テオフィリンによって標的特異的ＲＮＡ置換活性が調節されるアロステリックトランス−スプライシンググループＩリボザイム
本発明は、テオフィリンによって標的特異的ＲＮＡ置換活性が調節されるアロステリックトランス−スプライシンググループＩリボザイムを提供する。さらに詳しくは、癌に特異的なＲＮＡ転写体であるｈＴＥＲＴ(human Telomerase reverse transcriptase)のｍＲＮＡを認知してトランス−スプライシングする能力が検証されたｈＴＥＲＴ標的トランス−スプライシングリボザイムにテオフィリンアプタマーをコミュニケーションモジュールを介して結合させたテオフィリン依存性アロステリックトランス−スプライシングリボザイムを提供する。本発明に係るアロステリックトランス−スプライシンググループＩリボザイムは、テオフィリン依存的にＲＮＡ置換活性が調節されてトランス−スプライシング反応によって標的ｈＴＥＲＴ ＲＮＡを補正することにより、標的ｈＴＥＲＴ ＲＮＡを発現する癌細胞のみを選択的に診断し、或いは細胞死を誘導して治療することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、テオフィリンによって標的特異的ＲＮＡ置換活性が調節されるアロステリックトランス−スプライシンググループＩリボザイムに関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子突然変異による人体の難治性疾患の分子遺伝学的原因と因子に関する研究により、そのような疾病の新しい治療技術として遺伝子治療技術が盛んに開発されている。ところが、現存する遺伝子治療技術にはまだ克服すべき問題点がある。
【０００３】
遺伝病に主に用いられる遺伝子治療方法は、突然変異遺伝子に相応する正常遺伝子を患者の適切な細胞に伝達する方法を採用している(Morgan, R.A. and Anderson, W.F. 1993, Human gene therapy. Annu Rev Biochem. 62: 191-217)。
理論的に、このような治療方法によって効果を得るためには、所望の遺伝産物の生成を生体の正しい調節メカニズムの下で得なければならない。ところが、ウイルス粒子の伝達遺伝子サイズにおける制限性のため、殆ど全ての遺伝子治療方法は、様々な種類のプロモータ、またはそれらの断片における遺伝子自体のプロモータの調節下にｃＤＮＡの形で所望の遺伝子を伝達する方式を採用している。よって、伝達遺伝子の調節を自然そのままに調節することができる様々な遺伝子因子が含まれておらず、所望の疾病治療効果を極大化していない実情である。
【０００４】
また、遺伝子発現のために用いるプロモータなどが他の種類のプロモータを活性化させるおそれがあるとともに、クロマチン構造を変化させることにより、遺伝子の伝達された細胞が持っている他の遺伝子の発現（例えば、プロトオンコジーン）を増加させるおそれがあるという問題点がある。また、正常な遺伝子の伝達が患者細胞内の突然変異遺伝子産物の減少には何の影響も及ぼすことができない。突然変異遺伝子産物がドミナントネガティブ(dominant negative)な機能を持つ場合、既存の方法では治療効果を極大化することができないであろう。よって、正常な遺伝子のよく調節された発現を誘導すると同時に、突然変異遺伝子の発現を抑制することが可能な新規の遺伝子治療法の開発が必要である(Lan, N., Howrey, R.P., Lee, S.W., Smith, C.A., and Sullenger, B.A. 1998, Ribozyme-Mediated Repair of Sickle b-Globin mRNAs in Erythrocyte Precursors. Science 280: 1593; Phylactou, L.A., Darrah, C., and Wood, M.J. 1998, Ribozyme-mediated trans-splicing of a trinucleotide repeat. Nat. Genet. 18: 378-381; Rogers, C.S., Vanoye, C.G., Sullenger, B.A., and George, A.L.Jr. 2002, Functional repair of a mutant chloride channel using a trans-splicing ribozyme, J. Clin. Invest. 110: 1783-1789; Shin, K.S., Sullenger, B.A., and Lee, S.W. 2004, Ribozyme-mediated induction of apoptosis in human cancer cells by targeted repair of mutant p53 RNA. Mol Ther.10: 365-372; Ryu, K.J., Kim, J.H., and Lee, S.W. 2003, Ribozyme-mediated selective induction of new gene activity in hepatitis C virus internal ribosome entry site-expressing cells by targeted trans-splicing. Mol. Ther. 7; 386-395)。
【０００５】
テトラヒメナ好熱菌(Tetrahymena thermophila)からのグループＩイントロンリボザイムが、実験管内だけでなく、バクテリア、ひいては人体細胞内でトランス−スプライシング反応を行うことにより、別途に存在する２つの転写体を互に連結させることができるという事実が報告された(Been, M. and Cech, T. 1986, One binding site determines sequence specificity of Tetrahymena pre-rRNA self-splicing, trans-splicing, and RNA enzyme activity. Cell 47: 207-216; Sullenger, B.A. and Cech, T.R. 1994, Ribozyme-mediated repair of defective mRNA by targeted, trans-splicing. Nature 371: 619-622; Jones, J.T., Lee, S.W., and Sullenger, B.A. 1996, Tagging ribozyme reaction sites to follow trans-splicing in mammalian cells. Nat Med. 2: 643-648)。したがって、グループＩイントロンに基づいたトランス−スプライシングリボザイムによって、疾患に関連した遺伝子転写体または正常細胞では発現せず、疾病細胞でのみ特異的に発現する特定ＲＮＡが標的になった後、そのＲＮＡが正常なＲＮＡに補正されるか或いは新しい治療用遺伝子転写体に置換されるように、再びプログラムを誘発することにより、極めて疾患特異的で安全な遺伝子治療技術になれる。すなわち、標的遺伝子転写体の存在時にのみＲＮＡ置換が起るので、その結果として、適切な時間と空間でのみわれわれの所望する遺伝子産物が作られるであろう。特に、細胞内で発現するＲＮＡを標的にした後、所望の遺伝子産物で代置する方法なので、導入しようとする遺伝子の発現量を調節することができる。また、トランス−スプライシングリボザイムは、疾患特異ＲＮＡを除去すると同時に、われわれの所望する治療用遺伝子産物の発現を誘導することができるので、治療効果を倍加させることができる。
【０００６】
ＲＮＡは、人為的または自然的にスイッチとしての役割を果たすのに適した化学的、構造的特性を持っている(Mandal, M., Boese, B., Barrick, J.E., Winkler, W.C., and Breaker, R.R. 2003, Riboswitches control fundamental biochemical pathways in Bacillus subtilis and other bacteria. Cell113: 577-586)。このような特性を用いて、酵素活性を有するＲＮＡとしてのリボザイムに小分子またはタンパク質の特定の構造または配列を認知し、特異的に結合するアプタマーを結合させたものをアプタザイムと称する(Breaker, R.R. 2002, Engineered allosteric ribozymes as biosensor components. Curr. Opin. Biotechnol. 13: 31-39)。アプタザイムは、リボザイムとアプタマーとが主にコミュニケーションモジュールを介して連結される。コミュニケーションモジュールは、アプタマーから発生した信号をリボザイムに伝達する中間媒介体の役割を果たす構造である(Kertsburg, A. and Soukup, G.A. 2002, A versatile communication module for controlling RNA folding and catalysis. Nucleic Acids Res. 30: 4599-4606)。
【０００７】
アプタマーによってリガンドが感知されると、このような信号がコミュニケーションモジュールを介してリボザイムに伝達されるため、非活性状態で存在したリボザイムの活性がアロステリックに誘導または抑制される。すなわち、外部または内部の特定のリガンドによってリボザイムの活性が調節可能である。
【０００８】
現在の癌治療方法では、癌細胞のみを特異的に除去することが可能な技術の開発が必要である。アロステリックリボザイム(allosteric ribozyme, aptazyme)は、ＲＮＡの構造が他のリガンドなどとの結合によって変わることを用いて、リボザイムとアプタマーとを結合させたものである。低分子をリガンドとするアロステリックリボザイムの正確なメカニズムは、解明されていないが、リガンド結合によってリボザイムが構造的に安定化または不安定化されることによると思われる(Kertsburg, A. and Soukup, G.A. 2002, A versatile communication module for controlling RNA folding and catalysis. Nucleic Acids Res. 30: 4599-4606; Jose, A.M., Soukup, G.A., and Breaker, R.R. 2001, Cooperative binding of effectors by an allosteric ribozyme. Nucleic Acids Res. 29: 1631. 1637; Koizumi, M., Soukup, G.A., Kerr, J.N., and Breaker, R.R. 1999, Allosteric selection of ribozymes that respond to the second messengers cGMP and cAMP. Nature Struct. Biol. 6: 1062.1071)。低分子がリガンドとして作用するアプタザイムが初期に研究され、最近ではタンパク質またはオリゴと相互作用するアプタザイムに関する研究が行われている。
【０００９】
ｈＴＥＲＴ(human Telomerase reverse transciptase)は癌細胞の不死化(immortality)および増殖(proliferation)能力を調節する最も重要な酵素中の一つであって、このテロメラーゼは無限に複製される生殖細胞、造血細胞および癌細胞で８０〜９０％のテロメラーゼ活性を持っているが、癌細胞周辺の正常細胞はその活性を持っていない(Bryan, T.M. and Cech, T.R. 1999, Telomerase and the maintenance of chromosome ends. Curr. Opin. Cell Biol. 11; 318-324)。このようなテロメラーゼの特性を用いて、細胞成長に関与するテロメラーゼの抑制者を開発することにより、癌細胞の増殖を抑制しようとする試みが最近盛んに行われている(Bryan, T.M., Englezou, A., Gupta, J., Bacchetti, S., and Reddel, R.R. 1995, Telomere elongation in immortal human cells without detectable telomerase activity. Embo J. 14; 4240-4248; Artandi, S.E. and DePinho, R.A. 2000, Mice without telomerase: what can they teach us about human cancer Nat. Med. 6; 852-855)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者らは、癌細胞特異的なターゲットであるｈＴＥＲＴ ＲＮＡを特異的に認知してトランス−スプライシングする能力が検証されたｈＴＥＲＴターゲッティングトランス−スプライシングリボザイムに、テオフィリンに高い親和力を示すアプタマーを、普遍化されたコミュニケーションモジュールを介して結合させた様々なテオフィリン依存性アロステリックトランス−スプライシングリボザイムを開発した。
【００１１】
また、本発明によって、このようなリボザイムが、試験管および細胞内でテオフィリンが存在する条件でのみｈＴＥＲＴ ＲＮＡを選択的に認知して切断し、標的サイトの下端部位にリボザイムの３’エキソンを連結することを、インビトロ(in vitro)トランス−スプライシング分析、ルシフェラーゼ分析(Luciferase assay)、ＲＴ−ＰＣＲおよびＭＴＴ分析によって確認した。
【００１２】
このようなアロステリックトランス−スプライシングリボザイムを活用して、外部因子である低分子化合物によってリボザイム機能を活性化させることにより、特定の疾患特異的なＲＮＡを標的にした後、治療用遺伝子ＲＮＡへの置換を人為的に調節することが可能なシステムを開発することができる。また、疾患細胞特異的に治療用遺伝子発現を人為的に調節し、新しい概念の特異的で可逆的な遺伝子治療技術を開発することができる（図１）。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
そこで、本発明の目的は、テオフィリンによって活性が調節されるアロステリックトランス−スプライシンググループＩリボザイムの選別方法を提供することにある。
【００１４】
また、本発明の他の目的は、ｈＴＥＲＴ ＲＮＡを特異的に標的化し、テオフィリンによってＲＮＡ置換活性が調節されるアロステリックトランス−スプライシンググループＩリボザイムおよびその用途を提供することにある。
【００１５】
また、本発明の別の目的は、アロステリックトランス−スプライシンググループＩリボザイムを発現する発現ベクターおよびその用途を提供することにある。
【００１６】
本発明のある観点によれば、テオフィリンによって活性が調節されるアロステリックトランス−スプラインググループＩリボザイムの選別方法を提供する。
【００１７】
本発明の他の観点によれば、ｈＴＥＲＴ(human Telomerase reverse transcriptase)ＲＮＡを特異的に標的化し、テオフィリンによってＲＮＡ置換活性が調節されるアロステリックトランス−スプライシンググループＩリボザイムおよびその用途を提供する。
【００１８】
本発明の別の観点によれば、上述したアロステリックトランス−スプライシンググループＩリボザイムを発現するベクターおよびその用途を提供する。
【発明の効果】
【００１９】
上述したように、本発明に係るアロステリックトランス−スプライシンググループＩリボザイムは、テオフィリンによって依存的に活性が調節されてトランス−スプライシング反応を介して標的ｈＴＥＲＴ ＲＮＡを補正することにより、標的ｈＴＥＲＴ ＲＮＡを発現する癌細胞のみを選択的に診断し、あるいは細胞死を誘導して治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】アロステリックトランス−スプライシングリボザイムによるＲＮＡへの置換調節に関する模式図である。
【図２】ｈＴＥＲＴターゲッティングＴ／Ｓリボザイムを示す図である。
【図３】テオフィリン依存性アロステリックＴ／Ｓリボザイムを示す図である。
【図４】ＷＴ Ｐ９とＭｕ−Ｐ９の３’末端配列を示す図である。
【図５】インビトロにおけるトランス−スプラシング反応を示す図である。
【図６】インビトロにおけるトランス−スプライシング反応産物の実時間ＰＣＲ 分析を示す図である。
【図７】インビトロにおける拡張ＩＧＳを有するＴ／Ｓリボザイムによるトランス−スプライシング反応を示す図である。
【図８】インビトロにおけるアロステリックトランス−スプライシングリボザイムによるトランス−スプライシング反応の適合性を示す図である。
【図９】アロステリックトランス−スプライシングリボザイムによるテオフィリン依存性トランスジーン(transgene)の誘導を示す図である。
【図１０】標的ＲＮＡに対する１００ｎｔアンチセンス配列を含むアロステリックトランス−スプライシングリボザイムによるテオフィリン依存性トランスジーンの誘導を示す図である。
【図１１】ｈＴＥＲＴ−細胞におけるアロステリックトランス−スプライシングリボザイムによるトランスジーンの抑制を示す図である。
【図１２】標的ＲＮＡに対する３００ｎｔアンチセンス配列を含むアロステリックトランス−スプライシングリボザイムによるテオフィリン依存性トランスジーンの誘導を示す図である。
【図１３】細胞におけるアロステリックリボザイムによるテオフィリン依存性トランス−スプライシング反応を示す図である。
【図１４】テオフィリン依存性トランス−スプライシングリボザイムをエンコードする発現ベクターｐＡｖＱ−Ｔｈｅｏ−Ｒｉｂ２１ＡＳ−ＴＫとアデノウイルスベクター（Ａｄ−ＴｈｅｏＲｉｂ−ＴＫ、Ａｄ−Ｔｈｅｏ−ＣＲＴ）の基本構造である。
【図１５】アロステリックトランス−スプライシングリボザイムによるｈＴＥＲＴ＋ＨＴ−２９細胞におけるテオフィリン依存性細胞消退を示す図である。
【図１６】アロステリックトランス−スプライシングリボザイムによるｈＴＥＲＴ＋ＨｅｐＧ２細胞におけるテオフィリン依存性細胞消退を示す図である。
【図１７】アロステリックトランス−スプライシングリボザイムによるｈＴＥＲＴ＋Ｃａｐａｎ−１細胞におけるテオフィリン依存性細胞消退を示す図である。
【図１８】アロステリックトランス−スプライシングリボザイムによるｈＴＥＲＴ−ＩＭＲ９０細胞における細胞消退が現れないことを示す図である。
【図１９】アロステリックトランス−スプライシングリボザイムによるＨＴ−２９細胞のトランス−スプライシング反応を示す図である。
【図２０】アロステリックトランス−スプライシングリボザイムによるＨＴ−２９細胞のトランス−スプライシング反応を実時間ＰＣＲ分析によって示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、トランス−スプライシングリボザイムのＰ６とＰ８ドメインのそれぞれまたは両方ともにテオフィリンアプタマーとコミュニケーションモジュールを結合させたアプタザイム、Ｐ９ドメインの一部が除去されたトランス−スプライシングリボザイムのＰ６とＰ８ドメインのそれぞれまたは両方ともにテオフィリンアプタマーとコミュニケーションモジュールを結合させたアプタザイム、またはＰ９ドメインの一部が変異されたトランス−スプライシングリボザイムのＰ６とＰ８ドメインのそれぞれまたは両方ともにテオフィリンアプタマーとコミュニケーションモジュールを結合させたアプタザイムを製作する段階と、
テオフィリンとカフェインを用いてインビトロで前記製作されたアプタザイムのアロステリック調節を比較することにより、テオフィリン依存性トランス−スプライシング有無を確認する段階と、
哺乳類の細胞で０．１〜１ｍＭのテオフィリン存在下にルシフェラーゼ活性によってテオフィリ依存性トランスジーンの発現有無を確認する段階とを含むことを特徴とする、テオフィリンによって活性が調節されるアロステリックトランス−スプライシンググループＩリボザイム(allosteric trans-splicing group Ｉ ribozyme)の選別方法を提供する。
【００２２】
この際、前記アプタザイム製作段階で、ｈＴＥＲＴ ＲＮＡに対するアンチセンス１００〜３００ｎｔが付着しているアプタザイムをさらに製作する。
【００２３】
また、本発明は、ｈＴＥＲＴ(human Telomerase reverse transcriptase)ＲＮＡを特異的に標的化し、３’エキソンには蛍由来ルシフェラーゼ受容体遺伝子を含有するテオフィリンによってＲＮＡ置換活性が調節されるアロステリックトランス−スプライシンググループＩリボザイムを提供する。
【００２４】
この際、前記リボザイムは、好ましくは配列番号１で表されるＡＳ３００ΔＰ９ ８Ｔ、配列番号２で表されるＡＳ１００ Ｍｕ−Ｐ９ ６Ｔ８Ｔ、または配列番号３で表されるＡＳ３００ Ｗ−Ｐ９ ６Ｔ８Ｔである。
【００２５】
また、本発明は、前記リボザイムを発現するベクターを提供する。
【００２６】
この際、前記発現ベクターは、好ましくは配列番号４で表されるｐＳＥＡＰＡＳ３００ Ｄｅｌｔａ Ｐ９ ８Ｔ−Ｌｕｃｉ、配列番号５で表されるｐＳＥＡＰ ＡＳ１００ Ｍｕ−Ｐ９ ６Ｔ８Ｔ−Ｌｕｃｉ、または配列番号６で表されるｐＳＥＡＰ ＡＳ３００ Ｗ−Ｐ９ ６Ｔ８Ｔ−Ｌｕｃｉである。
【００２７】
また、本発明は、ｈＴＥＲＴ ＲＮＡを特異的に標的化し、３’−エキソンにはＨＳＶ−ＴＫ(herpes simplex virus thymidine kinase)細胞死遺伝子を含有するテオフィリンによってＲＮＡ置換活性が調節されるアロステリックトランス−スプライシンググループＩリボザイムを提供する。
【００２８】
この際、前記リボザイムは、好ましくは配列番号７で表されるＡＳ３００ Ｗ−Ｐ９ ６Ｔ８Ｔ−ＴＫである。
【００２９】
また、本発明は、前記リボザイムを哺乳類細胞で発現するベクターを提供する。
【００３０】
この際、前記発現ベクターは、好ましくは配列番号8で表されるｐＡｖＱ−Ｔｈｅｏ−Ｒｉｂ２１ＡＳ−ＴＫ（ＫＣＣＭ１０９３５Ｐ）である。
【００３１】
また、本発明は、前記リボザイムおよびテオフィリンを含有する遺伝子発現誘導剤, 癌診断剤または遺伝子し治療剤を提供する。
【００３２】
また、本発明は、前記発現ベクターおよびテオフィリンを含有する遺伝子発現誘導剤, 癌診断剤または遺伝子し治療剤を提供する。
【００３３】
以下、本発明をさらに詳しく説明する。
【００３４】
本発明のアロステリックトランス−スプライシンググループＩリボザイムは、以下、「アプタザイム(aptazyme)」または「テオフィリン依存的アプタザイム」という。
【００３５】
本明細書で言及されたテオフィリンアプタマーは、テオフィリンに特異的に結合するアプタマーを意味する。
【００３６】
本発明のアロステリックトランス−スプライシンググループＩリボザイムは、リボザイムの基質結合部位および触媒コア部位にアプタマーのように特定のリガンドと結合する部位を連結する場合、特定のリガンドとアプタマーとが結合してリガンドが感知されると、このような信号がコミュニケーションモジュールを介してリボザイムに伝達されてリボザイムの構造的変異が発生することにより、リボザイムのトランス−スプライシング活性がアロステリックに増加または阻害できる分子である。
【００３７】
本発明者らは、グループＩイントロンに基づいて開発した既存のｈＴＥＲＴターゲッティングトランス−スプライシングリボザイムにテオフィリンアプタマーをコミュニケーションモジュールを介して結合させることにより、ｈＴＥＲＴが在る癌細胞でのみトランス−スプライシングが誘導されるうえ、このようなトランス−スプライシングリボザイムの活性がテオフィリンによって調節可能なアプタザイムを開発した。
【００３８】
この際、トランス−スプライシングリボザイムのＰ６とＰ８ドメインのそれぞれまたは両方ともにテオフィリンアプタマーを結合させた、或いはＰ９ドメインを一部除去したトランス−スプライシングリボザイムのＰ６とＰ８ドメインのそれぞれまたは両方ともにテオフィリンアプタマーを結合させたアプタザイムを製作した（図３参照）。ここで、アプタマーとリボザイムとを連結する部位は、最も普遍化されたコミュニケーションモジュールを使用した。また、ＰＣＲを用いてクローニングする過程でＰ９ドメインが他の配列に変異されたｍｕ−Ｐ９ ６ｔ８ｔを得たが、この構造体に対しても実験を行った（図４参照）。全ての実験は、テオフィリン、カフェインおよび同一体積の溶媒（ｄＨ２ＯまたはＰＢＳ）に対する結果を比較することにより行われた。ここで、カフェインは、テオフィリンとは一つの残基が異なり、テオフィリンに対する実験結果を確認するために使用し、溶媒は対照群として使用した。
【００３９】
インビトロでアプタザイムのアロステリック調節を比較した結果、Mu−Ｐ９ ６ｔ８ｔとΔＰ９ ６ｔがテオフィリンに依存的にトランス−スプライシングされることを確認することができた（図５参照）。また、Mu−Ｐ９ ６ｔ８ｔがΔＰ９ ６ｔと比較するとき、ＰＣＲによるトランス−スプライシング産物の量が４０％以上多いことが分かった。これを実時間ＰＣＲを用いてｍｕ Ｐ９ ６ｔ８ｔでｄＨ２Ｏと比較するとき、テオフィリンが在る条件で１２倍以上のトランス−スプライシング産物が生成されることを確認した（図６参照）。また、拡張ＩＧＳを持つリボザイムに対してインビトロでアプタザイムのアロステリック調節を比較した結果、同一のリボザイム基本骨格を持っても、アンチセンス配列の存在有無によって活性に差異を示すことができることを確認した（図７参照）。
【００４０】
哺乳類の細胞からも確認をしたが、インビトロと細胞内で各アプタザイムのアロステリック調節結果が一致しない可能性があることを考慮し、インビトロで行った全てのアプタザイムを検証した。
【００４１】
この実験に先立ち、テオフィリンの最適濃度を細胞で確認するために、濃度別に細胞に処理した結果、テオフィリンの濃度が好ましくは０．１〜１．０ｍＭ、さらに好ましくは０．７ｍＭであることを確認した（図９参照）。
【００４２】
次いで、細胞内でトランス−スプライシング産物が発現し、発現したトランスジーンがその機能を行うか否かを確認するために、ルシフェラーゼ分析を行った。
【００４３】
細胞実験では、全体的にテオフィリンまたはカフェインを入れず、同一体積のＰＢＳ（溶媒）のみを入れた条件でもルシフェラーゼが発現した。これは、トランス−スプライシングアプタザイムの３’−アクソンのルシフェラーゼ遺伝子がトランス−スプライシングなしでリーク(leaky)に発現すると予測し、ターゲットが存在しないものと知られている細胞（ＳＫ−ＬＵ Ｉ）でリボザイムをトランスフェクションして確認した結果、予測とおり、ターゲットのない条件でもリークにルシフェラーゼが発現することを確認した（図１１参照）。
【００４４】
このような背景を補完するためにアンチセンスを増加させたが、アンチセンスの増加によって非特異的発現は減少させ、効率はさらに増加させることができると予測し、リボザイムのアンチセンスを１００個から３００個に増加させる改質を行い、さらに細胞内でこれを確認した。その結果、全体的に効率が増加するパターンを示した。結果として、ＡＳ−１００ Ｍｕ−Ｐ９ ６ｔ８ｔ、ＡＳ−３００ Ｗ−Ｐ９ ６ｔ８ｔおよびＡＳ−３００ ΔＰ９ ８ｔの場合、ｈＴＥＲＴ＋細胞内でテオフィリン依存的に効果的なルシフェラーゼ活性誘導を観察することができた（図１０および図１２参照）。細胞でトランス−スプライシングを検証するために細胞の総ＲＮＡを得てＲＮＡ水準でトランス−スプライシング産物を確認し、ＡＳ３００ ＷＴ、およびテオフィリンが在る場合のＡＳ３００ Ｗ−Ｐ９ ６Ｔ８Ｔでトランス−スプライシング産物バンドが現れることを確認した（図１３参照）。
【００４５】
３’−エキソンをルシフェラーゼからＨＳＶ−ＴＫ(herpes simplex virus thymidine kinase)に変えた、すなわちｈＴＥＲＴ ＲＮＡを特異的に標的化し、３’−エキソンにはＨＳＶ−ＴＫ細胞死遺伝子を含有するアロステリックトランス−スプライシンググループＩリボザイムを製作し、このリボザイムをエンコードする発現ベクター（ｐＡｖＱ−Ｔｈｅｏ−Ｒｉｂ２１ＡＳ−ＴＫ）を製作した後、これを用いてアデノウイルスを作って実験を行った。
【００４６】
ｈＴＥＲＴ陽性細胞株（ＨＴ−２９、ＨｅｐＧ２、Ｃａｐａｎ−１）と陰性細胞株（ＩＭＲ９０）で多様なアデノウイルスを処理し、ＧＣＶとテオフィリンとカフェインを５日間処理した後、ＭＴＴ分析によって細胞死を観察した。この際、陽性対照群としてＡｄ−ＴＫ（ＣＭＶプロモータの下にＨＳＶｔｋを発現するアデノウイルス性ベクター）を用い、ｈＴＥＲＴ＋細胞における陽性対照群としてＡｄ−Ｒｉｂ−ＴＫ（ｈＴＥＲＴ特異的でＨＳＶｔｋが標識(tagging)されているアデノウイルス性ベクター）を用いた。陰性対照群としては、Ａｄ−ＬａｃＺ（ＣＭＶプロモータの下にＬＡｃＺを発現するアデノウイルス性ベクター）を用いた。その結果、ｈＴＥＲＴ＋細胞株では、Ａｄ−ＴＫとＡｄ−Ｒｉｂ−ＴＫは調節化合物の有無に関係なくＧＣＶを処理したときに死ぬが、Ａｄ−ＴｈｅｏＲｉｂ−ＴＫはテオフィリンが在る場合にのみ特異的に細胞死が起ることを確認した（図１５~図１７参照）。そして、陰性対照群であるＡｄ−ＬａｃＺはいずれの場合でも細胞死が起っていない。
【００４７】
このような特異的細胞死がターゲットＲＮＡによって調節されるかを確認するために、ｈＴＥＲＴ−細胞株であるＩＭＲ９０で実験した結果、Ａｄ−ＴＫは GCVを処理したときに細胞死が起ったが、Ａｄ−Ｒｉｂ−ＴＫ、Ａｄ−ＴｈｅｏＲｉｂ−ＴＫおよびＡｄ−ＬａｃＺは細胞死が起っていないことからみて、ｈＴＥＲＴターゲットＲＮＡによって細胞死が調節されるものと確認された（図１８参照）。
【００４８】
ｈＴＥＲＴ＋細胞であるＨＴ−２９に、ＭＴＴ分析によって最も細胞死がよく誘導されたアデノウイルス１００Ｍ．Ｏ．Ｉ、化学物質１００μＭを処理し、総ＲＮＡを得た後、実時間ＰＣＲを行った。その結果、テオフィリン存在の際に、Ａｄ−Ｔｈｅｏ−ＣＲＴが導入されたＨＴ−２９細胞でのみ測定されたトランス−スプライシング産物が現れ、特にトランス−スプライシング産物の量がＡｄ−Ｒｉｂ−ＴＫを処理した場合とほぼ同様であると確認された。カフェインではトランス−スプライシングの量がある程度現れたが、その量がテオフィリン処理の場合に比べて７８％も少なかった（図２０参照）。これはカフェインがテオフィリンアプタマーにテオフィリンよりも１０００倍弱いがある程度結合をするためであると考えられる。このような結果より、本発明のアロステリックリボザイムによって誘発されたテオフィリン依存的標的特異的な細胞死誘導は、細胞内におけるテオフィリン依存的で標的ＲＮＡ特異的なトランス−スプライシング反応によるものであることが分かった。
【実施例】
【００４９】
以下、本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明したが、これらの実施例は本発明を限定するものではない。
【００５０】
参照例１：基質（ｈＴＥＲＴ）ＲＮＡの製造
ターゲットＲＮＡを製作するために、ｈＴＥＲＴの−１から＋２１８まで含まれているｐＣｌ−ｎｅｏベクター（ｅｘｏｎ１〜２）を、配列番号９で表されるプライマー５’−ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＡＧＧＣＡＧＣＧＣＴＧＣＧＴＣＣＴ−３’と、配列番号１０で表されるプライマー５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＴＧＧＣＧＧＡＡＧＧＡＧＧＧＧＧＣＧＧＣＧＧＧ−３’を用いてＰＣＲで増幅させ、ｈＴＥＲＴ ＲＮＡをコードするＤＮＡを製造した。このように製造されたＤＮＡからインビトロ転写を介してＲＮＡを作るが、ＤＮＡテンプレート（３μｇ）、１０×転写バッファ、１０ｍＭ ＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ）、０．５ｍＭ ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ（Ｒｏｃｈｅ）、８０Ｕ ＲＮａｓｅ抑制剤（Ｋｏｓｃｏ）、２００Ｕ Ｔ７ ＲＮＡ重合酵素（Ａｍｂｉｏｎ）およびＤＥＰＣ−Ｈ２０を最終１００μＬまで入れて混ぜた後、３７℃で３時間反応させ、５Ｕ ＤＮａｓｅＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を３７℃で３０分間さらに処理し、ＤＮＡテンプレートを完全に除去した後、フェノール抽出（ｐＨ７．０）およびエタノール沈殿によってＲＮＡを精製し、しかる後に、ＲＮＡバンドを６％変性アクリルアミドゲル上で溶出した後、精製してＴＥバッファ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶かした。
【００５１】
参照例２：テオフィリン依存性ｈＴＥＲＴターゲッティングトランス−スプライシング（Ｔ／Ｓ）アプタザイムクローニング
アロステリックリボザイム開発のための基本トランス−スプライシングリボザイム骨格は、ｈＴＥＲＴの＋２１ｎｔ部位を特異的に認知し、Ｐ１、Ｐ１０および標的ＲＮＡに対する３００個のアンチセンス配列が添加された拡張ＩＧＳを有するグループＩイントロンリボザイムを用いた(Kwon, B.S., Jung, H.S., Song, M.S., Cho, K.S., Kim, S.C., Kimm, K., Jeong, J.S., Kim, I.H., and Lee, S.W. 2005, Specific regression of human cancer cells by ribozyme-mediated targeted replacement of tumor-specific transcript. Mol. Ther. 12: 824-834; Hong, S.H., Jeong, J.S., Lee, Y.J., Jung, H.I., Cho, K.S., Kim, C.M., Kwon, B.S., Sullenger, B.A., Lee, S.W.*, and Kim, I.H.* 2008, In vivo reprogramming of hTERT by trans-splicing ribozyme to target tumor cells. Mol Ther. 16: 74-80)。
【００５２】
ｈＴＥＲＴターゲッティングリボザイムのＰ６ドメインとＰ８ドメインのそれぞれまたは両方ともにテオフィリンアプタマーをコミュニケーションモジュールを介してクローニングした。また、リボザイムのＰ９ドメインを欠損させたΔＰ９リボザイムにも、前記と同様にＰ６、Ｐ８ドメインを改質した。テオフィリンアプタマーがコミュニケーションモジュールを介して連結された自己スプライシングリボザイムからｈＴＥＲＴをターゲットすることが可能なＩＧＳ含有の配列番号１１（５’−ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＣＡＧＧＡＡＡＡＧＴＴＡＴＣＡＧＧＣＡ−３’）のプライマーと、リボザイムの３’エキソンの前まで増幅することが可能な配列番号１２（５’−ＣＧＡＧＴＡＣＴＣＣＡＡＡＡＣＴＡＡＴＣＡＡ−３’）のプライマーを用いて、テオフィリンアプタマーが結合したｈＴＥＲＴターゲッティングトランス−スプライシングリボザイムをＨｉｎｄＩＩＩとＮｒｕＩを用いてＳＥＡＰプロモータベクターにクローニングした。その後、ルシフェラーゼ遺伝子を配列番号１３（５’−ＣＧＡＴＧＡＴＣＡＣＧＡＡＧＡＣＧＣ−３’）のプライマーおよび配列番号１４（５’−ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＴＴＡＣＡＡＴＴＴＧＧＡＣＴＴＴ−３’）のプライマーを用いてＰＣＲし、ＮｒｕＩとＸｂａＩを用いてリボザイムの後ろにクローニングした。ところが、ＰＣＲを用いたクローニング過程中にＰ９ドメインが非意図の配列に変異された構造体(construct)を得た。この構造体を含んでｗｉｌｄ Ｐ９ ６ｔ、ｗｉｌｄ Ｐ９ ８ｔの２個のｗｉｌｄ構造体、ΔＰ９ ６ｔ、ΔＰ９ ８ｔ、ΔＰ９ ６ｔ８ｔの３個の欠損構造体、およびｍｕ Ｐ９ ６ｔ８ｔを製作した。また、対照群としてアプタマーのないｗｉｌｄ Ｐ９とΔＰ９を含んで総８種の構造体を製作した。
【００５３】
製作されたテオフィリン依存性ｈＴＥＲＴターゲッティングＴ／Ｓアプタザイムの塩基配列は、ターミネータレディー反応混合物(terminator ready reaction mixture)（ＰＥ ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）３μＬ、定量されたＤＮＡ１００ｎｇ、配列番号１５（５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＴＧＧＣＧＧＡＡＧＧＡＧＧＧＧＧＣＧＧＣＧＧＧ−３’）のプライマー３．２ｐｍｏｌを総１０μＬの反応で（９６℃−１０’、５０℃−５’、６０℃−４’）×２５サイクル反応させた後、精製のために４０μＬのｄＨ２Ｏを添加した後、３Ｍ ＮａＯＡＣ（１／１０ｖｏｌｕｍｅ）、１００％ ＥｔＯＨ（２ｖｏｌｕｍｅ）を仕込み、ｖｏｒｔｅｘの後、１３０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、７０％ＥｔＯＨ（４００μＬ）で洗浄した後、ＥｔＯＨを除去し、真空乾燥機(speed-vacuum)で乾燥させた後、１５μＬのテンプレート抑制試薬(template suppression reagent)に溶かした。次に、ｖｏｒｔｅｘとスピンダウンの後、シーケンシングチューブに移して自動配列分析器（ＡＢＩ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ）でシーケンシングを確認した。
【００５４】
参照例３：テオフィリン依存性ｈＴＥＲＴターゲッティングＴ／ＳアプタザイムＲＮＡの製造
Ｔ７重合酵素プロモータが含まれた配列番号１６（５’−ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＣＡＧＧＡＡＡＡＧＴＴＡＴＣＡＧＧＣＡ−３’）のプライマー、およびリボザイムの３’エキソンの中間を取る配列番号１７（５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＧＣＡＡＣＴＧＣＡＡＣＴＣＣＧＡＴＡＡ−３’）のプライマーを用いてＰＣＲし、ＤＮＡテンプレート（３μｇ）、ＮＴＰ量を１.５ｍＭに増やして自己スプライシングを最大限防止し、１×スプライシングバッファ（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＤＴＴ、４ｍＭスペルミジン）、０．５ｍＭ ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ（Ｒｏｃｈｅ）、８０Ｕ ＲＮａｓｅ抑制剤（Ｋｏｓｃｏ）、２００Ｕ Ｔ７ ＲＮＡ重合酵素（Ａｍｂｉｏｎ）、ＤＥＰＣ−Ｈ２０を最終１００μＬまで入れて混ぜた後、３７℃で３時間転写させ、５Ｕ ＤＮａｓｅＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を３７℃で３０分間さらに処理することにより、ＤＮＡテンプレートを完全に除去した後、フェノール抽出（ｐＨ７．０）およびエタノール沈殿によってＲＮＡを精製し、しかる後に、ＲＮＡバンドを４％変性アクリルアミドゲル上で溶出した後、精製してＴＥバッファ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶かした。
【００５５】
参照例４：インビトロトランス−スプライシング反応
テオフィリン（５００μＭ）、テオフィリンとは一つの残基が異なるカフェイン（５００μＭ）、または同一体積のｄＨ２Ｏそれぞれが存在する状態で、リボザイム（５０ｎＭ）と基質ＲＮＡとしてのｈＴＥＲＴ ＲＮＡ（１０ｎＭ）とをスプライシング条件（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／５ｍＭ ＭｇＣｌ２／１００μＭグアノシン）の下に３７℃で３時間反応させ後、形成された産物をＲＴ−ＰＣＲ反応によって分析した。この際、ＲＴのためのプライマーはルシフェラーゼ認知部位（５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＧＣＡＡＣＴＧＣＡＡＣＴＣＣＧＡＴＡＡ−３’、配列番号１８）を用い、ＰＣＲのための５’プライマーはｈＴＥＲＴ ＲＮＡの５’末端（５’−ＧＧＡＡＴＴＣＧＣＡＧＣＧＣＴＧＣＧＴＣＣＴＧＣＴ−３’、配列番号１９）を用い、３’プライマーはルシフェラーゼを認知する部位（５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＣＴＧＣＡＴＡＣＧＡＣＧＡＴＴ−３’、配列番号２０）を用いた。
【００５６】
参照例５：半定量的(Semi-quantitative)ＰＣＲ
インビトロトランス−スプライシング反応の後、トランス−スプライシング産物に対して実時間ＰＣＲを用いて半定量的ＰＣＲを行った。それぞれのサンプルを三つぞろいで進行してそれらの平均値を求めたうえ、その融点を確認し、アガロースゲル上で確認した。この際、ＳＹＢＲグリーンを用いて検出した。また、半定量的にサンプルを比較することができるように、ＲＴ反応から定量された標準対照群を使用した。補正のためにＲＴ反応の際に、各サンプルに同量の任意のＲＮＡ（ｒａｓ ＲＮＡ）を仕込み、ＲＴプライマー製作の際にトランス−スプライシング産物と内部対照群(internal control)のｒａｓ ＲＮＡが一つのプライマーとしてＲＴできるようにデザインし、配列番号２１（５’−ＧＣＣＣＡＡＣＡＣＣＧＧＣＡＴＡＡＡＧＴＴＡＣＡＴＡＡＴＴＡＣＡＣＡＣＴＴ−３’）のプライマーを製作した。よって、ＲＴされたサンプルの定量的な比較において、ｒａｓ ＣＤＮＡの量でその値を補正した。
【００５７】
ＰＣＲ条件は、予熱(preheating)９６℃１０分、変性(denaturation)９６℃５分、結合(annealing)６０℃１５秒、延長(extension)７２℃３０秒であった。この際、５’プライマーはｈＴＥＲＴ認知部位（５’−ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＴＧＣＧＴＣＣＴＧＣＴＣＧＡ、配列番号２２）を使用し、３’プライマーはルシフェラーゼ認知部位（５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＣＴＧＣＡＴＡＣＡＣＧＡＴＴ、配列番号２３）を使用した。内部対照群であるｒａｓ ｃＤＮＡのＰＣＲプライマーは、次のとおりである；５’プライマー（５’−ＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴ、配列番号２４）、３’プライマー（５；ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＡＣＡＴＡＡＴＴＡＣＡＣＡＣＴＴ、配列番号２５）。
【００５８】
参照例６：特異性を増加させた特異Ｔ／Ｓアプタザイムの製作
ｈＴＲＥＴ配列上でＩＧＳによって認知される部位から３’末端側に相補的な１００ｎｔのアンチセンス鎖を配列番号２６（５’−ＡＡＴＴＣＡＡＧＣＴＴＣＧＴＴＴＴＧＣＧＧＣＡＧＣＡＧＧＡＡＡＡＧＴＴＡＴＣＡＧＧＣＡＴＧ−３’）および配列番号２７（５’−ＣＣＴＧＡＴＡＡＣＴＴＴＴＣＣＴＧＣＣＧＣＡＡＡＡＣＧＡＡＧＣＴＴＧ−３’）のプライマーを用い、３００ｎｔのアンチセンス鎖を配列番号２８（５’−ＧＧＧＡＡＧＣＴＴＧＧＧＡＡＧＣＣＣＴＧＧＣＣＣ−３’）および配列番号２９（５’−ＧＧＧＡＡＧＣＴＴＡＡＧＧＣＣＡＧＣＡＣＧＴＴＣＴＴ−３’）のプライマーを用いてＰＣＲした。これを製作したリボザイム構造体のリボザイムの前にＨｉｎｄＩＩＩ酵素部位にクローニングした。
【００５９】
参照例７：細胞培養
ｈＴＥＲＴ陽性細胞株は２９３（ヒト腎臓／ｎｏｒｍａｌ）、ＨＴ−２９（結腸／結腸直腸腺癌）、Ｃａｐａｎ−１（膵臓／腺癌）およびＨｅｐＧ２（肝／肝細胞癌）を参照し、ｈＴＥＲＴ陰性細胞株はＩＭＲ−９０（肺／線維芽細胞／ｎｏｒｍａｌ）、ＳＫ−ＬＵ１（肺／腺癌）ＡＴＣＣを参照して３７℃で５％ＣＯ--２インキュベータで培養した。
【００６０】
参照例８：細胞株におけるトランス−スプライシングアプタザイムの特異性、効率性の検証
１）テオフィリンの最適濃度試験
２９３細胞を３×１０５で３５ｍｍディッシュにシードして８０％程度成長したとき、Mu Ｐ９ ６ｔ８ｔ構造体１μｇをリポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてトランスフェクションし、テオフィリンまたはカフェインがそれぞれ０．１ｍＭ、０．３ｍＭ、０．５ｍＭ、０．７ｍＭ、１ｍＭの条件で１８時間培養した後、ルシフェラーゼ分析を行った。対照群として同一体積のＰＢＳを使用した。
【００６１】
２）デュアルルシフェラーゼの分析
３５ｍｍのディッシュにトランスフェクションしたそれぞれ細胞の培地を除去し、１×ＰＢＳでよく拭いた。ここで、１×不活性溶解バッファ(passive lysis buffer)を２００μＬ入れて常温で１５分間溶解させ、細胞を得た後、１３０００ｒｐｍで１分間遠心分離して上澄み液のみを新しいチューブに移した。発光試料測定装置(luminometer)のチューブにＬＡＲＩＩ(Luciferase assay reagentＩＩ)を１００μＬ仕込み、ここに細胞破砕物２０μＬを仕込んで混ぜた後、発光試料測定装置で読み取った。さらに、ここにＳｔｏｐ＆Ｇｌｏ ｒｅａｇｅｎｔ ｍｉｘ（Ｓｔｏｐ＆Ｇｌｏ２０μＬ＋Ｓｔｏｐ＆Ｇｌｏバッファ１ｍＬ）を１００μＬ仕込んで混ぜた後、発光試料測定装置（ＴＤ＋２０／２０）で読み取った。遅延時間は３秒、統合時間は１２秒とし、感度はそれぞれの細胞に応じて４５％に設定した。
【００６２】
トランスフェクションの際に、テオフィリン、カフェインはＰＢＳに溶かして細胞に処理した。また、細胞に対するトランスフェクション作業が終わり、ＭＥＭ培地で取り替える段階で、各化学物質を処理して１８時間培養した後、ルシフェラーゼ分析を行った。
【００６３】
３）細胞内トランス−スプライシング反応
リボザイムベクター１μｇを２９３細胞にリポフェクタミン４μＬを用いてトランジェントにトランスフェクションした。トランスフェクション５時間後、０．７ｍＭのテオフィリンまたはカフェイン入りの培地で取り替えた後、１８時間後に細胞破砕物を獲得し、総ＲＮＡを精製した。この際、ＲＮＡを抽出するとき、インビトロにおけるトランス−スプライシング反応可能性を最小化するために、２０ｍＭ ＥＤＴＡが含まれたグアノシンイソシアネート細胞破砕物溶液(geanosine isocyanate cell lysate solution)を用いてＲＮＡを抽出した。ＲＮＡを、ルシフェラーゼ部位を認知するプライマー（５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＧＣＡＡＣＴＧＣＡＡＣＴＣＣＧＡＴＡＡ、配列番号３０）を用いて逆転写反応の後、ｃＤＮＡを、重畳ルシフェラーゼプライマー(nested luciferase primer)を３’プライマー（５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＣＡＡＣＡＣＣＧＧＣＡＴＡＡＡＧ、配列番号３１）として、ｈＴＥＲＴ５’末端を認知する部位を５’プライマーとして（５’−ＡＧＣＧＣＴＧＣＧＴＣＣＴＧＣＴ、配列番号３２）それぞれ用いてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ条件は、予熱９６℃１０分、変性９６℃５分、結合５８℃３０秒、伸長７２℃２０秒を１サイクルとして４０サイクルを繰り返し行った。この際、反応産物の反応対照群として抽出されたＲＮＡをオリゴｄＴに逆転写した後、ＧＡＰＤＨ５’プライマー（５’−ＴＧＡＣＡＴＣＡＡＧＡＡＧＧＴＧＧＴＧＡ、配列番号３３）およびＧＡＰＤＨ３’プライマー（５’−ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ、配列番号３４）を用いてＧＡＰＤＨ ＲＮＡ発現度を観察し、内部対照群として用いた。
【００６４】
４）テオフィリン依存性ｈＴＥＲＴターゲッティングＴ／Ｓエプタザイムを発現するアデノウイルスの製作
ｐＡｖＱシャットルベクターにＡＳ３００ ＷＴ Ｐ９−ＴＫとＡＳ３００ Ｗ−Ｐ９ ６Ｔ８Ｔ−ＴＫをＢａｍＨＩとＢｓｔＢＩにクローニングしてリボザイムをＣＭＶプロモータの下に哺乳類細胞で発現するベクターを製作した。製作されたベクターをＰｍｅＩで線形化(linearization)させ、５型アデノウイルスゲノムＤＮＡプラスミドであるΔＥ１／Ｅ３ ｐＡｄｅｎｏｖｅｃｔｏｒ（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）と共にＢＪ５１８３バクテリアにエレクトロポレーション法を用いてコトランスフェクションさせた。バクテリア細胞内で相同組換えを介して獲得した組換えアデノウイルス性ベクター構造体を分離、精製してｍｉｎｉｐｒｅｐで確認し、しかる後に、ＰａｃＩで線形化した後、パッケージング細胞株である２９３細胞にトランスフェクションした。ウイルス増殖によって形成されるプラーククローン(plaque clone)を獲得した後、細胞残屑(cell debris)を除去したウイルス上澄み液を得て２９３細胞にもう１回感染させ、細胞の溶血が起るかを検証した。
【００６５】
ＡＳ３００ ＷＴ Ｐ９−ＴＫ（オリジナルＴ／Ｓリボザイム）とＡＳ３００ Ｗ−Ｐ９ ６Ｔ８Ｔ−ＴＫ（アロステリックＴ／Ｓリボザイム）をＣＭＶプロモータの下に発現するアデノウイルス性ベクターをそれぞれＡｄ−Ｒｉｂ−ＴＫ、Ａｄ−ＴｈｅｏＲｉｂ−ＴＫと命名した。
【００６６】
組換えアデノウイルス（Ａｄ−Ｒｉｂ−ＴＫ、Ａｄ−ＴｈｅｏＲｉｂ−ＴＫ）が成功裏に製作されたかは、組換えウイルスゲノムＤＮＡがトランスフェクションされた２９３から得た上澄み液を２９３細胞に感染させた後、ＣＰＥ観察によって検証した。また、細胞溶解を誘発するプラーククローンからのウイルス上澄み液からＤＮＡを得てＰＣＲ実験（ＴＫおよびウイルスＩＴＲ部位）によって検証した。
【００６７】
ウイルス感染した細胞の破砕物からＲＮＡを抽出した後、ＲＴ−ＰＣＲを行って（ＴＫ ＲＮＡ）組換えウイルス構造体が碌に形成され且つこのようなウイルスからトランスジーンが発現できることを検証した。各組換えアデノウイルスクローンを感染させた２９３細胞の上澄み液から得た組換えウイルスを多数回２９３細胞に再び感染させてウイルスの量を増幅し、Ｖｉｖａｐｕｒｅ（登録商標） ＡｄｅｎｏＰＡＣＫＴＭを用いて組換えアデノウイルス性ベクターを分離、精製した。獲得した組換えウイルスを連続的に希釈した後、ＴＣＩＤ５０分析を行うことにより、各精製されたウイルスベクターのＰＦＵタイターを決定した。
【００６８】
５）ＭＴＴ分析
細胞を９６ウェルプレート（ＴＰＰ）にシードした後、１日後にＡｄ−ＴＫ（ＣＭＶプロモータの下にＴＫ遺伝子を発現するアデノウイルス性ベクター）、Ａｄ−Ｒｉｂ−ＴＫ、Ａｄ−ＴｈｅｏＲｉｂ−ＴＫ、Ａｄ−ＬａｃＺ（ＣＭＶプロモータの下にＬａｃＺを発現するアデノウイルス性ベクター）アデノウイルスをそれぞれ感染させた。ウイルス感染の翌日から５日間ＧＣＶと化学物質（テオフィリン、カフェイン）が含有された培地を２日に１回ずつ取り替えた。ＨＴ−２９は３×１０３／ｗｅｌｌ、ＨｅｐＧ２は３×１０３／ｗｅｌｌ、Ｃａｐａｎ−１は５×１０３／ｗｅｌｌ、ＩＭＲ９０は５×１０３／ｗｅｌｌの細胞数でそれぞれシードした。５日後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ ＯＮＥ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を各培地に２０％添加して９６ウェルに各ウェル当たり１００μＬで処理してＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ ｍｏｄｅｌ５５０（ＢｉｏＲａｄ）によって４９０ｎｍ波長で測定し、細胞の細胞生存率を観察した。
【００６９】
６）半定量的ＰＣＲ
３５ｍｍのディッシュにアデノウイルスを感染させてから２４時間後、化学物質（テオフィリン、カフェイン）が含まれた培地で取り替え、さらに２４時間後、細胞でＴｒｉＺｏｌ反応試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＲＮＡを精製してＲＴした後、実時間ＰＣＲを用いてＴ／Ｓ産物に対する半定量的ＰＣＲを行った。Ｔ／Ｓ ＰＣＲ産物の量を、ＧＡＰＤＨをＰＣＲした量を用いて補正した。
【００７０】
ＲＮＡをオリゴｄＴを用いて逆転写反応させた後、ｃＤＮＡを、ＴＫプライマーを３’プライマー（５’−ＣＣＣＡＴＧＣＡＣＧＴＣＴＴＴＡＴＣＣＴＧＧＡＴ−３’、配列番号３５）として、ｈＴＥＲＴ５’末端を認知する部位を５’プライマーとして（５’−ＧＧＡＡＴＴＣＧＣＡＧＣＧＣＴＧＣＧＴＣＣＴＧＣＴ−３’、配列番号３６）それぞれ用いて実時間ＰＣＲ増幅した。反応産物の反応対照群として抽出したＲＮＡをオリゴｄＴで逆転写した後、ＧＡＰＤＨ５’−プライマー（５’−ＴＧＡＣＡＴＣＡＡＧＡＡＧＧＴＧＧＴＧＡ、配列番号３７）およびＧＡＰＤＨ３’−プライマー（５’−ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ、配列番号３８）を用いてＧＡＰＤＨ ＲＮＡ発現度を観察し、内部対照群として用いた。
【００７１】
実施例１：テオフィリンアプタマーが付着しており且つｈＴＥＲＴ ＲＮＡを特異的に標的化するトランス−スプライシングリボザイムの製造
アロステリックリボザイム開発のための基本トランス−スプライシングリボザイム骨格は、ｈＴＥＲＴの＋２１ｎｔ部位を特異的に認知し、Ｐ１、Ｐ１０、そして標的ＲＮＡに対する３００個のアンチセンス配列が添加された拡張ＩＧＳを有するグループＩイントロンリボザイムを用いた（図２）。このようなリボザイムは、既に細胞および動物モデルでｈＴＥＲＴ ＲＮＡ特異的にトランスジーンを発現させることにより、ｈＴＥＲＴ発現癌細胞特異的な細胞死を誘導することを観察した(Mol. Ther. 2005;12:824, Mol Ther. 2008;16:74)。
【００７２】
テオフィリン依存性アロステリックリボザイムを製作するために、テオフィリンの受容体ドメインとしてテオフィリンＲＮＡアプタマー(Science 1994;263;1425)を、本研究チームで開発したｈＴＥＲＴ−特異Ｔ／Ｓリボザイムの触媒機能のためのＲＮＡ折り畳みに重要な役割(Nucleic Acid Res. 2002;30:4599)を果たすＰ６またはＰ８ドメイン、あるいはＰ６＋Ｐ８ドメインに付着させた。また、Ｐ９ドメインを最小化させたΔＰ９ドメインが置換されたリボザイム、またはＰ９が変異されているリボザイムのＰ６、Ｐ８、またはＰ６＋Ｐ８ドメインにテオフィリンアプタマーを付着させたＴ／Ｓリボザイムを製造した。図３はトランス−スプライシングリボザイムの根幹構造であるグループＩイントロンの構造および塩基配列、並びにテオフィリンアプタマーおよびアプタマーをリボザイムに連結させるコミュニケーションモジュール構造(Nucleic Acis Res.2002;30:4599)などを示す。
【００７３】
製作したトランス−スプライシングリボザイム構造体は、次のとおりである。
−ｈＴＥＲＴ特異的トランス−スプライシングリボザイム（ＷＴ）
−ＷＴのＰ６またはＰ８にアプタマーが付着しているリボザイム（Ｗ−Ｐ９ ６ｔ、ＷＴ−Ｐ９ ８ｔ）
−変異Ｐ９のＰ６とＰ８ドメインにアプタマーが付着しているリボザイム（Ｍｕ−Ｐ９ ６ｔ８ｔ）
−ＷＴリボザイムのＰ９部位がΔＰ９で置換されたリボザイム（ΔＰ９）
−ΔＰ９リボザイムにＰ６、Ｐ８、Ｐ６＋Ｐ８にアプタマーが付着しているリボザイム（ΔＰ９ ６ｔ、ΔＰ ８ｔ、ΔＰ９ ６ｔ８ｔ）
−ｈＴＥＲＴに対するアンチセンス３００ｎｔが付着しているＷＴリボザイム（ＡＳ−３００ ＷＴ）
−Ｐ１、Ｐ１０ヘリックスを含有し、Ｐ６＋Ｐ８にアプタマーを含有しているＷＴリボザイム（ＩＧＳ Ｗ−Ｐ９ ６ｔ８ｔ）
−アンチセンス３００ｎｔが付着しており、Ｐ６＋Ｐ８にアプタマーを含有しているＷＴリボザイム（ＡＳ−３００ Ｗ−Ｐ９ ６ｔ８ｔ）
−アンチセンス３００ｎｔが付着しており、Ｐ６＋Ｐ８にアプタマーを含有しているＭｕ−Ｐ９リボザイム（ＡＳ−３００ Ｍｕ−Ｐ９ ６ｔ８ｔ）
【００７４】
変異Ｐ９の構造は、リボザイムベクターを製造するＰＣＲ過程中に偶然製作された構造体であって、インビトロ上における標的ＲＮＡ（ｈＴＥＲＴ ＲＮＡ）とのトランススプライシング反応を行った結果、リボザイムの活性には影響を及ぼさない部位であることが分かった。
【００７５】
したがって、本発明におけるアロステリックリボザイム製作のための候補として、このような変異Ｐ９に基づいたリボザイム構造体も共に製作し、その機能を観察した。図４は野性型Ｐ９配列と変異Ｐ９（Ｍｕ−Ｐ９）配列を示した。他の部分は太字と下線で表示した。
【００７６】
実施例２：リボザイムのテオフィリン依存性ＲＮＡ置換機能を定量的に分析
前記で製作したリボザイムと基質ＲＮＡとしてのｈＴＥＲＴ ＲＮＡをスプライシング条件の下に３７℃で３時間反応させた後、形成された産物をＲＴ−ＰＣＲ反応によって分析した。スプライシング反応の際に、水または０．５ｍＭカフェイン（テオフィリン構造類似体、アロステリック効果の特異性に対する陰性対照群）または０．５ｍＭテオフィリンと共に反応させることにより、トランス−スプライシング反応がテオフィリン特異的にアロステリックにターンオン(turn on)されるかを観察した。図５はＲＴ−ＰＣＲ産物の結果を示している。
【００７７】
図５を参照すると、ＷＴおよびΔＰ９リボザイムの場合には予想とおりにカフェイン、テオフィリン、水を問わずに常にトランス−スプライシング反応が誘発され、Ｗ−Ｐ９ ６ｔの場合にも化合物に関係なく反応が誘発されることが分かった。また、Ｗ−Ｐ９ ８ｔの場合にもテオフィリン特異的にトランス−スプライシング反応が起らず、ΔＰ９ ８ｔおよびΔＰ ６ｔ８ｔの場合にはトランス−スプライシング反応自体が非常に非効率的に行われていることが分かった。これに対し、Ｍｕ−Ｐ９ ６ｔ８ｔとΔＰ９ ６ｔリボザイムの場合にはテオフィリン特異的に３１９ｂｐサイズのトランス−スプライシング産物がインビトロ上で生成されることが分かった。よって、 グループＩイントロンのＰ６またはＰ８ドメインがリボザイムのＰ９配列または構造的性質によってテオフィリン依存的にアロステリックにリボザイム活性を調節することが可能な主要ドメインであることが分かった。
【００７８】
アロステリックリボザイムによるテオフィリン依存性トランス−スプライシング反応の誘導調節の度合いを比較分析するために、トランス−スプライシング産物に対する実時間ＰＣＲ分析（分析機器；Ｃｏｒｂｅｔｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＲＧ６）を行った。前記トランス−スプライシング反応によってテオフィリン依存的に酵素活性が調節されるＭｕ−Ｐ９ ６ｔ８ｔリボザイム、または低分子化合物とは関係なく構造的に酵素活性を持つＷＴリボザイムをｈＴＥＲＴ ＲＮＡと共にスプライシング反応させた後、ＲＴ反応を行った。ＲＴされたサンプルの定量的比較において、その値をｒａｓ ｃＤＮＡの量を用いて補正した。その結果を図６に示した。図６を参照すると、ＷＴリボザイムの場合にはスプライシングバッファ上に水、テオフィリンおよびカフェインの存在を問わずに同量のトランス−スプライシング産物を生成することが分かった。また、ΔＰ９ ６ｔリボザイムの場合、実時間で反応産物を定量分析した結果、テオフィリン依存性トランス−スプライシング反応結果を示さなかった。ところが、以前の実験によって確認したインビトロ上でテオフィリン依存的に調節されるＭｕ−Ｐ９ ６ｔ８ｔリボザイムの場合、内部対照群で各ＲＴサンプルの値を補正して比較したとき、カフェインに比べてテオフィリンが存在する条件で４．３倍の差異を示し、同一体積のｄＨ２Ｏとは１２．１６倍の差異を示した。したがって、Ｍｕ−Ｐ９ ６ｔ８ｔリボザイムは、インビトロ上で効果的にテオフィリン依存的にトランス−スプライシング反応が調節できるアロステリックリボザイムであることが分かった。
【００７９】
前記で分析したリボザイムのＩＧＳは、６個のｎｔのみを持っているので、細胞内における標的ＲＮＡ特異的なトランス−スプライシング反応のためにはＩＧＳ基が拡張されたリボザイムを利用しなければならない(Nat. Biotechnol.1996;15:902, J. Mol. Biol. 1999;185:1935, Mol. Ther. 2003;7:386, Mol. Ther. 2004;10:365; Mol. Ther. 2005;12:824)。このように拡張されたＩＧＳを持つリボザイムは、インビトロ転写を介して製造した後、ｈＴＥＲＴ ＲＮＡとのインビトロ上におけるトランス−スプライシング反応を行った。この際、トランス−スプライシング反応がテオフィリンに依存的であるかを観察した。製作したリボザイムは、ｈＴＥＲＴに対するアンチセンス３００ｎｔが付着しているＷＴリボザイム（ＡＳ−３００ ＷＴ）、Ｐ１、Ｐ１０へリックスを含有し且つＰ６＋Ｐ８にアプタマーを含有しているＷＴリボザイム（ＩＧＳ Ｗ−Ｐ９ ６ｔ８ｔ）、アンチセンス３００ｎｔが付着しており且つＰ６＋Ｐ８にアプタマーを含有しているＷＴイボザイム（ＡＳ−３００ Ｗ−Ｐ９ ６ｔ８ｔ）、およびアンチセンス３００ｎｔが付着しており且つＰ６＋Ｐ８にアプタマーを含有しているＭｕ−Ｐ９リボザイム（ＡＳ−３００ Ｍｕ−Ｐ９ ６ｔ８ｔ）などであり、その反応結果（トランス−スプライシング産物のＲＴ−ＰＣＲ産物）は図７に示した。
【００８０】
図７を参照すると、予想とおり、ＡＳ−３００ ＷＴの場合にはテオフィリンに関係なくスプライシング反応が誘発された。ＡＳ３００ Ｗ−Ｐ９ ６ｔ８ｔの場合にも、インビトロ上ではテオフィリンに関係なくスプライシング反応が誘発されたが、ＡＳ３００ Ｍｕ−Ｐ９ ６ｔ８ｔの場合には、ＡＳ３００がない場合とは異なり、スプライシング反応自体がよく起らないことが分かった。これに対し、アンチセンスなしでＰ１とＰ１０へリックスを持つＩＧＳ Ｗ−Ｐ９ ６ｔ８ｔの場合には、テオフィリンが存在する場合にのみトランス−スプライシング反応が誘発できることが分かった。このような結果は、６ｎｔのＩＧＳのみを持つリボザイムと拡張されたＩＧＳ配列を持つリボザイムとが同一のリボザイム基本骨格を持つとしても、アンチセンス配列の存在有無によって異なる活性を示すＲＮＡ構造的差異が存在しうることを示唆する。よって、これは各拡張ＩＧＳを有するリボザイムのインビトロ、ひいては細胞内におけるスプライシング活性をそれぞれ観察しなければならないことを示唆する。
【００８１】
前記結果より、テオフィリンアプタマーが付着している一部のリボザイムはインビトロ上でテオフィリン依存的にトランス−スプライシング活性がアロステリックに調節できることが分かった。果たしてこのようなトランス−スプライシング産物が正確なトランス−スプライシング反応によって生成された産物であるかを検証するために、獲得したトランス−スプライシングＲＴ−ＰＣＴ産物をｐＵＣ１９ベクターにクローニングした後、その塩基配列を決定した。図８に示すように、トランス−スプライシング反応産物の配列データより、標的ＲＮＡであるｈＴＥＲＴ ＲＮＡの＋２１ｎｔ部位の下流域と、リボザイムの３’エキソンに付着している蛍ルシフェラーゼＲＮＡとが正確に連結された産物であることが分かった。このような結果は、アロステリックトランス−スプライシングリボザイムの反応が非常に正確に起ることを意味する。
【００８２】
実施例３：３’エキソンにレポーター遺伝子が付着しているアロステリックトランス−スプライシングリボザイムの製作
テオフィリン依存性アロステリックリボザイム発現ベクターを製作するために、テオフィリンの受容体ドメインとしてテオフィリンＲＮＡアプタマー（Ｓｃｉｅｎｃｅ１９９４；２６３：１４２５）を、本発明者らによって開発したｈＴＥＲＴ−特異トランス−スプライシングリボザイムの触媒機能のためのＲＮＡ折り畳みに重要な役割(Nucleic Acis Res. 2002;30:4599)を果たすＰ６、Ｐ８、またはＰ６＋Ｐ８ドメインに付着させた。また、Ｐ９ドメインを最小化させたΔＰ９ドメインが置換されたリボザイム、または変異Ｐ９を含有したリボザイムのＰ６、Ｐ８、またはＰ６＋Ｐ８ドメインにテオフィリンアプタマーを付着させたトランス−スプライシングリボザイムを製造した。発現誘導のためのトランスジーンとして蛍ルシフェラーゼ遺伝子をリボザイムの３’エキソンに挿入し、ＳＶ４０プロモータシステムを用いて細胞内リボザイムの発現を図った。製作したトランス−スプライシングリボザイム構造体は、次のとおりである。
【００８３】
ベクターの製造は、インビトロスプライシング反応のために製造したアロステリックリボザイム構造体のリボザイム部位からルシフェラーゼ３’末端までＰＣＲ反応によって増幅した後、そのＤＮＡを、ＳＶ４０プロモータが含有されたｐＳＥＡＰベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩ部位に挿入した後、ＨｉｎｄＩＩＩ部位にｈＴＥＲＴ ＲＮＡに対するアンチセンス配列を挿入することにより行った。この際、リボザイムを増幅するための５’プライマーには、Ｐ１、Ｐ１０へリックス、およびｈＴＥＲＴ ＲＮＡの＋２１ｎｔを認知するＩＧＳ配列を含有している（５’−ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＣＡＧＧＡＡＡＡＧＴＴＡＴＣＡＧＧＣＡ−３’、配列番号３９）。
【００８４】
（１）ｈＴＥＲＴ ＲＮＡに対して１００ｎｔアンチセンスを含有するベクター；
−ｈＴＥＲＴ特異的リボザイム（ＡＳ−１００ ＷＴ）発現ベクター、
−ＷＴのＰ６、Ｐ８にアプタマーが付着しているリボザイム（ＡＳ−１００ Ｗ−Ｐ９ ６ｔ、ＡＳ−１００ ＷＴ−Ｐ９ ８ｔ）発現ベクター、
−変異Ｐ９のＰ６＋Ｐ８ドメインにアプタマーが付着しているリボザイム（ＡＳ−１００ Ｍｕ−Ｐ９ ６ｔ８ｔ）発現ベクター（ｐＳＥＡＰ ＡＳ１００ Ｍｕ−Ｐ９ ６Ｔ８Ｔ−Ｌｕｃｉ、配列番号５）、
−ΔＰ９リボザイムのＰ６、Ｐ８、Ｐ６＋Ｐ８にアプタマーが付着しているリボザイム（ＡＳ−１００ ΔＰ９ ６ｔ、ＡＳ−１００ ΔＰ９ ８ｔ、ＡＳ−１００ ΔＰ９ ６ｔ８ｔ）発現ベクター、
（２）ｈＴＥＲＴ ＲＮＡに対して３００ｎｔアンチセンスを含有するベクター
−ｈＴＥＲＴ特異的リボザイム（ＡＳ−３００ ＷＴ）発現ベクター、
−ＷＴのＰ６＋Ｐ８にアプタマーが付着しているリボザイム（ＡＳ−３００ Ｗ−Ｐ９ ６ｔ８ｔ）発現ベクター（ｐＳＥＡＰ ＡＳ３００ Ｗ−Ｐ９ ６Ｔ８Ｔ−Ｌｕｃｉ、配列番号６）、
−変異Ｐ９のＰ６＋Ｐ８ドメインにアプタマーが付着しているリボザイム（ＡＳ−３００ Ｍｕ−Ｐ９ ６ｔ８ｔ）発現ベクター、
−ΔＰ９リボザイムのＰ６ドメインにアプタマーが付着しているリボザイム（ＡＳ−３００ ΔＰ９ ６ｔ）発現ベクター、
−ΔＰ９リボザイムのＰ８ドメインにアプタマーが付着しているリボザイム（ＡＳ−３００ ΔＰ９ ８ｔ）発現ベクター（ｐＳＥＡＰ ＡＳ３００ Ｄｅｌｔａ Ｐ９ ８Ｔ−Ｌｕｃｉ、配列番号４）
【００８５】
実施例４：リボザイムの細胞内における化合物依存性ｈＴＥＲＴ ＲＮＡの特異的置換機能の観察
１）テオフィリン依存性トランス−スプライシングトランスジーン誘導条件の確立
前記で製造した３’エキソンにルシフェラーゼが付着しているアロステリックリボザイムがどの細胞内でテオフィリン濃度条件の下で最もアロステリックにトランスジーン発現を誘導するかその条件をまず樹立した。
【００８６】
インビトロ上におけるトランス−スプライシング反応によってテオフィリン依存的にトランス−スプライシング反応を誘導したＭｕ−Ｐ９ ６ｔ８ｔリボザイム発現ベクターを２９３細胞にリポフェクタミンを用いてトランジェントにトランスフェクションした。この際、トランスフェクション効率を測定し、発現産物の活性を標準化するために、ＣＭＶプロモータの下にレニラルシフェラーゼ(renillar luciferase)を発現することが可能なベクターを共にコトランスフェクションした。トランスフェクション４時間後に新規の培地で取り替えたが、この際、新規の培地には０．１ｍＭ、０．３ｍＭ、０．５ｍＭ、０．７ｍＭおよび１ｍＭのカフェインまたはテオフィリンを添加し、果たしてどの程度のテオフィリン下で最もテオフィリン依存的にルシフェラーゼ活性が誘導されるかを検証した。新規の培地で取り替えてから１８時間後、細胞破砕物を得た後、レニラルシフェラーゼ活性によって標準化させた蛍ルシフェラーゼ活性を照度計ＴＤ−２０／２０(Turner Designs Instrument)を用いて測定した。この際、測定されたルシフェラーゼ活性は、ＳＶ４０プロモータの下でルシフェラーゼを発現するベクター（ＳＶ４０−Ｌｕｃｉ）をトランスフェクションした後、生成されるルシフェラーゼ値に対する相対値（％）で図９のように示した。
【００８７】
図９を参照すると、０．７ｍＭのテオフィリン存在の際に０．７ｍＭのカフェイン存在の場合と比較して最も細胞内におけるテオフィリン特異的ルシフェラーゼ活性の誘導が増加することが分かった。したがって、多様なリボザイム発現ベクターによるテオフィリン依存性遺伝子発現誘導のためのテオフィリン濃度条件を０．７ｍＭに固定して次の実験を行った。
【００８８】
２）１００ｎｔアンチセンス含有リボザイム発現ベクターによるテオフィリン依存性トランスジーン発現の誘導
ｈＴＥＲＴ ＲＮＡに対する１００ｎｔアンチセンス配列を持っており且つテオフィリンアプタマーが付着しているリボザイムによる細胞内トランスジーン活性誘導の有無をルシフェラーゼ分析によって観察した。
【００８９】
この際、測定されたルシフェラーゼ活性は、ＰＢＳを処理した細胞破砕物から観察されるルシフェラーゼ値に対する相対値（％）で図１０のように示した。
【００９０】
図１０を参照すると、インビトロデータと一致するように、ＡＳ−１００ Ｍｕ−Ｐ９ ６ｔ８ｔリボザイムの場合、最もテオフィリン特異的にルシフェラーゼ活性の誘導を増進させることが分かった。ところが、インビトロデータとは異なり、ＡＳ−１００ ΔＰ９ ６ｔリボザイムよりはＡＳ−１００ ΔＰ９ ８ｔリボザイムの場合がさらにテオフィリン特異的にトランスジーンの発現を誘導することが分かった。このような結果は、ＩＧＳの前にアンチセンス配列が１００ｎｔさらに付加されることにより引き起こされ得るリボザイム構造的変異、そして細胞内における環境がインビトロ上における環境と必ずしも一致しないためであると思われる。これに対し、ＷＴ、Ｗ−Ｐ９ ６ｔ、Ｗ−Ｐ９ ８ｔおよびΔＰ９、ΔＰ９ ６ｔ８ｔリボザイムの場合は、テオフィリン特異的に細胞内におけるトランスジーン活性を誘導するとは見られなかった。
【００９１】
３）ｈＴＥＲＴ−陰性細胞におけるアロステリックリボザイム活性
前記結果より、細胞内でテオフィリン依存的にアロステリックにトランスジーン活性を誘導することができるものと観察されたＡＳ−１００ Ｍｕ−Ｐ９ ６ｔ８ｔリボザイム、および細胞内ではアロステリック効果を示していないＡＳ−１００ ΔＰ９ ６ｔリボザイムが、果たしてｈＴＥＲＴ標的ＲＮＡ特異的にトランスジーン活性を誘導するかを調べるために、ｈＴＥＲＴ陰性細胞であるＳＫ−Ｌｕ−１細胞に各リボザイムベクターをＤＭＲＩＥ−Ｃを用いてトランジェントにトランスフェクションし、その４時間後、テオフィリン入りの培地で取り替えた。新規の培地で取り替えてから１８時間の後、細胞破砕物を得た後、ルシフェラーゼ活性を測定してＳＶ４０−Ｌｕｃｉベクターによるルシフェラーゼ発現値との相対値を図１１のように測定した。
【００９２】
図１１を参照すると、ＡＳ−１００ ＷＴリボザイムと同様に、ＡＳ−１００ Ｍｕ−Ｐ９ ６ｔ８ｔおよびＡＳ−１００ ΔＰ９ ６ｔリボザイムの両方とも標的ＲＮＡが存在しなければ、テオフィリンの存在と関係なくトランスジーン発現誘導が抑制されることが分かった。すなわち、テオフィリン依存性アロステリックトランス−スプライシングリボザイムは、ターゲットＲＮＡ特異的にトランスジーン発現を誘導することができることが分かった。
【００９３】
４）３００ｎｔアンチセンス含有リボザイム発現ベクターによるテオフィリン依存性トランス発現の誘導
アンチセンス配列の長さを増加させることにより、トランス−スプライシングリボザイムのアロステリックトランスジーン発現誘導効果がさらに増進できるかを観察するために、ｈＴＥＲＴ ＲＮＡに対して３００ｎｔのアンチセンス配列を含有したリボザイムベクターを製造した後、細胞内におけるテオフィリン依存的ルシフェラーゼ活性の誘導を比較観察した。
本実験のためのテオフィリン依存性対照群としてＡＳ−３００ ＷＴリボザイムを用いた。インビトロでテオフィリン依存的にトランス−スプライシング反応を誘発し且つＡＳ−１００配列含有の際に細胞内でテオフィリン依存的トランスジーン活性を誘導した、Ｍｕ−Ｐ９ ６ｔ８ｔの基本骨格に３００ｎｔアンチセンスを含有したリボザイム（ＡＳ−３００ Ｍｕ−Ｐ９ ６ｔ８ｔ）、インビトロでテオフィリン依存的にトランス−スプライシング反応を誘発した、ΔＰ９ ６ｔの基本骨格に３００ｎｔアンチセンスを含有したリボザイム（ＡＳ−３００ ΔＰ９ ６ｔ）、ＡＳ-１００配列含有の際に細胞内でテオフィリン依存的トランスジーン活性を誘導した、ΔＰ９ ８ｔの基本骨格に３００ｎｔアンチセンスを含有したリボザイム（ＡＳ−３００ ΔＰ９ ８ｔ）、および拡張されたＩＧＳ含有の際（Ｐ１＋Ｐ１０へリックス）にインビトロでテオフィリン依存的にトランス−スプライシング反応を誘発した、Ｗ−Ｐ９ ６ｔ８ｔの基本骨格に３００ｎｔアンチセンスを含有したリボザイム（ＡＳ−３００ Ｗ−Ｐ９ ６ｔ８ｔ）の発現ベクターを、それぞれｈＴＥＲＴ陽性細胞としての２９３細胞にコトランスフェクションした後、ルシフェラーゼ活性を測定し、テオフィリン依存的遺伝子の活性誘導有無を相互比較し、観察した。この際、測定されたルシフェラーゼ活性はＳＶ４０プロモータの下で蛍ルシフェラーゼを発現するベクター（ＳＶ４０−Ｌｕｃｉ）をトランスフェクションした後、生成されるルシフェラーゼ値に対する相対値（％）で図１２のように示した。
【００９４】
図１２を参照すると、予想とおり、ＡＳ−３００ ＷＴリボザイムはテオフィリンの存在有無を問わずにルシフェラーゼ発現を効果的に誘導した。アンチセンス配列３００ｎｔを含有したリボザイムのうちＡＳ−３００ Ｍｕ−Ｐ９ ６ｔ８ｔとＡＳ−３００ ΔＰ９ ６ｔリボザイムの場合、テオフィリン依存的トランスジーン活性誘導を観察することはできなかった。これに対し、ＡＳ−３００ Ｗ−Ｐ９ ６ｔ８ｔとＡＳ−３００ ΔＰ９ ８ｔの場合は、テオフィリン依存的に効果的なルシフェラーゼ活性誘導を観察することができ、リボザイムのＩＧＳの前にアンチセンス配列１００ｎｔを挿入する場合よりアンチセンス配列３００ｎｔを挿入した場合が、さらにトランスジーン発現誘導を増加させることができることを観察することができた。
【００９５】
５）アロステリックリボザイムによる細胞内トランス−スプライシング反応
前記実験によって、細胞内でテオフィリン依存的にトランスジーンの活性を誘導、増進させることが可能なリボザイム構造体を探索した。このようなテオフィリン依存性トランスジーンの誘導が、果たして細胞内トランス−スプライシング反応のアロステリック効果によって誘発されるかを検証するために、テオフィリンアプタマーが付着しているリボザイム発現ベクターを２９３細胞にトランジェントにトランスフェクションした後、細胞内トランス−スプライシング反応産物の存在有無を観察した。
【００９６】
ＧＡＰＤＨ ＲＮＡ発現度を観察して内部対照群として用いた。ＲＴ−ＰＣＲ産物をアガロースゲルで分析した結果は、図１３に示した。
【００９７】
図１３を参照すると、予想とおり、陽性対照群であるＷＴリボザイム（ＡＳ−３００ ＷＴ）の場合、ｈＴＥＲＴ特異的トランス−スプライシング反応物を得ることができた（ｌａｎｅ３）。テオフィリンアプタマーが付着しているリボザイムは、ルシフェラーゼ活性の誘導結果と一致するように、ＡＳ−３００ Ｍｕ−Ｐ９ ６ｔ８ｔリボザイムベクターの場合にはテオフィリン、カフェインおよびＰＢＳ存在の際に培地を問わずに全てトランス−スプライシング産物が生成されたが（ｌａｎｅ７〜９）、これに対し、ＡＳ−３００ Ｗ−Ｐ９ ６ｔ８ｔリボザイムベクターの場合には、ルシフェラーゼ活性の誘導結果と一致するように、テオフィリンを処理した細胞のみ３１１ｂｐのトランス−スプライシング産物が生成されること（ｌａｎｅ４）を観察することができた。このような結果はＡＳ−３００ Ｗ−Ｐ９ ６ｔ８ｔリボザイムのインビトロトランス−スプライシング結果とは異なるが、これはインビトロと細胞内における環境的相異によるものと思われる。このようなトランス−スプライシング産物が、ＲＮＡ抽出過程中に誘発されるインビトロトランス−スプライシング反応ではなく、細胞内におけるトランス−スプライシング反応の結果であることを検証するために、２９３細胞とＡＳ−３００ Ｗ−Ｐ９ ６ｔ８ｔリボザイムベクターをトランスフェクションさせたＳＫ−Ｌｕ−１細胞（ｈＴＥＲＴネガティブ）を混合し、ＲＮＡを抽出した後、ＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。その結果、図１３に示すように、何のトランス−スプライシング産物も発見されないことからみて（ｌａｎｅ１０）、テオフィリン存在の際にＡＳ−３００ Ｗ−Ｐ９ ６ｔ８ｔリボザイムがトランスフェクションされた２９３細胞でのみ測定されたトランス−スプライシング産物は、細胞におけるテオフィリン依存的で標的ＲＮＡ特異的なトランス−スプライシング反応によるものであることが分かった。
【００９８】
前記結果をまとめてみた結果、ｈＴＥＲＴ ＲＮＡを発現する細胞特異的に且つテオフィリン依存的にトランスジーン発現を調節することが可能な、すなわちテオフィリン依存的に細胞内で人為的にＲＮＡ置換反応を調節することが可能なアロステリックリボザイム候補としてＡＳ−３００ Ｗ−Ｐ９ ６ｔ８ｔとＡＳ−３００ ΔＰ９ ８ｔなどを開発した。さらに、インビトロ上で効率的なアロステリックリボザイムとしてＩＧＳ Ｗ−Ｐ９ ６ｔ８ｔを発掘した。
【００９９】
実施例５：アデノウイルス性ベクターによるｈＴＥＲＴ発現癌細胞特異的な細胞死調節機能の観察
１）ＨＴ−２９細胞（ｈＴＥＲＴ＋）におけるテオフィリン依存性細胞死の誘導
開発したアロステリックリボザイムの３’エキソンに細胞死遺伝子としてのＨＳＶチミジンキナーゼ遺伝子を挿入（ＡＳ３００ Ｗ−Ｐ９ ６Ｔ８Ｔ−ＴＫ）してＣＭＶプロモータの下でリボザイムを哺乳類細胞で発現することが可能なベクター（ｐＡｖＱ−Ｔｈｅｏ−Ｒｉｂ２１ＡＳ−ＴＫ、配列番号８）を製作した後、組換えアデノウイルス性ベクターを製作した（図１４）。
【０１００】
前記ｐＡｖＱ−Ｔｈｅｏ−Ｒｉｂ２１ＡＳ−ＴＫを韓国微生物保存センターに２００８年３月２１日付けで寄託し、寄託番号ＫＣＣＭ１０９３５Ｐを与えられた。
【０１０１】
ＨＳＶｔｋを３’エキソンとして持っており、テオフィリン依存性アロステリックリボザイムを発現するアデノウイルス性ベクター（Ａｄ−ＴｈｅｏＲｉｂＴＫ）が果たして標的特異的に、そしてテオフィリン依存的にトランスジーン発現を誘導するかを観察するために、ウイルス処理の後、ＧＣＶと調節化合物を処理し、しかる後に、ＭＴＴ分析によって大腸癌細胞としてのＨＴ−２９細胞の生存率を観察した。この際、陽性対照群としてＡｄ−ＴＫ（ＣＭＶプロモータの下にＨＳＶｔｋを発現するアデノウイルス性ベクター）を用い、ｈＴＥＲＴ＋細胞における陽性対照群としてＡｄ−Ｒｉｂ−ＴＫ（ｈＴＥＲＴ特異的であり、ＨＳＶｔｋが標識されているアデノウイルス性ベクター）を用いた。陰性対照群としては、Ａｄ−ＬａｃＺ（ＣＭＶプロモータの下にＬａｃＺを発現するアデノウイルス性ベクター）を用いた。Ａｄ−ＴｈｅｏＲｉｂ−ＴＫを処理した場合、テオフィリン或いはカフェインを処理した後の生存率を相互比較し、その結果を図１５に示した。
【０１０２】
図１５を参照すると、Ａｄ−ＴＫおよびＡｄ−Ｒｉｂ−ＴＫの場合、ＧＣＶ濃度が増加すると同時にアデノウイルス濃度が増加しながら細胞生存率が減少するが、化学物質の濃度には影響されないことが観察された。これに対し、Ａｄ−ＬａｃＺの場合はいずれの場合でも細胞生存率に影響を及ぼさなかった。注目すべき点は、アロステリックリボザイムであるＡｄ−ＴｈｅｏＲｉｂ ＴＫを感染させた場合、カフェイン処理によっては細胞生存率がＧＣＶ、ウイルスおよび化学物質の濃度を増加させても細胞生存率に影響を及ぼさなかったが、テオフィリンを処理した場合には、陽性対照群と同様に、ウイルス濃度およびＧＣＶ濃度に比例するように細胞生存率が減少した。また、テオフィリン濃度が増加すると、それにより細胞生存率も一緒に減少することが観察された。これは、Ａｄ−ＴｈｅｏＲｉｂ−ＴＫはテオフィリンによってその活性がアロステリックに調節されるので、テオフィリンを処理すればトランスジーン発現が誘導されることにより、癌細胞の細胞死が誘発されたことを示唆する。最もアロステリックに遺伝子発現が誘導される条件は、１００ｍｏｉアデノウイルス、１００μＭテオフィリン、１０μＭ ＧＣＶを処理した場合である。
【０１０３】
２）ＨｅｐＧ２細胞（ｈＴＥＲＴ＋）におけるテオフィリン依存性細胞死の誘導
Ａｄ−ＴｈｅｏＲｉｂ−ＴＫが果たして標的特異的に且つテオフィリン依存的にトランスジーン発現を誘導するかを観察するためにウイルス処理し、ＧＣＶと調節化合物を処理した後、ＭＴＴ分析によって肝癌細胞としてのＨｅｐＧ２細胞における細胞生存率も観察した。この際、陽性対照群としてＡｄ−ＴＫを用い、ｈＴＥＲＴ＋細胞における陽性対照群としてＡｄ−Ｒｉｂ−ＴＫを用いた。陰性対照群としてはＡｄ−ＬａｃＺを用いた。Ａｄ−ＴｈｅｏＲｉｂ−ＴＫを処理した場合、テオフィリン或いはカフェインを処理した後の生存率を相互比較し、その結果を図１６に示した。
【０１０４】
図１６を参照すると、ＨＴ−２９細胞と同様に、Ａｄ−ＴＫおよびＡｄ−Ｒｉｂ−ＴＫの場合、ＧＣＶ濃度が増加すると同時にアデノウイルス濃度が増加しながら細胞生存率が減少するが、化学物質の濃度には影響されないことが観察された。これに対し、Ａｄ−ＬａｃＺの場合は、いずれの場合でも細胞生存率に影響を及ぼさなかった。注目すべき点は、アロステリックリボザイムであるＡｄ−ＴｈｅｏＲｉｂ−ＴＫを感染させた場合、カフェイン処理によってはＧＣＶ、ウイルスおよび化学物質の濃度を増加させても細胞生存率に影響を及ぼさなかったが、テオフィリンを処理した場合には、陽性対照群と同様に、ウイルス濃度およびＧＣＶ濃度に比例するように細胞生存率が減少した。また、テオフィリン濃度が増加すると、それにより細胞生存率も一緒に減少することが観察された。これは、ｈＴＥＲＴ＋であるＨＴ−２９以外にも、ＨｅｐＧ２細胞においても、Ａｄ−ＴｈｅｏＲｉｂ−ＴＫはテオフィリンによってその活性がアロステリックに調節されるので、テオフィリンを処理すればトランスジーン発現が誘導されることにより、癌細胞の細胞死が誘発されたことを示唆する。最もアロステリックに遺伝子発現が誘導される条件は、１０ｍｏｉアデノウイルス、１０μＭテオフィリン、１０μＭ ＧＣＶを処理した場合である。
【０１０５】
３）Ｃａｐａｎ−１細胞（ｈＴＥＲＴ＋）におけるテオフィリン依存性細胞 死の誘導
Ａｄ−ＴｈｅｏＲｉｂ−ＴＫが果たして標的特異的に且つテオフィリン依存的にトランスジーン発現を誘導するかを観察するために、ウイルス処理し、ＧＣＶと調節化合物を処理した後、ＭＴＴ分析によって膵臓癌細胞としてのＣａｐａｎ−１細胞における細胞生存率も観察し、その結果を図１７に示した。
図１７を参照すると、ＨＴ−２９、ＨｅｐＧ２細胞と同様に、Ａｄ−ＴＫおよびＡｄ−Ｒｉｂ−ＴＫの場合、ＧＣＶ濃度が増加すると同時にアデノウイルス濃度が増加しながら細胞生存率が減少するが、化学物質の濃度には影響されないことが観察された。これに対し、Ａｄ−ＬａｃＺの場合はいずれの場合でも細胞生存率に影響を及ぼさなかった。注目すべき点は、アロステリックリボザイムであるＡｄ−ＴｈｅｏＲｉｂ−ＴＫを感染させた場合、カフェイン処理によってはＧＣＶ、ウイルスおよび化学物質の濃度を増加させても細胞生存率に影響を及ぼさなかったが、テオフィリンを処理した場合には、陽性対照群と同様に、ウイルス濃度およびＧＣＶ濃度に比例するように細胞生存率が減少した。また、テオフィリン濃度が増加すると、それにより細胞生存率も一緒に減少することが観察された。これは、ｈＴＥＲＴ＋であるＨＴ−２９、ＨｅｐＧ２以外にも、Ｃａｐａｎ−１細胞においても、Ａｄ−ＴｈｅｏＲｉｂ−ＴＫはテオフィリンによってその活性がアロステリックに調節されるので、テオフィリンを処理すればトランスジーン発現が誘導されることにより、癌細胞の細胞死が誘発されたことを示唆する。最もアロステリックに遺伝子発現が誘導される条件は、１００ｍｏｉアデノウイルス、５００μＭテオフィリン、５０μＭ ＧＣＶを処理した場合である。
【０１０６】
４）ＩＭＲ９０細胞（ｈＴＥＲＴ−）におけるテオフィリン依存性細胞死誘導の観察
ｈＴＥＲＴ＋細胞でＡｄ−ＴｈｅｏＲｉｂ−ＴＫ活性がテオフィリン依存的に調節されることが標的特異的であるかを観察するために、ｈＴＥＲＴ−であるＩＭＲ９０細胞におけるウイルス感染後の細胞生存率を観察し、その結果を図１８に示した。
図１８を参照すると、Ａｄ−ＴＫの場合、ウイルスおよびＧＣＶの濃度に比例するように細胞生存率が減少し、このような現象が化学物質の濃度とは関係ないことを観察した。ところが、リボザイムを発現するＡｄ−Ｒｉｂ−ＴＫおよびアロステリックなＡｄ−ＴｈｅｏＲｉｂ−ＴＫの場合は、ウイルス、ＧＣＶおよび化学物質の濃度と関係なくその濃度を増加させても細胞生存率には影響を及ぼすことができなかった。これは、Ａｄ−ＴｈｅｏＲｉｂ−ＴＫの場合、外部化合物によってその活性を人為的に調節することができるうえ、非常に標的特異的にトランスジーンを誘発することができることを示唆する。
【０１０７】
実施例６：アロステリックリボザイム発現アデノウイルス性ベクターによるテオフィリン依存性細胞内トランス−スプライシング反応の調節
テオフィリン依存性トランスジーン誘導が果たして細胞内トランス−スプライシング反応のアロステリック効果によって誘発されるかを検証するために、テオフィリンアプタマーが付着しているリボザイム発現アデノウイルス性ベクター（１００ｍｏｉ）をＨＴ−２９細胞に感染させた後、前記実験で構築したアロステリック条件である０．１ｍＭテオフィリンまたは非対象化合物としてのカフェインを同一の濃度で処理した後、細胞内トランス−スプライシング反応産物の存在有無を観察した。ＧＡＰＤＨ ＲＮＡ発現度を観察して内部対照群として用いた。ＲＴ−ＰＣＲ産物をアガロースゲルで分析し、その結果を図１９に示した。
【０１０８】
図１９を参照すると、予想とおり、陰性対照群であるＡｄ−ＬａｃＺの場合、低分子化合物処理と関係なく、いずれのトランス−スプライシング産物の生成が観察されなかった。これに対し、Ａｄ−ＴｈｅｏＲｉｂ−ＴＫ（Ａｄ−Ｔｈｅｏ−Ｒｉｂ２ＡＳ−ＴＫ）をｈＴＥＲＴ発現癌細胞としてのＨＴ−２９細胞に導入した後、カフェイン処理の際にはトランス−スプライシング産物が殆ど形成されなかったが、ＭＴＴ分析で観察されたように０．１ｍＭテオフィリン処理の際に４２９ｎｔの予想されたトランス−スプライシング産物が形成された。このようなトランス−スプライシング産物をクローニングし、シークエシングした結果、予想とおり、ｈＴＥＲＴの＋２１部位がスプライシングされた産物であることを観察した。これに対し、このようなトランス−スプライシング産物は、同一条件の下でｈＴＥＲＴを発現しないＩＭＲ９０細胞では形成されなかった。これは、本リボザイムが標的ＲＮＡの存在時にのみトランス−スプライシング機能を行うことができることを確認する結果である。このようなテオフィリン依存的トランス−スプライシング産物が、ＲＮＡ抽出過程中に誘発されるインビトロトランス−スプライシング反応ではなく、細胞内におけるトランス−スプライシング反応の結果であることを検証するために、ｍｏｃｋトランスフェクションしたＨＴ−２９細胞と、Ａｄ ＴｈｅｏＲｉｂ−ＴＫの導入後にテオフィリンを処理したＩＭＲ９０細胞（ｈＴＥＲＴネガティブ）とを混合し、しかる後に、ＲＮＡを抽出してＲＴ ＰＣＲ反応を行った（ｍｉｘ）。その結果、予想されたトランス−スプライシング産物が発見されないことからみて、テオフィリン存在の際にＡｄ−ＴｈｅｏＲｉｂ−ＴＫが導入されたＨＴ−２９細胞でのみ測定されたトランス−スプラシング産物および細胞死は、細胞内におけるテオフィリン依存的で標的ＲＮＡ特異的なトランス−スプライシング反応によるものであることが分かった。
ＨＴ−２９細胞におけるトランス−スプライシング反応産物の量を相対的に比較するために、ＲＴの後、実時間ＰＣＲを行った。Ｔ／Ｓ ＰＣＲ産物の量をＧＡＰＤＨのＰＣＲ産物の量を用いて補正した後、グラフで示した（図２０）。
【０１０９】
図２０を参照すると、陰性対照群であるＡｄ−ＬａｃＺの場合、低分子化合物処理と関係なくいずれのＴ／Ｓ産物の生成も観察されなかった。これに対し、Ａｄ−ＴｈｅｏＲｉｂ−ＴＫを細胞に導入した後でＰＢＳを処理した場合、Ｔ／Ｓ産物が殆ど生成されず、カフェインを処理した場合は、ＰＢＳ処理した場合より反応産物が若干増加したが、テオフィリン処理の場合に比べて７８％その生成物が著しく減少した。これに対し、Ａｄ−ＴｈｅｏＲｉｂ−ＴＫを細胞に導入した後でテオフィリンを処理した場合には、Ａｄ−Ｒｉｂ−ＴＫによって形成されるトランス−スプライシング産物と同様に効果的にトランス−スプライシング反応が誘発された。このような結果は、アロステリックリボザイムによって誘発されたテオフィリン依存的標的特異的な細胞死の誘導がテオフィリンによる標的特異的なトランス−スプライシング反応の活性化に起因することを示唆する。
【産業上の利用可能性】
【０１１０】
上述したように、本発明は、テオフィリンによってその活性を調節することが可能なトランス−スプライシングリボザイムをモデルシステムとして構築することにより、疾患特異ＲＮＡを標的化して遺伝子発現を誘導することが可能な、非常に特異的な遺伝子治療技術であるトランス−スプライシングリボザイムと、外部因子によって遺伝子発現を調節することが可能な可逆的遺伝子技術との組み合わせにおいて実験的土台を提供する。本発明に係るアロステリックトランススプライシンググループＩリボザイムは、多様な難治性疾患に使用できる汎用的遺伝子治療剤への活用が可能であり、診断剤の開発またはリボザイムの活性メカニズム研究のための道具としての活用も可能であろう。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、テオフィリンによって標的特異的ＲＮＡ置換活性が調節されるアロステリックトランス−スプライシンググループＩリボザイムに関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子突然変異による人体の難治性疾患の分子遺伝学的原因と因子に関する研究により、そのような疾病の新しい治療技術として遺伝子治療技術が盛んに開発されている。ところが、現存する遺伝子治療技術にはまだ克服すべき問題点がある。
【０００３】
遺伝病に主に用いられる遺伝子治療方法は、突然変異遺伝子に相応する正常遺伝子を患者の適切な細胞に伝達する方法を採用している(Morgan, R.A. and Anderson, W.F. 1993, Human gene therapy. Annu Rev Biochem. 62: 191-217)。
理論的に、このような治療方法によって効果を得るためには、所望の遺伝産物の生成を生体の正しい調節メカニズムの下で得なければならない。ところが、ウイルス粒子の伝達遺伝子サイズにおける制限性のため、殆ど全ての遺伝子治療方法は、様々な種類のプロモータ、またはそれらの断片における遺伝子自体のプロモータの調節下にｃＤＮＡの形で所望の遺伝子を伝達する方式を採用している。よって、伝達遺伝子の調節を自然そのままに調節することができる様々な遺伝子因子が含まれておらず、所望の疾病治療効果を極大化していない実情である。
【０００４】
また、遺伝子発現のために用いるプロモータなどが他の種類のプロモータを活性化させるおそれがあるとともに、クロマチン構造を変化させることにより、遺伝子の伝達された細胞が持っている他の遺伝子の発現（例えば、プロトオンコジーン）を増加させるおそれがあるという問題点がある。また、正常な遺伝子の伝達が患者細胞内の突然変異遺伝子産物の減少には何の影響も及ぼすことができない。突然変異遺伝子産物がドミナントネガティブ(dominant negative)な機能を持つ場合、既存の方法では治療効果を極大化することができないであろう。よって、正常な遺伝子のよく調節された発現を誘導すると同時に、突然変異遺伝子の発現を抑制することが可能な新規の遺伝子治療法の開発が必要である(Lan, N., Howrey, R.P., Lee, S.W., Smith, C.A., and Sullenger, B.A. 1998, Ribozyme-Mediated Repair of Sickle b-Globin mRNAs in Erythrocyte Precursors. Science 280: 1593; Phylactou, L.A., Darrah, C., and Wood, M.J. 1998, Ribozyme-mediated trans-splicing of a trinucleotide repeat. Nat. Genet. 18: 378-381; Rogers, C.S., Vanoye, C.G., Sullenger, B.A., and George, A.L.Jr. 2002, Functional repair of a mutant chloride channel using a trans-splicing ribozyme, J. Clin. Invest. 110: 1783-1789; Shin, K.S., Sullenger, B.A., and Lee, S.W. 2004, Ribozyme-mediated induction of apoptosis in human cancer cells by targeted repair of mutant p53 RNA. Mol Ther.10: 365-372; Ryu, K.J., Kim, J.H., and Lee, S.W. 2003, Ribozyme-mediated selective induction of new gene activity in hepatitis C virus internal ribosome entry site-expressing cells by targeted trans-splicing. Mol. Ther. 7; 386-395)。
【０００５】
テトラヒメナ好熱菌(Tetrahymena thermophila)からのグループＩイントロンリボザイムが、実験管内だけでなく、バクテリア、ひいては人体細胞内でトランス−スプライシング反応を行うことにより、別途に存在する２つの転写体を互に連結させることができるという事実が報告された(Been, M. and Cech, T. 1986, One binding site determines sequence specificity of Tetrahymena pre-rRNA self-splicing, trans-splicing, and RNA enzyme activity. Cell 47: 207-216; Sullenger, B.A. and Cech, T.R. 1994, Ribozyme-mediated repair of defective mRNA by targeted, trans-splicing. Nature 371: 619-622; Jones, J.T., Lee, S.W., and Sullenger, B.A. 1996, Tagging ribozyme reaction sites to follow trans-splicing in mammalian cells. Nat Med. 2: 643-648)。したがって、グループＩイントロンに基づいたトランス−スプライシングリボザイムによって、疾患に関連した遺伝子転写体または正常細胞では発現せず、疾病細胞でのみ特異的に発現する特定ＲＮＡが標的になった後、そのＲＮＡが正常なＲＮＡに補正されるか或いは新しい治療用遺伝子転写体に置換されるように、再びプログラムを誘発することにより、極めて疾患特異的で安全な遺伝子治療技術になれる。すなわち、標的遺伝子転写体の存在時にのみＲＮＡ置換が起るので、その結果として、適切な時間と空間でのみわれわれの所望する遺伝子産物が作られるであろう。特に、細胞内で発現するＲＮＡを標的にした後、所望の遺伝子産物で代置する方法なので、導入しようとする遺伝子の発現量を調節することができる。また、トランス−スプライシングリボザイムは、疾患特異ＲＮＡを除去すると同時に、われわれの所望する治療用遺伝子産物の発現を誘導することができるので、治療効果を倍加させることができる。
【０００６】
ＲＮＡは、人為的または自然的にスイッチとしての役割を果たすのに適した化学的、構造的特性を持っている(Mandal, M., Boese, B., Barrick, J.E., Winkler, W.C., and Breaker, R.R. 2003, Riboswitches control fundamental biochemical pathways in Bacillus subtilis and other bacteria. Cell113: 577-586)。このような特性を用いて、酵素活性を有するＲＮＡとしてのリボザイムに小分子またはタンパク質の特定の構造または配列を認知し、特異的に結合するアプタマーを結合させたものをアプタザイムと称する(Breaker, R.R. 2002, Engineered allosteric ribozymes as biosensor components. Curr. Opin. Biotechnol. 13: 31-39)。アプタザイムは、リボザイムとアプタマーとが主にコミュニケーションモジュールを介して連結される。コミュニケーションモジュールは、アプタマーから発生した信号をリボザイムに伝達する中間媒介体の役割を果たす構造である(Kertsburg, A. and Soukup, G.A. 2002, A versatile communication module for controlling RNA folding and catalysis. Nucleic Acids Res. 30: 4599-4606)。
【０００７】
アプタマーによってリガンドが感知されると、このような信号がコミュニケーションモジュールを介してリボザイムに伝達されるため、非活性状態で存在したリボザイムの活性がアロステリックに誘導または抑制される。すなわち、外部または内部の特定のリガンドによってリボザイムの活性が調節可能である。
【０００８】
現在の癌治療方法では、癌細胞のみを特異的に除去することが可能な技術の開発が必要である。アロステリックリボザイム(allosteric ribozyme, aptazyme)は、ＲＮＡの構造が他のリガンドなどとの結合によって変わることを用いて、リボザイムとアプタマーとを結合させたものである。低分子をリガンドとするアロステリックリボザイムの正確なメカニズムは、解明されていないが、リガンド結合によってリボザイムが構造的に安定化または不安定化されることによると思われる(Kertsburg, A. and Soukup, G.A. 2002, A versatile communication module for controlling RNA folding and catalysis. Nucleic Acids Res. 30: 4599-4606; Jose, A.M., Soukup, G.A., and Breaker, R.R. 2001, Cooperative binding of effectors by an allosteric ribozyme. Nucleic Acids Res. 29: 1631. 1637; Koizumi, M., Soukup, G.A., Kerr, J.N., and Breaker, R.R. 1999, Allosteric selection of ribozymes that respond to the second messengers cGMP and cAMP. Nature Struct. Biol. 6: 1062.1071)。低分子がリガンドとして作用するアプタザイムが初期に研究され、最近ではタンパク質またはオリゴと相互作用するアプタザイムに関する研究が行われている。
【０００９】
ｈＴＥＲＴ(human Telomerase reverse transciptase)は癌細胞の不死化(immortality)および増殖(proliferation)能力を調節する最も重要な酵素中の一つであって、このテロメラーゼは無限に複製される生殖細胞、造血細胞および癌細胞で８０〜９０％のテロメラーゼ活性を持っているが、癌細胞周辺の正常細胞はその活性を持っていない(Bryan, T.M. and Cech, T.R. 1999, Telomerase and the maintenance of chromosome ends. Curr. Opin. Cell Biol. 11; 318-324)。このようなテロメラーゼの特性を用いて、細胞成長に関与するテロメラーゼの抑制者を開発することにより、癌細胞の増殖を抑制しようとする試みが最近盛んに行われている(Bryan, T.M., Englezou, A., Gupta, J., Bacchetti, S., and Reddel, R.R. 1995, Telomere elongation in immortal human cells without detectable telomerase activity. Embo J. 14; 4240-4248; Artandi, S.E. and DePinho, R.A. 2000, Mice without telomerase: what can they teach us about human cancer Nat. Med. 6; 852-855)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者らは、癌細胞特異的なターゲットであるｈＴＥＲＴ ＲＮＡを特異的に認知してトランス−スプライシングする能力が検証されたｈＴＥＲＴターゲッティングトランス−スプライシングリボザイムに、テオフィリンに高い親和力を示すアプタマーを、普遍化されたコミュニケーションモジュールを介して結合させた様々なテオフィリン依存性アロステリックトランス−スプライシングリボザイムを開発した。
【００１１】
また、本発明によって、このようなリボザイムが、試験管および細胞内でテオフィリンが存在する条件でのみｈＴＥＲＴ ＲＮＡを選択的に認知して切断し、標的サイトの下端部位にリボザイムの３’エキソンを連結することを、インビトロ(in vitro)トランス−スプライシング分析、ルシフェラーゼ分析(Luciferase assay)、ＲＴ−ＰＣＲおよびＭＴＴ分析によって確認した。
【００１２】
このようなアロステリックトランス−スプライシングリボザイムを活用して、外部因子である低分子化合物によってリボザイム機能を活性化させることにより、特定の疾患特異的なＲＮＡを標的にした後、治療用遺伝子ＲＮＡへの置換を人為的に調節することが可能なシステムを開発することができる。また、疾患細胞特異的に治療用遺伝子発現を人為的に調節し、新しい概念の特異的で可逆的な遺伝子治療技術を開発することができる（図１）。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
そこで、本発明の目的は、テオフィリンによって活性が調節されるアロステリックトランス−スプライシンググループＩリボザイムの選別方法を提供することにある。
【００１４】
また、本発明の他の目的は、ｈＴＥＲＴ ＲＮＡを特異的に標的化し、テオフィリンによってＲＮＡ置換活性が調節されるアロステリックトランス−スプライシンググループＩリボザイムおよびその用途を提供することにある。
【００１５】
また、本発明の別の目的は、アロステリックトランス−スプライシンググループＩリボザイムを発現する発現ベクターおよびその用途を提供することにある。
【００１６】
本発明のある観点によれば、テオフィリンによって活性が調節されるアロステリックトランス−スプラインググループＩリボザイムの選別方法を提供する。
【００１７】
本発明の他の観点によれば、ｈＴＥＲＴ(human Telomerase reverse transcriptase)ＲＮＡを特異的に標的化し、テオフィリンによってＲＮＡ置換活性が調節されるアロステリックトランス−スプライシンググループＩリボザイムおよびその用途を提供する。
【００１８】
本発明の別の観点によれば、上述したアロステリックトランス−スプライシンググループＩリボザイムを発現するベクターおよびその用途を提供する。
【発明の効果】
【００１９】
上述したように、本発明に係るアロステリックトランス−スプライシンググループＩリボザイムは、テオフィリンによって依存的に活性が調節されてトランス−スプライシング反応を介して標的ｈＴＥＲＴ ＲＮＡを補正することにより、標的ｈＴＥＲＴ ＲＮＡを発現する癌細胞のみを選択的に診断し、あるいは細胞死を誘導して治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】アロステリックトランス−スプライシングリボザイムによるＲＮＡへの置換調節に関する模式図である。
【図２】ｈＴＥＲＴターゲッティングＴ／Ｓリボザイムを示す図である。
【図３】テオフィリン依存性アロステリックＴ／Ｓリボザイムを示す図である。
【図４】ＷＴ Ｐ９とＭｕ−Ｐ９の３’末端配列を示す図である。
【図５】インビトロにおけるトランス−スプラシング反応を示す図である。
【図６】インビトロにおけるトランス−スプライシング反応産物の実時間ＰＣＲ 分析を示す図である。
【図７】インビトロにおける拡張ＩＧＳを有するＴ／Ｓリボザイムによるトランス−スプライシング反応を示す図である。
【図８】インビトロにおけるアロステリックトランス−スプライシングリボザイムによるトランス−スプライシング反応の適合性を示す図である。
【図９】アロステリックトランス−スプライシングリボザイムによるテオフィリン依存性トランスジーン(transgene)の誘導を示す図である。
【図１０】標的ＲＮＡに対する１００ｎｔアンチセンス配列を含むアロステリックトランス−スプライシングリボザイムによるテオフィリン依存性トランスジーンの誘導を示す図である。
【図１１】ｈＴＥＲＴ−細胞におけるアロステリックトランス−スプライシングリボザイムによるトランスジーンの抑制を示す図である。
【図１２】標的ＲＮＡに対する３００ｎｔアンチセンス配列を含むアロステリックトランス−スプライシングリボザイムによるテオフィリン依存性トランスジーンの誘導を示す図である。
【図１３】細胞におけるアロステリックリボザイムによるテオフィリン依存性トランス−スプライシング反応を示す図である。
【図１４】テオフィリン依存性トランス−スプライシングリボザイムをエンコードする発現ベクターｐＡｖＱ−Ｔｈｅｏ−Ｒｉｂ２１ＡＳ−ＴＫとアデノウイルスベクター（Ａｄ−ＴｈｅｏＲｉｂ−ＴＫ、Ａｄ−Ｔｈｅｏ−ＣＲＴ）の基本構造である。
【図１５】アロステリックトランス−スプライシングリボザイムによるｈＴＥＲＴ＋ＨＴ−２９細胞におけるテオフィリン依存性細胞消退を示す図である。
【図１６】アロステリックトランス−スプライシングリボザイムによるｈＴＥＲＴ＋ＨｅｐＧ２細胞におけるテオフィリン依存性細胞消退を示す図である。
【図１７】アロステリックトランス−スプライシングリボザイムによるｈＴＥＲＴ＋Ｃａｐａｎ−１細胞におけるテオフィリン依存性細胞消退を示す図である。
【図１８】アロステリックトランス−スプライシングリボザイムによるｈＴＥＲＴ−ＩＭＲ９０細胞における細胞消退が現れないことを示す図である。
【図１９】アロステリックトランス−スプライシングリボザイムによるＨＴ−２９細胞のトランス−スプライシング反応を示す図である。
【図２０】アロステリックトランス−スプライシングリボザイムによるＨＴ−２９細胞のトランス−スプライシング反応を実時間ＰＣＲ分析によって示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、トランス−スプライシングリボザイムのＰ６とＰ８ドメインのそれぞれまたは両方ともにテオフィリンアプタマーとコミュニケーションモジュールを結合させたアプタザイム、Ｐ９ドメインの一部が除去されたトランス−スプライシングリボザイムのＰ６とＰ８ドメインのそれぞれまたは両方ともにテオフィリンアプタマーとコミュニケーションモジュールを結合させたアプタザイム、またはＰ９ドメインの一部が変異されたトランス−スプライシングリボザイムのＰ６とＰ８ドメインのそれぞれまたは両方ともにテオフィリンアプタマーとコミュニケーションモジュールを結合させたアプタザイムを製作する段階と、
テオフィリンとカフェインを用いてインビトロで前記製作されたアプタザイムのアロステリック調節を比較することにより、テオフィリン依存性トランス−スプライシング有無を確認する段階と、
哺乳類の細胞で０．１〜１ｍＭのテオフィリン存在下にルシフェラーゼ活性によってテオフィリ依存性トランスジーンの発現有無を確認する段階とを含むことを特徴とする、テオフィリンによって活性が調節されるアロステリックトランス−スプライシンググループＩリボザイム(allosteric trans-splicing group Ｉ ribozyme)の選別方法を提供する。
【００２２】
この際、前記アプタザイム製作段階で、ｈＴＥＲＴ ＲＮＡに対するアンチセンス１００〜３００ｎｔが付着しているアプタザイムをさらに製作する。
【００２３】
また、本発明は、ｈＴＥＲＴ(human Telomerase reverse transcriptase)ＲＮＡを特異的に標的化し、３’エキソンには蛍由来ルシフェラーゼ受容体遺伝子を含有するテオフィリンによってＲＮＡ置換活性が調節されるアロステリックトランス−スプライシンググループＩリボザイムを提供する。
【００２４】
この際、前記リボザイムは、好ましくは配列番号１で表されるＡＳ３００ΔＰ９ ８Ｔ、配列番号２で表されるＡＳ１００ Ｍｕ−Ｐ９ ６Ｔ８Ｔ、または配列番号３で表されるＡＳ３００ Ｗ−Ｐ９ ６Ｔ８Ｔである。
【００２５】
また、本発明は、前記リボザイムを発現するベクターを提供する。
【００２６】
この際、前記発現ベクターは、好ましくは配列番号４で表されるｐＳＥＡＰＡＳ３００ Ｄｅｌｔａ Ｐ９ ８Ｔ−Ｌｕｃｉ、配列番号５で表されるｐＳＥＡＰ ＡＳ１００ Ｍｕ−Ｐ９ ６Ｔ８Ｔ−Ｌｕｃｉ、または配列番号６で表されるｐＳＥＡＰ ＡＳ３００ Ｗ−Ｐ９ ６Ｔ８Ｔ−Ｌｕｃｉである。
【００２７】
また、本発明は、ｈＴＥＲＴ ＲＮＡを特異的に標的化し、３’−エキソンにはＨＳＶ−ＴＫ(herpes simplex virus thymidine kinase)細胞死遺伝子を含有するテオフィリンによってＲＮＡ置換活性が調節されるアロステリックトランス−スプライシンググループＩリボザイムを提供する。
【００２８】
この際、前記リボザイムは、好ましくは配列番号７で表されるＡＳ３００ Ｗ−Ｐ９ ６Ｔ８Ｔ−ＴＫである。
【００２９】
また、本発明は、前記リボザイムを哺乳類細胞で発現するベクターを提供する。
【００３０】
この際、前記発現ベクターは、好ましくは配列番号8で表されるｐＡｖＱ−Ｔｈｅｏ−Ｒｉｂ２１ＡＳ−ＴＫ（ＫＣＣＭ１０９３５Ｐ）である。
【００３１】
また、本発明は、前記リボザイムおよびテオフィリンを含有する遺伝子発現誘導剤, 癌診断剤または遺伝子し治療剤を提供する。
【００３２】
また、本発明は、前記発現ベクターおよびテオフィリンを含有する遺伝子発現誘導剤, 癌診断剤または遺伝子し治療剤を提供する。
【００３３】
以下、本発明をさらに詳しく説明する。
【００３４】
本発明のアロステリックトランス−スプライシンググループＩリボザイムは、以下、「アプタザイム(aptazyme)」または「テオフィリン依存的アプタザイム」という。
【００３５】
本明細書で言及されたテオフィリンアプタマーは、テオフィリンに特異的に結合するアプタマーを意味する。
【００３６】
本発明のアロステリックトランス−スプライシンググループＩリボザイムは、リボザイムの基質結合部位および触媒コア部位にアプタマーのように特定のリガンドと結合する部位を連結する場合、特定のリガンドとアプタマーとが結合してリガンドが感知されると、このような信号がコミュニケーションモジュールを介してリボザイムに伝達されてリボザイムの構造的変異が発生することにより、リボザイムのトランス−スプライシング活性がアロステリックに増加または阻害できる分子である。
【００３７】
本発明者らは、グループＩイントロンに基づいて開発した既存のｈＴＥＲＴターゲッティングトランス−スプライシングリボザイムにテオフィリンアプタマーをコミュニケーションモジュールを介して結合させることにより、ｈＴＥＲＴが在る癌細胞でのみトランス−スプライシングが誘導されるうえ、このようなトランス−スプライシングリボザイムの活性がテオフィリンによって調節可能なアプタザイムを開発した。
【００３８】
この際、トランス−スプライシングリボザイムのＰ６とＰ８ドメインのそれぞれまたは両方ともにテオフィリンアプタマーを結合させた、或いはＰ９ドメインを一部除去したトランス−スプライシングリボザイムのＰ６とＰ８ドメインのそれぞれまたは両方ともにテオフィリンアプタマーを結合させたアプタザイムを製作した（図３参照）。ここで、アプタマーとリボザイムとを連結する部位は、最も普遍化されたコミュニケーションモジュールを使用した。また、ＰＣＲを用いてクローニングする過程でＰ９ドメインが他の配列に変異されたｍｕ−Ｐ９ ６ｔ８ｔを得たが、この構造体に対しても実験を行った（図４参照）。全ての実験は、テオフィリン、カフェインおよび同一体積の溶媒（ｄＨ２ＯまたはＰＢＳ）に対する結果を比較することにより行われた。ここで、カフェインは、テオフィリンとは一つの残基が異なり、テオフィリンに対する実験結果を確認するために使用し、溶媒は対照群として使用した。
【００３９】
インビトロでアプタザイムのアロステリック調節を比較した結果、Mu−Ｐ９ ６ｔ８ｔとΔＰ９ ６ｔがテオフィリンに依存的にトランス−スプライシングされることを確認することができた（図５参照）。また、Mu−Ｐ９ ６ｔ８ｔがΔＰ９ ６ｔと比較するとき、ＰＣＲによるトランス−スプライシング産物の量が４０％以上多いことが分かった。これを実時間ＰＣＲを用いてｍｕ Ｐ９ ６ｔ８ｔでｄＨ２Ｏと比較するとき、テオフィリンが在る条件で１２倍以上のトランス−スプライシング産物が生成されることを確認した（図６参照）。また、拡張ＩＧＳを持つリボザイムに対してインビトロでアプタザイムのアロステリック調節を比較した結果、同一のリボザイム基本骨格を持っても、アンチセンス配列の存在有無によって活性に差異を示すことができることを確認した（図７参照）。
【００４０】
哺乳類の細胞からも確認をしたが、インビトロと細胞内で各アプタザイムのアロステリック調節結果が一致しない可能性があることを考慮し、インビトロで行った全てのアプタザイムを検証した。
【００４１】
この実験に先立ち、テオフィリンの最適濃度を細胞で確認するために、濃度別に細胞に処理した結果、テオフィリンの濃度が好ましくは０．１〜１．０ｍＭ、さらに好ましくは０．７ｍＭであることを確認した（図９参照）。
【００４２】
次いで、細胞内でトランス−スプライシング産物が発現し、発現したトランスジーンがその機能を行うか否かを確認するために、ルシフェラーゼ分析を行った。
【００４３】
細胞実験では、全体的にテオフィリンまたはカフェインを入れず、同一体積のＰＢＳ（溶媒）のみを入れた条件でもルシフェラーゼが発現した。これは、トランス−スプライシングアプタザイムの３’−アクソンのルシフェラーゼ遺伝子がトランス−スプライシングなしでリーク(leaky)に発現すると予測し、ターゲットが存在しないものと知られている細胞（ＳＫ−ＬＵ Ｉ）でリボザイムをトランスフェクションして確認した結果、予測とおり、ターゲットのない条件でもリークにルシフェラーゼが発現することを確認した（図１１参照）。
【００４４】
このような背景を補完するためにアンチセンスを増加させたが、アンチセンスの増加によって非特異的発現は減少させ、効率はさらに増加させることができると予測し、リボザイムのアンチセンスを１００個から３００個に増加させる改質を行い、さらに細胞内でこれを確認した。その結果、全体的に効率が増加するパターンを示した。結果として、ＡＳ−１００ Ｍｕ−Ｐ９ ６ｔ８ｔ、ＡＳ−３００ Ｗ−Ｐ９ ６ｔ８ｔおよびＡＳ−３００ ΔＰ９ ８ｔの場合、ｈＴＥＲＴ＋細胞内でテオフィリン依存的に効果的なルシフェラーゼ活性誘導を観察することができた（図１０および図１２参照）。細胞でトランス−スプライシングを検証するために細胞の総ＲＮＡを得てＲＮＡ水準でトランス−スプライシング産物を確認し、ＡＳ３００ ＷＴ、およびテオフィリンが在る場合のＡＳ３００ Ｗ−Ｐ９ ６Ｔ８Ｔでトランス−スプライシング産物バンドが現れることを確認した（図１３参照）。
【００４５】
３’−エキソンをルシフェラーゼからＨＳＶ−ＴＫ(herpes simplex virus thymidine kinase)に変えた、すなわちｈＴＥＲＴ ＲＮＡを特異的に標的化し、３’−エキソンにはＨＳＶ−ＴＫ細胞死遺伝子を含有するアロステリックトランス−スプライシンググループＩリボザイムを製作し、このリボザイムをエンコードする発現ベクター（ｐＡｖＱ−Ｔｈｅｏ−Ｒｉｂ２１ＡＳ−ＴＫ）を製作した後、これを用いてアデノウイルスを作って実験を行った。
【００４６】
ｈＴＥＲＴ陽性細胞株（ＨＴ−２９、ＨｅｐＧ２、Ｃａｐａｎ−１）と陰性細胞株（ＩＭＲ９０）で多様なアデノウイルスを処理し、ＧＣＶとテオフィリンとカフェインを５日間処理した後、ＭＴＴ分析によって細胞死を観察した。この際、陽性対照群としてＡｄ−ＴＫ（ＣＭＶプロモータの下にＨＳＶｔｋを発現するアデノウイルス性ベクター）を用い、ｈＴＥＲＴ＋細胞における陽性対照群としてＡｄ−Ｒｉｂ−ＴＫ（ｈＴＥＲＴ特異的でＨＳＶｔｋが標識(tagging)されているアデノウイルス性ベクター）を用いた。陰性対照群としては、Ａｄ−ＬａｃＺ（ＣＭＶプロモータの下にＬＡｃＺを発現するアデノウイルス性ベクター）を用いた。その結果、ｈＴＥＲＴ＋細胞株では、Ａｄ−ＴＫとＡｄ−Ｒｉｂ−ＴＫは調節化合物の有無に関係なくＧＣＶを処理したときに死ぬが、Ａｄ−ＴｈｅｏＲｉｂ−ＴＫはテオフィリンが在る場合にのみ特異的に細胞死が起ることを確認した（図１５~図１７参照）。そして、陰性対照群であるＡｄ−ＬａｃＺはいずれの場合でも細胞死が起っていない。
【００４７】
このような特異的細胞死がターゲットＲＮＡによって調節されるかを確認するために、ｈＴＥＲＴ−細胞株であるＩＭＲ９０で実験した結果、Ａｄ−ＴＫは GCVを処理したときに細胞死が起ったが、Ａｄ−Ｒｉｂ−ＴＫ、Ａｄ−ＴｈｅｏＲｉｂ−ＴＫおよびＡｄ−ＬａｃＺは細胞死が起っていないことからみて、ｈＴＥＲＴターゲットＲＮＡによって細胞死が調節されるものと確認された（図１８参照）。
【００４８】
ｈＴＥＲＴ＋細胞であるＨＴ−２９に、ＭＴＴ分析によって最も細胞死がよく誘導されたアデノウイルス１００Ｍ．Ｏ．Ｉ、化学物質１００μＭを処理し、総ＲＮＡを得た後、実時間ＰＣＲを行った。その結果、テオフィリン存在の際に、Ａｄ−Ｔｈｅｏ−ＣＲＴが導入されたＨＴ−２９細胞でのみ測定されたトランス−スプライシング産物が現れ、特にトランス−スプライシング産物の量がＡｄ−Ｒｉｂ−ＴＫを処理した場合とほぼ同様であると確認された。カフェインではトランス−スプライシングの量がある程度現れたが、その量がテオフィリン処理の場合に比べて７８％も少なかった（図２０参照）。これはカフェインがテオフィリンアプタマーにテオフィリンよりも１０００倍弱いがある程度結合をするためであると考えられる。このような結果より、本発明のアロステリックリボザイムによって誘発されたテオフィリン依存的標的特異的な細胞死誘導は、細胞内におけるテオフィリン依存的で標的ＲＮＡ特異的なトランス−スプライシング反応によるものであることが分かった。
【実施例】
【００４９】
以下、本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明したが、これらの実施例は本発明を限定するものではない。
【００５０】
参照例１：基質（ｈＴＥＲＴ）ＲＮＡの製造
ターゲットＲＮＡを製作するために、ｈＴＥＲＴの−１から＋２１８まで含まれているｐＣｌ−ｎｅｏベクター（ｅｘｏｎ１〜２）を、配列番号９で表されるプライマー５’−ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＡＧＧＣＡＧＣＧＣＴＧＣＧＴＣＣＴ−３’と、配列番号１０で表されるプライマー５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＴＧＧＣＧＧＡＡＧＧＡＧＧＧＧＧＣＧＧＣＧＧＧ−３’を用いてＰＣＲで増幅させ、ｈＴＥＲＴ ＲＮＡをコードするＤＮＡを製造した。このように製造されたＤＮＡからインビトロ転写を介してＲＮＡを作るが、ＤＮＡテンプレート（３μｇ）、１０×転写バッファ、１０ｍＭ ＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ）、０．５ｍＭ ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ（Ｒｏｃｈｅ）、８０Ｕ ＲＮａｓｅ抑制剤（Ｋｏｓｃｏ）、２００Ｕ Ｔ７ ＲＮＡ重合酵素（Ａｍｂｉｏｎ）およびＤＥＰＣ−Ｈ２０を最終１００μＬまで入れて混ぜた後、３７℃で３時間反応させ、５Ｕ ＤＮａｓｅＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を３７℃で３０分間さらに処理し、ＤＮＡテンプレートを完全に除去した後、フェノール抽出（ｐＨ７．０）およびエタノール沈殿によってＲＮＡを精製し、しかる後に、ＲＮＡバンドを６％変性アクリルアミドゲル上で溶出した後、精製してＴＥバッファ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶かした。
【００５１】
参照例２：テオフィリン依存性ｈＴＥＲＴターゲッティングトランス−スプライシング（Ｔ／Ｓ）アプタザイムクローニング
アロステリックリボザイム開発のための基本トランス−スプライシングリボザイム骨格は、ｈＴＥＲＴの＋２１ｎｔ部位を特異的に認知し、Ｐ１、Ｐ１０および標的ＲＮＡに対する３００個のアンチセンス配列が添加された拡張ＩＧＳを有するグループＩイントロンリボザイムを用いた(Kwon, B.S., Jung, H.S., Song, M.S., Cho, K.S., Kim, S.C., Kimm, K., Jeong, J.S., Kim, I.H., and Lee, S.W. 2005, Specific regression of human cancer cells by ribozyme-mediated targeted replacement of tumor-specific transcript. Mol. Ther. 12: 824-834; Hong, S.H., Jeong, J.S., Lee, Y.J., Jung, H.I., Cho, K.S., Kim, C.M., Kwon, B.S., Sullenger, B.A., Lee, S.W.*, and Kim, I.H.* 2008, In vivo reprogramming of hTERT by trans-splicing ribozyme to target tumor cells. Mol Ther. 16: 74-80)。
【００５２】
ｈＴＥＲＴターゲッティングリボザイムのＰ６ドメインとＰ８ドメインのそれぞれまたは両方ともにテオフィリンアプタマーをコミュニケーションモジュールを介してクローニングした。また、リボザイムのＰ９ドメインを欠損させたΔＰ９リボザイムにも、前記と同様にＰ６、Ｐ８ドメインを改質した。テオフィリンアプタマーがコミュニケーションモジュールを介して連結された自己スプライシングリボザイムからｈＴＥＲＴをターゲットすることが可能なＩＧＳ含有の配列番号１１（５’−ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＣＡＧＧＡＡＡＡＧＴＴＡＴＣＡＧＧＣＡ−３’）のプライマーと、リボザイムの３’エキソンの前まで増幅することが可能な配列番号１２（５’−ＣＧＡＧＴＡＣＴＣＣＡＡＡＡＣＴＡＡＴＣＡＡ−３’）のプライマーを用いて、テオフィリンアプタマーが結合したｈＴＥＲＴターゲッティングトランス−スプライシングリボザイムをＨｉｎｄＩＩＩとＮｒｕＩを用いてＳＥＡＰプロモータベクターにクローニングした。その後、ルシフェラーゼ遺伝子を配列番号１３（５’−ＣＧＡＴＧＡＴＣＡＣＧＡＡＧＡＣＧＣ−３’）のプライマーおよび配列番号１４（５’−ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＴＴＡＣＡＡＴＴＴＧＧＡＣＴＴＴ−３’）のプライマーを用いてＰＣＲし、ＮｒｕＩとＸｂａＩを用いてリボザイムの後ろにクローニングした。ところが、ＰＣＲを用いたクローニング過程中にＰ９ドメインが非意図の配列に変異された構造体(construct)を得た。この構造体を含んでｗｉｌｄ Ｐ９ ６ｔ、ｗｉｌｄ Ｐ９ ８ｔの２個のｗｉｌｄ構造体、ΔＰ９ ６ｔ、ΔＰ９ ８ｔ、ΔＰ９ ６ｔ８ｔの３個の欠損構造体、およびｍｕ Ｐ９ ６ｔ８ｔを製作した。また、対照群としてアプタマーのないｗｉｌｄ Ｐ９とΔＰ９を含んで総８種の構造体を製作した。
【００５３】
製作されたテオフィリン依存性ｈＴＥＲＴターゲッティングＴ／Ｓアプタザイムの塩基配列は、ターミネータレディー反応混合物(terminator ready reaction mixture)（ＰＥ ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）３μＬ、定量されたＤＮＡ１００ｎｇ、配列番号１５（５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＴＧＧＣＧＧＡＡＧＧＡＧＧＧＧＧＣＧＧＣＧＧＧ−３’）のプライマー３．２ｐｍｏｌを総１０μＬの反応で（９６℃−１０’、５０℃−５’、６０℃−４’）×２５サイクル反応させた後、精製のために４０μＬのｄＨ２Ｏを添加した後、３Ｍ ＮａＯＡＣ（１／１０ｖｏｌｕｍｅ）、１００％ ＥｔＯＨ（２ｖｏｌｕｍｅ）を仕込み、ｖｏｒｔｅｘの後、１３０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、７０％ＥｔＯＨ（４００μＬ）で洗浄した後、ＥｔＯＨを除去し、真空乾燥機(speed-vacuum)で乾燥させた後、１５μＬのテンプレート抑制試薬(template suppression reagent)に溶かした。次に、ｖｏｒｔｅｘとスピンダウンの後、シーケンシングチューブに移して自動配列分析器（ＡＢＩ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ）でシーケンシングを確認した。
【００５４】
参照例３：テオフィリン依存性ｈＴＥＲＴターゲッティングＴ／ＳアプタザイムＲＮＡの製造
Ｔ７重合酵素プロモータが含まれた配列番号１６（５’−ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＣＡＧＧＡＡＡＡＧＴＴＡＴＣＡＧＧＣＡ−３’）のプライマー、およびリボザイムの３’エキソンの中間を取る配列番号１７（５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＧＣＡＡＣＴＧＣＡＡＣＴＣＣＧＡＴＡＡ−３’）のプライマーを用いてＰＣＲし、ＤＮＡテンプレート（３μｇ）、ＮＴＰ量を１.５ｍＭに増やして自己スプライシングを最大限防止し、１×スプライシングバッファ（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＤＴＴ、４ｍＭスペルミジン）、０．５ｍＭ ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ（Ｒｏｃｈｅ）、８０Ｕ ＲＮａｓｅ抑制剤（Ｋｏｓｃｏ）、２００Ｕ Ｔ７ ＲＮＡ重合酵素（Ａｍｂｉｏｎ）、ＤＥＰＣ−Ｈ２０を最終１００μＬまで入れて混ぜた後、３７℃で３時間転写させ、５Ｕ ＤＮａｓｅＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を３７℃で３０分間さらに処理することにより、ＤＮＡテンプレートを完全に除去した後、フェノール抽出（ｐＨ７．０）およびエタノール沈殿によってＲＮＡを精製し、しかる後に、ＲＮＡバンドを４％変性アクリルアミドゲル上で溶出した後、精製してＴＥバッファ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶かした。
【００５５】
参照例４：インビトロトランス−スプライシング反応
テオフィリン（５００μＭ）、テオフィリンとは一つの残基が異なるカフェイン（５００μＭ）、または同一体積のｄＨ２Ｏそれぞれが存在する状態で、リボザイム（５０ｎＭ）と基質ＲＮＡとしてのｈＴＥＲＴ ＲＮＡ（１０ｎＭ）とをスプライシング条件（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／５ｍＭ ＭｇＣｌ２／１００μＭグアノシン）の下に３７℃で３時間反応させ後、形成された産物をＲＴ−ＰＣＲ反応によって分析した。この際、ＲＴのためのプライマーはルシフェラーゼ認知部位（５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＧＣＡＡＣＴＧＣＡＡＣＴＣＣＧＡＴＡＡ−３’、配列番号１８）を用い、ＰＣＲのための５’プライマーはｈＴＥＲＴ ＲＮＡの５’末端（５’−ＧＧＡＡＴＴＣＧＣＡＧＣＧＣＴＧＣＧＴＣＣＴＧＣＴ−３’、配列番号１９）を用い、３’プライマーはルシフェラーゼを認知する部位（５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＣＴＧＣＡＴＡＣＧＡＣＧＡＴＴ−３’、配列番号２０）を用いた。
【００５６】
参照例５：半定量的(Semi-quantitative)ＰＣＲ
インビトロトランス−スプライシング反応の後、トランス−スプライシング産物に対して実時間ＰＣＲを用いて半定量的ＰＣＲを行った。それぞれのサンプルを三つぞろいで進行してそれらの平均値を求めたうえ、その融点を確認し、アガロースゲル上で確認した。この際、ＳＹＢＲグリーンを用いて検出した。また、半定量的にサンプルを比較することができるように、ＲＴ反応から定量された標準対照群を使用した。補正のためにＲＴ反応の際に、各サンプルに同量の任意のＲＮＡ（ｒａｓ ＲＮＡ）を仕込み、ＲＴプライマー製作の際にトランス−スプライシング産物と内部対照群(internal control)のｒａｓ ＲＮＡが一つのプライマーとしてＲＴできるようにデザインし、配列番号２１（５’−ＧＣＣＣＡＡＣＡＣＣＧＧＣＡＴＡＡＡＧＴＴＡＣＡＴＡＡＴＴＡＣＡＣＡＣＴＴ−３’）のプライマーを製作した。よって、ＲＴされたサンプルの定量的な比較において、ｒａｓ ＣＤＮＡの量でその値を補正した。
【００５７】
ＰＣＲ条件は、予熱(preheating)９６℃１０分、変性(denaturation)９６℃５分、結合(annealing)６０℃１５秒、延長(extension)７２℃３０秒であった。この際、５’プライマーはｈＴＥＲＴ認知部位（５’−ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＴＧＣＧＴＣＣＴＧＣＴＣＧＡ、配列番号２２）を使用し、３’プライマーはルシフェラーゼ認知部位（５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＣＴＧＣＡＴＡＣＡＣＧＡＴＴ、配列番号２３）を使用した。内部対照群であるｒａｓ ｃＤＮＡのＰＣＲプライマーは、次のとおりである；５’プライマー（５’−ＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴ、配列番号２４）、３’プライマー（５；ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＡＣＡＴＡＡＴＴＡＣＡＣＡＣＴＴ、配列番号２５）。
【００５８】
参照例６：特異性を増加させた特異Ｔ／Ｓアプタザイムの製作
ｈＴＲＥＴ配列上でＩＧＳによって認知される部位から３’末端側に相補的な１００ｎｔのアンチセンス鎖を配列番号２６（５’−ＡＡＴＴＣＡＡＧＣＴＴＣＧＴＴＴＴＧＣＧＧＣＡＧＣＡＧＧＡＡＡＡＧＴＴＡＴＣＡＧＧＣＡＴＧ−３’）および配列番号２７（５’−ＣＣＴＧＡＴＡＡＣＴＴＴＴＣＣＴＧＣＣＧＣＡＡＡＡＣＧＡＡＧＣＴＴＧ−３’）のプライマーを用い、３００ｎｔのアンチセンス鎖を配列番号２８（５’−ＧＧＧＡＡＧＣＴＴＧＧＧＡＡＧＣＣＣＴＧＧＣＣＣ−３’）および配列番号２９（５’−ＧＧＧＡＡＧＣＴＴＡＡＧＧＣＣＡＧＣＡＣＧＴＴＣＴＴ−３’）のプライマーを用いてＰＣＲした。これを製作したリボザイム構造体のリボザイムの前にＨｉｎｄＩＩＩ酵素部位にクローニングした。
【００５９】
参照例７：細胞培養
ｈＴＥＲＴ陽性細胞株は２９３（ヒト腎臓／ｎｏｒｍａｌ）、ＨＴ−２９（結腸／結腸直腸腺癌）、Ｃａｐａｎ−１（膵臓／腺癌）およびＨｅｐＧ２（肝／肝細胞癌）を参照し、ｈＴＥＲＴ陰性細胞株はＩＭＲ−９０（肺／線維芽細胞／ｎｏｒｍａｌ）、ＳＫ−ＬＵ１（肺／腺癌）ＡＴＣＣを参照して３７℃で５％ＣＯ--２インキュベータで培養した。
【００６０】
参照例８：細胞株におけるトランス−スプライシングアプタザイムの特異性、効率性の検証
１）テオフィリンの最適濃度試験
２９３細胞を３×１０５で３５ｍｍディッシュにシードして８０％程度成長したとき、Mu Ｐ９ ６ｔ８ｔ構造体１μｇをリポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてトランスフェクションし、テオフィリンまたはカフェインがそれぞれ０．１ｍＭ、０．３ｍＭ、０．５ｍＭ、０．７ｍＭ、１ｍＭの条件で１８時間培養した後、ルシフェラーゼ分析を行った。対照群として同一体積のＰＢＳを使用した。
【００６１】
２）デュアルルシフェラーゼの分析
３５ｍｍのディッシュにトランスフェクションしたそれぞれ細胞の培地を除去し、１×ＰＢＳでよく拭いた。ここで、１×不活性溶解バッファ(passive lysis buffer)を２００μＬ入れて常温で１５分間溶解させ、細胞を得た後、１３０００ｒｐｍで１分間遠心分離して上澄み液のみを新しいチューブに移した。発光試料測定装置(luminometer)のチューブにＬＡＲＩＩ(Luciferase assay reagentＩＩ)を１００μＬ仕込み、ここに細胞破砕物２０μＬを仕込んで混ぜた後、発光試料測定装置で読み取った。さらに、ここにＳｔｏｐ＆Ｇｌｏ ｒｅａｇｅｎｔ ｍｉｘ（Ｓｔｏｐ＆Ｇｌｏ２０μＬ＋Ｓｔｏｐ＆Ｇｌｏバッファ１ｍＬ）を１００μＬ仕込んで混ぜた後、発光試料測定装置（ＴＤ＋２０／２０）で読み取った。遅延時間は３秒、統合時間は１２秒とし、感度はそれぞれの細胞に応じて４５％に設定した。
【００６２】
トランスフェクションの際に、テオフィリン、カフェインはＰＢＳに溶かして細胞に処理した。また、細胞に対するトランスフェクション作業が終わり、ＭＥＭ培地で取り替える段階で、各化学物質を処理して１８時間培養した後、ルシフェラーゼ分析を行った。
【００６３】
３）細胞内トランス−スプライシング反応
リボザイムベクター１μｇを２９３細胞にリポフェクタミン４μＬを用いてトランジェントにトランスフェクションした。トランスフェクション５時間後、０．７ｍＭのテオフィリンまたはカフェイン入りの培地で取り替えた後、１８時間後に細胞破砕物を獲得し、総ＲＮＡを精製した。この際、ＲＮＡを抽出するとき、インビトロにおけるトランス−スプライシング反応可能性を最小化するために、２０ｍＭ ＥＤＴＡが含まれたグアノシンイソシアネート細胞破砕物溶液(geanosine isocyanate cell lysate solution)を用いてＲＮＡを抽出した。ＲＮＡを、ルシフェラーゼ部位を認知するプライマー（５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＧＣＡＡＣＴＧＣＡＡＣＴＣＣＧＡＴＡＡ、配列番号３０）を用いて逆転写反応の後、ｃＤＮＡを、重畳ルシフェラーゼプライマー(nested luciferase primer)を３’プライマー（５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＣＡＡＣＡＣＣＧＧＣＡＴＡＡＡＧ、配列番号３１）として、ｈＴＥＲＴ５’末端を認知する部位を５’プライマーとして（５’−ＡＧＣＧＣＴＧＣＧＴＣＣＴＧＣＴ、配列番号３２）それぞれ用いてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ条件は、予熱９６℃１０分、変性９６℃５分、結合５８℃３０秒、伸長７２℃２０秒を１サイクルとして４０サイクルを繰り返し行った。この際、反応産物の反応対照群として抽出されたＲＮＡをオリゴｄＴに逆転写した後、ＧＡＰＤＨ５’プライマー（５’−ＴＧＡＣＡＴＣＡＡＧＡＡＧＧＴＧＧＴＧＡ、配列番号３３）およびＧＡＰＤＨ３’プライマー（５’−ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ、配列番号３４）を用いてＧＡＰＤＨ ＲＮＡ発現度を観察し、内部対照群として用いた。
【００６４】
４）テオフィリン依存性ｈＴＥＲＴターゲッティングＴ／Ｓエプタザイムを発現するアデノウイルスの製作
ｐＡｖＱシャットルベクターにＡＳ３００ ＷＴ Ｐ９−ＴＫとＡＳ３００ Ｗ−Ｐ９ ６Ｔ８Ｔ−ＴＫをＢａｍＨＩとＢｓｔＢＩにクローニングしてリボザイムをＣＭＶプロモータの下に哺乳類細胞で発現するベクターを製作した。製作されたベクターをＰｍｅＩで線形化(linearization)させ、５型アデノウイルスゲノムＤＮＡプラスミドであるΔＥ１／Ｅ３ ｐＡｄｅｎｏｖｅｃｔｏｒ（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）と共にＢＪ５１８３バクテリアにエレクトロポレーション法を用いてコトランスフェクションさせた。バクテリア細胞内で相同組換えを介して獲得した組換えアデノウイルス性ベクター構造体を分離、精製してｍｉｎｉｐｒｅｐで確認し、しかる後に、ＰａｃＩで線形化した後、パッケージング細胞株である２９３細胞にトランスフェクションした。ウイルス増殖によって形成されるプラーククローン(plaque clone)を獲得した後、細胞残屑(cell debris)を除去したウイルス上澄み液を得て２９３細胞にもう１回感染させ、細胞の溶血が起るかを検証した。
【００６５】
ＡＳ３００ ＷＴ Ｐ９−ＴＫ（オリジナルＴ／Ｓリボザイム）とＡＳ３００ Ｗ−Ｐ９ ６Ｔ８Ｔ−ＴＫ（アロステリックＴ／Ｓリボザイム）をＣＭＶプロモータの下に発現するアデノウイルス性ベクターをそれぞれＡｄ−Ｒｉｂ−ＴＫ、Ａｄ−ＴｈｅｏＲｉｂ−ＴＫと命名した。
【００６６】
組換えアデノウイルス（Ａｄ−Ｒｉｂ−ＴＫ、Ａｄ−ＴｈｅｏＲｉｂ−ＴＫ）が成功裏に製作されたかは、組換えウイルスゲノムＤＮＡがトランスフェクションされた２９３から得た上澄み液を２９３細胞に感染させた後、ＣＰＥ観察によって検証した。また、細胞溶解を誘発するプラーククローンからのウイルス上澄み液からＤＮＡを得てＰＣＲ実験（ＴＫおよびウイルスＩＴＲ部位）によって検証した。
【００６７】
ウイルス感染した細胞の破砕物からＲＮＡを抽出した後、ＲＴ−ＰＣＲを行って（ＴＫ ＲＮＡ）組換えウイルス構造体が碌に形成され且つこのようなウイルスからトランスジーンが発現できることを検証した。各組換えアデノウイルスクローンを感染させた２９３細胞の上澄み液から得た組換えウイルスを多数回２９３細胞に再び感染させてウイルスの量を増幅し、Ｖｉｖａｐｕｒｅ（登録商標） ＡｄｅｎｏＰＡＣＫＴＭを用いて組換えアデノウイルス性ベクターを分離、精製した。獲得した組換えウイルスを連続的に希釈した後、ＴＣＩＤ５０分析を行うことにより、各精製されたウイルスベクターのＰＦＵタイターを決定した。
【００６８】
５）ＭＴＴ分析
細胞を９６ウェルプレート（ＴＰＰ）にシードした後、１日後にＡｄ−ＴＫ（ＣＭＶプロモータの下にＴＫ遺伝子を発現するアデノウイルス性ベクター）、Ａｄ−Ｒｉｂ−ＴＫ、Ａｄ−ＴｈｅｏＲｉｂ−ＴＫ、Ａｄ−ＬａｃＺ（ＣＭＶプロモータの下にＬａｃＺを発現するアデノウイルス性ベクター）アデノウイルスをそれぞれ感染させた。ウイルス感染の翌日から５日間ＧＣＶと化学物質（テオフィリン、カフェイン）が含有された培地を２日に１回ずつ取り替えた。ＨＴ−２９は３×１０３／ｗｅｌｌ、ＨｅｐＧ２は３×１０３／ｗｅｌｌ、Ｃａｐａｎ−１は５×１０３／ｗｅｌｌ、ＩＭＲ９０は５×１０３／ｗｅｌｌの細胞数でそれぞれシードした。５日後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ ＯＮＥ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を各培地に２０％添加して９６ウェルに各ウェル当たり１００μＬで処理してＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ ｍｏｄｅｌ５５０（ＢｉｏＲａｄ）によって４９０ｎｍ波長で測定し、細胞の細胞生存率を観察した。
【００６９】
６）半定量的ＰＣＲ
３５ｍｍのディッシュにアデノウイルスを感染させてから２４時間後、化学物質（テオフィリン、カフェイン）が含まれた培地で取り替え、さらに２４時間後、細胞でＴｒｉＺｏｌ反応試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＲＮＡを精製してＲＴした後、実時間ＰＣＲを用いてＴ／Ｓ産物に対する半定量的ＰＣＲを行った。Ｔ／Ｓ ＰＣＲ産物の量を、ＧＡＰＤＨをＰＣＲした量を用いて補正した。
【００７０】
ＲＮＡをオリゴｄＴを用いて逆転写反応させた後、ｃＤＮＡを、ＴＫプライマーを３’プライマー（５’−ＣＣＣＡＴＧＣＡＣＧＴＣＴＴＴＡＴＣＣＴＧＧＡＴ−３’、配列番号３５）として、ｈＴＥＲＴ５’末端を認知する部位を５’プライマーとして（５’−ＧＧＡＡＴＴＣＧＣＡＧＣＧＣＴＧＣＧＴＣＣＴＧＣＴ−３’、配列番号３６）それぞれ用いて実時間ＰＣＲ増幅した。反応産物の反応対照群として抽出したＲＮＡをオリゴｄＴで逆転写した後、ＧＡＰＤＨ５’−プライマー（５’−ＴＧＡＣＡＴＣＡＡＧＡＡＧＧＴＧＧＴＧＡ、配列番号３７）およびＧＡＰＤＨ３’−プライマー（５’−ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ、配列番号３８）を用いてＧＡＰＤＨ ＲＮＡ発現度を観察し、内部対照群として用いた。
【００７１】
実施例１：テオフィリンアプタマーが付着しており且つｈＴＥＲＴ ＲＮＡを特異的に標的化するトランス−スプライシングリボザイムの製造
アロステリックリボザイム開発のための基本トランス−スプライシングリボザイム骨格は、ｈＴＥＲＴの＋２１ｎｔ部位を特異的に認知し、Ｐ１、Ｐ１０、そして標的ＲＮＡに対する３００個のアンチセンス配列が添加された拡張ＩＧＳを有するグループＩイントロンリボザイムを用いた（図２）。このようなリボザイムは、既に細胞および動物モデルでｈＴＥＲＴ ＲＮＡ特異的にトランスジーンを発現させることにより、ｈＴＥＲＴ発現癌細胞特異的な細胞死を誘導することを観察した(Mol. Ther. 2005;12:824, Mol Ther. 2008;16:74)。
【００７２】
テオフィリン依存性アロステリックリボザイムを製作するために、テオフィリンの受容体ドメインとしてテオフィリンＲＮＡアプタマー(Science 1994;263;1425)を、本研究チームで開発したｈＴＥＲＴ−特異Ｔ／Ｓリボザイムの触媒機能のためのＲＮＡ折り畳みに重要な役割(Nucleic Acid Res. 2002;30:4599)を果たすＰ６またはＰ８ドメイン、あるいはＰ６＋Ｐ８ドメインに付着させた。また、Ｐ９ドメインを最小化させたΔＰ９ドメインが置換されたリボザイム、またはＰ９が変異されているリボザイムのＰ６、Ｐ８、またはＰ６＋Ｐ８ドメインにテオフィリンアプタマーを付着させたＴ／Ｓリボザイムを製造した。図３はトランス−スプライシングリボザイムの根幹構造であるグループＩイントロンの構造および塩基配列、並びにテオフィリンアプタマーおよびアプタマーをリボザイムに連結させるコミュニケーションモジュール構造(Nucleic Acis Res.2002;30:4599)などを示す。
【００７３】
製作したトランス−スプライシングリボザイム構造体は、次のとおりである。
−ｈＴＥＲＴ特異的トランス−スプライシングリボザイム（ＷＴ）
−ＷＴのＰ６またはＰ８にアプタマーが付着しているリボザイム（Ｗ−Ｐ９ ６ｔ、ＷＴ−Ｐ９ ８ｔ）
−変異Ｐ９のＰ６とＰ８ドメインにアプタマーが付着しているリボザイム（Ｍｕ−Ｐ９ ６ｔ８ｔ）
−ＷＴリボザイムのＰ９部位がΔＰ９で置換されたリボザイム（ΔＰ９）
−ΔＰ９リボザイムにＰ６、Ｐ８、Ｐ６＋Ｐ８にアプタマーが付着しているリボザイム（ΔＰ９ ６ｔ、ΔＰ ８ｔ、ΔＰ９ ６ｔ８ｔ）
−ｈＴＥＲＴに対するアンチセンス３００ｎｔが付着しているＷＴリボザイム（ＡＳ−３００ ＷＴ）
−Ｐ１、Ｐ１０ヘリックスを含有し、Ｐ６＋Ｐ８にアプタマーを含有しているＷＴリボザイム（ＩＧＳ Ｗ−Ｐ９ ６ｔ８ｔ）
−アンチセンス３００ｎｔが付着しており、Ｐ６＋Ｐ８にアプタマーを含有しているＷＴリボザイム（ＡＳ−３００ Ｗ−Ｐ９ ６ｔ８ｔ）
−アンチセンス３００ｎｔが付着しており、Ｐ６＋Ｐ８にアプタマーを含有しているＭｕ−Ｐ９リボザイム（ＡＳ−３００ Ｍｕ−Ｐ９ ６ｔ８ｔ）
【００７４】
変異Ｐ９の構造は、リボザイムベクターを製造するＰＣＲ過程中に偶然製作された構造体であって、インビトロ上における標的ＲＮＡ（ｈＴＥＲＴ ＲＮＡ）とのトランススプライシング反応を行った結果、リボザイムの活性には影響を及ぼさない部位であることが分かった。
【００７５】
したがって、本発明におけるアロステリックリボザイム製作のための候補として、このような変異Ｐ９に基づいたリボザイム構造体も共に製作し、その機能を観察した。図４は野性型Ｐ９配列と変異Ｐ９（Ｍｕ−Ｐ９）配列を示した。他の部分は太字と下線で表示した。
【００７６】
実施例２：リボザイムのテオフィリン依存性ＲＮＡ置換機能を定量的に分析
前記で製作したリボザイムと基質ＲＮＡとしてのｈＴＥＲＴ ＲＮＡをスプライシング条件の下に３７℃で３時間反応させた後、形成された産物をＲＴ−ＰＣＲ反応によって分析した。スプライシング反応の際に、水または０．５ｍＭカフェイン（テオフィリン構造類似体、アロステリック効果の特異性に対する陰性対照群）または０．５ｍＭテオフィリンと共に反応させることにより、トランス−スプライシング反応がテオフィリン特異的にアロステリックにターンオン(turn on)されるかを観察した。図５はＲＴ−ＰＣＲ産物の結果を示している。
【００７７】
図５を参照すると、ＷＴおよびΔＰ９リボザイムの場合には予想とおりにカフェイン、テオフィリン、水を問わずに常にトランス−スプライシング反応が誘発され、Ｗ−Ｐ９ ６ｔの場合にも化合物に関係なく反応が誘発されることが分かった。また、Ｗ−Ｐ９ ８ｔの場合にもテオフィリン特異的にトランス−スプライシング反応が起らず、ΔＰ９ ８ｔおよびΔＰ ６ｔ８ｔの場合にはトランス−スプライシング反応自体が非常に非効率的に行われていることが分かった。これに対し、Ｍｕ−Ｐ９ ６ｔ８ｔとΔＰ９ ６ｔリボザイムの場合にはテオフィリン特異的に３１９ｂｐサイズのトランス−スプライシング産物がインビトロ上で生成されることが分かった。よって、 グループＩイントロンのＰ６またはＰ８ドメインがリボザイムのＰ９配列または構造的性質によってテオフィリン依存的にアロステリックにリボザイム活性を調節することが可能な主要ドメインであることが分かった。
【００７８】
アロステリックリボザイムによるテオフィリン依存性トランス−スプライシング反応の誘導調節の度合いを比較分析するために、トランス−スプライシング産物に対する実時間ＰＣＲ分析（分析機器；Ｃｏｒｂｅｔｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＲＧ６）を行った。前記トランス−スプライシング反応によってテオフィリン依存的に酵素活性が調節されるＭｕ−Ｐ９ ６ｔ８ｔリボザイム、または低分子化合物とは関係なく構造的に酵素活性を持つＷＴリボザイムをｈＴＥＲＴ ＲＮＡと共にスプライシング反応させた後、ＲＴ反応を行った。ＲＴされたサンプルの定量的比較において、その値をｒａｓ ｃＤＮＡの量を用いて補正した。その結果を図６に示した。図６を参照すると、ＷＴリボザイムの場合にはスプライシングバッファ上に水、テオフィリンおよびカフェインの存在を問わずに同量のトランス−スプライシング産物を生成することが分かった。また、ΔＰ９ ６ｔリボザイムの場合、実時間で反応産物を定量分析した結果、テオフィリン依存性トランス−スプライシング反応結果を示さなかった。ところが、以前の実験によって確認したインビトロ上でテオフィリン依存的に調節されるＭｕ−Ｐ９ ６ｔ８ｔリボザイムの場合、内部対照群で各ＲＴサンプルの値を補正して比較したとき、カフェインに比べてテオフィリンが存在する条件で４．３倍の差異を示し、同一体積のｄＨ２Ｏとは１２．１６倍の差異を示した。したがって、Ｍｕ−Ｐ９ ６ｔ８ｔリボザイムは、インビトロ上で効果的にテオフィリン依存的にトランス−スプライシング反応が調節できるアロステリックリボザイムであることが分かった。
【００７９】
前記で分析したリボザイムのＩＧＳは、６個のｎｔのみを持っているので、細胞内における標的ＲＮＡ特異的なトランス−スプライシング反応のためにはＩＧＳ基が拡張されたリボザイムを利用しなければならない(Nat. Biotechnol.1996;15:902, J. Mol. Biol. 1999;185:1935, Mol. Ther. 2003;7:386, Mol. Ther. 2004;10:365; Mol. Ther. 2005;12:824)。このように拡張されたＩＧＳを持つリボザイムは、インビトロ転写を介して製造した後、ｈＴＥＲＴ ＲＮＡとのインビトロ上におけるトランス−スプライシング反応を行った。この際、トランス−スプライシング反応がテオフィリンに依存的であるかを観察した。製作したリボザイムは、ｈＴＥＲＴに対するアンチセンス３００ｎｔが付着しているＷＴリボザイム（ＡＳ−３００ ＷＴ）、Ｐ１、Ｐ１０へリックスを含有し且つＰ６＋Ｐ８にアプタマーを含有しているＷＴリボザイム（ＩＧＳ Ｗ−Ｐ９ ６ｔ８ｔ）、アンチセンス３００ｎｔが付着しており且つＰ６＋Ｐ８にアプタマーを含有しているＷＴイボザイム（ＡＳ−３００ Ｗ−Ｐ９ ６ｔ８ｔ）、およびアンチセンス３００ｎｔが付着しており且つＰ６＋Ｐ８にアプタマーを含有しているＭｕ−Ｐ９リボザイム（ＡＳ−３００ Ｍｕ−Ｐ９ ６ｔ８ｔ）などであり、その反応結果（トランス−スプライシング産物のＲＴ−ＰＣＲ産物）は図７に示した。
【００８０】
図７を参照すると、予想とおり、ＡＳ−３００ ＷＴの場合にはテオフィリンに関係なくスプライシング反応が誘発された。ＡＳ３００ Ｗ−Ｐ９ ６ｔ８ｔの場合にも、インビトロ上ではテオフィリンに関係なくスプライシング反応が誘発されたが、ＡＳ３００ Ｍｕ−Ｐ９ ６ｔ８ｔの場合には、ＡＳ３００がない場合とは異なり、スプライシング反応自体がよく起らないことが分かった。これに対し、アンチセンスなしでＰ１とＰ１０へリックスを持つＩＧＳ Ｗ−Ｐ９ ６ｔ８ｔの場合には、テオフィリンが存在する場合にのみトランス−スプライシング反応が誘発できることが分かった。このような結果は、６ｎｔのＩＧＳのみを持つリボザイムと拡張されたＩＧＳ配列を持つリボザイムとが同一のリボザイム基本骨格を持つとしても、アンチセンス配列の存在有無によって異なる活性を示すＲＮＡ構造的差異が存在しうることを示唆する。よって、これは各拡張ＩＧＳを有するリボザイムのインビトロ、ひいては細胞内におけるスプライシング活性をそれぞれ観察しなければならないことを示唆する。
【００８１】
前記結果より、テオフィリンアプタマーが付着している一部のリボザイムはインビトロ上でテオフィリン依存的にトランス−スプライシング活性がアロステリックに調節できることが分かった。果たしてこのようなトランス−スプライシング産物が正確なトランス−スプライシング反応によって生成された産物であるかを検証するために、獲得したトランス−スプライシングＲＴ−ＰＣＴ産物をｐＵＣ１９ベクターにクローニングした後、その塩基配列を決定した。図８に示すように、トランス−スプライシング反応産物の配列データより、標的ＲＮＡであるｈＴＥＲＴ ＲＮＡの＋２１ｎｔ部位の下流域と、リボザイムの３’エキソンに付着している蛍ルシフェラーゼＲＮＡとが正確に連結された産物であることが分かった。このような結果は、アロステリックトランス−スプライシングリボザイムの反応が非常に正確に起ることを意味する。
【００８２】
実施例３：３’エキソンにレポーター遺伝子が付着しているアロステリックトランス−スプライシングリボザイムの製作
テオフィリン依存性アロステリックリボザイム発現ベクターを製作するために、テオフィリンの受容体ドメインとしてテオフィリンＲＮＡアプタマー（Ｓｃｉｅｎｃｅ１９９４；２６３：１４２５）を、本発明者らによって開発したｈＴＥＲＴ−特異トランス−スプライシングリボザイムの触媒機能のためのＲＮＡ折り畳みに重要な役割(Nucleic Acis Res. 2002;30:4599)を果たすＰ６、Ｐ８、またはＰ６＋Ｐ８ドメインに付着させた。また、Ｐ９ドメインを最小化させたΔＰ９ドメインが置換されたリボザイム、または変異Ｐ９を含有したリボザイムのＰ６、Ｐ８、またはＰ６＋Ｐ８ドメインにテオフィリンアプタマーを付着させたトランス−スプライシングリボザイムを製造した。発現誘導のためのトランスジーンとして蛍ルシフェラーゼ遺伝子をリボザイムの３’エキソンに挿入し、ＳＶ４０プロモータシステムを用いて細胞内リボザイムの発現を図った。製作したトランス−スプライシングリボザイム構造体は、次のとおりである。
【００８３】
ベクターの製造は、インビトロスプライシング反応のために製造したアロステリックリボザイム構造体のリボザイム部位からルシフェラーゼ３’末端までＰＣＲ反応によって増幅した後、そのＤＮＡを、ＳＶ４０プロモータが含有されたｐＳＥＡＰベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩ部位に挿入した後、ＨｉｎｄＩＩＩ部位にｈＴＥＲＴ ＲＮＡに対するアンチセンス配列を挿入することにより行った。この際、リボザイムを増幅するための５’プライマーには、Ｐ１、Ｐ１０へリックス、およびｈＴＥＲＴ ＲＮＡの＋２１ｎｔを認知するＩＧＳ配列を含有している（５’−ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＣＡＧＧＡＡＡＡＧＴＴＡＴＣＡＧＧＣＡ−３’、配列番号３９）。
【００８４】
（１）ｈＴＥＲＴ ＲＮＡに対して１００ｎｔアンチセンスを含有するベクター；
−ｈＴＥＲＴ特異的リボザイム（ＡＳ−１００ ＷＴ）発現ベクター、
−ＷＴのＰ６、Ｐ８にアプタマーが付着しているリボザイム（ＡＳ−１００ Ｗ−Ｐ９ ６ｔ、ＡＳ−１００ ＷＴ−Ｐ９ ８ｔ）発現ベクター、
−変異Ｐ９のＰ６＋Ｐ８ドメインにアプタマーが付着しているリボザイム（ＡＳ−１００ Ｍｕ−Ｐ９ ６ｔ８ｔ）発現ベクター（ｐＳＥＡＰ ＡＳ１００ Ｍｕ−Ｐ９ ６Ｔ８Ｔ−Ｌｕｃｉ、配列番号５）、
−ΔＰ９リボザイムのＰ６、Ｐ８、Ｐ６＋Ｐ８にアプタマーが付着しているリボザイム（ＡＳ−１００ ΔＰ９ ６ｔ、ＡＳ−１００ ΔＰ９ ８ｔ、ＡＳ−１００ ΔＰ９ ６ｔ８ｔ）発現ベクター、
（２）ｈＴＥＲＴ ＲＮＡに対して３００ｎｔアンチセンスを含有するベクター
−ｈＴＥＲＴ特異的リボザイム（ＡＳ−３００ ＷＴ）発現ベクター、
−ＷＴのＰ６＋Ｐ８にアプタマーが付着しているリボザイム（ＡＳ−３００ Ｗ−Ｐ９ ６ｔ８ｔ）発現ベクター（ｐＳＥＡＰ ＡＳ３００ Ｗ−Ｐ９ ６Ｔ８Ｔ−Ｌｕｃｉ、配列番号６）、
−変異Ｐ９のＰ６＋Ｐ８ドメインにアプタマーが付着しているリボザイム（ＡＳ−３００ Ｍｕ−Ｐ９ ６ｔ８ｔ）発現ベクター、
−ΔＰ９リボザイムのＰ６ドメインにアプタマーが付着しているリボザイム（ＡＳ−３００ ΔＰ９ ６ｔ）発現ベクター、
−ΔＰ９リボザイムのＰ８ドメインにアプタマーが付着しているリボザイム（ＡＳ−３００ ΔＰ９ ８ｔ）発現ベクター（ｐＳＥＡＰ ＡＳ３００ Ｄｅｌｔａ Ｐ９ ８Ｔ−Ｌｕｃｉ、配列番号４）
【００８５】
実施例４：リボザイムの細胞内における化合物依存性ｈＴＥＲＴ ＲＮＡの特異的置換機能の観察
１）テオフィリン依存性トランス−スプライシングトランスジーン誘導条件の確立
前記で製造した３’エキソンにルシフェラーゼが付着しているアロステリックリボザイムがどの細胞内でテオフィリン濃度条件の下で最もアロステリックにトランスジーン発現を誘導するかその条件をまず樹立した。
【００８６】
インビトロ上におけるトランス−スプライシング反応によってテオフィリン依存的にトランス−スプライシング反応を誘導したＭｕ−Ｐ９ ６ｔ８ｔリボザイム発現ベクターを２９３細胞にリポフェクタミンを用いてトランジェントにトランスフェクションした。この際、トランスフェクション効率を測定し、発現産物の活性を標準化するために、ＣＭＶプロモータの下にレニラルシフェラーゼ(renillar luciferase)を発現することが可能なベクターを共にコトランスフェクションした。トランスフェクション４時間後に新規の培地で取り替えたが、この際、新規の培地には０．１ｍＭ、０．３ｍＭ、０．５ｍＭ、０．７ｍＭおよび１ｍＭのカフェインまたはテオフィリンを添加し、果たしてどの程度のテオフィリン下で最もテオフィリン依存的にルシフェラーゼ活性が誘導されるかを検証した。新規の培地で取り替えてから１８時間後、細胞破砕物を得た後、レニラルシフェラーゼ活性によって標準化させた蛍ルシフェラーゼ活性を照度計ＴＤ−２０／２０(Turner Designs Instrument)を用いて測定した。この際、測定されたルシフェラーゼ活性は、ＳＶ４０プロモータの下でルシフェラーゼを発現するベクター（ＳＶ４０−Ｌｕｃｉ）をトランスフェクションした後、生成されるルシフェラーゼ値に対する相対値（％）で図９のように示した。
【００８７】
図９を参照すると、０．７ｍＭのテオフィリン存在の際に０．７ｍＭのカフェイン存在の場合と比較して最も細胞内におけるテオフィリン特異的ルシフェラーゼ活性の誘導が増加することが分かった。したがって、多様なリボザイム発現ベクターによるテオフィリン依存性遺伝子発現誘導のためのテオフィリン濃度条件を０．７ｍＭに固定して次の実験を行った。
【００８８】
２）１００ｎｔアンチセンス含有リボザイム発現ベクターによるテオフィリン依存性トランスジーン発現の誘導
ｈＴＥＲＴ ＲＮＡに対する１００ｎｔアンチセンス配列を持っており且つテオフィリンアプタマーが付着しているリボザイムによる細胞内トランスジーン活性誘導の有無をルシフェラーゼ分析によって観察した。
【００８９】
この際、測定されたルシフェラーゼ活性は、ＰＢＳを処理した細胞破砕物から観察されるルシフェラーゼ値に対する相対値（％）で図１０のように示した。
【００９０】
図１０を参照すると、インビトロデータと一致するように、ＡＳ−１００ Ｍｕ−Ｐ９ ６ｔ８ｔリボザイムの場合、最もテオフィリン特異的にルシフェラーゼ活性の誘導を増進させることが分かった。ところが、インビトロデータとは異なり、ＡＳ−１００ ΔＰ９ ６ｔリボザイムよりはＡＳ−１００ ΔＰ９ ８ｔリボザイムの場合がさらにテオフィリン特異的にトランスジーンの発現を誘導することが分かった。このような結果は、ＩＧＳの前にアンチセンス配列が１００ｎｔさらに付加されることにより引き起こされ得るリボザイム構造的変異、そして細胞内における環境がインビトロ上における環境と必ずしも一致しないためであると思われる。これに対し、ＷＴ、Ｗ−Ｐ９ ６ｔ、Ｗ−Ｐ９ ８ｔおよびΔＰ９、ΔＰ９ ６ｔ８ｔリボザイムの場合は、テオフィリン特異的に細胞内におけるトランスジーン活性を誘導するとは見られなかった。
【００９１】
３）ｈＴＥＲＴ−陰性細胞におけるアロステリックリボザイム活性
前記結果より、細胞内でテオフィリン依存的にアロステリックにトランスジーン活性を誘導することができるものと観察されたＡＳ−１００ Ｍｕ−Ｐ９ ６ｔ８ｔリボザイム、および細胞内ではアロステリック効果を示していないＡＳ−１００ ΔＰ９ ６ｔリボザイムが、果たしてｈＴＥＲＴ標的ＲＮＡ特異的にトランスジーン活性を誘導するかを調べるために、ｈＴＥＲＴ陰性細胞であるＳＫ−Ｌｕ−１細胞に各リボザイムベクターをＤＭＲＩＥ−Ｃを用いてトランジェントにトランスフェクションし、その４時間後、テオフィリン入りの培地で取り替えた。新規の培地で取り替えてから１８時間の後、細胞破砕物を得た後、ルシフェラーゼ活性を測定してＳＶ４０−Ｌｕｃｉベクターによるルシフェラーゼ発現値との相対値を図１１のように測定した。
【００９２】
図１１を参照すると、ＡＳ−１００ ＷＴリボザイムと同様に、ＡＳ−１００ Ｍｕ−Ｐ９ ６ｔ８ｔおよびＡＳ−１００ ΔＰ９ ６ｔリボザイムの両方とも標的ＲＮＡが存在しなければ、テオフィリンの存在と関係なくトランスジーン発現誘導が抑制されることが分かった。すなわち、テオフィリン依存性アロステリックトランス−スプライシングリボザイムは、ターゲットＲＮＡ特異的にトランスジーン発現を誘導することができることが分かった。
【００９３】
４）３００ｎｔアンチセンス含有リボザイム発現ベクターによるテオフィリン依存性トランス発現の誘導
アンチセンス配列の長さを増加させることにより、トランス−スプライシングリボザイムのアロステリックトランスジーン発現誘導効果がさらに増進できるかを観察するために、ｈＴＥＲＴ ＲＮＡに対して３００ｎｔのアンチセンス配列を含有したリボザイムベクターを製造した後、細胞内におけるテオフィリン依存的ルシフェラーゼ活性の誘導を比較観察した。
本実験のためのテオフィリン依存性対照群としてＡＳ−３００ ＷＴリボザイムを用いた。インビトロでテオフィリン依存的にトランス−スプライシング反応を誘発し且つＡＳ−１００配列含有の際に細胞内でテオフィリン依存的トランスジーン活性を誘導した、Ｍｕ−Ｐ９ ６ｔ８ｔの基本骨格に３００ｎｔアンチセンスを含有したリボザイム（ＡＳ−３００ Ｍｕ−Ｐ９ ６ｔ８ｔ）、インビトロでテオフィリン依存的にトランス−スプライシング反応を誘発した、ΔＰ９ ６ｔの基本骨格に３００ｎｔアンチセンスを含有したリボザイム（ＡＳ−３００ ΔＰ９ ６ｔ）、ＡＳ-１００配列含有の際に細胞内でテオフィリン依存的トランスジーン活性を誘導した、ΔＰ９ ８ｔの基本骨格に３００ｎｔアンチセンスを含有したリボザイム（ＡＳ−３００ ΔＰ９ ８ｔ）、および拡張されたＩＧＳ含有の際（Ｐ１＋Ｐ１０へリックス）にインビトロでテオフィリン依存的にトランス−スプライシング反応を誘発した、Ｗ−Ｐ９ ６ｔ８ｔの基本骨格に３００ｎｔアンチセンスを含有したリボザイム（ＡＳ−３００ Ｗ−Ｐ９ ６ｔ８ｔ）の発現ベクターを、それぞれｈＴＥＲＴ陽性細胞としての２９３細胞にコトランスフェクションした後、ルシフェラーゼ活性を測定し、テオフィリン依存的遺伝子の活性誘導有無を相互比較し、観察した。この際、測定されたルシフェラーゼ活性はＳＶ４０プロモータの下で蛍ルシフェラーゼを発現するベクター（ＳＶ４０−Ｌｕｃｉ）をトランスフェクションした後、生成されるルシフェラーゼ値に対する相対値（％）で図１２のように示した。
【００９４】
図１２を参照すると、予想とおり、ＡＳ−３００ ＷＴリボザイムはテオフィリンの存在有無を問わずにルシフェラーゼ発現を効果的に誘導した。アンチセンス配列３００ｎｔを含有したリボザイムのうちＡＳ−３００ Ｍｕ−Ｐ９ ６ｔ８ｔとＡＳ−３００ ΔＰ９ ６ｔリボザイムの場合、テオフィリン依存的トランスジーン活性誘導を観察することはできなかった。これに対し、ＡＳ−３００ Ｗ−Ｐ９ ６ｔ８ｔとＡＳ−３００ ΔＰ９ ８ｔの場合は、テオフィリン依存的に効果的なルシフェラーゼ活性誘導を観察することができ、リボザイムのＩＧＳの前にアンチセンス配列１００ｎｔを挿入する場合よりアンチセンス配列３００ｎｔを挿入した場合が、さらにトランスジーン発現誘導を増加させることができることを観察することができた。
【００９５】
５）アロステリックリボザイムによる細胞内トランス−スプライシング反応
前記実験によって、細胞内でテオフィリン依存的にトランスジーンの活性を誘導、増進させることが可能なリボザイム構造体を探索した。このようなテオフィリン依存性トランスジーンの誘導が、果たして細胞内トランス−スプライシング反応のアロステリック効果によって誘発されるかを検証するために、テオフィリンアプタマーが付着しているリボザイム発現ベクターを２９３細胞にトランジェントにトランスフェクションした後、細胞内トランス−スプライシング反応産物の存在有無を観察した。
【００９６】
ＧＡＰＤＨ ＲＮＡ発現度を観察して内部対照群として用いた。ＲＴ−ＰＣＲ産物をアガロースゲルで分析した結果は、図１３に示した。
【００９７】
図１３を参照すると、予想とおり、陽性対照群であるＷＴリボザイム（ＡＳ−３００ ＷＴ）の場合、ｈＴＥＲＴ特異的トランス−スプライシング反応物を得ることができた（ｌａｎｅ３）。テオフィリンアプタマーが付着しているリボザイムは、ルシフェラーゼ活性の誘導結果と一致するように、ＡＳ−３００ Ｍｕ−Ｐ９ ６ｔ８ｔリボザイムベクターの場合にはテオフィリン、カフェインおよびＰＢＳ存在の際に培地を問わずに全てトランス−スプライシング産物が生成されたが（ｌａｎｅ７〜９）、これに対し、ＡＳ−３００ Ｗ−Ｐ９ ６ｔ８ｔリボザイムベクターの場合には、ルシフェラーゼ活性の誘導結果と一致するように、テオフィリンを処理した細胞のみ３１１ｂｐのトランス−スプライシング産物が生成されること（ｌａｎｅ４）を観察することができた。このような結果はＡＳ−３００ Ｗ−Ｐ９ ６ｔ８ｔリボザイムのインビトロトランス−スプライシング結果とは異なるが、これはインビトロと細胞内における環境的相異によるものと思われる。このようなトランス−スプライシング産物が、ＲＮＡ抽出過程中に誘発されるインビトロトランス−スプライシング反応ではなく、細胞内におけるトランス−スプライシング反応の結果であることを検証するために、２９３細胞とＡＳ−３００ Ｗ−Ｐ９ ６ｔ８ｔリボザイムベクターをトランスフェクションさせたＳＫ−Ｌｕ−１細胞（ｈＴＥＲＴネガティブ）を混合し、ＲＮＡを抽出した後、ＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。その結果、図１３に示すように、何のトランス−スプライシング産物も発見されないことからみて（ｌａｎｅ１０）、テオフィリン存在の際にＡＳ−３００ Ｗ−Ｐ９ ６ｔ８ｔリボザイムがトランスフェクションされた２９３細胞でのみ測定されたトランス−スプライシング産物は、細胞におけるテオフィリン依存的で標的ＲＮＡ特異的なトランス−スプライシング反応によるものであることが分かった。
【００９８】
前記結果をまとめてみた結果、ｈＴＥＲＴ ＲＮＡを発現する細胞特異的に且つテオフィリン依存的にトランスジーン発現を調節することが可能な、すなわちテオフィリン依存的に細胞内で人為的にＲＮＡ置換反応を調節することが可能なアロステリックリボザイム候補としてＡＳ−３００ Ｗ−Ｐ９ ６ｔ８ｔとＡＳ−３００ ΔＰ９ ８ｔなどを開発した。さらに、インビトロ上で効率的なアロステリックリボザイムとしてＩＧＳ Ｗ−Ｐ９ ６ｔ８ｔを発掘した。
【００９９】
実施例５：アデノウイルス性ベクターによるｈＴＥＲＴ発現癌細胞特異的な細胞死調節機能の観察
１）ＨＴ−２９細胞（ｈＴＥＲＴ＋）におけるテオフィリン依存性細胞死の誘導
開発したアロステリックリボザイムの３’エキソンに細胞死遺伝子としてのＨＳＶチミジンキナーゼ遺伝子を挿入（ＡＳ３００ Ｗ−Ｐ９ ６Ｔ８Ｔ−ＴＫ）してＣＭＶプロモータの下でリボザイムを哺乳類細胞で発現することが可能なベクター（ｐＡｖＱ−Ｔｈｅｏ−Ｒｉｂ２１ＡＳ−ＴＫ、配列番号８）を製作した後、組換えアデノウイルス性ベクターを製作した（図１４）。
【０１００】
前記ｐＡｖＱ−Ｔｈｅｏ−Ｒｉｂ２１ＡＳ−ＴＫを韓国微生物保存センターに２００８年３月２１日付けで寄託し、寄託番号ＫＣＣＭ１０９３５Ｐを与えられた。
【０１０１】
ＨＳＶｔｋを３’エキソンとして持っており、テオフィリン依存性アロステリックリボザイムを発現するアデノウイルス性ベクター（Ａｄ−ＴｈｅｏＲｉｂＴＫ）が果たして標的特異的に、そしてテオフィリン依存的にトランスジーン発現を誘導するかを観察するために、ウイルス処理の後、ＧＣＶと調節化合物を処理し、しかる後に、ＭＴＴ分析によって大腸癌細胞としてのＨＴ−２９細胞の生存率を観察した。この際、陽性対照群としてＡｄ−ＴＫ（ＣＭＶプロモータの下にＨＳＶｔｋを発現するアデノウイルス性ベクター）を用い、ｈＴＥＲＴ＋細胞における陽性対照群としてＡｄ−Ｒｉｂ−ＴＫ（ｈＴＥＲＴ特異的であり、ＨＳＶｔｋが標識されているアデノウイルス性ベクター）を用いた。陰性対照群としては、Ａｄ−ＬａｃＺ（ＣＭＶプロモータの下にＬａｃＺを発現するアデノウイルス性ベクター）を用いた。Ａｄ−ＴｈｅｏＲｉｂ−ＴＫを処理した場合、テオフィリン或いはカフェインを処理した後の生存率を相互比較し、その結果を図１５に示した。
【０１０２】
図１５を参照すると、Ａｄ−ＴＫおよびＡｄ−Ｒｉｂ−ＴＫの場合、ＧＣＶ濃度が増加すると同時にアデノウイルス濃度が増加しながら細胞生存率が減少するが、化学物質の濃度には影響されないことが観察された。これに対し、Ａｄ−ＬａｃＺの場合はいずれの場合でも細胞生存率に影響を及ぼさなかった。注目すべき点は、アロステリックリボザイムであるＡｄ−ＴｈｅｏＲｉｂ ＴＫを感染させた場合、カフェイン処理によっては細胞生存率がＧＣＶ、ウイルスおよび化学物質の濃度を増加させても細胞生存率に影響を及ぼさなかったが、テオフィリンを処理した場合には、陽性対照群と同様に、ウイルス濃度およびＧＣＶ濃度に比例するように細胞生存率が減少した。また、テオフィリン濃度が増加すると、それにより細胞生存率も一緒に減少することが観察された。これは、Ａｄ−ＴｈｅｏＲｉｂ−ＴＫはテオフィリンによってその活性がアロステリックに調節されるので、テオフィリンを処理すればトランスジーン発現が誘導されることにより、癌細胞の細胞死が誘発されたことを示唆する。最もアロステリックに遺伝子発現が誘導される条件は、１００ｍｏｉアデノウイルス、１００μＭテオフィリン、１０μＭ ＧＣＶを処理した場合である。
【０１０３】
２）ＨｅｐＧ２細胞（ｈＴＥＲＴ＋）におけるテオフィリン依存性細胞死の誘導
Ａｄ−ＴｈｅｏＲｉｂ−ＴＫが果たして標的特異的に且つテオフィリン依存的にトランスジーン発現を誘導するかを観察するためにウイルス処理し、ＧＣＶと調節化合物を処理した後、ＭＴＴ分析によって肝癌細胞としてのＨｅｐＧ２細胞における細胞生存率も観察した。この際、陽性対照群としてＡｄ−ＴＫを用い、ｈＴＥＲＴ＋細胞における陽性対照群としてＡｄ−Ｒｉｂ−ＴＫを用いた。陰性対照群としてはＡｄ−ＬａｃＺを用いた。Ａｄ−ＴｈｅｏＲｉｂ−ＴＫを処理した場合、テオフィリン或いはカフェインを処理した後の生存率を相互比較し、その結果を図１６に示した。
【０１０４】
図１６を参照すると、ＨＴ−２９細胞と同様に、Ａｄ−ＴＫおよびＡｄ−Ｒｉｂ−ＴＫの場合、ＧＣＶ濃度が増加すると同時にアデノウイルス濃度が増加しながら細胞生存率が減少するが、化学物質の濃度には影響されないことが観察された。これに対し、Ａｄ−ＬａｃＺの場合は、いずれの場合でも細胞生存率に影響を及ぼさなかった。注目すべき点は、アロステリックリボザイムであるＡｄ−ＴｈｅｏＲｉｂ−ＴＫを感染させた場合、カフェイン処理によってはＧＣＶ、ウイルスおよび化学物質の濃度を増加させても細胞生存率に影響を及ぼさなかったが、テオフィリンを処理した場合には、陽性対照群と同様に、ウイルス濃度およびＧＣＶ濃度に比例するように細胞生存率が減少した。また、テオフィリン濃度が増加すると、それにより細胞生存率も一緒に減少することが観察された。これは、ｈＴＥＲＴ＋であるＨＴ−２９以外にも、ＨｅｐＧ２細胞においても、Ａｄ−ＴｈｅｏＲｉｂ−ＴＫはテオフィリンによってその活性がアロステリックに調節されるので、テオフィリンを処理すればトランスジーン発現が誘導されることにより、癌細胞の細胞死が誘発されたことを示唆する。最もアロステリックに遺伝子発現が誘導される条件は、１０ｍｏｉアデノウイルス、１０μＭテオフィリン、１０μＭ ＧＣＶを処理した場合である。
【０１０５】
３）Ｃａｐａｎ−１細胞（ｈＴＥＲＴ＋）におけるテオフィリン依存性細胞 死の誘導
Ａｄ−ＴｈｅｏＲｉｂ−ＴＫが果たして標的特異的に且つテオフィリン依存的にトランスジーン発現を誘導するかを観察するために、ウイルス処理し、ＧＣＶと調節化合物を処理した後、ＭＴＴ分析によって膵臓癌細胞としてのＣａｐａｎ−１細胞における細胞生存率も観察し、その結果を図１７に示した。
図１７を参照すると、ＨＴ−２９、ＨｅｐＧ２細胞と同様に、Ａｄ−ＴＫおよびＡｄ−Ｒｉｂ−ＴＫの場合、ＧＣＶ濃度が増加すると同時にアデノウイルス濃度が増加しながら細胞生存率が減少するが、化学物質の濃度には影響されないことが観察された。これに対し、Ａｄ−ＬａｃＺの場合はいずれの場合でも細胞生存率に影響を及ぼさなかった。注目すべき点は、アロステリックリボザイムであるＡｄ−ＴｈｅｏＲｉｂ−ＴＫを感染させた場合、カフェイン処理によってはＧＣＶ、ウイルスおよび化学物質の濃度を増加させても細胞生存率に影響を及ぼさなかったが、テオフィリンを処理した場合には、陽性対照群と同様に、ウイルス濃度およびＧＣＶ濃度に比例するように細胞生存率が減少した。また、テオフィリン濃度が増加すると、それにより細胞生存率も一緒に減少することが観察された。これは、ｈＴＥＲＴ＋であるＨＴ−２９、ＨｅｐＧ２以外にも、Ｃａｐａｎ−１細胞においても、Ａｄ−ＴｈｅｏＲｉｂ−ＴＫはテオフィリンによってその活性がアロステリックに調節されるので、テオフィリンを処理すればトランスジーン発現が誘導されることにより、癌細胞の細胞死が誘発されたことを示唆する。最もアロステリックに遺伝子発現が誘導される条件は、１００ｍｏｉアデノウイルス、５００μＭテオフィリン、５０μＭ ＧＣＶを処理した場合である。
【０１０６】
４）ＩＭＲ９０細胞（ｈＴＥＲＴ−）におけるテオフィリン依存性細胞死誘導の観察
ｈＴＥＲＴ＋細胞でＡｄ−ＴｈｅｏＲｉｂ−ＴＫ活性がテオフィリン依存的に調節されることが標的特異的であるかを観察するために、ｈＴＥＲＴ−であるＩＭＲ９０細胞におけるウイルス感染後の細胞生存率を観察し、その結果を図１８に示した。
図１８を参照すると、Ａｄ−ＴＫの場合、ウイルスおよびＧＣＶの濃度に比例するように細胞生存率が減少し、このような現象が化学物質の濃度とは関係ないことを観察した。ところが、リボザイムを発現するＡｄ−Ｒｉｂ−ＴＫおよびアロステリックなＡｄ−ＴｈｅｏＲｉｂ−ＴＫの場合は、ウイルス、ＧＣＶおよび化学物質の濃度と関係なくその濃度を増加させても細胞生存率には影響を及ぼすことができなかった。これは、Ａｄ−ＴｈｅｏＲｉｂ−ＴＫの場合、外部化合物によってその活性を人為的に調節することができるうえ、非常に標的特異的にトランスジーンを誘発することができることを示唆する。
【０１０７】
実施例６：アロステリックリボザイム発現アデノウイルス性ベクターによるテオフィリン依存性細胞内トランス−スプライシング反応の調節
テオフィリン依存性トランスジーン誘導が果たして細胞内トランス−スプライシング反応のアロステリック効果によって誘発されるかを検証するために、テオフィリンアプタマーが付着しているリボザイム発現アデノウイルス性ベクター（１００ｍｏｉ）をＨＴ−２９細胞に感染させた後、前記実験で構築したアロステリック条件である０．１ｍＭテオフィリンまたは非対象化合物としてのカフェインを同一の濃度で処理した後、細胞内トランス−スプライシング反応産物の存在有無を観察した。ＧＡＰＤＨ ＲＮＡ発現度を観察して内部対照群として用いた。ＲＴ−ＰＣＲ産物をアガロースゲルで分析し、その結果を図１９に示した。
【０１０８】
図１９を参照すると、予想とおり、陰性対照群であるＡｄ−ＬａｃＺの場合、低分子化合物処理と関係なく、いずれのトランス−スプライシング産物の生成が観察されなかった。これに対し、Ａｄ−ＴｈｅｏＲｉｂ−ＴＫ（Ａｄ−Ｔｈｅｏ−Ｒｉｂ２ＡＳ−ＴＫ）をｈＴＥＲＴ発現癌細胞としてのＨＴ−２９細胞に導入した後、カフェイン処理の際にはトランス−スプライシング産物が殆ど形成されなかったが、ＭＴＴ分析で観察されたように０．１ｍＭテオフィリン処理の際に４２９ｎｔの予想されたトランス−スプライシング産物が形成された。このようなトランス−スプライシング産物をクローニングし、シークエシングした結果、予想とおり、ｈＴＥＲＴの＋２１部位がスプライシングされた産物であることを観察した。これに対し、このようなトランス−スプライシング産物は、同一条件の下でｈＴＥＲＴを発現しないＩＭＲ９０細胞では形成されなかった。これは、本リボザイムが標的ＲＮＡの存在時にのみトランス−スプライシング機能を行うことができることを確認する結果である。このようなテオフィリン依存的トランス−スプライシング産物が、ＲＮＡ抽出過程中に誘発されるインビトロトランス−スプライシング反応ではなく、細胞内におけるトランス−スプライシング反応の結果であることを検証するために、ｍｏｃｋトランスフェクションしたＨＴ−２９細胞と、Ａｄ ＴｈｅｏＲｉｂ−ＴＫの導入後にテオフィリンを処理したＩＭＲ９０細胞（ｈＴＥＲＴネガティブ）とを混合し、しかる後に、ＲＮＡを抽出してＲＴ ＰＣＲ反応を行った（ｍｉｘ）。その結果、予想されたトランス−スプライシング産物が発見されないことからみて、テオフィリン存在の際にＡｄ−ＴｈｅｏＲｉｂ−ＴＫが導入されたＨＴ−２９細胞でのみ測定されたトランス−スプラシング産物および細胞死は、細胞内におけるテオフィリン依存的で標的ＲＮＡ特異的なトランス−スプライシング反応によるものであることが分かった。
ＨＴ−２９細胞におけるトランス−スプライシング反応産物の量を相対的に比較するために、ＲＴの後、実時間ＰＣＲを行った。Ｔ／Ｓ ＰＣＲ産物の量をＧＡＰＤＨのＰＣＲ産物の量を用いて補正した後、グラフで示した（図２０）。
【０１０９】
図２０を参照すると、陰性対照群であるＡｄ−ＬａｃＺの場合、低分子化合物処理と関係なくいずれのＴ／Ｓ産物の生成も観察されなかった。これに対し、Ａｄ−ＴｈｅｏＲｉｂ−ＴＫを細胞に導入した後でＰＢＳを処理した場合、Ｔ／Ｓ産物が殆ど生成されず、カフェインを処理した場合は、ＰＢＳ処理した場合より反応産物が若干増加したが、テオフィリン処理の場合に比べて７８％その生成物が著しく減少した。これに対し、Ａｄ−ＴｈｅｏＲｉｂ−ＴＫを細胞に導入した後でテオフィリンを処理した場合には、Ａｄ−Ｒｉｂ−ＴＫによって形成されるトランス−スプライシング産物と同様に効果的にトランス−スプライシング反応が誘発された。このような結果は、アロステリックリボザイムによって誘発されたテオフィリン依存的標的特異的な細胞死の誘導がテオフィリンによる標的特異的なトランス−スプライシング反応の活性化に起因することを示唆する。
【産業上の利用可能性】
【０１１０】
上述したように、本発明は、テオフィリンによってその活性を調節することが可能なトランス−スプライシングリボザイムをモデルシステムとして構築することにより、疾患特異ＲＮＡを標的化して遺伝子発現を誘導することが可能な、非常に特異的な遺伝子治療技術であるトランス−スプライシングリボザイムと、外部因子によって遺伝子発現を調節することが可能な可逆的遺伝子技術との組み合わせにおいて実験的土台を提供する。本発明に係るアロステリックトランススプライシンググループＩリボザイムは、多様な難治性疾患に使用できる汎用的遺伝子治療剤への活用が可能であり、診断剤の開発またはリボザイムの活性メカニズム研究のための道具としての活用も可能であろう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランス−スプライシングリボザイムのＰ６とＰ８ドメインのそれぞれまたは両方ともにテオフィリンアプタマーとコミュニケーションモジュールを結合させたアプタザイム、Ｐ９ドメインの一部が除去されたトランス−スプライシングリボザイムのＰ６とＰ８ドメインのそれぞれまたは両方ともにテオフィリンアプタマーとコミュニケーションモジュールを結合させたアプタザイム、またはＰ９ドメインの一部が変異されたトランス−スプライシングリボザイムのＰ６とＰ８ドメインのそれぞれまたは両方ともにテオフィリンアプタマーとコミュニケーションモジュールを結合させたアプタザイムを製作する段階と、
テオフィリンとカフェインを用いてインビトロで前記製作されたアプタザイムのアロステリック調節を比較してテオフィリン依存性トランス−スプライシング有無を確認する段階と、
哺乳類の細胞で０．１〜１ｍＭのテオフィリン存在の下にルシフェラーゼ活性によってテオフィリン依存性トランスジーンの発現有無を確認する段階とを含むことを特徴とする、テオフィリンによって活性が調節されるアロステリックトランス−スプラインググループＩリボザイムの選別方法。
【請求項２】
前記アプタザイムを製作する段階で、ｈＴＥＲＴ ＲＮＡに対するアンチセンス１００〜３００ｎｔが付着しているアプタザイムをさらに製作することを特徴とする、請求項１に記載の選別方法。
【請求項３】
前記トランス−スプライシングリボザイムの変異されたＰ９ドメインの塩基配列は「ＣＧＡＡＡＧＧＧＡＧ」であることを特徴とする、請求項１に記載の選別方法。
【請求項４】
ｈＴＥＲＴ(human Telomerase reverse transcriptase)ＲＮＡを特異的に標的化し、３’エキソンには蛍由来ルシフェラーゼ受容体遺伝子を含有することを特徴とする、テオフィリンによってＲＮＡ置換活性が調節されるアロステリックトランス−スプラインググループＩリボザイム。
【請求項５】
前記リボザイムは、配列番号１で表されるＡＳ３００ ΔＰ９ ８Ｔ、配列番号２で表されるＡＳ１００ Ｍｕ−Ｐ９ ６Ｔ８Ｔ、または配列番号３で表されるＡＳ３００ Ｗ−Ｐ９ ６Ｔ８Ｔであることを特徴とする、請求項４に記載のリボザイム。
【請求項６】
請求項４に記載のリボザイムをエンコードする発現ベクター。
【請求項７】
前記発現ベクターは、配列番号４で表されるｐＳＥＡＰ ＡＳ３００ Ｄｅｌｔａ Ｐ９ ８Ｔ−Ｌｕｃｉ、配列番号５で表されるｐＳＥＡＰ ＡＳ１００ Ｍｕ−Ｐ９ ６Ｔ８Ｔ−Ｌｕｃｉ、または配列番号６で表されるｐＳＥＡＰ ＡＳ３００ Ｗ−Ｐ９ ６Ｔ８Ｔ−Ｌｕｃｉであることを特徴とする、請求項６に記載の発現ベクター。
【請求項８】
ｈＴＥＲＴ(human Telomerase reverse transcriptase)ＲＮＡを特異的に標的化し、３’エキソンにはＨＳＶ−ＴＫ(herpes simple virus thymidine kinase)細胞死遺伝子を含有することを特徴とする、テオフィリンによってＲＮＡ置換活性が調節されるアロステリックトランス−スプラインググループＩリボザイム。
【請求項９】
前記リボザイムは、配列番号７で表されるＡＳ３００ Ｗ−Ｐ９ ６Ｔ８Ｔ−ＴＫであることを特徴とする、請求項８に記載のリボザイム。
【請求項１０】
請求項８に記載のリボザイムを哺乳類細胞で発現する発現ベクター。
【請求項１１】
前記発現ベクターは、配列番号８で表されるｐＡｖＱ−Ｔｈｅｏ−Ｒｉｂ２１ＡＳ−ＴＫ（ＫＣＣＭ１０９３５Ｐ）であることを特徴とする、請求項１０に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
請求項４または請求項８に記載のリボザイムおよびテオフィリンを含むことを特徴とする、遺伝子発現誘導剤。
【請求項１３】
請求項６または請求項１０に記載の発現ベクターおよびテオフィリンを含むことを特徴とする、遺伝子発現誘導剤。
【請求項１４】
請求項４または請求項８に記載のリボザイムおよびテオフィリンを含むことを特徴とする、癌診断剤。
【請求項１５】
請求項６または請求項１０に記載の発現ベクターおよびテオフィリンを含むことを特徴とする、癌診断剤。
【請求項１６】
請求項４または請求項８に記載のリボザイムおよびテオフィリンを含むことを特徴とする、 遺伝子治療剤。
【請求項１７】
請求項６または請求項１０に記載の発現ベクターおよびテオフィリンを含むことを特徴とする、 遺伝子治療剤 。
【請求項１】
トランス−スプライシングリボザイムのＰ６とＰ８ドメインのそれぞれまたは両方ともにテオフィリンアプタマーとコミュニケーションモジュールを結合させたアプタザイム、Ｐ９ドメインの一部が除去されたトランス−スプライシングリボザイムのＰ６とＰ８ドメインのそれぞれまたは両方ともにテオフィリンアプタマーとコミュニケーションモジュールを結合させたアプタザイム、またはＰ９ドメインの一部が変異されたトランス−スプライシングリボザイムのＰ６とＰ８ドメインのそれぞれまたは両方ともにテオフィリンアプタマーとコミュニケーションモジュールを結合させたアプタザイムを製作する段階と、
テオフィリンとカフェインを用いてインビトロで前記製作されたアプタザイムのアロステリック調節を比較してテオフィリン依存性トランス−スプライシング有無を確認する段階と、
哺乳類の細胞で０．１〜１ｍＭのテオフィリン存在の下にルシフェラーゼ活性によってテオフィリン依存性トランスジーンの発現有無を確認する段階とを含むことを特徴とする、テオフィリンによって活性が調節されるアロステリックトランス−スプラインググループＩリボザイムの選別方法。
【請求項２】
前記アプタザイムを製作する段階で、ｈＴＥＲＴ ＲＮＡに対するアンチセンス１００〜３００ｎｔが付着しているアプタザイムをさらに製作することを特徴とする、請求項１に記載の選別方法。
【請求項３】
前記トランス−スプライシングリボザイムの変異されたＰ９ドメインの塩基配列は「ＣＧＡＡＡＧＧＧＡＧ」であることを特徴とする、請求項１に記載の選別方法。
【請求項４】
ｈＴＥＲＴ(human Telomerase reverse transcriptase)ＲＮＡを特異的に標的化し、３’エキソンには蛍由来ルシフェラーゼ受容体遺伝子を含有することを特徴とする、テオフィリンによってＲＮＡ置換活性が調節されるアロステリックトランス−スプラインググループＩリボザイム。
【請求項５】
前記リボザイムは、配列番号１で表されるＡＳ３００ ΔＰ９ ８Ｔ、配列番号２で表されるＡＳ１００ Ｍｕ−Ｐ９ ６Ｔ８Ｔ、または配列番号３で表されるＡＳ３００ Ｗ−Ｐ９ ６Ｔ８Ｔであることを特徴とする、請求項４に記載のリボザイム。
【請求項６】
請求項４に記載のリボザイムをエンコードする発現ベクター。
【請求項７】
前記発現ベクターは、配列番号４で表されるｐＳＥＡＰ ＡＳ３００ Ｄｅｌｔａ Ｐ９ ８Ｔ−Ｌｕｃｉ、配列番号５で表されるｐＳＥＡＰ ＡＳ１００ Ｍｕ−Ｐ９ ６Ｔ８Ｔ−Ｌｕｃｉ、または配列番号６で表されるｐＳＥＡＰ ＡＳ３００ Ｗ−Ｐ９ ６Ｔ８Ｔ−Ｌｕｃｉであることを特徴とする、請求項６に記載の発現ベクター。
【請求項８】
ｈＴＥＲＴ(human Telomerase reverse transcriptase)ＲＮＡを特異的に標的化し、３’エキソンにはＨＳＶ−ＴＫ(herpes simple virus thymidine kinase)細胞死遺伝子を含有することを特徴とする、テオフィリンによってＲＮＡ置換活性が調節されるアロステリックトランス−スプラインググループＩリボザイム。
【請求項９】
前記リボザイムは、配列番号７で表されるＡＳ３００ Ｗ−Ｐ９ ６Ｔ８Ｔ−ＴＫであることを特徴とする、請求項８に記載のリボザイム。
【請求項１０】
請求項８に記載のリボザイムを哺乳類細胞で発現する発現ベクター。
【請求項１１】
前記発現ベクターは、配列番号８で表されるｐＡｖＱ−Ｔｈｅｏ−Ｒｉｂ２１ＡＳ−ＴＫ（ＫＣＣＭ１０９３５Ｐ）であることを特徴とする、請求項１０に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
請求項４または請求項８に記載のリボザイムおよびテオフィリンを含むことを特徴とする、遺伝子発現誘導剤。
【請求項１３】
請求項６または請求項１０に記載の発現ベクターおよびテオフィリンを含むことを特徴とする、遺伝子発現誘導剤。
【請求項１４】
請求項４または請求項８に記載のリボザイムおよびテオフィリンを含むことを特徴とする、癌診断剤。
【請求項１５】
請求項６または請求項１０に記載の発現ベクターおよびテオフィリンを含むことを特徴とする、癌診断剤。
【請求項１６】
請求項４または請求項８に記載のリボザイムおよびテオフィリンを含むことを特徴とする、 遺伝子治療剤。
【請求項１７】
請求項６または請求項１０に記載の発現ベクターおよびテオフィリンを含むことを特徴とする、 遺伝子治療剤 。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【公表番号】特表２０１０−５２２５７２（Ｐ２０１０−５２２５７２Ａ）
【公表日】平成２２年７月８日（２０１０．７．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５０６０９５（Ｐ２０１０−５０６０９５）
【出願日】平成２０年１２月１６日（２００８．１２．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００８／００７４４０
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１１９９６５
【国際公開日】平成２１年１０月１日（２００９．１０．１）
【出願人】（５０９０８３１５３）インダストリー−アカデミック コーオペレーション ファウンデーション、ダンコック ユニバーシティー (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年７月８日（２０１０．７．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月１６日（２００８．１２．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００８／００７４４０
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１１９９６５
【国際公開日】平成２１年１０月１日（２００９．１０．１）
【出願人】（５０９０８３１５３）インダストリー−アカデミック コーオペレーション ファウンデーション、ダンコック ユニバーシティー (1)
【Ｆターム（参考）】
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