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リボフラビンベースのエアロゾル及び臨床試験におけるプラセボとしての使用
説明

リボフラビンベースのエアロゾル及び臨床試験におけるプラセボとしての使用

個体の第1集団にエアロゾル吸入を介して試験化合物を投与するステップと;個体の第2集団にエアロゾル吸入を介してリボフラビン5’−リン酸から成るプラセボを投与するステップと;前記2つの集団の生物学的マーカーを比較するステップとを具えるエアロゾル化試験化合物の評価方法である。リボフラビン5’−リン酸(フラビンモノヌクレオチドとしても知られている)から成るエアロゾルは臨床試験におけるプラセボ、又は治療的に使用しうる。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本出願は、2009年8月19日に出願された「慢性閉塞性肺疾の治療用のエアロゾル化レボフロキサシンの使用」と題した米国仮出願第61/235,319号、及び2009年10月6日に出願された米国仮出願第61/249,228号の利益を主張するものであり全体を参照することによって組み込まれている。
【0002】
技術分野
本発明は、エアロゾル化した試験化合物を評価する方法及び化合物に関連している。特に、リボフラビン5’−リン酸の使用に関連する方法と化合物を提供する。
【背景技術】
【0003】
様々な治療用化合物が経口的、又は非経口的に、例えば静脈注射、筋肉注射又は皮下注射などで投与されている。薬剤の注射は効果的であるものの、患者への不快感や不便さによって患者がアドバイスに従わないという特徴がある。その結果、注射の代替品又は代用品として治療化合物を経口組成物で提供するのが望ましいとしばしば考えられている。しかし、経口組成物は、吸収が悪く、肝臓における初回通過代謝が速く、有効血漿レベルに達するのが遅く、及びその他の問題によってしばしば特徴づけられる。更に、経口、非経口投与は一般的に薬物を全身に送達する。疾病の局所のみに薬剤が必要な場合、局所投与により全身投与で生じ得る副作用を防ぐことができる。
【0004】
いくつかのエアロゾル化組成物は、鼻腔内又は口内吸入を通した鼻腔、副鼻腔洞及び呼吸器区画への直接的な投与に使用されてきた。エアロゾル投与は、例えば薬物送達の非呼吸経路に関連する非呼吸性毒性のリスクを低減し、部位への高い薬物送達濃度を可能にする複数の利点を有している。鼻腔内又は経口吸入を介した特定の化合物と組成物を投与する前の有効性の評価については継続した必要性がある。
【発明の概要】
【0005】
本発明はエアロゾル化した試験化合物を評価する方法及び組成物に関連している。特に感染者の個体の第一集団についてのリボフラビン5’−リン酸の使用に関連する方法及び組成物に関連している。
【0006】
本発明の一部の実施態様は、試験化合物を評価する方法を含んでいる。このような方法の一部は、エアロゾルの吸入を介したリボフラビン5’−リン酸を第1集団の個体に投与するステップ;エアロゾルの吸入を介した第2集団の個体にリボフラビン5’−リン酸を投与するステップ;及び試験試薬を投与した少なくとも1の個体の生物学的マーカーとプラセボを投与した少なくとも1の個体の生物学的マーカーの比較するステップ;を具えている。
【0007】
一部の実施態様において、試験化合物の投与は、試験化合物のエアロゾル化溶液を送達するステップを含んでいる。
【0008】
一部の実施態様において、投与は肺内投与、又は経鼻投与である。
【0009】
一部の実施態様において、試験化合物又はプラセボは肺内送達装置によって送達される。このような一部の実施態様において肺内送達装置は、噴霧器又は定量吸入器である。
【0010】
一部の実施態様において、生物学的なマーカーは、治療効果に関連するマーカー、副作用に関連するマーカー、毒作用に関連するマーカー、薬力学的パラメーターに関連するマーカーを含んでいる。
【0011】
一部の実施態様において、試験化合物は、抗生物質、抗アレルギー薬、抗がん剤、抗真菌剤、抗悪性腫瘍薬、鎮痛薬、気管支拡張薬、抗ヒスタミン薬、抗ウイルス薬、鎮咳薬、アンギナール製剤、抗炎症薬、免疫調節薬、5−リポキシゲナーゼ阻害薬、ロイコトリエン拮抗薬、ホスホリパーゼA2阻害剤、ホスホジエステラーゼIV阻害剤、ペプチド類、タンパク質、ステロイド及びワクチン製剤から成る群の少なくとも1つのメンバー(種類)を含んでいる。
【0012】
一部の実施態様において、プラセボは、リボフラビン5’−リン酸の溶液から成る。このような実施態様の一部において、この溶液は、約0.1mg/mLより高く、約0.001mg/Lより高く、約0.005mg/Lより高く、約0.02mg/Lより高く、及び約0.06mg/Lよりも高いリボフラビン5’−リン酸の濃度から成る。
【0013】
一部の実施態様において、リボフラビン5’−リン酸のエアロゾルは、約0.001mg/kg/日よりも高く、約0.01mg/kg/日よりも高く、約0.1mg/kg/日よりも高く及び、約0.2mg/kg/日よりも高い吸入可能送達用量から成る。
【0014】
一部の実施態様において、リボフラビン5’−リン酸のエアロゾルは約0.01mg/kg/日よりも高く、約0.1mg/kg/日よりも高く、約1.0mg/kg/日よりも高く、約2.0mg/kg/日よりも高い量から成る。
【0015】
一部の実施態様において、エアロゾル化リボフラビン5’−リン酸は、3.0μmよりも小さい又は同等な幾何標準偏差を有する約0.5μm乃至約4.5μmの空気動力学的中央粒子径から成る。
【0016】
一部の実施態様において、エアロゾル化リボフラビン5’−リン酸は、2.7μmよりも小さい又は同等な幾何標準偏差を有する約1.0μm乃至約3.5μmの空気動力学的中央粒子径から成る。
【0017】
一部の実施態様において、エアロゾル化リボフラビン5’−リン酸は、エアロゾル化リボフラビン5’−リン酸は、2.4μmよりも小さい又は同等な幾何標準偏差を有する約1.1μm乃至約3.1μmの空気動力学的中央粒子径から成る。
【0018】
一部の実施態様において、プラセボは少なくとも毎日投与する。
【0019】
一部の実施態様において、個体は動物である。このような一部の実施態様において、動物は哺乳類である。このような一部の実施態様において、哺乳類はラット、犬、及び人間を含んでいる。
【0020】
本発明の一部の実施態様は、同様に試験化合物又はプラセボを集団の個体に投与して試験化合物を評価する方法も含み:集団の個体において試験化合物とプラセボの治験を実施するステップを具え、プラセボはエアロゾル化したリボフラビン5’−リン酸である。
【0021】
前述の記載に加えて、本発明の一部の実施態様は、リボフラビン5’−リン酸から成るエアロゾルを含んでいる。一部の実施態様において、エアロゾルはリボフラビン5’−リン酸の溶液を含んでいる。
【0022】
一部の実施態様において、この溶液は約0.1mg/mLよりも高く、約0.001mg/Lよりも高く、約0.005mg/Lよりも高く、約0.02mg/Lよりも高く、及び約0.06mg/Lよりも高い濃度のリボフラビン5’−リン酸から成る。
【0023】
一部の実施態様において、エアロゾルは、約0.001mg/kg/日よりも高く、約0.01mg/kg/日よりも高く、約0.1mg/kg/日よりも高く、及び約0.2mg/kg/日よりも高い吸入可能送達量のリボフラビン5’−リン酸を含んでいる。
【0024】
一部の実施態様において、エアロゾルは約0.01mg/kg/日よりも高く、約0.1mg/kg/日よりも高く、約1.0mg/kg/日よりも高く、及び約2.0mg/kg/日よりも高いリボフラビン5’−リン酸の用量を含んでいる。
【0025】
一部の実施態様において、エアロゾルは3.0μmよりも小さい又は同等な幾何標準偏差を有する約0.5μm乃至約4.5μmの空気動力学的中央粒子径から成り、2.7μmよりも小さい又は同等な幾何標準偏差を有する約1.0μm乃至約3.5μmの空気動力学的中央粒子径から成り、又は2.4μmよりも小さい又は同等な幾何標準偏差を有する約1.1μm乃至約3.1μmの空気動力学的中央粒子径のエアロゾル化リボフラビン5’−リン酸から成るエアロゾルを含んでいる。
【図面の簡単な説明】
【0026】
【図1】図1は、雄又は雌ラットにおける28日間のエアロゾル化リボフラビン5’−リン酸の後の平均血漿濃度−時間のプロファイルのグラフを示している。
【図2A】図2Aは、雄ラットにおける28日間のリボフラビン5’−リン酸エアロゾル化投与後の平均リボフラビンCmax(最高血中濃度)と平均リボフラビンAUC()(薬物血中濃度−時間曲線下面積)を示すグラフである。
【図2B】図2Bは、雌ラットにおける28日間のリボフラビン5’−リン酸エアロゾル化投与後の平均リボフラビンCmax平均リボフラビンとAUC()のグラフを示している。
【図3】図3は、雄又は雌の犬における28日間のリボフラビン5’−リン酸エアロゾル化投与後の平均リボフラビン血漿濃度−時間のプロファイルのグラフを示している。
【図4A】図4Aは犬における28日間のリボフラビン5’−リン酸エアロゾル化投与後の平均リボフラビンCmaxとAUC()のグラフを示している。
【図4B】図4Bは犬における28日間のリボフラビン5’−リン酸エアロゾル化投与後の平均リボフラビンCmaxとAUC()のグラフを示している。
【発明を実施するための形態】
【0027】
本発明は、エアロゾル化試験化合物を評価する方法及び化合物に関連している。特に、リボフラビン5’−リン酸の使用に関連する方法及び化合物を提供する。一部の実施態様は、試験化合物又はプラセボを個体の集団に投与するステップを具え、プラセボはリボフラビン5’−リン酸のエアロゾル化溶液を含み、及び試験化合物を投与した少なくとも1の個体の生物学的マーカーとプラセボを投与した少なくとも1の個体の生物学的マーカーとを比較するステップを具える試験化合物の評価方法を含んでいる。更なる実施態様は、個体の集団において試験化合物とプラセボの治験を実施するステップを具える、プラセボはリボフラビン5’−リン酸のエアロゾル化溶液から成る試験化合物の評価方法を含んでいる。
【0028】
出願人は、リボフラビン5’−リン酸のエアロゾル化溶液の吸入投与により臨床所見上の副作用は検出されず、哺乳類モデルシステムにおいて局所、又は全体的な毒性を示さず、忍容性が良好であることを発見した。例えば、犬では1.34mg/kg/日のリボフラビン5’−リン酸を28日間の連続して口鼻投与した後に副作用は確認されなかった。ラットでは2.4mg/kg/日のリボフラビン5’−リン酸を28日間連続して鼻からのみエアロゾル投与した後に副作用は確認されなかった。リボフラビン5’−リン酸のエアロゾル化溶液は、臨床所見上の副作用がなく、局部性又は全身性の毒性が顕れていないため試験化合物を評価する方法におけるプラセボ対照として良く適している。従って、本発明の一部の実施態様では、リボフラビン5’−リン酸のエアロゾル化溶液を対照として使用する試験化合物の評価方法を提供している。
【0029】
試験化合物を評価する一部の方法は治験を含んでよい。治験は、新規治療化合物、新規組成物、及び治療化合物の新たな使用についての安全性と有効性のデータを集めるために実施する。治験は、無作為、盲検及び/又はプラセボ対照をするように設計された無作為化比較試験を含んでよい。無作為化試験において、各試験対照は研究治療又はプラセボを受けるように無作為に割り当てられる。盲検に関連する試験の対象は、試験治療又はプラセボのいずれを受けるかを知らず、試験が二重盲検の場合は、同様に研究者も所定の対象がいずれの治療を受けているかを知らない。そして、プラセボ対照試験において、ある対象の群は試験治療を受け、別の対照群がプラセボを受ける。
【0030】
プラセボ群の1つの目的は、治療自体に依存していないプラセボ効果を明らかにすることである。そのような因子は、ヘルスケアの専門家による治療を受けていることへの認知や進行中の試験研究に対する治療効果に対する期待を含んでいる。プラセボ群と別の群を比較をしなければ、治療効果自体が何らかの効果を有しているか否かを知ることができない。従って、プラセボの使用は治療化合物、及び/又は治療の有効性についての何らかの定量的評価を作成を試みる殆どの臨床試験の標準的な対照コンポーネントである。
【0031】
一部の実施態様は、プラセボとしてリボフラビン5’−リン酸のエアロゾル化溶液の使用を含んでいる。このような一部の実施態様において、試験化合物又はプラセボは個体の集団に投与できる。試験化合物の有効性は試験化合物を投与した少なくとも1個体の生物学的マーカーとプラセボを投与した少なくともl個体の生物学的マーカーとを比較することで確認できる。
【0032】
生物学的なマーカーの例は、治療効果に関連するマーカー、副作用に関連するマーカー、毒作用に関連するマーカー、薬力学的パラメーターに関連するマーカーを含んでいる。一般的に、治療効果は治療効果は望ましく及び/又は有益であり、一方で副作用は有害及び/又は望ましくない。両タイプの効果は、個体における生理学的又は行動の変化を含みうる。薬力学的パラメータは、試験化合物の個体の身体への生理作用に関連している。薬物動態パラメータは、試験化合物の身体への効果に関連している。
【0033】
本明細書に使用する「個体」は動物を含んでいる。「動物」という用語は、例えば哺乳類、霊長類、ネズミ、ラット、犬、及び人間といった通常の意味と最も幅広い意味に使用し、無脊椎動物を含む。
【0034】
一部の実施態様は、リボフラビン5’−リン酸又はその塩を使用している。リボフラビン5’−リン酸は、フラビンモノヌクレオチド及びビタミンBリン酸塩としても知られている。リボフラビン5’−リン酸は下記の構造を有している。

【0035】
一般的に、試験化合物を評価する一部の方法において、プラセボは試験化合物の組成に実質的に類似する組成を含み得る。プラセボの組成は一般的には試験化合物を含んでいないと解釈すべきである。逆に言えば、試験化合物を含んでいる組成は一般的にプラセボを含んでいない。試験化合物及びプラセボの組成は、投与のモードに応じて、同様に試験化合物またはプラセボの特性に応じて様々である。化合物のエアロゾル送達の例は米国特許出願公報第2006−0276483号に開示されており、全体を参照することにより本明細書に組み込まれている。
【0036】
リボフラビン5’−リン酸の一部の溶液は、黄色/橙色/赤色を有する。リボフラビン5’−リン酸溶液の色はリボフラビン5’−リン酸溶液の濃度などの要素によって多様になり得る。一部の実施態様において、リボフラビン5’−リン酸溶液は試験化合物に含まれる溶液の色を都合よく隠すことができる。このような実施態様の一部において、試験化合物を含んでいる組成は同様にリボフラビン5’−リン酸を含みうる。それによって、試験化合物を含んでいる溶液のうち欠如している色をプラセボ溶液に適合させうる。
【0037】
試験化合物を評価する一部の方法は、例えば約0.001mg/mL、約0.002mg/mL、約0.003mg/mL、約0.004mg/mL、約0.005mg/mL、約0.006mg/mL、約0.007mg/mL、約0.008mg/mL、約0.009mg/mL、及び約0.01mg/mL、約0.02mg/mL、約0.03mg/mL、約0.04mg/mL、約0.05mg/mL、約0.06mg/mL、約0.07mg/mL、約0.08mg/mL、約0.09mg/mL、及び約0.1mg/mL、約0.2mg/mL、約0.3mg/mL、約0.4mg/mL、約0.5mg/mL、約0.6mg/mL、約0.7mg/mL、約0.8mg/mL、約0.9mg/mL、及び約1mg/mL、約2mg/mL、約3mg/mL、約4mg/mL、約5mg/mL、約6mg/mL、約7mg/mL、約8mg/mL、約9mg/mL、及び約10mg/mLよりも高い濃度から成るリボフラビン5’−リン酸の溶液含んでよい。
【0038】
試験化合物を評価する一部の方法は、約0.001mg/kg/日、約0.002mg/kg/日、約0.003mg/kg/日、約0.004mg/kg/日、約0.005mg/kg/日、約0.006mg/kg/日、約0.007mg/kg/日、約0.008mg/kg/日、約0.009mg/kg/日、及び約0.01mg/kg/日、約0.02mg/kg/日、約0.03mg/kg/日、約0.04mg/kg/日、約0.05mg/kg/日、約0.06mg/kg/日、約0.07mg/kg/日、約0.08mg/kg/日、約0.09mg/kg/日、及び約0.1mg/kg/日、約0.2mg/kg/日、約0.3mg/kg/日、約0.4mg/kg/日、約0.5mg/kg/日、約0.6mg/kg/日、約0.7mg/kg/日、約0.8mg/kg/日、約0.9mg/kg/日、及び約1mg/kg/日、約2mg/kg/日、約3mg/kg/日、約4mg/kg/日、約5mg/kg/日、約6mg/kg/日、約7mg/kg/日、約8mg/kg/日、約9mg/kg/日、及び約10mg/kg/日よりも高い吸入送達用量のリボフラビン5’−リン酸を含んでよい。
【0039】
試験化合物を評価する一部の方法は約0.001mg/kg/日、約0.002mg/kg/日、約0.003mg/kg/日、約0.004mg/kg/日、約0.005mg/kg/日、約0.006mg/kg/日、約0.007mg/kg/日、約0.008mg/kg/日、約0.009mg/kg/日、及び約0.01mg/kg/日、約0.02mg/kg/日、約0.03mg/kg/日、約0.04mg/kg/日、約0.05mg/kg/日、約0.06mg/kg/日、約0.07mg/kg/日、約0.08mg/kg/日、約0.09mg/kg/日、及び約0.1mg/kg/日、約0.2mg/kg/日、約0.3mg/kg/日、約0.4mg/kg/日、約0.5mg/kg/日、約0.6mg/kg/日、約0.7mg/kg/日、約0.8mg/kg/日、約0.9mg/kg/日、及び約1mg/kg/日、約2mg/kg/日、約3mg/kg/日、約4mg/kg/日、約5mg/kg/日、約6mg/kg/日、約7mg/kg/日、約8mg/kg/日、約9mg/kg/日、及び約10mg/kg/日よりも高い用量のリボフラビン5’−リン酸を含んでよい。
【0040】
試験化合物を評価する一部の方法は、3.0μmよりも小さい又は同等な幾何標準偏差を有する約0.5μm乃至約4.5μmの空気動力学的中央粒子径から成るエアロゾル化リボフラビン5’−リン酸を含んでよい。試験化合物を評価する更なる方法は、2.7μmよりも小さい又は同等な幾何標準偏差を有する約1.0μm乃至約3.5μmの空気動力学的中央粒子径から成るエアロゾル化リボフラビン5’−リン酸を含んでよい。化合物を評価する更なる方法は、2.4μmよりも小さい又は同等な幾何標準偏差を有する約1.1μm乃至約3.1μmの空気動力学的中央粒子径から成るエアロゾル化リボフラビン5’−リン酸を含んでよい。
【0041】
投与のモード
試験化合物とプラセボは、肺及び鼻腔送達モードを含む多様な送達モードによって投与することができる。
【0042】
肺内投与
一部の実施態様は、試験化合物又はプラセボは肺送達で行うことができる。試験化合物又はプラセボは吸入によって肺に送達することができ、肺上皮層を横断して血流へ載る。治療薬の肺送達用に設計された当業者に周知な噴霧器、定量式吸入器、及び粉末吸入器を含む様々な機械装置を使用することができるが、これらに限定されない。これらの装置は試験試薬又はプラセボの調剤に適した組成で行う。一般的には、各組成は、使用する装置のタイプに特異的であり、適切な噴射材料、治療に有効な希釈液に加えてアジュバント及び/又は担体の使用を含めることができる。
【0043】
一般的に、吸入粒子は大きな粒子で主要な原因を占める固着(impaction)と小さな粒子で一般的にみられる堆積(sedimentation)の、2つのメカニズムのうち、いずれかにより沈着(deposition)する。固着は、吸入粒子のモメンタムが気流に乗らないほど大きく、物理的な表面に衝突した際に生ずる。対照的に、堆積は、吸入気流によって移動する非常に小さな粒子が気流のランダムな拡散の結果として、主に肺の深い部分の物理的表面に衝突した祭に生じる。
【0044】
肺内投与では、中間と下気道が選ばれ、上気道は阻止される。肺内薬剤送達は、口や喉を通したエアロゾルの吸入によって達成しうる。約5μmを超える空気動力学的中央粒子径(MMAD)を有する粒子は一般的に肺に到達しない。そのかわり、これらは喉の後部に衝突し飲み込まれ、口腔内吸収も可能である。約2乃至約5μmの直径を有する粒子は上及び中肺内領域に到達(気流送達により)するには十分小さいが、肺胞に到達するには大きすぎる。微粒子、すなわち約0.5乃至約2μmは、肺胞に到達することができる。同様に約0.5μmよりも小さい粒径を有する粒子も堆積により肺胞に沈着するが、非常に小さな粒子は息に吐き出されうる。粒径の測定は、容積平均直径(VMD)、質量中央径(MMD)又はMMADを参照できる。これらは衝突(MMD及びMMAD)又はレーザー(VMD)によって測定することができる。液体粒子では、例えば湿度標準などの環境条件が保たれればVMD、MMD及びMMADは一定になりうる。しかし、MMD及びMMAD測定で湿度が保たれなければ、衝突体(impactor)計測の間の脱水によりVMDよりも小さくなる。しかし、この記載の目的は、VMD、MMD及びMMAD計測は、VMD、MMD及びMMADが比較できるように標準環境下で行うように考慮すべき点にある。MMD及びMMADによる乾燥粉末粒子サイズの計測も同様に比較できるように考慮すべきである。
【0045】
エアロゾルの粒子サイズは空気動力学的中央粒子径(MMAD)と表現しうる。大型(例えばMMAD>5μm)の粒子は上気道の湾曲を通り過ぎるには大きすぎて上気道に沈着しうる。微粒子(例えばMMAD<2μm)は低気道にあまり沈着せず、息に吐き出されることで、上気道への更なる沈着の機会を提供している。したがって、吸入による大型粒子の固着、及び微粒子の繰り返しの吸入と呼気の間の堆積によって不忍容(例えば、咳及び気管支けいれん)が生じうる。したがって、ある実施態様では、中気道部分の沈着を最大化し、上気道の沈着に関連している不忍容を最小化する適切な粒子サイズ(例えばMMAD=2乃至5μm)を使用する。更に、幾何標準偏差(GSD)に限定した規定粒子サイズの生成により、適切な沈着と忍容性になりうる。狭いGSDは所望のMMADサイズの範囲外の粒子を制限する。ある実施態様では、約2.5μmよりも小さく又は同等のGSDである約2μm乃至約5μmのMMADを有し、本明細書に開示されている1又はそれ以上の化合物を含むエアロゾルを提供する。別の実施態様では、約2μmのGSDよりも小さく又は同等である約2.8μm乃至約4.3μmのMMADを有するエアロゾルを提供する。別の実施態様では、約1.8μmよりも小さく又は同等のGSDである約2.5μm乃至約4.5μmのMMADを有するエアロゾルを提供する。
【0046】
試験化合物又はプラセボ及び/又は他の選択的な活性成分は平均粒子サイズが0.1μmから又は10μmよりも小さく又は大きい粒子を都合よく調整でき、より好ましくは約0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、又は0.9μm乃至、約1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、又は9.5μmまでである。試験化合物又はプラセボの肺送達用の薬学的に許容可能な担体はトレハロース、マンニトール、キシリトール、スクロース、ラクトース、及びソルビトールといった炭化水素が含まれる。処方に使用する他の成分はDPPC、DOPE、DSPC、及びDOPCを含めることができる。シクロデキストリンなどポリエチレングリコールやデキストランを含む天然又は合成界面活性剤を使用できる。胆汁酸塩と他の関連する増進剤と同様にセルロースとセルロース誘導体、アミノ酸を使用できる。リポソーム、マイクロカプセル、ミクロスフェア、包接錯体、及び他のタイプの担体を使用してもよい。
【0047】
ある実施態様において、噴霧器は、本明細書に開示する試験化合物又はプラセボの主に約2乃至約5μmのMMADを有するエアロゾルの形成を可能にする基準で選択される。水性及び非加圧液体システムでは、様々な噴霧器(小型量噴霧器を含む)によって組成物のエアロゾル化が可能である。コンプレッサ駆動型の噴霧器はジェット技術を組み込んでおり、圧縮空気を使用して液体エアロゾルを生成する。このような装置は、例えばHealthdyne Technologies社、Invacare社、Mountain Medical Equipment社、Pari Respiratory社、Mada Medical社Puritan−Bennet社、Schuco社、DeVilbiss Health Care社及びHospitak社で市販されている。超音波噴霧器は吸入可能な液滴を生成する圧電性結晶の振動型の機械エネルギーに依存しており、例えばOmron Healthcare社やDeVilbiss Health Care社で市販されている。振動メッシュ噴霧器は、吸入可能な液滴を生成するような圧電物質又は機械的パルスのいずれかに依存している。本明細書に記載されている試験化合物又はプラセボに使用する噴霧器の例は米国特許番号第4,268,460号、第4,253,468号、第4,046,146号、第3,826,255号、第4,649,911号、第4,510,929号、第4,624,251号、第5,164,740号、第5,586,550号、第5,758,637号、第6,644,304号、第6,338,443号、第5,906,202号、第5,934,272号、第5,960,792号、第5,971,951号、第6,070,575号、第6,192,876号、第6,230,706号、第6,349,719号、第6,367,470号、第6,543,442号、第6,584,971号、第6,601,581号、第4,263,907号、第5,709,202号、第5,823,179号、第6,192,876号、第6,644,304号、第5,549,102号、第6,083,922号、第6,161,536号、第6,264,922号、第6,557,549号、及び第6,612,303号に記載されており、全体を参照することにより本明細書に組み込まれている。本明細書に記載のフルオロキノロン抗生物質に使用できる市販の噴霧器の例は、Aerogen社により製品化されているResprgard II(登録商標)、Aeroneb(登録商標)、Aeroneb(登録商標)Pro、及びAeroneb(登録商標)Go、Aradigm社により製品化されているAERx(登録商標)及びAERx Essence(商標)、Respironics社により製品化されているPorta−Neb(登録商標)、Freeway Freedom(商標)、Sidestream、Ventstream及びI−neb、及びPARI,GmbHにより製品化されているPARI LC−Plus(登録商標)、PARI LC−Star(登録商標)、及びe−Flow(商標)などである。更に非限定的な実施例は米国特許第6,196,219号は全体を参照することにより本明細書に組み込まれている。噴霧器を使用した更なる方法が米国特許出願公報第2006−0276483号に開示されており、全体を参照することにより本明細書に組み込まれている。
【0048】
ジェット技術又は超音波の噴霧器に使用する適切な製剤処方は、一般的に水に溶解又は懸濁した試験化合物又はプラセボは、溶液1mL当たり約0.01又は100mgよりも少なく、又はそれよりも高い阻害剤濃度から成り、好ましくは約0.1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10mg/mL乃至約15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、又は90mg/mLまでの溶液である。組成には緩衝液と単糖(例えばタンパク質安定剤と浸透圧調整用)を含んでよい。噴霧器の組成には、エアロゾル形成における溶液の噴霧化により引き起こされる界面の凝集を減少させ、阻害する界面活性剤を含んでよい。
【0049】
一部の実施態様は定量式吸入器(MDI)を利用している。噴射剤駆動型の吸入器(pMDI)は作動ごとに定量の試験化合物又はプラセボを放出する。試験化合物又はプラセボはハロゲン化炭化水素といった適切な噴射剤に試験化合物又はプラセボの懸濁液又は溶液として組成されている。pMDIsは、例えばNewman,S.P.,Aerosols and the Lung,Clarke et al,eds,pp.197−224(Butterworths,London,England,1984)に記載されている。
【0050】
一部の実施態様において、MDIにおける試験化合物又はプラセボの粒子サイズは最適に選択しうる。一部の実施態様では、活性成分の粒子は50μmよりも小さい直径を有する。一部の実施態様において、約10μmよりも小さい直径を有する。一部の実施態様において、粒子は約1μm乃至約5μmの直径を有する。一部の実施態様において、粒子は約1μmよりも小さい直径を有している。一部の有利な実施態様において、直径は約2μm乃至約5μmの直径を有している。
【0051】
定量式吸入器に使用する組成は、一般的に界面活性剤を用いて噴射剤に懸濁させた活性成分を含む微粉から成る。噴射剤は、クロロフルオロカーボン類、ヒドロクロロフルオロカーボン類、ヒドロフルオロカーボン類及び炭化水素類を含む通常の噴射剤を含んでいる。好ましい噴射剤はトリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール、1,1,1,2−テトラフルオロエタン、及びこれらの組み合わせである。ヒドロフルオロアルカン類をを含んでいる医薬品エアロゾルの調整は米国特許番第6,585,958号、米国特許番第2,868,691号、及び米国特許番第3,014,844号に存在しており全体を参照することによって本明細書に組み込まれている。適切な界面活性剤はソルビタン、トリオレイン、大豆レシチン及びオレイン酸を含んでいる。
【0052】
一部の実施態様では、乾燥粉末吸入器を利用している。乾燥粉末吸入器は主に2つの設計がある。1つの設計は、試験化合物又はプラセボのリザーバが装置内に配置されており、ある量の試験化合物又はプラセボが吸入チャンバに入れられる定量装置である。2つめは、工場内で定量化した装置であり、各噴霧量は異なるコンテナで製造されたものである。両システムは、質量中央径が約1乃至5μmの微粒子の試験化合物又はプラセボの組成に依存しており、通常は、より大きい添加粒子(一般的には100μmのラクトース粒子)との共組成を伴っている。試験化合物又はプラセボの粉末は吸入チャンバに入れられ(定量装置又は工場で定量化の開封により)、個体の吸気流によって加速することで粉末は装置外に放出され口腔に送り込まれる。粉末経路に特徴づけられる非層流によって、添加−試験化合物又はプラセボの凝集は解消し、大型添加粒子の大部分は喉の奥に固着し、一方でプラセボ粒子は肺の深部に沈着する。
【0053】
液体噴霧器とMDIsによって試験化合物又はプラセボのエアロゾル形成についての粒子径は適切になされる。MMADが約5μmよりも大きい粒子径の場合、粒子は上気道に沈着する。エアロゾルが約1μmの粒子径よりも小さい場合、肺胞に送達され、全身の血液循環に移動しはじめる。
【0054】
本明細書で使用する乾燥粉末吸入器についての更なる例は、米国特許第4,811,731号、第5,113,855号、第5,840,279号、第3,507,277号、第3,669,113号、第3,635,219号、第3,991,761号、第4,353,365号、第4,889,144号、第4,907,538号、第5,829,434号、第6,681,768号、第6,561,186号、第5,918,594号、第6,003,512号、第5,775,320号、第5,740,794号、及び第6,626,173号に記載されており、全体を参照することにより本明細書に組み込まれている。
【0055】
粉末吸入装置から分配される組成物は、一般的に試験化合物又はプラセボから成る乾燥微粉であり、選択的にラクトース、ソルビトール、スクロース、マンニトール、トレハロース又はキシリトールなど装置内からの粉末の分散を促進する量の充填剤を含み、一般的には組成物中に1重量%から又は99重量%よりも少なく又は大きく、好ましくは組成物中の約5、10、15、20、25、30、35、40、45、又は50重量%乃至約55、60、65、70、75、80、85、又は90重量%までである。
【0056】
一部の実施態様は、リボフラビン5’−リン酸のエアロゾルを含んでいる。エアロゾルは、空気中に固体粒子の懸濁液と液体の懸濁液を含んでいる。一部の実施態様では、エアロゾルはリボフラビン5’−リン酸の溶液を含んでいる。
【0057】
一部の実施態様では、リボフラビン5’−リン酸の溶液は約0.1mg/mLよりも高く、約0.001mg/Lよりも高く、約0.005mg/Lよりも高く、約0.02mg/Lよりも高く、及び約0.06mg/Lよりも高い濃度である。
【0058】
一部の実施態様において、エアロゾルは、約0.001mg/kg/日よりも高く、約0.01mg/kg/日よりも高く、約0.1mg/kg/日よりも高く、及び約0.2mg/kg/日よりも高い吸入送達用量のリボフラビン5’−リン酸を含んでいる。
【0059】
一部の実施態様において、エアロゾルは約0.01mg/kg/日よりも高く、約0.1mg/kg/日よりも高く、約1.0mg/kg/日よりも高く、及び約2.0mg/kg/日よりも高い量のリボフラビン5’−リン酸を含んでいる。
【0060】
一部の実施態様においてエアロゾルは3.0μmよりも小さい又は同等な幾何標準偏差を有する約0.5μm乃至約4.5μmの空気動力学的中央粒子径から成り、2.7μmよりも小さい又は同等な幾何標準偏差を有する約1.0μm乃至約3.5μmの空気動力学的中央粒子径から成り、又は2.4μmよりも小さい又は同等な幾何標準偏差を有する約1.1μm乃至約3.1μmの空気動力学的中央粒子径から成るエアロゾル化リボフラビン5’−リン酸を含んでいる。
【0061】
エアロゾルを添加する更なる方法は米国特許公報第2006−0276483号に記載されており、全体を参照することにより本明細書に組み込まれている。
【0062】
経鼻内投与
経鼻送達は、直接、肺に製品の沈着をさせる必要もなく、鼻に治療製品を投与した後、血流へのプラセボ及び/又は試験化合物の移動を可能にする。一部の実施態様において、試験化合物とプラセボを噴霧型点鼻薬又は点鼻薬により投与できる。噴霧型点鼻薬は液体又は固体の噴霧型点鼻薬でよい。噴霧型点鼻薬はエアロゾル又は非エアロゾルの噴霧型点鼻薬でよい。経鼻送達システムは:1)エアロゾル化計量ポンプ、2)手動計量ポンプ及び3)圧力型噴霧型計量瓶を含んでよい。これらは、対象の血流中へ試験化合物の迅速な吸収を提供するのに有効である。
【0063】
エアロゾルは適切な機械装置を使用して吹き込んでよい。一部の実施態様において、この器具は、噴霧の形式で薬剤量を放出するように適合させた装置であるリザーバと噴霧器を具えている。複数回投与する試験化合物又はプラセボはリザーバに含まれており、選択的に溶液又は懸濁体又は固体粒子剤型、若しくは固形粒子混合物などでよい。
【0064】
一部の実施態様において、器具は計量ポンプを具えるポンプ噴霧器である。一部の実施態様において、器具は圧力噴霧器であり、この噴霧器は、計量バルブと推定上の医薬組成物を具え、更に、薬剤的に許容可能な噴射剤から成る圧力型噴霧装置を具えている。本明細書に開示する例示的な噴射剤は、1,1,1,2−テトラフルオロエタン及び1,1,1,2,3,3,3−ヘプタフルオロプロパンなどのハイドロフルオロカーボン類だけでなくジクロロジフロロメタンなどのクロロフルオロカーボン類の1つまたは混合物である。適切な圧力型スプレー装置は、当該技術分野において周知で慣用なものである。
【0065】
一部の実施態様において、粉末は経鼻吸入器を使用して投与できる。一部の実施態様において、粉末は吸入器に装填するカプセル中に収容されている。カプセルは針によって穴をあけることでカプセルの上と下に開口部を作る。次いで空気又は他の薬剤上許容可能な噴射剤が針を通して粉末粒子を放出する。一部の実施態様において、薬剤上許容可能な噴射剤は、例えば塩化エチル、ブタン、プロパン、ジクロロジフロロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、及びトリクロロモノフルオロメタンを含む。
【0066】
一部の試験化合物は、非常に水に溶けにくい化合物であり、ある量の水性溶媒に推定上の治療効果量を溶解できなないためエアロゾル又は非エアロゾルによる経鼻注入に影響を与える。経鼻投与に適した注入量は評価する化合物の性質によって様々である。一部の実施態様において、経鼻投与に適した注入量は、鼻腔につき約25μl乃至約250μlの幅でよく、好ましくは鼻腔につき約50μl乃至約150μlであり、特に鼻腔につき約50μl乃至約100μlである。固体又は液体粒子は微細ポンプ、エアロゾル化注入ガス気流等の作動により気流中に浮遊する。
【0067】
試験化合物
試験化合物は、個体における治療効果を評価する化合物を含んでよい。本明細書で記載するように、「試験化合物」とは疾病の診断、治療、緩和、処置又は予防、若しくは身体の構造又は機能に影響を与える物質を含み、慣用的及び最大限広範な意味として使用する。試験化合物の例は、抗生物質、抗アレルギー薬、抗がん剤、抗真菌剤、抗悪性腫瘍薬、鎮痛薬、気管支拡張薬、抗ヒスタミン薬、抗ウイルス薬、鎮咳薬、アンギナール製剤、抗炎症薬、免疫調節薬、5−リポキシゲナーゼ阻害薬、ロイコトリエン拮抗薬、ホスホリパーゼA阻害剤、ホスホジエステラーゼIV阻害剤、ペプチド類、タンパク質、ステロイド及びワクチン製剤として有用である化合物を含めることができる。
【0068】
好ましくは、試験化合物は口腔及び/又は鼻腔吸入に適している。一部の実施態様において、試験化合物はエアロゾル投与に適した組成物中に存在している。本明細書で開示する添加剤の実施例は、共溶媒(例:エタノール、水)、界面活性剤(例:オレイン酸、ソルビタンエステル類、ポリオキシエチレン類、グリコール類、オリゴ乳酸類)及び当該技術分野で周知な添加剤を含める。
【0069】
リボフラビン5’−リン酸の治療的な使用
一部の実施態様は、エアロゾル化リボフラビン5’−リン酸の使用を含んでいる。このような一部の実施態様において、リボフラビン5’−リン酸は本明細書記載の任意の方法によって、リボフラビン5’−リン酸を必要とする対象に投与できる。例えば、一部の実施態様において、リボフラビン5’−リン酸溶液はエアロゾル化溶液として対象に投与することができる。このような方法によりリボフラビンの迅速な送達と吸収が可能になる。対象は例えば人間などの哺乳類を含む。用量は経験的に決定できる。リボフラビン5’−リン酸は様々な適応症の治療に使用できる。
【0070】
一部のこのような実施態様において、リボフラビン5’−リン酸はβ遮断薬と併用して片頭痛の治療又は緩和に使用できる。頻発性偏頭痛の病歴がある54人の男女を無作為化プラセボ対照試験によって3ヶ月にわたり400mg/日のリボフラビンを投与して偏頭痛の予防効果を調べた(Schoenen J,et al.Effectiveness of high−dose riboflavin in migraine prophylaxis.A randomized controlled trial. Neurology.1998;50(2):466−470)。リボフラビンは、プラセボよりも有意に良好であった。有益な効果の殆どは第3月目に報告されているが、リボフラビンはプラセボよりも発作の頻度と頭痛日数を著しく減少させることができる。同じ研究者による最近の研究では、β遮断薬と呼ばれる薬剤又は高用量のリボフラビンは臨床改善がみられたが、β遮断薬は皮質情報処理に働き、リボフラビンは脳ミトコンドリアエネルギーの貯蓄を低下させるため、各治療薬は異なる病理的メカニズムに作用していると推定される(Sandor PS,et al.Prophylactic treatment of migraine with beta−blockers and riboflavin:differential effects on the intensity dependence of auditory evoked cortical potentials.Headache.2000;40(l):30−35)。23人の患者の小規模試験において、毎日400mgのリボフラビンを3月にわたって投与したところ偏頭痛発作の頻度の低下が報告された。(Boehnke C,et al.High−dose riboflavin treatment is efficacious in migraine prophylaxis:an open study in a tertiary care centre.Eur J Neurol.2004;11(7):475−477)。
【0071】
一部の実施態様において、リボフラビン5’−リン酸は新生児黄疸の治療に使用できる。例えば、リボフラビン5’−リン酸は新生児黄疸の光線治療の一部として使用できる。幼児に放射する光の使用によって黄疸により生ずる毒素であるビリルビンだけでなく、幼児の血中に自然に存在するリボフラビンも分解するため追加的な補給が必要である。
【0072】
一部の実施態様において、リボフラビン5’−リン酸はリボフラビン欠乏の治療に使用することができる。例えば、リボフラビン5’−リン酸はリボフラビン欠乏(例:リボフラビン欠乏症)の患者に有益である。例えばリボフラビン欠乏症は、虚弱、咽喉腫脹/痛、舌炎(例:舌腫脹)、口角びらん症/炎、(口角の皮膚のひび割れ、又は痛み)、皮膚炎(かぶれ)、又は貧血を生ずる。特定の群は高齢、これらに伴う慢性疾患、貧困、及びこれらに伴うアルコール依存症を含むリボフラビン欠乏に影響を受けやすい。
【0073】
一部の実施態様において、リボフラビン5’−リン酸は鉄欠乏貧血と鎌状赤血球貧血の治療に使用することができる。鉄欠乏貧血と鎌状赤血球貧血において、リボフラビンのレベルは低くなりうる。リボフラビン欠乏と鉄欠乏である個体においてリボフラビン欠乏の修正は鉄治療への応答を改善できる。
【0074】
一部の実施態様において、リボフラビン5’−リン酸は認知機能の促進に使用できる。一部の実施態様において、リボフラビン5’−リン酸は認識機能の促進に使用できる。リボフラビンを伴う適切な栄養補給は認知機能の維持に必要である。三環系抗鬱薬を処方している患者において、リボフラビンを含むビタミンB群の治療は、鬱と認知機能のスコアを改善することが報告されている。これは三環系抗鬱薬によって生じるリボフラビン量の枯渇に関連している。
【0075】
一部の実施態様において、リボフラビン5’−リン酸は鬱の治療に使用できる。リボフラビンを伴う適切な栄養補給は、認知機能の維持に必要である。三環系抗鬱薬を処方している患者において、リボフラビンを含むビタミンB群の治療は、鬱のスコアを改善することが報告されている。これは三環系抗鬱薬によって生じるリボフラビン量の枯渇に関連している。
【0076】
一部の実施態様において、リボフラビン5’−リン酸は子癇前症の治療に使用できる。子癇前症は妊娠期間中の血圧の上昇、尿中のたんぱく質、及び浮腫(実質的な膨張)として定義できる。子癇前症を伴う女性の約5%が子癇に発展し、妊産婦死亡の大きな原因に進行する可能性がある。子癇は発作に加えて高血圧と出血(大量出血)の高いリスクにより特徴づけられる(Crombleholme WR.Obstetrics.In:Tierney LM,McPhee SJ,Papadakis MA,eds.Current Medical Treatment and Diagnosis.37th ed.Stamford:Appleton and Lange;1998:731−734)。154人の妊婦による子癇前症のリスク増加に関する研究では、リボフラビン欠乏の妊婦は、リボフラビンが充分な栄養状態の者に対して、子癇前症に発展する可能性が4.7倍高いことが発見された。細胞内のフラボコエンザイムレベルの減少はミトコンドリアの機能不全を引き起こし、酸化的ストレスの増加及び酸化窒素の放出を妨げ、それによって血管拡張を妨害する。全てのこれらの変化は子癇前症に関連している(Wacker J,et al.Riboflavin deficiency and preeclampsia.Obstet Gynecol.2000;96(l):38−44)。
【0077】
実施例
後述する実施例は、本発明の様々な態様の実施についてのベストモードの記載を意図するだけでなく、上記の発明の使用様式をより完全に記述する役割を果たしている。これらの実施例はいかなる方法においても本発明の真の範囲を制限するためではなく、むしろ例証目的のために存在していると解釈すべきである。これらの全体を参照することにより本明細書に組み込まれている。
【0078】
実施例1−リボフラビン5’−リン酸:SDラットにおける28日間のエアロゾル化液体吸入毒性試験
本試験の目的は、試験物であるリボフラビン5’−リン酸を28日間連続してラットに吸入(鼻のみ)投与して毒性と毒物動態プロファイルを測定することである。表1は各群の呼吸送達用量を示している。

【0079】
試験物:リボフラビン5’−リン酸ナトリウム塩水和物;代替名称:ビタミンBリン酸塩;性状:黄結晶:力価;74%。賦形剤:生理食塩水(0.9%(w/v)注射用食塩水);性状:無色透明溶液。試験システム:ラット(ドブネズミ);系統:スプラグダウリー系統:CD(SD)。
【0080】
試験物と対照物組成の調整
各群の試験(0.5mg/mL、2.0mg/mL、5.0mg/mL)及び/又は、賦形剤対照組成物を毎日新たに生理食塩水に溶解し調整した。調整した全ての試験組成物は遮光し、室温(RT)で保存した。
【0081】
処置
暴露システムへの順応
動物を暴露大気に供する前に全動物を(対照を含む)3日にわたる拘束処理に順応させた。動物は暴露の間最長1時間にわたって使用する投与チューブの拘束に徐々に慣れていった。
【0082】
エアロゾル生成の特質及び理論的用量レベル
処置:鼻腔からのみの暴露を60分間、連日吸入させた。処理期間:28日。予測エアロゾル濃度と用量レベルを表2に示している。

達成用量の推定
=(E×RMV×T)/BW
=達成用量レベル(mg/kg/日)
=動物へ送達された有効濃度(mg/L空気)
RMV=毎分呼吸量(L/分)、下記に詳細に記載するBide、Armour及びYe e2000の理論に基づいて計算している。
RMV(L )=0.499×体重(kg)809
T=時間、すなわち、暴露時間(分)
BW=暴露期間中の平均体重(kg)
【0083】
この達成用量の推定は、呼吸器内に100%沈着すると仮定している。(Bide R.W.,et al.Allometric Respiration/Body Mass Data for Animals to be Used for Estimates of Inhalation Toxicity to Young Adult Humans.J.App.Toxicol.,2000 Vol.20,全体を参照することによって本明細書に組み込まれている。)
【0084】
吸入暴露システム
エアロゾルは、高速度空気流(各噴霧器へ10L/分)に連結した3つの医療用噴霧器(側流)で試験物又は対照物を計量して生成した。生成したエアロゾルは直径40mmのチューブを通して貫流吸入暴露システムに充填した。エアロゾル発生の間、暴露システムを通過する空気流量をモニターし、手動で記録した。暴露システムへの空気流量はエアロゾル生成器から供給する空気の絶対量を広域流量計を使用して制御した。
【0085】
動物暴露システムからのエアロゾル排気流の調整は排気バルブを使用して達成し、暴露システムにおける空気流の総バランスは圧力計を使用してモニターした。このシステムは最小1.0L/分の空気を各動物の暴露ポートに供給し、動物の暴露サイトにおいて確実に若干の陽圧になるように調整した。これにより生成エアロゾルは確実に希釈されない。システムに取り付けて各個体に同一の暴露位置で分配するネットワークを使用して企図した各暴露位置へエアロゾルの等量送達を達成した。
【0086】
エアロゾル濃度の分布、粒子サイズ分布、酸素濃度、相対湿度及び温度の決定は、暴露システムの代表的なポートから流速1L/分の試験空気サンプルを採取して行った。サンプルの流量は、使用する前に第一空気流キャリブレータを使用して調整した広域流量メータを用いて厳密に制御した。各エアロゾル濃度試料の絶対量は、湿式ガスメータを用いて測定した。
【0087】
エアロゾル濃度の決定
ラットに投与する前に暴露システムの群2乃至群4の上層、中層、底層の複数のエアロゾルサンプルを収集して、暴露システム内の大気の均質性を試験した。各層間の変動係数が20%よりも下であることを確認した。治療期間は、連日、エアロゾル生成のたびに対照群を含む全ての群から複数のエアロゾル濃度のサンプルをフィルター上に採取した。採取したフィルターは、ITR分析化学研究所に移し、有効な分析法(ITR StudyNo.40241)を使用してリボフラビン5’−リン酸濃度の化学測定をした。
【0088】
粒子サイズ分布の測定
治療期間中は毎週、群2乃至4の生成エアロゾルの粒子サイズ分布を7−段階マーサーカスケードインパクター(7−Stage Mercer Cascade Impactor)でサンプルを採取し、得られたサンプル物質をITR Laboratories Canada社の分析化学研究所に移し、有効な分析法を使用してエアロゾル化リボフラビン5’−リン酸の粒子径を化学的に測定した(ITR Study No.40241)。群1の生成エアロゾルの粒子サイズ分布は、毎週重量分析によって測定した。空気動力学的中央粒子径(MMAD)と幾何標準偏差(GSD)はインパクタ(衝突式採集器)から得られた結果に基づきログプロビット変換を使用して算出した。
【0089】
死亡率、臨床症状、体重、食事消費量、眼科学、機能性観察バッテリー(FOB法)及び臨床化学、血液学、血液凝固及び検尿の調査を行った。試験の初日と最終日に、試験設計した動物から採取した血液サンプルから血漿を調整しリボフラビン5’−リン酸の含有量と毒物動態評価の分析を行った。全ての、毒性試験(主研究)用の動物は、処理期間の28日が完了した後に安楽死させ、特定の臓器を採取し、計量し、顕微鏡で評価した。毒物動態用の動物は血液サンプリング完了の後に安楽死させ、剖検検査又は組織採取は行わなかった。下記の表は血液試験(表3)、血液凝集試験(表4)、臨床化学試験(表5)、及び尿検査(表6)において使用した試験、方法及び略記を要約している。









【0090】
結果
投与組成物の分析
分析により、全ての組成物が承認基準範囲内(±10%)にあることが決定した。この組成物濃度の調製濃度は94.4乃至106.4%の濃度であるため許容できると考えられる。正式な組成物は安定条件又は4℃で利用可能であったが、分析の少なくとも48時間前から冷蔵保存した組成物、又は調整した日に室温保存した組成物の結果から、全ての組成物の濃度は安定であったことが示された。
【0091】
試験大気濃度と推定達成用量レベル
表7は達成試験大気濃度を示している。

【0092】
群2乃至4の達成エアロゾル濃度の全てが標的リボフラビン5’−リン酸濃度の10%範囲内である。7.3乃至9.0%の変動係数を有するリボフラビン5’−リン酸群の生成大気は安定であった。

【0093】
群2乃至群4の上層、中層、下層の大気から得られたエアロゾルは均質であると考えられた。

【0094】
全ての群の全推定達成用量は許容可能であり、予測用量レベルに対して3.3%以内であった。毒物動態(TK)評価には、各TK日における平均体重と達成リボフラビン5’−リン酸エアロゾル濃度を使用して達成用量レベルを算出した。表10はリボフラビン5’−リン酸の達成用量レベルを示している。

【0095】
表11は、リボフラビン5’−リン酸の達成用量レベルを示している。

【0096】
粒子サイズ分布
リボフラビン5’−リン酸の粒子サイズ分布の測定が表12に要約されている。

【0097】
粒子サイズ分布の計測により、リボフラビン5’−リン酸のエアロゾル化組成物はラットに呼吸可能であり、呼吸器に100%沈着するとことが確認された。対応する質量測定した対照エアロゾルは呼吸可能であると考えられ、リボフラビン5’−リン酸処理群との比較は可能である。
【0098】
毒物動態学
リボフラビン5’−リン酸に単一又は反復暴露後、ごく一部の動物からしかリボフラビン5’−リン酸濃度は検出されず、計測濃度は一般的に定量限界より僅か上にある程度で、毒物動態パラメータは算出できない。
【0099】
第1日目
対照群の1日目(群1)において、計測可能な濃度のリボフラビン5’−リン酸又は代謝物質(リボフラビン)はなかった。また、1日目のリボフラビン5’−リン酸の低用量群において、24時間目に0.829μg/mLのリボフラビン濃度を有する1匹の雌ラットが記録された以外は計測可能な濃度のリボフラビン5’−リン酸又はリボフラビンはされなかった。中用量及び高用量群においては雌雄ともに、リボフラビンの血漿濃度の若干の増加が観察された。Cmax値については雄では中用量及び高用量において、それぞれ0.0782μg/mLと0.146μg/mLであり、雌では0.0491μg/mLと0.124μg/mLであった。関連するAUC()値については、雄ではそれぞれ0.0159μg.時/mLと0.104μg.時/mL、及び雌では0.0096μg.時/mLと0.0842μg.時/mLであった。1日目の濃度値は雌よりも雄が若干高かった。雄と雌のCmax比とAUC()比は中用量では1.59と1.18であり、高用量では1.65と1.24であった。
【0100】
第28日目
対照群1(群1)の28日目において、計測可能な濃度のリボフラビン5’−リン酸又は代謝物質(リボフラビン)はなかった。また、低用量グループにおいて計測可能な濃度のリボフラビン5’−リン酸又はリボフラビンは検出されなかった。Cmaxの値については、雄の中用量及び高用量群では、それぞれ0.266μg/mLと0.117μg/mLであり、雌では0.0735μg/mLと0.145μg/mLであった。AUC()値については、雄の高用量では0.117μg.時/mLであり、雌の中用量と高用量ではそれぞれ0.0121μg.時/mLと0.0566μg.時/mLであった。全体的にリボフラビンの血漿濃度(CmaxとAUC())は、リボフラビン5’−リン酸の投与用量に応じて雌雄ともに増加しなかった。同様に、雌雄共に28日間の連日投与の後にリボフラビンの蓄積は確認されなかった。28日目対1日目のCmax比とAUC()比は雄の高用量において、それぞれ0.801と0.433であった。雌の28日目対1日目のCmax比とAUC()比は中用量及び高用量において、それぞれ1.50と1.17、及び1.25と0.672であった。
【0101】
図1は、28日間のエアロゾル化リボフラビン5’−リン酸後の雄又は雌における平均リボフラビン血漿濃度−時間プロファイルのグラフを示している。図2Aは、28日間のエアロゾル化リボフラビン5’−リン酸投与後の雄ラットにおける平均リボフラビンCmaxとAUC()のグラフを示している。図2Bは、28日間のエアロゾル化リボフラビン5’−リン酸投与後の雌ラットにおける平均リボフラビンCmaxとAUC()のグラフを示している。表13は、28日間のエアロゾル化リボフラビン5’−リン酸投与後のリボフラビンの毒物動態パラメータを要約している。

【0102】
機能性観察バッテリー(FOB法)
本試験期間の処置に関連すると考えられる機能性観察バッテリーのパラメータ変化は記録されなかった。一部のパラメータにおいて、対照群との間に統計的な有意差(p≦0.05)が記録された。しかし、賦形剤対照群との差は雌雄間の間で一貫しておらず、用量レベルに関連していないことが示され、これらは偶発的であり処置に関連していないと考えられた。
【0103】
血液学パラメータ
全ての動物において試験期間の処置に関連すると考えられるいかなる血液学パラメータの変化は記録されなかった。一部のパラメータにおいて対照群との間に統計的に有意な差(p≦0.05)がいくつか記録された。しかし、賦形剤対照群との間の変化は雌雄間で一貫しておらず、用量レベルに関連していないことを示しており、これらは偶発的であり、処置に関連していないと考えられる。
【0104】
凝固
凝固時間は治療によって影響を受けない。
【0105】
臨床化学
全ての動物において試験期間の処置に関連すると考えられるいかなる臨床化学パラメータの変化は記録されなかった。いくつかのパラメーターに関して対照群との間に統計的な有意差(p≦0.05)が記録された。しかし、賦形剤対照群との間の変化は雌雄間で一貫しておらず、用量レベルに関連していないことを示しており、これらは偶発的であり、処置に関連していないと考えられる。
【0106】
検尿
処置による影響を受けると考えられる全検尿パラメータの評価に変化はなかった。
【0107】
臓器重量
全ての動物において、試験期間の処置に関連すると考えられるいかなる臓器重量(絶対又は体重に対する相対)の変化は記録されなかった。群2と群3の雄の動物で心臓(相対)と前立腺(絶対と相対)で対照群との間の統計的な有意差(p≦0.05)が記録された。さらに、いくつかの他の臓器についても統計的な有意差(p≦0.05)が記録された。しかし、賦形剤対照群との間の変化は雌雄間で一貫しておらず、用量レベルに関連していないことを示しており、これらは偶発的であり、処置に関連していないと考えられる。
【0108】
肉眼的所見
試験物の投与に起因する所見はなく、死検の観察による全所見は偶発的原因であり、生物学的重要性がないと考えられる。
【0109】
顕微鏡所見
試験物に関連すると考えられる顕微鏡所見はなかった。全ての変化は、死によるものであり、用量に関連しておらず、発生率又は重症度が低く、対照と処置動物で発生しており、又は試験ラットの齢と系統に付随的であるため、毒性学的に重要ではないと考えられた。
【0110】
考察
本試験の第一の目的は、試験物であるリボフラビン5’−リン酸のラットへの28日間の連日吸入投与(鼻のみ)後に、毒性と毒物動態プロファイルの測定をすることである。リボフラビン5’−リン酸は、機能的観察バッテリーの評価と臨床病理学的パラメータ又は下記の全主要臓器の組織病理学的試験調査により忍容性が高く、有害な臨床観察がないことが発見された。脾臓、胸腺、リンパ節、リンパ組織、下顎リンパ節及び腸間膜リンパ節を含むリンパ組織と鼻腔、気道組織、上咽頭、喉頭気、気管支リンパ節、気管分岐部、気管、肺及び気管支を含む気道組織を組織学的に評価し、局所又は全身毒性の兆候はなかった。
【0111】
0.244mg/kg/日を投与した一匹の雄ラットの死亡が12日目に確認された。死亡は、一匹の低用量ラットに限定されているため試験物によるものではなく、死因は偶然であり、拘束方法に関連していると考えられる。処置動物において測定可能な血漿濃度のリボフラビン5’−リン酸不足のため、動態は算定していない。雌雄ともに血漿中の代謝物(リボフラビン)濃度は測定可能であり、暴露量(CmaxとAUC())は用量に比例しているように見える。リボフラビン5’−リン酸の28日間の反復投与後にリボフラビン暴露において性差はなく、リボフラビン5’−リン酸の28日間の反復投与後に蓄積はなかった。
【0112】
結果的に、試験物のリボフラビン5’−リン酸を毎日一回の28日の連続吸入投与の後、SDラットにおける無毒性量(NOEL)は高用量グループの2.479mg/kg/日であると考えられた。実施例2−リボフラビン5’−リン酸:ビーグルにおける28日エアロゾル化吸入毒性試験。
【0113】
試験設計
本試験の目的は、試験物のリボフラビン5’−リン酸を28日間連日で犬に吸入(口鼻)投与した後に毒性と毒性動態プロファイルを測定することである。

【0114】
試験物:リボフラビン5’−リン酸ナトリウム塩水和物;代替名称:ビタミンBリン酸塩;性状:黄結晶:力価;74%。賦形剤:生理食塩水(0.9%(w/v)注射用食塩水);性状:無色透明溶液。暴露方法:口腔鼻フェイスマスクによる吸入。
【0115】
各群の試験(0.5mg/mL、2.0mg/mL、5.0mg/mL)及び/又は賦形剤対照組成物(0mg/mL)を毎日新たに生理食塩水に溶解し調整した。調整した全ての試験組成物は遮光し、室温(RT)で保存した。
【0116】
処置
処置の期間:28日:試験システム:犬(ケイネス・ファミリアリス);系統:ビーグル

予測エアロゾル濃度と用量レベルは表15に要約している。
【0117】
達成用量レベルの推定
暴露期間の達成用量レベルは実施例1に記載の方法を使用して推定した。
【0118】
吸入システム
エアロゾルは3つの噴霧器で臨床試験物と対象物組成物の流量を計量して生成した。生成したエアロゾルは40mmのチューブを通して貫流吸入暴露システムに充填した。暴露システムを通過する空気流量は、エアロゾル生成の間、モニターし、手動で記録した。暴露システムへの空気流量はエアロゾル生成器から供給する空気の絶対量を広域流量計を使用して制御した。動物暴露システムからのエアロゾル排気流の調整は排気バルブを使用することで達成した。このシステムは最小6L/分のエアロゾルを各動物の暴露ポートに供給し、周囲からの空気の流入によって動物の暴露サイトの生成エアロゾルが確実に希釈されないように若干の陽圧になるように調整した。流量の多少のばらつきはバルーンリザーバによってバッファした。システムに取り付けて各個体に同一の暴露位置に分配するネットワークを使用して企図した暴露位置へエアロゾルの等量送達を達成した。
【0119】
吸入システムのモニタリング
エアロゾル濃度の分布、粒子サイズ分布、酸素濃度、相対湿度と温度の決定は、暴露システムの代表的なポートから流速1L/分の試験空気サンプルを採取して行った。サンプルの流量は、使用する前に第一空気流キャリブレータを使用し調整した広域流量メータを用いて厳密に調整した。
【0120】
エアロゾル濃度の決定
治療期間は連日、エアロゾル生成のたびに対照群を含む全ての群から複数のエアロゾル濃度のサンプルをフィルター上に収集した。
【0121】
粒子サイズ分布と空気動力学的中央粒子径
処置期間中は毎週、群2乃至4の生成エアロゾルの粒子サイズ分布は、7−段階マーサーカスケードインパクター(7−Stage Mercer Cascade Impactor)でサンプルを採取し、有効な分析法を使用してエアロゾル化したリボフラビン5’−リン酸の粒子サイズを測定した。群1の生成エアロゾルの粒子サイズ分布は、重量分析によって毎週、算定した。MMADと幾何標準偏差(GSD)はインパクタ(衝突式採集器)から得られた結果に基づきログプロビット変換を使用して計算した。
【0122】
生存中の観察
処置期間直前の前処置期間の1週間のみのデータを収集した。
【0123】
死亡率
死亡率の確認は順応と前処置期間に1日1回、そして試験の処置期間に1日2回(午前と午後)行った。
【0124】
臨床所見
ケージ越しでの臨床的兆候(健康障害、行動変化等)は順応期間に1日1回、処置期間は詳細な臨床試験日を除き、1日2回(暴露前と暴露後)記録した。各犬の詳細な臨床診察は前処置に少なくとも1回、第1日目の1日前、処置期間に週1回及び死検の前に(ケージ内での臨床的兆候観察に代えて朝に)行った。
【0125】
体重
群割り付けの前に少なくとも1回、処置開始の約1週間前に全動物の体重を記録した。全動物の体重は第1日目の1日前と処置期間に週1回、及び最後に記録した。
【0126】
食料消費
全動物の各食餌量は前処置の最後の1週間と処置期間を通して記録した。
【0127】
検眼
全動物の眼底検査(間接検)と生体顕微鏡(細隙灯)検査は前処置期間に1回と処置期間の第4週目に行った。
【0128】
心電図記録法(ECG)と血圧
全犬の心電図(四肢誘導I、II及びIIIとVR、VL、及びVFによる増高誘導)を前処置に1回と、処置期間の第1日目と第4週目の処置後、少なくとも90分間(90乃至120分)に得た。更に、非観血的血圧はTail−cuff方式を使用してECGと同じ機会に計測した。透写図により心臓電気活動障害の全体的な変化の指標を調べ、心拍(誘導II)、静脈洞及び房室調律又は伝導性を含む潜在的異常の存在を測定した。心拍、PR間隔、QRS時間、QT及びQTc間隔値を表にして試験記録に組み込んだ。ECGの記録中は各動物を拘束するつり鎖を使用した。ECGは獣医循環器の獣医が評価した。
【0129】
循環器パラメータ測定
全動物の循環器パラメータ(1回換気量、呼吸数及び分時拍出量)を前処置の間に1回少なくとも15分間と処置期間の第4週目の期間に暴露の終了から90分(平均15分のインターバルで記録した)までに得た。一部の動物では、ハードウェア調整の間に生じた動物の発声/動物の過剰な行動のため、データの獲得はターゲットである暴露終了から15分の代わりに、暴露終了後の35分以内に開始している。呼吸器計測期間のこのような騒動は一般的で、不可避であり、試験設計の完成度、又は総合的なデータ解釈の逸脱に影響はない。このデータはNOTOCORD社/LifeShirt Wireless systemを使用して得た。データ収集の前に、これらの犬をLifeShirtと保護ジャケットに最大90分間を3日間徐々に順応させた。
【0130】
毒物動態
9つの一連の血液サンプル(各約2.0mL)を各犬の処置期間のそれぞれ第1日目と第28日目に取り除いた。この目的のために、各犬を静脈穿刺により採血し、ヘパリンナトリウム、抗凝血剤を含むチューブに収集した。試験管に採取した後、即座に濡れた氷の上に30分以内放置した。どの試験でも、サンプルは、投与前、暴露直後(IPD)、暴露後15分及び30分、1、2、4、6及び24時間に収集した。収集の後、サンプルを遠心分離(約4℃)し、生じた血漿を採取し、輸送中(ドライアイス上で)の光から保護するラベル付きのチューブ入れITR(約−20℃)で凍結保存した。
【0131】
臨床病理
血液/尿サンプリング
室内試験(血液、凝固、臨床化学及び検尿)は全動物の処置の開始前と処置の終了時(第29日目)に行った。血液サンプルは、少なくとも12時間から成る一晩の摂食制限期間後に静脈せん刺によって採取した。尿は一晩(少なくとも16時間、20時間未満)の摂食及び摂水制限した動物から採取した。
【0132】
血液学パラメータ
EDTA抗凝固剤中にサンプル(名目上1mL)を含む試験管に採取し、下記のパラメータについて計測した。

赤血球細胞算定 血小板算定
平均赤血球ヘモグロビン量(算定) WBC分析(絶対数)
ヘマトクリット(算定) 網状赤血球(絶対数とパーセンテージ)
平均赤血球容積 平均赤血球ヘモグロビン量
ヘモグロビン濃度(算定) ハインツ小体細胞の形態(血液塗抹染色標本)
白血球細胞計数
*血液塗抹染色標本スライドは、その後の評価に必要ではなく、将来的に可能な分析のために保持した。
【0133】
凝固
血液サンプル(名目上1.3mL)をクエン酸塩抗凝血剤を含む試験管に採取し、下記のパラメータについて計測した。
活性化部分トロンボプラスチン時間
プロトロンビン時間
【0134】
臨床化学
以下のパラメーターは、凝固活性剤を含む血液サンプル(名目上1.1mL)試験管についての測定である。
A/G比(算定) アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ グロブリン(算定) カリウム
アラニンアミノトランスフェラーゼ ビリルビン(総合、直接、間接)
ブドウ糖 ナトリウム
アルブミン カルシウム
乳酸脱水素酵素 総タンパク質
アルカリ性ホスファターゼ 塩化物
マグネシウム トリグリセリド
アミラーゼ コレステロール(総合)
リン(無機) 尿素
クレアチニン
【0135】
検尿
尿サンプルで下記のパラメータを測定した。
ビリルビン グルコース
タンパク質 ウロビリノーゲン
血液 ケトン
沈渣鏡検 体積
色及び外観 pH
比重
【0136】
データ評価と統計
研究の実施の間に得られた数値データを群平均と標準偏差の算定に供し、全個体の数値を非数値の結果と共に記録した。分散の同質性にはLeveneMedian検定を、標準化にはコルモゴルフ・スミルノフ検定を使用してデータ(ECGを除く)を解析した。同種のデータは、分散分析を使用して解析し、グループ間の有意差はダネット検定を使用して解析した。
異種データはクラスカル−ワリス検定を使用して解析し、対照群と処理群のグループ間の有意差はダン検定を使用して評価した。p≦0.05の有意水準で報告した。対照 との比較、すなわち群1と群2乃至4を比較する統計解析を行った。数値データをグループ平均と標準偏差の算定に供した。
【0137】
結果
用量組成の解析
解析によって全組成物が許容基準範囲内(±10%)であることが決定した。調整濃度の薬剤濃度範囲は94.9乃至104.5%であるため許容可能と考えられる。正式な組成物安定条件又は4℃での使用は可能でなかったが、分析の少なくとも48時間前から冷蔵保存した組成物、又は調整した日に室温保存した組成物の結果から、全ての組成物の濃度は安定であったことが示された。

表16は試験大気濃度と推定薬剤レベルを要約している。
【0138】
群2乃至群4の全ての達成エアロゾル濃度はターゲットのリボフラビン5’−リン酸濃度に対して6.7%内であった。全リボフラビン5’−リン酸群の生成空気は8.1%乃至10.7%の変動係数であり、28日間通して安定であった。表17は主研究の動物における全ての推定達成用量レベルを示している。

【0139】
全リボフラビン5’−リン酸処理群の全ての推定達成用量は許容可能であり、予測用量レベルの11.7%内であった。各毒物動態日の毒物動態評価、平均体重、及び達成リボフラビン5’−リン酸エアロゾル濃度を達成用量レベルの算定に使用した。表18は、第1日目の達成リボフラビン5’−リン酸濃度を要約している。

【0140】
表19は、第28日目の達成リボフラビン5’−リン酸用量を要約している。

【0141】
粒子サイズ分析
表20では、粒子サイズ分布の測定を要約している。

【0142】
粒径分布測定によりエアロゾル化組成物を犬が吸入できることを確認した。呼吸器への沈着は100%であると考えられる。
【0143】
相対湿度、温度、及び酸素濃度
試験期間の暴露大気の酸素濃度、温度、及び相対湿度を表21に要約している。

【0144】
暴露大気酸素濃度、温度及び相対湿度の幅は許容可能であると考えられる。
【0145】
生前観察
死亡率
本試験の経過で早期の死亡はなかった。
【0146】
医学的兆候
処置期間にリボフラビン5’−リン酸に関連する医学的兆候は見られなかった。暴露期間、発声、呼吸数の増加、活動及び唾液の増加は治療群と対照群で記録された。これらの医学的兆候は過渡期間であり、吸入暴露の拘束に関連したストレスの結果として一般的に観察される。したがって、これらの医学的所見は試験物に関連していると考えられない。臨床観察は、偶発的であり処置に関連していない。
【0147】
体重
リボフラビン5’−リン酸の処置に関連すると考えられる体重変化はなかった。
【0148】
食料消費
処置に関連すると考えられる食料消費の変化は記録されなかった。賦形剤の間に統計的な有意差(p≦0.05)は多くの日で記録された。しかし、賦形剤対照群との差は雌雄間で一貫しておらず、用量レベルに関連していないことを示しており、これらは偶発的であり、処置に関連していないと考えられる。
【0149】
眼科医学
治療に関連する眼球の変化は記録されなかった。持続性乳頭状の膜、絨毯組織の染色変化、核内の点状不透体及び隆起後眼会合線(prominent posterior suture lines)等の所見が片方又は両方の眼について処置の終了時にあった。しかし、これらの所見は前処置の眼科評価に観察され、偶発的であり犬群集では通常であると考えられ、リボフラビン5’−リン酸の処置に関連はしていない。
【0150】
心電図検査
リボフラビン5’−リン酸の処置で心電図波形は、影響を受けなかった。このパラメータから得られたデータは、対照群又は試験物(リボフラビン5’−リン酸)のいずれの処置に関連する効果も支持していない。リボフラビン5’−リン酸の処置に関連すると考えられる血圧の変化はなかった。
【0151】
呼吸器パラメータ測定
リボフラビン5’−リン酸の処置によって影響すると考えられた呼吸器パラメータの評価(呼吸数、一回換気量、及び分時換気量)に変化はなかった。2処理群での呼吸数において賦形剤対照群との間に統計的に有意な差(p≦0.05)が記録された。しかし、統計的に有意な変化は生物学的に重要ではないと考えられ、想定範囲内であった。
【0152】
毒物動態
リボフラビン5’−リン酸の一回又は複数回の反復暴露の後、処置動物(群2)の一匹からのみリボフラビン5’−リン酸の濃度が検出された。リボフラビン5’−リン酸は他の処理動物で検出されていないため動態は算出できなかった。
【0153】
第1日目
第1日目の対照群(群1)において、計測可能な濃度のリボフラビン5’−リン酸はなく、その代謝物質(リボフラビン)については検出限界の僅か上にある6つのみが計測可能な濃度であった。リボフラビンのTmax中央値が0.125時間を示した群2の雄を除き、全ての群で0時間(すなわち投与時点直後にCmaxに到達した)であった。リボフラビンの平均Cmax値は、雄では低、中、高用量で、それぞれ0.0588μg/mL、0.205μg/mL及び0.358μg/mLであり、雌では0.0566μg/mL、0.161μg/mL及び0.391μg/mLであった。関連するAUC()値は、雄ではそれぞれ0.0344μg・時/mL、0.295μg・時/mL及び0.588μg・時/mLであり、雌では、0.151μg・時/mL、0.430μg・時/mL及び0.625μg・時/mLであった。第1日目の血漿のリボフラビンの暴露量(CmaxとAUC())は、雌雄共にリボフラビン5’−リン酸の投与用量に相関しており、リボフラビン5’−リン酸の一回投与を受けたリボフラビン血漿の暴露量(CmaxとAUC())については性に関連する明らかな違いはなかった。
【0154】
第28日目
第28日目の対照群において、検出限界の僅か上に3つの測定可能な濃度のリボフラビン5’−リン酸と、8つの測定可能な濃度のその代謝物(リボフラビン)があった。第28日目のリボフラビンのCmax値は雄では低、中、高用量でそれぞれ0.0623μg/mL、0.140μg/mL及び0.382μg/mLであり、雌では0.0498μg/mL、0.147μg/mL及び0.289μg/mLであった。関連するAUC()値は雄では、それぞれ0.0582μg・時/mL、0.243μg・時/mL及び0.554μg・時/mLであり、雌では0.0846μg・時/mL、0.773μg・時/mL及び0.509μg・時/mLであった。第1日目の血漿のリボフラビンの暴露量(CmaxとAUC())は、雌雄共にリボフラビン5’−リン酸に相関しており、リボフラビン5’−リン酸の一回投与を受けたリボフラビン血漿の暴露量(CmaxとAUC())については雌雄に関連する明らかな違いはなかった。第28日目と第1日目のリボフラビンCmax比は雄では低、中、高用量群において、それぞれ1.06、0.683及び1.07であり、雌では0.880、0.913及び0.739であった。関連するリボフラビンのAUC()比は、雄ではそれぞれ1.69、0.824及び0.942であり、雌では0.560、1.80及び0.814であった。
【0155】
図3は、28日間のエアロゾル化リボフラビン5’−リン酸投与後の雄犬と雌犬における平均リボフラビン血漿濃度−時間プロファイルのグラフを示している。図4A及び図4Bは28日間のエアロゾル化リボフラビン5’−リン酸投与後の平均リボフラビンCmax及びAUC()を示すグラフである。下の表は、28日間のリボフラビン5’−リン酸のエアロゾル投与後のリボフラビンの毒物動態のパラメータを要約している。

【0156】
血液学パラメータ
処置期間の処置に関連すると考えられる血液パラメータの変化はなかった。測定パラメータは実施例1に列挙したものと同じである。対照群との統計的な有意差(p≦0.05)は複数のパラメータで記録された。しかし、賦形剤対照群との差は雌雄の間で一貫しておらず、用量レベルに関連していないことを示しており、これらは偶発的であり、処置に関連していないと考えられた。
【0157】
凝集時間
凝集時間は処置によって変化しなかった。凝固計法を使用したプロトロンビン時間(PTT)及び凝固計法を使用した活性部分トロンボプラスチン時間(APTT)を含む複数のパラメータを測定した。下記の表は処置前と第29日目の凝集を要約している。
【0158】
臨床化学
処置期間の処置に関連すると考えられる臨床化学パラメータの変化は記録されなかった。複数のパラメータで対照群との間に統計的な有意差(p≦0.05)が記録された。しかし、賦形剤対照群との差は雌雄の間で一貫しておらず、用量レベルに関連していないことを示しており、これらは偶発的であり、処置に関連していないと考えられた。
【0159】
尿検
処置に影響したと考えられる尿検パラメータ評価の変化はなかった。複数のパラメータで対照群との間に統計的な有意差(p≦0.05)が記録された。しかし、賦形剤対照群との差は雌雄の間で一貫しておらず、用量レベルに関連していないことを示しており、これらは偶発的であり、処置に関連していないと考えられた。
【0160】
臓器重量
脾臓重量の若干の増加が群4の雄(絶対と相対重量)と群3の雄(絶対又は体重に対する相対)において試験終了時に観察された。しかし、重量は想定の範囲内であり、統計的な有意差は、対照の3匹の雄の記録対照重量の全てが比較的軽かったことによるものと考えられ、雌ではそのように対応する重量変化は記録されなかった。他の組織についても偶然に統計的有意になった対照重量との差が記録され、同様に処置に無関係であり生物学的に重要でないと考えられた。
【0161】
肉眼的所見
試験物に関連すると考えられる肉眼での所見はなかった。対照群を含む治療群の殆どで散発性の所見がまれに記録され、試験物に関連していると考えられなかった。小型の前立腺と胸腺は年齢に関連した偶発的な所見であり、試験化合物に関連していないと考えられた。他の変化は方法に関連したもの、死によるもの、又は偶然によるものであり、試験物と関連していなかった。
【0162】
顕微鏡所見
処置期間の終了時に試験化合物に関連する病理組織学的所見の証拠はなかった。肺性慢性活動性炎症と気管支肺胞上皮炎症は異物型肉芽腫と頻繁に関連しており、対照群を含む殆どの処置群群で見られ、試験物に関連しているとは考えられなかった。毒物学的に重要である他の変化は犬の死によるものであり、用量に関連しておらず、発生率又は重症度が低く、対照動物と処置動物で発生しており、又は、ビーグルの齢と系統に付随的であるため、毒性学的に重要ではないと考えられた。
【0163】
考察
試験の目的は試化合物、リボフラビン5’−リン酸をビーグル犬に28日間の口鼻吸入投与し、毒性と毒性動態プロファイルを測定することであった。ビーグル犬においてリボフラビン5’−リン酸の吸入暴露は忍容性が良好であり、本試験の経過で早期の死亡はなかった。臨床的観察、眼作用、心電図パターン、間接血圧計、呼吸測定又は全身性についての臨床病理の評価により有害な効果の検出は、いずれの群においても記録されなかった。試験物のリボフラビン5’−リン酸に関連していると考えられる肉体的所見又は顕微鏡的所見はなかった。処置動物において測定可能な血漿濃度のリボフラビン5’−リン酸がなかったため、動態は算定していない。雌雄ともに血漿中の代謝物(リボフラビン)濃度は測定可能であり、暴露量(CmaxとAUC()は用量に比例しているように見える。リボフラビン暴露において性差はなく、リボフラビン5’−リン酸の28日間の連続投与後に蓄積はなかった。結果的に、リボフラビン5’−リン酸の試験物を最大60分/日、28日連続して吸入(口鼻)投与した後、ビーグル犬における無毒性量(NOEL)は高用量群で試験した1.341mg/kg/日であると考えられた。
【0164】
実施例3−治験第2相:レボフロキサシンと塩化マグネシウム組成物、又はリボフラビン5’−リン酸を含むプラセボのCOPD患者への投与
塩化マグネシウムと組成したレボフロキサシンの安全性、忍容性、効果を評価する臨床試験を慢性閉塞性肺疾患(COPD)患者に対して行った。本試験は第2層、多施設、無作為、二重盲検、プラセボ対照試験である。患者は、240mgBIDレボフロキサシンと塩化マグネシウムの組成物又はリボフラビン5’−リン酸を含むプラセボの投与を行った。表23に試験薬とプラセボの組成を示す。
【0165】
試験薬とプラセボは改変PARI eFlow(登録商標)噴霧器を使用して投与した。本試験は少なくとも6回、12回よりも少ない連続する治療サイクルを含む。各治療サイクルは28日であった。各治療サイクルでは240mgBIDレボフロキサシンと塩化マグネシウムの組成物又はプラセボを5日間連続投与した。

【0166】
患者集団
約300の患者を試験した。本試験に含まれる患者は:(1)非増悪時でも殆ど毎日、粘液膿性痰(黄色、緑又は茶/黄褐色)の生産を有するCOPDの病歴があり;(2)測定努力呼気量(FEV)が予測FEV(気管支拡張薬投与後)の70%未満であり、年齢、背丈、性を用いたHankinsonとN.Hanes基準を使用したスクリーニングべ―スの1秒率(FEV/FVC)の予測値が0.7未満であり;(3)サイクル1の第1日目の12か月前に、少なくとも2回の急性増悪の記録があり、抗生物質、全身性コルチコステロイド、入院又はこれらの治療の組み合わせの期間を含む急性増悪の期間を含み;(4)サイクル1の第1日目の30日前に治療が必要な急性増悪期間がなく;(5)患者が慢性治療に長期間作用型の気管支拡張剤の吸入、及び/又は全身性ステロイドの吸入を受けた場合、サイクル1の第1日目の30日前は安定的な治療病歴であり;及び(6)生涯喫煙量が少なくとも10パックイヤーである;基準を有する者を含む。例えば、喘息、気管支癌、肺結核、嚢胞性線維症又は拡散気管支拡張症の一次診断の病歴といった臨床上関連性があると考えられるCOPD以外の何らかの呼吸器障害を有する患者を本試験から除外する基準を含んでいる。
【0167】
患者集団は、有効性評価可能(EE)集団、改良治療意図(MITT)集団、及び薬物動態(PK)集団が含まれている。EE集団は、主要なプロトコル違反することなく、治療サイクルの80%を完了する試験に登録した全ての患者が含まれている。このMITT集団は、試験に登録した全ての患者が含まれ、少なくとも1用量の試験薬を受ける。PK集団は、少なくとも1用量の試験薬を受け、少なくとも1回のPKサンプルの採取を受ける全患者が含まれている。
【0168】
試験終点
有効性は:(1)全ての増悪事象の期間と深刻度合;(2)痰の微生物;(3)肺機能テスト;(4)生活の質 /症状と兆候;(5)BODE指標:を使用して評価した。
【0169】
増悪
COPDの急性発作は本試験の第一終点である。症候性呼吸器の劣化を含む急性発作は、抗生物質、全身性コルチコステロイド、入院、又はこれらの治療の組み合わせを含む。更に増悪は、痰生産の増加、膿性の高い痰、痰の色の変化、咳の増加、喘鳴の増加、胸部絞扼感、運動耐性の減少、疲労の増加、水分貯留、急性錯乱、呼吸困難の悪化によって特徴づけられる。
【0170】
急性発作の深刻度合を測定には例えば、必要な薬物治療、必要な薬物治療の用量、急性発作の発症の日、及び急性発作の期間を含む基準を使用する。第一効果の分析は、レボフロキサシン治療群とプラセボ処置群の間の急性発作の度合の比較、及び/又はレボフロキサシン治療群とプラセボ処置群との全ての急性発作の深刻度の比較を含む。
【0171】
微生物評価
微生物評価は患者の痰のバクテリアを同定して定量した。塩化マグネシウムを配合したレボフロキサシン投与したCOPD患者の痰はプラセボ投与の患者と比較して肺炎球菌(S.pneumoniae)、β溶血性レンサ球菌(B−hemolytic streptococci)、黄色ブドウ球菌(S.aureus)、インフルエンザ菌(H.influenzae)、カタル球菌(M.catarrhalis)、緑膿菌(P.aeruginosa)及びその他のバクテリアを含む低いバクテリア密度を有していた。レボフロキサシンを投与した患者では低いバクテリア密度が確認された。
【0172】
肺機能評価
全ての患者は強制肺活量(FVC)及び努力性呼気(FEV)を測定して肺機能試験を行った。次いでFEV/FVC比、FVCパーセント、FEVパーセンを算定した。肺機能試験はアメリカ胸部疾患学会/ヨーロッパ呼吸器学会(ATS/ERS)の肺活量測定基準(2005)によって行い、全てを参照することにより本明細書に組み込まれている。
【0173】
生活の質(QOL)/兆候と症状
患者は兆候及び症状のアンケートである聖ジョージ呼吸器質問表(SGRQ)に記入した。(Meguro et al.,(2007)“Development and validation of an improved,COPD−specific version of the St George’s Respiratory Questionnaire”Chest 132:456−63全体を参照することによって本明細書に組み込まれている。)SGRQは総合的な健康、日常生活、及び生活状態が与える影響を測定する疾病特異的な形式で設計されており、通常性(fixed)、及び可逆性気道閉塞の患者用に開発されてきた。これら構成要素のスコアと略式スコアは100点基準に基づいている。
【0174】
BODEインデックス
BODEインデックスは疾病の類型化に優れており、COPDの呼吸、認知及び全身の特徴を評価する多次元の等級システムである。肥満指数(B)気流閉塞(O)呼吸困難(D)及び運動能力(E)(B−O−D−E)に関連する指標である(Celli BR,et al.,The body−mass index,airflow obstruction,dyspnea,and exercise capacity index in chronic obstructive pulmonary disease.N Engl J Med.2004 Mar 4;350(10):1005−12,全体を参照することにより本明細書に組み込まれている)。従って、COPDの重症度とCOPD患者の死のリスクを一定時間の短距離歩行による測定からFEV、低酸素血症又は高二酸化炭素血症の存在を含む様々な指標を使用して等級化しうる。
【0175】
患者の6分の歩行試験(6MWT)を含むBODE指標の測定した要素を評価をした。6MWTは測定表面を、患者が彼/彼女のペースで6分間歩ける距離を測定した。
【0176】
本明細書に示し、記載した本発明の好ましい実施態様は、単なる実施例としてとして提供しておりこれらの当業者には自明である。本発明から離れることなく多数の変形、変化、及び置換が当業者により行われるであろう。本明細書記載の本発明についての様々な代替的な実施態様が本発明の実施に使用されうると解釈すべきである。本発明の範囲を規定する下記の請求は発明の範囲を定義し、それによって、これらの特許請求の範囲及びその均等物の範囲内でメソッドや構造体がカバーされることを意図している。
【0177】
本明細書に同程度に参照され、組み込まれている全ての刊行物、特許及び特許出願は、個々の刊行物、特許、又は特許出願を特定し、指示するように参照され、組み込まれている。

【特許請求の範囲】
【請求項1】
試験化合物を評価する方法において:
個体の第1集団にエアロゾル吸入を介して試験化合物を投与するステップと;
個体の第2集団にエアロゾル吸入を介してリボフラビン5’−リン酸を含むプラセボを投与するステップと;
試験化合物を投与した少なくとも1の個体における生物学的マーカーとプラセボを投与した少なくとも1の個体における生物学的マーカーを比較するステップと;
を具えることを特徴とする方法。
【請求項2】
請求項1に記載の方法において、前記試験化合物の前記投与が前記試験化合物をエアロゾル化した溶液を送達するステップを具えていることを特徴とする方法。
【請求項3】
請求項1に記載の方法において、前記投与が肺内又は鼻腔内へのものであることを特徴とする方法。
【請求項4】
請求項1に記載の方法において、前記試験化合物又はプラセボが肺送達装置によって送達されることを特徴とする方法。
【請求項5】
請求項4に記載の方法において、前記肺送達装置が噴霧器又は定量吸入器であることを特徴とする方法。
【請求項6】
請求項1に記載の方法において、前記生物学的マーカが治療効果に関連するマーカ、副作用に関連するマーカ、毒作用に関連するマーカ、薬力学的なパラメータに関連するマーカから成る群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項7】
請求項1に記載の方法において、前記試験化合物が抗生物質、抗アレルギー薬、抗がん剤、抗真菌剤、抗悪性腫瘍薬、鎮痛薬、気管支拡張薬、抗ヒスタミン薬、抗ウイルス薬、鎮咳薬、アンギナール製剤、抗炎症薬、免疫調節薬、5−リポキシゲナーゼ阻害薬、ロイコトリエン拮抗薬、ホスホリパーゼA阻害剤、ホスホジエステラーゼIV阻害剤、ペプチド類、タンパク質、ステロイド及びワクチン製剤から成る群の少なくとも1種類を含むことを特徴とする方法。
【請求項8】
請求項1に記載の方法において、前記プラセボがリボフラビン5’−リン酸の溶液を含むことを特徴とする方法。
【請求項9】
請求項8に記載の方法において、リボフラビン5’−リン酸の前記溶液が約0.1mg/mLを超える濃度を有すること特徴とする方法。
【請求項10】
請求項8に記載の方法において、リボフラビン5’−リン酸の前記溶液が約0.001mg/Lを超える濃度を有すること特徴とする方法。
【請求項11】
請求項8に記載の方法において、リボフラビン5’−リン酸の前記溶液が約0.005mg/Lを超える濃度を有すること特徴とする方法。
【請求項12】
請求項8に記載の方法において、リボフラビン5’−リン酸の前記溶液が約0.02mg/Lを超える濃度を有すること特徴とする方法。
【請求項13】
請求項8に記載の方法において、リボフラビン5’−リン酸の前記溶液が約0.06mg/Lを超える濃度を有すること特徴とする方法。
【請求項14】
請求項8に記載の方法において、前記リボフラビン5’−リン酸エアロゾルが約0.001mg/kg/日を超える呼吸送達用量を含むことを特徴とする方法。
【請求項15】
請求項1に記載の方法において、前記ボフラビン5’−リン酸のエアロゾルが約0.01mg/kg/日を超える呼吸送達用量を含むことを特徴とする方法。
【請求項16】
請求項1に記載の方法において、前記ボフラビン5’−リン酸のエアロゾルが約0.1mg/kg/日を超える呼吸送達用量を含むことを特徴とする方法。
【請求項17】
請求項1に記載の方法において、前記ボフラビン5’−リン酸のエアロゾルが約0.2mg/kg/日を超える呼吸送達用量を含むことを特徴とする方法。
【請求項18】
請求項1に記載の方法において、前記ボフラビン5’−リン酸のエアロゾルが約0.01mg/kg/日を超える投与量を含むことを特徴とする方法。
【請求項19】
請求項1に記載の方法において、前記ボフラビン5’−リン酸のエアロゾルが約0.1mg/kg/日を超える投与量を含むことを特徴とする方法。
【請求項20】
請求項1に記載の方法において、前記リボフラビン5’−リン酸のエアロゾルが約1.0mg/kg/日を超える投与量を含むことを特徴とする方法。
【請求項21】
請求項1に記載の方法において、前記リボフラビン5’−リン酸のエアロゾルが約2.0mg/kg/日を超える投与量を含むことを特徴とする方法。
【請求項22】
請求項1に記載の方法において、前記エアロゾル化リボフラビン5’−リン酸が3.0μmよりも小さい又は同等の幾何標準偏差を有する約0.5μm乃至約4.5μmの空気動力学的中央粒子径から成ることを特徴とする方法。
【請求項23】
請求項1に記載の方法において、前記エアロゾル化リボフラビン5’−リン酸が2.7μmよりも小さい又は同等の幾何標準偏差を有する約1.0μm乃至約3.5μmの空気動力学的中央粒子径から成ることを特徴とする方法。
【請求項24】
請求項1に記載の方法において、前記エアロゾル化リボフラビン5’−リン酸が2.4μmよりも小さい又は同等の幾何標準偏差を有する約1.1μm乃至約3.1μmの空気動力学的中央粒子径から成ることを特徴とする方法。
【請求項25】
請求項1に記載の方法において、前記プラセボが少なくとも毎日投与されることを特徴とする方法。
【請求項26】
請求項1に記載の方法において、前記個体が動物であることを特徴とする方法。
【請求項27】
請求項26に記載の方法において、前記動物が哺乳類であることを特徴とする方法。
【請求項28】
請求項27に記載の方法において、前記哺乳類がラット、犬及び人から成る群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項29】
試験化合物を評価する方法において:個体集団における試験化合物とプラセボの治験を実施するステップを具え、当該プラセボがエアロゾル化リボフラビン5’−リン酸を含むことを特徴とする方法。
【請求項30】
エアロゾルがリボフラビン5’−リン酸を含むエアロゾル。
【請求項31】
請求項30に記載のエアロゾルがリボフラビン5’−リン酸の溶液を含むことを特徴とするエアロゾル。
【請求項32】
請求項31に記載のエアロゾルおいて、リボフラビン5’−リン酸の前記溶液が約0.1mg/mLを超える濃度を有すること特徴とするエアロゾル。
【請求項33】
請求項31に記載のエアロゾルおいて、リボフラビン5’−リン酸の前記溶液が約0.001mg/Lを超える濃度を有すること特徴とするエアロゾル。
【請求項34】
請求項31に記載のエアロゾルおいて、リボフラビン5’−リン酸の前記溶液が約0.005mg/Lを超える濃度を有すること特徴とするエアロゾル。
【請求項35】
請求項31に記載のエアロゾルおいて、リボフラビン5’−リン酸の前記溶液が約0.02mg/Lを超える濃度を有すること特徴とするエアロゾル。
【請求項36】
請求項31に記載のエアロゾルおいて、リボフラビン5’−リン酸の前記溶液が約0.06mg/Lを超える濃度を有すること特徴とするエアロゾル。
【請求項37】
請求項30又は31に記載のエアロゾルおいて、前記エアロゾルが0.001mg/kg/日を超える呼吸送達用量のリボフラビン5’−リン酸を含むことを特徴とするエアロゾル。
【請求項38】
請求項30又は31に記載のエアロゾルおいて、前記エアロゾルが0.01mg/kg/日を超える呼吸送達用量のリボフラビン5’−リン酸を含むことを特徴とするエアロゾル。
【請求項39】
請求項30又は31に記載のエアロゾルおいて、前記エアロゾルが0.1mg/kg/日を超える呼吸送達用量のリボフラビン5’−リン酸を含むことを特徴とするエアロゾル。
【請求項40】
請求項30又は31に記載のエアロゾルおいて、前記エアロゾルが0.2mg/kg/日を超える呼吸送達用量のリボフラビン5’−リン酸を含むことを特徴とするエアロゾル。
【請求項41】
請求項30又は31に記載のエアロゾルおいて、前記エアロゾルが0.01mg/kg/日を超える用量のリボフラビン5’−リン酸を含むことを特徴とするエアロゾル。
【請求項42】
請求項30又は31に記載のエアロゾルおいて、前記エアロゾルが0.1mg/kg/日を超える用量のリボフラビン5’−リン酸を含むことを特徴とするエアロゾル。
【請求項43】
請求項30又は31に記載のエアロゾルおいて、前記エアロゾルが1.0mg/kg/日を超える用量のリボフラビン5’−リン酸を含むことを特徴とするエアロゾル。
【請求項44】
請求項30又は31に記載のエアロゾルおいて、前記エアロゾルが2.0mg/kg/日を超える用量のリボフラビン5’−リン酸を含むことを特徴とするエアロゾル。
【請求項45】
請求項30又は31に記載のエアロゾルおいて、前記エアロゾル化リボフラビン5’−リン酸が3.0μmよりも小さい又は同等の幾何標準偏差を有する約0.5μm乃至約4.5μmの空気動力学的中央粒子径から成ることを特徴とするエアロゾル。
【請求項46】
請求項30又は31に記載のエアロゾルおいて、前記エアロゾル化リボフラビン5’−リン酸が2.7μmよりも小さい又は同等の幾何標準偏差を有する約1.0μm乃至約3.5μmの空気動力学的中央粒子径から成ることを特徴とするエアロゾル。
【請求項47】
請求項30又は31に記載のエアロゾルおいて、前記エアロゾル化リボフラビン5’−リン酸が2.4μmよりも小さい又は同等の幾何標準偏差を有する約1.1μm乃至約3.1μmの空気動力学的中央粒子径から成ることを特徴とするエアロゾル。

【図1】
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【図2A】
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【図2B】
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【図3】
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【図4A】
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【図4B】
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【公表番号】特表2013−502579(P2013−502579A)
【公表日】平成25年1月24日(2013.1.24)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2012−525533(P2012−525533)
【出願日】平成22年8月19日(2010.8.19)
【国際出願番号】PCT/US2010/002306
【国際公開番号】WO2011/022074
【国際公開日】平成23年2月24日(2011.2.24)
【出願人】(511251537)エムペックス ファーマスーティカルズ,インコーポレイテッド (4)
【氏名又は名称原語表記】MPEX PHARMACEUTICLAS,INC.
【Fターム(参考)】