心房細動の治療のための化合物
アデノシンＡ２Ａレセプターアンタゴニストは、ヒトを含めた哺乳動物において心房細動に対する医薬の製造に有用である。アデノシンＡ２Ａレセプターはヒト心房筋細胞に存在し、心房細動を引き起こす病理メカニズムに関与していることが見出された。当業界において知られている他の薬剤よりＡ２Ａアンタゴニストを用いる利点は、Ａ２Ａアンタゴニストが心房細動の患者を特に標的としていることである。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本発明は、ヒトおよび獣医学の分野に関し、特に心血管疾患の治療のための化合物、とりわけ心房細動の治療のための化合物に関する。
【０００２】
発明の背景
心房細動は、最も一般的な不整脈であり、高い罹患率および死亡率と関連している。その発生率および頻度はますます増加し、それは臨床的および経済的負担の増大となる（現在の頻度は全人口の２％である）。動悸、眩暈、呼吸困難などの重篤な臨床症状に加え、心房細動は、７５歳以上の人々における虚血性脳梗塞において、単一の最も重要な因子である。全体的にみれば、心房細動は、心血管疾患による入院の５％以上を占める。心房細動は、約９０％のケースにおいて、他の心疾患、例えば高血圧性心疾患、うっ血性心不全、または心臓弁疾患を伴い発生している。わずか１０％のケースにおいて、心房細動は、他の心臓異常を伴わずに発生している（心房細動“単独”）。心房細動は三つの形態に分類される：（１）数秒〜数日にわたる期間の自己終結型心房細動の発症(episode)により特徴づけられる発作性心房細動、（２）医療介入により、終結されるまで無期限に続く持続性心房細動、そして（３）薬理的または電気的除細動により、終結されない恒久型心房細動である。
【０００３】
いくつかの研究により、心房細動が、心房周辺においてランダムに変動する多数の回帰性電気小波から生じていることが示された。これらの小波は、左心房から肺静脈の近位５〜６ｃｍ部分へ伸びる心筋スリーブに通常位置する電気的トリガーにより生じている。心房細動が誘発されると、不整脈の持続に関与する、その電気的、機械的、および代謝的性質に影響を及ぼす心房の変化（心房リモデリング）が生まれる。心房細動の存在下において、心室拍数の制御が高められ、心拍数の制御が医学的治療により抑制できないと、心頻拍性筋障害（tachycardiomyopathy）と通常称される、心室拡張および心収縮機能障害に至る。発作および血栓塞栓症は、心房細動に関連した死亡および罹患の主原因であり、これの基本的な病態生理学的基礎は、血流の異常（例えば心房静止）と内皮または心臓内障害を伴うプロトロンボチック（prothrombotic）または過凝血状態である。
【０００４】
心臓学における他の下位体系専門分野(subspecialty)では、この４０年の間に不整脈の診断および治療において重要な進展を遂げた。多大な進歩にもかかわらず、不整脈の現実の療法および不整脈突然死の防止は、少数の患者において行なわれているに過ぎない。今日、心房細動療法は、適宜に、心房細動関連症状の減少、血栓塞栓合併症の防止、および不整脈の終結からなる。
【０００５】
一般的に、心房細動の処置には二つのアプローチ（ ａ）不整脈自体の治療およびｂ）血栓塞栓の危険性の減少)がある（ｃｆ．M.B.lqbal et al.,”Recent developments in atrial fibrillation”,British Medical Journal,2005,vol.330,pp.238-43）。不整脈の治療には、調律制御（洞調律の回復および維持）と、心拍数制御とがある。薬理学的に、調律および心拍数制御は、抗不整脈薬（クラスＩおよびクラスIII抗不整脈剤）により治療されている。現在用いられているそれらの例は、フレカイニド、プロパフェノン、アミオダロン、ドフェチリド、イブチリド、およびソタロールである。非薬理学的に、調律および心拍数制御は、電気的除細動、心房性ペーシング、埋込み可能な心房除細動器、高周波カテーテル切除、および外科的迷路処置(surgical maze procedure)により行なわれる。
【０００６】
血栓塞栓の危険性の減少、ひいては発作防止は、治療の戦略上極めて重要である。薬理学的には、アスピリンおよびワルファリンが、心房血栓形成および血栓塞栓事象を防止するために、大多数の患者において推奨されている。高い危険性を有する患者の試験から集積されたデータは、発作を防止する上でワルファリンがアスピリンより良いが、ワルファリンにおいて大出血の危険性がアスピリンの場合より２倍であることを示した。いずれにしても、抗凝血治療は、年齢、共存症、および禁忌に基づき個別に行なう必要がある。非薬理学的に、血栓塞栓の危険性の減少は、左心房付属器の切除またはカテーテル（研究中の処置）により現在、実施されている。
【０００７】
最近の研究は、薬理学的および非薬理学的双方の治療戦略への新たなアプローチに向けられている。最も有望な薬剤は、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）インヒビターおよびアンギオテンシンIIレセプター遮断薬である。プロテアーゼインヒビター、十分な選択性および特異性のホスファターゼ、または抗酸化剤も、構造的変化、心房拡張、および収縮性機能不全を減少または逆転させる上で、新たな治療戦略をもたらす。しかしながら、心房細動の治療の問題は、なお満足のゆくようには解決されていない。
【発明の概要】
【０００８】
本発明者らは、医薬品の周知のグループ、即ちアデノシンＡ２Ａレセプターアンタゴニストが、ヒトを含めた哺乳動物において心房細動に対する医薬の製造に有用であることを見出した。
【０００９】
本発明は、意外にもアデノシンＡ２Ａレセプターが、ヒト心房筋細胞に存在し、心房細動を引き起こす病理メカニズムに関与していることを見出した。特に、本発明者らは、原形質膜で機能種であるホモダイマーアデノシンＡ２Ａレセプター種の発現が心房細動の患者で上方調節されていることを見出した。電気生理学実験においては、これら患者からの心房筋細胞におけるアデノシンＡ２Ａレセプターの活性化が、カルシウム波として測定される自発的筋小胞体カルシウム放出において、プロテインキナーゼＡ媒介性の増加に至ることを証明した。
【００１０】
さらに、二つの異なる実験アプローチ（共焦点カルシウム画像法およびパッチクランプ技術）を用いて、本発明者らは、心房細動において見られるカルシウム波振動数上昇をアデノシンＡ２Ａレセプターアンタゴニストにより減少させたことを見出した。実際に、アデノシンＡ２Ａレセプターアンタゴニストは、カルシウム波によりアゴニスト刺激効果を逆転させるのみならず、基礎カルシウム波振動数も減少させる。一緒にすると、これらの結果は、細胞内カルシウム流動のアデノシンＡ２Ａレセプター媒介調節異常が細動心房の複雑な電気的リモデリングの一因であることを示唆している。これらの事実は、アデノシンＡ２Ａレセプターアンタゴニストを心房細動を治療するための選択的治療剤として方向づけられている。
【００１１】
これまでに、最近の調査研究として、本発明者らは、心房細動期のある患者から摘出された右心房筋細胞が、この不整脈のない患者からの筋細胞より頻繁な自発的筋小胞体Ｃａ２＋放出を示すことのみを記載した（ｃｆ．L.Hove-Madsen et al.,”Atrial fibrillation is associated with increased spontaneous calcium release from the sarcoplasmic reticulum in human atrial myocytes”,Circulation,2004,vol.September,pp.1358-63）。
【００１２】
したがって、本発明は、ヒトを含む哺乳動物における心房細動の予防および／または治療用の医薬の製造のためのアデノシンＡ２Ａレセプターアンタゴニストの使用に関する。以下において、“アデノシンＡ２Ａレセプターアンタゴニスト”は“Ａ２Ａアンタゴニスト”として、“アデノシンＡ２Ａレセプター”は“Ａ２Ａレセプター”として称される。本発明のこの態様は、適量の許容される希釈剤または担体と一緒に有効量のＡ２Ａアンタゴニストを、必要な哺乳動物（好ましくはヒト）へ投与することからなる、Ａ２Ａレセプターで拮抗することによる心房細動の予防および／または治療のための方法としても、一方では明確に表されている。
【００１３】
当業界において知られる他の薬剤よりＡ２Ａアンタゴニストを用いる利点は、Ａ２Ａアンタゴニストが心房細動の患者を特に標的としていることである。このように、機能性ダイマーＡ２Ａレセプターの発現は、正常な心房の大きさをもつ過去に心房細動病歴のない患者において低いが、ダイマーレセプター種の発現は心房細動のある患者において強く上方調節される。ところが、現在用いられている他の薬剤は、様々な細胞において多数の機能を大きく調節するレセプターまたはチャンネルでより広く作用する。こうして、カルシウムアンタゴニストはＬ型カルシウムチャンネルを阻害することにより、カルシウム過負荷を減少させるのみならず、心臓収縮性も減少させる。さらに、Ｌ型カルシウム電流は平滑筋機能と分泌細胞とを、結果としてカルシウムアンタゴニストの望ましくない副作用と共に調節する。
【００１４】
Ａ２Ａレセプター
アデノシンは、体内において全ての代謝活性細胞により産生されるプリンヌクレオシドである。アデノシンは、細胞表面レセプターの四種の異なるサブタイプ：Ｇタンパク質結合レセプタースーパーファミリーに属するＡ１、Ａ２Ａ、Ａ２Ｂ、およびＡ３を介して、その効果を発揮する。Ａ１およびＡ３は阻害性Ｇタンパク質と結合するが、Ａ２ＡおよびＡ２Ｂは刺激性Ｇタンパク質と結合する。Ａ２Ａレセプターは、脳において、ニューロンおよびグリア細胞の双方において主に見られる（線条および側坐核において最高レベル、嗅球と視床下部および海馬領域において中〜高レベル）。線条において、Ａ２Ａレセプターは、神経伝達物質の放出および機能を調節する（ｃｆ．H.Kase et al.,”Progress in pursuit of therapeutic A2A antagonists:the adenosine A2A receptor selective antagonist KW6002:research and development toward a novel nondopaminergic therapy for Parkinson’s disease”,Neurology,2003,vol.61,pp.97-100）。末梢組織において、Ａ２Ａレセプターは、血小板、好中球、脾臓、胸腺、内皮、および血管平滑筋細胞に存在することが知られ、そこでは冠状動脈心疾患の患者において、心筋灌流の評価をなしうる強い冠状血管拡張を誘導する（ｃｆ．Z.Gao et al.,”Novel short-acting A2A adenosine receptor agonists for coronary vasodilatation:inverse relationship between affinity and duration od action of A2A agonists”,J.Pharmacol.Exp.Ther.,2001,vol.298,pp.209-18）。しかしながら、Ａ２Ａレセプターは、これまでにヒト心房筋細胞に存在していないとされてきた。
【００１５】
心房細動を治療するために適した化合物
一般的に、アンタゴニストは、レセプターを活性化することなしに、レセプターと結合する分子である。それはレセプターの結合部位における内在性リガンドまたは基質と競合し、よって内在性リガンド結合に応答して細胞内シグナルを伝達しうるレセプターの能力を阻害する。アンタゴニストは、いくつかの様式により機能している。それは、Ａ２Ａレセプターへのアデノシンの結合を実質的に妨害、阻止、または防止し、それによりアデノシン媒介生物活性を阻害、抑制するか、またはその停止を引き起こすために十分な親和性および特異性により、アデノシンと結合またはそれを隔離しうる。
【００１６】
Ａ２Ａレセプターは、心筋細胞において、内在性リガンドの非存在下において、基礎活性を呈する。この活性は、該レセプターの構成的活性によるか、または内在性アデノシンによるレセプターの活性化によるものである。この状況下において、心房細動の治療は、アンタゴニストまたは逆作動薬(inverse agonist)を用いてこの基礎活性を低下させることにより行なえる。本発明のＡ２Ａアンタゴニストの一部は、逆作動(inverse agonism)を発揮しうる。
【００１７】
Ａ２Ａレセプターの既知局在性および機能に従い、Ａ２Ａアンタゴニストは、パーキンソンおよびＣＮＳ（精神分裂症、アルツハイマー病における老人性痴呆、器質因性の(organic origin)精神病など）の他の疾患に対して、これまで用いられてきた。それらの中で、主なものはパーキンソン病である。
【００１８】
あらゆるＡ２Ａアンタゴニストが、本発明の目的に沿う使用に検討される。多くの異なる化合物が、Ａ２Ａアンタゴニストとして詳細に研究されてきたが、これらは二つの大きな群（キサンチン誘導体および非キサンチン複素環類）に分類される。
【００１９】
本発明の具体的な態様において、Ａ２Ａアンタゴニストは、キサンチン誘導体またはその薬学上許容される塩である。様々な位置における異なる置換基でも、プリン環のデアゾ-アナログもしくはアゾ-アナログまたは他の複素環式アナログあるいは三または四環式誘導体／アナログであっても、類似のＡ２Ａ拮抗活性を有しうる。キサンチン誘導体の中で、ある化合物に共通した、好ましい構造は１，３，７‐トリアルキル‐８‐スチリル‐キサンチン構造である。好ましい態様において、Ａ２Ａアンタゴニストは、ＤＭＰＸとして知られるテオブロミン（式１）、ＫＦ１７８３７（式２）、ＫＷ６００２として知られるイストラデフィリン（式３）、ｐ‐スルホスチリル‐ＤＭＰＸ（式４）、ＢＳ‐ＤＭＰＸ（式５）、ＭＳＸ‐２（式６）、ＣＳＣ（式７）、キサンチンアミン同族体（ＸＡＣ、式８）、およびＭＳＸ‐３からなる群より選択される化合物である。
【００２０】
さらに好ましい態様において、Ａ２ＡアンタゴニストはＫＷ６００２である。現在、この化合物は、パーキンソン病についてフェーズIIIの臨床試験下にある。他の好ましい態様において、Ａ２Ａアンタゴニストは、ＭＳＸ‐２である。他の好ましい態様において、Ａ２Ａアンタゴニストは、ＭＳＸ‐３、ＭＳＸ‐２のリン酸エステル、ＭＳＸ‐２のプロドラッグである。
【化１】
【００２１】
Ａ２Ａレセプター拮抗活性を示すことが知られた他のキサンチン化合物は、例えば米国特許第５４８４９２０号、米国特許第５５８７３７８号、米国特許第５５４３４１５号、およびＥＰ１０１６４０７Ａ１号において記載されている。
【００２２】
本発明の他の具体的態様において、Ａ２Ａアンタゴニストは、非キサンチン複素環である。典型的な非キサンチンアデノシンＡ２Ａアンタゴニストはアデニンから誘導され、様々な置換基を有する一、二、三、および四環式化合物を含めた最広義のアデニン誘導体を表す。Ａ２Ａ拮抗活性を有した、アデニンから誘導されない、別の複素環式化合物が同定された。Ａ２Ａレセプター拮抗作用を示す、ある２-アミノピリジン化合物が知られ（例えば、ＷＯ０２／１４２８２号、ＷＯ０１／２５２１０号）、ある９-アミノピリミジン化合物も知られている（例えば、米国特許出願第２００１／００２７１９６号）。
【００２３】
好ましい態様において、Ａ２Ａアンタゴニストは、ＳＣＨ５８２６１（式９）、ＡＮＲ-８２（式１０）、ＺＭ２４１３８５（式１１）、ＳＣＨ６３３９０（式１２）、ＣＧＳ１５９４３（式１３）８ＦＢ-ＰＴＰ（式１４）、ＶＥＲ-６６２３（Ｖ２００６としても知られる、式１５）、（−）Ｒ，Ｓ-メフロキン（式１６）、および７ＦＢ-ＰＴＰ（式１７）からなる群から選択されるものである。さらに好ましい態様において、非キサンチン化合物の群の中で、Ａ２ＡアンタゴニストはＶＥＲ-６６２３である。
【００２４】
Ａ２Ａアンタゴニストとして好ましい他の化合物は、式１８のピラゾロピリミジン誘導体、式１９のトリアゾロキノキサリン誘導体、式２０の９‐置換２‐アミノ‐６‐フリル‐アデニン誘導体、ならびに式２１、２２、および２３のトリアゾロトリアジン誘導体である。
【化２】
【００２５】
他のトリアゾロピリミジンＡ２Ａアンタゴニストは、例えばＷＯ２００４／０２９０５６号、ＷＯ９５／０１３５６号、米国特許第５５６５４６０号、ＷＯ９７／０５１３８号、ＷＯ９８／５２５６８号、ＷＯ０１／９２２６４号、およびＰＣＴ／ＵＳ０２／３２６３０号において開示されている。特に、置換ピラゾール〔４，３‐ｅ〕‐１，２，４‐トリアゾロ‐〔１，５‐ｃ〕ピリミジン化合物が、ＷＯ２００５／０５４２４５号、米国特許出願第２００４／２２０１９４号公報、および米国特許出願第２００３２１２０５９号公報において開示されている。
【００２６】
適切なＡ２Ａアンタゴニストの他の具体例としては下記特許、特許出願、および論文において開示された化合物がある：ＷＯ９５／０１３５６号、米国特許第６６３０４７５号、米国特許第５９３５９６４号、ＷＯ０３／０３２９９６号、ＷＯ０３／０４８１６５号、ＷＯ０３／０４８１６４号、ＷＯ０３／０４８１６３号、ＷＯ２００５／０４２５００号、ＷＯ２００５／０５８８８３号、ＷＯ２００５／０４０１５１号、ＷＯ２００５／０３９５７２号、ＷＯ２００４／０９２１７７号、米国特許出願第２００４１３８２３５号公報、ＷＯ２００４／０１９９４９号、ＷＯ０２／１４２８２号、ＷＯ２００４／０１６６０５号、ＷＯ０３／０８２８７３号、米国特許第５４８４９２０号、米国特許第５７０３０８５号、ＷＯ９２／０６９７６号、ＷＯ９４／０１１１４号、米国特許第５５６５４６０号、ＷＯ９８／４２７１１号、ＷＯ００／７２０１号、ＷＯ９９／４３６７８号、ＷＯ９９／２６６２７号、ＷＯ０１／９２２６４号、ＷＯ９９／３５１４７号、ＷＯ００／１３６８２号、ＷＯ００／１３６８１号、ＷＯ００／６９４６４号、ＷＯ０１／４０２３０号、ＷＯ０１／０２４０９号、ＷＯ０１／０２４００号、ＥＰ１０５４０１２号、ＷＯ０１／６２２３３号、ＷＯ０１／１７９９９号、ＷＯ０１／８０８９３号、ＷＯ０２／１４２８２号、ＷＯ０１／９７７８６号、ＷＯ０１／１６１３４号、ＷＯ００／７３３０７号、米国特許出願第２００５０４３３１５号、米国特許出願第２００３１４９０６０号、Baraldi et al.,”Recent developments in the field of A2A and A3 adenosine receptor antagonists”,European Journal of Medicinal Chemistry,2003,vol.38,pp.367-82、E.Ongini,et al.,”Selective adenosine A2A receptor antagonists”,Farmaco,2001,vol.56,pp.87-90、C.E.Muller et al.,”A2A Adenosine receptor antagonists - future drugs for Parkinson’s disease?”,Drugs of the Future,2000,vol.25,pp.1043-52、L.J.Knutsen et al.,”KW-6002(Kyowa Hakko Kogyo)”,Curr.Opin.Investig.Drugs,2001,vol.2,pp.668-73、B.Cacciari et al.,”Medicinal chemistry of A2A adenosine receptor antagonists”,Curr.Top.Med.Chem.,2003,vol.3,pp.403-11、G.Yao et al.,”Synthesis of alkyne derivatives of novel triazolopyrazine as A2A adenosine receptor antagonists”,Bioorg.Med.Chem.Lett.,2005,vol.15,pp.511-5、E.Kiselgof et al.,”6-(2-furanyl)-9H-purin-2-amine derivatives as A2A adenosine antagonists”,Bioorg.Med.Chem.Lett.,2005,vol.15,pp.2119-22、S.M.Weiss et al.,”Discovery of nonxanthine adenosine A2A receptor antagonists for the treatment of Parkinson’s disease”,Neurology,2003,vol.61(Supp.6),pp.S101-6；C.B.Vu et al.,”Novel diamino derivatives of [1,2,4]triazolo[1,5-a][1,3,5]triazine as potent and selective adenosine A2A receptor antagonists”,J.Med.Chem.,2005,vol.48,pp.2009-18、C.B.Vu et al.,”Piperazine derivatives of [1,2,4]triazolo[1,5-a][1,3,5]triazine as potent and selective adenosine A2A receptor antagonists”,J.Med.Chem.,2004,vol.47,pp.4291-9。
【００２７】
当業者であれば、化合物が本発明の目的にとって、良いＡ２Ａアンタゴニストであるか否かがわかるであろう。例えば、化合物が良いＡ２Ａアンタゴニストであるか否かを評価する適切な方法が当業界にある。例として、米国特許出願第２００４／０１３８２３５号段落番号〔０２２６〕‐〔０２４０〕において記載された放射性リガンド結合アッセイに基づく方法がある。
【００２８】
Ａ２ＡアンタゴニストがＡ２Ａレセプターに選択的であることは、心房細動の治療に好ましい。上記すべてのＡ２ＡアンタゴニストがＡ２Ａレセプターに選択的であるが、選択性の程度はそれらの中でも異なる。選択性は、異なる種（例えばラット、ヒト）においても若干、異なる。
【００２９】
Ａ２Ａアンタゴニストは、引用された特許および出願に記載の公知の方法により製造される。
【００３０】
医薬組成物および投与
治療に関して、有効量とは、有益または望ましい臨床結果に影響を与えるために（即ち、疾患または障害の進行を緩和、改善、安定、逆転、もしくは遅延させるか、または疾患もしくは障害の病的結果を和らげるために）十分である、活性成分の量に関する。有効量は通常、個別に医師により決定される。
【００３１】
治療に際して、本発明による使用向けの活性化合物は、加工していない化合物のままで投与してもよいが、医薬組成物において、一種以上のアジュバント、賦形剤、担体、緩衝剤、希釈剤、および／または他の常用製薬助剤と一緒に、場合により生理学上許容される塩の形態により、活性成分を導入することが好ましい。諸成分は、直腸、口腔、鼻内、および経皮経路を含めた、類似効用を有する剤の投与で許容されるいずれかの投与様式により、動脈内注射、静脈内、腹腔内、非経口、筋肉内、皮下、経口、局所により、吸入剤として、または例えばステント、すなわち動脈挿入円筒ポリマーのような含浸または被覆装置から、単回または複数回に分けて投与される。
【００３２】
投与における他の好ましい様式は、非経口、特に注射による。注射による投与の形態には、水性もしくは油性懸濁液または乳濁液、および無菌水溶液がある。経口投与は、投与に際して他の好ましい経路である。医薬組成物は、錠剤、丸剤、粉末、エリキシル、懸濁液、乳濁液、溶液、シロップ、エアゾル、カプセルなどの形態をとることができる。
【００３３】
本発明の組成物は、当業界において知られた操作を用いることにより、患者へ投与後に活性成分の即時、持続、または遅延放出をなしうるように処方しうる。経口投与用の制御放出薬物送達系としては、ポリマー被覆リザーバーまたは薬物‐ポリマーマトリックス処方物を含有した浸透ポンプ系および溶解系がある。本発明の方法において、使用のための他の処方は、経皮送達装置（“パッチ”）を用いる。このような経皮パッチは、制御された量により、化合物の連続的または断続的注入を行なうために用いられる。
【００３４】
本組成物は、好ましくは単位剤形で処方される。投与量は、疾患の種類および程度に依存し、その決定は医師の裁量に属する。
【００３５】
別記されない限り、ここで用いられているすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する業界の当業者により通常理解されるものと同様の意味を有する。明細書および請求の範囲を通して、“含んでなる”との用語およびその変更態様は、他の技術的特徴、添加物、成分、または工程を除外する意味ではない。本願の要約書もここに付されている。本発明の追加目的、利点、および特徴は、本明細書に記載の試験から当業者に明らかとなるか、または本発明の実施により判明するであろう。以下の実施例および図面は実例で示されているが、本発明はこれらに限定されない。
【発明の具体的説明】
【００３６】
図面の詳細な説明
図１Ａは、抗Ａ２Ａレセプター（パネル１、４、７、および１０）と抗ミオシン（２）、抗α‐アクチニン（５）、抗コネキシン‐４３（８）、または抗ＲｙＲ（１１）により二重染色された、摘出直後のヒト右心房筋細胞を示す。二重免疫蛍光像の二重焼付け（パネル３、６、９、および１２）においては、Ａ２Ａレセプターとα‐アクチニンとの共存およびＡ２Ａレセプターとリアノジンレセプター（ＲｙＲ）との重複分布を現した。図１Ｂは、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥにより分離され、かつウサギ抗Ａ２Ａレセプター抗体を用いてイムノブロットされた、ヒトＡ２Ａレセプターを有する一過性トランスフェクトＨＥＫ細胞からの細胞膜（陽性制御、Ｃ＋）と、洞調律（ＳＩＮＵＳ）または心房細動（ＡＦ）を有する個体から得られたヒト心房膜とを示す。“Ｄｉ”はダイマーを意味し、“Ｍｏ”はモノマーを意味する。図１Ｃは、図１Ｂのイムノブロットの相対濃度走査（Relative Densitometric Scan（ＲＤＳ））を示す。Ａ２Ａレセプター（モノマー＋ダイマー）の全量が黒棒により示される。Ａ２Ａレセプターモノマー（白棒）およびダイマー（灰色棒）の相対量は、各列において、Ａ２Ａレセプター（ダイマー＋モノマー）の全合計を用いて標準化される。
【００３７】
図２Ａにおいて、２００ｎＭ ＣＧＳ２１６８０への心筋細胞の暴露前（対照）、暴露中（ＣＧＳ）、および暴露後（洗浄、Ｗ）に、−８０ｍＶで固定された膜電位で、自発的ＩＮＣＸが記録された。水平および垂直目盛棒は、各々３０ｓおよび１００ｐＡに相当する。図２Ｂは、自発的Ｎａ‐Ｃａ交換電流の数に及ぼすＣＧＳ２１６８０の刺激効果の時間経過を示す（各３０ｓスィープにおける事象としてカウントされた、ｅ／ｓ）。棒上の太線は、ＣＧＳ２１６８０適用期間を示す。図２Ｃは、Ａ２ＡアンタゴニストＺＭ２４１３８５（１μＭ）が自発的ＩＮＣＸで、２００ｎＭ ＣＧＳ２１６８０の刺激効果をどのように逆転させられたかを示す。水平および垂直目盛棒は、各々３０ｓおよび１００ｐＡに相当する。図２Ｄは、心房細動のない対照患者８例およびそれを有する患者１１例からの心筋細胞におけるＣＧＳ効果の概要である。ＣＧＳ２１６８０の効果を評価するために、対応のあるｔ検定(paired t-test)が用いられ、ｐ値を棒上に示す。ＩＮＣＸＦは、ＩＮＣＸ振動数を意味する。図２Ｅは、１０μＭ Ｈ‐８９の添加が患者５例において、２００ｎＭ ＣＧＳ２１６８０の刺激効果を消失させたことを示す。ＡＮＯＶＡは、波振動数に及ぼす治療の有意な効果（ｐ＝０．００１）を示し、事後検定は、ＣＧＳ vs 対照においてｐ＝０．０３、ＣＧＳ vs ＣＧＳ＋Ｈ‐８９においてｐ＝０．００２、およびＣＧＳ＋８９ vs 対照においてｐ＝０．０５を示した。
【００３８】
図３Ａにおいて、Ａ２ＡアンタゴニストＳＣＨ５８２６１（５０ｎＭ）は、心房細動の患者の試料において、自発的ＩＮＣＸ振動数の可逆的減少を引き起こした。水平および垂直目盛棒は、各々３０ｓおよび１００ｐＡに相当する。図３Ｂにおいて、Ａ２Ａアンタゴニストは共焦点カルシウム画像法（左パネル、ｎ＝６）またはパッチ‐クランプ技術（右パネル、ｎ＝７）で測定された自発的カルシウム波振動数（ＷＦ）を双方とも減少させた。ＺＭ２４１３８５およびＳＣＨ５８２６１の５０ｎＭの効果は同程度であり、集計した。共焦点実験に対応のないｔ検定およびパッチ‐クランプ実験に対応のあるｔ検定を用いた統計的な有意差が棒上に示される。
【００３９】
ヒト右心房におけるＡ２Ａレセプターの発現および局在性
ヒト右心房筋細胞におけるＡ２Ａレセプターの存在をイムノブロッティングにより調べた。その結果、Ａ２Ａレセプターが右心房に存在し、該レセプターのモノマーおよびダイマー種双方がこの組織において発現され、洞調律のある心房の試料においてダイマー型が少数であることを示した。心房筋におけるＡ２Ａレセプター局在性が、レセプターＡ２Ａとミオシン、α‐アクチニン、コネキシン‐４３、またはＲｙＲに対する抗体により二重標識された試料によって、共焦点顕微鏡観察により研究された。Ａ２Ａレセプターは心筋線維に沿い横縞状パターンで発現され、筋節においてＺ線のレベルで細胞骨格関連タンパク質α‐アクチニンと共存した。Ａ２Ａレセプターの分布は、心房細動を有するおよび有しない患者の試料において質的に類似した。
【００４０】
心房細動のある患者におけるＡ２Ａレセプター発現の上方調節
摘出された心房筋細胞は、Ａ２Ａレセプター縞状パターンと、心房組織サンプルとにおいて見られるα‐アクチニンとのコロニー化およびＲｙＲとの重複分布を保持していた（図１Ａ参照）。心房細動を有するおよび有しない患者の心筋細胞において、レセプター局在性に差異が観察されなかった（データ示さず）。ウエスタンブロッティングにより測定されたＡ２Ａレセプタータンパク質レベルは心房細動のある患者において著しく増加し（図１Ｂ‐Ｃ参照）、興味深いことに、細胞表面に存在する機能型であるダイマーＡ２Ａレセプター種が心房細動において著しく上昇した（図１Ｃ参照）。有意差は、血管において観察されなかった。したがって、これらの結果は、ヒト心房筋細胞におけるＡ２Ａレセプターの発現のみならず、心房細動のある患者において、主にホモダイマー型でのそれらの上方調節も初めて証明した。
【００４１】
Ａ２Ａレセプターのアゴニスト刺激は、心房細動のある患者において自発的筋小胞体（ＳＲ）カルシウム放出のＰＫＡ依存性増加を誘導する
自発的ＳＲカルシウム放出に及ぼすＡ２Ａレセプターアゴニストの効果を、洞調律のある患者および心房細動のある患者から摘出された心房筋細胞により分析した。局所的な非伝播カルシウム放出（カルシウムスパーク）とＳＲからの再現的カルシウム放出（カルシウム波）との双方を分析した。Ａ２ＡレセプターアゴニストＣＧＳ２１６８０（２００ｎＭ）とのプレインキュベーションは、心房細動を有する患者においてカルシウム波の数を増加させたが、不整脈を有しないものではそうではなかった。
【００４２】
自発的ＳＲカルシウム放出に及ぼすＣＧＳ２１６８０の効果が、膜電位に及ぼす効果に付随的であるか否かを調べるために、−８０ｍＶにおいて膜電位を固定する際にパッチ‐クランプ技術を用いた。これは、ＣＧＳ２１６８０がそれらにより活性化されたＮａ‐Ｃａ交換電流（ＩＮＣＸ）として測定される自発的カルシウム波の数を可逆的に増加させることを妨げなかった（図２ＡおよびＢ参照）。実際に、心房細胞患者におけるＣＧＳ２１６８０の有意な刺激効果をこのアプローチから確認した（図２Ｄ参照）。したがって、ＣＧＳ２１６８０により誘導される自発的ＳＲカルシウム放出の増加は、ＲｙＲ活性のＡ２Ａレセプター依存性調節によるものである。ＣＧＳ２１６８０の特異的効果は、二種の選択的Ａ２ＡアンタゴニストＺＭ２４１３８５（図２Ｃ参照）およびＳＣＨ５８２６１により逆転された。
【００４３】
Ａ２Ａレセプターは、Ｇｓタンパク質に結合されるため、アゴニスト媒介レセプター活性化はｃＡＭＰレベルを増加させ、次いでこれがＰＫＡ活性化とＲｙＲリン酸化とに至る。Ａ２ＡレセプターがＰＫＡのｃＡＭＰ依存性活性化を介して、その効果を発揮するか否かを試験するために、選択的ＰＫＡインヒビターＨ‐８９を用いた。心房細動のある患者の筋細胞において、ＣＧＳ２１６８０の刺激効果がＨ‐８９により失われたが（図２Ｅ参照）、このことは自発的ＳＲカルシウム放出のＡ２Ａレセプター依存性調節が実際にＰＫＡ活性化で媒介されていることを証明している。興味深いことに、Ｈ‐８９はＣＧＳ２１６８０の効果を消失させるのみならず、それはＣＧＳ２１６８０適用前に記録された基準より有意に低いレベルまで自発的カルシウム放出を実際に減少させた。共焦点顕微鏡観察によるカルシウムスパークおよび波の分析から、Ａ２Ａレセプター媒介自発的カルシウム放出のＰＫＡ依存性を確認した。
【００４４】
Ａ２Ａレセプター遮断は基礎自発的ＳＲカルシウム放出を減少させる
ヒト心房筋細胞における基礎ｃＡＭＰトーン（tone）の存在が、Ｌ型カルシウム電流の神経ホルモン調節の研究において主張された。ＰＫＡ遮断剤Ｈ‐８９が、カルシウム波振動数を基準レベル以下に減少させるという本発明者らの観察は、ヒト心房筋細胞で基礎Ａ２Ａレセプター依存性ｃＡＭＰトーンがあることをさらに示唆している。この考えと一致して、基礎ＳＲカルシウム放出の上昇を示す心房細動患者からの細胞に適用されたＡ２Ａレセプター選択的アンタゴニストＳＣＨ５８２６１またはＺＭ２４１３８５は、共焦点顕微鏡観察またはパッチ‐クランプ技術により測定されるカルシウム波振動数を有意に減少させた（図３参照）。
【００４５】
ヒト試料
心臓手術を受ける合計５４例の患者からの心臓組織試料をこの研究において用いた。心房組織試料は手術時に通常捨てられる組織からなるが、この研究において用いられる許諾が各患者から得られた。該研究は、Sant Pau病院（Barcelona,Spain）の倫理委員会により承認された。
【００４６】
患者５４例中１７例は心房細動の病歴を有していたが、残りの患者はこの不整脈を有しなかった。患者２５例は心房細動を有しなかったが、左心房拡張（左心房直径＞４０ｍｍ）を有していた。特定の実験群において用いられた患者の数が適宜に示されている。Ｃａ２＋アンタゴニストにおいて治療された患者は、研究から除外された。他の患者薬物療法は、測定されるパラメーターに有意な影響を与え無いことがわかった。免疫組織化学分析においては、心房細動のある合計８例の患者（左心房直径：５３．８±６．８ｍｍ）および心房拡張も心房細動の病歴もない患者１５例（左心房直径：３６．５±３．４ｍｍ）を対照として用いた。
【００４７】
抗体
次の一次抗体を用いた：Ａ２Ａレセプターの第二細胞外ループに相当するペプチドに対して作製されたウサギアフィニティー精製抗Ａ２Ａレセプターポリクローナル抗体ＶＣ２１‐Ａｂ、ウサギ抗Ａ２Ａレセプター抗体（クローンＰＡ１‐０４２，Affinity BioReagents，Golden，ＣＯ，U.S.A.）、マウス抗遅筋ミオシン抗体（クローンＮＯＱ７．５．４Ｄ，Chemicon International，Temecula，California，U.S.A.）、マウス抗α‐アクチニン抗体（クローンＥＡ‐５３，SigmaAldrich Chemical Co.，St.Louis，ＭＯ，U.S.A.）、マウス抗コネキシン‐４３抗体（クローン２，Transduction Laboratories，Lexington，ＫＹ，U.S.A.）、マウス抗リアノジンレセプター抗体（クローンＣ３‐３３，Calbiochem，San Diego，California，U.S.A.）。用いられた二次抗体は、ALEXAFLUOR 488複合ヤギ抗マウスＩｇＧ（１／１０００）、TEXAS RED複合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１／２０００）（Molecular Probes，Eugene，ＯＲ，U.S.A.）、西洋ワサビ(horseradish)ペルオキシダーゼ複合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１／６００００）（Pierce Chemical Co.，Rockford，ＩＬ，U.S.A.）、およびウサギ抗マウスＩｇＧ（１：２０００）（Dako，Glostrup，Denmark）であった。
【００４８】
筋細胞摘出
前記ようにヒト心房組織試料から筋細胞を摘出した（ｃｆ．L.Hove-Madsen et al.,”Atrial fibrillation is associated with increased spontaneous calcium release from the sarcoplasmic reticulum in human atrial myocytes”,Circulation,2004,vol.110,pp.1358-63）。簡単に言えば、試料をすすぎ、３０ｍＭブタンジオンモノオキシム（ＢＤＭ）を含有した無カルシウム溶液中において細断し、０．５ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ（Worthington２型，３１８ｕ／ｍｇ）および０．５ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼ（Sigma XXIV型，１１ｕ／ｍｇ固体）を含有した無Ｃａ２＋溶液中、３５℃においてインキュベートした。４５分間後、組織を酵素溶液から取り出し、細胞を無Ｃａ２＋溶液中パスツールピペットによりほぐした。残りの組織は０．４ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼを含有した新鮮無カルシウム溶液中において、３×１５分間かけて消化した。ほぐした細胞を含有する溶液を６００ｒｐｍで１分間遠心し、無カルシウム溶液に再懸濁し、次いでカルシウムを１ｍＭまで徐々に増やした。透明な横縞のある粒状でない細長い細胞のみを実験に用いた。
【００４９】
陽性対照：細胞培養およびトランスフェクション
ＨＥＫ‐２９３細胞をダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ，Sigma Aldrich Chemical Co.）により増殖させた。リン酸カルシウム沈降法により、ヒトＡ２ＡレセプターについてコードするＤＮＡ（ｃｆ．M.Canals et al.,”Adenosine A2A-dopamine D2 receptor-receptor heteromerization:qualitative and quantitative assessment by fluorescence and bioluminescence energy tranfer”,J.Biol.Chem.,2003,vol.278,pp.46741-9）により細胞を一過性にトランスフェクトした。細胞をトランスフェクションから２４時間後または４８時間後に収集した。
【００５０】
自発的ＳＲカルシウム放出
レーザー走査共焦点顕微鏡（Leica TCS SP2 AOBS，Germany）を用いて、ｆｌｕｏ‐３負荷細胞によりカルシウムスパークおよびカルシウム波を検出した。実験溶液はＮａＣｌ １３６（ｍＭ）、ＫＣｌ ４、ＮａＨ２ＰＯ４ ０．３３、ＮａＨＣＯ３ ４、ＣａＣｌ２ ２、ＭｇＣｌ２ １．６、ＨＥＰＥＳ１０、グルコース５、ピルビン酸５（ｐＨ＝７．４）を含有していた。１〜５％に減衰された４８８ｎｍの励起により５００〜６５０ｎｍにおいて蛍光を集めた。カルシウムスパークおよびカルシウム波は１ｋＨｚの走査速度で２×１０．２４ｓにわたり静止条件下において測定した。カルシウムスパークは、隣接３μｍセクションには検出可能な増加がなく、カルシウムスパークの中心を含む３μｍセクションでのシグナル量の増加として検出した。２以上の隣接３μｍセクションにおけるシグナル量の増加をカルシウム波として計測した。各カルシウムスパークの振幅とその半減期とをカルシウムスパーク過渡現象の減衰期の指数的激変から求めた。カルシウムスパーク振動数を各細胞において求め、走査された細胞の長さに対して標準化した。
【００５１】
パッチ‐クランプ
カルシウム波に伴う一過性内向きＮａ‐Ｃａ交換電流を、ソフトウェア制御パッチ‐クランプ増幅器（ＥＰＣ１０，ＨＥＫＡ，Germany）を用いて、穿孔パッチ形状により記録した。ピペット抵抗は、１．５〜４ＭΩであった。実験は、室温において行い、アクセス抵抗が安定して、ピペット抵抗の５倍未満に減少したときに始めた。細胞外溶液は、ＮａＣｌ １２７（ｍＭ）、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）５、ＨＥＰＥＳ １０、ＮａＨＣＯ３ ４、ＮａＨ２ＰＯ４ ０．３３、グルコース１０、ピルビン酸５、ＣａＣｌ２ ２、ＭｇＣｌ２ １．８（ｐＨ＝７．４）を含有していた。ピペット溶液は、アスパラギン酸 １０９（ｍＭ）、ＣｓＣｌ ４７、Ｍｇ２ＡＴＰ３、ＭｇＣｌ２ １、Ｎａ２ホスホクレアチン５、Ｌｉ２ＧＴＰ０．４２、ＨＥＰＥＳ １０、および２５０μｇ／ｍＬアンホテリシンＢ（ｐＨ＝７．２）を含有していた。Ａ２ＡレセプターアゴニストＣＧＳ２１６８０、アンタゴニストＺＭ２４１３８５およびＳＣＨ５８２６１とプロテインキナーゼＡインヒビターＨ‐８９をＤＭＳＯにすべて溶解し、１０ｍＭストック溶液として保管した。細胞を１０ｍＭカフェインへ一時的に暴露することにより、カフェイン放出性ＳＲカルシウム含有量を測定した。得られたＮａ‐Ｃａ交換電流の時間積分量を、Ｎａ‐Ｃａ交換器により３Ｎａ＋：１Ｃａ２＋の化学量論と仮定して、ＳＲから放出されたカルシウムのｐｍｏｌｅ（１０−１８モル）に変換した。
【００５２】
データ分析および統計
電気生理学的および共焦点カルシウム画像法実験を患者の臨床データに関する知識無しに実施した。同一患者の細胞において記録されたＣａ２＋スパークおよびＣａ２＋波を平均化した。別記されない限り、各患者の平均値を統計分析に用い、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表示した。一連のデータを正規性について検定した。具体的効果を検定する際に、有意差を評価する上でスチューデントｔ検定を用いた。ＡＮＯＶＡは複数効果の比較に用い、スチューデント‐ニューマン‐クールス事後検定は具体的効果の有意性を評価するために用いた。
【００５３】
膜調製
０．３２Ｍスクロース含有５ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４：緩衝液Ａ）の氷冷溶液中、Polytronホモゲナイザー（Kinematica，ＰＴＡ ２０ＴＳローター，セッティング５，３回の１５ｓ期）による細胞の破壊後に、遠心により膜を得た。４℃において３０分間にわたる１０００×ｇの遠心（タイプ７５Ｔｉローターで３５００ｒｐｍ）により細胞残屑(cell debris)を分離した。上澄みを４℃において、３０分間にわたり２６０００×ｇにより遠心し（タイプ７５Ｔｉローターで２００００ｒｐｍ）、ペレットを緩衝液Ａに再懸濁し、３７℃において３０分間インキュベートし、同条件により遠心した。ペレットを０．３Ｍ ＫＣｌに再懸濁し、４℃において一晩攪拌し、４℃において３０分間にわたり２６０００×ｇにより遠心し（タイプ７５Ｔｉローターで２００００ｒｐｍ）、上記のような緩衝液Ａにより一度洗浄した。最終ペレット（膜フラクション）を５０ｍＭトリスＨＣｌに再懸濁し、−８０℃において凍結した。トランスフェクトされたＨＥＫ細胞からの膜懸濁物は上述のとおり、得た（C.Herrera et al.,“Adenosine A2B receptors behave as an alternative anchoring protein for cell surface adenosine deaminase in lymphocytes and cultured cells”,Mol.Pharmacol.,2001,vol.59,pp.127-34参照）。タンパク質をビシンコニン酸法（Pierce Chemical Co.）により定量した。
【００５４】
ゲル電気泳動およびイムノブロッティング
ヒト細胞または一過性トランスフェクトＨＥＫ細胞からの膜を３７℃において、２時間加熱することによりＳＤＳ‐ＰＡＧＥ試料緩衝液（８Ｍ尿素，２％ＳＤＳ，１００ｍＭ ＤＴＴ，３７５ｍＭトリス，ｐＨ６．８）により処理し、１０％ゲルでＳＤＳ‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離させた。セミドライ・トランスファー・システムを用いてタンパク質をＰＶＤＦ膜へ移し、指定された抗体、次いで西洋ワサビ(horseradish)ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１／６００００）によりイムノブロットした。化学発光検出キット（SuperSignal，West Pico Chemiluminiscent基質，Pierce）を用いて、免疫反応バンドを展開させた。
【００５５】
免疫染色
免疫組織化学法では、ヒト心房組織をＯＣＴに包埋し、液体窒素冷却イソペンタンにより凍結させた。１８℃に冷却されたクリオスタットにより、８μｍ断片に切断した。各断片をSUPERFROST PLUS（BDH Chemicals Ltd.，Poole，United Kingdom）スライド上に集め、風乾し、−７０℃において貯蔵した。免疫蛍光法においては、トリス緩衝液（ＴＢＳ）（１５０ｍＭ ＮａＣｌ／５０ｍＭトリスＨＣｌ，ｐＨ７．５）中１０％ロバ血清で３０分間にわたり各断片を遮断した。スライドをアフィニティー精製抗Ａ２Ａレセプター（ＶＣ２１，２５μｇ／ｍＬ）および抗α‐アクチニン（１：５００希釈）、抗ミオシン（２μｇ／ｍＬ）、抗コネキシン‐４３（２．５μｇ／ｍＬ）、および抗リアノジンレセプター（６．５μｇ／ｍＬ）を室温において１時間インキュベートし、次いで１０分間にわたりＴＢＳによって３回洗浄した。ALEXA FLUOR 488複合ヤギ抗マウスＩｇＧおよびTEXAS RED複合ヤギ抗ウサギＩｇＧを１：２０００の希釈で遮断溶液に適用した。断片をすすぎ、VECTASHIELD免疫蛍光培地（Vector Laboratories Inc.，Burlingame，ＣＡ，U.S.A.）によりマウントした。免疫組織化学法においては、ポリ‐Ｄ‐リジンで被覆された２４ｍｍガラスカバースリップに摘出直後のヒト筋細胞を置いた。付着後、摘出溶液細胞をリン酸緩衝液ですすぎ、室温において２０分間かけてＰＢＳ中２％パラホルムアルデヒドにより固定した。細胞をＰＢＳにより洗浄し、アルデヒド基を封止するために０．１Ｍグリシンと５分間インキュベートした。ＰＢＳによる洗浄後、ＰＢＳ中０．２％トリトン‐Ｘ‐１００で１５分間かけて筋細胞の透過性を上げた。次いで細胞をＰＢＳにより洗浄し、室温において１０％ウマ血清で３０分間遮断し、次の一次抗体：ウサギポリクローナル抗Ａ２Ａレセプター（１０μｇ／ｍＬ）、抗α‐アクチニン（１：５００希釈）、抗ミオシン（１：５００希釈）、および抗コネキシン‐４３（１：１５０希釈）と室温において１時間インキュベートし、ＰＢＳにより３回洗浄し、ALEXA FLUOR 488と複合化された抗マウス抗体および／またはTEXAS REDと複合化された抗ウサギ抗体により染色した。最後に、細胞を再び３回すすぎ、VECTASHIELDでマウントした。Leica ＴＣＳ４Ｄ共焦点レーザー走査顕微鏡（Leica Lasertechnik GmbH，Heidelberg，Germany）で共焦点顕微鏡観察を行なった。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】心房細動を有する患者におけるＡ２Ａレセプター発現の上方調節。
【図２】Ａ２Ａレセプターのアゴニスト刺激には、心房細動を有する患者において自発的筋小胞体カルシウム放出のＰＫＡ依存性増加がある。
【図３】Ａ２Ａアンタゴニストは、心房細動の患者において基礎自発的筋小胞体カルシウム放出を減少させる。−８０ｍＶの保持電位において自発的ＩＮＣＸを示す実験。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【背景技術】
【０００１】
本発明は、ヒトおよび獣医学の分野に関し、特に心血管疾患の治療のための化合物、とりわけ心房細動の治療のための化合物に関する。
【０００２】
発明の背景
心房細動は、最も一般的な不整脈であり、高い罹患率および死亡率と関連している。その発生率および頻度はますます増加し、それは臨床的および経済的負担の増大となる（現在の頻度は全人口の２％である）。動悸、眩暈、呼吸困難などの重篤な臨床症状に加え、心房細動は、７５歳以上の人々における虚血性脳梗塞において、単一の最も重要な因子である。全体的にみれば、心房細動は、心血管疾患による入院の５％以上を占める。心房細動は、約９０％のケースにおいて、他の心疾患、例えば高血圧性心疾患、うっ血性心不全、または心臓弁疾患を伴い発生している。わずか１０％のケースにおいて、心房細動は、他の心臓異常を伴わずに発生している（心房細動“単独”）。心房細動は三つの形態に分類される：（１）数秒〜数日にわたる期間の自己終結型心房細動の発症(episode)により特徴づけられる発作性心房細動、（２）医療介入により、終結されるまで無期限に続く持続性心房細動、そして（３）薬理的または電気的除細動により、終結されない恒久型心房細動である。
【０００３】
いくつかの研究により、心房細動が、心房周辺においてランダムに変動する多数の回帰性電気小波から生じていることが示された。これらの小波は、左心房から肺静脈の近位５〜６ｃｍ部分へ伸びる心筋スリーブに通常位置する電気的トリガーにより生じている。心房細動が誘発されると、不整脈の持続に関与する、その電気的、機械的、および代謝的性質に影響を及ぼす心房の変化（心房リモデリング）が生まれる。心房細動の存在下において、心室拍数の制御が高められ、心拍数の制御が医学的治療により抑制できないと、心頻拍性筋障害（tachycardiomyopathy）と通常称される、心室拡張および心収縮機能障害に至る。発作および血栓塞栓症は、心房細動に関連した死亡および罹患の主原因であり、これの基本的な病態生理学的基礎は、血流の異常（例えば心房静止）と内皮または心臓内障害を伴うプロトロンボチック（prothrombotic）または過凝血状態である。
【０００４】
心臓学における他の下位体系専門分野(subspecialty)では、この４０年の間に不整脈の診断および治療において重要な進展を遂げた。多大な進歩にもかかわらず、不整脈の現実の療法および不整脈突然死の防止は、少数の患者において行なわれているに過ぎない。今日、心房細動療法は、適宜に、心房細動関連症状の減少、血栓塞栓合併症の防止、および不整脈の終結からなる。
【０００５】
一般的に、心房細動の処置には二つのアプローチ（ ａ）不整脈自体の治療およびｂ）血栓塞栓の危険性の減少)がある（ｃｆ．M.B.lqbal et al.,”Recent developments in atrial fibrillation”,British Medical Journal,2005,vol.330,pp.238-43）。不整脈の治療には、調律制御（洞調律の回復および維持）と、心拍数制御とがある。薬理学的に、調律および心拍数制御は、抗不整脈薬（クラスＩおよびクラスIII抗不整脈剤）により治療されている。現在用いられているそれらの例は、フレカイニド、プロパフェノン、アミオダロン、ドフェチリド、イブチリド、およびソタロールである。非薬理学的に、調律および心拍数制御は、電気的除細動、心房性ペーシング、埋込み可能な心房除細動器、高周波カテーテル切除、および外科的迷路処置(surgical maze procedure)により行なわれる。
【０００６】
血栓塞栓の危険性の減少、ひいては発作防止は、治療の戦略上極めて重要である。薬理学的には、アスピリンおよびワルファリンが、心房血栓形成および血栓塞栓事象を防止するために、大多数の患者において推奨されている。高い危険性を有する患者の試験から集積されたデータは、発作を防止する上でワルファリンがアスピリンより良いが、ワルファリンにおいて大出血の危険性がアスピリンの場合より２倍であることを示した。いずれにしても、抗凝血治療は、年齢、共存症、および禁忌に基づき個別に行なう必要がある。非薬理学的に、血栓塞栓の危険性の減少は、左心房付属器の切除またはカテーテル（研究中の処置）により現在、実施されている。
【０００７】
最近の研究は、薬理学的および非薬理学的双方の治療戦略への新たなアプローチに向けられている。最も有望な薬剤は、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）インヒビターおよびアンギオテンシンIIレセプター遮断薬である。プロテアーゼインヒビター、十分な選択性および特異性のホスファターゼ、または抗酸化剤も、構造的変化、心房拡張、および収縮性機能不全を減少または逆転させる上で、新たな治療戦略をもたらす。しかしながら、心房細動の治療の問題は、なお満足のゆくようには解決されていない。
【発明の概要】
【０００８】
本発明者らは、医薬品の周知のグループ、即ちアデノシンＡ２Ａレセプターアンタゴニストが、ヒトを含めた哺乳動物において心房細動に対する医薬の製造に有用であることを見出した。
【０００９】
本発明は、意外にもアデノシンＡ２Ａレセプターが、ヒト心房筋細胞に存在し、心房細動を引き起こす病理メカニズムに関与していることを見出した。特に、本発明者らは、原形質膜で機能種であるホモダイマーアデノシンＡ２Ａレセプター種の発現が心房細動の患者で上方調節されていることを見出した。電気生理学実験においては、これら患者からの心房筋細胞におけるアデノシンＡ２Ａレセプターの活性化が、カルシウム波として測定される自発的筋小胞体カルシウム放出において、プロテインキナーゼＡ媒介性の増加に至ることを証明した。
【００１０】
さらに、二つの異なる実験アプローチ（共焦点カルシウム画像法およびパッチクランプ技術）を用いて、本発明者らは、心房細動において見られるカルシウム波振動数上昇をアデノシンＡ２Ａレセプターアンタゴニストにより減少させたことを見出した。実際に、アデノシンＡ２Ａレセプターアンタゴニストは、カルシウム波によりアゴニスト刺激効果を逆転させるのみならず、基礎カルシウム波振動数も減少させる。一緒にすると、これらの結果は、細胞内カルシウム流動のアデノシンＡ２Ａレセプター媒介調節異常が細動心房の複雑な電気的リモデリングの一因であることを示唆している。これらの事実は、アデノシンＡ２Ａレセプターアンタゴニストを心房細動を治療するための選択的治療剤として方向づけられている。
【００１１】
これまでに、最近の調査研究として、本発明者らは、心房細動期のある患者から摘出された右心房筋細胞が、この不整脈のない患者からの筋細胞より頻繁な自発的筋小胞体Ｃａ２＋放出を示すことのみを記載した（ｃｆ．L.Hove-Madsen et al.,”Atrial fibrillation is associated with increased spontaneous calcium release from the sarcoplasmic reticulum in human atrial myocytes”,Circulation,2004,vol.September,pp.1358-63）。
【００１２】
したがって、本発明は、ヒトを含む哺乳動物における心房細動の予防および／または治療用の医薬の製造のためのアデノシンＡ２Ａレセプターアンタゴニストの使用に関する。以下において、“アデノシンＡ２Ａレセプターアンタゴニスト”は“Ａ２Ａアンタゴニスト”として、“アデノシンＡ２Ａレセプター”は“Ａ２Ａレセプター”として称される。本発明のこの態様は、適量の許容される希釈剤または担体と一緒に有効量のＡ２Ａアンタゴニストを、必要な哺乳動物（好ましくはヒト）へ投与することからなる、Ａ２Ａレセプターで拮抗することによる心房細動の予防および／または治療のための方法としても、一方では明確に表されている。
【００１３】
当業界において知られる他の薬剤よりＡ２Ａアンタゴニストを用いる利点は、Ａ２Ａアンタゴニストが心房細動の患者を特に標的としていることである。このように、機能性ダイマーＡ２Ａレセプターの発現は、正常な心房の大きさをもつ過去に心房細動病歴のない患者において低いが、ダイマーレセプター種の発現は心房細動のある患者において強く上方調節される。ところが、現在用いられている他の薬剤は、様々な細胞において多数の機能を大きく調節するレセプターまたはチャンネルでより広く作用する。こうして、カルシウムアンタゴニストはＬ型カルシウムチャンネルを阻害することにより、カルシウム過負荷を減少させるのみならず、心臓収縮性も減少させる。さらに、Ｌ型カルシウム電流は平滑筋機能と分泌細胞とを、結果としてカルシウムアンタゴニストの望ましくない副作用と共に調節する。
【００１４】
Ａ２Ａレセプター
アデノシンは、体内において全ての代謝活性細胞により産生されるプリンヌクレオシドである。アデノシンは、細胞表面レセプターの四種の異なるサブタイプ：Ｇタンパク質結合レセプタースーパーファミリーに属するＡ１、Ａ２Ａ、Ａ２Ｂ、およびＡ３を介して、その効果を発揮する。Ａ１およびＡ３は阻害性Ｇタンパク質と結合するが、Ａ２ＡおよびＡ２Ｂは刺激性Ｇタンパク質と結合する。Ａ２Ａレセプターは、脳において、ニューロンおよびグリア細胞の双方において主に見られる（線条および側坐核において最高レベル、嗅球と視床下部および海馬領域において中〜高レベル）。線条において、Ａ２Ａレセプターは、神経伝達物質の放出および機能を調節する（ｃｆ．H.Kase et al.,”Progress in pursuit of therapeutic A2A antagonists:the adenosine A2A receptor selective antagonist KW6002:research and development toward a novel nondopaminergic therapy for Parkinson’s disease”,Neurology,2003,vol.61,pp.97-100）。末梢組織において、Ａ２Ａレセプターは、血小板、好中球、脾臓、胸腺、内皮、および血管平滑筋細胞に存在することが知られ、そこでは冠状動脈心疾患の患者において、心筋灌流の評価をなしうる強い冠状血管拡張を誘導する（ｃｆ．Z.Gao et al.,”Novel short-acting A2A adenosine receptor agonists for coronary vasodilatation:inverse relationship between affinity and duration od action of A2A agonists”,J.Pharmacol.Exp.Ther.,2001,vol.298,pp.209-18）。しかしながら、Ａ２Ａレセプターは、これまでにヒト心房筋細胞に存在していないとされてきた。
【００１５】
心房細動を治療するために適した化合物
一般的に、アンタゴニストは、レセプターを活性化することなしに、レセプターと結合する分子である。それはレセプターの結合部位における内在性リガンドまたは基質と競合し、よって内在性リガンド結合に応答して細胞内シグナルを伝達しうるレセプターの能力を阻害する。アンタゴニストは、いくつかの様式により機能している。それは、Ａ２Ａレセプターへのアデノシンの結合を実質的に妨害、阻止、または防止し、それによりアデノシン媒介生物活性を阻害、抑制するか、またはその停止を引き起こすために十分な親和性および特異性により、アデノシンと結合またはそれを隔離しうる。
【００１６】
Ａ２Ａレセプターは、心筋細胞において、内在性リガンドの非存在下において、基礎活性を呈する。この活性は、該レセプターの構成的活性によるか、または内在性アデノシンによるレセプターの活性化によるものである。この状況下において、心房細動の治療は、アンタゴニストまたは逆作動薬(inverse agonist)を用いてこの基礎活性を低下させることにより行なえる。本発明のＡ２Ａアンタゴニストの一部は、逆作動(inverse agonism)を発揮しうる。
【００１７】
Ａ２Ａレセプターの既知局在性および機能に従い、Ａ２Ａアンタゴニストは、パーキンソンおよびＣＮＳ（精神分裂症、アルツハイマー病における老人性痴呆、器質因性の(organic origin)精神病など）の他の疾患に対して、これまで用いられてきた。それらの中で、主なものはパーキンソン病である。
【００１８】
あらゆるＡ２Ａアンタゴニストが、本発明の目的に沿う使用に検討される。多くの異なる化合物が、Ａ２Ａアンタゴニストとして詳細に研究されてきたが、これらは二つの大きな群（キサンチン誘導体および非キサンチン複素環類）に分類される。
【００１９】
本発明の具体的な態様において、Ａ２Ａアンタゴニストは、キサンチン誘導体またはその薬学上許容される塩である。様々な位置における異なる置換基でも、プリン環のデアゾ-アナログもしくはアゾ-アナログまたは他の複素環式アナログあるいは三または四環式誘導体／アナログであっても、類似のＡ２Ａ拮抗活性を有しうる。キサンチン誘導体の中で、ある化合物に共通した、好ましい構造は１，３，７‐トリアルキル‐８‐スチリル‐キサンチン構造である。好ましい態様において、Ａ２Ａアンタゴニストは、ＤＭＰＸとして知られるテオブロミン（式１）、ＫＦ１７８３７（式２）、ＫＷ６００２として知られるイストラデフィリン（式３）、ｐ‐スルホスチリル‐ＤＭＰＸ（式４）、ＢＳ‐ＤＭＰＸ（式５）、ＭＳＸ‐２（式６）、ＣＳＣ（式７）、キサンチンアミン同族体（ＸＡＣ、式８）、およびＭＳＸ‐３からなる群より選択される化合物である。
【００２０】
さらに好ましい態様において、Ａ２ＡアンタゴニストはＫＷ６００２である。現在、この化合物は、パーキンソン病についてフェーズIIIの臨床試験下にある。他の好ましい態様において、Ａ２Ａアンタゴニストは、ＭＳＸ‐２である。他の好ましい態様において、Ａ２Ａアンタゴニストは、ＭＳＸ‐３、ＭＳＸ‐２のリン酸エステル、ＭＳＸ‐２のプロドラッグである。
【化１】
【００２１】
Ａ２Ａレセプター拮抗活性を示すことが知られた他のキサンチン化合物は、例えば米国特許第５４８４９２０号、米国特許第５５８７３７８号、米国特許第５５４３４１５号、およびＥＰ１０１６４０７Ａ１号において記載されている。
【００２２】
本発明の他の具体的態様において、Ａ２Ａアンタゴニストは、非キサンチン複素環である。典型的な非キサンチンアデノシンＡ２Ａアンタゴニストはアデニンから誘導され、様々な置換基を有する一、二、三、および四環式化合物を含めた最広義のアデニン誘導体を表す。Ａ２Ａ拮抗活性を有した、アデニンから誘導されない、別の複素環式化合物が同定された。Ａ２Ａレセプター拮抗作用を示す、ある２-アミノピリジン化合物が知られ（例えば、ＷＯ０２／１４２８２号、ＷＯ０１／２５２１０号）、ある９-アミノピリミジン化合物も知られている（例えば、米国特許出願第２００１／００２７１９６号）。
【００２３】
好ましい態様において、Ａ２Ａアンタゴニストは、ＳＣＨ５８２６１（式９）、ＡＮＲ-８２（式１０）、ＺＭ２４１３８５（式１１）、ＳＣＨ６３３９０（式１２）、ＣＧＳ１５９４３（式１３）８ＦＢ-ＰＴＰ（式１４）、ＶＥＲ-６６２３（Ｖ２００６としても知られる、式１５）、（−）Ｒ，Ｓ-メフロキン（式１６）、および７ＦＢ-ＰＴＰ（式１７）からなる群から選択されるものである。さらに好ましい態様において、非キサンチン化合物の群の中で、Ａ２ＡアンタゴニストはＶＥＲ-６６２３である。
【００２４】
Ａ２Ａアンタゴニストとして好ましい他の化合物は、式１８のピラゾロピリミジン誘導体、式１９のトリアゾロキノキサリン誘導体、式２０の９‐置換２‐アミノ‐６‐フリル‐アデニン誘導体、ならびに式２１、２２、および２３のトリアゾロトリアジン誘導体である。
【化２】
【００２５】
他のトリアゾロピリミジンＡ２Ａアンタゴニストは、例えばＷＯ２００４／０２９０５６号、ＷＯ９５／０１３５６号、米国特許第５５６５４６０号、ＷＯ９７／０５１３８号、ＷＯ９８／５２５６８号、ＷＯ０１／９２２６４号、およびＰＣＴ／ＵＳ０２／３２６３０号において開示されている。特に、置換ピラゾール〔４，３‐ｅ〕‐１，２，４‐トリアゾロ‐〔１，５‐ｃ〕ピリミジン化合物が、ＷＯ２００５／０５４２４５号、米国特許出願第２００４／２２０１９４号公報、および米国特許出願第２００３２１２０５９号公報において開示されている。
【００２６】
適切なＡ２Ａアンタゴニストの他の具体例としては下記特許、特許出願、および論文において開示された化合物がある：ＷＯ９５／０１３５６号、米国特許第６６３０４７５号、米国特許第５９３５９６４号、ＷＯ０３／０３２９９６号、ＷＯ０３／０４８１６５号、ＷＯ０３／０４８１６４号、ＷＯ０３／０４８１６３号、ＷＯ２００５／０４２５００号、ＷＯ２００５／０５８８８３号、ＷＯ２００５／０４０１５１号、ＷＯ２００５／０３９５７２号、ＷＯ２００４／０９２１７７号、米国特許出願第２００４１３８２３５号公報、ＷＯ２００４／０１９９４９号、ＷＯ０２／１４２８２号、ＷＯ２００４／０１６６０５号、ＷＯ０３／０８２８７３号、米国特許第５４８４９２０号、米国特許第５７０３０８５号、ＷＯ９２／０６９７６号、ＷＯ９４／０１１１４号、米国特許第５５６５４６０号、ＷＯ９８／４２７１１号、ＷＯ００／７２０１号、ＷＯ９９／４３６７８号、ＷＯ９９／２６６２７号、ＷＯ０１／９２２６４号、ＷＯ９９／３５１４７号、ＷＯ００／１３６８２号、ＷＯ００／１３６８１号、ＷＯ００／６９４６４号、ＷＯ０１／４０２３０号、ＷＯ０１／０２４０９号、ＷＯ０１／０２４００号、ＥＰ１０５４０１２号、ＷＯ０１／６２２３３号、ＷＯ０１／１７９９９号、ＷＯ０１／８０８９３号、ＷＯ０２／１４２８２号、ＷＯ０１／９７７８６号、ＷＯ０１／１６１３４号、ＷＯ００／７３３０７号、米国特許出願第２００５０４３３１５号、米国特許出願第２００３１４９０６０号、Baraldi et al.,”Recent developments in the field of A2A and A3 adenosine receptor antagonists”,European Journal of Medicinal Chemistry,2003,vol.38,pp.367-82、E.Ongini,et al.,”Selective adenosine A2A receptor antagonists”,Farmaco,2001,vol.56,pp.87-90、C.E.Muller et al.,”A2A Adenosine receptor antagonists - future drugs for Parkinson’s disease?”,Drugs of the Future,2000,vol.25,pp.1043-52、L.J.Knutsen et al.,”KW-6002(Kyowa Hakko Kogyo)”,Curr.Opin.Investig.Drugs,2001,vol.2,pp.668-73、B.Cacciari et al.,”Medicinal chemistry of A2A adenosine receptor antagonists”,Curr.Top.Med.Chem.,2003,vol.3,pp.403-11、G.Yao et al.,”Synthesis of alkyne derivatives of novel triazolopyrazine as A2A adenosine receptor antagonists”,Bioorg.Med.Chem.Lett.,2005,vol.15,pp.511-5、E.Kiselgof et al.,”6-(2-furanyl)-9H-purin-2-amine derivatives as A2A adenosine antagonists”,Bioorg.Med.Chem.Lett.,2005,vol.15,pp.2119-22、S.M.Weiss et al.,”Discovery of nonxanthine adenosine A2A receptor antagonists for the treatment of Parkinson’s disease”,Neurology,2003,vol.61(Supp.6),pp.S101-6；C.B.Vu et al.,”Novel diamino derivatives of [1,2,4]triazolo[1,5-a][1,3,5]triazine as potent and selective adenosine A2A receptor antagonists”,J.Med.Chem.,2005,vol.48,pp.2009-18、C.B.Vu et al.,”Piperazine derivatives of [1,2,4]triazolo[1,5-a][1,3,5]triazine as potent and selective adenosine A2A receptor antagonists”,J.Med.Chem.,2004,vol.47,pp.4291-9。
【００２７】
当業者であれば、化合物が本発明の目的にとって、良いＡ２Ａアンタゴニストであるか否かがわかるであろう。例えば、化合物が良いＡ２Ａアンタゴニストであるか否かを評価する適切な方法が当業界にある。例として、米国特許出願第２００４／０１３８２３５号段落番号〔０２２６〕‐〔０２４０〕において記載された放射性リガンド結合アッセイに基づく方法がある。
【００２８】
Ａ２ＡアンタゴニストがＡ２Ａレセプターに選択的であることは、心房細動の治療に好ましい。上記すべてのＡ２ＡアンタゴニストがＡ２Ａレセプターに選択的であるが、選択性の程度はそれらの中でも異なる。選択性は、異なる種（例えばラット、ヒト）においても若干、異なる。
【００２９】
Ａ２Ａアンタゴニストは、引用された特許および出願に記載の公知の方法により製造される。
【００３０】
医薬組成物および投与
治療に関して、有効量とは、有益または望ましい臨床結果に影響を与えるために（即ち、疾患または障害の進行を緩和、改善、安定、逆転、もしくは遅延させるか、または疾患もしくは障害の病的結果を和らげるために）十分である、活性成分の量に関する。有効量は通常、個別に医師により決定される。
【００３１】
治療に際して、本発明による使用向けの活性化合物は、加工していない化合物のままで投与してもよいが、医薬組成物において、一種以上のアジュバント、賦形剤、担体、緩衝剤、希釈剤、および／または他の常用製薬助剤と一緒に、場合により生理学上許容される塩の形態により、活性成分を導入することが好ましい。諸成分は、直腸、口腔、鼻内、および経皮経路を含めた、類似効用を有する剤の投与で許容されるいずれかの投与様式により、動脈内注射、静脈内、腹腔内、非経口、筋肉内、皮下、経口、局所により、吸入剤として、または例えばステント、すなわち動脈挿入円筒ポリマーのような含浸または被覆装置から、単回または複数回に分けて投与される。
【００３２】
投与における他の好ましい様式は、非経口、特に注射による。注射による投与の形態には、水性もしくは油性懸濁液または乳濁液、および無菌水溶液がある。経口投与は、投与に際して他の好ましい経路である。医薬組成物は、錠剤、丸剤、粉末、エリキシル、懸濁液、乳濁液、溶液、シロップ、エアゾル、カプセルなどの形態をとることができる。
【００３３】
本発明の組成物は、当業界において知られた操作を用いることにより、患者へ投与後に活性成分の即時、持続、または遅延放出をなしうるように処方しうる。経口投与用の制御放出薬物送達系としては、ポリマー被覆リザーバーまたは薬物‐ポリマーマトリックス処方物を含有した浸透ポンプ系および溶解系がある。本発明の方法において、使用のための他の処方は、経皮送達装置（“パッチ”）を用いる。このような経皮パッチは、制御された量により、化合物の連続的または断続的注入を行なうために用いられる。
【００３４】
本組成物は、好ましくは単位剤形で処方される。投与量は、疾患の種類および程度に依存し、その決定は医師の裁量に属する。
【００３５】
別記されない限り、ここで用いられているすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する業界の当業者により通常理解されるものと同様の意味を有する。明細書および請求の範囲を通して、“含んでなる”との用語およびその変更態様は、他の技術的特徴、添加物、成分、または工程を除外する意味ではない。本願の要約書もここに付されている。本発明の追加目的、利点、および特徴は、本明細書に記載の試験から当業者に明らかとなるか、または本発明の実施により判明するであろう。以下の実施例および図面は実例で示されているが、本発明はこれらに限定されない。
【発明の具体的説明】
【００３６】
図面の詳細な説明
図１Ａは、抗Ａ２Ａレセプター（パネル１、４、７、および１０）と抗ミオシン（２）、抗α‐アクチニン（５）、抗コネキシン‐４３（８）、または抗ＲｙＲ（１１）により二重染色された、摘出直後のヒト右心房筋細胞を示す。二重免疫蛍光像の二重焼付け（パネル３、６、９、および１２）においては、Ａ２Ａレセプターとα‐アクチニンとの共存およびＡ２Ａレセプターとリアノジンレセプター（ＲｙＲ）との重複分布を現した。図１Ｂは、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥにより分離され、かつウサギ抗Ａ２Ａレセプター抗体を用いてイムノブロットされた、ヒトＡ２Ａレセプターを有する一過性トランスフェクトＨＥＫ細胞からの細胞膜（陽性制御、Ｃ＋）と、洞調律（ＳＩＮＵＳ）または心房細動（ＡＦ）を有する個体から得られたヒト心房膜とを示す。“Ｄｉ”はダイマーを意味し、“Ｍｏ”はモノマーを意味する。図１Ｃは、図１Ｂのイムノブロットの相対濃度走査（Relative Densitometric Scan（ＲＤＳ））を示す。Ａ２Ａレセプター（モノマー＋ダイマー）の全量が黒棒により示される。Ａ２Ａレセプターモノマー（白棒）およびダイマー（灰色棒）の相対量は、各列において、Ａ２Ａレセプター（ダイマー＋モノマー）の全合計を用いて標準化される。
【００３７】
図２Ａにおいて、２００ｎＭ ＣＧＳ２１６８０への心筋細胞の暴露前（対照）、暴露中（ＣＧＳ）、および暴露後（洗浄、Ｗ）に、−８０ｍＶで固定された膜電位で、自発的ＩＮＣＸが記録された。水平および垂直目盛棒は、各々３０ｓおよび１００ｐＡに相当する。図２Ｂは、自発的Ｎａ‐Ｃａ交換電流の数に及ぼすＣＧＳ２１６８０の刺激効果の時間経過を示す（各３０ｓスィープにおける事象としてカウントされた、ｅ／ｓ）。棒上の太線は、ＣＧＳ２１６８０適用期間を示す。図２Ｃは、Ａ２ＡアンタゴニストＺＭ２４１３８５（１μＭ）が自発的ＩＮＣＸで、２００ｎＭ ＣＧＳ２１６８０の刺激効果をどのように逆転させられたかを示す。水平および垂直目盛棒は、各々３０ｓおよび１００ｐＡに相当する。図２Ｄは、心房細動のない対照患者８例およびそれを有する患者１１例からの心筋細胞におけるＣＧＳ効果の概要である。ＣＧＳ２１６８０の効果を評価するために、対応のあるｔ検定(paired t-test)が用いられ、ｐ値を棒上に示す。ＩＮＣＸＦは、ＩＮＣＸ振動数を意味する。図２Ｅは、１０μＭ Ｈ‐８９の添加が患者５例において、２００ｎＭ ＣＧＳ２１６８０の刺激効果を消失させたことを示す。ＡＮＯＶＡは、波振動数に及ぼす治療の有意な効果（ｐ＝０．００１）を示し、事後検定は、ＣＧＳ vs 対照においてｐ＝０．０３、ＣＧＳ vs ＣＧＳ＋Ｈ‐８９においてｐ＝０．００２、およびＣＧＳ＋８９ vs 対照においてｐ＝０．０５を示した。
【００３８】
図３Ａにおいて、Ａ２ＡアンタゴニストＳＣＨ５８２６１（５０ｎＭ）は、心房細動の患者の試料において、自発的ＩＮＣＸ振動数の可逆的減少を引き起こした。水平および垂直目盛棒は、各々３０ｓおよび１００ｐＡに相当する。図３Ｂにおいて、Ａ２Ａアンタゴニストは共焦点カルシウム画像法（左パネル、ｎ＝６）またはパッチ‐クランプ技術（右パネル、ｎ＝７）で測定された自発的カルシウム波振動数（ＷＦ）を双方とも減少させた。ＺＭ２４１３８５およびＳＣＨ５８２６１の５０ｎＭの効果は同程度であり、集計した。共焦点実験に対応のないｔ検定およびパッチ‐クランプ実験に対応のあるｔ検定を用いた統計的な有意差が棒上に示される。
【００３９】
ヒト右心房におけるＡ２Ａレセプターの発現および局在性
ヒト右心房筋細胞におけるＡ２Ａレセプターの存在をイムノブロッティングにより調べた。その結果、Ａ２Ａレセプターが右心房に存在し、該レセプターのモノマーおよびダイマー種双方がこの組織において発現され、洞調律のある心房の試料においてダイマー型が少数であることを示した。心房筋におけるＡ２Ａレセプター局在性が、レセプターＡ２Ａとミオシン、α‐アクチニン、コネキシン‐４３、またはＲｙＲに対する抗体により二重標識された試料によって、共焦点顕微鏡観察により研究された。Ａ２Ａレセプターは心筋線維に沿い横縞状パターンで発現され、筋節においてＺ線のレベルで細胞骨格関連タンパク質α‐アクチニンと共存した。Ａ２Ａレセプターの分布は、心房細動を有するおよび有しない患者の試料において質的に類似した。
【００４０】
心房細動のある患者におけるＡ２Ａレセプター発現の上方調節
摘出された心房筋細胞は、Ａ２Ａレセプター縞状パターンと、心房組織サンプルとにおいて見られるα‐アクチニンとのコロニー化およびＲｙＲとの重複分布を保持していた（図１Ａ参照）。心房細動を有するおよび有しない患者の心筋細胞において、レセプター局在性に差異が観察されなかった（データ示さず）。ウエスタンブロッティングにより測定されたＡ２Ａレセプタータンパク質レベルは心房細動のある患者において著しく増加し（図１Ｂ‐Ｃ参照）、興味深いことに、細胞表面に存在する機能型であるダイマーＡ２Ａレセプター種が心房細動において著しく上昇した（図１Ｃ参照）。有意差は、血管において観察されなかった。したがって、これらの結果は、ヒト心房筋細胞におけるＡ２Ａレセプターの発現のみならず、心房細動のある患者において、主にホモダイマー型でのそれらの上方調節も初めて証明した。
【００４１】
Ａ２Ａレセプターのアゴニスト刺激は、心房細動のある患者において自発的筋小胞体（ＳＲ）カルシウム放出のＰＫＡ依存性増加を誘導する
自発的ＳＲカルシウム放出に及ぼすＡ２Ａレセプターアゴニストの効果を、洞調律のある患者および心房細動のある患者から摘出された心房筋細胞により分析した。局所的な非伝播カルシウム放出（カルシウムスパーク）とＳＲからの再現的カルシウム放出（カルシウム波）との双方を分析した。Ａ２ＡレセプターアゴニストＣＧＳ２１６８０（２００ｎＭ）とのプレインキュベーションは、心房細動を有する患者においてカルシウム波の数を増加させたが、不整脈を有しないものではそうではなかった。
【００４２】
自発的ＳＲカルシウム放出に及ぼすＣＧＳ２１６８０の効果が、膜電位に及ぼす効果に付随的であるか否かを調べるために、−８０ｍＶにおいて膜電位を固定する際にパッチ‐クランプ技術を用いた。これは、ＣＧＳ２１６８０がそれらにより活性化されたＮａ‐Ｃａ交換電流（ＩＮＣＸ）として測定される自発的カルシウム波の数を可逆的に増加させることを妨げなかった（図２ＡおよびＢ参照）。実際に、心房細胞患者におけるＣＧＳ２１６８０の有意な刺激効果をこのアプローチから確認した（図２Ｄ参照）。したがって、ＣＧＳ２１６８０により誘導される自発的ＳＲカルシウム放出の増加は、ＲｙＲ活性のＡ２Ａレセプター依存性調節によるものである。ＣＧＳ２１６８０の特異的効果は、二種の選択的Ａ２ＡアンタゴニストＺＭ２４１３８５（図２Ｃ参照）およびＳＣＨ５８２６１により逆転された。
【００４３】
Ａ２Ａレセプターは、Ｇｓタンパク質に結合されるため、アゴニスト媒介レセプター活性化はｃＡＭＰレベルを増加させ、次いでこれがＰＫＡ活性化とＲｙＲリン酸化とに至る。Ａ２ＡレセプターがＰＫＡのｃＡＭＰ依存性活性化を介して、その効果を発揮するか否かを試験するために、選択的ＰＫＡインヒビターＨ‐８９を用いた。心房細動のある患者の筋細胞において、ＣＧＳ２１６８０の刺激効果がＨ‐８９により失われたが（図２Ｅ参照）、このことは自発的ＳＲカルシウム放出のＡ２Ａレセプター依存性調節が実際にＰＫＡ活性化で媒介されていることを証明している。興味深いことに、Ｈ‐８９はＣＧＳ２１６８０の効果を消失させるのみならず、それはＣＧＳ２１６８０適用前に記録された基準より有意に低いレベルまで自発的カルシウム放出を実際に減少させた。共焦点顕微鏡観察によるカルシウムスパークおよび波の分析から、Ａ２Ａレセプター媒介自発的カルシウム放出のＰＫＡ依存性を確認した。
【００４４】
Ａ２Ａレセプター遮断は基礎自発的ＳＲカルシウム放出を減少させる
ヒト心房筋細胞における基礎ｃＡＭＰトーン（tone）の存在が、Ｌ型カルシウム電流の神経ホルモン調節の研究において主張された。ＰＫＡ遮断剤Ｈ‐８９が、カルシウム波振動数を基準レベル以下に減少させるという本発明者らの観察は、ヒト心房筋細胞で基礎Ａ２Ａレセプター依存性ｃＡＭＰトーンがあることをさらに示唆している。この考えと一致して、基礎ＳＲカルシウム放出の上昇を示す心房細動患者からの細胞に適用されたＡ２Ａレセプター選択的アンタゴニストＳＣＨ５８２６１またはＺＭ２４１３８５は、共焦点顕微鏡観察またはパッチ‐クランプ技術により測定されるカルシウム波振動数を有意に減少させた（図３参照）。
【００４５】
ヒト試料
心臓手術を受ける合計５４例の患者からの心臓組織試料をこの研究において用いた。心房組織試料は手術時に通常捨てられる組織からなるが、この研究において用いられる許諾が各患者から得られた。該研究は、Sant Pau病院（Barcelona,Spain）の倫理委員会により承認された。
【００４６】
患者５４例中１７例は心房細動の病歴を有していたが、残りの患者はこの不整脈を有しなかった。患者２５例は心房細動を有しなかったが、左心房拡張（左心房直径＞４０ｍｍ）を有していた。特定の実験群において用いられた患者の数が適宜に示されている。Ｃａ２＋アンタゴニストにおいて治療された患者は、研究から除外された。他の患者薬物療法は、測定されるパラメーターに有意な影響を与え無いことがわかった。免疫組織化学分析においては、心房細動のある合計８例の患者（左心房直径：５３．８±６．８ｍｍ）および心房拡張も心房細動の病歴もない患者１５例（左心房直径：３６．５±３．４ｍｍ）を対照として用いた。
【００４７】
抗体
次の一次抗体を用いた：Ａ２Ａレセプターの第二細胞外ループに相当するペプチドに対して作製されたウサギアフィニティー精製抗Ａ２Ａレセプターポリクローナル抗体ＶＣ２１‐Ａｂ、ウサギ抗Ａ２Ａレセプター抗体（クローンＰＡ１‐０４２，Affinity BioReagents，Golden，ＣＯ，U.S.A.）、マウス抗遅筋ミオシン抗体（クローンＮＯＱ７．５．４Ｄ，Chemicon International，Temecula，California，U.S.A.）、マウス抗α‐アクチニン抗体（クローンＥＡ‐５３，SigmaAldrich Chemical Co.，St.Louis，ＭＯ，U.S.A.）、マウス抗コネキシン‐４３抗体（クローン２，Transduction Laboratories，Lexington，ＫＹ，U.S.A.）、マウス抗リアノジンレセプター抗体（クローンＣ３‐３３，Calbiochem，San Diego，California，U.S.A.）。用いられた二次抗体は、ALEXAFLUOR 488複合ヤギ抗マウスＩｇＧ（１／１０００）、TEXAS RED複合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１／２０００）（Molecular Probes，Eugene，ＯＲ，U.S.A.）、西洋ワサビ(horseradish)ペルオキシダーゼ複合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１／６００００）（Pierce Chemical Co.，Rockford，ＩＬ，U.S.A.）、およびウサギ抗マウスＩｇＧ（１：２０００）（Dako，Glostrup，Denmark）であった。
【００４８】
筋細胞摘出
前記ようにヒト心房組織試料から筋細胞を摘出した（ｃｆ．L.Hove-Madsen et al.,”Atrial fibrillation is associated with increased spontaneous calcium release from the sarcoplasmic reticulum in human atrial myocytes”,Circulation,2004,vol.110,pp.1358-63）。簡単に言えば、試料をすすぎ、３０ｍＭブタンジオンモノオキシム（ＢＤＭ）を含有した無カルシウム溶液中において細断し、０．５ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ（Worthington２型，３１８ｕ／ｍｇ）および０．５ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼ（Sigma XXIV型，１１ｕ／ｍｇ固体）を含有した無Ｃａ２＋溶液中、３５℃においてインキュベートした。４５分間後、組織を酵素溶液から取り出し、細胞を無Ｃａ２＋溶液中パスツールピペットによりほぐした。残りの組織は０．４ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼを含有した新鮮無カルシウム溶液中において、３×１５分間かけて消化した。ほぐした細胞を含有する溶液を６００ｒｐｍで１分間遠心し、無カルシウム溶液に再懸濁し、次いでカルシウムを１ｍＭまで徐々に増やした。透明な横縞のある粒状でない細長い細胞のみを実験に用いた。
【００４９】
陽性対照：細胞培養およびトランスフェクション
ＨＥＫ‐２９３細胞をダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ，Sigma Aldrich Chemical Co.）により増殖させた。リン酸カルシウム沈降法により、ヒトＡ２ＡレセプターについてコードするＤＮＡ（ｃｆ．M.Canals et al.,”Adenosine A2A-dopamine D2 receptor-receptor heteromerization:qualitative and quantitative assessment by fluorescence and bioluminescence energy tranfer”,J.Biol.Chem.,2003,vol.278,pp.46741-9）により細胞を一過性にトランスフェクトした。細胞をトランスフェクションから２４時間後または４８時間後に収集した。
【００５０】
自発的ＳＲカルシウム放出
レーザー走査共焦点顕微鏡（Leica TCS SP2 AOBS，Germany）を用いて、ｆｌｕｏ‐３負荷細胞によりカルシウムスパークおよびカルシウム波を検出した。実験溶液はＮａＣｌ １３６（ｍＭ）、ＫＣｌ ４、ＮａＨ２ＰＯ４ ０．３３、ＮａＨＣＯ３ ４、ＣａＣｌ２ ２、ＭｇＣｌ２ １．６、ＨＥＰＥＳ１０、グルコース５、ピルビン酸５（ｐＨ＝７．４）を含有していた。１〜５％に減衰された４８８ｎｍの励起により５００〜６５０ｎｍにおいて蛍光を集めた。カルシウムスパークおよびカルシウム波は１ｋＨｚの走査速度で２×１０．２４ｓにわたり静止条件下において測定した。カルシウムスパークは、隣接３μｍセクションには検出可能な増加がなく、カルシウムスパークの中心を含む３μｍセクションでのシグナル量の増加として検出した。２以上の隣接３μｍセクションにおけるシグナル量の増加をカルシウム波として計測した。各カルシウムスパークの振幅とその半減期とをカルシウムスパーク過渡現象の減衰期の指数的激変から求めた。カルシウムスパーク振動数を各細胞において求め、走査された細胞の長さに対して標準化した。
【００５１】
パッチ‐クランプ
カルシウム波に伴う一過性内向きＮａ‐Ｃａ交換電流を、ソフトウェア制御パッチ‐クランプ増幅器（ＥＰＣ１０，ＨＥＫＡ，Germany）を用いて、穿孔パッチ形状により記録した。ピペット抵抗は、１．５〜４ＭΩであった。実験は、室温において行い、アクセス抵抗が安定して、ピペット抵抗の５倍未満に減少したときに始めた。細胞外溶液は、ＮａＣｌ １２７（ｍＭ）、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）５、ＨＥＰＥＳ １０、ＮａＨＣＯ３ ４、ＮａＨ２ＰＯ４ ０．３３、グルコース１０、ピルビン酸５、ＣａＣｌ２ ２、ＭｇＣｌ２ １．８（ｐＨ＝７．４）を含有していた。ピペット溶液は、アスパラギン酸 １０９（ｍＭ）、ＣｓＣｌ ４７、Ｍｇ２ＡＴＰ３、ＭｇＣｌ２ １、Ｎａ２ホスホクレアチン５、Ｌｉ２ＧＴＰ０．４２、ＨＥＰＥＳ １０、および２５０μｇ／ｍＬアンホテリシンＢ（ｐＨ＝７．２）を含有していた。Ａ２ＡレセプターアゴニストＣＧＳ２１６８０、アンタゴニストＺＭ２４１３８５およびＳＣＨ５８２６１とプロテインキナーゼＡインヒビターＨ‐８９をＤＭＳＯにすべて溶解し、１０ｍＭストック溶液として保管した。細胞を１０ｍＭカフェインへ一時的に暴露することにより、カフェイン放出性ＳＲカルシウム含有量を測定した。得られたＮａ‐Ｃａ交換電流の時間積分量を、Ｎａ‐Ｃａ交換器により３Ｎａ＋：１Ｃａ２＋の化学量論と仮定して、ＳＲから放出されたカルシウムのｐｍｏｌｅ（１０−１８モル）に変換した。
【００５２】
データ分析および統計
電気生理学的および共焦点カルシウム画像法実験を患者の臨床データに関する知識無しに実施した。同一患者の細胞において記録されたＣａ２＋スパークおよびＣａ２＋波を平均化した。別記されない限り、各患者の平均値を統計分析に用い、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表示した。一連のデータを正規性について検定した。具体的効果を検定する際に、有意差を評価する上でスチューデントｔ検定を用いた。ＡＮＯＶＡは複数効果の比較に用い、スチューデント‐ニューマン‐クールス事後検定は具体的効果の有意性を評価するために用いた。
【００５３】
膜調製
０．３２Ｍスクロース含有５ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４：緩衝液Ａ）の氷冷溶液中、Polytronホモゲナイザー（Kinematica，ＰＴＡ ２０ＴＳローター，セッティング５，３回の１５ｓ期）による細胞の破壊後に、遠心により膜を得た。４℃において３０分間にわたる１０００×ｇの遠心（タイプ７５Ｔｉローターで３５００ｒｐｍ）により細胞残屑(cell debris)を分離した。上澄みを４℃において、３０分間にわたり２６０００×ｇにより遠心し（タイプ７５Ｔｉローターで２００００ｒｐｍ）、ペレットを緩衝液Ａに再懸濁し、３７℃において３０分間インキュベートし、同条件により遠心した。ペレットを０．３Ｍ ＫＣｌに再懸濁し、４℃において一晩攪拌し、４℃において３０分間にわたり２６０００×ｇにより遠心し（タイプ７５Ｔｉローターで２００００ｒｐｍ）、上記のような緩衝液Ａにより一度洗浄した。最終ペレット（膜フラクション）を５０ｍＭトリスＨＣｌに再懸濁し、−８０℃において凍結した。トランスフェクトされたＨＥＫ細胞からの膜懸濁物は上述のとおり、得た（C.Herrera et al.,“Adenosine A2B receptors behave as an alternative anchoring protein for cell surface adenosine deaminase in lymphocytes and cultured cells”,Mol.Pharmacol.,2001,vol.59,pp.127-34参照）。タンパク質をビシンコニン酸法（Pierce Chemical Co.）により定量した。
【００５４】
ゲル電気泳動およびイムノブロッティング
ヒト細胞または一過性トランスフェクトＨＥＫ細胞からの膜を３７℃において、２時間加熱することによりＳＤＳ‐ＰＡＧＥ試料緩衝液（８Ｍ尿素，２％ＳＤＳ，１００ｍＭ ＤＴＴ，３７５ｍＭトリス，ｐＨ６．８）により処理し、１０％ゲルでＳＤＳ‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離させた。セミドライ・トランスファー・システムを用いてタンパク質をＰＶＤＦ膜へ移し、指定された抗体、次いで西洋ワサビ(horseradish)ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１／６００００）によりイムノブロットした。化学発光検出キット（SuperSignal，West Pico Chemiluminiscent基質，Pierce）を用いて、免疫反応バンドを展開させた。
【００５５】
免疫染色
免疫組織化学法では、ヒト心房組織をＯＣＴに包埋し、液体窒素冷却イソペンタンにより凍結させた。１８℃に冷却されたクリオスタットにより、８μｍ断片に切断した。各断片をSUPERFROST PLUS（BDH Chemicals Ltd.，Poole，United Kingdom）スライド上に集め、風乾し、−７０℃において貯蔵した。免疫蛍光法においては、トリス緩衝液（ＴＢＳ）（１５０ｍＭ ＮａＣｌ／５０ｍＭトリスＨＣｌ，ｐＨ７．５）中１０％ロバ血清で３０分間にわたり各断片を遮断した。スライドをアフィニティー精製抗Ａ２Ａレセプター（ＶＣ２１，２５μｇ／ｍＬ）および抗α‐アクチニン（１：５００希釈）、抗ミオシン（２μｇ／ｍＬ）、抗コネキシン‐４３（２．５μｇ／ｍＬ）、および抗リアノジンレセプター（６．５μｇ／ｍＬ）を室温において１時間インキュベートし、次いで１０分間にわたりＴＢＳによって３回洗浄した。ALEXA FLUOR 488複合ヤギ抗マウスＩｇＧおよびTEXAS RED複合ヤギ抗ウサギＩｇＧを１：２０００の希釈で遮断溶液に適用した。断片をすすぎ、VECTASHIELD免疫蛍光培地（Vector Laboratories Inc.，Burlingame，ＣＡ，U.S.A.）によりマウントした。免疫組織化学法においては、ポリ‐Ｄ‐リジンで被覆された２４ｍｍガラスカバースリップに摘出直後のヒト筋細胞を置いた。付着後、摘出溶液細胞をリン酸緩衝液ですすぎ、室温において２０分間かけてＰＢＳ中２％パラホルムアルデヒドにより固定した。細胞をＰＢＳにより洗浄し、アルデヒド基を封止するために０．１Ｍグリシンと５分間インキュベートした。ＰＢＳによる洗浄後、ＰＢＳ中０．２％トリトン‐Ｘ‐１００で１５分間かけて筋細胞の透過性を上げた。次いで細胞をＰＢＳにより洗浄し、室温において１０％ウマ血清で３０分間遮断し、次の一次抗体：ウサギポリクローナル抗Ａ２Ａレセプター（１０μｇ／ｍＬ）、抗α‐アクチニン（１：５００希釈）、抗ミオシン（１：５００希釈）、および抗コネキシン‐４３（１：１５０希釈）と室温において１時間インキュベートし、ＰＢＳにより３回洗浄し、ALEXA FLUOR 488と複合化された抗マウス抗体および／またはTEXAS REDと複合化された抗ウサギ抗体により染色した。最後に、細胞を再び３回すすぎ、VECTASHIELDでマウントした。Leica ＴＣＳ４Ｄ共焦点レーザー走査顕微鏡（Leica Lasertechnik GmbH，Heidelberg，Germany）で共焦点顕微鏡観察を行なった。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】心房細動を有する患者におけるＡ２Ａレセプター発現の上方調節。
【図２】Ａ２Ａレセプターのアゴニスト刺激には、心房細動を有する患者において自発的筋小胞体カルシウム放出のＰＫＡ依存性増加がある。
【図３】Ａ２Ａアンタゴニストは、心房細動の患者において基礎自発的筋小胞体カルシウム放出を減少させる。−８０ｍＶの保持電位において自発的ＩＮＣＸを示す実験。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトを含む哺乳動物において、心房細動の予防および／または治療用の医薬の製造のための、アデノシンＡ２Ａレセプターアンタゴニストの使用。
【請求項２】
前記Ａ２Ａアンタゴニストが、キサンチン誘導体またはその薬学上許容される塩である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記Ａ２Ａアンタゴニストが、下記式からなる群から選択される化合物である、請求項２に記載の使用：
【化１】
【請求項４】
前記Ａ２Ａアンタゴニストが、ＫＷ６００２としても知られる式（３）の化合物である、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記Ａ２Ａアンタゴニストが、ＭＳＸ‐２としても知られる式（６）の化合物である、請求項３に記載の使用。
【請求項６】
前記Ａ２Ａアンタゴニストが請求項３に記載の式（６）の化合物のリン酸エステルである、請求項２に記載の使用。
【請求項７】
前記Ａ２Ａアンタゴニストがピラゾロピリミジン誘導体である、請求項１に記載の使用。
【請求項８】
前記Ａ２Ａアンタゴニストがトリアゾロキノキサリン誘導体である、請求項１に記載の使用。
【請求項９】
前記Ａ２Ａアンタゴニストがトリアゾロトリアジン誘導体である、請求項１に記載の使用。
【請求項１０】
前記Ａ２Ａアンタゴニストが下記式からなる群より選択される化合物である、請求項１に記載の使用：
【化２】
【請求項１１】
前記Ａ２ＡアンタゴニストがＶＥＲ‐６６２３としても知られる式（１５）の化合物である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１】
ヒトを含む哺乳動物において、心房細動の予防および／または治療用の医薬の製造のための、アデノシンＡ２Ａレセプターアンタゴニストの使用。
【請求項２】
前記Ａ２Ａアンタゴニストが、キサンチン誘導体またはその薬学上許容される塩である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記Ａ２Ａアンタゴニストが、下記式からなる群から選択される化合物である、請求項２に記載の使用：
【化１】
【請求項４】
前記Ａ２Ａアンタゴニストが、ＫＷ６００２としても知られる式（３）の化合物である、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記Ａ２Ａアンタゴニストが、ＭＳＸ‐２としても知られる式（６）の化合物である、請求項３に記載の使用。
【請求項６】
前記Ａ２Ａアンタゴニストが請求項３に記載の式（６）の化合物のリン酸エステルである、請求項２に記載の使用。
【請求項７】
前記Ａ２Ａアンタゴニストがピラゾロピリミジン誘導体である、請求項１に記載の使用。
【請求項８】
前記Ａ２Ａアンタゴニストがトリアゾロキノキサリン誘導体である、請求項１に記載の使用。
【請求項９】
前記Ａ２Ａアンタゴニストがトリアゾロトリアジン誘導体である、請求項１に記載の使用。
【請求項１０】
前記Ａ２Ａアンタゴニストが下記式からなる群より選択される化合物である、請求項１に記載の使用：
【化２】
【請求項１１】
前記Ａ２ＡアンタゴニストがＶＥＲ‐６６２３としても知られる式（１５）の化合物である、請求項１０に記載の使用。
【図２】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図３】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図３】
【公表番号】特表２００９−５１１５５１（Ｐ２００９−５１１５５１Ａ）
【公表日】平成２１年３月１９日（２００９．３．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５３５０４７（Ｐ２００８−５３５０４７）
【出願日】平成１８年１０月１０日（２００６．１０．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＳ２００６／０００５６４
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０４５７０５
【国際公開日】平成１９年４月２６日（２００７．４．２６）
【出願人】（５０６０６１７１６）プロイェクト、デ、ビオメディシナ、シーマ、ソシエダッド、リミターダ (34)
【氏名又は名称原語表記】ＰＲＯＹＥＣＴＯ ＤＥ ＢＩＯＭＥＤＩＣＩＮＡ ＣＩＭＡ， Ｓ．Ｌ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年３月１９日（２００９．３．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１０月１０日（２００６．１０．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＳ２００６／０００５６４
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０４５７０５
【国際公開日】平成１９年４月２６日（２００７．４．２６）
【出願人】（５０６０６１７１６）プロイェクト、デ、ビオメディシナ、シーマ、ソシエダッド、リミターダ (34)
【氏名又は名称原語表記】ＰＲＯＹＥＣＴＯ ＤＥ ＢＩＯＭＥＤＩＣＩＮＡ ＣＩＭＡ， Ｓ．Ｌ．
【Ｆターム（参考）】
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