メラニン生成抑制剤
【課題】 皮膚のシミ・ソバカス、肌荒れの原因としては不明な点も多いが、メラニン生成などによる色素沈着もその要因の１つとして挙げられている。美肌効果、シミ・ソバカスの防止効果、肌荒れ防止効果を有する物質として種々用いられているが、着色や有効性などに問題があった。本発明は、着色の問題がほとんどなく、また哺乳動物、特にヒトに対する毒性がほとんどなく、メラニン生成抑制効果または美白効果の高いメラニン生成抑制剤を提供することを目的とする。
【解決手段】 特定の化合物を含有することにより上記課題を解決する。
【解決手段】 特定の化合物を含有することにより上記課題を解決する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化１で示される特定の化合物の１種又は２種以上を有効成分とするメラニン生成抑制剤に関し、さらに好ましくは美白効果を有する２，３−ジヒドロ−３，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン、２，３−ジヒドロ−２，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン及び２，３−ジヒドロ−２，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン−結合−サポニンの群より選ばれる１種又は２種以上を有効成分とするメラニン生成抑制剤に関し、さらに当該メラニン生成抑制剤を含む化粧品に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚のシミ・ソバカス、肌荒れの原因としては不明な点も多いが、メラニン生成などによる色素沈着もその要因の１つとして挙げられている。美肌効果、シミ・ソバカスの防止効果、肌荒れ防止効果を有する物質としては、アルブチンなどがすでに知られており（例えば、特許文献１参照。）、様々な美白化粧料やシミ・ソバカス防止を目的とする医薬部外品の基材として適用されている。また、古くから黒糖およびその抽出物の美白効果や美肌効果についてもよく知られている（例えば、特許文献２〜５参照。）。また、含酸素単環系化合物で美白作用を有するものとしてコウジ酸（例えば、特許文献６参照。）や３−ヒドロキシ−４−ピラノンあるいは３−アシルオキシ−４−ピラノン（例えば、特許文献７参照。）が知られている。
【０００３】
【特許文献１】特開昭６０−５６９１２号公報
【特許文献２】特公昭５９−４８８０９号公報
【特許文献３】特開昭６１−２３６７２８号公報
【特許文献４】特開２００２−２１２０４８号公報
【特許文献５】特開平５−３１０５４７号公報
【特許文献６】特公昭５６−１８５６９号公報
【特許文献７】特公昭５９−３５８８４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、特公昭５９−４８８０９号公報、特開昭６１−２３６７２８号公報、特開２００２−２１２０４８号公報などでは黒砂糖から抽出した成分が着色成分（シュガー色素）や天然黒色成分であるために、これらを配合して調製された化粧料は著しく着色し、一般的な化粧料としては利用しがたいものである。更に、含酸素単環系化合物で美白作用を有するものとしてコウジ酸や３−ヒドロキシ−４−ピラノンあるいは３−アシルオキシ−４−ピラノンなどは、安全性と有効性に問題があり、満足すべき美白作用を有していない問題があった。
【０００５】
そこで、本発明者らは、鋭意検討を行ったところ、食経験のある大豆や黒砂糖および廃糖蜜からの抽出研究において、従来知られていた美白作用がある化合物とは全く異なる物質が、意外にもメラニン生成抑制効果に優れていることを見出した。
【０００６】
従って、本発明の目的は、化粧料に添加しても着色の問題がほとんどなく、また哺乳動物、特にヒトに対する毒性がほとんどなく、メラニン生成抑制効果または美白効果の高いメラニン生成抑制剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち、本発明の要旨は、化１で示される特定の化合物の１種又は２種以上を有効成分とするメラニン生成抑制剤に関し、さらに詳しくは美白効果を有する２，３−ジヒドロ−３，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン、２，３−ジヒドロ−２，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン及び２，３−ジヒドロ−２，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン−結合−サポニンの群より選ばれる１種又は２種以上を有効成分とするメラニン生成抑制剤に関し、さらに当該メラニン生成抑制剤を含む化粧品に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のメラニン生成抑制剤により、化粧料に添加しても着色の問題がほとんどなく、また哺乳動物、特にヒトに対する毒性がほとんどなく、また高いメラニン生成抑制効果または美白効果も得られるという効果が奏される。さらに、本発明のメラニン生成抑制剤により、美白効果の高い化粧料を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明のメラニン生成抑制剤は、以下の一般式（１）：
【００１０】
【化１】
但し、式中、Ｒ１は水素原子（Ｈ）又は水酸基（ＯＨ）あるいはサポニンを示す。Ｒ２は水素原子（Ｈ）又は水酸基（ＯＨ）示す
で表される化合物の１種又は２種以上を有効成分とするメラニン生成抑制剤に関し、さらに当該メラニン生成抑制剤を含む化粧品に関する。
【００１１】
一般式（１）で表される化合物としては、２，３−ジヒドロ−３，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン、大豆ＤＤＭＰサポニン（２，３−ジヒドロ−２，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン−結合−サポニン）及び２，３−ジヒドロ−２，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オンが挙げられ、２，３−ジヒドロ−３，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オンが最も好ましい。
【００１２】
２，３−ジヒドロ−３，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オンは、食品添加物の香料として認められている安全な物質であり、砂糖やフルクトースとアラニンのメイラード反応で生成する物質であり焼き菓子にも含まれており、また廃糖蜜や黒砂糖にも含まれている。更にまた、２，３−ジヒドロ−２，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オンや２，３−ジヒドロ−２，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン−結合−サポニン（ＤＤＭＰサポニン）は大豆中に含まれ、納豆、豆腐、味噌などとして摂取している物質であり、食しても安全な化合物である。これらの化合物は、一般的な化学合成方法により得ることもできるが、大豆や黒砂糖や廃糖蜜などの原料から抽出して得ることもできる。これらの美白作用のある物質は、単独で使用してもよく、または２種以上併用されてもよい。
【００１３】
本発明に使用される原料としては、例えば、緑豆、黄豆、黒豆などの大豆や黒砂糖、廃糖蜜などが挙げられる。かかる原料は、単独で使用されてもよく、または２種以上併用されてもよい。
【００１４】
２，３−ジヒドロ−３，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オンは、食品添加物の香料として市販されているものを使用してもよく、また、糖とアラニンのメイラード反応生成物から水で抽出しＨＰＬＣで分画する既存の方法（日本食品科学工学会誌，第２巻，第１号，２０−２５頁，１９９５年）で調製したものを使用してもよい。また更に、廃糖蜜や黒砂糖からアルコールなどで抽出し、ＨＰＬＣなどで分離精製して得ることもできる。
大豆から２，３−ジヒドロ−２，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン又は２，３−ジヒドロ−２，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン−結合−サポニン（大豆ＤＤＭＰサポニン）を抽出する方法としては、特に限定するものではないが、粉砕した大豆から７０％エタノール水溶液で抽出した画分をブタノール水溶液で抽出し、ブタノール層を更にＨＰＬＣで分画する既存の方法（Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第５７巻、第４号、５４６−５５０頁、１９９３年）で調製したものを使用してもよい。
【００１５】
また、廃糖蜜や黒砂糖から２，３−ジヒドロ−３，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オンを抽出する方法としては、例えば以下のような方法が挙げられる。
【００１６】
（１）廃糖蜜を水に溶解し、遠心分離やろ過法により夾雑物を除去する工程；
（２）工程（１）で得られた溶液と吸着剤とを接触させた後、吸着剤を水で洗浄して糖分を十分除去した後、吸着剤を１５〜３５重量％濃度のアルコールで吸着物質を溶離させる工程；
（３）工程（２）で得られた溶離液をブタノールと水で分配してブタノール層を分取する工程；
（４）工程（３）で得られたブタノール層をゲルろ過カラムを用いて５〜１５重量％濃度のアルコールで溶出させる工程；ならびに
（５）工程（４）で得られた溶出液を逆相系カラムにかけ、１０〜２０重量％濃度のアルコールで溶出させる工程、
を含む方法により、２，３−ジヒドロ−３，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オンを含む画分を得ることができる。さらに、所望により、画分に含まれるアルコールを蒸発させて濃縮物として得ることもできる。
【００１７】
あるいは、前記方法のうち工程（３）の代わりに、
（３’）工程（２）で得られた溶離液を吸着剤カラムを用いて２〜１０重量％濃度のアルコールで吸着物質をで溶出させる工程、
を含む方法により、２，３−ジヒドロ−３，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オンを得ることができる。さらに、所望により、画分に含まれるアルコールを蒸発させて濃縮物として得ることもできる。
【００１８】
前記工程（２）で用いられる吸着剤としては、例えば、芳香樹脂系合成吸着剤を用いることができ、、例えば、スチレンとジビニルベンゼンから重合された多孔性合成樹脂が使用できる。そのような樹脂としては例えば、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤタイプ（ロームアンドハース社製）、ＨＰタイプ（三菱化成社製）などが挙げられる。
【００１９】
前記工程（３’）で用いられるカラム用吸着剤としては、オクタデシル基を化学結合させたシリカゲル系の充填剤が使用でき、ＣＯＳＭＯＳＩＬタイプ（ナカライテスク社製）、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌタイプ（野村化学社製）、ＴＳＫｇｅｌタイプ（東ソー社製）、ＹＭＣ−ｐａｃｋタイプ（ワイエムシー社製）、ＭＣＩ ＧＥＬ ＯＤＳタイプ（三菱化学社製）などが挙げられる。
【００２０】
前記工程（４）におけるゲルろ過カラムに使用する充填剤としては、１０００〜７０００の分子量を分画可能なものが望ましく、Ｔｏｙｏｐｅｒｌ ＨＷ−４０Ｃ（東ソー社製）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５（ファルマシア社製）などが挙げられる。
【００２１】
前記工程（５）における逆相系カラムに使用する充填剤としては、オクチル基を化学結合させたシリカゲル系が使用でき、ＣＯＳＭＯＳＩＬタイプ（ナカライテスク社製）、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌタイプ（野村化学社製）、ＴＳＫｇｅｌタイプ（東ソー社製）、ＹＭＣ−ｐａｃｋタイプ（ワイエムシー社製）、ＭＣＩ ＧＥＬ ＯＴＳタイプ（三菱化学社製）、Ｌｉｃｈｒｏｐｒｅｐ タイプ（メルク社製）などが挙げられる。
【００２２】
前記工程（２）、（３’）、（４）および（５）で使用されるアルコールとしては、低級アルコール、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノールなどが挙げられる。各工程で使用されるアルコールの濃度は、各工程で使用されるカラムに応じて変動し、工程（２）においては、１５〜３５重量％が好ましく、２０〜３０重量％がより好ましく、工程（３’）においては、２〜１０重量％が好ましく、３〜７重量％がより好ましく、工程（４）においては、５〜１５重量％が好ましく、７〜１３重量％がより好ましく、工程（５）においては、１０〜２０重量％が好ましく、１３〜１７重量％がより好ましい。
【００２３】
以上のようにして２，３−ジヒドロ−３，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オンを得ることができる。本発明のメラニン生成抑制剤としては、前記抽出方法により得られた画分をそのまま使用してもよいし、所望により、得られた画分を更に逆相カラムなどの分取ＨＰＬＣで精製した精製品を使用してもよい。
【００２４】
本発明のメラニン生成抑制剤がメラニン生成抑制の効果を有するためには、メラニン生成抑制剤中に化１で示される特定の化合物の１種又は２種以上、好ましくは２，３−ジヒドロ−３，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン、２，３−ジヒドロ−２，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン及び２，３−ジヒドロ−２，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン−結合−サポニンの群より選ばれる１種又は２種以上が、好ましくは１重量％以上、より好ましくは１０重量％以上、水、エタノール、グリセン、プロピレングリコールなどの溶媒に分散溶解していることが望ましい。
【００２５】
なお、本発明のメラニン生成抑制剤中の化１で示される特定の化合物の１種又は２種以上、好ましくは２，３−ジヒドロ−３，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン、２，３−ジヒドロ−２，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン及び２，３−ジヒドロ−２，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン−結合−サポニンの群より選ばれる１種又は２種以上の濃度は、例えば、オクチル基を化学結合させたシリカ系充填剤の逆相カラムによる高速液体クロマトグラフィー分析によって分析することができる。また薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、展開相：クロロホルム−メタノール（９：１）、発色液：硫酸）で確認することもできる。
【００２６】
メラニン生成のメカニズムは、次のように推定されている。Ｌ−チロシンがチロシナーゼの作用によりＬ−ドーパを経てドーパキノンとなり、これが酵素または非酵素的に酸化重合されてメラニンが生成される。従って、チロシナーゼの作用を阻害または抑制することによりメラニン生成が抑制できると考えられる。以上のことから、本発明のメラニン生成抑制剤のメラニン生成抑制の効果は、チロシナーゼ阻害活性を指標として測定することができ、その阻害活性は、メラニンの生成を抑制できる程度の活性を有していればよいが、好ましくは１０％以上、より好ましくは４０％以上、さらに好ましくは６０％以上である。
【００２７】
本発明においてチロシナーゼ阻害活性は、以下のようにして測定することができる。
（ｉ）L−チロシン溶液とリン酸緩衝液を混合し、これに試料溶液または水を加えて直ちに４７０ｎｍの吸光度を測定する；
（ｉｉ）工程（ｉ）の混合液を３７℃で１０分間インキュベートし、チロシナーゼ溶液を加えて攪拌した後、３７℃で１５分間酵素反応させた後４７０ｎｍの吸光度を測定する；
（ｉｉｉ）以下の式を用いてチロシナーゼ阻害活性を計算する。
チロシナーゼ阻害活性（％）＝{（ｂ−ａ）−（Ｂ−Ａ）／（ｂ−ａ）} ×１００
Ａ：試料溶液を用いた場合の工程（ｉ）における吸光度
Ｂ：試料溶液を用いた場合の工程（ｉｉ）における吸光度
ａ：水を用いた場合の工程（ｉ）における吸光度
ｂ：水を用いた場合の工程（ｉｉ）における吸光度
【００２８】
また、本発明のメラニン生成抑制剤のメラニン生成抑制の効果は、該抑制剤を添加したウシ胎児血清加イーグルＭＥＭ培地でＢ−１６メラノーマ細胞を試料を３７℃、７日間培養し、細胞数と遠心分離して得られた細胞の白色化度を指標とすることにより評価できる。
（評価基準）
白色化度大：ほとんど白色化しており、褐色細胞が見られない
白色化度中：やや白色化しており、褐色細胞が見られない
白色化度小：白色化していない
【００２９】
本発明のメラニン生成抑制剤は、メラニン色素の沈着によるシミ、ソバカスを防止し、美白作用を有する化粧品として利用され得る。
【００３０】
本発明の化粧品における前記メラニン生成抑制剤の含有量は、よりよい美白効果およびコストパフォーマンスの観点から、固形分として好ましくは０．０１〜１０重量％、より好ましくは、０．１〜５重量％である。
【００３１】
本発明の化粧品には、前記メラニン生成抑制剤の他、化粧品に従来から使用されている成分、例えば、アスコルビン酸、アスコルビン酸グルコシド、アルブチン、タキオキシド、３，４−ジメトキシフェニル−Ｏ−Ｄ−グルコース、ヒドロキノン、ｌ−システイン、桑エキス、甘草エキスなどの美白作用をもつ物質などが含有されていてもよい。
【００３２】
本発明の化粧品としては、例えば、化粧水、乳液、クレンジングクリーム、マッサージクリームなどのクリーム類、パック、ファンデーションなどのメーキャップ化粧品、石鹸、洗顔クリーム、ボディローション、ボディーシャンプーなどが挙げられる。これらの化粧品は、前記メラニン生成抑制剤を添加する以外は通常の化粧品と同様の方法で調製される。
【００３３】
次に、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は当該実施例のみに限定されるものではない。
【実施例】
【００３４】
実施例１ メラニン生成抑制剤の調製１
糖蜜160gを4Lの水に溶かし，ろ過して夾雑物を除去して糖蜜水溶液を得た。これをＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−２カラムに通液し，水で洗浄後２５重量％ＭｅＯＨで溶出した。
【００３５】
得られた２５重量％ＭｅＯＨ画分（５．１７ｇ）をｎ−ＢｕＯＨと水にて分配してＢｕＯＨ層（１．１３ｇ）を得、ＢｕＯＨを留去、同画分をＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＨＷ−４０Ｃカラム（２５×６５ｃｍ）にて１０％ＭｅＯＨを用いて溶出させ、吸光度２７０ｎｍで溶出ピークを検出し、主ピーク成分ごとに６つの留分に分画し、それぞれ、画分１（３０ｍｇ）、画分２（１４４ｍｇ）、画分３（４３７ｍｇ）、画分４（１２４ｍｇ）、画分５（１１８ｍｇ）、および画分６（１３１ｍｇ）を得た。
【００３６】
この内、チロシナーゼ阻害活性を測定し最も強かった画分４を低圧分取カラム（ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ ＲＰ−８）にて１５重量％ＭｅＯＨを用いて溶出させ、吸光度２７０ｎｍで溶出ピークを検出し、主ピーク成分ごとに３つの画分に分画し、それぞれ画分４−１（５．１ｍｇ）、画分４−２（２．３ｍｇ）、画分４−３（７．１ｍｇ）の固形分を得た。これらの画分４−１〜４−３は、チロシナーゼ阻害活性作用が認められた。
【００３７】
これらの画分をＩＲ測定（フーリエ変換赤外分光光度計ＦＴＳ−３０００、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）した。ＥＩ−ＭＳ（７０ｅＶ）は、二重収束質量分析計Ｍ−２５００（日立製作所）で測定した。１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲおよび２次元ＮＭＲは重メタノール（ＣＤ３ＯＤ）又は重クロロホルム（ＣＤＣｌ３）を溶媒に核磁気共鳴吸収装置ＪＮＭ−Ａ５００（日本電子）にて室温で測定した。
【００３８】
その結果、画分４−２の成分は２，３−ジヒドロ−３，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オンであることが判明した。また、画分４−１はタキオキシドであることが分かった。画分４−３を更に分取ＨＰＬＣ（Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ−ＭＧ−５；８．０×２５０ｍｍ）にて精製して分析したところグアイアシルグリセロール−β−D−グルコピラノシド、シリンギルグリセロール−β−D−グルコピラノシドであった。
【００３９】
実施例２ メラニン生成抑制剤の調製２
糖蜜２５０ｇを７Ｌの水に溶かし，ろ過して夾雑物を除去して糖蜜水溶液を得た。これをＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−２カラムに通液し，水で洗浄後２５重量％ＭｅＯＨで溶出した。この２５重量％ＭｅＯＨ溶出画分（８．５ｇ）をＰｒｅｐａｒａｔｉｖｅ Ｃ１８カラム（１×３５ｃｍ、ＯＤＳカラム、ウォーターズ社製）に通液し、５％ＭｅＯＨを用いて溶出させた画分（２．６ｇ）を得た。これをＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＨＷ−４０Ｃカラム（２５×６５ｃｍ）にて１０％ＭｅＯＨを用いて溶出させ、吸光度２７０ｎｍで溶出ピークを検出し、主ピーク成分ごとに５つの画分に分画し、それぞれ、画分１（１４１ｍｇ）、画分２（６２９ｍｇ）、画分３（９３６ｍｇ）、画分４（２７４ｍｇ）、画分５（３９２ｍｇ）が得られた。
【００４０】
この内、チロシナーゼ阻害活性を測定し最も強かった画分４を低圧分取カラム（ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ ＲＰ−８）にて１５重量％ＭｅＯＨを用いて溶出させ、吸光度２７０ｎｍで溶出ピークを検出し、主ピーク成分ごとに３つの画分に分画し、それぞれ画分４−１（７．１ｍｇ）、画分４−２（４．３ｍｇ）、画分４−３（１２．３ｍｇ）の固形分を得た。これらの画分４−１〜４−３は、チロシナーゼ阻害活性作用が認められた。
【００４１】
これらの画分をＩＲ測定（フーリエ変換赤外分光光度計ＦＴＳ−３０００、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）した。ＥＩ−ＭＳ（７０ｅＶ）は、二重収束質量分析計Ｍ−２５００（日立製作所）で測定した。１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲおよび２次元ＮＭＲは重メタノール（ＣＤ３ＯＤ）又は重クロロホルム（ＣＤＣｌ３）を溶媒に核磁気共鳴吸収装置ＪＮＭ−Ａ５００（日本電子）にて室温で測定した。その結果、画分４−２の成分は２，３−ジヒドロ−３，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オンであることが判明した。また、画分４−１はタキオキシドであることが分かった。画分４−３を更に分取ＨＰＬＣ（Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ−ＭＧ−５；８．０×２５０ｍｍ）にて精製して分析したところグアイアシルグリセロール−β−D−グルコピラノシド、シリンギルグリセロール−β−D−グルコピラノシドであった。
【００４２】
実施例３
大豆としてスズユタカ１００ｇを粉砕し、７０％エタノール水溶液１０００ｍｌを加え、室温で７時間抽出した。その後、ろ過してろ液を４０℃以下で濃縮した。この濃縮物に水１００ｍｌとブタノール１００ｍｌを加えて溶解させ、ブタノール層を得た。このブタノール層を減圧下で濃縮し、５０ｍｇの濃縮物を得た。これらは、ＯＤＳカラムを用いたＨＰＬＣ分析の既存の方法（Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，第５７巻，第４号，５４６−５５０頁，１９９３年）により大豆ＤＤＭＰサポニン（２，３−ジヒドロ−２，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン−結合−サポニン）の混合物であることが分かった。
【００４３】
実施例４
実施例３と全く同様にスズユタカを処理して、約５２ｍｇの大豆ＤＤＭＰサポニンを得た。これを水１０ｍｌに分散溶解させて、β−グルコシターゼを作用させた後、ブタノール１０ｍｌを加え、よく攪拌し水層を得た。この水相を濃縮して濃縮物を５ｍｇ得た。この濃縮物をＩＲ測定（フーリエ変換赤外分光光度計ＦＴＳ−３０００、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）した。ＥＩ−ＭＳ（７０ｅＶ）は、二重収束質量分析計Ｍ−２５００（日立製作所）で測定した。１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲおよび２次元ＮＭＲは重メタノール（ＣＤ３ＯＤ）又は重クロロホルム（ＣＤＣｌ３）を溶媒に核磁気共鳴吸収装置ＪＮＭ−Ａ５００（日本電子）にて室温で測定した。その結果、濃縮物は、２，３−ジヒドロ−２，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オンであることが判明した。
【００４４】
試験例１ チロシナーゼ阻害活性の測定
実施例１および２で得られた２，３−ジヒドロ−３，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン、実施例３で得られた大豆ＤＤＭＰサポニン（２，３−ジヒドロ−２，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン−結合−サポニン）及び実施例４で得られた２，３−ジヒドロ−２，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン、ならびにアルブチン、コウジ酸、３−ヒドロキシ−４−ピラノンをそれぞれ０．３ｍｇ／ｍｌおよび０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解したリン酸緩衝液（０．０５ｍＭ、ｐＨ６．８）５０μＬに、０．５ｍｇ／ｍｌのＬ−チロシン溶液１５０μＬおよびリン酸緩衝液７５０μＬを加え、直ちに４７０ｎｍの吸光度を測定した。
【００４５】
次いで、混合溶液を３７℃で１０分間プレインキュベートした後、チロシナーゼ溶液２５μｌ（マッシュルーム由来、４７０ユニット）を加えて撹拌した後、３７℃で１５分間酵素反応させた後、４７０ｎｍの吸光度を測定した。
【００４６】
上記で得られた４７０ｎｍの吸光度をもとに、各化合物のチロシナーゼ阻害活性を測定した。その結果を表１に示す。
【００４７】
【表１】
【００４８】
表１の結果より、実施例１および２で得られた２，３−ジヒドロ−３，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン、実施例３で得られた大豆ＤＤＭＰサポニン（２，３−ジヒドロ−２，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン−結合−サポニン）及び実施例４で得られた２，３−ジヒドロ−２，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オンは、従来から知られているアルブチン、コウジ酸、３−ヒドロキシ−４−ピラノンと比較して低濃度で、チロシナーゼ阻害活性を有することがわかる。
【００４９】
試験例２ 培養細胞を用いたメラニン生成抑制効果試験
Ｂ１６メラノーマ細胞２×１０5個を径６ｃｍの培養シャーレ中、試験物質（２，３−ジヒドロ−２，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン、大豆ＤＤＭＰサポニン、２，３−ジヒドロ−２，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン）を０．０５重量％添加した１０％ウシ胎児血清加イーグルＭＥＭ培地を用い、５％炭酸ガスを含有する空気下３７℃、７日間培養した。
【００５０】
培養終了後、０．０２５重量％トリプシンを含むダルベッコリン酸緩衝液を培養シャーレに添加して細胞を剥離し、細胞数を計測した。遠心分離し得られた細胞を肉眼で観察し、細胞の白色化度を以下の評価基準に従って評価した。
（評価基準）
白色化度大：ほとんど白色化しており、褐色細胞が見られない
白色化度中：やや白色化しており、褐色細胞が見られない
白色化度小：白色化していない
【００５１】
メラニン生成抑制剤を添加しなかったコントロールの場合、培養７日後の細胞数は５．４×１０５個で白色化度は小であった。
【００５２】
２，３−ジヒドロ−３，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オンの場合、培養７日後の細胞数は４．８×１０５個で白色化度が大であった。
【００５３】
大豆ＤＤＭＰサポニンの場合、培養７日後の細胞数は５．０×１０５個で白色化度が中であった。
【００５４】
２，３−ジヒドロ−２，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オンの場合、培養７日後の細胞数は４．７×１０５個で白色化度が大であった。
【００５５】
以上の結果より、本発明のメラニン生成抑制剤を添加してメラノーマ細胞を培養した場合、白色化度が大であると共に、細胞に対する毒性がほとんど認められなかった。従って、本発明のメラニン生成抑制剤は、人体に対してほとんど毒性がないと考えられる。
【００５６】
実施例５ メラニン生成抑制剤を含有する化粧品
本発明の２，３−ジヒドロ−３，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン又は２，３−ジヒドロ−２，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オンあるいは２，３−ジヒドロ−２，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン−結合−サポニン（大豆DDMPサポニン）を含有する化粧料の処方例を示す。尚、配合量は重量％である。
（処方１：化粧水）
グリセリン ３．０
プロピレングリコール ２．０
オレイルアルコール ０．１
ポリオキシエチレン（20）ソルビタンモノラウリン酸エステル １．５
エタノール ２０
２，３−ジヒドロ−３，５−ジヒドロキシ−６−メチル−
４Ｈ−ピラン−４−オン ０．３
香料・防腐剤 適量
精製水 全量 １００
（処方２：クリーム）
スクワラン ５．０
ステアリン酸 ２．０
ステアリルアルコール ７．０
還元ラノリン ２．０
オクチルドデカノール ６．０
ポリオキシエチレン（25）セチルアルコール ３．０
親油型モノステアリン酸グリセリン ２．０
プロピレングリコール ５．０
大豆DDMPサポニン ０．０１
香料・防腐剤 適量
精製水 全量 １００
（処方３：乳液）
流動パラフィン １０．０
ステアリン酸 ０．２
セタノール １．５
ワセリン ３．０
ラノリンアルコール ２．０
ポリオキシエチレン（10）モノオレイン酸エステル ２．０
グリセリン ３．０
プロピレングリコール ５．０
トリエタノールアミン １．０
２，３−ジヒドロ−２，５−ジヒドロキシ−
６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン ０．１
香料・防腐剤 適量
精製水 全量 １００
（処方４：パック）
ポリビニルアルコール １５．０
カルボキシメチルセルロースナトリウム ５．０
プロピレングリコール ３．０
エタノール １０．０
２，３−ジヒドロ−３，５−ジヒドロキシ−
６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン １．０
香料・防腐剤 適量
精製水 全量 １００
【００５７】
試験例３
色黒、シミ、ソバカスに悩む被験者４０名をパネルとし、半分の２０名には前述の実施例５の処方1：化粧水を、残りの２０名には実施例３の処方1：化粧水より２，３−ジヒドロ−３，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オンを除いた処方の化粧水（比較例）を３ケ月間毎日使用させた場合の美白効果を判定した。その結果、実施例３の処方１：化粧水を使用した場合は、有効（色素沈着がかなり薄くなった）：１０名、やや有効（色素沈着がやや薄くなった）：７名，無効（色素沈着に変化がなかった）：３名であった。また、比較例の化粧水を使用した場合は、有効（色素沈着がかなり薄くなった）：０名、やや有効（色素沈着がやや薄くなった）：５名，無効（色素沈着に変化がなかった）：１５名であった。これから分かるように、本発明品を含む化粧水の方が比較対象の化粧水よりも明らかに美白効果が認められた。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明のメラニン生成抑制剤は、美白効果を有する化粧品に利用できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化１で示される特定の化合物の１種又は２種以上を有効成分とするメラニン生成抑制剤に関し、さらに好ましくは美白効果を有する２，３−ジヒドロ−３，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン、２，３−ジヒドロ−２，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン及び２，３−ジヒドロ−２，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン−結合−サポニンの群より選ばれる１種又は２種以上を有効成分とするメラニン生成抑制剤に関し、さらに当該メラニン生成抑制剤を含む化粧品に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚のシミ・ソバカス、肌荒れの原因としては不明な点も多いが、メラニン生成などによる色素沈着もその要因の１つとして挙げられている。美肌効果、シミ・ソバカスの防止効果、肌荒れ防止効果を有する物質としては、アルブチンなどがすでに知られており（例えば、特許文献１参照。）、様々な美白化粧料やシミ・ソバカス防止を目的とする医薬部外品の基材として適用されている。また、古くから黒糖およびその抽出物の美白効果や美肌効果についてもよく知られている（例えば、特許文献２〜５参照。）。また、含酸素単環系化合物で美白作用を有するものとしてコウジ酸（例えば、特許文献６参照。）や３−ヒドロキシ−４−ピラノンあるいは３−アシルオキシ−４−ピラノン（例えば、特許文献７参照。）が知られている。
【０００３】
【特許文献１】特開昭６０−５６９１２号公報
【特許文献２】特公昭５９−４８８０９号公報
【特許文献３】特開昭６１−２３６７２８号公報
【特許文献４】特開２００２−２１２０４８号公報
【特許文献５】特開平５−３１０５４７号公報
【特許文献６】特公昭５６−１８５６９号公報
【特許文献７】特公昭５９−３５８８４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、特公昭５９−４８８０９号公報、特開昭６１−２３６７２８号公報、特開２００２−２１２０４８号公報などでは黒砂糖から抽出した成分が着色成分（シュガー色素）や天然黒色成分であるために、これらを配合して調製された化粧料は著しく着色し、一般的な化粧料としては利用しがたいものである。更に、含酸素単環系化合物で美白作用を有するものとしてコウジ酸や３−ヒドロキシ−４−ピラノンあるいは３−アシルオキシ−４−ピラノンなどは、安全性と有効性に問題があり、満足すべき美白作用を有していない問題があった。
【０００５】
そこで、本発明者らは、鋭意検討を行ったところ、食経験のある大豆や黒砂糖および廃糖蜜からの抽出研究において、従来知られていた美白作用がある化合物とは全く異なる物質が、意外にもメラニン生成抑制効果に優れていることを見出した。
【０００６】
従って、本発明の目的は、化粧料に添加しても着色の問題がほとんどなく、また哺乳動物、特にヒトに対する毒性がほとんどなく、メラニン生成抑制効果または美白効果の高いメラニン生成抑制剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち、本発明の要旨は、化１で示される特定の化合物の１種又は２種以上を有効成分とするメラニン生成抑制剤に関し、さらに詳しくは美白効果を有する２，３−ジヒドロ−３，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン、２，３−ジヒドロ−２，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン及び２，３−ジヒドロ−２，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン−結合−サポニンの群より選ばれる１種又は２種以上を有効成分とするメラニン生成抑制剤に関し、さらに当該メラニン生成抑制剤を含む化粧品に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のメラニン生成抑制剤により、化粧料に添加しても着色の問題がほとんどなく、また哺乳動物、特にヒトに対する毒性がほとんどなく、また高いメラニン生成抑制効果または美白効果も得られるという効果が奏される。さらに、本発明のメラニン生成抑制剤により、美白効果の高い化粧料を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明のメラニン生成抑制剤は、以下の一般式（１）：
【００１０】
【化１】
但し、式中、Ｒ１は水素原子（Ｈ）又は水酸基（ＯＨ）あるいはサポニンを示す。Ｒ２は水素原子（Ｈ）又は水酸基（ＯＨ）示す
で表される化合物の１種又は２種以上を有効成分とするメラニン生成抑制剤に関し、さらに当該メラニン生成抑制剤を含む化粧品に関する。
【００１１】
一般式（１）で表される化合物としては、２，３−ジヒドロ−３，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン、大豆ＤＤＭＰサポニン（２，３−ジヒドロ−２，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン−結合−サポニン）及び２，３−ジヒドロ−２，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オンが挙げられ、２，３−ジヒドロ−３，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オンが最も好ましい。
【００１２】
２，３−ジヒドロ−３，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オンは、食品添加物の香料として認められている安全な物質であり、砂糖やフルクトースとアラニンのメイラード反応で生成する物質であり焼き菓子にも含まれており、また廃糖蜜や黒砂糖にも含まれている。更にまた、２，３−ジヒドロ−２，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オンや２，３−ジヒドロ−２，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン−結合−サポニン（ＤＤＭＰサポニン）は大豆中に含まれ、納豆、豆腐、味噌などとして摂取している物質であり、食しても安全な化合物である。これらの化合物は、一般的な化学合成方法により得ることもできるが、大豆や黒砂糖や廃糖蜜などの原料から抽出して得ることもできる。これらの美白作用のある物質は、単独で使用してもよく、または２種以上併用されてもよい。
【００１３】
本発明に使用される原料としては、例えば、緑豆、黄豆、黒豆などの大豆や黒砂糖、廃糖蜜などが挙げられる。かかる原料は、単独で使用されてもよく、または２種以上併用されてもよい。
【００１４】
２，３−ジヒドロ−３，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オンは、食品添加物の香料として市販されているものを使用してもよく、また、糖とアラニンのメイラード反応生成物から水で抽出しＨＰＬＣで分画する既存の方法（日本食品科学工学会誌，第２巻，第１号，２０−２５頁，１９９５年）で調製したものを使用してもよい。また更に、廃糖蜜や黒砂糖からアルコールなどで抽出し、ＨＰＬＣなどで分離精製して得ることもできる。
大豆から２，３−ジヒドロ−２，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン又は２，３−ジヒドロ−２，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン−結合−サポニン（大豆ＤＤＭＰサポニン）を抽出する方法としては、特に限定するものではないが、粉砕した大豆から７０％エタノール水溶液で抽出した画分をブタノール水溶液で抽出し、ブタノール層を更にＨＰＬＣで分画する既存の方法（Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第５７巻、第４号、５４６−５５０頁、１９９３年）で調製したものを使用してもよい。
【００１５】
また、廃糖蜜や黒砂糖から２，３−ジヒドロ−３，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オンを抽出する方法としては、例えば以下のような方法が挙げられる。
【００１６】
（１）廃糖蜜を水に溶解し、遠心分離やろ過法により夾雑物を除去する工程；
（２）工程（１）で得られた溶液と吸着剤とを接触させた後、吸着剤を水で洗浄して糖分を十分除去した後、吸着剤を１５〜３５重量％濃度のアルコールで吸着物質を溶離させる工程；
（３）工程（２）で得られた溶離液をブタノールと水で分配してブタノール層を分取する工程；
（４）工程（３）で得られたブタノール層をゲルろ過カラムを用いて５〜１５重量％濃度のアルコールで溶出させる工程；ならびに
（５）工程（４）で得られた溶出液を逆相系カラムにかけ、１０〜２０重量％濃度のアルコールで溶出させる工程、
を含む方法により、２，３−ジヒドロ−３，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オンを含む画分を得ることができる。さらに、所望により、画分に含まれるアルコールを蒸発させて濃縮物として得ることもできる。
【００１７】
あるいは、前記方法のうち工程（３）の代わりに、
（３’）工程（２）で得られた溶離液を吸着剤カラムを用いて２〜１０重量％濃度のアルコールで吸着物質をで溶出させる工程、
を含む方法により、２，３−ジヒドロ−３，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オンを得ることができる。さらに、所望により、画分に含まれるアルコールを蒸発させて濃縮物として得ることもできる。
【００１８】
前記工程（２）で用いられる吸着剤としては、例えば、芳香樹脂系合成吸着剤を用いることができ、、例えば、スチレンとジビニルベンゼンから重合された多孔性合成樹脂が使用できる。そのような樹脂としては例えば、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤタイプ（ロームアンドハース社製）、ＨＰタイプ（三菱化成社製）などが挙げられる。
【００１９】
前記工程（３’）で用いられるカラム用吸着剤としては、オクタデシル基を化学結合させたシリカゲル系の充填剤が使用でき、ＣＯＳＭＯＳＩＬタイプ（ナカライテスク社製）、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌタイプ（野村化学社製）、ＴＳＫｇｅｌタイプ（東ソー社製）、ＹＭＣ−ｐａｃｋタイプ（ワイエムシー社製）、ＭＣＩ ＧＥＬ ＯＤＳタイプ（三菱化学社製）などが挙げられる。
【００２０】
前記工程（４）におけるゲルろ過カラムに使用する充填剤としては、１０００〜７０００の分子量を分画可能なものが望ましく、Ｔｏｙｏｐｅｒｌ ＨＷ−４０Ｃ（東ソー社製）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５（ファルマシア社製）などが挙げられる。
【００２１】
前記工程（５）における逆相系カラムに使用する充填剤としては、オクチル基を化学結合させたシリカゲル系が使用でき、ＣＯＳＭＯＳＩＬタイプ（ナカライテスク社製）、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌタイプ（野村化学社製）、ＴＳＫｇｅｌタイプ（東ソー社製）、ＹＭＣ−ｐａｃｋタイプ（ワイエムシー社製）、ＭＣＩ ＧＥＬ ＯＴＳタイプ（三菱化学社製）、Ｌｉｃｈｒｏｐｒｅｐ タイプ（メルク社製）などが挙げられる。
【００２２】
前記工程（２）、（３’）、（４）および（５）で使用されるアルコールとしては、低級アルコール、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノールなどが挙げられる。各工程で使用されるアルコールの濃度は、各工程で使用されるカラムに応じて変動し、工程（２）においては、１５〜３５重量％が好ましく、２０〜３０重量％がより好ましく、工程（３’）においては、２〜１０重量％が好ましく、３〜７重量％がより好ましく、工程（４）においては、５〜１５重量％が好ましく、７〜１３重量％がより好ましく、工程（５）においては、１０〜２０重量％が好ましく、１３〜１７重量％がより好ましい。
【００２３】
以上のようにして２，３−ジヒドロ−３，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オンを得ることができる。本発明のメラニン生成抑制剤としては、前記抽出方法により得られた画分をそのまま使用してもよいし、所望により、得られた画分を更に逆相カラムなどの分取ＨＰＬＣで精製した精製品を使用してもよい。
【００２４】
本発明のメラニン生成抑制剤がメラニン生成抑制の効果を有するためには、メラニン生成抑制剤中に化１で示される特定の化合物の１種又は２種以上、好ましくは２，３−ジヒドロ−３，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン、２，３−ジヒドロ−２，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン及び２，３−ジヒドロ−２，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン−結合−サポニンの群より選ばれる１種又は２種以上が、好ましくは１重量％以上、より好ましくは１０重量％以上、水、エタノール、グリセン、プロピレングリコールなどの溶媒に分散溶解していることが望ましい。
【００２５】
なお、本発明のメラニン生成抑制剤中の化１で示される特定の化合物の１種又は２種以上、好ましくは２，３−ジヒドロ−３，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン、２，３−ジヒドロ−２，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン及び２，３−ジヒドロ−２，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン−結合−サポニンの群より選ばれる１種又は２種以上の濃度は、例えば、オクチル基を化学結合させたシリカ系充填剤の逆相カラムによる高速液体クロマトグラフィー分析によって分析することができる。また薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、展開相：クロロホルム−メタノール（９：１）、発色液：硫酸）で確認することもできる。
【００２６】
メラニン生成のメカニズムは、次のように推定されている。Ｌ−チロシンがチロシナーゼの作用によりＬ−ドーパを経てドーパキノンとなり、これが酵素または非酵素的に酸化重合されてメラニンが生成される。従って、チロシナーゼの作用を阻害または抑制することによりメラニン生成が抑制できると考えられる。以上のことから、本発明のメラニン生成抑制剤のメラニン生成抑制の効果は、チロシナーゼ阻害活性を指標として測定することができ、その阻害活性は、メラニンの生成を抑制できる程度の活性を有していればよいが、好ましくは１０％以上、より好ましくは４０％以上、さらに好ましくは６０％以上である。
【００２７】
本発明においてチロシナーゼ阻害活性は、以下のようにして測定することができる。
（ｉ）L−チロシン溶液とリン酸緩衝液を混合し、これに試料溶液または水を加えて直ちに４７０ｎｍの吸光度を測定する；
（ｉｉ）工程（ｉ）の混合液を３７℃で１０分間インキュベートし、チロシナーゼ溶液を加えて攪拌した後、３７℃で１５分間酵素反応させた後４７０ｎｍの吸光度を測定する；
（ｉｉｉ）以下の式を用いてチロシナーゼ阻害活性を計算する。
チロシナーゼ阻害活性（％）＝{（ｂ−ａ）−（Ｂ−Ａ）／（ｂ−ａ）} ×１００
Ａ：試料溶液を用いた場合の工程（ｉ）における吸光度
Ｂ：試料溶液を用いた場合の工程（ｉｉ）における吸光度
ａ：水を用いた場合の工程（ｉ）における吸光度
ｂ：水を用いた場合の工程（ｉｉ）における吸光度
【００２８】
また、本発明のメラニン生成抑制剤のメラニン生成抑制の効果は、該抑制剤を添加したウシ胎児血清加イーグルＭＥＭ培地でＢ−１６メラノーマ細胞を試料を３７℃、７日間培養し、細胞数と遠心分離して得られた細胞の白色化度を指標とすることにより評価できる。
（評価基準）
白色化度大：ほとんど白色化しており、褐色細胞が見られない
白色化度中：やや白色化しており、褐色細胞が見られない
白色化度小：白色化していない
【００２９】
本発明のメラニン生成抑制剤は、メラニン色素の沈着によるシミ、ソバカスを防止し、美白作用を有する化粧品として利用され得る。
【００３０】
本発明の化粧品における前記メラニン生成抑制剤の含有量は、よりよい美白効果およびコストパフォーマンスの観点から、固形分として好ましくは０．０１〜１０重量％、より好ましくは、０．１〜５重量％である。
【００３１】
本発明の化粧品には、前記メラニン生成抑制剤の他、化粧品に従来から使用されている成分、例えば、アスコルビン酸、アスコルビン酸グルコシド、アルブチン、タキオキシド、３，４−ジメトキシフェニル−Ｏ−Ｄ−グルコース、ヒドロキノン、ｌ−システイン、桑エキス、甘草エキスなどの美白作用をもつ物質などが含有されていてもよい。
【００３２】
本発明の化粧品としては、例えば、化粧水、乳液、クレンジングクリーム、マッサージクリームなどのクリーム類、パック、ファンデーションなどのメーキャップ化粧品、石鹸、洗顔クリーム、ボディローション、ボディーシャンプーなどが挙げられる。これらの化粧品は、前記メラニン生成抑制剤を添加する以外は通常の化粧品と同様の方法で調製される。
【００３３】
次に、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は当該実施例のみに限定されるものではない。
【実施例】
【００３４】
実施例１ メラニン生成抑制剤の調製１
糖蜜160gを4Lの水に溶かし，ろ過して夾雑物を除去して糖蜜水溶液を得た。これをＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−２カラムに通液し，水で洗浄後２５重量％ＭｅＯＨで溶出した。
【００３５】
得られた２５重量％ＭｅＯＨ画分（５．１７ｇ）をｎ−ＢｕＯＨと水にて分配してＢｕＯＨ層（１．１３ｇ）を得、ＢｕＯＨを留去、同画分をＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＨＷ−４０Ｃカラム（２５×６５ｃｍ）にて１０％ＭｅＯＨを用いて溶出させ、吸光度２７０ｎｍで溶出ピークを検出し、主ピーク成分ごとに６つの留分に分画し、それぞれ、画分１（３０ｍｇ）、画分２（１４４ｍｇ）、画分３（４３７ｍｇ）、画分４（１２４ｍｇ）、画分５（１１８ｍｇ）、および画分６（１３１ｍｇ）を得た。
【００３６】
この内、チロシナーゼ阻害活性を測定し最も強かった画分４を低圧分取カラム（ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ ＲＰ−８）にて１５重量％ＭｅＯＨを用いて溶出させ、吸光度２７０ｎｍで溶出ピークを検出し、主ピーク成分ごとに３つの画分に分画し、それぞれ画分４−１（５．１ｍｇ）、画分４−２（２．３ｍｇ）、画分４−３（７．１ｍｇ）の固形分を得た。これらの画分４−１〜４−３は、チロシナーゼ阻害活性作用が認められた。
【００３７】
これらの画分をＩＲ測定（フーリエ変換赤外分光光度計ＦＴＳ−３０００、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）した。ＥＩ−ＭＳ（７０ｅＶ）は、二重収束質量分析計Ｍ−２５００（日立製作所）で測定した。１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲおよび２次元ＮＭＲは重メタノール（ＣＤ３ＯＤ）又は重クロロホルム（ＣＤＣｌ３）を溶媒に核磁気共鳴吸収装置ＪＮＭ−Ａ５００（日本電子）にて室温で測定した。
【００３８】
その結果、画分４−２の成分は２，３−ジヒドロ−３，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オンであることが判明した。また、画分４−１はタキオキシドであることが分かった。画分４−３を更に分取ＨＰＬＣ（Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ−ＭＧ−５；８．０×２５０ｍｍ）にて精製して分析したところグアイアシルグリセロール−β−D−グルコピラノシド、シリンギルグリセロール−β−D−グルコピラノシドであった。
【００３９】
実施例２ メラニン生成抑制剤の調製２
糖蜜２５０ｇを７Ｌの水に溶かし，ろ過して夾雑物を除去して糖蜜水溶液を得た。これをＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−２カラムに通液し，水で洗浄後２５重量％ＭｅＯＨで溶出した。この２５重量％ＭｅＯＨ溶出画分（８．５ｇ）をＰｒｅｐａｒａｔｉｖｅ Ｃ１８カラム（１×３５ｃｍ、ＯＤＳカラム、ウォーターズ社製）に通液し、５％ＭｅＯＨを用いて溶出させた画分（２．６ｇ）を得た。これをＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＨＷ−４０Ｃカラム（２５×６５ｃｍ）にて１０％ＭｅＯＨを用いて溶出させ、吸光度２７０ｎｍで溶出ピークを検出し、主ピーク成分ごとに５つの画分に分画し、それぞれ、画分１（１４１ｍｇ）、画分２（６２９ｍｇ）、画分３（９３６ｍｇ）、画分４（２７４ｍｇ）、画分５（３９２ｍｇ）が得られた。
【００４０】
この内、チロシナーゼ阻害活性を測定し最も強かった画分４を低圧分取カラム（ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ ＲＰ−８）にて１５重量％ＭｅＯＨを用いて溶出させ、吸光度２７０ｎｍで溶出ピークを検出し、主ピーク成分ごとに３つの画分に分画し、それぞれ画分４−１（７．１ｍｇ）、画分４−２（４．３ｍｇ）、画分４−３（１２．３ｍｇ）の固形分を得た。これらの画分４−１〜４−３は、チロシナーゼ阻害活性作用が認められた。
【００４１】
これらの画分をＩＲ測定（フーリエ変換赤外分光光度計ＦＴＳ−３０００、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）した。ＥＩ−ＭＳ（７０ｅＶ）は、二重収束質量分析計Ｍ−２５００（日立製作所）で測定した。１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲおよび２次元ＮＭＲは重メタノール（ＣＤ３ＯＤ）又は重クロロホルム（ＣＤＣｌ３）を溶媒に核磁気共鳴吸収装置ＪＮＭ−Ａ５００（日本電子）にて室温で測定した。その結果、画分４−２の成分は２，３−ジヒドロ−３，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オンであることが判明した。また、画分４−１はタキオキシドであることが分かった。画分４−３を更に分取ＨＰＬＣ（Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ−ＭＧ−５；８．０×２５０ｍｍ）にて精製して分析したところグアイアシルグリセロール−β−D−グルコピラノシド、シリンギルグリセロール−β−D−グルコピラノシドであった。
【００４２】
実施例３
大豆としてスズユタカ１００ｇを粉砕し、７０％エタノール水溶液１０００ｍｌを加え、室温で７時間抽出した。その後、ろ過してろ液を４０℃以下で濃縮した。この濃縮物に水１００ｍｌとブタノール１００ｍｌを加えて溶解させ、ブタノール層を得た。このブタノール層を減圧下で濃縮し、５０ｍｇの濃縮物を得た。これらは、ＯＤＳカラムを用いたＨＰＬＣ分析の既存の方法（Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，第５７巻，第４号，５４６−５５０頁，１９９３年）により大豆ＤＤＭＰサポニン（２，３−ジヒドロ−２，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン−結合−サポニン）の混合物であることが分かった。
【００４３】
実施例４
実施例３と全く同様にスズユタカを処理して、約５２ｍｇの大豆ＤＤＭＰサポニンを得た。これを水１０ｍｌに分散溶解させて、β−グルコシターゼを作用させた後、ブタノール１０ｍｌを加え、よく攪拌し水層を得た。この水相を濃縮して濃縮物を５ｍｇ得た。この濃縮物をＩＲ測定（フーリエ変換赤外分光光度計ＦＴＳ−３０００、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）した。ＥＩ−ＭＳ（７０ｅＶ）は、二重収束質量分析計Ｍ−２５００（日立製作所）で測定した。１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲおよび２次元ＮＭＲは重メタノール（ＣＤ３ＯＤ）又は重クロロホルム（ＣＤＣｌ３）を溶媒に核磁気共鳴吸収装置ＪＮＭ−Ａ５００（日本電子）にて室温で測定した。その結果、濃縮物は、２，３−ジヒドロ−２，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オンであることが判明した。
【００４４】
試験例１ チロシナーゼ阻害活性の測定
実施例１および２で得られた２，３−ジヒドロ−３，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン、実施例３で得られた大豆ＤＤＭＰサポニン（２，３−ジヒドロ−２，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン−結合−サポニン）及び実施例４で得られた２，３−ジヒドロ−２，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン、ならびにアルブチン、コウジ酸、３−ヒドロキシ−４−ピラノンをそれぞれ０．３ｍｇ／ｍｌおよび０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解したリン酸緩衝液（０．０５ｍＭ、ｐＨ６．８）５０μＬに、０．５ｍｇ／ｍｌのＬ−チロシン溶液１５０μＬおよびリン酸緩衝液７５０μＬを加え、直ちに４７０ｎｍの吸光度を測定した。
【００４５】
次いで、混合溶液を３７℃で１０分間プレインキュベートした後、チロシナーゼ溶液２５μｌ（マッシュルーム由来、４７０ユニット）を加えて撹拌した後、３７℃で１５分間酵素反応させた後、４７０ｎｍの吸光度を測定した。
【００４６】
上記で得られた４７０ｎｍの吸光度をもとに、各化合物のチロシナーゼ阻害活性を測定した。その結果を表１に示す。
【００４７】
【表１】
【００４８】
表１の結果より、実施例１および２で得られた２，３−ジヒドロ−３，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン、実施例３で得られた大豆ＤＤＭＰサポニン（２，３−ジヒドロ−２，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン−結合−サポニン）及び実施例４で得られた２，３−ジヒドロ−２，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オンは、従来から知られているアルブチン、コウジ酸、３−ヒドロキシ−４−ピラノンと比較して低濃度で、チロシナーゼ阻害活性を有することがわかる。
【００４９】
試験例２ 培養細胞を用いたメラニン生成抑制効果試験
Ｂ１６メラノーマ細胞２×１０5個を径６ｃｍの培養シャーレ中、試験物質（２，３−ジヒドロ−２，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン、大豆ＤＤＭＰサポニン、２，３−ジヒドロ−２，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン）を０．０５重量％添加した１０％ウシ胎児血清加イーグルＭＥＭ培地を用い、５％炭酸ガスを含有する空気下３７℃、７日間培養した。
【００５０】
培養終了後、０．０２５重量％トリプシンを含むダルベッコリン酸緩衝液を培養シャーレに添加して細胞を剥離し、細胞数を計測した。遠心分離し得られた細胞を肉眼で観察し、細胞の白色化度を以下の評価基準に従って評価した。
（評価基準）
白色化度大：ほとんど白色化しており、褐色細胞が見られない
白色化度中：やや白色化しており、褐色細胞が見られない
白色化度小：白色化していない
【００５１】
メラニン生成抑制剤を添加しなかったコントロールの場合、培養７日後の細胞数は５．４×１０５個で白色化度は小であった。
【００５２】
２，３−ジヒドロ−３，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オンの場合、培養７日後の細胞数は４．８×１０５個で白色化度が大であった。
【００５３】
大豆ＤＤＭＰサポニンの場合、培養７日後の細胞数は５．０×１０５個で白色化度が中であった。
【００５４】
２，３−ジヒドロ−２，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オンの場合、培養７日後の細胞数は４．７×１０５個で白色化度が大であった。
【００５５】
以上の結果より、本発明のメラニン生成抑制剤を添加してメラノーマ細胞を培養した場合、白色化度が大であると共に、細胞に対する毒性がほとんど認められなかった。従って、本発明のメラニン生成抑制剤は、人体に対してほとんど毒性がないと考えられる。
【００５６】
実施例５ メラニン生成抑制剤を含有する化粧品
本発明の２，３−ジヒドロ−３，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン又は２，３−ジヒドロ−２，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オンあるいは２，３−ジヒドロ−２，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン−結合−サポニン（大豆DDMPサポニン）を含有する化粧料の処方例を示す。尚、配合量は重量％である。
（処方１：化粧水）
グリセリン ３．０
プロピレングリコール ２．０
オレイルアルコール ０．１
ポリオキシエチレン（20）ソルビタンモノラウリン酸エステル １．５
エタノール ２０
２，３−ジヒドロ−３，５−ジヒドロキシ−６−メチル−
４Ｈ−ピラン−４−オン ０．３
香料・防腐剤 適量
精製水 全量 １００
（処方２：クリーム）
スクワラン ５．０
ステアリン酸 ２．０
ステアリルアルコール ７．０
還元ラノリン ２．０
オクチルドデカノール ６．０
ポリオキシエチレン（25）セチルアルコール ３．０
親油型モノステアリン酸グリセリン ２．０
プロピレングリコール ５．０
大豆DDMPサポニン ０．０１
香料・防腐剤 適量
精製水 全量 １００
（処方３：乳液）
流動パラフィン １０．０
ステアリン酸 ０．２
セタノール １．５
ワセリン ３．０
ラノリンアルコール ２．０
ポリオキシエチレン（10）モノオレイン酸エステル ２．０
グリセリン ３．０
プロピレングリコール ５．０
トリエタノールアミン １．０
２，３−ジヒドロ−２，５−ジヒドロキシ−
６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン ０．１
香料・防腐剤 適量
精製水 全量 １００
（処方４：パック）
ポリビニルアルコール １５．０
カルボキシメチルセルロースナトリウム ５．０
プロピレングリコール ３．０
エタノール １０．０
２，３−ジヒドロ−３，５−ジヒドロキシ−
６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン １．０
香料・防腐剤 適量
精製水 全量 １００
【００５７】
試験例３
色黒、シミ、ソバカスに悩む被験者４０名をパネルとし、半分の２０名には前述の実施例５の処方1：化粧水を、残りの２０名には実施例３の処方1：化粧水より２，３−ジヒドロ−３，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オンを除いた処方の化粧水（比較例）を３ケ月間毎日使用させた場合の美白効果を判定した。その結果、実施例３の処方１：化粧水を使用した場合は、有効（色素沈着がかなり薄くなった）：１０名、やや有効（色素沈着がやや薄くなった）：７名，無効（色素沈着に変化がなかった）：３名であった。また、比較例の化粧水を使用した場合は、有効（色素沈着がかなり薄くなった）：０名、やや有効（色素沈着がやや薄くなった）：５名，無効（色素沈着に変化がなかった）：１５名であった。これから分かるように、本発明品を含む化粧水の方が比較対象の化粧水よりも明らかに美白効果が認められた。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明のメラニン生成抑制剤は、美白効果を有する化粧品に利用できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式で表される化合物の１種又は２種以上を有効成分とするメラニン生成抑制剤。
【化１】
但し、式中、Ｒ1は水素原子（Ｈ）又は水酸基（ＯＨ）あるいはサポニンを示す。Ｒ2は水素原子（Ｈ）又は水酸基（ＯＨ）示す。
【請求項２】
２，３ジヒドロ−３，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン、２，３ジヒドロ−２，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン及び２，３ジヒドロ−２，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン−結合−サポニンの群より選ばれる１種又は２種以上を有効成分とするメラニン生成抑制剤。
【請求項３】
請求項１又は２記載のメラニン生成抑制剤を含んでなる化粧品。
【請求項１】
下記一般式で表される化合物の１種又は２種以上を有効成分とするメラニン生成抑制剤。
【化１】
但し、式中、Ｒ1は水素原子（Ｈ）又は水酸基（ＯＨ）あるいはサポニンを示す。Ｒ2は水素原子（Ｈ）又は水酸基（ＯＨ）示す。
【請求項２】
２，３ジヒドロ−３，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン、２，３ジヒドロ−２，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン及び２，３ジヒドロ−２，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−オン−結合−サポニンの群より選ばれる１種又は２種以上を有効成分とするメラニン生成抑制剤。
【請求項３】
請求項１又は２記載のメラニン生成抑制剤を含んでなる化粧品。
【公開番号】特開２００６−２８０７７（Ｐ２００６−２８０７７Ａ）
【公開日】平成１８年２月２日（２００６．２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２０８４６６（Ｐ２００４−２０８４６６）
【出願日】平成１６年７月１５日（２００４．７．１５）
【出願人】（０００２０４１８１）太陽化学株式会社 (244)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年２月２日（２００６．２．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年７月１５日（２００４．７．１５）
【出願人】（０００２０４１８１）太陽化学株式会社 (244)
【Ｆターム（参考）】
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