ヒアルロン酸の生産
レンサ球菌細胞中の一つ又はそれ以上の酵素の活性を改変すること及び／又は利用できる基質又は基質前駆物質の量を改変することを含んでいる、ヒアルロン酸を産生する方法が記載されている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はレンサ球菌種（Streptococcus sp.）中でヒアルロン酸を生産する方法、更にこのような方法で生産されたヒアルロン酸にも関する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００２】
ヒアルロン酸（ＨＡ）は、β−１−３及びβ−１−４グリコシド結合で交互に連結しているグルクロン酸及びＮ−アセチルグルコサミンの二糖２，０００〜２５，０００個からなる、一様な繰り返しの、直鎖グリコサミノグリカン：［β−１，４−グルクロン酸−β−１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン］ｎ：である。
【０００３】
その様々な天然の機能を反映して、ＨＡは医薬、化粧品及び特定食品において多くの適用が見出されている。多くの適用において、高分子量が望ましい特性であって、高分子量（ＭＷ）ＨＡを生産するために異なった取り組みが採用されてきた。
【０００４】
高ＭＷ ＨＡは鶏のトサカから丁寧な抽出によって得ることができる。鶏のトサカにあるＨＡは非常に高い値、例えば１，２００万〜１，４００万（１２〜１４Ｍ）ダルトン（Ｄａ）にまで達することがある。抽出方法次第で、３〜５ＭＤａの最終生成物が得られる（米国特許第４，１４１，９７３号）。医薬及び化粧品において動物由来製品の使用を控えることが増加して、微生物によるＨＡ産生への転換が見られている。Ｃ群レンサ球菌、特にストレプトコッカス・エクイ亜種エクイ（Streptococcus equi subsp. equi）及びストレプトコッカス・エクイ亜種ズーエピデミカス（Streptococcus equi subsp. zooepidemicus）、の発酵を経由する微生物によるＨＡの生産は、１９８０年代の初頭から工業的に実施されている。しかしながら、微生物から得られるＨＡは、鶏のトサカから得られ得るＨＡより分子量が小さい（通常、０．５〜２ＭＤａ）。
【０００５】
ある適用では、分子量を増大するために化学的架橋が利用されている（例えば、米国特許第４，５８２，８６５号、米国特許第６，９０３，１９９号、米国特許第７，１２５，８６０号、及び米国特許第６，７０３，４４４号）。別の適用では、特に眼科の適用では、架橋結合が好ましくなく、菌株工学（strain engineering）が高ＭＷ ＨＡを実現化するための唯一の手段である。
【０００６】
ＨＡは、病原性ランスフィールド分類Ａ群及びＣ群レンサ球菌によって細胞外皮膜として合成される。顕微鏡下では、これらの胞子非形成且つ非運動性細菌は、多数の細胞外皮膜に取り囲まれて典型的に対に又は鎖状に配置されている球状又は卵形に見える。羊血液寒天プレート上では、これらのβ−溶血性細菌のコロニーは、細菌コロニーを取り囲むムコイド又は粘性透明層として確認されるＨＡと透明帯を生じる。このＨＡ皮膜は、恐らくＨＡ皮膜を外部物質として認識しない高等生物の免疫系としてのステルス機能を細菌に提供している、これらレンサ球菌の病原性因子である。
【０００７】
ＨＡは、ＨＡシンターゼ（ＥＣ２．４．１．２１２）による触媒作用を受ける反応において、２つの活性化グリコシルドナー、ＵＤＰ−グルクロン酸（ＵＤＰ−ＧＵＡ）及びＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＵＤＰ−ＮＡＧ）の重合によって生成する（図１）。２つの前駆体はグルコース−６−リン酸から枝分かれする２つの経路で合成される。
第一の経路は、α−ホスホグルコムターゼ（ＥＣ５．４．２．２）によるグルコース−６−リン酸のグルコース−１−リン酸への変換から出発する。ＵＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ（ＥＣ２．７．７．９）は、ヌクレオチド糖ＵＤＰ−グルコースを生成するＵＴＰとグルコース−１−リン酸の反応を触媒する。次いで、ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２２）の作用によって、ＵＤＰ−グルコースの１級アルコール基を特異的に酸化することによってＵＤＰ−ＧＵＡが得られる。
アミノ糖の生成に関する第二の経路は、ホスホグルコイソメラーゼ（ＥＣ５．３．１．９）の触媒作用を受けるグルコース−６−リン酸のフルクトース−６−リン酸への転換から出発する。アミドトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．１６）によるグルタミンからフルクトース−６−リン酸へのアミノ基の転移はグルコサミン−６−リン酸を生じる。ムターゼ（ＥＣ５．４．２．１０）によるリン酸基の転位はグルコサミン−６−リン酸からグルコサミン−１−リン酸を生成する。アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．４）によるアセチル基の転移はＮ−アセチルグルコサミン−６−リン酸を形成する。最後に、ピロホスホリラーゼ（ＥＣ２．７．７．２３）をＵＤＰに付加してＵＤＰ−ＮＡＧが得られる。
【０００８】
ＨＡ産生におけるそれらの役割に加えて、この２つの経路は細胞壁成分の生合成に必要である。ＵＤＰ−ＧＵＡ経路における中間体は細胞壁多糖類及びテイコ酸の生合成に用いられる。ＵＤＰ−ＮＡＧはリポ多糖類、プロテオグリカン、更にペプチドグリカンにおけるアミノ糖源である。ペプチドグリカン合成の第一工程は、ＵＤＰ−ＮＡＧとホスホエノールピルベートを結合してＵＤＰ−Ｎ−アセチル−３−Ｏ−（１−カルボキシビニル）−グルコサミンを形成する、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン １−カルボキシビニルトランスフェラーゼ（ＵＤＰ−ＮＡＧ−ＣＶＴ）（ＥＣ２．５．１．７）によって触媒される。
【０００９】
ＨＡシンターゼはＨＡ ＭＷを調節するのに重要な役割を演じて、部位特異的突然変異誘発（site directed mutagenesis）はＨＡ ＭＷを修正するために用いられていた（Kumari, K., et al. (2006). "Mutation of Two intramembrane Polar Residues Conserved within the Hyaluronan Synthase Family Alters Hyaluronan Product Size." J. Biol. Chem. 281(17): 11755-11760）。菌株の選択に続く無作為の突然変異生成はＨＡ ＭＷを含む菌株特性の改善にも用いられている（Kim, J.-H., et al. (1996). "Selection of a Streptococcus equi mutant and optimization of culture conditions for the production of high molecular weight hyaluronic acid." Enzy. Microbial Tech. 19(6): 440-445; Lee, M.S., et al. (1999). "Construction and analysis of library for random insertional mutagenesis in Streptococcus pneumoniae: Use for recovery of mutants defective in genetic transformation and for identification of essnetial genes." Appl. Environ. Microbiol. 65(5): 1883-1890: 米国特許第５，４９６，７２６号；米国特許第７，３２３，３２９号）。
【００１０】
ＨＡシンターゼ（ＨａｓＡ）に加えて高いＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ活性（ＨａｓＢ）が高いＨＡ収率を達成するために必要であるということを幾つかの研究が明らかにしている。大腸菌（Escherichia coli.）、枯草菌（Bacillus subtilis）又は乳酸レンサ球菌（Lactococcus lactis）のような異種宿主中でのＨａｓＡの発現は、さらにＨａｓＢが過剰発現されなければ、殆ど若しくは全くＨＡを生じない（DeAngelis P. "polypeptide, or a variant, analogue or fragment thereof", L., et al. (1993) "Molecular cloning, identification, and sequence of the hyaluronan synthase gene from group A Streptococcus pyogenes." J. Biol. Chem. 268:19181-19184; 国際特許出願公開第ＷＯ０３／０５４１６３号公報；Chien L. J., Lee C. K. (2007) "Hyaluronic acid production by recombinant Lactococcus lactis." Appl. Microbiol. Biotechnol. 77:339-346）。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
第１の態様では、本発明はヒアルロン酸を生産する方法を提供し、方法は培養培地中でレンサ球菌細胞を生育させること（ここで細胞はヒアルロン酸合成に必要な酵素を発現する、ここで細胞中にある、ホスホグルコイソメラーゼ、Ｄ−フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ、ホスホグルコサミンムターゼ、グルコサミン−１−リン酸アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸ピロホスホリラーゼ、グルコサミン−６−リン酸アセチルトランスフェラーゼ、及びホスホアセチルグルコサミンムターゼから選ばれる１つ又はそれ以上の酵素の活性又は量を増大させる）；及び任意にこの細胞により産生されたヒアルロン酸を回収することを含有してなる。
【００１２】
第２の態様では、本発明はヒアルロン酸を生産する方法を提供し、方法はヒアルロン酸の合成に必要な酵素を発現するレンサ球菌細胞からヒアルロン酸を回収することを含有してなり、ここで細胞中にある、ホスホグルコイソメラーゼ、Ｄ−フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ、ホスホグルコサミンムターゼ、グルコサミン−１−リン酸アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸ピロホスホリラーゼ、グルコサミン−６−リン酸アセチルトランスフェラーゼ、及びホスホアセチルグルコサミンムターゼから選ばれる１つ又はそれ以上の酵素の活性又は量を増大させる。
【００１３】
第３の態様では、本発明はヒアルロン酸を生産する方法を提供し、方法は培養培地中でレンサ球菌細胞を生育させること（ここで細胞はヒアルロン酸合成に必要な酵素を発現する、ここで細胞中にある、ホスホグルコイソメラーゼ、Ｄ−フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ、ホスホグルコサミンムターゼ、グルコサミン−１−リン酸アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸ピロホスホリラーゼ、グルコサミン−６−リン酸アセチルトランスフェラーゼ、及びホスホアセチルグルコサミンムターゼから選ばれる１つ又はそれ以上の酵素の活性又は量を増大させるように細胞を改変又は処理してある）；及び任意にこの細胞により産生されたヒアルロン酸を回収することを含有してなる。
【００１４】
第４の態様では、本発明はヒアルロン酸を生産する方法を提供し、方法はヒアルロン酸の合成に必要な酵素を発現するレンサ球菌細胞からヒアルロン酸を回収することを含有してなり、ここで細胞中にある、ホスホグルコイソメラーゼ、Ｄ−フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ、ホスホグルコサミンムターゼ、グルコサミン−１−リン酸アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸ピロホスホリラーゼ、グルコサミン−６−リン酸アセチルトランスフェラーゼ、及びホスホアセチルグルコサミンムターゼから選ばれる１つ又はそれ以上の酵素の活性又は量を増大させるように、細胞を改変又は処理してある。
【００１５】
第５の態様では、本発明はヒアルロン酸を生産する方法を提供し、方法は培養培地中でレンサ球菌細胞を生育させること（ここで細胞はヒアルロン酸合成に必要な酵素を発現して、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン及びグルコサミンから選ばれる１つ又はそれ以上の基質をもたらす）；及び任意にこの細胞により産生されたヒアルロン酸を回収することを含有してなる。
【００１６】
第６の態様では、本発明はヒアルロン酸を生産する方法を提供し、方法はヒアルロン酸の合成に必要な酵素を発現するレンサ球菌細胞からヒアルロン酸を回収することを含有してなり、ここでＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン及びグルコサミンから選ばれる１つ又はそれ以上の基質がもたらされる。
【００１７】
第７の態様では、本発明はヒアルロン酸を生産する方法を提供し、方法は培養培地中でレンサ球菌細胞を生育させること（ここで細胞はヒアルロン酸合成に必要な酵素を発現して、細胞中にあるＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン及びグルコサミンから選ばれる１つ又はそれ以上の基質の量を増大するように改変又は処理されている）；及び任意にこの細胞により産生されたヒアルロン酸を回収することを含有してなる。
【００１８】
第８の態様では、本発明はヒアルロン酸を生産する方法を提供し、方法はヒアルロン酸の合成に必要な酵素を発現するレンサ球菌細胞からヒアルロン酸を回収することを含有してなり、ここで細胞は細胞中のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン及びグルコサミンから選ばれる１つ又はそれ以上の基質の量を増大するように改変又は処理されている。
【００１９】
第９の態様では、本発明はヒアルロン酸を生産する方法を提供し、方法は培養培地中でレンサ球菌細胞を生育させること（ここで細胞はヒアルロン酸合成に必要な酵素を発現して、細胞中にあるＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン １−カルボキシビニルトランスフェラーゼ及びウンデカプレニルジホスホ−ムラモイルペンタペプチド ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼから選ばれる１つ又はそれ以上の酵素の活性又は量が減少又は失効されている）；及び任意にこの細胞により産生されたヒアルロン酸を回収することを含有してなる。
【００２０】
第１０の態様では、本発明はヒアルロン酸を生産する方法を提供し、方法はヒアルロン酸の合成に必要な酵素を発現するレンサ球菌細胞からヒアルロン酸を回収することを含有してなり、細胞中にあるＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン １−カルボキシビニルトランスフェラーゼ及びウンデカプレニルジホスホ−ムラモイルペンタペプチド ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼから選ばれる１つ又はそれ以上の酵素の活性又は量が減少又は失効している。
【００２１】
第１１の態様では、本発明はヒアルロン酸を生産する方法を提供し、方法は培養培地中でレンサ球菌細胞を生育させること（ここで細胞はヒアルロン酸合成に必要な酵素を発現して、細胞中にあるＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン １−カルボキシビニルトランスフェラーゼ及びウンデカプレニルジホスホ−ムラモイルペンタペプチド ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼから選ばれる１つ又はそれ以上の酵素の活性又は量が減少又は失効するように細胞が改変又は処理されている）；及び任意にこの細胞により産生されたヒアルロン酸を回収することを含有してなる。
【００２２】
第１２の態様では、本発明はヒアルロン酸を生産する方法を提供し、方法はヒアルロン酸の合成に必要な酵素を発現するレンサ球菌細胞からヒアルロン酸を回収することを含有してなり、細胞中にあるＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン １−カルボキシビニルトランスフェラーゼ及びウンデカプレニルジホスホ−ムラモイルペンタペプチド ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼから選ばれる１つ又はそれ以上の酵素の活性又は量が減少又は失効している。
【００２３】
第１３の態様では、本発明は更に本発明の方法によって得られるか又は得られうるヒアルロン酸を提供する。このヒアルロン酸は少なくとも３又は３．５ＭＤａの平均分子量を有し得る。このヒアルロン酸は実質的に架橋されていなくてもよい。
【００２４】
第１４の態様では、本発明はヒアルロン酸を合成する酵素を含有しているレンサ球菌細胞を提供し、この細胞はホスホグルコイソメラーゼ、Ｄ−フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ、ホスホグルコサミンムターゼ、グルコサミン−１−リン酸アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸ピロホスホリラーゼ、グルコサミン−６−リン酸アセチルトランスフェラーゼ、及びホスホアセチルグルコサミンムターゼから選ばれる１つ又はそれ以上の酵素を過剰に発現するように遺伝子的に改変されている。
【００２５】
第１５の態様では、本発明はヒアルロン酸を合成する酵素を含有しているレンサ球菌細胞を提供し、この細胞はＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン １−カルボキシビニルトランスフェラーゼ及びウンデカプレニルジホスホ−ムラモイルペンタペプチド ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼから選ばれる１つ又はそれ以上の酵素をより少なく発現する、又は発現しない又は下方調節された活性で発現するように遺伝子的に改変されている。
【００２６】
第１６の態様では、本発明は、本発明のヒアルロン酸及び薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤を含有している医薬組成物を提供する。
【００２７】
第１７の態様では、本発明は、本発明のヒアルロン酸及び美容上許容される担体、賦形剤又は希釈剤を含有している化粧品組成物を提供する。
【００２８】
第１７の態様では、本発明は、本発明のヒアルロン酸を含有している食品若しくは食品添加物を提供する。
【００２９】
（定義）
別に定義しない限り、本明細書で用いられる全ての技術及び科学用語は、当業者（例えば、細胞生物学、化学、分子生物学及び細胞培養における）によって普通に理解されているようなものと同じ意味を有している。分子及び生化学的方法で用いられている標準的な技術は、Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 3rd ed. (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 及び Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th Ed, John Wiley & Sons, Inc. -及び Current Protocols in Molecular Biology と言う標題の完全版に見出すことができる。
【００３０】
本明細書を通して用語「含有する（comprise)」、又は「含有する（comprises)」又は「含有している（comprising）」のような変形は、規定される成分、整数又は手順、若しくは成分、整数又は手順の群の包含を暗示しているが、その他の成分、整数又は手順、若しくは成分、整数又は手順の群を除外していないと理解すべきである。
【００３１】
本明細書を通して、別に定義しない限り、数値への言及は、「約」その数値、を意味すると取るべきである。用語「約」は、値は値を測定するために用いられる装置及び方法に対する誤差の固有のばらつき、又は研究課題に存在するばらつきを含んでいることを示すために用いられる。
【００３２】
本明細書中での先行技術への言及は、先行技術がオーストラリアにおいて周知の一般知識の一部を形成しているという認識又は何らかの示唆ではなく、そしてそのように取ってはならない。
本発明をこれから、例示のみを目的として、以下の図面を参照して記載する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、ヒアルロン酸の生産をもたらす生合成経路の概要フローチャートを示す。
【図２】図２は、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン １−カルボキシビニルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．５．１．７）（ＵＰＤ−ＮＡＧ−ＣＶＴ）の位置を示しているＳ．ズーエピデミカス（S. zooepidemicus）（ＡＴＣＣ３５２４６）の２Ｄゲルを示す。ヒアルロニダーゼを用いてタンパク質を採取してＨＡ皮膜を除去した。ｐＨ勾配（４〜７）及び２４ｃｍの１２％ポリアクリルアミドゲルを用いてタンパク質を分離した。タンパク質をｃｙ３で標識化して、タイフーンスキャナー（typhoon scanner）を用いて可視化した。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ及びＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ／ＴＯＦを用いてタンパク質のスポットを確認した。
【図３Ａ】図３は、嫌気性条件下における野生型Ｓ．ズーエピデミカス（ＡＴＣＣ３５２４６）について（図Ａ）及びｇlｍＵ及びｐｇｉをコードするｐＮＺプラスミドを保有しているＳ．ズーエピデミカスについて（図Ｂ）のフェドバッチ培養におけるＨＡの産生の定常期を示す。標準培養物はグルコースを消費するまで発酵し更に３０分放置して必須アミン酸を枯渇した。グルコースの摂取によって、ＨＡ産生が再開されてバイオマスがコンスタントに残存した。
【図３Ｂ】図３は、嫌気性条件下における野生型Ｓ．ズーエピデミカス（ＡＴＣＣ３５２４６）について（図Ａ）及びｇｌｍＵ及びｐｇｉをコードするｐＮＺプラスミドを保有しているＳ．ズーエピデミカスについて（図Ｂ）のフェドバッチ培養におけるＨＡの産生の定常期を示す。標準培養物はグルコースを消費するまで発酵し更に３０分放置して必須アミン酸を枯渇した。グルコースの摂取によって、ＨＡ産生が再開されてバイオマスがコンスタントに残存した。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明者らは、自然に高収率でＨＡを産生するレンサ球菌においてＨＡ前駆体の生合成に関わる過剰発現酵素の効果を検討した。増強された発現はＨＡの収率に対して限られた効果を有しているのに対して、驚くことに、ＨＡ前駆体の生合成に関わる特定酵素の増強された発現が産生されるＨＡの分子量の増大をもたらすということを本発明者らは見出した。
【００３５】
ＵＤＰ−ＮＡＧ経路に関わる酵素（例えば、ホスホグルコイソメラーゼ、Ｄ−フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ、グルコサミン−１−リン酸アセチルトランスフェラーゼ及びＮ−アセチルグルコサミン−１−リン酸ピロホスホリラーゼ）の増強されたレベルを発現するように改変された細胞は、野生型の細胞及びＨＡシンターゼ又はＵＤＰ−ＧＵＡ経路に関わる酵素（例えば、ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ及びＵＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ）を過剰発現するように改変された細胞に比べて、有意に高分子量であるＨＡを産生した。
【００３６】
本発明は更に、高いレベルのＵＤＰ−ＮＡＧを伴う細胞が分子量が増加したＨＡを産生することを確認した。このことは、野生型細胞及びＵＤＰ−ＧＵＡ経路中の遺伝子を発現する細胞に比べて、ＵＤＰ−ＮＡＧ経路中の遺伝子を過剰に発現する細胞についても言える。このことは、高レベルのＧｌｍＵ（グルコサミン−１−リン酸アセチルトラスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸ピロホスホリラーゼ）をそして、ペプチドグリカン生合成におけるＵＤＰ−ＮＡＧ依存第１段階を触媒する酵素である、ＵＤＰ−ＮＡＧ−ＣＶＴの低レベルを発現することが見出されている、空プラスミドコントロールを保有している細胞についても言える。
【００３７】
従って本発明者らは、ＨＡの分子量は、ＵＤＰ−ＮＡＧの供給を増大することによって大きくでき、これはＵＤＰ−ＮＡＧを産生する酵素の活性を増大することにより、細胞がＵＤＰ−ＮＡＧへ変換する基質で培地を補完することにより、そして／又はＵＤＰ−ＮＡＧに対してＨＡシンターゼと競合する酵素の活性を減少することによって達成できるとういう結論に達した。
【００３８】
（酵素の発現又は活性を増大する方法及び細胞）
本発明は部分的に、レンサ球菌種におけるヒアルロン酸産生の経路において多数の酵素の増大した発現／活性は、細胞によって産生された得られるヒアルロン酸の分子量（ＭＷ）の増大をもたらすという知見に基づいている。ＨＡのＭＷの増大をもたらすとして確認された特定の酵素は、ホスホグルコイソメラーゼ（ＨａｓＥ，Ｐｇｉ−ＥＣ５．３．１．９）、Ｄ−フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ（ＧｌｍＳ−ＥＣ２．６．１．１６）及びグルコサミン−１−リン酸アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸ピロホスホリラーゼ（ＨａｓＤ，ＧｌｍＵ−ＥＣ２．３．１．４及び２．７．７．２３）である。
【００３９】
従って、本発明の方法では、レンサ球菌の細胞がホスホグルコイソメラーゼ、Ｄ−フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ、ホスホグルコサミンムターゼ、グルコサミン−１−リン酸アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸ピロホスホリラーゼ、グルコサミン−６−リン酸アセチルトランスフェラーゼ、及びホスホアセチルグルコサミンムターゼから選ばれる１つ又はそれ以上の酵素の活性／発現を増大させている可能性がある。
【００４０】
ある態様では、レンサ球菌細胞は、異種遺伝子、例えば、グルコサミン−６−リン酸アセチルトランスフェラーゼ又はホスホアセチルグルコサミンムターゼをコードする真核生物遺伝子を過剰発現するように遺伝子的に改変されている。
【００４１】
細胞が少なくともホスホグルコイメラーゼの活性／発現を増大していることが好ましい。
【００４２】
一態様では、細胞はＨＡシンターゼ（ＨａｓＡ）の野生型のレベル及び活性を有している。
【００４３】
増大した発現／活性は、遺伝子的に改変されていない、そして標準的な条件下（富栄養培地（Ｍ１７Ｇ）又は２％ｗ／ｖのグルコースを補完した既知組成培地（ＣＤＭ）中、３７℃でのような）で生育した対応する野生型の株と比較して測定することができる。例えば、ムコイドＣ群ストレプトコッカス・エクイ亜種ズーエピデミカスの場合、適切な対照株はＡＴＣＣ３５２４６である。
【００４４】
一態様では、酵素の活性増大は、酵素の発現を指示する１つ又はそれ以上の核酸配列を導入することによって遺伝子的に改変された細胞によって達成される。このような配列は、エレクトロポレーションを用いて細胞にプラスミドＤＮＡを導入した後、選択培地上で形質転換細胞を選択するような、当業者に公知の各種の技術によって導入することができる。これらの異種核酸配列は、染色体外に保持することができ、若しくは相同的組み換えによって宿主細胞のゲノムに導入することができる。
【００４５】
従って、本発明は、ヒアルロン酸の合成用の酵素を含有しているレンサ球菌細胞で、その細胞がホスホグリコイソメラーゼ、Ｄ−フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ、ホスホグルコサミンムターゼ、グルコサミン−１−リン酸アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸ピロホスホリラーゼ、グルコサミン−６−リン酸アセチルトランスフェラーゼ、及びホスホアセチルグルコサミンムターゼから選ばれる１つ又はそれ以上の酵素を過剰発現するように遺伝子的に改変されている、レンサ球菌細胞を提供する。
特定の態様では、細胞は、１つ又はそれ以上の酵素をコードする１つ又はそれ以上の異種核酸配列を含有している。
別の態様では、細胞は、１つ又はそれ以上の酵素をコードするゲノム調節配列に１つ又はそれ以上の突然変異を含有していて、その突然変異は野生型細胞と比較して、１つ又はそれ以上の酵素の発現レベルの増大をもたらす。
更なる態様では、細胞は、１つ又はそれ以上の酵素のコード配列中に、増大した酵素活性をもたらす１つ又はそれ以上の突然変異を含有していてもよい。
これらの態様の組合わせも可能である。
【００４６】
上記の方法及び細胞に関連して、細胞がホスホグルコイソメラーゼ及び／又はグルコサミン−１−リン酸アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸ピロホスホリラーゼの増大した活性／発現をもたらすことが特に好ましい。
【００４７】
目的の酵素をコードしていて、適当なレンサ球菌宿主細胞において酵素の発現を指示することができる調節配列に操作可能に結合している、核酸配列は、多くの供給源から誘導することができる。現在まで４つのレンサ球菌の種からＨＡＳオペロンがクローン化されている。ｈａｓＤ／ｇｌｍＵの配列がＳ．エクイシミラス（S. equisimilus）及びＳ．エクイ亜種ズーエピデミカスに対してクローン化されている。配列は別の種からも得ることができ、例えば、枯草菌（B.subtillis）はｔｕａＤと称するｈａｓＢのホモログを有している。ＨａｓＤ／ｇｌｍＵは多数の細菌種、例えば、化膿レンサ球菌（S. pyogenes）（受入れ番号 Ｎｏ．ＹＰ＿００１１２９０２７）；大腸菌（受入れ番号 Ｎｏ．ＡＢＧ７１９０００及びＰ０ＡＣＣ７）及び枯草菌（受入れ番号 Ｎｏ．Ｐ１４１９２）に対してクローン化されている。化膿レンサ球菌、大腸菌及び枯草菌の完全ゲノムは配列が決定されて公表されている。
【００４８】
さらなる実例として、Ｓ．ズーエピデミカスのゲノムＤＮＡ由来のｈａｓＤ（ｇｌｍＵ）、ｈａｓＥ（ｐｇｉ）及びｇｌｍＭの配列を増幅するための適切なオリゴヌクレチドプライマーが、以下の実施例の欄に記載されている。
【００４９】
ある態様では、目的の１つ又はそれ以上の酵素をコードする核酸配列が、培養培地に誘導分子を添加することによって、酵素の発現を所望通りに上方調節するよう誘導可能である調節配列に操作可能に連結されている。
【００５０】
別のアプローチは、目的の酵素をコードする異種配列の発現を制御する宿主細胞の調節配列を、相同的組み換えによって、例えばプロモーター配列で改変することである。
【００５１】
更なるアプローチは、異種配列の増幅が生じ、目的の酵素をコードする異種ＤＮＡの複写数の増大をもたらし、酵素の発現及び活性の増大を引き起こすように細胞を処理することである。
【００５２】
細胞に多数の突然変異を誘発して、当該技術分野で公知の酵素分析、例えば実施例の欄に記載されている例を用いて酵素活性の増大を試験することが可能である。部位特異的突然変異誘発法を用い、コード配列を改変して酵素活性を増大することも可能である。
【００５３】
目的の酵素の活性を化学処理によって上方調節することもできる。例えば、１つ又はそれ以上の目的酵素の発現を上方調節する分子、例えば転写調節タンパク質に結合して、転写調節タンパク質の目的酵素の発現を調節する調節配列との結合を改変する化合物。適切な化合物を、例えば化合物ライブラリーをスクリーニングして、上記のような酵素活性の増大について試験することによって、同定することができる。
【００５４】
本発明の、そして本発明の方法で用いられるレンサ球菌細胞は、ストレプトコッカス エクイ（例えば、ストレプトコッカス・エクイ亜種ズーエピデミカス又はストレプトコッカス・エクイ亜種エクイ）のような、ランスフィールド分類のＡ群又はＣ群レンサ球菌が好ましい。これらの細菌は天然に細胞外皮膜としてＨＡを産生する。
【００５５】
（基質のレベルを増大する方法及び細胞）
本発明は、ＨＡの生合成に関わる特定の基質のレンサ球菌中の増強されたレベルが産生されたＨＡの分子量の増大をもたらすという予期せぬ知見にも基づいている。そのような特定の基質の１つはＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンである。グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン及びＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンのような特定の基質の増強されたレベル、そしてそれによる産生されたＨＡの分子量の増大を様々の方法で達成することができるということが更に確認されている。これらの方法は、これに限定されないが、特定の基質又は基質前駆物質の追加量の供給を包含する。これは、例えば、特定の基質又は基質前駆物質の内因性産生を増大することによって、又は特定の基質又は基質前駆物質の生物学的利用能を外因的に増大することによって達成することができる。グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン及びＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンのような特定の基質のレベルを増強して、それによって産生されたＨＡの分子量を増大するその他の方法は、これに限定されないが、これらの基質又は基質前駆物質を、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン １−カルボキシビニルトランスフェラーゼ（ＵＤＰ−ＮＡＧ−ＣＶＴ）のような、異なった生合成経路に動員させる酵素の活性又は量を下方調節又は抑制することを包含する。
【００５６】
一態様では、本発明は、ＵＤＰ−ＮＡＧの基質前駆物質を供給してＨＡを産生する方法を包含している。これらの前駆物質は、グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン及びＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンを包含してもよい。加えて、このような方法は、グルタミン、アセチルＣｏＡ及びＵＴＰを含む代謝産物の供給を更に包含している。
【００５７】
グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン及びＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンのような特定の基質又は基質前駆物質の内因性産生を増大する方法は、当該基質又はその前駆物質を産生する酵素をコードする発現ベクターでＨＡ−産生レンサ球菌細胞を形質転換、トランスフェクト又は形質導入することを包含する。発現ベクターの導入は、エレクトロポレーション、次いで選択培地上で形質転換細胞を選択することによって達成できる。そのようにして細胞に導入された異種核酸配列は、染色体外に保持されるか、或は相同的組み替えによって宿主細胞のゲノムに導入することができる。このような細菌細胞を形質転換する方法は当業者に周知であって、ガイダンスを、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989 及び Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. and Wiley-Intersciences, 1992 から得ることができる。
【００５８】
従って本発明は、方法が培養培地中でレンサ球菌細胞を生育すること（その細胞はヒアルロン酸合成に必要な酵素を発現し、そこでその細胞は、細胞中にあるグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン及びＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンから選ばれる１つ又はそれ以上の基質又はそれらの前駆物質の量を増大するように改変又は処理されている）；及び任意に細胞によって産生されたヒアルロン酸を回収することを含有してなる、ヒアルロン酸を生産する方法を提供する。
本発明は、ヒアルロン酸合成に必要な酵素を発現するレンサ球菌からヒアルロン酸を回収することを含有してなる、ヒアルロン酸を生産する方法も提供し、ここで細胞は細胞中にあるグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン及びＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンから選ばれる１つ又はそれ以上の基質又はそれらの前駆物質の量を増大するように改変又は処理されている。好ましい態様では、基質がＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンである。
【００５９】
グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン及びＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンのような、特定の基質又は基質前駆物質の生物利用能を増大する方法は、ＨＡ産生レンサ球菌細胞をその基質又は基質前駆物質と共に培養することを包含する。
【００６０】
従って、本発明は、方法が培養培地中でレンサ球菌細胞を生育すること（その細胞はヒアルロン酸合成に必要な酵素を発現する）；及びグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン及びＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンから選ばれる１つ又はそれ以上の基質又はそれらの前駆物質を供給すること；及び任意に細胞によって産生されたヒアルロン酸を回収することを含有してなる、ヒアルロン酸を生産する方法を提供する。
本発明は、ヒアルロン酸合成に必要な酵素を発現するレンサ球菌細胞からヒアルロン酸を回収することを含有してなる、ヒアルロン酸を生産する方法も提供し、ここではグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン及びＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンから選ばれる１つ又はそれ以上の基質又はそれらの前駆物質が供給されている。好ましい態様では、基質がグルコサミンである。
【００６１】
従って本発明は、ヒアルロン酸を合成する酵素を含有してなるレンサ球菌細胞で、その細胞がグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン及びＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンから選ばれる１つ又はそれ以上の基質又はそれらの前駆物質を産生する酵素を過剰発現するように遺伝子改変されている、レンサ球菌細胞を提供する。
ある態様では、過剰発現は、ＨＡ産生レンサ球菌細胞を、基質又はその前駆物質或は当該基質又は前駆物質を産生する酵素をコードする発現ベクターで形質転換、トランスフェクト又は形質導入することによって達成できる。発現ベクターの導入は、エレクトロポレーション、次いで選択培地上で形質転換細胞を選択することによって達成できる。そのようにして細胞に導入された異種核酸配列は、染色体外に保持されるか、或は相同的組み替えによって宿主細胞のゲノムに導入することができる。ある好ましい態様では、細胞がＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンを過剰発現する。
【００６２】
ＨＡ産生で用いられる特定の基質又は基質前駆物質の生物利用能を最大化する更なる方法は、基質を代替え生合成に動員させる酵素に対して競合的親和性を有する代替え基質を供給することを包含する。例えば、ＵＤＰ−ＮＡＧ−ＣＶＴに対して競合的親和性を有しているＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンの代替え基質の供給は、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンではない、ペプチドグリカン生合成に用いるためのＵＤＰ-ＮＡＧ-ＣＶＴによる基質の動員をもたらし、それにより、ＨＡ産生に用いることのできるＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンのレベルの増強が可能になる。
【００６３】
（酵素の発現又は活性を減少する方法又は細胞）
ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン １−カルボキシビニルトランスフェラーゼ（ＵＤＰ−ＮＡＧ−ＣＶＴ）（ｍｕｒＡ）又はＭｕｒＧトランスフェラーゼ（ｍｕｒＧ）（ウンデカプレニルジホスホ−ムラモイルペンタペプチド ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ）のような、細胞中の酵素の活性又は量を下方調節又は抑制する方法は、酵素をコードする遺伝子を、例えば、挿入又は欠失による破壊によって、又は遺伝子の転写に関わる遺伝子又は補助因子の何れか一方を標的とする定方向の又はランダムな他の何らかの形式の突然変異誘発によって、遺伝子を「ノックアウト」することにより遺伝子の転写を減少又は抑制するように、破壊することを包含する。
これに関しては、ＵＤＰ−ＮＡＧ−ＣＶＴは一般に、それぞれが別の遺伝子に由来する２つのアイソフォームにあるＨＡ−産生レンサ球菌に存在していることに留意することが重要である。
従って、ＵＤＰ−ＮＡＧ−ＣＶＴをコードする１つの遺伝子は、レンサ球菌細胞の生存能力を損なうことなく、下方調節又は抑制できる。細胞中の酵素の活性又は量を下方調節又は抑制する別の方法は、遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳を、例えば、アンチセンスｍＲＮＡ又はｓｉＲＮＡのような干渉ＲＮＡを用いることによって、中断させることを包含する。細胞中の酵素の活性又は量を下方調節又は抑制する更なる方法は、小分子又は抗体のようなアンタゴニストを用いて酵素を標的にすることを包含する。
このように下方調節又は抑制する方法は当業者に周知であって、本明細書の他の部分に開示されているような標準的なテキストからガイダンスを得ることができる。
【００６４】
従って本発明は、その方法が培養培地中で、ヒアルロン酸合成に必要な酵素を発現する、レンサ球菌細胞を生育すること（ここで、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン １−カルボキシビニルトランスフェラーゼ（ＵＤＰ−ＮＡＧ−ＣＶＴ）（ｍｕｒＡ）又はＭｕｒＧトランスフェラーゼ（ｍｕｒＧ）（ウンデカプレニルジホスホ−ムラモイルペンタペプチド ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ）から選ばれる細胞中の１つ又はそれ以上の酵素の活性又は量が減少又は抑制されている）；及び任意に細胞によって産生されたヒアルロン酸を回収することを含有してなる、ヒアルロン酸を生産する方法を提供する。
本発明は、ヒアルロン酸合成に必要な酵素を発現するレンサ球菌からヒアルロン酸を回収することを含有してなるヒアルロン酸を生産する方法も提供し、ここで、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン １−カルボキシビニルトランスフェラーゼ（ＵＤＰ−ＮＡＧ−ＣＶＴ）（ｍｕｒＡ）又はＭｕｒＧトランスフェラーゼ（ｍｕｒＧ）（ウンデカプレニルジホスホ−ムラモイルペンタペプチド ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ）から選ばれる細胞中の１つ又はそれ以上の酵素の活性又は量が減少又は抑制されている。
本発明は、その方法が培養培地中で、ヒアルロン酸合成に必要な酵素を発現する、レンサ球菌細胞を生育すること（ここで、細胞は、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン １−カルボキシビニルトランスフェラーゼ（ＵＤＰ−ＮＡＧ−ＣＶＴ）（ｍｕｒＡ）又はＭｕｒＧトランスフェラーゼ（ｍｕｒＧ）（ウンデカプレニルジホスホ−ムラモイルペンタペプチド ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ）から選ばれる細胞中の１つ又はそれ以上の酵素の活性又は量が減少又は抑制するように改変又は処理されている）；及び任意に細胞によって産生されたヒアルロン酸を回収することを含有してなる、ヒアルロン酸を生産する方法を更に提供する。
本発明はその上に、ヒアルロン酸合成に必要な酵素を発現するレンサ球菌からヒアルロン酸を回収することを含有してなるヒアルロン酸を生産する方法を提供し、ここで、細胞は、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン １−カルボキシビニルトランスフェラーゼ（ＵＤＰ−ＮＡＧ−ＣＶＴ）（ｍｕｒＡ）又はＭｕｒＧトランスフェラーゼ（ｍｕｒＧ）（ウンデカプレニルジホスホ−ムラモイルペンタペプチド ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ）から選ばれる細胞中の１つ又はそれ以上の酵素の活性又は量が減少又は抑制するように改変又は処理されている。
【００６５】
酵素の減少又は抑制された活性又は量は、遺伝子的に改変されていない、そして標準的な条件下（例えば、富栄養培地（Ｍ１７Ｇ）又は２％ｗ／ｖのグルコースを補完した既知組成培地（ＣＤＭ）中、３７℃でのような）で生育させた対応する野生株と比較して測定することができる。例えば、ムコイドＣ群ストレプトコッカス・エクイ亜種ズーエピデミカスの場合、適切な対照株はＡＴＣＣ３５２４６である。
【００６６】
本発明の、そして本発明の方法で用いられるレンサ球菌細胞は、ストレプトコッカス エクイ（例えば、ストレプトコッカス・エクイ亜種ズーエピデミカス又はストレプトコッカス・エクイ亜種エクイ）のような、ランスフィールド分類のＡ群又はＣ群レンサ球菌が好ましい。これらの細菌は天然に細胞外皮膜としてＨＡを産生する。
【００６７】
本発明は更にヒアルロン酸の合成のための酵素を含有するレンサ球菌細胞を提供し、この細胞はＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン １−カルボキシビニルトランスフェラーゼ（ＵＤＰ−ＮＡＧ−ＣＶＴ）（ｍｕｒＡ）又はＭｕｒＧトランスフェラーゼ（ｍｕｒＧ）（ウンデカプレニルジホスホ−ムラモイルペンタペプチド ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ）から選ばれる１つ又はそれ以上の酵素を低発現するか又は発現しないか或は下方調節された活性で発現するように遺伝子改変されている。
ある態様では、細胞は１つ又はそれ以上の酵素をコードするゲノム調節配列中に１つ又はそれ以上の突然変異を含有していて、その突然変異は、野生型の細胞と比較すると、１つ又はそれ以上の酵素の発現の下方調節又は抑制をもたらす。
別の態様では、細胞は１つ又はそれ以上の酵素のコード配列中に１つ又はそれ以上の突然変異を含有していてもよく、この突然変異は、野生型の細胞と比較すると、１つ又はそれ以上の酵素の発現の下方調節又は抑制をもたらす。
ある好ましい態様では、この酵素がＵＤＰ−ＮＡＧ−ＣＶＴである。
別の好ましい態様では、細胞はＵＤＰ−ＮＡＧ−ＣＶＴをコードする１つ以上の遺伝子を含有していてもよく、それによりＵＤＰ−ＮＡＧ−ＣＶＴをコードする１つの遺伝子は細胞の生存能力を損なうことなく、下方調節又は抑制される。このような下方調節又は抑制は本明細書に記載されている何れかの方法によって達成することができる。
別の態様では、細胞中の酵素の活性又は量の下方調節又は抑制は、酵素をコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳を、例えば、酵素に向けられる抗体、又はアンチセンスｍＲＮＡ又はｓｉＲＮＡのような干渉ＲＮＡを用いて中断させることによって達成される。このような抗体又はｍＲＮＡを、当業者に公知の方法によって、発現ベクター中で、細胞に導入することができる。
ある態様では、細胞は野生型のＨＡシンターゼ（ＨａｓＡ）のレベル及び活性を有している。
【００６８】
目的の酵素の活性を化学処理を用いて下方調節することもできる。例えば目的の１つ又はそれ以上の酵素の発現を下方調節する分子、例えば、転写調節タンパク質に結合して、転写調節タンパク質の目的の酵素の発現を調節する調節配列との結合を改変する化合物で。適切な化合物は、例えば、化合物ライブラリーをスクリーニングして酵素活性の減少を試験することによって同定することができる。
【００６９】
（細胞培養及びヒアルロン酸の産生）
本発明は、本発明の方法によって得られるか又は得られうるヒアルロン酸を提供する。ＨＡは、上記のような適当なレンサ球菌を、適切な条件下で、培養することによる、本発明の方法に従って生産することができる。例えば、連続発酵又はバッチフェド培養法を用いることができる。ＨＡを産生するために用いることができる条件の例は国際出願公開第ＷＯ９２／０８７７７号公報に記載されていて、これは６．０〜７．０のｐＨ及び１％飽和以下の溶解酸素を用いる連続発酵方法を記載している。この全内容は参照として本明細書に組み込まれている。この全内容も参照として本明細書に組み込まれている、米国特許第６，５３７，７９５号は、バッチフェド培養法を記載している。細胞の培養に適している既知組成培地は、本明細書の実施例に記載されている。細胞は通常、約３５℃〜約４０℃の範囲内、より好ましくは約３７℃の温度で培養する。
【００７０】
バッチにおいて又は連続培養における適切な間隔でＨＡの産生が所望のレベルに達したら、その後にＨＡを細胞から回収することができる。細菌からＨＡを精製する多くの方法が当該技術分野で知られている。一般に、ＨＡを１つ又はそれ以上の精製工程に付して、そこで特に医薬品グレードのＨＡが生産される。米国特許第４，７８２，０４６号に基づいている、以下の記載は例示である。
【００７１】
一般に、バイオマスを、ホルムアルデヒドのような適当な試薬で処理して、ＨＡをラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）又はドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）のような、陰イオン界面活性剤、又は同等の陰イオン洗浄剤で抽出して、ＨＡを細胞から放出する。
【００７２】
次いで、得られる混合物を、例えば０．４５μｍの混合セルロースエステルフィルターを通して、単純ろ過してもよい。代替え手段は、混合物を、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイドのような、非イオン洗浄剤又は同等の非イオン洗浄剤で処理してＨＡと陰イオン洗浄剤を沈殿させることである。得られる沈殿物を遠心分離又は篩いろ過によって採集することができる。次いで沈殿物をＣａＣｌ２中に可溶化する。得られる懸濁液を遠心分離又は篩いろ過して細胞混入物質及び両方の洗浄剤を含有している沈殿物を除去する。
【００７３】
次いで、何れかの方法から得られるろ液／上澄液を適当なアルコール（９５％のＥｔＯＨ又は９９％のイソプロパノールが好ましい）で抽出する。ゼラチン状の沈殿物が形成され、これを遠心分離又は篩いろ過で採取する。ペレットを通常は、例えばエタノール／食塩溶液で洗浄する。
【００７４】
米国特許第４，７８２，０４６号に記載のような、用いることができる更なる精製工程は以下の通りである。沈殿物を脱イオンした蒸留水に４〜１０℃で１晩かけて可溶化する。懸濁液を遠心分離又は篩いろ過して、沈殿物を除去する。上澄液に１％ｗ／ｖのＮａＣｌを添加して、溶解する。次いで、適当なアルコールを添加してＨＡを沈殿させる。この沈殿物を沈静化させて、その後遠心分離又は篩いろ過によってこれを採取することができる。
【００７５】
水にＨＡを溶解した後１．０％のＮａＣｌを添加して、アルコールで沈殿させることを、ＨＡ−水溶液か透明になるまで、徐々に容量を減らして（元の容量の１／２０〜１／１００）繰り返してもよい。これは少なくとも４回の追加アルコール沈殿工程を必要とするかもしれない。
【００７６】
得られるＨＡを、例えば０．１％のベータプロピオラクトン（４℃〜１０℃で２４〜４８時間）を用いて殺菌できる−次いで３７℃に加熱して、ベータプロピオラクトンを加水分解する。
【００７７】
別の殺菌方法は、例えば、一般に約０．４５μｍの孔経を有する、混合セルロースエステルフィルターのような、適当なタンパク質結合フィルターを用いるろ過を包含する。
【００７８】
得られる本発明の細菌性ＨＡは、３ＭＤａより大きい、好ましくは３．５ＭＤａより大きい分子量（クロスリンキングせずに）を有していることが好ましい。
【００７９】
（組成物及び処置方法）
本発明のＨＡは、美容及び再生手術において；皮膚の老化防止において；皺取り製品；滑液を含む代替体液（例えば、変形性関節症の治療用注射組成物として）に；火傷及び潰瘍の局所治療として；水晶体摘出、眼内レンズ移植、角膜移植、緑内障ろ過、及び網膜付着手術（例えば、点眼液又はゲルの形成において）における手術補助として；手術、例えば心臓手術、ヘルニアの修復、鼻腔／副鼻腔の修復、関節鏡視下手術及び脊髄手術における接着管理として；等のような、多くの適用において用いることができる。ＨＡは特定食品にも用いることができる。
【００８０】
従って本発明はまた、本発明の方法によって得られた若しくは得られ得るＨＡを、美容的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤と共に含有している化粧用組成物を、更に本発明の方法によって得られた若しくは得られ得るＨＡを、薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤と共に含有している医薬組成物も含有している。更に、本発明は本発明のヒアルロン酸を含有している食品又は食品添加物を提供する。
【００８１】
本発明の組成物は治療的に又は美容的に投与できる。治療適用においては、既に疾患を患っている対象に、対象が治癒するか或は疾患又は合併症を少なくとも部分的に抑えるのに十分な量で、組成物を投与する。組成物の量は患者を有効に治療するのに十分でなければならない。組成物は、当業者に公知の方法に従って調製することができて、美容的又は薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤を含有できる。投与可能な組成物を調製する方法は当業者に明らかであって、例えば、本明細書に参照として取り込まれている、Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. に詳細に記載されている。
【００８２】
本発明の組成物は局所製剤及び／又は他の治療成分を含んでいてもよい。局所投与に適している製剤は、塗布剤、ローション、クリーム、軟膏又はペーストのような、治療が必要な部位への皮膚を介する浸透に適している液体又は半流動体製剤、及び眼、耳又は鼻に投与するのに適している点滴薬を包含する。
【００８３】
本発明の点滴薬は、無菌の水性又は油性溶液又は懸濁液を含んでいてよい。これらは、ヒアルロン酸を、抗菌及び／又は抗真菌剤及び／又はその他の適切な保存剤の水溶液中に溶解して、任意に界面活性剤を含有させることによって調製できる。次いで、得られる溶液をろ過して清澄にし、適当な容器に移して殺菌する。殺菌は加圧滅菌又は９０℃〜１００℃に３０分間保持することによって、又はろ過した後に殺菌技術を用いて容器に移すことによって実施できる。点滴薬に加えるのに適している抗菌又は抗真菌剤の例は、硝酸又は酢酸フェニル水銀（０，００２％）、塩化ベンザルコニウム（０．０１％）及び酢酸クロルヘキシジン（０．０１％）である。油性溶液の製剤用の適切な溶媒は、グリセロール、希釈アルコール及びプロピレングリコールを包含する。
【００８４】
本発明によるローションは、皮膚への適用に適しているものを包含する。皮膚に適用するローション又は塗布剤は、アルコール又はアセトンのような、速乾剤及び皮膚冷却剤、及び／又はグリセロール又はひまし油若しくははラッカセイ油等の油のような保湿剤も含んでいてよい。
【００８５】
本発明によるクリーム、軟膏又はペーストは、外用のためのヒアルロン酸の半流動体製剤である。これらは、微粉化又は粉末形態のヒアルロン酸を、単独で又は水性又は非水性溶液又は懸濁液中で、脂肪性基剤又は非脂肪性基剤と混合することによって作ることができる。基剤は、固形、軟又は流動パラフィンのような炭化水素、グリセロール、密ろう、金属石けん、ゴム糊、アーモンド、コーン、ラッカセイ、ヒマシ又はオリーブ油のような天然由来の油、羊毛脂若しくはその誘導体、又はプロピレングリコール若しくはマクロゴールのようなアルコールと一緒のステアリン酸若しくはオレイン酸のような脂肪酸を含んでいてよい。
【００８６】
組成物は、ソルビタンエステル又はそれらのポリオキシエチレン誘導体のような、陰イオン性、陽イオン性若しくは非イオン性界面活性剤のような適切な界面活性剤の何れかを包含することができる。天然のゴム、セルロース誘導体、又はケイ素シリカのような無機物質、及びラノリンのようなその他の成分を包含してもよい。
【００８７】
組成物はリポソームの形態で投与することもできる。リポソームはリン脂質又はその他の脂質物質から得られ、水性媒体中に分散されている単層又は複層の水和液晶によって形成できる。リポソームを形成できる非毒性で、生理学的に許容され、そして代謝可能な脂質を使用できる。リポソーム形態にある組成物は、安定化剤、保存剤及び賦形剤を含有することができる。好ましい脂質は、天然及び合成の両方の、リン脂質及びホスファチジルコリン（レクチン）を包含する。リポソームを生産する方法は当該技術分野で公知であって、これに関して具体的にPrescott, Ed., Methods in Cell Biology, Volume XIV, Academic Press, New York, N.Y. (1976), p. 33 以下を参照されたい。この内容は参照して本明細書に取り込まれている。
【００８８】
（用量）
何れかの特定の患者に対する治療又は美容に有効な用量は、治療される疾患及び疾患の重症度、使用される化合物又は薬剤の活性、用いる組成物、患者の年齢、体重、健康状態、性別及び食習慣、投与期間、投与経路、ヒアルロン酸の分画速度、治療期間、及び治療と組み合わせて又は同時に用いられる何れかの薬剤を包含する、多数の因子に、当該技術分野で周知のその他の関連する因子を伴って決定されるであろう。従って、当業者は、通常の実験によって、適用可能な疾患を治療するのに必要なヒアルロン酸の有効で、非毒性の量を決定することができるだろう。
【００８９】
一般に、治療又は美容の適用においては、病態継続期間に治療を行う。
【００９０】
更に、組成物の個々の用量の最適な分量及び間隔は、治療される疾患の種類及び程度、投与の形態、経路及び部位、及び治療される特定の個人の性質によって決定されるということは、当業者に理解できるであろう。また、このような最適な状態は従来の技術によって決定できる。
【００９１】
規定日数について１日に与える組成物の投与回数のような、最適な治療コースは、従来の治療コース決定検査を用いて当業者が確定することができる。
【００９２】
（投与経路）
本発明の組成物は、当業者が周知の標準的な経路によって投与できる。組成物は骨膜関節又は炎症の部位に直接注射することもできる。
【００９３】
（担体、賦形剤及び希釈剤）
担体、賦形剤及び希釈剤は、組成物の別の成分と適合して、その服用者に有害ではないという観点から、「許容される」ものでなければならない。このような担体、賦形剤及び希釈剤は本発明の組成物の品質及び半減期を向上させるために用いることができる。これらは本発明の組成物の生物活性を増大又は保護するためにも用いることができる。
【００９４】
薬学的に及び／又は美容上許容される担体又は希釈剤の例は、脱塩水又は蒸留水；食塩液；ピーナッツ油、サフラワー油、オリーブ油、綿実油、トウモロコシ油、ごま油、ラッカセイ油又はヤシ油のような植物油；メチルポリシロキサン、フェニルポリシロキサン及びメチルフェニルポリソルポキサン（polysolpoxane）のような、ポリシロキサンを含む、シリコン油；揮発性シリコン；流動パラフィン、軟パラフィン又はスクアランのような鉱物油；メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム又はヒドロキシプロピルメチルセルロースのような、セルロース誘導体；低級アルカノール、例えばエタノール又はイソプロパノール；低級アラルカノール；低級ポリアルキレングリコール又は低級アルキレングリコール、例えばポリエチレングリコール、ポリプレングリコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール又はグリセロール；パルミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸イソプロピル又はオレイン酸エチルのような脂肪酸エステル；ポリビニルピロリドン；寒天；トラガカントゴム又はアカシアゴム；及びワセリンである。一般に、担体（複数を含む）は組成物の１０〜９９．９重量％を形成するであろう。
【００９５】
本発明の組成物は、注射による投与に適している形態、経口摂取に適している製剤（例えば、カプセル、錠剤、カプレット、エリキシルのような）の形態、局所投与に適している軟膏、クリーム又はローションの形態、経鼻吸入又は経口吸入によるような吸入による投与に適しているエアゾール形態、非経口投与、即ち皮下、皮内又は静脈内注射に適している形態であってよい。
【００９６】
注射用溶液又は懸濁液として投与するための、非毒性で許容される希釈剤又は担体としては、リンゲル溶液、等張食塩液、リン酸緩衝食塩液、エタノール及び１，２−プロピレングリコールを含むことができる。
【００９７】
本発明を、説明するのみであって限定するものではない、以下の実施例を参照して、ここで更に記述する。
【実施例】
【００９８】
実施例１．材料及び方法
１．１ 細菌株
ムコイドＣ群の ストレプトコッカス・エクイ亜種ズーエピデミカス株（Streptococcus equi subsp. zooepidemicus strain )ATCC 35246 (S. ズーエピデミカス（zooepidemicus）) を American Type Culture Collection (PO Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America) から入手した。
【００９９】
１．２ 組み換え株の構築
６つの遺伝子、すなわちｈａｓＡ、ｈａｓＢ、ｈａｓＣ、ｇｌｍＵ、ｐｇｉ及びｇｌｍＳを、表１に記載するプライマーを用いて S. ズーエピデミカスゲノムＤＮＡから増幅した。オリゴヌクレオチドプライマーを、ＮＣＢＩ（ncbi. nlm. gov；受入れ番号ＡＦ３４７０２２）及びSanger Institute S. zooepidemicus Blast Server 上で入手できる ストレプトコッカス・エクイ亜種ズーエピデミカス（S. ズーエピデミカス）ｈａｓオペロンの部分配列から入手できるデータに基づいてデザインした。プライマーＧｕａＢは S.ズーエピデミカスのハウスキーピング遺伝子を前方向及び逆方向に増幅して、S.ズーエピデミカスについてのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の陽性コントロールとして用いた。ＰＣＲ産物のサイズを QIAquick Gel Extraction kit (Quiagen) を用いて抽出したアガロースゲル及びバンドで確認した。精製したＰＣＲ産物を所望の制限酵素で二重消化して（表１を参照されたい）、ナイシン誘引プラスミドｐＮＺ８１４８（Kuipers, O.P., et al. (1998) "Quorum sensing-controlled gene expression in lactic acid bacteria." J. Biotech. 64(1):15-21）中にライゲーションした。ライゲーション混合物を、エレクトロコンピテント（electrocompetent）乳酸レンサ球菌 ( Lactococcus lactis ）ＭＧ１３６３を形質転換するために用いて、５μｇＣｍ／ｍｌを含有するＭ１７Ｇ寒天プレート上で１晩培養した後、形質転換体を同定した。コロニーを１晩培養して組み換えプラスミドを QIAprep Spin Miniprep kit (Quiagen) を用いてペレットから精製した。挿入部位及び配列をＤＮＡシーケンシングによって確認した。このプラスミドを エレクトロコンピテント S. ズーエピデミカス細胞を形質転換するために用いて、２．５μｇ／ｍｌのＣｍを含有するＭ１７Ｇ寒天プレート上で１晩培養した後、組み換え株を単離した。この組み換え株を２．５μｇ／ｍｌのＣｍを含有する羊血液寒天プレート上で常時保管した。
【０１００】
【表１】
【０１０１】
１．３ 生育培地及び培養条件
血液寒天プレートから単一コロニーを選択して既知組成培地（ＣＤＭ：表２）中に１晩接種した。ｐＮＺ株に対しては、２．５μｇ／ｍｌのＣｍ及び２０ｎｇ／ｍｌのナイシンを培地に添加した。生育を、分光光度計を用いて５３０ｎｍで監視した。
【０１０２】
第１回目のＯＤ５３０に達したときに、培養物を、２Ｌのバイオリアクター（Applikon）中の０．０５のＤ５３０に接種した。バイオリアクターを可動用量１．４Ｌで、そして温度を３７℃に保持して操作した。リアクターを３００ｒｐｍで撹拌して、発酵中は窒素を拡散して嫌気性条件を保持した。５ＭのＮａＯＨ及び５ＭのＨＣｌを添加してｐＨを６．７に調節した。
【０１０３】
好気性培養も、可動用量を１．４Ｌから１Ｌにして泡が冷却器に入らないようにした以外は、上記のように行った。好気性条件を、発酵期間中ずっと０．４Ｌ／分の流速で定常的に底から空気を拡散することによって保持した。
【０１０４】
バッチ／フェドバッチ発酵のために、最初のバッチ相を上記のように実施した。培養が、グルコースの枯渇による定常期に到達したら、これを少なくと更に３０分生育させて、必須アミノ酸（例えば、アルギニンデイミナーゼ経路を介するアルギニン）の完全な枯渇を確認した。定常期の１時間後に、図３Ａ及び３Ｂに示されるように、追加のグルコースを培養物に添加した。この戦略により、必須アミノ酸の１つが枯渇するので、バイオマスが合成されずにＨＡを産生する定常期を実現した。
【０１０５】
表２に示したように、既知組成培地（ＣＤＭ）は、Van de Rijn, I. et al. (1980). "Growth characteristics of group A streotococci in a new chemically defined medium". Infect. Immun. 27(2):444-448 を改変した。全ての化学物質は Sigma Aldrich から購入した。
【０１０６】
【表２−１】
【０１０７】
【表２−２】
【０１０８】
１．４ バイオマス及び発酵産物の測定
１時間毎にサンプルを採取して、光学密度を分光光度計を用いて波長５３０ｎｍで測定して、方程式：バイオマス（ｇ／Ｌ）＝ＯＤ５３０＊０．２６±０．０１（Goh, L.-T. (1998). Fermentation studies of Hyaluronic acid production by Streptococcus zooepidemicus. Department of Chemical Engineering. Brisbane Australia）：を用いてバイオマスに変換した。残ったサンプルを等量のＳＤＳと混合してＨＡ皮膜を破壊して、細胞を除去するためにシリンジフィルター（０．４５μｍ）でろ過した。
【０１０９】
ＢｉｏＲａｄ ＨＰＸ−８７Ｈアシッドカラムを用い、１ＭのＨ２ＳＯ４を溶出液とし、１分当たり１ｍＬの流速で、ＨＰＬＣにより乳酸、酢酸塩、ギ酸塩、グルコース及びエタノールを測定した。グルコース濃度が４０ｐｐｍ以下のサンプルをＹＳＩ ２７００ Select Biochemistry Glucose Analyser（Yellow Springs Inc.）を用いて分析した。
【０１１０】
サンプルのＨＡ濃度をＨＡ比濁定量分析（Di Ferrante, N. (1956). "Turbidimetric measurement of acid mucopoly-saccharides and hyaluronidase activity." J. Bio. Chem. 220:303-306）を用いて測定した。すなわち、２００μＬのサンプルを０．５ＭのＮａＯＨ中で、 ２００μＬの０．１Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ＝５．６）及び４００μＬの２．５％Ｗ／Ｖ臭化セチル−トリメチル−アンモニウム（ＣＴＡＢ）と混合した。２０分間培養した後、ＯＤ６００を測定して、ＨＡ濃度を較正曲線から決定した
【０１１１】
１．５ ＵＤＰ糖類の測定
５ｍｌの細胞懸濁液を遠心分離（５０,０００×ｇ、２分、３７℃）によってペレットにして、沸騰エタノールで抽出した。抽出液を、５００ｍｇのＳＡＸ樹脂カラム（６ｍｌ貯留、Isolute, International Sorbent Technology）を用いる固相抽出で、酢酸ナトリウムの代わりに２ｍＬの０．１５Ｍクエン酸ナトリウムを用いて代謝物をカラムから溶出する以外は、他の文献（Jensen, N.B.S., Jokumsen, K.V., Villadsen, J., Determination of the phosphorylated sugars of Embden-Meyerhoff-Parnas pathway in Lactococcus lactis using a fast sampling technique and solid phase extraction. Biotechnol. Bioeng. 1999, 63, 356-362）に記載のようにして処理した。
【０１１２】
サンプルを水で１：１（ｗ／ｗ）に希釈した後に、高圧アニオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ）によるＵＤＰ−糖分析を行った。２５μＬの希釈したサンプルを、Ａｍｉｎｏ Ｔｒａｐガードカラム（２ｍｍ×５０ｍｍ）及びＣａｒｂｏ Ｐａｃ ＰＡ １０分析カラム（２ｍｍ×２５０ｍｍ）（Dionex, Sunnyvale, USA）を装着したＡＡＡ Ｄｉｒｅｃｔシステム（Dionex, Sunnyvale, USA）に注入した。カラムの温度を３０℃に保持して、流速を０．２５ｍｌ／分に設定した。ＵＤＰ−糖を、１ｍＭのＮａＯＨ中で酢酸ナトリウム勾配で溶出して、金電極を用いるＥＤ４０電気化学検出器（Dionex, Sunnyvale, USA）で検出した。
【０１１３】
１．６ 酵素活性の分析
ｈａｓＡ活性を、既に記載されている方法（Tlapak-Simmons, V.L., Baggenstoss, B.A., Kumari, K., Heldermon, C., and Weigel, P.H. (1999). Kinetic Characterization of the Recombinant Hyaluronan Synthases from Streptococcus pyogenes and Streptococcus equisimilis. J Biological Chemistry 274, 4246-4253）に基づく手順を用い、得られた膜抽出物からＨＡのインビボ合成によって分析した。最初に、４００μＬの膜溶解液を、洗浄緩衝液（５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、５ｍＭのＥＤＴＡ、１０％のグリセロール、プロテアーゼインヒビター混合物（GE healthcare）、ｐＨ７）に溶解した４ｍＭのＵＤＰ−グルクロン酸の２００μＬ、及び４ｍＭのＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン（洗浄緩衝液中）の４００μＬと混合した。次いで、１００μＬのＨＡＳ緩衝液（２５０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、５００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＧＴＡ）、２０μＬの１Ｍ ＭｇＣｌ２、２０μＬの２０ｍＭ ＤＴＴ、１０μＬのプロテアーゼインヒビター混合物（GE healthcare）及び５０μＬの洗浄緩衝液を反応物に添加した。酵素反応を水浴中で３７℃に２時間保持し、次いで１００℃の水浴中で２分間保持して反応を停止した（Tlapak-Simmons, et al. (1999) ibid）。室温まで冷却した後、１ｍＬの０．１％ＳＤＳを加えて膜抽出液に付着しているＨＡを剥がして、ＨＡを上記の比濁分析で測定した。
【０１１４】
既に記載されている方法に基づく手順を用いてその他の酵素活性を分析した：ＨａｓＢ（Dougherty, B. and van de Rijn, I. (1993). "Molecular characterization of hasB from an operon required for hyaluronic acid synthesis in group A streptococci. Demonstration of UDP-glucose dehydrogenase activity." J. Biol. Chem. 268(10): 7118-7124）、ＨａｓＣ（Franke, J. and Sussman, M. (1971). "Synthesis of Uridine Diphosphate Glucose Pyrophosphorylase during the Development of Dictyostelium discoideum." J. Biol. Chem. 246(21): 6381-6388）及びＰｇｉ（Bergmeyer, H.U., et al. (1974). Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer, H.U., ed). New York, NY, Academic Press, Inc.）。
【０１１５】
ＧｌｍＵ活性は測定しなかったが、発現はリアルタイムＰＣＲを用いて確認した。ＲＮＡをＲＮｅａｓｙミニキット（Quiagen）を用いて細胞抽出物から精製し、ＤＮａｓｅで処理して、プライマー：ＧｌｍＵＦ（５’−ＧＴＣＣＡＴＧＧＡＡＡＧＧＡＡＴＣＡＡＡＡＣＡＴＧＡＡＡＡＡＣＴＡＣＧ−３”）（配列番号７）及びＧｌｍＵＲ（５’−ＡＴＣＴＣＴＡＧＡＡＣＴＡＴＡＧＣＴＴＡＣＴＧＧＧＧＧＣＴＧ−３’）（配列番号８）：を用いて、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ ＰＣＲキット（Gibco）でＲＴ−ＰＣＲを行った。２４サイクル後に、得られたｇｌｍＵ遺伝子の１３９６ｂｐＤＮＡ断片をアガロースゲル上で、バンド強度に基づいて定量化した（Scion Image Beta 4.0.3）。
【０１１６】
１．７ 分子量の測定
ＨＡサンプルを、１５ｍＬの培養物を、室温で１０分間培養した０．１％ｗ／ｖのＳＤＳ（１５ｍＬ）と混合して培養液から精製した（Chong, B.F. (2002). Improving the cellular economy of Streptococcus zooepideicus through metabolic engineering. Department of Chemical Engineering. Brisbane, The University of Queensland）。次いで、サンプルを０．４５μｍのフィルターでろ過し、ろ液を溶解し、３倍量のエタノールと混合して、１晩４℃に放置した。次いで、沈殿物を遠心分離（９６３０×ｇ；４℃；２０分）して、上澄液を除去した。ペレットを１５ｍＬのエタノール；食塩溶液（７５％ｗ／ｖエタノール、２５％ｗ／ｖ０．１５ＭのＮａＣｌ）中で洗浄して、再び遠心分離（１７６００×ｇ；４℃；２０分）した。上澄液を除去した後、ペレットを１晩乾燥する。最後に、ＨＡペレットを０．１５ＭのＮａＣｌにゆっくり揺すりながら再懸濁して、不溶物を遠心分離（１７６００×ｇ；４℃；２０分）で除去して、サンプルを０．４５μｍのフィルターでろ過した。
【０１１７】
Ｕｂｂｅｌｏｈｄｅ Ｄｉｌｕｔｉｏｎ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ（直径０．６３ｍｍ、５７００ｍｍ３容量）を用いてＬａｕｄａ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ粘度測定システムで固有粘度を測定した。全ての測定は３７℃で実施して、０．１５Ｍの塩化ナトリウムを希釈溶媒として用いた。この固有粘度は、上記のように処理した公知分子量の標準値を用いて適合させたパラメータと共に、Ｍａｒｋ−Ｈｏｕｗｉｎｋ−Ｓａｋｕｒａｄａの式：［η］＝０．０２９２×Ｍｗ０.７８４８を用いて平均分子量を決定するために、使用した。
【０１１８】
１．８ プロテオミクス
指数関数的に増殖している細胞（ＯＤ５３０＝２〜４）２００ｍＬを、２０ｍｇのヒアルロニダーゼを含有しているＳｃｈｏｔｔボトル中に採取して、３７℃で１０分間培養した。細胞を２０,０００×ｇ（２０分、４℃、Avanti J26 XPI, Beckman Coulter）でペレットにして、３０ｍｌの溶解緩衝液（３０ｍＭトリス、７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、４％ＣＨＡＰＳ及びプロテアーゼインヒビターのカクテル）に再懸濁した。細胞を１００μｍのガラスビーズ１．４４ｇを用いてビーズビーター上で溶解した。細胞を２−Ｄクリーンアップキットを用いて浄化して、２−Ｄ Ｑｕａｎｔキットを用い、製造会社（GE Healthcare）の手順書に従って、タンパク質濃度を測定した。ＣｙＤＹＥラベリングキットを用い、製造会社（GE-Healthcare）の手順書に従って、５０μｇのタンパク質を標識化した。
【０１１９】
ＩＰＧストリップ（GE Healthcare、２４ｃｍ）を用いて等電点電気泳動を実施した。タンパク質を、能動的な再水和によって、Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒｅ Ｉ ユニット（GE, Healthcare）上で分離した、等電点電気泳動の前１２時間３０Ｖ；１時間５００Ｖ（Step and hold）；１時間１０００Ｖ（gradient）；３時間８０００Ｖ（gradient）；１２時間８０００Ｖ（Step and hold）。平衡後、ＩＰＧストリップを、Ｅｔｔａｎ Ｄａｌｔ１２電気泳動ユニット（GE Healthcare）上で２ｗ／ゲルで３０分及び１８ｗ／ゲルで６時間行う、ポリアクリルアミドゲルを用いて二次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥに移した。ゲル画像を、Ｔｙｐｈｏｏｎトリオ９１００（GE Healthcare）を用い、製造会社の手順書に従って、１００μｍでスキャンした。タンパク質を、質量分析法（ＬＣ／ＭＳ及びＭＡＬＤＩ ＴＯＦ／ＴＯＦ）を用いて同定した。
【０１２０】
１．９ 質量分析
タンパク質スポットをゲルから切り取って、過剰のトリプシン（Promega, Trypsin Gold, MS grade）でゲル内分解した（３７℃で１晩）。ペプチドをＳｐｅｅｄｉＶａｃ（SPD111V, Tthermo Savant）を用いて乾燥して、ＭＳ分析するために８０μＬの５％ギ酸に再溶解した。Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ Ｂｉｎａｒｙ ＨＰＬＣシステム（Agilent)を、Ｖｙｄａｃ ＭＳＣ１８３００Ａ（粒子サイズ５μｍのカラム（１５０ｍｍ×２ｍｍ））（Vydac) を用いるＭＳの前に、サンプルの逆相分離を実施するために用いた。ＲＰ−ＨＰＬＣカラムからの溶出物をＴｕｒｂｏｌｏｎＳｐｒａｙソースに直接導入した。
【０１２１】
質量分析実験は、ハイブリッド四重極／リニア イオントラップ４０００ＱＴＲＰ ＭＳ／ＭＳシステム（Applied Biosystems）上で実施した。ＴｕｒｂｏｌｏｎＳｐｒａｙソースを備えた４０００ＱＴＲＡＰを陽性エレクトロスプレイイオン化モードで操作した。Ａｎａｌｙｓｔ１．４．１ソフトウエアをデータ分析に用いた。データベース検索用の質量分析データを提供するために用いられる取得プロトコルは、以下の手順：Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｃａｎ（ＥＭＳ）を用いるＨＰＬＣ溶出物の質量プロファイリング：を含んでいた。＋２〜＋３の荷電状態又は未知の荷電を有する、これらの各スキャンにおける最も多いイオン及び次に多いイオンを回転衝突エネルギーを用いてＣＩＤに付した。高産生イオンスキャンを断片イオンを並べて、続いて行うデータベース検索のための産生イオンスペクトルを示すために用いた。
【０１２２】
また、幾つかのサンプルを、４７００プロテオミクスアナライザーＭＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ（Applied Biosystems）を用いるＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いて分析した。必要に応じて、サンプルを最初にミクロＣ１８ＺｉｐＴｉｐｓ（Millipore）を用いて脱塩して、ペプチドを６０％ＡＣＮ／０．１％ギ酸中の５ｍｇ/ｍＬのＣＨＣＡを用いてＭＡＬＤＩ標的プレート上に直接溶出した。全てのＭＳスペクトルを４８００のレーザーエネルギーの正反射モードで記録した。ＴＯＦ−ＴＯＦからの全てのＭＳ／ＭＳデータを、デフォルト正イオン、１ｋＶの衝突エネルギー、反射モード、５５００のレーザーエネルギーでのＭＳ／ＭＳ方法を用いて取得した。ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを、機器に搭載されているＰｅａｋ Ｐｉｃｋｅｒソフトウェアを用いて分析した。閾値（＞２０：１ シグナル：ノイズ）基準に合致して、除外リスト上にない、１０個の最大強度スペクトルピークを実験のＴＯＦ−ＴＯＦ、ＭＳ／ＭＳ部分の取得リストに含めた。閾値基準を次のように設定した：質量範囲：５００〜４０００Ｄａ；最小クラスター面積：５００；最小シグナル対ノイズ（Ｓ／Ｎ）：２０；スポット当たりのＭＳ／ＭＳスペクトルの最大数：１０。マトリックスクラスターイオン及びトリプシン自己消化ピークを除外するマスフィルターを適用した。
【０１２３】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ並びに非解読のＴＯＦ−ＭＳ及びＴＯＦ−ＴＯＦ ＭＳ／ＭＳデータのデータベース検索を、ＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔソフトウェア（バージョン２．０．１）及びＰａｒａｇｏｎアリゴリズム（Applied Biosystems）を用いて実行した。
【０１２４】
実施例２．結果
２．１ ＨＡの分子量を増大する酵素の過剰発現
７つの遺伝子組み換えＳ．ｅｑｕｉ株（ｈａｓＡ、ｈａｓＢ、ｈａｓＣ、ｇｌｍＵ、ｇｌｍＳ及びpｇｉ−ｇｌｍＵ）を材料及び方法で概説したようにして作出した。遺伝子の過剰発現を酵素分析（ｈａｓＡ、ｈａｓＢ、ｈａｓＣ、ｇｌｍＳ及びｐｇｉ）又はＲＴ−ＰＣＲ（ｇｌｍＵ）を用いて確認した。それぞれの株をバイオリアクター中で発酵して、産生したＨＡの分子量を粘度測定法を用いて測定した。それぞれの改変株は、分子量が野生型株のそれよりも大きいＨＡを産出した（表３）。しかしながら、その増大はある程度そのプラスミドに起因している；過剰発現のために用いられたｎｉｓＡプロモータを伴うｐＮＺ８１４８プラスミド又はクロラムフェニコールマーカーがエリスロマイシンマーカーに置き換わっているｎｉｓＲＫプロモータを伴う同様なプラスミドｐＮＺ９５３０を担持している株は、野生型（ＷＴ）と比べて増大した分子量を示した。
【０１２５】
空のプラスミド株に比べると、ＵＤＰ−ＮＡＧ経路に関わる遺伝子を担持する株（ｐｇｉ、ｇｌｍＳ及びｇｌｍＵ）のみがより高い分子量を示した。更に、ｐｇｉとｇｌｍＵの両方を過剰発現するように組み換えられた別の株が全ての株で最も高い分子量を産生した。この観察と一致して、ＨＡ ＭＷはＵＤＰ−ＮＡＧのレベルと強く相関した（０．８６）が、ＵＤＰ−ＧＵＡレベルとは相関しなかった（０．０７）。
【０１２６】
【表３】
【０１２７】
２．２ ＷＴ、空のプラスミド（ｐＮＺ８１４８）及びＰＧＩ＋＋株のプロテオミクス分析
空のプラスミドがＵＤＰ−ＮＡＧレベルを増大しそれによって分子量を増大するメカニズムを確認するためにプロテオミクスを用いた。野生型（ＷＴ）、空のプラスミド（ｐＮＺ８１４８）及びＰＧＩ＋＋株をＤＩＧＥプロテオミクスを用いて比較した（図２）。
【０１２８】
１０のタンパク質スポットの存在度はＡＮＯＶＡ検査によると、野生型と空のプラスミド（ｐＮＺ８１４８）の培養物の間で有意に異なっていた（表４）。これらのスポットのうち７つは分離用クーマシーゲル中の存在量が少ないため、ＭＳによる同定ができなかった。スポット２４をＳ．ズーエピデミカスゲノム中に見出されたＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン １−カルボキシビニルトランスフェラーゼ（ＵＤＰ−ＮＡＧ−ＣＶＴ）の２つのホモログに位置付けた。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて、５つのペプチドを１つの遺伝子に位置づけ、３つのペプチドを別の物に位置付けた。ＵＤＰ−ＮＡＧ−ＣＶＴは、ＵＤＰ−ＮＡＧからのペプチドグリカン生合成の第１段階を触媒して、ＵＤＰ−ＮＡＧの主要な非ＨＡ関連ドレインを示す。スポット５６をＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ（ＧｌｍＵ）に位置付けた。ＵＤＰ−ＮＡＧ−ＣＶＴの有意な減少を伴うＧｌｍＵの有意な増大は、何故、空のプラスミド株が、野生型（ＷＴ）より高いＵＤＰ−ＮＡＧ濃度及びより高いＭＷを持つのかを説明できる。
【０１２９】
【表４】
【０１３０】
空のプラスミド株に比べると、ｐｇｉ＋＋株はｇｌｍＵがさらに１．８倍増大することを示した（表５）。幾つかのタンパク質は有意に異なっていたが、ＭＳによって同定できなかった。２つの未同定タンパク質（スポット４８及び２０１）は類似のパターン、すなわち、野生型に比べて空のプラスミド中に増大した存在量及び空のプラスミド及びｐｇｉ＋＋株の間での更なる増大、を示した。ｐｇｉに位置付けられた２つのスポット（９５及び４６３）は期待通りの増大を示したが、決定的な結論はこれらのスポット中の別のタンパク質の混入によって阻まれた。
【０１３１】
【表５】
【０１３２】
２．３ 好気性条件は分子量を更に増大する
ｐｇｉ及び、２つの遺伝子ｐｇｉとｇｌｍＵを担持する２つの突然変異株を好気性条件下で野生型と比較した。表６に示したように、好気性条件は、ＨＡの収率に殆ど影響を与えず、やや減少した生育速度を示したが、ＨＡのＭＷを有意に増大した。
【０１３３】
【表６】
【０１３４】
２．４ 高分子量のＨＡ産生定常期を達成するためのバッチ−フェド−バッチ発酵
処理を最適化することによって更にＨＡのＭＷを増大するために、バッチ／フェドバッチ戦略を企てた。この戦略は、アルギニン枯渇を達成するように、バッチの間で短期間のグルコース欠乏を含んでいる。実際に可能であることを示す実験として、野生型レンサ球菌を嫌気性条件下で培養した（図３Ａ）。ＨＰＬＣ分析は、バッチ期間の終期にグルコースが枯渇した時点で、アルギニンは既に枯渇していたことを示した。細胞の生育ではなくＨＡの産生が栄養供給後に再開した。
【０１３５】
フェドバッチ発酵の終期における平均分子量は、バッチ条件下での１．８ＭＤａと比べて２．４ＭＤａであった。図３Ａに示すように、６６％のＨＡがバッチ発酵で、そして３４％が定常期に産生した。このことから定常期の間に産生したＨＡが３．６ＭＤａの平均分子量を有していることが推測される。
【０１３６】
最適な発酵を導くために、２つの遺伝子ｐｇｉ−ｇｌｍＵを担持している株を、図３Ｂに示すように、好気性条件下で試験した。表７に示したように、フェドバッチ戦略を用いて５．０ＭＤａを得た。６１％のＨＡがバッチ条件下で４．２ＭＤａの平均ＭＷで産生された。残りの３９％は、６．４ＭＤａの平均ＭＷで定常期に産生された。
【０１３７】
【表７】
【０１３８】
２．５ グルコサミン上での発酵
代謝されるならば、グルコサミンは、その過程でグルコサミン−６−リン酸を産生するホスホトランスフェラーゼシステムによって輸送されることが期待される。グルコサミン−６−リン酸はＵＤＰ−ＮＡＧ経路の一部である（図１）ので、グルコサミンの供給はＵＤＰ−ＮＡＧレベルを増大するだろう。
【０１３９】
Ｓ．ズーエピデミカスは、グルコースをグルコサミンで置き換えたＣＤＭ上で良く生育する。測定したＵＤＰ−ＮＡＧレベルは、グルコースによる培地上で見られるよりも２倍大きかった。しかしながら、ＵＤＰ−ＧＵＡ濃度はより少ない検出値であってＭＷはたった１．５ＭＤａであった。このことは、グルコサミンはＵＤＰ−ＮＡＧレベルを増大するために供給できるが、ＵＤＰ−ＧＵＡが枯渇されないことを保証するために注意しなければならない。例えば、培養物に、グルコースとグルコサミンの混合物を、２つの前駆体の供給を平衡化するように供給することができる。
【０１４０】
実施例３ 結論
本発明者等は、ＨＡの生合成経路における特定の酵素を過剰発現し、野生型の株と比べて有意に高いＭＷのＨＡを合成できる、多数のレンサ球菌株の設計及び構築について記載してきた。
【０１４１】
全ての株が野生型と比べて高い分子量のＨＡを産生したが、ＵＤＰ−ＮＡＧ経路中の遺伝子を過剰発現する株だけが、空のプラスミドコントロールより高い分子量のＨＡを産生した。分子量はＵＤＰ−ＮＡＧレベルと強く相関するが、ＵＤＰ−ＧＵＡレベルとは相関しないことが観察された。ＵＤＰ−ＮＡＧのより高いレベル、及びそれによる空のプラスミドコントロールの野生型株と比較した分子量は、ペプチドグリカン生合成のＵＤＰ−ＮＡＧとの低い競合性に起因していた；ＤＩＧＥプロテオミクスは、空のプラスミドコントロールにおいて、ペプチドグリカン生合成における最初のＵＤＰ−ＮＡＧ利用工程を触媒する、ＵＤＰ−ＮＡＧ−ＣＶＴのレベルの有意な減少を確認した。
【０１４２】
上記の各項目で言及されている多くの特徴及び態様は、必要に応じて、変更すべきところは変更して、他の項目に適用される。従って、ある項目で特定されている特徴を、必要に応じて別の項目で特定されている特徴と組み合わせることができる。
【０１４３】
上記明細書で述べられている全ての刊行物は参照して本明細書に組み込まれる。本発明の記述した方法及び産生物の多くの改変及び変法は、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく当業者に明らかであろう。本発明は特定の好ましい態様に関連して記載されているが、当然なことながら、クレームされている発明をそのような特定の態様に過度に限定すべきではない。実際に、関連する分野の当業者にとって明白な、本発明を実施するための、記載されている方法の多くの改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内であることが意図されている。
【技術分野】
【０００１】
本発明はレンサ球菌種（Streptococcus sp.）中でヒアルロン酸を生産する方法、更にこのような方法で生産されたヒアルロン酸にも関する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００２】
ヒアルロン酸（ＨＡ）は、β−１−３及びβ−１−４グリコシド結合で交互に連結しているグルクロン酸及びＮ−アセチルグルコサミンの二糖２，０００〜２５，０００個からなる、一様な繰り返しの、直鎖グリコサミノグリカン：［β−１，４−グルクロン酸−β−１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン］ｎ：である。
【０００３】
その様々な天然の機能を反映して、ＨＡは医薬、化粧品及び特定食品において多くの適用が見出されている。多くの適用において、高分子量が望ましい特性であって、高分子量（ＭＷ）ＨＡを生産するために異なった取り組みが採用されてきた。
【０００４】
高ＭＷ ＨＡは鶏のトサカから丁寧な抽出によって得ることができる。鶏のトサカにあるＨＡは非常に高い値、例えば１，２００万〜１，４００万（１２〜１４Ｍ）ダルトン（Ｄａ）にまで達することがある。抽出方法次第で、３〜５ＭＤａの最終生成物が得られる（米国特許第４，１４１，９７３号）。医薬及び化粧品において動物由来製品の使用を控えることが増加して、微生物によるＨＡ産生への転換が見られている。Ｃ群レンサ球菌、特にストレプトコッカス・エクイ亜種エクイ（Streptococcus equi subsp. equi）及びストレプトコッカス・エクイ亜種ズーエピデミカス（Streptococcus equi subsp. zooepidemicus）、の発酵を経由する微生物によるＨＡの生産は、１９８０年代の初頭から工業的に実施されている。しかしながら、微生物から得られるＨＡは、鶏のトサカから得られ得るＨＡより分子量が小さい（通常、０．５〜２ＭＤａ）。
【０００５】
ある適用では、分子量を増大するために化学的架橋が利用されている（例えば、米国特許第４，５８２，８６５号、米国特許第６，９０３，１９９号、米国特許第７，１２５，８６０号、及び米国特許第６，７０３，４４４号）。別の適用では、特に眼科の適用では、架橋結合が好ましくなく、菌株工学（strain engineering）が高ＭＷ ＨＡを実現化するための唯一の手段である。
【０００６】
ＨＡは、病原性ランスフィールド分類Ａ群及びＣ群レンサ球菌によって細胞外皮膜として合成される。顕微鏡下では、これらの胞子非形成且つ非運動性細菌は、多数の細胞外皮膜に取り囲まれて典型的に対に又は鎖状に配置されている球状又は卵形に見える。羊血液寒天プレート上では、これらのβ−溶血性細菌のコロニーは、細菌コロニーを取り囲むムコイド又は粘性透明層として確認されるＨＡと透明帯を生じる。このＨＡ皮膜は、恐らくＨＡ皮膜を外部物質として認識しない高等生物の免疫系としてのステルス機能を細菌に提供している、これらレンサ球菌の病原性因子である。
【０００７】
ＨＡは、ＨＡシンターゼ（ＥＣ２．４．１．２１２）による触媒作用を受ける反応において、２つの活性化グリコシルドナー、ＵＤＰ−グルクロン酸（ＵＤＰ−ＧＵＡ）及びＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＵＤＰ−ＮＡＧ）の重合によって生成する（図１）。２つの前駆体はグルコース−６−リン酸から枝分かれする２つの経路で合成される。
第一の経路は、α−ホスホグルコムターゼ（ＥＣ５．４．２．２）によるグルコース−６−リン酸のグルコース−１−リン酸への変換から出発する。ＵＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ（ＥＣ２．７．７．９）は、ヌクレオチド糖ＵＤＰ−グルコースを生成するＵＴＰとグルコース−１−リン酸の反応を触媒する。次いで、ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２２）の作用によって、ＵＤＰ−グルコースの１級アルコール基を特異的に酸化することによってＵＤＰ−ＧＵＡが得られる。
アミノ糖の生成に関する第二の経路は、ホスホグルコイソメラーゼ（ＥＣ５．３．１．９）の触媒作用を受けるグルコース−６−リン酸のフルクトース−６−リン酸への転換から出発する。アミドトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．１６）によるグルタミンからフルクトース−６−リン酸へのアミノ基の転移はグルコサミン−６−リン酸を生じる。ムターゼ（ＥＣ５．４．２．１０）によるリン酸基の転位はグルコサミン−６−リン酸からグルコサミン−１−リン酸を生成する。アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．４）によるアセチル基の転移はＮ−アセチルグルコサミン−６−リン酸を形成する。最後に、ピロホスホリラーゼ（ＥＣ２．７．７．２３）をＵＤＰに付加してＵＤＰ−ＮＡＧが得られる。
【０００８】
ＨＡ産生におけるそれらの役割に加えて、この２つの経路は細胞壁成分の生合成に必要である。ＵＤＰ−ＧＵＡ経路における中間体は細胞壁多糖類及びテイコ酸の生合成に用いられる。ＵＤＰ−ＮＡＧはリポ多糖類、プロテオグリカン、更にペプチドグリカンにおけるアミノ糖源である。ペプチドグリカン合成の第一工程は、ＵＤＰ−ＮＡＧとホスホエノールピルベートを結合してＵＤＰ−Ｎ−アセチル−３−Ｏ−（１−カルボキシビニル）−グルコサミンを形成する、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン １−カルボキシビニルトランスフェラーゼ（ＵＤＰ−ＮＡＧ−ＣＶＴ）（ＥＣ２．５．１．７）によって触媒される。
【０００９】
ＨＡシンターゼはＨＡ ＭＷを調節するのに重要な役割を演じて、部位特異的突然変異誘発（site directed mutagenesis）はＨＡ ＭＷを修正するために用いられていた（Kumari, K., et al. (2006). "Mutation of Two intramembrane Polar Residues Conserved within the Hyaluronan Synthase Family Alters Hyaluronan Product Size." J. Biol. Chem. 281(17): 11755-11760）。菌株の選択に続く無作為の突然変異生成はＨＡ ＭＷを含む菌株特性の改善にも用いられている（Kim, J.-H., et al. (1996). "Selection of a Streptococcus equi mutant and optimization of culture conditions for the production of high molecular weight hyaluronic acid." Enzy. Microbial Tech. 19(6): 440-445; Lee, M.S., et al. (1999). "Construction and analysis of library for random insertional mutagenesis in Streptococcus pneumoniae: Use for recovery of mutants defective in genetic transformation and for identification of essnetial genes." Appl. Environ. Microbiol. 65(5): 1883-1890: 米国特許第５，４９６，７２６号；米国特許第７，３２３，３２９号）。
【００１０】
ＨＡシンターゼ（ＨａｓＡ）に加えて高いＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ活性（ＨａｓＢ）が高いＨＡ収率を達成するために必要であるということを幾つかの研究が明らかにしている。大腸菌（Escherichia coli.）、枯草菌（Bacillus subtilis）又は乳酸レンサ球菌（Lactococcus lactis）のような異種宿主中でのＨａｓＡの発現は、さらにＨａｓＢが過剰発現されなければ、殆ど若しくは全くＨＡを生じない（DeAngelis P. "polypeptide, or a variant, analogue or fragment thereof", L., et al. (1993) "Molecular cloning, identification, and sequence of the hyaluronan synthase gene from group A Streptococcus pyogenes." J. Biol. Chem. 268:19181-19184; 国際特許出願公開第ＷＯ０３／０５４１６３号公報；Chien L. J., Lee C. K. (2007) "Hyaluronic acid production by recombinant Lactococcus lactis." Appl. Microbiol. Biotechnol. 77:339-346）。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
第１の態様では、本発明はヒアルロン酸を生産する方法を提供し、方法は培養培地中でレンサ球菌細胞を生育させること（ここで細胞はヒアルロン酸合成に必要な酵素を発現する、ここで細胞中にある、ホスホグルコイソメラーゼ、Ｄ−フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ、ホスホグルコサミンムターゼ、グルコサミン−１−リン酸アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸ピロホスホリラーゼ、グルコサミン−６−リン酸アセチルトランスフェラーゼ、及びホスホアセチルグルコサミンムターゼから選ばれる１つ又はそれ以上の酵素の活性又は量を増大させる）；及び任意にこの細胞により産生されたヒアルロン酸を回収することを含有してなる。
【００１２】
第２の態様では、本発明はヒアルロン酸を生産する方法を提供し、方法はヒアルロン酸の合成に必要な酵素を発現するレンサ球菌細胞からヒアルロン酸を回収することを含有してなり、ここで細胞中にある、ホスホグルコイソメラーゼ、Ｄ−フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ、ホスホグルコサミンムターゼ、グルコサミン−１−リン酸アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸ピロホスホリラーゼ、グルコサミン−６−リン酸アセチルトランスフェラーゼ、及びホスホアセチルグルコサミンムターゼから選ばれる１つ又はそれ以上の酵素の活性又は量を増大させる。
【００１３】
第３の態様では、本発明はヒアルロン酸を生産する方法を提供し、方法は培養培地中でレンサ球菌細胞を生育させること（ここで細胞はヒアルロン酸合成に必要な酵素を発現する、ここで細胞中にある、ホスホグルコイソメラーゼ、Ｄ−フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ、ホスホグルコサミンムターゼ、グルコサミン−１−リン酸アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸ピロホスホリラーゼ、グルコサミン−６−リン酸アセチルトランスフェラーゼ、及びホスホアセチルグルコサミンムターゼから選ばれる１つ又はそれ以上の酵素の活性又は量を増大させるように細胞を改変又は処理してある）；及び任意にこの細胞により産生されたヒアルロン酸を回収することを含有してなる。
【００１４】
第４の態様では、本発明はヒアルロン酸を生産する方法を提供し、方法はヒアルロン酸の合成に必要な酵素を発現するレンサ球菌細胞からヒアルロン酸を回収することを含有してなり、ここで細胞中にある、ホスホグルコイソメラーゼ、Ｄ−フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ、ホスホグルコサミンムターゼ、グルコサミン−１−リン酸アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸ピロホスホリラーゼ、グルコサミン−６−リン酸アセチルトランスフェラーゼ、及びホスホアセチルグルコサミンムターゼから選ばれる１つ又はそれ以上の酵素の活性又は量を増大させるように、細胞を改変又は処理してある。
【００１５】
第５の態様では、本発明はヒアルロン酸を生産する方法を提供し、方法は培養培地中でレンサ球菌細胞を生育させること（ここで細胞はヒアルロン酸合成に必要な酵素を発現して、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン及びグルコサミンから選ばれる１つ又はそれ以上の基質をもたらす）；及び任意にこの細胞により産生されたヒアルロン酸を回収することを含有してなる。
【００１６】
第６の態様では、本発明はヒアルロン酸を生産する方法を提供し、方法はヒアルロン酸の合成に必要な酵素を発現するレンサ球菌細胞からヒアルロン酸を回収することを含有してなり、ここでＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン及びグルコサミンから選ばれる１つ又はそれ以上の基質がもたらされる。
【００１７】
第７の態様では、本発明はヒアルロン酸を生産する方法を提供し、方法は培養培地中でレンサ球菌細胞を生育させること（ここで細胞はヒアルロン酸合成に必要な酵素を発現して、細胞中にあるＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン及びグルコサミンから選ばれる１つ又はそれ以上の基質の量を増大するように改変又は処理されている）；及び任意にこの細胞により産生されたヒアルロン酸を回収することを含有してなる。
【００１８】
第８の態様では、本発明はヒアルロン酸を生産する方法を提供し、方法はヒアルロン酸の合成に必要な酵素を発現するレンサ球菌細胞からヒアルロン酸を回収することを含有してなり、ここで細胞は細胞中のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン及びグルコサミンから選ばれる１つ又はそれ以上の基質の量を増大するように改変又は処理されている。
【００１９】
第９の態様では、本発明はヒアルロン酸を生産する方法を提供し、方法は培養培地中でレンサ球菌細胞を生育させること（ここで細胞はヒアルロン酸合成に必要な酵素を発現して、細胞中にあるＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン １−カルボキシビニルトランスフェラーゼ及びウンデカプレニルジホスホ−ムラモイルペンタペプチド ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼから選ばれる１つ又はそれ以上の酵素の活性又は量が減少又は失効されている）；及び任意にこの細胞により産生されたヒアルロン酸を回収することを含有してなる。
【００２０】
第１０の態様では、本発明はヒアルロン酸を生産する方法を提供し、方法はヒアルロン酸の合成に必要な酵素を発現するレンサ球菌細胞からヒアルロン酸を回収することを含有してなり、細胞中にあるＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン １−カルボキシビニルトランスフェラーゼ及びウンデカプレニルジホスホ−ムラモイルペンタペプチド ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼから選ばれる１つ又はそれ以上の酵素の活性又は量が減少又は失効している。
【００２１】
第１１の態様では、本発明はヒアルロン酸を生産する方法を提供し、方法は培養培地中でレンサ球菌細胞を生育させること（ここで細胞はヒアルロン酸合成に必要な酵素を発現して、細胞中にあるＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン １−カルボキシビニルトランスフェラーゼ及びウンデカプレニルジホスホ−ムラモイルペンタペプチド ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼから選ばれる１つ又はそれ以上の酵素の活性又は量が減少又は失効するように細胞が改変又は処理されている）；及び任意にこの細胞により産生されたヒアルロン酸を回収することを含有してなる。
【００２２】
第１２の態様では、本発明はヒアルロン酸を生産する方法を提供し、方法はヒアルロン酸の合成に必要な酵素を発現するレンサ球菌細胞からヒアルロン酸を回収することを含有してなり、細胞中にあるＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン １−カルボキシビニルトランスフェラーゼ及びウンデカプレニルジホスホ−ムラモイルペンタペプチド ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼから選ばれる１つ又はそれ以上の酵素の活性又は量が減少又は失効している。
【００２３】
第１３の態様では、本発明は更に本発明の方法によって得られるか又は得られうるヒアルロン酸を提供する。このヒアルロン酸は少なくとも３又は３．５ＭＤａの平均分子量を有し得る。このヒアルロン酸は実質的に架橋されていなくてもよい。
【００２４】
第１４の態様では、本発明はヒアルロン酸を合成する酵素を含有しているレンサ球菌細胞を提供し、この細胞はホスホグルコイソメラーゼ、Ｄ−フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ、ホスホグルコサミンムターゼ、グルコサミン−１−リン酸アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸ピロホスホリラーゼ、グルコサミン−６−リン酸アセチルトランスフェラーゼ、及びホスホアセチルグルコサミンムターゼから選ばれる１つ又はそれ以上の酵素を過剰に発現するように遺伝子的に改変されている。
【００２５】
第１５の態様では、本発明はヒアルロン酸を合成する酵素を含有しているレンサ球菌細胞を提供し、この細胞はＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン １−カルボキシビニルトランスフェラーゼ及びウンデカプレニルジホスホ−ムラモイルペンタペプチド ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼから選ばれる１つ又はそれ以上の酵素をより少なく発現する、又は発現しない又は下方調節された活性で発現するように遺伝子的に改変されている。
【００２６】
第１６の態様では、本発明は、本発明のヒアルロン酸及び薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤を含有している医薬組成物を提供する。
【００２７】
第１７の態様では、本発明は、本発明のヒアルロン酸及び美容上許容される担体、賦形剤又は希釈剤を含有している化粧品組成物を提供する。
【００２８】
第１７の態様では、本発明は、本発明のヒアルロン酸を含有している食品若しくは食品添加物を提供する。
【００２９】
（定義）
別に定義しない限り、本明細書で用いられる全ての技術及び科学用語は、当業者（例えば、細胞生物学、化学、分子生物学及び細胞培養における）によって普通に理解されているようなものと同じ意味を有している。分子及び生化学的方法で用いられている標準的な技術は、Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 3rd ed. (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 及び Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th Ed, John Wiley & Sons, Inc. -及び Current Protocols in Molecular Biology と言う標題の完全版に見出すことができる。
【００３０】
本明細書を通して用語「含有する（comprise)」、又は「含有する（comprises)」又は「含有している（comprising）」のような変形は、規定される成分、整数又は手順、若しくは成分、整数又は手順の群の包含を暗示しているが、その他の成分、整数又は手順、若しくは成分、整数又は手順の群を除外していないと理解すべきである。
【００３１】
本明細書を通して、別に定義しない限り、数値への言及は、「約」その数値、を意味すると取るべきである。用語「約」は、値は値を測定するために用いられる装置及び方法に対する誤差の固有のばらつき、又は研究課題に存在するばらつきを含んでいることを示すために用いられる。
【００３２】
本明細書中での先行技術への言及は、先行技術がオーストラリアにおいて周知の一般知識の一部を形成しているという認識又は何らかの示唆ではなく、そしてそのように取ってはならない。
本発明をこれから、例示のみを目的として、以下の図面を参照して記載する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、ヒアルロン酸の生産をもたらす生合成経路の概要フローチャートを示す。
【図２】図２は、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン １−カルボキシビニルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．５．１．７）（ＵＰＤ−ＮＡＧ−ＣＶＴ）の位置を示しているＳ．ズーエピデミカス（S. zooepidemicus）（ＡＴＣＣ３５２４６）の２Ｄゲルを示す。ヒアルロニダーゼを用いてタンパク質を採取してＨＡ皮膜を除去した。ｐＨ勾配（４〜７）及び２４ｃｍの１２％ポリアクリルアミドゲルを用いてタンパク質を分離した。タンパク質をｃｙ３で標識化して、タイフーンスキャナー（typhoon scanner）を用いて可視化した。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ及びＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ／ＴＯＦを用いてタンパク質のスポットを確認した。
【図３Ａ】図３は、嫌気性条件下における野生型Ｓ．ズーエピデミカス（ＡＴＣＣ３５２４６）について（図Ａ）及びｇlｍＵ及びｐｇｉをコードするｐＮＺプラスミドを保有しているＳ．ズーエピデミカスについて（図Ｂ）のフェドバッチ培養におけるＨＡの産生の定常期を示す。標準培養物はグルコースを消費するまで発酵し更に３０分放置して必須アミン酸を枯渇した。グルコースの摂取によって、ＨＡ産生が再開されてバイオマスがコンスタントに残存した。
【図３Ｂ】図３は、嫌気性条件下における野生型Ｓ．ズーエピデミカス（ＡＴＣＣ３５２４６）について（図Ａ）及びｇｌｍＵ及びｐｇｉをコードするｐＮＺプラスミドを保有しているＳ．ズーエピデミカスについて（図Ｂ）のフェドバッチ培養におけるＨＡの産生の定常期を示す。標準培養物はグルコースを消費するまで発酵し更に３０分放置して必須アミン酸を枯渇した。グルコースの摂取によって、ＨＡ産生が再開されてバイオマスがコンスタントに残存した。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明者らは、自然に高収率でＨＡを産生するレンサ球菌においてＨＡ前駆体の生合成に関わる過剰発現酵素の効果を検討した。増強された発現はＨＡの収率に対して限られた効果を有しているのに対して、驚くことに、ＨＡ前駆体の生合成に関わる特定酵素の増強された発現が産生されるＨＡの分子量の増大をもたらすということを本発明者らは見出した。
【００３５】
ＵＤＰ−ＮＡＧ経路に関わる酵素（例えば、ホスホグルコイソメラーゼ、Ｄ−フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ、グルコサミン−１−リン酸アセチルトランスフェラーゼ及びＮ−アセチルグルコサミン−１−リン酸ピロホスホリラーゼ）の増強されたレベルを発現するように改変された細胞は、野生型の細胞及びＨＡシンターゼ又はＵＤＰ−ＧＵＡ経路に関わる酵素（例えば、ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ及びＵＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ）を過剰発現するように改変された細胞に比べて、有意に高分子量であるＨＡを産生した。
【００３６】
本発明は更に、高いレベルのＵＤＰ−ＮＡＧを伴う細胞が分子量が増加したＨＡを産生することを確認した。このことは、野生型細胞及びＵＤＰ−ＧＵＡ経路中の遺伝子を発現する細胞に比べて、ＵＤＰ−ＮＡＧ経路中の遺伝子を過剰に発現する細胞についても言える。このことは、高レベルのＧｌｍＵ（グルコサミン−１−リン酸アセチルトラスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸ピロホスホリラーゼ）をそして、ペプチドグリカン生合成におけるＵＤＰ−ＮＡＧ依存第１段階を触媒する酵素である、ＵＤＰ−ＮＡＧ−ＣＶＴの低レベルを発現することが見出されている、空プラスミドコントロールを保有している細胞についても言える。
【００３７】
従って本発明者らは、ＨＡの分子量は、ＵＤＰ−ＮＡＧの供給を増大することによって大きくでき、これはＵＤＰ−ＮＡＧを産生する酵素の活性を増大することにより、細胞がＵＤＰ−ＮＡＧへ変換する基質で培地を補完することにより、そして／又はＵＤＰ−ＮＡＧに対してＨＡシンターゼと競合する酵素の活性を減少することによって達成できるとういう結論に達した。
【００３８】
（酵素の発現又は活性を増大する方法及び細胞）
本発明は部分的に、レンサ球菌種におけるヒアルロン酸産生の経路において多数の酵素の増大した発現／活性は、細胞によって産生された得られるヒアルロン酸の分子量（ＭＷ）の増大をもたらすという知見に基づいている。ＨＡのＭＷの増大をもたらすとして確認された特定の酵素は、ホスホグルコイソメラーゼ（ＨａｓＥ，Ｐｇｉ−ＥＣ５．３．１．９）、Ｄ−フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ（ＧｌｍＳ−ＥＣ２．６．１．１６）及びグルコサミン−１−リン酸アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸ピロホスホリラーゼ（ＨａｓＤ，ＧｌｍＵ−ＥＣ２．３．１．４及び２．７．７．２３）である。
【００３９】
従って、本発明の方法では、レンサ球菌の細胞がホスホグルコイソメラーゼ、Ｄ−フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ、ホスホグルコサミンムターゼ、グルコサミン−１−リン酸アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸ピロホスホリラーゼ、グルコサミン−６−リン酸アセチルトランスフェラーゼ、及びホスホアセチルグルコサミンムターゼから選ばれる１つ又はそれ以上の酵素の活性／発現を増大させている可能性がある。
【００４０】
ある態様では、レンサ球菌細胞は、異種遺伝子、例えば、グルコサミン−６−リン酸アセチルトランスフェラーゼ又はホスホアセチルグルコサミンムターゼをコードする真核生物遺伝子を過剰発現するように遺伝子的に改変されている。
【００４１】
細胞が少なくともホスホグルコイメラーゼの活性／発現を増大していることが好ましい。
【００４２】
一態様では、細胞はＨＡシンターゼ（ＨａｓＡ）の野生型のレベル及び活性を有している。
【００４３】
増大した発現／活性は、遺伝子的に改変されていない、そして標準的な条件下（富栄養培地（Ｍ１７Ｇ）又は２％ｗ／ｖのグルコースを補完した既知組成培地（ＣＤＭ）中、３７℃でのような）で生育した対応する野生型の株と比較して測定することができる。例えば、ムコイドＣ群ストレプトコッカス・エクイ亜種ズーエピデミカスの場合、適切な対照株はＡＴＣＣ３５２４６である。
【００４４】
一態様では、酵素の活性増大は、酵素の発現を指示する１つ又はそれ以上の核酸配列を導入することによって遺伝子的に改変された細胞によって達成される。このような配列は、エレクトロポレーションを用いて細胞にプラスミドＤＮＡを導入した後、選択培地上で形質転換細胞を選択するような、当業者に公知の各種の技術によって導入することができる。これらの異種核酸配列は、染色体外に保持することができ、若しくは相同的組み換えによって宿主細胞のゲノムに導入することができる。
【００４５】
従って、本発明は、ヒアルロン酸の合成用の酵素を含有しているレンサ球菌細胞で、その細胞がホスホグリコイソメラーゼ、Ｄ−フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ、ホスホグルコサミンムターゼ、グルコサミン−１−リン酸アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸ピロホスホリラーゼ、グルコサミン−６−リン酸アセチルトランスフェラーゼ、及びホスホアセチルグルコサミンムターゼから選ばれる１つ又はそれ以上の酵素を過剰発現するように遺伝子的に改変されている、レンサ球菌細胞を提供する。
特定の態様では、細胞は、１つ又はそれ以上の酵素をコードする１つ又はそれ以上の異種核酸配列を含有している。
別の態様では、細胞は、１つ又はそれ以上の酵素をコードするゲノム調節配列に１つ又はそれ以上の突然変異を含有していて、その突然変異は野生型細胞と比較して、１つ又はそれ以上の酵素の発現レベルの増大をもたらす。
更なる態様では、細胞は、１つ又はそれ以上の酵素のコード配列中に、増大した酵素活性をもたらす１つ又はそれ以上の突然変異を含有していてもよい。
これらの態様の組合わせも可能である。
【００４６】
上記の方法及び細胞に関連して、細胞がホスホグルコイソメラーゼ及び／又はグルコサミン−１−リン酸アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸ピロホスホリラーゼの増大した活性／発現をもたらすことが特に好ましい。
【００４７】
目的の酵素をコードしていて、適当なレンサ球菌宿主細胞において酵素の発現を指示することができる調節配列に操作可能に結合している、核酸配列は、多くの供給源から誘導することができる。現在まで４つのレンサ球菌の種からＨＡＳオペロンがクローン化されている。ｈａｓＤ／ｇｌｍＵの配列がＳ．エクイシミラス（S. equisimilus）及びＳ．エクイ亜種ズーエピデミカスに対してクローン化されている。配列は別の種からも得ることができ、例えば、枯草菌（B.subtillis）はｔｕａＤと称するｈａｓＢのホモログを有している。ＨａｓＤ／ｇｌｍＵは多数の細菌種、例えば、化膿レンサ球菌（S. pyogenes）（受入れ番号 Ｎｏ．ＹＰ＿００１１２９０２７）；大腸菌（受入れ番号 Ｎｏ．ＡＢＧ７１９０００及びＰ０ＡＣＣ７）及び枯草菌（受入れ番号 Ｎｏ．Ｐ１４１９２）に対してクローン化されている。化膿レンサ球菌、大腸菌及び枯草菌の完全ゲノムは配列が決定されて公表されている。
【００４８】
さらなる実例として、Ｓ．ズーエピデミカスのゲノムＤＮＡ由来のｈａｓＤ（ｇｌｍＵ）、ｈａｓＥ（ｐｇｉ）及びｇｌｍＭの配列を増幅するための適切なオリゴヌクレチドプライマーが、以下の実施例の欄に記載されている。
【００４９】
ある態様では、目的の１つ又はそれ以上の酵素をコードする核酸配列が、培養培地に誘導分子を添加することによって、酵素の発現を所望通りに上方調節するよう誘導可能である調節配列に操作可能に連結されている。
【００５０】
別のアプローチは、目的の酵素をコードする異種配列の発現を制御する宿主細胞の調節配列を、相同的組み換えによって、例えばプロモーター配列で改変することである。
【００５１】
更なるアプローチは、異種配列の増幅が生じ、目的の酵素をコードする異種ＤＮＡの複写数の増大をもたらし、酵素の発現及び活性の増大を引き起こすように細胞を処理することである。
【００５２】
細胞に多数の突然変異を誘発して、当該技術分野で公知の酵素分析、例えば実施例の欄に記載されている例を用いて酵素活性の増大を試験することが可能である。部位特異的突然変異誘発法を用い、コード配列を改変して酵素活性を増大することも可能である。
【００５３】
目的の酵素の活性を化学処理によって上方調節することもできる。例えば、１つ又はそれ以上の目的酵素の発現を上方調節する分子、例えば転写調節タンパク質に結合して、転写調節タンパク質の目的酵素の発現を調節する調節配列との結合を改変する化合物。適切な化合物を、例えば化合物ライブラリーをスクリーニングして、上記のような酵素活性の増大について試験することによって、同定することができる。
【００５４】
本発明の、そして本発明の方法で用いられるレンサ球菌細胞は、ストレプトコッカス エクイ（例えば、ストレプトコッカス・エクイ亜種ズーエピデミカス又はストレプトコッカス・エクイ亜種エクイ）のような、ランスフィールド分類のＡ群又はＣ群レンサ球菌が好ましい。これらの細菌は天然に細胞外皮膜としてＨＡを産生する。
【００５５】
（基質のレベルを増大する方法及び細胞）
本発明は、ＨＡの生合成に関わる特定の基質のレンサ球菌中の増強されたレベルが産生されたＨＡの分子量の増大をもたらすという予期せぬ知見にも基づいている。そのような特定の基質の１つはＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンである。グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン及びＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンのような特定の基質の増強されたレベル、そしてそれによる産生されたＨＡの分子量の増大を様々の方法で達成することができるということが更に確認されている。これらの方法は、これに限定されないが、特定の基質又は基質前駆物質の追加量の供給を包含する。これは、例えば、特定の基質又は基質前駆物質の内因性産生を増大することによって、又は特定の基質又は基質前駆物質の生物学的利用能を外因的に増大することによって達成することができる。グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン及びＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンのような特定の基質のレベルを増強して、それによって産生されたＨＡの分子量を増大するその他の方法は、これに限定されないが、これらの基質又は基質前駆物質を、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン １−カルボキシビニルトランスフェラーゼ（ＵＤＰ−ＮＡＧ−ＣＶＴ）のような、異なった生合成経路に動員させる酵素の活性又は量を下方調節又は抑制することを包含する。
【００５６】
一態様では、本発明は、ＵＤＰ−ＮＡＧの基質前駆物質を供給してＨＡを産生する方法を包含している。これらの前駆物質は、グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン及びＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンを包含してもよい。加えて、このような方法は、グルタミン、アセチルＣｏＡ及びＵＴＰを含む代謝産物の供給を更に包含している。
【００５７】
グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン及びＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンのような特定の基質又は基質前駆物質の内因性産生を増大する方法は、当該基質又はその前駆物質を産生する酵素をコードする発現ベクターでＨＡ−産生レンサ球菌細胞を形質転換、トランスフェクト又は形質導入することを包含する。発現ベクターの導入は、エレクトロポレーション、次いで選択培地上で形質転換細胞を選択することによって達成できる。そのようにして細胞に導入された異種核酸配列は、染色体外に保持されるか、或は相同的組み替えによって宿主細胞のゲノムに導入することができる。このような細菌細胞を形質転換する方法は当業者に周知であって、ガイダンスを、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989 及び Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. and Wiley-Intersciences, 1992 から得ることができる。
【００５８】
従って本発明は、方法が培養培地中でレンサ球菌細胞を生育すること（その細胞はヒアルロン酸合成に必要な酵素を発現し、そこでその細胞は、細胞中にあるグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン及びＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンから選ばれる１つ又はそれ以上の基質又はそれらの前駆物質の量を増大するように改変又は処理されている）；及び任意に細胞によって産生されたヒアルロン酸を回収することを含有してなる、ヒアルロン酸を生産する方法を提供する。
本発明は、ヒアルロン酸合成に必要な酵素を発現するレンサ球菌からヒアルロン酸を回収することを含有してなる、ヒアルロン酸を生産する方法も提供し、ここで細胞は細胞中にあるグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン及びＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンから選ばれる１つ又はそれ以上の基質又はそれらの前駆物質の量を増大するように改変又は処理されている。好ましい態様では、基質がＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンである。
【００５９】
グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン及びＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンのような、特定の基質又は基質前駆物質の生物利用能を増大する方法は、ＨＡ産生レンサ球菌細胞をその基質又は基質前駆物質と共に培養することを包含する。
【００６０】
従って、本発明は、方法が培養培地中でレンサ球菌細胞を生育すること（その細胞はヒアルロン酸合成に必要な酵素を発現する）；及びグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン及びＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンから選ばれる１つ又はそれ以上の基質又はそれらの前駆物質を供給すること；及び任意に細胞によって産生されたヒアルロン酸を回収することを含有してなる、ヒアルロン酸を生産する方法を提供する。
本発明は、ヒアルロン酸合成に必要な酵素を発現するレンサ球菌細胞からヒアルロン酸を回収することを含有してなる、ヒアルロン酸を生産する方法も提供し、ここではグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン及びＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンから選ばれる１つ又はそれ以上の基質又はそれらの前駆物質が供給されている。好ましい態様では、基質がグルコサミンである。
【００６１】
従って本発明は、ヒアルロン酸を合成する酵素を含有してなるレンサ球菌細胞で、その細胞がグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン及びＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンから選ばれる１つ又はそれ以上の基質又はそれらの前駆物質を産生する酵素を過剰発現するように遺伝子改変されている、レンサ球菌細胞を提供する。
ある態様では、過剰発現は、ＨＡ産生レンサ球菌細胞を、基質又はその前駆物質或は当該基質又は前駆物質を産生する酵素をコードする発現ベクターで形質転換、トランスフェクト又は形質導入することによって達成できる。発現ベクターの導入は、エレクトロポレーション、次いで選択培地上で形質転換細胞を選択することによって達成できる。そのようにして細胞に導入された異種核酸配列は、染色体外に保持されるか、或は相同的組み替えによって宿主細胞のゲノムに導入することができる。ある好ましい態様では、細胞がＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンを過剰発現する。
【００６２】
ＨＡ産生で用いられる特定の基質又は基質前駆物質の生物利用能を最大化する更なる方法は、基質を代替え生合成に動員させる酵素に対して競合的親和性を有する代替え基質を供給することを包含する。例えば、ＵＤＰ−ＮＡＧ−ＣＶＴに対して競合的親和性を有しているＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンの代替え基質の供給は、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンではない、ペプチドグリカン生合成に用いるためのＵＤＰ-ＮＡＧ-ＣＶＴによる基質の動員をもたらし、それにより、ＨＡ産生に用いることのできるＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンのレベルの増強が可能になる。
【００６３】
（酵素の発現又は活性を減少する方法又は細胞）
ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン １−カルボキシビニルトランスフェラーゼ（ＵＤＰ−ＮＡＧ−ＣＶＴ）（ｍｕｒＡ）又はＭｕｒＧトランスフェラーゼ（ｍｕｒＧ）（ウンデカプレニルジホスホ−ムラモイルペンタペプチド ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ）のような、細胞中の酵素の活性又は量を下方調節又は抑制する方法は、酵素をコードする遺伝子を、例えば、挿入又は欠失による破壊によって、又は遺伝子の転写に関わる遺伝子又は補助因子の何れか一方を標的とする定方向の又はランダムな他の何らかの形式の突然変異誘発によって、遺伝子を「ノックアウト」することにより遺伝子の転写を減少又は抑制するように、破壊することを包含する。
これに関しては、ＵＤＰ−ＮＡＧ−ＣＶＴは一般に、それぞれが別の遺伝子に由来する２つのアイソフォームにあるＨＡ−産生レンサ球菌に存在していることに留意することが重要である。
従って、ＵＤＰ−ＮＡＧ−ＣＶＴをコードする１つの遺伝子は、レンサ球菌細胞の生存能力を損なうことなく、下方調節又は抑制できる。細胞中の酵素の活性又は量を下方調節又は抑制する別の方法は、遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳を、例えば、アンチセンスｍＲＮＡ又はｓｉＲＮＡのような干渉ＲＮＡを用いることによって、中断させることを包含する。細胞中の酵素の活性又は量を下方調節又は抑制する更なる方法は、小分子又は抗体のようなアンタゴニストを用いて酵素を標的にすることを包含する。
このように下方調節又は抑制する方法は当業者に周知であって、本明細書の他の部分に開示されているような標準的なテキストからガイダンスを得ることができる。
【００６４】
従って本発明は、その方法が培養培地中で、ヒアルロン酸合成に必要な酵素を発現する、レンサ球菌細胞を生育すること（ここで、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン １−カルボキシビニルトランスフェラーゼ（ＵＤＰ−ＮＡＧ−ＣＶＴ）（ｍｕｒＡ）又はＭｕｒＧトランスフェラーゼ（ｍｕｒＧ）（ウンデカプレニルジホスホ−ムラモイルペンタペプチド ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ）から選ばれる細胞中の１つ又はそれ以上の酵素の活性又は量が減少又は抑制されている）；及び任意に細胞によって産生されたヒアルロン酸を回収することを含有してなる、ヒアルロン酸を生産する方法を提供する。
本発明は、ヒアルロン酸合成に必要な酵素を発現するレンサ球菌からヒアルロン酸を回収することを含有してなるヒアルロン酸を生産する方法も提供し、ここで、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン １−カルボキシビニルトランスフェラーゼ（ＵＤＰ−ＮＡＧ−ＣＶＴ）（ｍｕｒＡ）又はＭｕｒＧトランスフェラーゼ（ｍｕｒＧ）（ウンデカプレニルジホスホ−ムラモイルペンタペプチド ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ）から選ばれる細胞中の１つ又はそれ以上の酵素の活性又は量が減少又は抑制されている。
本発明は、その方法が培養培地中で、ヒアルロン酸合成に必要な酵素を発現する、レンサ球菌細胞を生育すること（ここで、細胞は、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン １−カルボキシビニルトランスフェラーゼ（ＵＤＰ−ＮＡＧ−ＣＶＴ）（ｍｕｒＡ）又はＭｕｒＧトランスフェラーゼ（ｍｕｒＧ）（ウンデカプレニルジホスホ−ムラモイルペンタペプチド ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ）から選ばれる細胞中の１つ又はそれ以上の酵素の活性又は量が減少又は抑制するように改変又は処理されている）；及び任意に細胞によって産生されたヒアルロン酸を回収することを含有してなる、ヒアルロン酸を生産する方法を更に提供する。
本発明はその上に、ヒアルロン酸合成に必要な酵素を発現するレンサ球菌からヒアルロン酸を回収することを含有してなるヒアルロン酸を生産する方法を提供し、ここで、細胞は、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン １−カルボキシビニルトランスフェラーゼ（ＵＤＰ−ＮＡＧ−ＣＶＴ）（ｍｕｒＡ）又はＭｕｒＧトランスフェラーゼ（ｍｕｒＧ）（ウンデカプレニルジホスホ−ムラモイルペンタペプチド ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ）から選ばれる細胞中の１つ又はそれ以上の酵素の活性又は量が減少又は抑制するように改変又は処理されている。
【００６５】
酵素の減少又は抑制された活性又は量は、遺伝子的に改変されていない、そして標準的な条件下（例えば、富栄養培地（Ｍ１７Ｇ）又は２％ｗ／ｖのグルコースを補完した既知組成培地（ＣＤＭ）中、３７℃でのような）で生育させた対応する野生株と比較して測定することができる。例えば、ムコイドＣ群ストレプトコッカス・エクイ亜種ズーエピデミカスの場合、適切な対照株はＡＴＣＣ３５２４６である。
【００６６】
本発明の、そして本発明の方法で用いられるレンサ球菌細胞は、ストレプトコッカス エクイ（例えば、ストレプトコッカス・エクイ亜種ズーエピデミカス又はストレプトコッカス・エクイ亜種エクイ）のような、ランスフィールド分類のＡ群又はＣ群レンサ球菌が好ましい。これらの細菌は天然に細胞外皮膜としてＨＡを産生する。
【００６７】
本発明は更にヒアルロン酸の合成のための酵素を含有するレンサ球菌細胞を提供し、この細胞はＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン １−カルボキシビニルトランスフェラーゼ（ＵＤＰ−ＮＡＧ−ＣＶＴ）（ｍｕｒＡ）又はＭｕｒＧトランスフェラーゼ（ｍｕｒＧ）（ウンデカプレニルジホスホ−ムラモイルペンタペプチド ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ）から選ばれる１つ又はそれ以上の酵素を低発現するか又は発現しないか或は下方調節された活性で発現するように遺伝子改変されている。
ある態様では、細胞は１つ又はそれ以上の酵素をコードするゲノム調節配列中に１つ又はそれ以上の突然変異を含有していて、その突然変異は、野生型の細胞と比較すると、１つ又はそれ以上の酵素の発現の下方調節又は抑制をもたらす。
別の態様では、細胞は１つ又はそれ以上の酵素のコード配列中に１つ又はそれ以上の突然変異を含有していてもよく、この突然変異は、野生型の細胞と比較すると、１つ又はそれ以上の酵素の発現の下方調節又は抑制をもたらす。
ある好ましい態様では、この酵素がＵＤＰ−ＮＡＧ−ＣＶＴである。
別の好ましい態様では、細胞はＵＤＰ−ＮＡＧ−ＣＶＴをコードする１つ以上の遺伝子を含有していてもよく、それによりＵＤＰ−ＮＡＧ−ＣＶＴをコードする１つの遺伝子は細胞の生存能力を損なうことなく、下方調節又は抑制される。このような下方調節又は抑制は本明細書に記載されている何れかの方法によって達成することができる。
別の態様では、細胞中の酵素の活性又は量の下方調節又は抑制は、酵素をコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳を、例えば、酵素に向けられる抗体、又はアンチセンスｍＲＮＡ又はｓｉＲＮＡのような干渉ＲＮＡを用いて中断させることによって達成される。このような抗体又はｍＲＮＡを、当業者に公知の方法によって、発現ベクター中で、細胞に導入することができる。
ある態様では、細胞は野生型のＨＡシンターゼ（ＨａｓＡ）のレベル及び活性を有している。
【００６８】
目的の酵素の活性を化学処理を用いて下方調節することもできる。例えば目的の１つ又はそれ以上の酵素の発現を下方調節する分子、例えば、転写調節タンパク質に結合して、転写調節タンパク質の目的の酵素の発現を調節する調節配列との結合を改変する化合物で。適切な化合物は、例えば、化合物ライブラリーをスクリーニングして酵素活性の減少を試験することによって同定することができる。
【００６９】
（細胞培養及びヒアルロン酸の産生）
本発明は、本発明の方法によって得られるか又は得られうるヒアルロン酸を提供する。ＨＡは、上記のような適当なレンサ球菌を、適切な条件下で、培養することによる、本発明の方法に従って生産することができる。例えば、連続発酵又はバッチフェド培養法を用いることができる。ＨＡを産生するために用いることができる条件の例は国際出願公開第ＷＯ９２／０８７７７号公報に記載されていて、これは６．０〜７．０のｐＨ及び１％飽和以下の溶解酸素を用いる連続発酵方法を記載している。この全内容は参照として本明細書に組み込まれている。この全内容も参照として本明細書に組み込まれている、米国特許第６，５３７，７９５号は、バッチフェド培養法を記載している。細胞の培養に適している既知組成培地は、本明細書の実施例に記載されている。細胞は通常、約３５℃〜約４０℃の範囲内、より好ましくは約３７℃の温度で培養する。
【００７０】
バッチにおいて又は連続培養における適切な間隔でＨＡの産生が所望のレベルに達したら、その後にＨＡを細胞から回収することができる。細菌からＨＡを精製する多くの方法が当該技術分野で知られている。一般に、ＨＡを１つ又はそれ以上の精製工程に付して、そこで特に医薬品グレードのＨＡが生産される。米国特許第４，７８２，０４６号に基づいている、以下の記載は例示である。
【００７１】
一般に、バイオマスを、ホルムアルデヒドのような適当な試薬で処理して、ＨＡをラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）又はドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）のような、陰イオン界面活性剤、又は同等の陰イオン洗浄剤で抽出して、ＨＡを細胞から放出する。
【００７２】
次いで、得られる混合物を、例えば０．４５μｍの混合セルロースエステルフィルターを通して、単純ろ過してもよい。代替え手段は、混合物を、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイドのような、非イオン洗浄剤又は同等の非イオン洗浄剤で処理してＨＡと陰イオン洗浄剤を沈殿させることである。得られる沈殿物を遠心分離又は篩いろ過によって採集することができる。次いで沈殿物をＣａＣｌ２中に可溶化する。得られる懸濁液を遠心分離又は篩いろ過して細胞混入物質及び両方の洗浄剤を含有している沈殿物を除去する。
【００７３】
次いで、何れかの方法から得られるろ液／上澄液を適当なアルコール（９５％のＥｔＯＨ又は９９％のイソプロパノールが好ましい）で抽出する。ゼラチン状の沈殿物が形成され、これを遠心分離又は篩いろ過で採取する。ペレットを通常は、例えばエタノール／食塩溶液で洗浄する。
【００７４】
米国特許第４，７８２，０４６号に記載のような、用いることができる更なる精製工程は以下の通りである。沈殿物を脱イオンした蒸留水に４〜１０℃で１晩かけて可溶化する。懸濁液を遠心分離又は篩いろ過して、沈殿物を除去する。上澄液に１％ｗ／ｖのＮａＣｌを添加して、溶解する。次いで、適当なアルコールを添加してＨＡを沈殿させる。この沈殿物を沈静化させて、その後遠心分離又は篩いろ過によってこれを採取することができる。
【００７５】
水にＨＡを溶解した後１．０％のＮａＣｌを添加して、アルコールで沈殿させることを、ＨＡ−水溶液か透明になるまで、徐々に容量を減らして（元の容量の１／２０〜１／１００）繰り返してもよい。これは少なくとも４回の追加アルコール沈殿工程を必要とするかもしれない。
【００７６】
得られるＨＡを、例えば０．１％のベータプロピオラクトン（４℃〜１０℃で２４〜４８時間）を用いて殺菌できる−次いで３７℃に加熱して、ベータプロピオラクトンを加水分解する。
【００７７】
別の殺菌方法は、例えば、一般に約０．４５μｍの孔経を有する、混合セルロースエステルフィルターのような、適当なタンパク質結合フィルターを用いるろ過を包含する。
【００７８】
得られる本発明の細菌性ＨＡは、３ＭＤａより大きい、好ましくは３．５ＭＤａより大きい分子量（クロスリンキングせずに）を有していることが好ましい。
【００７９】
（組成物及び処置方法）
本発明のＨＡは、美容及び再生手術において；皮膚の老化防止において；皺取り製品；滑液を含む代替体液（例えば、変形性関節症の治療用注射組成物として）に；火傷及び潰瘍の局所治療として；水晶体摘出、眼内レンズ移植、角膜移植、緑内障ろ過、及び網膜付着手術（例えば、点眼液又はゲルの形成において）における手術補助として；手術、例えば心臓手術、ヘルニアの修復、鼻腔／副鼻腔の修復、関節鏡視下手術及び脊髄手術における接着管理として；等のような、多くの適用において用いることができる。ＨＡは特定食品にも用いることができる。
【００８０】
従って本発明はまた、本発明の方法によって得られた若しくは得られ得るＨＡを、美容的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤と共に含有している化粧用組成物を、更に本発明の方法によって得られた若しくは得られ得るＨＡを、薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤と共に含有している医薬組成物も含有している。更に、本発明は本発明のヒアルロン酸を含有している食品又は食品添加物を提供する。
【００８１】
本発明の組成物は治療的に又は美容的に投与できる。治療適用においては、既に疾患を患っている対象に、対象が治癒するか或は疾患又は合併症を少なくとも部分的に抑えるのに十分な量で、組成物を投与する。組成物の量は患者を有効に治療するのに十分でなければならない。組成物は、当業者に公知の方法に従って調製することができて、美容的又は薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤を含有できる。投与可能な組成物を調製する方法は当業者に明らかであって、例えば、本明細書に参照として取り込まれている、Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. に詳細に記載されている。
【００８２】
本発明の組成物は局所製剤及び／又は他の治療成分を含んでいてもよい。局所投与に適している製剤は、塗布剤、ローション、クリーム、軟膏又はペーストのような、治療が必要な部位への皮膚を介する浸透に適している液体又は半流動体製剤、及び眼、耳又は鼻に投与するのに適している点滴薬を包含する。
【００８３】
本発明の点滴薬は、無菌の水性又は油性溶液又は懸濁液を含んでいてよい。これらは、ヒアルロン酸を、抗菌及び／又は抗真菌剤及び／又はその他の適切な保存剤の水溶液中に溶解して、任意に界面活性剤を含有させることによって調製できる。次いで、得られる溶液をろ過して清澄にし、適当な容器に移して殺菌する。殺菌は加圧滅菌又は９０℃〜１００℃に３０分間保持することによって、又はろ過した後に殺菌技術を用いて容器に移すことによって実施できる。点滴薬に加えるのに適している抗菌又は抗真菌剤の例は、硝酸又は酢酸フェニル水銀（０，００２％）、塩化ベンザルコニウム（０．０１％）及び酢酸クロルヘキシジン（０．０１％）である。油性溶液の製剤用の適切な溶媒は、グリセロール、希釈アルコール及びプロピレングリコールを包含する。
【００８４】
本発明によるローションは、皮膚への適用に適しているものを包含する。皮膚に適用するローション又は塗布剤は、アルコール又はアセトンのような、速乾剤及び皮膚冷却剤、及び／又はグリセロール又はひまし油若しくははラッカセイ油等の油のような保湿剤も含んでいてよい。
【００８５】
本発明によるクリーム、軟膏又はペーストは、外用のためのヒアルロン酸の半流動体製剤である。これらは、微粉化又は粉末形態のヒアルロン酸を、単独で又は水性又は非水性溶液又は懸濁液中で、脂肪性基剤又は非脂肪性基剤と混合することによって作ることができる。基剤は、固形、軟又は流動パラフィンのような炭化水素、グリセロール、密ろう、金属石けん、ゴム糊、アーモンド、コーン、ラッカセイ、ヒマシ又はオリーブ油のような天然由来の油、羊毛脂若しくはその誘導体、又はプロピレングリコール若しくはマクロゴールのようなアルコールと一緒のステアリン酸若しくはオレイン酸のような脂肪酸を含んでいてよい。
【００８６】
組成物は、ソルビタンエステル又はそれらのポリオキシエチレン誘導体のような、陰イオン性、陽イオン性若しくは非イオン性界面活性剤のような適切な界面活性剤の何れかを包含することができる。天然のゴム、セルロース誘導体、又はケイ素シリカのような無機物質、及びラノリンのようなその他の成分を包含してもよい。
【００８７】
組成物はリポソームの形態で投与することもできる。リポソームはリン脂質又はその他の脂質物質から得られ、水性媒体中に分散されている単層又は複層の水和液晶によって形成できる。リポソームを形成できる非毒性で、生理学的に許容され、そして代謝可能な脂質を使用できる。リポソーム形態にある組成物は、安定化剤、保存剤及び賦形剤を含有することができる。好ましい脂質は、天然及び合成の両方の、リン脂質及びホスファチジルコリン（レクチン）を包含する。リポソームを生産する方法は当該技術分野で公知であって、これに関して具体的にPrescott, Ed., Methods in Cell Biology, Volume XIV, Academic Press, New York, N.Y. (1976), p. 33 以下を参照されたい。この内容は参照して本明細書に取り込まれている。
【００８８】
（用量）
何れかの特定の患者に対する治療又は美容に有効な用量は、治療される疾患及び疾患の重症度、使用される化合物又は薬剤の活性、用いる組成物、患者の年齢、体重、健康状態、性別及び食習慣、投与期間、投与経路、ヒアルロン酸の分画速度、治療期間、及び治療と組み合わせて又は同時に用いられる何れかの薬剤を包含する、多数の因子に、当該技術分野で周知のその他の関連する因子を伴って決定されるであろう。従って、当業者は、通常の実験によって、適用可能な疾患を治療するのに必要なヒアルロン酸の有効で、非毒性の量を決定することができるだろう。
【００８９】
一般に、治療又は美容の適用においては、病態継続期間に治療を行う。
【００９０】
更に、組成物の個々の用量の最適な分量及び間隔は、治療される疾患の種類及び程度、投与の形態、経路及び部位、及び治療される特定の個人の性質によって決定されるということは、当業者に理解できるであろう。また、このような最適な状態は従来の技術によって決定できる。
【００９１】
規定日数について１日に与える組成物の投与回数のような、最適な治療コースは、従来の治療コース決定検査を用いて当業者が確定することができる。
【００９２】
（投与経路）
本発明の組成物は、当業者が周知の標準的な経路によって投与できる。組成物は骨膜関節又は炎症の部位に直接注射することもできる。
【００９３】
（担体、賦形剤及び希釈剤）
担体、賦形剤及び希釈剤は、組成物の別の成分と適合して、その服用者に有害ではないという観点から、「許容される」ものでなければならない。このような担体、賦形剤及び希釈剤は本発明の組成物の品質及び半減期を向上させるために用いることができる。これらは本発明の組成物の生物活性を増大又は保護するためにも用いることができる。
【００９４】
薬学的に及び／又は美容上許容される担体又は希釈剤の例は、脱塩水又は蒸留水；食塩液；ピーナッツ油、サフラワー油、オリーブ油、綿実油、トウモロコシ油、ごま油、ラッカセイ油又はヤシ油のような植物油；メチルポリシロキサン、フェニルポリシロキサン及びメチルフェニルポリソルポキサン（polysolpoxane）のような、ポリシロキサンを含む、シリコン油；揮発性シリコン；流動パラフィン、軟パラフィン又はスクアランのような鉱物油；メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム又はヒドロキシプロピルメチルセルロースのような、セルロース誘導体；低級アルカノール、例えばエタノール又はイソプロパノール；低級アラルカノール；低級ポリアルキレングリコール又は低級アルキレングリコール、例えばポリエチレングリコール、ポリプレングリコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール又はグリセロール；パルミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸イソプロピル又はオレイン酸エチルのような脂肪酸エステル；ポリビニルピロリドン；寒天；トラガカントゴム又はアカシアゴム；及びワセリンである。一般に、担体（複数を含む）は組成物の１０〜９９．９重量％を形成するであろう。
【００９５】
本発明の組成物は、注射による投与に適している形態、経口摂取に適している製剤（例えば、カプセル、錠剤、カプレット、エリキシルのような）の形態、局所投与に適している軟膏、クリーム又はローションの形態、経鼻吸入又は経口吸入によるような吸入による投与に適しているエアゾール形態、非経口投与、即ち皮下、皮内又は静脈内注射に適している形態であってよい。
【００９６】
注射用溶液又は懸濁液として投与するための、非毒性で許容される希釈剤又は担体としては、リンゲル溶液、等張食塩液、リン酸緩衝食塩液、エタノール及び１，２−プロピレングリコールを含むことができる。
【００９７】
本発明を、説明するのみであって限定するものではない、以下の実施例を参照して、ここで更に記述する。
【実施例】
【００９８】
実施例１．材料及び方法
１．１ 細菌株
ムコイドＣ群の ストレプトコッカス・エクイ亜種ズーエピデミカス株（Streptococcus equi subsp. zooepidemicus strain )ATCC 35246 (S. ズーエピデミカス（zooepidemicus）) を American Type Culture Collection (PO Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America) から入手した。
【００９９】
１．２ 組み換え株の構築
６つの遺伝子、すなわちｈａｓＡ、ｈａｓＢ、ｈａｓＣ、ｇｌｍＵ、ｐｇｉ及びｇｌｍＳを、表１に記載するプライマーを用いて S. ズーエピデミカスゲノムＤＮＡから増幅した。オリゴヌクレオチドプライマーを、ＮＣＢＩ（ncbi. nlm. gov；受入れ番号ＡＦ３４７０２２）及びSanger Institute S. zooepidemicus Blast Server 上で入手できる ストレプトコッカス・エクイ亜種ズーエピデミカス（S. ズーエピデミカス）ｈａｓオペロンの部分配列から入手できるデータに基づいてデザインした。プライマーＧｕａＢは S.ズーエピデミカスのハウスキーピング遺伝子を前方向及び逆方向に増幅して、S.ズーエピデミカスについてのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の陽性コントロールとして用いた。ＰＣＲ産物のサイズを QIAquick Gel Extraction kit (Quiagen) を用いて抽出したアガロースゲル及びバンドで確認した。精製したＰＣＲ産物を所望の制限酵素で二重消化して（表１を参照されたい）、ナイシン誘引プラスミドｐＮＺ８１４８（Kuipers, O.P., et al. (1998) "Quorum sensing-controlled gene expression in lactic acid bacteria." J. Biotech. 64(1):15-21）中にライゲーションした。ライゲーション混合物を、エレクトロコンピテント（electrocompetent）乳酸レンサ球菌 ( Lactococcus lactis ）ＭＧ１３６３を形質転換するために用いて、５μｇＣｍ／ｍｌを含有するＭ１７Ｇ寒天プレート上で１晩培養した後、形質転換体を同定した。コロニーを１晩培養して組み換えプラスミドを QIAprep Spin Miniprep kit (Quiagen) を用いてペレットから精製した。挿入部位及び配列をＤＮＡシーケンシングによって確認した。このプラスミドを エレクトロコンピテント S. ズーエピデミカス細胞を形質転換するために用いて、２．５μｇ／ｍｌのＣｍを含有するＭ１７Ｇ寒天プレート上で１晩培養した後、組み換え株を単離した。この組み換え株を２．５μｇ／ｍｌのＣｍを含有する羊血液寒天プレート上で常時保管した。
【０１００】
【表１】
【０１０１】
１．３ 生育培地及び培養条件
血液寒天プレートから単一コロニーを選択して既知組成培地（ＣＤＭ：表２）中に１晩接種した。ｐＮＺ株に対しては、２．５μｇ／ｍｌのＣｍ及び２０ｎｇ／ｍｌのナイシンを培地に添加した。生育を、分光光度計を用いて５３０ｎｍで監視した。
【０１０２】
第１回目のＯＤ５３０に達したときに、培養物を、２Ｌのバイオリアクター（Applikon）中の０．０５のＤ５３０に接種した。バイオリアクターを可動用量１．４Ｌで、そして温度を３７℃に保持して操作した。リアクターを３００ｒｐｍで撹拌して、発酵中は窒素を拡散して嫌気性条件を保持した。５ＭのＮａＯＨ及び５ＭのＨＣｌを添加してｐＨを６．７に調節した。
【０１０３】
好気性培養も、可動用量を１．４Ｌから１Ｌにして泡が冷却器に入らないようにした以外は、上記のように行った。好気性条件を、発酵期間中ずっと０．４Ｌ／分の流速で定常的に底から空気を拡散することによって保持した。
【０１０４】
バッチ／フェドバッチ発酵のために、最初のバッチ相を上記のように実施した。培養が、グルコースの枯渇による定常期に到達したら、これを少なくと更に３０分生育させて、必須アミノ酸（例えば、アルギニンデイミナーゼ経路を介するアルギニン）の完全な枯渇を確認した。定常期の１時間後に、図３Ａ及び３Ｂに示されるように、追加のグルコースを培養物に添加した。この戦略により、必須アミノ酸の１つが枯渇するので、バイオマスが合成されずにＨＡを産生する定常期を実現した。
【０１０５】
表２に示したように、既知組成培地（ＣＤＭ）は、Van de Rijn, I. et al. (1980). "Growth characteristics of group A streotococci in a new chemically defined medium". Infect. Immun. 27(2):444-448 を改変した。全ての化学物質は Sigma Aldrich から購入した。
【０１０６】
【表２−１】
【０１０７】
【表２−２】
【０１０８】
１．４ バイオマス及び発酵産物の測定
１時間毎にサンプルを採取して、光学密度を分光光度計を用いて波長５３０ｎｍで測定して、方程式：バイオマス（ｇ／Ｌ）＝ＯＤ５３０＊０．２６±０．０１（Goh, L.-T. (1998). Fermentation studies of Hyaluronic acid production by Streptococcus zooepidemicus. Department of Chemical Engineering. Brisbane Australia）：を用いてバイオマスに変換した。残ったサンプルを等量のＳＤＳと混合してＨＡ皮膜を破壊して、細胞を除去するためにシリンジフィルター（０．４５μｍ）でろ過した。
【０１０９】
ＢｉｏＲａｄ ＨＰＸ−８７Ｈアシッドカラムを用い、１ＭのＨ２ＳＯ４を溶出液とし、１分当たり１ｍＬの流速で、ＨＰＬＣにより乳酸、酢酸塩、ギ酸塩、グルコース及びエタノールを測定した。グルコース濃度が４０ｐｐｍ以下のサンプルをＹＳＩ ２７００ Select Biochemistry Glucose Analyser（Yellow Springs Inc.）を用いて分析した。
【０１１０】
サンプルのＨＡ濃度をＨＡ比濁定量分析（Di Ferrante, N. (1956). "Turbidimetric measurement of acid mucopoly-saccharides and hyaluronidase activity." J. Bio. Chem. 220:303-306）を用いて測定した。すなわち、２００μＬのサンプルを０．５ＭのＮａＯＨ中で、 ２００μＬの０．１Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ＝５．６）及び４００μＬの２．５％Ｗ／Ｖ臭化セチル−トリメチル−アンモニウム（ＣＴＡＢ）と混合した。２０分間培養した後、ＯＤ６００を測定して、ＨＡ濃度を較正曲線から決定した
【０１１１】
１．５ ＵＤＰ糖類の測定
５ｍｌの細胞懸濁液を遠心分離（５０,０００×ｇ、２分、３７℃）によってペレットにして、沸騰エタノールで抽出した。抽出液を、５００ｍｇのＳＡＸ樹脂カラム（６ｍｌ貯留、Isolute, International Sorbent Technology）を用いる固相抽出で、酢酸ナトリウムの代わりに２ｍＬの０．１５Ｍクエン酸ナトリウムを用いて代謝物をカラムから溶出する以外は、他の文献（Jensen, N.B.S., Jokumsen, K.V., Villadsen, J., Determination of the phosphorylated sugars of Embden-Meyerhoff-Parnas pathway in Lactococcus lactis using a fast sampling technique and solid phase extraction. Biotechnol. Bioeng. 1999, 63, 356-362）に記載のようにして処理した。
【０１１２】
サンプルを水で１：１（ｗ／ｗ）に希釈した後に、高圧アニオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ）によるＵＤＰ−糖分析を行った。２５μＬの希釈したサンプルを、Ａｍｉｎｏ Ｔｒａｐガードカラム（２ｍｍ×５０ｍｍ）及びＣａｒｂｏ Ｐａｃ ＰＡ １０分析カラム（２ｍｍ×２５０ｍｍ）（Dionex, Sunnyvale, USA）を装着したＡＡＡ Ｄｉｒｅｃｔシステム（Dionex, Sunnyvale, USA）に注入した。カラムの温度を３０℃に保持して、流速を０．２５ｍｌ／分に設定した。ＵＤＰ−糖を、１ｍＭのＮａＯＨ中で酢酸ナトリウム勾配で溶出して、金電極を用いるＥＤ４０電気化学検出器（Dionex, Sunnyvale, USA）で検出した。
【０１１３】
１．６ 酵素活性の分析
ｈａｓＡ活性を、既に記載されている方法（Tlapak-Simmons, V.L., Baggenstoss, B.A., Kumari, K., Heldermon, C., and Weigel, P.H. (1999). Kinetic Characterization of the Recombinant Hyaluronan Synthases from Streptococcus pyogenes and Streptococcus equisimilis. J Biological Chemistry 274, 4246-4253）に基づく手順を用い、得られた膜抽出物からＨＡのインビボ合成によって分析した。最初に、４００μＬの膜溶解液を、洗浄緩衝液（５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、５ｍＭのＥＤＴＡ、１０％のグリセロール、プロテアーゼインヒビター混合物（GE healthcare）、ｐＨ７）に溶解した４ｍＭのＵＤＰ−グルクロン酸の２００μＬ、及び４ｍＭのＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン（洗浄緩衝液中）の４００μＬと混合した。次いで、１００μＬのＨＡＳ緩衝液（２５０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、５００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＧＴＡ）、２０μＬの１Ｍ ＭｇＣｌ２、２０μＬの２０ｍＭ ＤＴＴ、１０μＬのプロテアーゼインヒビター混合物（GE healthcare）及び５０μＬの洗浄緩衝液を反応物に添加した。酵素反応を水浴中で３７℃に２時間保持し、次いで１００℃の水浴中で２分間保持して反応を停止した（Tlapak-Simmons, et al. (1999) ibid）。室温まで冷却した後、１ｍＬの０．１％ＳＤＳを加えて膜抽出液に付着しているＨＡを剥がして、ＨＡを上記の比濁分析で測定した。
【０１１４】
既に記載されている方法に基づく手順を用いてその他の酵素活性を分析した：ＨａｓＢ（Dougherty, B. and van de Rijn, I. (1993). "Molecular characterization of hasB from an operon required for hyaluronic acid synthesis in group A streptococci. Demonstration of UDP-glucose dehydrogenase activity." J. Biol. Chem. 268(10): 7118-7124）、ＨａｓＣ（Franke, J. and Sussman, M. (1971). "Synthesis of Uridine Diphosphate Glucose Pyrophosphorylase during the Development of Dictyostelium discoideum." J. Biol. Chem. 246(21): 6381-6388）及びＰｇｉ（Bergmeyer, H.U., et al. (1974). Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer, H.U., ed). New York, NY, Academic Press, Inc.）。
【０１１５】
ＧｌｍＵ活性は測定しなかったが、発現はリアルタイムＰＣＲを用いて確認した。ＲＮＡをＲＮｅａｓｙミニキット（Quiagen）を用いて細胞抽出物から精製し、ＤＮａｓｅで処理して、プライマー：ＧｌｍＵＦ（５’−ＧＴＣＣＡＴＧＧＡＡＡＧＧＡＡＴＣＡＡＡＡＣＡＴＧＡＡＡＡＡＣＴＡＣＧ−３”）（配列番号７）及びＧｌｍＵＲ（５’−ＡＴＣＴＣＴＡＧＡＡＣＴＡＴＡＧＣＴＴＡＣＴＧＧＧＧＧＣＴＧ−３’）（配列番号８）：を用いて、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ ＰＣＲキット（Gibco）でＲＴ−ＰＣＲを行った。２４サイクル後に、得られたｇｌｍＵ遺伝子の１３９６ｂｐＤＮＡ断片をアガロースゲル上で、バンド強度に基づいて定量化した（Scion Image Beta 4.0.3）。
【０１１６】
１．７ 分子量の測定
ＨＡサンプルを、１５ｍＬの培養物を、室温で１０分間培養した０．１％ｗ／ｖのＳＤＳ（１５ｍＬ）と混合して培養液から精製した（Chong, B.F. (2002). Improving the cellular economy of Streptococcus zooepideicus through metabolic engineering. Department of Chemical Engineering. Brisbane, The University of Queensland）。次いで、サンプルを０．４５μｍのフィルターでろ過し、ろ液を溶解し、３倍量のエタノールと混合して、１晩４℃に放置した。次いで、沈殿物を遠心分離（９６３０×ｇ；４℃；２０分）して、上澄液を除去した。ペレットを１５ｍＬのエタノール；食塩溶液（７５％ｗ／ｖエタノール、２５％ｗ／ｖ０．１５ＭのＮａＣｌ）中で洗浄して、再び遠心分離（１７６００×ｇ；４℃；２０分）した。上澄液を除去した後、ペレットを１晩乾燥する。最後に、ＨＡペレットを０．１５ＭのＮａＣｌにゆっくり揺すりながら再懸濁して、不溶物を遠心分離（１７６００×ｇ；４℃；２０分）で除去して、サンプルを０．４５μｍのフィルターでろ過した。
【０１１７】
Ｕｂｂｅｌｏｈｄｅ Ｄｉｌｕｔｉｏｎ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ（直径０．６３ｍｍ、５７００ｍｍ３容量）を用いてＬａｕｄａ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ粘度測定システムで固有粘度を測定した。全ての測定は３７℃で実施して、０．１５Ｍの塩化ナトリウムを希釈溶媒として用いた。この固有粘度は、上記のように処理した公知分子量の標準値を用いて適合させたパラメータと共に、Ｍａｒｋ−Ｈｏｕｗｉｎｋ−Ｓａｋｕｒａｄａの式：［η］＝０．０２９２×Ｍｗ０.７８４８を用いて平均分子量を決定するために、使用した。
【０１１８】
１．８ プロテオミクス
指数関数的に増殖している細胞（ＯＤ５３０＝２〜４）２００ｍＬを、２０ｍｇのヒアルロニダーゼを含有しているＳｃｈｏｔｔボトル中に採取して、３７℃で１０分間培養した。細胞を２０,０００×ｇ（２０分、４℃、Avanti J26 XPI, Beckman Coulter）でペレットにして、３０ｍｌの溶解緩衝液（３０ｍＭトリス、７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、４％ＣＨＡＰＳ及びプロテアーゼインヒビターのカクテル）に再懸濁した。細胞を１００μｍのガラスビーズ１．４４ｇを用いてビーズビーター上で溶解した。細胞を２−Ｄクリーンアップキットを用いて浄化して、２−Ｄ Ｑｕａｎｔキットを用い、製造会社（GE Healthcare）の手順書に従って、タンパク質濃度を測定した。ＣｙＤＹＥラベリングキットを用い、製造会社（GE-Healthcare）の手順書に従って、５０μｇのタンパク質を標識化した。
【０１１９】
ＩＰＧストリップ（GE Healthcare、２４ｃｍ）を用いて等電点電気泳動を実施した。タンパク質を、能動的な再水和によって、Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒｅ Ｉ ユニット（GE, Healthcare）上で分離した、等電点電気泳動の前１２時間３０Ｖ；１時間５００Ｖ（Step and hold）；１時間１０００Ｖ（gradient）；３時間８０００Ｖ（gradient）；１２時間８０００Ｖ（Step and hold）。平衡後、ＩＰＧストリップを、Ｅｔｔａｎ Ｄａｌｔ１２電気泳動ユニット（GE Healthcare）上で２ｗ／ゲルで３０分及び１８ｗ／ゲルで６時間行う、ポリアクリルアミドゲルを用いて二次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥに移した。ゲル画像を、Ｔｙｐｈｏｏｎトリオ９１００（GE Healthcare）を用い、製造会社の手順書に従って、１００μｍでスキャンした。タンパク質を、質量分析法（ＬＣ／ＭＳ及びＭＡＬＤＩ ＴＯＦ／ＴＯＦ）を用いて同定した。
【０１２０】
１．９ 質量分析
タンパク質スポットをゲルから切り取って、過剰のトリプシン（Promega, Trypsin Gold, MS grade）でゲル内分解した（３７℃で１晩）。ペプチドをＳｐｅｅｄｉＶａｃ（SPD111V, Tthermo Savant）を用いて乾燥して、ＭＳ分析するために８０μＬの５％ギ酸に再溶解した。Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ Ｂｉｎａｒｙ ＨＰＬＣシステム（Agilent)を、Ｖｙｄａｃ ＭＳＣ１８３００Ａ（粒子サイズ５μｍのカラム（１５０ｍｍ×２ｍｍ））（Vydac) を用いるＭＳの前に、サンプルの逆相分離を実施するために用いた。ＲＰ−ＨＰＬＣカラムからの溶出物をＴｕｒｂｏｌｏｎＳｐｒａｙソースに直接導入した。
【０１２１】
質量分析実験は、ハイブリッド四重極／リニア イオントラップ４０００ＱＴＲＰ ＭＳ／ＭＳシステム（Applied Biosystems）上で実施した。ＴｕｒｂｏｌｏｎＳｐｒａｙソースを備えた４０００ＱＴＲＡＰを陽性エレクトロスプレイイオン化モードで操作した。Ａｎａｌｙｓｔ１．４．１ソフトウエアをデータ分析に用いた。データベース検索用の質量分析データを提供するために用いられる取得プロトコルは、以下の手順：Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｃａｎ（ＥＭＳ）を用いるＨＰＬＣ溶出物の質量プロファイリング：を含んでいた。＋２〜＋３の荷電状態又は未知の荷電を有する、これらの各スキャンにおける最も多いイオン及び次に多いイオンを回転衝突エネルギーを用いてＣＩＤに付した。高産生イオンスキャンを断片イオンを並べて、続いて行うデータベース検索のための産生イオンスペクトルを示すために用いた。
【０１２２】
また、幾つかのサンプルを、４７００プロテオミクスアナライザーＭＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ（Applied Biosystems）を用いるＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いて分析した。必要に応じて、サンプルを最初にミクロＣ１８ＺｉｐＴｉｐｓ（Millipore）を用いて脱塩して、ペプチドを６０％ＡＣＮ／０．１％ギ酸中の５ｍｇ/ｍＬのＣＨＣＡを用いてＭＡＬＤＩ標的プレート上に直接溶出した。全てのＭＳスペクトルを４８００のレーザーエネルギーの正反射モードで記録した。ＴＯＦ−ＴＯＦからの全てのＭＳ／ＭＳデータを、デフォルト正イオン、１ｋＶの衝突エネルギー、反射モード、５５００のレーザーエネルギーでのＭＳ／ＭＳ方法を用いて取得した。ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを、機器に搭載されているＰｅａｋ Ｐｉｃｋｅｒソフトウェアを用いて分析した。閾値（＞２０：１ シグナル：ノイズ）基準に合致して、除外リスト上にない、１０個の最大強度スペクトルピークを実験のＴＯＦ−ＴＯＦ、ＭＳ／ＭＳ部分の取得リストに含めた。閾値基準を次のように設定した：質量範囲：５００〜４０００Ｄａ；最小クラスター面積：５００；最小シグナル対ノイズ（Ｓ／Ｎ）：２０；スポット当たりのＭＳ／ＭＳスペクトルの最大数：１０。マトリックスクラスターイオン及びトリプシン自己消化ピークを除外するマスフィルターを適用した。
【０１２３】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ並びに非解読のＴＯＦ−ＭＳ及びＴＯＦ−ＴＯＦ ＭＳ／ＭＳデータのデータベース検索を、ＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔソフトウェア（バージョン２．０．１）及びＰａｒａｇｏｎアリゴリズム（Applied Biosystems）を用いて実行した。
【０１２４】
実施例２．結果
２．１ ＨＡの分子量を増大する酵素の過剰発現
７つの遺伝子組み換えＳ．ｅｑｕｉ株（ｈａｓＡ、ｈａｓＢ、ｈａｓＣ、ｇｌｍＵ、ｇｌｍＳ及びpｇｉ−ｇｌｍＵ）を材料及び方法で概説したようにして作出した。遺伝子の過剰発現を酵素分析（ｈａｓＡ、ｈａｓＢ、ｈａｓＣ、ｇｌｍＳ及びｐｇｉ）又はＲＴ−ＰＣＲ（ｇｌｍＵ）を用いて確認した。それぞれの株をバイオリアクター中で発酵して、産生したＨＡの分子量を粘度測定法を用いて測定した。それぞれの改変株は、分子量が野生型株のそれよりも大きいＨＡを産出した（表３）。しかしながら、その増大はある程度そのプラスミドに起因している；過剰発現のために用いられたｎｉｓＡプロモータを伴うｐＮＺ８１４８プラスミド又はクロラムフェニコールマーカーがエリスロマイシンマーカーに置き換わっているｎｉｓＲＫプロモータを伴う同様なプラスミドｐＮＺ９５３０を担持している株は、野生型（ＷＴ）と比べて増大した分子量を示した。
【０１２５】
空のプラスミド株に比べると、ＵＤＰ−ＮＡＧ経路に関わる遺伝子を担持する株（ｐｇｉ、ｇｌｍＳ及びｇｌｍＵ）のみがより高い分子量を示した。更に、ｐｇｉとｇｌｍＵの両方を過剰発現するように組み換えられた別の株が全ての株で最も高い分子量を産生した。この観察と一致して、ＨＡ ＭＷはＵＤＰ−ＮＡＧのレベルと強く相関した（０．８６）が、ＵＤＰ−ＧＵＡレベルとは相関しなかった（０．０７）。
【０１２６】
【表３】
【０１２７】
２．２ ＷＴ、空のプラスミド（ｐＮＺ８１４８）及びＰＧＩ＋＋株のプロテオミクス分析
空のプラスミドがＵＤＰ−ＮＡＧレベルを増大しそれによって分子量を増大するメカニズムを確認するためにプロテオミクスを用いた。野生型（ＷＴ）、空のプラスミド（ｐＮＺ８１４８）及びＰＧＩ＋＋株をＤＩＧＥプロテオミクスを用いて比較した（図２）。
【０１２８】
１０のタンパク質スポットの存在度はＡＮＯＶＡ検査によると、野生型と空のプラスミド（ｐＮＺ８１４８）の培養物の間で有意に異なっていた（表４）。これらのスポットのうち７つは分離用クーマシーゲル中の存在量が少ないため、ＭＳによる同定ができなかった。スポット２４をＳ．ズーエピデミカスゲノム中に見出されたＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン １−カルボキシビニルトランスフェラーゼ（ＵＤＰ−ＮＡＧ−ＣＶＴ）の２つのホモログに位置付けた。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて、５つのペプチドを１つの遺伝子に位置づけ、３つのペプチドを別の物に位置付けた。ＵＤＰ−ＮＡＧ−ＣＶＴは、ＵＤＰ−ＮＡＧからのペプチドグリカン生合成の第１段階を触媒して、ＵＤＰ−ＮＡＧの主要な非ＨＡ関連ドレインを示す。スポット５６をＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ（ＧｌｍＵ）に位置付けた。ＵＤＰ−ＮＡＧ−ＣＶＴの有意な減少を伴うＧｌｍＵの有意な増大は、何故、空のプラスミド株が、野生型（ＷＴ）より高いＵＤＰ−ＮＡＧ濃度及びより高いＭＷを持つのかを説明できる。
【０１２９】
【表４】
【０１３０】
空のプラスミド株に比べると、ｐｇｉ＋＋株はｇｌｍＵがさらに１．８倍増大することを示した（表５）。幾つかのタンパク質は有意に異なっていたが、ＭＳによって同定できなかった。２つの未同定タンパク質（スポット４８及び２０１）は類似のパターン、すなわち、野生型に比べて空のプラスミド中に増大した存在量及び空のプラスミド及びｐｇｉ＋＋株の間での更なる増大、を示した。ｐｇｉに位置付けられた２つのスポット（９５及び４６３）は期待通りの増大を示したが、決定的な結論はこれらのスポット中の別のタンパク質の混入によって阻まれた。
【０１３１】
【表５】
【０１３２】
２．３ 好気性条件は分子量を更に増大する
ｐｇｉ及び、２つの遺伝子ｐｇｉとｇｌｍＵを担持する２つの突然変異株を好気性条件下で野生型と比較した。表６に示したように、好気性条件は、ＨＡの収率に殆ど影響を与えず、やや減少した生育速度を示したが、ＨＡのＭＷを有意に増大した。
【０１３３】
【表６】
【０１３４】
２．４ 高分子量のＨＡ産生定常期を達成するためのバッチ−フェド−バッチ発酵
処理を最適化することによって更にＨＡのＭＷを増大するために、バッチ／フェドバッチ戦略を企てた。この戦略は、アルギニン枯渇を達成するように、バッチの間で短期間のグルコース欠乏を含んでいる。実際に可能であることを示す実験として、野生型レンサ球菌を嫌気性条件下で培養した（図３Ａ）。ＨＰＬＣ分析は、バッチ期間の終期にグルコースが枯渇した時点で、アルギニンは既に枯渇していたことを示した。細胞の生育ではなくＨＡの産生が栄養供給後に再開した。
【０１３５】
フェドバッチ発酵の終期における平均分子量は、バッチ条件下での１．８ＭＤａと比べて２．４ＭＤａであった。図３Ａに示すように、６６％のＨＡがバッチ発酵で、そして３４％が定常期に産生した。このことから定常期の間に産生したＨＡが３．６ＭＤａの平均分子量を有していることが推測される。
【０１３６】
最適な発酵を導くために、２つの遺伝子ｐｇｉ−ｇｌｍＵを担持している株を、図３Ｂに示すように、好気性条件下で試験した。表７に示したように、フェドバッチ戦略を用いて５．０ＭＤａを得た。６１％のＨＡがバッチ条件下で４．２ＭＤａの平均ＭＷで産生された。残りの３９％は、６．４ＭＤａの平均ＭＷで定常期に産生された。
【０１３７】
【表７】
【０１３８】
２．５ グルコサミン上での発酵
代謝されるならば、グルコサミンは、その過程でグルコサミン−６−リン酸を産生するホスホトランスフェラーゼシステムによって輸送されることが期待される。グルコサミン−６−リン酸はＵＤＰ−ＮＡＧ経路の一部である（図１）ので、グルコサミンの供給はＵＤＰ−ＮＡＧレベルを増大するだろう。
【０１３９】
Ｓ．ズーエピデミカスは、グルコースをグルコサミンで置き換えたＣＤＭ上で良く生育する。測定したＵＤＰ−ＮＡＧレベルは、グルコースによる培地上で見られるよりも２倍大きかった。しかしながら、ＵＤＰ−ＧＵＡ濃度はより少ない検出値であってＭＷはたった１．５ＭＤａであった。このことは、グルコサミンはＵＤＰ−ＮＡＧレベルを増大するために供給できるが、ＵＤＰ−ＧＵＡが枯渇されないことを保証するために注意しなければならない。例えば、培養物に、グルコースとグルコサミンの混合物を、２つの前駆体の供給を平衡化するように供給することができる。
【０１４０】
実施例３ 結論
本発明者等は、ＨＡの生合成経路における特定の酵素を過剰発現し、野生型の株と比べて有意に高いＭＷのＨＡを合成できる、多数のレンサ球菌株の設計及び構築について記載してきた。
【０１４１】
全ての株が野生型と比べて高い分子量のＨＡを産生したが、ＵＤＰ−ＮＡＧ経路中の遺伝子を過剰発現する株だけが、空のプラスミドコントロールより高い分子量のＨＡを産生した。分子量はＵＤＰ−ＮＡＧレベルと強く相関するが、ＵＤＰ−ＧＵＡレベルとは相関しないことが観察された。ＵＤＰ−ＮＡＧのより高いレベル、及びそれによる空のプラスミドコントロールの野生型株と比較した分子量は、ペプチドグリカン生合成のＵＤＰ−ＮＡＧとの低い競合性に起因していた；ＤＩＧＥプロテオミクスは、空のプラスミドコントロールにおいて、ペプチドグリカン生合成における最初のＵＤＰ−ＮＡＧ利用工程を触媒する、ＵＤＰ−ＮＡＧ−ＣＶＴのレベルの有意な減少を確認した。
【０１４２】
上記の各項目で言及されている多くの特徴及び態様は、必要に応じて、変更すべきところは変更して、他の項目に適用される。従って、ある項目で特定されている特徴を、必要に応じて別の項目で特定されている特徴と組み合わせることができる。
【０１４３】
上記明細書で述べられている全ての刊行物は参照して本明細書に組み込まれる。本発明の記述した方法及び産生物の多くの改変及び変法は、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく当業者に明らかであろう。本発明は特定の好ましい態様に関連して記載されているが、当然なことながら、クレームされている発明をそのような特定の態様に過度に限定すべきではない。実際に、関連する分野の当業者にとって明白な、本発明を実施するための、記載されている方法の多くの改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内であることが意図されている。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
方法が、培地中でレンサ球菌細胞を生育すること（ここにおいて、当該細胞はヒアルロン酸合成に必要な酵素を発現し、
当該細胞中の、
（ａ）ホスホグルコイソメラーゼ；
（ｂ）Ｄ−フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ；
（ｃ）ホスホグルコサミンムターゼ；
（ｄ）グルコサミン−１−リン酸アセチルトランスフェラーゼ；
（ｅ）Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸ピロホスホリラーゼ
（ｆ）グルコサミン−６−リン酸アセチルトランスフェラーゼ；及び
（ｇ）ホスホアセチルグルコサミンムターゼ：
から選ばれる１つ又はそれ以上の酵素の活性又は量が増大されている）、それによりヒアルロン酸を産生することを含有してなる、ヒアルロン酸を産生する方法。
【請求項２】
細胞によって産生されたヒアルロン酸を回収することを更に含有してなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
方法が、ヒアルロン酸合成に必要な酵素を発現するレンサ球菌細胞からヒアルロン酸を回収すること（ここにおいて、当該細胞中の、
（ａ）ホスホグルコイソメラーゼ；
（ｂ）Ｄ−フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ；
（ｃ）ホスホグルコサミンムターゼ；
（ｄ）グルコサミン−１−リン酸アセチルトランスフェラーゼ；
（ｅ）Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸ピロホスホリラーゼ
（ｆ）グルコサミン−６−リン酸アセチルトランスフェラーゼ；及び
（ｇ）ホスホアセチルグルコサミンムターゼ：
から選ばれる１つ又はそれ以上の酵素の活性又は量が増大されている）を含有してなる、ヒアルロン酸を産生する方法。
【請求項４】
方法が、培地中でレンサ球菌細胞を生育すること（ここにおいて、当該細胞がヒアルロン酸合成に必要な酵素を発現し、
細胞中の、
（ａ）ホスホグルコイソメラーゼ；
（ｂ）Ｄ−フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ；
（ｃ）ホスホグルコサミンムターゼ；
（ｄ）グルコサミン−１−リン酸アセチルトランスフェラーゼ；
（ｅ）Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸ピロホスホリラーゼ
（ｆ）グルコサミン−６−リン酸アセチルトランスフェラーゼ；及び
（ｇ）ホスホアセチルグルコサミンムターゼ：
から選ばれる１つ又はそれ以上の酵素の活性又は量を増大するように当該細胞が組み替 えられているか又は処理されている）、それによりヒアルロン酸を産生することを含有してなる、ヒアルロン酸を産生する方法。
【請求項５】
細胞によって産生されたヒアルロン酸を回収することを更に含有してなる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
方法が、ヒアルロン酸合成に必要な酵素を発現するレンサ球菌細胞からヒアルロン酸を回収すること（ここにおいて、細胞中の、
（ａ）ホスホグルコイソメラーゼ；
（ｂ）Ｄ−フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ；
（ｃ）ホスホグルコサミンムターゼ；
（ｄ）グルコサミン−１−リン酸アセチルトランスフェラーゼ；
（ｅ）Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸ピロホスホリラーゼ
（ｆ）グルコサミン−６−リン酸アセチルトランスフェラーゼ；及び
（ｇ）ホスホアセチルグルコサミンムターゼ：
から選ばれる１つ又はそれ以上の酵素の活性又は量を増大するように当該細胞が組み替 えられているか又は処理されている）を含有してなる、ヒアルロン酸を産生する方法。
【請求項７】
細胞中の１つ又はそれ以上の酵素の活性又は量が、野生型レンサ球菌細胞と比較してより多くのＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンを産生する、請求項１〜６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
産生されたヒアルロン酸が野生型レンサ球菌細胞と比較してより高い平均分子量からなる、請求項１〜７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
方法が、培地中でレンサ球菌細胞を培養すること（ここにおいて、当該細胞はヒアルロン酸合成に必要な酵素を発現する）；及び
（ａ）ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン；
（ｂ）Ｎ−アセチルグルコサミン；及び
（ｃ）グルコサミン；
から選ばれる１つ又はそれ以上の基質を提供すること、それによってヒアルロン酸を産生することを含有してなる、ヒアルロン酸を産生する方法。
【請求項１０】
細胞によって産生されたヒアルロン酸を回収することを更に含有してなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
方法が、ヒアルロン酸合成に必要な酵素を発現するレンサ球菌細胞からヒアルロン酸を回収すること（ここにおいて、
（ａ）ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン；
（ｂ）Ｎ−アセチルグルコサミン；及び
（ｃ）グルコサミン；
から選ばれる１つ又はそれ以上の基質が提供されている）を含有してなる、ヒアルロン酸を産生する方法。
【請求項１２】
（ａ）グルタミン；
（ｂ）アセチル−ＣｏＡ；及び
（ｃ）ＵＴＰ；
から選ばれる１つ又はそれ以上の代謝物を提供することを更に含有してなる、請求項９〜１１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３】
方法が、培地中でレンサ球菌細胞を生育すること（ここにおいて、当該細胞がヒアルロン酸合成に必要な酵素を発現して；
細胞中の
（ａ）ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン；
（ｂ）Ｎ−アセチルグルコサミン；及び
（ｃ）グルコサミン；
から選ばれる１つ又はそれ以上の基質の量を増大するように当該細胞が組み替えられているか又は処理されている）、それによりヒアルロン酸を産生することを含有してなる、ヒアルロン酸を産生する方法。
【請求項１４】
細胞によって産生されたヒアルロン酸を回収することを更に含有してなる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
方法が、ヒアルロン酸合成に必要な酵素を発現するレンサ球菌細胞からヒアルロン酸を回収すること（ここにおいて、細胞中の
（ａ）ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン；
（ｂ）Ｎ−アセチルグルコサミン；及び
（ｃ）グルコサミン；
から選ばれる１つ又はそれ以上の基質の量を増大するように当該細胞が組み替えられているか又は処理されている）を含有してなる、ヒアルロン酸を産生する方法。
【請求項１６】
細胞中の
（ａ）グルタミン；
（ｂ）アセチル−ＣｏＡ；及び
（ｃ）ＵＴＰ；
から選ばれる１つ又はそれ以上の代謝物の量を増大するように当該細胞が組み替えられているか又は処理されている、請求項１３〜１５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１７】
細胞中のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンの量が野生型レンサ球菌細胞と比較して多い、請求項９〜１６の何れか一項に記載の方法。
【請求項１８】
産生されたヒアルロン酸が野生型レンサ球菌細胞と比較してより高い平均分子量からなる、請求項９〜１６の何れか一項に記載の方法。
【請求項１９】
方法が、培地中でレンサ球菌細胞（当該細胞はヒアルロン酸合成に必要な酵素を発現する）を生育すること（ここにおいて、当該細胞中の、
（ａ）ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン １−カルボキシビニルトランスフェラーゼ；及び
（ｂ）ウンデカプレニルジホスホ−ムラモイルペンタペプチド ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ；
から選ばれる１つ又はそれ以上の酵素の活性又は量が減少又無効にされている）、それによりヒアルロン酸を産生することを含有してなる、ヒアルロン酸を産生する方法。
【請求項２０】
細胞によって産生されたヒアルロン酸を回収することを更に含有してなる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
方法が、ヒアルロン酸合成に必要な酵素を発現するレンサ球菌細胞からヒアルロン酸を回収すること（ここにおいて、当該細胞中の、
（ａ）ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン １−カルボキシビニルトランスフェラーゼ；及び
（ｂ）ウンデカプレニルジホスホ−ムラモイルペンタペプチド ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ；
から選ばれる１つ又はそれ以上の酵素の活性又は量が減少又無効にされている）を含有してなる、ヒアルロン酸を産生する方法。
【請求項２２】
方法が、培地中でレンサ球菌細胞（当該細胞はヒアルロン酸合成に必要な酵素を発現する）を生育すること（ここにおいて、当該細胞はヒアルロン酸合成に必要な酵素を発現し、細胞中の、
（ａ）ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン １−カルボキシビニルトランスフェラーゼ；及び
（ｂ）ウンデカプレニルジホスホ−ムラモイルペンタペプチド ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ；
から選ばれる１つ又はそれ以上の酵素の活性又は量を減少又無効するように当該細胞が組み替えられているか又は処理されている）、それによりヒアルロン酸を産生することを含有してなる、ヒアルロン酸を産生する方法。
【請求項２３】
細胞によって産生されたヒアルロン酸を回収することを更に含有してなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
方法が、ヒアルロン酸合成に必要な酵素を発現するレンサ球菌細胞からヒアルロン酸を回収すること（ここにおいて、細胞中の、
（ａ）ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン １−カルボキシビニルトランスフェラーゼ；及び
（ｂ）ウンデカプレニルジホスホ−ムラモイルペンタペプチド ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ；
から選ばれる１つ又はそれ以上の酵素の活性又は量を減少又無効にするように当該細胞が組み替えられているか又は処理されている）を含有してなる、ヒアルロン酸を産生する方法。
【請求項２５】
細胞中のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン １−カルボキシビニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の少なくとも１つのコピーが、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン １−カルボキシビニルトランスフェラーゼを低発現するように、又は発現しないように、又は下方調節された活性で発現するように変異されている、請求項１９〜２４の何れか一項に記載の方法。
【請求項２６】
１つ又はそれ以上の酵素の活性又は量が、野生型レンサ球菌細胞と比較して、１つ又はそれ以上の酵素によるＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンの使用の削減をもたらす、請求項１９〜２５の何れか一項に記載の方法。
【請求項２７】
産生されたヒアルロン酸が野生型レンサ球菌細胞と比較して高い平均分子量からなる、請求項１９〜２６の何れか一項に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１〜２７の何れか一項に記載の方法によって得られるか又は得られ得るヒアルロン酸。
【請求項２９】
少なくとも３ＭＤａの平均分子量を有している、請求項２８項に記載のヒアルロン酸。
【請求項３０】
実質的に架橋を有していない、請求項２８又は２９に記載のヒアルロン酸。
【請求項３１】
ヒアルロン酸の合成のための酵素を含有してなるレンサ球菌細胞（ここにおいて、当該細胞は、
（ａ）ホスホグルコイソメラーゼ；
（ｂ）Ｄ−フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ；
（ｃ）ホスホグルコサミンムターゼ；
（ｄ）グルコサミン−１−リン酸アセチルトランスフェラーゼ；
（ｅ）Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸ピロホスホリラーゼ
（ｆ）グルコサミン−６−リン酸アセチルトランスフェラーゼ；及び
（ｇ）ホスホアセチルグルコサミンムターゼ：
から選ばれる１つ又はそれ以上の酵素を過剰発現又は上方調節された活性で発現するように処理されているか又は遺伝子組み替えされている）。
【請求項３２】
ヒアルロン酸の合成のための酵素を含有してなるレンサ球菌細胞（ここにおいて、当該細胞は、
（ａ）ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン １−カルボキシビニルトランスフェラーゼ；及び
（ｂ）ウンデカプレニルジホスホ−ムラモイルペンタペプチド ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ；
から選ばれる１つ又はそれ以上の酵素を低発現するように、又は発現しないように、又は下方調節された活性で発現するように処理されているか又は遺伝子組み替えされている）。
【請求項３３】
細胞中のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン １−カルボキシビニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の少なくとも１つのコピーが、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン １−カルボキシビニルトランスフェラーゼを低発現するように、又は発現しないように、又は下方調節された活性で発現するように変異されている、請求項３２に記載の細胞。
【請求項３４】
請求項２８〜３０の何れか一項に記載のヒアルロン酸及び薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤を含有してなる、医薬組成物。
【請求項３５】
請求項２８〜３０の何れか一項に記載のヒアルロン酸及び美容的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤を含有してなる、化粧品組成物。
【請求項３６】
請求項２８〜３０の何れか一項に記載のヒアルロン酸を含有してなる、食品又は食品添加物。
【請求項１】
方法が、培地中でレンサ球菌細胞を生育すること（ここにおいて、当該細胞はヒアルロン酸合成に必要な酵素を発現し、
当該細胞中の、
（ａ）ホスホグルコイソメラーゼ；
（ｂ）Ｄ−フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ；
（ｃ）ホスホグルコサミンムターゼ；
（ｄ）グルコサミン−１−リン酸アセチルトランスフェラーゼ；
（ｅ）Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸ピロホスホリラーゼ
（ｆ）グルコサミン−６−リン酸アセチルトランスフェラーゼ；及び
（ｇ）ホスホアセチルグルコサミンムターゼ：
から選ばれる１つ又はそれ以上の酵素の活性又は量が増大されている）、それによりヒアルロン酸を産生することを含有してなる、ヒアルロン酸を産生する方法。
【請求項２】
細胞によって産生されたヒアルロン酸を回収することを更に含有してなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
方法が、ヒアルロン酸合成に必要な酵素を発現するレンサ球菌細胞からヒアルロン酸を回収すること（ここにおいて、当該細胞中の、
（ａ）ホスホグルコイソメラーゼ；
（ｂ）Ｄ−フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ；
（ｃ）ホスホグルコサミンムターゼ；
（ｄ）グルコサミン−１−リン酸アセチルトランスフェラーゼ；
（ｅ）Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸ピロホスホリラーゼ
（ｆ）グルコサミン−６−リン酸アセチルトランスフェラーゼ；及び
（ｇ）ホスホアセチルグルコサミンムターゼ：
から選ばれる１つ又はそれ以上の酵素の活性又は量が増大されている）を含有してなる、ヒアルロン酸を産生する方法。
【請求項４】
方法が、培地中でレンサ球菌細胞を生育すること（ここにおいて、当該細胞がヒアルロン酸合成に必要な酵素を発現し、
細胞中の、
（ａ）ホスホグルコイソメラーゼ；
（ｂ）Ｄ−フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ；
（ｃ）ホスホグルコサミンムターゼ；
（ｄ）グルコサミン−１−リン酸アセチルトランスフェラーゼ；
（ｅ）Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸ピロホスホリラーゼ
（ｆ）グルコサミン−６−リン酸アセチルトランスフェラーゼ；及び
（ｇ）ホスホアセチルグルコサミンムターゼ：
から選ばれる１つ又はそれ以上の酵素の活性又は量を増大するように当該細胞が組み替 えられているか又は処理されている）、それによりヒアルロン酸を産生することを含有してなる、ヒアルロン酸を産生する方法。
【請求項５】
細胞によって産生されたヒアルロン酸を回収することを更に含有してなる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
方法が、ヒアルロン酸合成に必要な酵素を発現するレンサ球菌細胞からヒアルロン酸を回収すること（ここにおいて、細胞中の、
（ａ）ホスホグルコイソメラーゼ；
（ｂ）Ｄ−フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ；
（ｃ）ホスホグルコサミンムターゼ；
（ｄ）グルコサミン−１−リン酸アセチルトランスフェラーゼ；
（ｅ）Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸ピロホスホリラーゼ
（ｆ）グルコサミン−６−リン酸アセチルトランスフェラーゼ；及び
（ｇ）ホスホアセチルグルコサミンムターゼ：
から選ばれる１つ又はそれ以上の酵素の活性又は量を増大するように当該細胞が組み替 えられているか又は処理されている）を含有してなる、ヒアルロン酸を産生する方法。
【請求項７】
細胞中の１つ又はそれ以上の酵素の活性又は量が、野生型レンサ球菌細胞と比較してより多くのＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンを産生する、請求項１〜６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
産生されたヒアルロン酸が野生型レンサ球菌細胞と比較してより高い平均分子量からなる、請求項１〜７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
方法が、培地中でレンサ球菌細胞を培養すること（ここにおいて、当該細胞はヒアルロン酸合成に必要な酵素を発現する）；及び
（ａ）ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン；
（ｂ）Ｎ−アセチルグルコサミン；及び
（ｃ）グルコサミン；
から選ばれる１つ又はそれ以上の基質を提供すること、それによってヒアルロン酸を産生することを含有してなる、ヒアルロン酸を産生する方法。
【請求項１０】
細胞によって産生されたヒアルロン酸を回収することを更に含有してなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
方法が、ヒアルロン酸合成に必要な酵素を発現するレンサ球菌細胞からヒアルロン酸を回収すること（ここにおいて、
（ａ）ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン；
（ｂ）Ｎ−アセチルグルコサミン；及び
（ｃ）グルコサミン；
から選ばれる１つ又はそれ以上の基質が提供されている）を含有してなる、ヒアルロン酸を産生する方法。
【請求項１２】
（ａ）グルタミン；
（ｂ）アセチル−ＣｏＡ；及び
（ｃ）ＵＴＰ；
から選ばれる１つ又はそれ以上の代謝物を提供することを更に含有してなる、請求項９〜１１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３】
方法が、培地中でレンサ球菌細胞を生育すること（ここにおいて、当該細胞がヒアルロン酸合成に必要な酵素を発現して；
細胞中の
（ａ）ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン；
（ｂ）Ｎ−アセチルグルコサミン；及び
（ｃ）グルコサミン；
から選ばれる１つ又はそれ以上の基質の量を増大するように当該細胞が組み替えられているか又は処理されている）、それによりヒアルロン酸を産生することを含有してなる、ヒアルロン酸を産生する方法。
【請求項１４】
細胞によって産生されたヒアルロン酸を回収することを更に含有してなる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
方法が、ヒアルロン酸合成に必要な酵素を発現するレンサ球菌細胞からヒアルロン酸を回収すること（ここにおいて、細胞中の
（ａ）ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン；
（ｂ）Ｎ−アセチルグルコサミン；及び
（ｃ）グルコサミン；
から選ばれる１つ又はそれ以上の基質の量を増大するように当該細胞が組み替えられているか又は処理されている）を含有してなる、ヒアルロン酸を産生する方法。
【請求項１６】
細胞中の
（ａ）グルタミン；
（ｂ）アセチル−ＣｏＡ；及び
（ｃ）ＵＴＰ；
から選ばれる１つ又はそれ以上の代謝物の量を増大するように当該細胞が組み替えられているか又は処理されている、請求項１３〜１５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１７】
細胞中のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンの量が野生型レンサ球菌細胞と比較して多い、請求項９〜１６の何れか一項に記載の方法。
【請求項１８】
産生されたヒアルロン酸が野生型レンサ球菌細胞と比較してより高い平均分子量からなる、請求項９〜１６の何れか一項に記載の方法。
【請求項１９】
方法が、培地中でレンサ球菌細胞（当該細胞はヒアルロン酸合成に必要な酵素を発現する）を生育すること（ここにおいて、当該細胞中の、
（ａ）ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン １−カルボキシビニルトランスフェラーゼ；及び
（ｂ）ウンデカプレニルジホスホ−ムラモイルペンタペプチド ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ；
から選ばれる１つ又はそれ以上の酵素の活性又は量が減少又無効にされている）、それによりヒアルロン酸を産生することを含有してなる、ヒアルロン酸を産生する方法。
【請求項２０】
細胞によって産生されたヒアルロン酸を回収することを更に含有してなる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
方法が、ヒアルロン酸合成に必要な酵素を発現するレンサ球菌細胞からヒアルロン酸を回収すること（ここにおいて、当該細胞中の、
（ａ）ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン １−カルボキシビニルトランスフェラーゼ；及び
（ｂ）ウンデカプレニルジホスホ−ムラモイルペンタペプチド ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ；
から選ばれる１つ又はそれ以上の酵素の活性又は量が減少又無効にされている）を含有してなる、ヒアルロン酸を産生する方法。
【請求項２２】
方法が、培地中でレンサ球菌細胞（当該細胞はヒアルロン酸合成に必要な酵素を発現する）を生育すること（ここにおいて、当該細胞はヒアルロン酸合成に必要な酵素を発現し、細胞中の、
（ａ）ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン １−カルボキシビニルトランスフェラーゼ；及び
（ｂ）ウンデカプレニルジホスホ−ムラモイルペンタペプチド ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ；
から選ばれる１つ又はそれ以上の酵素の活性又は量を減少又無効するように当該細胞が組み替えられているか又は処理されている）、それによりヒアルロン酸を産生することを含有してなる、ヒアルロン酸を産生する方法。
【請求項２３】
細胞によって産生されたヒアルロン酸を回収することを更に含有してなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
方法が、ヒアルロン酸合成に必要な酵素を発現するレンサ球菌細胞からヒアルロン酸を回収すること（ここにおいて、細胞中の、
（ａ）ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン １−カルボキシビニルトランスフェラーゼ；及び
（ｂ）ウンデカプレニルジホスホ−ムラモイルペンタペプチド ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ；
から選ばれる１つ又はそれ以上の酵素の活性又は量を減少又無効にするように当該細胞が組み替えられているか又は処理されている）を含有してなる、ヒアルロン酸を産生する方法。
【請求項２５】
細胞中のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン １−カルボキシビニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の少なくとも１つのコピーが、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン １−カルボキシビニルトランスフェラーゼを低発現するように、又は発現しないように、又は下方調節された活性で発現するように変異されている、請求項１９〜２４の何れか一項に記載の方法。
【請求項２６】
１つ又はそれ以上の酵素の活性又は量が、野生型レンサ球菌細胞と比較して、１つ又はそれ以上の酵素によるＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンの使用の削減をもたらす、請求項１９〜２５の何れか一項に記載の方法。
【請求項２７】
産生されたヒアルロン酸が野生型レンサ球菌細胞と比較して高い平均分子量からなる、請求項１９〜２６の何れか一項に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１〜２７の何れか一項に記載の方法によって得られるか又は得られ得るヒアルロン酸。
【請求項２９】
少なくとも３ＭＤａの平均分子量を有している、請求項２８項に記載のヒアルロン酸。
【請求項３０】
実質的に架橋を有していない、請求項２８又は２９に記載のヒアルロン酸。
【請求項３１】
ヒアルロン酸の合成のための酵素を含有してなるレンサ球菌細胞（ここにおいて、当該細胞は、
（ａ）ホスホグルコイソメラーゼ；
（ｂ）Ｄ−フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ；
（ｃ）ホスホグルコサミンムターゼ；
（ｄ）グルコサミン−１−リン酸アセチルトランスフェラーゼ；
（ｅ）Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸ピロホスホリラーゼ
（ｆ）グルコサミン−６−リン酸アセチルトランスフェラーゼ；及び
（ｇ）ホスホアセチルグルコサミンムターゼ：
から選ばれる１つ又はそれ以上の酵素を過剰発現又は上方調節された活性で発現するように処理されているか又は遺伝子組み替えされている）。
【請求項３２】
ヒアルロン酸の合成のための酵素を含有してなるレンサ球菌細胞（ここにおいて、当該細胞は、
（ａ）ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン １−カルボキシビニルトランスフェラーゼ；及び
（ｂ）ウンデカプレニルジホスホ−ムラモイルペンタペプチド ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ；
から選ばれる１つ又はそれ以上の酵素を低発現するように、又は発現しないように、又は下方調節された活性で発現するように処理されているか又は遺伝子組み替えされている）。
【請求項３３】
細胞中のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン １−カルボキシビニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の少なくとも１つのコピーが、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン １−カルボキシビニルトランスフェラーゼを低発現するように、又は発現しないように、又は下方調節された活性で発現するように変異されている、請求項３２に記載の細胞。
【請求項３４】
請求項２８〜３０の何れか一項に記載のヒアルロン酸及び薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤を含有してなる、医薬組成物。
【請求項３５】
請求項２８〜３０の何れか一項に記載のヒアルロン酸及び美容的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤を含有してなる、化粧品組成物。
【請求項３６】
請求項２８〜３０の何れか一項に記載のヒアルロン酸を含有してなる、食品又は食品添加物。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【公表番号】特表２０１０−５３６３８７（Ｐ２０１０−５３６３８７Ａ）
【公表日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２２１３０（Ｐ２０１０−５２２１３０）
【出願日】平成２０年８月２９日（２００８．８．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＵ２００８／００１２６７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０２６６３５
【国際公開日】平成２１年３月５日（２００９．３．５）
【出願人】（５０００２０７６０）ザ・ユニバーシティ・オブ・クイーンズランド (20)
【出願人】（５１００５１２６６）シュガー インダストリー イノヴェーション プロプライエタリ リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月２９日（２００８．８．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＵ２００８／００１２６７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０２６６３５
【国際公開日】平成２１年３月５日（２００９．３．５）
【出願人】（５０００２０７６０）ザ・ユニバーシティ・オブ・クイーンズランド (20)
【出願人】（５１００５１２６６）シュガー インダストリー イノヴェーション プロプライエタリ リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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