メラニン合成抑制剤
【課題】 メラニン合成抑制剤並びに美白剤として有用な植物とその抽出物を提供すること。
【解決手段】 ケールスプラウト若しくはその粉砕物またはケールスプラウト抽出物がメラニン合成抑制活性を有することを解明し、美白剤として使用可能であることを見出し、本発明を完成させた。本発明によると、ケールスプラウト若しくはその粉砕物またはケールスプラウト抽出物のメラニン合成抑制活性は、従来技術のコウジ酸やケールの成熟体と比較しても高い活性を示した。
【解決手段】 ケールスプラウト若しくはその粉砕物またはケールスプラウト抽出物がメラニン合成抑制活性を有することを解明し、美白剤として使用可能であることを見出し、本発明を完成させた。本発明によると、ケールスプラウト若しくはその粉砕物またはケールスプラウト抽出物のメラニン合成抑制活性は、従来技術のコウジ酸やケールの成熟体と比較しても高い活性を示した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ケールスプラウト若しくはその粉砕物またはケールスプラウトの抽出物を含有するメラニン合成抑制剤並びにメラニン合成抑制剤を含有する美白剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
シミやソバカスは、ホルモン分泌の異常や紫外線への曝露に起因する皮膚症状である。紫外線により、皮膚内に存在するチロシンがチロシナーゼの働きにより酸化されてメラニン色素が過剰に産生されるとシミ、ソバカスの原因となる。シミやソバカスのない美しい肌を保つには紫外線から皮膚を防御することが大切であるが、紫外線に全く曝露されない日常生活をおくることは現実的には不可能である。そのため、多くの人々が紫外線によるシミやソバカスの生成を緩和・軽減する素材を必要としている。現在までに、上記のような機能性素材を見つけるため多くの研究がなされてきた。その結果、コウジ酸（特許文献１）、バラやキク（特許文献２）などは、メラニン合成抑制活性を示し、美白剤として有用であることが知られている。また、ケールの成熟体に関しても、メラニン合成抑制活性を示し、美白剤として有用であることが知られている（特許文献３）。
【特許文献１】特公昭６３−２４９６８号公報
【特許文献２】特開２００１−４８８０１号公報
【特許文献３】特開２００４−９１３９６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
従来のメラニン合成抑制剤は活性が十分に認められないことがあり、それ故に美白剤としての効果も不十分な場合があった。本発明はメラニン合成抑制剤さらには美白剤として有用な植物とその抽出物を提供すること目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
そこで、本研究者らは、鋭意研究を重ねた結果、ケールスプラウト若しくはその粉砕物またはケールスプラウト抽出物を含有することを特徴とするメラニン合成抑制剤と、メラニン合成抑制剤を含有する美白剤を見出し、本発明を完成させた。
【０００５】
本発明によると、ケールスプラウトのメラニン合成抑制活性は、ケールの成熟体と比較しても顕著に強い活性を示した。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
以下、本発明について詳細に説明する。
【０００７】
本発明のメラニン合成抑制剤並びに美白剤は、ケールスプラウトまたはその抽出物を含有することを特徴とする。
【０００８】
ケールスプラウトは、アブラナ科ブラシカ属に属するケールのスプラウトをいい、具体的には発芽後、本葉展開前に収穫した幼植物体をいう。ケールスプラウトは発芽ケールとも呼ばれている。
【０００９】
一般にアブラナ科のスプラウトは成熟体に比べ、スルフォラファンやグルコシノレート類が多く含まれており、大腸ガン予防作用（特開２００５−６０２２９）や神経成長因子産生促進作用（特開２００７−１５９５８）などが報告されている。そのため、ケールスプラウトにはケールとは異なる様々な効果が期待されている。
また、ブロッコリーのスプラウトには、メラニン合成抑制活性があることも報告されている（特開２００３−１５５２２１）。
【００１０】
本発明に用いるケールの品種は特に制限されず、キッチンケール、ツリーケール、ブッシュケール、マローケール、シベリアンケール、スコッチケール、コラードおよび緑葉カンラン等の様々な種類のケールを使用することができる。また、栽培方法や栽培地に関しては特に限定されるものでもない。
【００１１】
本発明において、ケールスプラウトとは前記各種ケールのスプラウトをいい、例えばケールの種子を、９℃〜３１℃、好ましくは１２℃〜２８℃、さらに好ましくは１５℃〜２５℃で水に浸漬させ、１日間〜７日間、好ましくは２日間〜６日間、さらに好ましくは３日間〜５日間発芽させた後、芽を１ｍｍ〜１００ｍｍ、好ましくは５ｍｍ〜７５ｍｍ、さらに好ましくは１０ｍｍ〜５０ｍｍに成長させることによって得られる。
【００１２】
ケールスプラウトは、収穫後直ちに処理することが好ましく、処理までに時間を要する場合、その変質を防ぐために、低温貯蔵などの当業者が通常用いる手段により貯蔵される。
【００１３】
ケールスプラウトは、水などで付着物を洗浄した後、必要に応じて、適当な大きさに細片化される。細片化は、当業者が通常使用するスライス、破砕、細断などの植物体を細片化する方法で行われる。
【００１４】
本発明に用いるケールスプラウトは上記ケールスプラウトを乾燥して得られる乾燥物、粉砕物またはこれらの抽出物のすべてが含まれる。
【００１５】
本発明に用いるケールスプラウト抽出物には、抽出処理によって抽出原料から得られる抽出液、抽出液の希釈液若しくは濃縮液、抽出液を乾燥して得られる乾燥物、またはこれらの抽出後の粗精製物若しくは精製物のすべてが含まれる。
ケールスプラウト抽出物の溶液中のケールスプラウト濃度は特に制限はないが、好ましくは０．０１〜１００質量％程度である。
【００１６】
抽出溶媒の例としては水（熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等を含む）、低級１価アルコール（メチルアルコール、エチルアルコール等）、液状多価アルコール（グリセリン、１，３−ブチレングリコール等）、低級エステル（酢酸エチル等）、エーテル類（ジエチルエーテル等）、アセトニトリル等が挙げられ、それらの一種または二種以上を用いることができる。
【００１７】
抽出処理は、ケールスプラウトに含まれる可溶性成分を溶出させる限り特に限定されず、常法に従って行うことができる。抽出処理の際には特殊な抽出方法を採用する必要はなく、室温ないし還流加熱下において任意の装置を使用することができる。抽出処理により可溶性成分を溶出させた後、ろ過して抽出残渣を除くことにより、抽出液を得ることができる。
【００１８】
得られた抽出液は、抽出液の希釈液若しくは濃縮液、抽出液の乾燥物、またはこれらの精製物を得るために、常法に従って希釈、濃縮、乾燥、精製等の処理を施してもよい。抽出液の乾燥物を得るに当たっては、吸湿性を改善するためにデキストリン、シクロデキストリン等のキャリアーを添加してもよい。
【００１９】
ケールスプラウト若しくはその粉砕物またはケールスプラウトの抽出物は、そのままメラニン合成抑制剤並びに美白剤として利用できるほか、更に医薬品類または医薬部外品類または化粧料または飲食品類へ配合できる。
【００２０】
本発明の剤は、経口で又は非経口で投与することができる。
【００２１】
本発明の剤のケールスプラウト若しくはその粉砕物またはケールスプラウトの抽出物の配合量としては、乾燥重量として０．０００１〜５０質量％が好ましく、０．０１〜１０質量％がさらに好ましいが、用いる剤型、使用対象等の様々の条件に応じて、広範囲でその配合量を適宜設定できる。
【００２２】
尚、本発明のメラニン合成抑制剤並びに美白剤は、必要に応じ、本発明の効果を損なわない範囲内で、医薬品類、医薬部外品類、化粧料、飲食品類などの製剤に使用される成分や添加剤、すなわち、水、アルコール類、界面活性剤、ゲル化剤、水溶性高分子、皮膜形成剤、樹脂、包接化合物、抗菌剤、香料、消臭剤、塩類、ｐＨ調整剤、清涼剤、植物・動物抽出物、血行促進剤、収斂剤、抗脂漏剤、保湿剤、キレート剤、角質溶解剤、酵素、ホルモン類、ビタミン類等を任意に選択・併用して製造することができる。
【００２３】
医薬品類、医薬部外品類としては、アンプル状、カプセル状、粉末状、顆粒状、丸剤、錠剤状、固形状、液状、シート状などの種々の形態で提供することができる。
【００２４】
化粧料としては、前記メラニン合成抑制剤並びに美白剤をそのまま、または種々の美容成分を加えて、柔軟性化粧水、収れん性化粧水、洗浄用化粧水等の化粧水類、エモリエントクリーム、モイスチュアクリーム、マッサージクリーム、クレンジングクリーム、メイクアップクリーム等のクリーム類、エモリエント乳液、モイスチュア乳液、ナリシング乳液、クレンジング乳液等の乳液類、ゼリー状パック、ピールオフパック、洗い流しパック、粉末パック等のパック類、美容液、洗顔料、養毛剤、育毛剤、パック、口紅、リップクリーム、ファンデーション、シャンプー、リンス、トリートメント、及び浴用剤といった種々の製剤形態で提供することができる。
【００２５】
飲食品類としては、前記メラニン合成抑制剤並びに美白剤をそのまま、または種々の栄養成分を加えて、保健用食品または栄養補助食品または食品素材として提供することができる。
【００２６】
飲食品の組成物としては、食用に適した形態、例えば、カプセル状、粉末状、顆粒状、丸剤、錠剤状、固形状、液状、シート状などに成形して食用に供してもよく、また種々の食品、例えば、食肉加工食品、水産加工食品、発酵乳製品に添加して使用することができ、水、果汁、牛乳、清涼飲料などの飲料に添加して使用してもよい。また、砂糖、乳糖、麦芽糖などの適当な助剤を添加することもできる。
【実施例】
【００２７】
以下、本発明の実施例について説明する。なお、本発明は、下記の実施例に限定して解釈すべきではなく、特許請求の範囲における記載の範囲内で種々の変更が可能である。
【００２８】
（ケールスプラウトの粉砕物、ケールスプラウト抽出物の調製）
ケールの種子を１５℃〜２５℃の水に浸漬させ、４日間発芽させた後、芽を１０〜５０ｍｍに成長させた全草（芽、種子、根）を乾燥し、粉砕処理工程を経て、粉砕、殺菌、篩過して、粉砕物を得た。得られた粉砕物５０ｇを、５０％エチルアルコールを用いて抽出した。抽出後濾過し、濾液の溶媒を除き、ケールスプラウト抽出物１２ｇを得た。
【００２９】
（ケールの粉砕物、ケール抽出物の調製）
ケールの成熟体を乾燥し、粉砕処理工程を経て、粉砕、殺菌、篩過して、粉砕物を得た。得られた粉砕物５０ｇを、５０％エチルアルコールを用いて抽出した。抽出後濾過し、濾液の溶媒を除き、ケール抽出物１０ｇを得た。
【００３０】
（試験培地の調製）
テオフィリン（和光純薬工業株式会社製）を１３３．４ｍＭとなるようにＤＭＳＯ（和光純薬工業株式会社製）で溶解した。さらに、通常培地（１０％ウシ胎児血清含有Ｄ−ＭＥＭ：シグマ製）で４００倍に希釈し試験培地とした。
【００３１】
（Ｂ１６メラノーマ細胞の調製）
メラニン合成抑制活性の評価に用いたＢ１６メラノーマ細胞の調製は、以下のように行った。マウス由来の凍結Ｂ１６メラノーマ細胞（ＲＣＢ１２８３：独立行政法人理化学研究所）を通常培地を用いて融解し、６ｗｅｌｌプレートに播種後、炭酸ガスインキュベーター内で培養した。さらに６ｗｅｌｌプレートから７５ｃｍ２フラスコへ継代して、炭酸ガスインキュベーターで培養を継続した。その後、７５ｃｍ２フラスコから細胞を回収して６ｗｅｌｌプレートに播種し、炭酸ガスインキュベーター内で２４時間培養を行った。上記プレートより培地を除去後、被験物質を含んだ培地を１．５ｍｌ／ｗｅｌｌで添加し、更に試験培地を１．５ｍｌ／ｗｅｌｌで添加し３日間培養を行った。培養後、各ｗｅｌｌから細胞培養上清を除去し、２ｍｌのリン酸緩衝液（ＰＢＳ（−）：シグマ製）で細胞を１回洗浄後、ＰＢＳ（−）にて希釈したＴｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（シグマ製）を５００μｌ／ｗｅｌｌ添加した。室温で４〜５分間処理後、１０％ウシ胎児血清含有ＰＢＳ（−）を５００μｌ／ｗｅｌｌ添加してトリプシンの中和をした。その後、ピペッティングにて細胞の剥離を行い、細胞を回収した。２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行い、上清を除去した後、１ｍｌのＰＢＳ（−）を添加し懸濁後に、懸濁液６０μｌをサンプリングし、細胞数を計測した。残りの細胞は遠心分離を行い、上清を完全に除去した。細胞に１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を２５０μｌ添加し、６５℃〜７５℃の恒温槽で６０分間加温後、振盪し完全に溶解した。
【００３２】
（メラニン合成抑制活性の測定）
メラニン合成抑制活性は、以下のように評価した。得られたマウス由来のＢ１６メラノーマ細胞溶解液を９６ｗｅｌｌプレートへ２００μｌ／ｗｅｌｌで移し、バリオスキャン（サーモ製）にて合成メラニン量を４９０ｎｍの波長で測定した。
【００３３】
メラニン合成抑制活性は次の式から求められる阻害率で表した。
(数１) 阻害率（％）＝１００−(被験物質の吸光度／陰性コントールの吸光度)×１００
【００３４】
さらに、濃度と活性の回帰分析から、IC50（50%阻害濃度）を算出した。
【００３５】
（実施例１）
ケールスプラウトの粉砕物を３ｍｇ／ｍｌの濃度となるように試験培地に浸漬し、1時間室温処理した。その後、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、上清を０．２μｍのフィルターで濾過滅菌したものを実施例１とした。
【００３６】
（実施例２）
ケールスプラウト抽出物を０．３３ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌの濃度となるように試験培地に浸漬し、1時間室温処理した。その後、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、上清を０．２μｍのフィルターで濾過滅菌したものを実施例２とした。
【００３７】
（比較例１）
ケール（スプラウトではなく、成熟体）の粉砕物を３ｍｇ／ｍｌの濃度となるように試験培地に浸漬し、1時間室温処理した。その後、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、上清を０．２μｍのフィルターで濾過滅菌したものを比較例１とした。
【００３８】
（比較例２）
ケール（スプラウトではなく、成熟体）の抽出物を０．３３ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌの濃度となるように試験培地に浸漬し、1時間室温処理した。その後、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、上清を０．２μｍのフィルターで濾過滅菌したものを比較例２とした。
【００３９】
（陽性コントール）
コウジ酸を蒸留水で溶解後、試験培地にて０．１５ｍｇ／ｍｌの濃度になるように調製後、０．２μｍのフィルターで濾過滅菌したものを陽性コントロールとした。
【００４０】
（陰性コントール）
試験培地のみを０．２μｍのフィルターで濾過滅菌したものを陰性コントロールとした。
【００４１】
結果を表１、表２に示す。
【００４２】
【表１】
【００４３】
【表２】
【００４４】
表１に示すように、ケールスプラウトの阻害率は８０．６％であり、高い活性が確認できた。また、成熟体のケールと比較しても顕著に高いメラニン合成抑制活性を有していた。
【００４５】
さらに、ケールスプラウト抽出物の阻害率は０．３３ｍｇ／ｍｌ濃度で６０．４％を示し、同濃度のケール抽出物（４１．０％）と比較して高い阻害率を示した。また、１．０ｍｇ／ｍｌの濃度では８６．６％の阻害率を示し、従来技術のコウジ酸（６６．３％）と比較しても高いメラニン合成抑制活性を有していた。
【００４６】
また、表２に示すIC50値から、ケールスプラウトはケールと比較して２倍以上の活性を示すことが明らかとなった。
【００４７】
以上の結果より、ケールスプラウトおよびケールスプラウトの抽出物が高いメラニン合成抑制活性を示す素材であることが明らかとなった。
【００４８】
また、ケールスプラウトはケールと比較しても、高いメラニン合成抑制活性を示し、メラニン合成抑制剤並びにメラニン合成抑制剤を含有する美白剤としても非常に有用な素材であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明により、ケールスプラウト若しくはその粉砕物またはケールスプラウト抽出物に由来する有用なメラニン合成抑制剤並びにメラニン合成抑制剤を含有する美白剤を提供できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ケールスプラウト若しくはその粉砕物またはケールスプラウトの抽出物を含有するメラニン合成抑制剤並びにメラニン合成抑制剤を含有する美白剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
シミやソバカスは、ホルモン分泌の異常や紫外線への曝露に起因する皮膚症状である。紫外線により、皮膚内に存在するチロシンがチロシナーゼの働きにより酸化されてメラニン色素が過剰に産生されるとシミ、ソバカスの原因となる。シミやソバカスのない美しい肌を保つには紫外線から皮膚を防御することが大切であるが、紫外線に全く曝露されない日常生活をおくることは現実的には不可能である。そのため、多くの人々が紫外線によるシミやソバカスの生成を緩和・軽減する素材を必要としている。現在までに、上記のような機能性素材を見つけるため多くの研究がなされてきた。その結果、コウジ酸（特許文献１）、バラやキク（特許文献２）などは、メラニン合成抑制活性を示し、美白剤として有用であることが知られている。また、ケールの成熟体に関しても、メラニン合成抑制活性を示し、美白剤として有用であることが知られている（特許文献３）。
【特許文献１】特公昭６３−２４９６８号公報
【特許文献２】特開２００１−４８８０１号公報
【特許文献３】特開２００４−９１３９６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
従来のメラニン合成抑制剤は活性が十分に認められないことがあり、それ故に美白剤としての効果も不十分な場合があった。本発明はメラニン合成抑制剤さらには美白剤として有用な植物とその抽出物を提供すること目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
そこで、本研究者らは、鋭意研究を重ねた結果、ケールスプラウト若しくはその粉砕物またはケールスプラウト抽出物を含有することを特徴とするメラニン合成抑制剤と、メラニン合成抑制剤を含有する美白剤を見出し、本発明を完成させた。
【０００５】
本発明によると、ケールスプラウトのメラニン合成抑制活性は、ケールの成熟体と比較しても顕著に強い活性を示した。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
以下、本発明について詳細に説明する。
【０００７】
本発明のメラニン合成抑制剤並びに美白剤は、ケールスプラウトまたはその抽出物を含有することを特徴とする。
【０００８】
ケールスプラウトは、アブラナ科ブラシカ属に属するケールのスプラウトをいい、具体的には発芽後、本葉展開前に収穫した幼植物体をいう。ケールスプラウトは発芽ケールとも呼ばれている。
【０００９】
一般にアブラナ科のスプラウトは成熟体に比べ、スルフォラファンやグルコシノレート類が多く含まれており、大腸ガン予防作用（特開２００５−６０２２９）や神経成長因子産生促進作用（特開２００７−１５９５８）などが報告されている。そのため、ケールスプラウトにはケールとは異なる様々な効果が期待されている。
また、ブロッコリーのスプラウトには、メラニン合成抑制活性があることも報告されている（特開２００３−１５５２２１）。
【００１０】
本発明に用いるケールの品種は特に制限されず、キッチンケール、ツリーケール、ブッシュケール、マローケール、シベリアンケール、スコッチケール、コラードおよび緑葉カンラン等の様々な種類のケールを使用することができる。また、栽培方法や栽培地に関しては特に限定されるものでもない。
【００１１】
本発明において、ケールスプラウトとは前記各種ケールのスプラウトをいい、例えばケールの種子を、９℃〜３１℃、好ましくは１２℃〜２８℃、さらに好ましくは１５℃〜２５℃で水に浸漬させ、１日間〜７日間、好ましくは２日間〜６日間、さらに好ましくは３日間〜５日間発芽させた後、芽を１ｍｍ〜１００ｍｍ、好ましくは５ｍｍ〜７５ｍｍ、さらに好ましくは１０ｍｍ〜５０ｍｍに成長させることによって得られる。
【００１２】
ケールスプラウトは、収穫後直ちに処理することが好ましく、処理までに時間を要する場合、その変質を防ぐために、低温貯蔵などの当業者が通常用いる手段により貯蔵される。
【００１３】
ケールスプラウトは、水などで付着物を洗浄した後、必要に応じて、適当な大きさに細片化される。細片化は、当業者が通常使用するスライス、破砕、細断などの植物体を細片化する方法で行われる。
【００１４】
本発明に用いるケールスプラウトは上記ケールスプラウトを乾燥して得られる乾燥物、粉砕物またはこれらの抽出物のすべてが含まれる。
【００１５】
本発明に用いるケールスプラウト抽出物には、抽出処理によって抽出原料から得られる抽出液、抽出液の希釈液若しくは濃縮液、抽出液を乾燥して得られる乾燥物、またはこれらの抽出後の粗精製物若しくは精製物のすべてが含まれる。
ケールスプラウト抽出物の溶液中のケールスプラウト濃度は特に制限はないが、好ましくは０．０１〜１００質量％程度である。
【００１６】
抽出溶媒の例としては水（熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等を含む）、低級１価アルコール（メチルアルコール、エチルアルコール等）、液状多価アルコール（グリセリン、１，３−ブチレングリコール等）、低級エステル（酢酸エチル等）、エーテル類（ジエチルエーテル等）、アセトニトリル等が挙げられ、それらの一種または二種以上を用いることができる。
【００１７】
抽出処理は、ケールスプラウトに含まれる可溶性成分を溶出させる限り特に限定されず、常法に従って行うことができる。抽出処理の際には特殊な抽出方法を採用する必要はなく、室温ないし還流加熱下において任意の装置を使用することができる。抽出処理により可溶性成分を溶出させた後、ろ過して抽出残渣を除くことにより、抽出液を得ることができる。
【００１８】
得られた抽出液は、抽出液の希釈液若しくは濃縮液、抽出液の乾燥物、またはこれらの精製物を得るために、常法に従って希釈、濃縮、乾燥、精製等の処理を施してもよい。抽出液の乾燥物を得るに当たっては、吸湿性を改善するためにデキストリン、シクロデキストリン等のキャリアーを添加してもよい。
【００１９】
ケールスプラウト若しくはその粉砕物またはケールスプラウトの抽出物は、そのままメラニン合成抑制剤並びに美白剤として利用できるほか、更に医薬品類または医薬部外品類または化粧料または飲食品類へ配合できる。
【００２０】
本発明の剤は、経口で又は非経口で投与することができる。
【００２１】
本発明の剤のケールスプラウト若しくはその粉砕物またはケールスプラウトの抽出物の配合量としては、乾燥重量として０．０００１〜５０質量％が好ましく、０．０１〜１０質量％がさらに好ましいが、用いる剤型、使用対象等の様々の条件に応じて、広範囲でその配合量を適宜設定できる。
【００２２】
尚、本発明のメラニン合成抑制剤並びに美白剤は、必要に応じ、本発明の効果を損なわない範囲内で、医薬品類、医薬部外品類、化粧料、飲食品類などの製剤に使用される成分や添加剤、すなわち、水、アルコール類、界面活性剤、ゲル化剤、水溶性高分子、皮膜形成剤、樹脂、包接化合物、抗菌剤、香料、消臭剤、塩類、ｐＨ調整剤、清涼剤、植物・動物抽出物、血行促進剤、収斂剤、抗脂漏剤、保湿剤、キレート剤、角質溶解剤、酵素、ホルモン類、ビタミン類等を任意に選択・併用して製造することができる。
【００２３】
医薬品類、医薬部外品類としては、アンプル状、カプセル状、粉末状、顆粒状、丸剤、錠剤状、固形状、液状、シート状などの種々の形態で提供することができる。
【００２４】
化粧料としては、前記メラニン合成抑制剤並びに美白剤をそのまま、または種々の美容成分を加えて、柔軟性化粧水、収れん性化粧水、洗浄用化粧水等の化粧水類、エモリエントクリーム、モイスチュアクリーム、マッサージクリーム、クレンジングクリーム、メイクアップクリーム等のクリーム類、エモリエント乳液、モイスチュア乳液、ナリシング乳液、クレンジング乳液等の乳液類、ゼリー状パック、ピールオフパック、洗い流しパック、粉末パック等のパック類、美容液、洗顔料、養毛剤、育毛剤、パック、口紅、リップクリーム、ファンデーション、シャンプー、リンス、トリートメント、及び浴用剤といった種々の製剤形態で提供することができる。
【００２５】
飲食品類としては、前記メラニン合成抑制剤並びに美白剤をそのまま、または種々の栄養成分を加えて、保健用食品または栄養補助食品または食品素材として提供することができる。
【００２６】
飲食品の組成物としては、食用に適した形態、例えば、カプセル状、粉末状、顆粒状、丸剤、錠剤状、固形状、液状、シート状などに成形して食用に供してもよく、また種々の食品、例えば、食肉加工食品、水産加工食品、発酵乳製品に添加して使用することができ、水、果汁、牛乳、清涼飲料などの飲料に添加して使用してもよい。また、砂糖、乳糖、麦芽糖などの適当な助剤を添加することもできる。
【実施例】
【００２７】
以下、本発明の実施例について説明する。なお、本発明は、下記の実施例に限定して解釈すべきではなく、特許請求の範囲における記載の範囲内で種々の変更が可能である。
【００２８】
（ケールスプラウトの粉砕物、ケールスプラウト抽出物の調製）
ケールの種子を１５℃〜２５℃の水に浸漬させ、４日間発芽させた後、芽を１０〜５０ｍｍに成長させた全草（芽、種子、根）を乾燥し、粉砕処理工程を経て、粉砕、殺菌、篩過して、粉砕物を得た。得られた粉砕物５０ｇを、５０％エチルアルコールを用いて抽出した。抽出後濾過し、濾液の溶媒を除き、ケールスプラウト抽出物１２ｇを得た。
【００２９】
（ケールの粉砕物、ケール抽出物の調製）
ケールの成熟体を乾燥し、粉砕処理工程を経て、粉砕、殺菌、篩過して、粉砕物を得た。得られた粉砕物５０ｇを、５０％エチルアルコールを用いて抽出した。抽出後濾過し、濾液の溶媒を除き、ケール抽出物１０ｇを得た。
【００３０】
（試験培地の調製）
テオフィリン（和光純薬工業株式会社製）を１３３．４ｍＭとなるようにＤＭＳＯ（和光純薬工業株式会社製）で溶解した。さらに、通常培地（１０％ウシ胎児血清含有Ｄ−ＭＥＭ：シグマ製）で４００倍に希釈し試験培地とした。
【００３１】
（Ｂ１６メラノーマ細胞の調製）
メラニン合成抑制活性の評価に用いたＢ１６メラノーマ細胞の調製は、以下のように行った。マウス由来の凍結Ｂ１６メラノーマ細胞（ＲＣＢ１２８３：独立行政法人理化学研究所）を通常培地を用いて融解し、６ｗｅｌｌプレートに播種後、炭酸ガスインキュベーター内で培養した。さらに６ｗｅｌｌプレートから７５ｃｍ２フラスコへ継代して、炭酸ガスインキュベーターで培養を継続した。その後、７５ｃｍ２フラスコから細胞を回収して６ｗｅｌｌプレートに播種し、炭酸ガスインキュベーター内で２４時間培養を行った。上記プレートより培地を除去後、被験物質を含んだ培地を１．５ｍｌ／ｗｅｌｌで添加し、更に試験培地を１．５ｍｌ／ｗｅｌｌで添加し３日間培養を行った。培養後、各ｗｅｌｌから細胞培養上清を除去し、２ｍｌのリン酸緩衝液（ＰＢＳ（−）：シグマ製）で細胞を１回洗浄後、ＰＢＳ（−）にて希釈したＴｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（シグマ製）を５００μｌ／ｗｅｌｌ添加した。室温で４〜５分間処理後、１０％ウシ胎児血清含有ＰＢＳ（−）を５００μｌ／ｗｅｌｌ添加してトリプシンの中和をした。その後、ピペッティングにて細胞の剥離を行い、細胞を回収した。２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行い、上清を除去した後、１ｍｌのＰＢＳ（−）を添加し懸濁後に、懸濁液６０μｌをサンプリングし、細胞数を計測した。残りの細胞は遠心分離を行い、上清を完全に除去した。細胞に１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を２５０μｌ添加し、６５℃〜７５℃の恒温槽で６０分間加温後、振盪し完全に溶解した。
【００３２】
（メラニン合成抑制活性の測定）
メラニン合成抑制活性は、以下のように評価した。得られたマウス由来のＢ１６メラノーマ細胞溶解液を９６ｗｅｌｌプレートへ２００μｌ／ｗｅｌｌで移し、バリオスキャン（サーモ製）にて合成メラニン量を４９０ｎｍの波長で測定した。
【００３３】
メラニン合成抑制活性は次の式から求められる阻害率で表した。
(数１) 阻害率（％）＝１００−(被験物質の吸光度／陰性コントールの吸光度)×１００
【００３４】
さらに、濃度と活性の回帰分析から、IC50（50%阻害濃度）を算出した。
【００３５】
（実施例１）
ケールスプラウトの粉砕物を３ｍｇ／ｍｌの濃度となるように試験培地に浸漬し、1時間室温処理した。その後、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、上清を０．２μｍのフィルターで濾過滅菌したものを実施例１とした。
【００３６】
（実施例２）
ケールスプラウト抽出物を０．３３ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌの濃度となるように試験培地に浸漬し、1時間室温処理した。その後、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、上清を０．２μｍのフィルターで濾過滅菌したものを実施例２とした。
【００３７】
（比較例１）
ケール（スプラウトではなく、成熟体）の粉砕物を３ｍｇ／ｍｌの濃度となるように試験培地に浸漬し、1時間室温処理した。その後、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、上清を０．２μｍのフィルターで濾過滅菌したものを比較例１とした。
【００３８】
（比較例２）
ケール（スプラウトではなく、成熟体）の抽出物を０．３３ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌの濃度となるように試験培地に浸漬し、1時間室温処理した。その後、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、上清を０．２μｍのフィルターで濾過滅菌したものを比較例２とした。
【００３９】
（陽性コントール）
コウジ酸を蒸留水で溶解後、試験培地にて０．１５ｍｇ／ｍｌの濃度になるように調製後、０．２μｍのフィルターで濾過滅菌したものを陽性コントロールとした。
【００４０】
（陰性コントール）
試験培地のみを０．２μｍのフィルターで濾過滅菌したものを陰性コントロールとした。
【００４１】
結果を表１、表２に示す。
【００４２】
【表１】
【００４３】
【表２】
【００４４】
表１に示すように、ケールスプラウトの阻害率は８０．６％であり、高い活性が確認できた。また、成熟体のケールと比較しても顕著に高いメラニン合成抑制活性を有していた。
【００４５】
さらに、ケールスプラウト抽出物の阻害率は０．３３ｍｇ／ｍｌ濃度で６０．４％を示し、同濃度のケール抽出物（４１．０％）と比較して高い阻害率を示した。また、１．０ｍｇ／ｍｌの濃度では８６．６％の阻害率を示し、従来技術のコウジ酸（６６．３％）と比較しても高いメラニン合成抑制活性を有していた。
【００４６】
また、表２に示すIC50値から、ケールスプラウトはケールと比較して２倍以上の活性を示すことが明らかとなった。
【００４７】
以上の結果より、ケールスプラウトおよびケールスプラウトの抽出物が高いメラニン合成抑制活性を示す素材であることが明らかとなった。
【００４８】
また、ケールスプラウトはケールと比較しても、高いメラニン合成抑制活性を示し、メラニン合成抑制剤並びにメラニン合成抑制剤を含有する美白剤としても非常に有用な素材であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明により、ケールスプラウト若しくはその粉砕物またはケールスプラウト抽出物に由来する有用なメラニン合成抑制剤並びにメラニン合成抑制剤を含有する美白剤を提供できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ケールスプラウト若しくはその粉砕物またはケールスプラウトの抽出物を含有することを特徴とする、メラニン合成抑制剤
【請求項２】
請求項１記載のメラニン合成抑制剤を含有する美白剤
【請求項１】
ケールスプラウト若しくはその粉砕物またはケールスプラウトの抽出物を含有することを特徴とする、メラニン合成抑制剤
【請求項２】
請求項１記載のメラニン合成抑制剤を含有する美白剤
【公開番号】特開２０１０−１３４１４（Ｐ２０１０−１３４１４Ａ）
【公開日】平成２２年１月２１日（２０１０．１．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１７６７８０（Ｐ２００８−１７６７８０）
【出願日】平成２０年７月７日（２００８．７．７）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 新聞名 健康産業流通新聞 発行者 株式会社健康産業流通新聞社 発行日 平成２０年３月８日（土）
【出願人】（３９８０２８５０３）株式会社東洋新薬 (182)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１月２１日（２０１０．１．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年７月７日（２００８．７．７）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 新聞名 健康産業流通新聞 発行者 株式会社健康産業流通新聞社 発行日 平成２０年３月８日（土）
【出願人】（３９８０２８５０３）株式会社東洋新薬 (182)
【Ｆターム（参考）】
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