抗ストレス剤
【課題】効果的にストレスや不安、攻撃性の低下や積極性の向上が可能な気分状態改善剤、すなわち、抗ストレス剤のスクリーニング方法、ならびにＶＥＧＦの発現により精神状態が改善された状態のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供すること。
【解決手段】ＶＥＧＦ蛋白質もしくはＶＥＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＶＥＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいはＶＥＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくはＶＥＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＶＥＧＦ蛋白質と実質的に同質な活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ、又はそれらＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＶＥＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡを有効成分として含有することを特徴とする、抗ストレス剤。
【解決手段】ＶＥＧＦ蛋白質もしくはＶＥＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＶＥＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいはＶＥＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくはＶＥＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＶＥＧＦ蛋白質と実質的に同質な活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ、又はそれらＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＶＥＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡを有効成分として含有することを特徴とする、抗ストレス剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、効果的にストレスや不安、攻撃性の低下や積極性の向上ができる、気分状態改善剤に関する。また、本発明は、それらの気分状態改善剤をスクリーニングする方法に関する。さらに、精神状態が改善された状態のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
喜怒哀楽は我々の日常生活する上で重要な心的要因であり、我々の人生に彩を与えるものである。喜び、悲しみ、恐怖、不安、怒りなども含め「情動」と呼ぶが、これらは個人の時折々の主観的な感情として片付けられるものではなく、生命維持に必要な高次脳機能として、特に恐怖、不安等が進化上保存されている。
【０００３】
我々の健康には、身体機能のみならず精神機能も正常に維持されることが必須であり、情動に関わる疾病も少なくない。情動の異常、すなわち気分障害は我々の社会生活において非常によく見られる精神疾患である。例えば、気分障害の一つである「うつ病」は、米国での調査によると生涯罹患率が２割にも達することが示されている。現代社会では、気分障害を罹患する人の割合が増加する傾向にあり、例えば、年々増加傾向にある日本国における自殺者数のうち、約７割が気分障害を罹患していたという推計もある。このように、情動の異常は単なる個人の問題としては済まされず、社会問題にまで発展するものであり、現代社会において早急に解決されるべき課題となっている。
【０００４】
疾病としての気分障害や個人の気分を改善させる手段として、現在、カウンセリング、認知療法、運動療法、電気痙攣法、ハーブ療法、音楽療法、趣味等による気分の改善、社会技能の取得などが知られている。しかしながら、これらの療法は改善まで時間を必要とするのもが多く、さらにその効果も一定ではない。そのような理由から、現実的にはこれらの療法と平行して薬物療法を行わざるを得ない。
【０００５】
薬物療法を行うにあたり、情動に変化を与える向精神薬が使用される。向精神薬はその作用機構の違いからいくつかのクラスに分類されるが（非特許文献１）、神経伝達物質であるモノアミンの脳内濃度を変化させる薬剤が特に広く用いられている。例えば、臨床で使用される抗うつ剤はモノアミン分解を阻害するものや、モノアミンの取り込みを阻害する薬剤がほとんどであり、これらを用いた薬物療法は一定の臨床成果を得ている。これらの薬効の生理学的説明としては、モノアミンの脳内濃度が情動の変化をもたらすといったモノアミン仮説に基づく（非特許文献２）（非特許文献３）。すなわち、セロトニンの脳内濃度が低下したためにうつ病が発症するという解釈である。しかしながら、この仮説が発表されて既に４０年以上たつが、情動をつかさどる脳内メカニズム（分子メカニズム、関連する神経ネットワークや脳領域）は多くの点で不明である。
【０００６】
情動に変化を及ぼしうる因子としては、モノアミン以外に、酸素・栄養の循環、代謝、神経伝達物質、成長因子、ホルモンなどの様々な要因が考えられる。中でも成長因子は神経細胞の機能と密接な関連があることから、高次脳機能に影響を与える。例えば、成長因子は脳において神経細胞の増殖、神経新生の促進、軸索の投射、神経細胞の構造や機能の成熟化、シナプス可塑性、神経保護、記憶や学習、情動など、細胞が生まれてから死ぬまでの運命や、分子から個体レベルに及ぶ脳機能に影響を与える。
【０００７】
情動に影響を与える成長因子はいくつか知られており、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、はその例である（非特許文献３）。ＢＤＮＦ、ＩＧＦ、ＶＥＧＦは環境の変化によって発現レベルが変化することから、外界の刺激が脳機能に長期的変化を誘導する際の仲介分子として働いている可能性が高い。
【０００８】
ＢＤＮＦは脳由来の成長因子で神経機能とのかかわりが深く、神経新生、シナプス可塑性、神経保護、記憶、情動に重要な働きを示す（非特許文献４）。この遺伝子が失われると、生後まもなく死亡する。ＢＤＮＦを海馬のみで欠失させても神経可塑性の低下や、空間記憶の障害、さらに情動の障害が起きる。運動をはじめ、学習、電気刺激によって脳で発現し、それを阻害すると効果が失われる（非特許文献５）。
【０００９】
ＩＧＦ−Ｉは主に末梢組織で作られ、個体の成長や寿命、脳では神経新生、神経可塑性、記憶、情動に関わっている。この遺伝子が失われると固体の成長が著しく妨げられ、ＩＧＦ−Ｉの発現量が低いと寿命が延びる。運動によって末梢で作られたＩＧＦ−Ｉは血管系を循環し血液脳関門を通過して脳組織に到達する。ＩＧＦ−Ｉは空間記憶の促進や抗うつ作用との関わりが示されている。また、ＩＧＦ−Ｉは、ＢＤＮＦの脳内作用を調節しているとの報告がある（非特許文献６）。
【００１０】
ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）は血管新生に必須な因子であり、脳を含む様々な組織で作られている。この遺伝子が失われると胎生致死となり、脳に限定して欠失させても出生直後に死亡する。ＶＥＧＦは、運動をはじめ、学習、低酸素、電気刺激、虚血、脳障害などの様々な刺激によって誘導され、脳では神経新生や血管新生のほか、神経保護、記憶、情動とのかかわりが指摘されている。（非特許文献７、非特許文献８）
【００１１】
ＶＥＧＦには、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄというアイソフォームが存在する。これらは、蛋白質の一次構造において高い相同性を示すが、異なる遺伝子でコードされている。この４種類のアイソフォームの中でも、血管新生に深く関わっているのがＶＥＧＦ−Ａであると考えられている。その理由から、一般的にＶＥＧＦといえば、ＶＥＧＦ−Ａを示す。
【００１２】
ＶＥＧＦ−Ａの遺伝子はスプライシングの違い（エクソンの組み合わせによる違い）から、少なくとも５種類のスプライスバリアントが作られる。例えば、マウス／ヒトのＶＥＧＦ−Ａ遺伝子からは、ＶＥＧＦ１２０／１２１（エクソン番号：１，２，３，４，５，８）、ＶＥＧＦ１４４／１４５（エクソン番号：１，２，３，４，５，６，８）、ＶＥＧＦ１６４／１６５（エクソン番号：１，２，３，４，５，７，８）、ＶＥＧＦ２０５／２０６（エクソン番号：１，２，３，４，５，６，６,７，８）が作られる。
【００１３】
ＶＥＧＦの後の番号は成熟型ＶＥＧＦのアミノ酸残基の数を示している。即ち、ＶＥＧＦ１２０であれば、成熟型はアミノ酸１２０残基から構成されている。これらのスプライスバリアントは、個体の発生段階や組織においてその種類と発現量が異なっている。
【００１４】
ＶＥＧＦは分泌性の蛋白質である。未成熟型（前駆体）のＶＥＧＦには、そのアミノ末端側（Ｎ−末端側）に２６アミノ酸残基で構成されるシグナルペプチドを有する。この配列は小胞体の膜を通過する際に、シグナルペプチターゼによって切断される。即ち、ＶＥＧＦ１２０の場合、１４６アミノ酸残基からなる前駆体として産生され、２６アミノ酸残基からなるシグナルペプチドが切断されることによって、１２０アミノ酸残基からなる成熟体となる。
【００１５】
こうして作られた成熟型ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦ産生細胞の細胞外へと分泌されるか、もしくはＶＥＧＦ産生細胞の細胞膜上にとどまる。細胞外へ分泌されるスプライシングバリアントは、ＶＥＧＦ１２０／１２１やＶＥＧＦ１４４／１４５、ＶＥＧＦ１６４／１６５である。
【００１６】
ＶＥＧＦ受容体には、ＶＥＧＦ受容体１（別名：Ｆｌｔ−１）とＶＥＧＦ受容体２（別名：Ｆｌｋ−１）、ニューロピリン１とニューロピリン２が知られている。スプライシングバリアントのＶＥＧＦ１２０／１２１やＶＥＧＦ１４５／１４６はＶＥＧＦ受容体１ と２のみに結合するが、スプライシングバリアントのＶＥＧＦ１６４／１６５、ＶＥＧＦ１８８／１８９とＶＥＧＦ２０５／２０６はＶＥＧＦ受容体１と２以外に、ニューロピリン１又は２にも結合する。即ち、ＶＥＧＦ１２０は、ＶＥＧＦ受容体１又は２のみに結合する。
【００１７】
従来、ＶＥＧＦは、大腸がん、胃がん、肺がんなどにおける様々な腫瘍細胞で、血管を腫瘍に引き込むために過剰発現されていることが知られており、このＶＥＧＦ作用を抑えるために、ＶＥＧＦの発現を抑制、又は働きを阻害させる阻害剤の開発において大きく注目されている（特許文献１〜４）。また、一方、皮膚機能低下を抑制する皮膚賦活剤としてＶＥＧＦの発現を促す物質の探索も盛んである（特許文献５〜７）。しかしながら、抗ストレス剤などの方面からの研究はなされていない。
【００１８】
【非特許文献１】Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ ＬＥ ｅｔ ａｌ． ＮｅｕｒｏＲｘ． ２００５ Ｏｃｔ；２（４）：５９０−６１１．
【非特許文献２】Ｓｃｈｉｌｄｋｒａｕｔ ＪＪ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒ Ｒｅｓ． １９６５ Ｄｅｃ；３（４）：２１３−２８．
【非特許文献３】Ｃｏｐｐｅｎ Ａ ｅｔ ａｌ． Ｌａｎｃｅｔ． １９６７ Ｄｅｃ ２；２（７５２７）：１１７８−８０．
【非特許文献４】Ｔａｎｉｓ ＫＱ ｅｔ ａｌ． ＣＮＳ Ｎｅｕｒｏｌ Ｄｉｓｏｒｄ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ． ２００７ Ａｐｒ；６（２）：１５１−６０．
【非特許文献５】Ｄｕｍａｎ ＲＳ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ． ２００６ Ｊｕｎ １５；５９（１２）：１１１６−２７．
【非特許文献６】Ａｒｓｅｎｉｊｅｖｉｃ Ｙ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １９９８ Ｍａｒ １５；１８（６）：２１１８−２８．
【非特許文献７】Ｎｅｕｆｅｌｄ Ｇ ｅｔ ａｌ． ＦＡＳＥＢ Ｊ． １９９９ Ｊａｎ；１３（１）：９−２２．
【非特許文献８】Ｗａｒｎｅｒ−Ｓｃｈｍｉｄｔ ＪＬ ｅｔ ａｌ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ２００８ Ｆｅｂ；８（１）：１４−９．
【特許文献１】特開２００１−３５４５６２号公報
【特許文献２】特開２００３−０１２５４１号公報
【特許文献３】特許第３５４４６７５号公報
【特許文献４】特許第４０５４３７３号公報
【特許文献５】特開平１１−２８６４３２号公報
【特許文献６】特許第４０５０５６０号公報
【特許文献７】特開２０００−２１２０５９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明の目的は、効果的にストレスや不安、攻撃性の低下や積極性の向上が可能な気分状態改善剤である、抗ストレス剤を提供することである。
また、本発明は、前記抗ストレス剤のスクリーニング方法を提供するものである。さらに、本発明はＶＥＧＦの発現により精神状態が改善された状態のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく検討したところ、ＶＥＧＦを過剰に発現したトランスジェニック非ヒト哺乳動物がストレスや不安、攻撃性の低下を示し、積極性のある行動を示すことを見いだした。本発明はかかる知見に基づいて開発されたものである。
【００２１】
すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕 ＶＥＧＦ蛋白質もしくはＶＥＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＶＥＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいはＶＥＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくはＶＥＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＶＥＧＦ蛋白質と実質的に同質な活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ、又はそれらＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＶＥＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡを有効成分として含有することを特徴とする、抗ストレス剤、
〔２〕 ＶＥＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくはＶＥＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＶＥＧＦ蛋白質と実質的に同質な活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ、又はそれらＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＶＥＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡをコードするｍＲＮＡの発現量を指標とした、及び／又は、ＶＥＧＦ蛋白質もしくはＶＥＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＶＥＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩のタンパク質量を指標とした、抗ストレス剤のための化合物又は組成物のスクリーニング方法、
〔３〕 前記〔２〕に記載のスクリーニング方法により選択される物質を有効成分として含有する抗ストレス剤、
〔４〕 ＶＥＧＦ受容体１であるＦｌｔ−１、及び／又は、ＶＥＧＦ受容体２であるＦｌｋ−１に対するアゴニスト活性を指標とした抗ストレス剤のための化合物及び組成物のスクリーニング方法、
〔５〕 前記〔４〕に記載のスクリーニング方法により選択される物質を有効成分として含有する抗ストレス剤、
〔６〕 脳内でＶＥＧＦ蛋白質が過剰に発現されており、且つ、脳内で神経新生及び血管新生が促進されていることを特徴とするトランスジェニック非ヒト哺乳動物、
〔７〕 血液脳関門が緩やかになっており、末梢投与の薬剤や組成物の脳内における生理活性評価が容易になっていることを特徴とする前記〔６〕記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物、
〔８〕 高感度に情動行動が評価できることを特徴とする前記〔６〕及び〔７〕記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物
に関する。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の抗ストレス剤は、以前より提供されている脳内モノアミン代謝やＧＡＢＡ受容体に作用するものとは異なる、新規の作用を備えた抗ストレス剤を提供できる。
また、本発明のスクリーニング方法を用いることで、種々の天然原料、人工的に作製された原料などから、前記抗ストレス剤を効率よく選択することができる。
また、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いれば、ストレス、不安、積極性低下及び攻撃性増進等の現在問題となっている精神病に関連した因子の特定や、ストレッサーの探索をしやすくすることができる。
なお、本発明において、抗ストレスとは、ストレスを低減する作用のほか、不安、攻撃性の低下や積極性の向上が可能な作用も含む。したがって、本発明の抗ストレス剤は、抗不安剤、積極性向上剤及び攻撃性抑制剤としても利用し得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
１．抗ストレス剤
本発明で用いる「ＶＥＧＦ蛋白質」は、血管内皮増殖因子の全てのアイソフォーム（ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄを含む）およびそれらの全てのスプライスバリアントを意味する。なお、ＶＥＧＦ蛋白質のアミノ酸配列は既に知られたものである。
また、作用対象の生物種がヒトである場合、免疫反応による副作用を低減する観点から、ヒト由来の血管内皮増殖因子を用いるのが好ましい。
【００２４】
また、「ＶＥＧＦ蛋白質の部分ペプチド」とは、前記ＶＥＧＦを構成するアミノ酸配列に含むようなペプチドであって、ＶＥＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩をいう。
【００２５】
また、「ＶＥＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡ」とは、ＶＥＧＦ蛋白質を発現しうるＤＮＡ配列をいう。ＶＥＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡ配列の具体例としては、ＧｅｎｅＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪにアクセション番号：ＡＫ３１３８７９， ＢＣ０３５２１２， ＢＣ０６５５２２， Ｄ８９６３０， Ｍ６３９７１， Ｍ６３９７２， Ｍ６３９７３， Ｍ６３９７４， Ｍ６３９７５， Ｍ６３９７６， Ｍ６３９７７， Ｍ６３９７８， ＢＣ０２７９４８， ＡＹ２６３１４５， ＡＹ０４７５８１， ＡＦ０２４７１０， ＥＵ３３２８６６， ＤＱ２２９９００， ＡＦ４６８１１０， Ｕ５２８１９， ＢＣ０４６３０３， ＢＣ０６１４６８， Ｄ８９６２８， Ｍ９５２００， ＡＦ２８６７２５， Ｕ５０２７９， ＢＣ０９６３７７， ＡＦ２６６４６７， ＡＢ０４７５５２， Ｕ７３６２０， ＡＹ２６３１４６， ＡＹ７５６０６８， Ｕ４８８００， ＡＦ３１７８９２等として登録されているヒト又はマウス由来のＶＥＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡ等が好ましく挙げられる。
また、本発明のＶＥＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡには前記ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであってＶＥＧＦ蛋白質と実質的に同質な活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ等が包含される。
【００２６】
また、本発明のＶＥＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡは上記に限定されず、発現する蛋白質がＶＥＧＦ蛋白質と実質的に同じ作用を有する蛋白質をコードするＤＮＡである限り、本発明のＶＥＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡとして使用できる。例えば、ＶＥＧＦ蛋白質の部分ペプチドをコードするＤＮＡであってＶＥＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ等も好ましく使用できる。
【００２７】
ＶＥＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくはＶＥＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＶＥＧＦ蛋白質と実質的に同質な活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ、又はそれらＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、例えば上記ＤＮＡの部分配列をプローブとし、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味する。
【００２８】
ＶＥＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくはＶＥＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＶＥＧＦ蛋白質と実質的に同質な活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ、又はそれらＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとして、具体的には、前記ＧｅｎｅＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪに記されている塩基配列と約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するＤＮＡ等が挙げられる。ハイブリダイゼーションは公知の方法、例えばモレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ． Ｐｒｅｓｓ． ２００１）に記載の方法等に従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書の記載方法に従って行うことができる。
【００２９】
本発明の抗ストレス剤は、前記のような（１）ＶＥＧＦ蛋白質、（２）ＶＥＧＦ蛋白質の部分ペプチド又はその塩、（３）ＶＥＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡ、（４）ＶＥＧＦ蛋白質の部分ペプチドをコードするＤＮＡ、（５）これらのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＶＥＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡのいずれか１種のみからなっていてもよく、２種以上を混合して調製してもよい。各剤中における各成分の含有量については特に限定はないが、例えば、（１）ＶＥＧＦ蛋白質であれば０．０１〜５０重量％、（２）ＶＥＧＦ蛋白質の部分ペプチド又はその塩であれば０．０１〜５０重量％、（３）ＶＥＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡであれば０．０１〜１０重量％、（４）ＶＥＧＦ蛋白質の部分ペプチドをコードするＤＮＡであれば０．０１〜１０重量％、（５）これらのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＶＥＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡであれば０．０１〜１０重量％であることが好ましい。
なお、本発明の抗ストレス剤は、例えば、抗不安剤、積極性向上剤及び攻撃性抑制剤などの用途でも使用できるが、これらの用途に応じて、前記ＶＥＧＦ蛋白質等を適宜水等の溶媒に溶解して使用してもよい。
【００３０】
本発明の抗ストレス剤には、前記の各成分を混合して調製する以外に、スクリーニング方法を用いて選択される物質を用いることもできる。
【００３１】
本発明の抗ストレス剤は、ヒトのほか、ヒト以外の哺乳動物（例えばサル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、チンパンジー等）にも適用できる。これらの動物への適用量としては、特に限定はない。また、投与方法としては、最終的に脳組織中のＶＥＧＦ濃度が２０ｎｇ／ｇ組織重以上、好ましくは５０ｎｇ／ｇ組織重以上になるような方法であれば特に限定はない。
例えば、ヒトであれば、一日あたり経口投与であれば、１日あたりＶＥＧＦ蛋白質が１ｇ／ｋｇ体重以下となるようにすればよい。
【００３２】
２．スクリーニング方法
本発明者らは、後述の実施例で確認した通り、ＶＥＧＦに情動（ストレス、不安、うつ、攻撃性、恐怖）の制御に優れた効果があることをはじめて見出している。この結果に基づくと、ＶＥＧＦの発現を促す因子にも、ストレス、不安、うつ、攻撃性を軽減させる効果があると考えられる。これまでの知見で、ＶＥＧＦの発現は様々な環境因子、例えば、運動、虚血、低酸素、電気的痙攣、脳障害などによって促進されることが知られている。しかし、虚血、低酸素、電気痙攣などはＶＥＧＦ の発現を顕著に促進する方法であるが、健康上避けるべきで手法であり、実用的であるとは言えない。一方、運動はより自然的な環境刺激であるが、ＶＥＧＦの発現の促進効果は低い傾向にある。すなわち、生体におけるＶＥＧＦの発現をより効率的に促進するような化合物や組成物のスクリーニング方法を見つけることは特に重要である。
【００３３】
ＶＥＧＦの発現を促進する化合物や組成物には、情動を制御する作用があると考えられることから、それらをスクリーニングする必要がある。これは、ＶＥＧＦの発現量を指標として、化合物や組成物の効果を評価することで達成される。すなわち、化合物や組成物を生体に投与して、ＶＥＧＦの発現量の程度を比較することによって評価できる。ＶＥＧＦの発現量は、１）遺伝子の転写の段階（ｍＲＮＡレベル）、もしくは２）ｍＲＮＡの翻訳の段階（タンパク質レベル）の２種類の方法で測定することが可能である。以下に、その２つの手法について記述する。
【００３４】
本発明による抗ストレス剤のための化合物及び組成物のスクリーニング方法は、ＶＥＧＦ ｍＲＮＡ、及び／又はＶＥＧＦ蛋白質の発現量を指標としてスクリーニングすることができる。即ち、被検物質を投与し、ＶＥＧＦ ｍＲＮＡ、及び／又はＶＥＧＦ蛋白質の発現量の程度を比較することによって、評価することができる。
【００３５】
本発明のスクリーニング方法に利用される試験動物としては、ＶＥＧＦの情報伝達系が高度に保存されている哺乳動物を用いるのが適当である。具体的にはヒト及び非ヒト哺乳動物、例えばマウス、ハムスター、ラット、モルモット、ウサギ等のげっ歯類の他、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ブタ、サル等を使用することができるが、多様な条件下で化合物や組成物の効果を検討するため、小動物を用いて多くの例数を得るのが望ましい。即ち、育成及び使用の簡便さなどの観点から見て、げっ歯類が好ましく、その中でもマウスが好ましい。
【００３６】
本発明のスクリーニング方法における化合物や組成物の投与は、化合物や組成物の性質に依存するため、経口投与、腹腔内投与、静脈投与、皮下投与等が考えられる。また、投与量及び投与期間についても、化合物や組成物の性質に基づいて異なる条件を検討する。
【００３７】
本発明のスクリーニング方法において、ＶＥＧＦ遺伝子発現のレベルを定量的に解析する上で、ＶＥＧＦ ｍＲＮＡ の発現量の変化を調べる。ＶＥＧＦ ｍＲＮＡの発現を定量的に調べる方法として、ノーザンブロット法、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法、ジーンチップやＤＮＡマイクロアレイを利用する方法、などさまざまな手法が考えられる。中でも、最も経済的かつ、迅速に、また高感度でＶＥＧＦ ｍＲＮＡの発現量を調べる方法としてはＰＣＲを用いる方法があげられる。また、リアルタイムＰＣＲ法を用いると、ＶＥＧＦ ｍＲＮＡの発現レベルが、定量的に、高感度で、比較的安価で、短時間に行うことができる。
【００３８】
本発明のスクリーニング方法におけるＶＥＧＦ ｍＲＮＡ試料の調製に必要な組織とその操作としては、ＶＥＧＦは、様々な細胞で産生されていることから、ｍＲＮＡ試料の調製には、基本的にどの組織を用いてもよい。中でも、本発明ではＶＥＧＦによる中枢神経系への効果を主眼とするため、脳組織を用いるのが好ましい。脳組織としては、脳全体を用いるか、もしくは脳を解剖し、大脳辺縁系（情動と密接な関わりを持つ領域）等の領域を得ることも可能である。これらの脳組織を動物より迅速に摘出し、低温で処理し（急速に冷やしてｍＲＮＡの分解・産生を止める）、脳を解剖する場合は氷上で行う。得られた組織を秤量し、液体窒素もしくはドライアイス等で急速に凍結し、超低温冷凍庫（−８０℃）で保存する。
【００３９】
ｍＲＮＡ試料の調製においては、経済的で、簡便で、再現性が高い抽出法が選択される。精製されたｍＲＮＡ をＰＣＲに用いるのが理想的ではあるが、ｍＲＮＡの精製には、時間、労力、設備が必要なうえ、得られるサンプル量が非常に僅かなため実験誤差を生じやすい。そこで、より実用的な手法としては、ｍＲＮＡを含むｔｏｔａｌ ＲＮＡを粗ｍＲＮＡ標品（ｔｏｔａｌ ＲＮＡには全てのｍＲＮＡが含まれるが、ｔｏｔａｌ ＲＮＡに対するｍＲＮＡの割合は通常１−２％程度である）として用いる。ｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製する方法にはいろいろあるが、一例として酸フェノール法があり、組織よりｔｏｔａｌ ＲＮＡを迅速に、高収率で回収することが可能である。得られた粗ｍＲＮＡ試料は、超低温冷凍庫（−８０℃）で保存する。ＲＮＡは分解されやすいことから、ＲＴ−ＰＣＲ 反応を行う際に、ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）で処理された水に溶解する。
【００４０】
ＰＣＲにおいては、ＤＮＡが鋳型となる。遺伝子発現の解析にあたっては、転写産物としてのｍＲＮＡを逆転写することによって得られたｃＤＮＡを鋳型とする。逆転写反応はＲＮＡをＤＮＡに変換する反応であり、鋳型ｍＲＮＡ、核酸基質（ｄＮＴＰ）、プライマーＤＮＡ（オリゴｄＴプライマー、ランダムプライマー）の存在下、逆転写酵素（ＭＭＬＶ又はＡＭＶ由来、もしくはそれらの改良型）を作用させることによって、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成する。逆転写反応の実際の操作は、市販のキットを用いて簡便に行うことができる。逆転写反応において、生成されるそれぞれのｃＤＮＡの量はその鋳型であるｍＲＮＡの量と化学量論的である。すなわち、それぞれのｍＲＮＡの存在量に比例してｃＤＮＡが合成される。
また、逆転写反応とＰＣＲを一度に行う方法も使用することができる。この場合は、ｔｏｔａｌ ＲＮＡをＰＣＲ溶液に直接加えることによって、一連の反応を進行させることができる。
【００４１】
ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）は、微量に存在するＤＮＡを増幅して検出する方法である。しかし、ＰＣＲによってＤＮＡが過剰に増幅されると、ＰＣＲ産物の生成が飽和してしまうため（一定量に落ち着くため）定量的な比較は困難となる。リアルタイムＰＣＲでは、ＤＮＡの増幅の状況を逐次追跡することができるため、個々の増幅の程度を知ることができる。すなわち、鋳型として用いたｃＤＮＡの量が多ければ、少ない増幅回数で検出可能なレベルにまで増幅されるが、逆にｃＤＮＡの量が少なければ、検出されるまでより多くの増幅回数が必要となる。この増幅の差から、ＰＣＲに用いたｃＤＮＡの存在量を比較することができる。濃度が既知のコントロールＤＮＡ試料を用いて検定線を作成すると、ＰＣＲに用いたｃＤＮＡの絶対量を知ることができる。前述の通り、ＰＣＲに用いたｃＤＮＡの量は、組織のｍＲＮＡの量と比例関係にある。よって、リアルタイムＰＣＲによって、組織におけるｍＲＮＡの発現量を比較することができる。リアルタイムＰＣＲのための試薬や装置は市販のものを使用すればよく特に限定はない。増幅されるＤＮＡの検出方法としては、一般的にはインターカレーター法を用い、検出特異性を高く必要がある場合は蛍光標識プローブ法を用いる。
【００４２】
本発明のスクリーニング方法において、ＶＥＧＦ遺伝子発現の変化は、組織中のｍＲＮＡの存在量を測定することによって調べることができる。しかし、遺伝子産物、具体的にはＶＥＧＦ蛋白質の発現量が、翻訳の段階で調節されている場合もある。そのため、組織中のＶＥＧＦ蛋白質の存在量を比較することも必要になる。特定のタンパク質を検出して定量的に測定する方法も多数あるが、最も一般的な方法はＥＬＩＳＡ法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ、酵素結合免疫吸着検定法）である。そこで、本発明でもＥＬＩＳＡ法を用いてＶＥＧＦ蛋白質の発現量を比較し、化合物や組成物の効果を評価することができる。
【００４３】
本発明のスクリーニング方法において、タンパク質試料の作製に必要な組織とその操作としては、本発明では、ＶＥＧＦによる脳機能への作用を主眼とするため、タンパク質試料は脳組織より調製する。脳組織としては、脳全体、もしくは特定の脳領域を用いてもかまわない。しかし、情動との関わりが深い大脳辺縁系などの領域を調べることによって、解析の精度を上げることが望ましい。脳組織の摘出は迅速に行い、脳を氷冷した緩衝液に浸して急速に冷やす（タンパク質の分解を抑える）。特定の脳領域を得るため解剖が必要な場合は氷上で行う。得られた組織は秤量し、液体窒素もしくはドライアイス等で急速に凍結し、超低温冷凍庫（−８０℃）で保存する。
【００４４】
タンパク質試料の調製は、タンパク質分解を最小限に抑えるため全て氷上で行う。得られた脳組織に対し、その重さに従ってホモジナイズ溶液を加える（例、組織重量の１０倍量の溶液を添加する）。ホモジナイズ溶液は、ＲＩＰＡ溶液などのタンパク質の機能・構造に影響を与えず、全ての細胞内タンパク質を抽出できる溶液を使用する。この溶液に、さらに各種タンパク質分解酵素の阻害剤を加えて、タンパク質の分解を防ぐ。ホモジナイズ溶液の添加後、破砕機（ホモジナイザーもしくは超音波破砕機）を用いて組織を破壊し均一化する。この溶液を１０，０００ｘｇで遠心分離し、上清を回収する。当日に、測定を行わない場合は、−８０℃にて凍結保存する。
【００４５】
ＥＬＩＳＡに用いるタンパク質試料について、タンパク質の総量を測定する。これは、一連の試料調製作業において、一定体積に溶解しているタンパク質量に若干のばらつきが生じるためである。すなわち、総タンパク質量で基準化することによって、組織におけるＶＥＧＦの存在量を比較することができる。タンパク質濃度の測定は、ローリー（Ｌｏｗｒｙ）法もしくはブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）法を用いて呈色反応を行い、分光光度計により測定する。濃度が既知のタンパク質溶液（例、牛血清アルブミン）を各段階に希釈して標準溶液を作製し、これらの呈色反応を基準として、試料中のタンパク質濃度を検定することができる。
【００４６】
ＶＥＧＦ蛋白質量の検定は、市販のＥＬＩＳＡキットを用いればよい。例えば、Ｂｉｏｓｏｕｒｓｅ社製、ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡキットが挙げられるがこれに限定されない。ＥＬＩＳＡでは、まず、抗ＶＥＧＦ抗体が付着したマルチウェルプレートにタンパク質試料を入れ、試料中のＶＥＧＦを抗原抗体反応によって特異的に容器に吸着させる。次に、別の抗ＶＥＧＦ抗体（１次抗体）を加えて、容器表面に吸着されたＶＥＧＦと特異的に結合させる。最後に、酵素（例、過酸化酵素）と架橋された２次抗体を１次抗体と反応させて、酵素基質反応（呈色反応）を行う。
一方、濃度が既知のＶＥＧＦ溶液を一定濃度に希釈したものを標準試料とし、これも同様に反応させる。酵素基質反応による呈色の度合いを分光光度計で測定し、標準試料の検定線を作成することによって、試料中のＶＥＧＦの絶対量を求めることができる。最終的に、試料のタンパク質総量に対するＶＥＧＦ量をもって、組織中のＶＥＧＦの濃度とする（例えば、ＶＥＧＦ（ｐｇ）／タンパク質総量（ｍｇ））。組織中のＶＥＧＦの濃度を比較することによって、化合物や組成物の効果を比較することができる。
【００４７】
ＶＥＧＦは、不安、うつ、恐怖、攻撃性などの情動を緩和する作用を示す。これらの作用は、ＶＥＧＦがＶＥＧＦ受容体を活性化することで達成される。しかし、ＶＥＧＦ受容体には幾つかの種類があり（「背景」を参照）、これらの全てが情動に影響を与えるとは限らない。すなわち、それらの受容体に特異的な化合物や組成物をスクリーニングすることによって、情動の制御により効果的で、しかも副作用の少ないものが得られる可能性が高い。そこで、各種ＶＥＧＦ受容体の活性、望ましくはＦｌｔ−１及び／又はＦｌｋ−１に対するアゴニスト活性を指標として化合物や組成物をスクリーニングする。これは培養細胞を用いて行うことができる。Ｆｌｔ−１及び／又はＦｌｋ−１に対するアゴニスト活性は、例えば、培養細胞株にＦｌｔ−1またはＦｌｋ−１の遺伝子を導入して過剰発現させ、各種アンタゴニストの添加で生じる生理活性の変化（細胞分裂活性、転写活性、リン酸化酵素等のシグナル伝達因子の活性）を定量することによって調べることができる。
【００４８】
前記のスクリーニング方法を用いることで、抗ストレス剤、抗不安剤、積極性向上剤又は攻撃性抑制剤として使用し得る化合物又は組成物を探索することができる。
【００４９】
３．トランスジェニック非ヒト哺乳動物
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、脳内でＶＥＧＦ蛋白質が過剰に発現されており、且つ、脳内で神経新生及び血管新生が促進されていることを特徴とする。脳内におけるＶＥＧＦ蛋白質の過剰発現の程度としては、定常状態におけるＶＥＧＦの組織濃度の１０％以上であればよい。脳内で神経新生が促進されていることは、核酸類似物質（ブロモデオキシウリジン等）を末梢投与することによって確認した場合に、神経新生が起きている脳領域（側脳室の上衣下層や海馬歯状回の顆粒細胞下層等）における陽性細胞の密度が定常レベルよりも５％以上であればよく、または未熟神経細胞を免疫染色することによって確認した場合に、海馬歯状回の顆粒細胞等の神経細胞層における陽性細胞の密度が定常レベルよりも５％以上であればよい。血管新生が促進されていることは、血管内皮細胞を免疫染色することによって確認した場合に、血管内皮細胞もしくは毛細血管の密度が定常レベルよりも５％以上であればよい。
【００５０】
また、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、血液脳関門が緩やかになっている。通常、末梢投与された薬剤や組成物のほとんど（９割以上）は血液脳関門で阻止されて脳組織に到達しないため、脳内における生理活性の評価ができない。しかし、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、血液脳関門が緩やかであるために、末梢投与された薬剤や組成物が脳組織に到達しやすく、脳内における生理活性評価が容易になっている。前記血液脳関門が緩やかになっているとは、例えば、色素（例、エバンスブルー）や化学標識された物質（例、放射性同位体で標識された蛋白質）等を末梢投与することによって調べた場合に、それらの物質の濃度が脳組織中で１０％以上増加していればよい。また、末梢投与された薬剤や組成物の脳内における生理活性評価が容易になっていることは、例えば、通常血液脳関門で阻止される物質（例、ドーパミン、セロトニン等）を投与して、脳機能の変化（例、覚醒作用、抗うつ作用等）を調べることによって判断することができる。したがって、本発明において生理活性評価には、具体的には後述の実施例に記載の方法を用いることができる。
【００５１】
また、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、高感度に情動行動が評価できるものである。ここで、高感度に情動行動が評価できるとは、コンピュータによる画像解析を用いて動物の位置や移動速度を計測することにより、欝や不安行動を評価できることをいう。具体的には後述の実施例に記載の方法で評価することができる。
【００５２】
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、胚芽細胞と、生殖細胞あるいは体細胞とが、非ヒト哺乳動物又はこの動物の先祖に胚発生の段階（好ましくは、単細胞、又は受精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）においてＶＥＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡ配列を導入することによって作り出される。
【００５３】
以下、トランスジェニック非ヒト哺乳動物が、トランスジェニックマウスの場合を例に挙げて説明する。本発明者らは、マウス由来ＶＥＧＦ蛋白質の例として、野生型マウスの脳よりＶＥＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡ配列をクローニングし、発現ベクターを構築する。さらに、該当遺伝子を脳特異的に発現させるため、カルシウムカルモジュリンキナーゼ・タイプＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）遺伝子プロモーターと連結することで、該当遺伝子が脳特異的に発現するようにする。発現ベクターを構築した後、培養神経細胞へ遺伝子導入を行い、ＶＥＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡより、ＶＥＧＦ蛋白質が神経細胞にて発現することを確認する。さらに、発現ベクターを宿主マウスへ遺伝子導入を行い、該当遺伝子がトランスジェニックマウス内で発現していることをＰＣＲ法及び、インサイチュハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法により確認する。
【００５４】
なお、本発明において「神経新生」とは、幼弱な未分化細胞（例えば神経幹細胞等）から神経芽細胞を経て新しい神経（神経細胞）に分化させることをいい、神経細胞に分化する神経芽細胞や未分化細胞の増殖も含む。また、神経新生は、損傷した神経の再生や神経修復を含む。「神経」には神経中枢（例えば脳、脊髄等）及び末梢神経（例えば尺骨神経、橈骨神経、腓骨神経等）を含む。
【００５５】
また、本発明に用いられる発現ベクターは、宿主中で複製可能であれば特に限定されず、たとえばプラスミド、シャトルベクター、ヘルパープラスミドなどが挙げられる。
【００５６】
プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、酵母由来プラスミド（例えばＹＥｐ１３、ＹＣｐ５０等）などが挙げられる。ファージＤＮＡとしては、λファージ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。さらに、レトロウィルス又はワクシアニウィルスなどの動物ウィルス、バキュロウィルスなどの昆虫ウィルスベクターを用いることもできる。
【００５７】
本発明で用いられる形質転換体は、本発明の遺伝子を宿主中に導入することにより得ることができる。ここで宿主としては目的遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではないが、非ヒト哺乳動物が望ましい。
【００５８】
また、非ヒト哺乳動物としては、例えばマウス、ハムスター、ラット、モルモット、ウサギ等のげっ歯類の他、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ブタ、サル等を使用することができるが、作成、育成及び使用の簡便さなどの観点から見て、げっ歯類が好ましく、その中でもマウスが好ましい。
【実施例】
【００５９】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術が限定されるものではない。
【００６０】
実施例１：ＶＥＧＦトランスジェニックマウスの作製
本発明者らは、ＶＥＧＦを過剰に発現するトランスジェニックマウスを作製するために以下の手順を踏んだ。
【００６１】
本発明者らは、野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の脳からｔｏｔａｌＲＮＡを抽出し、それらを鋳型ＤＮＡとするためにＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ーポリメラーゼ連鎖反応）を行った。ＰＣＲ用のプライマーは、マウスＶＥＧＦ−Ａのエクソン１に存在する翻訳開始部位の上流配列（２１塩基対）、とエクソン８に存在する翻訳終止部位の下流配列（２１塩基対）に対応している。まず、マウス脳のｔｏｔａｌ ＲＮＡを、逆転写酵素（ＭＭＬＶ由来）とランダムプライマーを用いて、ｃＤＮＡに変換した。その後、これらのＤＮＡ産物を鋳型として、ＶＥＧＦ−Ａのプライマーを用いてＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を行った。この操作により、数本の長さの異なるＤＮＡ断片（４００−６００塩基対長）が増幅された。それぞれのＤＮＡ断片を、シリカ樹脂を用いて精製し、ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、ｐＣＲＩＩベクターにクローニングした。
【００６２】
ｐＣＲＩＩベクターにクローニングされたｃＤＮＡについて、その全塩基配列を明らかにし、ＶＥＧＦのｃＤＮＡ断片が得られていることを確認した。得られたＶＥＧＦｃＤＮＡの塩基配列は、Ｇｅｎｅｂａｎｋ〔（１）アクセション番号：ＢＣ０６１４６８、塩基番号（ＣＤＳ）：３９５．．９６７〕に登録されているマウスＶＥＧＦ−Ａの塩基配列（成熟体が１２０アミノ酸残基長のスプライスバリアントであるＶＥＧＦ１２０）と完全に一致していた。本研究では、ＶＥＧＦの情報伝達系を解析する目的でＶＥＧＦ１２０に焦点を当てる（ＶＥＧＦ１２０を発現させることにより、ＶＥＧＦ受容体１と２のみを活性化させる）。これらの操作によって得られたＶＥＧＦ１２０のベクターをｐＣＲＩＩ−ＶＥＧＦ１２０と名付けた。
【００６３】
続いて、発現ベクターへのクローニングを目的に、ｐＣＲＩＩ−ＶＥＧＦ１２０からＶＥＧＦ１２０のｃＤＮＡ断片を制限酵素処理によって切り出し、動物細胞用発現ベクターｐＮＮ２６５に組み込んだ。このベクターは、ＣＭＶプロモーターを保有していることから様々な動物細胞種で遺伝子発現を可能とする。また、このベクターはクローニング部位にエクソン―イントロン構造を持つことから、より自然な形で遺伝子発現を行うことができる。また、クローニング部位の下流領域にはＳＶ４０由来のポリＡシグナルが存在し、ｍＲＮＡの成熟化を助ける。この操作で得られた発現ベクターについて、制限酵素処理及びＤＮＡ塩基配列解析を行い、ＶＥＧＦ１２０のｃＤＮＡがｐＮＮ２６５に正しくクローニングされていることを確認した。この組換えベクターは、ｐＮＮ２６５−ＶＥＧＦ１２０と名付けた。
【００６４】
次に培養細胞におけるＶＥＧＦの発現を確認すべく、ＶＥＧＦ１２０の発現ベクターであるｐＮＮ２６５−ＶＥＧＦ１２０を、ヒト胎児腎臓由来の細胞株であるＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入した。遺伝子導入には、トランスフェクションと呼ばれる手法を用い、ベクターＤＮＡを効率的（通常１−５割程度）に細胞に付与する。ＤＮＡを付与された細胞では、発現ベクター上の遺伝子が活性化されて、その遺伝子産物が作られる。遺伝子導入２日後に細胞を回収して、タンパク質抽出液を得た。このタンパク質試料を用いて、ウエスタンブロットを行い、抗ＶＥＧＦ抗体を用いて、ＶＥＧＦを検出した。これにより、ＶＥＧＦ１２０は予想された分子量で発現され、また培養液中に分泌されることを確認した。この一連の操作によって、ＶＥＧＦ１２０の発現系が哺乳動物細胞において正常に作動することが確認された。
【００６５】
カルシウムカルモジュリンキナーゼ・タイプＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）遺伝子プロモーター作動性発現ベクターを構築するために、ＣＭＶプロモーター作動性のＶＥＧＦ１２０発現ベクター（ｐＮＮ２６５−ＶＥＧＦ１２０）から、ＶＥＧＦ１２０ ｃＤＮＡを有するエクソン−イントロン構造とポリＡシグナルを含む領域のＤＮＡ断片（「ＶＥＧＦ１２０エクソン−イントロンカセット」と呼ぶことにする）を制限酵素処理により得て、ＣａＭＫＩＩプロモーター作動性の発現ベクターｐＭＭ６０３に組み込んだ。これにより、ＶＥＧＦ１２０の発現がＣａＭＫＩＩプロモーターの制御下に置かれることになる。この操作で得られた組み換えＤＮＡについて、制限酵素処理及びＤＮＡ塩基配列解析を行い、ＶＥＧＦ１２０エクソン−イントロンカセットがｐＭＭ６０３に正しくクローニングされていることを確認した。この組換えベクターを、ｐＭＭ６０３−ＶＥＧＦ１２０と名付けた。
【００６６】
次に、神経細胞にてＶＥＧＦ１２０が産生されることを確かめるために、ｐＭＭ６０３−ＶＥＧＦ１２０を、ラット胎児から調製した初代海馬培養細胞に遺伝子導入を行った。この目的は、ＣａＭＫＩＩプロモーターの働きにより、神経細胞においてＶＥＧＦ１２０が産生されることを確かめるためである。遺伝子導入にはトランスフェクション用いるが、一般に神経細胞への導入効率は低く、通常１％程度である。遺伝子導入後２日目に、培養細胞を固定して、抗ＶＥＧＦ抗体を用いて免疫染色を行った。結果として、ｐＭＭ６０３−ＶＥＧＦ１２０が導入された神経細胞では期待通りＶＥＧＦ１２０の発現が確認され、ＣａＭＫＩＩプロモーターが作動しないアストロサイト（主要なグリア細胞）においてはＶＥＧＦ１２０の発現が見られないことがわかった。すなわち、ＣａＭＫＩＩプロモーターが神経細胞で特異的に作動すること、及びＶＥＧＦ１２０が神経細胞において正常に産生されることを確認した。
【００６７】
トランスジェニックマウスを作製するため、ＶＥＧＦ１２０発現カセットを調製した。ｐＭＭ６０３−ＶＥＧＦ１２０を制限酵素で処理することによって、ＣａＭＫＩＩプロモーター制御下のＶＥＧＦ１２０エクソン―イントロンカセット（「ＶＥＧＦ１２０発現カセット」と呼ぶ）のＤＮＡ断片を調製した。続いて、ＶＥＧＦ１２０発現カセットを受精卵に微量投入しトランスジェニックマウスの作製を行った。ＶＥＧＦ１２０発現カセットのＤＮＡ断片をマウス受精卵に微量注入する作業はＳＬＣ株式会社への委託によって行われた。作業としては、まずＤＢＦ１マウス（ＤＢＡ／２マウスとＣ５７ＢＬ／６マウスを交配させて得られる）から受精卵（３００細胞程）を得て、微量注入法によりＤＮＡ断片を受精卵の核の中に導入した。正常に２細胞へと分裂した胚（２２３胚）は、仮親の雌マウスに移植され、２０日後に産仔として得られた。
【００６８】
得られた産仔について尾からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法によって遺伝子改変がなされた動物を同定した。ＰＣＲにおいて、ＶＥＧＦ１２０発現カセットに特異的な配列をもつプライマーを用いると、遺伝子改変がなされた動物ではＤＮＡの増幅がみられるが、野生型であれば増幅はみられない。また、コントロールとしてマウスの内在性ＶＥＧＦ−Ａに対するプライマーを用いると、野生型マウスでも遺伝子改変マウスでも同様に増幅される。これらのプライマーを用いると、それぞれのＤＮＡ標本について、ＰＣＲによる反応が正しく行われたかどうかを確認すると同時に、遺伝子型を判定することができる。このようなＰＣＲを用いた手法でマウスの遺伝子型を判定し、離乳したマウスの３３匹中４匹がトランスジェニックマウス（ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウス、系統１から４）であることが判明した。このマウス世代をＦ０とする。
【００６９】
戻し交配を繰り返すことによって、産仔の遺伝的背景が交配に用いた動物の遺伝的背景に近づく。すなわち、野生型動物Ｃ５７ＢＬ／６を対照群として各種の実験を行う場合、遺伝子改変動物をＣ５７ＢＬ／６マウスの遺伝的背景に近づける必要がある。言い換えると、遺伝子改変がなされた領域以外の染色体ＤＮＡを全て、交配に使用する動物の染色体ＤＮＡに置換するということである。今回得られたトランスジェニックマウス（Ｆ０）は、既に５０％のＣ５７ＢＬ／６マウスの遺伝的背景を有していることから、最初の戻し交配で得られる産仔（Ｆ１）は、７５％のＣ５７ＢＬ／６マウスの遺伝的背景を有することになる。戻し交配を５回行うと（Ｆ５）、９８．４％がＣ５７ＢＬ／６マウスの遺伝的背景を有することになる。４系統（系統１から４）のＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスを、野生型マウスであるＣ５７ＢＬ／６マウスと交配させ、得られた産仔の遺伝子型をＰＣＲ法によって調べたところ、２系統について改変遺伝子がＦ１に受け継がれていることがわかった（他の２系統については、２細胞期以降に改変遺伝子が染色体ＤＮＡに挿入され、生殖細胞に受け継がれなかった可能性がある）。この２系統（ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの系統１と系統２とする）について、５回以上の戻し交配を行い、以下の実験に用いた。
【００７０】
実施例２：脳におけるＶＥＧＦの発現
本発明者らはＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの前脳におけるＶＥＧＦ ｍＲＮＡの発現を以下の手順で確認を行った
【００７１】
遺伝子が活性化するとｍＲＮＡが生成される。すなわち、ｍＲＮＡの発現形態を調べることによって、ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスにおいてＶＥＧＦが発現しているかどうかを確認することができる。組織におけるｍＲＮＡの発現を調べるために、ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎを行った。
【００７２】
ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの作製に使用したＣａＭＫＩＩのプロモーターは、前脳の神経細胞で特異的な活性を有する。そのため、脳組織を標本としてｍＲＮＡの解析をすることにした。脳標本は、ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの系統１と系統２のほか、野生型マウスと低酸素処理を行った野生型マウスを使用した。ＶＥＧＦ−Ａは、虚血や低酸素によって顕著に産生されることが知られており、これを内在性ＶＥＧＦ−Ａのポジティブコントロールとすることができる。脳標本は、マウスから脳を摘出後、すぐに包埋剤（ＯＣＴ ｃｏｍｐｏｕｎｄ， Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅｃｈ， ＵＳＡ）とともに−８０℃で凍結した。この凍結脳標本から、厚さ４０μｍの矢状切片（脳を縦切りにした切片）Ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎは、Ｓｃｈａｅｒｅｎ−Ｗｉｅｍｅｒｓ ａｎｄ Ｇｅｒｆｉｎ−Ｍｏｓｅｒ（１９９３）の方法に従った。ｍＲＮＡを検出するためのアンチセンスプローブは、ｐＣＲＩＩ−ＶＥＧＦ１２０を鋳型として、ジゴキシゲニン（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ）（ＤＩＧ）で化学標識された核酸類似体を基質に用い、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写法により合成した。このアンチセンスプローブは、塩基長が４００ｂｐ程度で、ＶＥＧＦ１２０ ｃＤＮＡの全領域を包含しており、検出できるＶＥＧＦ−Ａ ｍＲＮＡは、全ての内在性のＶＥＧＦ−Ａ（ＶＥＧＦ１２０， ＶＥＧＦ１４４， ＶＥＧＦ１６４， ＶＥＧＦ１８８， ＶＥＧＦ２０５を含む）及び、改変遺伝子由来のＶＥＧＦ１２０である。同様に、センスプローブをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写法により作製し、これは非特異的シグナルの程度を調べる目的で使用する。脳切片にアンチセンスプローブ（又はセンスプローブ）を含有したハイブリダイゼーション溶液を加えると、脳組織中のＶＥＧＦ−Ａ ｍＲＮＡとＤＩＧで標識されたアンチセンスプローブとの間で特異的に相補的な２本鎖の形成反応が起こり、アンチセンスプローブが組織中に安定的に保持される。次に、ＤＩＧで標識されたアンチセンスプローブを検出するために、アルカリ性フォスファターゼと架橋された抗ＤＩＧ抗体を加えて、ＤＩＧを特異的に反応させる。最後に、アルカリ性フォスファターゼの基質を脳切片上に加えることによって呈色反応が起こり、酵素濃度が高い部分がより強く紫色に着色する。すなわち、ＶＥＧＦ ｍＲＮＡがより多く産生されている領域において、強い紫色のシグナルが検出される。
【００７３】
６週齢のＴＧマウス系統１、ＴＧマウス系統２、ＷＴマウス、低酸素処理のＷＴマウスから脳組織を取り出し、厚さ４０μｍの矢状切片（正中線より１ｍｍ程外側）を作製した。これらの脳切片を、ＶＥＧＦ−Ａのアンチセンスプローブを用いて、ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎを行った。結果を図１に示す。図１の左の４つの写真は矢状切片の全体像であり、右の４つの写真は海馬領域を拡大したものである。図からわかるように、ＶＥＧＦ１２０ ｍＲＮＡは、ＷＴマウスでは染色が薄く基底レベルであるが、ＴＧマウス系統１（ＴＧ（Ｌ１））では発現量が高いことがわかる。ＴＧマウス系統１では、特に大脳皮質、線条体、海馬において顕著なＶＥＧＦ ｍＲＮＡの発現が見られ、これはプロモーターとして用いたＣａＭＫＩＩの発現パターンと一致している。一方、ＴＧマウス系統２（ＴＧ（Ｌ２））ではほぼＷＴマウスと同程度の染色であり、ＶＥＧＦの過剰発現が起きていないことを表している。低酸素処理を行ったＷＴマウスでは、ＶＥＧＦ ｍＲＮＡの発現が脳全体で高くなっていた。これは、虚血や低酸素によってＶＥＧＦの発現が増加するという報告と一致している。
海馬領域について検討しても同様な結果が導かれる。ＴＧマウス系統１（ＴＧ（Ｌ１））の海馬では、ＣＡ１−３領域の錐体細胞層及び歯状回の顆粒細胞層（海馬の錐体細胞及び顆粒細胞はともに興奮性の神経細胞である）において明瞭な染色がみられることから、ＴＧマウスの神経細胞では導入遺伝子であるＶＥＧＦ１２０が活性化していることを意味する。ＣａＭＫＩＩのプロモーターは神経細胞に特異的に発現することが知られており、この結果とうまく一致している。ＷＴマウスの海馬におけるＶＥＧＦの発現は、通常の環境下では基底状態であるが（神経細胞層に薄い染色がみられる）、動物を低酸素下に置くと、海馬の神経細胞でＶＥＧＦ ｍＲＮＡの発現量が著しく高くなっている。酸素が低い状態では、生体反応として、新たな血管形成を促すために、血管新生因子であるＶＥＧＦの産生が（酸素要求性の高い神経細胞は特に）増加するものと考えられる。
【００７４】
実施例３：ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの脳におけるＶＥＧＦタンパク質の発現
遺伝子が活性化するとｍＲＮＡが生成され、遺伝子産物としてのタンパク質に翻訳される。ここでは、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法を用いて、ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスにおけるＶＥＧＦの発現をタンパク質レベルから調べることを目的とした。
【００７５】
タンパク質の発現レベルを定量的に解析する方法として、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法を用いる。この方法は、まず、標本タンパク質を界面活性剤（ＳＤＳ）で処理することによって負に帯電させ、電場のかかった多孔質ゲル中を電気泳動させることにより、分子量に従って分離する。次に、ゲル中のタンパク質を膜（例、ＰＶＤＦ膜）に転写・固定させ、１次抗体（例、抗ＶＥＧＦウサギ抗体）と反応させる。最後に、酵素（例、過酸化酵素）と結合した２次抗体（例、過酸化酵素結合型−抗ウサギＩｇＧロバ抗体）と反応させて、酵素基質反応（例、化学発光）を行う。これにより、目的とするタンパク質が存在する部位が特異的に検出できるほか（見かけの分子量がわかる）、酵素抗体反応の強度が検出するタンパク質の存在量と比例することから、発現量を定量的に調べることができる。
タンパク質標本は、マウスの脳及び各脳領域から得る。これらをＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法を用いてＶＥＧＦを検出すれば、全体としてのＶＥＧＦ発現量の違い、及び各脳領域での発現量の違いを調べることができる。
【００７６】
６週齢のＷＴ及びＴＧマウス（系統１と２）を用いて、脳及び各脳領域からタンパク質標本を得た。結果を図２に示す。図２の左図は、系統１と系統２のＷＴ及びＴＧマウスの脳全体のＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔである（Ｌ１とＬ２：系統１と２のＴＧマウス、Ｃ１とＣ２：系統１と２のＷＴマウス）。ＶＥＧＦのシグナル（バンド）は、ＴＧマウス系統１から検出されたが、ＴＧマウス系統２とＷＴマウスについては検出できなかった（ＶＥＧＦの存在量が少ないためと考えられる）。検出されたバンドは３本あるが、上部の２つはそれぞれ、未成熟型（約２３ｋＤａ）、成熟型（約１９ｋＤａ）のＶＥＧＦであり、最も小さいバンド（約１６ｋＤａ）は分解産物もしくは非修飾型のＶＥＧＦであると思われる。一次構造から推定される成熟型ＶＥＧＦ１２０の分子量は１４ｋＤａであるが、翻訳後に糖鎖修飾を受けて分子量が大きくなることが知られている。図２の右図は、系統１のＴＧマウスについて各脳領域のタンパク標本をＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔで分析したものである（Ｔｏｔａｌ：脳全体、Ｏｂ：嗅球、Ｃｔ：大脳皮質、Ｈｐ：海馬、Ｓｔ：線条体、Ｔｈ：視床、Ｃｂ：小脳）。図からわかるように、大脳皮質、海馬、線条体で特にＶＥＧＦの発現が強く見られた。この結果は、ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎによるｍＲＮＡの発現分布と一致している。すなわち、タンパク質レベルでもＴＧマウスの前脳においてＶＥＧＦが過剰に産生されていることが判明した。
【００７７】
実施例４： ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの脳におけるＶＥＧＦタンパク質の経時的発現
ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの系統１についてＶＥＧＦ１２０の過剰発現が確認されたが、前述の実験は６週齢のマウスついて行ったものであった。そこで、週例の異なるマウスからタンパク質標本を調製し、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法を用いてＶＥＧＦ１２０の発現量を調べることにした。
【００７８】
６、１０、３０、５０週齢のＴＧマウス、及び６週齢のＷＴマウスの海馬を摘出し、タンパク質標本をＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔで分析した。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法の原理については、前述の通りである。この実験では、検出するタンパク質として、ＶＥＧＦのほか、ＶＥＧＦ受容体２（Ｆｌｋ−１）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、及び内部標準としてβ−チューブリン（β−Ｔｕｂｕｌｉｎ）の解析を行った。結果を図３に示す。図３に示すように、ＴＧマウスにおいてＶＥＧＦ１２０（ここでは成熟体のみを示している）は、６、１０、３０、５０週齢の全てにおいて発現が確認され、ほぼ一定であることがわかった。これは、用いたＣａＭＫＩＩのプロモーターの発現様式と一致しており、一生の間発現が継続することを示唆している。また、ＶＥＧＦの受容体であるＦｌｋ−１についても同様な結果が得られ、発現のレベルはほぼ一定であることがわかった。リガンドが多量に存在すると、その受容体の発現量が低下する現象（受容体のダウンレギュレーション）が見られることがある。しかし、ＶＥＧＦの過剰発現（生後２、３週齢より始る）にもかかわらず、Ｆｌｋ−１の発現は一定であることから、ダウンレギュレーションによってＶＥＧＦシグナル伝達系の不活性化は起っていないと考えられる。ＶＥＧＦ以外の成長因子としてＢＤＮＦを検出したところ、この因子は週例とともに徐々に発現量が減少する傾向にあることがわかった。内部標準として用いているβ−Ｔｕｂｕｌｉｎは主要な細胞骨格タンパク質であり、どの細胞、どの時期においてもほぼ一定に産生されている。この結果からもわかるように、ほかのタンパク質の変化にも関わらず、一定量の発現が見られている。
【００７９】
実施例５：ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの海馬神経細胞におけるＶＥＧＦ１２０の発現
本実験は、神経細胞においてＶＥＧＦ１２０タンパク質が過剰に発現されているかどうかを調べるために行う。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法では、組織をすり潰して得られる試料を分析するため、異なる細胞種における発現様式が解析できない。そのため、免疫組織化学染色法を用いて、細胞レベルでの解析をおこなう。
【００８０】
免疫組織化学染色法は、組織の切片に抗体を反応させることによって、目的とするタンパク質を特異的に検出する方法である。ここでは蛍光抗体法による免疫化学染色を行う。これはまず、組織の切片を調製してそれを１次抗体（例、抗ＶＥＧＦウサギ抗体）と反応させて、次に、１次抗体に対して蛍光標識された２次抗体（例、Ｃｙ５標識‐抗ウサギＩｇＧロバ抗体）とを反応させる。この操作で、目的とするタンパク質が存在している部分が特異的に蛍光染色される。切片を蛍光顕微鏡下で観察し、どの細胞でタンパク質が発現しているかを調べる。
【００８１】
６週齢のＷＴ及びＴＧマウスから脳組織を摘出し、４０μｍ厚の冠状切片を作製した。結果を図４に示す。図４は、海馬を含む脳切片について蛍光抗体法によるＶＥＧＦの免疫化学染色を行い、海馬の歯状回（ＤＧ、左側の２枚の写真）とＣＡ１領域（ＣＡ１、右側の２枚の写真）について観察したものである（スケール：１００μｍ）。サイト１３グリーン（Ｓｙｔｏ１３ ｇｒｅｅｎ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社）による核染色も同時に行った。ＶＥＧＦを赤色、細胞核を緑色で示した。ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスにおいて、海馬歯状回の顆粒細胞と海馬ＣＡ１領域の錐体細胞の両神経細胞において蛍光が検出されたことから、神経細胞でＶＥＧＦ１２０が発現していることが分かる。
【００８２】
実施例６： ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスにおける脳の比較
本発明者らは実験を通して、ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの脳はＷＴマウスと比較するとやや大きい印象を得ていた。そのため、両マウスの脳を比較することにした。
【００８３】
ＷＴ及びＴＧマウスの脳を取り出して、形態及びその重量を比較する。また、体重を測定することによって、体重に対する脳重量の比を算出することができる。
【００８４】
６週齢のＷＴ及びＴＧマウスから脳組織を摘出し、それを並べて比較した。結果を図５に示す図５に示すように、ＷＴマウスに比べると、ＴＧマウスの脳は大きく、特に前脳が肥大していることが分かる。また、ＴＧマウスの脳は赤味を帯びており、脳表面の血管（図では前大脳動脈や中大脳脳動脈が明瞭に観察される）。これは、ＶＥＧＦによる細胞増殖と血管新生の促進による影響であることが考えられる。
【００８５】
次に、１５週齢の雄マウスについて、脳重量と体重について比較した。結果を図６に示す。図６に示すように、ＷＴマウスに比べてＴＧマウスは約２割も脳重量が増加していることが判明した（ＷＴマウス：４６４．３±４．２ｍｇ、ＴＧマウス：５７０．９±１２．２ｍｇ；対応のないスチューデントｔ−検定（ｕｎｐａｉｒｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）による検定でＰ＜０．０１）。一方、体重においてはＴＧマウスが１割ほど軽いことがわかった（ＷＴマウス：３３．２±０．８ｇ、ＴＧマウス：２９．７±１．１ｇ；ｕｎｐａｉｒｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔによる検定でＰ＜０．０１）。結果として、体重に対する脳重量の比でみるとＴＧマウスで３７％の増加となっていた（ＷＴマウス：１．４３±０．０２％、ＴＧマウス：１．９５±０．０８％；ｕｎｐａｉｒｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔによる検定でＰ＜０．０１）。この結果により、ＴＧマウスの脳は有意に大きくなっていることがわかった。
【００８６】
実施例７： ＶＥＧＦ１２０−ＴＧ マウスの脳における細胞数の変化
ＷＴマウスにくらべてＴＧマウスの脳は有意に大きくなっていることから、脳組織中の細胞増殖が促進されていることが考えられた。そのため、細胞増殖の程度を定量的に解析することにした。
【００８７】
ＷＴ及びＴＧマウスの脳から切片を作製し、これを核染色及び神経細胞の免疫組織染色を行う。核はそれぞれの細胞に存在することから、核染色によって細胞数を調べることができる。また、神経細胞に特異的なタンパク質であるＮｅｕＮの発現を指標として個々の神経細胞を同定し、脳組織中の神経細胞数を調べることができる。この実験によって、細胞数及び神経細胞数に差があるかどうか定量的に比較することができる。
【００８８】
６週齢のＷＴ及びＴＧマウスより脳を摘出し冠状切片を作製した。大脳皮質及び線条体を含む切片について、ｓｙｔｏ１３ ｇｒｅｅｎによる核染色（緑色）及びＮｅｕＮ（青色）に対する免疫組織染色を行い、図７に示すような結果を得た。ＴＧマウスでは明らかに細胞核の密度が高くなっていることがわかる（スケール：２００μｍ）。次に、これらの画像をもとに、単位体積あたりの細胞数及び神経細胞数を定量的に調べたのが図８である。細胞密度についてみてみると、大脳皮質と線条体においてともにＴＧマウスが３割程増加していることがわかった（遺伝子型による効果：Ｆ１，２８＝７２．６０，Ｐ＜０．０００１、相互作用による効果は有意差なし； ｔｗｏ−ｗａｙ ｆａｃｔｏｒｉａｌ ＡＮＯＶＡ（２方向性要因分散分析）による検定）。次に、神経細胞密度についてみると、大脳皮質及び線条体ともにＷＴ及びＴＧマウスの間で変化がみられないことがわかった（遺伝子型による効果：Ｆ１，２８＝０．１８，Ｐ＝０．６７、相互作用による効果は有意差なし；ｔｗｏ−ｗａｙ ｆａｃｔｏｒｉａｌ ＡＮＯＶＡによる検定）。しかし、ＴＧマウスでは脳の体積が大きくなっていることを考慮すると、神経細胞数は総和として増加している可能性がある。これらの結果より、ＴＧマウスの脳においては細胞増殖が有意に増加していることが明らかになった。
【００８９】
実施例８： ＶＥＧＦ１２０−ＴＧ マウスの脳における細胞増殖の程度
ＴＧマウスの脳では細胞密度が高くなっていることから、細胞分裂の速度が増加していることが示唆される。これを定量的に解析するために、分裂細胞を特異的に標識してその数を測定することにした。
【００９０】
分裂細胞ではＤＮＡの複製が盛んに起こっていることから、化学標識された核酸を動物に投与することによって、ｉｎ ｖｉｖｏで体内のすべての分裂細胞を標識することができる。核酸類似物質としては、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（５−ｂｒｏｍｏ−２’−ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ）（ＢｒｄＵ）を用い、ＤＮＡ合成時にチミジンと間違って取り込まれることによって、分裂細胞の染色体ＤＮＡが特異的に標識される。ＢｒｄＵを体重当たり１００ｍｇ／ｋｇ、投与量を１０ｍｇ／ｍｌとして腹腔内投与し、２時間後に動物を４％パラホルムアルデヒド溶液を用いて灌流固定する。この操作によって、２時間の間で分裂していた細胞が ｉｎ ｖｉｖｏ標識されることになる。ＢｒｄＵで特異的に標識された細胞は、抗ＢｒｄＵ抗体を用いた免疫組織染色によって検出することができる。蛍光画像を解析し、単位面積あたりのＢｒｄＵ陽性細胞の数を測定し、切片の厚さを考慮することによって、単位体積あたりの分裂細胞数を調べることができる。この数を比較することで、細胞分裂の程度を定量的に比較することが可能となる。
【００９１】
６週齢のＷＴ及びＴＧマウス、それぞれ３匹を実験に使用した。動物にＢｒｄＵを腹腔投与して、分裂細胞を２時間標識した。灌流固定後、マウスの脳より４０μｍ厚の冠状切片を調製し、免疫組織染色によりＢｒｄＵで標識された分裂細胞を検出した。図９に結果を示す（スケール：２ｍｍ）。図９では、大脳皮質と線条体を含む領域を観察した図を示している。上の２枚の写真は位相差顕微鏡による画像を、下の２枚の写真はＢｒｄＵの蛍光画像を示し、ＷＴ及びＴＧマウスの脳切片を、それぞれ左側と右側に配置している。分裂細胞は、ＷＴマウス及びＴＧマウスにおいて、同様な分布を示し、特に側脳室の上衣、外套、で多く観察された。しかし、分裂細胞の数はＴＧマウスにおいて増加していることが確認され、大脳皮質や線条体では分裂細胞の数は比較的に少ないが、ＴＧマウスにおいてはその部分においても増加していた。それを定量的に測定した結果を図１０に示す。大脳皮質及び線条体における分裂細胞数はＴＧマウスにおいて３〜５倍増加していた（大脳皮質−ＷＴマウス：１０９±１６ｃｅｌｌｓ／ｍｍ3、ＴＧマウス：４２０±１５ｃｅｌｌｓ／ｍｍ3；線条体−ＷＴマウス：６５±７ｃｅｌｌｓ／ｍｍ3、ＴＧマウス：３６８±１６ｃｅｌｌｓ／ｍｍ3；遺伝子型による効果：Ｆ１，８＝２１５．３２，Ｐ＜０．０００１、相互作用による効果は有意差なし； ｔｗｏ−ｗａｙ ｆａｃｔｏｒｉａｌ ＡＮＯＶＡによる検定）。
【００９２】
実施例９： ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスにおける海馬の肥大
前項で大脳皮質と線条体における解析を行ったが、次に海馬について比較することにした。
【００９３】
ＷＴ及びＴＧマウスから海馬を取り出し、吻側から尾側へ２５０μｍ毎に５０μｍ厚の切片を得る。これを、ｓｙｔｏ１３ ｇｒｅｅｎにより核染色し、海馬の神経細胞層を可視化する。まず、海馬及び歯状回の顆粒細胞層の断面積を測定し、次に各切片から得られた面積から体積を得る。算出された海馬の体積、及び歯状回の体積から、ＶＥＧＦが海馬の細胞増殖にたいする効果を比較する。
【００９４】
６週齢のＷＴ及びＴＧマウスをそれぞれ４匹を実験に使用した。マウス脳より海馬を取り出し、吻側から尾側へ向かって２５０μｍ毎に５０μｍ厚の切片を得る。これらの切片をｓｙｔｏ１３ｇｒｅｅｎにより核染色し、写真を撮った。結果を図１１に示す。図１１においてその一例である（ＷＴマウスは左図、ＴＧマウスは右図に示す、スケールは１ｍｍ）。各切片について、海馬（海馬台と海馬采を除く）及び顆粒細胞層について断面積を求めた結果を図１２に示す。ＴＧマウスの海馬及び顆粒細胞層についてＷＴマウスのものよりも大きくなっていることがわかる。このデータをもとに、体積を求めた結果を図１３に示す。ＷＴマウスと比べてＴＧマウスの海馬は有意に大きくなっていることがわかる（ＷＴマウス：０．４６０±０．０１５ｍｍ3、ＴＧマウス：０．７２１±０．０２６ｍｍ3；ｕｎｐａｉｒｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔによる検定でＰ＜０．００１）。同様に、歯状回の顆粒細胞層も有意に大きくなっていることがわかった（ＷＴマウス：１２．５２６±０．２３３ｍｍ3、ＴＧマウス：１５．４９１±０．２８４ｍｍ3；ｕｎｐａｉｒｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔによる検定でｐ＜０．００１）。
【００９５】
実施例１０：ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスにおける神経新生
ＴＧマウスの海馬が大きいことから、細胞新生が盛んになっていることが予想された。海馬は神経細胞が特に盛んな領域であり、顆粒細胞層（海馬歯状回の神経細胞層）の拡大は神経新生の増大によるものと考えることができる。そこで、ＢｒｄＵ標識によって分裂細胞を特異的に検出し、その細胞密度を定量的に比較することにした。
【００９６】
前述の通り、核酸類似体であるＢｒｄＵを動物に投与して、分裂細胞を特異的に標識する。海馬領域について２００μｍおきに厚さ４０μｍの冠状切片を作製し、抗ＢｒｄＵ抗体を用いて免疫組織染色を行う。ＢｒｄＵ陽性細胞である分裂細胞は蛍光により同定する。同時にｓｙｔｏ１３ｇｒｅｅｎを用いて細胞核を染色し、海馬歯状回の顆粒細胞層を可視化する。神経前駆細胞は顆粒細胞下層（ｓｕｂｇｒａｎｕｌａｒ ｚｏｎｅ， ＳＧＺ）に多く存在することから、ほとんどのＢｒｄＵ陽性細胞はこの領域で見いだされる。そのため、顆粒細胞下層に沿ってＢｒｄＵ陽性細胞数を計測することによって、分裂細胞の密度を求めることができる。分裂細胞の密度としては、顆粒細胞下層の単位長さあたりのＢｒｄＵ陽性細胞の数とし（細胞数／ｍｍ ＳＧＺ）、これは同一個体の海馬のどの部分においてもほぼ一定であること知られている。
【００９７】
６週齢のＷＴ及びＴＧマウスをそれぞれ１０匹実験に使用した。マウスの海馬を含む領域２００μｍおきに冠状切片を得て（領域：海馬の吻側末端から１２００μｍの位置に始まって１８００μｍの位置まで）、１個体あたり約４−６片を実験に用いた。抗ＢｒｄＵ抗体による免疫組織染色とｓｙｔｏ１３ ｇｒｅｅｎによる核染色を施し、各切片の左右の海馬歯状回について写真を撮った（合計８−１２枚の画像）。図１４に結果を示す。図１４では、ＷＴ及びＴＧマウスの歯状回におけるＢｒｄＵ陽性細胞の免疫染色画像（白黒）を示しており、各画像の右上に挿入された図は、同一領域の核染色画像（緑色）である（スケール：２００μｍ）。緑色で示された顆粒細胞層より下の細胞層が顆粒細胞下層（ＳＧＺ）であり、神経前駆細胞が豊富に存在している部分である。ＷＴ及びＴＧマウスともに、ＢｒｄＵ陽性細胞の多くが顆粒細胞下層に存在していることがわかる。予想通り、ＴＧマウスでより多くの増殖細胞がみられることが分かる。これらの画像をもとに、各個体からＢｒｄＵ陽性細胞の密度（ＢｒｄＵ陽性細胞数／ｍｍ ＳＧＺ）の平均を求めた結果を図１５に示す。この解析によって、ＴＧマウスはＷＴマウスに比べて、海馬歯状回の顆粒細胞下層における分裂細胞の密度が約２倍になっていることが判明した（ＷＴマウス： ４．９８±０．５８ｃｅｌｌｓ／ｍｍ ＳＧＺ、ＴＧマウス：１０．４７±１．６３ｃｅｌｌｓ／ｍｍ ＳＧＺ；Ｗｅｌｃｈ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔによる検定でＰ＜０．０１）。このことから、ＶＥＧＦは海馬において細胞増殖を有意に促進していることが明らかとなった。また、顆粒細胞下層における分裂細胞のほとんどは神経前駆細胞であると考えられることから、神経新生が盛んになっていると考えられる（神経新生については、後述の実施例で証明している）。
【００９８】
実施例１１：ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの海馬における細胞新生の程度
ＶＥＧＦは海馬における神経新生を著しく増加させることを示したが、別の刺激を与えることによってさらに細胞新生が促進されるかどうかを調べることにした。これは、ＶＥＧＦによって細胞新生が飽和レベルまで活性化されているかどうかを調べるためである。
【００９９】
海馬歯状回における分裂細胞の測定は前述の実施例に従う。ここでは、海馬での神経新生を効果的に促進する刺激として随意運動を用いることとし、げっ歯類においては廻し車を飼育箱に設置することによって随意的に運動をさせることができる。ＷＴ及びＴＧマウスをそれぞれ２群に分けて、廻し車（直径１６ｃｍ、奥行き８．５ｃｍ）を設置したものとそうでない飼育箱（幅２５ｃｍ、高さ３５ｃｍ、奥行き４０ｃｍ）に入れて３週間飼育する。廻し車の回転は、赤外線センサーが付属したデジタルカウンターで自動計測する。回転数と廻し車の円周（約５０ｃｍ）より、走行距離を算出することができる。マウスは飼育箱に入れられたあと、徐々に廻し車で運動するようになり、３週間後の時点では、１匹について１日あたり約２ｋｍ走るようになる。その後、核酸類似体であるＢｒｄＵをマウスに投与することによって分裂細胞を標識し、海馬歯状回におけるＢｒｄＵ陽性細胞の密度を測定する。
【０１００】
６週齢のＷＴ及びＴＧマウスをそれぞれ対照群と運動群の２群に分けて実験を行った。用いた動物数は、ＷＴマウスの対照群と運動群でそれぞれ６、７匹、ＴＧマウスの対照群と運動群でそれぞれ６、５匹である。３週間廻し車で随意運動したものとそうでないマウスに対し、ともにＢｒｄＵを投与し分裂細胞を標識した。灌流固定後、マウスから脳を取り出し、これより海馬を含む領域について冠状切片を作成した（前述の通り）。これらを、抗ＢｒｄＵ抗体を用いた免疫組織染色とｓｙｔｏ１３ ｇｒｅｅｎによる核染色を行い、顆粒細胞下層におけるＢｒｄＵ陽性細胞の密度を測定した。図１６にその結果を示す。まずＷＴマウスについてみてみると、運動群は対照群とくらべて分裂細胞の密度が約４０％も上昇していることがわかった（ＷＴマウス対照群：４．４３±０．５７ｃｅｌｌｓ／ｍｍＳＧＺ、ＷＴマウス運動群：６．３５±０．２９ｃｅｌｌｓ／ｍｍＳＧＺ；ｕｎｐａｉｒｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ による検定でＰ＜０．０１）。しかし、ＴＧマウスついてみると、随意運動による促進効果はみられないことがわかった（ＴＧマウス対照群：１１．２０±２．６７ｃｅｌｌｓ／ｍｍ ＳＧＺ、ＴＧマウス運動群：１１．９３±１．６５ｃｅｌｌｓ／ｍｍ ＳＧＺ；ｕｎｐａｉｒｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔによる検定でＰ＝０．８３）。また、分裂細胞の密度は、ＷＴマウスと比べてＴＧマウスのほうが高くなっている（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ ｔｅｓｔによる検定でＰ＜０．０１）。この結果から、ＴＧマウスの歯状回における細胞分裂はほぼ飽和レベルに達していると思われ、ＶＥＧＦ１２０が十分に細胞新生を促進していることが考えられる。
【０１０１】
実施例１２： ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの海馬歯状回における神経前駆細胞の観察
ＴＧマウスの海馬歯状回において細胞新生が促進されていることが明らかとなった。それらの分裂細胞は神経前駆細胞である可能性が高い。そのため、実際にそうであるのか検証するために、神経前駆細胞の検出をおこなった。
【０１０２】
中枢神経系における神経前駆細胞は、ネスチン（Ｎｅｓｔｉｎ）とよばれる中間系繊維タンパク質を発現している。すなわち、このタンパク質を指標とすることによって、免疫組織染色法を用いて神経前駆細胞の分布を調べることができ、またＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法を用いるとＮｅｓｔｉｎタンパク質の発現量を比較することができる。実験では、ＷＴ及びＴＧマウスの海馬より得たタンパク質標本を用いて比較を行った。
【０１０３】
６週齢のＷＴ及びＴＧマウスから、海馬領域を含む冠状切片を作製した。抗Ｎｅｓｔｉｎ抗体（ウサギ由来モノクローナル抗体、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社）を用いて免疫組織染色を行った。ここでは、ＢｒｄＵに対する免疫組織染色（赤色）及びｓｙｔｏ１３ ｇｒｅｅｎによる核染色（緑色）を同時に行っている。図１７に示すように、ＴＧマウスはＷＴマウスに比べて、Ｎｅｓｔｉｎの免疫染色（青色）が強い（スケール：２００μｍ）。ＷＴマウスについてみると、Ｎｅｓｔｉｎ陽である神経前駆細胞は、海馬歯状回の顆粒細胞下層に沿って存在していることがわかる。それに対して、ＴＧマウスにおいては、Ｎｅｓｔｉｎ陽性細胞が歯状回の顆粒細胞下層のみならず、顆粒細胞層に挟まれた海馬門部（多形細胞層）にも多数散在していることがわかった。次に、海馬より得たタンパク質試料をＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法で解析することによって、Ｎｅｓｔｉｎタンパク質の発現量を比較することにした。ＷＴ及びＴＧマウスそれぞれ２匹を実験に用いた。図１８に示すように、Ｎｅｓｔｉｎタンパク質（〜１４０ｋＤａ）はＴＧマウスにおいて顕著に発現していることが確認された（分子量マーカー：上から１０３，７７，５０，３４ｋＤａ）。内部標準として用いたβ−Ｔｕｂｕｌｉｎ（〜５１ｋＤａ）の量は、それぞれについてほぼ同程度であり、等量のタンパク質が分析されていることがわかる。すなわち、ＴＧマウスでは明らかにＮｅｓｔｉｎの発現レベルが高くなっており、神経前駆細胞の数が増加しているものと考えられる。
【０１０４】
実施例１３：ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの海馬歯状回における未熟神経細胞の増加
ＴＧマウスの脳では神経前駆細胞の数が有意に増加していたことから、神経細胞の新生が盛んになっていることが考えられる。これを検証するために、未熟神経細胞を免疫組織染色により同定し、神経新生の程度を調べることにした。
【０１０５】
ダブルコルチン（Ｄｏｕｂｌｅｃｏｒｔｉｎ）（Ｄｃｘ）は、中枢神経系の未熟神経細胞で特異的に発現する構造タンパク質である。抗Ｄｃｘ抗体を用いて免疫組織染色を行えば、未熟な神経細胞の組織における分布や細胞構造を調べることができる。ＷＴマウスとＴＧマウスの未熟神経細胞を比較することにより、神経新生の様子を観察することができる。
【０１０６】
６週齢のＷＴ及びＴＧマウスをＢｒｄＵで標識し、１０週齢の時点で動物を灌流固定した。海馬領域を含む冠状切片を作製し、抗Ｄｃｘ抗体（ウサギ由来クローナル抗体、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社）と抗ＮｅｕＮ抗体による免疫染色組織染色、およびｓｙｔｏ１３ｇｒｅｅｎによる核染色を行った。また同時に、ＢｒｄＵに対する免疫組織染色（赤色）を行っている。図１９に海馬歯状回の蛍光染色画像を示している（スケール：５０μｍ）。左側の２枚はＷＴマウス、右側の２枚にはＴＧマウスの画像を示している。Ｄｃｘ免疫染色（緑色）のみの免疫染色画像とＮｅｕＮ（青色）とＢｒｄＵ（赤色）を重ね合わせた免疫染色画像を示している。
図１９から明らかなように、ＴＧマウスの脳ではより多くの未熟神経細胞が存在していることがわかる。ＷＴのＤｃｘ染色で分かるように、通常、未熟神経細胞は顆粒細胞層でもっとも内側にその細胞体が存在し、頂上樹状突起及び基底樹状突起を伸長している。ところが、ＴＧマウスでは、未熟細胞が顆粒細胞層のあらゆる場所に存在し、樹状突起の発達も著しいことがわかった。また、生まれてから４週間を経たＢｒｄＵ陽性細胞は、そのほとんどが神経細胞の指標タンパク質であるＮｅｕＮと共染色されていることから、神経細胞に分化していることが考えられる。Ｄｃｘの場合と同様に、より成熟化した若い神経細胞についても、通常そのほとんどが顆粒細胞の最内側に存在しているが、ＴＧマウスでは顆粒細胞層の中央もしくは外側まで分布していた。これは、ＴＧマウスにおいて新しく作られた神経細胞がより早く発達しているものと捉えることができる。これらの結果から、ＶＥＧＦは神経新生を促していることが証明され、神経細胞の成熟化にも正に作用している可能性がある。
【０１０７】
実施例１４： ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの海馬歯状回における新生細胞の分化
海馬歯状回でみられる分裂細胞のほとんどは神経前駆細胞であることが知られている。しかし、ＶＥＧＦが細胞の分化に変化を与えている可能性があるため、海馬歯状回における分裂細胞がどのような細胞に分化しているのかについて、調べることにした。
【０１０８】
分裂細胞はＢｒｄＵを投与することによってｉｎ ｖｉｖｏで標識することができる。したがって、細胞が分化するために十分な時間（４週間）を与えた後で、それらの細胞を観察することで調べることができる。本実験では、６週齢のマウスにＢｒｄＵを４回投与し（１日１回、４日間）、４週間後の１０週齢の時点で動物を固定する。得られた脳から海馬を含む領域について冠状切片を作製し（前述の通り）、ＢｒｄＵ及び各種細胞マーカーに対する免疫組織染色を行う。細胞特異的マーカーとしては、神経細胞に対してはＮｅｕＮ、アストロサイトに対してはグリア細胞繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）を用いる。すなわち、切片をＢｒｄＵ、ＮｅｕＮ、ＧＦＡＰについて３重染色する。海馬歯状回の顆粒細胞層を観察して、ＢｒｄＵに陽性である細胞について、それらがＮｅｕＮもしくはＧＦＡＰと共染色されているか、又はＮｅｕＮやＧＦＡＰともに陰性であるかどうかを調べる。この操作よって、生まれてから４週間を経た細胞が、神経細胞、アストロサイト、もしくはその他の細胞に分化していることを調べることができる。
【０１０９】
６週齢のＷＴ及びＴＧマウスをＢｒｄＵで標識し、１０週齢の時点で動物を灌流固定した。海馬を含む脳領域について冠状切片を作製し、免疫染色を行った。神経細胞及びアストロサイトを検出するために、抗Ｎｅｓｔｉｎ抗体（マウスモノクローナル抗体、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社）と抗ＧＦＡＰ抗体（ウサギポリクローナル抗体、Ｓｉｇｍａ社）を用いている。図２０は、ＢｒｄＵ（赤色）、ＮｅｕＮ（緑色）、ＧＦＡＰ（青色）について海馬歯状回領域の免疫組織染色画像である（スケール：５０μｍ）。ＷＴマウスにおいては、ＢｒｄＵ陽性細胞の多くはＮｅｕＮと共染色されていることから、神経細胞に分化していることがわかる。また、これらの若い神経細胞は、顆粒細胞層の最も内側に存在していることがわかる。ＴＧマウスでも多くのＢｒｄＵ陽性細胞が神経細胞に分化していることがわかるが、それらは顆粒細胞層の内側だけでなく中央部や外側にも分布していた。どのような細胞に分化したのかついて、定量的に調べたのが図２１である。海馬歯状回の顆粒細胞下層で生まれたほとんどの細胞は（約８０％）、顆粒細胞層で神経細胞（顆粒細胞）に分化しており、アストロサイトは１％程度であった（神経細胞−ＷＴマウス：８０．２±２．３％、ＴＧマウス：７６．５±２．９％； アストロサイト−ＷＴマウス：０．６±０．５％、ＴＧマウス：０．５±０．３％；その他の細胞種−ＷＴマウス：１９．２±２．１％、ＴＧマウス：２３．０±３．０％；スチール−ドワス検定（Ｓｔｅｅｌ−Ｄｗａｓｓ’ｓ ｔｅｓｔ）による検定で両遺伝子型で有意差なし）。このことから、ＶＥＧＦは神経前駆細胞由来の新生細胞の分化に影響を与えないことがわかった。また、図２２に示すように、顆粒細胞層におけるＢｒｄＵ陽性細胞の数を比較してみた。ＷＴ及びＴＧマウスをそれぞれ４匹について調べたところ、ＴＧマウスでは顆粒細胞層におけるＢｒｄＵ陽性細胞の数はほぼ２倍になっていた（ＷＴマウス：４．５８±０．２４ｃｅｌｌｓ／ｍｍ3、ＴＧマウス：９．７８±１．１７ｘ１０3ｃｅｌｌｓ／ｍｍ3；Ｗｅｌｃｈ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔによる分析でＰ＜０．００１）。これは、前述の６週齢のマウスの顆粒細胞下層において、分裂細胞の数がほぼ２倍になっていた事実と一致している。
【０１１０】
実施例１５： ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの脳における血管新生
ＶＥＧＦはもともと血管新生を促進する因子として見出された。そのためＶＥＧＦ１２０を前脳で発現するマウスでは、毛細血管の新生がどのようになっているかを調べる必要がある。そこで、ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの脳において血管構造を調べることにした。
【０１１１】
血管構造を可視化する方法として、レクチンによる染色法を用いた。Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ（トマト）のレクチンは、血管内皮細胞（血管の内皮を構成する細胞）の膜上に発現している糖鎖を特異的に認識する（Ｔｈｕｒｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。この性質を利用して、トマトレクチンを循環系に灌流したり、あるいは組織切片に作用させたりすることで血管構造を可視化することができる。実際的には、まず、ビオチン（ビタミンＢの一種）化されたトマトレクチンを作用させ、次に蛍光物質で化学標識されたアビジン（卵白由来糖タンパク質）を作用させる。アビジンとビオチンは非常に高い親和性を持つことから、上記の操作により、トマトレクチンが存在する部分が蛍光物質で特異的に染色されることになる。レクチンで染色された切片を蛍光顕微鏡で観察することによって、血管構造を可視化することができる。
【０１１２】
６週齢のＷＴ及びＴＧマウスから脳を取り出し、４０μｍ厚の冠状切片を作製した。解析に使用した脳領域は、大脳皮質、海馬、小脳である。脳切片をビオチン化されたトマトレクチンと反応させた。次に、Ｃｙ５標識アビジンと反応させ、図２３に示すような蛍光画像を得た（スケール：５００μｍ）。図から明らかなように、ＴＧマウスの海馬歯状回や大脳皮質では顕著な血管形成が観察されたが、小脳ではＷＴマウスと同程度であった。
次にこれを定量することにした。毛細血管の数の測定は困難であるため、単位面積当たりの蛍光強度について比較することにした。ＷＴ及びＴＧマウスを各群２−３匹用いて、ＷＴマウスの小脳におけるレクチン染色の蛍光強度を１として、比較を行った。図２４にその結果を示す。ＴＧマウスの海馬（歯状回とＣＡ１領域）と大脳皮質では血管新生が促進されていたが、小脳では変化がみられなかった（歯状回−ＷＴマウス：１．３１±０．０２、ＴＧマウス：２．５２±０．２２；ＣＡ１領域−ＷＴマウス：０．９３±０．１８、ＴＧマウス：１．４８±０．１９；大脳皮質−ＷＴマウス：１．１５±０．１６、ＴＧマウス：１．５４±０．１９；小脳−ＷＴマウス：１．００±０．０５、ＴＧマウス：０．８９±０．０５）。この結果は、ＴＧマウスの前脳において血管新生が促進されていることを示す。血管形成が前脳に限られた理由としては、ＶＥＧＦ１２０の発現に用いたＣａＭＫＩＩのプロモーターは、前脳に特異的であり、小脳ではほとんど働かないためである。
【０１１３】
実施例１６： ＶＥＧＦ１２０による血管径の拡張
レクチンを用いた血管構造の解析で、ＴＧマウスでは脳血管の数が増えているだけではなく、血管自体も大きくなっているような印象を得た。そこで、本実験では血管径について定量的に測定することにした。
【０１１４】
前述のようにトマトのレクチンを用いて血管構造を可視化する。測定する領域として、ＴＧマウスの脳で血管新生が特に盛んである海馬歯状回の門部（多形細胞層）を選択する。ＷＴ及びＴＧマウスの脳切片についてレクチン染色を行い、海馬歯状回の門部にある毛細血管を無作為に選ぶ。画像解析プログラムとしてＬＳＭイメージブラウザー（ＬＳＭ Ｉｍａｇｅ Ｂｒｏｗｓｅｒ）（Ｚｅｉｓｓ）を用い、個々の毛細血管の短径を測定する。ＷＴ及びＴＧマウスの脳血管の直径を比較することによって、ＶＥＧＦが血管の発達に関係しているかどうかを調べることができる。
【０１１５】
６週齢のＷＴ及びＴＧマウスをそれぞれ３匹実験に使用した。海馬を含む脳の冠状切片についてレクチン染色を行った。海馬歯状回の門部（顆粒細胞層に挟まれた領域）より蛍光画像を得て、無作為に合計２００本の毛細血管を抽出し、それぞれについて短径を測定した。図２５は、その結果をヒストグラム及び累計曲線で表したものである。海馬における毛細血管の直径は、ＷＴマウスに比べてＴＧマウスのほうが有意に大きくなっていることがわかる（ＷＴマウス：６．１±０．１μｍ、ＴＧマウス：１０．２±０．２μｍ；ｕｎｐａｉｒｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔによる検定でＰ＜０．０００１）。すなわち、ＶＥＧＦは、新たに血管を形成する作用に加えて、血管径を拡張させる作用も有していることがわかる。
【０１１６】
実施例１７：ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの脳における脳内浸潤実験
ＶＥＧＦは血管内皮細胞に直接的に作用することから、血液脳関門の浸透性に変化がみられる可能性があった。そのため、血液脳関門が血液中の物質を排除する程度について調べることにした。
【０１１７】
脳血液関門の浸透性について調べる方法として、水溶性色素を利用する方法がある。水溶性の青色色素であるエバンスブルー（Ｅｖａｎｓ ｂｌｕｅ）は、生体に無害であり、血液脳関門によって排除される。Ｅｖａｎｓ ｂｌｕｅ溶液をマウスの尾静脈から静脈投与すると、色素は循環系を通じて全身に行き渡る。血管中の色素はしだいに組織へと浸透し、脳を除くほとんどの組織は青色に着色する。一方、血液脳関門が存在する脳組織においては色素の浸透が少ない。すなわち、ＶＥＧＦがもし血液脳関門の浸透性を高める効果があるならば、色素により脳組織が着色することになる。ＷＴ及びＴＧマウスについて比較することで、ＶＥＧＦの血液脳関門に対する効果を知ることができる。
【０１１８】
６週齢のＷＴ及びＴＧマウスを実験に使用した。１％Ｅｖａｎｓ Ｂｌｕｅを０．９％生理食塩水に溶かしてフィルター濾過した溶液を、マウス尾静脈より２００μｌ静脈投与した。２４時間後、マウスを麻酔してＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）で灌流した。これは、血液中の色素を洗い流して、組織中に浸透した色素のみを観察するために行う（２４時間後、青色の色素の大半は血液中から失われており、血液は通常の赤色を呈している）。灌流後、開腹したマウスを腹側から見たものが図２６である。ここでは、色素を投与していないＷＴマウス（１番目）、色素を投与したＷＴマウス（２番目）、色素とともにセロトニン（５−ＨＴ；血液脳関門の弛緩を促す）を投与したＷＴマウス（３番目）、色素を投与したＴＧマウス（４番目）を示している。図から明らかなように、色素を投与していないマウスでは、内臓組織はやや赤い褐色を呈しているが、色素を投与した全てのマウスで、内臓組織は濃い青色を呈していることがわかる。これらのマウスより脳組織を取り出して、頭頂より見たものが図２７である。色素を投与していないＷＴマウスでは、灌流後、脳は白色を呈している。色素を投与したＷＴマウスの脳もほぼ白色であり、青色は非常に薄い。これを内臓組織と比べると染色の程度に顕著な違いがあることが分かり、脳組織への色素の浸透を阻害する血液脳関門の存在が明らかである。また、色素とともにセロトニンを投与したＷＴマウスについても、脳はほぼ白色である。しかし、色素のみと比べるとやや青みを帯びていることがわかる。一方、ＴＧマウスの脳は明瞭に青色を呈している。これは、ＶＥＧＦ１２０の発現によって血液脳関門が緩くなっていることを意味している。しかし、ＴＧマウスの脳における染色の程度は、内臓組織でみられた深い青と比べると明らかに薄いことから、血液脳関門の機能が完全に失われているのではないことが分かる。また、ＶＥＧＦ１２０は前脳で発現していることから、前脳にくらべて小脳の染色の度合いが低くなっていることがわかる。
【０１１９】
実施例１８：ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの抗不安様行動１
不安に対するＶＥＧＦの効果を調べるために、オープンフィールド試験を行った。
【０１２０】
オープンフィールド試験では、周囲を壁で囲まれた広く明るい平坦な空間（オープンフィールド）に動物を入れて、その行動を観察する。例えば、マウスなどの動物は、隠れるところがない広い場所や明るい場所を忌避して、周囲の壁に沿って移動する性質（接触走性）を示す。そのような性質は不安様行動として捉えることができる。しかし、不安感が低下した動物では、オープンフィールドの中央に滞在する時間が長くなる。そのため、中央部分に滞在した時間を比較することにより、不安様行動を定量化することができる。
【０１２１】
１０週齢の雄マウスを３０ｃｍの高さの壁で囲まれたオープンフィールド（５０ｃｍｘ５０ｃｍ）に入れて、その行動を１０分間観察した。ＷＴ及びＴＧマウスについてそれぞれ１９、１８匹を試験した。図２８に示すように、ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスはＷＴマウスに比べて中央領域に滞在した時間が有意に増加していた（ＷＴマウス：８６．６±６．７ｓｅｃ、ＴＧマウス：１２４．３±１５．９ｓｅｃ；Ｐ＜０．０５繰り返しのないＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔによる検定）。一方、試験時間（１０分間）に移動した距離は、双方とも変化は見られなかった（ＷＴマウス：３６７５±１５２ｃｍ、ＴＧマウス：３３０２±２４９ｃｍ、Ｐ＝０．３８繰り返しのないＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔによる検定）。すなわち、移動距離が同程度にもかかわらず、ＴＧマウスが中央領域により長い時間滞在していることが判明した。このことから、ＴＧマウスは不安感が減少していると考えられる。
【０１２２】
実施例１９： ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの抗不安様行動２
不安に対するＶＥＧＦの効果を調べるために、高架式十字迷路試験を行う。
【０１２３】
抗不安剤のスクリーニングなど不安様行動の指標として広く利用されている、高架十時迷路と呼ばれる装置を用いて測定した。高架式十字迷路では、床から高く持ち上げられた十字状のステージに実験動物を置いてその行動を観察する。ただし、十字状のステージの、対称的な位置にある２つのプラットフォームには壁が装備されて、動物が転落しないようなつくりになっており（安全なプラットフォーム：クローズドアームと呼ぶ）、残り２つの対照的な位置にあるプラットフォームには壁がなく、転落する危険性がある（危険なプラットフォーム：オープンアームと呼ぶ）。通常、げっ歯類をこのようなステージに置くと、ほとんどの時間をより安全なクローズドアームで過ごす。これは、高所における恐怖と開空間に対する忌避が同時に作用しているためと考えられる。不安感が低下した動物では、オープンアームに滞在している時間が長くなる傾向をしめす。従って、オープンアームでの滞在時間を測定することによって、不安感もしくは恐怖感の程度を定量的に比較することができる。
【０１２４】
３００ルクス（ｌｕｘ）の照明下、１０週齢雄マウスを高架式十字迷路（十字状の４本のアーム：一辺の長さ４５ｃｍ、幅５ｃｍ；クローズドアームは高さ１５ｃｍの壁で囲まれている）のプラットフォームの中央に置いて実験を開始し、その行動を１０分間観察した。ＷＴ及びＴＧマウスについてそれぞれ１８、１５匹を試験した。図２９に示すように、ＴＧマウスはＷＴマウスと比べてオープンアームに滞在した時間が有意に増加していた（ＷＴマウス：３．６３±１．２８％、ＴＧマウス：２４．２±４．９％、繰り返しのないＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔによる検定でＰ＜０．０５）。一方、試験時間（１０分間）に移動した距離は、両群に違いは見られなかった（ＷＴマウス：１５８３±８２ｃｍ、ＴＧマウス：１６７５±１０７ｃｍ、繰り返しのないＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔによる検定でＰ＝０．４９）。すなわち、移動距離が同程度にもかかわらず、ＴＧマウスがオープンアームにより長い時間滞在していたことになる。よって、前述のオープンフィールド試験の結果と同様に、ＴＧマウスは不安様行動が減少していることを示している。
【０１２５】
実施例２０：ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの抗うつ様行動
うつ様行動に対するＶＥＧＦの効果を調べるために、Ｐｏｒｓｏｌｔの強制水泳試験を行う。
【０１２６】
Ｐｏｒｓｏｌｔの強制水泳試験は、実験動物のうつ様行動を測定する試験であり、抗うつ剤の効果を評価するために広く用いられている方法である（Ｐｏｒｓｏｌｔ ｅｔ ａｌ．， １９７７）。試験では、水の入った容器に動物を入れ、その行動を観察する。ただし、装置は動物が逃げられないような仕組みになっているため、時間が経つと動物は逃避行動を止めてしまう。これは、動物が水面に浮いているが動いていない状態であり、あきらめの心理的背景が反映されているものと考えることができる。例えば、抗うつ剤を投与すると、動物はより長い時間逃避行動を示し、従って不動時間が短くなる。すなわち、不動時間を測定することによって、うつ様状態の程度を定量的に比較することができる。
【０１２７】
３０ｌｕｘの照明下、１０週齢の雄マウスを水の入った円筒状容器（直径１３ｃｍ、高さ３０ｃｍ；２５℃の水が円筒容器の半分の高さ１５ｃｍまで満たされている）に投入し、その行動を１０分間観察した。ＷＴ及びＴＧマウスについてそれぞれ１８、１５匹を試験した。図３０に示すように、ＴＧマウスはＷＴマウスに比べて不動時間（％表示）が有意に減少していた（ＷＴマウス：６３．４±２．０％、ＴＧマウス：４０．９±４．０％；ウェルチｔ−検定（Ｗｅｌｃｈ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）による検定でＰ＜０．０００１）。１分毎の不動時間についてみると、最初の１分間は両群とも同程度動いていたにもかかわらず、ＷＴマウスのほうがより早く逃避行動をあきらめている。この結果から、ＷＴマウスに比べてＴＧマウスのほうがうつに対して耐性が高いことを示している。
【０１２８】
実施例２１：ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスでみられる恐怖感の減少
恐怖感及び恐怖に関わる学習行動に対するＶＥＧＦの効果を調べるために、恐怖条件付け試験を行う。
【０１２９】
恐怖条件付けは、動物の恐怖感に基づいた学習を評価するために広く用いられている方法である。恐怖条件付けは、古典的条件づけの一種である。原理としては、まず、それ自体では特徴のない刺激（条件刺激：例えば、音）を与えた後で、無条件反応を誘発する刺激（無条件刺激；例えば、足に電気を流すと驚愕する）を提示すれば、動物は両刺激を関連付けるようになる（条件付け）。例えば、音がしばらく鳴った後で足に電気が流れるようにすれば、両者の関連付けによって、動物は音が鳴っただけで驚愕反応を示すようになる。古典的条件付けは、１）条件付け、及び２）条件刺激の提示による学習の評価、の２つの過程に分けられる。本実験においては、１日目に条件付けを行う。動物を実験箱の中に入れて、音刺激（条件刺激：広域の波長が混ざった雑音、ホワイトノイズ、６０ｄＢ）３０秒間提示し、最後の２秒間に足に電気ショック（無条件刺激：パルス電流、０．２ｍＡ）を与える。これを間隔をおいて数回繰り返すと、マウスの驚愕反応（不動反応）は次第に大きくなってゆく。驚愕反応は、不動時間（％）の増加によって定量的に評価することができる。２日目は文脈学習について評価する。動物を１日目と同じ実験箱に入れると、動物は実験箱の環境を記憶しているために（条件刺激に相当する）、電気ショック（無条件刺激）がない状態でも驚愕反応が誘発される。これは、周囲の環境と電気ショックとの関連付けによる学習である。３日目は手掛かり学習について評価する。動物を１日目の条件付けとは全く異なる環境に置いてその行動を観察する。ただし、１日目に用いた条件刺激（音刺激、ホワイトノイズ）を提示することによって、驚愕反応が誘発される。これは、音刺激と環境と電気ショックとの関連付けによる学習である。まとめると、１日目に条件付けを行って驚愕反応の程度を測定し、２日目と３日目に恐怖条件付けによる学習の程度について２種類の方法で評価する。
【０１３０】
１０週齢の雄マウスを用いて恐怖条件づけを行った。ここでは、ＷＴ及びＴＧマウスをそれぞれ１４、１０匹実験に使用した。その結果を図３１の１日目に示している。１日目の条件付けでは、実験時間の７分間に、条件刺激と無条件刺激の組み合わせを３回提示した（１．５、３．５、５．５ｍｉｎに音刺激を開始：１日目の図中に矢印で示す）。最初の１分間の不動時間は、両群ともにほぼ０％であったが、刺激を繰り返すたびに、ＷＴマウスとＴＧマウスともに驚愕反応（不動反応）の程度が徐々に大きくなった（最初と最後の１分間の比較−ＷＴマウス：０．０±０．０から７４．２±５．２％へ増加、ＴＧマウス：０．３±０．３から３８．１±９．７％へ増加）。しかし、ＴＧマウスはＷＴマウスに比べて驚愕反応の程度が有意に低いことが判明した（４−７番目の各１分間についてＰ＜０．０５、ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ（一方向性分散分析）後のターキー・クラマー検定（Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ’ｓ ｔｅｓｔ）による検定）。これは、ＴＧマウスにおいて、電気ショックに対する恐怖感が減少している可能性を示す。また、痛覚が低下している可能性も考えられたため、後述の熱痛覚の実験も合わせて実施した。その結果、痛覚が原因ではなく、恐怖感が低下していると判断を下した。図３１の２日目は、条件付けを行った時と同じ実験箱に動物を入れて、その行動を２分間観察したものである。ＷＴ及びＴＧマウスの両群とも文脈学習による驚愕反応を示したが、１日目と同様にＴＧマウスの不動時間はＷＴマウスに比べて少なかった（２日目の最初の１分間−ＷＴマウス：７１．０±３．３％、ＴＧマウス：４６．２±１０．１％）。しかし、１日目の最後の１分間と２日目の最初の１分間における不動時間を比べてみると、ＷＴマウス及びＴＧマウスのそれぞれについて差は見られなかった（ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ後のＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ’ｓｔｅｓｔによる検定でＰ＞０．０５）。これはすなわち、ＴＧマウスは文脈学習を遂行する能力があることを示しており、この学習に必要な扁桃体と海馬の機能が、正常に保持されていることを示している。図３１の３日目では、条件づけを行ったときとは全く異なる実験箱に動物を入れて、その行動を６分間観察したものである。ただし、３分目と４分目の２分間では、１日目の条件付けの際に用いた音刺激が提示された（３日目の図中に横棒で示す）。異なる環境に置かれるとマウスは比較的自由に動き回っていたが、音刺激が提示されると驚愕反応を示した（３日目の最初の１分間−ＷＴマウス：１１．５±３．５％、ＴＧマウス：１９．０±４．７％；３日目の３番目の１分間−ＷＴマウス：６０．９±６．９％、ＴＧマウス：５４．５±９．９％；両群ともにＰ＜０．０１、ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ後のＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ’ｓ ｔｅｓｔによる検定）。すなわち、両群ともに手がかり学習を遂行する能力があることを示しており、群間の比較でも有意差はみられなかった（遺伝子型による効果：Ｆ１，２２＝０．９１，Ｐ＝０．３５、時間ブロック間での効果：Ｆ５，１１０＝２４．８０，Ｐ＜０．０００１、相互作用による効果：Ｆ５，１１０＝１．１９，Ｐ＝０．３２、ｔｗｏ−ｗａｙ ｒｅｐｅａｔｅｄ ｍｅａｓｕｒｅ ＡＮＯＶＡ（２方向性反復測定分散分析）による検定）。これは、ＷＴ及びＴＧマウスともに、内側膝状体（聴覚に関わる視床領域）及び扁桃体の機能は正常であることを意味している。
以上の結果をまとめると、ＴＧマウスは恐怖感が低下しているものの、恐怖に関わる文脈学習及び手掛かり学習ともに正常であることがわかった。
【０１３１】
実施例２２：ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスでみられる恐怖感の減少−痛覚の確認実験
前述の恐怖条件付けの試験では、電気ショックに対する驚愕反応がＴＧマウスで低下していた。しかしこの結果は、１）恐怖感が低下している可能性と、２）痛覚が低下している可能性の、２つの解釈が可能であり、原因を特定するに至っていない。そこで、ホットプレートテストを行い、熱痛覚に対する動物の応答を定量的に調べることにした。
【０１３２】
ホットプレートテストは、熱に対する動物の応答を指標として痛覚の程度を評価するテストであり、痛覚試験として広く利用されている（Ｍｏｇｉｌ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。本実験では、温度が５５℃に保たれた金属表面に被験動物を置き、熱応答に要する時間を測定する。動物の熱応答としては、後肢を震わせたり後肢をなめたりする行動を熱痛覚の指標としている。すなわち、熱応答に要する時間が長いほど、痛覚が低下している評価する。
【０１３３】
図３２に示すように、３０週齢の雄マウスを用いてホットプレートテストを行った。ＷＴマウスとＴＧマウスそれぞれ２０、１４匹を試験に供した。温度が５５℃の金属表面にマウスを置き、熱痛覚にともなう後肢の応答に要した時間を測定したところ、ＴＧマウスがＷＴマウスにくらべて若干短いことが判明した（ＷＴマウス：１８．１±１．２１ｓｅｃ、ＴＧマウス：１０．７±１．７８ｓｅｃ； ｕｎｐａｉｒｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔによる検定でＰ＜０．０１）。この結果は、熱痛覚において、ＴＧマウスがＷＴマウスよりも熱痛覚への感受性がやや高いことを示すものである。すなわち、ＴＧマウスの痛覚はＷＴマウスに比べて鈍化しているとは言えない。つまり、恐怖条件付けにおいてＴＧマウスはＷＴマウスよりも驚愕反応が低下していたが、これはＴＧマウスの痛覚が低下しているためではなく、むしろ恐怖に対する応答（恐怖感）が減少していると解釈するのが妥当である。
【０１３４】
実施例２３：ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスにおける攻撃行動評価
攻撃行動におけるＶＥＧＦの効果を調べるために、レジデント−イントルーダー攻撃性アッセイを行った。
【０１３５】
レジデント−イントルーダー攻撃性アッセイはげっ歯類（通常はオス）が侵入者に対して自分の縄張りを守るために行使する攻撃行動を指標とした試験である。オスの被験動物を数週間程度単独で飼育し（レジデント）、その飼育箱に別の（イントルーダー）を投入すると、イントルーダーに対しレジデントは攻撃行動を示す。攻撃行動としては、咬みつく、引っ掻く、突進する、執拗に追い回す、などの行動が含まれ、それらの行動を攻撃行動の指標とする。定量的にはレジデントがイントルーダーに攻撃を開始するまでの時間、攻撃した回数、攻撃していた時間を測定する。攻撃性が高いほど、攻撃開始までの時間が短くなり、攻撃回数は増え、攻撃時間は長くなる。さらに、この実験を２−３日継続して繰り返すと、レジデントの攻撃性が一層高まる傾向にある。
【０１３６】
３０週齢の雄マウスを用いてレジデント−イントルーダー攻撃性アッセイを行った。本実験ではＷＴ及びＴＧマウスそれぞれ１５、１４匹を用いた。被験マウスであるレジデントを４週間単独飼育させ、その飼育箱にイントルーダーとしてグループ飼育されていた６週齢のＢＡＬＢ／ｃ雄マウスを１匹投入し、２０分間レジデントのイントルーダーに対する攻撃行動を観察した。この実験は３日間継続して行われ、図３３に示す結果を得た。レジデントが攻撃開始に要した時間はＴＧマウスと比較してＷＴマウスは有意に短く、ＴＧマウスでは試験時間（１２００ｓｅｃ）にまったく攻撃しないことが多かった。（１日目−ＷＴマウス：４９３±１２４ｓｅｃ、ＴＧマウス：１１０６±８８ｓｅｃ；２日目−ＷＴマウス：６９２±１２９ｓｅｃ、ＴＧマウス：１１２８±７２ｓｅｃ；３日目−ＷＴマウス：５７７±１４４ｓｅｃ、ＴＧマウス：１２００±０ｓｅｃ；１−３日目の全てにおいて、ＷＴマウスとＴＧマウスの有意差はＰ＜０．０５、マン・ホイットニーＵ検定（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ’ｓ Ｕ ｔｅｓｔ）による検定）。攻撃回数についてみても、ＴＧマウスのほうが有意に少なかった（１日目−ＷＴマウス：３．１±０．９回、ＴＧマウス：０．６±０．３回；２日目−ＷＴマウス：６．１±１．６回、ＴＧマウス：０．４±０．２回；３日目−ＷＴマウス：６．７±１．７回、ＴＧマウス：０．１±０．１回；１−３日目の全てにおいて、ＷＴマウスとＴＧマウスの有意差はＰ＜０．０５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ’ｓ Ｕ ｔｅｓｔによる検定）。さらに、攻撃時間についてみても同様な結果が得られ、ＴＧマウスのほうが有意に短いことが判明した（１日目−ＷＴマウス：９．０±４．４ｓｅｃ、ＴＧマウス：０．５±０．３ｓｅｃ；２日目−ＷＴマウス：１８．０±５．８ｓｅｃ、ＴＧマウス：０．２±０．１ｓｅｃ；３日目−ＷＴマウス：１６．１±５．４ｓｅｃ、ＴＧマウス：０．１±０．１ｓｅｃ；１−３日目の全てにおいて、ＷＴマウスとＴＧマウスの有意差はＰ＜０．０５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ’ｓ Ｕ ｔｅｓｔによる検定）。この結果から、ＴＧマウスはＷＴマウスに比べて攻撃性が非常に低下していることがわかった。すなわち、ＶＥＧＦには、高等動物の攻撃行動を抑える作用があることが分かった。
【０１３７】
実施例２４： ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスにおける基礎行動量の測定
これまでの結果から、ＶＥＧＦは不安、うつ、攻撃性、恐怖を含む情動に有意な変化をもたらすことが分かった。しかし、ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスにおいては、ＶＥＧＦが前脳で発現されたことで、前脳の機能に依存した行動が全て非特異的に変化してしまっている可能性も考えられた。もし、ＶＥＧＦが非特異的に動物の行動に変化を与えているとすれば、ＶＥＧＦが特定の神経活動を制御しているというよりは、（細胞増殖や血管形成の促進等の効果で）間接的に脳の本来の機能に影響が出ている可能性がある。そのため、情動以外の動物行動を測定しておく必要がある。
なお、恐怖条件づけにおいては、少なくとも（海馬や扁桃体が関わる）文脈学習や（視床の内側膝状体や扁桃体が関わる）手がかり学習が正常であることを示している。しかし、各種の動物行動を調べることによって、ＶＥＧＦによる影響の範囲を見極める必要がある。
【０１３８】
被験動物の飼育箱に赤外線センサーを設置し、動物がセンサーを横切る回数を昼夜数日間に渡って連続観察し、自然な状態における活動量の変化を調べる。
【０１３９】
１０週齢の雄マウスを用いて、飼育箱における基礎活動量を３日間（昼夜）にわたって測定した。ＷＴマウスとＴＧマウスのそれぞれ９匹を試験に供した。飼育箱を横切る形で赤外線を照射し、動物がそれを横切るとカウントされる仕組みになっている。センサーを横切った回数を３０分毎に集計し、これを図３４の折れ線グラフで表した。ＷＴマウス（灰色の線）とＴＧマウス（黒線）はともに、夜間（２０：００−８：００、影で示す）に活動し、昼間（２０：００−８：００）は活動量が減少している様子がわかる。２日目と３日目について行動量を集計し、それを図３４の棒グラフに示した。すると、ＷＴマウスとＴＧマウスの総活動量は同程度で、有意差は見られなかった（ＷＴマウス：２５９１±３５６回、ＴＧマウス：３４２２±７０８回；ｕｎｐａｉｒｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔによる検定でＰ＝０．０７）。夜間の行動量（％）を比較してみると、ＴＧマウスのほうがＷＴマウスよりも若干高く、昼夜の活動がより明瞭になっていた（ＷＴマウス：６７．７±５．８％、ＴＧマウス：８４．０±２．８％；ｕｎｐａｉｒｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔによる検定でＰ＜０．０５）。しかし、全体として自然な飼育環境下で両群の活動には大きな変化はみられなかった。
【０１４０】
実施例２５： 拘束ストレスに対する血中コルチゾールの変化
我々が危険や脅威にさらされると、ストレス反応が誘発される。ストレス反応の生理的変化としては、大きく２つの系があり、１）内分泌系と２）交感神経系がある。内分泌系では、ストレスによって下垂体前葉から副腎皮質刺激ホルモンが放出され、それが刺激になって副腎皮質からグルココルチコイド（コルチゾールなど）が放出され、これが血糖値上昇、血圧上昇、抗炎症作用につながる。一方、交感神経系が活性化されると、副腎髄質からアドレナリンやノルアドレナリンの放出が増え、これが心拍数上昇、血糖値上昇、汗分泌、瞳孔拡張等につながる。ＴＧマウスでは、不安、うつ、恐怖、攻撃性が低下していることから、ストレスに対する反応性に違いがある可能性が考えられた。そこで、ストレス応答として内分泌系の働きに違いがあるかどうかを確かめるため、血中コルチゾールの測定を行うことにした。
【０１４１】
動物に対するストレスとして、拘束ストレスを用いることにした。拘束ストレスとは、動物を物理的に動けないようにして（通常、網や容器を用いて拘束する）誘導されるストレスのことである。実験系としては、動物が身動きできないような容器に押し込んで、ストレスを誘導する。ストレス応答の生体指標としては、血中のコルチゾール濃度を用いる。血液標本としては、ストレスをかける前、ストレスをかけた後、ストレス後にしばらく回復させた後の３点から得る。通常、自然状態では血中コルチゾールの濃度は低いが、ストレスをかけると急激に上昇し、ストレスがなくなってしばらくすると濃度が低下して基礎レベルに近づく。コルチゾールの濃度はＥＬＩＳＡ法を用いた分析によって、定量的に測定する。採取した血液は、遠心分離によって血清を得て、それをＥＬＩＳＡ用の試料とする。ストレスに伴う血中コルチゾール濃度の変化を測定することによって、ＷＴマウスとＴＧマウスの間で、内分泌系を介したストレス反応に違いがあるかどうかを調べる。
【０１４２】
６週齢の雄マウスを用いて、拘束ストレスによる血中コルチゾール濃度の変化を測定した。ＷＴマウスとＴＧマウスについて、コントロール群、ストレス群、ストレス／回復群の３グループにわけた（各群４−５匹）。ストレス群及びストレス／回復群のマウスは、プラスチック製の円筒容器（直径３ｃｍ、長さ１１ｃｍ、呼吸用の空気穴がある）に挿入されて１時間の拘束ストレスを受けた。ストレス／回復群のマウスについては、拘束ストレスの後、飼育箱に戻して、１時間回復させた。ＷＴ及びＴＧマウスの各３群から、血液を採取し、遠心分離によって血清を回収した。これらの標本から、血中コルチゾールの濃度をＥＬＩＳＡ法によって定量的に測定した（Ｃａｙｍａｎ、Ｃｏｒｔｉｓｏｌ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＥＩＡ Ｋｉｔ）。結果を図３５に示す。ストレス前では、ＷＴ及びＴＧマウスともに低レベルの血中コルチゾールが検出され、遺伝子型間での差異は見られなかった（ＷＴマウス：１１．０±３．２ｐｇ／ｍｌ、ＴＧマウス３３．１±１３．５ｐｇ／ｍｌ；クラスカル・ワリス検定（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ ｔｅｓｔ）後のシェフェの方法（Ｓｃｈｅｆｆｅ’ｓ ｔｅｓｔ）による検定でＰ＞０．０５）。１時間の拘束ストレスを与えると、ＷＴ及びＴＧマウスともに血中コルチゾールの濃度が急激に上昇し、遺伝子型間での有意差はみられなかった（ＷＴマウス：３６０．１±２７．５ｐｇ／ｍｌ、ＴＧマウス：２７１．１±４６．５ｐｇ／ｍｌ；ストレス前と後での比較では両遺伝子型ともにＰ＜０．０１、ＷＴ及びＴＧマウス間の比較ではＰ＞０．０５、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ ｔｅｓｔ後のＳｃｈｅｆｆｅ’ｓ ｔｅｓｔによる検定）。ストレス後、マウスを飼育箱に戻して１時間回復させた場合、ＷＴ及びＴＧマウスともに血中コルチゾール濃度は平常レベル近くにまで減少したが、両遺伝子型間で差は見られなかった（ＷＴマウス：６９．７±１０．９ｐｇ／ｍｌ、ＴＧマウス：９５．０±１５．４ｐｇ／ｍｌ；ストレス直後と１時間回復後での比較では両遺伝子型ともにＰ＜０．０１、ＷＴ及びＴＧマウス間の比較ではＰ＞０．０５、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ ｔｅｓｔ 後のＳｃｈｅｆｆｅ’ｓ ｔｅｓｔによる検定）。すなわち、ＴＧマウスでは正常な内分泌系を介したストレス反応がみられた。前述の結果を考慮すると、ＴＧマウスにおける情動の変化は、内分泌系を介したストレス反応には影響を与えていないことがわかる。
【図面の簡単な説明】
【０１４３】
【図１】図１はＣａＭＫＩＩプロモーターによりＶＥＧＦ１２０が過剰発現しているＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウス及び野生型マウス、低酸素環境下に晒したマウスの各脳切片のｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎの結果を示す顕微鏡写真の概略図である。
【図２】図２はＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの脳内各領域におけるＶＥＧＦ蛋白質の発現レベルをＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法を用いて調べた結果を示す写真の概略図である。
【図３】図３はＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの海馬領域における、ＶＥＧＦ蛋白質の各週齢での発現レベルの変遷をＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法を用いて調べた結果を示す写真の概略図である。
【図４】図４はＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの海馬領域神経細胞におけるＶＥＧＦ１２０の部位特異的発現を、免疫組織化学染色法を用いて示した結果を示す顕微鏡写真の概略図である。
【図５】図５は野生型マウスとＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの脳の大きさを比較した結果を示す写真の概略図である。
【図６】図６は野生型マウスとＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの脳重量、及び体重、体重に占める脳重量の割合を比較した結果を示すグラフである。
【図７】図７はＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの脳組織中の細胞数及び神経細胞数を、免疫組織化学染色法を用いて野生型マウスの脳組織と比較した結果を示す顕微鏡写真の概略図である。
【図８】図８は図７の結果を元に、細胞数を計測し野生型マウスと比較した結果を示すグラフである。
【図９】図９は野生型マウスとＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの脳における細胞増殖程度を、抗ＢｒｄＵ抗体を用いた免疫組織染色法により検出した結果を示す顕微鏡写真の概略図である。
【図１０】図１０は図９の結果を定量化し、比較した結果を示すグラフである。
【図１１】図１１は野生型マウスとＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスにおける海馬組織を核染色し、海馬における神経細胞層を可視化した結果を示す顕微鏡写真の概略図である。
【図１２】図１２は野生型マウスとＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスにおける海馬及び顆粒細胞層の断面積を測定し、比較した結果を示すグラフである。
【図１３】図１３は野生型マウスとＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスにおける海馬及び顆粒細胞層の体積を測定し、比較した結果を示すグラフである。
【図１４】図１４は野生型マウスとＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの歯状回におけるＢｒｄＵ陽性細胞の免疫染色法により検出した結果を示す顕微鏡写真の概略図である。
【図１５】図１５は図１４の結果より算出した野生型マウスとＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスにおけるＢｒｄＵ陽性細胞密度の平均を求めた結果を示したグラフである。
【図１６】図１６は野生型マウスとＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスにおけるＢｒｄＵ陽性細胞密度の平均をもとめた運動刺激の前後で比較した結果を示したグラフである。
【図１７】図１７は野生型マウスとＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスにおける神経前駆細胞の検出を行った結果を示した顕微鏡写真の概略図である。
【図１８】図１８は野生型マウスとＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスにおける神経前駆細胞の発現の指標となるＮｅｓｔｉｎ蛋白質の発現量をＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ法で解析した結果を示した写真の概略図である。
【図１９】図１９は野生型マウスとＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスにおける未熟神経細胞の組織における分布状況を免疫組織染色により観察した結果を示した顕微鏡写真の概略図である。
【図２０】図２０は野生型マウスとＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの海馬歯状回における新生細胞の分化を免疫組織染色法にて比較した結果を示した顕微鏡写真の概略図である。
【図２１】図２１は野生型マウスとＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの海馬歯状回における新生細胞がどのような細胞へと分化したかを定量的に解析した結果を示したグラフである。
【図２２】図２２は野生型マウスとＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの海馬歯状回における顆粒細胞層におけるＢｒｄＵ陽性細胞の数を比較した結果を示したグラフである。
【図２３】図２３は野生型マウスとＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの脳における血管新生を、レクチンによる染色により比較した結果を示した顕微鏡写真の概略図である。
【図２４】図２４は野生型マウスとＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの脳における血管新生を、レクチンによる染色の蛍光強度を測定し、比較した結果を示したグラフである。
【図２５】図２５は野生型マウスとＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの海馬歯状回の門部における、毛細血管の直径の分布を比較した結果を示したグラフである。
【図２６】図２６は野生型マウスとＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスに色素を投与し、内臓組織の染色を観察した結果を示した写真の概略図である。
【図２７】図２７は野生型マウスとＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスに色素を投与した後、脳組織の染色の様子を比較観察した結果を示し写真の概略図である。
【図２８】図２８は不安に対するＶＥＧＦの効果を調べるために、野生型マウスとＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスに対し、オープンフィールド試験を行った結果を示したグラフである。
【図２９】図２９は不安に対するＶＥＧＦの効果を調べるために、野生型マウスとＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスに対し、高架式十字迷路試験を行った結果を示したグラフである。
【図３０】図３０はうつ様行動に対するＶＥＧＦの効果を調べるために、Ｐｏｒｓｏｌｔの強制水泳試験を野生型マウスとＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスに対し行った結果を示したグラフである。
【図３１】図３１は恐怖感及び恐怖に関わる学習行動に対するＶＥＧＦの効果を調べるために、恐怖条件付け試験を行った結果を示したグラフである。
【図３２】図３２は熱痛覚に対する野生型マウス及びＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの応答の違いを、ホットプレートテストにより比較した結果を示したグラフである。
【図３３】図３３は攻撃行動におけるＶＥＧＦの効果を調べるために、野生型マウスとＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスに対しレジデント−イントルーダー攻撃性アッセイを行った結果を示したものである。
【図３４】図３４は野生型マウスとＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスにおける、基礎行動量を比較した結果を示したグラフである。
【図３５】図３５はストレスに対する野生型マウスとＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの反応の違いを血中コルチゾール濃度の違いにより比較した結果を示したグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、効果的にストレスや不安、攻撃性の低下や積極性の向上ができる、気分状態改善剤に関する。また、本発明は、それらの気分状態改善剤をスクリーニングする方法に関する。さらに、精神状態が改善された状態のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
喜怒哀楽は我々の日常生活する上で重要な心的要因であり、我々の人生に彩を与えるものである。喜び、悲しみ、恐怖、不安、怒りなども含め「情動」と呼ぶが、これらは個人の時折々の主観的な感情として片付けられるものではなく、生命維持に必要な高次脳機能として、特に恐怖、不安等が進化上保存されている。
【０００３】
我々の健康には、身体機能のみならず精神機能も正常に維持されることが必須であり、情動に関わる疾病も少なくない。情動の異常、すなわち気分障害は我々の社会生活において非常によく見られる精神疾患である。例えば、気分障害の一つである「うつ病」は、米国での調査によると生涯罹患率が２割にも達することが示されている。現代社会では、気分障害を罹患する人の割合が増加する傾向にあり、例えば、年々増加傾向にある日本国における自殺者数のうち、約７割が気分障害を罹患していたという推計もある。このように、情動の異常は単なる個人の問題としては済まされず、社会問題にまで発展するものであり、現代社会において早急に解決されるべき課題となっている。
【０００４】
疾病としての気分障害や個人の気分を改善させる手段として、現在、カウンセリング、認知療法、運動療法、電気痙攣法、ハーブ療法、音楽療法、趣味等による気分の改善、社会技能の取得などが知られている。しかしながら、これらの療法は改善まで時間を必要とするのもが多く、さらにその効果も一定ではない。そのような理由から、現実的にはこれらの療法と平行して薬物療法を行わざるを得ない。
【０００５】
薬物療法を行うにあたり、情動に変化を与える向精神薬が使用される。向精神薬はその作用機構の違いからいくつかのクラスに分類されるが（非特許文献１）、神経伝達物質であるモノアミンの脳内濃度を変化させる薬剤が特に広く用いられている。例えば、臨床で使用される抗うつ剤はモノアミン分解を阻害するものや、モノアミンの取り込みを阻害する薬剤がほとんどであり、これらを用いた薬物療法は一定の臨床成果を得ている。これらの薬効の生理学的説明としては、モノアミンの脳内濃度が情動の変化をもたらすといったモノアミン仮説に基づく（非特許文献２）（非特許文献３）。すなわち、セロトニンの脳内濃度が低下したためにうつ病が発症するという解釈である。しかしながら、この仮説が発表されて既に４０年以上たつが、情動をつかさどる脳内メカニズム（分子メカニズム、関連する神経ネットワークや脳領域）は多くの点で不明である。
【０００６】
情動に変化を及ぼしうる因子としては、モノアミン以外に、酸素・栄養の循環、代謝、神経伝達物質、成長因子、ホルモンなどの様々な要因が考えられる。中でも成長因子は神経細胞の機能と密接な関連があることから、高次脳機能に影響を与える。例えば、成長因子は脳において神経細胞の増殖、神経新生の促進、軸索の投射、神経細胞の構造や機能の成熟化、シナプス可塑性、神経保護、記憶や学習、情動など、細胞が生まれてから死ぬまでの運命や、分子から個体レベルに及ぶ脳機能に影響を与える。
【０００７】
情動に影響を与える成長因子はいくつか知られており、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、はその例である（非特許文献３）。ＢＤＮＦ、ＩＧＦ、ＶＥＧＦは環境の変化によって発現レベルが変化することから、外界の刺激が脳機能に長期的変化を誘導する際の仲介分子として働いている可能性が高い。
【０００８】
ＢＤＮＦは脳由来の成長因子で神経機能とのかかわりが深く、神経新生、シナプス可塑性、神経保護、記憶、情動に重要な働きを示す（非特許文献４）。この遺伝子が失われると、生後まもなく死亡する。ＢＤＮＦを海馬のみで欠失させても神経可塑性の低下や、空間記憶の障害、さらに情動の障害が起きる。運動をはじめ、学習、電気刺激によって脳で発現し、それを阻害すると効果が失われる（非特許文献５）。
【０００９】
ＩＧＦ−Ｉは主に末梢組織で作られ、個体の成長や寿命、脳では神経新生、神経可塑性、記憶、情動に関わっている。この遺伝子が失われると固体の成長が著しく妨げられ、ＩＧＦ−Ｉの発現量が低いと寿命が延びる。運動によって末梢で作られたＩＧＦ−Ｉは血管系を循環し血液脳関門を通過して脳組織に到達する。ＩＧＦ−Ｉは空間記憶の促進や抗うつ作用との関わりが示されている。また、ＩＧＦ−Ｉは、ＢＤＮＦの脳内作用を調節しているとの報告がある（非特許文献６）。
【００１０】
ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）は血管新生に必須な因子であり、脳を含む様々な組織で作られている。この遺伝子が失われると胎生致死となり、脳に限定して欠失させても出生直後に死亡する。ＶＥＧＦは、運動をはじめ、学習、低酸素、電気刺激、虚血、脳障害などの様々な刺激によって誘導され、脳では神経新生や血管新生のほか、神経保護、記憶、情動とのかかわりが指摘されている。（非特許文献７、非特許文献８）
【００１１】
ＶＥＧＦには、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄというアイソフォームが存在する。これらは、蛋白質の一次構造において高い相同性を示すが、異なる遺伝子でコードされている。この４種類のアイソフォームの中でも、血管新生に深く関わっているのがＶＥＧＦ−Ａであると考えられている。その理由から、一般的にＶＥＧＦといえば、ＶＥＧＦ−Ａを示す。
【００１２】
ＶＥＧＦ−Ａの遺伝子はスプライシングの違い（エクソンの組み合わせによる違い）から、少なくとも５種類のスプライスバリアントが作られる。例えば、マウス／ヒトのＶＥＧＦ−Ａ遺伝子からは、ＶＥＧＦ１２０／１２１（エクソン番号：１，２，３，４，５，８）、ＶＥＧＦ１４４／１４５（エクソン番号：１，２，３，４，５，６，８）、ＶＥＧＦ１６４／１６５（エクソン番号：１，２，３，４，５，７，８）、ＶＥＧＦ２０５／２０６（エクソン番号：１，２，３，４，５，６，６,７，８）が作られる。
【００１３】
ＶＥＧＦの後の番号は成熟型ＶＥＧＦのアミノ酸残基の数を示している。即ち、ＶＥＧＦ１２０であれば、成熟型はアミノ酸１２０残基から構成されている。これらのスプライスバリアントは、個体の発生段階や組織においてその種類と発現量が異なっている。
【００１４】
ＶＥＧＦは分泌性の蛋白質である。未成熟型（前駆体）のＶＥＧＦには、そのアミノ末端側（Ｎ−末端側）に２６アミノ酸残基で構成されるシグナルペプチドを有する。この配列は小胞体の膜を通過する際に、シグナルペプチターゼによって切断される。即ち、ＶＥＧＦ１２０の場合、１４６アミノ酸残基からなる前駆体として産生され、２６アミノ酸残基からなるシグナルペプチドが切断されることによって、１２０アミノ酸残基からなる成熟体となる。
【００１５】
こうして作られた成熟型ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦ産生細胞の細胞外へと分泌されるか、もしくはＶＥＧＦ産生細胞の細胞膜上にとどまる。細胞外へ分泌されるスプライシングバリアントは、ＶＥＧＦ１２０／１２１やＶＥＧＦ１４４／１４５、ＶＥＧＦ１６４／１６５である。
【００１６】
ＶＥＧＦ受容体には、ＶＥＧＦ受容体１（別名：Ｆｌｔ−１）とＶＥＧＦ受容体２（別名：Ｆｌｋ−１）、ニューロピリン１とニューロピリン２が知られている。スプライシングバリアントのＶＥＧＦ１２０／１２１やＶＥＧＦ１４５／１４６はＶＥＧＦ受容体１ と２のみに結合するが、スプライシングバリアントのＶＥＧＦ１６４／１６５、ＶＥＧＦ１８８／１８９とＶＥＧＦ２０５／２０６はＶＥＧＦ受容体１と２以外に、ニューロピリン１又は２にも結合する。即ち、ＶＥＧＦ１２０は、ＶＥＧＦ受容体１又は２のみに結合する。
【００１７】
従来、ＶＥＧＦは、大腸がん、胃がん、肺がんなどにおける様々な腫瘍細胞で、血管を腫瘍に引き込むために過剰発現されていることが知られており、このＶＥＧＦ作用を抑えるために、ＶＥＧＦの発現を抑制、又は働きを阻害させる阻害剤の開発において大きく注目されている（特許文献１〜４）。また、一方、皮膚機能低下を抑制する皮膚賦活剤としてＶＥＧＦの発現を促す物質の探索も盛んである（特許文献５〜７）。しかしながら、抗ストレス剤などの方面からの研究はなされていない。
【００１８】
【非特許文献１】Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ ＬＥ ｅｔ ａｌ． ＮｅｕｒｏＲｘ． ２００５ Ｏｃｔ；２（４）：５９０−６１１．
【非特許文献２】Ｓｃｈｉｌｄｋｒａｕｔ ＪＪ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒ Ｒｅｓ． １９６５ Ｄｅｃ；３（４）：２１３−２８．
【非特許文献３】Ｃｏｐｐｅｎ Ａ ｅｔ ａｌ． Ｌａｎｃｅｔ． １９６７ Ｄｅｃ ２；２（７５２７）：１１７８−８０．
【非特許文献４】Ｔａｎｉｓ ＫＱ ｅｔ ａｌ． ＣＮＳ Ｎｅｕｒｏｌ Ｄｉｓｏｒｄ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ． ２００７ Ａｐｒ；６（２）：１５１−６０．
【非特許文献５】Ｄｕｍａｎ ＲＳ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ． ２００６ Ｊｕｎ １５；５９（１２）：１１１６−２７．
【非特許文献６】Ａｒｓｅｎｉｊｅｖｉｃ Ｙ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １９９８ Ｍａｒ １５；１８（６）：２１１８−２８．
【非特許文献７】Ｎｅｕｆｅｌｄ Ｇ ｅｔ ａｌ． ＦＡＳＥＢ Ｊ． １９９９ Ｊａｎ；１３（１）：９−２２．
【非特許文献８】Ｗａｒｎｅｒ−Ｓｃｈｍｉｄｔ ＪＬ ｅｔ ａｌ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ２００８ Ｆｅｂ；８（１）：１４−９．
【特許文献１】特開２００１−３５４５６２号公報
【特許文献２】特開２００３−０１２５４１号公報
【特許文献３】特許第３５４４６７５号公報
【特許文献４】特許第４０５４３７３号公報
【特許文献５】特開平１１−２８６４３２号公報
【特許文献６】特許第４０５０５６０号公報
【特許文献７】特開２０００−２１２０５９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明の目的は、効果的にストレスや不安、攻撃性の低下や積極性の向上が可能な気分状態改善剤である、抗ストレス剤を提供することである。
また、本発明は、前記抗ストレス剤のスクリーニング方法を提供するものである。さらに、本発明はＶＥＧＦの発現により精神状態が改善された状態のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく検討したところ、ＶＥＧＦを過剰に発現したトランスジェニック非ヒト哺乳動物がストレスや不安、攻撃性の低下を示し、積極性のある行動を示すことを見いだした。本発明はかかる知見に基づいて開発されたものである。
【００２１】
すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕 ＶＥＧＦ蛋白質もしくはＶＥＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＶＥＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいはＶＥＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくはＶＥＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＶＥＧＦ蛋白質と実質的に同質な活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ、又はそれらＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＶＥＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡを有効成分として含有することを特徴とする、抗ストレス剤、
〔２〕 ＶＥＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくはＶＥＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＶＥＧＦ蛋白質と実質的に同質な活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ、又はそれらＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＶＥＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡをコードするｍＲＮＡの発現量を指標とした、及び／又は、ＶＥＧＦ蛋白質もしくはＶＥＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＶＥＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩のタンパク質量を指標とした、抗ストレス剤のための化合物又は組成物のスクリーニング方法、
〔３〕 前記〔２〕に記載のスクリーニング方法により選択される物質を有効成分として含有する抗ストレス剤、
〔４〕 ＶＥＧＦ受容体１であるＦｌｔ−１、及び／又は、ＶＥＧＦ受容体２であるＦｌｋ−１に対するアゴニスト活性を指標とした抗ストレス剤のための化合物及び組成物のスクリーニング方法、
〔５〕 前記〔４〕に記載のスクリーニング方法により選択される物質を有効成分として含有する抗ストレス剤、
〔６〕 脳内でＶＥＧＦ蛋白質が過剰に発現されており、且つ、脳内で神経新生及び血管新生が促進されていることを特徴とするトランスジェニック非ヒト哺乳動物、
〔７〕 血液脳関門が緩やかになっており、末梢投与の薬剤や組成物の脳内における生理活性評価が容易になっていることを特徴とする前記〔６〕記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物、
〔８〕 高感度に情動行動が評価できることを特徴とする前記〔６〕及び〔７〕記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物
に関する。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の抗ストレス剤は、以前より提供されている脳内モノアミン代謝やＧＡＢＡ受容体に作用するものとは異なる、新規の作用を備えた抗ストレス剤を提供できる。
また、本発明のスクリーニング方法を用いることで、種々の天然原料、人工的に作製された原料などから、前記抗ストレス剤を効率よく選択することができる。
また、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いれば、ストレス、不安、積極性低下及び攻撃性増進等の現在問題となっている精神病に関連した因子の特定や、ストレッサーの探索をしやすくすることができる。
なお、本発明において、抗ストレスとは、ストレスを低減する作用のほか、不安、攻撃性の低下や積極性の向上が可能な作用も含む。したがって、本発明の抗ストレス剤は、抗不安剤、積極性向上剤及び攻撃性抑制剤としても利用し得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
１．抗ストレス剤
本発明で用いる「ＶＥＧＦ蛋白質」は、血管内皮増殖因子の全てのアイソフォーム（ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄを含む）およびそれらの全てのスプライスバリアントを意味する。なお、ＶＥＧＦ蛋白質のアミノ酸配列は既に知られたものである。
また、作用対象の生物種がヒトである場合、免疫反応による副作用を低減する観点から、ヒト由来の血管内皮増殖因子を用いるのが好ましい。
【００２４】
また、「ＶＥＧＦ蛋白質の部分ペプチド」とは、前記ＶＥＧＦを構成するアミノ酸配列に含むようなペプチドであって、ＶＥＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩をいう。
【００２５】
また、「ＶＥＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡ」とは、ＶＥＧＦ蛋白質を発現しうるＤＮＡ配列をいう。ＶＥＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡ配列の具体例としては、ＧｅｎｅＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪにアクセション番号：ＡＫ３１３８７９， ＢＣ０３５２１２， ＢＣ０６５５２２， Ｄ８９６３０， Ｍ６３９７１， Ｍ６３９７２， Ｍ６３９７３， Ｍ６３９７４， Ｍ６３９７５， Ｍ６３９７６， Ｍ６３９７７， Ｍ６３９７８， ＢＣ０２７９４８， ＡＹ２６３１４５， ＡＹ０４７５８１， ＡＦ０２４７１０， ＥＵ３３２８６６， ＤＱ２２９９００， ＡＦ４６８１１０， Ｕ５２８１９， ＢＣ０４６３０３， ＢＣ０６１４６８， Ｄ８９６２８， Ｍ９５２００， ＡＦ２８６７２５， Ｕ５０２７９， ＢＣ０９６３７７， ＡＦ２６６４６７， ＡＢ０４７５５２， Ｕ７３６２０， ＡＹ２６３１４６， ＡＹ７５６０６８， Ｕ４８８００， ＡＦ３１７８９２等として登録されているヒト又はマウス由来のＶＥＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡ等が好ましく挙げられる。
また、本発明のＶＥＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡには前記ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであってＶＥＧＦ蛋白質と実質的に同質な活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ等が包含される。
【００２６】
また、本発明のＶＥＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡは上記に限定されず、発現する蛋白質がＶＥＧＦ蛋白質と実質的に同じ作用を有する蛋白質をコードするＤＮＡである限り、本発明のＶＥＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡとして使用できる。例えば、ＶＥＧＦ蛋白質の部分ペプチドをコードするＤＮＡであってＶＥＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ等も好ましく使用できる。
【００２７】
ＶＥＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくはＶＥＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＶＥＧＦ蛋白質と実質的に同質な活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ、又はそれらＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、例えば上記ＤＮＡの部分配列をプローブとし、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味する。
【００２８】
ＶＥＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくはＶＥＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＶＥＧＦ蛋白質と実質的に同質な活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ、又はそれらＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとして、具体的には、前記ＧｅｎｅＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪに記されている塩基配列と約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するＤＮＡ等が挙げられる。ハイブリダイゼーションは公知の方法、例えばモレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ． Ｐｒｅｓｓ． ２００１）に記載の方法等に従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書の記載方法に従って行うことができる。
【００２９】
本発明の抗ストレス剤は、前記のような（１）ＶＥＧＦ蛋白質、（２）ＶＥＧＦ蛋白質の部分ペプチド又はその塩、（３）ＶＥＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡ、（４）ＶＥＧＦ蛋白質の部分ペプチドをコードするＤＮＡ、（５）これらのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＶＥＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡのいずれか１種のみからなっていてもよく、２種以上を混合して調製してもよい。各剤中における各成分の含有量については特に限定はないが、例えば、（１）ＶＥＧＦ蛋白質であれば０．０１〜５０重量％、（２）ＶＥＧＦ蛋白質の部分ペプチド又はその塩であれば０．０１〜５０重量％、（３）ＶＥＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡであれば０．０１〜１０重量％、（４）ＶＥＧＦ蛋白質の部分ペプチドをコードするＤＮＡであれば０．０１〜１０重量％、（５）これらのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＶＥＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡであれば０．０１〜１０重量％であることが好ましい。
なお、本発明の抗ストレス剤は、例えば、抗不安剤、積極性向上剤及び攻撃性抑制剤などの用途でも使用できるが、これらの用途に応じて、前記ＶＥＧＦ蛋白質等を適宜水等の溶媒に溶解して使用してもよい。
【００３０】
本発明の抗ストレス剤には、前記の各成分を混合して調製する以外に、スクリーニング方法を用いて選択される物質を用いることもできる。
【００３１】
本発明の抗ストレス剤は、ヒトのほか、ヒト以外の哺乳動物（例えばサル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、チンパンジー等）にも適用できる。これらの動物への適用量としては、特に限定はない。また、投与方法としては、最終的に脳組織中のＶＥＧＦ濃度が２０ｎｇ／ｇ組織重以上、好ましくは５０ｎｇ／ｇ組織重以上になるような方法であれば特に限定はない。
例えば、ヒトであれば、一日あたり経口投与であれば、１日あたりＶＥＧＦ蛋白質が１ｇ／ｋｇ体重以下となるようにすればよい。
【００３２】
２．スクリーニング方法
本発明者らは、後述の実施例で確認した通り、ＶＥＧＦに情動（ストレス、不安、うつ、攻撃性、恐怖）の制御に優れた効果があることをはじめて見出している。この結果に基づくと、ＶＥＧＦの発現を促す因子にも、ストレス、不安、うつ、攻撃性を軽減させる効果があると考えられる。これまでの知見で、ＶＥＧＦの発現は様々な環境因子、例えば、運動、虚血、低酸素、電気的痙攣、脳障害などによって促進されることが知られている。しかし、虚血、低酸素、電気痙攣などはＶＥＧＦ の発現を顕著に促進する方法であるが、健康上避けるべきで手法であり、実用的であるとは言えない。一方、運動はより自然的な環境刺激であるが、ＶＥＧＦの発現の促進効果は低い傾向にある。すなわち、生体におけるＶＥＧＦの発現をより効率的に促進するような化合物や組成物のスクリーニング方法を見つけることは特に重要である。
【００３３】
ＶＥＧＦの発現を促進する化合物や組成物には、情動を制御する作用があると考えられることから、それらをスクリーニングする必要がある。これは、ＶＥＧＦの発現量を指標として、化合物や組成物の効果を評価することで達成される。すなわち、化合物や組成物を生体に投与して、ＶＥＧＦの発現量の程度を比較することによって評価できる。ＶＥＧＦの発現量は、１）遺伝子の転写の段階（ｍＲＮＡレベル）、もしくは２）ｍＲＮＡの翻訳の段階（タンパク質レベル）の２種類の方法で測定することが可能である。以下に、その２つの手法について記述する。
【００３４】
本発明による抗ストレス剤のための化合物及び組成物のスクリーニング方法は、ＶＥＧＦ ｍＲＮＡ、及び／又はＶＥＧＦ蛋白質の発現量を指標としてスクリーニングすることができる。即ち、被検物質を投与し、ＶＥＧＦ ｍＲＮＡ、及び／又はＶＥＧＦ蛋白質の発現量の程度を比較することによって、評価することができる。
【００３５】
本発明のスクリーニング方法に利用される試験動物としては、ＶＥＧＦの情報伝達系が高度に保存されている哺乳動物を用いるのが適当である。具体的にはヒト及び非ヒト哺乳動物、例えばマウス、ハムスター、ラット、モルモット、ウサギ等のげっ歯類の他、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ブタ、サル等を使用することができるが、多様な条件下で化合物や組成物の効果を検討するため、小動物を用いて多くの例数を得るのが望ましい。即ち、育成及び使用の簡便さなどの観点から見て、げっ歯類が好ましく、その中でもマウスが好ましい。
【００３６】
本発明のスクリーニング方法における化合物や組成物の投与は、化合物や組成物の性質に依存するため、経口投与、腹腔内投与、静脈投与、皮下投与等が考えられる。また、投与量及び投与期間についても、化合物や組成物の性質に基づいて異なる条件を検討する。
【００３７】
本発明のスクリーニング方法において、ＶＥＧＦ遺伝子発現のレベルを定量的に解析する上で、ＶＥＧＦ ｍＲＮＡ の発現量の変化を調べる。ＶＥＧＦ ｍＲＮＡの発現を定量的に調べる方法として、ノーザンブロット法、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法、ジーンチップやＤＮＡマイクロアレイを利用する方法、などさまざまな手法が考えられる。中でも、最も経済的かつ、迅速に、また高感度でＶＥＧＦ ｍＲＮＡの発現量を調べる方法としてはＰＣＲを用いる方法があげられる。また、リアルタイムＰＣＲ法を用いると、ＶＥＧＦ ｍＲＮＡの発現レベルが、定量的に、高感度で、比較的安価で、短時間に行うことができる。
【００３８】
本発明のスクリーニング方法におけるＶＥＧＦ ｍＲＮＡ試料の調製に必要な組織とその操作としては、ＶＥＧＦは、様々な細胞で産生されていることから、ｍＲＮＡ試料の調製には、基本的にどの組織を用いてもよい。中でも、本発明ではＶＥＧＦによる中枢神経系への効果を主眼とするため、脳組織を用いるのが好ましい。脳組織としては、脳全体を用いるか、もしくは脳を解剖し、大脳辺縁系（情動と密接な関わりを持つ領域）等の領域を得ることも可能である。これらの脳組織を動物より迅速に摘出し、低温で処理し（急速に冷やしてｍＲＮＡの分解・産生を止める）、脳を解剖する場合は氷上で行う。得られた組織を秤量し、液体窒素もしくはドライアイス等で急速に凍結し、超低温冷凍庫（−８０℃）で保存する。
【００３９】
ｍＲＮＡ試料の調製においては、経済的で、簡便で、再現性が高い抽出法が選択される。精製されたｍＲＮＡ をＰＣＲに用いるのが理想的ではあるが、ｍＲＮＡの精製には、時間、労力、設備が必要なうえ、得られるサンプル量が非常に僅かなため実験誤差を生じやすい。そこで、より実用的な手法としては、ｍＲＮＡを含むｔｏｔａｌ ＲＮＡを粗ｍＲＮＡ標品（ｔｏｔａｌ ＲＮＡには全てのｍＲＮＡが含まれるが、ｔｏｔａｌ ＲＮＡに対するｍＲＮＡの割合は通常１−２％程度である）として用いる。ｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製する方法にはいろいろあるが、一例として酸フェノール法があり、組織よりｔｏｔａｌ ＲＮＡを迅速に、高収率で回収することが可能である。得られた粗ｍＲＮＡ試料は、超低温冷凍庫（−８０℃）で保存する。ＲＮＡは分解されやすいことから、ＲＴ−ＰＣＲ 反応を行う際に、ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）で処理された水に溶解する。
【００４０】
ＰＣＲにおいては、ＤＮＡが鋳型となる。遺伝子発現の解析にあたっては、転写産物としてのｍＲＮＡを逆転写することによって得られたｃＤＮＡを鋳型とする。逆転写反応はＲＮＡをＤＮＡに変換する反応であり、鋳型ｍＲＮＡ、核酸基質（ｄＮＴＰ）、プライマーＤＮＡ（オリゴｄＴプライマー、ランダムプライマー）の存在下、逆転写酵素（ＭＭＬＶ又はＡＭＶ由来、もしくはそれらの改良型）を作用させることによって、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成する。逆転写反応の実際の操作は、市販のキットを用いて簡便に行うことができる。逆転写反応において、生成されるそれぞれのｃＤＮＡの量はその鋳型であるｍＲＮＡの量と化学量論的である。すなわち、それぞれのｍＲＮＡの存在量に比例してｃＤＮＡが合成される。
また、逆転写反応とＰＣＲを一度に行う方法も使用することができる。この場合は、ｔｏｔａｌ ＲＮＡをＰＣＲ溶液に直接加えることによって、一連の反応を進行させることができる。
【００４１】
ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）は、微量に存在するＤＮＡを増幅して検出する方法である。しかし、ＰＣＲによってＤＮＡが過剰に増幅されると、ＰＣＲ産物の生成が飽和してしまうため（一定量に落ち着くため）定量的な比較は困難となる。リアルタイムＰＣＲでは、ＤＮＡの増幅の状況を逐次追跡することができるため、個々の増幅の程度を知ることができる。すなわち、鋳型として用いたｃＤＮＡの量が多ければ、少ない増幅回数で検出可能なレベルにまで増幅されるが、逆にｃＤＮＡの量が少なければ、検出されるまでより多くの増幅回数が必要となる。この増幅の差から、ＰＣＲに用いたｃＤＮＡの存在量を比較することができる。濃度が既知のコントロールＤＮＡ試料を用いて検定線を作成すると、ＰＣＲに用いたｃＤＮＡの絶対量を知ることができる。前述の通り、ＰＣＲに用いたｃＤＮＡの量は、組織のｍＲＮＡの量と比例関係にある。よって、リアルタイムＰＣＲによって、組織におけるｍＲＮＡの発現量を比較することができる。リアルタイムＰＣＲのための試薬や装置は市販のものを使用すればよく特に限定はない。増幅されるＤＮＡの検出方法としては、一般的にはインターカレーター法を用い、検出特異性を高く必要がある場合は蛍光標識プローブ法を用いる。
【００４２】
本発明のスクリーニング方法において、ＶＥＧＦ遺伝子発現の変化は、組織中のｍＲＮＡの存在量を測定することによって調べることができる。しかし、遺伝子産物、具体的にはＶＥＧＦ蛋白質の発現量が、翻訳の段階で調節されている場合もある。そのため、組織中のＶＥＧＦ蛋白質の存在量を比較することも必要になる。特定のタンパク質を検出して定量的に測定する方法も多数あるが、最も一般的な方法はＥＬＩＳＡ法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ、酵素結合免疫吸着検定法）である。そこで、本発明でもＥＬＩＳＡ法を用いてＶＥＧＦ蛋白質の発現量を比較し、化合物や組成物の効果を評価することができる。
【００４３】
本発明のスクリーニング方法において、タンパク質試料の作製に必要な組織とその操作としては、本発明では、ＶＥＧＦによる脳機能への作用を主眼とするため、タンパク質試料は脳組織より調製する。脳組織としては、脳全体、もしくは特定の脳領域を用いてもかまわない。しかし、情動との関わりが深い大脳辺縁系などの領域を調べることによって、解析の精度を上げることが望ましい。脳組織の摘出は迅速に行い、脳を氷冷した緩衝液に浸して急速に冷やす（タンパク質の分解を抑える）。特定の脳領域を得るため解剖が必要な場合は氷上で行う。得られた組織は秤量し、液体窒素もしくはドライアイス等で急速に凍結し、超低温冷凍庫（−８０℃）で保存する。
【００４４】
タンパク質試料の調製は、タンパク質分解を最小限に抑えるため全て氷上で行う。得られた脳組織に対し、その重さに従ってホモジナイズ溶液を加える（例、組織重量の１０倍量の溶液を添加する）。ホモジナイズ溶液は、ＲＩＰＡ溶液などのタンパク質の機能・構造に影響を与えず、全ての細胞内タンパク質を抽出できる溶液を使用する。この溶液に、さらに各種タンパク質分解酵素の阻害剤を加えて、タンパク質の分解を防ぐ。ホモジナイズ溶液の添加後、破砕機（ホモジナイザーもしくは超音波破砕機）を用いて組織を破壊し均一化する。この溶液を１０，０００ｘｇで遠心分離し、上清を回収する。当日に、測定を行わない場合は、−８０℃にて凍結保存する。
【００４５】
ＥＬＩＳＡに用いるタンパク質試料について、タンパク質の総量を測定する。これは、一連の試料調製作業において、一定体積に溶解しているタンパク質量に若干のばらつきが生じるためである。すなわち、総タンパク質量で基準化することによって、組織におけるＶＥＧＦの存在量を比較することができる。タンパク質濃度の測定は、ローリー（Ｌｏｗｒｙ）法もしくはブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）法を用いて呈色反応を行い、分光光度計により測定する。濃度が既知のタンパク質溶液（例、牛血清アルブミン）を各段階に希釈して標準溶液を作製し、これらの呈色反応を基準として、試料中のタンパク質濃度を検定することができる。
【００４６】
ＶＥＧＦ蛋白質量の検定は、市販のＥＬＩＳＡキットを用いればよい。例えば、Ｂｉｏｓｏｕｒｓｅ社製、ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡキットが挙げられるがこれに限定されない。ＥＬＩＳＡでは、まず、抗ＶＥＧＦ抗体が付着したマルチウェルプレートにタンパク質試料を入れ、試料中のＶＥＧＦを抗原抗体反応によって特異的に容器に吸着させる。次に、別の抗ＶＥＧＦ抗体（１次抗体）を加えて、容器表面に吸着されたＶＥＧＦと特異的に結合させる。最後に、酵素（例、過酸化酵素）と架橋された２次抗体を１次抗体と反応させて、酵素基質反応（呈色反応）を行う。
一方、濃度が既知のＶＥＧＦ溶液を一定濃度に希釈したものを標準試料とし、これも同様に反応させる。酵素基質反応による呈色の度合いを分光光度計で測定し、標準試料の検定線を作成することによって、試料中のＶＥＧＦの絶対量を求めることができる。最終的に、試料のタンパク質総量に対するＶＥＧＦ量をもって、組織中のＶＥＧＦの濃度とする（例えば、ＶＥＧＦ（ｐｇ）／タンパク質総量（ｍｇ））。組織中のＶＥＧＦの濃度を比較することによって、化合物や組成物の効果を比較することができる。
【００４７】
ＶＥＧＦは、不安、うつ、恐怖、攻撃性などの情動を緩和する作用を示す。これらの作用は、ＶＥＧＦがＶＥＧＦ受容体を活性化することで達成される。しかし、ＶＥＧＦ受容体には幾つかの種類があり（「背景」を参照）、これらの全てが情動に影響を与えるとは限らない。すなわち、それらの受容体に特異的な化合物や組成物をスクリーニングすることによって、情動の制御により効果的で、しかも副作用の少ないものが得られる可能性が高い。そこで、各種ＶＥＧＦ受容体の活性、望ましくはＦｌｔ−１及び／又はＦｌｋ−１に対するアゴニスト活性を指標として化合物や組成物をスクリーニングする。これは培養細胞を用いて行うことができる。Ｆｌｔ−１及び／又はＦｌｋ−１に対するアゴニスト活性は、例えば、培養細胞株にＦｌｔ−1またはＦｌｋ−１の遺伝子を導入して過剰発現させ、各種アンタゴニストの添加で生じる生理活性の変化（細胞分裂活性、転写活性、リン酸化酵素等のシグナル伝達因子の活性）を定量することによって調べることができる。
【００４８】
前記のスクリーニング方法を用いることで、抗ストレス剤、抗不安剤、積極性向上剤又は攻撃性抑制剤として使用し得る化合物又は組成物を探索することができる。
【００４９】
３．トランスジェニック非ヒト哺乳動物
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、脳内でＶＥＧＦ蛋白質が過剰に発現されており、且つ、脳内で神経新生及び血管新生が促進されていることを特徴とする。脳内におけるＶＥＧＦ蛋白質の過剰発現の程度としては、定常状態におけるＶＥＧＦの組織濃度の１０％以上であればよい。脳内で神経新生が促進されていることは、核酸類似物質（ブロモデオキシウリジン等）を末梢投与することによって確認した場合に、神経新生が起きている脳領域（側脳室の上衣下層や海馬歯状回の顆粒細胞下層等）における陽性細胞の密度が定常レベルよりも５％以上であればよく、または未熟神経細胞を免疫染色することによって確認した場合に、海馬歯状回の顆粒細胞等の神経細胞層における陽性細胞の密度が定常レベルよりも５％以上であればよい。血管新生が促進されていることは、血管内皮細胞を免疫染色することによって確認した場合に、血管内皮細胞もしくは毛細血管の密度が定常レベルよりも５％以上であればよい。
【００５０】
また、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、血液脳関門が緩やかになっている。通常、末梢投与された薬剤や組成物のほとんど（９割以上）は血液脳関門で阻止されて脳組織に到達しないため、脳内における生理活性の評価ができない。しかし、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、血液脳関門が緩やかであるために、末梢投与された薬剤や組成物が脳組織に到達しやすく、脳内における生理活性評価が容易になっている。前記血液脳関門が緩やかになっているとは、例えば、色素（例、エバンスブルー）や化学標識された物質（例、放射性同位体で標識された蛋白質）等を末梢投与することによって調べた場合に、それらの物質の濃度が脳組織中で１０％以上増加していればよい。また、末梢投与された薬剤や組成物の脳内における生理活性評価が容易になっていることは、例えば、通常血液脳関門で阻止される物質（例、ドーパミン、セロトニン等）を投与して、脳機能の変化（例、覚醒作用、抗うつ作用等）を調べることによって判断することができる。したがって、本発明において生理活性評価には、具体的には後述の実施例に記載の方法を用いることができる。
【００５１】
また、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、高感度に情動行動が評価できるものである。ここで、高感度に情動行動が評価できるとは、コンピュータによる画像解析を用いて動物の位置や移動速度を計測することにより、欝や不安行動を評価できることをいう。具体的には後述の実施例に記載の方法で評価することができる。
【００５２】
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、胚芽細胞と、生殖細胞あるいは体細胞とが、非ヒト哺乳動物又はこの動物の先祖に胚発生の段階（好ましくは、単細胞、又は受精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）においてＶＥＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡ配列を導入することによって作り出される。
【００５３】
以下、トランスジェニック非ヒト哺乳動物が、トランスジェニックマウスの場合を例に挙げて説明する。本発明者らは、マウス由来ＶＥＧＦ蛋白質の例として、野生型マウスの脳よりＶＥＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡ配列をクローニングし、発現ベクターを構築する。さらに、該当遺伝子を脳特異的に発現させるため、カルシウムカルモジュリンキナーゼ・タイプＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）遺伝子プロモーターと連結することで、該当遺伝子が脳特異的に発現するようにする。発現ベクターを構築した後、培養神経細胞へ遺伝子導入を行い、ＶＥＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡより、ＶＥＧＦ蛋白質が神経細胞にて発現することを確認する。さらに、発現ベクターを宿主マウスへ遺伝子導入を行い、該当遺伝子がトランスジェニックマウス内で発現していることをＰＣＲ法及び、インサイチュハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法により確認する。
【００５４】
なお、本発明において「神経新生」とは、幼弱な未分化細胞（例えば神経幹細胞等）から神経芽細胞を経て新しい神経（神経細胞）に分化させることをいい、神経細胞に分化する神経芽細胞や未分化細胞の増殖も含む。また、神経新生は、損傷した神経の再生や神経修復を含む。「神経」には神経中枢（例えば脳、脊髄等）及び末梢神経（例えば尺骨神経、橈骨神経、腓骨神経等）を含む。
【００５５】
また、本発明に用いられる発現ベクターは、宿主中で複製可能であれば特に限定されず、たとえばプラスミド、シャトルベクター、ヘルパープラスミドなどが挙げられる。
【００５６】
プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、酵母由来プラスミド（例えばＹＥｐ１３、ＹＣｐ５０等）などが挙げられる。ファージＤＮＡとしては、λファージ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。さらに、レトロウィルス又はワクシアニウィルスなどの動物ウィルス、バキュロウィルスなどの昆虫ウィルスベクターを用いることもできる。
【００５７】
本発明で用いられる形質転換体は、本発明の遺伝子を宿主中に導入することにより得ることができる。ここで宿主としては目的遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではないが、非ヒト哺乳動物が望ましい。
【００５８】
また、非ヒト哺乳動物としては、例えばマウス、ハムスター、ラット、モルモット、ウサギ等のげっ歯類の他、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ブタ、サル等を使用することができるが、作成、育成及び使用の簡便さなどの観点から見て、げっ歯類が好ましく、その中でもマウスが好ましい。
【実施例】
【００５９】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術が限定されるものではない。
【００６０】
実施例１：ＶＥＧＦトランスジェニックマウスの作製
本発明者らは、ＶＥＧＦを過剰に発現するトランスジェニックマウスを作製するために以下の手順を踏んだ。
【００６１】
本発明者らは、野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の脳からｔｏｔａｌＲＮＡを抽出し、それらを鋳型ＤＮＡとするためにＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ーポリメラーゼ連鎖反応）を行った。ＰＣＲ用のプライマーは、マウスＶＥＧＦ−Ａのエクソン１に存在する翻訳開始部位の上流配列（２１塩基対）、とエクソン８に存在する翻訳終止部位の下流配列（２１塩基対）に対応している。まず、マウス脳のｔｏｔａｌ ＲＮＡを、逆転写酵素（ＭＭＬＶ由来）とランダムプライマーを用いて、ｃＤＮＡに変換した。その後、これらのＤＮＡ産物を鋳型として、ＶＥＧＦ−Ａのプライマーを用いてＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を行った。この操作により、数本の長さの異なるＤＮＡ断片（４００−６００塩基対長）が増幅された。それぞれのＤＮＡ断片を、シリカ樹脂を用いて精製し、ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、ｐＣＲＩＩベクターにクローニングした。
【００６２】
ｐＣＲＩＩベクターにクローニングされたｃＤＮＡについて、その全塩基配列を明らかにし、ＶＥＧＦのｃＤＮＡ断片が得られていることを確認した。得られたＶＥＧＦｃＤＮＡの塩基配列は、Ｇｅｎｅｂａｎｋ〔（１）アクセション番号：ＢＣ０６１４６８、塩基番号（ＣＤＳ）：３９５．．９６７〕に登録されているマウスＶＥＧＦ−Ａの塩基配列（成熟体が１２０アミノ酸残基長のスプライスバリアントであるＶＥＧＦ１２０）と完全に一致していた。本研究では、ＶＥＧＦの情報伝達系を解析する目的でＶＥＧＦ１２０に焦点を当てる（ＶＥＧＦ１２０を発現させることにより、ＶＥＧＦ受容体１と２のみを活性化させる）。これらの操作によって得られたＶＥＧＦ１２０のベクターをｐＣＲＩＩ−ＶＥＧＦ１２０と名付けた。
【００６３】
続いて、発現ベクターへのクローニングを目的に、ｐＣＲＩＩ−ＶＥＧＦ１２０からＶＥＧＦ１２０のｃＤＮＡ断片を制限酵素処理によって切り出し、動物細胞用発現ベクターｐＮＮ２６５に組み込んだ。このベクターは、ＣＭＶプロモーターを保有していることから様々な動物細胞種で遺伝子発現を可能とする。また、このベクターはクローニング部位にエクソン―イントロン構造を持つことから、より自然な形で遺伝子発現を行うことができる。また、クローニング部位の下流領域にはＳＶ４０由来のポリＡシグナルが存在し、ｍＲＮＡの成熟化を助ける。この操作で得られた発現ベクターについて、制限酵素処理及びＤＮＡ塩基配列解析を行い、ＶＥＧＦ１２０のｃＤＮＡがｐＮＮ２６５に正しくクローニングされていることを確認した。この組換えベクターは、ｐＮＮ２６５−ＶＥＧＦ１２０と名付けた。
【００６４】
次に培養細胞におけるＶＥＧＦの発現を確認すべく、ＶＥＧＦ１２０の発現ベクターであるｐＮＮ２６５−ＶＥＧＦ１２０を、ヒト胎児腎臓由来の細胞株であるＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入した。遺伝子導入には、トランスフェクションと呼ばれる手法を用い、ベクターＤＮＡを効率的（通常１−５割程度）に細胞に付与する。ＤＮＡを付与された細胞では、発現ベクター上の遺伝子が活性化されて、その遺伝子産物が作られる。遺伝子導入２日後に細胞を回収して、タンパク質抽出液を得た。このタンパク質試料を用いて、ウエスタンブロットを行い、抗ＶＥＧＦ抗体を用いて、ＶＥＧＦを検出した。これにより、ＶＥＧＦ１２０は予想された分子量で発現され、また培養液中に分泌されることを確認した。この一連の操作によって、ＶＥＧＦ１２０の発現系が哺乳動物細胞において正常に作動することが確認された。
【００６５】
カルシウムカルモジュリンキナーゼ・タイプＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）遺伝子プロモーター作動性発現ベクターを構築するために、ＣＭＶプロモーター作動性のＶＥＧＦ１２０発現ベクター（ｐＮＮ２６５−ＶＥＧＦ１２０）から、ＶＥＧＦ１２０ ｃＤＮＡを有するエクソン−イントロン構造とポリＡシグナルを含む領域のＤＮＡ断片（「ＶＥＧＦ１２０エクソン−イントロンカセット」と呼ぶことにする）を制限酵素処理により得て、ＣａＭＫＩＩプロモーター作動性の発現ベクターｐＭＭ６０３に組み込んだ。これにより、ＶＥＧＦ１２０の発現がＣａＭＫＩＩプロモーターの制御下に置かれることになる。この操作で得られた組み換えＤＮＡについて、制限酵素処理及びＤＮＡ塩基配列解析を行い、ＶＥＧＦ１２０エクソン−イントロンカセットがｐＭＭ６０３に正しくクローニングされていることを確認した。この組換えベクターを、ｐＭＭ６０３−ＶＥＧＦ１２０と名付けた。
【００６６】
次に、神経細胞にてＶＥＧＦ１２０が産生されることを確かめるために、ｐＭＭ６０３−ＶＥＧＦ１２０を、ラット胎児から調製した初代海馬培養細胞に遺伝子導入を行った。この目的は、ＣａＭＫＩＩプロモーターの働きにより、神経細胞においてＶＥＧＦ１２０が産生されることを確かめるためである。遺伝子導入にはトランスフェクション用いるが、一般に神経細胞への導入効率は低く、通常１％程度である。遺伝子導入後２日目に、培養細胞を固定して、抗ＶＥＧＦ抗体を用いて免疫染色を行った。結果として、ｐＭＭ６０３−ＶＥＧＦ１２０が導入された神経細胞では期待通りＶＥＧＦ１２０の発現が確認され、ＣａＭＫＩＩプロモーターが作動しないアストロサイト（主要なグリア細胞）においてはＶＥＧＦ１２０の発現が見られないことがわかった。すなわち、ＣａＭＫＩＩプロモーターが神経細胞で特異的に作動すること、及びＶＥＧＦ１２０が神経細胞において正常に産生されることを確認した。
【００６７】
トランスジェニックマウスを作製するため、ＶＥＧＦ１２０発現カセットを調製した。ｐＭＭ６０３−ＶＥＧＦ１２０を制限酵素で処理することによって、ＣａＭＫＩＩプロモーター制御下のＶＥＧＦ１２０エクソン―イントロンカセット（「ＶＥＧＦ１２０発現カセット」と呼ぶ）のＤＮＡ断片を調製した。続いて、ＶＥＧＦ１２０発現カセットを受精卵に微量投入しトランスジェニックマウスの作製を行った。ＶＥＧＦ１２０発現カセットのＤＮＡ断片をマウス受精卵に微量注入する作業はＳＬＣ株式会社への委託によって行われた。作業としては、まずＤＢＦ１マウス（ＤＢＡ／２マウスとＣ５７ＢＬ／６マウスを交配させて得られる）から受精卵（３００細胞程）を得て、微量注入法によりＤＮＡ断片を受精卵の核の中に導入した。正常に２細胞へと分裂した胚（２２３胚）は、仮親の雌マウスに移植され、２０日後に産仔として得られた。
【００６８】
得られた産仔について尾からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法によって遺伝子改変がなされた動物を同定した。ＰＣＲにおいて、ＶＥＧＦ１２０発現カセットに特異的な配列をもつプライマーを用いると、遺伝子改変がなされた動物ではＤＮＡの増幅がみられるが、野生型であれば増幅はみられない。また、コントロールとしてマウスの内在性ＶＥＧＦ−Ａに対するプライマーを用いると、野生型マウスでも遺伝子改変マウスでも同様に増幅される。これらのプライマーを用いると、それぞれのＤＮＡ標本について、ＰＣＲによる反応が正しく行われたかどうかを確認すると同時に、遺伝子型を判定することができる。このようなＰＣＲを用いた手法でマウスの遺伝子型を判定し、離乳したマウスの３３匹中４匹がトランスジェニックマウス（ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウス、系統１から４）であることが判明した。このマウス世代をＦ０とする。
【００６９】
戻し交配を繰り返すことによって、産仔の遺伝的背景が交配に用いた動物の遺伝的背景に近づく。すなわち、野生型動物Ｃ５７ＢＬ／６を対照群として各種の実験を行う場合、遺伝子改変動物をＣ５７ＢＬ／６マウスの遺伝的背景に近づける必要がある。言い換えると、遺伝子改変がなされた領域以外の染色体ＤＮＡを全て、交配に使用する動物の染色体ＤＮＡに置換するということである。今回得られたトランスジェニックマウス（Ｆ０）は、既に５０％のＣ５７ＢＬ／６マウスの遺伝的背景を有していることから、最初の戻し交配で得られる産仔（Ｆ１）は、７５％のＣ５７ＢＬ／６マウスの遺伝的背景を有することになる。戻し交配を５回行うと（Ｆ５）、９８．４％がＣ５７ＢＬ／６マウスの遺伝的背景を有することになる。４系統（系統１から４）のＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスを、野生型マウスであるＣ５７ＢＬ／６マウスと交配させ、得られた産仔の遺伝子型をＰＣＲ法によって調べたところ、２系統について改変遺伝子がＦ１に受け継がれていることがわかった（他の２系統については、２細胞期以降に改変遺伝子が染色体ＤＮＡに挿入され、生殖細胞に受け継がれなかった可能性がある）。この２系統（ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの系統１と系統２とする）について、５回以上の戻し交配を行い、以下の実験に用いた。
【００７０】
実施例２：脳におけるＶＥＧＦの発現
本発明者らはＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの前脳におけるＶＥＧＦ ｍＲＮＡの発現を以下の手順で確認を行った
【００７１】
遺伝子が活性化するとｍＲＮＡが生成される。すなわち、ｍＲＮＡの発現形態を調べることによって、ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスにおいてＶＥＧＦが発現しているかどうかを確認することができる。組織におけるｍＲＮＡの発現を調べるために、ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎを行った。
【００７２】
ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの作製に使用したＣａＭＫＩＩのプロモーターは、前脳の神経細胞で特異的な活性を有する。そのため、脳組織を標本としてｍＲＮＡの解析をすることにした。脳標本は、ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの系統１と系統２のほか、野生型マウスと低酸素処理を行った野生型マウスを使用した。ＶＥＧＦ−Ａは、虚血や低酸素によって顕著に産生されることが知られており、これを内在性ＶＥＧＦ−Ａのポジティブコントロールとすることができる。脳標本は、マウスから脳を摘出後、すぐに包埋剤（ＯＣＴ ｃｏｍｐｏｕｎｄ， Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅｃｈ， ＵＳＡ）とともに−８０℃で凍結した。この凍結脳標本から、厚さ４０μｍの矢状切片（脳を縦切りにした切片）Ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎは、Ｓｃｈａｅｒｅｎ−Ｗｉｅｍｅｒｓ ａｎｄ Ｇｅｒｆｉｎ−Ｍｏｓｅｒ（１９９３）の方法に従った。ｍＲＮＡを検出するためのアンチセンスプローブは、ｐＣＲＩＩ−ＶＥＧＦ１２０を鋳型として、ジゴキシゲニン（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ）（ＤＩＧ）で化学標識された核酸類似体を基質に用い、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写法により合成した。このアンチセンスプローブは、塩基長が４００ｂｐ程度で、ＶＥＧＦ１２０ ｃＤＮＡの全領域を包含しており、検出できるＶＥＧＦ−Ａ ｍＲＮＡは、全ての内在性のＶＥＧＦ−Ａ（ＶＥＧＦ１２０， ＶＥＧＦ１４４， ＶＥＧＦ１６４， ＶＥＧＦ１８８， ＶＥＧＦ２０５を含む）及び、改変遺伝子由来のＶＥＧＦ１２０である。同様に、センスプローブをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写法により作製し、これは非特異的シグナルの程度を調べる目的で使用する。脳切片にアンチセンスプローブ（又はセンスプローブ）を含有したハイブリダイゼーション溶液を加えると、脳組織中のＶＥＧＦ−Ａ ｍＲＮＡとＤＩＧで標識されたアンチセンスプローブとの間で特異的に相補的な２本鎖の形成反応が起こり、アンチセンスプローブが組織中に安定的に保持される。次に、ＤＩＧで標識されたアンチセンスプローブを検出するために、アルカリ性フォスファターゼと架橋された抗ＤＩＧ抗体を加えて、ＤＩＧを特異的に反応させる。最後に、アルカリ性フォスファターゼの基質を脳切片上に加えることによって呈色反応が起こり、酵素濃度が高い部分がより強く紫色に着色する。すなわち、ＶＥＧＦ ｍＲＮＡがより多く産生されている領域において、強い紫色のシグナルが検出される。
【００７３】
６週齢のＴＧマウス系統１、ＴＧマウス系統２、ＷＴマウス、低酸素処理のＷＴマウスから脳組織を取り出し、厚さ４０μｍの矢状切片（正中線より１ｍｍ程外側）を作製した。これらの脳切片を、ＶＥＧＦ−Ａのアンチセンスプローブを用いて、ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎを行った。結果を図１に示す。図１の左の４つの写真は矢状切片の全体像であり、右の４つの写真は海馬領域を拡大したものである。図からわかるように、ＶＥＧＦ１２０ ｍＲＮＡは、ＷＴマウスでは染色が薄く基底レベルであるが、ＴＧマウス系統１（ＴＧ（Ｌ１））では発現量が高いことがわかる。ＴＧマウス系統１では、特に大脳皮質、線条体、海馬において顕著なＶＥＧＦ ｍＲＮＡの発現が見られ、これはプロモーターとして用いたＣａＭＫＩＩの発現パターンと一致している。一方、ＴＧマウス系統２（ＴＧ（Ｌ２））ではほぼＷＴマウスと同程度の染色であり、ＶＥＧＦの過剰発現が起きていないことを表している。低酸素処理を行ったＷＴマウスでは、ＶＥＧＦ ｍＲＮＡの発現が脳全体で高くなっていた。これは、虚血や低酸素によってＶＥＧＦの発現が増加するという報告と一致している。
海馬領域について検討しても同様な結果が導かれる。ＴＧマウス系統１（ＴＧ（Ｌ１））の海馬では、ＣＡ１−３領域の錐体細胞層及び歯状回の顆粒細胞層（海馬の錐体細胞及び顆粒細胞はともに興奮性の神経細胞である）において明瞭な染色がみられることから、ＴＧマウスの神経細胞では導入遺伝子であるＶＥＧＦ１２０が活性化していることを意味する。ＣａＭＫＩＩのプロモーターは神経細胞に特異的に発現することが知られており、この結果とうまく一致している。ＷＴマウスの海馬におけるＶＥＧＦの発現は、通常の環境下では基底状態であるが（神経細胞層に薄い染色がみられる）、動物を低酸素下に置くと、海馬の神経細胞でＶＥＧＦ ｍＲＮＡの発現量が著しく高くなっている。酸素が低い状態では、生体反応として、新たな血管形成を促すために、血管新生因子であるＶＥＧＦの産生が（酸素要求性の高い神経細胞は特に）増加するものと考えられる。
【００７４】
実施例３：ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの脳におけるＶＥＧＦタンパク質の発現
遺伝子が活性化するとｍＲＮＡが生成され、遺伝子産物としてのタンパク質に翻訳される。ここでは、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法を用いて、ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスにおけるＶＥＧＦの発現をタンパク質レベルから調べることを目的とした。
【００７５】
タンパク質の発現レベルを定量的に解析する方法として、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法を用いる。この方法は、まず、標本タンパク質を界面活性剤（ＳＤＳ）で処理することによって負に帯電させ、電場のかかった多孔質ゲル中を電気泳動させることにより、分子量に従って分離する。次に、ゲル中のタンパク質を膜（例、ＰＶＤＦ膜）に転写・固定させ、１次抗体（例、抗ＶＥＧＦウサギ抗体）と反応させる。最後に、酵素（例、過酸化酵素）と結合した２次抗体（例、過酸化酵素結合型−抗ウサギＩｇＧロバ抗体）と反応させて、酵素基質反応（例、化学発光）を行う。これにより、目的とするタンパク質が存在する部位が特異的に検出できるほか（見かけの分子量がわかる）、酵素抗体反応の強度が検出するタンパク質の存在量と比例することから、発現量を定量的に調べることができる。
タンパク質標本は、マウスの脳及び各脳領域から得る。これらをＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法を用いてＶＥＧＦを検出すれば、全体としてのＶＥＧＦ発現量の違い、及び各脳領域での発現量の違いを調べることができる。
【００７６】
６週齢のＷＴ及びＴＧマウス（系統１と２）を用いて、脳及び各脳領域からタンパク質標本を得た。結果を図２に示す。図２の左図は、系統１と系統２のＷＴ及びＴＧマウスの脳全体のＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔである（Ｌ１とＬ２：系統１と２のＴＧマウス、Ｃ１とＣ２：系統１と２のＷＴマウス）。ＶＥＧＦのシグナル（バンド）は、ＴＧマウス系統１から検出されたが、ＴＧマウス系統２とＷＴマウスについては検出できなかった（ＶＥＧＦの存在量が少ないためと考えられる）。検出されたバンドは３本あるが、上部の２つはそれぞれ、未成熟型（約２３ｋＤａ）、成熟型（約１９ｋＤａ）のＶＥＧＦであり、最も小さいバンド（約１６ｋＤａ）は分解産物もしくは非修飾型のＶＥＧＦであると思われる。一次構造から推定される成熟型ＶＥＧＦ１２０の分子量は１４ｋＤａであるが、翻訳後に糖鎖修飾を受けて分子量が大きくなることが知られている。図２の右図は、系統１のＴＧマウスについて各脳領域のタンパク標本をＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔで分析したものである（Ｔｏｔａｌ：脳全体、Ｏｂ：嗅球、Ｃｔ：大脳皮質、Ｈｐ：海馬、Ｓｔ：線条体、Ｔｈ：視床、Ｃｂ：小脳）。図からわかるように、大脳皮質、海馬、線条体で特にＶＥＧＦの発現が強く見られた。この結果は、ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎによるｍＲＮＡの発現分布と一致している。すなわち、タンパク質レベルでもＴＧマウスの前脳においてＶＥＧＦが過剰に産生されていることが判明した。
【００７７】
実施例４： ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの脳におけるＶＥＧＦタンパク質の経時的発現
ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの系統１についてＶＥＧＦ１２０の過剰発現が確認されたが、前述の実験は６週齢のマウスついて行ったものであった。そこで、週例の異なるマウスからタンパク質標本を調製し、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法を用いてＶＥＧＦ１２０の発現量を調べることにした。
【００７８】
６、１０、３０、５０週齢のＴＧマウス、及び６週齢のＷＴマウスの海馬を摘出し、タンパク質標本をＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔで分析した。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法の原理については、前述の通りである。この実験では、検出するタンパク質として、ＶＥＧＦのほか、ＶＥＧＦ受容体２（Ｆｌｋ−１）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、及び内部標準としてβ−チューブリン（β−Ｔｕｂｕｌｉｎ）の解析を行った。結果を図３に示す。図３に示すように、ＴＧマウスにおいてＶＥＧＦ１２０（ここでは成熟体のみを示している）は、６、１０、３０、５０週齢の全てにおいて発現が確認され、ほぼ一定であることがわかった。これは、用いたＣａＭＫＩＩのプロモーターの発現様式と一致しており、一生の間発現が継続することを示唆している。また、ＶＥＧＦの受容体であるＦｌｋ−１についても同様な結果が得られ、発現のレベルはほぼ一定であることがわかった。リガンドが多量に存在すると、その受容体の発現量が低下する現象（受容体のダウンレギュレーション）が見られることがある。しかし、ＶＥＧＦの過剰発現（生後２、３週齢より始る）にもかかわらず、Ｆｌｋ−１の発現は一定であることから、ダウンレギュレーションによってＶＥＧＦシグナル伝達系の不活性化は起っていないと考えられる。ＶＥＧＦ以外の成長因子としてＢＤＮＦを検出したところ、この因子は週例とともに徐々に発現量が減少する傾向にあることがわかった。内部標準として用いているβ−Ｔｕｂｕｌｉｎは主要な細胞骨格タンパク質であり、どの細胞、どの時期においてもほぼ一定に産生されている。この結果からもわかるように、ほかのタンパク質の変化にも関わらず、一定量の発現が見られている。
【００７９】
実施例５：ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの海馬神経細胞におけるＶＥＧＦ１２０の発現
本実験は、神経細胞においてＶＥＧＦ１２０タンパク質が過剰に発現されているかどうかを調べるために行う。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法では、組織をすり潰して得られる試料を分析するため、異なる細胞種における発現様式が解析できない。そのため、免疫組織化学染色法を用いて、細胞レベルでの解析をおこなう。
【００８０】
免疫組織化学染色法は、組織の切片に抗体を反応させることによって、目的とするタンパク質を特異的に検出する方法である。ここでは蛍光抗体法による免疫化学染色を行う。これはまず、組織の切片を調製してそれを１次抗体（例、抗ＶＥＧＦウサギ抗体）と反応させて、次に、１次抗体に対して蛍光標識された２次抗体（例、Ｃｙ５標識‐抗ウサギＩｇＧロバ抗体）とを反応させる。この操作で、目的とするタンパク質が存在している部分が特異的に蛍光染色される。切片を蛍光顕微鏡下で観察し、どの細胞でタンパク質が発現しているかを調べる。
【００８１】
６週齢のＷＴ及びＴＧマウスから脳組織を摘出し、４０μｍ厚の冠状切片を作製した。結果を図４に示す。図４は、海馬を含む脳切片について蛍光抗体法によるＶＥＧＦの免疫化学染色を行い、海馬の歯状回（ＤＧ、左側の２枚の写真）とＣＡ１領域（ＣＡ１、右側の２枚の写真）について観察したものである（スケール：１００μｍ）。サイト１３グリーン（Ｓｙｔｏ１３ ｇｒｅｅｎ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社）による核染色も同時に行った。ＶＥＧＦを赤色、細胞核を緑色で示した。ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスにおいて、海馬歯状回の顆粒細胞と海馬ＣＡ１領域の錐体細胞の両神経細胞において蛍光が検出されたことから、神経細胞でＶＥＧＦ１２０が発現していることが分かる。
【００８２】
実施例６： ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスにおける脳の比較
本発明者らは実験を通して、ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの脳はＷＴマウスと比較するとやや大きい印象を得ていた。そのため、両マウスの脳を比較することにした。
【００８３】
ＷＴ及びＴＧマウスの脳を取り出して、形態及びその重量を比較する。また、体重を測定することによって、体重に対する脳重量の比を算出することができる。
【００８４】
６週齢のＷＴ及びＴＧマウスから脳組織を摘出し、それを並べて比較した。結果を図５に示す図５に示すように、ＷＴマウスに比べると、ＴＧマウスの脳は大きく、特に前脳が肥大していることが分かる。また、ＴＧマウスの脳は赤味を帯びており、脳表面の血管（図では前大脳動脈や中大脳脳動脈が明瞭に観察される）。これは、ＶＥＧＦによる細胞増殖と血管新生の促進による影響であることが考えられる。
【００８５】
次に、１５週齢の雄マウスについて、脳重量と体重について比較した。結果を図６に示す。図６に示すように、ＷＴマウスに比べてＴＧマウスは約２割も脳重量が増加していることが判明した（ＷＴマウス：４６４．３±４．２ｍｇ、ＴＧマウス：５７０．９±１２．２ｍｇ；対応のないスチューデントｔ−検定（ｕｎｐａｉｒｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）による検定でＰ＜０．０１）。一方、体重においてはＴＧマウスが１割ほど軽いことがわかった（ＷＴマウス：３３．２±０．８ｇ、ＴＧマウス：２９．７±１．１ｇ；ｕｎｐａｉｒｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔによる検定でＰ＜０．０１）。結果として、体重に対する脳重量の比でみるとＴＧマウスで３７％の増加となっていた（ＷＴマウス：１．４３±０．０２％、ＴＧマウス：１．９５±０．０８％；ｕｎｐａｉｒｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔによる検定でＰ＜０．０１）。この結果により、ＴＧマウスの脳は有意に大きくなっていることがわかった。
【００８６】
実施例７： ＶＥＧＦ１２０−ＴＧ マウスの脳における細胞数の変化
ＷＴマウスにくらべてＴＧマウスの脳は有意に大きくなっていることから、脳組織中の細胞増殖が促進されていることが考えられた。そのため、細胞増殖の程度を定量的に解析することにした。
【００８７】
ＷＴ及びＴＧマウスの脳から切片を作製し、これを核染色及び神経細胞の免疫組織染色を行う。核はそれぞれの細胞に存在することから、核染色によって細胞数を調べることができる。また、神経細胞に特異的なタンパク質であるＮｅｕＮの発現を指標として個々の神経細胞を同定し、脳組織中の神経細胞数を調べることができる。この実験によって、細胞数及び神経細胞数に差があるかどうか定量的に比較することができる。
【００８８】
６週齢のＷＴ及びＴＧマウスより脳を摘出し冠状切片を作製した。大脳皮質及び線条体を含む切片について、ｓｙｔｏ１３ ｇｒｅｅｎによる核染色（緑色）及びＮｅｕＮ（青色）に対する免疫組織染色を行い、図７に示すような結果を得た。ＴＧマウスでは明らかに細胞核の密度が高くなっていることがわかる（スケール：２００μｍ）。次に、これらの画像をもとに、単位体積あたりの細胞数及び神経細胞数を定量的に調べたのが図８である。細胞密度についてみてみると、大脳皮質と線条体においてともにＴＧマウスが３割程増加していることがわかった（遺伝子型による効果：Ｆ１，２８＝７２．６０，Ｐ＜０．０００１、相互作用による効果は有意差なし； ｔｗｏ−ｗａｙ ｆａｃｔｏｒｉａｌ ＡＮＯＶＡ（２方向性要因分散分析）による検定）。次に、神経細胞密度についてみると、大脳皮質及び線条体ともにＷＴ及びＴＧマウスの間で変化がみられないことがわかった（遺伝子型による効果：Ｆ１，２８＝０．１８，Ｐ＝０．６７、相互作用による効果は有意差なし；ｔｗｏ−ｗａｙ ｆａｃｔｏｒｉａｌ ＡＮＯＶＡによる検定）。しかし、ＴＧマウスでは脳の体積が大きくなっていることを考慮すると、神経細胞数は総和として増加している可能性がある。これらの結果より、ＴＧマウスの脳においては細胞増殖が有意に増加していることが明らかになった。
【００８９】
実施例８： ＶＥＧＦ１２０−ＴＧ マウスの脳における細胞増殖の程度
ＴＧマウスの脳では細胞密度が高くなっていることから、細胞分裂の速度が増加していることが示唆される。これを定量的に解析するために、分裂細胞を特異的に標識してその数を測定することにした。
【００９０】
分裂細胞ではＤＮＡの複製が盛んに起こっていることから、化学標識された核酸を動物に投与することによって、ｉｎ ｖｉｖｏで体内のすべての分裂細胞を標識することができる。核酸類似物質としては、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（５−ｂｒｏｍｏ−２’−ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ）（ＢｒｄＵ）を用い、ＤＮＡ合成時にチミジンと間違って取り込まれることによって、分裂細胞の染色体ＤＮＡが特異的に標識される。ＢｒｄＵを体重当たり１００ｍｇ／ｋｇ、投与量を１０ｍｇ／ｍｌとして腹腔内投与し、２時間後に動物を４％パラホルムアルデヒド溶液を用いて灌流固定する。この操作によって、２時間の間で分裂していた細胞が ｉｎ ｖｉｖｏ標識されることになる。ＢｒｄＵで特異的に標識された細胞は、抗ＢｒｄＵ抗体を用いた免疫組織染色によって検出することができる。蛍光画像を解析し、単位面積あたりのＢｒｄＵ陽性細胞の数を測定し、切片の厚さを考慮することによって、単位体積あたりの分裂細胞数を調べることができる。この数を比較することで、細胞分裂の程度を定量的に比較することが可能となる。
【００９１】
６週齢のＷＴ及びＴＧマウス、それぞれ３匹を実験に使用した。動物にＢｒｄＵを腹腔投与して、分裂細胞を２時間標識した。灌流固定後、マウスの脳より４０μｍ厚の冠状切片を調製し、免疫組織染色によりＢｒｄＵで標識された分裂細胞を検出した。図９に結果を示す（スケール：２ｍｍ）。図９では、大脳皮質と線条体を含む領域を観察した図を示している。上の２枚の写真は位相差顕微鏡による画像を、下の２枚の写真はＢｒｄＵの蛍光画像を示し、ＷＴ及びＴＧマウスの脳切片を、それぞれ左側と右側に配置している。分裂細胞は、ＷＴマウス及びＴＧマウスにおいて、同様な分布を示し、特に側脳室の上衣、外套、で多く観察された。しかし、分裂細胞の数はＴＧマウスにおいて増加していることが確認され、大脳皮質や線条体では分裂細胞の数は比較的に少ないが、ＴＧマウスにおいてはその部分においても増加していた。それを定量的に測定した結果を図１０に示す。大脳皮質及び線条体における分裂細胞数はＴＧマウスにおいて３〜５倍増加していた（大脳皮質−ＷＴマウス：１０９±１６ｃｅｌｌｓ／ｍｍ3、ＴＧマウス：４２０±１５ｃｅｌｌｓ／ｍｍ3；線条体−ＷＴマウス：６５±７ｃｅｌｌｓ／ｍｍ3、ＴＧマウス：３６８±１６ｃｅｌｌｓ／ｍｍ3；遺伝子型による効果：Ｆ１，８＝２１５．３２，Ｐ＜０．０００１、相互作用による効果は有意差なし； ｔｗｏ−ｗａｙ ｆａｃｔｏｒｉａｌ ＡＮＯＶＡによる検定）。
【００９２】
実施例９： ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスにおける海馬の肥大
前項で大脳皮質と線条体における解析を行ったが、次に海馬について比較することにした。
【００９３】
ＷＴ及びＴＧマウスから海馬を取り出し、吻側から尾側へ２５０μｍ毎に５０μｍ厚の切片を得る。これを、ｓｙｔｏ１３ ｇｒｅｅｎにより核染色し、海馬の神経細胞層を可視化する。まず、海馬及び歯状回の顆粒細胞層の断面積を測定し、次に各切片から得られた面積から体積を得る。算出された海馬の体積、及び歯状回の体積から、ＶＥＧＦが海馬の細胞増殖にたいする効果を比較する。
【００９４】
６週齢のＷＴ及びＴＧマウスをそれぞれ４匹を実験に使用した。マウス脳より海馬を取り出し、吻側から尾側へ向かって２５０μｍ毎に５０μｍ厚の切片を得る。これらの切片をｓｙｔｏ１３ｇｒｅｅｎにより核染色し、写真を撮った。結果を図１１に示す。図１１においてその一例である（ＷＴマウスは左図、ＴＧマウスは右図に示す、スケールは１ｍｍ）。各切片について、海馬（海馬台と海馬采を除く）及び顆粒細胞層について断面積を求めた結果を図１２に示す。ＴＧマウスの海馬及び顆粒細胞層についてＷＴマウスのものよりも大きくなっていることがわかる。このデータをもとに、体積を求めた結果を図１３に示す。ＷＴマウスと比べてＴＧマウスの海馬は有意に大きくなっていることがわかる（ＷＴマウス：０．４６０±０．０１５ｍｍ3、ＴＧマウス：０．７２１±０．０２６ｍｍ3；ｕｎｐａｉｒｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔによる検定でＰ＜０．００１）。同様に、歯状回の顆粒細胞層も有意に大きくなっていることがわかった（ＷＴマウス：１２．５２６±０．２３３ｍｍ3、ＴＧマウス：１５．４９１±０．２８４ｍｍ3；ｕｎｐａｉｒｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔによる検定でｐ＜０．００１）。
【００９５】
実施例１０：ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスにおける神経新生
ＴＧマウスの海馬が大きいことから、細胞新生が盛んになっていることが予想された。海馬は神経細胞が特に盛んな領域であり、顆粒細胞層（海馬歯状回の神経細胞層）の拡大は神経新生の増大によるものと考えることができる。そこで、ＢｒｄＵ標識によって分裂細胞を特異的に検出し、その細胞密度を定量的に比較することにした。
【００９６】
前述の通り、核酸類似体であるＢｒｄＵを動物に投与して、分裂細胞を特異的に標識する。海馬領域について２００μｍおきに厚さ４０μｍの冠状切片を作製し、抗ＢｒｄＵ抗体を用いて免疫組織染色を行う。ＢｒｄＵ陽性細胞である分裂細胞は蛍光により同定する。同時にｓｙｔｏ１３ｇｒｅｅｎを用いて細胞核を染色し、海馬歯状回の顆粒細胞層を可視化する。神経前駆細胞は顆粒細胞下層（ｓｕｂｇｒａｎｕｌａｒ ｚｏｎｅ， ＳＧＺ）に多く存在することから、ほとんどのＢｒｄＵ陽性細胞はこの領域で見いだされる。そのため、顆粒細胞下層に沿ってＢｒｄＵ陽性細胞数を計測することによって、分裂細胞の密度を求めることができる。分裂細胞の密度としては、顆粒細胞下層の単位長さあたりのＢｒｄＵ陽性細胞の数とし（細胞数／ｍｍ ＳＧＺ）、これは同一個体の海馬のどの部分においてもほぼ一定であること知られている。
【００９７】
６週齢のＷＴ及びＴＧマウスをそれぞれ１０匹実験に使用した。マウスの海馬を含む領域２００μｍおきに冠状切片を得て（領域：海馬の吻側末端から１２００μｍの位置に始まって１８００μｍの位置まで）、１個体あたり約４−６片を実験に用いた。抗ＢｒｄＵ抗体による免疫組織染色とｓｙｔｏ１３ ｇｒｅｅｎによる核染色を施し、各切片の左右の海馬歯状回について写真を撮った（合計８−１２枚の画像）。図１４に結果を示す。図１４では、ＷＴ及びＴＧマウスの歯状回におけるＢｒｄＵ陽性細胞の免疫染色画像（白黒）を示しており、各画像の右上に挿入された図は、同一領域の核染色画像（緑色）である（スケール：２００μｍ）。緑色で示された顆粒細胞層より下の細胞層が顆粒細胞下層（ＳＧＺ）であり、神経前駆細胞が豊富に存在している部分である。ＷＴ及びＴＧマウスともに、ＢｒｄＵ陽性細胞の多くが顆粒細胞下層に存在していることがわかる。予想通り、ＴＧマウスでより多くの増殖細胞がみられることが分かる。これらの画像をもとに、各個体からＢｒｄＵ陽性細胞の密度（ＢｒｄＵ陽性細胞数／ｍｍ ＳＧＺ）の平均を求めた結果を図１５に示す。この解析によって、ＴＧマウスはＷＴマウスに比べて、海馬歯状回の顆粒細胞下層における分裂細胞の密度が約２倍になっていることが判明した（ＷＴマウス： ４．９８±０．５８ｃｅｌｌｓ／ｍｍ ＳＧＺ、ＴＧマウス：１０．４７±１．６３ｃｅｌｌｓ／ｍｍ ＳＧＺ；Ｗｅｌｃｈ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔによる検定でＰ＜０．０１）。このことから、ＶＥＧＦは海馬において細胞増殖を有意に促進していることが明らかとなった。また、顆粒細胞下層における分裂細胞のほとんどは神経前駆細胞であると考えられることから、神経新生が盛んになっていると考えられる（神経新生については、後述の実施例で証明している）。
【００９８】
実施例１１：ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの海馬における細胞新生の程度
ＶＥＧＦは海馬における神経新生を著しく増加させることを示したが、別の刺激を与えることによってさらに細胞新生が促進されるかどうかを調べることにした。これは、ＶＥＧＦによって細胞新生が飽和レベルまで活性化されているかどうかを調べるためである。
【００９９】
海馬歯状回における分裂細胞の測定は前述の実施例に従う。ここでは、海馬での神経新生を効果的に促進する刺激として随意運動を用いることとし、げっ歯類においては廻し車を飼育箱に設置することによって随意的に運動をさせることができる。ＷＴ及びＴＧマウスをそれぞれ２群に分けて、廻し車（直径１６ｃｍ、奥行き８．５ｃｍ）を設置したものとそうでない飼育箱（幅２５ｃｍ、高さ３５ｃｍ、奥行き４０ｃｍ）に入れて３週間飼育する。廻し車の回転は、赤外線センサーが付属したデジタルカウンターで自動計測する。回転数と廻し車の円周（約５０ｃｍ）より、走行距離を算出することができる。マウスは飼育箱に入れられたあと、徐々に廻し車で運動するようになり、３週間後の時点では、１匹について１日あたり約２ｋｍ走るようになる。その後、核酸類似体であるＢｒｄＵをマウスに投与することによって分裂細胞を標識し、海馬歯状回におけるＢｒｄＵ陽性細胞の密度を測定する。
【０１００】
６週齢のＷＴ及びＴＧマウスをそれぞれ対照群と運動群の２群に分けて実験を行った。用いた動物数は、ＷＴマウスの対照群と運動群でそれぞれ６、７匹、ＴＧマウスの対照群と運動群でそれぞれ６、５匹である。３週間廻し車で随意運動したものとそうでないマウスに対し、ともにＢｒｄＵを投与し分裂細胞を標識した。灌流固定後、マウスから脳を取り出し、これより海馬を含む領域について冠状切片を作成した（前述の通り）。これらを、抗ＢｒｄＵ抗体を用いた免疫組織染色とｓｙｔｏ１３ ｇｒｅｅｎによる核染色を行い、顆粒細胞下層におけるＢｒｄＵ陽性細胞の密度を測定した。図１６にその結果を示す。まずＷＴマウスについてみてみると、運動群は対照群とくらべて分裂細胞の密度が約４０％も上昇していることがわかった（ＷＴマウス対照群：４．４３±０．５７ｃｅｌｌｓ／ｍｍＳＧＺ、ＷＴマウス運動群：６．３５±０．２９ｃｅｌｌｓ／ｍｍＳＧＺ；ｕｎｐａｉｒｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ による検定でＰ＜０．０１）。しかし、ＴＧマウスついてみると、随意運動による促進効果はみられないことがわかった（ＴＧマウス対照群：１１．２０±２．６７ｃｅｌｌｓ／ｍｍ ＳＧＺ、ＴＧマウス運動群：１１．９３±１．６５ｃｅｌｌｓ／ｍｍ ＳＧＺ；ｕｎｐａｉｒｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔによる検定でＰ＝０．８３）。また、分裂細胞の密度は、ＷＴマウスと比べてＴＧマウスのほうが高くなっている（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ ｔｅｓｔによる検定でＰ＜０．０１）。この結果から、ＴＧマウスの歯状回における細胞分裂はほぼ飽和レベルに達していると思われ、ＶＥＧＦ１２０が十分に細胞新生を促進していることが考えられる。
【０１０１】
実施例１２： ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの海馬歯状回における神経前駆細胞の観察
ＴＧマウスの海馬歯状回において細胞新生が促進されていることが明らかとなった。それらの分裂細胞は神経前駆細胞である可能性が高い。そのため、実際にそうであるのか検証するために、神経前駆細胞の検出をおこなった。
【０１０２】
中枢神経系における神経前駆細胞は、ネスチン（Ｎｅｓｔｉｎ）とよばれる中間系繊維タンパク質を発現している。すなわち、このタンパク質を指標とすることによって、免疫組織染色法を用いて神経前駆細胞の分布を調べることができ、またＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法を用いるとＮｅｓｔｉｎタンパク質の発現量を比較することができる。実験では、ＷＴ及びＴＧマウスの海馬より得たタンパク質標本を用いて比較を行った。
【０１０３】
６週齢のＷＴ及びＴＧマウスから、海馬領域を含む冠状切片を作製した。抗Ｎｅｓｔｉｎ抗体（ウサギ由来モノクローナル抗体、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社）を用いて免疫組織染色を行った。ここでは、ＢｒｄＵに対する免疫組織染色（赤色）及びｓｙｔｏ１３ ｇｒｅｅｎによる核染色（緑色）を同時に行っている。図１７に示すように、ＴＧマウスはＷＴマウスに比べて、Ｎｅｓｔｉｎの免疫染色（青色）が強い（スケール：２００μｍ）。ＷＴマウスについてみると、Ｎｅｓｔｉｎ陽である神経前駆細胞は、海馬歯状回の顆粒細胞下層に沿って存在していることがわかる。それに対して、ＴＧマウスにおいては、Ｎｅｓｔｉｎ陽性細胞が歯状回の顆粒細胞下層のみならず、顆粒細胞層に挟まれた海馬門部（多形細胞層）にも多数散在していることがわかった。次に、海馬より得たタンパク質試料をＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法で解析することによって、Ｎｅｓｔｉｎタンパク質の発現量を比較することにした。ＷＴ及びＴＧマウスそれぞれ２匹を実験に用いた。図１８に示すように、Ｎｅｓｔｉｎタンパク質（〜１４０ｋＤａ）はＴＧマウスにおいて顕著に発現していることが確認された（分子量マーカー：上から１０３，７７，５０，３４ｋＤａ）。内部標準として用いたβ−Ｔｕｂｕｌｉｎ（〜５１ｋＤａ）の量は、それぞれについてほぼ同程度であり、等量のタンパク質が分析されていることがわかる。すなわち、ＴＧマウスでは明らかにＮｅｓｔｉｎの発現レベルが高くなっており、神経前駆細胞の数が増加しているものと考えられる。
【０１０４】
実施例１３：ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの海馬歯状回における未熟神経細胞の増加
ＴＧマウスの脳では神経前駆細胞の数が有意に増加していたことから、神経細胞の新生が盛んになっていることが考えられる。これを検証するために、未熟神経細胞を免疫組織染色により同定し、神経新生の程度を調べることにした。
【０１０５】
ダブルコルチン（Ｄｏｕｂｌｅｃｏｒｔｉｎ）（Ｄｃｘ）は、中枢神経系の未熟神経細胞で特異的に発現する構造タンパク質である。抗Ｄｃｘ抗体を用いて免疫組織染色を行えば、未熟な神経細胞の組織における分布や細胞構造を調べることができる。ＷＴマウスとＴＧマウスの未熟神経細胞を比較することにより、神経新生の様子を観察することができる。
【０１０６】
６週齢のＷＴ及びＴＧマウスをＢｒｄＵで標識し、１０週齢の時点で動物を灌流固定した。海馬領域を含む冠状切片を作製し、抗Ｄｃｘ抗体（ウサギ由来クローナル抗体、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社）と抗ＮｅｕＮ抗体による免疫染色組織染色、およびｓｙｔｏ１３ｇｒｅｅｎによる核染色を行った。また同時に、ＢｒｄＵに対する免疫組織染色（赤色）を行っている。図１９に海馬歯状回の蛍光染色画像を示している（スケール：５０μｍ）。左側の２枚はＷＴマウス、右側の２枚にはＴＧマウスの画像を示している。Ｄｃｘ免疫染色（緑色）のみの免疫染色画像とＮｅｕＮ（青色）とＢｒｄＵ（赤色）を重ね合わせた免疫染色画像を示している。
図１９から明らかなように、ＴＧマウスの脳ではより多くの未熟神経細胞が存在していることがわかる。ＷＴのＤｃｘ染色で分かるように、通常、未熟神経細胞は顆粒細胞層でもっとも内側にその細胞体が存在し、頂上樹状突起及び基底樹状突起を伸長している。ところが、ＴＧマウスでは、未熟細胞が顆粒細胞層のあらゆる場所に存在し、樹状突起の発達も著しいことがわかった。また、生まれてから４週間を経たＢｒｄＵ陽性細胞は、そのほとんどが神経細胞の指標タンパク質であるＮｅｕＮと共染色されていることから、神経細胞に分化していることが考えられる。Ｄｃｘの場合と同様に、より成熟化した若い神経細胞についても、通常そのほとんどが顆粒細胞の最内側に存在しているが、ＴＧマウスでは顆粒細胞層の中央もしくは外側まで分布していた。これは、ＴＧマウスにおいて新しく作られた神経細胞がより早く発達しているものと捉えることができる。これらの結果から、ＶＥＧＦは神経新生を促していることが証明され、神経細胞の成熟化にも正に作用している可能性がある。
【０１０７】
実施例１４： ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの海馬歯状回における新生細胞の分化
海馬歯状回でみられる分裂細胞のほとんどは神経前駆細胞であることが知られている。しかし、ＶＥＧＦが細胞の分化に変化を与えている可能性があるため、海馬歯状回における分裂細胞がどのような細胞に分化しているのかについて、調べることにした。
【０１０８】
分裂細胞はＢｒｄＵを投与することによってｉｎ ｖｉｖｏで標識することができる。したがって、細胞が分化するために十分な時間（４週間）を与えた後で、それらの細胞を観察することで調べることができる。本実験では、６週齢のマウスにＢｒｄＵを４回投与し（１日１回、４日間）、４週間後の１０週齢の時点で動物を固定する。得られた脳から海馬を含む領域について冠状切片を作製し（前述の通り）、ＢｒｄＵ及び各種細胞マーカーに対する免疫組織染色を行う。細胞特異的マーカーとしては、神経細胞に対してはＮｅｕＮ、アストロサイトに対してはグリア細胞繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）を用いる。すなわち、切片をＢｒｄＵ、ＮｅｕＮ、ＧＦＡＰについて３重染色する。海馬歯状回の顆粒細胞層を観察して、ＢｒｄＵに陽性である細胞について、それらがＮｅｕＮもしくはＧＦＡＰと共染色されているか、又はＮｅｕＮやＧＦＡＰともに陰性であるかどうかを調べる。この操作よって、生まれてから４週間を経た細胞が、神経細胞、アストロサイト、もしくはその他の細胞に分化していることを調べることができる。
【０１０９】
６週齢のＷＴ及びＴＧマウスをＢｒｄＵで標識し、１０週齢の時点で動物を灌流固定した。海馬を含む脳領域について冠状切片を作製し、免疫染色を行った。神経細胞及びアストロサイトを検出するために、抗Ｎｅｓｔｉｎ抗体（マウスモノクローナル抗体、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社）と抗ＧＦＡＰ抗体（ウサギポリクローナル抗体、Ｓｉｇｍａ社）を用いている。図２０は、ＢｒｄＵ（赤色）、ＮｅｕＮ（緑色）、ＧＦＡＰ（青色）について海馬歯状回領域の免疫組織染色画像である（スケール：５０μｍ）。ＷＴマウスにおいては、ＢｒｄＵ陽性細胞の多くはＮｅｕＮと共染色されていることから、神経細胞に分化していることがわかる。また、これらの若い神経細胞は、顆粒細胞層の最も内側に存在していることがわかる。ＴＧマウスでも多くのＢｒｄＵ陽性細胞が神経細胞に分化していることがわかるが、それらは顆粒細胞層の内側だけでなく中央部や外側にも分布していた。どのような細胞に分化したのかついて、定量的に調べたのが図２１である。海馬歯状回の顆粒細胞下層で生まれたほとんどの細胞は（約８０％）、顆粒細胞層で神経細胞（顆粒細胞）に分化しており、アストロサイトは１％程度であった（神経細胞−ＷＴマウス：８０．２±２．３％、ＴＧマウス：７６．５±２．９％； アストロサイト−ＷＴマウス：０．６±０．５％、ＴＧマウス：０．５±０．３％；その他の細胞種−ＷＴマウス：１９．２±２．１％、ＴＧマウス：２３．０±３．０％；スチール−ドワス検定（Ｓｔｅｅｌ−Ｄｗａｓｓ’ｓ ｔｅｓｔ）による検定で両遺伝子型で有意差なし）。このことから、ＶＥＧＦは神経前駆細胞由来の新生細胞の分化に影響を与えないことがわかった。また、図２２に示すように、顆粒細胞層におけるＢｒｄＵ陽性細胞の数を比較してみた。ＷＴ及びＴＧマウスをそれぞれ４匹について調べたところ、ＴＧマウスでは顆粒細胞層におけるＢｒｄＵ陽性細胞の数はほぼ２倍になっていた（ＷＴマウス：４．５８±０．２４ｃｅｌｌｓ／ｍｍ3、ＴＧマウス：９．７８±１．１７ｘ１０3ｃｅｌｌｓ／ｍｍ3；Ｗｅｌｃｈ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔによる分析でＰ＜０．００１）。これは、前述の６週齢のマウスの顆粒細胞下層において、分裂細胞の数がほぼ２倍になっていた事実と一致している。
【０１１０】
実施例１５： ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの脳における血管新生
ＶＥＧＦはもともと血管新生を促進する因子として見出された。そのためＶＥＧＦ１２０を前脳で発現するマウスでは、毛細血管の新生がどのようになっているかを調べる必要がある。そこで、ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの脳において血管構造を調べることにした。
【０１１１】
血管構造を可視化する方法として、レクチンによる染色法を用いた。Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ（トマト）のレクチンは、血管内皮細胞（血管の内皮を構成する細胞）の膜上に発現している糖鎖を特異的に認識する（Ｔｈｕｒｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。この性質を利用して、トマトレクチンを循環系に灌流したり、あるいは組織切片に作用させたりすることで血管構造を可視化することができる。実際的には、まず、ビオチン（ビタミンＢの一種）化されたトマトレクチンを作用させ、次に蛍光物質で化学標識されたアビジン（卵白由来糖タンパク質）を作用させる。アビジンとビオチンは非常に高い親和性を持つことから、上記の操作により、トマトレクチンが存在する部分が蛍光物質で特異的に染色されることになる。レクチンで染色された切片を蛍光顕微鏡で観察することによって、血管構造を可視化することができる。
【０１１２】
６週齢のＷＴ及びＴＧマウスから脳を取り出し、４０μｍ厚の冠状切片を作製した。解析に使用した脳領域は、大脳皮質、海馬、小脳である。脳切片をビオチン化されたトマトレクチンと反応させた。次に、Ｃｙ５標識アビジンと反応させ、図２３に示すような蛍光画像を得た（スケール：５００μｍ）。図から明らかなように、ＴＧマウスの海馬歯状回や大脳皮質では顕著な血管形成が観察されたが、小脳ではＷＴマウスと同程度であった。
次にこれを定量することにした。毛細血管の数の測定は困難であるため、単位面積当たりの蛍光強度について比較することにした。ＷＴ及びＴＧマウスを各群２−３匹用いて、ＷＴマウスの小脳におけるレクチン染色の蛍光強度を１として、比較を行った。図２４にその結果を示す。ＴＧマウスの海馬（歯状回とＣＡ１領域）と大脳皮質では血管新生が促進されていたが、小脳では変化がみられなかった（歯状回−ＷＴマウス：１．３１±０．０２、ＴＧマウス：２．５２±０．２２；ＣＡ１領域−ＷＴマウス：０．９３±０．１８、ＴＧマウス：１．４８±０．１９；大脳皮質−ＷＴマウス：１．１５±０．１６、ＴＧマウス：１．５４±０．１９；小脳−ＷＴマウス：１．００±０．０５、ＴＧマウス：０．８９±０．０５）。この結果は、ＴＧマウスの前脳において血管新生が促進されていることを示す。血管形成が前脳に限られた理由としては、ＶＥＧＦ１２０の発現に用いたＣａＭＫＩＩのプロモーターは、前脳に特異的であり、小脳ではほとんど働かないためである。
【０１１３】
実施例１６： ＶＥＧＦ１２０による血管径の拡張
レクチンを用いた血管構造の解析で、ＴＧマウスでは脳血管の数が増えているだけではなく、血管自体も大きくなっているような印象を得た。そこで、本実験では血管径について定量的に測定することにした。
【０１１４】
前述のようにトマトのレクチンを用いて血管構造を可視化する。測定する領域として、ＴＧマウスの脳で血管新生が特に盛んである海馬歯状回の門部（多形細胞層）を選択する。ＷＴ及びＴＧマウスの脳切片についてレクチン染色を行い、海馬歯状回の門部にある毛細血管を無作為に選ぶ。画像解析プログラムとしてＬＳＭイメージブラウザー（ＬＳＭ Ｉｍａｇｅ Ｂｒｏｗｓｅｒ）（Ｚｅｉｓｓ）を用い、個々の毛細血管の短径を測定する。ＷＴ及びＴＧマウスの脳血管の直径を比較することによって、ＶＥＧＦが血管の発達に関係しているかどうかを調べることができる。
【０１１５】
６週齢のＷＴ及びＴＧマウスをそれぞれ３匹実験に使用した。海馬を含む脳の冠状切片についてレクチン染色を行った。海馬歯状回の門部（顆粒細胞層に挟まれた領域）より蛍光画像を得て、無作為に合計２００本の毛細血管を抽出し、それぞれについて短径を測定した。図２５は、その結果をヒストグラム及び累計曲線で表したものである。海馬における毛細血管の直径は、ＷＴマウスに比べてＴＧマウスのほうが有意に大きくなっていることがわかる（ＷＴマウス：６．１±０．１μｍ、ＴＧマウス：１０．２±０．２μｍ；ｕｎｐａｉｒｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔによる検定でＰ＜０．０００１）。すなわち、ＶＥＧＦは、新たに血管を形成する作用に加えて、血管径を拡張させる作用も有していることがわかる。
【０１１６】
実施例１７：ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの脳における脳内浸潤実験
ＶＥＧＦは血管内皮細胞に直接的に作用することから、血液脳関門の浸透性に変化がみられる可能性があった。そのため、血液脳関門が血液中の物質を排除する程度について調べることにした。
【０１１７】
脳血液関門の浸透性について調べる方法として、水溶性色素を利用する方法がある。水溶性の青色色素であるエバンスブルー（Ｅｖａｎｓ ｂｌｕｅ）は、生体に無害であり、血液脳関門によって排除される。Ｅｖａｎｓ ｂｌｕｅ溶液をマウスの尾静脈から静脈投与すると、色素は循環系を通じて全身に行き渡る。血管中の色素はしだいに組織へと浸透し、脳を除くほとんどの組織は青色に着色する。一方、血液脳関門が存在する脳組織においては色素の浸透が少ない。すなわち、ＶＥＧＦがもし血液脳関門の浸透性を高める効果があるならば、色素により脳組織が着色することになる。ＷＴ及びＴＧマウスについて比較することで、ＶＥＧＦの血液脳関門に対する効果を知ることができる。
【０１１８】
６週齢のＷＴ及びＴＧマウスを実験に使用した。１％Ｅｖａｎｓ Ｂｌｕｅを０．９％生理食塩水に溶かしてフィルター濾過した溶液を、マウス尾静脈より２００μｌ静脈投与した。２４時間後、マウスを麻酔してＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）で灌流した。これは、血液中の色素を洗い流して、組織中に浸透した色素のみを観察するために行う（２４時間後、青色の色素の大半は血液中から失われており、血液は通常の赤色を呈している）。灌流後、開腹したマウスを腹側から見たものが図２６である。ここでは、色素を投与していないＷＴマウス（１番目）、色素を投与したＷＴマウス（２番目）、色素とともにセロトニン（５−ＨＴ；血液脳関門の弛緩を促す）を投与したＷＴマウス（３番目）、色素を投与したＴＧマウス（４番目）を示している。図から明らかなように、色素を投与していないマウスでは、内臓組織はやや赤い褐色を呈しているが、色素を投与した全てのマウスで、内臓組織は濃い青色を呈していることがわかる。これらのマウスより脳組織を取り出して、頭頂より見たものが図２７である。色素を投与していないＷＴマウスでは、灌流後、脳は白色を呈している。色素を投与したＷＴマウスの脳もほぼ白色であり、青色は非常に薄い。これを内臓組織と比べると染色の程度に顕著な違いがあることが分かり、脳組織への色素の浸透を阻害する血液脳関門の存在が明らかである。また、色素とともにセロトニンを投与したＷＴマウスについても、脳はほぼ白色である。しかし、色素のみと比べるとやや青みを帯びていることがわかる。一方、ＴＧマウスの脳は明瞭に青色を呈している。これは、ＶＥＧＦ１２０の発現によって血液脳関門が緩くなっていることを意味している。しかし、ＴＧマウスの脳における染色の程度は、内臓組織でみられた深い青と比べると明らかに薄いことから、血液脳関門の機能が完全に失われているのではないことが分かる。また、ＶＥＧＦ１２０は前脳で発現していることから、前脳にくらべて小脳の染色の度合いが低くなっていることがわかる。
【０１１９】
実施例１８：ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの抗不安様行動１
不安に対するＶＥＧＦの効果を調べるために、オープンフィールド試験を行った。
【０１２０】
オープンフィールド試験では、周囲を壁で囲まれた広く明るい平坦な空間（オープンフィールド）に動物を入れて、その行動を観察する。例えば、マウスなどの動物は、隠れるところがない広い場所や明るい場所を忌避して、周囲の壁に沿って移動する性質（接触走性）を示す。そのような性質は不安様行動として捉えることができる。しかし、不安感が低下した動物では、オープンフィールドの中央に滞在する時間が長くなる。そのため、中央部分に滞在した時間を比較することにより、不安様行動を定量化することができる。
【０１２１】
１０週齢の雄マウスを３０ｃｍの高さの壁で囲まれたオープンフィールド（５０ｃｍｘ５０ｃｍ）に入れて、その行動を１０分間観察した。ＷＴ及びＴＧマウスについてそれぞれ１９、１８匹を試験した。図２８に示すように、ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスはＷＴマウスに比べて中央領域に滞在した時間が有意に増加していた（ＷＴマウス：８６．６±６．７ｓｅｃ、ＴＧマウス：１２４．３±１５．９ｓｅｃ；Ｐ＜０．０５繰り返しのないＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔによる検定）。一方、試験時間（１０分間）に移動した距離は、双方とも変化は見られなかった（ＷＴマウス：３６７５±１５２ｃｍ、ＴＧマウス：３３０２±２４９ｃｍ、Ｐ＝０．３８繰り返しのないＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔによる検定）。すなわち、移動距離が同程度にもかかわらず、ＴＧマウスが中央領域により長い時間滞在していることが判明した。このことから、ＴＧマウスは不安感が減少していると考えられる。
【０１２２】
実施例１９： ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの抗不安様行動２
不安に対するＶＥＧＦの効果を調べるために、高架式十字迷路試験を行う。
【０１２３】
抗不安剤のスクリーニングなど不安様行動の指標として広く利用されている、高架十時迷路と呼ばれる装置を用いて測定した。高架式十字迷路では、床から高く持ち上げられた十字状のステージに実験動物を置いてその行動を観察する。ただし、十字状のステージの、対称的な位置にある２つのプラットフォームには壁が装備されて、動物が転落しないようなつくりになっており（安全なプラットフォーム：クローズドアームと呼ぶ）、残り２つの対照的な位置にあるプラットフォームには壁がなく、転落する危険性がある（危険なプラットフォーム：オープンアームと呼ぶ）。通常、げっ歯類をこのようなステージに置くと、ほとんどの時間をより安全なクローズドアームで過ごす。これは、高所における恐怖と開空間に対する忌避が同時に作用しているためと考えられる。不安感が低下した動物では、オープンアームに滞在している時間が長くなる傾向をしめす。従って、オープンアームでの滞在時間を測定することによって、不安感もしくは恐怖感の程度を定量的に比較することができる。
【０１２４】
３００ルクス（ｌｕｘ）の照明下、１０週齢雄マウスを高架式十字迷路（十字状の４本のアーム：一辺の長さ４５ｃｍ、幅５ｃｍ；クローズドアームは高さ１５ｃｍの壁で囲まれている）のプラットフォームの中央に置いて実験を開始し、その行動を１０分間観察した。ＷＴ及びＴＧマウスについてそれぞれ１８、１５匹を試験した。図２９に示すように、ＴＧマウスはＷＴマウスと比べてオープンアームに滞在した時間が有意に増加していた（ＷＴマウス：３．６３±１．２８％、ＴＧマウス：２４．２±４．９％、繰り返しのないＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔによる検定でＰ＜０．０５）。一方、試験時間（１０分間）に移動した距離は、両群に違いは見られなかった（ＷＴマウス：１５８３±８２ｃｍ、ＴＧマウス：１６７５±１０７ｃｍ、繰り返しのないＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔによる検定でＰ＝０．４９）。すなわち、移動距離が同程度にもかかわらず、ＴＧマウスがオープンアームにより長い時間滞在していたことになる。よって、前述のオープンフィールド試験の結果と同様に、ＴＧマウスは不安様行動が減少していることを示している。
【０１２５】
実施例２０：ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの抗うつ様行動
うつ様行動に対するＶＥＧＦの効果を調べるために、Ｐｏｒｓｏｌｔの強制水泳試験を行う。
【０１２６】
Ｐｏｒｓｏｌｔの強制水泳試験は、実験動物のうつ様行動を測定する試験であり、抗うつ剤の効果を評価するために広く用いられている方法である（Ｐｏｒｓｏｌｔ ｅｔ ａｌ．， １９７７）。試験では、水の入った容器に動物を入れ、その行動を観察する。ただし、装置は動物が逃げられないような仕組みになっているため、時間が経つと動物は逃避行動を止めてしまう。これは、動物が水面に浮いているが動いていない状態であり、あきらめの心理的背景が反映されているものと考えることができる。例えば、抗うつ剤を投与すると、動物はより長い時間逃避行動を示し、従って不動時間が短くなる。すなわち、不動時間を測定することによって、うつ様状態の程度を定量的に比較することができる。
【０１２７】
３０ｌｕｘの照明下、１０週齢の雄マウスを水の入った円筒状容器（直径１３ｃｍ、高さ３０ｃｍ；２５℃の水が円筒容器の半分の高さ１５ｃｍまで満たされている）に投入し、その行動を１０分間観察した。ＷＴ及びＴＧマウスについてそれぞれ１８、１５匹を試験した。図３０に示すように、ＴＧマウスはＷＴマウスに比べて不動時間（％表示）が有意に減少していた（ＷＴマウス：６３．４±２．０％、ＴＧマウス：４０．９±４．０％；ウェルチｔ−検定（Ｗｅｌｃｈ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）による検定でＰ＜０．０００１）。１分毎の不動時間についてみると、最初の１分間は両群とも同程度動いていたにもかかわらず、ＷＴマウスのほうがより早く逃避行動をあきらめている。この結果から、ＷＴマウスに比べてＴＧマウスのほうがうつに対して耐性が高いことを示している。
【０１２８】
実施例２１：ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスでみられる恐怖感の減少
恐怖感及び恐怖に関わる学習行動に対するＶＥＧＦの効果を調べるために、恐怖条件付け試験を行う。
【０１２９】
恐怖条件付けは、動物の恐怖感に基づいた学習を評価するために広く用いられている方法である。恐怖条件付けは、古典的条件づけの一種である。原理としては、まず、それ自体では特徴のない刺激（条件刺激：例えば、音）を与えた後で、無条件反応を誘発する刺激（無条件刺激；例えば、足に電気を流すと驚愕する）を提示すれば、動物は両刺激を関連付けるようになる（条件付け）。例えば、音がしばらく鳴った後で足に電気が流れるようにすれば、両者の関連付けによって、動物は音が鳴っただけで驚愕反応を示すようになる。古典的条件付けは、１）条件付け、及び２）条件刺激の提示による学習の評価、の２つの過程に分けられる。本実験においては、１日目に条件付けを行う。動物を実験箱の中に入れて、音刺激（条件刺激：広域の波長が混ざった雑音、ホワイトノイズ、６０ｄＢ）３０秒間提示し、最後の２秒間に足に電気ショック（無条件刺激：パルス電流、０．２ｍＡ）を与える。これを間隔をおいて数回繰り返すと、マウスの驚愕反応（不動反応）は次第に大きくなってゆく。驚愕反応は、不動時間（％）の増加によって定量的に評価することができる。２日目は文脈学習について評価する。動物を１日目と同じ実験箱に入れると、動物は実験箱の環境を記憶しているために（条件刺激に相当する）、電気ショック（無条件刺激）がない状態でも驚愕反応が誘発される。これは、周囲の環境と電気ショックとの関連付けによる学習である。３日目は手掛かり学習について評価する。動物を１日目の条件付けとは全く異なる環境に置いてその行動を観察する。ただし、１日目に用いた条件刺激（音刺激、ホワイトノイズ）を提示することによって、驚愕反応が誘発される。これは、音刺激と環境と電気ショックとの関連付けによる学習である。まとめると、１日目に条件付けを行って驚愕反応の程度を測定し、２日目と３日目に恐怖条件付けによる学習の程度について２種類の方法で評価する。
【０１３０】
１０週齢の雄マウスを用いて恐怖条件づけを行った。ここでは、ＷＴ及びＴＧマウスをそれぞれ１４、１０匹実験に使用した。その結果を図３１の１日目に示している。１日目の条件付けでは、実験時間の７分間に、条件刺激と無条件刺激の組み合わせを３回提示した（１．５、３．５、５．５ｍｉｎに音刺激を開始：１日目の図中に矢印で示す）。最初の１分間の不動時間は、両群ともにほぼ０％であったが、刺激を繰り返すたびに、ＷＴマウスとＴＧマウスともに驚愕反応（不動反応）の程度が徐々に大きくなった（最初と最後の１分間の比較−ＷＴマウス：０．０±０．０から７４．２±５．２％へ増加、ＴＧマウス：０．３±０．３から３８．１±９．７％へ増加）。しかし、ＴＧマウスはＷＴマウスに比べて驚愕反応の程度が有意に低いことが判明した（４−７番目の各１分間についてＰ＜０．０５、ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ（一方向性分散分析）後のターキー・クラマー検定（Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ’ｓ ｔｅｓｔ）による検定）。これは、ＴＧマウスにおいて、電気ショックに対する恐怖感が減少している可能性を示す。また、痛覚が低下している可能性も考えられたため、後述の熱痛覚の実験も合わせて実施した。その結果、痛覚が原因ではなく、恐怖感が低下していると判断を下した。図３１の２日目は、条件付けを行った時と同じ実験箱に動物を入れて、その行動を２分間観察したものである。ＷＴ及びＴＧマウスの両群とも文脈学習による驚愕反応を示したが、１日目と同様にＴＧマウスの不動時間はＷＴマウスに比べて少なかった（２日目の最初の１分間−ＷＴマウス：７１．０±３．３％、ＴＧマウス：４６．２±１０．１％）。しかし、１日目の最後の１分間と２日目の最初の１分間における不動時間を比べてみると、ＷＴマウス及びＴＧマウスのそれぞれについて差は見られなかった（ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ後のＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ’ｓｔｅｓｔによる検定でＰ＞０．０５）。これはすなわち、ＴＧマウスは文脈学習を遂行する能力があることを示しており、この学習に必要な扁桃体と海馬の機能が、正常に保持されていることを示している。図３１の３日目では、条件づけを行ったときとは全く異なる実験箱に動物を入れて、その行動を６分間観察したものである。ただし、３分目と４分目の２分間では、１日目の条件付けの際に用いた音刺激が提示された（３日目の図中に横棒で示す）。異なる環境に置かれるとマウスは比較的自由に動き回っていたが、音刺激が提示されると驚愕反応を示した（３日目の最初の１分間−ＷＴマウス：１１．５±３．５％、ＴＧマウス：１９．０±４．７％；３日目の３番目の１分間−ＷＴマウス：６０．９±６．９％、ＴＧマウス：５４．５±９．９％；両群ともにＰ＜０．０１、ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ後のＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ’ｓ ｔｅｓｔによる検定）。すなわち、両群ともに手がかり学習を遂行する能力があることを示しており、群間の比較でも有意差はみられなかった（遺伝子型による効果：Ｆ１，２２＝０．９１，Ｐ＝０．３５、時間ブロック間での効果：Ｆ５，１１０＝２４．８０，Ｐ＜０．０００１、相互作用による効果：Ｆ５，１１０＝１．１９，Ｐ＝０．３２、ｔｗｏ−ｗａｙ ｒｅｐｅａｔｅｄ ｍｅａｓｕｒｅ ＡＮＯＶＡ（２方向性反復測定分散分析）による検定）。これは、ＷＴ及びＴＧマウスともに、内側膝状体（聴覚に関わる視床領域）及び扁桃体の機能は正常であることを意味している。
以上の結果をまとめると、ＴＧマウスは恐怖感が低下しているものの、恐怖に関わる文脈学習及び手掛かり学習ともに正常であることがわかった。
【０１３１】
実施例２２：ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスでみられる恐怖感の減少−痛覚の確認実験
前述の恐怖条件付けの試験では、電気ショックに対する驚愕反応がＴＧマウスで低下していた。しかしこの結果は、１）恐怖感が低下している可能性と、２）痛覚が低下している可能性の、２つの解釈が可能であり、原因を特定するに至っていない。そこで、ホットプレートテストを行い、熱痛覚に対する動物の応答を定量的に調べることにした。
【０１３２】
ホットプレートテストは、熱に対する動物の応答を指標として痛覚の程度を評価するテストであり、痛覚試験として広く利用されている（Ｍｏｇｉｌ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。本実験では、温度が５５℃に保たれた金属表面に被験動物を置き、熱応答に要する時間を測定する。動物の熱応答としては、後肢を震わせたり後肢をなめたりする行動を熱痛覚の指標としている。すなわち、熱応答に要する時間が長いほど、痛覚が低下している評価する。
【０１３３】
図３２に示すように、３０週齢の雄マウスを用いてホットプレートテストを行った。ＷＴマウスとＴＧマウスそれぞれ２０、１４匹を試験に供した。温度が５５℃の金属表面にマウスを置き、熱痛覚にともなう後肢の応答に要した時間を測定したところ、ＴＧマウスがＷＴマウスにくらべて若干短いことが判明した（ＷＴマウス：１８．１±１．２１ｓｅｃ、ＴＧマウス：１０．７±１．７８ｓｅｃ； ｕｎｐａｉｒｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔによる検定でＰ＜０．０１）。この結果は、熱痛覚において、ＴＧマウスがＷＴマウスよりも熱痛覚への感受性がやや高いことを示すものである。すなわち、ＴＧマウスの痛覚はＷＴマウスに比べて鈍化しているとは言えない。つまり、恐怖条件付けにおいてＴＧマウスはＷＴマウスよりも驚愕反応が低下していたが、これはＴＧマウスの痛覚が低下しているためではなく、むしろ恐怖に対する応答（恐怖感）が減少していると解釈するのが妥当である。
【０１３４】
実施例２３：ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスにおける攻撃行動評価
攻撃行動におけるＶＥＧＦの効果を調べるために、レジデント−イントルーダー攻撃性アッセイを行った。
【０１３５】
レジデント−イントルーダー攻撃性アッセイはげっ歯類（通常はオス）が侵入者に対して自分の縄張りを守るために行使する攻撃行動を指標とした試験である。オスの被験動物を数週間程度単独で飼育し（レジデント）、その飼育箱に別の（イントルーダー）を投入すると、イントルーダーに対しレジデントは攻撃行動を示す。攻撃行動としては、咬みつく、引っ掻く、突進する、執拗に追い回す、などの行動が含まれ、それらの行動を攻撃行動の指標とする。定量的にはレジデントがイントルーダーに攻撃を開始するまでの時間、攻撃した回数、攻撃していた時間を測定する。攻撃性が高いほど、攻撃開始までの時間が短くなり、攻撃回数は増え、攻撃時間は長くなる。さらに、この実験を２−３日継続して繰り返すと、レジデントの攻撃性が一層高まる傾向にある。
【０１３６】
３０週齢の雄マウスを用いてレジデント−イントルーダー攻撃性アッセイを行った。本実験ではＷＴ及びＴＧマウスそれぞれ１５、１４匹を用いた。被験マウスであるレジデントを４週間単独飼育させ、その飼育箱にイントルーダーとしてグループ飼育されていた６週齢のＢＡＬＢ／ｃ雄マウスを１匹投入し、２０分間レジデントのイントルーダーに対する攻撃行動を観察した。この実験は３日間継続して行われ、図３３に示す結果を得た。レジデントが攻撃開始に要した時間はＴＧマウスと比較してＷＴマウスは有意に短く、ＴＧマウスでは試験時間（１２００ｓｅｃ）にまったく攻撃しないことが多かった。（１日目−ＷＴマウス：４９３±１２４ｓｅｃ、ＴＧマウス：１１０６±８８ｓｅｃ；２日目−ＷＴマウス：６９２±１２９ｓｅｃ、ＴＧマウス：１１２８±７２ｓｅｃ；３日目−ＷＴマウス：５７７±１４４ｓｅｃ、ＴＧマウス：１２００±０ｓｅｃ；１−３日目の全てにおいて、ＷＴマウスとＴＧマウスの有意差はＰ＜０．０５、マン・ホイットニーＵ検定（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ’ｓ Ｕ ｔｅｓｔ）による検定）。攻撃回数についてみても、ＴＧマウスのほうが有意に少なかった（１日目−ＷＴマウス：３．１±０．９回、ＴＧマウス：０．６±０．３回；２日目−ＷＴマウス：６．１±１．６回、ＴＧマウス：０．４±０．２回；３日目−ＷＴマウス：６．７±１．７回、ＴＧマウス：０．１±０．１回；１−３日目の全てにおいて、ＷＴマウスとＴＧマウスの有意差はＰ＜０．０５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ’ｓ Ｕ ｔｅｓｔによる検定）。さらに、攻撃時間についてみても同様な結果が得られ、ＴＧマウスのほうが有意に短いことが判明した（１日目−ＷＴマウス：９．０±４．４ｓｅｃ、ＴＧマウス：０．５±０．３ｓｅｃ；２日目−ＷＴマウス：１８．０±５．８ｓｅｃ、ＴＧマウス：０．２±０．１ｓｅｃ；３日目−ＷＴマウス：１６．１±５．４ｓｅｃ、ＴＧマウス：０．１±０．１ｓｅｃ；１−３日目の全てにおいて、ＷＴマウスとＴＧマウスの有意差はＰ＜０．０５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ’ｓ Ｕ ｔｅｓｔによる検定）。この結果から、ＴＧマウスはＷＴマウスに比べて攻撃性が非常に低下していることがわかった。すなわち、ＶＥＧＦには、高等動物の攻撃行動を抑える作用があることが分かった。
【０１３７】
実施例２４： ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスにおける基礎行動量の測定
これまでの結果から、ＶＥＧＦは不安、うつ、攻撃性、恐怖を含む情動に有意な変化をもたらすことが分かった。しかし、ＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスにおいては、ＶＥＧＦが前脳で発現されたことで、前脳の機能に依存した行動が全て非特異的に変化してしまっている可能性も考えられた。もし、ＶＥＧＦが非特異的に動物の行動に変化を与えているとすれば、ＶＥＧＦが特定の神経活動を制御しているというよりは、（細胞増殖や血管形成の促進等の効果で）間接的に脳の本来の機能に影響が出ている可能性がある。そのため、情動以外の動物行動を測定しておく必要がある。
なお、恐怖条件づけにおいては、少なくとも（海馬や扁桃体が関わる）文脈学習や（視床の内側膝状体や扁桃体が関わる）手がかり学習が正常であることを示している。しかし、各種の動物行動を調べることによって、ＶＥＧＦによる影響の範囲を見極める必要がある。
【０１３８】
被験動物の飼育箱に赤外線センサーを設置し、動物がセンサーを横切る回数を昼夜数日間に渡って連続観察し、自然な状態における活動量の変化を調べる。
【０１３９】
１０週齢の雄マウスを用いて、飼育箱における基礎活動量を３日間（昼夜）にわたって測定した。ＷＴマウスとＴＧマウスのそれぞれ９匹を試験に供した。飼育箱を横切る形で赤外線を照射し、動物がそれを横切るとカウントされる仕組みになっている。センサーを横切った回数を３０分毎に集計し、これを図３４の折れ線グラフで表した。ＷＴマウス（灰色の線）とＴＧマウス（黒線）はともに、夜間（２０：００−８：００、影で示す）に活動し、昼間（２０：００−８：００）は活動量が減少している様子がわかる。２日目と３日目について行動量を集計し、それを図３４の棒グラフに示した。すると、ＷＴマウスとＴＧマウスの総活動量は同程度で、有意差は見られなかった（ＷＴマウス：２５９１±３５６回、ＴＧマウス：３４２２±７０８回；ｕｎｐａｉｒｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔによる検定でＰ＝０．０７）。夜間の行動量（％）を比較してみると、ＴＧマウスのほうがＷＴマウスよりも若干高く、昼夜の活動がより明瞭になっていた（ＷＴマウス：６７．７±５．８％、ＴＧマウス：８４．０±２．８％；ｕｎｐａｉｒｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔによる検定でＰ＜０．０５）。しかし、全体として自然な飼育環境下で両群の活動には大きな変化はみられなかった。
【０１４０】
実施例２５： 拘束ストレスに対する血中コルチゾールの変化
我々が危険や脅威にさらされると、ストレス反応が誘発される。ストレス反応の生理的変化としては、大きく２つの系があり、１）内分泌系と２）交感神経系がある。内分泌系では、ストレスによって下垂体前葉から副腎皮質刺激ホルモンが放出され、それが刺激になって副腎皮質からグルココルチコイド（コルチゾールなど）が放出され、これが血糖値上昇、血圧上昇、抗炎症作用につながる。一方、交感神経系が活性化されると、副腎髄質からアドレナリンやノルアドレナリンの放出が増え、これが心拍数上昇、血糖値上昇、汗分泌、瞳孔拡張等につながる。ＴＧマウスでは、不安、うつ、恐怖、攻撃性が低下していることから、ストレスに対する反応性に違いがある可能性が考えられた。そこで、ストレス応答として内分泌系の働きに違いがあるかどうかを確かめるため、血中コルチゾールの測定を行うことにした。
【０１４１】
動物に対するストレスとして、拘束ストレスを用いることにした。拘束ストレスとは、動物を物理的に動けないようにして（通常、網や容器を用いて拘束する）誘導されるストレスのことである。実験系としては、動物が身動きできないような容器に押し込んで、ストレスを誘導する。ストレス応答の生体指標としては、血中のコルチゾール濃度を用いる。血液標本としては、ストレスをかける前、ストレスをかけた後、ストレス後にしばらく回復させた後の３点から得る。通常、自然状態では血中コルチゾールの濃度は低いが、ストレスをかけると急激に上昇し、ストレスがなくなってしばらくすると濃度が低下して基礎レベルに近づく。コルチゾールの濃度はＥＬＩＳＡ法を用いた分析によって、定量的に測定する。採取した血液は、遠心分離によって血清を得て、それをＥＬＩＳＡ用の試料とする。ストレスに伴う血中コルチゾール濃度の変化を測定することによって、ＷＴマウスとＴＧマウスの間で、内分泌系を介したストレス反応に違いがあるかどうかを調べる。
【０１４２】
６週齢の雄マウスを用いて、拘束ストレスによる血中コルチゾール濃度の変化を測定した。ＷＴマウスとＴＧマウスについて、コントロール群、ストレス群、ストレス／回復群の３グループにわけた（各群４−５匹）。ストレス群及びストレス／回復群のマウスは、プラスチック製の円筒容器（直径３ｃｍ、長さ１１ｃｍ、呼吸用の空気穴がある）に挿入されて１時間の拘束ストレスを受けた。ストレス／回復群のマウスについては、拘束ストレスの後、飼育箱に戻して、１時間回復させた。ＷＴ及びＴＧマウスの各３群から、血液を採取し、遠心分離によって血清を回収した。これらの標本から、血中コルチゾールの濃度をＥＬＩＳＡ法によって定量的に測定した（Ｃａｙｍａｎ、Ｃｏｒｔｉｓｏｌ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＥＩＡ Ｋｉｔ）。結果を図３５に示す。ストレス前では、ＷＴ及びＴＧマウスともに低レベルの血中コルチゾールが検出され、遺伝子型間での差異は見られなかった（ＷＴマウス：１１．０±３．２ｐｇ／ｍｌ、ＴＧマウス３３．１±１３．５ｐｇ／ｍｌ；クラスカル・ワリス検定（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ ｔｅｓｔ）後のシェフェの方法（Ｓｃｈｅｆｆｅ’ｓ ｔｅｓｔ）による検定でＰ＞０．０５）。１時間の拘束ストレスを与えると、ＷＴ及びＴＧマウスともに血中コルチゾールの濃度が急激に上昇し、遺伝子型間での有意差はみられなかった（ＷＴマウス：３６０．１±２７．５ｐｇ／ｍｌ、ＴＧマウス：２７１．１±４６．５ｐｇ／ｍｌ；ストレス前と後での比較では両遺伝子型ともにＰ＜０．０１、ＷＴ及びＴＧマウス間の比較ではＰ＞０．０５、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ ｔｅｓｔ後のＳｃｈｅｆｆｅ’ｓ ｔｅｓｔによる検定）。ストレス後、マウスを飼育箱に戻して１時間回復させた場合、ＷＴ及びＴＧマウスともに血中コルチゾール濃度は平常レベル近くにまで減少したが、両遺伝子型間で差は見られなかった（ＷＴマウス：６９．７±１０．９ｐｇ／ｍｌ、ＴＧマウス：９５．０±１５．４ｐｇ／ｍｌ；ストレス直後と１時間回復後での比較では両遺伝子型ともにＰ＜０．０１、ＷＴ及びＴＧマウス間の比較ではＰ＞０．０５、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ ｔｅｓｔ 後のＳｃｈｅｆｆｅ’ｓ ｔｅｓｔによる検定）。すなわち、ＴＧマウスでは正常な内分泌系を介したストレス反応がみられた。前述の結果を考慮すると、ＴＧマウスにおける情動の変化は、内分泌系を介したストレス反応には影響を与えていないことがわかる。
【図面の簡単な説明】
【０１４３】
【図１】図１はＣａＭＫＩＩプロモーターによりＶＥＧＦ１２０が過剰発現しているＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウス及び野生型マウス、低酸素環境下に晒したマウスの各脳切片のｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎの結果を示す顕微鏡写真の概略図である。
【図２】図２はＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの脳内各領域におけるＶＥＧＦ蛋白質の発現レベルをＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法を用いて調べた結果を示す写真の概略図である。
【図３】図３はＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの海馬領域における、ＶＥＧＦ蛋白質の各週齢での発現レベルの変遷をＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法を用いて調べた結果を示す写真の概略図である。
【図４】図４はＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの海馬領域神経細胞におけるＶＥＧＦ１２０の部位特異的発現を、免疫組織化学染色法を用いて示した結果を示す顕微鏡写真の概略図である。
【図５】図５は野生型マウスとＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの脳の大きさを比較した結果を示す写真の概略図である。
【図６】図６は野生型マウスとＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの脳重量、及び体重、体重に占める脳重量の割合を比較した結果を示すグラフである。
【図７】図７はＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの脳組織中の細胞数及び神経細胞数を、免疫組織化学染色法を用いて野生型マウスの脳組織と比較した結果を示す顕微鏡写真の概略図である。
【図８】図８は図７の結果を元に、細胞数を計測し野生型マウスと比較した結果を示すグラフである。
【図９】図９は野生型マウスとＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの脳における細胞増殖程度を、抗ＢｒｄＵ抗体を用いた免疫組織染色法により検出した結果を示す顕微鏡写真の概略図である。
【図１０】図１０は図９の結果を定量化し、比較した結果を示すグラフである。
【図１１】図１１は野生型マウスとＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスにおける海馬組織を核染色し、海馬における神経細胞層を可視化した結果を示す顕微鏡写真の概略図である。
【図１２】図１２は野生型マウスとＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスにおける海馬及び顆粒細胞層の断面積を測定し、比較した結果を示すグラフである。
【図１３】図１３は野生型マウスとＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスにおける海馬及び顆粒細胞層の体積を測定し、比較した結果を示すグラフである。
【図１４】図１４は野生型マウスとＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの歯状回におけるＢｒｄＵ陽性細胞の免疫染色法により検出した結果を示す顕微鏡写真の概略図である。
【図１５】図１５は図１４の結果より算出した野生型マウスとＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスにおけるＢｒｄＵ陽性細胞密度の平均を求めた結果を示したグラフである。
【図１６】図１６は野生型マウスとＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスにおけるＢｒｄＵ陽性細胞密度の平均をもとめた運動刺激の前後で比較した結果を示したグラフである。
【図１７】図１７は野生型マウスとＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスにおける神経前駆細胞の検出を行った結果を示した顕微鏡写真の概略図である。
【図１８】図１８は野生型マウスとＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスにおける神経前駆細胞の発現の指標となるＮｅｓｔｉｎ蛋白質の発現量をＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ法で解析した結果を示した写真の概略図である。
【図１９】図１９は野生型マウスとＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスにおける未熟神経細胞の組織における分布状況を免疫組織染色により観察した結果を示した顕微鏡写真の概略図である。
【図２０】図２０は野生型マウスとＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの海馬歯状回における新生細胞の分化を免疫組織染色法にて比較した結果を示した顕微鏡写真の概略図である。
【図２１】図２１は野生型マウスとＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの海馬歯状回における新生細胞がどのような細胞へと分化したかを定量的に解析した結果を示したグラフである。
【図２２】図２２は野生型マウスとＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの海馬歯状回における顆粒細胞層におけるＢｒｄＵ陽性細胞の数を比較した結果を示したグラフである。
【図２３】図２３は野生型マウスとＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの脳における血管新生を、レクチンによる染色により比較した結果を示した顕微鏡写真の概略図である。
【図２４】図２４は野生型マウスとＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの脳における血管新生を、レクチンによる染色の蛍光強度を測定し、比較した結果を示したグラフである。
【図２５】図２５は野生型マウスとＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの海馬歯状回の門部における、毛細血管の直径の分布を比較した結果を示したグラフである。
【図２６】図２６は野生型マウスとＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスに色素を投与し、内臓組織の染色を観察した結果を示した写真の概略図である。
【図２７】図２７は野生型マウスとＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスに色素を投与した後、脳組織の染色の様子を比較観察した結果を示し写真の概略図である。
【図２８】図２８は不安に対するＶＥＧＦの効果を調べるために、野生型マウスとＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスに対し、オープンフィールド試験を行った結果を示したグラフである。
【図２９】図２９は不安に対するＶＥＧＦの効果を調べるために、野生型マウスとＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスに対し、高架式十字迷路試験を行った結果を示したグラフである。
【図３０】図３０はうつ様行動に対するＶＥＧＦの効果を調べるために、Ｐｏｒｓｏｌｔの強制水泳試験を野生型マウスとＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスに対し行った結果を示したグラフである。
【図３１】図３１は恐怖感及び恐怖に関わる学習行動に対するＶＥＧＦの効果を調べるために、恐怖条件付け試験を行った結果を示したグラフである。
【図３２】図３２は熱痛覚に対する野生型マウス及びＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの応答の違いを、ホットプレートテストにより比較した結果を示したグラフである。
【図３３】図３３は攻撃行動におけるＶＥＧＦの効果を調べるために、野生型マウスとＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスに対しレジデント−イントルーダー攻撃性アッセイを行った結果を示したものである。
【図３４】図３４は野生型マウスとＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスにおける、基礎行動量を比較した結果を示したグラフである。
【図３５】図３５はストレスに対する野生型マウスとＶＥＧＦ１２０−ＴＧマウスの反応の違いを血中コルチゾール濃度の違いにより比較した結果を示したグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶＥＧＦ蛋白質もしくはＶＥＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＶＥＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいはＶＥＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくはＶＥＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＶＥＧＦ蛋白質と実質的に同質な活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ、又はそれらＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＶＥＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡを有効成分として含有することを特徴とする、抗ストレス剤。
【請求項２】
ＶＥＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくはＶＥＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＶＥＧＦ蛋白質と実質的に同質な活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ、又はそれらＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＶＥＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡをコードするｍＲＮＡの発現量を指標とした、及び／又は、ＶＥＧＦ蛋白質もしくはＶＥＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＶＥＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩のタンパク質量を指標とした、抗ストレス剤のための化合物又は組成物のスクリーニング方法。
【請求項３】
請求項２に記載のスクリーニング方法により選択される物質を有効成分として含有する抗ストレス剤。
【請求項４】
ＶＥＧＦ受容体１であるＦｌｔ−１、及び／又は、ＶＥＧＦ受容体２であるＦｌｋ−１に対するアゴニスト活性を指標とした抗ストレス剤のための化合物及び組成物のスクリーニング方法
【請求項５】
請求項４に記載のスクリーニング方法により選択される物質を有効成分として含有する抗ストレス剤。
【請求項６】
脳内でＶＥＧＦ蛋白質が過剰に発現されており、且つ、脳内で神経新生及び血管新生が促進されていることを特徴とするトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項７】
血液脳関門が緩やかになっており、末梢投与の薬剤や組成物の脳内における生理活性評価が容易になっていることを特徴とする請求項６記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項８】
高感度に情動行動が評価できることを特徴とする請求項６及び７記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項１】
ＶＥＧＦ蛋白質もしくはＶＥＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＶＥＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいはＶＥＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくはＶＥＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＶＥＧＦ蛋白質と実質的に同質な活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ、又はそれらＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＶＥＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡを有効成分として含有することを特徴とする、抗ストレス剤。
【請求項２】
ＶＥＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくはＶＥＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＶＥＧＦ蛋白質と実質的に同質な活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ、又はそれらＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＶＥＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡをコードするｍＲＮＡの発現量を指標とした、及び／又は、ＶＥＧＦ蛋白質もしくはＶＥＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＶＥＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩のタンパク質量を指標とした、抗ストレス剤のための化合物又は組成物のスクリーニング方法。
【請求項３】
請求項２に記載のスクリーニング方法により選択される物質を有効成分として含有する抗ストレス剤。
【請求項４】
ＶＥＧＦ受容体１であるＦｌｔ−１、及び／又は、ＶＥＧＦ受容体２であるＦｌｋ−１に対するアゴニスト活性を指標とした抗ストレス剤のための化合物及び組成物のスクリーニング方法
【請求項５】
請求項４に記載のスクリーニング方法により選択される物質を有効成分として含有する抗ストレス剤。
【請求項６】
脳内でＶＥＧＦ蛋白質が過剰に発現されており、且つ、脳内で神経新生及び血管新生が促進されていることを特徴とするトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項７】
血液脳関門が緩やかになっており、末梢投与の薬剤や組成物の脳内における生理活性評価が容易になっていることを特徴とする請求項６記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項８】
高感度に情動行動が評価できることを特徴とする請求項６及び７記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【公開番号】特開２０１０−１０５９９９（Ｐ２０１０−１０５９９９Ａ）
【公開日】平成２２年５月１３日（２０１０．５．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２８２５３３（Ｐ２００８−２８２５３３）
【出願日】平成２０年１０月３１日（２００８．１０．３１）
【出願人】（３９００２０１８９）ユーハ味覚糖株式会社 (242)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年５月１３日（２０１０．５．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月３１日（２００８．１０．３１）
【出願人】（３９００２０１８９）ユーハ味覚糖株式会社 (242)
【Ｆターム（参考）】
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