【課題】哺乳動物（例えば、ヒト）治療用糖タンパク質の生成のための宿主株になり得る、修飾オリゴ糖を有する真核生物宿主細胞を提供する。
【解決手段】Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＧｎＴ）ＩＩＩ活性を下等真核生物宿主細胞に導入し、発現させる工程からなる。修飾脂質結合オリゴ糖を有する宿主細胞が作製されるかまたは選択される。操作された宿主細胞において作製されたＮ−グリカンは、バイセクト型Ｎ−グリカン構造を生成するＧｎＴＩＩＩ活性を示し、１種以上の酵素（例えば、グリコシルトランスフェラーゼ、糖トランスポーターおよびマンノシダーゼ）の異種発現によってさらに修飾されて、ヒト様糖タンパク質を生じ得る。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
下等真核生物宿主細胞においてヒト様糖タンパク質を作製するためのプロセスであって、
該プロセスは、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性を該細胞に導
入する工程を包含する、プロセス。
【請求項２】
下等真核生物宿主細胞においてヒト様糖タンパク質を作製するためのプロセスであって、
該プロセスは、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性を該細胞にお
いて発現させる工程を包含する、プロセス。
【請求項３】
下等真核生物宿主細胞においてヒト様糖タンパク質を作製するためのプロセスであって、
該プロセスは、ＧｌｃＮＡｃ_３Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３Ｇｌｃ
ＮＡｃ_２またはＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２バイセクト型構造を含むＮ−グリ
カンを生成する１以上の酵素活性を該細胞において発現させる工程を包含する、プロセス
。
【請求項４】
前記Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性は、バイセクト型グリカ
ンを生成する、請求項１または２に記載のプロセス。
【請求項５】
前記糖タンパク質は、バイセクト型グリカンを含む、請求項１または２に記載のプロセス
。
【請求項６】
前記活性は、実質的に細胞内にある、請求項１または２に記載のプロセス。
【請求項７】
前記宿主細胞から前記糖タンパク質を単離する工程をさらに包含する、請求項１、２、ま
たは３に記載のプロセス。
【請求項８】
前記宿主細胞は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃ
ａ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉ
ｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉ
ｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉ
ｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐ
ｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ種、Ｓａｃｃｈａｒｏｍ
ｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃ
ａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇ
ｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ
、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ種、Ｆｕｓ
ａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ、およびＮｅ
ｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａからなる群より選択される、請求項１、２、または３に
記載のプロセス。
【請求項９】
前記宿主細胞は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃ
ａ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉ
ｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉ
ｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉ
ｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐ
ｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、およびＰｉｃｈｉａ種からなる群より
選択される、請求項８に記載のプロセス。
【請求項１０】
前記宿主細胞は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓである、請求項９に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記糖タンパク質は、治療用タンパク質である、請求項１、２、または３に記載のプロセ
ス。
【請求項１２】
前記治療用タンパク質は、エリスロポエチン、サイトカイン、凝固因子、可溶性ＩｇＥレ
セプターα鎖、ＩｇＧ、ＩｇＧフラグメント、ＩｇＭ、インターロイキン、ウロキナーゼ
、カイメース、尿素トリプシンインヒビター、ＩＧＦ結合タンパク質、上皮増殖因子、成
長ホルモン放出因子、アネキシンＶ融合タンパク質、アンジオスタチン、血管内皮増殖因
子−２、骨髄前駆細胞阻害因子−１、オステオプロテゲリン、α−１−アンチトリプシン
、α−フェトプロテイン、ＤＮａｓｅ ＩＩ、ＡＡＴ、ｒｈＴＢＰ−１（ｏｎｅｒｃｅｐ
ｔ、ＴＮＦ結合タンパク質１ともいわれる）、ＴＡＣＩ−Ｉｇ（膜貫通活性化因子および
カルシウム調節因子およびサイクロフィリンリガンド相互作用因子）、ＦＳＨ（卵胞刺激
ホルモン）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＣ（グルカゴン様タンパク質１）ありまたはなしのＧＬＰ
−１からなる群より選択される、請求項１１に記載のプロセス。
【請求項１３】
Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性を含む、下等真核生物宿主細
胞。
【請求項１４】
Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ活性およびＮ−アセチルグルコサミ
ニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性を含む、下等真核生物宿主細胞。
【請求項１５】
前記活性は、実質的に細胞内にある、請求項１３または１４に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
前記細胞は、ＧｎＴＩＩＩ活性で反応し得るＧｌｃＮＡｃＭａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２構造を
含むＮ−グリカンを生成する、請求項１３または１４に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
前記Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性は、バイセクト型グリカ
ンを生成する、請求項１３または１４に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
バイセクト型グリカンを含むＮ−グリカンを含む、下等真核生物宿主細胞。
【請求項１９】
前記Ｎ−グリカンは、１０モル％を超える前記バイセクト型グリカンを含む、請求項１８
に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
前記Ｎ−グリカンは、８０モル％を超える前記バイセクト型グリカンを含む、請求項１８
に記載の宿主細胞。
【請求項２１】
ＧｌｃＮＡｃ_３Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２または
ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２バイセクト型構造を含むＮ−グリカンを含む下等
真核生物宿主細胞。
【請求項２２】
前記宿主細胞は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃ
ａ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉ
ｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉ
ｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉ
ｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐ
ｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ種、Ｓａｃｃｈａｒｏｍ
ｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃ
ａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇ
ｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ
、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ種、Ｆｕｓ
ａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ、およびＮｅ
ｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａからなる群より選択される、請求項１３、１４、１８、
または２１に記載の宿主細胞。
【請求項２３】
前記宿主細胞は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃ
ａ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉ
ｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉ
ｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉ
ｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐ
ｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、およびＰｉｃｈｉａ種からなる群より
選択される、請求項２２に記載の宿主細胞。
【請求項２４】
前記宿主細胞は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓである、請求項２３に記載の宿主細胞
。
【請求項２５】
バイセクト型ＧｌｃＮＡｃにより修飾される、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２コア構造またはＭ
ａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２コア構造を含む、下等真核生物宿主細胞。
【請求項２６】
前記細胞は、１０モル％を超える前記修飾構造を生成する、請求項２５に記載の宿主細胞
。
【請求項２７】
前記細胞は、５０モル％を超える前記修飾構造を生成する、請求項２５に記載の宿主細胞
。
【請求項２８】
Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ活性およびＮ−アセチルグルコサミニ
ルトランスフェラーゼＩＩＩ活性を含む、下等真核生物宿主細胞。
【請求項２９】
前記活性は、実質的に細胞内にある、請求項２８に記載の宿主細胞。
【請求項３０】
前記細胞は、ＧｎＴＩＩＩ活性で反応し得るＧｌｃＮＡｃＭａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２を含む
Ｎ−グリカンを生成する、請求項２８に記載の宿主細胞。
【請求項３１】
前記Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性は、バイセクト型グリカ
ンを生成する、請求項２８に記載の宿主細胞。
【請求項３２】
ＧｎＴＩＩＩ活性およびマンノシダーゼＩＩ活性を含む、下等真核生物宿主細胞。
【請求項３３】
Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ活性をさらに含む、請求項３２に記載
の宿主細胞。
【請求項３４】
Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ活性をさらに含む、請求項３２に記
載の宿主細胞。
【請求項３５】
Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ活性およびＮ−アセチルグルコサミニ
ルトランスフェラーゼＩＩ活性をさらに含む、請求項３２に記載の宿主細胞。
【請求項３６】
ＯＣＨ１マンノシルトランスフェラーゼ活性を欠いている、請求項１３、１４、２８、ま
たは３２に記載の宿主細胞。
【請求項３７】
Ｄｏｌ−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２−ＰＰ−Ｄｏｌマンノシルトランスフェラ
ーゼ活性を欠いている、請求項１３、１４、２８、または３２に記載の宿主細胞。
【請求項３８】
α−１，２−マンノシダーゼＩ活性をさらに含む、請求項１３、１４、２８、または３２
に記載の宿主細胞。
【請求項３９】
ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターをさらに含む、請求項１３、１４、２８、または
３２に記載の宿主細胞。
【請求項４０】
請求項１に記載のプロセスによって作製される、糖タンパク質。
【請求項４１】
請求項２に記載のプロセスによって作製される、糖タンパク質。
【請求項４２】
請求項３に記載のプロセスによって作製される、糖タンパク質。
【請求項４３】
請求項８に記載のプロセスによって作製される、糖タンパク質。
【請求項４４】
請求項９に記載のプロセスによって作製される、糖タンパク質。
【請求項４５】
請求項１０に記載のプロセスによって作製される、糖タンパク質。
【請求項４６】
請求項１１に記載のプロセスによって作製される、糖タンパク質。
【請求項４７】
下等真核生物宿主細胞において生成されるＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２またはＭａｎ_３Ｇｌｃ
ＮＡｃ_２コア構造にバイセクト型ＧｌｃＮＡｃを含む、糖タンパク質。
【請求項４８】
下等真核生物宿主細胞において生成されるＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２、Ｍａｎ_４ＧｌｃＮＡ
ｃ_２、Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、ＧｌｃＮＡｃＭ
ａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２、またはＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２コア構造に結合し
たバイセクト型ＧｌｃＮＡｃを含む、糖タンパク質。
【請求項４９】
１０モル％を超える前記コア構造がバイセクト型ＧｌｃＮＡｃにより修飾される、請求項
４８に記載の糖タンパク質。
【請求項５０】
８０モル％を超える前記コア構造がバイセクト型ＧｌｃＮＡｃにより修飾される、請求項
４８に記載の糖タンパク質。
【請求項５１】
請求項４０〜５０のいずれか１項に記載の糖タンパク質を含む、薬学的組成物。
【請求項５２】
ｐＶＡ、ｐＶＢ、およびｐＶＣからなる群より選択される、ベクター。
【請求項５３】
前記ベクターは、ｐＶＡ５３、ｐＶＡ５４、ｐＶＡ５５、ｐＶＢ５３、ｐＶＢ５４、およ
びｐＶＢ５５からなる群より選択される、請求項５２に記載のベクター。

【図１Ａ】

【図１Ｂ】

【図２】

【図３−１】

【図３−２】

【図４Ａ】

【図４Ｂ】

【図４Ｃ】

【図４Ｄ】

【図４Ｅ】

【図４Ｆ】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６−１】

【図１６−２】

【図１６−３】

【図１６−４】

【図１９−１】

【図１９−２】

【図１９−３】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図２８】

【図２９】

【図３０】

【図３１】

【図３２】

【図３３】

【図３４】

【図３５】

【図３６】

【図１７】

【図１８】

【図２０】

【図３７】

【図３８】

【公開番号】特開２０１１−１９５２１（Ｐ２０１１−１９５２１Ａ）
【公開日】平成２３年２月３日（２０１１．２．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１８１３１９（Ｐ２０１０−１８１３１９）
【出願日】平成２２年８月１３日（２０１０．８．１３）
【分割の表示】特願２００６−５０３７５７（Ｐ２００６−５０３７５７）の分割
【原出願日】平成１６年２月２０日（２００４．２．２０）
【出願人】（５０３００７２８７）グライコフィ，　インコーポレイテッド (37)
【Ｆターム（参考）】