドを含む。タンパク質およびポリペプチドの例としては限定はしないが、チトクロムＰ４５０イソ型、アンギオテンシン、ならびに乳漿タンパク質および乳タンパク質、例えば、βラクトグロブリンが挙げられる。
チトクロムＰ４５０イソ型の例としては限定はしないが、Ｃｙｐｌａ２、Ｃｙｐ１ｂ１、Ｃｙｐ２ａ４、Ｃｙｐ２ａ１２、Ｃｙｐ２ｂ１０、Ｃｙｐ２ｃ２９、Ｃｙｐ２ｃ３７、Ｃｙｐ２ｃ３９、Ｃｙｐ２ｃ４０、Ｃｙｐ２ｄ９、Ｃｙｐ２ｄ２２、Ｃｙｐ２ｄ２６、Ｃｙｐ２ｊ５、Ｃｙｐ２ｅｌ、Ｃｙｐ３ａ１１、Ｃｙｐ４ａ１０、Ｃｙｐ４ａ１４、およびそれらの組み合わせが挙げられる。種々の実施形態では、目的のアミン含有化合物は、ニトロフラン代謝物を含む。ニトロフラン代謝物の例としては限定はしないが、３−アミノ−２−オキサゾリジノン（ＡＯＺ）、５−モルホリノメチル−３−アミノ−オキサゾリジノン（ＡＭＯＺ）、セミカルバジド（ＳＥＭ）、１−アミノヒダントイン（ＡＨＤ）およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【００４２】
【化２】
本発明の教示の種々の実施形態が適用され得るアミン含有化合物は、広範な種々の供給源タイプ、例えば、生理学的な流体サンプル、細胞もしくは組織溶解液サンプル、合成ペプチドサンプル、ポリペプチドサンプル、タンパク質サンプル、細胞培養サンプル、ファーメンテーションブロス培地サンプル、農産物サンプル、畜産品サンプル、動物食餌サンプル、ヒト消費のための食品もしくは飲料のサンプル、およびそれらの組み合わせに由来し得る。このサンプルは、種々の供給源、状態またはその両方に由来し得る；例えば、コントロール対実験、異なる時点由来のサンプル（例えば、配列を形成するため）、疾患対正常、実験対疾患（混入対非混入など）。生理学的液体の例としては、限定はしないが、血液、血清、血漿、汗、涙、尿、腹水、リンパ液、膣分泌物、精液、脊髄液、腹水、唾液、喀痰、乳房浸出液およびそれらの組み合わせが挙げられる。ヒト消費のための食物または飲料の例としては限定はしないが、ワイン、ハチミツ、ショウユ、家禽、ブタ肉、牛肉、魚、甲殻類およびそれらの組み合わせが挙げられる。種々の実施形態では、目的のアミン含有化合物は、アミノ酸であって、アミノ酸の供給源は、タンパク質を含み、これは、例えば、加水分解、消化されて、アミノ酸を生成する。種々の実施形態では、目的のアミン含有化合物は合成ペプチドである。
【００４３】
標準化合物
広範な種々の化合物を標準化合物として用いてもよい。種々の実施形態では、標準化合物は、目的のアミン含有化合物のうち１つを含む。種々の実施形態では、標準化合物は、１つ以上のコントロールサンプル、既知濃度のサンプル、またはそれらの組み合わせ由来である。種々の実施形態では、標準化合物は、分析物中で目的の各々のアミン含有化合物について提供される。
【００４４】
種々の実施形態では、標準化合物の濃度曲線は、２つ以上の公知の濃度で標準化合物と会合されたレポーターイオンのイオンシグナルを測定するように、ＰＤＩＴＭを用いて作成され得る。
【００４５】
アイソバリックタグ
種々の実施形態では、アイソバリックタグは、一般式（Ｉ）：
Ｒ−Ｌ−ＡＲＧ（Ｉ）
によって示され得、ここでＲは、切断可能なリンカー基（Ｌ）を通じてアミン反応性基（ＡＲＧ）に共有結合されたレポーター基（Ｒ）であって、このリンカー基は、Ｒ＋Ｌの質量がアイソバリックタグのセットの各々のアイソバリックタグについてと実質的に同じになるような重量を有するバランス基を含む。例えば、種々の実施形態では、リンカー基Lは、一般式（ＩＩ）：
Ｘ−Ｂ−Ｙ（ＩＩ）
によって示され得、ここでＸは、バランス基とレポーター基との間の結合に相当し、この結合Ｘは、中性ガスでの標識された分析物の衝突の際に壊れ（例えば、衝突誘発性の解離を介する）、Ｙは、分析物反応性基が分析物と反応されてこの分析物を標識するとき、バランス基と分析物との間の結合であって、Ｂは、バランス基である。分析物は、その分析物と式（Ｉ）の試薬、その塩、および／またはその水和物との反応によって標識されてもよい。
【００４６】
アミン反応性基
アミン反応性基の例としては、アミン官能性基と選択的に反応して、特定の部位でのアミン含有化合物との共有結合または非共有結合を形成する基が挙げられるがこれらに限定されない。このアミン反応性基は、事前に存在してもよいし、またはインサイチュで調製されてもよい。アミン反応性基のインサイチュ調製は、分析物の非存在下で進行されてもよく、または分析物の存在下で進行されてもよい。例えば、カルボン酸基は、水溶性カルボジイミド（例えば、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩；ＥＤＣ）を用いてインサイチュで修飾されて、これによってアルキルまたはアリールアミン基のような求核試薬と反応され得る求電子基が調製されてもよい。種々の実施形態では、ＥＤＣを用いた標識試薬のカルボン酸基の活性化は、分析物を含むアミン（求核試薬）の存在下で行われてもよい。種々の実施形態では、アミン（求核試薬）含有分析物はまた、ＥＤＣが行われる最初の反応後に添加されてもよい。種々の実施形態では、この反応基は、保護基のインサイチュの除去によってインサイチュで生成され得る。結果として、求核試薬および／または求電子基の反応による分析物の誘導体化をもたらし得る、任意の既存のまたは新規に作成された試薬（単数または複数）が考慮される。
【００４７】
種々の実施形態では、適切なアミン反応性基は、活性エステルを含む。活性なエステルは、ペプチド合成において周知であって、ペプチド合成において通常用いられる条件下でアミノ酸のＮ−αアミンと容易に反応する特定のエステルをいう。アミン反応性活性エステルは、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ）、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル（Ｐｆｐ）、２−ニトロフェニルエステル、４−ニトロフェニルエステル、２，４−ジニトロフェニルエステル、または２，４−ジハロフェニルエステルであってもよい。種々の実施形態では、アミン反応性基は、混合無水物であってもよい。なぜなら混合無水物は、アミン基と効率的に反応し、それによってアミド結合を生成し得るからである。
【００４８】
レポーター基
本発明の教示の種々の実施形態で用いられるアイソバリックタグ（単数または複数）のレポーター基は、決定され得る固有の質量（または質量対電荷比）を有する基であってもよい。例えば、各々のレポーターのセットは、固有の総重量を有してもよい。異なるレポーターは、その固有の質量を達成するために１つ以上の重原子同位体を含んでもよい。例えば、同位体の炭素（１２Ｃ、１３Ｃ、および１４Ｃ）、窒素（１４Ｎおよび１５Ｎ）、酸素（１６Ｏおよび１８Ｏ）または水素（水素、重水素および三重水素）が存在し、レポーター部分の多様な基の調製で用いられ得る。適切な重原子同位体の例としては限定はしないが、１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏおよび重水素が挙げられる。
【００４９】
固有のレポーターを目的のサンプルと会合させ、それによって、そのサンプルの１つまたは複数の分析物をこのレポーターで標識してもよい。この方式では、例えば、このレポーターについての情報は、このサンプルの分析物の１つまたは全てについての情報と関連され得る。しかし、このレポーターが決定される場合、このレポーターは分析物と物理的に連結される必要はない。そうではなく、レポーターの固有の総重量は、標識された分析物のイオンがフラグメント化され、それによって娘フラグメントイオンおよび検出可能なレポーターが生成された後、例えば、タンデム質量分析器の第二の質量分析で決定されてもよい。この決定されたレポーターは、決定された分析物が由来するサンプルを特定するために用いられ得る。さらに、他のレポーターまたは較正標準（例えば、特定のレポーターで標識された分析物）のいずれかの量に対する、固有のレポーターの量を用いて、サンプルまたはサンプル中の分析物の相対量または絶対量（しばしば、濃度および／または量として表現される）を決定してもよい。従って、特定のサンプル中の１つ以上の分析物の量のような情報を、各々の特定のサンプルを標識するために用いられるレポーター部分と関連させてもよい。分析物（単数または複数）の同一性がまた決定される場合、その情報を、種々のレポーターに関与する情報と関連させ、それによってサンプルの１つまたは複数における各々の標識された分析物の同一性および量の決定を促進してもよい。
【００５０】
このレポーターは、固定の電荷を含んでもよく、またはイオン化されてもよい。レポーターが固定電荷を含んでもよく、またはイオン化されてもよいので、標識試薬は、単離されてもよく、反応性の分析物を塩（または塩の混合物）または双性イオンの形態で標識するために用いられてもよい。レポーターのイオン化によって、質量分析計におけるその決定が容易になる。従って、レポーターは、時には識別イオン（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｉｏｎ）と呼ばれるイオンとして決定され得る。イオン化される場合、レポーターは、１つ以上の正味の正または負の家電を含み得る。従って、レポーターは、１つ以上の酸性基または塩基性基を含んでもよい。なぜなら、このような基は、質量分析計で容易にイオン化され得るからである。例えば、レポーターは、１つ以上の塩基性窒素原子（正の電荷）または１つ以上のイオン化可能な酸性基、例えばカルボン酸基、スルホン酸基、またはリン酸基（負の電荷）を含んでもよい。塩基性窒素を含むレポーターの非限定的な例としては、置換または非置換のモルホリン、ピペリジンまたはピペラジンが挙げられる。
【００５１】
レポーターは、置換または非置換の酢酸部分（ここにＮ−アルキル酢酸部分のカルボニル炭素を通じて分析物が連結される）とＮ−アルキル化された環窒素原子を含む５員、６員または７員の複素環であってもよく、ここで各々の異なる標識が１つ以上の重原子同位体を含む。この複素環は、置換されても非置換であってもよい。この複素環は、脂肪族であっても芳香族であってもよい。複素環部分の可能な置換基としてはアルキル、アルコキシおよびアリール基が挙げられる。この置換基は、支持体に対する分析物の連結に適切である、保護基または非保護基、例えば、アミン、ヒドロキシルまたはチオール基を含んでもよい。複素環は、さらなるヘテロ原子、例えば、１つ以上の窒素、酸素またはイオウ原子を含んでもよい。
【００５２】
レポーターは、分析物の分析のための代表的な条件下で実質的にサブフラグメントでないように選択され得る。このレポーターは、質量分析計における標識された分析物の選択されたイオンの少なくとも一部の結合ＸおよびＹの両方のフラグメンテーションを生じるように適用された解離エネルギーの条件下で実質的にサブフラグメントでないように選択され得る。「実質的にサブフラグメントでない」とは、本発明者らは、このレポーターのフラグメントは、目的の分析物の首尾よい分析に適用されるとき、バックグラウンドノイズを超えて検出することが困難または不可能であるということを意味する。レポーターの総重量は、決定しようと努める分析物、または分析物の任意の予想フラグメントと比較して異なるように意図的に選択され得る。例えば、タンパク質またはペプチドが分析物である場合、レポーターの総重量は、任意の天然に存在するアミノ酸もしくはペプチド、またはその予想フラグメントの量と比較して異なるように選択され得る。これによって、分析物の決定が容易になり得る。なぜなら、分析物次第で、同じ同時質量（ｃｏｉｎｃｉｄｅｎｔ ｍａｓｓ）を有するサンプルの潜在的な成分がなければ、任意の分析物の結果に信頼が加わり得るからである。
【００５３】
リンカー基
本教示の種々の実施形態で用いられる標識試薬（単数または複数）のリンカーは、分析物との反応が生じたか否かに依存して、分析物に対してレポーターを、または分析物反応基（ＡＲＧ）に対してレポーターを連結させる。このリンカーは、結合ＸおよびＹの両方がフラグメント化される（例えば、結合ＸおよびＹの両方のフラグメンテーションの際に中性の損失を受ける）とき中性種を生成するように選択され得る。このリンカーは、カルボニルまたはチオカルボニル基のように極めて小さくてもよい。このリンカーは、それより大きい部分であってもよい。このリンカーは、ポリマーまたはバイオポリマーであってもよい。このリンカーは、解離性エネルギーレベルに供された場合サブフラグメントになるように設計され得る；これには、リンカーの中性のフラグメントのみを生じるサブフラグメント化が挙げられる。
【００５４】
このリンカー基は、その質量が、混合物の各々の標識された分析物について、またはアイソバリック試薬のセットについてレポーターの間の総重量の相違について補償するように、１つ以上の重原子同位体を含んでもよい。さらに、レポーター／リンカーの組み合わせの総重量（すなわち、全体としてとった総重量）は、混合物の各々の標識された分析物について、または試薬のセットおよび／もしくはキットについて実質的に同じであってもよい。リンカーは、標識試薬におけるレポーターについての質量バランスとして作用し得るので、レポーター／リンカーの組み合わせの総重量は全ての試薬のセットまたはキットについて同じであり、リンカー基はまた、バランス基（Ｂ）を含むと言われる。リンカーのバランス基（Ｂ）における原子の数が多いほど、異なる異性体／アイソバリックな標識試薬のセットおよび／またはキットの可能な数が多くなる。
【００５５】
結合ＸおよびＹ
Ｘは、レポーターの原子とリンカーの原子との間の結合である。Ｙはリンカーの原子といずれかのアミン反応基の原子との間の結合であるか、または標識試薬が分析物と反応させられる場合は分析物である。標識された分析物（例えば、Ｒ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−分析物）の選択されたイオンの少なくとも一部において、十分な解離性エネルギーレベルに供されるとき、結合Ｘが破壊するように、結合Ｘは選択される。種々の実施形態では、標識された分析物（例えば、Ｒ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−分析物）の選択されたイオンの少なくとも一部において、十分な解離性エネルギーレベルに供されるとき、結合Ｙが破壊するように、結合Ｙはまた選択される。結合Ｘ，結合Ｙまたは結合ＸおよびＹの両方が、標識された分析物の選択されたイオンの少なくとも一部で破壊するように、解離性エネルギーレベルは、質量分析計において調節されてもよい。レポーターが分析物から独立して決定され得るように、結合Ｘの破壊によって分析物からレポーターを遊離させる。結合Ｘがすでに破壊されているかいないかに依存して、結合Ｙの破壊は、分析物からレポーター／リンカーの組み合わせを、または分析物からリンカーを遊離させる。種々の実施形態では、結合Ｙは結合Ｘよりも不安定であってもよく、結合Ｘは結合Ｙよりも不安定であってもよく、または結合ＸおよびＹは、実質的に同じ反応不安定性であってもよい。
【００５６】
例えば、目的の分析物がタンパク質またはペプチドである場合、結合ＸおよびＹの相対的な不安定性は、アミド（ペプチド）結合に関して調節され得る。結合Ｘ、結合Ｙまたは結合ＸおよびＹの両方は、代表的なアミド（ペプチド）結合と比較してさらに不安定であっても、等しく不安定であっても、または不安定さが少なくてもよい。例えば、解離性エネルギーの条件下で、結合Ｘおよび／または結合Ｙは、Ｚ−ｐｒｏまたはＺ−ａｓｐ二量体のペプチド結合（ここでＺは、天然のアミノ酸であり、Ｐｒｏはプロリンであり、ａｓｐはアスパラギン酸である）と比較して、破壊（フラグメンテーション）する傾向が少なくてもよい。種々の実施形態では、結合ＸおよびＹは、代表的なアミド結合とほぼ同じレベルの解離性エネルギーで破壊する。
【００５７】
結合ＸおよびＹはまた、結合Ｙの破壊が結合Ｘの破壊を生じる（逆も同様）ように存在してもよい。種々の実施形態では、実体量の分析物またはその娘フラグメントイオンが、第二の質量分析における部分的標識を含まないように、結合ＸおよびＹの両方が、本質的に同時にフラグメント化してもよい。「実体量の分析物（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ａｎａｌｙｔｅ）」とは、約２５％未満、好ましくは約１０％未満、部分的に標識された分析物がＭＳ／ＭＳスペクトルで決定され得るということを本発明者らは意味する。
【００５８】
図２Ａを参照して、アイソバリックタグの模式図を図示する。各々のタグは、各々のタグの名目上の質量が実質的に等しいように、レポーター基１２、アミン反応基２１４、およびバランス基２１８（例えば、レポーター基の間の質量の相違を相殺する）から構成される。
【００５９】
種々の実施形態では、１セットのアイソバリックタグが、アミン誘導体化アミン含有化合物（フラグメンテーションの非存在下では、実質的にはクロマトグラフィーで識別不能であり、かつ実質的には質量分析で識別不能であるが、ＣＩＤ後、強力な低質量のＭＳ／ＭＳの兆候的イオン（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｉｏｎ）を生じる）を含む。
【００６０】
種々の実施形態では、１セットのアイソバリックタグは、一般式（ＩＩＩａ）−（ＩＩＩｄ）によってそれぞれ示される、タグＱ１１４、Ｑ１１５、Ｑ１１６およびＱ１１７を含む：
【００６１】
【化３】
本発明の教示の種々の実施形態での使用に適切なレポーター基、リンカー基、バランス基、アミン反応基、アイソバリックタグおよびアイソバリックタグのセットのさらなる例は、米国特許出願公開第２００４／０２１９６８６号；同第２００４／０２２０４１２号；同第２００５０１４７９８２号；同第２００５／０１４７９８５号；同第２００５／０１４８０８７号；同第２００５／０１４８７７１号；同第２００５／０１４８７７３号；同第２００５／０１４８７７４号および同第２００５／０２０８５５０号（その全ての内容全体が参照によって本明細書に援用される）に見出され得る。
【００６２】
合わせたサンプル
任意の適切な組み合わせの１つ以上のアイソバリックに標識された標準化合物、１つ以上のアイソバリックに標識されたアミン含有化合物、またはその組み合わせを、本発明の教示の方法で用いてもよい。例えば、一般には、合わせたサンプル中の種々のアイソバリックに標識された化合物Ｎの数は、アイソバリックタグのセットにおけるアイソバリックタグの数Ｔ以下である。任意の１つの合わせたサンプルでは、可能な組み合わせのアイソバリックに標識された標準化合物、１つ以上のアイソバリックに標識されたアミン含有化合物は以下：
（Ｓ＋Ｃ）≦Ｔ（１）
のように表現されてもよく、ここでＴは、アイソバリックタグのセットにおけるアイソバリックタグの数に相当し；Ｓは、種々のアイソバリック標識でアイソバリックに標識された標準化合物の数に相当して、０〜Ｔ（包括的）におよび；Ｃは、種々のアイソバリック標識でアイソバリックに標識されたアミン含有化合物の数に相当し、０〜Ｔ（包括的）におよぶ。
【００６３】
例えば、種々の実施形態では、１つ以上のアイソバリック標識された標準化合物（例えば、コントロールサンプル由来、濃度既知のサンプル由来、など）を、目的の１つ以上のアイソバリックに標識されたアミン含有試験化合物と合わせ、この１つ以上のアイソバリックに標識された標準化合物は、１つ以上のレポーターイオンシグナルを提供し、これが例えば、内部濃度標準として機能し得る。種々の実施形態では、アイソバリックに標識された標準化合物の追加は、合わせたサンプル中の目的の１つ以上のアミン含有化合物についての内部標準として機能し得る。種々の実施形態では、種々のアイソバリックに標識された標準化合物が、合わせたサンプル中の目的の各々の異なるアミン含有化合物について付加され（例えば、Ｓ＝Ｃ）、各々の異なるアイソバリックに標識された標準化合物が、例えば、目的の種々のアミン含有化合物についての内部標準として機能する。
【００６４】
種々の実施形態では、この合わせたサンプル中で分析されるべきアミン含有化合物のうち２つ以上が、目的の同じアミン含有化合物を含む。例えば、アミン含有化合物＃１〜＃Ｘ（ここでＸ＞１）は、目的の同じアミン含有化合物を、ただし、例えば、異なるサンプル（異なるアイソバリック標識が異なるサンプル由来のアミン含有化合物について用いられている）から、含んでもよい。例えば、異なるサンプルは、同じ系（例えば、患者、場所など）の異なる時点に由来してもよく、いくつかのプロセス、例えば、疾患、ファーメンテーションなどの進行をモニターするために用いられてもよい。
【００６５】
種々の実施形態では、サンプルを、同じアミン含有化合物について用いられる異なるアイソバリックタグで処理する。例えば、サンプルを三連で処理し、ここでは異なるアイソバリックタグが、３つの部分の各々について用いられており、ここで次いで、合わせたサンプルの少なくとも一部を組み合わせる（これはまた、１つ以上の標準化合物を含み得る）；これによって、この合わせたサンプルの単一の実験分析においてアミン含有化合物の濃度の３つの測定値を得る。三連、または一般には多重の測定は、しばしば、実質的に有意な、および／または正確な結果を得るのに必要である。例えば、伝統的なアプローチを用いるアミノ酸分析結果は、代表的には、これらの伝統的な技術が通常遭遇する泳動間の変動およびバックグラウンドの干渉のせいで、同じサンプルの三連の分析に基づく。本発明の教示に種々の実施形態が、単一の実験的泳動においてアミン含有化合物の濃度の複数の測定をもたらす能力によって、このような泳動間の変動に起因する不正確性を減じることが容易になり得る。
【００６６】
種々の実施形態では、アイソバリックに標識された標準化合物は、合わせたサンプルに添加されず、種々の実施形態では、例えば、目的の１つ以上のアミン含有化合物の濃度は、標準化合物の濃度曲線に対するアミン含有化合物の対応するレポーターイオンシグナルの比較に少なくとももとづいて決定され得る。
【００６７】
種々の実施形態では、合わせたサンプルを浄化し（例えば、干渉するサンプル、干渉アーチファクト、などを除去するため；高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣ、交換分画、陽イオン交換、高解像陽イオン交換など、およびそれらの組み合わせによって）、その後にそれを用いて、レポーターイオンシグナルを測定する。
【００６８】
質量分析器
広範な種々の質量分析システムを本発明の教示で用いてＰＤＩＴＭを行ってもよい。適切な質量分析器システムは、２つの質量分析器の間のイオン飛行経路に配置されたイオン分離器を備える２つの質量分離器を包含する。適切な質量分析器の例としては、限定はしないが、四重極、ＲＦ多重極、イオントラップ、飛行時間（ＴＯＦ）、および時限イオン選別器（ｔｉｍｅｄ ｉｏｎ ｓｅｌｅｃｔｏｒ）と組み合わせたＴＯＦが挙げられる。適切なイオン分離器としては限定はしないが、以下の原理で作動するものが挙げられる：衝突誘起解離（ＣＩＤ（衝突支援解離（ＣＡＤ）とも呼ばれる））、光誘起解離（ＰＩＤ）、表面誘起解離（ＳＩＤ）、ポスト・ソース分解、またはそれらの組み合わせ。
【００６９】
質量分析器のための適切な質量分析シシステムの例としては、限定はしないが、３つ組の四重極、四重極線形イオントラップ（例えば、４０００Ｑ ＴＲＡＰ（登録商標）ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム、Ｑ ＴＲＡＰ（登録商標）ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム）、四重極ＴＯＦ（例えば、ＱＳＴＡＲ（登録商標）ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム）およびＴＯＦ−ＴＯＦのうちの１つ以上を備えるシステムが挙げられる。
【００７０】
質量分析計システムに適切なイオン源としては限定はしないが、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）、および大気圧光イオン化（ＡＰＰＩ）のイオン源が挙げられる。たとえば、ＥＳＩイオン源は、ＬＣカラムに由来するイオン化サンプルを質量分析装置へ導入するための手段として機能し得る。ＥＳＩのいくつかの所望の特徴のうちの１つは、クロマトグラフィーカラム由来の画分が、このカラムからＥＳＩイオン源へ直接進行し得るというということである。
【００７１】
種々の実施形態では、質量分析装置システムは、ＭＡＬＤＩイオン源を備える。種々の実施形態では、合わせたサンプルの少なくとも一部は、ＭＡＬＤＩマトリクス材と混合されて、ＭＡＬＤＩイオン化源を有する質量分析器を用いる親・娘イオン遷移モニタリングに供される。種々の実施形態では、合わせたサンプルの少なくとも一部をクロマトグラフィーカラム上にロードし、この溶離液の少なくとも一部をＭＡＬＤＩマトリクス材と混合して、ＭＡＬＤＩイオン源を備える質量分析器を用いる親・娘イオン遷移モニタリングに供する。ＭＡＬＤＩマトリクス材の例としては限定はしないが、表１に列挙されるものが挙げられる。
【００７２】
【表１】
種々の実施形態では、質量分析器システムは、親イオンを選択するため、およびそのフラグメント娘イオンを検出するためのトリプル四重極質量分析計を備える。種々の実施形態では、第一の四重極は、親イオンを選択する。第二の四重極は、十分に高い圧力および電圧で維持され、その結果複数の低エネルギー衝突が、親イオンのいくつかをフラグメントにさせる。第三の四重極は、選択された娘イオンを検出器に伝送するように選択される。種々の実施形態では、トリプル四重極質量分析計は、イオン源とトリプル四重極との間に位置するイオン・トラップを備え得る。このイオントラップは、イオン（例えば、全てのイオン、特定のｍ／ｚ範囲を有するイオンなど）を衝突させ得、充填時間後、この選択されたイオンを第一の四重極に対して末端電極をパルス化することによって伝送して、この選択されたイオンがイオントラップから出ることを可能にする。所望の充填時間は、例えば、イオンの数、イオントラップ内の電荷密度、種々の兆候的ペプチドの溶出の間の時間、デューティ・サイクル、励起状態の化学種の崩壊率、または多価イオン、またはそれらの組み合わせに基づいて決定され得る。
【００７３】
種々の実施形態では、三重の四重極質量分析計における１つ以上の四重極は、線形イオンとして設定可能であり得る（例えば、四重極内の実質的に細長い円柱状トラップ容積をもたらすための末端電極の付加によって）。種々の実施形態では、第一の四重極は親イオンを選択する。第二の四重極は、十分に高い衝突ガス圧および電圧で維持され、その結果複数の低エネルギー衝突が親イオンのいくつかをフラグメントにさせる。この第三の四重極は、フラグメントイオンをトラップするように、充填時間後、末端電極をパルスして、この選択された娘イオンがイオントラップを出ることを可能にすることによって、選択された娘イオンを検出器に伝送するように選択される。所望の充填時間は、例えば、フラグメントイオンの数、イオントラップ内の電荷密度、種々の兆候的ペプチドの溶出の間の時間、デューティ・サイクル、励起状態の化学種の崩壊率、または多価イオン、またはそれらの組み合わせに基づいて決定され得る。
【００７４】
種々の実施形態では、質量分析計システムは、親イオンを選択するため、およびそのフラグメント娘イオンを検出するために、２つの四重極質量分析計およびＴＯＦ質量分析計を備える。種々の実施形態では、第一の四重極は、親イオンを選択する。第二の四重極は、十分に高い圧力および電圧で維持され、その結果複数の低エネルギー衝突が、このイオンのいくつかをフラグメントにさせ、ＴＯＦ質量分析計は、例えば、質量範囲（目的の娘イオンおよび抽出された作成されたイオンクロマトグラムを包含する）にまたがってイオンをモニタリングすることによって、検出器から離れた選択されたイオンの時間ウインドウの外側に現れるイオンを偏向させることによって、選択された娘イオンの時間ウインドウに達するように検出器を時間ゲートすること、またはそれらの組み合わせによって、検出のための娘イオンを選択する。
【００７５】
種々の実施形態では、質量分析システムは、２つのＴＯＦ質量分析器およびイオン分離器（例えば、ＣＩＤまたはＳＩＤなど）を備える。種々の実施形態では、第一のＴＯＦは、イオン分裂器における導入のために親イオンを選択し（例えば、分裂器から離れて選択された親イオンの時間ウインドウの外側に出現するイオンを偏向させることによって）第二のＴＯＦ質量分析器は、検出のための娘イオンを選択する（例えば、目的の娘イオンおよび作成された抽出されたイオンクロマトグラムを包含する質量範囲にまたがってイオンをモニタリングすることによって、検出器から離れて選択された娘イオンの時間ウインドウの外側に出現するイオンを偏向させることによって、選択された娘イオンの時間ウインドウに達するように検出器を時間ゲートすることによって、またはそれらの組み合わせによって）。ＴＯＦ分析器は線形であってもよくまたは分析器を反映する。
【００７６】
種々の実施形態では、質量分析システムは、飛行時間質量分析計およびイオンレフレクターを備える。このイオンレフレクターは、ＴＯＦのフィールド・フリードリフト領域の末端に位置し、これを用いてイオンの飛行経路を改変することによって初期運動エネルギー分布の効果を補償する。種々の実施形態では、イオンレフレクターは、加速電圧よりもわずかに大きいレベルまで増大させる電位で偏向された一連のリングからなる。作動中、イオンは、レフレクターに浸透するので、それらは、その電場の方向の速度がゼロになるまで減速される。ゼロの速度ポイントで、そのイオンは方向を反転して、レフレクターを通じて加速し戻される。このイオンは、所得エネルギーと同一のエネルギーであって、ただし反対方向の速度でこのレフレクターを出る。より大きいエネルギーを有するイオンは、このレフレクターにさらに深く浸透して、結果としてさらに長時間このレフレクター内に残る。このレフレクターに用いられる電位は、イオンの飛行経路を改変するように選択され、その結果質量および電荷が同様のイオンは、実質的に同じ時間で検出器に達する。
【００７７】
種々の実施形態では、質量分析計システムは、タンデムＭＳ−ＭＳ装置を備え、この装置は、目的の親イオンを選択するための時限イオン選別器を有する第一のフィールドフリードリフト領域と、娘イオンを生じるための分裂チャンバ（またはイオン分裂器）と、検出のために選択された娘イオンを伝送するための質量分離器とを備える。種々の実施形態では、この時限イオン選別器は、パルスイオンデフレクターを備える。種々の実施形態では、このイオンデフレクターは、パルスイオンデフレクターとして用いられてもよい。この質量分離器は、イオンレフレクターを備えてもよい。種々の実施形態では、分裂チャンバは、イオンのフラグメンテーションを生じて、抽出を遅らせるように設計された衝突セルである。種々の実施形態では、この分裂チャンバはまた、飛行時間分光測定によるフラグメントイオンの分析のための遅延抽出イオン源として機能し得る。
【００７８】
種々の実施形態では、質量分析計システムは、タンデムＴＯＦ−ＭＳを備え、これはパスルイオン源によって作成される複数のイオンの経路に沿って配置された第一、第二および第三のＴＯＦ質量分離器を有する。この第一の質量分離器は、パルスイオン源によって発生される複数のイオンを受容するように配置される。この第一の質量分離器は、パルスイオン源によって発生される複数のイオンを加速して、その質量対電荷比に応じてこの複数のイオンを分離して、この複数のイオンからその質量対電荷比に基づいてイオンの第一の群を選択する。この第一の質量分離器はまた、イオンの第一の群の少なくとも一部をフラグメント化させる。この第二の質量分離器は、第一の質量分離器によって発生された第一の群のイオンおよびそのフラグメントを受容するように配置される。この第二の質量分離器は、イオンの第一の群およびそのフラグメントを加速して、その質量対電荷比に応じてこのイオンの第一の群およびそのフラグメントを分離して、その質量対電荷比に基づいてイオンの第一の群およびそのフラグメントからイオンの第二の群を選択する。この第二の質量分離器はまた、イオンの第二の群の少なくとも一部をフラグメント化させる。この第一および／または第二の質量分離器はまた、イオンガイド、イオン集束エレメント、および／またはイオンステアリングエレメントを備え得る。種々の実施形態では、第二のＴＯＦ質量分離器は、イオンの第一の群およびそのフラグメントを加速する。種々の実施形態では、第二のＴＯＦ質量分離器は、フィールド・フリー領域およびイオン選別器を備え、この選別器は実質的に第二の所定の範囲内である質量対電荷比を有するイオンを選択する。種々の実施形態では、第一および第二のＴＯＦ質量分離器のうちの少なくとも１つは、フラグメント化したイオンを選択する時限イオン選別器を備える。種々の実施形態では、第一および第二の質量分離器のうちの少なくとも１つは、イオン分離器を備える。この第三の質量分離器は、第二の質量分離器によって発生されるイオンの第二の群およびそのフラグメントを受容するように配置されている。この第三の質量分離器は、イオンの第二の群およびそのフラグメントを加速して、その質量対電荷比に応じてこのイオンの第二の群およびそのフラグメントを分離する。種々の実施形態では、この第三の質量分離器は、イオンの第二の群およびそのフラグメントを、パルス加速を用いて加速する。種々の実施形態では、イオン検出器が、イオンの第二の群およびそのフラグメントを受容するように配置される。種々の実施形態では、イオンレフレクターは、イオンの第一および第二の群ならびにそのフラグメントのうちの少なくとも１つのエネルギーを、それらがイオン検出器に達する前に補正するためにフィールド・フリー領域に配置される。
【００７９】
種々の実施形態では、質量分析計システムは、ＴＯＦ質量分析器を備え、これは複数の飛行経路、時間内に同時に行われ得る複数の作動方式、または両方を有する。このＴＯＦ質量分析器は、経路選択イオンデフレクターを備え、このイオンデフレクターは、第一のイオン経路、第二のイオン経路または第三のイオン経路のいずれかにそって質量分析器に入るサンプルイオンのポケットから選択されたイオンを指向させる。いくつかの実施形態では、さらに多くのイオン経路が使用されてもよい。種々の実施形態では、第二のイオンデフレクターを、イオンデフレクターを選択する経路として用いてもよい。時間依存性の電圧を、経路選択イオンデフレクターに加えて、利用可能なイオン経路のなかから選択し、所定の質量対電荷比の範囲内の質量対電荷比を有するイオンを、選択されたイオン経路にそって伝えることを可能にさせる。
【００８０】
例えば、複数の飛行経路を有するＴＯＦ質量分析器の作動の種々の実施形態では、第一の所定の電圧を、第一の所定の質量対電荷比の範囲に相当する第一の所定の時間間隔について経路選択イオンデフレクターに与え、これによって第一の質量対電荷比の範囲内のイオンを、第一のイオン経路にそって伝えさせる。種々の実施形態では、この第一の所定の電圧は、ゼロであって、これによって、イオンが最初の経路にそって伝え続けることが可能になる。第二の所定の電圧を、第二の所定の質量対電荷比の範囲に相当する第二の所定の時間範囲について経路選択イオンデフレクターに与え、これによって第二の質量対電荷比の範囲内のイオンを、第二のイオン経路にそって伝えさせる。さらなる時間範囲および電圧（第三、第四などを含む）を使用して、特定の測定について必要なできるだけ多くのイオン経路を適合させてもよい。第一の所定の電圧の振幅および極性を選択して、第一のイオン経路中にイオンを偏向させて、第二の所定の電圧の振幅および極性を選択して、第二のイオン経路中にイオンを偏向させる。この第一の時間間隔は、第一の所定の質量対電荷比の範囲内のイオンが経路選択イオンデフレクターを通じて伝わっている時間に相当するように選択され、この第二の時間間隔は、第二の所定の質量対電荷比の範囲内のイオンが経路選択イオンデフレクターを通じて伝わっている時間に相当するように選択される。第一のＴＯＦ質量分離器は、第一のイオン経路にそって伝わる第一の質量対電荷比の範囲内のイオンのパケットを受容するように配置されている。この第一のＴＯＦ質量分離器は、第一の質量対電荷比の範囲内のイオンをその質量に応じて分ける。第一の検出器は、第一のイオン経路にそって伝えられているイオンの第一の群を受容するように配置されている。この第二のＴＯＦ質量分離器は、第二のイオン経路にそって伝わるイオンのパケットの一部を受容するように配置されている。この第二のＴＯＦ質量分離器は、第二の質量対電荷比の範囲内のイオンをその質量に応じて分ける。第二の検出器は、第二のイオン経路にそって伝えられているイオンの第二の群を受容するように配置されている。いくつかの実施形態では、さらなる質量分離器および検出器（第三、第四などを含む）を、対応する経路にそって指向されるイオンを受容するように配置してもよい。１実施形態では、第三の所定の質量範囲内のイオンを破棄する第三のイオン経路を使用する。第一および第二の質量分離器は、任意のタイプの質量分離器であってもよい。例えば、第一および第二の質量分離器のうちの少なくとも１つは、フィールド・フリードリフト領域、イオン加速器、イオン分裂器、または時限イオン選別器を備えてもよい。この第一および第二の質量分離器はまた、複数の質量分離デバイスを備えてもよい。種々の実施形態では、イオンレフレクターが、イオンの第一の群を受容するように含まれかつ配置され、それによってイオンレフレクターは、イオンの第一の群についてＴＯＦ質量分析器の解像力を向上させる。種々の実施形態では、イオンレクレクターが、イオンの第二の群を受容するように含まれかつ配置され、それによってイオンレフレクターは、イオンの第二の群についてＴＯＦ質量分析器の解像力を向上させる。
【００８１】
本発明の教示の別の局面では、本明細書に記載される方法の機能は、一般的な目的のコンピューターでコンピューター読み取り可能な装置として実行され得る。このコンピューターは、質量分析システムから隔てられても、それから取り外し可能でも、またはそれに組み込まれてもよい。このコンピューター読み取り可能な装置は、例えば、ＦＯＲＴＲＡＮ、ＰＡＳＣＡＬ、Ｃ、Ｃ＋＋またはＢＡＳＩＣなどの多数の高レベル言語のうちのいずれか１つで書かれてもよい。さらにコンピューター読み取り可能な装置は、ＥＸＣＥＬまたはＶＩＳＵＡＬ ＢＡＳＩＣのような、市販のソフトウェアに組み込まれたスクリプト、マクロまたは機能で書かれてもよい。さらに、コンピューター読み取り可能な装置は、コンピューター上に存在するマイクロプロセッサーに指向されるアセンブリ言語で実行され得る。例えば、コンピューター読み取り可能な装置は、ＩＢＭ ＰＣまたはＰＣ単独で行うように構成されている場合、Ｉｎｔｅｌ８０×８６アセンブリ言語で実行されてもよい。１実施形態では、コンピューター読み取り可能な装置は、限定はしないが、コンピューター読み取り可能なプログラム媒体、例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスク、光学ディスク、磁気テープ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭなどを含む、製造業者の品目に組み込まれる。
【実施例】
【００８２】
本発明の教示の局面は、排他的ではなく、本発明の教示の範囲を限定するとは決して解釈されるべきではない以下の実施例に照らしてさらに理解され得る。
【００８３】
実施例１：種々のサンプルのタイプ由来の化合物
以下の実施例は、種々のサンプルタイプの使用を図示する。この実施例の教示は、排他的ではなく、かつこれらの実験または本発明の教示の範囲を限定するものではない。
【００８４】
本発明の教示の方法を用いる種々のサンプルタイプ由来の１つ以上のアミン含有化合物の分析の種々の実施形態が図示される。種々の実施形態では、目的の１つ以上のアミン含有化合物は、この実施例において、１つ以上の多様なサンプルタイプ、例えば、血漿、ワイン、タンパク質、ペプチドおよびアミノ酸に由来し得る。一般には、サンプル中の目的の化合物が、例えば、一級アミンおよび二級アミンのようなアイソバリックタグでの標識のために適切な１つ以上のアミン基を含むようにサンプルを処理してもよい。
【００８５】
図３を参照すれば、種々の実施形態では、血漿（ブロック３０５）のサンプルに含まれる１つ以上のアミン含有化合物の標識は、目的のアミン含有化合物のうちの１つ以上を沈殿させる工程（工程３２５）、続いてこの上清の遠心分離および少なくとも一部の収集（工程３４０）を包含する。広範な種々のアプローチを用いて、限定はしないが、７〜１０％のスルホサリチル酸（ＳＳＡ）溶液、エタノール、イソプロパノールおよびそれらの組み合わせを含む、目的のアミン含有化合物を沈殿させてもよい。次いで、この上清の少なくとも一部を１セットのアイソバリックタグ（例えば、ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬）由来の１つ以上のアイソバリックタグと合わせて（工程３５０）、血漿サンプルから目的のアイソバリック標識されたアミン含有化合物を調製する。
【００８６】
種々の実施形態では、ワインのサンプル（ブロック３１０）に含まれる１つ以上のアミン含有化合物の標識は、７〜１０％のＳＳＡ溶液を含む、目的のアミン含有化合物の１つ以上を沈殿させる工程（工程３３０）、続いて、この上清の少なくとも一部の遠心分離および収集（工程３４５）を包含する。次いで、この上清の少なくとも一部を１セットのアイソバリックタグ（例えば、ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬）由来の１つ以上のアイソバリックタグと合わせて（工程３５０）、ワインサンプルから目的のアイソバリック標識されたアミン含有化合物を調製する。
【００８７】
種々の実施形態では、タンパク質、ペプチドまたはポリペプチドのサンプル（ブロック３１５）に含まれる１つ以上のアミン含有化合物の標識は、サンプルの少なくとも一部を（例えば、６モル（Ｍ）の塩酸（ＨＣｌ）で）加水分解する工程、消化する工程（例えば、トリプシンで）、またはその両方（工程３２５）（例えば、ペプチドおよび／またはアミノ酸のフラグメントを生成するため）、およびこの処理されたサンプルと１セットのアイソバリックタグ（例えば、ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬）由来の１つ以上のアイソバリックタグと合わせて（工程３５０）、タンパク質、ペプチドまたはポリペプチドサンプルから目的のアイソバリック標識されたアミン含有化合物を調製する工程を包含する。
【００８８】
種々の実施形態では、このサンプルは、アミノ酸またはアミノ酸の混合物（ブロック３２０）を含み、アミノ酸のうち１つ以上が目的のアミン含有化合物を含む。種々の実施形態では、アミノ酸サンプルを、１セットのアイソバリックタグ（例えば、ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬）由来の１つ以上のアイソバリックタグと合わせて（工程３５０）、アミノ酸サンプルから目的のアイソバリック標識されたアミン含有化合物を調製してもよい。ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬を用いる種々の実施形態では、目的のアイソバリックに標識されたアミン含有化合物を、１つ以上の翻訳後修飾を実質的に変化させることなく調製し得る。
【００８９】
実施例２
サンプル調製およびｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬での標識
以下の実施例は、ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬を用いる１つ以上のアイソバリックタグで、１つ以上のタンパク質またはペプチドを含む１つ以上のサンプルを調製して標識する種々の実施形態の例を図示する。この実施例の教示は、排他的ではなく、かつこれらの実験または本発明の教示の範囲を限定するものではない。
【００９０】
タンパク質またはペプチドのサンプルの還元ならびにシステインのブロック
図４Ａを参照して、種々の実施形態では、少なくとも１つおよび最大４つのサンプル試験管の各々（各々が５〜１００μｇのタンパク質を含む）に対して、２０μＬの溶解緩衝液および１μＬの変性剤を添加し、続いてボルテックスによって混合する（工程４０５）。各々のサンプル試験管に対して、２μＬの還元試薬を添加し、続いてボルテックスによって混合し６０℃で１時間インキュベーションする（工程４１０）。各々のサンプル試験管をスピンさせた後、各々のサンプル試験管に１μＬのシステインブロック試薬を添加し、次いでボルテックスによって混合し、スピニングして、室温で１０分間インキュベーションする（工程４１５）。
【００９１】
トリプシンによるタンパク質またはペプチドのサンプルの消化
図４Ａを参照して、種々の実施形態では、少なくとも１つおよび最大２つのサンプル試験管（各々が５〜１００μｇの還元および標識されるべきシステインブロックタンパク質を含む）種々の実施形態において、１バイアルのトリプシンを２５μＬのＭｉｌｌＱ（登録商標）Ｗａｔｅｒまたはその等価物で再構成する。例えば、少なくとも１つおよび最大４つのサンプル試験管（各々が５〜１００μｇの還元および標識されるべきシステインブロックタンパク質を含む）他の実施形態では、２バイアルのトリプシンを２５μＬのＭｉｌｌＱ（登録商標）Ｗａｔｅｒまたはその等価物で再構成する。トリプシンの希釈されたバイアルの各々を、ボルテックスおよびスピニングによって混合する（工程４２０）。
【００９２】
少なくとも１つおよび最大４つのサンプル試験管（各々が５〜１００μｇの還元および標識されるべきシステインブロックタンパク質を含む）の各々に、１０μＬのトリプシン溶液を添加する。各々のサンプル試験管をボルテックスによって混合し、次いでスピンさせて、３７℃で少なくとも１２時間および最大１６時間までインキュベートする。次いで、各々のサンプル試験管中のサンプル消化液をスピンさせる（工程４２５）。
【００９３】
タンパク質またはペプチドサンプルの加水分解
種々の実施形態では、タンパク質またはペプチドのサンプルを加水分解による分析のために調製する。従って、種々の実施形態では、還元工程（例えば、工程４１０）および消化工程（例えば、工程４２０）は用いない。図４Ｂを参照、種々の実施形態では、タンパク質および／またはペプチドを含むサンプルを、例えば、酸を用いて加水分解する（工程４２７）。本発明の教示での使用に適切であるタンパク質およびペプチドの加水分解には広範な種々の技術が当該分野で利用可能である。加水分解を、例えば、強力な酸加水分解を用いて行って（例えば、減圧下で１００℃で６Ｎの塩酸を用いる処理による）、遊離のアミノ酸を生成する。いくつかの加水分解条件で、いくつかのアミド（例えば、Ａｓｎ、Ｇｌｎ）をその酸に変換し得、他のアミノ酸を分解し得ると理解される。従って、種々の実施形態では、強力な酸加水分解以外の加水分解法を用いてもよい。
【００９４】
ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬を用いるアミノ酸の標識
図４Ａおよび４Ｂを参照、種々の実施形態では、少なくとも１つのバイアルｉＴＲＡＱ（商標）ブランドのアイソバリック試薬、および最大４バイアルの種々のｉＴＲＡＱ（商標）ブランドのアイソバリック試薬を室温まで温めて、ｉＴＲＡＱ（商標）ブランドのアイソバリック試薬の各々のバイアルに、７０μＬのエタノールを添加し、続いてボルテックスによって混合し、スピニングする（工程４３０）。１つのバイアルｉＴＲＡＱ（商標）ブランドのアイソバリック試薬を、例えば、消化されたタンパク質、加水分解されたタンパク質など由来のアミノ酸の各々のサンプル試験管について用いる。
【００９５】
アミノ酸の１つのサンプル試験管に、エタノール中の１つのｉＴＲＡＱ（商標）ブランドのアイソバリック試薬を含む１バイアルの内容物を添加し、続いてボルテックスによる混合、スピニングおよび室温で１時間のインキュベーションをする（工程４３５）。種々の実施形態では、各々の標識されたアミノ酸の少なくとも一部を浄化し（工程４４０）、（例えば、干渉するサンプル、干渉アーチファクト、などを除去するため；高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣ、交換分画、陽イオン交換、高解像陽イオン交換など、およびそれらの組み合わせによって）、その後にそれを用いて、レポーターイオンシグナルを測定する。浄化された標識されたアミノ酸の少なくとも一部をクロマトグラフィーカラムにロードする（工程４４５）（例えば、ＬＣカラム、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）カラム、またはその組み合わせ）。次いで、このクロマトグラフィーカラムからの溶離液の少なくとも一部を質量分析計システムに向け（工程４５０）、１つ以上のアミン含有化合物のアミン含有化合物レポーターイオン遷移シグナルを測定する。種々の実施形態では、アミン含有化合物レポーターイオン遷移シグナルは観察されない（工程４５５）。アミン含有化合物レポーターイオン遷移シグナルが観察されない種々の実施形態では、標識されたアミノ酸のサンプルについて、アミノ酸を標識する工程を繰り返す（工程４６０）。
【００９６】
分析のためにｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬標識アミノ酸を組み合わせる
図４Ａおよび４Ｂを参照、種々の実施形態では、各々の標識されたアミノ酸サンプル試験管の全内容物を、１つの新しいサンプル試験管に移して、合わせたサンプルを得て、これをボルテックスして混合し、次いでスピンする（工程４６５）。標識された消化されたタンパク質の各々の少なくとも一部を浄化し（工程４７０）、（例えば、干渉するサンプル、干渉アーチファクト、などを除去するため；高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣ、交換分画、陽イオン交換、高解像陽イオン交換など、およびそれらの組み合わせによって）、その後にそれを用いて、レポーターイオンシグナルを測定する（工程４７５）。浄化された標識されたアミノ酸サンプルの少なくとも一部をクロマトグラフィーカラムにロードする（例えば、ＬＣカラム、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）カラム、またはその組み合わせ）。次いで、このクロマトグラフィーカラムからの溶離液の少なくとも一部を質量分析計システムに向け（工程４８０）、１つ以上のアミン含有化合物のアミン含有化合物レポーターイオン遷移シグナルを、ＰＤＩＴＭ（例えば、ＭＲＭ）を用いて測定する。次いで、合わせたサンプル中の目的の１つ以上のアミン含有化合物の濃度（例えば、相対、絶対または両方）を決定する（工程４８５）。
【００９７】
実施例３
標準化合物との組み合わせ
図５を参照、種々の実施形態では、１つ以上のサンプル中の１つ以上のアミン含有化合物の濃度の決定を、限定はしないが、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、ニトロフラン代謝物、ポリアミンおよびカテコールアミンを含む１つ以上のアミン含有化合物を得て進行させてもよい。種々の実施形態では、アイソバリックに標識された標準化合物（工程５０５）（例えば、コントロールサンプル由来の目的のアミン含有化合物、濃度が既知のサンプル由来の目的のアミン含有化合物など）を、分析されるべき２つ以上のアイソバリックに標識されたアミン含有試験化合物、例えば、試験化合物＃１（工程５１０）、試験化合物＃２（工程５２０）、および試験化合物＃３（と例えば、組み合わせて）内部標準として用いる（工程５２５）。
【００９８】
種々の実施形態では、分析されるべき２つ以上のアミン含有試験化合物は、目的の同じアミン含有化合物を含む。例えば、試験化合物＃１、試験化合物＃２、および試験化合物＃３は、目的の同じアミン含有化合物（例えば、リジン）を、ただし、３つの異なるサンプルから（例えば、時点１、時点２、時点３など、例えば、いくつかのプロセス、例えば、疾患、ファーメンテーションなどの進行をモニターするため）、同じサンプル（例えば、サンプルの１つの実験試行において三連の分析物を得るため）、またはその組み合わせを含んでもよい。
【００９９】
１つ以上のアミン含有化合物の濃度の決定は、標準化合物および各々のアミン含有試験化合物を１セットのアイソバリックタグ由来の異なるアイソバリックタグ（例えば、ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬）で標識して、進行し得る。例えば、標準化合物を、アイソバリックタグのセット由来の第一のアイソバリックタグで標識し（工程５３０）、試験化合物＃１をアイソバリックタグのセット由来の第二のアイソバリックタグで標識し（工程５３５）、試験化合物＃２をアイソバリックタグのセット由来の第三のアイソバリックタグで標識し（工程５４０）、試験化合物＃３をアイソバリックタグのセット由来の第四のアイソバリックタグで標識してもよい（工程５４５）。
【０１００】
種々の実施形態では、アイソバリックに標識された標準化合物の少なくとも一部およびアイソバリックに標識された試験化合物の一部を合わせて（工程５５０）、合わせたサンプルを生成し、この合わせたサンプルの少なくとも一部をＰＤＩＴＭに供する。
【０１０１】
種々の実施形態では、アイソバリックに標識された標準化合物を添加することで、合わせたサンプル中で目的の１つ以上のアミン含有化合物について内部標準として機能し得る。種々の実施形態では、種々のアイソバリックに標識された標準化合物を、合わせたサンプル中の目的の各々の異なるアミン含有化合物について添加して、各々の異なるアイソバリックに標識された標準化合物が、例えば、目的の種々のアミン含有化合物について内部標準として機能する。
【０１０２】
実施例４
アミン含有化合物濃度の多重決定
以下の実施例は、１セットのｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬由来のアイソバリックタグを用いる４つのポリアミンの濃度の多重決定を例示する。本実施例の教示は、排他的ではなく、かつこれらの実験または本発明の教示の範囲を限定するものではない。
【０１０３】
材料および方法：
本実施例のスペクトルは、図６Ｂ〜図１０ＤのスペクトルのＡＰＩ２０００トリプル四重極ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム、および図１１〜図１３のスペクトルについてはＨＩＬＣカラムを装備したＨＰＬＣシステムに連結されたＡＰＩ２０００トリプル四重極装置を用いて得た。このクロマトグラフィー設定は、オートサンプラー、１５０×２．１ｍｍＣ１８逆相カラムおよびカラムヒーターを装備した二成分勾配のＨＰＬＣシステムを含む。アミン含有化合物は、メタノール中にそれらを溶解すること、次いで標準的な標識プロトコールを用いてそれらをｉＴＲＡＱ試薬と反応させることによって調製した。標準のアミンをＦｌｕｋａから得た。
【０１０４】
スペクトル：
実施例４は、合わせたサンプルを用いる複数のアミン含有化合物の濃度の決定を図示する。図６Ａ〜図１０Ｄは、未標識のおよび１セットのアイソバリックタグ由来のアイソバリックで標識された両方の個々のアミン含有化合物の質量スペクトルを示す。この実施例では、アイソバリックタグは、ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬であった。図１１および図１３は、合わせたサンプルについてのクロマトグラムを示す。本実施例の合わせたサンプル中の目的のアミン含有化合物は、１，４ジアミノブタン（プトレセン（ｐｕｔｒｅｓｃｅｎｅ））、１，５ジアミノペンタン（カドベリン）、Ｎ１−（３−アミノプロピル）−ブタン−１，４−ジアミン（スペルミジン）および１，７ジアミノヘプタンであった。図１２Ａ〜図１２Ｃは、それぞれ、１，４ジアミノブタン（プトレセン（ｐｕｔｒｅｓｃｅｎｅ））、１，５ジアミノペンタン（カドベリン）、および１，７ジアミノヘプタンについてのクロマトグラムを示す。
【０１０５】
図６Ａ〜図６Ｃを参照、未標識（６０２）およびアイソバリックタグで一級アミンで標識した（６０４）両方のプトレセン（ｐｕｔｒｅｓｃｅｎｅ）の質量スペクトルを得た。本実施例では、ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬のアイソバリックタグのセット由来の１１４アイソバリックタグＱ１１４を用いて、プトレセン（ｐｕｔｒｅｓｃｅｎｅ）の一級アミンを標識した。図６Ｂは、ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬のアイソバリックタグのセット由来のアイソバリックタグＱ１１４を用いて標識したプトレセン（ｐｕｔｒｅｓｃｅｎｅ）のＥＳＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。主要なピークは、標識されたプトレセン（ｐｕｔｒｅｓｃｅｎｅ）に対応する６３５を観察した（ｍ／ｚ約３７７）が、マイナーなピークは、標識されたプトレセン（ｐｕｔｒｅｓｃｅｎｅ）−ナトリウム付加物（ｍ／ｚ約３９９）に、および溶媒６３０（ｍ／ｚ約３７５）、６１０（ｍ／ｚ約２４５）に存在する低質量不純物に相当し、ピーク６１５、６２０、６２５のクラスター（約３１９〜３２１の間のｍ／ｚ）も観察された。
【０１０６】
図６Ｃは、ＣＩＤに供された標識されたプトレセンのＥＳＩ ＴＯＦ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。観察された主要なピーク６５０は、１１４アイソバリックタグのレポーターイオンに対応したが、標識されたプトレセン（ｍ／ｚ約３７７）６７０に、およびプトレセン構造特異的なフラグメント６６０（ｍ／ｚ約２３３）に対応するピークも観察された。
【０１０７】
図７Ａ〜７Ｃを参照、カドベリンの質量スペクトル（未標識７０２およびアイソバリックタグを用いて一級アミンで標識された７０４の両方）を得た。この実施例では、ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬アイソバリックタグのセット由来の１１５アイソバリックタグＱ１１５を用いてカドベリンの一級アミンを標識した。図７Ｂは、ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬アイソバリックタグのセット由来のアイソバリックタグＱ１１５を用いて標識したカドベリンのＥＳＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。７３０で観察されるピークは、標識されたカドベリン（ｍ／ｚ約３９１）に相当したが、溶媒７１０（ｍ／ｚ約１０２）および７２５（ｍ／ｚ約２４８）のバックグラウンドに、およびｉＴＲＡＱ（商標）反応副産物７１５（ｍ／ｚ約１６３）および７２０（ｍ／ｚ約１９１）に対応するピークも観察された。
【０１０８】
図７Ｃは、ＣＩＤに供された標識されたカドベリンのＥＳＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。観察される主要ピーク７４０は、１１５アイソバリックタグのレポーターイオンに対応するが、標識カドベリン７６０（ｍ／ｚ約３９１）に、およびカドベリン構造特異的フラグメント７５０（ｍ／ｚ約２４７）に対応するピークも観察された。
【０１０９】
図８Ａ〜８Ｃを参照、１，７−ジアミノヘプタンの質量スペクトル（未標識８０２およびアイソバリックタグを用いる一級アミンでの標識８０４の両方）が得られた。この実施例では、ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬アイソバリックタグのセット由来の１１６アイソバリックタグＱ１１６を用いて１，７−ジアミノヘプタンの一級アミンを標識した。図８Ｂは、ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬アイソバリックタグのセット由来のアイソバリックタグＱ１１６を用いて標識した１，２−ジアミノヘプタンのＥＳＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。観察されるピーク８２５は、標識された１，７−ジアミノヘプタン（ｍ／ｚ約４１９）に相当したが、溶媒バックグラウンド８１０（ｍ／ｚ約１０２）に、およびｉＴＲＡＱ（商標）反応副産物８１５（ｍ／ｚ約１６３）および８２０（ｍ／ｚ約１９１）に対応するピークも観察された。
【０１１０】
図８Ｃは、ＣＩＤに供された標識された１，７−ジアミノヘプタンのＥＳＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。観察される主要ピーク８３０は、１１６アイソバリックタグのレポーターイオンに対応するが、標識された１，７−ジアミノヘプタン８５０（ｍ／ｚ約４１９）に、および構造特異的フラグメント８４０（ｍ／ｚ約２７５）に対応するピークも観察された。
【０１１１】
図９Ａ〜９Ｄを参照、スペルミジン（未標識９０２およびアイソバリックタグを用いる一級アミンでの標識９０４の両方）の質量スペクトルを得た。この実施例では、ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬アイソバリックタグのセット由来の１１４アイソバリックタグＱ１１４を用いてスペルミジンの一級アミンを標識した。図９Ｂは、ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬アイソバリックタグのセット由来のアイソバリックタグＱ１１４を用いて標識したスペルミジンのＥＳＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。観察されるピーク９２５は、標識されたスペルミジン（ｍ／ｚ約４３４）に相当したが、ｉＴＲＡＱ（商標）反応副産物９０８（ｍ／ｚ約１６３）、９１６（ｍ／ｚ約２１７）、９１８（ｍ／ｚ約２４５）、９３０（ｍ／ｚ約４５８）に、および部分的に標識された二級アミン９３５（ｍ／ｚ約５７８）に対応するピークも観察された。
【０１１２】
図９Ｃは、ＣＩＤに供された標識されたスペルミジンのＥＳＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。観察されるピーク９４５は、１１４アイソバリックタグのレポーターイオンに対応するが、標識されたスペルミジン９８０（ｍ／ｚ約４３４）、構造特異的なフラグメント９４０（ｍ／ｚ約９７）、９５５（ｍ／ｚ約２０２）、および９７０（ｍ／ｚ約２９０）に、ｉＴＲＡＱ（商標）標識９５０（ｍ／ｚ約１４５）に、および溶媒構造フラグメント９６０（ｍ／ｚ約２１６）に対応するピークも観察された。
【０１１３】
図９Ｄは、ＣＩＤに供された標識されたスペルミジンのＥＳＩ ＴＯＦ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。観察されるピーク９８５は、１１４アイソバリックタグのレポーターイオンに対応するが、標識されたスペルミジン９９５（ｍ／ｚ約４３４）に、および二次標識されたアミン９９０（ｍ／ｚ約５７８）に対応するピークも観察された。
【０１１４】
図１０Ａ〜１０Ｄを参照、スペルミジン（未標識１００２およびアイソバリックタグを用いる一級アミンでの標識１００４の両方）の質量スペクトルを得た。この実施例では、ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬アイソバリックタグのセット由来の１１７アイソバリックタグＱ１１７を用いてスペルミジンの一級アミンを標識した。図１０Ｂは、ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬アイソバリックタグのセット由来のアイソバリックタグＱ１１７を用いて標識したスペルミジンのＥＳＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。観察されるピーク１０３５は、標識されたスペルミジン（ｍ／ｚ約４９１）に相当したが、溶媒バックグラウンド１００８（ｍ／ｚ約１７７）、１０２０（ｍ／ｚ約２４８）、および１０２２（ｍ／ｚ約２４８）に、ｉＴＲＡＱ（商標）反応副産物１０１０（ｍ／ｚ約１８５）、および１０１２（ｍ／ｚ約１９１）に、ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬アイソバリックタグのセット由来のアイソバリックタグＱ１１４で標識されたスペルミジン１０３０（ｍ／ｚ約４３４）に、標準のスペルミジンにおける不純物１０４０（ｍ／ｚ約５３５）、１０４５（ｍ／ｚ約７３８）、および１０５０（ｍ／ｚ約７５４）に対応するピークも観察された。
【０１１５】
図１０Ｃは、ＣＩＤに供された標識されたスペルミンのＥＳＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。観察されるピーク１０６０は、１１７アイソバリックタグのレポーターイオンに対応するが、標識されたスペルミン１０７５（ｍ／ｚ約４９１）に、構造特異的なフラグメント１０５５（ｍ／ｚ約１００）、１０５８（ｍ／ｚ約２０２）、および１０７０（ｍ／ｚ約２７３）に対応するピークも観察された。
【０１１６】
図１０Ｄは、ＣＩＤに供された標識されたスペルミンのＥＳＩ ＴＯＦ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。観察されるピーク１０８０は、１１７アイソバリックタグのレポーターイオンに対応するが、標識されたスペルミン１０９０（ｍ／ｚ約４９１）に、一級アミンで標識を有する、構造特異的フラグメント１０８２（ｍ／ｚ約２０２）に、構造特異的フラグメント１０８５（ｍ／ｚ約２７３）に、および全てのアミンが標識されたインタクトなアミン１０９５（ｍ／ｚ約６３５）に対応するピークも観察された。
【０１１７】
図１１は、合わせたサンプルについてのクロマトグラムを示しており、これは、ＨＩＬＣカラムを装備したＨＰＬＣシステムに連結されたＡＰＩ２０００トリプル四重極装置上のＭＲＭモードで分析された、１，４ジアミノブタン（プトレセン）１１２０、１，５ジアミノペンタン（カドベリン）１１１０、および１，７ジアミノヘプタン１１０５についてのクロマトグラムを示す。
【０１１８】
図１２Ａ〜図１２Ｃを参照、アイソバリックタグを有する一級アミンで標識されたプトレセン、カドヘリンおよび１，７−ジアミノヘプタンのクロマトグラムを得た。図１２Ａは、図１１で示されるＬＣ／ＭＳ／ＭＳ試行から得られたｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬アイソバリックタグのセット由来の１１４アイソバリックタグＱ１１４で標識されたプトレセンの抽出されたイオンクロマトグラムを示す。観察されるピーク１２０５は、標識プトレセン（保持時間約８．９分）に対応する。図１２Ｂは、図１１で示されるＬＣ／ＭＳ／ＭＳ試行から得られたｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬アイソバリックタグのセット由来の１１５アイソバリックタグＱ１１５で標識されたカドベリンの抽出されたイオンクロマトグラムを示す。観察されるピーク１２１５は、標識カドベリン（保持時間約８．８分）に対応した。図１２Ｃは、図１１で示されるＬＣ／ＭＳ／ＭＳ試行から得られたｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬アイソバリックタグのセット由来の１１６アイソバリックタグＱ１１６で標識された１，７−ジアミノヘプタンの抽出されたイオンクロマトグラムを示す。観察されるピーク１２２５は、標識された１，７−ジアミノヘプタン（保持時間約８．４分）に対応した。
【０１１９】
図１３は、合わせたサンプルについてのクロマトグラムを示しており、これは、１，７−ジアミノヘプタン１３０５、カドベリン１３１０、およびプトレセン１３２０についてのクロマトグラムを示す。
【０１２０】
図１４Ａ〜図１４Ｃを参照、マトリックスシアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸を用いて９５％アセトニトリルのバックグラウンドＯ−ＭＡＬＤＩ質量スペクトルを得た。同じスペクトルの３つの質量範囲にみられるほとんどのイオンは、溶媒に由来する化学的バックグラウンドおよび４−ヒドロキシ桂皮酸由来のマトリックスイオンから生じる。
【０１２１】
図１５は、９５％アセトニトリル（ＡＣＮ）およびシアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）中のアイソバリックタグを用いて一級アミンで標識された、プトレセン、カドベリンおよび１，７−ジアミノヘプタンの混合物のＯ−ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。標識されたプトレセン１５１２（ｍ／ｚ約３７９）、標識されたカドベリン１５２０（ｍ／ｚ約３９１）、標識された１，７−ジアミノヘプタン１５２５（ｍ／ｚ約４１９）、および標識されたスペルミジン１５３０（ｍ／ｚ約４３４）に対応する観察されたピーク、ただし、標準における化学的不純物１５０２（ｍ／ｚ約３５９）、１５０４（ｍ／ｚ約３６１）、１５０８（ｍ／ｚ約３７７）、および１５１５（ｍ／ｚ約３８０）に対応するピークも観察された。
【０１２２】
図１６Ａ〜１６Ｂを参照、プトレセンの質量スペクトル（未標識１６０２およびアイソバリックタグを用いる一級アミンでの標識１６０４の両方）の質量スペクトルを得た。この実施例では、ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬アイソバリックタグのセット由来の１１４アイソバリックタグＱ１１４を用いてプトレセンの一級アミンを標識した。図１６Ｂは、ＣＩＤに供された、マトリックス４−ヒドロキシ桂皮酸中の標識されたプトレセンのＯ−ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。観察される主要なピーク１６０８は、１１４アイソバリックタグのレポーターイオンに対応するが、標識されたプトレセン１６４０（ｍ／ｚ約３７７）に、インタクトな標識１６１０（ｍ／ｚ約１４５）に、構造特異的フラグメント１６１５（ｍ／ｚ約１７２）、１６２０（ｍ／ｚ約２３３）、１６３０（ｍ／ｚ約３３１）、および１６３５（ｍ／ｚ約３５９）に対応するピークも観察された。
【０１２３】
図１７Ａ〜図１７Ｂを参照、カドベリンの質量スペクトル（未標識１７０２およびアイソバリックタグを用いる一級アミンでの標識１７０４の両方）の質量スペクトルを得た。この実施例では、ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬アイソバリックタグのセット由来の１１５アイソバリックタグＱ１１５を用いてカドベリンの一級アミンを標識した。図１７Ｂは、マトリックス４−ヒドロキシ桂皮酸中のｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬アイソバリックタグのセット由来のアイソバリックタグＱ１１５で標識されたカドベリンのＯ−ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。観察された主なピーク１７０８は、１１５アイソバリックタグのレポーターイオンに対応したが、標識されたカドベリン１７３０（ｍ／ｚ約３９１）に、インタクトな標識１７１２（ｍ／ｚ約１４５）に、および構造特異的フラグメント１７２０（ｍ／ｚ約２４７）に対応するピークも観察された。
【０１２４】
図１８Ａ〜１８Ｂを参照、１，７−ジアミノヘプタン（未標識１８０２およびアイソバリックタグを用いる一級アミンでの標識１８０４の両方）の質量スペクトルを得た。この実施例では、ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬アイソバリックタグのセット由来の１１６アイソバリックタグＱ１１６を用いてカドベリンの一級アミンを標識した。図１８Ｂは、マトリックス４−ヒドロキシ桂皮酸中のｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬アイソバリックタグのセット由来のアイソバリックタグＱ１１６を用いて標識した１，７−ジアミノヘプタンのＯ−ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。観察されるピーク１８１５は、１１６アイソバリックタグのレポーターイオンに相当したが、標識された１，７−ジアミノヘプタン１８４５（ｍ／ｚ約４１９）に、ｉＴＲＡＱ（商標）標識フラグメント１８１０（ｍ／ｚ約１０１）に、および構造特異的フラグメント１８２５（ｍ／ｚ約２７５）および１８３５（ｍ／ｚ約３８１）に対応するピークも観察された。
【０１２５】
図１９Ａ〜１９Ｂを参照、スペルミジン（未標識１９０２およびアイソバリックタグを用いる一級アミンでの標識１９０４の両方）の質量スペクトルを得た。この実施例では、ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬アイソバリックタグのセット由来の１１４アイソバリックタグＱ１１４を用いてスペルミジンの一級アミンを標識した。図１９Ｂは、マトリックス４−ヒドロキシ桂皮酸中のｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬アイソバリックタグのセット由来のアイソバリックタグＱ１１４を用いて標識したスペルミジンのＯ−ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。観察される主要なピーク１９０８は、１１４アイソバリックタグのレポーターイオンに相当したが、標識されたスペルミジン１９６５（ｍ／ｚ約４３４）に、インタクトなｉＴＲＡＱ（商標）標識１９１２（ｍ／ｚ約１４５）に、および構造特異的フラグメント１９１５（ｍ／ｚ約１５６）、１９１８（ｍ／ｚ約１７５）、１９２５（ｍ／ｚ約１８４）、１９３０（ｍ／ｚ約２０２）、１９３５（ｍ／ｚ約２２０）、１９４０（ｍ／ｚ約２７３）、１９４５（ｍ／ｚ約２９０）および１９６０（ｍ／ｚ約４１４）に対応するピークも観察された。
【０１２６】
図２０Ａ〜２０Ｂを参照、スペルミン（未標識２００２およびアイソバリックタグを用いる一級アミンでの標識２００４の両方）の質量スペクトルを得た。この実施例では、ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬アイソバリックタグのセット由来の１１７アイソバリックタグＱ１１７を用いてスペルミジンの一級アミンを標識した。図２０Ｂは、９５％アセトニトリルおよびＣＨＣＡ中のｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬アイソバリックタグのセット由来のアイソバリックタグＱ１１７を用いて標識されたスペルミンのＯ−ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。観察される主要なピーク２０１５は、標識されたスペルミン（ｍ／ｚ約４９１）に対応するが、構造特異的フラグメント２００８（ｍ／ｚ約３７９）、および２０３０（ｍ／ｚ約５３５）に対応するピークも観察された。
【０１２７】
図２１Ａ〜図２１Ｃを参照、スペルミン（未標識２１０２およびアイソバリックタグを用いる一級アミンでの標識２１０４の両方）の質量スペクトルを得た。この実施例では、ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬アイソバリックタグのセット由来の１１７アイソバリックタグＱ１１７を用いてスペルミンの一級アミンを標識した。図２１Ｂは、４−ヒドロキシ桂皮酸マトリックス中のｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬アイソバリックタグのセット由来のアイソバリックタグＱ１１４で標識されたスペルミンのＯ−ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。観察されたピーク２１１０は、１１７アイソバリックタグのレポーターイオンに対応したが、標識されたスペルミン２１４０（ｍ／ｚ約４９１）に、および構造特異的フラグメント２１２０（ｍ／ｚ約２０２）、２１３０（ｍ／ｚ約２７５）、および２１３５（ｍ／ｚ約４７３）に対応するピークも観察された。
【０１２８】
図２１Ｃは、４−ヒドロキシ桂皮酸マトリックス中のｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬アイソバリックタグのセット由来のアイソバリックタグＱ１１７で標識されたスペルミンのＯ−ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。観察されたピーク２１５０は、１１７アイソバリックタグのレポーターイオンに対応したが、標識されたスペルミン２１８０（ｍ／ｚ約４９１）に、および構造特異的フラグメント２１６０（ｍ／ｚ約２０２）、および２１７０（ｍ／ｚ約２７５）に対応するピークも観察された。
【０１２９】
図２２Ａ〜２２Ｂを参照、スペルミン（未標識２２０２およびアイソバリックタグを用いる一級アミンで標識２２０４の両方）の質量スペクトルを得た。この実施例では、ｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬アイソバリックタグのセット由来の１１７アイソバリックタグＱ１１７を用いてスペルミンの一級アミンを標識した。図２２Ｂは、４−ヒドロキシ桂皮酸マトリックス中のｉＴＲＡＱ（商標）ブランド試薬アイソバリックタグのセット由来のアイソバリックタグＱ１１７を用いて標識したスペルミンのＯ−ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。観察される主要なピーク２２１０は、１１７アイソバリックタグのレポーターイオンに相当したが、標識されたスペルミン２２５０（ｍ／ｚ約４９１）に、構造特異的フラグメント２２２０（ｍ／ｚ約２０２）、２２３０（ｍ／ｚ約２７１）、および２２３５（ｍ／ｚ約２７３）に、およびフラグメンテーションについて選択された前駆体イオン２２６０（ｍ／ｚ約６３５）に対応するピークも観察された。
【０１３０】
図２３は、種々のアミノ酸：２３１０、２３２０、２３３０、２３４０、２３５０および２３６０についてのタンパク質加水分解産物にみられるアミノ酸を含む、ｉＴＲＡＱ（商標）１１５標識アミノ酸標準のＭＲＭ分析のクロマトグラムを示す。
【０１３１】
実施例５
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）サンプル
以下の実施例は、遊離アミノ酸を生成するために加水分解に供したタンパク質サンプルのアミノ酸の濃度の決定を例示する。本実施例の教示は、排他的ではなく、これらの実験または本発明の教示の範囲を限定するものではない。
【０１３２】
材料および方法：
タンパク質またはペプチド加水分解産物を、標準的な加水分解方法によって調製する。詳細には、１μｇを含むウシ血清サンプルを６ＮのＨＣｌを用いて１１０℃で１７時間加水分解した。次いで、この加水分解したサンプルを緩衝液、イソプロパノールおよびｉＴＲＡＱブランド試薬と混合して、室温で反応させる。次いで、このサンプルを乾燥して、分析のための所望の濃度まで再溶解するかまたは直接希釈する（代表的には、０．２μｇのペプチドまたはタンパク質が各々の分析に必要）。標準（すなわち、ノルロイシン、ノバリン）を、サンプルに添加し、その後、加水分解および／または標識して、実験手順を通じてサンプルを回収する。サンプル標識の詳細はまた、プロトコール形式で表２に示す。
【０１３３】
複数のサンプルについては（内部標準を含む場合は最大４または最大３まで）、上記のように各々のサンプルを調製し、種々のｉＴＲＡＱ試薬（１１４、１１５、１１６または１１７）で標識する。標識反応後、標識されたサンプルと種々の試薬を一緒に混合する。別々のバイアル中で（ただし、異なるタグ付け試薬を用いて）アミンまたはアミノ酸標準混合物について同じプロセスを行って、標識された標準を用いて外部較正曲線を生成してもよい。標識された標準をまた、サンプルと混合してもよく、これによって各々のアミンまたはアミノ酸についての内部標準を得る（図１を参照のこと）。ＨＰＬＣ分離は、１ｍｌ／分の流速で検出器まで２００μＬ／分のスプリットで、５０℃に加熱したＣ１８カラム（１５％炭素をロードして完全末端キャップした）を用いて行う。勾配、洗浄および平衡は全部で２０分かかる。
【０１３４】
アミノ酸濃度の定量は、ＨＰＬＣ分離、続いてＭＲＭモードで作動するトリプル四重極またはＱ ＴＲＡＰ ＭＡ／ＭＳシステムのいずれかでＥＳＩ ＭＲＭ分析を用いて行う。ＭＲＭ分析のために、ＭＲＭ遷移は、アミノ酸の標識量からなり、ＭＳ／ＭＳで用いられる特定の試薬について、例えば１１７試薬について生成されるレポーターイオンのフラグメントグリシンは、２２０．１＞１１７．１の遷移を用いてモニターする。モニターするのに必要なすべてのアミノ酸についてのＭＲＭ遷移がこの方法に入る。遷移の１つはサンプル中でスパイクされる内部標準について正常には逆転される。あらゆるアミノ酸についての内部標準は、検出応答およびクロマトグラフィー分離における任意の変動について補正する。定量は、Ａｎａｌｙｓｔ（商標）ソフトウェアおよびアミノ酸分析を支持するために特に設計されたツールを用いて行う。
【０１３５】
【表２】
本実施例のデータの作成のためのサンプルホールディングおよびＬＣ／ＭＳ／ＭＳ設定のさらなる詳細は以下のとおりである。ＬＣカラム上のローディングの前に、各々のサンプルを、ｉＴＲＡＱ試薬１１４で標識した６ｐｍｏｌｅ／μＬのアミノ酸標準を含有する２５μＬの３％ギ酸を用いて再構成した。次いで５μＬの溶液を、製造業者の推奨する手順を用いてＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＭＤＳ Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ２０００ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ装置に注入した。装置の作動条件に対する詳細は、表３〜１１に示す。表３および表４の示す条件は、装置のＬＣ部分に関連し、表５〜１１に示す条件は、その装置のＭＳ／ＭＳ部分に関連した。
【０１３６】
【表３】
【０１３７】
【表４】
本実施例では、全ての遷移を施行中連続してスキャンしないように、ＭＳ／ＭＳデータ取得においては複数のピリオド（ピリオド１〜３）を用いる。あるピリオド中の遷移のみをそのピリオドの間にスキャンする。これによって、１ピークあたりより多くのデータポイントが可能になり、これでより良好な獲得が得られる。
【０１３８】
【表５】
【０１３９】
【表６】
【０１４０】
【表７】
【０１４１】
【表８】
【０１４２】
【表９】
【０１４３】
【表１０】
【０１４４】
【表１１】
スペクトルおよび結果：
本発明の実施例では、２０アミノ酸の濃度を決定した。表１２は、各々のアミノ酸（第２列に列挙）について得たデータをまとめる。第３列は、ＬＣカラム上のアミノ酸の保持時間を列挙する。第四列は、濃度が未知のサンプルのアミノ酸と関連したピークの面積を列挙しており、第五列は、アミノ酸標準サンプルと関連したピークの面積を列挙しており、第六列は、標準サンプル中のアミノ酸の濃度を列挙しており、第七列は、本発明の教示を用いるこの実施例におけるアミノ酸について決定した濃度を列挙した。未知のサンプル中のアミノ酸の濃度は、未知のサンプルのアミノ酸に関連するピークの領域を標準サンプルに関連するピークの領域で割ること、およびこの比に公知のサンプルの濃度を掛けることによって決定した。
【０１４５】
スペクトルの例を図２４、および２５Ａ〜２５Ｕに示す。
【０１４６】
図２４は、ｉＴＲＡＱ（商標）１１４標識したアミノ酸標準、および１１７標識したサンプルのＭＲＭ分析のクロマトグラムを示す。図２４に示される種々の保持時間に対応するアミノ酸を表１２に列挙する。図２５Ａ〜図２５Ｕは、測定した種々のアミノ酸についてのＭＲＭデータを模式的に示す。図２５Ａ〜図２５Ｕの各々の右パネルは、内部標準（ＩＳ）１１４標識アミノ酸のイオンシグナルを、左パネルは、１１７標識サンプルのイオンシグナルを示している。いずれか面積が由来するピークには影をつけている。Ｃｙａについて注記すべきであるが、サンプルのシグナルは検出されておらず、従って影付きのピークは、図２５Ａの左パネルにはみられない。
【０１４７】
図２６Ａ〜Ｂは、Ｂｅｃｋｍａｎでのカラム誘導体化の前後の標準アミノ酸分析方法／装置に対してアミノ酸の測定濃度を比較する。この結果は、これらの方法と極めて一致している。
【０１４８】
図２６Ａおよび図２６Ｂは、理論、およびＢｅｃｋｍａｎ Ｇｏｌｄシステムに対して代表的なタンパク質加水分解産物サンプルについて、結果を比較する。図２６Ａは、各々のアミノ酸の理論上のモルパーセント（所定のアミノ酸について最も左のバー）と、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｇｏｌｄシステムで決定したモルパーセント（所定のアミノ酸について真ん中のバー）およびＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いてこの実施例で測定したモルパーセント（所定のアミノ酸について最も右のバー）とを比較する。図２６Ｂは、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｇｏｌｄシステムで行ったタンパク質加水分解サンプルについての理論値からの変動（所定のアミノ酸について左のバー）およびＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いてこの実施例で測定した値（所定のアミノ酸について右のバー）とを比較する。本実施例からのチロシンの値（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム）は低い。なぜなら、このサンプルは、ヒドロキシルアミンでは処理されなかったからである（ヒドロキシアミンは、チロシンから望ましくない第二のｉＴＲＡＱ試薬標識を除去し得る）。
【０１４９】
【表１２】
実施例６：体液サンプル
以下の実施例は、生物学的サンプル中の遊離アミノ酸の濃度の決定を例示する。本実施例のデータは血漿サンプルに対してであるが、本発明の実施例の教示は、限定はしないが尿を含む他の体液に供され得る。本実施例の教示は、排他的ではなく、これらの実験または本発明の教示の範囲を限定するものではない。本実施例では、血漿サンプル中の４８の遊離のアミノ酸をモニターした。このモニターされたアミノ酸を表１３に列挙する。
【０１５０】
【表１３】
血漿中の１つ以上の遊離アミノ酸のモニタリングは、例えば、新生児における疾患の検出および／またはモニタリング、バイオマーカーの検出などを含むいくつかの実際的な適用を有する。例えば、新生児における特定の遊離アミノ酸は、暗示的な新生児の代謝性疾患、例えば、メチルマロン酸血症およびプロピオン酸血症などであってもよい。特定の一般的アミノ酸病（ａｍｉｎｏａｃｉｄｏｐａｔｈｉｅｓ）に関連するアミノ酸の上昇の例も表１４に列挙する。
【０１５１】
【表１４】
このような代謝性障害は、遺伝子障害のまれな群であるが、それらは、罹患した乳幼児に重篤な結果を有し得る。未処置のままであれば、これらの障害は、不可逆性の精神遅滞（軽度から重度におよぶ）、身体障害、神経学的障害、さらには致死を生じ得る。早期の検出（出生後すぐ）および正確な診断が、急速かつ有益な処置を達成するには極めて重要である。
【０１５２】
材料および方法：
体液（例えば、血漿、血清、尿）については、１部のサンプルを４部のイソプロパノールまたはエタノールと混合して、サンプル中のほとんどのタンパク質を沈殿させる。緩衝液を上清に加えて、標識反応のために塩基性ｐＨを維持する。次いで、ｉＴＲＡＱブランド試薬を添加して、室温で反応させる。次いで、このサンプルを乾燥して再溶解するか、または分析のために所望の濃度まで直接希釈する（代表的には１００ｎＬの体液が各々の分析に必要である）。サンプル標識の詳細はまた、プロトコール形式で表１５に示す。
【０１５３】
【表１５】
本実施例のデータの作成のためのサンプルホールディングおよびＬＣ／ＭＳ／ＭＳ設定のさらなる詳細は以下のとおりである。ＬＣカラム上のローディングの前に、各々のサンプルを、ｉＴＲＡＱ試薬１１７で標識した１０ｐｍｏｌｅ／μＬのアミノ酸標準を含有する４０μＬの３％ギ酸を用いて再構成した。次いで２μＬの容積を、製造業者の推奨する手順を用いてＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＭＤＭ Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ３２０００ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ装置に注入した。装置の作動条件に対する詳細は、表１６〜２６に示す。表１６および表１７の示す条件は、その装置のＬＣ部分に関連し、表１８〜２６に示す条件は、その装置のＭＳ／ＭＳ部分に関連した。
【０１５４】
【表１６】
【０１５５】
【表１７】
本実施例では、全ての遷移を施行中連続してスキャンしないように、ＭＳ／ＭＳデータ取得においては複数のピリオド（ピリオド１〜４）を用いる。あるピリオド中の遷移のみをそのピリオドの間にスキャンする。これによって、１ピークあたりより多くのデータポイントが可能になり、これでより良好な獲得が得られる。
【０１５６】
【表１８】
【０１５７】
【表１９】
【０１５８】
【表２０】
【０１５９】
【表２１】
【０１６０】
【表２２】
【０１６１】
【表２３】
【０１６２】
【表２４】
【０１６３】
【表２５】
【０１６４】
【表２６】
スペクトルおよび結果：
本実施例では、４８アミノ酸をモニターした。表２７は、各々の検出されたアミノ酸について得られたデータをまとめる。第２列は、内部標準におけるアミノ酸の量を列挙し、第３列は、外部標準スパイクにおける量、第四列は、サンプル中の測定したアミノ酸のレベルを列挙しており、第五列は、血漿コントロールの範囲を列挙する。
【０１６５】
【表２７】
実施例７；カテコールアミン
本実施例は、ｉＴＲＡＱ標識されたカテコールアミン（ＣＡＴ）のクロマトグラム分離を考察する。ＣＡＴはしばしば、尿、血漿およびＣＳＦ（脳脊髄液）のサンプルの臨床分析における目的である。血漿および尿中の慣用的な臨床分析は、例えば、腫瘍（神経芽細胞腫、フェアチトクロマ（ｐｈｅａｃｙｔｏｃｈｒｏｍａ）など）ならびにその年齢および位置を診断するために行う。ＣＡＴはまたしばしば神経伝達物質であって、ＣＳＦ中で、例えば、高血圧の薬の薬物開発における製薬産業においてモニターされる。
【０１６６】
カテコールアミンおよび関連の化合物は、重要な心血管系および代謝のエフェクターである。種々の体液中のこれらの化合物の濃度を決定することは、臨床および薬物開発の研究室において重大である。現在では、標準的な分析方法は、種々の化学的およびクロマトグラフィー干渉である傾向である。ここでは、本発明者らは、ｉＴＲＡＱ化学、１セットの４アミン反応性アイソバリック複数標識試薬を用いる単一分析におけるカテコールアミン、関連化合物およびアミノ酸の高感度の定量のための新規な方法を示す。この誘導体をＭＲＭ（複数反応モニタリング）モードにおいてＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて、分析して定量し、これによって極めて高い程度の感度および特異性を得た。
【０１６７】
本発明の実施例では、ＣＡＴ類 ヒスタミン、ノルエピネフリン、エピネフリン、メタネフリン、ドーパミンおよびセロトニンをモニターする。さらに、アミノ酸であるｇｌｕおよびｔｙｒをモニターする。
【０１６８】
材料および方法
カテコールアミン、関連の化合物およびいくつかのアミノ酸の標準混合物を調製して、標準的なプロトコールを用いてｉＴＲＡＱ試薬で標識した。誘導体は、Ｃ１８逆相カラムで、揮発性イオン対合試薬を含む水−アセトニトリル勾配を用いて、１ｍＬ／分の流速で分離した。誘導体化された標準の一連の希釈物を注入して、ＬＯＤ（検出限界）および較正曲線を種々の成分について決定した。体液サンプル（尿、ＣＳＦ、血漿）（標準の添加は有無）を、公開されたプロトコールに従って調製して、標識して分析し、この方法の感度および正確性に対するマトリクス効果を決定した。サンプルを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＭＤＳ ＳＣＩＥＸ ＡＰＩ−４０００トリプル四重極質量分析計、ＥＳＩ＋、ＭＲＭモードで分析した。
【０１６９】
結果
この結果は、以下のカテコールアミン、関連化合物およびアミノ酸を標識および定量する実現可能性を示す：ドーパ（３，４−ジヒドロキシ−ＤＬ−フェニルアラニン）、ドーパミン、エピネフリン、ノルエピネフリン、メタネフリン、ノルメタネフリン、メチルドーパ、３−メトキシチラミン、セラトニン（Ｓｅｒａｔｏｎｉｎ）、ヒスタミン、ＡＢＡ（アミノ酪酸）、チロシンおよびグルタミン酸。ＬＯＤは、抽出物提出の時点で０．００４ピコモル／μＬである。種々のサンプルについての直線性は、（Ｒ＝０．９０００〜０．９９９８）におよぶ。正確性および精度に取り組む。ベースラインの分離が、カテコールアミン異性体のドーパ（３４２／１１７）およびメタネフリン（３４２／１１７）について、ならびにエピネフリン（３２８／１１７）およびノルメタネフリン（３２８／１１７）について達成されている。
【０１７０】
実施例８
ドーパミン範囲
図２７Ａおよび図２７Ｂは、アミノ酸濃度の決定のための本発明の教示の種々の実施形態の動的な範囲および応答に対するデータを示す。図２７Ａは、約１０〜約９９０ピコモル（ｐｍｏｌｅ）というノルバリンの濃度についての応答に対するデータを示す。各々の実験（データポイント）は、３０ｐｍｏｌｅの内部標準および３通りの注射を用いる。漸増量のアミノ酸をＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムに注射して、それらの応答に対してプロットした。図２７Ａによって、その応答は、３ケタの大きさの濃度について線形であるということが示される。
【０１７１】
図２７Ｂは、約１０〜約９９０ピコモル（ｐｍｏｌｅ）というロイシンの濃度についての応答に対するデータを示す。各々の実験（データポイント）は、３０ｐｍｏｌｅの内部標準および３通りの注射を用いる。漸増量のアミノ酸をＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムに注射して、それらの応答に対してプロットした。図２９Ｂによって、その応答は、３ケタの大きさの濃度について線形であるということが示される。
【０１７２】
実施例９
生理学的な流体中のチロキシンおよび構造的に関連する甲状腺ホルモンの多重の絶対的および相対的な定量
以下の実施例は、ｉＴＲＡＱブランド試薬のセット由来のアイソバリックタグを用いるチロキシンの定量のための方法を例示する。本実施例の方法では、チロキシンは、一般式ＩＶ：
【０１７３】
【化４】
によって示され得、ここで各々のＲ１は独立してヨウ素または水素であり；かつ
Ｒ２はカルボキシル、ヒドロキシルまたはメチルである。
【０１７４】
チロキシン化合物は、甲状腺ホルモンであってもよく、それらの血中の値は、例えば、疾患の診断および予測指標として機能し得る。例えば、以下の３つのチロキシン化合物（式（ＩＶａ）−（ＩＶｃ））がしばしば疾患状態をモニタリングするために用いられる：
【０１７５】
【化５】
本実施例は、本教示の場合種々の実施形態を用いてサンプル中のチロキシンを分析するための方法を例示する。例えば、提供され得る分析物としては、限定はしないが以下が挙げられる：
１．外部較正曲線を用いる１サンプル中のチロキシンの絶対的定量。例えば、チロキシンは、ｉＴＲＡＱブランド試薬のセット由来の１１４、１１５または１１６アイソバリックタグで別々に標識されてもよく、アミノ酸標準で作成された外部較正は、ｉＴＲＡＱブランド試薬のセット由来の１１７アイソバリックタグで標識されてもよい。
【０１７６】
２．（１）において上で記載されたような外部較正曲線、ならびにｉＴＲＡＱブランド試薬のセット由来の１１７アイソバリックタグで標識されたチロキシンからなる内部標準および分析されるべきサンプルに直接添加された標識された標準を用いる１サンプル中のチロキシンの絶対的定量。
【０１７７】
３．外部較正曲線を用いる２つの異なるサンプル中のチロキシンの絶対的定量。各々のチロキシンサンプルは例えば、ｉＴＲＡＱブランド試薬のセット由来の１１４、１１５、または１１６アイソバリックタグで別々に標識されてもよい。ｉＴＲＡＱブランド試薬のセット由来の１１７アイソバリックタグで標識されたチロキシン標準を用いて、外部較正曲線を作成してもよい。２つのサンプルは、例えば、同じであって、二連のサンプルで処理されても、または異なるサンプルでもよい。
【０１７８】
４．外部較正および内部標準を用いる２つの異なるサンプル中のチロキシンの絶対的定量。チロキシン標準は、ｉＴＲＡＱブランド試薬のセット由来の１１７アイソバリックタグで標識されて、内部標準としてサンプルに添加されてもよい。２つのサンプルは、例えば、同じであって、二連のサンプルで処理されても、または異なるサンプルであってもよい。
【０１７９】
５．外部較正を用いる３つのサンプル中のチロキシンの絶対的定量。各々のチロキシンサンプルは、ｉＴＲＡＱブランド試薬のセット由来の１１７アイソバリックタグで標識されたチロキシン標準を用いて、ｉＴＲＡＱブランド試薬のセット由来の１１４、１１５、または１１６アイソバリックタグで別々に標識されてもよい。この３つのサンプルは、例えば、同じであって、三連のサンプルで処理されても、または３つのサンプルのうち２つが同じであって二連で処理されても、２つ以上の異なるサンプルであっても、またはその組み合わせでもよい。
【０１８０】
６．外部較正および内部標準を用いる３つのサンプル中のチロキシンの絶対的定量。チロキシン標準は、ｉＴＲＡＱブランド試薬のセット由来の１１７アイソバリックタグで標識されて、このサンプルに直接添加されてもよい。この３つのサンプルは、例えば、同じであって、三連で処理されても、または３つのサンプルのうち２つが同じであって二連で処置されても、２つ以上の異なるサンプルであっても、またはその組み合わせでもよい。
【０１８１】
７．外部較正曲線を用いる４つのサンプル中のチロキシンの絶対的定量。各々のチロキシンサンプルは、ｉＴＲＡＱブランド試薬のセット由来の１１４、１１５、１１６または１１７アイソバリックタグで別々に標識されてもよい。この４つのサンプルは、例えば、同じであって、四連で処理されても、または４つのサンプルのうち３つが同じであって三連で処理されても、３つのサンプルのうち２つが同じであって二連で処理されても、２つ以上の異なるサンプルであっても、またはその組み合わせでもよい。
【０１８２】
８．ｉＴＲＡＱブランド試薬のセット由来の１１４、１１５、１１６または１１７アイソバリックタグで標識された最大４つのサンプルにおけるチロキシンの相対的定量。この４つのサンプルは、例えば、同じであって、四連で処理されても、４つのサンプルのうち３つが同じであって三連で処理されても、３つのサンプルのうち２つが同じであって二連で処理されても、２つ以上の異なるサンプルであっても、またはその組み合わせでもよい。
【０１８３】
材料および方法
以下の構成要素が、生理学的な流体中でチロキシン（ＩＶａ）の絶対的定量を決定するのに用いられ得る：チロキシン標準、ｉＴＲＡＱブランド試薬のセット由来の１〜４アイソバリックタグ、オートサンプラーおよびカラムヒーター、１５０×２．１ｍｍのＣ１８逆相カラム、トリプル四重極またはＱ Ｔｒａｐテクノロジーに基づくＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムを装備したバイナリーＨＰＬＣシステム。
【０１８４】
チロキシン標準サンプルを、塩基性緩衝液（０．５Ｍの重炭酸トリエチルアンモニウムまたはホウ酸ナトリウム、ｐＨ８．５）に溶解し、ここにエタノールに溶解されたｉＴＲＡＱブランド試薬セット由来のアイソバリックタグのうちの１つを添加する（例えば、１１７アイソバリックタグ）。目的のサンプルを、塩基性緩衝液に添加して、ｉＴＲＡＱブランド試薬セット由来の異なるアイソバリックタグ（例えば、１１４、１１５または１１６アイソバリックタグ）をこのサンプルに添加する。サンプル中の総アミン含量よりも約３倍〜５倍過剰のｉＴＲＡＱブランド試薬を用いる。両方のサンプルをそれぞれのｉＴＲＡＱ試薬と３０分間、室温で反応させ、その後に適切な溶媒（例えば、０．１％ギ酸＋１０ｍＭのトルエンスルホン酸または１０ｍＭのトルエンスルホン酸または１０ｍＭのスルホン酸水素ナトリウム）に希釈して、ＰＤＩＴＭ（例えば、ＭＲＭ分析）に供する。
【０１８５】
サンプルの絶対定量は、例えば、１１７アイソバリックタグで標識された標準を用いる、較正曲線を作成するための、外部標準の使用、内部標準を得るために目的のサンプルに添加された１１７アイソバリックタグで標識された標準サンプルの使用、またはその両方によって提供され得る。
【０１８６】
ＬＣ−ＭＲＭ分析
本明細書に考察されるとおり、広範な種々の装置を用いてもよい。例えば、種々の実施形態では、実験設定は、バイナリーＨＰＬＣポンプ、オートサンプラー、カラムヒーターおよびＣ１８カラムを備える。ＨＰＬＣは、勾配条件下で２００μｌ／ｍｌの流速で作動させて、チロキシンおよび誘導体のベースライン解像を得る。ＨＰＬＣは、トリプル四重極または線形イオントラップ質量分析計のいずれかと、ＭＲＭ方式で干渉して、サンプル中のチロキシンのＰＤＴＩＭおよび定量が得られる。
【０１８７】
限定はしないが、特許、特許出願、記事、本、論文およびウェブページを含む本出願に引用される全ての文献および同様の資料は、このような文献および同様の資料の形式にかかわらず、その全体が参照によって明らかに援用される。組み込まれる文献および同様の資料のうちの１つ以上が、限定はしないが規定される用語、用語の用法、記載される技術などを含む本出願と異なるかまたは矛盾する事象では、本出願が支配する。
【０１８８】
本明細書に用いられる見出しは、組織化の目的に過ぎず、記載される主題を限定するとは決して解釈されるべきではない。
【０１８９】
本発明の教示は、種々の実施形態および実施例と組み合わせて記載してきたが、本発明の教示は、このような実施形態または実施例に限定されるものではない。逆に、本教示は、当業者によって理解されるとおり、種々の代替、改変および等価物を包含する。
【０１９０】
本教示は、特定の例示的実施例を参照して特に示されかつ記載されてきたが、形態および詳細における種々の変化が、本教示の趣旨および範囲から逸脱することなくなされ得るということが理解されるべきである。例えば、任意の開示された工程を、任意の他の開示された工程と組み合わせて、本発明の種々の実施形態に従ってアミン含有化合物を分析する方法を得てもよい。従って、本教示の趣旨および範囲内の全ての実施形態、ならびにその等価物が特許請求される。本教示の方法、システムおよびアッセイの説明および図表は、その効果について言及するのでない限り、構成要素の記載された順序を限定すると判断されるべきではない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上のサンプルにおいて１つ以上のチロキシン化合物を分析するための方法であって、該チロキシン化合物が、一般式（ＩＶ）：
【化６】
によって示され得、
ここでＲ１の各々が独立してヨウ素または水素であり；かつ
Ｒ２がカルボキシ、ヒドロキシまたはメチルであり、
該方法は、以下の工程：
チロキシンを含む標準化合物を提供する工程と；
１セットのアイソバリックタグ由来のアイソバリックタグで該標準化合物を標識する工程と；
該セットのアイソバリックタグ由来の異なるアイソバリックタグで１つ以上のチロキシン化合物を各々標識する工程と；
該アイソバリックに標識された標準化合物の少なくとも一部と該アイソバリックに標識されたチロキシン化合物の各々の少なくとも一部とを合わせて、合わされたサンプルを生成する工程と；
該合わせたサンプルの少なくとも一部をクロマトグラフィーカラムにロードする工程と；
該クロマトグラフィーカラムからの溶離液の少なくとも一部を親・娘イオン遷移モニタリングに対して供する工程であって、
第一の伝送親イオンｍ／ｚ範囲が該アイソバリックに標識されたチロキシン化合物の１つ以上のｍ／ｚ値を含み、かつ第一の伝送娘イオンｍ／ｚ範囲が該アイソバリックに標識されたチロキシン化合物のアイソバリックタグの少なくとも１つに相当する少なくとも１つのレポーターイオンのｍ／ｚ値を含み；
第二の伝送親イオンｍ／ｚ範囲がアイソバリック標準化合物の１つ以上のｍ／ｚ値を含み、かつ第二の伝送娘イオンｍ／ｚ範囲が該アイソバリックに標識された標準化合物のアイソバリックタグに対応するレポーターイオンのｍ／ｚ値を含む、工程と；
該伝送レポーターイオンの１つ以上のイオンシグナルを測定する工程と；
該アイソバリックに標識された標準化合物に対応するレポーターイオンの該測定されたイオンシグナルに対する、対応するレポーターイオンの該測定されたイオンシグナルの比較に少なくとも基づいた、該アイソバリックに標識されたチロキシン化合物の１つ以上の濃度を決定する工程と；
を包含する、方法。
【請求項２】
前記１つ以上のチロキシン化合物が、一般式（ＩＶａ）：
【化７】
によって示される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１つ以上のチロキシン化合物が、一般式（ＩＶｂ）：
【化８】
によって示される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記１つ以上のチロキシン化合物が、一般式（ＩＶｃ）：
【化９】
によって示される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記サンプルの１つ以上が生理学的な流体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記１つ以上のチロキシン化合物が、２つ以上のサンプル由来の実質的に同じチロキシン化合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、前記クロマトグラフィーカラムからの溶離液の少なくとも一部を親・娘イオン遷移モニタリングに対して供する工程が、トリプル四重極、四重極／飛行時間質量分析計、線形イオントラップ質量分析計、またはタンデム飛行時間質量分析計のうちの１つ以上を用いる工程を包含する、方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、前記クロマトグラフィーカラムからの溶離液の少なくとも一部を親・娘イオン遷移モニタリングに対して供する工程が、マトリックス中で前記合わせたサンプルを混合する工程と、マトリックス支援レーザー脱離イオン化を用いて、該親・娘イオン遷移モニタリングのためにイオンを生成する工程とを包含する、方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、前記アイソバリックに標識されたチロキシン化合物のうち１つ以上の濃度を決定する工程が、該アイソバリックに標識されたチロキシン化合物のうち１つ以上の絶対濃度を決定する工程を包含する、方法。
【請求項１０】
１つ以上のサンプルにおいて１つ以上のチロキシン化合物を分析するための方法であって、該チロキシン化合物が、一般式（ＩＶ）：
【化１０】
によって示され得、
ここでＲ１の各々が独立してヨウ素または水素であり；かつ
Ｒ２がカルボキシ、ヒドロキシまたはメチルであり、
該方法は、以下の工程：
１セットのアイソバリックタグ由来の異なるアイソバリックタグを各々用いて１つ以上のチロシン化合物を標識する工程と；
該アイソバリックに標識された標準化合物の各々の少なくとも一部を合わせて、合わされたサンプルを生成する工程と；
該合わせたサンプルの少なくとも一部をクロマトグラフィーカラムにロードする工程と；
該クロマトグラフィーカラムからの溶離液の少なくとも一部を親・娘イオン遷移モニタリングに対して供する工程であって、ここで伝送親イオンｍ／ｚ範囲が該アイソバリックに標識されたチロキシン化合物の１つ以上のｍ／ｚ値を含み、かつ伝送娘イオンｍ／ｚ範囲が該アイソバリックに標識されたチロキシン化合物のアイソバリックタグの少なくとも１つに相当する少なくとも１つのレポーターイオンのｍ／ｚ値を含む、工程と；
該伝送レポーターイオンの１つ以上のイオンシグナルを測定する工程と；
標準化合物の濃度曲線に対する対応するレポーターイオンの測定されたイオンシグナルの比較に少なくとも基づいた、アイソバリックに標識されたチロキシン化合物の１つ以上の濃度を決定する工程と；
を包含する、方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、前記標準化合物の濃度曲線が：
（ａ）チロキシン化合物を含み、かつ第一の濃度を有する標準化合物を提供する工程と；
（ｂ）１セットのアイソバリックタグ由来のアイソバリックタグを用いて該標準化合物を標識する工程と；
（ｃ）該アイソバリックに標識された標準化合物の少なくとも一部をクロマトグラフィーカラムにロードする工程と；
（ｄ）該クロマトグラフィーカラムからの溶離液の少なくとも一部を親・娘イオン遷移モニタリングに対して供する工程であって、ここで伝送親イオンｍ／ｚ範囲が該アイソバリックに標識された標準化合物のｍ／ｚ値を含み、かつ伝送娘イオンｍ／ｚ範囲が該アイソバリックに標識された標準化合物のアイソバリックタグに相当する１つのレポーターイオンのｍ／ｚ値を含む、工程と；
（ｅ）該伝送レポーターイオンのイオンシグナルを測定する工程と；
（ｆ）１つ以上の異なる標準化合物濃度について、工程（ａ）〜（ｅ）を反復する工程と；
（ｇ）２つ以上の標準化合物濃度で該伝送レポーターイオンの測定されたイオンシグナルに少なくとも基づいて、該標準化合物について濃度曲線を作成する工程と；
によって生成される、方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載の方法であって、前記アイソバリックに標識されたチロキシン化合物のうち１つ以上の濃度を決定する工程が、該アイソバリックに標識されたチロキシン化合物のうち１つ以上の絶対濃度を決定する工程を包含する、方法。
【請求項１３】
前記１つ以上のチロキシン化合物が、一般式（ＩＶａ）：
【化１１】
によって示される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記１つ以上のチロキシン化合物が、一般式（ＩＶｂ）：
【化１２】
によって示される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記１つ以上のチロキシン化合物が、一般式（ＩＶｃ）：
【化１３】
によって示される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
１つ以上のサンプルにおいて１つ以上のチロキシン化合物を分析するための方法であって、該チロキシン化合物が、一般式（ＩＶ）：
【化１４】
によって示され得、
ここでＲ１の各々が独立してヨウ素または水素であり；かつ
Ｒ２がカルボキシ、ヒドロキシまたはメチルであり、
該方法は、以下の工程：
１セットのアイソバリックタグ由来の異なるアイソバリックタグを各々用いて１つ以上のチロシン化合物を標識する工程と；
該アイソバリックに標識されたチロキシン化合物の各々の少なくとも一部を合わせて、合わされたサンプルを生成する工程と；
該合わせたサンプルの少なくとも一部を、マトリックス支援レーザー脱離イオン化を用いる親・娘イオン遷移モニタリングに対して供する工程であって、ここで第一の伝送親イオンｍ／ｚ範囲が該アイソバリックに標識されたチロキシン化合物の１つ以上のｍ／ｚ値を含み、かつ第一の伝送娘イオンｍ／ｚ範囲が該アイソバリックに標識されたチロキシン化合物のアイソバリックタグの少なくとも１つに相当する少なくとも１つのレポーターイオンのｍ／ｚ値を含む、工程と；
該伝送レポーターイオンの１つ以上のイオンシグナルを測定する工程と；
チロキシン化合物を含む標準化合物の測定されたイオンシグナルに対する対応するレポーターイオンの測定されたイオンシグナルの比較に少なくとも基づいた、該アイソバリックに標識されたチロキシン化合物の１つ以上の濃度を決定する工程と；
を包含する、方法。
【請求項１７】
前記１つ以上のチロキシン化合物が、一般式（ＩＶａ）：
【化１５】
によって示される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記１つ以上のチロキシン化合物が、一般式（ＩＶｂ）：
【化１６】
によって示される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記１つ以上のチロキシン化合物が、一般式（ＩＶｃ）：
【化１７】
によって示される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１】
１つ以上のサンプルにおいて１つ以上のチロキシン化合物を分析するための方法であって、該チロキシン化合物が、一般式（ＩＶ）：
【化６】
によって示され得、
ここでＲ１の各々が独立してヨウ素または水素であり；かつ
Ｒ２がカルボキシ、ヒドロキシまたはメチルであり、
該方法は、以下の工程：
チロキシンを含む標準化合物を提供する工程と；
１セットのアイソバリックタグ由来のアイソバリックタグで該標準化合物を標識する工程と；
該セットのアイソバリックタグ由来の異なるアイソバリックタグで１つ以上のチロキシン化合物を各々標識する工程と；
該アイソバリックに標識された標準化合物の少なくとも一部と該アイソバリックに標識されたチロキシン化合物の各々の少なくとも一部とを合わせて、合わされたサンプルを生成する工程と；
該合わせたサンプルの少なくとも一部をクロマトグラフィーカラムにロードする工程と；
該クロマトグラフィーカラムからの溶離液の少なくとも一部を親・娘イオン遷移モニタリングに対して供する工程であって、
第一の伝送親イオンｍ／ｚ範囲が該アイソバリックに標識されたチロキシン化合物の１つ以上のｍ／ｚ値を含み、かつ第一の伝送娘イオンｍ／ｚ範囲が該アイソバリックに標識されたチロキシン化合物のアイソバリックタグの少なくとも１つに相当する少なくとも１つのレポーターイオンのｍ／ｚ値を含み；
第二の伝送親イオンｍ／ｚ範囲がアイソバリック標準化合物の１つ以上のｍ／ｚ値を含み、かつ第二の伝送娘イオンｍ／ｚ範囲が該アイソバリックに標識された標準化合物のアイソバリックタグに対応するレポーターイオンのｍ／ｚ値を含む、工程と；
該伝送レポーターイオンの１つ以上のイオンシグナルを測定する工程と；
該アイソバリックに標識された標準化合物に対応するレポーターイオンの該測定されたイオンシグナルに対する、対応するレポーターイオンの該測定されたイオンシグナルの比較に少なくとも基づいた、該アイソバリックに標識されたチロキシン化合物の１つ以上の濃度を決定する工程と；
を包含する、方法。
【請求項２】
前記１つ以上のチロキシン化合物が、一般式（ＩＶａ）：
【化７】
によって示される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１つ以上のチロキシン化合物が、一般式（ＩＶｂ）：
【化８】
によって示される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記１つ以上のチロキシン化合物が、一般式（ＩＶｃ）：
【化９】
によって示される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記サンプルの１つ以上が生理学的な流体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記１つ以上のチロキシン化合物が、２つ以上のサンプル由来の実質的に同じチロキシン化合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、前記クロマトグラフィーカラムからの溶離液の少なくとも一部を親・娘イオン遷移モニタリングに対して供する工程が、トリプル四重極、四重極／飛行時間質量分析計、線形イオントラップ質量分析計、またはタンデム飛行時間質量分析計のうちの１つ以上を用いる工程を包含する、方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、前記クロマトグラフィーカラムからの溶離液の少なくとも一部を親・娘イオン遷移モニタリングに対して供する工程が、マトリックス中で前記合わせたサンプルを混合する工程と、マトリックス支援レーザー脱離イオン化を用いて、該親・娘イオン遷移モニタリングのためにイオンを生成する工程とを包含する、方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、前記アイソバリックに標識されたチロキシン化合物のうち１つ以上の濃度を決定する工程が、該アイソバリックに標識されたチロキシン化合物のうち１つ以上の絶対濃度を決定する工程を包含する、方法。
【請求項１０】
１つ以上のサンプルにおいて１つ以上のチロキシン化合物を分析するための方法であって、該チロキシン化合物が、一般式（ＩＶ）：
【化１０】
によって示され得、
ここでＲ１の各々が独立してヨウ素または水素であり；かつ
Ｒ２がカルボキシ、ヒドロキシまたはメチルであり、
該方法は、以下の工程：
１セットのアイソバリックタグ由来の異なるアイソバリックタグを各々用いて１つ以上のチロシン化合物を標識する工程と；
該アイソバリックに標識された標準化合物の各々の少なくとも一部を合わせて、合わされたサンプルを生成する工程と；
該合わせたサンプルの少なくとも一部をクロマトグラフィーカラムにロードする工程と；
該クロマトグラフィーカラムからの溶離液の少なくとも一部を親・娘イオン遷移モニタリングに対して供する工程であって、ここで伝送親イオンｍ／ｚ範囲が該アイソバリックに標識されたチロキシン化合物の１つ以上のｍ／ｚ値を含み、かつ伝送娘イオンｍ／ｚ範囲が該アイソバリックに標識されたチロキシン化合物のアイソバリックタグの少なくとも１つに相当する少なくとも１つのレポーターイオンのｍ／ｚ値を含む、工程と；
該伝送レポーターイオンの１つ以上のイオンシグナルを測定する工程と；
標準化合物の濃度曲線に対する対応するレポーターイオンの測定されたイオンシグナルの比較に少なくとも基づいた、アイソバリックに標識されたチロキシン化合物の１つ以上の濃度を決定する工程と；
を包含する、方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、前記標準化合物の濃度曲線が：
（ａ）チロキシン化合物を含み、かつ第一の濃度を有する標準化合物を提供する工程と；
（ｂ）１セットのアイソバリックタグ由来のアイソバリックタグを用いて該標準化合物を標識する工程と；
（ｃ）該アイソバリックに標識された標準化合物の少なくとも一部をクロマトグラフィーカラムにロードする工程と；
（ｄ）該クロマトグラフィーカラムからの溶離液の少なくとも一部を親・娘イオン遷移モニタリングに対して供する工程であって、ここで伝送親イオンｍ／ｚ範囲が該アイソバリックに標識された標準化合物のｍ／ｚ値を含み、かつ伝送娘イオンｍ／ｚ範囲が該アイソバリックに標識された標準化合物のアイソバリックタグに相当する１つのレポーターイオンのｍ／ｚ値を含む、工程と；
（ｅ）該伝送レポーターイオンのイオンシグナルを測定する工程と；
（ｆ）１つ以上の異なる標準化合物濃度について、工程（ａ）〜（ｅ）を反復する工程と；
（ｇ）２つ以上の標準化合物濃度で該伝送レポーターイオンの測定されたイオンシグナルに少なくとも基づいて、該標準化合物について濃度曲線を作成する工程と；
によって生成される、方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載の方法であって、前記アイソバリックに標識されたチロキシン化合物のうち１つ以上の濃度を決定する工程が、該アイソバリックに標識されたチロキシン化合物のうち１つ以上の絶対濃度を決定する工程を包含する、方法。
【請求項１３】
前記１つ以上のチロキシン化合物が、一般式（ＩＶａ）：
【化１１】
によって示される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記１つ以上のチロキシン化合物が、一般式（ＩＶｂ）：
【化１２】
によって示される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記１つ以上のチロキシン化合物が、一般式（ＩＶｃ）：
【化１３】
によって示される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
１つ以上のサンプルにおいて１つ以上のチロキシン化合物を分析するための方法であって、該チロキシン化合物が、一般式（ＩＶ）：
【化１４】
によって示され得、
ここでＲ１の各々が独立してヨウ素または水素であり；かつ
Ｒ２がカルボキシ、ヒドロキシまたはメチルであり、
該方法は、以下の工程：
１セットのアイソバリックタグ由来の異なるアイソバリックタグを各々用いて１つ以上のチロシン化合物を標識する工程と；
該アイソバリックに標識されたチロキシン化合物の各々の少なくとも一部を合わせて、合わされたサンプルを生成する工程と；
該合わせたサンプルの少なくとも一部を、マトリックス支援レーザー脱離イオン化を用いる親・娘イオン遷移モニタリングに対して供する工程であって、ここで第一の伝送親イオンｍ／ｚ範囲が該アイソバリックに標識されたチロキシン化合物の１つ以上のｍ／ｚ値を含み、かつ第一の伝送娘イオンｍ／ｚ範囲が該アイソバリックに標識されたチロキシン化合物のアイソバリックタグの少なくとも１つに相当する少なくとも１つのレポーターイオンのｍ／ｚ値を含む、工程と；
該伝送レポーターイオンの１つ以上のイオンシグナルを測定する工程と；
チロキシン化合物を含む標準化合物の測定されたイオンシグナルに対する対応するレポーターイオンの測定されたイオンシグナルの比較に少なくとも基づいた、該アイソバリックに標識されたチロキシン化合物の１つ以上の濃度を決定する工程と；
を包含する、方法。
【請求項１７】
前記１つ以上のチロキシン化合物が、一般式（ＩＶａ）：
【化１５】
によって示される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記１つ以上のチロキシン化合物が、一般式（ＩＶｂ）：
【化１６】
によって示される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記１つ以上のチロキシン化合物が、一般式（ＩＶｃ）：
【化１７】
によって示される、請求項１６に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図９Ｄ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１０Ｄ】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【図１９Ａ】
【図１９Ｂ】
【図２０Ａ】
【図２０Ｂ】
【図２１Ａ】
【図２１Ｂ】
【図２１Ｃ】
【図２２Ａ】
【図２２Ｂ】
【図２３】
【図２４】
【図２５Ａ】
【図２５Ｂ】
【図２５Ｃ】
【図２５Ｄ】
【図２５Ｅ】
【図２５Ｆ】
【図２５Ｇ】
【図２５Ｈ】
【図２５Ｉ】
【図２５Ｊ】
【図２５Ｋ】
【図２５Ｌ】
【図２５Ｍ】
【図２５Ｎ】
【図２５Ｏ】
【図２５Ｐ】
【図２５Ｑ】
【図２５Ｒ】
【図２５Ｓ】
【図２５Ｔ】
【図２５Ｕ】
【図２６】
【図２７Ａ】
【図２７Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図９Ｄ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１０Ｄ】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【図１９Ａ】
【図１９Ｂ】
【図２０Ａ】
【図２０Ｂ】
【図２１Ａ】
【図２１Ｂ】
【図２１Ｃ】
【図２２Ａ】
【図２２Ｂ】
【図２３】
【図２４】
【図２５Ａ】
【図２５Ｂ】
【図２５Ｃ】
【図２５Ｄ】
【図２５Ｅ】
【図２５Ｆ】
【図２５Ｇ】
【図２５Ｈ】
【図２５Ｉ】
【図２５Ｊ】
【図２５Ｋ】
【図２５Ｌ】
【図２５Ｍ】
【図２５Ｎ】
【図２５Ｏ】
【図２５Ｐ】
【図２５Ｑ】
【図２５Ｒ】
【図２５Ｓ】
【図２５Ｔ】
【図２５Ｕ】
【図２６】
【図２７Ａ】
【図２７Ｂ】
【公表番号】特表２０１０−５００５７９（Ｐ２０１０−５００５７９Ａ）
【公表日】平成２２年１月７日（２０１０．１．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５２４０２５（Ｐ２００９−５２４０２５）
【出願日】平成１９年８月１５日（２００７．８．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７６０１６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０２２２０５
【国際公開日】平成２０年２月２１日（２００８．２．２１）
【出願人】（５０９１３０４１３）アプライド バイオシステムズ， エルエルシー (48)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１月７日（２０１０．１．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年８月１５日（２００７．８．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７６０１６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０２２２０５
【国際公開日】平成２０年２月２１日（２００８．２．２１）
【出願人】（５０９１３０４１３）アプライド バイオシステムズ， エルエルシー (48)
【Ｆターム（参考）】
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