修飾オリゴヌクレオチドを使用するＨＲＰ−３の阻害
本発明はＰＷＷＰドメインを有するタンパク質の活性を調節するための剤に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の詳細な説明
本発明はＰＷＷＰドメインを有するタンパク質の活性を調節するための剤に関する。
【０００２】
ＰＷＷＰドメインは、「ＨＤＧＦファミリー」として知られるタンパク質のファミリー中に見出される保存された構造モチーフである。このファミリーは６つのタンパク質を包含する：原型タンパク質、ＨＤＧＦ；ＨＲＰ−１、ＨＲＰ−２、ＨＲＰ−３、ＨＲＰ−４（ＨＲＰ＝ＨＤＧＦ関連タンパク質（ＨＤＧＦ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ））；及びＬＥＤＧＦ。図１は、この６つのタンパク質のアラインメント及びこのＰＷＷＰドメインの構造的保存を示し、これは常に全てのファミリーメンバーのＮ末端に存在する。更に、ＰＷＷＰドメインと２つの非関連タンパク質のオリゴヌクレオチド結合ドメインとの間の構造的相同性も強調されている；この相同性はオリゴヌクレオチド結合において推定上保存される役割を指し示す。この結論は最近になって、ＨＲＰ−３のＰＷＷＰドメインと二重鎖ＤＮＡとの間での複合体の構造のＮＭＲの解明により支持され、これは、マイクロモーラー（μＭ）の親和性で少なくとも１のｄｓ ＤＮＡで結合するＰＷＷＰドメインの能力を確認した。ＰＷＷＰドメインが、オリゴヌクレオチドと結合できるという事実は、治療的及び診断的使用のための短鎖オリゴヌクレオチドによるＨＤＧＦファミリー中のタンパク質のターゲッティングの道をひらく。
【０００３】
本発明者らは、ＰＷＷＰドメインタンパク質の新規生物学的活性を同定した。特に、ＨＲＰ−３は、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞の移動、増殖及び／又は足場形成独立成長を阻害することができることが見出された。更に、ＨＲＰ−３は、ＨＵＶＥＣ細胞に対する血管形成促進剤として作用することが見出された。更に、ＨＲＰ−３は、神経腫瘍中で、特に神経芽腫細胞中で過剰発現することが見出された。最後に、本発明者らは、高い親和性でもってＰＷＷＰドメインに結合でき、このようにしてＰＷＷＰドメインタンパク質の活性を阻害できる新規の単鎖オリゴヌクレオチド分子を同定した。
【０００４】
本発明の第１の観点は、ＰＷＷＰドメインタンパク質に結合でき、かつ、ＰＷＷＰドメインタンパク質、例えばＨＲＰ−３及びＨＤＧＦにより誘発される生物学的作用を阻害及び／又は遮断できる単鎖オリゴヌクレオチド分子に関する。
【０００５】
本発明の主題は、配列
【化１】
［式中、Ｙ及びＺはヌクレオチド又はヌクレオチドアナログ構成ブロックを示す、
その際、それぞれのＹ及びＺは互いと一緒に塩基対、特にワトソン−クリック塩基対を形成し、Ｘ1及びＸ2は独立してポリ（アルキレングリコール）単位を含む基から選択される、
ｎ及びｍは独立して０又は１を示し、その際ｎ及びｍの少なくとも１つは１である、
ｓは１〜２０、有利には５〜１８の整数である、
Ｂは架橋基である］
を含む単鎖オリゴヌクレオチド分子である。
【０００６】
有利には、本発明は、配列
【化２】
［式中、Ａ、Ｃ、Ｔ及びＧはヌクレオチド又はヌクレオチドアナログ構成ブロックを示す、
Ｘ1及びＸ2は独立してポリ（アルキレングリコール）単位を含む基から選択される、
ｎ及びｍは独立して０又は１を示し、その際ｎ及びｍの少なくとも１つは１である、かつ
Ｂは架橋基を示す］
を含む単鎖オリゴヌクレオチド分子に関する。
【０００７】
このオリゴヌクレオチド分子は、互いと一緒に塩基対、特にワトソンクリック塩基対を形成できるヌクレオチド又はヌクレオチドアナログ構成ブロックを含む。有利にはこの構成ブロックは、「Ａ」、「Ｃ」、「Ｔ」及び「Ｇ」から選択される。この「Ａ」構成ブロックは、核酸塩基アデニン又はそのアナログであって相補性核酸塩基「Ｔ」と塩基対を形成できるもの含む構成ブロックから選択される。この「Ｃ」構成ブロックは、核酸塩基シチジン又はそのアナログであって相補性核酸塩基「Ｇ」と塩基対を形成できるものを含む構成ブロックから選択される。この「Ｔ」構成ブロックは、核酸塩基チミン又はそのアナログであって相補性核酸塩基「Ａ」と塩基対を形成できるもの、例えば核酸塩基ウラシル（代わりに「Ｕ」構成ブロックとしても同定される）を、そしてこの「Ｇ」構成ブロックは核酸塩基グアニン又はそのアナログであって相補性核酸塩基「Ｃ」と塩基対を形成できるものを含む。
【０００８】
構成ブロックＡ、Ｃ、Ｔ及びＧは有利には、デオキシリボヌクレオチド構成ブロック、修飾デオキシリボヌクレオチド構成ブロック、リボヌクレオチド構成ブロック、修飾リボヌクレオチド構成ブロック、ヌクレオチドアナログ構成ブロック、特にＰＮＡ、ＬＮＡ又はモルホリノ構成ブロック又はその組み合わせから選択される。修飾デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド構成ブロックの例はヌクレオチドであって、このリボース糖の２′−Ｃ原子がハロゲン、例えばＦ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ、シアノ、アルキル、例えばＣ1〜Ｃ6−アルキル、アルケニル、例えばＣ2〜Ｃ6−アルケニル、アルキニル、例えばＣ2〜Ｃ6−アルキニル、アミノ、モノ−又はジ−アルキル置換アミノ、例えばＣ1〜Ｃ6−アルキルアミノ、アルコキシ、例えばＣ1〜Ｃ6−アルコキシで置換されたものであり、この場合にアルキル、アルケニル及びアルキニル基は非置換であるか又はハロゲン、ヒドロキシ−又はアルコキシ基により一又は多置換されていてよい。構成ブロックの更なる例は、糖−リン酸骨格のリン原子で生じる修飾を有するオリゴヌクレオチドアナログであり、これは例えばホスホロチオアート、メチルホスホナート、ホスホロアミダート及びホスホトリエステルである（例えば、Cohen, J. S., ed. Oligonucleotides: Antisense Inhibitors of Gene Expression,（CRC Press, Inc., Boca Raton FIa., 1989）。有利な例は、ペプチド核酸、（ＰＮＡ）、ヒドロキシプロリンペプチド核酸（ＨｙｐＮＡ）、セリンペプチド核酸（ＳｅｒＮＡ）を含む（例えばWO 2001/068673−オリゴヌクレオチドアナログ、その合成方法及び使用方法）。モルホリノ及び複素環式アナログ、２′−修飾ヌクレオシド、例えば２′Ｆ ＲＮＡ又は２′ＯＭｅＲＮＡ、コンフォメーションが制限されたヌクレオチド、二、三又は多環式ヌクレオシドアナログ、例えばａ−ビシクロ−ＤＮＡ、８−ビシクロＤＮＡ５′，６′ビシクロ−ＤＮＡ、ロックトヌクレオシドアナログ（ＬＮＡ）、及び、スピロ基を含むアナログ（cf. Velazquez S, San Felix A, Perez-Perez MJ, Balzarini J, De Clercq E1 Camarasa MJ. lnt Conf AIDS. 1992 JuI 19-24; 8:スペインにより説明されたとおり）、熱不安定性保護基、例えばプロドラッグとしての４−メチルチオ−１−ブチル基を有するオリゴヌクレオチド性アナログ（cf. Beaucage SL, Curr Protoc Nucleic Acid Chem. ２００４年１２月;第３章:3.11セクションにより説明されたとおり）、２′−５′連結したオリゴヌクレオチド、又は５′−５′又は３′−３′連結を有するオリゴヌクレオチド（逆転アミダイト（reversed amidite）の使用による連結逆位（linkage inversion））。
【０００９】
極めて有利な構成ブロックＡ、Ｃ、Ｔ及びＧはデオキシリボヌクレオチド構成ブロック、リボヌクレオチド構成ブロック、修飾リボヌクレオチド構成ブロック、有利には２′−ＯＭｅリボヌクレオチド構成ブロック及び逆転リボヌクレオチド構成ブロックであって３′−３′連結逆位を形成するものから選択される。
【００１０】
本発明の単鎖オリゴヌクレオチド分子は、この分子の５′−及び３′−末端に存在する基Ｘ1及び／又は基Ｘ2をそれぞれ含む。一実施態様において、オリゴヌクレオチド分子はＸ1及びＸ2基の両者を含む。更なる一実施態様において、この分子はＸ1基だけを含み、また更なる実施態様においてＸ2基だけを含む。
【００１１】
この基Ｘ1及びＸ2は、オリゴヌクレオチド分子を安定化できる基から選択される。有利には、Ｘ1及びＸ2は、線状又は分枝鎖状ポリ（Ｃ2〜Ｃ3−アルキレングリコール）単位、特にポリ（エチレングリコール）単位を含む基から選択される。これら単位は有利には、２００〜１０００００Ｄａ、特に有利に３００〜５００００Ｄａの範囲内の分子量を有する。特に有利な一実施態様において、このポリ（エチレングリコール）単位は、分枝鎖状ポリ（エチレングリコール）単位であってそれぞれ２０ｋＤａの２個のポリ（エチレングリコール）鎖を有するものであり、すなわち、分子量４００００Ｄａを有する分枝鎖状ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ（４０ＫＤａ））である。
【００１２】
更に、本発明のオリゴヌクレオチド分子は、架橋単位Ｂを含み、これは組立場（scaffold）を提供し、これによりこの分子内での５′−及び３′−自己相補的オリゴヌクレオチド間での二重鎖ステム構造の形成が可能になる。架橋単位の長さは有利には１〜２０ヌクレオチド性又は非ヌクレオチド性構成ブロックである。有利にはこの架橋単位は、（ｉ）少なくとも３つの対になっていないヌクレオチド又はヌクレオチドアナログ構成ブロックのヌクレオチド性スペーサー配列、又は、（ｉｉ）非ヌクレオチド性スペーサー配列、例えば少なくとも３つのエチレングリシド単位の、有利には少なくとも５つのエチレングリコール単位のポリ（エチレングリコール）スペーサー配列を含む。
【００１３】
より有利には、この架橋単位は、３つの「Ａ」構成ブロック、例えばデオキシリボヌクレオチド配列ＡＡＡ又はポリ（エチレングリコール）スペーサー配列であって３〜１０、有利には５〜１０、例えば３、５、７又は１０つのエチレングリコール単位を含むものを含む。より有利には、この架橋単位の３つの「Ａ」構成ブロックは、２′ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド構成ブロック、例えば修飾リボヌクレオチド配列ＡＡＡ（２′−ＯＭｅ）を含む。
【００１４】
本発明のオリゴヌクレオチド分子は、有利には、ＰＷＷＰドメインタンパク質、例えばＨＤＧＦ、ＨＤＧＦ−２、ＨＲＰ−１、ＨＲＰ−２、ＨＲＰ−３、ＨＲＰ−４及び／又はＬＥＤＧＦ、特にＨＲＰ−３及び／又はＨＤＧＦを阻害できる。有利にはＰＷＷＰドメインは、Prosite PS50821、Pfam PF00855又はInterPRO IPR000313で定義されているとおりである。
【００１５】
ＰＷＷＰドメインタンパク質は有利には、哺乳類タンパク質、より有利にはヒトタンパク質、例えばヒトＨＤＧＦ（Swiss Prot. No. P51858/ Q7Z4S4/Q7Z4S5）、ヒトＨＤＧＦ−２（Swiss Prot. No. Q7Z4V5）、ヒトＨＲＰ−３（Swiss Prot. No. Q9Y3E1）、及び／又はヒトＬＥＤＧＦ（Swiss Prot. No. 075475）である。本発明のオリゴヌクレオチド分子は有利には、ＰＷＷＰドメインの生物学的活性、例えば血管形成促進性活性を阻害できる。
【００１６】
有利な一実施態様において、このオリゴヌクレオチドは、少なくとも１０μＭ、有利には少なくとも１００μＭ、特に有利には少なくとも１０００μＭの親和性でＰＷＷＰドメインタンパク質に結合する。更なる有利な一実施態様において、このオリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ｎＭ、有利には少なくとも１００ｎＭ、特に有利には少なくとも１０００ｎＭの親和性でＰＷＷＰドメインタンパク質に結合するタンパク質へのこのオリゴヌクレオチドの結合は、ビアコア（Biacore）システム、円二色性又は電気泳動技術、例えばキャピラリー電気泳動によって決定されてよい。
【００１７】
本発明のオリゴヌクレオチド分子は、医薬において、例えばヒト又は獣医学的医薬において、診断及び／又は治療適用のために使用されてよい。例えば、このオリゴヌクレオチド分子は、ＰＷＷＰドメインタンパク質機能障害、特にＰＷＷＰドメインタンパク質過剰発現及び／又は過剰活性に関連、付随する、かつ／又はこれにより引き起こされる状態又は疾病の診断及び治療において使用されてよい。
【００１８】
より有利には、このオリゴヌクレオチド分子は、血管形成に関連した疾病、例えば癌、例えば神経癌、例えば神経芽腫、メラノーマ、結腸直腸癌、膵癌、胃癌、肝細胞癌及び肺癌の診断及び治療における使用のためである。特に有利な一実施態様において、このオリゴヌクレオチド分子は、例えば、神経癌、例えば神経芽腫におけるＨＲＰ−３の生物学的活性の阻害及び／又は遮断における使用のためである。
【００１９】
本発明のオリゴヌクレオチドは、これを必要とする被験体に、活性剤及び医薬的に許容可能な担体、希釈剤及び／又は助剤を含んでよい医薬組成物として投与されてよい。この医薬組成物は、任意の適した形態にあってよく、例えば腸管外、局所的、肺の投与その他のためであってよい。有利には、この医薬組成物は、例えば注射又は輸液による腸管外投与のために適している。
【００２０】
医薬組成物は、これを必要とする被験体に、疾病の種類及び深刻度及び投与経路に依存して、治療的有効用量、例えば、一日あたり０．００１〜１０００ｍｇ以上で投与される。
【００２１】
本発明のオリゴヌクレオチド分子は単独療法として又は更なる療法、例えば放射線、手術及び／又は更なる医薬、例えば抗癌医薬、例えば化学療法剤及び／又は抗腫瘍抗体の投与と組み合わせて投与されてよい。化学療法剤の有利な例は、チューブリン安定化剤、チューブリン脱安定化剤、代謝拮抗剤、プリン合成阻害剤、ヌクレオシドアナログ、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡ修飾剤、及び血管破砕剤である。化学療法剤の特定の例は、アミノグルテチミド、アミノプテリン、アナストロゾール、アンシタビン、ビモラン、５−ブロモウラシル、カンプトテシン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、クロロメチン、シスプラチン、クロドロン酸二ナトリウム、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ドキソルビシン、エチルイミナム（ethyliminum）、エトポシド、フロクスウリジン、５−フルオロウラシル、フルタミド、フトラフ−ル（ftorafur）、ヒドロキシ尿素、イソホスファミド、イオムスチン、メルカプトプリン、メトトレキセート、マイトマイシン、ニトロカファン、ポリアクチンＡ、タモキシフェン、チオ−ＴＥＰＡ、カリケアマイシン、タキソール、ゲムシタビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ダウノルビシン、ドセタキセル、イリノテカン、エポチロンＢ、及びエポチロンＤである。抗腫瘍抗体の有利な例は、抗ＶＥＧＦＲ抗体、例えばＡｖａｓｔｉｎ(R)、又は他の抗体、例えばＨｅｒｃｅｐｔｉｎ(R)、Ｒｉｔｕｘａｎ(R)、Ｍｙｌｏｔａｒｇ(R)、及びＣａｍｐａｔｈ(R)である。
【００２２】
本発明の特に有利な一観点によれば、オリゴヌクレオチド分子は、更なる化学療法医薬と組み合わせて投与されてよく、特に有利にはビンクリスチンと組み合わせて投与されてよい。
【００２３】
更に、本発明のオリゴヌクレオチド分子は、薬剤スクリーニングのために、例えば、このオリゴヌクレオチド分子及びその標的タンパク質の相互作用を調節する、すなわち、刺激又は阻害する化合物の同定のために使用されてよい。
【００２４】
本発明の更なる一観点は、医薬における使用のための、例えば診断及び／又は治療適用のための、ＨＲＰ−３ポリペプチド、有利には哺乳類ＨＲＰ−３ポリペプチド、より有利にはヒトＨＲＰ−３ポリペプチド、又は、これをコードする核酸分子に関する。この観点は、ＨＲＰ−３が、哺乳類細胞、特に哺乳類繊維芽細胞、例えばＮＩＨ ３Ｔ３細胞（つまり、３Ｔ３プロトコルにより培養された初代マウス胚性繊維芽細胞）の細胞移動、増殖及び／又は足場独立成長の有力な細胞外阻害剤であるとの知見を基礎とする。
【００２５】
この実施態様において、このＨＲＰ−３ポリペプチドは、これを必要とする被験体、例えばヒト患者に直接的に投与されてよい。又は、ＨＲＰ−３ポリペプチドをコードする核酸分子はこの分野で知られている非ウィルス性又はウィルス性ベクター系を使用して投与されてよい。ＨＲＰ−３ポリペプチド又はこれをコードする核酸が、この活性剤の細胞外提示を可能にするプロトコルにより投与されることが有利である。
【００２６】
本発明のまた更なる一実施態様は、医薬における使用のための、例えば診断及び／又は治療的適用のための、ＨＲＰ−３アンタゴニストに関する。この実施態様は、ＨＲＰ−３がＨＵＶＥＣ細胞中で有力な血管形成促進性活性を有するとの知見に基づく。
【００２７】
ＨＲＰ−３ポリペプチドアンタゴニストは、ＨＲＰ−３に対して指向されている抗体又は抗体断片、例えばモノクローナル、キメラヒト化、ヒト又は組み換え抗体又はこの抗原結合断片であってよい。又は、このアンタゴニストは、核酸エフェクター分子、例えばアンチセンス分子、リボザイム、ＲＮＡ干渉剤、例えばｓｉＲＮＡ分子であってＨＲＰ−３発現を阻害及び／又は遮断できるもの、又は、上述のとおりの単鎖オリゴヌクレオチド分子であってよい。又は、このアンタゴニストは、アプタマー、例えば核酸分子であってＨＲＰ−タンパク質に結合し、その活性を阻害又は遮断するために選択されたものであってよい。
【００２８】
ＨＲＰ−３アンタゴニストは、活性剤を治療的有効量で含有する医薬組成物の形でこれを必要とする被験体に投与される。抗体、核酸エフェクター分子及びアプタマーを投与するためのプロトコルはこの分野で知られている。
【００２９】
本発明の剤は、上述のとおり、血管形成の阻害のために、特に血管形成に関連した状態又は疾病の診断及び／又は治療において、及び／又は過剰増殖症状又は疾病の診断及び治療において特に有用である。更に特に、本発明の剤は、血管形成関連病理学、例えば癌、特に神経癌、例えば神経芽腫、肝癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、又は神経学癌における診断及び治療に有用である。使用の更なる有利な分野は、眼科学、疼痛、心臓血管疾病、皮膚科学、感染疾病、例えばウィルス疾病、炎症及び自己免疫疾病、及び呼吸疾病を含む。
【００３０】
更に、本発明は以下の図面及び実施例によりより詳細に説明される。
【００３１】
図面の簡単な説明：
図１は、ＨＤＧＦファミリーの６部分のアラインメント及びＰＷＷＰドメインの構造的保存を示し、これは常に全てのファミリーメンバーのＮ末端に存在する。
図２は、ＨＲＰ−３によるＮＩＨ−３Ｔ３移動に対する阻害作用を示す。
図３及び４は、刺激２４時間後のＨＲＰ−３により誘発される用量依存性ＨＵＶＥＣ発芽を示す。
図５及び６は、ＨＵＶＥＣ細胞株中でのＨＲＰ−３刺激あり及びなしでのＶＥＧＦＲ−２ ｍＲＮＡ発現及びＶＥＧＦ ｍＲＮＡ発現をそれぞれ示す。
図７は、ＨＵＶＥＣ細胞株中でのＶＥＧＦ刺激あり及びなしでのＨＲＰ−３ ｍＲＮＡ発現を示す。
図８は、抗ＶＥＧＦ抗体Ａｖａｓｔｉｎ及びＨＲＰ−３ありでのＨＵＶＥＣ細胞の発芽試験を示す。
図９は、増加する量のＨＲＰ−３タンパク質の存在下でのＨＵＶＥＣ細胞移動アッセイを示す。
図１０は、様々な正常及び腫瘍性のヒト細胞株中でのＨＲＰ−３発現レベルを示す。ＲＮＡを細胞から抽出し、ＤＮアーゼ処理、レトロ転写及びリアルタイムＰＣＲ分析した。１８Ｓ ＲＮＡレベルを試料標準化のために使用した。ＨＲＰ−３タンパク質がヒト神経芽腫細胞株により高度にかつ選択的に発現されていることが見出された。
図１１はウェスタンブロットアッセイを示し、この場合にＨＲＰ−３タンパク質がＳＨＳＹ条件培地中で見出された。
図１２は、設計された二重鎖ＤＮＡの配列を示し、二重鎖２、３及び４には赤で下線を引いた塩基があり、Lukasik et al.の二重鎖で導入した変化を強調する（二重鎖１）。
図１３は、図１２のＤＮＡ二重鎖１（ＤＮＡ１）を用いた３Ｔ３移動ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを示す。
図１４−Ａ）は、神経芽腫及び非神経芽腫細胞株のＨＲＰ−３転写産物レベルを示す。ＲＮＡを細胞から抽出し、ＤＮアーゼ処理、レトロ転写及びリアルタイムＰＣＲ分析した。１８Ｓ ＲＮＡレベルを試料標準化のために使用した。平均発現値に応じて細胞株を上から下に配置した。神経芽腫細胞株は灰色で印をしてある。
図１４−Ｂ）は、神経芽腫及び非神経芽腫細胞によるＨＲＰ−３の発現及び分泌を示す。タンパク質を細胞ライセートから抽出するか又は濃縮し、この条件培地から沈殿させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分画し、ＨＲＰ−３についてイムノブロットした。ＧＡＤＰＨレベルを試料標準について測定した。このバンドの相対強度をImageJ softwareを用いて計算した。
図１４−Ｃ）は、ＳＨ−ＳＨ５Ｙ、Ｇｌ−Ｌｌ−Ｎ及びＨＴＬＡ２３０神経芽腫異種移植片のＨＲＰ−３タンパク質レベルを示す。異種移植片腫瘍組織又は正常マウス組織から抽出したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＨＲＰ−３についてイムノブロットした。精製したＨＲＰ−３タンパク質をポジティブコントロールとして使用した。ＧＡＰＤＨのタンパク質レベルを試料標準化のために使用した。バンドの定量化をImageJ softwareを用いて実施した。
図１５は、３７℃で０〜２５時間のマウス血清中でのインキュベーション後の配列番号４、５、６及び７の本発明によるオリゴヌクレオチド分子（それぞれ化合物ＢＮ２０３、ＢＮ２０４、ＢＮ２０５及びＢＮ２０６として示す）のゲル電気泳動分析を示す。
図１６は、配列 配列番号１１（化合物ＢＮ２１０として示す）のオリゴヌクレオチド分子の細胞毒性アッセイを示す。ＭＴＴ試験を、ＢＮ２１０又はコントロール試験物質を用いた２４、４８及び７２時間のインキュべーション後のＨｅｐＧ２及び神経芽腫細胞株Ｇｌ−Ｌ−ｌＮ、ＳＨ−ＳＹ及びＩＭＲ３２に対して実施した。ポジティブ及びネガティブコントロールを、それぞれ１０％又は０％のウシ血清を含有する細胞培地を用いて実施した。
図１７は、ビンクリスチン（ＶＩＮ）単独又は配列 配列番号１１（ＢＮ２１０）のオリゴヌクレオチド分子と組み合わせた場合のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性を示す。ＧＩ−Ｌ−ＩＮ神経芽腫細胞を０．１５〜５ｎＭの範囲の濃度でのビンクリスチンで、単独で用いて又は２５０ｎＭのＢＮ２１０と組み合わせて処理した。４８時間後にＭＴＴ試験を実施した。
図１８は、甲状腺刺激性の神経芽腫異種移植片に対する、化学療法剤ビンクリスチン（ＶＣＲ）と組み合わせた配列 配列番号１１（ＢＮ２１０）の本発明によるオリゴヌクレオチド分子のｉｎ ｖｉｖｏ活性の結果を示す。
図１９は、配列番号１のオリゴヌクレオチドがＨＲＰ−３誘発したＨＵＶＥＣの発芽を遮断できることを示す。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、ＨＤＧＦファミリーの６部分のアラインメント及びＰＷＷＰドメインの構造的保存を示す図である。
【図２】図２は、ＨＲＰ−３によるＮＩＨ−３Ｔ３移動に対する阻害作用を示す図である。
【図３】図３は、刺激２４時間後のＨＲＰ−３により誘発される用量依存性ＨＵＶＥＣ発芽を示す図である。
【図４】図４は、刺激２４時間後のＨＲＰ−３により誘発される用量依存性ＨＵＶＥＣ発芽を示す図である。
【図５】図５は、ＨＵＶＥＣ細胞株中でのＨＲＰ−３刺激あり及びなしでのＶＥＧＦＲ−２ ｍＲＮＡ発現を示す図である。
【図６】図６は、ＨＵＶＥＣ細胞株中でのＨＲＰ−３刺激あり及びなしでのＶＥＧＦ ｍＲＮＡ発現を示す図である。
【図７】図７は、ＨＵＶＥＣ細胞株中でのＶＥＧＦ刺激あり及びなしでのＨＲＰ−３ ｍＲＮＡ発現を示す図である。
【図８】図８は、抗ＶＥＧＦ抗体Ａｖａｓｔｉｎ及びＨＲＰ−３ありでのＨＵＶＥＣ細胞の発芽試験を示す。
【図９】図９は、増加する量のＨＲＰ−３タンパク質の存在下でのＨＵＶＥＣ細胞移動アッセイを示す図である。
【図１０】図１０は、様々な正常及び腫瘍性のヒト細胞株中でのＨＲＰ−３発現レベルを示す図である。
【図１１】図１１はウェスタンブロットアッセイを示す図である。
【図１２】図１２は、設計された二重鎖ＤＮＡの配列を示す図である。
【図１３】図１３は、図１２のＤＮＡ二重鎖１（ＤＮＡ１）を用いた３Ｔ３移動ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを示す図である。
【図１４】図１４は、神経芽腫及び非神経芽腫細胞株のＨＲＰ−３転写産物レベルを示す（Ａ）、神経芽腫及び非神経芽腫細胞によるＨＲＰ−３の発現及び分泌を示す（Ｂ）、ＳＨ−ＳＨ５Ｙ、Ｇｌ−Ｌｌ−Ｎ及びＨＴＬＡ２３０神経芽腫異種移植片のＨＲＰ−３タンパク質レベルを示す（Ｃ）図である。
【図１５】図１５は、３７℃で０〜２５時間のマウス血清中でのインキュベーション後の配列番号４、５、６及び７の本発明によるオリゴヌクレオチド分子（それぞれ化合物ＢＮ２０３、ＢＮ２０４、ＢＮ２０５及びＢＮ２０６として示す）のゲル電気泳動分析を示す図である。
【図１６】配列 配列番号１１（化合物ＢＮ２１０として示す）のオリゴヌクレオチド分子の細胞毒性アッセイを示す図である。
【図１７】図１７は、ビンクリスチン（ＶＩＮ）単独又は配列 配列番号１１（ＢＮ２１０）のオリゴヌクレオチド分子と組み合わせた場合のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性を示す図である。
【図１８】図１８は、甲状腺刺激性の神経芽腫異種移植片に対する、化学療法剤ビンクリスチン（ＶＣＲ）と組み合わせた配列 配列番号１１（ＢＮ２１０）の本発明によるオリゴヌクレオチド分子のｉｎ ｖｉｖｏ活性の結果を示す図である。
【図１９】図１９は、配列番号１のオリゴヌクレオチドがＨＲＰ−３誘発したＨＵＶＥＣの発芽を遮断できることを示す図である。
【００３３】
実施例
材料と方法
ＨＲＰ−３タンパク質供給源
このタンパク質をＧＳＴコンジュゲートとして市販の供給源から最初に獲得した。同時に、このｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲによりヒト細胞から獲得した。このＨＲＰ−３コード領域を、制限部位としてＥｃｏＲＩ及びＮｄｅｌを使用してｐＥＴ３０ベクター中にクローニングした。この組み換えタンパク質を大腸菌（E. CoIi）ＴＯＰＦ１０及び１２中で生産しポジティブクローンを獲得した。２つのポジティブクローンを配列決定して、その正確さを確かめ、両者ともに正確である。したがって、このタンパク質発現工程のために我々のポジティブクローンを大腸菌ＢＬ２１中に形質転換した。異なる条件の温度及び時間における我々のクローンのいくつかの発現アッセイ後に、ＨＲＰ−３を第１の工程のためにＨＰＬＣを用いてカチオン交換により、そして第２の工程のために疎水性精製を用いて精製した。組み換えタンパク質が完全に精製した後に、ＬＡＬ試験を実施し、エンドトキシンの非存在を確かめ、次いでこれを定量化した。
【００３４】
実施例１
ＮＩＨ ３Ｔ３繊維芽細胞のための抗移動剤としてのＨＲＰ−３
ＮＩＨ ３Ｔ３繊維芽細胞に対する報告されたＨＤＧＦ活性と類似して、ＰＷＷＰドメインに結合できるリガンドによるいかなる干渉活性も報告できる試験を開発すべく、これら細胞に対するＨＲＰ−３活性を試験することに決めた。増加する量のタンパク質の存在下での３Ｔ３細胞の移動及び増殖アッセイを実施した。これらアッセイは、ＨＲＰ−３タンパク質の強力な抗移動作用の定義を可能にし、これは３０ｎｇ／ｍＬで５％のＦＢＳにより２４時間で誘発される３Ｔ３移動の５０％を妨げることができる。この試験はバリデーションされ、今や良好に再現可能である、図２。
【００３５】
更に、ＨＲＰ−３が３Ｔ３増殖及び足場依存性成長を０．１ｎｇ／ｍＬで遮断することが見出された。これら全てのデータは、３Ｔ３細胞の強力な増殖及び移動を誘発する、ＨＤＧＦの作用とは対照的なＨＲＰ−３の作用を示す。
【００３６】
実施例２
ＨＵＶＥＣ細胞のための血管形成剤としてのＨＲＰ−３
ＨＤＧＦが、様々な種類の腫瘍において血管形成に関連することが見出され、この理由のために、我々はＢＡＥＣ及びＨＵＶＥＣとしての内皮初代細胞株に対するＨＲＰ−３の活性を試験した。ＢＡＥＣ及びＨＵＶＥＣ細胞に対する増殖に対する作用が見出されなかった一方で、ＨＲＰ−３は、２４時間の刺激後にＨＵＶＥＣ発芽を誘発できる。図３及び４に示されるとおり、ＨＲＰ−３は、用量依存的にＨＵＶＥＣ細胞において発芽を誘発できる。図４には、ネガティブコントロール及びポジティブコントロールを６０ｎｇ／ｍＬでＶＥＧＦを用いて示している。このデータからは、１００ｎｇ／ｍｌを超える濃度でＨＵＶＥＣ細胞に対する発芽をＨＲＰ−３が刺激することを実証した。我々の結果を確かめるために、実験を盲目的にも実施している。
【００３７】
内皮細胞機能性の他の重要な観点は新規血管を形成できる能力であり、したがってマトリゲル（Matrigel）中で管形成アッセイを実施した；予備試験によれば、ＨＲＰ−３は、２４時間後にＨＵＶＥＣの血管様網目を維持することができる（示さず）。
【００３８】
この刺激の分子的基盤を理解するために、リアルタイムＰＣＲによりＨＵＶＥＣ細胞株中でＨＲＰ−３のｍＲＮＡ発現を研究した。興味深いことに、このタンパク質は高レベルで発現していることが見出された。ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦＲ−２がＨＲＰ−３誘発機構に関連しているかどうかを理解するために、我々のＨＲＰ−３でもってＨＵＶＥＣ細胞を刺激し、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ−２、ＨＲＰ−３及びＨＤＧＦのｍＲＮＡレベルを検査した。これら遺伝子の発現はＨＲＰ−３により変化しなかった。図５及び６。
【００３９】
ＨＲＰ−３がＶＥＧＦによりその上で制御されているかどうかを理解するために、ＨＵＶＥＣ細胞を６０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦで処理し、次いでＨＲＰ−３ ｍＲＮＡレベルを測定した：ネガティブコントロールと処理細胞との間には有意差は存在しなかった（図７）。
【００４０】
この最後のデータからはＨＲＰ−３血管形成促進性活性がＶＥＧＦとは独立していることを認めることができる。
【００４１】
この証明は、治療的使用のために血管形成を遮断するために極めて重要である。
【００４２】
更に、ＶＥＧＦ独立性血管形成活性を確かめるために、我々はＡｖａｓｔｉｎ、抗ＶＡＧＦ抗体を用いてＶＥＧＦ及び我々のタンパク質の存在下で別の発芽試験を実施した。Ａｖａｓｔｉｎは、ＨＵＶＥＣ発芽をＶＥＧＦ媒介的に遮断できるが、ＨＲＰ−３媒介的でない、図８。
【００４３】
増加する量のこのタンパク質の存在下でのＨＵＶＥＣの移動アッセイを実施した（図９）。これらアッセイにより、用量依存的にヒトの内皮細胞に対するタンパク質の抗移動作用の定義が可能になり、これは１００ｎｇ／ｍｌで５％ＦＢＳにより５及び１６時間で誘発された移動の約８０％を妨げることができる。
【００４４】
実施例３
神経腫瘍中でのＨＲＰ−３発現レベル
以前の刊行物から、ＨＤＧＦ発現が様々なヒトの癌中でメラノーマ、結腸直腸、膵臓、胃、肝細胞及び肺の癌腫として増加することを我々は知っている。このため、ヒトの腫瘍細胞株中のＨＤＧＦタンパク質の特異的過剰発現をリアルタイムＰＣＲによりスクリーニングすることが決定され、そして、我々はこの基本のｍＲＮＡレベルが全ての細胞株に対してＨＲＰ−３よりも高いことを認め、そして、これまでにはＨＤＧＦが乳癌、神経芽腫、骨肉腫、リンパ腫、膵臓及び子宮のアデノカルシノーマ中で過剰発現することが見出されているが、しかしこの最大の過剰発現はヒトの肝臓細胞であるＣｈａｎｇ細胞株中で見出された。
【００４５】
ＨＲＰ３が、ＰＷＷＰ結合オリゴヌクレオチドを開発するためのモデルとして使用すべきＰＷＷＰ含有タンパク質としてだけ意図されるにもかかわらず、我々は、タンパク質が過剰発現している既知の病理学が存在するかどうかを知りたいと思った。アレイデータのバイオインフォマティクス的スクリーニングは、攻撃的なグレードのヒトのグリオーマ、子供の希有致死性腫瘍、中で特異的な高レベルの発現を示した。この過剰発現は、ＨＲＰ−３の提案された増殖性機能に関係しているかもしれず、したがって、我々はリアルタイムＰＣＲによりＣＮＳ腫瘍細胞株中のこのタンパク質の特異的過剰発現についてスクリーニングを開始した。興味深いことに、このタンパク質は、ＳＨ−ＳＹ５神経芽腫中で、そしてＮＳＣ３４、アミノプテリン感受性神経芽腫Ｎ１８ＴＧ２と運動ニューロン富化した胚性の１２〜１４日の脊髄細胞の融合により生産されたマウス−マウスの神経ハイブリッド細胞株のサブクローン中で過剰発現していることが見出された（図１０）。
【００４６】
この発現レベルは特異的であり、というのも他の脳の腫瘍株、例えば神経芽腫Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞株、又は他の組織由来の細胞は高レベルでこのタンパク質を発現しなかったからである。ＳＨ−ＳＹ５細胞は４歳の子供の骨髄に住み着く攻撃性の神経芽腫の二次転移から獲得した。神経芽腫は希少疾患（orphaned ref. ORPHA635）であり、このｉｎ ｖｉｔｒｏモデルは現在ではＳＨ−ＳＹ細胞により提示されている。
【００４７】
最近の知見は、正常の神経外胚葉由来の組織の発達を駆動する分子経路が、神経芽腫成熟化にも関連していてよいことを示唆している。血管形成は神経分化の間に鍵となる役割を果たし、神経及びグリアの両者に栄養活性を発揮している。血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を含む、ＮＢｓにおける血管形成の誘発における重要な役割を果たすためにこれまでに種々の血管形成因子が同定されている。増加する量のタンパク質の存在下でのＳＨ−ＳＹ５及びＮＣＳ−３４細胞の増殖アッセイを実施した。これらアッセイにより、ＳＨＳＹに対してだけこのタンパク質の抗増殖性作用の定義が可能になり、これは１００ｎｇ／ｍＬで５％のＦＢＳにより２４及び４８ｈで誘発されたＳＨ−ＳＹ５増殖の２５％を妨げることが可能である。
【００４８】
神経芽腫の内部では、神経芽腫細胞が、内皮細胞中で新規の血管形成プロセスを助けることができる溶解性ＨＲＰ−３を産生すると我々は推測する。この理論を支持する結果、我々はＨＲＰ３タンパク質をＳＨＳＹ条件培地中でウェスタンブロットアッセイにより見出す、図１１。これは、ＨＤＧＦ及びＨＲＰ−３の両者がＳＨＳＹ細胞において高度に発現するが、ＨＲＰ−３だけが培地中に存在することを確認する。
【００４９】
我々の理論を更に支持するために、様々な神経芽腫細胞株を選択し、このＨＲＰ−３ ｍＲＮＡ及びタンパク質発現レベルを分析した。図１４Ａに示されるとおり、ＨＲＰ−３タンパク質が神経芽腫細胞株中に、検査した他の腫瘍細胞及び正常細胞株に比較してより高レベルで存在することが見出された。
【００５０】
次の工程として、ＨＲＰ−３が神経芽腫細胞により細胞外区画中に放出されるかどうかを分析した。１０つの神経芽腫細胞株の条件培地を濃縮し、タンパク質を沈殿させ、ウェスタンブロット分析によりＨＲＰ−３の存在について分析した。図１４−Ｂに示されるとおり、Ｇｌ−Ｌｌ−Ｎ、ＮＸＳ２、ＩＭＲ３２、ＨＴＬＡ２３０、ＬＡＮ５及びＳＫＮＢＥ２細胞を含む大抵の神経芽腫細胞株は、ＨＲＰ−３をその培養培地中に分泌する。
【００５１】
更に、我々は２つの以前に説明されているマウスモデルの神経芽腫、同所（orthotopic）異種移植片モデル及び偽転移性異種移植片モデル由来の腫瘍組織中のＨＲＰ−３発現を分析した（Pastorino et al., 2003; Marimpietri et al., 2007）。副腎中へのＧｌ−Ｌｌ−Ｎ細胞の同所注射が局所的な腫瘍の発達を生じた一方で、偽転移性モデル中へのＨＴＬＡ２３０細胞の静脈内注射は腎臓中での転移発達を生じた。両者の腫瘍中のＨＲＰ−３タンパク質のレベルをウェスタンブロット分析により分析し、未処理の健康なマウスの腎臓及び副腎中のＨＲＰ−３発現と比較した。図１４Ｃに示されるとおり、ＨＲＰ−３は、副腎及び脳組織中で発現することが見出され、その一方で腎臓及び肝臓組織は極めて低いレベルのＨＲＰ−３を含有した。重要なことに、ＨＴＬＡ２３０及びＧｌ−Ｌｌ−Ｎ腫瘍組織中のＨＲＰ−３タンパク質レベルはそれぞれの宿主組織中のレベルを超えた。
【００５２】
したがって、神経芽腫組織によるＨＲＰ−３発現及び分泌が異常なまでに高いＨＲＰ−３レベルを細胞外腫瘍環境において生じることを結論付けることができる。
【００５３】
実施例４
オリゴヌクレオチドによるＨＲＰ−３ターゲッティング
二重鎖ＤＮＡとの複合体にあるＰＷＷＰドメインの利用可能な構造を基礎として、短い（１５ｂｐ）二重鎖ＤＮＡ及び３つの派生ＤＮＡ二重鎖をＨＲＰ３をターゲッティングするために設計した（図１２）。この設計したＤＮＡの配列は図面中で左側に示され、Lukasik et alの二重鎖（二重鎖１）で導入された変化を強調して赤及び下線を引いた塩基を有する。この二重鎖は様々な分子形状を試験するために（二重鎖３）、そして、この結合のためにいかにこの配列が重要であるかを理解するために設計されている（二重鎖２及び４）。
【００５４】
４つの全てのＤＮＡ二重鎖を、これらがそのＰＷＷＰドメインに結合することによりＨＲＰ−３機能を妨げることができるかどうかを確認するために、我々の３Ｔ３移動ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて試験した（図１３）。図１３では、この左から最初の欄がＦＢＳを用いたコントロールの移動を、そして、この左から二番目の欄がＦＢＳなしのコントロールの移動を示す。この左から三番目の欄はネガティブコントロールである。この左から四番目の欄はＨＲＰ−３の存在における移動阻害を示す。この左から五番目の欄は１０００ｎＭの濃度での二重鎖（ＤＮＡ１）はＦＢＳを用いたコントロールと比較して移動に対するいかなる影響をも有さないことを示す。この更なるデータはＤＮＡ１がＨＲＰ−３の抗移動作用を濃度依存的に阻害することを示す。特に、ＤＮＡ１の２５０ｎＭの濃度では、３Ｔ３細胞の移動がＦＢＳを用いたコントロールと匹敵する。このように、二重鎖１は、ＨＲＰ−３のタンパク質作用を消滅させることができる。この作用は用量依存的であり、かつ、特異的にその構造に関連し、というのも単鎖はいかなる活性をも示さないからである。
【００５５】
我々は二重鎖２のわずかな活性だけを見出し、二重鎖３及び４の活性は見出さなかった。これらの最後のデータは特に興味深いものであり、というのもこれらはこの結合が主としてこのオリゴの構造−特異的活性で当然であることを確認するからである。
【００５６】
更に、これはＨＵＶＥＣ細胞に対して活性があるので、我々は移動アッセイを実施し、この場合に二重鎖１は５０ｎＭの濃度でＨＲＰ−３の完全に抗移動性の活性を回復できる（データ示さず）。
【００５７】
修飾した単鎖オリゴヌクレオチドを用いてヒトの内皮細胞発芽に対するこのタンパク質の作用を遮断することを２回試みた。組み換えタンパク質、及び合成オリゴ、配列番号１、２及び３を用いる試料においては、この発芽した球状体の数は組み換えタンパク質を用いた試料に比較して減少している（図１９）。
【００５８】
この結果から出発して、我々は、マウス血清中で改善された耐性を有する、本発明によるヘアピン構造を有するオリゴヌクレオチド配列を獲得した（図１５）。化学修飾の導入により、例えば、２′−ＯＭｅ、２′Ｆ又は逆転した極性の導入により、より良好なファーマコキネティック特性を有する本発明による分子配列を我々は設計した。これら配列は有利には線状及び分枝鎖状ＰＥＧでもってコンジュゲートされていてよい。
【００５９】
以下の本発明による配列においては、下線を引いたか又は星印を付したモノマーが修飾ヌクレオチド構成ブロックである：この下線を引いたモノマーは合成の２′−ＯＭｅ ＲＮＡ構成ブロックであり、かつ、星印を付したモノマーは末端基ＮＨ２を５′（５′−アミノ基）に有するヌクレオチド構成ブロックであり、これはＰＥＧ単位とアミド結合を形成できる。モノマー「ｉＡ」は、逆転した極性を指し、すなわち、３′−３′の逆位連結を有する構成ブロックである。
【００６０】
配列
【００６１】
実施例５
細胞毒性試験
結合（ref. Lukasik et al., 2006）、及び、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの溶解性ＨＲＰ−３の血管形成促進性作用の遮断（データ示さず）のためのこれら配列の能力から出発して、我々は、図１６で示されるように、様々な細胞株中での配列番号１１（化合物名ＢＮ２１０で同定）の細胞毒性、及びｉｎ ｖｉｖｏでのその急性毒性を試験することを決定した。
【００６２】
我々はＢＮ２１０の急性毒性をｉｎ ｖｉｖｏで評価した。２１．８〜２２．９ｇの重さの３０匹のＣＤ−１雌マウス（Charles River Italia s.r.l., Via Indipendenza, 11 23885 CALCO (Lecco)）を５匹の動物毎の、６つの群にわけ、マクロロンケージ（タイプＩＩＩ）中で室温２２±３℃及び相対湿度５５±１５％で飼育した。空気交換は１８０〜２２０／時間である。リン酸緩衝食塩水中に溶解したＢＮ２１０の３つの用量を試験した：３、１０及び３０ｍｇ／ｋｇを静脈内に（ｉ．ｖ．、尾静脈を介して）又は腹腔内に（ｉ．ｐ．）投与した。ＢＮ２１０濃度はこの処方物中でそれぞれ０．１５５、０．５１７及び１．５５１ｍｇ／ｍｌであった。マウスを、薬物投与後１４日間にわたり毒性徴候の外観について毎日、２回／日観察した。アーヴィン試験（Irvin test）において普通チェックするパラメーターを考慮した。この観察期間を通じて臨床的又は挙動変化の徴候はｉ．ｖ．又はｉ．ｐ．のいずれかで投与されたこの全ての３つの用量で検出されなかった。観察１４日後に全てのマウスを屠殺し、明白な病理学的検査のために解剖した。この剖検の間の全ての徴候又は病理学的変化が精査の対象であった。巨視的徴候又は病理学的変化はこの剖検検査の間に検出されなかった。
【００６３】
ＢＮ２１０が、ビンクリスチン、臨床使用において最も有力な化学療法剤の１つ、との相乗作用を有する可能性を更に試験した。このために、２５０ｎＭのＢＮ２１０単独で、又は様々な濃度のビンクリスチンと組み合わせて、Ｇｌ−Ｌ−ｌＮ神経芽腫細胞でＭＴＴ試験を実施した。図４に示されるように、ビンクリスチンが２．５〜５ｎＭの濃度でＧｌ−Ｌｌ−Ｎ細胞の増殖を阻害することができた一方で、２５０ｎＭのＢＮ２１０の添加はビンクリスチン処理の作用を促進も阻害もしなかった。更に、ＢＮ２１０単独、又はＰＥＧ後端部単独、は、Ｇｌ−Ｌｌ−Ｎ細胞に対していかなる細胞毒性作用も示さなかった。
【００６４】
実施例６
ｉｎ ｖｉｖｏモデル
以前の実験において、ＢＮ２１０は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで抗血管形成作用を有することが示されている（データ示さず）。したがって、腫瘍血管形成のモデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏでＢＮ２１０の効力を試験した。神経芽腫を腫瘍モデルとして選択し、というのもＨＲＰ−３は原則的にマウス中の神経系で発現するからであり、そして以前の実験はＨＲＰ−３が、様々なヒトの神経芽腫細胞株の条件培地中に存在し、かつ、過剰発現することを示している。ＨＲＰ−３は試験した細胞株のいずれの増殖にも作用しないので、細胞毒性剤、ビンクリスチンと組み合わせてＢＮ２１０を使用することが適当であることが見出された。
【００６５】
マウスを特定の病原体フリーの条件下で飼育した。このｉｎ ｖｉｖｏ実験を５週齢の雌の無胸腺（ヌードnu）マウスを使用して実施した。マウスをキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）及びケタミン（９０ｍｇ／ｋｇ）の混合物で麻酔処理し（Imalgene 1000, Merial Italia S.p.A., Milan,イタリア）、開腹手術し、神経芽腫（ＮＢ）細胞株、Ｇｌ−Ｌｌ−Ｎ（１０μｌの食塩水溶液／マウス中１．５×１０6細胞）で、左の副腎の包中に同所的に注射した、これは以前に報告されているとおりである（Pastorino F. et al., Cancer Res 63, 2003; Pastorino F. et al., Clin Cancer Res 2008）。腫瘍細胞移植後に死亡率は観察されなかった。ＮＢ腫瘍を２２日間にわたりこの注射した細胞から成長させ、次いで動物をランダムに３つの群に分けた。１つの群は５週間にわたり週に一回ビンクリスチン１ｍｇ／ｋｇを用いて、ｉ．ｖ．処理した（ＶＣＲ、全部で５投与）。第２の群の動物をＶＣＲ（１ｍｇ／ｋｇのｉ．ｖ．注射、５週間にわたり週に１回、全部で５投与）、及び、ＢＮ２１０（７ｍｇ／ｋｇのｉ．ｐ．注射、５日／週、全部で２０投与）の組み合わせで処理した。ネガティブコントロールマウスをＨＥＰＥＳ緩衝食塩水で処理した。生存実験における実験群（ｎ＝８マウス／群）の間での差異の有意性を、カイ二乗ログランク試験を使用してカプラン・マイヤー曲線により決定した。これら知見はＰ値が＜０．０５である場合に有意であるとみなされた。
【００６６】
同所性神経芽腫（ＮＢ）異種移植片に対するビンクリスチン（ＶＣＲ）と組み合わせた配列 配列番号１１（ＢＮ２１０）のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性
ＶＣＲ単独投与と比較して、ＢＮ２１０がＮＢ異種移植片中でＶＣＲの治療作用を改善するために使用できるかどうかを決定するために、Ｇｌ−Ｌｌ−Ｎ細胞をヌードマウスの左の副腎中に注入し、約２００ｍｍ3ｍｐサイズに達するまで成長させた（２２日）。ＮＢ腫瘍を有するマウスを次いで、上で報告されているとおり、週毎の間隔で薬剤で処理した。図１８に示されているとおり、ＶＣＲ単独で処理した（１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．、この実験において治療量以下の用量）ＮＢを有するマウスは、ネガティブコントロールマウスに比較してその寿命のいかなる増加も示さなかった。対照的に、ＶＣＲ＋ＢＮ２１０の組み合わせで処理したマウスは、ネガティブコントロール及びＶＣＲ処理群に比較してその寿命の統計学的に有意な増加を有した（ｐ＝０．００５８）（図１８）。
【技術分野】
【０００１】
発明の詳細な説明
本発明はＰＷＷＰドメインを有するタンパク質の活性を調節するための剤に関する。
【０００２】
ＰＷＷＰドメインは、「ＨＤＧＦファミリー」として知られるタンパク質のファミリー中に見出される保存された構造モチーフである。このファミリーは６つのタンパク質を包含する：原型タンパク質、ＨＤＧＦ；ＨＲＰ−１、ＨＲＰ−２、ＨＲＰ−３、ＨＲＰ−４（ＨＲＰ＝ＨＤＧＦ関連タンパク質（ＨＤＧＦ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ））；及びＬＥＤＧＦ。図１は、この６つのタンパク質のアラインメント及びこのＰＷＷＰドメインの構造的保存を示し、これは常に全てのファミリーメンバーのＮ末端に存在する。更に、ＰＷＷＰドメインと２つの非関連タンパク質のオリゴヌクレオチド結合ドメインとの間の構造的相同性も強調されている；この相同性はオリゴヌクレオチド結合において推定上保存される役割を指し示す。この結論は最近になって、ＨＲＰ−３のＰＷＷＰドメインと二重鎖ＤＮＡとの間での複合体の構造のＮＭＲの解明により支持され、これは、マイクロモーラー（μＭ）の親和性で少なくとも１のｄｓ ＤＮＡで結合するＰＷＷＰドメインの能力を確認した。ＰＷＷＰドメインが、オリゴヌクレオチドと結合できるという事実は、治療的及び診断的使用のための短鎖オリゴヌクレオチドによるＨＤＧＦファミリー中のタンパク質のターゲッティングの道をひらく。
【０００３】
本発明者らは、ＰＷＷＰドメインタンパク質の新規生物学的活性を同定した。特に、ＨＲＰ−３は、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞の移動、増殖及び／又は足場形成独立成長を阻害することができることが見出された。更に、ＨＲＰ−３は、ＨＵＶＥＣ細胞に対する血管形成促進剤として作用することが見出された。更に、ＨＲＰ−３は、神経腫瘍中で、特に神経芽腫細胞中で過剰発現することが見出された。最後に、本発明者らは、高い親和性でもってＰＷＷＰドメインに結合でき、このようにしてＰＷＷＰドメインタンパク質の活性を阻害できる新規の単鎖オリゴヌクレオチド分子を同定した。
【０００４】
本発明の第１の観点は、ＰＷＷＰドメインタンパク質に結合でき、かつ、ＰＷＷＰドメインタンパク質、例えばＨＲＰ−３及びＨＤＧＦにより誘発される生物学的作用を阻害及び／又は遮断できる単鎖オリゴヌクレオチド分子に関する。
【０００５】
本発明の主題は、配列
【化１】
［式中、Ｙ及びＺはヌクレオチド又はヌクレオチドアナログ構成ブロックを示す、
その際、それぞれのＹ及びＺは互いと一緒に塩基対、特にワトソン−クリック塩基対を形成し、Ｘ1及びＸ2は独立してポリ（アルキレングリコール）単位を含む基から選択される、
ｎ及びｍは独立して０又は１を示し、その際ｎ及びｍの少なくとも１つは１である、
ｓは１〜２０、有利には５〜１８の整数である、
Ｂは架橋基である］
を含む単鎖オリゴヌクレオチド分子である。
【０００６】
有利には、本発明は、配列
【化２】
［式中、Ａ、Ｃ、Ｔ及びＧはヌクレオチド又はヌクレオチドアナログ構成ブロックを示す、
Ｘ1及びＸ2は独立してポリ（アルキレングリコール）単位を含む基から選択される、
ｎ及びｍは独立して０又は１を示し、その際ｎ及びｍの少なくとも１つは１である、かつ
Ｂは架橋基を示す］
を含む単鎖オリゴヌクレオチド分子に関する。
【０００７】
このオリゴヌクレオチド分子は、互いと一緒に塩基対、特にワトソンクリック塩基対を形成できるヌクレオチド又はヌクレオチドアナログ構成ブロックを含む。有利にはこの構成ブロックは、「Ａ」、「Ｃ」、「Ｔ」及び「Ｇ」から選択される。この「Ａ」構成ブロックは、核酸塩基アデニン又はそのアナログであって相補性核酸塩基「Ｔ」と塩基対を形成できるもの含む構成ブロックから選択される。この「Ｃ」構成ブロックは、核酸塩基シチジン又はそのアナログであって相補性核酸塩基「Ｇ」と塩基対を形成できるものを含む構成ブロックから選択される。この「Ｔ」構成ブロックは、核酸塩基チミン又はそのアナログであって相補性核酸塩基「Ａ」と塩基対を形成できるもの、例えば核酸塩基ウラシル（代わりに「Ｕ」構成ブロックとしても同定される）を、そしてこの「Ｇ」構成ブロックは核酸塩基グアニン又はそのアナログであって相補性核酸塩基「Ｃ」と塩基対を形成できるものを含む。
【０００８】
構成ブロックＡ、Ｃ、Ｔ及びＧは有利には、デオキシリボヌクレオチド構成ブロック、修飾デオキシリボヌクレオチド構成ブロック、リボヌクレオチド構成ブロック、修飾リボヌクレオチド構成ブロック、ヌクレオチドアナログ構成ブロック、特にＰＮＡ、ＬＮＡ又はモルホリノ構成ブロック又はその組み合わせから選択される。修飾デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド構成ブロックの例はヌクレオチドであって、このリボース糖の２′−Ｃ原子がハロゲン、例えばＦ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ、シアノ、アルキル、例えばＣ1〜Ｃ6−アルキル、アルケニル、例えばＣ2〜Ｃ6−アルケニル、アルキニル、例えばＣ2〜Ｃ6−アルキニル、アミノ、モノ−又はジ−アルキル置換アミノ、例えばＣ1〜Ｃ6−アルキルアミノ、アルコキシ、例えばＣ1〜Ｃ6−アルコキシで置換されたものであり、この場合にアルキル、アルケニル及びアルキニル基は非置換であるか又はハロゲン、ヒドロキシ−又はアルコキシ基により一又は多置換されていてよい。構成ブロックの更なる例は、糖−リン酸骨格のリン原子で生じる修飾を有するオリゴヌクレオチドアナログであり、これは例えばホスホロチオアート、メチルホスホナート、ホスホロアミダート及びホスホトリエステルである（例えば、Cohen, J. S., ed. Oligonucleotides: Antisense Inhibitors of Gene Expression,（CRC Press, Inc., Boca Raton FIa., 1989）。有利な例は、ペプチド核酸、（ＰＮＡ）、ヒドロキシプロリンペプチド核酸（ＨｙｐＮＡ）、セリンペプチド核酸（ＳｅｒＮＡ）を含む（例えばWO 2001/068673−オリゴヌクレオチドアナログ、その合成方法及び使用方法）。モルホリノ及び複素環式アナログ、２′−修飾ヌクレオシド、例えば２′Ｆ ＲＮＡ又は２′ＯＭｅＲＮＡ、コンフォメーションが制限されたヌクレオチド、二、三又は多環式ヌクレオシドアナログ、例えばａ−ビシクロ−ＤＮＡ、８−ビシクロＤＮＡ５′，６′ビシクロ−ＤＮＡ、ロックトヌクレオシドアナログ（ＬＮＡ）、及び、スピロ基を含むアナログ（cf. Velazquez S, San Felix A, Perez-Perez MJ, Balzarini J, De Clercq E1 Camarasa MJ. lnt Conf AIDS. 1992 JuI 19-24; 8:スペインにより説明されたとおり）、熱不安定性保護基、例えばプロドラッグとしての４−メチルチオ−１−ブチル基を有するオリゴヌクレオチド性アナログ（cf. Beaucage SL, Curr Protoc Nucleic Acid Chem. ２００４年１２月;第３章:3.11セクションにより説明されたとおり）、２′−５′連結したオリゴヌクレオチド、又は５′−５′又は３′−３′連結を有するオリゴヌクレオチド（逆転アミダイト（reversed amidite）の使用による連結逆位（linkage inversion））。
【０００９】
極めて有利な構成ブロックＡ、Ｃ、Ｔ及びＧはデオキシリボヌクレオチド構成ブロック、リボヌクレオチド構成ブロック、修飾リボヌクレオチド構成ブロック、有利には２′−ＯＭｅリボヌクレオチド構成ブロック及び逆転リボヌクレオチド構成ブロックであって３′−３′連結逆位を形成するものから選択される。
【００１０】
本発明の単鎖オリゴヌクレオチド分子は、この分子の５′−及び３′−末端に存在する基Ｘ1及び／又は基Ｘ2をそれぞれ含む。一実施態様において、オリゴヌクレオチド分子はＸ1及びＸ2基の両者を含む。更なる一実施態様において、この分子はＸ1基だけを含み、また更なる実施態様においてＸ2基だけを含む。
【００１１】
この基Ｘ1及びＸ2は、オリゴヌクレオチド分子を安定化できる基から選択される。有利には、Ｘ1及びＸ2は、線状又は分枝鎖状ポリ（Ｃ2〜Ｃ3−アルキレングリコール）単位、特にポリ（エチレングリコール）単位を含む基から選択される。これら単位は有利には、２００〜１０００００Ｄａ、特に有利に３００〜５００００Ｄａの範囲内の分子量を有する。特に有利な一実施態様において、このポリ（エチレングリコール）単位は、分枝鎖状ポリ（エチレングリコール）単位であってそれぞれ２０ｋＤａの２個のポリ（エチレングリコール）鎖を有するものであり、すなわち、分子量４００００Ｄａを有する分枝鎖状ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ（４０ＫＤａ））である。
【００１２】
更に、本発明のオリゴヌクレオチド分子は、架橋単位Ｂを含み、これは組立場（scaffold）を提供し、これによりこの分子内での５′−及び３′−自己相補的オリゴヌクレオチド間での二重鎖ステム構造の形成が可能になる。架橋単位の長さは有利には１〜２０ヌクレオチド性又は非ヌクレオチド性構成ブロックである。有利にはこの架橋単位は、（ｉ）少なくとも３つの対になっていないヌクレオチド又はヌクレオチドアナログ構成ブロックのヌクレオチド性スペーサー配列、又は、（ｉｉ）非ヌクレオチド性スペーサー配列、例えば少なくとも３つのエチレングリシド単位の、有利には少なくとも５つのエチレングリコール単位のポリ（エチレングリコール）スペーサー配列を含む。
【００１３】
より有利には、この架橋単位は、３つの「Ａ」構成ブロック、例えばデオキシリボヌクレオチド配列ＡＡＡ又はポリ（エチレングリコール）スペーサー配列であって３〜１０、有利には５〜１０、例えば３、５、７又は１０つのエチレングリコール単位を含むものを含む。より有利には、この架橋単位の３つの「Ａ」構成ブロックは、２′ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド構成ブロック、例えば修飾リボヌクレオチド配列ＡＡＡ（２′−ＯＭｅ）を含む。
【００１４】
本発明のオリゴヌクレオチド分子は、有利には、ＰＷＷＰドメインタンパク質、例えばＨＤＧＦ、ＨＤＧＦ−２、ＨＲＰ−１、ＨＲＰ−２、ＨＲＰ−３、ＨＲＰ−４及び／又はＬＥＤＧＦ、特にＨＲＰ−３及び／又はＨＤＧＦを阻害できる。有利にはＰＷＷＰドメインは、Prosite PS50821、Pfam PF00855又はInterPRO IPR000313で定義されているとおりである。
【００１５】
ＰＷＷＰドメインタンパク質は有利には、哺乳類タンパク質、より有利にはヒトタンパク質、例えばヒトＨＤＧＦ（Swiss Prot. No. P51858/ Q7Z4S4/Q7Z4S5）、ヒトＨＤＧＦ−２（Swiss Prot. No. Q7Z4V5）、ヒトＨＲＰ−３（Swiss Prot. No. Q9Y3E1）、及び／又はヒトＬＥＤＧＦ（Swiss Prot. No. 075475）である。本発明のオリゴヌクレオチド分子は有利には、ＰＷＷＰドメインの生物学的活性、例えば血管形成促進性活性を阻害できる。
【００１６】
有利な一実施態様において、このオリゴヌクレオチドは、少なくとも１０μＭ、有利には少なくとも１００μＭ、特に有利には少なくとも１０００μＭの親和性でＰＷＷＰドメインタンパク質に結合する。更なる有利な一実施態様において、このオリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ｎＭ、有利には少なくとも１００ｎＭ、特に有利には少なくとも１０００ｎＭの親和性でＰＷＷＰドメインタンパク質に結合するタンパク質へのこのオリゴヌクレオチドの結合は、ビアコア（Biacore）システム、円二色性又は電気泳動技術、例えばキャピラリー電気泳動によって決定されてよい。
【００１７】
本発明のオリゴヌクレオチド分子は、医薬において、例えばヒト又は獣医学的医薬において、診断及び／又は治療適用のために使用されてよい。例えば、このオリゴヌクレオチド分子は、ＰＷＷＰドメインタンパク質機能障害、特にＰＷＷＰドメインタンパク質過剰発現及び／又は過剰活性に関連、付随する、かつ／又はこれにより引き起こされる状態又は疾病の診断及び治療において使用されてよい。
【００１８】
より有利には、このオリゴヌクレオチド分子は、血管形成に関連した疾病、例えば癌、例えば神経癌、例えば神経芽腫、メラノーマ、結腸直腸癌、膵癌、胃癌、肝細胞癌及び肺癌の診断及び治療における使用のためである。特に有利な一実施態様において、このオリゴヌクレオチド分子は、例えば、神経癌、例えば神経芽腫におけるＨＲＰ−３の生物学的活性の阻害及び／又は遮断における使用のためである。
【００１９】
本発明のオリゴヌクレオチドは、これを必要とする被験体に、活性剤及び医薬的に許容可能な担体、希釈剤及び／又は助剤を含んでよい医薬組成物として投与されてよい。この医薬組成物は、任意の適した形態にあってよく、例えば腸管外、局所的、肺の投与その他のためであってよい。有利には、この医薬組成物は、例えば注射又は輸液による腸管外投与のために適している。
【００２０】
医薬組成物は、これを必要とする被験体に、疾病の種類及び深刻度及び投与経路に依存して、治療的有効用量、例えば、一日あたり０．００１〜１０００ｍｇ以上で投与される。
【００２１】
本発明のオリゴヌクレオチド分子は単独療法として又は更なる療法、例えば放射線、手術及び／又は更なる医薬、例えば抗癌医薬、例えば化学療法剤及び／又は抗腫瘍抗体の投与と組み合わせて投与されてよい。化学療法剤の有利な例は、チューブリン安定化剤、チューブリン脱安定化剤、代謝拮抗剤、プリン合成阻害剤、ヌクレオシドアナログ、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡ修飾剤、及び血管破砕剤である。化学療法剤の特定の例は、アミノグルテチミド、アミノプテリン、アナストロゾール、アンシタビン、ビモラン、５−ブロモウラシル、カンプトテシン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、クロロメチン、シスプラチン、クロドロン酸二ナトリウム、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ドキソルビシン、エチルイミナム（ethyliminum）、エトポシド、フロクスウリジン、５−フルオロウラシル、フルタミド、フトラフ−ル（ftorafur）、ヒドロキシ尿素、イソホスファミド、イオムスチン、メルカプトプリン、メトトレキセート、マイトマイシン、ニトロカファン、ポリアクチンＡ、タモキシフェン、チオ−ＴＥＰＡ、カリケアマイシン、タキソール、ゲムシタビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ダウノルビシン、ドセタキセル、イリノテカン、エポチロンＢ、及びエポチロンＤである。抗腫瘍抗体の有利な例は、抗ＶＥＧＦＲ抗体、例えばＡｖａｓｔｉｎ(R)、又は他の抗体、例えばＨｅｒｃｅｐｔｉｎ(R)、Ｒｉｔｕｘａｎ(R)、Ｍｙｌｏｔａｒｇ(R)、及びＣａｍｐａｔｈ(R)である。
【００２２】
本発明の特に有利な一観点によれば、オリゴヌクレオチド分子は、更なる化学療法医薬と組み合わせて投与されてよく、特に有利にはビンクリスチンと組み合わせて投与されてよい。
【００２３】
更に、本発明のオリゴヌクレオチド分子は、薬剤スクリーニングのために、例えば、このオリゴヌクレオチド分子及びその標的タンパク質の相互作用を調節する、すなわち、刺激又は阻害する化合物の同定のために使用されてよい。
【００２４】
本発明の更なる一観点は、医薬における使用のための、例えば診断及び／又は治療適用のための、ＨＲＰ−３ポリペプチド、有利には哺乳類ＨＲＰ−３ポリペプチド、より有利にはヒトＨＲＰ−３ポリペプチド、又は、これをコードする核酸分子に関する。この観点は、ＨＲＰ−３が、哺乳類細胞、特に哺乳類繊維芽細胞、例えばＮＩＨ ３Ｔ３細胞（つまり、３Ｔ３プロトコルにより培養された初代マウス胚性繊維芽細胞）の細胞移動、増殖及び／又は足場独立成長の有力な細胞外阻害剤であるとの知見を基礎とする。
【００２５】
この実施態様において、このＨＲＰ−３ポリペプチドは、これを必要とする被験体、例えばヒト患者に直接的に投与されてよい。又は、ＨＲＰ−３ポリペプチドをコードする核酸分子はこの分野で知られている非ウィルス性又はウィルス性ベクター系を使用して投与されてよい。ＨＲＰ−３ポリペプチド又はこれをコードする核酸が、この活性剤の細胞外提示を可能にするプロトコルにより投与されることが有利である。
【００２６】
本発明のまた更なる一実施態様は、医薬における使用のための、例えば診断及び／又は治療的適用のための、ＨＲＰ−３アンタゴニストに関する。この実施態様は、ＨＲＰ−３がＨＵＶＥＣ細胞中で有力な血管形成促進性活性を有するとの知見に基づく。
【００２７】
ＨＲＰ−３ポリペプチドアンタゴニストは、ＨＲＰ−３に対して指向されている抗体又は抗体断片、例えばモノクローナル、キメラヒト化、ヒト又は組み換え抗体又はこの抗原結合断片であってよい。又は、このアンタゴニストは、核酸エフェクター分子、例えばアンチセンス分子、リボザイム、ＲＮＡ干渉剤、例えばｓｉＲＮＡ分子であってＨＲＰ−３発現を阻害及び／又は遮断できるもの、又は、上述のとおりの単鎖オリゴヌクレオチド分子であってよい。又は、このアンタゴニストは、アプタマー、例えば核酸分子であってＨＲＰ−タンパク質に結合し、その活性を阻害又は遮断するために選択されたものであってよい。
【００２８】
ＨＲＰ−３アンタゴニストは、活性剤を治療的有効量で含有する医薬組成物の形でこれを必要とする被験体に投与される。抗体、核酸エフェクター分子及びアプタマーを投与するためのプロトコルはこの分野で知られている。
【００２９】
本発明の剤は、上述のとおり、血管形成の阻害のために、特に血管形成に関連した状態又は疾病の診断及び／又は治療において、及び／又は過剰増殖症状又は疾病の診断及び治療において特に有用である。更に特に、本発明の剤は、血管形成関連病理学、例えば癌、特に神経癌、例えば神経芽腫、肝癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、又は神経学癌における診断及び治療に有用である。使用の更なる有利な分野は、眼科学、疼痛、心臓血管疾病、皮膚科学、感染疾病、例えばウィルス疾病、炎症及び自己免疫疾病、及び呼吸疾病を含む。
【００３０】
更に、本発明は以下の図面及び実施例によりより詳細に説明される。
【００３１】
図面の簡単な説明：
図１は、ＨＤＧＦファミリーの６部分のアラインメント及びＰＷＷＰドメインの構造的保存を示し、これは常に全てのファミリーメンバーのＮ末端に存在する。
図２は、ＨＲＰ−３によるＮＩＨ−３Ｔ３移動に対する阻害作用を示す。
図３及び４は、刺激２４時間後のＨＲＰ−３により誘発される用量依存性ＨＵＶＥＣ発芽を示す。
図５及び６は、ＨＵＶＥＣ細胞株中でのＨＲＰ−３刺激あり及びなしでのＶＥＧＦＲ−２ ｍＲＮＡ発現及びＶＥＧＦ ｍＲＮＡ発現をそれぞれ示す。
図７は、ＨＵＶＥＣ細胞株中でのＶＥＧＦ刺激あり及びなしでのＨＲＰ−３ ｍＲＮＡ発現を示す。
図８は、抗ＶＥＧＦ抗体Ａｖａｓｔｉｎ及びＨＲＰ−３ありでのＨＵＶＥＣ細胞の発芽試験を示す。
図９は、増加する量のＨＲＰ−３タンパク質の存在下でのＨＵＶＥＣ細胞移動アッセイを示す。
図１０は、様々な正常及び腫瘍性のヒト細胞株中でのＨＲＰ−３発現レベルを示す。ＲＮＡを細胞から抽出し、ＤＮアーゼ処理、レトロ転写及びリアルタイムＰＣＲ分析した。１８Ｓ ＲＮＡレベルを試料標準化のために使用した。ＨＲＰ−３タンパク質がヒト神経芽腫細胞株により高度にかつ選択的に発現されていることが見出された。
図１１はウェスタンブロットアッセイを示し、この場合にＨＲＰ−３タンパク質がＳＨＳＹ条件培地中で見出された。
図１２は、設計された二重鎖ＤＮＡの配列を示し、二重鎖２、３及び４には赤で下線を引いた塩基があり、Lukasik et al.の二重鎖で導入した変化を強調する（二重鎖１）。
図１３は、図１２のＤＮＡ二重鎖１（ＤＮＡ１）を用いた３Ｔ３移動ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを示す。
図１４−Ａ）は、神経芽腫及び非神経芽腫細胞株のＨＲＰ−３転写産物レベルを示す。ＲＮＡを細胞から抽出し、ＤＮアーゼ処理、レトロ転写及びリアルタイムＰＣＲ分析した。１８Ｓ ＲＮＡレベルを試料標準化のために使用した。平均発現値に応じて細胞株を上から下に配置した。神経芽腫細胞株は灰色で印をしてある。
図１４−Ｂ）は、神経芽腫及び非神経芽腫細胞によるＨＲＰ−３の発現及び分泌を示す。タンパク質を細胞ライセートから抽出するか又は濃縮し、この条件培地から沈殿させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分画し、ＨＲＰ−３についてイムノブロットした。ＧＡＤＰＨレベルを試料標準について測定した。このバンドの相対強度をImageJ softwareを用いて計算した。
図１４−Ｃ）は、ＳＨ−ＳＨ５Ｙ、Ｇｌ−Ｌｌ−Ｎ及びＨＴＬＡ２３０神経芽腫異種移植片のＨＲＰ−３タンパク質レベルを示す。異種移植片腫瘍組織又は正常マウス組織から抽出したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＨＲＰ−３についてイムノブロットした。精製したＨＲＰ−３タンパク質をポジティブコントロールとして使用した。ＧＡＰＤＨのタンパク質レベルを試料標準化のために使用した。バンドの定量化をImageJ softwareを用いて実施した。
図１５は、３７℃で０〜２５時間のマウス血清中でのインキュベーション後の配列番号４、５、６及び７の本発明によるオリゴヌクレオチド分子（それぞれ化合物ＢＮ２０３、ＢＮ２０４、ＢＮ２０５及びＢＮ２０６として示す）のゲル電気泳動分析を示す。
図１６は、配列 配列番号１１（化合物ＢＮ２１０として示す）のオリゴヌクレオチド分子の細胞毒性アッセイを示す。ＭＴＴ試験を、ＢＮ２１０又はコントロール試験物質を用いた２４、４８及び７２時間のインキュべーション後のＨｅｐＧ２及び神経芽腫細胞株Ｇｌ−Ｌ−ｌＮ、ＳＨ−ＳＹ及びＩＭＲ３２に対して実施した。ポジティブ及びネガティブコントロールを、それぞれ１０％又は０％のウシ血清を含有する細胞培地を用いて実施した。
図１７は、ビンクリスチン（ＶＩＮ）単独又は配列 配列番号１１（ＢＮ２１０）のオリゴヌクレオチド分子と組み合わせた場合のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性を示す。ＧＩ−Ｌ−ＩＮ神経芽腫細胞を０．１５〜５ｎＭの範囲の濃度でのビンクリスチンで、単独で用いて又は２５０ｎＭのＢＮ２１０と組み合わせて処理した。４８時間後にＭＴＴ試験を実施した。
図１８は、甲状腺刺激性の神経芽腫異種移植片に対する、化学療法剤ビンクリスチン（ＶＣＲ）と組み合わせた配列 配列番号１１（ＢＮ２１０）の本発明によるオリゴヌクレオチド分子のｉｎ ｖｉｖｏ活性の結果を示す。
図１９は、配列番号１のオリゴヌクレオチドがＨＲＰ−３誘発したＨＵＶＥＣの発芽を遮断できることを示す。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、ＨＤＧＦファミリーの６部分のアラインメント及びＰＷＷＰドメインの構造的保存を示す図である。
【図２】図２は、ＨＲＰ−３によるＮＩＨ−３Ｔ３移動に対する阻害作用を示す図である。
【図３】図３は、刺激２４時間後のＨＲＰ−３により誘発される用量依存性ＨＵＶＥＣ発芽を示す図である。
【図４】図４は、刺激２４時間後のＨＲＰ−３により誘発される用量依存性ＨＵＶＥＣ発芽を示す図である。
【図５】図５は、ＨＵＶＥＣ細胞株中でのＨＲＰ−３刺激あり及びなしでのＶＥＧＦＲ−２ ｍＲＮＡ発現を示す図である。
【図６】図６は、ＨＵＶＥＣ細胞株中でのＨＲＰ−３刺激あり及びなしでのＶＥＧＦ ｍＲＮＡ発現を示す図である。
【図７】図７は、ＨＵＶＥＣ細胞株中でのＶＥＧＦ刺激あり及びなしでのＨＲＰ−３ ｍＲＮＡ発現を示す図である。
【図８】図８は、抗ＶＥＧＦ抗体Ａｖａｓｔｉｎ及びＨＲＰ−３ありでのＨＵＶＥＣ細胞の発芽試験を示す。
【図９】図９は、増加する量のＨＲＰ−３タンパク質の存在下でのＨＵＶＥＣ細胞移動アッセイを示す図である。
【図１０】図１０は、様々な正常及び腫瘍性のヒト細胞株中でのＨＲＰ−３発現レベルを示す図である。
【図１１】図１１はウェスタンブロットアッセイを示す図である。
【図１２】図１２は、設計された二重鎖ＤＮＡの配列を示す図である。
【図１３】図１３は、図１２のＤＮＡ二重鎖１（ＤＮＡ１）を用いた３Ｔ３移動ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを示す図である。
【図１４】図１４は、神経芽腫及び非神経芽腫細胞株のＨＲＰ−３転写産物レベルを示す（Ａ）、神経芽腫及び非神経芽腫細胞によるＨＲＰ−３の発現及び分泌を示す（Ｂ）、ＳＨ−ＳＨ５Ｙ、Ｇｌ−Ｌｌ−Ｎ及びＨＴＬＡ２３０神経芽腫異種移植片のＨＲＰ−３タンパク質レベルを示す（Ｃ）図である。
【図１５】図１５は、３７℃で０〜２５時間のマウス血清中でのインキュベーション後の配列番号４、５、６及び７の本発明によるオリゴヌクレオチド分子（それぞれ化合物ＢＮ２０３、ＢＮ２０４、ＢＮ２０５及びＢＮ２０６として示す）のゲル電気泳動分析を示す図である。
【図１６】配列 配列番号１１（化合物ＢＮ２１０として示す）のオリゴヌクレオチド分子の細胞毒性アッセイを示す図である。
【図１７】図１７は、ビンクリスチン（ＶＩＮ）単独又は配列 配列番号１１（ＢＮ２１０）のオリゴヌクレオチド分子と組み合わせた場合のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性を示す図である。
【図１８】図１８は、甲状腺刺激性の神経芽腫異種移植片に対する、化学療法剤ビンクリスチン（ＶＣＲ）と組み合わせた配列 配列番号１１（ＢＮ２１０）の本発明によるオリゴヌクレオチド分子のｉｎ ｖｉｖｏ活性の結果を示す図である。
【図１９】図１９は、配列番号１のオリゴヌクレオチドがＨＲＰ−３誘発したＨＵＶＥＣの発芽を遮断できることを示す図である。
【００３３】
実施例
材料と方法
ＨＲＰ−３タンパク質供給源
このタンパク質をＧＳＴコンジュゲートとして市販の供給源から最初に獲得した。同時に、このｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲによりヒト細胞から獲得した。このＨＲＰ−３コード領域を、制限部位としてＥｃｏＲＩ及びＮｄｅｌを使用してｐＥＴ３０ベクター中にクローニングした。この組み換えタンパク質を大腸菌（E. CoIi）ＴＯＰＦ１０及び１２中で生産しポジティブクローンを獲得した。２つのポジティブクローンを配列決定して、その正確さを確かめ、両者ともに正確である。したがって、このタンパク質発現工程のために我々のポジティブクローンを大腸菌ＢＬ２１中に形質転換した。異なる条件の温度及び時間における我々のクローンのいくつかの発現アッセイ後に、ＨＲＰ−３を第１の工程のためにＨＰＬＣを用いてカチオン交換により、そして第２の工程のために疎水性精製を用いて精製した。組み換えタンパク質が完全に精製した後に、ＬＡＬ試験を実施し、エンドトキシンの非存在を確かめ、次いでこれを定量化した。
【００３４】
実施例１
ＮＩＨ ３Ｔ３繊維芽細胞のための抗移動剤としてのＨＲＰ−３
ＮＩＨ ３Ｔ３繊維芽細胞に対する報告されたＨＤＧＦ活性と類似して、ＰＷＷＰドメインに結合できるリガンドによるいかなる干渉活性も報告できる試験を開発すべく、これら細胞に対するＨＲＰ−３活性を試験することに決めた。増加する量のタンパク質の存在下での３Ｔ３細胞の移動及び増殖アッセイを実施した。これらアッセイは、ＨＲＰ−３タンパク質の強力な抗移動作用の定義を可能にし、これは３０ｎｇ／ｍＬで５％のＦＢＳにより２４時間で誘発される３Ｔ３移動の５０％を妨げることができる。この試験はバリデーションされ、今や良好に再現可能である、図２。
【００３５】
更に、ＨＲＰ−３が３Ｔ３増殖及び足場依存性成長を０．１ｎｇ／ｍＬで遮断することが見出された。これら全てのデータは、３Ｔ３細胞の強力な増殖及び移動を誘発する、ＨＤＧＦの作用とは対照的なＨＲＰ−３の作用を示す。
【００３６】
実施例２
ＨＵＶＥＣ細胞のための血管形成剤としてのＨＲＰ−３
ＨＤＧＦが、様々な種類の腫瘍において血管形成に関連することが見出され、この理由のために、我々はＢＡＥＣ及びＨＵＶＥＣとしての内皮初代細胞株に対するＨＲＰ−３の活性を試験した。ＢＡＥＣ及びＨＵＶＥＣ細胞に対する増殖に対する作用が見出されなかった一方で、ＨＲＰ−３は、２４時間の刺激後にＨＵＶＥＣ発芽を誘発できる。図３及び４に示されるとおり、ＨＲＰ−３は、用量依存的にＨＵＶＥＣ細胞において発芽を誘発できる。図４には、ネガティブコントロール及びポジティブコントロールを６０ｎｇ／ｍＬでＶＥＧＦを用いて示している。このデータからは、１００ｎｇ／ｍｌを超える濃度でＨＵＶＥＣ細胞に対する発芽をＨＲＰ−３が刺激することを実証した。我々の結果を確かめるために、実験を盲目的にも実施している。
【００３７】
内皮細胞機能性の他の重要な観点は新規血管を形成できる能力であり、したがってマトリゲル（Matrigel）中で管形成アッセイを実施した；予備試験によれば、ＨＲＰ−３は、２４時間後にＨＵＶＥＣの血管様網目を維持することができる（示さず）。
【００３８】
この刺激の分子的基盤を理解するために、リアルタイムＰＣＲによりＨＵＶＥＣ細胞株中でＨＲＰ−３のｍＲＮＡ発現を研究した。興味深いことに、このタンパク質は高レベルで発現していることが見出された。ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦＲ−２がＨＲＰ−３誘発機構に関連しているかどうかを理解するために、我々のＨＲＰ−３でもってＨＵＶＥＣ細胞を刺激し、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ−２、ＨＲＰ−３及びＨＤＧＦのｍＲＮＡレベルを検査した。これら遺伝子の発現はＨＲＰ−３により変化しなかった。図５及び６。
【００３９】
ＨＲＰ−３がＶＥＧＦによりその上で制御されているかどうかを理解するために、ＨＵＶＥＣ細胞を６０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦで処理し、次いでＨＲＰ−３ ｍＲＮＡレベルを測定した：ネガティブコントロールと処理細胞との間には有意差は存在しなかった（図７）。
【００４０】
この最後のデータからはＨＲＰ−３血管形成促進性活性がＶＥＧＦとは独立していることを認めることができる。
【００４１】
この証明は、治療的使用のために血管形成を遮断するために極めて重要である。
【００４２】
更に、ＶＥＧＦ独立性血管形成活性を確かめるために、我々はＡｖａｓｔｉｎ、抗ＶＡＧＦ抗体を用いてＶＥＧＦ及び我々のタンパク質の存在下で別の発芽試験を実施した。Ａｖａｓｔｉｎは、ＨＵＶＥＣ発芽をＶＥＧＦ媒介的に遮断できるが、ＨＲＰ−３媒介的でない、図８。
【００４３】
増加する量のこのタンパク質の存在下でのＨＵＶＥＣの移動アッセイを実施した（図９）。これらアッセイにより、用量依存的にヒトの内皮細胞に対するタンパク質の抗移動作用の定義が可能になり、これは１００ｎｇ／ｍｌで５％ＦＢＳにより５及び１６時間で誘発された移動の約８０％を妨げることができる。
【００４４】
実施例３
神経腫瘍中でのＨＲＰ−３発現レベル
以前の刊行物から、ＨＤＧＦ発現が様々なヒトの癌中でメラノーマ、結腸直腸、膵臓、胃、肝細胞及び肺の癌腫として増加することを我々は知っている。このため、ヒトの腫瘍細胞株中のＨＤＧＦタンパク質の特異的過剰発現をリアルタイムＰＣＲによりスクリーニングすることが決定され、そして、我々はこの基本のｍＲＮＡレベルが全ての細胞株に対してＨＲＰ−３よりも高いことを認め、そして、これまでにはＨＤＧＦが乳癌、神経芽腫、骨肉腫、リンパ腫、膵臓及び子宮のアデノカルシノーマ中で過剰発現することが見出されているが、しかしこの最大の過剰発現はヒトの肝臓細胞であるＣｈａｎｇ細胞株中で見出された。
【００４５】
ＨＲＰ３が、ＰＷＷＰ結合オリゴヌクレオチドを開発するためのモデルとして使用すべきＰＷＷＰ含有タンパク質としてだけ意図されるにもかかわらず、我々は、タンパク質が過剰発現している既知の病理学が存在するかどうかを知りたいと思った。アレイデータのバイオインフォマティクス的スクリーニングは、攻撃的なグレードのヒトのグリオーマ、子供の希有致死性腫瘍、中で特異的な高レベルの発現を示した。この過剰発現は、ＨＲＰ−３の提案された増殖性機能に関係しているかもしれず、したがって、我々はリアルタイムＰＣＲによりＣＮＳ腫瘍細胞株中のこのタンパク質の特異的過剰発現についてスクリーニングを開始した。興味深いことに、このタンパク質は、ＳＨ−ＳＹ５神経芽腫中で、そしてＮＳＣ３４、アミノプテリン感受性神経芽腫Ｎ１８ＴＧ２と運動ニューロン富化した胚性の１２〜１４日の脊髄細胞の融合により生産されたマウス−マウスの神経ハイブリッド細胞株のサブクローン中で過剰発現していることが見出された（図１０）。
【００４６】
この発現レベルは特異的であり、というのも他の脳の腫瘍株、例えば神経芽腫Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞株、又は他の組織由来の細胞は高レベルでこのタンパク質を発現しなかったからである。ＳＨ−ＳＹ５細胞は４歳の子供の骨髄に住み着く攻撃性の神経芽腫の二次転移から獲得した。神経芽腫は希少疾患（orphaned ref. ORPHA635）であり、このｉｎ ｖｉｔｒｏモデルは現在ではＳＨ−ＳＹ細胞により提示されている。
【００４７】
最近の知見は、正常の神経外胚葉由来の組織の発達を駆動する分子経路が、神経芽腫成熟化にも関連していてよいことを示唆している。血管形成は神経分化の間に鍵となる役割を果たし、神経及びグリアの両者に栄養活性を発揮している。血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を含む、ＮＢｓにおける血管形成の誘発における重要な役割を果たすためにこれまでに種々の血管形成因子が同定されている。増加する量のタンパク質の存在下でのＳＨ−ＳＹ５及びＮＣＳ−３４細胞の増殖アッセイを実施した。これらアッセイにより、ＳＨＳＹに対してだけこのタンパク質の抗増殖性作用の定義が可能になり、これは１００ｎｇ／ｍＬで５％のＦＢＳにより２４及び４８ｈで誘発されたＳＨ−ＳＹ５増殖の２５％を妨げることが可能である。
【００４８】
神経芽腫の内部では、神経芽腫細胞が、内皮細胞中で新規の血管形成プロセスを助けることができる溶解性ＨＲＰ−３を産生すると我々は推測する。この理論を支持する結果、我々はＨＲＰ３タンパク質をＳＨＳＹ条件培地中でウェスタンブロットアッセイにより見出す、図１１。これは、ＨＤＧＦ及びＨＲＰ−３の両者がＳＨＳＹ細胞において高度に発現するが、ＨＲＰ−３だけが培地中に存在することを確認する。
【００４９】
我々の理論を更に支持するために、様々な神経芽腫細胞株を選択し、このＨＲＰ−３ ｍＲＮＡ及びタンパク質発現レベルを分析した。図１４Ａに示されるとおり、ＨＲＰ−３タンパク質が神経芽腫細胞株中に、検査した他の腫瘍細胞及び正常細胞株に比較してより高レベルで存在することが見出された。
【００５０】
次の工程として、ＨＲＰ−３が神経芽腫細胞により細胞外区画中に放出されるかどうかを分析した。１０つの神経芽腫細胞株の条件培地を濃縮し、タンパク質を沈殿させ、ウェスタンブロット分析によりＨＲＰ−３の存在について分析した。図１４−Ｂに示されるとおり、Ｇｌ−Ｌｌ−Ｎ、ＮＸＳ２、ＩＭＲ３２、ＨＴＬＡ２３０、ＬＡＮ５及びＳＫＮＢＥ２細胞を含む大抵の神経芽腫細胞株は、ＨＲＰ−３をその培養培地中に分泌する。
【００５１】
更に、我々は２つの以前に説明されているマウスモデルの神経芽腫、同所（orthotopic）異種移植片モデル及び偽転移性異種移植片モデル由来の腫瘍組織中のＨＲＰ−３発現を分析した（Pastorino et al., 2003; Marimpietri et al., 2007）。副腎中へのＧｌ−Ｌｌ−Ｎ細胞の同所注射が局所的な腫瘍の発達を生じた一方で、偽転移性モデル中へのＨＴＬＡ２３０細胞の静脈内注射は腎臓中での転移発達を生じた。両者の腫瘍中のＨＲＰ−３タンパク質のレベルをウェスタンブロット分析により分析し、未処理の健康なマウスの腎臓及び副腎中のＨＲＰ−３発現と比較した。図１４Ｃに示されるとおり、ＨＲＰ−３は、副腎及び脳組織中で発現することが見出され、その一方で腎臓及び肝臓組織は極めて低いレベルのＨＲＰ−３を含有した。重要なことに、ＨＴＬＡ２３０及びＧｌ−Ｌｌ−Ｎ腫瘍組織中のＨＲＰ−３タンパク質レベルはそれぞれの宿主組織中のレベルを超えた。
【００５２】
したがって、神経芽腫組織によるＨＲＰ−３発現及び分泌が異常なまでに高いＨＲＰ−３レベルを細胞外腫瘍環境において生じることを結論付けることができる。
【００５３】
実施例４
オリゴヌクレオチドによるＨＲＰ−３ターゲッティング
二重鎖ＤＮＡとの複合体にあるＰＷＷＰドメインの利用可能な構造を基礎として、短い（１５ｂｐ）二重鎖ＤＮＡ及び３つの派生ＤＮＡ二重鎖をＨＲＰ３をターゲッティングするために設計した（図１２）。この設計したＤＮＡの配列は図面中で左側に示され、Lukasik et alの二重鎖（二重鎖１）で導入された変化を強調して赤及び下線を引いた塩基を有する。この二重鎖は様々な分子形状を試験するために（二重鎖３）、そして、この結合のためにいかにこの配列が重要であるかを理解するために設計されている（二重鎖２及び４）。
【００５４】
４つの全てのＤＮＡ二重鎖を、これらがそのＰＷＷＰドメインに結合することによりＨＲＰ−３機能を妨げることができるかどうかを確認するために、我々の３Ｔ３移動ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて試験した（図１３）。図１３では、この左から最初の欄がＦＢＳを用いたコントロールの移動を、そして、この左から二番目の欄がＦＢＳなしのコントロールの移動を示す。この左から三番目の欄はネガティブコントロールである。この左から四番目の欄はＨＲＰ−３の存在における移動阻害を示す。この左から五番目の欄は１０００ｎＭの濃度での二重鎖（ＤＮＡ１）はＦＢＳを用いたコントロールと比較して移動に対するいかなる影響をも有さないことを示す。この更なるデータはＤＮＡ１がＨＲＰ−３の抗移動作用を濃度依存的に阻害することを示す。特に、ＤＮＡ１の２５０ｎＭの濃度では、３Ｔ３細胞の移動がＦＢＳを用いたコントロールと匹敵する。このように、二重鎖１は、ＨＲＰ−３のタンパク質作用を消滅させることができる。この作用は用量依存的であり、かつ、特異的にその構造に関連し、というのも単鎖はいかなる活性をも示さないからである。
【００５５】
我々は二重鎖２のわずかな活性だけを見出し、二重鎖３及び４の活性は見出さなかった。これらの最後のデータは特に興味深いものであり、というのもこれらはこの結合が主としてこのオリゴの構造−特異的活性で当然であることを確認するからである。
【００５６】
更に、これはＨＵＶＥＣ細胞に対して活性があるので、我々は移動アッセイを実施し、この場合に二重鎖１は５０ｎＭの濃度でＨＲＰ−３の完全に抗移動性の活性を回復できる（データ示さず）。
【００５７】
修飾した単鎖オリゴヌクレオチドを用いてヒトの内皮細胞発芽に対するこのタンパク質の作用を遮断することを２回試みた。組み換えタンパク質、及び合成オリゴ、配列番号１、２及び３を用いる試料においては、この発芽した球状体の数は組み換えタンパク質を用いた試料に比較して減少している（図１９）。
【００５８】
この結果から出発して、我々は、マウス血清中で改善された耐性を有する、本発明によるヘアピン構造を有するオリゴヌクレオチド配列を獲得した（図１５）。化学修飾の導入により、例えば、２′−ＯＭｅ、２′Ｆ又は逆転した極性の導入により、より良好なファーマコキネティック特性を有する本発明による分子配列を我々は設計した。これら配列は有利には線状及び分枝鎖状ＰＥＧでもってコンジュゲートされていてよい。
【００５９】
以下の本発明による配列においては、下線を引いたか又は星印を付したモノマーが修飾ヌクレオチド構成ブロックである：この下線を引いたモノマーは合成の２′−ＯＭｅ ＲＮＡ構成ブロックであり、かつ、星印を付したモノマーは末端基ＮＨ２を５′（５′−アミノ基）に有するヌクレオチド構成ブロックであり、これはＰＥＧ単位とアミド結合を形成できる。モノマー「ｉＡ」は、逆転した極性を指し、すなわち、３′−３′の逆位連結を有する構成ブロックである。
【００６０】
配列
【００６１】
実施例５
細胞毒性試験
結合（ref. Lukasik et al., 2006）、及び、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの溶解性ＨＲＰ−３の血管形成促進性作用の遮断（データ示さず）のためのこれら配列の能力から出発して、我々は、図１６で示されるように、様々な細胞株中での配列番号１１（化合物名ＢＮ２１０で同定）の細胞毒性、及びｉｎ ｖｉｖｏでのその急性毒性を試験することを決定した。
【００６２】
我々はＢＮ２１０の急性毒性をｉｎ ｖｉｖｏで評価した。２１．８〜２２．９ｇの重さの３０匹のＣＤ−１雌マウス（Charles River Italia s.r.l., Via Indipendenza, 11 23885 CALCO (Lecco)）を５匹の動物毎の、６つの群にわけ、マクロロンケージ（タイプＩＩＩ）中で室温２２±３℃及び相対湿度５５±１５％で飼育した。空気交換は１８０〜２２０／時間である。リン酸緩衝食塩水中に溶解したＢＮ２１０の３つの用量を試験した：３、１０及び３０ｍｇ／ｋｇを静脈内に（ｉ．ｖ．、尾静脈を介して）又は腹腔内に（ｉ．ｐ．）投与した。ＢＮ２１０濃度はこの処方物中でそれぞれ０．１５５、０．５１７及び１．５５１ｍｇ／ｍｌであった。マウスを、薬物投与後１４日間にわたり毒性徴候の外観について毎日、２回／日観察した。アーヴィン試験（Irvin test）において普通チェックするパラメーターを考慮した。この観察期間を通じて臨床的又は挙動変化の徴候はｉ．ｖ．又はｉ．ｐ．のいずれかで投与されたこの全ての３つの用量で検出されなかった。観察１４日後に全てのマウスを屠殺し、明白な病理学的検査のために解剖した。この剖検の間の全ての徴候又は病理学的変化が精査の対象であった。巨視的徴候又は病理学的変化はこの剖検検査の間に検出されなかった。
【００６３】
ＢＮ２１０が、ビンクリスチン、臨床使用において最も有力な化学療法剤の１つ、との相乗作用を有する可能性を更に試験した。このために、２５０ｎＭのＢＮ２１０単独で、又は様々な濃度のビンクリスチンと組み合わせて、Ｇｌ−Ｌ−ｌＮ神経芽腫細胞でＭＴＴ試験を実施した。図４に示されるように、ビンクリスチンが２．５〜５ｎＭの濃度でＧｌ−Ｌｌ−Ｎ細胞の増殖を阻害することができた一方で、２５０ｎＭのＢＮ２１０の添加はビンクリスチン処理の作用を促進も阻害もしなかった。更に、ＢＮ２１０単独、又はＰＥＧ後端部単独、は、Ｇｌ−Ｌｌ−Ｎ細胞に対していかなる細胞毒性作用も示さなかった。
【００６４】
実施例６
ｉｎ ｖｉｖｏモデル
以前の実験において、ＢＮ２１０は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで抗血管形成作用を有することが示されている（データ示さず）。したがって、腫瘍血管形成のモデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏでＢＮ２１０の効力を試験した。神経芽腫を腫瘍モデルとして選択し、というのもＨＲＰ−３は原則的にマウス中の神経系で発現するからであり、そして以前の実験はＨＲＰ−３が、様々なヒトの神経芽腫細胞株の条件培地中に存在し、かつ、過剰発現することを示している。ＨＲＰ−３は試験した細胞株のいずれの増殖にも作用しないので、細胞毒性剤、ビンクリスチンと組み合わせてＢＮ２１０を使用することが適当であることが見出された。
【００６５】
マウスを特定の病原体フリーの条件下で飼育した。このｉｎ ｖｉｖｏ実験を５週齢の雌の無胸腺（ヌードnu）マウスを使用して実施した。マウスをキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）及びケタミン（９０ｍｇ／ｋｇ）の混合物で麻酔処理し（Imalgene 1000, Merial Italia S.p.A., Milan,イタリア）、開腹手術し、神経芽腫（ＮＢ）細胞株、Ｇｌ−Ｌｌ−Ｎ（１０μｌの食塩水溶液／マウス中１．５×１０6細胞）で、左の副腎の包中に同所的に注射した、これは以前に報告されているとおりである（Pastorino F. et al., Cancer Res 63, 2003; Pastorino F. et al., Clin Cancer Res 2008）。腫瘍細胞移植後に死亡率は観察されなかった。ＮＢ腫瘍を２２日間にわたりこの注射した細胞から成長させ、次いで動物をランダムに３つの群に分けた。１つの群は５週間にわたり週に一回ビンクリスチン１ｍｇ／ｋｇを用いて、ｉ．ｖ．処理した（ＶＣＲ、全部で５投与）。第２の群の動物をＶＣＲ（１ｍｇ／ｋｇのｉ．ｖ．注射、５週間にわたり週に１回、全部で５投与）、及び、ＢＮ２１０（７ｍｇ／ｋｇのｉ．ｐ．注射、５日／週、全部で２０投与）の組み合わせで処理した。ネガティブコントロールマウスをＨＥＰＥＳ緩衝食塩水で処理した。生存実験における実験群（ｎ＝８マウス／群）の間での差異の有意性を、カイ二乗ログランク試験を使用してカプラン・マイヤー曲線により決定した。これら知見はＰ値が＜０．０５である場合に有意であるとみなされた。
【００６６】
同所性神経芽腫（ＮＢ）異種移植片に対するビンクリスチン（ＶＣＲ）と組み合わせた配列 配列番号１１（ＢＮ２１０）のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性
ＶＣＲ単独投与と比較して、ＢＮ２１０がＮＢ異種移植片中でＶＣＲの治療作用を改善するために使用できるかどうかを決定するために、Ｇｌ−Ｌｌ−Ｎ細胞をヌードマウスの左の副腎中に注入し、約２００ｍｍ3ｍｐサイズに達するまで成長させた（２２日）。ＮＢ腫瘍を有するマウスを次いで、上で報告されているとおり、週毎の間隔で薬剤で処理した。図１８に示されているとおり、ＶＣＲ単独で処理した（１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．、この実験において治療量以下の用量）ＮＢを有するマウスは、ネガティブコントロールマウスに比較してその寿命のいかなる増加も示さなかった。対照的に、ＶＣＲ＋ＢＮ２１０の組み合わせで処理したマウスは、ネガティブコントロール及びＶＣＲ処理群に比較してその寿命の統計学的に有意な増加を有した（ｐ＝０．００５８）（図１８）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列
【化１】
［式中、Ｙ及びＺはヌクレオチド又はヌクレオチドアナログ構成ブロックを示す、
その際、それぞれのＹ及びＺは相互に一緒に塩基対、特にワトソン−クリック塩基対を形成し、Ｘ１及びＸ２は独立してポリ（アルキレングリコール）単位を含む基から選択される、
ｎ及びｍは独立して０又は１を示し、その際ｎ及びｍの少なくとも１つは１である、
ｓは１〜２０、有利には５〜１８の整数である、かつ
Ｂは架橋基である］
を含む単鎖オリゴヌクレオチド分子。
【請求項２】
配列
【化２】
［式中、Ａ、Ｃ、Ｔ及びＧはヌクレオチド又はヌクレオチドアナログ構成ブロックを示す、
Ｘ1及びＸ2は独立してポリ（アルキレングリコール）単位を含む基から選択される、
ｎ及びｍは独立して０又は１を示し、その際ｎ及びｍの少なくとも１つは１である、かつ
Ｂは架橋基を示す］
を含む請求項１記載の単鎖オリゴヌクレオチド分子。
【請求項３】
ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログが、デオキシリボヌクレオチド構成ブロック、修飾したデオキシリボヌクレオチド構成ブロック、リボヌクレオチド構成ブロック、修飾したリボヌクレオチド構成ブロック、ヌクレオチドアナログ構成ブロック、特にＰＮＡ、ＬＮＡ、Ｏ−メチルＲＮＡ、又はモルホリノ構成ブロック又はこの組み合わせから選択される請求項１又は２記載のオリゴヌクレオチド分子。
【請求項４】
Ｘ1及びＸ2が、２００〜１０００００Ｄａの範囲内にある分子量を有する線状又は分枝鎖状のポリ（エチレングリコール）単位を含む基から選択される請求項１から３までのいずれか１項記載のオリゴヌクレオチド分子。
【請求項５】
Ｂが、相補ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログ構成ブロックを連結でき、かつ、塩基対の形成を支持できる２０つまでの構成ブロックのスペーサー配列である請求項１から４までのいずれか１項記載のオリゴヌクレオチド分子。
【請求項６】
Ｂが、
（ｉ）少なくとも３つの対となっていないヌクレオチド又はヌクレオチドアナログ構成ブロックのヌクレオチド性スペーサー配列、又は
（ｉｉ）非ヌクレオチド性スペーサー配列、例えば少なくとも５つのエチレングリコール単位のポリ（エチレングリコール）スペーサー配列
を含む結合基である請求項１から５までのいずれか１項記載のオリゴヌクレオチド分子。
【請求項７】
ＰＷＷＰドメインタンパク質、例えばＨＤＧＦ、ＨＲＰ−１、ＨＲＰ−２、ＨＲＰ−３、ＨＲＰ−４及び／又はＬＥＤＧＦ、特にＨＲＰ−３及び／又はＨＤＧＦを阻害するための請求項１から６までのいずれか１項記載のオリゴヌクレオチド分子。
【請求項８】
ＰＷＷＰドメインタンパク質に少なくとも１０μＭ、有利には少なくとも１００μＭ、特に有利には少なくとも１０００μＭの親和性で結合する請求項１から７までのいずれか１項記載のオリゴヌクレオチド分子。
【請求項９】
医薬における使用のための、例えば診断及び／又は治療適用のための請求項１から８までのいずれか１項記載のオリゴヌクレオチド分子。
【請求項１０】
ＰＷＷＰドメインタンパク質機能障害と関連、付随する、かつ／又はこれにより引き起こされる状態又は疾病の診断及び治療における使用のための請求項９記載のオリゴヌクレオチド分子。
【請求項１１】
血管形成に関連した疾病、例えば癌、例えば神経芽腫、メラノーマ、結腸直腸癌、膵癌、胃癌、肝細胞癌及び肺癌の診断及び治療における使用のための請求項９又は１０記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
更なる療法、例えば放射線、手術及び／又は更なる医薬の投与と組み合わせた使用のための請求項９から１１までのいずれか１項記載のオリゴヌクレオチド分子。
【請求項１３】
薬剤スクリーニングにおける使用のための請求項１から８までのいずれか１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
医薬における使用のための、例えば診断及び／又は治療適用のためのＨＲＰ−３ポリペプチド、特に哺乳類のＨＲＰ−３、又は、これをコードする核酸分子。
【請求項１５】
細胞の移動、増殖及び／又は足場形成独立成長の阻害のための剤としての請求項１３又は１４記載の化合物。
【請求項１６】
過剰増殖状態又は疾病の診断及び治療における使用のための請求項１４又は１５記載の化合物。
【請求項１７】
医薬における使用のための、例えば診断及び／又は治療適用のためのＨＲＰ−３アンタゴニスト。
【請求項１８】
抗体、抗体断片、アンチセンス分子、リボザイム、ＲＮＡｉ剤又はアプタマーである請求項１７記載の化合物。
【請求項１９】
血管形成の阻害のための剤としての請求項１７又は１８記載の化合物。
【請求項２０】
血管形成に関連した状態又は疾病の診断及び治療における使用のための請求項１７から１９までのいずれか１項記載の化合物。
【請求項１】
配列
【化１】
［式中、Ｙ及びＺはヌクレオチド又はヌクレオチドアナログ構成ブロックを示す、
その際、それぞれのＹ及びＺは相互に一緒に塩基対、特にワトソン−クリック塩基対を形成し、Ｘ１及びＸ２は独立してポリ（アルキレングリコール）単位を含む基から選択される、
ｎ及びｍは独立して０又は１を示し、その際ｎ及びｍの少なくとも１つは１である、
ｓは１〜２０、有利には５〜１８の整数である、かつ
Ｂは架橋基である］
を含む単鎖オリゴヌクレオチド分子。
【請求項２】
配列
【化２】
［式中、Ａ、Ｃ、Ｔ及びＧはヌクレオチド又はヌクレオチドアナログ構成ブロックを示す、
Ｘ1及びＸ2は独立してポリ（アルキレングリコール）単位を含む基から選択される、
ｎ及びｍは独立して０又は１を示し、その際ｎ及びｍの少なくとも１つは１である、かつ
Ｂは架橋基を示す］
を含む請求項１記載の単鎖オリゴヌクレオチド分子。
【請求項３】
ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログが、デオキシリボヌクレオチド構成ブロック、修飾したデオキシリボヌクレオチド構成ブロック、リボヌクレオチド構成ブロック、修飾したリボヌクレオチド構成ブロック、ヌクレオチドアナログ構成ブロック、特にＰＮＡ、ＬＮＡ、Ｏ−メチルＲＮＡ、又はモルホリノ構成ブロック又はこの組み合わせから選択される請求項１又は２記載のオリゴヌクレオチド分子。
【請求項４】
Ｘ1及びＸ2が、２００〜１０００００Ｄａの範囲内にある分子量を有する線状又は分枝鎖状のポリ（エチレングリコール）単位を含む基から選択される請求項１から３までのいずれか１項記載のオリゴヌクレオチド分子。
【請求項５】
Ｂが、相補ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログ構成ブロックを連結でき、かつ、塩基対の形成を支持できる２０つまでの構成ブロックのスペーサー配列である請求項１から４までのいずれか１項記載のオリゴヌクレオチド分子。
【請求項６】
Ｂが、
（ｉ）少なくとも３つの対となっていないヌクレオチド又はヌクレオチドアナログ構成ブロックのヌクレオチド性スペーサー配列、又は
（ｉｉ）非ヌクレオチド性スペーサー配列、例えば少なくとも５つのエチレングリコール単位のポリ（エチレングリコール）スペーサー配列
を含む結合基である請求項１から５までのいずれか１項記載のオリゴヌクレオチド分子。
【請求項７】
ＰＷＷＰドメインタンパク質、例えばＨＤＧＦ、ＨＲＰ−１、ＨＲＰ−２、ＨＲＰ−３、ＨＲＰ−４及び／又はＬＥＤＧＦ、特にＨＲＰ−３及び／又はＨＤＧＦを阻害するための請求項１から６までのいずれか１項記載のオリゴヌクレオチド分子。
【請求項８】
ＰＷＷＰドメインタンパク質に少なくとも１０μＭ、有利には少なくとも１００μＭ、特に有利には少なくとも１０００μＭの親和性で結合する請求項１から７までのいずれか１項記載のオリゴヌクレオチド分子。
【請求項９】
医薬における使用のための、例えば診断及び／又は治療適用のための請求項１から８までのいずれか１項記載のオリゴヌクレオチド分子。
【請求項１０】
ＰＷＷＰドメインタンパク質機能障害と関連、付随する、かつ／又はこれにより引き起こされる状態又は疾病の診断及び治療における使用のための請求項９記載のオリゴヌクレオチド分子。
【請求項１１】
血管形成に関連した疾病、例えば癌、例えば神経芽腫、メラノーマ、結腸直腸癌、膵癌、胃癌、肝細胞癌及び肺癌の診断及び治療における使用のための請求項９又は１０記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
更なる療法、例えば放射線、手術及び／又は更なる医薬の投与と組み合わせた使用のための請求項９から１１までのいずれか１項記載のオリゴヌクレオチド分子。
【請求項１３】
薬剤スクリーニングにおける使用のための請求項１から８までのいずれか１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
医薬における使用のための、例えば診断及び／又は治療適用のためのＨＲＰ−３ポリペプチド、特に哺乳類のＨＲＰ−３、又は、これをコードする核酸分子。
【請求項１５】
細胞の移動、増殖及び／又は足場形成独立成長の阻害のための剤としての請求項１３又は１４記載の化合物。
【請求項１６】
過剰増殖状態又は疾病の診断及び治療における使用のための請求項１４又は１５記載の化合物。
【請求項１７】
医薬における使用のための、例えば診断及び／又は治療適用のためのＨＲＰ−３アンタゴニスト。
【請求項１８】
抗体、抗体断片、アンチセンス分子、リボザイム、ＲＮＡｉ剤又はアプタマーである請求項１７記載の化合物。
【請求項１９】
血管形成の阻害のための剤としての請求項１７又は１８記載の化合物。
【請求項２０】
血管形成に関連した状態又は疾病の診断及び治療における使用のための請求項１７から１９までのいずれか１項記載の化合物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４−１】
【図１４−２】
【図１４−３】
【図１５】
【図１６−１】
【図１６−２】
【図１６−３】
【図１６−４】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４−１】
【図１４−２】
【図１４−３】
【図１５】
【図１６−１】
【図１６−２】
【図１６−３】
【図１６−４】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【公表番号】特表２０１１−５２４７４５（Ｐ２０１１−５２４７４５Ａ）
【公表日】平成２３年９月８日（２０１１．９．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１２８９２（Ｐ２０１１−５１２８９２）
【出願日】平成２１年６月１０日（２００９．６．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／００４１８６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１４９９２１
【国際公開日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【出願人】（５１０３２８３８６）バイオニュークレオン ソチエタ・レスポンサビリタ・リミタータ (1)
【氏名又は名称原語表記】Ｂｉｏｎｕｃｌｅｏｎ Ｓ．ｒ．ｌ．
【住所又は居所原語表記】Ｖｉａ Ｒｉｂｅｓ ５， Ｉ−１００１０ Ｃｏｌｌｅｒｅｔｔｏ Ｇｉａｃｏｓａ （ＴＯ）， Ｉｔａｌｙ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年９月８日（２０１１．９．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月１０日（２００９．６．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／００４１８６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１４９９２１
【国際公開日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【出願人】（５１０３２８３８６）バイオニュークレオン ソチエタ・レスポンサビリタ・リミタータ (1)
【氏名又は名称原語表記】Ｂｉｏｎｕｃｌｅｏｎ Ｓ．ｒ．ｌ．
【住所又は居所原語表記】Ｖｉａ Ｒｉｂｅｓ ５， Ｉ−１００１０ Ｃｏｌｌｅｒｅｔｔｏ Ｇｉａｃｏｓａ （ＴＯ）， Ｉｔａｌｙ
【Ｆターム（参考）】
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