化学反応システム、及び化学反応方法、並びに抗原抗体反応の判定方法
【課題】効率よく、マイクロ流体デバイス内流路の残留液体を、気体流通手段等を用いた残留液除去部で液体を除去する、気泡発生防止手段を具備した化学反応システムを提供する。
【解決手段】複数の担体を流路に並べたマイクロ流路デバイス、または流路に複数の突起構造を持つマイクロ流路デバイスの液導入口と液排出口に接続可能なコネクタと、流路に液体を導入する配管、液体操作を制御する送液ポンプ、さらに、液体の排出・除去手段であるアスピレータやコンプレッサー等とその周辺部品であるコネクタ、配管を有する化学反応システムを用意する。複数種類の反応溶液、洗浄溶液に対して、各液の流通後に発生する担体の隙間に残る残留液体を、各溶液流通工程後に、液体除去手段と配管し、排出・除去させる。これらの液体の流通、除去を連続的に行うことで、溶液導入時の気泡の発生を防ぐことができる。これにより、反応効率を向上させ、さらに、化学発光の発光量を気泡による散乱光がない状態での発光計測が可能となる。
【解決手段】複数の担体を流路に並べたマイクロ流路デバイス、または流路に複数の突起構造を持つマイクロ流路デバイスの液導入口と液排出口に接続可能なコネクタと、流路に液体を導入する配管、液体操作を制御する送液ポンプ、さらに、液体の排出・除去手段であるアスピレータやコンプレッサー等とその周辺部品であるコネクタ、配管を有する化学反応システムを用意する。複数種類の反応溶液、洗浄溶液に対して、各液の流通後に発生する担体の隙間に残る残留液体を、各溶液流通工程後に、液体除去手段と配管し、排出・除去させる。これらの液体の流通、除去を連続的に行うことで、溶液導入時の気泡の発生を防ぐことができる。これにより、反応効率を向上させ、さらに、化学発光の発光量を気泡による散乱光がない状態での発光計測が可能となる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学反応システム、及び化学反応方法、並びに抗原抗体反応の判定方法に関し、例えば、微小な空間での化学反応を利用した化学反応システム、及び化学反応方法、並びに抗原抗体反応の判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、微小な空間を構成し、化学反応を行わせる技術が発展しつつある。微小な空間を構成する方法としては、半導体の製造工程で使用される微細加工技術を用いる方法がある。例えば、フォトリソグラフィー工程やエッチング工程を経て、シリコン基板やガラス基板に溝パターンを構成し、その上に別の基板を貼り付けることで微小な流路を形成して、流路内の流体を駆動するマイクロ流体デバイスを構成できる。そして、これらの微小空間を利用した化学反応による物質生産（非特許文献１参照）や化学分析（非特許文献２参照）が提案されている。
【０００３】
また、生体関連分子を計測する方法として、プローブ分子を固相に固定し、そのプローブ分子に捕捉された生体関連分子を計測する方法がある。例えば、異なるプローブ分子が固定された複数の担体や構造物が納められた微小な流路に試料を送液し、試料内の生体関連分子を担体や構造物上に捕捉し、計測する方法が提案されている（非特許文献３参照）。
【０００４】
一方、マイクロ流体デバイスの流路内で流体を正確に駆動するために、（マイクロ流体デバイス内に分岐構造を設けることや、表面を修飾することで、）溶液内の気泡を除去する方法がある。例えば、溶液を駆動する流路と分岐させた表面が親水性である流路を形成し、溶液内の気体を除去する方法が提案されている（特許文献１参照）。また、少なくとも二つのチャンネルが任意の領域において並行接触部分を形成しており、一つのチャンネルのみの内表面を化学修飾されているマイクロ流体デバイスにおいて、気液の多相流を操作し、溶液内の気体を除去する方法が提案されている（特許文献２参照）。
【０００５】
【非特許文献１】Analytical Chemistry, 74, 3112-3117(2002)
【非特許文献２】Analytical Chemistry, 73, 2112-2116(2001)
【非特許文献３】Nucleic Acids Research, 30, e87(2002)
【特許文献１】特開２００２−１０２６８１号公報
【特許文献２】特開２００５−１６９３８６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ところで、化学および生化学の分野にマイクロ流体デバイスを応用しようとする場合には、特に反応の効率化を図る観点からも、流路内に複数の担体を設置して利用することが多い。この担体としては、たとえば壁からの突起や流路内部に設置されるビーズや微粒子などが挙げられる。これら複数の担体を含む流路に対して、その化学反応の目的に応じた複数種類の液体を順次送液することが必要である。
【０００７】
しかしながら、この際、複数の担体が納められたマイクロ流体デバイスの流路では、液体が流通できる領域に広い部分と狭い部分が存在するため、流路と担体との隙間に気泡が生じやすいという問題が存在する。この気泡は、化学反応の効率を低下させる、化学反応の均一性を低下させる、溶液の流路内部での滞留時間分布を大きく広げてしまう、光計測時に光の散乱等が生じ正確な光量の計測ができなくなる、光計測時のクロストークを生じる原因となる、など化学反応デバイスの性能向上を妨げる大きな原因の一つとなってしまう。
【０００８】
この気泡は次のように発生すると考えられる。つまり、ある液体を流路に導入し、その後、その液体を排出する場合、複数の担体が納められたマイクロ流体デバイスの流路では、流路と担体との隙間に液体が残りやすい。マイクロ流路のスケールでこのような現象が起こるのは、液体の流れによる慣性力に対し液体の表面張力の寄与が大きくなってくるためである。このように流路と担体との隙間に液体が残った状態で、次の液体が導入されると、導入時に流れの分布が生じて均一に液体を導入することができず、結果として流路と担体との隙間に気泡が残ると考えられる。生じた気泡を取り除く方法として、流路に導入した液体の流れを用いて、気泡を押し出すことが考えられる。
【０００９】
しかし、マイクロ流体デバイスで通常想定されている液体の容量は小さいため、気泡を押し出すのに十分な流れを生じさせることは現実的には難しい。
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、複数の担体が納められたマイクロ流路に対して、気泡を生じさせずに溶液を導入する化学反応デバイス等を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するために、本発明では、複数の担体が配置された流路に第１の液体を導入し、次いで第１の液体を導出して、残留液除去部により流路に残留する液体を除去させてから、前記流路に第２の液体を導入することで、気泡の発生を抑制する化学反応システムを提供する。残留液除去部により流路から一旦液体を除去させることで、通常では流路に残ってしまう液体をほぼ完全に排出することが可能となるため、気泡が発生させることなく次の液体を導入することができる。
【００１１】
すなわち、本発明による化学反応システムは、流路と、前記流路の少なくとも一部に配置される複数の担体と、前記流路に第１の液体と第２の液体とを導入する液体導入部と、前記流路から前記第１の液体を導出する液体導出部と、前記流路から前記第１の液体を導出した後に前記流路の液体を除去させる残留液除去部とを有する。ここでの残留液除去部には、一般的に、アスピレータやコンプレッサー等の気体を流通させる気体制御部や、ヒータなどの担体の温度を調整する温度制御部を用いることができる。担体はビーズや、複数の突起構造物、などである。流路は、第１の基板に設けた溝と、溝を覆って設置される第２の基板とから構成されるものが多いが、ガラス等のキャピラリーの内部もこれに含まれる。
【００１２】
第１の液体と第２の液体の液量については、１マイクロリットルから１ミリリットルの範囲で操作する。また、第１の液体と第２の液体とを導入する速度については、毎分１マイクロリットルから毎分１ミリリットルで操作する。このような範囲で液体の容量や流速を設定すると、通常流路内部に頻繁に気泡が発生してしまう。しかし、本発明によりその気泡発生を回避できるという効果が得られる。
【００１３】
さらなる本発明の特徴は、以下本発明の実施するための最良の形態および添付図面によって明らかになるものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、複数の担体が納められたマイクロ流体デバイスに用いられてきた従来の化学反応システムに、気体流通手段を具備する残留液除去部を追加し、それを用いて、液体操作後の流路に残った残留液体を排出、除去する工程を追加することで、反応効率の低下や担体間の反応のばらつき、計測時の光散乱の原因となる、気泡の発生を防ぐことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下に、本発明の実施形態を、図を参照にして詳細に説明する。ただし、本実施形態は、本発明を実現するための1例に過ぎず、本発明の技術的範囲を限定するものではないことに注意すべきである。
【００１６】
＜第１の実施形態＞
図１は、本発明の第１の実施形態に関わる化学反応システム１００を模式的に示す図である。ここでは、溶液の導入と流路の液体を除去する構成及び動作について説明する。まず、図１（Ａ）を用いて、構成について説明する。化学反応システム１００では、流路が形成されたチップ１０１と試薬容器１０２がステージ１０３上に設置されている。
【００１７】
チップ１０１には、第１の基板１２１の上に図のｘ軸に沿った方向に主流路が形成されており、第２の基板１２２は主流路を覆って設置されている。また、主流路と第１のチューブ１０５、第２のチューブ１１０を配管するための開放端に繋がる副流路がｚ軸に沿った方向に形成されている。チップ１０１は、いわゆるコの字型の流路を持つマイクロ流体デバイスである。なお、チップ１０１の主流路、副流路の断面形状は、四角でも、丸でも良い。即ち、キャピラリーの内部を流路とし用いても良い。
【００１８】
試薬容器１０２に関しては、簡単のために、図１（Ａ）ではステージ上に３個セットされた例が示されているが、個数は３個に限られるものではなく、容器のセット数は使用する試薬の数によって変更できるようになっている。
【００１９】
チップ１０１上の流路の開放端の一端は、第１のコネクタ１０４と第１のチューブ１０５を介してシリンジポンプ１０６にセットされたシリンジ１０７と接続される。また、第１のチューブ１０５は第１のアクチュエータ１０８により保持されている。チップ１０１上の流路の開放端の片端は第２のコネクタ１０９と第２のチューブ１１０を介して廃液ボトル１１１に接続されており、さらに廃液ボトル１１１は第３のチューブ１１２を介してアスピレータ１１３と接続されている。第２のチューブ１１０は第２のアクチュエータ１１４により保持されている。制御機１１５による制御によって、ステージ１０３はｘ方向に、第１のアクチュエータ１０８及び第２のアクチュエータ１１４はｚ方向にそれぞれ駆動することができるようになっている。また、シリンジポンプ１０６は制御機１１５により、シリンジ１０７の押し引き駆動を制御することができる。アスピレータ１１３は制御機１１５により、Ｏｎ／Ｏｆｆを制御できる。光検出器１２０は、チップ１０１の流路内の流体挙動や反応後の光検出に用いる。なお、光検出器１２０として、ＣＣＤカメラ、ホトマル、ホトダイオード等を用いることができる。
【００２０】
図１（Ａ）は、チップ１０１の流路、第１のチューブ１０５と第２のチューブ１１０が、第１のコネクタ１０４と第２のコネクタ１０５を介して、接続されており、シリンジ１０７の押しの動作で、チップ１０１内の流路に溶液を導入し、また反応後は、溶液を導出することができる状態を示している。溶液の導入や導出、さらにそれらの送液速度は、シリンジポンプ１０６の移動距離と移動スピードで制御する。本システムにおけるハンドリング可能な溶液量は、１マイクロリットルから１ミリリットルである。また、送液速度は、毎分１マイクロリットルから毎分１ミリリットルの範囲で変更可能なものである。
【００２１】
送液量と送液速度を最適化すれば、発生した気泡を押し出すことができるということは一般的に知られている。しかしながら、実際には、送液に使用する試薬量にはコストの面で制限があり、また、送液速度も反応した生体物質に影響を与えないように設定する必要がある。このため、上記した使用溶液量と送液速度は、これらの現実的な状況を踏まえて設定されたものである。
【００２２】
続いて、図１（Ｂ）から（Ｇ）を用いて、チップ１０１上の流路への溶液の導入、及び流路からの溶液の導出の動作について説明する。まず、図１（Ｂ）に示すように、制御機１１５は、溶液の導入及び導出の指示を受けると、第１のアクチュエータ１０８及び第２のアクチュエータ１１４を駆動し、チップ１０１の流路と第１のチューブ１０５及び第２のチューブ１１０の接続を解除する。
【００２３】
次に、図１（Ｃ）に示すように、制御機１１５は、ステージ１０３を駆動し、３つの試薬容器１０２の内の１つの試薬容器上の開口部の中心位置に、第１のチューブ１０５の開口部中心を移動させ、その後に第１のアクチュエータ１０８を駆動し、チューブ１０５を試薬容器１０２の中に挿入する（図１（Ｄ））。挿入後、シリンジポンプ１０６を駆動し、シリンジ１０７を引いて、第１のチューブ１０５に試薬容器１０２の溶液を吸入する。シリンジ１０７が予め設定したある一定量の溶液を吸入した後、制御機１１５は、第１のアクチュエータ１０８を駆動し、第１のチューブ１０５を試薬容器１０２から取り出す（図１（Ｅ））。次に、図１（Ｆ）に示すように、制御機１１５は、ステージ１０３を駆動し、チップ１０１の位置をチューブ１０５及び第２のチューブ１１０の位置に移動させ、第１のアクチュエータ１０８及び第２のアクチュエータ１１４を駆動し、第１のチューブ１０５及び第２のチューブ１１０をチップ１０１上の流路と接続させる（図１（Ｇ））。シリンジポンプ１０６を駆動し、シリンジを押して、第１のチューブ１０５内の溶液をチップ１０１上の流路に導入する。ここで、流路内部で溶液の反応を行い、反応終了後、制御機１１５は、再度シリンジポンプ１０６を駆動し、シリンジ１０７の押しまたは引き操作により、流路内部の溶液を導出する。チップ１０１内の流路から導出された溶液は、廃液ボトル１１１に溜められる。
【００２４】
図１（Ｈ）を用いて、流路内部の液体を除去させる動作について説明する。制御機１１５は、流路内部の液体の除去の指示を受けると、第１のアクチュエータ１０８を駆動し、チップ１０１上の流路と第１のチューブ１０５との接続を解除する。そして、アスピレータ１１３をＯｎにし、チップ１０１上の流路内部に残っている溶液を吸引して、流路内部の液体を除去させる。このとき、チップ１０１内の流路中の残留液体は、廃液ボトル１１１に溜まることになる。
【００２５】
図１（Ｉ）は、ポンプ以外の駆動部を持たない場合の本システムの構成例を示している。この場合、チップ１０１上の流路に第１のチューブ１０５が第１のコネクタ１０４により、第２のチューブ１１０が第２のコネクタ１０９により接続され、固定されている。
【００２６】
また、第１のチューブ１０５には溶液導入多方弁１１６が接続され、溶液導入多方弁１１６の分岐口には溶液導入チューブ１１７が接続されている。溶液導入チューブ１１７のもう片端は試薬容器に挿入されている。第１のチューブ１０５には圧力開放多方弁１１８が接続されており、圧力開放多方弁１１８の分岐口には圧力開放チューブ１１９が接続され、圧力開放チューブ１１９のもう片端は大気開放となっている。溶液導入多方弁１１６と圧力開放多方弁１１８は、経路切替指示に基づいて、制御機１１５により、経路を切り替えることができるようになっている。試薬容器１０２の溶液を導入する際は、溶液導入多方弁１１６を切り替えて、シリンジ１０７から第１のチューブ１０５の経路を溶液導入チューブ１１７に接続し、シリンジポンプ１０６を駆動することで、溶液を第１のチューブ１０５に吸入することができる。また、流路の液体を除去する際は、圧力開放多方弁１１８を切り替えて、チップ１０１上の流路からコネクタ１０４を介して第１のチューブ１０５に接続されている経路を圧力開放チューブ１１９に接続し、アスピレータ１１３をＯｎにすることで、流路内部に残留している溶液を吸引することができる。
【００２７】
図２、図３を用いて、上記操作により２種の溶液を順次導入した際の、流路内部の様子について説明する。流路には、担体として突起構造物を有するものや微粒子を配列したものを設けることも考えられるが、ここでは、ビーズを流路内部に配列した例について説明する。
【００２８】
図２は、図１（Ｈ）の液体除去操作を行わない場合に得られる結果を説明する模式図である。流路２０１には、複数のビーズ２０２が並べられている（図２（Ａ））。ここに、図２（Ｂ）に示すように、流路２０１に第１の液体２０３を導入し、その後、図２（Ｃ）に示すように、流路２０１から第１の液体２０３を導出すると、ビーズ２０２と流路２０１の内壁との隙間に液体２０４が残留してしまう。この残留液体がある状態で、図２（Ｄ）に示すように第２の液体２０５を導入すると、図２（Ｅ）に示すように、ビーズ２０２と流路２０１の内壁との隙間に気泡２０６が生じてしまう。
【００２９】
一方、図３は、図１（Ｈ）の液体除去操作を行った場合に得られる結果とその効果を説明する模式図である。図２（Ａ）と同様に、複数のビーズ３０２を並べた流路３０１に（図３（Ａ））、流路３０１に第１の液体３０３を導入し（図３（Ｂ））、その後、図３（Ｃ）に示すように、流路３０１から第１の液体３０３を導出すると、ビーズ３０２と流路３０１の内壁との隙間に液体３０４が残留してしまう。次に、液体除去操作を行い、残留液除去部により流路３０１内から残留した液体３０４を排出する。液体除去操作終了後に、第２の液体３０５の導入を行うと、図３（Ｆ）に示すように、気泡が生じることなく、第２の液体３０５が流路３０１へ導入できる。
【００３０】
以上のように、液体除去操作を実行することにより、流路に気泡を生じさせること無く、流路へ溶液を挿入し、流路から溶液を導出することができるようになる。
【００３１】
なお、ここでは、流路の液体を除去させる手段として、アスピレータを用いているが、それをビーズ（担体）の温度を調整する温度制御部であるヒータと置き換えても同様の効果が得られるものである。
【００３２】
＜第２の実施形態＞
本実施形態は、第１の実施形態で説明した化学反応システム１００を用いたアプリケーションの適用形態である。複数の担体を持つ流路において様々な化学反応・生化学反応を行うことができるが、ここでは一例として、ビーズを一列に並べた流路でアレルギー診断を目的とした抗原抗体反応を行う工程について示す。検出方法は、二つに大別される。１つは、蛍光標識した２次抗体と励起光源を用いた蛍光検出法、もう一つは、酵素標識した２次抗体とその酵素と反応する発光気質を用いた化学発光法である。本例では、検出時に気泡の影響を受けやすい、化学発光の例のみを取り上げることにする。ただし、蛍光検出においても、本発明の化学反応システムが適用できるのは明らかである。
【００３３】
図４は、アレルギー診断における抗原抗体反応を説明するためのフローチャートを示している。反応前の準備工程として、アレルゲンをビーズに固定し（Ｓ１１）、ビーズを流路に任意の配列で並べておく（Ｓ１２）。
【００３４】
本発明の化学反応システム１００に関連する動作工程を示しているのは、Ｓ１３からＳ３０である。なお、S１３からS１６の工程は血液サンプル反応を、S１７からS２０の工程は血液サンプル反応後の洗浄を、S２１からS２４の工程は２次抗体反応を、S２５からS２８の工程は２次抗体反応後の洗浄を、さらに、S２９からS３０の工程は化学発光検出反応を、それぞれ示している。血液サンプルとしては、たとえば、血液、血液に抗凝固剤や生理食塩水等を添加した血液希釈液、血清、血漿等が挙げられる。なお、Ｓ１３乃至Ｓ１６、Ｓ１７乃至Ｓ２０、Ｓ２１乃至Ｓ２４、及びＳ２５乃至Ｓ２８のそれぞれは、上述の第１の実施形態で説明した溶液の導入、導出排出、及び液体除去の動作と同様の方法（図１（Ｂ）乃至（Ｈ）参照）で実行される。ここでは、Ｓ１３からＳ１６で血液サンプルの導入・導出を、Ｓ２１〜Ｓ２４で２次抗体の導入・導出を、順次行っているが、血液サンプルと２次抗体は、順次導入しても、同時に導入しても、混合した混合液を導入してもかまわない。ビーズに固定化したアレルゲンに反応した血液サンプル中の物質に２次抗体を効率的に反応させる観点からは、血液サンプルと２次抗体は順次導入するのが好ましい。
【００３５】
まず、血液サンプル反応フローが実行される。つまり、流路に血液サンプルを導入し（Ｓ１３）、流通させて、ビーズ上のアレルゲンに血液サンプルに含まれるアレルゲン特異免疫グロブリンＥを捕捉する反応を行う（Ｓ１４）。反応後、血液サンプルを流路から導出し（Ｓ１５）、アスピレータにより流路内部に残留している液体を排出する（Ｓ１６）。
【００３６】
次に、血液サンプル反応後の洗浄フローが実行される。つまり、流路に洗浄溶液を導入し（Ｓ１７）、流通させて、ビーズ表面や流路内壁に残っている未反応の物質を洗浄する（Ｓ１８）。洗浄後、洗浄溶液を流路から導出し（Ｓ１９）、アスピレータにより流路内部に残留している溶液を排出する（Ｓ２０）。
【００３７】
続いて、２次抗体反応フローが実行される。つまり、流路に２次抗体溶液として酵素標識された抗免疫グロブリンＥ抗体を導入し（Ｓ２１）、ビーズ上に捕捉されているアレルゲン免疫グロブリンＥと反応させる（Ｓ２２）。反応後、溶液を流路から導出し（Ｓ２３）、アスピレータにより流路内部に残留している溶液を排出する（Ｓ２４）。
【００３８】
さらに、２次抗体反応後の洗浄フローが実行される。つまり、流路に洗浄溶液を導入し（Ｓ２５）、流通させて、ビーズ表面や流路内壁に残っている未反応の物質を洗浄する（Ｓ２６）。洗浄後、洗浄溶液を流路から導出し（Ｓ２７）、アスピレータにより流路内部に残留している溶液をアスピレータにより排出する（Ｓ２８）。
【００３９】
最後に、化学発光検出反応のフローが実行される。つまり、流路にルミノールと過酸化水素を含む発光基質を導入し（Ｓ２９）、ビーズ上に存在する酵素との反応により、化学発光を生じさせ、検出器により計測する（Ｓ３０）。
【００４０】
従来の化学反応システムでは、Ｓ１６、Ｓ２０、Ｓ２４、Ｓ２８の排出・除去工程を行わないため、図２で説明したように、流路とビーズや、ビーズ同士の隙間に溶液が残ってしまうことになる。この後に、流路に溶液を導入すると、残った溶液が混入し、気泡が流路と樹脂ビーズとの隙間に生じてしまう。しかし、本発明の化学反応システム１００におけるＳ１６、Ｓ２０、Ｓ２４、Ｓ２８の工程の追加により、図４中の溶液導入工程の何れにおいても、気泡の発生を防ぐことができる。
【００４１】
気泡の影響については、次に図５で実際の反応検出結果を示し、説明する。要約すると、気泡が発生した結果、反応した抗体量を示す検出シグナルの値がばらつくことになる。それは、気泡によるビーズと溶液との接触面積の低下、洗浄を行う際の洗浄効率のばらつきが原因である。また、図４のＳ３０の工程において、ビーズと流路の隙間に気泡が存在している場合、化学発光により生じた光が気泡により散乱・屈折し、実際の発光量と検出器で得られる計測結果に違いが生じてしまう。
【００４２】
２次抗体と発光基質を均一に反応させ、化学発光反応により生じた光が気泡で散乱・屈折し検出シグナルのばらつきが生じることを防ぐ観点から、Ｓ２８で流路に残留する洗浄液を排出・除去することが好ましい。また、血液サンプル中の抗原と２次抗体を均一に効率よく反応させる観点から、Ｓ２０で流路に残留する洗浄液を排出・除去し、２次抗体の残留と気泡の発生を抑制することが好ましい。また、洗浄液により流路中で未反応の血液サンプル・２次抗体を効率的に洗浄する観点から、Ｓ１６、Ｓ２４で流路に残留する血液サンプル及び２次抗体を排出・除去することが好ましい。もっとも好ましい工程としては、Ｓ１６、Ｓ２０、Ｓ２４、Ｓ２８で流路に残留する溶液を排出・除去することである。
【００４３】
ここでは、化学発光計測を例に述べたが、蛍光計測など他の光計測全てに上記計測誤りは生じうる。
【００４４】
本方式により計測した例を以下に述べる。スギ花粉アレルゲン特異免疫グロブリンＥの検出を行った。スギ花粉アレルゲンを直径１００μｍの樹脂ビーズに固定した検査用ビーズと、ブロッキング剤を樹脂ビーズに固定したダミーのビーズを任意の配列でアクリルのチップ上に形成した幅１１０μｍ、深さ１３０μｍの流路に並べた。流路にスギ花粉特異免疫グロブリンＥが５０ｎｇ／ｍＬ含まれるヒト血清を５０μＬ導入し、毎分１０μＬで２０分往復流通させた。その後、流路からヒト血清を導出し、アスピレータにより１０秒間吸引する工程を３回繰り返した。
【００４５】
続いて、流路に洗浄溶液（リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）、Ｔｗｅｅｎ（０．０５％））を４０μＬ導入し、毎分１０μＬで４分一方向に流通させた。その後、流路から溶液を導出し、アスピレータにより１０秒間吸引する工程を２回繰り返した。次に、流路に２次抗体溶液（１０００ｎｇ／ｍＬ抗ヒト免疫グロブリンＥ抗体−ＨＲＰ）を５０μＬ導入し、毎分１０μＬで２０分往復流通させた。その後、流路から溶液を導出し、アスピレータにより１０秒間吸引する工程を３回繰り返した。さらに、流路に洗浄溶液（リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）、Ｔｗｅｅｎ（０．０５％））を４０μＬ導入し、毎分１０μＬで４分一方向に流通させた。その後、流路から溶液を導出し、アスピレータにより１０秒間吸引する工程を２回繰り返した。最後に、流路に発光基質（ルミノール、過酸化水素）を導入し、ＣＣＤカメラを用いて検査用ビーズからの発光を計測した。図５は計測結果の例である。
【００４６】
なお、上記のアスピレータの吸引時間やその回数は、予備実験を行い検討した結果を採用している。溶液の粘性や、マイクロ流体デバイスの形態による流路抵抗の違いから、これらのパラメータを変更する必要性が生じる。しかし、本化学反応システム１００にはＣＣＤカメラ等の光検出器１２０が備わっており、残留液体の挙動を常時画像としてモニタできるため、使用するマイクロ流体デバイスの違いによるパラメータの条件変更は比較的容易である。液体の除去が不十分な場合には、吸引回数を増やす等の制御をＣＣＤカメラによる画像認識で自動化することも可能である。
【００４７】
図５（Ａ）は、気泡が発生していないときの計測結果を示している。ＣＣＤ像５０１に示すように、流路５０３に３つの検査用ビーズ５０４と各検査用ビーズ５０４の間にダミーのビーズ５０５が３つずつ配列されている。発光基質５０６を導入したときに生じた化学発光を計測し、解析したプロファイル５０２には、検査用ビーズ５０４の位置から理想的なピーク５０７が検出されている。
【００４８】
一方、図５（Ｂ）は、気泡が発生したときの計測結果を示している。これは、図４におけるＳ２８の残留液体の排出・除去工程を省いた場合の典型的な結果である。ＣＣＤ像５０１に示すように、検査用ビーズ５０４とダミーのビーズ５０５は図５（Ａ）と同じ順序で配列されているが、液体除去工程を行わずに発光基質５０６を導入したため、気泡５０８が生じている。その結果、気泡５０８が検査用ビーズ５０４の周囲に存在する場合、プロファイル５０２に示すように、理想的なピーク５０７に比較して発光強度が低く、ピーク幅が広い、気泡の影響を受けたピーク５０９が検出される。
【００４９】
また、図４におけるＳ２８以外の残留液体の排出・液体除去工程であるＳ１６、Ｓ２０、Ｓ２４の何れかを省いた場合では、反応時の気泡が反応効率に影響し、検査用ビーズ５０４間でピーク強度がばらつくことになる。
【００５０】
＜第３の実施形態＞
図６は、本発明の第３の実施形態による化学反応システム６００を示す図である。この化学反応システム６００は、第１の実施形態の変形例に係るものである。図６において、チップ６０１上の流路の開放端の一端は、第１のコネクタ６０２と第１のチューブ６０３を介して、コンプレッサー６０４に接続されている。チップ６０１上の流路の開放端のもう片端は、第２のコネクタ６０５と第２のチューブ６０６を介して、廃液ボトル６０７に接続されている。第１のチューブ６０３は第１のアクチュエータ６０８に保持されており、第１のアクチュエータ６０８は第２のアクチュエータ６０９に搭載されている。第２のチューブ６０６は第３のアクチュエータ６１０に保持されている。第１のアクチュエータ６０８はｙ方向に、第２のアクチュエータと第３のアクチュエータはｚ方向に駆動させることができる。
【００５１】
図６には示されてはいないが、第１のアクチュエータ６０８には、シリンジに接続された溶液導入用のチューブ（図１（Ａ）の第１のチューブ１０５）が、ｙ軸に垂直、ｚ軸に並行に、第１のチューブ６０３と異なる位置に保持されている。そして、第１のアクチュエータ６０８を駆動させることで、チップ６０１上の流路と第１のチューブ６０３とを接続するか、チップ６０１上にシリンジに接続された溶液導入用チューブとを接続するかを、選択することができるようになっている。
【００５２】
このような構成を備える化学反応システム６００において、チップ６０１上の流路の液体除去操作は、コンプレッサー６０４をＯｎにし、流路内部に残留する液体を押し出して、廃液ボトル６０７に排出することにより実行される。
【００５３】
なお、ここでは、流路の液体を除去させる手段として、コンプレッサーを用いているが、それをビーズ（担体）の温度を調整する温度制御部であるヒータと置き換えても同様の効果が得られるものである。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１（Ａ）】本発明の第１の実施形態による化学反応システムの概略構成図である。
【図１（Ｂ）】試薬容器から溶液を分注し、流路に導入する工程を示す図である。
【図１（Ｃ）】試薬容器から溶液を分注し、流路に導入する工程を示す図である。
【図１（Ｄ）】試薬容器から溶液を分注し、流路に導入する工程を示す図である。
【図１（Ｅ）】試薬容器から溶液を分注し、流路に導入する工程を示す図である。
【図１（Ｆ）】試薬容器から溶液を分注し、流路に導入する工程を示す図である。
【図１（Ｇ）】試薬容器から溶液を分注し、流路に導入する工程を示す図である。
【図１（Ｈ）】流路内部の液体を除去させる工程を示す図である。
【図１（Ｉ）】多方弁を用いて、溶液導入する工程を示す図である。
【図２】流路内部の液体除去を行わずに、溶液を順次導入する工程を示す図である。
【図３】流路内部の液体除去を行い、溶液を順次導入する工程を示す図である。
【図４】本発明の第２の実施形態に基づくアレルギー診断を行う工程を説明するためのフローチャートである。
【図５】本発明の第２の実施形態に基づくアレルギー診断の計測結果を示す図である。
【図６】本発明の第３の実施形態に基づく化学反応システムの概略構成図である。
【符号の説明】
【００５５】
１０１：チップ、１０２：試薬容器、１０３：ステージ、１０４：第１のコネクタ、１０５：第１のチューブ、１０６：シリンジポンプ、１０７：シリンジ、１０８：第１のアクチュエータ、１０９：第２のコネクタ、１１０：第２のチューブ、１１１：廃液ボトル、１１２：第３のチューブ、１１３：アスピレータ、１１４：第２のアクチュエータ、１１５：制御機、１１６：溶液導入多方弁、１１７：溶液導入チューブ、１１８：圧力開放多方弁、１１９：圧力開放チューブ、１２０：光検出器、１２１：第１の基板、１２２：第２の基板、２０１：流路、２０２：ビーズ、２０３：第１の液体、２０４：液体、２０５：第２の液体、２０６：気泡、３０１：流路、３０２：ビーズ、３０３：第１の液体、３０４：液体、３０５：第２の液体、５０１：ＣＣＤ像、５０２：プロファイル、５０３：流路、５０４：検査用ビーズ、５０５：ダミーのビーズ、５０６：発光基質、５０７：理想的なピーク、５０８：気泡、５０９：気泡の影響を受けたピーク、６０１：チップ、６０２：第１のコネクタ、６０３：第１のチューブ、６０４：コンプレッサー、６０５：第２のコネクタ、６０６：第２のチューブ、６０７：廃液ボトル、６０８：第１のアクチュエータ、６０９：第２のアクチュエータ、６１０：第３のアクチュエータ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学反応システム、及び化学反応方法、並びに抗原抗体反応の判定方法に関し、例えば、微小な空間での化学反応を利用した化学反応システム、及び化学反応方法、並びに抗原抗体反応の判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、微小な空間を構成し、化学反応を行わせる技術が発展しつつある。微小な空間を構成する方法としては、半導体の製造工程で使用される微細加工技術を用いる方法がある。例えば、フォトリソグラフィー工程やエッチング工程を経て、シリコン基板やガラス基板に溝パターンを構成し、その上に別の基板を貼り付けることで微小な流路を形成して、流路内の流体を駆動するマイクロ流体デバイスを構成できる。そして、これらの微小空間を利用した化学反応による物質生産（非特許文献１参照）や化学分析（非特許文献２参照）が提案されている。
【０００３】
また、生体関連分子を計測する方法として、プローブ分子を固相に固定し、そのプローブ分子に捕捉された生体関連分子を計測する方法がある。例えば、異なるプローブ分子が固定された複数の担体や構造物が納められた微小な流路に試料を送液し、試料内の生体関連分子を担体や構造物上に捕捉し、計測する方法が提案されている（非特許文献３参照）。
【０００４】
一方、マイクロ流体デバイスの流路内で流体を正確に駆動するために、（マイクロ流体デバイス内に分岐構造を設けることや、表面を修飾することで、）溶液内の気泡を除去する方法がある。例えば、溶液を駆動する流路と分岐させた表面が親水性である流路を形成し、溶液内の気体を除去する方法が提案されている（特許文献１参照）。また、少なくとも二つのチャンネルが任意の領域において並行接触部分を形成しており、一つのチャンネルのみの内表面を化学修飾されているマイクロ流体デバイスにおいて、気液の多相流を操作し、溶液内の気体を除去する方法が提案されている（特許文献２参照）。
【０００５】
【非特許文献１】Analytical Chemistry, 74, 3112-3117(2002)
【非特許文献２】Analytical Chemistry, 73, 2112-2116(2001)
【非特許文献３】Nucleic Acids Research, 30, e87(2002)
【特許文献１】特開２００２−１０２６８１号公報
【特許文献２】特開２００５−１６９３８６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ところで、化学および生化学の分野にマイクロ流体デバイスを応用しようとする場合には、特に反応の効率化を図る観点からも、流路内に複数の担体を設置して利用することが多い。この担体としては、たとえば壁からの突起や流路内部に設置されるビーズや微粒子などが挙げられる。これら複数の担体を含む流路に対して、その化学反応の目的に応じた複数種類の液体を順次送液することが必要である。
【０００７】
しかしながら、この際、複数の担体が納められたマイクロ流体デバイスの流路では、液体が流通できる領域に広い部分と狭い部分が存在するため、流路と担体との隙間に気泡が生じやすいという問題が存在する。この気泡は、化学反応の効率を低下させる、化学反応の均一性を低下させる、溶液の流路内部での滞留時間分布を大きく広げてしまう、光計測時に光の散乱等が生じ正確な光量の計測ができなくなる、光計測時のクロストークを生じる原因となる、など化学反応デバイスの性能向上を妨げる大きな原因の一つとなってしまう。
【０００８】
この気泡は次のように発生すると考えられる。つまり、ある液体を流路に導入し、その後、その液体を排出する場合、複数の担体が納められたマイクロ流体デバイスの流路では、流路と担体との隙間に液体が残りやすい。マイクロ流路のスケールでこのような現象が起こるのは、液体の流れによる慣性力に対し液体の表面張力の寄与が大きくなってくるためである。このように流路と担体との隙間に液体が残った状態で、次の液体が導入されると、導入時に流れの分布が生じて均一に液体を導入することができず、結果として流路と担体との隙間に気泡が残ると考えられる。生じた気泡を取り除く方法として、流路に導入した液体の流れを用いて、気泡を押し出すことが考えられる。
【０００９】
しかし、マイクロ流体デバイスで通常想定されている液体の容量は小さいため、気泡を押し出すのに十分な流れを生じさせることは現実的には難しい。
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、複数の担体が納められたマイクロ流路に対して、気泡を生じさせずに溶液を導入する化学反応デバイス等を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するために、本発明では、複数の担体が配置された流路に第１の液体を導入し、次いで第１の液体を導出して、残留液除去部により流路に残留する液体を除去させてから、前記流路に第２の液体を導入することで、気泡の発生を抑制する化学反応システムを提供する。残留液除去部により流路から一旦液体を除去させることで、通常では流路に残ってしまう液体をほぼ完全に排出することが可能となるため、気泡が発生させることなく次の液体を導入することができる。
【００１１】
すなわち、本発明による化学反応システムは、流路と、前記流路の少なくとも一部に配置される複数の担体と、前記流路に第１の液体と第２の液体とを導入する液体導入部と、前記流路から前記第１の液体を導出する液体導出部と、前記流路から前記第１の液体を導出した後に前記流路の液体を除去させる残留液除去部とを有する。ここでの残留液除去部には、一般的に、アスピレータやコンプレッサー等の気体を流通させる気体制御部や、ヒータなどの担体の温度を調整する温度制御部を用いることができる。担体はビーズや、複数の突起構造物、などである。流路は、第１の基板に設けた溝と、溝を覆って設置される第２の基板とから構成されるものが多いが、ガラス等のキャピラリーの内部もこれに含まれる。
【００１２】
第１の液体と第２の液体の液量については、１マイクロリットルから１ミリリットルの範囲で操作する。また、第１の液体と第２の液体とを導入する速度については、毎分１マイクロリットルから毎分１ミリリットルで操作する。このような範囲で液体の容量や流速を設定すると、通常流路内部に頻繁に気泡が発生してしまう。しかし、本発明によりその気泡発生を回避できるという効果が得られる。
【００１３】
さらなる本発明の特徴は、以下本発明の実施するための最良の形態および添付図面によって明らかになるものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、複数の担体が納められたマイクロ流体デバイスに用いられてきた従来の化学反応システムに、気体流通手段を具備する残留液除去部を追加し、それを用いて、液体操作後の流路に残った残留液体を排出、除去する工程を追加することで、反応効率の低下や担体間の反応のばらつき、計測時の光散乱の原因となる、気泡の発生を防ぐことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下に、本発明の実施形態を、図を参照にして詳細に説明する。ただし、本実施形態は、本発明を実現するための1例に過ぎず、本発明の技術的範囲を限定するものではないことに注意すべきである。
【００１６】
＜第１の実施形態＞
図１は、本発明の第１の実施形態に関わる化学反応システム１００を模式的に示す図である。ここでは、溶液の導入と流路の液体を除去する構成及び動作について説明する。まず、図１（Ａ）を用いて、構成について説明する。化学反応システム１００では、流路が形成されたチップ１０１と試薬容器１０２がステージ１０３上に設置されている。
【００１７】
チップ１０１には、第１の基板１２１の上に図のｘ軸に沿った方向に主流路が形成されており、第２の基板１２２は主流路を覆って設置されている。また、主流路と第１のチューブ１０５、第２のチューブ１１０を配管するための開放端に繋がる副流路がｚ軸に沿った方向に形成されている。チップ１０１は、いわゆるコの字型の流路を持つマイクロ流体デバイスである。なお、チップ１０１の主流路、副流路の断面形状は、四角でも、丸でも良い。即ち、キャピラリーの内部を流路とし用いても良い。
【００１８】
試薬容器１０２に関しては、簡単のために、図１（Ａ）ではステージ上に３個セットされた例が示されているが、個数は３個に限られるものではなく、容器のセット数は使用する試薬の数によって変更できるようになっている。
【００１９】
チップ１０１上の流路の開放端の一端は、第１のコネクタ１０４と第１のチューブ１０５を介してシリンジポンプ１０６にセットされたシリンジ１０７と接続される。また、第１のチューブ１０５は第１のアクチュエータ１０８により保持されている。チップ１０１上の流路の開放端の片端は第２のコネクタ１０９と第２のチューブ１１０を介して廃液ボトル１１１に接続されており、さらに廃液ボトル１１１は第３のチューブ１１２を介してアスピレータ１１３と接続されている。第２のチューブ１１０は第２のアクチュエータ１１４により保持されている。制御機１１５による制御によって、ステージ１０３はｘ方向に、第１のアクチュエータ１０８及び第２のアクチュエータ１１４はｚ方向にそれぞれ駆動することができるようになっている。また、シリンジポンプ１０６は制御機１１５により、シリンジ１０７の押し引き駆動を制御することができる。アスピレータ１１３は制御機１１５により、Ｏｎ／Ｏｆｆを制御できる。光検出器１２０は、チップ１０１の流路内の流体挙動や反応後の光検出に用いる。なお、光検出器１２０として、ＣＣＤカメラ、ホトマル、ホトダイオード等を用いることができる。
【００２０】
図１（Ａ）は、チップ１０１の流路、第１のチューブ１０５と第２のチューブ１１０が、第１のコネクタ１０４と第２のコネクタ１０５を介して、接続されており、シリンジ１０７の押しの動作で、チップ１０１内の流路に溶液を導入し、また反応後は、溶液を導出することができる状態を示している。溶液の導入や導出、さらにそれらの送液速度は、シリンジポンプ１０６の移動距離と移動スピードで制御する。本システムにおけるハンドリング可能な溶液量は、１マイクロリットルから１ミリリットルである。また、送液速度は、毎分１マイクロリットルから毎分１ミリリットルの範囲で変更可能なものである。
【００２１】
送液量と送液速度を最適化すれば、発生した気泡を押し出すことができるということは一般的に知られている。しかしながら、実際には、送液に使用する試薬量にはコストの面で制限があり、また、送液速度も反応した生体物質に影響を与えないように設定する必要がある。このため、上記した使用溶液量と送液速度は、これらの現実的な状況を踏まえて設定されたものである。
【００２２】
続いて、図１（Ｂ）から（Ｇ）を用いて、チップ１０１上の流路への溶液の導入、及び流路からの溶液の導出の動作について説明する。まず、図１（Ｂ）に示すように、制御機１１５は、溶液の導入及び導出の指示を受けると、第１のアクチュエータ１０８及び第２のアクチュエータ１１４を駆動し、チップ１０１の流路と第１のチューブ１０５及び第２のチューブ１１０の接続を解除する。
【００２３】
次に、図１（Ｃ）に示すように、制御機１１５は、ステージ１０３を駆動し、３つの試薬容器１０２の内の１つの試薬容器上の開口部の中心位置に、第１のチューブ１０５の開口部中心を移動させ、その後に第１のアクチュエータ１０８を駆動し、チューブ１０５を試薬容器１０２の中に挿入する（図１（Ｄ））。挿入後、シリンジポンプ１０６を駆動し、シリンジ１０７を引いて、第１のチューブ１０５に試薬容器１０２の溶液を吸入する。シリンジ１０７が予め設定したある一定量の溶液を吸入した後、制御機１１５は、第１のアクチュエータ１０８を駆動し、第１のチューブ１０５を試薬容器１０２から取り出す（図１（Ｅ））。次に、図１（Ｆ）に示すように、制御機１１５は、ステージ１０３を駆動し、チップ１０１の位置をチューブ１０５及び第２のチューブ１１０の位置に移動させ、第１のアクチュエータ１０８及び第２のアクチュエータ１１４を駆動し、第１のチューブ１０５及び第２のチューブ１１０をチップ１０１上の流路と接続させる（図１（Ｇ））。シリンジポンプ１０６を駆動し、シリンジを押して、第１のチューブ１０５内の溶液をチップ１０１上の流路に導入する。ここで、流路内部で溶液の反応を行い、反応終了後、制御機１１５は、再度シリンジポンプ１０６を駆動し、シリンジ１０７の押しまたは引き操作により、流路内部の溶液を導出する。チップ１０１内の流路から導出された溶液は、廃液ボトル１１１に溜められる。
【００２４】
図１（Ｈ）を用いて、流路内部の液体を除去させる動作について説明する。制御機１１５は、流路内部の液体の除去の指示を受けると、第１のアクチュエータ１０８を駆動し、チップ１０１上の流路と第１のチューブ１０５との接続を解除する。そして、アスピレータ１１３をＯｎにし、チップ１０１上の流路内部に残っている溶液を吸引して、流路内部の液体を除去させる。このとき、チップ１０１内の流路中の残留液体は、廃液ボトル１１１に溜まることになる。
【００２５】
図１（Ｉ）は、ポンプ以外の駆動部を持たない場合の本システムの構成例を示している。この場合、チップ１０１上の流路に第１のチューブ１０５が第１のコネクタ１０４により、第２のチューブ１１０が第２のコネクタ１０９により接続され、固定されている。
【００２６】
また、第１のチューブ１０５には溶液導入多方弁１１６が接続され、溶液導入多方弁１１６の分岐口には溶液導入チューブ１１７が接続されている。溶液導入チューブ１１７のもう片端は試薬容器に挿入されている。第１のチューブ１０５には圧力開放多方弁１１８が接続されており、圧力開放多方弁１１８の分岐口には圧力開放チューブ１１９が接続され、圧力開放チューブ１１９のもう片端は大気開放となっている。溶液導入多方弁１１６と圧力開放多方弁１１８は、経路切替指示に基づいて、制御機１１５により、経路を切り替えることができるようになっている。試薬容器１０２の溶液を導入する際は、溶液導入多方弁１１６を切り替えて、シリンジ１０７から第１のチューブ１０５の経路を溶液導入チューブ１１７に接続し、シリンジポンプ１０６を駆動することで、溶液を第１のチューブ１０５に吸入することができる。また、流路の液体を除去する際は、圧力開放多方弁１１８を切り替えて、チップ１０１上の流路からコネクタ１０４を介して第１のチューブ１０５に接続されている経路を圧力開放チューブ１１９に接続し、アスピレータ１１３をＯｎにすることで、流路内部に残留している溶液を吸引することができる。
【００２７】
図２、図３を用いて、上記操作により２種の溶液を順次導入した際の、流路内部の様子について説明する。流路には、担体として突起構造物を有するものや微粒子を配列したものを設けることも考えられるが、ここでは、ビーズを流路内部に配列した例について説明する。
【００２８】
図２は、図１（Ｈ）の液体除去操作を行わない場合に得られる結果を説明する模式図である。流路２０１には、複数のビーズ２０２が並べられている（図２（Ａ））。ここに、図２（Ｂ）に示すように、流路２０１に第１の液体２０３を導入し、その後、図２（Ｃ）に示すように、流路２０１から第１の液体２０３を導出すると、ビーズ２０２と流路２０１の内壁との隙間に液体２０４が残留してしまう。この残留液体がある状態で、図２（Ｄ）に示すように第２の液体２０５を導入すると、図２（Ｅ）に示すように、ビーズ２０２と流路２０１の内壁との隙間に気泡２０６が生じてしまう。
【００２９】
一方、図３は、図１（Ｈ）の液体除去操作を行った場合に得られる結果とその効果を説明する模式図である。図２（Ａ）と同様に、複数のビーズ３０２を並べた流路３０１に（図３（Ａ））、流路３０１に第１の液体３０３を導入し（図３（Ｂ））、その後、図３（Ｃ）に示すように、流路３０１から第１の液体３０３を導出すると、ビーズ３０２と流路３０１の内壁との隙間に液体３０４が残留してしまう。次に、液体除去操作を行い、残留液除去部により流路３０１内から残留した液体３０４を排出する。液体除去操作終了後に、第２の液体３０５の導入を行うと、図３（Ｆ）に示すように、気泡が生じることなく、第２の液体３０５が流路３０１へ導入できる。
【００３０】
以上のように、液体除去操作を実行することにより、流路に気泡を生じさせること無く、流路へ溶液を挿入し、流路から溶液を導出することができるようになる。
【００３１】
なお、ここでは、流路の液体を除去させる手段として、アスピレータを用いているが、それをビーズ（担体）の温度を調整する温度制御部であるヒータと置き換えても同様の効果が得られるものである。
【００３２】
＜第２の実施形態＞
本実施形態は、第１の実施形態で説明した化学反応システム１００を用いたアプリケーションの適用形態である。複数の担体を持つ流路において様々な化学反応・生化学反応を行うことができるが、ここでは一例として、ビーズを一列に並べた流路でアレルギー診断を目的とした抗原抗体反応を行う工程について示す。検出方法は、二つに大別される。１つは、蛍光標識した２次抗体と励起光源を用いた蛍光検出法、もう一つは、酵素標識した２次抗体とその酵素と反応する発光気質を用いた化学発光法である。本例では、検出時に気泡の影響を受けやすい、化学発光の例のみを取り上げることにする。ただし、蛍光検出においても、本発明の化学反応システムが適用できるのは明らかである。
【００３３】
図４は、アレルギー診断における抗原抗体反応を説明するためのフローチャートを示している。反応前の準備工程として、アレルゲンをビーズに固定し（Ｓ１１）、ビーズを流路に任意の配列で並べておく（Ｓ１２）。
【００３４】
本発明の化学反応システム１００に関連する動作工程を示しているのは、Ｓ１３からＳ３０である。なお、S１３からS１６の工程は血液サンプル反応を、S１７からS２０の工程は血液サンプル反応後の洗浄を、S２１からS２４の工程は２次抗体反応を、S２５からS２８の工程は２次抗体反応後の洗浄を、さらに、S２９からS３０の工程は化学発光検出反応を、それぞれ示している。血液サンプルとしては、たとえば、血液、血液に抗凝固剤や生理食塩水等を添加した血液希釈液、血清、血漿等が挙げられる。なお、Ｓ１３乃至Ｓ１６、Ｓ１７乃至Ｓ２０、Ｓ２１乃至Ｓ２４、及びＳ２５乃至Ｓ２８のそれぞれは、上述の第１の実施形態で説明した溶液の導入、導出排出、及び液体除去の動作と同様の方法（図１（Ｂ）乃至（Ｈ）参照）で実行される。ここでは、Ｓ１３からＳ１６で血液サンプルの導入・導出を、Ｓ２１〜Ｓ２４で２次抗体の導入・導出を、順次行っているが、血液サンプルと２次抗体は、順次導入しても、同時に導入しても、混合した混合液を導入してもかまわない。ビーズに固定化したアレルゲンに反応した血液サンプル中の物質に２次抗体を効率的に反応させる観点からは、血液サンプルと２次抗体は順次導入するのが好ましい。
【００３５】
まず、血液サンプル反応フローが実行される。つまり、流路に血液サンプルを導入し（Ｓ１３）、流通させて、ビーズ上のアレルゲンに血液サンプルに含まれるアレルゲン特異免疫グロブリンＥを捕捉する反応を行う（Ｓ１４）。反応後、血液サンプルを流路から導出し（Ｓ１５）、アスピレータにより流路内部に残留している液体を排出する（Ｓ１６）。
【００３６】
次に、血液サンプル反応後の洗浄フローが実行される。つまり、流路に洗浄溶液を導入し（Ｓ１７）、流通させて、ビーズ表面や流路内壁に残っている未反応の物質を洗浄する（Ｓ１８）。洗浄後、洗浄溶液を流路から導出し（Ｓ１９）、アスピレータにより流路内部に残留している溶液を排出する（Ｓ２０）。
【００３７】
続いて、２次抗体反応フローが実行される。つまり、流路に２次抗体溶液として酵素標識された抗免疫グロブリンＥ抗体を導入し（Ｓ２１）、ビーズ上に捕捉されているアレルゲン免疫グロブリンＥと反応させる（Ｓ２２）。反応後、溶液を流路から導出し（Ｓ２３）、アスピレータにより流路内部に残留している溶液を排出する（Ｓ２４）。
【００３８】
さらに、２次抗体反応後の洗浄フローが実行される。つまり、流路に洗浄溶液を導入し（Ｓ２５）、流通させて、ビーズ表面や流路内壁に残っている未反応の物質を洗浄する（Ｓ２６）。洗浄後、洗浄溶液を流路から導出し（Ｓ２７）、アスピレータにより流路内部に残留している溶液をアスピレータにより排出する（Ｓ２８）。
【００３９】
最後に、化学発光検出反応のフローが実行される。つまり、流路にルミノールと過酸化水素を含む発光基質を導入し（Ｓ２９）、ビーズ上に存在する酵素との反応により、化学発光を生じさせ、検出器により計測する（Ｓ３０）。
【００４０】
従来の化学反応システムでは、Ｓ１６、Ｓ２０、Ｓ２４、Ｓ２８の排出・除去工程を行わないため、図２で説明したように、流路とビーズや、ビーズ同士の隙間に溶液が残ってしまうことになる。この後に、流路に溶液を導入すると、残った溶液が混入し、気泡が流路と樹脂ビーズとの隙間に生じてしまう。しかし、本発明の化学反応システム１００におけるＳ１６、Ｓ２０、Ｓ２４、Ｓ２８の工程の追加により、図４中の溶液導入工程の何れにおいても、気泡の発生を防ぐことができる。
【００４１】
気泡の影響については、次に図５で実際の反応検出結果を示し、説明する。要約すると、気泡が発生した結果、反応した抗体量を示す検出シグナルの値がばらつくことになる。それは、気泡によるビーズと溶液との接触面積の低下、洗浄を行う際の洗浄効率のばらつきが原因である。また、図４のＳ３０の工程において、ビーズと流路の隙間に気泡が存在している場合、化学発光により生じた光が気泡により散乱・屈折し、実際の発光量と検出器で得られる計測結果に違いが生じてしまう。
【００４２】
２次抗体と発光基質を均一に反応させ、化学発光反応により生じた光が気泡で散乱・屈折し検出シグナルのばらつきが生じることを防ぐ観点から、Ｓ２８で流路に残留する洗浄液を排出・除去することが好ましい。また、血液サンプル中の抗原と２次抗体を均一に効率よく反応させる観点から、Ｓ２０で流路に残留する洗浄液を排出・除去し、２次抗体の残留と気泡の発生を抑制することが好ましい。また、洗浄液により流路中で未反応の血液サンプル・２次抗体を効率的に洗浄する観点から、Ｓ１６、Ｓ２４で流路に残留する血液サンプル及び２次抗体を排出・除去することが好ましい。もっとも好ましい工程としては、Ｓ１６、Ｓ２０、Ｓ２４、Ｓ２８で流路に残留する溶液を排出・除去することである。
【００４３】
ここでは、化学発光計測を例に述べたが、蛍光計測など他の光計測全てに上記計測誤りは生じうる。
【００４４】
本方式により計測した例を以下に述べる。スギ花粉アレルゲン特異免疫グロブリンＥの検出を行った。スギ花粉アレルゲンを直径１００μｍの樹脂ビーズに固定した検査用ビーズと、ブロッキング剤を樹脂ビーズに固定したダミーのビーズを任意の配列でアクリルのチップ上に形成した幅１１０μｍ、深さ１３０μｍの流路に並べた。流路にスギ花粉特異免疫グロブリンＥが５０ｎｇ／ｍＬ含まれるヒト血清を５０μＬ導入し、毎分１０μＬで２０分往復流通させた。その後、流路からヒト血清を導出し、アスピレータにより１０秒間吸引する工程を３回繰り返した。
【００４５】
続いて、流路に洗浄溶液（リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）、Ｔｗｅｅｎ（０．０５％））を４０μＬ導入し、毎分１０μＬで４分一方向に流通させた。その後、流路から溶液を導出し、アスピレータにより１０秒間吸引する工程を２回繰り返した。次に、流路に２次抗体溶液（１０００ｎｇ／ｍＬ抗ヒト免疫グロブリンＥ抗体−ＨＲＰ）を５０μＬ導入し、毎分１０μＬで２０分往復流通させた。その後、流路から溶液を導出し、アスピレータにより１０秒間吸引する工程を３回繰り返した。さらに、流路に洗浄溶液（リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）、Ｔｗｅｅｎ（０．０５％））を４０μＬ導入し、毎分１０μＬで４分一方向に流通させた。その後、流路から溶液を導出し、アスピレータにより１０秒間吸引する工程を２回繰り返した。最後に、流路に発光基質（ルミノール、過酸化水素）を導入し、ＣＣＤカメラを用いて検査用ビーズからの発光を計測した。図５は計測結果の例である。
【００４６】
なお、上記のアスピレータの吸引時間やその回数は、予備実験を行い検討した結果を採用している。溶液の粘性や、マイクロ流体デバイスの形態による流路抵抗の違いから、これらのパラメータを変更する必要性が生じる。しかし、本化学反応システム１００にはＣＣＤカメラ等の光検出器１２０が備わっており、残留液体の挙動を常時画像としてモニタできるため、使用するマイクロ流体デバイスの違いによるパラメータの条件変更は比較的容易である。液体の除去が不十分な場合には、吸引回数を増やす等の制御をＣＣＤカメラによる画像認識で自動化することも可能である。
【００４７】
図５（Ａ）は、気泡が発生していないときの計測結果を示している。ＣＣＤ像５０１に示すように、流路５０３に３つの検査用ビーズ５０４と各検査用ビーズ５０４の間にダミーのビーズ５０５が３つずつ配列されている。発光基質５０６を導入したときに生じた化学発光を計測し、解析したプロファイル５０２には、検査用ビーズ５０４の位置から理想的なピーク５０７が検出されている。
【００４８】
一方、図５（Ｂ）は、気泡が発生したときの計測結果を示している。これは、図４におけるＳ２８の残留液体の排出・除去工程を省いた場合の典型的な結果である。ＣＣＤ像５０１に示すように、検査用ビーズ５０４とダミーのビーズ５０５は図５（Ａ）と同じ順序で配列されているが、液体除去工程を行わずに発光基質５０６を導入したため、気泡５０８が生じている。その結果、気泡５０８が検査用ビーズ５０４の周囲に存在する場合、プロファイル５０２に示すように、理想的なピーク５０７に比較して発光強度が低く、ピーク幅が広い、気泡の影響を受けたピーク５０９が検出される。
【００４９】
また、図４におけるＳ２８以外の残留液体の排出・液体除去工程であるＳ１６、Ｓ２０、Ｓ２４の何れかを省いた場合では、反応時の気泡が反応効率に影響し、検査用ビーズ５０４間でピーク強度がばらつくことになる。
【００５０】
＜第３の実施形態＞
図６は、本発明の第３の実施形態による化学反応システム６００を示す図である。この化学反応システム６００は、第１の実施形態の変形例に係るものである。図６において、チップ６０１上の流路の開放端の一端は、第１のコネクタ６０２と第１のチューブ６０３を介して、コンプレッサー６０４に接続されている。チップ６０１上の流路の開放端のもう片端は、第２のコネクタ６０５と第２のチューブ６０６を介して、廃液ボトル６０７に接続されている。第１のチューブ６０３は第１のアクチュエータ６０８に保持されており、第１のアクチュエータ６０８は第２のアクチュエータ６０９に搭載されている。第２のチューブ６０６は第３のアクチュエータ６１０に保持されている。第１のアクチュエータ６０８はｙ方向に、第２のアクチュエータと第３のアクチュエータはｚ方向に駆動させることができる。
【００５１】
図６には示されてはいないが、第１のアクチュエータ６０８には、シリンジに接続された溶液導入用のチューブ（図１（Ａ）の第１のチューブ１０５）が、ｙ軸に垂直、ｚ軸に並行に、第１のチューブ６０３と異なる位置に保持されている。そして、第１のアクチュエータ６０８を駆動させることで、チップ６０１上の流路と第１のチューブ６０３とを接続するか、チップ６０１上にシリンジに接続された溶液導入用チューブとを接続するかを、選択することができるようになっている。
【００５２】
このような構成を備える化学反応システム６００において、チップ６０１上の流路の液体除去操作は、コンプレッサー６０４をＯｎにし、流路内部に残留する液体を押し出して、廃液ボトル６０７に排出することにより実行される。
【００５３】
なお、ここでは、流路の液体を除去させる手段として、コンプレッサーを用いているが、それをビーズ（担体）の温度を調整する温度制御部であるヒータと置き換えても同様の効果が得られるものである。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１（Ａ）】本発明の第１の実施形態による化学反応システムの概略構成図である。
【図１（Ｂ）】試薬容器から溶液を分注し、流路に導入する工程を示す図である。
【図１（Ｃ）】試薬容器から溶液を分注し、流路に導入する工程を示す図である。
【図１（Ｄ）】試薬容器から溶液を分注し、流路に導入する工程を示す図である。
【図１（Ｅ）】試薬容器から溶液を分注し、流路に導入する工程を示す図である。
【図１（Ｆ）】試薬容器から溶液を分注し、流路に導入する工程を示す図である。
【図１（Ｇ）】試薬容器から溶液を分注し、流路に導入する工程を示す図である。
【図１（Ｈ）】流路内部の液体を除去させる工程を示す図である。
【図１（Ｉ）】多方弁を用いて、溶液導入する工程を示す図である。
【図２】流路内部の液体除去を行わずに、溶液を順次導入する工程を示す図である。
【図３】流路内部の液体除去を行い、溶液を順次導入する工程を示す図である。
【図４】本発明の第２の実施形態に基づくアレルギー診断を行う工程を説明するためのフローチャートである。
【図５】本発明の第２の実施形態に基づくアレルギー診断の計測結果を示す図である。
【図６】本発明の第３の実施形態に基づく化学反応システムの概略構成図である。
【符号の説明】
【００５５】
１０１：チップ、１０２：試薬容器、１０３：ステージ、１０４：第１のコネクタ、１０５：第１のチューブ、１０６：シリンジポンプ、１０７：シリンジ、１０８：第１のアクチュエータ、１０９：第２のコネクタ、１１０：第２のチューブ、１１１：廃液ボトル、１１２：第３のチューブ、１１３：アスピレータ、１１４：第２のアクチュエータ、１１５：制御機、１１６：溶液導入多方弁、１１７：溶液導入チューブ、１１８：圧力開放多方弁、１１９：圧力開放チューブ、１２０：光検出器、１２１：第１の基板、１２２：第２の基板、２０１：流路、２０２：ビーズ、２０３：第１の液体、２０４：液体、２０５：第２の液体、２０６：気泡、３０１：流路、３０２：ビーズ、３０３：第１の液体、３０４：液体、３０５：第２の液体、５０１：ＣＣＤ像、５０２：プロファイル、５０３：流路、５０４：検査用ビーズ、５０５：ダミーのビーズ、５０６：発光基質、５０７：理想的なピーク、５０８：気泡、５０９：気泡の影響を受けたピーク、６０１：チップ、６０２：第１のコネクタ、６０３：第１のチューブ、６０４：コンプレッサー、６０５：第２のコネクタ、６０６：第２のチューブ、６０７：廃液ボトル、６０８：第１のアクチュエータ、６０９：第２のアクチュエータ、６１０：第３のアクチュエータ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一部に複数の担体が配置される流路と、
前記流路に液体を導入する液体導入部と、
前記流路から液体を導出する液体導出部と、
前記流路に残留する液体を除去する残留液除去部と、
を備えることを特徴とする化学反応システム。
【請求項２】
前記残留液除去部は、前記流路に気体を流通させる気体制御部を含むことを特徴とする請求項１に記載の化学反応システム。
【請求項３】
前記残留液除去部は、アスピレータを含むことを特徴とする請求項２に記載の化学反応システム。
【請求項４】
前記残留液除去部は、コンプレッサーを含むことを特徴とする請求項２に記載の化学反応システム。
【請求項５】
前記残留液除去部は、前記担体の温度を調整する温度制御部を含むことを特徴とする請求項１乃至４の何れか１項に記載の化学反応システム。
【請求項６】
前記担体は、ビーズであることを特徴とする請求項１乃至５の何れか１項に記載の化学反応システム。
【請求項７】
前記流路が、第１の基板に設けた溝と、前記溝を覆って設置される第２の基板とによって構成されることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載の化学反応システム。
【請求項８】
前記流路が、キャピラリーの内部に構成されていることを特徴とする請求項１乃至６の何れか１項に記載の化学反応システム。
【請求項９】
前記流路に導入される液体の液量は、１マイクロリットルから１ミリリットルの範囲に含まれることを特徴とする請求項１乃至８の何れか１項に記載の化学反応システム。
【請求項１０】
前記流路に液体を導入する速度は、毎分１マイクロリットルから毎分１ミリリットルの範囲に含まれることを特徴とする請求項１乃至９の何れか１項に記載の化学反応システム。
【請求項１１】
さらに、前記流路内の化学反応を検出するための光検出器を備えることを特徴とする請求項１乃至１０の何れか１項に記載の化学反応システム。
【請求項１２】
前記検出器が光検出器であることを特徴とする請求項１１に記載の化学反応システム。
【請求項１３】
前記光検出器が、前記流路内の担体から発生した化学発光に伴う光を検出することを特徴とする請求項１２に記載の化学反応システム。
【請求項１４】
流路を有する微小空間において液体の化学反応を起こさせる化学反応方法であって、
少なくとも一部に複数の担体が配置された流路に、液体導入部を用いて、第１の液体を導入する第１の工程と、
液体導出部を用いて、前記流路から前記第１の液体を導出する第２の工程と、
残留液除去部を用いて、前記第２の工程後に前記流路に残留する液体を除去する第３の工程と、
前記第３の工程後に、前記液体導入部を用いて、前記第1の液体とは異なる第２の液体を前記流路に導入する第４の工程と、
を備えることを特徴とする化学反応方法。
【請求項１５】
さらに、前記第４の工程後に、検出器を用いて、前記流路内の化学反応を検出する第５の工程を備えることを特徴とする請求項１４に記載の化学反応方法。
【請求項１６】
前記検出器は光検出器であって、前記第５の工程において前記流路内の担体から発生した化学発光に伴う光を検出することを特徴とする請求項１５に記載の化学反応方法。
【請求項１７】
請求項１３に記載の化学反応システムを用いる、抗原抗体反応の判定方法であって、
抗原又は抗体を複数の担体に固定化する第１の工程と、
前記抗原又は抗体が固定化された前記複数の担体を流路に配列する第２の工程と、
前記複数の担体が配列された流路に血液サンプルを導入・導出する第３の工程と、
前記流路に２次抗体溶液を導入・導出する第４の工程と、
前記流路に洗浄液を導入・導出する第５の工程と、
前記流路に発光基質液を導入する第６の工程と、
前記光検出器により前記担体からの化学発光を検出する第７の工程と、
前記第４の工程及び前記第５の工程のいずれかの工程又は両方の工程の後に、前記流路に残留する液体を除去する工程と、
を備えることを特徴とする抗原抗体反応の判定方法。
【請求項１８】
前記第１の工程の後に、前記流路に残留する液体を除去する工程をさらに備えることを特徴とする請求項１７記載の判定方法。
【請求項１９】
前記第１の工程において前記複数の担体に固定化された抗原又は抗体がアレルゲンであって、アレルギー反応を判定することを特徴とする請求項１７又は１８記載の判定方法。
【請求項１】
少なくとも一部に複数の担体が配置される流路と、
前記流路に液体を導入する液体導入部と、
前記流路から液体を導出する液体導出部と、
前記流路に残留する液体を除去する残留液除去部と、
を備えることを特徴とする化学反応システム。
【請求項２】
前記残留液除去部は、前記流路に気体を流通させる気体制御部を含むことを特徴とする請求項１に記載の化学反応システム。
【請求項３】
前記残留液除去部は、アスピレータを含むことを特徴とする請求項２に記載の化学反応システム。
【請求項４】
前記残留液除去部は、コンプレッサーを含むことを特徴とする請求項２に記載の化学反応システム。
【請求項５】
前記残留液除去部は、前記担体の温度を調整する温度制御部を含むことを特徴とする請求項１乃至４の何れか１項に記載の化学反応システム。
【請求項６】
前記担体は、ビーズであることを特徴とする請求項１乃至５の何れか１項に記載の化学反応システム。
【請求項７】
前記流路が、第１の基板に設けた溝と、前記溝を覆って設置される第２の基板とによって構成されることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載の化学反応システム。
【請求項８】
前記流路が、キャピラリーの内部に構成されていることを特徴とする請求項１乃至６の何れか１項に記載の化学反応システム。
【請求項９】
前記流路に導入される液体の液量は、１マイクロリットルから１ミリリットルの範囲に含まれることを特徴とする請求項１乃至８の何れか１項に記載の化学反応システム。
【請求項１０】
前記流路に液体を導入する速度は、毎分１マイクロリットルから毎分１ミリリットルの範囲に含まれることを特徴とする請求項１乃至９の何れか１項に記載の化学反応システム。
【請求項１１】
さらに、前記流路内の化学反応を検出するための光検出器を備えることを特徴とする請求項１乃至１０の何れか１項に記載の化学反応システム。
【請求項１２】
前記検出器が光検出器であることを特徴とする請求項１１に記載の化学反応システム。
【請求項１３】
前記光検出器が、前記流路内の担体から発生した化学発光に伴う光を検出することを特徴とする請求項１２に記載の化学反応システム。
【請求項１４】
流路を有する微小空間において液体の化学反応を起こさせる化学反応方法であって、
少なくとも一部に複数の担体が配置された流路に、液体導入部を用いて、第１の液体を導入する第１の工程と、
液体導出部を用いて、前記流路から前記第１の液体を導出する第２の工程と、
残留液除去部を用いて、前記第２の工程後に前記流路に残留する液体を除去する第３の工程と、
前記第３の工程後に、前記液体導入部を用いて、前記第1の液体とは異なる第２の液体を前記流路に導入する第４の工程と、
を備えることを特徴とする化学反応方法。
【請求項１５】
さらに、前記第４の工程後に、検出器を用いて、前記流路内の化学反応を検出する第５の工程を備えることを特徴とする請求項１４に記載の化学反応方法。
【請求項１６】
前記検出器は光検出器であって、前記第５の工程において前記流路内の担体から発生した化学発光に伴う光を検出することを特徴とする請求項１５に記載の化学反応方法。
【請求項１７】
請求項１３に記載の化学反応システムを用いる、抗原抗体反応の判定方法であって、
抗原又は抗体を複数の担体に固定化する第１の工程と、
前記抗原又は抗体が固定化された前記複数の担体を流路に配列する第２の工程と、
前記複数の担体が配列された流路に血液サンプルを導入・導出する第３の工程と、
前記流路に２次抗体溶液を導入・導出する第４の工程と、
前記流路に洗浄液を導入・導出する第５の工程と、
前記流路に発光基質液を導入する第６の工程と、
前記光検出器により前記担体からの化学発光を検出する第７の工程と、
前記第４の工程及び前記第５の工程のいずれかの工程又は両方の工程の後に、前記流路に残留する液体を除去する工程と、
を備えることを特徴とする抗原抗体反応の判定方法。
【請求項１８】
前記第１の工程の後に、前記流路に残留する液体を除去する工程をさらに備えることを特徴とする請求項１７記載の判定方法。
【請求項１９】
前記第１の工程において前記複数の担体に固定化された抗原又は抗体がアレルゲンであって、アレルギー反応を判定することを特徴とする請求項１７又は１８記載の判定方法。
【図１（Ａ）】
【図１（Ｂ）】
【図１（Ｃ）】
【図１（Ｄ）】
【図１（Ｅ）】
【図１（Ｆ）】
【図１（Ｇ）】
【図１（Ｈ）】
【図１（Ｉ）】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図１（Ｂ）】
【図１（Ｃ）】
【図１（Ｄ）】
【図１（Ｅ）】
【図１（Ｆ）】
【図１（Ｇ）】
【図１（Ｈ）】
【図１（Ｉ）】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００９−６６５１２（Ｐ２００９−６６５１２Ａ）
【公開日】平成２１年４月２日（２００９．４．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２３７０９２（Ｐ２００７−２３７０９２）
【出願日】平成１９年９月１２日（２００７．９．１２）
【出願人】（０００００４４５５）日立化成工業株式会社 (4,649)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年４月２日（２００９．４．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年９月１２日（２００７．９．１２）
【出願人】（０００００４４５５）日立化成工業株式会社 (4,649)
【Ｆターム（参考）】
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