抗菌活性を有するＲｕｍＣペプチド
本発明は、抗菌活性を有するＲｕｍＣ１ペプチド、ＲｕｍＣ２ペプチド及びＲｕｍＣ３ペプチドに関し、また、これらのペプチドをコードし、Ruminococcus gnavus E1から単離された遺伝子にも関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗菌活性を有するＲｕｍＣ１ペプチド、ＲｕｍＣ２ペプチド及びＲｕｍＣ３ペプチドに関し、また、これらのペプチドをコードし、Ruminococcus gnavus E1から単離された遺伝子にも関する。
【背景技術】
【０００２】
特定の菌株は、これらの競合者に対し、静菌作用又は殺菌作用を有する物質を放出する能力を持っている。これらの抗菌物質は、例えば有機酸のような有機物、過酸化水素（Ross等.,Int.J.Food Microbiol.79,3-16,2002)、又はペプチドからなり得る。抗生物質の種類に分類される酵素学的に生産された抗菌ペプチド（Mootz等.,Curr.Opin.Chem.Biol.1,543-551,1997; Keating等.,Curr.Opin.Chem.Biol.3,598-606,1999）、及びバクテリオシンの種類に分類されるリボソーム性に生産されたペプチド（Jacob等.,Ann.Inst.Pasteur(Paris)84,222-224,1953）は、区別される。
【０００３】
バクテリオシンは、研究界及び産業界における関心を増大させている。それらの使用は、特に、養殖業において、抗生物質の使用に代わる解決法となるかもしれない（Luchansky,Antonie Van Leeuwenhoek 76,335,1999;O'Sullivan等.,Biochimie 84,593-604,2002）。
【０００４】
バクテリオシンの多くの異なる発現法は、近年に開発された。特に、Morriset等（Morisset等.,Appl.Environ.Microbiol.,70,4672-4680,2004）は、Leuconostoc mesenteroidesの亜種のdextranicum DSM20484の中において、Leuconostoc mesenteroidesの亜種のmesenteroides Y105により産生されたクラスIIａのバクテリオシンであるメセンテリシンY105の変種を発現させた。同様に、Flynn等（Microbiol.,148,973-984,2002）は、Lactobacillus plantarum、Lactococcus lactis及びBacillus cereusの中において、Lactobacillus salivariusの亜種のsalivarius UCC118により、クラスIIｂのバクテリオシンであるABP-118の発現を最初に成し遂げた。
【０００５】
さらに、いくつかの試験がバクテリオシンを発現するために、Escherichia coli細菌において（McCormic等.,Appl.Environ.Microbiol.,69,1352-1358,2003; Biet等.,Microbiol.,144,2845-2854,1998; Miller等.,Appl.Environ.Microbiol.,64,14-20,1998; Richard等.,J.Bacteril.,186,4276-4284,2004; Kloche等.,Appl.Microbiol.Biotechnol.,67:532-538,2005）、Saccharomyces cerevisiae酵母において（Schoeman等.,Yeast,15,647-656,1999; Van Reene等.,Int.J.Food Microbiol.,81,29-40,2003）及び乳酸菌において（Rodriguez等.,Int.J.Food Microbiol.,80,101-116,2003）行われた。
【０００６】
多くの研究は、新規のバクテリオシンを同定することを目的とし、また、これらのバクテリオシンを生産するために行われた。
【０００７】
消化器の生態系には、細菌、酵母及び古細菌が連合している大量で且つ非常に複合的なミクロフローラが形成されている。このミクロフローラは、基本的に嫌気性であり、Bacteroides属、Eubacterium属、Clostridium属、Ruminococcus属、Bifidobacterium属及びFusobacterium属が主に見られる（Suau等.,Appl.Environ.Microbiol.65,4799-4807,1999）。ミクロフローラは宿主の健康に大きな影響を及ぼす。特に、食品由来の代謝合成物の毒化及び解毒に関する（Hughes及びRowland Microbial Ecology Health Disease 2,179-185,2000）。また、それは、腸細胞の機能の発現を調整することも可能である（Bry等.,Science 273,1380-1383,1996; Hooper等.,Science 291,881-884,2001）。また、それは、病原性外因の細菌の侵入に対して、宿主を保護する役割を果たす（Ducluzeau等.,Microbial Ecology and Intestinal Infections 2,240-246,2000）。
【０００８】
周知の腸の病原菌の１つとして、絶対嫌気性グラム陽性菌であるClostridium perfringensがあり、これは胞子形成することができ、自然環境において、非常に広範に存在する。この病原菌は食品から生じるが、腸内にも少し存在し、ストレスの影響により増殖及び毒素の分泌を開始できる。Clostridium perfringens菌株は、これらが産生する毒素の機能により５つのトキシノタイプに分類される（Petit等.,Trends Microbiol.7,104-110,1999）。タイプＡのC.perfringens菌株は、ヒトの消化器疾患の原因となる。１９９７年に、アメリカにおいて、245000件以上のC.perfringensの感染が記録された。これにより、４１人が入院し、そのうち７人が死亡した（Mead等.,Emerg.Infect.Dis.5,607-625,1999）。タイプＡ及びタイプＣのC.perfringens菌株は、それぞれブタ及び家禽の壊死性腸炎の原因となり得る。家禽において、壊死性腸炎は、進行の速い急性の病態であり、死亡率は１日に１％〜２％に達する。健康な動物における壊死性腸炎の発生率に加えて、その病態は、かなりの経済的影響をもつ。１９９９年まで、この病気は成長因子のような抗生物質を用いることにより十分に制御されていた。しかしながら、欧州連合は耐性菌の選択及びこれによるヒトへの抗生物質の効果の減少を恐れ、飼料にそれらを用いることを禁止した。この禁止以来、ブタ及び家禽において、Clostridium perfringensにより生じる壊死性腸炎は、欧州において、もはや制御できていない。Reseau National d'Observations Epidemiologiques en Aviculture (RNOEA) (AFSSA Ploufragan)により公表されたその件数は、１９９９年及び２０００年においてかなり増加している（Valancony,Bulletin des GTV 12,9-12,2001）。
【０００９】
現在、この病気の制御及び治療のための代替の解決策の探索が、最も重要なことである。
【００１０】
Ruminococcus gnavusは、Clostridiales目のLachnospiraceae科に属する絶対嫌気性細菌である。Dabard等は、ヒトの優占フローラから単離したRuminococcus gnavus E1菌株がruminococcin A又はＲｕｍＡとして知られる抗菌物質を産生でき、この物質は培養上清に蓄積されることを示した（Appl.Environ.Microbiol.,67,4111-4118,2001）。それは、lantibioticsの系統群に属するバクテリオシンであり、病原菌のClostridium菌種の種々の菌株に対し有効である。Gomez等は、Ruminococcin Aの生合成に関する遺伝子の発現がトリプシンがある場合には誘導されることを示した（J.Bacteriol.,184,18-28,2002）。また、これと同一の著者等は、特定の消化酵素がＲｕｍＡの産生の誘導を阻害する可能性を示した。
【００１１】
従って、発明者は他のバクテリオシンに関心をもった。
【００１２】
本発明は、Clostridium perfringensに対する抗菌活性を有するＲｕｍＣ１ペプチド、ＲｕｍＣ２ペプチド及びＲｕｍＣ３ペプチドに関し、また、これらのペプチドをコードする遺伝子に関する。
【発明の概要】
【００１３】
（配列表の説明）
配列番号１：Ruminococcus gnavus E1のＲｕｍＣペプチドの保存された配列
配列番号２：エドマン分解法により試験的に決定されたRuminococcus gnavus E1のＲｕｍＣペプチドのペプチド配列
配列番号３：エドマン分解法により試験的に決定されたRuminococcus gnavus E1のＲｕｍＣペプチドのペプチド配列
配列番号４：配列番号７から推定されたRuminococcus gnavus E1のＲｕｍＣ１ペプチドのペプチド配列
配列番号５：配列番号８から推定されたRuminococcus gnavus E1のＲｕｍＣ２ペプチドのペプチド配列
配列番号６：配列番号９から推定されたRuminococcus gnavus E1のＲｕｍＣ３ペプチドのペプチド配列
配列番号７：Ruminococcus gnavus E1のｒｕｍＣ１遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号８：Ruminococcus gnavus E1のｒｕｍＣ２遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号９：Ruminococcus gnavus E1のｒｕｍＣ３遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号１０〜１２：試験的に決定されたペプチド配列
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、配列番号１の配列のペプチド、配列番号１のポリペプチドと少なくとも８０％の相同性を有するペプチドを含んでいるペプチド、配列番号２の配列のペプチド、及び配列番号２のポリペプチドと少なくとも８０％の相同性を有するペプチドを含んでいるペプチドのうちから選択されるペプチドを含んでいることを特徴とする抗菌活性を有するペプチドに関する。本発明の一実施形態によると、このペプチドは、配列番号３の配列のペプチドをさらに含んでいる。本発明の他の実施形態によると、このペプチドは配列番号４、５又は６の配列のペプチドから選択されるペプチドを含んでいる。
【００１５】
本発明は、配列番号７、８又は９の配列のうちの１つを有するポリヌクレオチド、配列番号７、８又は９の配列のうちの１つを有するポリヌクレオチドとハイブリッド形成するポリヌクレオチド、及び前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのうちから選択されるポリヌクレオチドを含んでいることを特徴とする抗菌活性をコードするポリヌクレオチドに関する。
【００１６】
本発明は、転写方向に、宿主生物において機能するプロモータ、前記ポリヌクレオチド及び前記の宿主生物と同一の宿主生物におけるターミネータ配列を含んでいることを特徴とする発現カセットに関する。
【００１７】
さらに、本発明は、前記ポリヌクレオチド及び／又は発現カセットを含んでいるベクターに関する。
【００１８】
本発明は、前記ポリヌクレオチド、発現カセット及び／又はベクターを用いて形質転換された宿主生物に関する。
【００１９】
本発明は、２００６年１２月１９日にＣＮＣＭ Ｉ−３７０５番として、ＣＮＣＭ（Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F-75015 Paris）に寄託されたRuminococcus gnavus菌株に関する。また、前記ペプチドを産生する単離された形態の遺伝的に改変されていない菌株に関する。
【００２０】
本発明は、宿主生物又は前記菌株により得られるタンパク質混合物又は発酵マストに関する。
【００２１】
本発明は、前記ペプチド、前記宿主生物、前記菌株、前記宿主生物の発酵マスト又は前記菌株の発酵マストを含んでいる組成物に関する。本発明の一実施形態によると、前記組成物は液状又は粉末状である。
【００２２】
本発明は、前記ペプチド、前記宿主細胞、前記菌株、前記宿主細胞の発酵マスト又は前記発酵マストを含んでいる栄養性添加物に関する。本発明の一実施形態によると、前記添加物は液状又は粉末状である。
【００２３】
本発明は、動物のための栄養基礎成分及び前記栄養性添加物を含んでいることを特徴とする飼料に関する。
【００２４】
本発明は、薬物、栄養性添加物又は飼料を製造するための、前記ペプチド、前記宿主細胞、前記菌株、前記宿主細胞の発酵マスト又は前記菌株の発酵マストの用途に関する。本発明の一実施形態によると、前記薬物又は前記栄養性添加物は、家禽又はブタの壊死性腸炎の予防又は治療を目的とされている。本発明の他の実施形態によると、前記薬物又は前記栄養性添加物は、ヒトの消化器疾患の予防又は治療を目的とされている。
【００２５】
本発明は、動物に処理するための前記ペプチドの非治療的用途に関する。本発明の一実施形態によると、前記ペプチドは、その動物に内在的な菌株又はその動物に外因的な菌株から得られる。本発明の他の実施形態によると、前記ペプチドは、その動物に内在的な菌株から得られ、また、前記内在的な菌株によりペプチドの産生は促進される。本発明のさらなる他の実施形態によると、前記ペプチドは動物に内在的な菌株から得られ、また、前記内在的な菌株の成長は促進される。
【００２６】
（ペプチド）
従って、本発明は、抗菌活性を有するペプチドに関する。好ましくは、これらのペプチドは、Ruminococcus gnavus、例えばRuminocuccus gnavusの変異株から単離される。参考として、これらのペプチドは、２００６年１２月１９日にＣＮＣＭ Ｉ−３７０５番として、ＣＮＣＭ（Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F-75015 Paris）に寄託されたRuminococcus gnavus菌株、すなわち、LEM 9-17菌株から単離され得る。
【００２７】
「抗菌活性」という用語は、標的細菌の成長若しくは発生を阻害する又は標的細菌を殺す能力を意味する。抗菌活性を測定する方法は、当業者に知られている。本発明においては、抗菌活性は寒天培地で培養されたClostridium perfringens CpA菌株に対する活性試験により示される。本発明のペプチドのうちの１つを含む検体は、寒天培地に形成されたウェルに置かれる。抗菌活性は、成長抑制によるハローがウェルの周囲に形成されることにより示される。
【００２８】
Ruminococcus gnavus E1のＲｕｍＣ１ペプチド、ＲｕｍＣ２ペプチド及びＲｕｍＣ３ペプチドのペプチド配列は、それぞれ配列番号４、配列番号５及び配列番号６の配列により表される。これらの配列は、それぞれ配列番号７、配列番号８及び配列番号９の配列により表されるｒｕｍＣ１遺伝子、ｒｕｍＣ２遺伝子及びｒｕｍＣ３遺伝子のヌクレオチド配列から推定される。
【００２９】
本発明は、抗菌活性を有するRuminococcus gnavus E1のＲｕｍＣ１ペプチド、ＲｕｍＣ２ペプチド及びＲｕｍＣ３ペプチドの断片に関する。「ペプチド断片」という用語は、それが由来するペプチドの全てでなく、その一部からなるペプチドを意味する。従って、本発明は、配列番号１、配列番号２及び配列番号３の配列のペプチドに関する。
【００３０】
これらの断片は、抗菌活性を保存する。本発明は、生物学的活性断片に関する。「生物学的活性断片」という用語は、それが由来するポリペプチドの機能を保存するポリペプチドの断片を意味する。
【００３１】
本発明は、配列番号１、２又は３の配列のペプチドのいずれかと同一のアミノ酸の少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％及び好ましくは少なくとも９９％を備え、抗菌活性を有するペプチドに関する。
【００３２】
配列番号１、配列番号２及び配列番号３の配列のペプチドを調製する方法は、当業者に知られている。
【００３３】
ＲｕｍＣペプチドは、細胞外の環境において、細菌により分泌（又は放出）される。配列番号４、５及び／又は６の配列のペプチドのいずれかが所与のアミノ酸によるシグナルペプチドを含むことも可能である。この場合、本発明は、シグナルペプチドの切断の後に得られた成熟ペプチドに関する。本発明の一実施形態によると、配列番号４、５及び６の配列の２０番目〜６３番目のペプチド配列に関する。
【００３４】
他の実施形態において、配列番号４、５又は６のペプチドの潜在的なシグナルペプチドは、異種の宿主生物により、このペプチドの発現及び分泌を行うために異種のシグナルペプチドに置換されてもよい。
【００３５】
本発明の対象は、配列番号４、５及び６のペプチドと少なくとも８０％の相同性を有し、抗菌活性を備えるペプチドである。本発明の一実施形態によると、このペプチドは、Ruminococcus gnavus菌株から単離される。本発明の他の実施形態によると、このペプチドは、Ruminococcusのその他の菌株又は他の細菌から単離される。また、このペプチドは、化学合成を介して得られる。
【００３６】
本発明の一対象は、配列番号４、５及び６の配列のペプチドのいずれかと同一のアミノ酸の少なくとも９０％、９５％、９８％及び好ましくは少なくとも９９％を有するペプチドである。
【００３７】
「同一のアミノ酸」という用語は、２つの配列の間で不変であるアミノ酸を意味する。これらのペプチドは、配列番号４、５及び６の配列により表されるペプチドに関連する少なくとも１つのアミノ酸の除去、付加又は置換されてもよい。転写の後に、例えば脱水、硫化物橋の形成又はランチオニン等により修飾されたアミノ酸は、２つの配列の間で不変であるアミノ酸としてみなされる。
【００３８】
本発明の対象は、配列番号４、５及び６の配列のペプチドのいずれかと少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％及び好ましくは少なくとも９９％の類似性を有するペプチドである。
【００３９】
「類似性」という用語は、互いのタンパク質又は核酸の配列の類似点の程度を意味する。これらのペプチドは、配列番号４、５及び６の配列により表されるペプチドに関する少なくとも１つのアミノ酸の除去、付加又は置換されてもよい。スコアにより定量化された２つの配列の間の類似性の度合いは、互いの配列の相同性及び／又は保存している置換の割合に基づく。
【００４０】
ポリペプチド同士の間の同一性及び類似性の程度の測定及び同定の方法は、当業者に知られている。配列の比較は、例えばVector NTi 9.1.0の手段、配列比較プログラムのAlignX (Clustal W algorithm) (Invitrogen INFORMAX, http://www.invitrogen.com)又はCLUSTAW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) のツールを用いることにより行われる。
【００４１】
本発明に係るペプチドは、それらの自然環境から単離又は精製され得る。前記ペプチドは異なる工程を介して調製される。これらの工程は、特に、これらのペプチドを自然発現する細菌のような自然原料からの精製、適した宿主細胞による組み換え型ペプチドの産生及びこれらの後の精製、化学合成を介した生産、又はこれらの異なる方法の組み合わせである。従って、本発明の配列番号１〜６の配列のペプチドは、２００６年１２月１９日にＣＮＣＭ Ｉ−３７０５番として、ＣＮＣＭに寄託されたRuminococcus gnavus菌株から単離され得る。他の実施形態において、本発明のペプチドは、本発明に係るＲｕｍＣペプチド又は抗菌活性を有するＲｕｍＣペプチドの断片を発現する組み換え型宿主生物から単離される。
【００４２】
本発明の対象は、本発明に係るペプチドを含む融合タンパク質、組み換えタンパク質又はキメラタンパク質である。
【００４３】
本発明のペプチドは、Ruminococcus gnavus E1菌株を宿しているモノゼニックラットの盲腸の内容物から単離され、また、Ruminococcus gnavus変異株、さらに特異的には２００６年１２月１９日にＣＮＣＭ Ｉ−３７０５番として、ＣＮＣＭ（Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F-75015 Paris）に寄託されたRuminococcus gnavus菌株から単離され得る。これらのペプチドは、Clostridium perfringensに対する活性試験により実証される抗菌活性を有する。
【００４４】
質量分析法は、本発明に係るＲｕｍＣペプチドのおおよその分子量の決定を可能とした。その分子量は、４０００Ｄａから４６００Ｄａまでであり、より具体的には、４１００Ｄａから４５００Ｄａまでである。
【００４５】
本発明の一実施形態によると、前記ペプチドは、栄養的又は医薬的用途、例えば動物の栄養摂取のために用いるのに適する。
【００４６】
「栄養的又は医薬的用途に適するペプチド」という用語は、栄養物又は医薬に適することを特徴とするペプチドを意味する。栄養的又は医薬的用途に必須の特徴は、特にそのペプチドが耐えることができるｐＨである。具体的に、ヒト及び動物の消化器系のｐＨは酸性であり、従って、前記ペプチドがこのｐＨに耐えることは重要である。栄養的用途のための他の必須の特徴は、抗菌物質が活性する温度である。具体的に、薬物、栄養性添加物又は飼料に含まれる抗菌物質の加工は、例えば処理温度及び室温以上の温度を含む。従って、用いられる抗菌剤の活性は、加工の条件、特に前記の温度条件において安定でなければならない。
【００４７】
本発明の一実施形態によると、本発明に係るペプチド又はペプチド混合物は、中性ｐＨにおいて抗菌活性を有し、また、酸性ｐＨ、例えば７未満、好ましくは４．４未満において、抗菌活性を維持する。
【００４８】
本発明の一実施形態によると、本発明に係るペプチド又はペプチド混合物は、３７℃において抗菌活性を有し、室温以上及び未満、例えば５０℃以上の温度においてこの活性を維持する。
【００４９】
本発明は、モノゼニックラットの盲腸の内容物又はRuminococcus gnavus変異株から単離され、Clostridium perfringens菌株に対して活性を有し、質量分析法により測定された４０００Ｄａから４６００Ｄａまでの分子量を有し、ｐＨ７未満のｐＨに耐え、抗菌活性を備えるペプチドに関する。一実施形態によると、前記ペプチドは、配列番号１の配列及び／又は配列番号２の配列を含む。他の実施形態によると、前記ペプチドは、配列番号３の配列のペプチドを含む。好ましくは、前記ペプチドは、配列番号４、５又は６の配列を有するペプチドのいずれかから選択されるペプチドを含む。
【００５０】
本発明は抗菌活性を有するペプチドに関し、それは、Ruminococcus gnavus変異株、例えば２００６年１２月１９日にＣＮＣＭ Ｉ−３７０５番として、ＣＮＣＭに寄託されたRuminococcus gnavus菌株から得られる。一実施形態によると、前記ペプチドは、Clostridium perfringens菌株に対する抗菌活性を有する。他の実施形態によると、前記ペプチドは、質量分析法により測定された４０００Ｄａから４６００Ｄａまで、好ましくは４１００Ｄａから４５００Ｄａまでの分子量を有する。他の実施形態によると、前記ペプチドは、中性ｐＨにおいて抗菌活性を有し、酸性ｐＨ、例えばｐＨ７未満、好ましくは４．４未満において、抗菌活性を維持する。一実施形態によると、前記ペプチドは、配列番号１の配列及び／又は配列番号２の配列を含む。他の実施形態によると、前記ペプチドは、配列番号３の配列のペプチドをさらに含む。好ましくは、前記ペプチドは、配列番号４、５又は６の配列を有するペプチドのいずれかから選択されるペプチドを含む。
【００５１】
本発明は、モノゼニックラットの盲腸の内容物から単離された抗菌能力を有するペプチドに関し、これは、逆相ＨＰＬＣの２１４ｎｍにおいて検出された図４Ａのクロマトグラムに対応し、種々のClostridium perfringens菌株、特に、トキシノタイプＡに対して活性を有する。
【００５２】
（ポリヌクレオチド）
本発明は、抗菌活性をコードするポリヌクレオチドに関する。好ましくは、これらのポリヌクレオチドは、Ruminococcusの抗菌活性をコードする。
【００５３】
本発明によると、「ポリヌクレオチド」という用語は、１本鎖ポリヌクレオチド、そのＤＮＡ型若しくはＲＮＡ型の相補鎖又は相補的ＤＮＡ型若しくはゲノムＤＮＡ型の２本鎖を意味する。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ型、特に２本鎖ＤＮＡの型である。また、「ポリヌクレオチド」という用語は、修飾ポリヌクレオチドも意味する。
【００５４】
本発明のポリヌクレオチドは、それらの自然環境から単離又は精製され得る。また、本発明のポリヌクレオチドは、化学合成を介し、又は「分子クローニング：研究室マニュアル」（コールドスプリングハーバー研究所出版、コールドスプリングハーバー、ＮＹ、１９８９）において、Sambrook、Fristsch及びManiatisにより述べられている標準的な分子生物学的方法を介して調製され得る。
【００５５】
本発明は、配列番号７、８又は９の配列のいずれかのポリヌクレオチドに関する。また、本発明は、配列番号７、８又は９の配列のいずれかのポリヌクレオチドとハイブリッド形成するポリヌクレオチドに関する。また、本発明は、前記の抗菌活性を有するペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。
【００５６】
本発明は、配列番号７、８又は９の配列のいずれか１つのポリヌクレオチドと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％及び好ましくは少なくとも９９％の同一性を有するポリヌクレオチドに関する。このポリヌクレオチドは、抗菌活性をコードしている。一実施形態によると、前記ポリヌクレオチドは、Clostridium perfringens菌株に対する抗菌活性をコードしている。
【００５７】
「同一のヌクレオチド」という用語は、不変又は２つの配列の間で不変であるヌクレオチドを意味する。このポリヌクレオチドは、基準のポリヌクレオチドに関する少なくとも１つのヌクレオチドを除去、付加又は置換してもよい。
【００５８】
本発明は、配列番号７、８又は９の配列のいずれか１つのポリヌクレオチドと、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％及び好ましくは少なくとも９９％の類似性を有するポリヌクレオチドに関する。このポリヌクレオチドは、抗菌活性をコードする。一実施形態によると、前記ポリヌクレオチドは、Clostridium perfringens菌株に対する抗菌活性をコードする。
【００５９】
「類似性」という用語は、タンパク質配列同士又は核酸配列同士の類似点の程度を意味する。このポリヌクレオチドは、基準のポリヌクレオチドに関する少なくとも１つのヌクレオチドを除去、付加又は置換してもよい。スコアにより定量化された２つの配列の間の類似性の度合いは、同一性の割合及び／又は配列の保存されている置換の割合に基づく。
【００６０】
核酸の配列同士の同一性の度合い及び類似性の度合いの測定及び同定の方法は当業者に知られている。配列の比較は、例えばVector NTi 9.1.0の手段、配列比較プログラムのAlignX (Clustal W algorithm) (Invitrogen INFORMAX, http://www.invitrogen.com)又はCLUSTAW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) のツールを用いることにより行われる。
【００６１】
本発明は、配列番号７、８又は９の配列のいずれか１つのポリヌクレオチドと選択的にハイブリッド形成できるポリヌクレオチドに関する。好ましくは、選択的なハイブリッド形成は、中程度に厳しい条件下で、さらに好ましくは、非常に厳しい条件下で行われる。本発明によると、「選択的にハイブリッド形成ができる配列」という用語は、バックグラウンドのノイズよりも著しく高いレベルに基準の配列とハイブリッド形成する配列を意味する。選択的にハイブリッド形成できる配列と基準の配列との相互作用により発生する信号のレベルは、通常、バックグラウンドノイズが発生する他のＤＮＡ配列同士の相互作用の信号よりも１０倍、好ましくは１００倍の強さである。選択的なハイブリッド形成が可能なハイブリッド形成の厳しい条件は、当業者に知られている。一般に、ハイブリッド形成及び洗浄の温度は、所与のｐＨ及び所与のイオン強度における基準の配列のＴｍよりも少なくとも５℃低い。概して、ハイブリッド形成の温度は、１５塩基〜５０塩基のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドでは少なくとも３０℃であり、５０塩基よりも多くのヌクレオチドからなるポリヌクレオチドは少なくとも６０℃である。一例として、ハイブリッド形成は、以下の緩衝液中で行われる。６×ＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ ＰＶＰ、０．０２％ Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ ＢＳＡ及び５００μｇ／ｍｌ 変性サーモン精液ＤＮＡ。洗浄は、例えば、２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ緩衝液で軽度の厳しい条件下において、０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ緩衝液で中程度の厳しい条件下において、及び０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ緩衝液で非常に厳しい条件下において連続的に行われる。当然に、ハイブリッド形成は、当業者に知られている一般的な他の方法により行われてもよい（特に、Sambrook、Fristsch及びManiatisの「分子クローニング：研究室マニュアル」（コールドスプリングハーバー研究所出版、コールドスプリングハーバー、ＮＹ、１９８９）を参照）。好ましくは、基準のポリヌクレオチドと選択的にハイブリッド形成するポリヌクレオチドは、基準の配列の機能を保存する。本発明の場合、配列番号７、８又は９の配列のいずれか１つのポリヌクレオチドと選択的にハイブリッド形成するポリヌクレオチドは、抗菌活性をコードする。
【００６２】
本発明は、一般に、本発明に係るペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。遺伝子コードの縮重のため、異なるポリヌクレオチドが同一のペプチドをコードすることもある。
【００６３】
（発現カセット）
本発明の一実施形態によると、本発明に係るペプチドをコードしているポリヌクレオチドは、当業者に知られているクローニング技術を用いて発現カセットに挿入される。この発現カセットは、本発明に係るペプチドをコードしている配列の転写及び翻訳に必要な配列を含む。
【００６４】
好ましくは、この発現カセットは、宿主細胞を介してペプチドを生産するための配列、及びこの発現を制御するのに必要な配列の両方を含む。
【００６５】
これらの発現カセットは、転写方向に、宿主生物において機能するプロモータ、本発明に係るポリヌクレオチド、及び前記宿主生物において機能するターミネータ配列を含む。
【００６６】
全ての型のプロモータ配列は、本発明に係る発現カセットに用いられることができる。プロモータの選択は、特に、所望の遺伝子の発現のために選択された宿主生物に依存する。特定のプロモータは、恒常的な発現を可能とするが、他のプロモータは誘導性である。
【００６７】
真菌類の機能的プロモータにおいて、Aspergillus nidulansからのグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素のプロモータが特に言及されている（Roberts等.,Current Genet.15,177-180,1989）。
【００６８】
細菌の機能的プロモータにおいて、バクテリオファージＴ７からのＲＮＡポリメラーゼのプロモータが特に言及されている（Studier等.,Methods in Enzymology,185,60-89,1990）。
【００６９】
酵母の機能的プロモータにおいて、ＧＡＬ１遺伝子のプロモータ（Elledge等.,Proc.Natl Acad.Science,USA.88,1731-1735,1991）、又はＧａｌ４のプロモータについて言及され、また、S.cerevisiaeのＡＤＨプロモータについても言及されている。これら全てのプロモータは、文献に記載され、当業者に知られている。
【００７０】
Penicillium funiculosumにおける発現のために、例えば、Ｈ４Ｂヒストンプロモータ、アスパラギン酸プロテアーゼプロモータ又はｃｓ１１３プロモータ（WO00/68401）を含む発現カセットが選択される。
【００７１】
pichia pastoris酵母における発現のために、例えば、メタノール誘導性ＡＯＸ１プロモータ（Tschopp等.,Biotechnology,5,1305-1308,1987）又はＧＡＰの強い恒常性プロモータ（Waterham等.,Gene 186,37-44,1997）を含む発現カセットが選択される。
【００７２】
Schizosaccharomyces pombeにおける発現のために、例えば、チアミンにより抑制され、チアミンの非存在下において活性されるＮｔｍ１制御プロモータ（Maundrell,J.Biol.Chem.265,10857-10864,1989）を含む発現カセットが選択される。
【００７３】
本発明に係る発現カセットは、ポリペプチド又はポリヌクレオチドの発現に必要な他の配列を含んでもよい。それは、例えば、宿主細胞により産生されたポリペプチドの分泌を可能とする制御配列又はシグナル配列である。特に、発現カセットに挿入されたコード配列の発現レベルを増大させる制御配列を用いることも可能である。本発明によると、特に、プロモータ制御配列、及び転写活性因子（エンハンサ）のようなプロモータとコード配列との間に位置する他のプロモータ制御配列の組み合わせを用いることもできる。
【００７４】
さらに、本発明に係る発現カセットは、シグナル配列のような宿主生物により産生されるポリペプチドの分泌に必要な配列を含んでもよい。Pichia Pastorisによる分泌のために、例えば、分泌シグナルとしてα因子配列を用いることができる。
【００７５】
多種多様なターミネータ配列は、本発明に係る発現カセットに用いることができ、これらの配列は、転写の終結及びｍＲＮＡのポリアデニル化を引き起こす。選択された宿主生物において機能的である全てのターミネータ配列が用いられ得る。
【００７６】
Penicillium funiculosumにおける発現のために、例えば、Ｈ４.Ｂヒストンターミネータ、アスパラギン酸プロテアーゼターミネータ又はｃｓ１１３ターミネータ（WO00/68401）を含む発現カセットが選択される。
【００７７】
本発明の対象は、本発明に係る発現カセットを含むポリヌクレオチドであり、本発明に係る発現カセットはベクターに挿入されていることが好ましい。
【００７８】
（ベクター）
本発明は、本発明に係る少なくとも１つのポリヌクレオチド又は発現カセットを含み、宿主生物を形質転換させるクローニングベクター又は発現ベクターに関する。このベクターは、特に、本発明に係るポリヌクレオチド又は発現カセットが挿入されているプラスミド、コスミド、バクテリオファージ又はウイルスに相当する。これらのベクターを構築し、これらのベクターに本発明のポリヌクレオチドを挿入するための技術は、当業者に知られている。特に、ポリヌクレオチド又はペプチドの発現誘導のために、宿主細胞において自己で維持、自己複製又は自己増殖できるベクターが、一般に用いられ得る。当業者は、形質転換させるための宿主生物の機能、及び用いられる形質転換技術の作用から適切なベクターを選択する。
【００７９】
本発明のベクターは、特に、宿主生物における本発明に係るベクターの複製及び／又は本発明に係るペプチドの発現のために、宿主生物の形質転換に用いられる。
【００８０】
本発明は、本発明に係る発現カセットを含む発現ベクター及び／又は本発明に係るポリヌクレオチドを用いて、宿主生物を形質転換させる工程、及び前記宿主生物により産生されたペプチドを単離させる工程を含んでいる本発明に係るペプチドの調製方法に関する。
【００８１】
（宿主生物）
本発明の対象は、本発明に係る少なくとも１つのポリヌクレオチド、少なくとも１つの発現カセット又は少なくとも１つのベクターの宿主生物への組み込みにより、該宿主生物を形質転換させる方法である。ポリヌクレオチドは、宿主生物のゲノムに組み込まれてもよく、また、宿主生物において安定に複製されてもよい。宿主生物の形質転換の方法は、当業者に知られ、文献に広く記載されている。
【００８２】
本発明は、本発明に係るポリヌクレオチド、発現カセット又はベクターを用いて形質転換された宿主生物に関する。
【００８３】
本発明によると、「宿主生物」という用語は、特に、細菌、酵母又は真菌から選択される、特に、高等又は下等な単細胞又は多細胞生物のいずれも意味する。特に、「宿主生物」はヒトでない生物を意味する。好ましくは、酵母は、例えば、Piachia pastoris、Saccharomyces cervisiae、Yarrowia lipolytica及びSchwanniomyces occidentalisから選択される。真菌は、例えば、Aspergillus、Trichoderma及びPenicilliumsから選択され、好ましくは、Penicillium funiculosum、Trichoderma reesei、Aspergillus niger、Aspergillus awamori、Aspergillus kawachii及びTrichoderma koningiiから選択される。本発明の一実施形態において、宿主生物は、本発明に係るペプチドを発現又は過剰発現させるPenicillium funiculosum菌株である。他の実施形態において、宿主生物は、本発明に係るペプチドを発現又は過剰発現させるDebaromyces castellii菌株である。さらに他の実施形態において、宿主生物は、本発明に係るペプチドを発現又は過剰発現させるRuminococcus gnavus菌株である。
【００８４】
ベクターの構築、宿主生物の形質転換及びこれらの生物における異種のタンパク質の発現を行う技術は、文献に広く記載されており、特に、Sambrook、Fristsch及びManiatisの「分子クローニング：研究室マニュアル」（コールドスプリングハーバー研究所出版、コールドスプリングハーバー、ＮＹ、１９８９）又はAusubel等の「分子生物学における現代のプロトコール」（Greene Publishing Associates,Inc.,及びJohn Wiley and Sons,NY,1992）に記載されている。
【００８５】
（菌株）
Ruminococcus gnavusの新規の菌株は、２００６年１２月１９日にＣＮＣＭ Ｉ−３７０５番として、ＣＮＣＭ（Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F-75015 Paris）に寄託された。ＣＮＣＭは、ブダペスト条約第７条に従う国際寄託当局である。
【００８６】
前記の新規の菌株は、R.gnavus L14菌株の無作為の変異誘発により得られた。この菌株は、インビトロではＲｕｍＡを産生する能力を失い、インビボではＲｕｍＣを合成できるR.gnavusの自然変異型である。強力なアルキル化剤であるＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＧ）は変異誘発のために用いられた。遺伝子組み換えは、他の起源のＤＮＡ又はＲＮＡを用いる組み換え技術により成されなかった。
【００８７】
LEM9-17菌株の培養培地は、好ましくは、酵母抽出物及びヘミンを加えたＢＨＩ培地（BHI-YH）である。
【００８８】
（タンパク質混合物、発酵マスト）
本発明は、本発明に係る抗菌活性を有するペプチドの調製方法に関し、該方法は以下の工程を含んでいる。
【００８９】
ａ）Ruminococcus gnavus菌株を培養する、又は、前記ペプチドの発現を誘導する条件下で本発明に係る宿主生物の形質転換を行う、
ｂ）前記ペプチドを含む培養上清を回収する。
【００９０】
培養上性からのペプチドの分離は、電荷、大きさ及び／又は疎水性を利用して行われる。当業者は、培地の種々の構成物の電荷、大きさ及び／又は疎水性により分離する種々の技術を知っている。
【００９１】
この培養上清又は発酵マストは、食品添加物又は飼料の剤形のために濃縮又は凍結乾燥され得る。この方法は、培養上清から抗菌物質を精製する付加的工程を含んでもよい。
【００９２】
宿主生物が培養培地に抗菌物質を分泌しない場合、細胞の溶解及び細胞抽出物の精製といった付加的工程が必要となり得る。
【００９３】
本発明のペプチドは、モノゼニックラットの盲腸の内容物から得られてもよい。
【００９４】
（組成物）
本発明に係る組成物は、本発明に係るペプチド、本発明に係る宿主生物、本発明に係る菌株、本発明に係る発酵マスト又は本発明に係る菌株の発酵マストを含む。前記組成物は、液体状又は粉末状である。これらの組成物は、種々の成分を含む。
【００９５】
液体の組成物は、例えば他の抗菌剤、例えばソルビン酸、ソルビン酸塩、安息香酸、安息香酸塩、フマル酸又はフマル酸塩を含んでもよい。本発明の組成物は、ソルビトールを含んでもよい。ソルビトールは、安定化剤であり、製剤化に関わる物質である。本発明の組成物は、凍結防止剤、例えば、エチレングリコール、グリセロール、プロピレングリコール及び1,2−プロパンジオールを含んでもよい。
【００９６】
粉末状の組成物は、担体を含む。この担体は、小麦粉、デンプン、マルトデキストリン、石膏及びコーンコブから選択され得る。
【００９７】
本発明に係る組成物は、抗菌活性を有する。それらは、抗生物質の使用に代わる方法を提供する。それらは、例えば、動物の飼育において又はヒトに対する薬物として用いられ得る。
【００９８】
本発明の組成物は、本発明に係る少なくとも１つのペプチドを含み、また、それらは、他の物質、例えばビタミン、他の活性源、アミノ酸又は無機塩類を含んでもよい。
【００９９】
本発明に係る組成物は、例えば、ブタ又は家禽の壊死性腸炎の予防又は治療、及びヒトの消化器疾患の予防又は治療を可能とする。
【０１００】
本発明の組成物は、例えば、飼料に加えられ、又は、例えば栄養基礎成分と組み合わされる。従って、本発明は、本発明に係る組成物を含む飼料に関する。通常、この飼料は、抗菌活性を有する組成物が組み込まれた粉末又は顆粒の形状である。本発明の対象は、本発明に係るペプチド、本発明に係る宿主生物又は本発明に係る宿主生物の発酵マスト若しくは培養上清を含んでいる飼料である。
【０１０１】
「飼料」という用語は、動物の食べ物として用いられ得る全てのものを意味する。「栄養基礎成分」という用語は、例えば、穀類とタンパク質と動物及び／又は植物由来の脂質との混合により構成された動物の食料の必須の要素を構成する全てのものを意味する。通常、これらの栄養基礎成分は、例えばトウモロコシ、小麦、エンドウ豆及び大豆を含む。これらの栄養基礎成分は、それらが意図する種々の動物種のニーズに適応される。それらは、例えば、家禽（産卵鶏、ブロイラ鶏、シチメンチョウ及びカモ）又はブタ（成長が終了したブタ又は子豚）であってもよい。
【０１０２】
（ペプチドの用途）
本発明は、薬物の製造のための本発明に係るペプチド、本発明に係る宿主生物、本発明に係る菌株、本発明に係る宿主生物の発酵マスト又は本発明に係る菌株の発酵マストの用途に関する。
【０１０３】
また、本発明は、飼料において他の組成物と組み合わせる栄養性添加物とする本発明に係るペプチド、本発明に係る宿主生物、本発明に係る菌株、本発明に係る宿主生物の発酵マスト又は本発明に係る菌株の発酵マストの用途に関する。
【０１０４】
本発明の一実施形態によると、この薬物又は栄養性添加物は、ブタ又は家禽の壊死性腸炎の予防又は治療に用いられる。
【０１０５】
本発明の一実施形態によると、この薬物又は栄養性添加物は、ヒトの消化器疾患の予防又は治療に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】R.gnavus E1菌株を宿しているモノゼニックラットの盲腸の１０ｇの内容物に含まれる可溶性画分のセファデックスＧ−７５における分子ふるいにより得られたクロマトグラムであり、ｘ軸は溶出量をｍＬで示し、ｙ軸は２８０ｎｍの吸光度を示し、陰影の付いた領域は、C.perfringensに対する活性を有する分画（３２５分画〜３５８分画）に相当する。
【図２Ａ】セファデックスＧ−７５における標準タンパク質の分子ふるいにより得られたクロマトグラムであり、ｘ軸は溶出量をｍＬで示し、ｙ軸は２８０ｎｍの吸光度を示し、ａは６７ｋＤａのアルブミンであり、ｂは４３ｋＤａのオボアルブミンであり、ｃは２５ｋＤａのキモトリプシンであり、ｄは１３．７ｋＤａのリボヌクレアーゼＡである。
【図２Ｂ】図２Ａのクロマトグラムから得られた対数検量線（ＭＭ）＝ｆ（Ｖｅ）であり、ｘ軸は溶出量をｍＬで示し、ｙ軸は分子量の対数を示す。
【図３】活性ＧＦ分画の陽イオン交換カラムにおけるＨＰＬＣにより得られたクロマトグラムであり、ｙ軸の左側は２１４ｎｍの吸光度を示し、ｙ軸の右側はＮａＣｌの濃度をＭで示し、ｘ軸は時間を分で示している。
【図４】Ａは活性ＣＭ分画の逆相ＨＰＬＣにより得られたクロマトグラムであり、ｙ軸の左側は２１４ｎｍの吸光度を示し、ｙ軸の右側はアセトニトリル溶出液の割合を示し、ｘ軸は時間を分で示している。Ｂ及びＣは逆相ＨＰＬＣから得られた分画の質量スペクトルであり、ｘ軸は質量／電荷を示し、ｙ軸は信号強度を示している。
【図５】R.gnavus E1菌株を宿しているモノゼニックラットの盲腸の内容物からＲｕｍＣを精製するためのプロトコールである。
【図６】脱塩されたＳＮ ９−１７分画の陽イオン交換樹脂におけるＦＰＬＣにより得られたクロマトグラムであり、ｘ軸は時間を分で示し、ｙ軸は２１４ｎｍの吸光度を示し、ａは２１４ｎｍの吸光度であり、ｂはＮａＣｌの濃度であり、ｃは伝導率であり、ｄは流速をｍＬ／分で示している。
【図７】ＲｕｍＣの精製の間の種々の分画の質量スペクトルであり、ｘ軸は質量／電荷を示し、ｙ軸は信号強度を示し、ＡはＳＮ ９−１７であり、Ｂは活性ＣＭ分画であり、ＣはＲ １０ｋＤａである。
【図８】ＧＦ ４７−５０の分画の質量スペクトルであり、ｘ軸は質量／電荷を示し、ｙ軸は信号強度を示している。
【図９】LEM 9-17変異株からＲｕｍＣを精製するためのプロトコールである。
【発明を実施するための形態】
【０１０７】
（材料及び方法）
１．細菌株及び培養培地
ＲｕｍＣを産生するRuminococcus gnavus E1は、健常な成人の糞便の優位な微生物叢から単離された（Dabard等.,Appl.Environ.Microbiol.,67,4111-4118,2001）。R.gnavus L14菌株は、インビトロにおいてＲｕｍＡを産生する能力を失い、インビボにおいてＲｕｍＣを合成できるR.gnavus E1の自然変異体である。
【０１０８】
２００６年１２月１９日にＣＮＣＭ Ｉ−３７０５番として、ＣＮＣＭに寄託されたRuminococcus gnavus菌株は、L14菌株の無作為の変異誘発により得られた。これは、トリプシンが添加された寒天培地（５００μｇ／ｍｌ、しかしながら液体培地には入っていない）において、インビトロでＲｕｍＣを産生できる。それは、LEM 9-17菌株である。
【０１０９】
活性試験のための標的として用いられる菌株は、Clostridium perfringens CpA菌株である（Dabard等.,Appl.Environ.Microbiol.,67,4111-4118,2001）。
【０１１０】
これらの４つの菌株は、制御された環境下（８５％ Ｎ２、１０％ Ｈ２、５％ ＣＯ２）でフレター型のチャンバーにおいて嫌気的に培養される。それらは、酵母抽出物及びヘミンが加えられたＢＨＩ培地（ＢＨＩ−ＹＨ）において３７℃で培養される。
【０１１１】
液体ＢＨＩ−ＹＨ：３７ｇ／ＬのＢＨＩ（Brain Heart Infusion,Difco Laboratories）
５ｇ／Ｌの酵母抽出物（Yeast Extract,Fluka）
５ｍｇ／Ｌのヘミン（Hemin,Sigma）
寒天ＢＨＩ−ＹＨ：上記の材料＋１５ｇ／Ｌの寒天（BACTO agar,Difco Laboratories）
２．液体検体を用いる抗菌活性試験
液体検体を用いる抗菌活性試験を行うために、１０４個〜１０５個のC.perfringens CpA細胞を寒天培地に播く。３０分間室温に置いた後に、パスツールピペットを用いて、寒天培地に直径が６ｍｍのウェルを形成する。形成したウェル及び培養シャーレに１００μＬ以下の検体を播き、３７℃で１６時間〜２４時間培養する。検体がC.perfringens CpAに対する直接的な抗菌物質を含む場合、細菌の成長は阻害されて、ウェルの周囲に成長抑制によるハローの形成が引き起こされる。
【０１１２】
この活性試験は、C.perfringensが予め播種された寒天培地に、１０μＬの検体を直接播くことにより行われてもよい。
【０１１３】
３．寒天培地における成長コロニーを用いる抗菌活性試験
抗菌物質を潜在的に産生する菌株を５０μｇ／ｍＬのトリプシンを追加する又は他の方法により含む寒天培地において、２４時間培養した後に、抗菌物質を潜在的に産生する菌株を標的菌株を含む軟寒天培地（７．５ｇ／Ｌの寒天を含む）に播く。この軟寒天培地は、１０４個〜１０５個の標的菌株の細胞を含む５ｍＬの液体培地で灌流された５ｍＬの寒天培地を即座に混合することにより調製される。その培養シャーレを、１６時間〜２４時間、３７℃で再び保温する。成長抑制によるハローは、抗菌物質を産生するコロニーの周囲に見られる。
【０１１４】
４．盲腸の内容物における壊死細胞片及び食物の残留物の除去
１０ｇの盲腸の内容物を３０ｍＬのＰＢＳ（NaCl 137mM, KCl 2.68mM, Na2HPO4 8.1mM, KH2PO4 1.47mM, pH7.4）により希釈し、１００００×ｇ、４℃の条件で１５分間遠心分離を行う。これにより、壊死細胞片及び食物の残留物を含む沈殿物が除去される。
【０１１５】
５．遠心分離ろ過装置
遠心分離ろ過装置は、遠心分離を用いて分子量により、２つの分画にタンパク質を分離するろ過膜である。これは、検体の濃縮又は脱塩のために用いることもできる。
【０１１６】
いくつかの製造業者は、これらの型の製品を販売している。ほとんどの場合、膜は再生セルロースにより作られているが、それらは、ポリエーテルスルホンにより作られていてもよい。それらの選択は、処理される検体の容量及び膜の分離許容限界による（表１）。ローターの型及び遠心分離の速度の選択のために製造業者により設けられている説明書に従って、これらのろ過装置を用いた。しかしながら、遠心分離の時間は、検体の粘性により変更できた。
【０１１７】
表１：ＲｕｍＣの精製試験において用いられるろ過装置の特性
【０１１８】
【表１】
【０１１９】
６．セファデックスＧ−７５による分子ふるい
盲腸の内容物の上清の分子ふるいは、セファデックスＧ−７５（２．４×１８７ｃｍ）のカラムにより行われる。検体（容量はカラムの容積の約２％とする）をカラムに吸着させ、ＰＢＳを用い、流速を１ｍＬ／分とし、４℃で溶出を行い、２ｍＬの６００分画が回収する。それぞれの分画の２８０ｎｍの吸光度を検出することによりクロマトグラムが得られる。
【０１２０】
７．ＦＰＬＣによる分子ふるい
活性ＣＭ分画の分子ふるいは、ＦＰＬＣにより行われる。検体をHiLoad 26/60 Superdex 30pgカラム（ＧＥヘルスケア）に吸着させる。ＰＢＳを用いて、２．５ｍＬ／分の流速で溶出を行う。溶出されたタンパク質を、２８０ｎｍの吸光度の変化を測定することにより検出する。２分の溶出に相当する分画は自動的に回収される。
【０１２１】
８．陽イオン交換ＣＭカラムによるＨＰＬＣ
陽イオン交換ＨＰＬＣは、Waters 616 Pump注入器を備えるWaters 600S Contorollerにより行われる。検体（０．５ｍＬ）をＴＳＫのCM-3SW Spherogel分取用カラムに吸着させる。２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液によるｐＨ５とした条件下において、０Ｍ〜１Ｍの濃度勾配をつけたＮａＣｌを用いて０．８ｍＬ／分の流速で溶出を行う。初めの２０分間は、ＮａＣｌの非存在下で均一濃度において溶出を行い、その後の３０分間は、０Ｍから０．５ＭにリニアにＮａＣｌの濃度勾配がつけられた条件下で行う。その後の５分間は、均一濃度の条件下で溶出を行い、その後の１分間でＮａＣｌの濃度を１Ｍにし、均一濃度で１５分間続け、最後に開始時の条件に戻す。溶出されたタンパク質を、Waters 486 Tunable Absorbance Detectorを用いて２８０ｎｍ又は２１４ｎｍの吸光度を測定することにより検出する。分画は自動的に回収され、それをAmicon Ultra PL-5装置を用いて脱塩する。
【０１２２】
９．陽イオン交換カラムによるＦＰＬＣ
陽イオン交換クロマトグラフィは、ＦＰＬＣの連鎖により行われる。検体をHi-Prep 16/10 CM FFカラム（ＧＥヘルスケア）に吸着する。２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液によりｐＨ５とした条件下において、０Ｍ〜０．４Ｍの濃度勾配をつけたＮａＣｌを用いて溶出を行う。ＮａＣｌの非存在下の均一濃度で２ｍＬ／分の流速の条件により、溶出を５０分間行う。その後に、４０分間かけて０Ｍから０．４ＭにリニアにＮａＣｌの濃度を変化させ、５ｍＬ／分の流速で溶出を続ける。溶出されたタンパク質を、２８０ｎｍの吸光度の変化を測定することにより検出する。１ｍＬの分画は、自動的に回収され、それをSep-Pak C18カートリッジにより脱塩する。
【０１２３】
１０．逆相ＨＰＬＣ
逆相ＨＰＬＣは、Alliance Waters 1690 Separations Moduleにより行われる。０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いて事前に酸性化された検体（１００μＬ）を、Vydac 218TP52 250×2分析用カラムに吸着する。一定の流速（０．５ｍＬ／分）で溶出を行う。１５％のアセトニトリルの均一濃度で１０分間の溶出を行った後に、６０分かけてアセトニトリルの濃度を１５％から３０％にリニアに濃度を変化させる。１分間でアセトニトリルの濃度を７０％に変更し、溶出を均一濃度で１９分間続けた後に、開始時の条件に戻す。溶出されたタンパク質を、Waters 996 Photodiode Array Detectorを用いて２１４ｎｍにおける吸光度の変化を測定することにより検出する。アセトニトリルは、Speed Vac Concentrator（Savant）を用いて蒸発させる。
【０１２４】
１１．質量分析
質量分析は、Timone proteomic plateau（薬科大学、マルセイユ、フランス）において行われた。
【０１２５】
Maldi型の質量スペクトルは、遅延抽出を有する正の線形モードにおいて用いられるEttan Maldi-Tof Pro spectrometer（ＧＥヘルスケア、ウプサラ、スウェーデン）により得られる。液滴乾燥の方法を介してMaldiの標的において、α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸の５ｍｇ／ｍＬの溶液を用いて検体を共結晶化する。良好な信号を得るために、２０ｋＶの加速電位及び最小のレベルに設定されたレーザによりスペクトルを得る。質量が知られているペプチドの標準混合物（Pepmix4,Laserbiolabs, ニース, フランス）を取得し、これを用いて外部のモードにおいてスペクトルの較正を行う。
【０１２６】
結晶化させることが困難である特定の検体の場合、共結晶化を2,5−ジヒドロキシ安息香酸溶液を用いて行う。
【０１２７】
１２．エドマン法
この技術は、フェニルイソチオシアネート（Ｃ６Ｈ５Ｎ＝Ｃ＝Ｓ）を有するタンパク質の遊離末端アミノ酸の反応に基づく。この環状化合物は、基本的な媒体において、タンパク質の第１のアミノ酸残基に求核的に攻撃を行う。ペプチドのフェニルチオカルボミル（ＰＴＣ）誘導体は、その後に、加水分解により切断される。第１のアミノ酸のアニリノ−チアゾリノン（ＡＴＺ）及びこのアミノ酸を失ったタンパク質が得られる。ＡＺＴ−アミノ酸は、フェニルチオヒダントイン−（ＰＴＨ）アミノ酸に転換される。
【０１２８】
連続的に得られたＰＴＨ−アミノ酸を２８０ｎｍにおける吸光度の測定及び溶出時間の比較によるＲＰ−ＨＰＬＣにより分離及び同定する。反応サイクルは繰り返すことが可能であるため、タンパク質の配列を検出できる。
【０１２９】
１３．無作為の変異誘導
３７℃で２４時間培養されたL14菌株の１４ｍＬの培養液を２ｍＬチューブに７つに分け、その後に、これらのチューブに対して５８００×ｇで１０分間遠心分離を行う。細胞の沈殿物に対して、２ｍＬの０．１Ｍクエン酸塩緩衝液（クエン酸２１ｍｇ／ｍＬ、ＮａＯＨ８．８ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ５．５）を用いて、２度の洗浄を行い、その後に、強力な変異誘発剤であるＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＧ）の濃度が増大するように変化させているクエン酸塩緩衝液をそれぞれに加える。
【０１３０】
表２：Sep-Pakによる脱塩に用いられる溶液の量
【０１３１】
【表２】
【０１３２】
その後に、３７℃で３０分間、それぞれのチューブを保温し、５８００×ｇで１０分間遠心分離する。沈殿物を０．１Ｍのリン酸緩衝液（KH2PO4 13.6mg/mL, NaOH 2.32mg/mL, pH7）を用いて洗浄し、その後に、それを液体ＢＨＩ−ＹＨ培地に入れる。
【０１３３】
１４．Sep-Pak C18カートリッジ（Waters）における脱塩
本モデルによると、これらのカラムは、相が流されるシリンジ形状の中にあり、又は、シリンジの端に固着されたミニカラムである。緩衝液の流動は、蠕動型ポンプにより保証される。第１段階において、カラムにＨ２Ｏを通過させ、その後にＣＨ３ＣＮを通過させ、最後に０．０５％ＴＦＡを含むＨ２Ｏを通過させるにより、カラムは平衡化される。その後に、０．０５％ＴＦＡを用いて事前に酸性化された検体を吸着させる。Ｈ２Ｏ−０．０５％ＴＦＡ、４０％ＣＨ３ＣＮ−０．０５％ＴＦＡ及びＣＨ３ＣＮ−０．０５％ＴＦＡを連続的に加えることにより、３つの工程において溶出を連続的に行う。
【０１３４】
従って、３つの分画が回収される。それらは、カラムにより保持されないタンパク質及び塩に相当する分画（分画ＮＲ）、４０％ＣＨ３ＣＮにより希釈されたタンパク質を含む分画（４０％ＡＣＮ分画）及び１００％ＣＨ３ＣＮにより希釈されたタンパク質を含む分画（１００％ＡＣＮ分画）である。溶媒を容量に依存して、Speed Vac Concentrator又はRotavaporを用いて蒸発させる。
【０１３５】
表３はＲｕｍＣの精製から得られる分画の脱塩のために用いられる溶液の容量を示している（結果及び考察を参照）。これらの容量は、Sep-Pakの相の容量に依存する。
【０１３６】
表３：Sep-Pakによる脱塩に用いられる溶液の容量
【０１３７】
【表３】
【０１３８】
１５．温度耐性試験
ＲｕｍＣを含む分画を分割し、ヒートブロックを用いて５分〜１５分間それぞれを異なる温度で熱し、その後に４℃で保存する。その後に、それらを用いて抗菌活性試験を行う。
【０１３９】
１６．ｐＨ耐性試験
ＲｕｍＣを含む分画を分割し、それぞれを所望の緩衝液により約１０倍に希釈する。室温で１０分間置いた後に、それぞれの溶液をVivaspin 500 3kDaろ過装置に吸着し、その後に製造業者の説明書に従って遠心分離を行う。Vivaspin 500により保持されている分画に緩衝液を加え、そのろ過装置に対して再び遠心分離を行う。Vivaspin 500 3kDaにより保持された、すなわち、ＲｕｍＣを含む分画のそれぞれの容量は、開始時の容量と一致するように緩衝液を用いて調節する。これらの分画を４℃で保存し、その後に、それらを用いて抗菌活性試験を行う。
【０１４０】
Vivaspin 500 3kDaろ過装置は、ｐＨ９以上には耐えられない。従って、酸性又は中性のｐＨの緩衝液のみを用いた。構成は以下の通りである。
【０１４１】
ｐＨ２緩衝液：５０ｍＭ ＫＣｌ−１３ｍＭ ＨＣｌ
ｐＨ４．４緩衝液：０．２Ｍ ｐＨ４．４ 酢酸ナトリウム緩衝液
ｐＨ７緩衝液：５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４−３９ｍＭ ＮａＯＨ。
【０１４２】
（結果及び考察）
１．盲腸の内容物からのＲｕｍＣの精製
Ruminococcus gnavus E1菌株は培養可能であるにもかかわらず、ＲｕｍＣは、試験された培養条件下のインビトロにおいて産生されない。ＲｕｍＣを精製するために、E1菌株を宿しているモノゼニックラットの盲腸の内容物を用いること、又は、インビトロにおいてＲｕｍＣを産生できるR.gnavus変異株を作製することが必要である（第２節を参照）。
【０１４３】
１．１．モノゼニックラットの盲腸の内容物の希釈
第１工程として、ＰＢＳにより盲腸の内容物を希釈した。
【０１４４】
１．２．壊死細胞片の除去
精製の第２工程において、盲腸の内容物を遠心分離することにより、細菌、壊死細胞片及び食物の残留物を除去する。
【０１４５】
１．３．濃縮
前記のように調製された溶液をAmicon Ultra-15 PL-5システムにより濃縮し、その後に、分子ふるいカラムにかける。
【０１４６】
１．４．抗菌活性試験
得られた全ての分画をC.perfringens CpA菌株に対して試験した。これは、モノゼニックラットの盲腸の内容物中に抗C.perfringens物質が存在するかどうか確認する試験であった。
【０１４７】
陰性対照としてアゼニックラット（微生物を含まない）の盲腸の内容物を用いた。抗C.perfringens活性は検出されなかった。従って、モノゼニックラットの盲腸の内容物に含まれる抗C.perfringens物質は、実際にR.gnavus E1に特異的である。
【０１４８】
その後は、それぞれの精製試験の後に、抗C.perfringens活性試験を続けた。第１段階において、負の結果がこの試験の感度の許容限界と関連しないことが確実であることに注意し、活性があるかどうかのみを調べた。第２段階において、確立されていたプロトコールを用いて定量試験を行った。
【０１４９】
１．５．セファデックスＧ−７５カラムによる分子ふるい
分子ふるいは、セファデックスＧ−７５カラム（２．４×１８７ｃｍ）により行われた。回収した２ｍＬの６００分画のそれぞれの２８０ｎｍにおける吸光度を検出することにより、溶出をモニタリングした。
【０１５０】
事前にMicrocon YM-3を用いて濃縮された分画を用いて、抗菌活性試験を行った。
【０１５１】
３２５分画〜３５８の分画は、C.perfringensに対して活性があることを証明し、新規の活性ＧＦ分画を構成するためにこれらを貯えた（図１の陰影領域）。
【０１５２】
アゼニックラットの盲腸の内容物を用いた対照群の溶出プロファイルは、モノゼニックラットの盲腸の内容物を用いて得られた検体の溶出プロファイルと比較されたが、抗C.perfringens活性は検出されなかった。
【０１５３】
１．６．ＲｕｍＣの大きさの評価
活性ＧＦ分画にあるＲｕｍＣの大きさを評価するために、分子量が知られている標準タンパク質を前記と同一のセファデックスＧ−７５カラムに吸着させ、それぞれの溶出容量を測定した（図２Ａ）。その後に、物質の分子量の対数（ｌｏｇ（ＭＭ））とその溶出容量（Ｖｅ）との釣り合いを定義する較正曲線を描いた（図２Ｂ）。６８３ｍＬの溶出容量の平均値を用いると、外挿であるが、抗菌物質は選択された標準タンパク質の範囲内にあり、その分子量は、約５２００Ｄａであると評価された。
【０１５４】
１．７．陽イオン交換樹脂によるクロマトグラフィ
カルボキシメチル（ＣＭ）−Sepherogelカラムによる陽イオン交換クロマトグラフィに活性ＧＦ分画をかける場合、ＨＰＬＣ法を用いることが予測された。ｐＨ５においてＮａＣｌの濃度勾配を用いて溶出を行い、これを２１４ｎｍにおいてモニタリングした（図３）。
【０１５５】
活性は３２分〜３８分に見られ（活性ＣＭ分画）、これはＮａＣｌの濃度が０．２Ｍ〜０．３Ｍに対応する。この技術によると、保持されていない分画、特に全ての黄色の色素の混入を除去することができた。
【０１５６】
質量分析法による活性ＣＭ分画の分析により、約４２００ｋＤａの単一のペプチドを含むことが示される（結果は示さず）。
【０１５７】
この分画に対してＮ末端の配列決定法を行った。初めの１１アミノ酸は、AGVIX(N/S)GXAV（配列番号１０）と決定された。この配列は、周知のタンパク質との強い相同性は示されていない。
【０１５８】
また、配列決定法は２つの主要でない配列を明らかにした。
【０１５９】
１．８．逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィ
２１４ｎｍにおける種々の吸収ピークが得られた。
【０１６０】
活性はａ（又は２重ピーク）及びｂ（又は単一ピーク）として示されている２つの分画において明らかにされた（図４）。これら２つの分画の質量分析法による分析により、３つの主要なペプチドの存在が明らかとなり、それぞれのペプチドの分子量は４２３０Ｄａ〜４４６０Ｄａである。（図４Ｂ及び図４Ｃ）。
【０１６１】
盲腸の内容物からのＲｕｍＣの精製を、３つのクロマトグラフィ、すなわち、分子ふるい、陽イオン交換クロマトグラフィ及び逆相クロマトグラフィを用いて再び行った。得られた溶出プロファイルは、第１の試験の溶出プロファイルと同等である。従って、ＲｕｍＣの精製法は、再現性があるため採用できる。
【０１６２】
盲腸の内容物からＲｕｍＣを精製する方法を要約した模式図を図５に示す。
【０１６３】
１．９．精製収率及び精製因子
慣習により、溶液中の任意の活性単位（ＡＡＵ）の数値は、活性のある最終希釈度の逆数となるように定義される。従って、精製により得られたそれぞれの活性分画の希釈系列液（２倍）に対して抗C.perfringens活性の試験を行った。
【０１６４】
精製因子は、それぞれの分画のタンパク質のAAU/mgで表される特異的活性との比較により得られる。種々の分画におけるタンパク質の量の評価は、質量吸光係数Ｅ０．１％である１．８を用いて、２８０ｎｍにおけるそれらの測定値から推定された。
【０１６５】
表４はモノゼニックラットの盲腸の内容物からＲｕｍＣを精製するためのプロトコールの工程における活性収率及び精製因子を示す。
【０１６６】
表４：１０ｇのモノゼニックラットの盲腸からインビボにおいてＲｕｍＣを精製するときの活性収率及び精製因子
【０１６７】
【表４】
【０１６８】
１．１０．ペプチド配列の決定
２重ピーク分画及び単一ピーク分画における生成物の分子量は異なるが、エドマン法により、AGXIXSGSVAV（配列番号３）である単一の主要なＮ末端配列を決めることが可能である。
【０１６９】
関連する２つの分画において、AGPAYXVGYXGNNGAVT（配列番号２）である１７残基の主要でない配列も明らかにされた。
【０１７０】
２．無作為の変異誘導による変異株の作製
用いられた技術は、R.gnavus L14菌株の無作為の変異誘導であった。この菌株は、インビトロでＲｕｍＡを産生する能力を失ったが、インビボでＲｕｍＣを合成できるR.gnavus E1の自然発生的な変異体である。この菌株は、強力なアルキル化剤であるＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＧ）処理を受けた。
【０１７１】
同一のL14菌株培養液を分割したそれぞれに、ＮＧの濃度を増やしていくように処理した（０μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ）。処理後に、種々の細胞懸濁液を懸濁し、培養シャーレに播いた。培養後に、コロニーを数えることにより、細胞懸濁液中の生細胞の濃度を推定することができた。
【０１７２】
対照濃度（ＮＧ処理をしていないチューブ１）と比較することにより、それぞれの処理における死亡率が決定できた。ＮＧによる処理が効果的であったと思える。死亡率は５０％〜９９％であり、濃度と共に増大する。
【０１７３】
所望の変異体を見つけるために、種々の処理において生存したクローンから無作為に選択された約８６０のコロニーを、トリプシンが添加された寒天培地において２次培養し、その後に、それらに対し抗C.perfringens活性試験を行った。
【０１７４】
８３クローンはトリプシンの存在下で寒天培地において、抗C.perfringens物質を産生できることを見いだした。
【０１７５】
これらのクローンのうち２０クローンを、より厳密な特徴付けのために選択した。
【０１７６】
第１段階において、クローンに影響している変異に対して、ＰＣＲによりｒｕｍＡの染色体組織を復元しないことを確認した。
【０１７７】
その後に、選択された２０クローンに対して、トリプシンの存在下又は非存在下で寒天培地及び液体培地において、抗Clostridium perfringens活性試験を行った。
【０１７８】
トリプシンを添加した寒天培地において、試験した２０クローンのうちの７つの周囲に成長抑制によるハローが認められた。
【０１７９】
その一方で、トリプシンを添加していない寒天培地において、抗C.perfringens物質を産生したクローンは無かった。従って、トリプシンはバクテリオシンの合成において常に重要である。トリプシンを含んでいる液体培地において培養されたクローンは、抗C.perfringens物質を産生しない。
【０１８０】
３．変異株を用いる精製
産生及び精製試験は、産生能を有する７つのクローンのうちの１つのクローンである変異体９−１７に対して行った。
【０１８１】
その試験を種々の細胞濃度及びトリプシン濃度を含む軟寒天培地において行った。変異体の培養の後に、その寒天培地を細かく砕き、上清（ＳＮ９−１７）を回収するために遠心分離した。この上清をC.perfringensに対して試験し、活性を実証した。質量分析法による分析をこの活性上清に対して行った（図７Ａ）。
【０１８２】
３．１．ＦＰＬＣ法を用いた陽イオン交換樹脂によるクロマトグラフィ
イオン交換クロマトグラフィを行う前に、検体を脱塩する必要がある。
【０１８３】
第１の試験は、AmiconによるＳＮ９−１７の脱塩が不十分であることを示した。従って、Sep-Pakによる検体の脱塩は、予備的な精製工程として考えられるべきである。
【０１８４】
Sep-Pakからのタンパク質の溶出は、４０％アセトニトリル溶液を用いて行われる。Rotavaporによりアセトニトリルを蒸発させた後に、その溶液は、ｐＨ５の２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液により希釈されることにより、ｐＨ５に平衡化される。６５ｍＬのＳＮ９−１７からｐＨ５に平衡化された５０ｍＬの脱塩化ＳＮ９−１７が得られ、これをカルボキシメチル−セファロース陽イオン交換カラムに吸着させる。
【０１８５】
０Ｍ〜０．４ＭのＮａＣｌの濃度勾配を４０分間かけて変化させた。対照が２８０ｎｍの吸収において変動させるとき、ほんのわずかなタンパク質が、０．２Ｍ〜０．３ＭのＮａＣｌを用いて溶出された分画に存在するにもかかわらず、抗C.perfringens活性は、この分画において認められた。（図６）。盲腸の内容物からＲｕｍＣを精製する間に、それはすでに見られた。活性分画を蓄積した後に、Sep-Pakにより脱塩及び濃縮を行った。この分画（活性ＣＭ分画）に対する質量分析法により、陽イオン交換クロマトグラフィによってなされた精製において実質的に得られたものを確認し、２５００Ｄａ未満の分子量を有する全ての混入物を示す（図７Ｂ）。
【０１８６】
３．２．ＣＭ分画の分子ふるい
活性ＣＭ分画の分子ふるいは、１０ｋＤａ未満の質量を有するペプチドの分離ができるカラムを用いたＦＰＬＣ法により行われた。溶出は２８０ｎｍの吸光度の変動を検出することによりモニターされる。タンパク質の量は少なく、分離は不十分であることがわかる（図示せず）。それにもかかわらず、選択された分画において抗C.perfringens活性を試験した。吸着された活性の５％のみがふるいの後に認められた。従って、この技術を精製のために採用しなかった。その一方で、活性分画（ＧＦ４７−５０）は、質量分析法により分析され、４２３５Ｄａのペプチドに対して実質的に純粋であることが証明された（図８）。
【０１８７】
３．３．ＣＭ分画のろ過
活性ＣＭ分画から混入物を除去する他の試みは、ろ過装置を用いて行われた。ＲｕｍＣは５ｋＤａフィルターにより（わずかに小さな分子量を有するにもかかわらず）保持されるため、第１の試験を、分離限界が５ｋＤａであるVivaspin 500を用いて行った。残念ながら、不純物もそのフィルターに保持される。但し、それらの分子量は２．５ｋＤａ未満である。具体的に、質量分析法において、精製により得られたいかなるものも認められなかった（結果は示さず）。従って。第２の試験を、分離限界が１０ｋＤａであるMicroconろ過装置を用いて試みた。具体的に、その分子量にもかかわらず、ＲｕｍＣが１０ｋＤａフィルターにより保持される（１０ｋＤａ Ｒ分画）ことが以前に述べられていた。質量分析法は以前の結果を確認し、混入物の多くの割合が保持されない分画において除去されることを可能とする（図７Ｃ）。
【０１８８】
３．４．１０ｋＤａ Ｒ分画のＨＰＬＣ法による逆相クロマトグラフィ
３つのＲｕｍＣのピーク（４２３５Ｄａ、４３２４Ｄａ及び４４５６Ｄａ）を含む１０ｋＤａ Ｒ分画を逆相クロマトグラフィにかけた。流速及び勾配の条件は、盲腸の内容物からＲｕｍＣを精製するための条件と同一であり、得られた結果は同等である。２つの異なる分画は、C.perfringensに対する活性がある２重ピーク分画及び単一ピーク分画である。
【０１８９】
３．５．精製収率及び精製因子
精製プロトコールを評価するために、定量的活性試験をそれぞれの活性分画の２倍の系列希釈液を用いて行った。それぞれの分画に含まれる任意活性単位（ＡＡＵ）の数値を算出し、精製収率が推定した（表５）。活性物質の相当な損失は、培養上清の脱塩の工程において見られ、陽イオン交換クロマトグラフィの後に、さらなる脱塩工程が続く。その損失は、陽イオン交換クロマトグラフィにおいて起こるおそれは十分にありそうだが、これはプロトコールの正当性における疑いを認めない。
【０１９０】
表５：変異体９−１７の培養上清からのＲｕｍＣの精製における収率
【０１９１】
【表５】
【０１９２】
精製プロトコールを評価するための他の重要な判断基準は、それぞれの工程により設けられている精製において得られたものの実証である。精製因子は、それぞれの工程における特異的活性（タンパク質のAAU/mg）を比較することにより決定される。しかし、これを行うためには、それぞれの分画に含まれるタンパク質の質量を測定しなければならない。精製モニタリングは、感度が理由で質量分析法により行われ、あまりにも多くの生体材料の消費を避けることを可能とした。この方法は定量的でないが、精製されたものは非常に明らかに示された。
【０１９３】
３．６．質量分析法
２重ピーク及び単一ピークの分画を質量分析法により分析した。得られた結果は、盲腸の内容物を用いる精製から得られた分画を用いて得られた結果と同一である。２重ピーク分画は、４３２４Ｄａ及び４４５６Ｄａのペプチドを含むが、単一ピーク分画は、４２３５Ｄａのペプチドを含む。
【０１９４】
３．７．配列決定
これらの分画に対して配列決定を行った。
【０１９５】
単一ピーク分画において、得られた配列は、すでに決定された配列であるAGXIXSGSVAV（配列番号３）と同一である。主要でない配列は、AGPAY（配列番号１１）として第５のサイクルに現れる。
【０１９６】
２重ピーク分画に関しては、AGXVXSGSTAV（配列番号１２）でありわずかに異なる。主要でない配列は、AGPAY（配列番号１１）であり同一である。
【０１９７】
変異株からのＲｕｍＣの精製を要約した模式図を図９に示している。
【０１９８】
精製されたＲｕｍＣの生産は、非常に単純化されている。
【０１９９】
４．ＲｕｍＣペプチドの特徴付け
４．１．異なる菌株に関する抗菌活性
ＲｕｍＣの抗菌活性について、R.gnavus E1（ＳＮ ＣＣＥ１）菌株を宿すモノゼニックラットの盲腸の内容物の上清を濃縮した第１段階を用いて、異なるグラム陽性病原菌株及びグラム陰性病原菌株に対して試験した。他の試験として、ＳＮ ＣＣＥ１に感受性のある菌株に対して、２つの精製された分画を用いて行った。その結果は表６に示す。
【０２００】
表６：異なる病原菌株に対するＲｕｍＣの活性試験の結果
【０２０１】
【表６】
【０２０２】
試験された全てのClostridium perfringens菌株は、ＲｕｍＣペプチドに感受性がある。
【０２０３】
４．２．C.perfringensに対する抗菌力
ＲｕｍＣの抗菌力について、精製されたＲｕｍＣ分画のそれぞれの最低阻害濃度をインビボで測定すること、及びC.perfringensに対して用いられる対照抗生物質であるメトロニダゾールの最小阻害濃度と比較することにより評価した。
【０２０４】
これを行うために、２重ピーク及び単一ピークの分画の２倍系列希釈液を調製した（１／５１２希釈まで）。これらの種々の希釈液及び異なる濃度のメトロニダゾール溶液を用いて、抗C.perfringens活性試験を行った（結果は示さず）。この試験において、メトロニダゾールの最小阻害濃度は２５μｇ／ｍＬである。この結果は、以前にDabard等により得られた結果（Dabard等.,Appl.Environ.Microbiol.,67,4111-4118,2001）と一致している。
【０２０５】
２重ピーク及び単一ピークの分画に関して、濃縮溶液（希釈液１）のみは活性である。これらの溶液の濃度は正確に分かっていないが、エドマン法により約４０μｇ／ｍＬと推定できる。
【０２０６】
C.perfringensに対するＲｕｍＣの抗菌力は、メトロニダゾールの抗菌力と同等であると考えられる。
【０２０７】
４．３．温度耐性
熱に対するＲｕｍＣの耐性についての第１の予備試験を、同一のペプチド量を異なる温度で１５分間置くことにより行った。インビボの２つのＲｕｍＣ分画（２重ピーク及び単一ピーク分画）において、７５℃で１５分間の処理は活性に影響はなかった。しかしながら、１００℃では、ペプチドは１５分以内に完全に不活性化される。
【０２０８】
９−１７株の培養上清から精製されたＲｕｍＣ検体を用いて、これらの試験を完了した。種々の温度における保温時間を５分とした。１００℃における保温時間を１５分とした。
【０２０９】
試験した第１の温度を８０℃とした。３つのペプチドを含む精製された分画である活性ＣＭ分画を用いて、第１の試験を行った。
【０２１０】
２重ピーク及び単一ピーク分画と対照的に、活性ＣＭ分画は１００℃で１５分間の処理に耐える。
【０２１１】
その後に、ＧＦ４７−５０分画について試験した。４２３５Ｄａのペプチドのみを含むこの純粋な分画は、１００℃で１５分間の処理に影響を受ける。また、それは、９０℃で５分間の処理にも影響を受ける（表７）。
【０２１２】
表７：温度耐性試験の要約表
【０２１３】
【表７】
【０２１４】
４．４．ｐＨ耐性
活性ＣＭ分画に含まれているペプチドのｐＨ耐性を、ｐＨ２、ｐＨ４．４及びｐＨ７において試験した。
【０２１５】
ｐＨ２において見られた活性は、ｐＨ７において見られた活性と同等である。４℃で２４時間置いた後に、ｐＨ２において活性の損失は見られない。
【０２１６】
従って、本発明のペプチドは、酸性ｐＨに対する耐性を有し、特に動物の栄養又は薬物の分野において用いるのに適している。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗菌活性を有するＲｕｍＣ１ペプチド、ＲｕｍＣ２ペプチド及びＲｕｍＣ３ペプチドに関し、また、これらのペプチドをコードし、Ruminococcus gnavus E1から単離された遺伝子にも関する。
【背景技術】
【０００２】
特定の菌株は、これらの競合者に対し、静菌作用又は殺菌作用を有する物質を放出する能力を持っている。これらの抗菌物質は、例えば有機酸のような有機物、過酸化水素（Ross等.,Int.J.Food Microbiol.79,3-16,2002)、又はペプチドからなり得る。抗生物質の種類に分類される酵素学的に生産された抗菌ペプチド（Mootz等.,Curr.Opin.Chem.Biol.1,543-551,1997; Keating等.,Curr.Opin.Chem.Biol.3,598-606,1999）、及びバクテリオシンの種類に分類されるリボソーム性に生産されたペプチド（Jacob等.,Ann.Inst.Pasteur(Paris)84,222-224,1953）は、区別される。
【０００３】
バクテリオシンは、研究界及び産業界における関心を増大させている。それらの使用は、特に、養殖業において、抗生物質の使用に代わる解決法となるかもしれない（Luchansky,Antonie Van Leeuwenhoek 76,335,1999;O'Sullivan等.,Biochimie 84,593-604,2002）。
【０００４】
バクテリオシンの多くの異なる発現法は、近年に開発された。特に、Morriset等（Morisset等.,Appl.Environ.Microbiol.,70,4672-4680,2004）は、Leuconostoc mesenteroidesの亜種のdextranicum DSM20484の中において、Leuconostoc mesenteroidesの亜種のmesenteroides Y105により産生されたクラスIIａのバクテリオシンであるメセンテリシンY105の変種を発現させた。同様に、Flynn等（Microbiol.,148,973-984,2002）は、Lactobacillus plantarum、Lactococcus lactis及びBacillus cereusの中において、Lactobacillus salivariusの亜種のsalivarius UCC118により、クラスIIｂのバクテリオシンであるABP-118の発現を最初に成し遂げた。
【０００５】
さらに、いくつかの試験がバクテリオシンを発現するために、Escherichia coli細菌において（McCormic等.,Appl.Environ.Microbiol.,69,1352-1358,2003; Biet等.,Microbiol.,144,2845-2854,1998; Miller等.,Appl.Environ.Microbiol.,64,14-20,1998; Richard等.,J.Bacteril.,186,4276-4284,2004; Kloche等.,Appl.Microbiol.Biotechnol.,67:532-538,2005）、Saccharomyces cerevisiae酵母において（Schoeman等.,Yeast,15,647-656,1999; Van Reene等.,Int.J.Food Microbiol.,81,29-40,2003）及び乳酸菌において（Rodriguez等.,Int.J.Food Microbiol.,80,101-116,2003）行われた。
【０００６】
多くの研究は、新規のバクテリオシンを同定することを目的とし、また、これらのバクテリオシンを生産するために行われた。
【０００７】
消化器の生態系には、細菌、酵母及び古細菌が連合している大量で且つ非常に複合的なミクロフローラが形成されている。このミクロフローラは、基本的に嫌気性であり、Bacteroides属、Eubacterium属、Clostridium属、Ruminococcus属、Bifidobacterium属及びFusobacterium属が主に見られる（Suau等.,Appl.Environ.Microbiol.65,4799-4807,1999）。ミクロフローラは宿主の健康に大きな影響を及ぼす。特に、食品由来の代謝合成物の毒化及び解毒に関する（Hughes及びRowland Microbial Ecology Health Disease 2,179-185,2000）。また、それは、腸細胞の機能の発現を調整することも可能である（Bry等.,Science 273,1380-1383,1996; Hooper等.,Science 291,881-884,2001）。また、それは、病原性外因の細菌の侵入に対して、宿主を保護する役割を果たす（Ducluzeau等.,Microbial Ecology and Intestinal Infections 2,240-246,2000）。
【０００８】
周知の腸の病原菌の１つとして、絶対嫌気性グラム陽性菌であるClostridium perfringensがあり、これは胞子形成することができ、自然環境において、非常に広範に存在する。この病原菌は食品から生じるが、腸内にも少し存在し、ストレスの影響により増殖及び毒素の分泌を開始できる。Clostridium perfringens菌株は、これらが産生する毒素の機能により５つのトキシノタイプに分類される（Petit等.,Trends Microbiol.7,104-110,1999）。タイプＡのC.perfringens菌株は、ヒトの消化器疾患の原因となる。１９９７年に、アメリカにおいて、245000件以上のC.perfringensの感染が記録された。これにより、４１人が入院し、そのうち７人が死亡した（Mead等.,Emerg.Infect.Dis.5,607-625,1999）。タイプＡ及びタイプＣのC.perfringens菌株は、それぞれブタ及び家禽の壊死性腸炎の原因となり得る。家禽において、壊死性腸炎は、進行の速い急性の病態であり、死亡率は１日に１％〜２％に達する。健康な動物における壊死性腸炎の発生率に加えて、その病態は、かなりの経済的影響をもつ。１９９９年まで、この病気は成長因子のような抗生物質を用いることにより十分に制御されていた。しかしながら、欧州連合は耐性菌の選択及びこれによるヒトへの抗生物質の効果の減少を恐れ、飼料にそれらを用いることを禁止した。この禁止以来、ブタ及び家禽において、Clostridium perfringensにより生じる壊死性腸炎は、欧州において、もはや制御できていない。Reseau National d'Observations Epidemiologiques en Aviculture (RNOEA) (AFSSA Ploufragan)により公表されたその件数は、１９９９年及び２０００年においてかなり増加している（Valancony,Bulletin des GTV 12,9-12,2001）。
【０００９】
現在、この病気の制御及び治療のための代替の解決策の探索が、最も重要なことである。
【００１０】
Ruminococcus gnavusは、Clostridiales目のLachnospiraceae科に属する絶対嫌気性細菌である。Dabard等は、ヒトの優占フローラから単離したRuminococcus gnavus E1菌株がruminococcin A又はＲｕｍＡとして知られる抗菌物質を産生でき、この物質は培養上清に蓄積されることを示した（Appl.Environ.Microbiol.,67,4111-4118,2001）。それは、lantibioticsの系統群に属するバクテリオシンであり、病原菌のClostridium菌種の種々の菌株に対し有効である。Gomez等は、Ruminococcin Aの生合成に関する遺伝子の発現がトリプシンがある場合には誘導されることを示した（J.Bacteriol.,184,18-28,2002）。また、これと同一の著者等は、特定の消化酵素がＲｕｍＡの産生の誘導を阻害する可能性を示した。
【００１１】
従って、発明者は他のバクテリオシンに関心をもった。
【００１２】
本発明は、Clostridium perfringensに対する抗菌活性を有するＲｕｍＣ１ペプチド、ＲｕｍＣ２ペプチド及びＲｕｍＣ３ペプチドに関し、また、これらのペプチドをコードする遺伝子に関する。
【発明の概要】
【００１３】
（配列表の説明）
配列番号１：Ruminococcus gnavus E1のＲｕｍＣペプチドの保存された配列
配列番号２：エドマン分解法により試験的に決定されたRuminococcus gnavus E1のＲｕｍＣペプチドのペプチド配列
配列番号３：エドマン分解法により試験的に決定されたRuminococcus gnavus E1のＲｕｍＣペプチドのペプチド配列
配列番号４：配列番号７から推定されたRuminococcus gnavus E1のＲｕｍＣ１ペプチドのペプチド配列
配列番号５：配列番号８から推定されたRuminococcus gnavus E1のＲｕｍＣ２ペプチドのペプチド配列
配列番号６：配列番号９から推定されたRuminococcus gnavus E1のＲｕｍＣ３ペプチドのペプチド配列
配列番号７：Ruminococcus gnavus E1のｒｕｍＣ１遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号８：Ruminococcus gnavus E1のｒｕｍＣ２遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号９：Ruminococcus gnavus E1のｒｕｍＣ３遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号１０〜１２：試験的に決定されたペプチド配列
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、配列番号１の配列のペプチド、配列番号１のポリペプチドと少なくとも８０％の相同性を有するペプチドを含んでいるペプチド、配列番号２の配列のペプチド、及び配列番号２のポリペプチドと少なくとも８０％の相同性を有するペプチドを含んでいるペプチドのうちから選択されるペプチドを含んでいることを特徴とする抗菌活性を有するペプチドに関する。本発明の一実施形態によると、このペプチドは、配列番号３の配列のペプチドをさらに含んでいる。本発明の他の実施形態によると、このペプチドは配列番号４、５又は６の配列のペプチドから選択されるペプチドを含んでいる。
【００１５】
本発明は、配列番号７、８又は９の配列のうちの１つを有するポリヌクレオチド、配列番号７、８又は９の配列のうちの１つを有するポリヌクレオチドとハイブリッド形成するポリヌクレオチド、及び前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのうちから選択されるポリヌクレオチドを含んでいることを特徴とする抗菌活性をコードするポリヌクレオチドに関する。
【００１６】
本発明は、転写方向に、宿主生物において機能するプロモータ、前記ポリヌクレオチド及び前記の宿主生物と同一の宿主生物におけるターミネータ配列を含んでいることを特徴とする発現カセットに関する。
【００１７】
さらに、本発明は、前記ポリヌクレオチド及び／又は発現カセットを含んでいるベクターに関する。
【００１８】
本発明は、前記ポリヌクレオチド、発現カセット及び／又はベクターを用いて形質転換された宿主生物に関する。
【００１９】
本発明は、２００６年１２月１９日にＣＮＣＭ Ｉ−３７０５番として、ＣＮＣＭ（Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F-75015 Paris）に寄託されたRuminococcus gnavus菌株に関する。また、前記ペプチドを産生する単離された形態の遺伝的に改変されていない菌株に関する。
【００２０】
本発明は、宿主生物又は前記菌株により得られるタンパク質混合物又は発酵マストに関する。
【００２１】
本発明は、前記ペプチド、前記宿主生物、前記菌株、前記宿主生物の発酵マスト又は前記菌株の発酵マストを含んでいる組成物に関する。本発明の一実施形態によると、前記組成物は液状又は粉末状である。
【００２２】
本発明は、前記ペプチド、前記宿主細胞、前記菌株、前記宿主細胞の発酵マスト又は前記発酵マストを含んでいる栄養性添加物に関する。本発明の一実施形態によると、前記添加物は液状又は粉末状である。
【００２３】
本発明は、動物のための栄養基礎成分及び前記栄養性添加物を含んでいることを特徴とする飼料に関する。
【００２４】
本発明は、薬物、栄養性添加物又は飼料を製造するための、前記ペプチド、前記宿主細胞、前記菌株、前記宿主細胞の発酵マスト又は前記菌株の発酵マストの用途に関する。本発明の一実施形態によると、前記薬物又は前記栄養性添加物は、家禽又はブタの壊死性腸炎の予防又は治療を目的とされている。本発明の他の実施形態によると、前記薬物又は前記栄養性添加物は、ヒトの消化器疾患の予防又は治療を目的とされている。
【００２５】
本発明は、動物に処理するための前記ペプチドの非治療的用途に関する。本発明の一実施形態によると、前記ペプチドは、その動物に内在的な菌株又はその動物に外因的な菌株から得られる。本発明の他の実施形態によると、前記ペプチドは、その動物に内在的な菌株から得られ、また、前記内在的な菌株によりペプチドの産生は促進される。本発明のさらなる他の実施形態によると、前記ペプチドは動物に内在的な菌株から得られ、また、前記内在的な菌株の成長は促進される。
【００２６】
（ペプチド）
従って、本発明は、抗菌活性を有するペプチドに関する。好ましくは、これらのペプチドは、Ruminococcus gnavus、例えばRuminocuccus gnavusの変異株から単離される。参考として、これらのペプチドは、２００６年１２月１９日にＣＮＣＭ Ｉ−３７０５番として、ＣＮＣＭ（Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F-75015 Paris）に寄託されたRuminococcus gnavus菌株、すなわち、LEM 9-17菌株から単離され得る。
【００２７】
「抗菌活性」という用語は、標的細菌の成長若しくは発生を阻害する又は標的細菌を殺す能力を意味する。抗菌活性を測定する方法は、当業者に知られている。本発明においては、抗菌活性は寒天培地で培養されたClostridium perfringens CpA菌株に対する活性試験により示される。本発明のペプチドのうちの１つを含む検体は、寒天培地に形成されたウェルに置かれる。抗菌活性は、成長抑制によるハローがウェルの周囲に形成されることにより示される。
【００２８】
Ruminococcus gnavus E1のＲｕｍＣ１ペプチド、ＲｕｍＣ２ペプチド及びＲｕｍＣ３ペプチドのペプチド配列は、それぞれ配列番号４、配列番号５及び配列番号６の配列により表される。これらの配列は、それぞれ配列番号７、配列番号８及び配列番号９の配列により表されるｒｕｍＣ１遺伝子、ｒｕｍＣ２遺伝子及びｒｕｍＣ３遺伝子のヌクレオチド配列から推定される。
【００２９】
本発明は、抗菌活性を有するRuminococcus gnavus E1のＲｕｍＣ１ペプチド、ＲｕｍＣ２ペプチド及びＲｕｍＣ３ペプチドの断片に関する。「ペプチド断片」という用語は、それが由来するペプチドの全てでなく、その一部からなるペプチドを意味する。従って、本発明は、配列番号１、配列番号２及び配列番号３の配列のペプチドに関する。
【００３０】
これらの断片は、抗菌活性を保存する。本発明は、生物学的活性断片に関する。「生物学的活性断片」という用語は、それが由来するポリペプチドの機能を保存するポリペプチドの断片を意味する。
【００３１】
本発明は、配列番号１、２又は３の配列のペプチドのいずれかと同一のアミノ酸の少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％及び好ましくは少なくとも９９％を備え、抗菌活性を有するペプチドに関する。
【００３２】
配列番号１、配列番号２及び配列番号３の配列のペプチドを調製する方法は、当業者に知られている。
【００３３】
ＲｕｍＣペプチドは、細胞外の環境において、細菌により分泌（又は放出）される。配列番号４、５及び／又は６の配列のペプチドのいずれかが所与のアミノ酸によるシグナルペプチドを含むことも可能である。この場合、本発明は、シグナルペプチドの切断の後に得られた成熟ペプチドに関する。本発明の一実施形態によると、配列番号４、５及び６の配列の２０番目〜６３番目のペプチド配列に関する。
【００３４】
他の実施形態において、配列番号４、５又は６のペプチドの潜在的なシグナルペプチドは、異種の宿主生物により、このペプチドの発現及び分泌を行うために異種のシグナルペプチドに置換されてもよい。
【００３５】
本発明の対象は、配列番号４、５及び６のペプチドと少なくとも８０％の相同性を有し、抗菌活性を備えるペプチドである。本発明の一実施形態によると、このペプチドは、Ruminococcus gnavus菌株から単離される。本発明の他の実施形態によると、このペプチドは、Ruminococcusのその他の菌株又は他の細菌から単離される。また、このペプチドは、化学合成を介して得られる。
【００３６】
本発明の一対象は、配列番号４、５及び６の配列のペプチドのいずれかと同一のアミノ酸の少なくとも９０％、９５％、９８％及び好ましくは少なくとも９９％を有するペプチドである。
【００３７】
「同一のアミノ酸」という用語は、２つの配列の間で不変であるアミノ酸を意味する。これらのペプチドは、配列番号４、５及び６の配列により表されるペプチドに関連する少なくとも１つのアミノ酸の除去、付加又は置換されてもよい。転写の後に、例えば脱水、硫化物橋の形成又はランチオニン等により修飾されたアミノ酸は、２つの配列の間で不変であるアミノ酸としてみなされる。
【００３８】
本発明の対象は、配列番号４、５及び６の配列のペプチドのいずれかと少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％及び好ましくは少なくとも９９％の類似性を有するペプチドである。
【００３９】
「類似性」という用語は、互いのタンパク質又は核酸の配列の類似点の程度を意味する。これらのペプチドは、配列番号４、５及び６の配列により表されるペプチドに関する少なくとも１つのアミノ酸の除去、付加又は置換されてもよい。スコアにより定量化された２つの配列の間の類似性の度合いは、互いの配列の相同性及び／又は保存している置換の割合に基づく。
【００４０】
ポリペプチド同士の間の同一性及び類似性の程度の測定及び同定の方法は、当業者に知られている。配列の比較は、例えばVector NTi 9.1.0の手段、配列比較プログラムのAlignX (Clustal W algorithm) (Invitrogen INFORMAX, http://www.invitrogen.com)又はCLUSTAW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) のツールを用いることにより行われる。
【００４１】
本発明に係るペプチドは、それらの自然環境から単離又は精製され得る。前記ペプチドは異なる工程を介して調製される。これらの工程は、特に、これらのペプチドを自然発現する細菌のような自然原料からの精製、適した宿主細胞による組み換え型ペプチドの産生及びこれらの後の精製、化学合成を介した生産、又はこれらの異なる方法の組み合わせである。従って、本発明の配列番号１〜６の配列のペプチドは、２００６年１２月１９日にＣＮＣＭ Ｉ−３７０５番として、ＣＮＣＭに寄託されたRuminococcus gnavus菌株から単離され得る。他の実施形態において、本発明のペプチドは、本発明に係るＲｕｍＣペプチド又は抗菌活性を有するＲｕｍＣペプチドの断片を発現する組み換え型宿主生物から単離される。
【００４２】
本発明の対象は、本発明に係るペプチドを含む融合タンパク質、組み換えタンパク質又はキメラタンパク質である。
【００４３】
本発明のペプチドは、Ruminococcus gnavus E1菌株を宿しているモノゼニックラットの盲腸の内容物から単離され、また、Ruminococcus gnavus変異株、さらに特異的には２００６年１２月１９日にＣＮＣＭ Ｉ−３７０５番として、ＣＮＣＭ（Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F-75015 Paris）に寄託されたRuminococcus gnavus菌株から単離され得る。これらのペプチドは、Clostridium perfringensに対する活性試験により実証される抗菌活性を有する。
【００４４】
質量分析法は、本発明に係るＲｕｍＣペプチドのおおよその分子量の決定を可能とした。その分子量は、４０００Ｄａから４６００Ｄａまでであり、より具体的には、４１００Ｄａから４５００Ｄａまでである。
【００４５】
本発明の一実施形態によると、前記ペプチドは、栄養的又は医薬的用途、例えば動物の栄養摂取のために用いるのに適する。
【００４６】
「栄養的又は医薬的用途に適するペプチド」という用語は、栄養物又は医薬に適することを特徴とするペプチドを意味する。栄養的又は医薬的用途に必須の特徴は、特にそのペプチドが耐えることができるｐＨである。具体的に、ヒト及び動物の消化器系のｐＨは酸性であり、従って、前記ペプチドがこのｐＨに耐えることは重要である。栄養的用途のための他の必須の特徴は、抗菌物質が活性する温度である。具体的に、薬物、栄養性添加物又は飼料に含まれる抗菌物質の加工は、例えば処理温度及び室温以上の温度を含む。従って、用いられる抗菌剤の活性は、加工の条件、特に前記の温度条件において安定でなければならない。
【００４７】
本発明の一実施形態によると、本発明に係るペプチド又はペプチド混合物は、中性ｐＨにおいて抗菌活性を有し、また、酸性ｐＨ、例えば７未満、好ましくは４．４未満において、抗菌活性を維持する。
【００４８】
本発明の一実施形態によると、本発明に係るペプチド又はペプチド混合物は、３７℃において抗菌活性を有し、室温以上及び未満、例えば５０℃以上の温度においてこの活性を維持する。
【００４９】
本発明は、モノゼニックラットの盲腸の内容物又はRuminococcus gnavus変異株から単離され、Clostridium perfringens菌株に対して活性を有し、質量分析法により測定された４０００Ｄａから４６００Ｄａまでの分子量を有し、ｐＨ７未満のｐＨに耐え、抗菌活性を備えるペプチドに関する。一実施形態によると、前記ペプチドは、配列番号１の配列及び／又は配列番号２の配列を含む。他の実施形態によると、前記ペプチドは、配列番号３の配列のペプチドを含む。好ましくは、前記ペプチドは、配列番号４、５又は６の配列を有するペプチドのいずれかから選択されるペプチドを含む。
【００５０】
本発明は抗菌活性を有するペプチドに関し、それは、Ruminococcus gnavus変異株、例えば２００６年１２月１９日にＣＮＣＭ Ｉ−３７０５番として、ＣＮＣＭに寄託されたRuminococcus gnavus菌株から得られる。一実施形態によると、前記ペプチドは、Clostridium perfringens菌株に対する抗菌活性を有する。他の実施形態によると、前記ペプチドは、質量分析法により測定された４０００Ｄａから４６００Ｄａまで、好ましくは４１００Ｄａから４５００Ｄａまでの分子量を有する。他の実施形態によると、前記ペプチドは、中性ｐＨにおいて抗菌活性を有し、酸性ｐＨ、例えばｐＨ７未満、好ましくは４．４未満において、抗菌活性を維持する。一実施形態によると、前記ペプチドは、配列番号１の配列及び／又は配列番号２の配列を含む。他の実施形態によると、前記ペプチドは、配列番号３の配列のペプチドをさらに含む。好ましくは、前記ペプチドは、配列番号４、５又は６の配列を有するペプチドのいずれかから選択されるペプチドを含む。
【００５１】
本発明は、モノゼニックラットの盲腸の内容物から単離された抗菌能力を有するペプチドに関し、これは、逆相ＨＰＬＣの２１４ｎｍにおいて検出された図４Ａのクロマトグラムに対応し、種々のClostridium perfringens菌株、特に、トキシノタイプＡに対して活性を有する。
【００５２】
（ポリヌクレオチド）
本発明は、抗菌活性をコードするポリヌクレオチドに関する。好ましくは、これらのポリヌクレオチドは、Ruminococcusの抗菌活性をコードする。
【００５３】
本発明によると、「ポリヌクレオチド」という用語は、１本鎖ポリヌクレオチド、そのＤＮＡ型若しくはＲＮＡ型の相補鎖又は相補的ＤＮＡ型若しくはゲノムＤＮＡ型の２本鎖を意味する。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ型、特に２本鎖ＤＮＡの型である。また、「ポリヌクレオチド」という用語は、修飾ポリヌクレオチドも意味する。
【００５４】
本発明のポリヌクレオチドは、それらの自然環境から単離又は精製され得る。また、本発明のポリヌクレオチドは、化学合成を介し、又は「分子クローニング：研究室マニュアル」（コールドスプリングハーバー研究所出版、コールドスプリングハーバー、ＮＹ、１９８９）において、Sambrook、Fristsch及びManiatisにより述べられている標準的な分子生物学的方法を介して調製され得る。
【００５５】
本発明は、配列番号７、８又は９の配列のいずれかのポリヌクレオチドに関する。また、本発明は、配列番号７、８又は９の配列のいずれかのポリヌクレオチドとハイブリッド形成するポリヌクレオチドに関する。また、本発明は、前記の抗菌活性を有するペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。
【００５６】
本発明は、配列番号７、８又は９の配列のいずれか１つのポリヌクレオチドと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％及び好ましくは少なくとも９９％の同一性を有するポリヌクレオチドに関する。このポリヌクレオチドは、抗菌活性をコードしている。一実施形態によると、前記ポリヌクレオチドは、Clostridium perfringens菌株に対する抗菌活性をコードしている。
【００５７】
「同一のヌクレオチド」という用語は、不変又は２つの配列の間で不変であるヌクレオチドを意味する。このポリヌクレオチドは、基準のポリヌクレオチドに関する少なくとも１つのヌクレオチドを除去、付加又は置換してもよい。
【００５８】
本発明は、配列番号７、８又は９の配列のいずれか１つのポリヌクレオチドと、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％及び好ましくは少なくとも９９％の類似性を有するポリヌクレオチドに関する。このポリヌクレオチドは、抗菌活性をコードする。一実施形態によると、前記ポリヌクレオチドは、Clostridium perfringens菌株に対する抗菌活性をコードする。
【００５９】
「類似性」という用語は、タンパク質配列同士又は核酸配列同士の類似点の程度を意味する。このポリヌクレオチドは、基準のポリヌクレオチドに関する少なくとも１つのヌクレオチドを除去、付加又は置換してもよい。スコアにより定量化された２つの配列の間の類似性の度合いは、同一性の割合及び／又は配列の保存されている置換の割合に基づく。
【００６０】
核酸の配列同士の同一性の度合い及び類似性の度合いの測定及び同定の方法は当業者に知られている。配列の比較は、例えばVector NTi 9.1.0の手段、配列比較プログラムのAlignX (Clustal W algorithm) (Invitrogen INFORMAX, http://www.invitrogen.com)又はCLUSTAW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) のツールを用いることにより行われる。
【００６１】
本発明は、配列番号７、８又は９の配列のいずれか１つのポリヌクレオチドと選択的にハイブリッド形成できるポリヌクレオチドに関する。好ましくは、選択的なハイブリッド形成は、中程度に厳しい条件下で、さらに好ましくは、非常に厳しい条件下で行われる。本発明によると、「選択的にハイブリッド形成ができる配列」という用語は、バックグラウンドのノイズよりも著しく高いレベルに基準の配列とハイブリッド形成する配列を意味する。選択的にハイブリッド形成できる配列と基準の配列との相互作用により発生する信号のレベルは、通常、バックグラウンドノイズが発生する他のＤＮＡ配列同士の相互作用の信号よりも１０倍、好ましくは１００倍の強さである。選択的なハイブリッド形成が可能なハイブリッド形成の厳しい条件は、当業者に知られている。一般に、ハイブリッド形成及び洗浄の温度は、所与のｐＨ及び所与のイオン強度における基準の配列のＴｍよりも少なくとも５℃低い。概して、ハイブリッド形成の温度は、１５塩基〜５０塩基のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドでは少なくとも３０℃であり、５０塩基よりも多くのヌクレオチドからなるポリヌクレオチドは少なくとも６０℃である。一例として、ハイブリッド形成は、以下の緩衝液中で行われる。６×ＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ ＰＶＰ、０．０２％ Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ ＢＳＡ及び５００μｇ／ｍｌ 変性サーモン精液ＤＮＡ。洗浄は、例えば、２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ緩衝液で軽度の厳しい条件下において、０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ緩衝液で中程度の厳しい条件下において、及び０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ緩衝液で非常に厳しい条件下において連続的に行われる。当然に、ハイブリッド形成は、当業者に知られている一般的な他の方法により行われてもよい（特に、Sambrook、Fristsch及びManiatisの「分子クローニング：研究室マニュアル」（コールドスプリングハーバー研究所出版、コールドスプリングハーバー、ＮＹ、１９８９）を参照）。好ましくは、基準のポリヌクレオチドと選択的にハイブリッド形成するポリヌクレオチドは、基準の配列の機能を保存する。本発明の場合、配列番号７、８又は９の配列のいずれか１つのポリヌクレオチドと選択的にハイブリッド形成するポリヌクレオチドは、抗菌活性をコードする。
【００６２】
本発明は、一般に、本発明に係るペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。遺伝子コードの縮重のため、異なるポリヌクレオチドが同一のペプチドをコードすることもある。
【００６３】
（発現カセット）
本発明の一実施形態によると、本発明に係るペプチドをコードしているポリヌクレオチドは、当業者に知られているクローニング技術を用いて発現カセットに挿入される。この発現カセットは、本発明に係るペプチドをコードしている配列の転写及び翻訳に必要な配列を含む。
【００６４】
好ましくは、この発現カセットは、宿主細胞を介してペプチドを生産するための配列、及びこの発現を制御するのに必要な配列の両方を含む。
【００６５】
これらの発現カセットは、転写方向に、宿主生物において機能するプロモータ、本発明に係るポリヌクレオチド、及び前記宿主生物において機能するターミネータ配列を含む。
【００６６】
全ての型のプロモータ配列は、本発明に係る発現カセットに用いられることができる。プロモータの選択は、特に、所望の遺伝子の発現のために選択された宿主生物に依存する。特定のプロモータは、恒常的な発現を可能とするが、他のプロモータは誘導性である。
【００６７】
真菌類の機能的プロモータにおいて、Aspergillus nidulansからのグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素のプロモータが特に言及されている（Roberts等.,Current Genet.15,177-180,1989）。
【００６８】
細菌の機能的プロモータにおいて、バクテリオファージＴ７からのＲＮＡポリメラーゼのプロモータが特に言及されている（Studier等.,Methods in Enzymology,185,60-89,1990）。
【００６９】
酵母の機能的プロモータにおいて、ＧＡＬ１遺伝子のプロモータ（Elledge等.,Proc.Natl Acad.Science,USA.88,1731-1735,1991）、又はＧａｌ４のプロモータについて言及され、また、S.cerevisiaeのＡＤＨプロモータについても言及されている。これら全てのプロモータは、文献に記載され、当業者に知られている。
【００７０】
Penicillium funiculosumにおける発現のために、例えば、Ｈ４Ｂヒストンプロモータ、アスパラギン酸プロテアーゼプロモータ又はｃｓ１１３プロモータ（WO00/68401）を含む発現カセットが選択される。
【００７１】
pichia pastoris酵母における発現のために、例えば、メタノール誘導性ＡＯＸ１プロモータ（Tschopp等.,Biotechnology,5,1305-1308,1987）又はＧＡＰの強い恒常性プロモータ（Waterham等.,Gene 186,37-44,1997）を含む発現カセットが選択される。
【００７２】
Schizosaccharomyces pombeにおける発現のために、例えば、チアミンにより抑制され、チアミンの非存在下において活性されるＮｔｍ１制御プロモータ（Maundrell,J.Biol.Chem.265,10857-10864,1989）を含む発現カセットが選択される。
【００７３】
本発明に係る発現カセットは、ポリペプチド又はポリヌクレオチドの発現に必要な他の配列を含んでもよい。それは、例えば、宿主細胞により産生されたポリペプチドの分泌を可能とする制御配列又はシグナル配列である。特に、発現カセットに挿入されたコード配列の発現レベルを増大させる制御配列を用いることも可能である。本発明によると、特に、プロモータ制御配列、及び転写活性因子（エンハンサ）のようなプロモータとコード配列との間に位置する他のプロモータ制御配列の組み合わせを用いることもできる。
【００７４】
さらに、本発明に係る発現カセットは、シグナル配列のような宿主生物により産生されるポリペプチドの分泌に必要な配列を含んでもよい。Pichia Pastorisによる分泌のために、例えば、分泌シグナルとしてα因子配列を用いることができる。
【００７５】
多種多様なターミネータ配列は、本発明に係る発現カセットに用いることができ、これらの配列は、転写の終結及びｍＲＮＡのポリアデニル化を引き起こす。選択された宿主生物において機能的である全てのターミネータ配列が用いられ得る。
【００７６】
Penicillium funiculosumにおける発現のために、例えば、Ｈ４.Ｂヒストンターミネータ、アスパラギン酸プロテアーゼターミネータ又はｃｓ１１３ターミネータ（WO00/68401）を含む発現カセットが選択される。
【００７７】
本発明の対象は、本発明に係る発現カセットを含むポリヌクレオチドであり、本発明に係る発現カセットはベクターに挿入されていることが好ましい。
【００７８】
（ベクター）
本発明は、本発明に係る少なくとも１つのポリヌクレオチド又は発現カセットを含み、宿主生物を形質転換させるクローニングベクター又は発現ベクターに関する。このベクターは、特に、本発明に係るポリヌクレオチド又は発現カセットが挿入されているプラスミド、コスミド、バクテリオファージ又はウイルスに相当する。これらのベクターを構築し、これらのベクターに本発明のポリヌクレオチドを挿入するための技術は、当業者に知られている。特に、ポリヌクレオチド又はペプチドの発現誘導のために、宿主細胞において自己で維持、自己複製又は自己増殖できるベクターが、一般に用いられ得る。当業者は、形質転換させるための宿主生物の機能、及び用いられる形質転換技術の作用から適切なベクターを選択する。
【００７９】
本発明のベクターは、特に、宿主生物における本発明に係るベクターの複製及び／又は本発明に係るペプチドの発現のために、宿主生物の形質転換に用いられる。
【００８０】
本発明は、本発明に係る発現カセットを含む発現ベクター及び／又は本発明に係るポリヌクレオチドを用いて、宿主生物を形質転換させる工程、及び前記宿主生物により産生されたペプチドを単離させる工程を含んでいる本発明に係るペプチドの調製方法に関する。
【００８１】
（宿主生物）
本発明の対象は、本発明に係る少なくとも１つのポリヌクレオチド、少なくとも１つの発現カセット又は少なくとも１つのベクターの宿主生物への組み込みにより、該宿主生物を形質転換させる方法である。ポリヌクレオチドは、宿主生物のゲノムに組み込まれてもよく、また、宿主生物において安定に複製されてもよい。宿主生物の形質転換の方法は、当業者に知られ、文献に広く記載されている。
【００８２】
本発明は、本発明に係るポリヌクレオチド、発現カセット又はベクターを用いて形質転換された宿主生物に関する。
【００８３】
本発明によると、「宿主生物」という用語は、特に、細菌、酵母又は真菌から選択される、特に、高等又は下等な単細胞又は多細胞生物のいずれも意味する。特に、「宿主生物」はヒトでない生物を意味する。好ましくは、酵母は、例えば、Piachia pastoris、Saccharomyces cervisiae、Yarrowia lipolytica及びSchwanniomyces occidentalisから選択される。真菌は、例えば、Aspergillus、Trichoderma及びPenicilliumsから選択され、好ましくは、Penicillium funiculosum、Trichoderma reesei、Aspergillus niger、Aspergillus awamori、Aspergillus kawachii及びTrichoderma koningiiから選択される。本発明の一実施形態において、宿主生物は、本発明に係るペプチドを発現又は過剰発現させるPenicillium funiculosum菌株である。他の実施形態において、宿主生物は、本発明に係るペプチドを発現又は過剰発現させるDebaromyces castellii菌株である。さらに他の実施形態において、宿主生物は、本発明に係るペプチドを発現又は過剰発現させるRuminococcus gnavus菌株である。
【００８４】
ベクターの構築、宿主生物の形質転換及びこれらの生物における異種のタンパク質の発現を行う技術は、文献に広く記載されており、特に、Sambrook、Fristsch及びManiatisの「分子クローニング：研究室マニュアル」（コールドスプリングハーバー研究所出版、コールドスプリングハーバー、ＮＹ、１９８９）又はAusubel等の「分子生物学における現代のプロトコール」（Greene Publishing Associates,Inc.,及びJohn Wiley and Sons,NY,1992）に記載されている。
【００８５】
（菌株）
Ruminococcus gnavusの新規の菌株は、２００６年１２月１９日にＣＮＣＭ Ｉ−３７０５番として、ＣＮＣＭ（Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F-75015 Paris）に寄託された。ＣＮＣＭは、ブダペスト条約第７条に従う国際寄託当局である。
【００８６】
前記の新規の菌株は、R.gnavus L14菌株の無作為の変異誘発により得られた。この菌株は、インビトロではＲｕｍＡを産生する能力を失い、インビボではＲｕｍＣを合成できるR.gnavusの自然変異型である。強力なアルキル化剤であるＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＧ）は変異誘発のために用いられた。遺伝子組み換えは、他の起源のＤＮＡ又はＲＮＡを用いる組み換え技術により成されなかった。
【００８７】
LEM9-17菌株の培養培地は、好ましくは、酵母抽出物及びヘミンを加えたＢＨＩ培地（BHI-YH）である。
【００８８】
（タンパク質混合物、発酵マスト）
本発明は、本発明に係る抗菌活性を有するペプチドの調製方法に関し、該方法は以下の工程を含んでいる。
【００８９】
ａ）Ruminococcus gnavus菌株を培養する、又は、前記ペプチドの発現を誘導する条件下で本発明に係る宿主生物の形質転換を行う、
ｂ）前記ペプチドを含む培養上清を回収する。
【００９０】
培養上性からのペプチドの分離は、電荷、大きさ及び／又は疎水性を利用して行われる。当業者は、培地の種々の構成物の電荷、大きさ及び／又は疎水性により分離する種々の技術を知っている。
【００９１】
この培養上清又は発酵マストは、食品添加物又は飼料の剤形のために濃縮又は凍結乾燥され得る。この方法は、培養上清から抗菌物質を精製する付加的工程を含んでもよい。
【００９２】
宿主生物が培養培地に抗菌物質を分泌しない場合、細胞の溶解及び細胞抽出物の精製といった付加的工程が必要となり得る。
【００９３】
本発明のペプチドは、モノゼニックラットの盲腸の内容物から得られてもよい。
【００９４】
（組成物）
本発明に係る組成物は、本発明に係るペプチド、本発明に係る宿主生物、本発明に係る菌株、本発明に係る発酵マスト又は本発明に係る菌株の発酵マストを含む。前記組成物は、液体状又は粉末状である。これらの組成物は、種々の成分を含む。
【００９５】
液体の組成物は、例えば他の抗菌剤、例えばソルビン酸、ソルビン酸塩、安息香酸、安息香酸塩、フマル酸又はフマル酸塩を含んでもよい。本発明の組成物は、ソルビトールを含んでもよい。ソルビトールは、安定化剤であり、製剤化に関わる物質である。本発明の組成物は、凍結防止剤、例えば、エチレングリコール、グリセロール、プロピレングリコール及び1,2−プロパンジオールを含んでもよい。
【００９６】
粉末状の組成物は、担体を含む。この担体は、小麦粉、デンプン、マルトデキストリン、石膏及びコーンコブから選択され得る。
【００９７】
本発明に係る組成物は、抗菌活性を有する。それらは、抗生物質の使用に代わる方法を提供する。それらは、例えば、動物の飼育において又はヒトに対する薬物として用いられ得る。
【００９８】
本発明の組成物は、本発明に係る少なくとも１つのペプチドを含み、また、それらは、他の物質、例えばビタミン、他の活性源、アミノ酸又は無機塩類を含んでもよい。
【００９９】
本発明に係る組成物は、例えば、ブタ又は家禽の壊死性腸炎の予防又は治療、及びヒトの消化器疾患の予防又は治療を可能とする。
【０１００】
本発明の組成物は、例えば、飼料に加えられ、又は、例えば栄養基礎成分と組み合わされる。従って、本発明は、本発明に係る組成物を含む飼料に関する。通常、この飼料は、抗菌活性を有する組成物が組み込まれた粉末又は顆粒の形状である。本発明の対象は、本発明に係るペプチド、本発明に係る宿主生物又は本発明に係る宿主生物の発酵マスト若しくは培養上清を含んでいる飼料である。
【０１０１】
「飼料」という用語は、動物の食べ物として用いられ得る全てのものを意味する。「栄養基礎成分」という用語は、例えば、穀類とタンパク質と動物及び／又は植物由来の脂質との混合により構成された動物の食料の必須の要素を構成する全てのものを意味する。通常、これらの栄養基礎成分は、例えばトウモロコシ、小麦、エンドウ豆及び大豆を含む。これらの栄養基礎成分は、それらが意図する種々の動物種のニーズに適応される。それらは、例えば、家禽（産卵鶏、ブロイラ鶏、シチメンチョウ及びカモ）又はブタ（成長が終了したブタ又は子豚）であってもよい。
【０１０２】
（ペプチドの用途）
本発明は、薬物の製造のための本発明に係るペプチド、本発明に係る宿主生物、本発明に係る菌株、本発明に係る宿主生物の発酵マスト又は本発明に係る菌株の発酵マストの用途に関する。
【０１０３】
また、本発明は、飼料において他の組成物と組み合わせる栄養性添加物とする本発明に係るペプチド、本発明に係る宿主生物、本発明に係る菌株、本発明に係る宿主生物の発酵マスト又は本発明に係る菌株の発酵マストの用途に関する。
【０１０４】
本発明の一実施形態によると、この薬物又は栄養性添加物は、ブタ又は家禽の壊死性腸炎の予防又は治療に用いられる。
【０１０５】
本発明の一実施形態によると、この薬物又は栄養性添加物は、ヒトの消化器疾患の予防又は治療に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】R.gnavus E1菌株を宿しているモノゼニックラットの盲腸の１０ｇの内容物に含まれる可溶性画分のセファデックスＧ−７５における分子ふるいにより得られたクロマトグラムであり、ｘ軸は溶出量をｍＬで示し、ｙ軸は２８０ｎｍの吸光度を示し、陰影の付いた領域は、C.perfringensに対する活性を有する分画（３２５分画〜３５８分画）に相当する。
【図２Ａ】セファデックスＧ−７５における標準タンパク質の分子ふるいにより得られたクロマトグラムであり、ｘ軸は溶出量をｍＬで示し、ｙ軸は２８０ｎｍの吸光度を示し、ａは６７ｋＤａのアルブミンであり、ｂは４３ｋＤａのオボアルブミンであり、ｃは２５ｋＤａのキモトリプシンであり、ｄは１３．７ｋＤａのリボヌクレアーゼＡである。
【図２Ｂ】図２Ａのクロマトグラムから得られた対数検量線（ＭＭ）＝ｆ（Ｖｅ）であり、ｘ軸は溶出量をｍＬで示し、ｙ軸は分子量の対数を示す。
【図３】活性ＧＦ分画の陽イオン交換カラムにおけるＨＰＬＣにより得られたクロマトグラムであり、ｙ軸の左側は２１４ｎｍの吸光度を示し、ｙ軸の右側はＮａＣｌの濃度をＭで示し、ｘ軸は時間を分で示している。
【図４】Ａは活性ＣＭ分画の逆相ＨＰＬＣにより得られたクロマトグラムであり、ｙ軸の左側は２１４ｎｍの吸光度を示し、ｙ軸の右側はアセトニトリル溶出液の割合を示し、ｘ軸は時間を分で示している。Ｂ及びＣは逆相ＨＰＬＣから得られた分画の質量スペクトルであり、ｘ軸は質量／電荷を示し、ｙ軸は信号強度を示している。
【図５】R.gnavus E1菌株を宿しているモノゼニックラットの盲腸の内容物からＲｕｍＣを精製するためのプロトコールである。
【図６】脱塩されたＳＮ ９−１７分画の陽イオン交換樹脂におけるＦＰＬＣにより得られたクロマトグラムであり、ｘ軸は時間を分で示し、ｙ軸は２１４ｎｍの吸光度を示し、ａは２１４ｎｍの吸光度であり、ｂはＮａＣｌの濃度であり、ｃは伝導率であり、ｄは流速をｍＬ／分で示している。
【図７】ＲｕｍＣの精製の間の種々の分画の質量スペクトルであり、ｘ軸は質量／電荷を示し、ｙ軸は信号強度を示し、ＡはＳＮ ９−１７であり、Ｂは活性ＣＭ分画であり、ＣはＲ １０ｋＤａである。
【図８】ＧＦ ４７−５０の分画の質量スペクトルであり、ｘ軸は質量／電荷を示し、ｙ軸は信号強度を示している。
【図９】LEM 9-17変異株からＲｕｍＣを精製するためのプロトコールである。
【発明を実施するための形態】
【０１０７】
（材料及び方法）
１．細菌株及び培養培地
ＲｕｍＣを産生するRuminococcus gnavus E1は、健常な成人の糞便の優位な微生物叢から単離された（Dabard等.,Appl.Environ.Microbiol.,67,4111-4118,2001）。R.gnavus L14菌株は、インビトロにおいてＲｕｍＡを産生する能力を失い、インビボにおいてＲｕｍＣを合成できるR.gnavus E1の自然変異体である。
【０１０８】
２００６年１２月１９日にＣＮＣＭ Ｉ−３７０５番として、ＣＮＣＭに寄託されたRuminococcus gnavus菌株は、L14菌株の無作為の変異誘発により得られた。これは、トリプシンが添加された寒天培地（５００μｇ／ｍｌ、しかしながら液体培地には入っていない）において、インビトロでＲｕｍＣを産生できる。それは、LEM 9-17菌株である。
【０１０９】
活性試験のための標的として用いられる菌株は、Clostridium perfringens CpA菌株である（Dabard等.,Appl.Environ.Microbiol.,67,4111-4118,2001）。
【０１１０】
これらの４つの菌株は、制御された環境下（８５％ Ｎ２、１０％ Ｈ２、５％ ＣＯ２）でフレター型のチャンバーにおいて嫌気的に培養される。それらは、酵母抽出物及びヘミンが加えられたＢＨＩ培地（ＢＨＩ−ＹＨ）において３７℃で培養される。
【０１１１】
液体ＢＨＩ−ＹＨ：３７ｇ／ＬのＢＨＩ（Brain Heart Infusion,Difco Laboratories）
５ｇ／Ｌの酵母抽出物（Yeast Extract,Fluka）
５ｍｇ／Ｌのヘミン（Hemin,Sigma）
寒天ＢＨＩ−ＹＨ：上記の材料＋１５ｇ／Ｌの寒天（BACTO agar,Difco Laboratories）
２．液体検体を用いる抗菌活性試験
液体検体を用いる抗菌活性試験を行うために、１０４個〜１０５個のC.perfringens CpA細胞を寒天培地に播く。３０分間室温に置いた後に、パスツールピペットを用いて、寒天培地に直径が６ｍｍのウェルを形成する。形成したウェル及び培養シャーレに１００μＬ以下の検体を播き、３７℃で１６時間〜２４時間培養する。検体がC.perfringens CpAに対する直接的な抗菌物質を含む場合、細菌の成長は阻害されて、ウェルの周囲に成長抑制によるハローの形成が引き起こされる。
【０１１２】
この活性試験は、C.perfringensが予め播種された寒天培地に、１０μＬの検体を直接播くことにより行われてもよい。
【０１１３】
３．寒天培地における成長コロニーを用いる抗菌活性試験
抗菌物質を潜在的に産生する菌株を５０μｇ／ｍＬのトリプシンを追加する又は他の方法により含む寒天培地において、２４時間培養した後に、抗菌物質を潜在的に産生する菌株を標的菌株を含む軟寒天培地（７．５ｇ／Ｌの寒天を含む）に播く。この軟寒天培地は、１０４個〜１０５個の標的菌株の細胞を含む５ｍＬの液体培地で灌流された５ｍＬの寒天培地を即座に混合することにより調製される。その培養シャーレを、１６時間〜２４時間、３７℃で再び保温する。成長抑制によるハローは、抗菌物質を産生するコロニーの周囲に見られる。
【０１１４】
４．盲腸の内容物における壊死細胞片及び食物の残留物の除去
１０ｇの盲腸の内容物を３０ｍＬのＰＢＳ（NaCl 137mM, KCl 2.68mM, Na2HPO4 8.1mM, KH2PO4 1.47mM, pH7.4）により希釈し、１００００×ｇ、４℃の条件で１５分間遠心分離を行う。これにより、壊死細胞片及び食物の残留物を含む沈殿物が除去される。
【０１１５】
５．遠心分離ろ過装置
遠心分離ろ過装置は、遠心分離を用いて分子量により、２つの分画にタンパク質を分離するろ過膜である。これは、検体の濃縮又は脱塩のために用いることもできる。
【０１１６】
いくつかの製造業者は、これらの型の製品を販売している。ほとんどの場合、膜は再生セルロースにより作られているが、それらは、ポリエーテルスルホンにより作られていてもよい。それらの選択は、処理される検体の容量及び膜の分離許容限界による（表１）。ローターの型及び遠心分離の速度の選択のために製造業者により設けられている説明書に従って、これらのろ過装置を用いた。しかしながら、遠心分離の時間は、検体の粘性により変更できた。
【０１１７】
表１：ＲｕｍＣの精製試験において用いられるろ過装置の特性
【０１１８】
【表１】
【０１１９】
６．セファデックスＧ−７５による分子ふるい
盲腸の内容物の上清の分子ふるいは、セファデックスＧ−７５（２．４×１８７ｃｍ）のカラムにより行われる。検体（容量はカラムの容積の約２％とする）をカラムに吸着させ、ＰＢＳを用い、流速を１ｍＬ／分とし、４℃で溶出を行い、２ｍＬの６００分画が回収する。それぞれの分画の２８０ｎｍの吸光度を検出することによりクロマトグラムが得られる。
【０１２０】
７．ＦＰＬＣによる分子ふるい
活性ＣＭ分画の分子ふるいは、ＦＰＬＣにより行われる。検体をHiLoad 26/60 Superdex 30pgカラム（ＧＥヘルスケア）に吸着させる。ＰＢＳを用いて、２．５ｍＬ／分の流速で溶出を行う。溶出されたタンパク質を、２８０ｎｍの吸光度の変化を測定することにより検出する。２分の溶出に相当する分画は自動的に回収される。
【０１２１】
８．陽イオン交換ＣＭカラムによるＨＰＬＣ
陽イオン交換ＨＰＬＣは、Waters 616 Pump注入器を備えるWaters 600S Contorollerにより行われる。検体（０．５ｍＬ）をＴＳＫのCM-3SW Spherogel分取用カラムに吸着させる。２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液によるｐＨ５とした条件下において、０Ｍ〜１Ｍの濃度勾配をつけたＮａＣｌを用いて０．８ｍＬ／分の流速で溶出を行う。初めの２０分間は、ＮａＣｌの非存在下で均一濃度において溶出を行い、その後の３０分間は、０Ｍから０．５ＭにリニアにＮａＣｌの濃度勾配がつけられた条件下で行う。その後の５分間は、均一濃度の条件下で溶出を行い、その後の１分間でＮａＣｌの濃度を１Ｍにし、均一濃度で１５分間続け、最後に開始時の条件に戻す。溶出されたタンパク質を、Waters 486 Tunable Absorbance Detectorを用いて２８０ｎｍ又は２１４ｎｍの吸光度を測定することにより検出する。分画は自動的に回収され、それをAmicon Ultra PL-5装置を用いて脱塩する。
【０１２２】
９．陽イオン交換カラムによるＦＰＬＣ
陽イオン交換クロマトグラフィは、ＦＰＬＣの連鎖により行われる。検体をHi-Prep 16/10 CM FFカラム（ＧＥヘルスケア）に吸着する。２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液によりｐＨ５とした条件下において、０Ｍ〜０．４Ｍの濃度勾配をつけたＮａＣｌを用いて溶出を行う。ＮａＣｌの非存在下の均一濃度で２ｍＬ／分の流速の条件により、溶出を５０分間行う。その後に、４０分間かけて０Ｍから０．４ＭにリニアにＮａＣｌの濃度を変化させ、５ｍＬ／分の流速で溶出を続ける。溶出されたタンパク質を、２８０ｎｍの吸光度の変化を測定することにより検出する。１ｍＬの分画は、自動的に回収され、それをSep-Pak C18カートリッジにより脱塩する。
【０１２３】
１０．逆相ＨＰＬＣ
逆相ＨＰＬＣは、Alliance Waters 1690 Separations Moduleにより行われる。０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いて事前に酸性化された検体（１００μＬ）を、Vydac 218TP52 250×2分析用カラムに吸着する。一定の流速（０．５ｍＬ／分）で溶出を行う。１５％のアセトニトリルの均一濃度で１０分間の溶出を行った後に、６０分かけてアセトニトリルの濃度を１５％から３０％にリニアに濃度を変化させる。１分間でアセトニトリルの濃度を７０％に変更し、溶出を均一濃度で１９分間続けた後に、開始時の条件に戻す。溶出されたタンパク質を、Waters 996 Photodiode Array Detectorを用いて２１４ｎｍにおける吸光度の変化を測定することにより検出する。アセトニトリルは、Speed Vac Concentrator（Savant）を用いて蒸発させる。
【０１２４】
１１．質量分析
質量分析は、Timone proteomic plateau（薬科大学、マルセイユ、フランス）において行われた。
【０１２５】
Maldi型の質量スペクトルは、遅延抽出を有する正の線形モードにおいて用いられるEttan Maldi-Tof Pro spectrometer（ＧＥヘルスケア、ウプサラ、スウェーデン）により得られる。液滴乾燥の方法を介してMaldiの標的において、α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸の５ｍｇ／ｍＬの溶液を用いて検体を共結晶化する。良好な信号を得るために、２０ｋＶの加速電位及び最小のレベルに設定されたレーザによりスペクトルを得る。質量が知られているペプチドの標準混合物（Pepmix4,Laserbiolabs, ニース, フランス）を取得し、これを用いて外部のモードにおいてスペクトルの較正を行う。
【０１２６】
結晶化させることが困難である特定の検体の場合、共結晶化を2,5−ジヒドロキシ安息香酸溶液を用いて行う。
【０１２７】
１２．エドマン法
この技術は、フェニルイソチオシアネート（Ｃ６Ｈ５Ｎ＝Ｃ＝Ｓ）を有するタンパク質の遊離末端アミノ酸の反応に基づく。この環状化合物は、基本的な媒体において、タンパク質の第１のアミノ酸残基に求核的に攻撃を行う。ペプチドのフェニルチオカルボミル（ＰＴＣ）誘導体は、その後に、加水分解により切断される。第１のアミノ酸のアニリノ−チアゾリノン（ＡＴＺ）及びこのアミノ酸を失ったタンパク質が得られる。ＡＺＴ−アミノ酸は、フェニルチオヒダントイン−（ＰＴＨ）アミノ酸に転換される。
【０１２８】
連続的に得られたＰＴＨ−アミノ酸を２８０ｎｍにおける吸光度の測定及び溶出時間の比較によるＲＰ−ＨＰＬＣにより分離及び同定する。反応サイクルは繰り返すことが可能であるため、タンパク質の配列を検出できる。
【０１２９】
１３．無作為の変異誘導
３７℃で２４時間培養されたL14菌株の１４ｍＬの培養液を２ｍＬチューブに７つに分け、その後に、これらのチューブに対して５８００×ｇで１０分間遠心分離を行う。細胞の沈殿物に対して、２ｍＬの０．１Ｍクエン酸塩緩衝液（クエン酸２１ｍｇ／ｍＬ、ＮａＯＨ８．８ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ５．５）を用いて、２度の洗浄を行い、その後に、強力な変異誘発剤であるＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＧ）の濃度が増大するように変化させているクエン酸塩緩衝液をそれぞれに加える。
【０１３０】
表２：Sep-Pakによる脱塩に用いられる溶液の量
【０１３１】
【表２】
【０１３２】
その後に、３７℃で３０分間、それぞれのチューブを保温し、５８００×ｇで１０分間遠心分離する。沈殿物を０．１Ｍのリン酸緩衝液（KH2PO4 13.6mg/mL, NaOH 2.32mg/mL, pH7）を用いて洗浄し、その後に、それを液体ＢＨＩ−ＹＨ培地に入れる。
【０１３３】
１４．Sep-Pak C18カートリッジ（Waters）における脱塩
本モデルによると、これらのカラムは、相が流されるシリンジ形状の中にあり、又は、シリンジの端に固着されたミニカラムである。緩衝液の流動は、蠕動型ポンプにより保証される。第１段階において、カラムにＨ２Ｏを通過させ、その後にＣＨ３ＣＮを通過させ、最後に０．０５％ＴＦＡを含むＨ２Ｏを通過させるにより、カラムは平衡化される。その後に、０．０５％ＴＦＡを用いて事前に酸性化された検体を吸着させる。Ｈ２Ｏ−０．０５％ＴＦＡ、４０％ＣＨ３ＣＮ−０．０５％ＴＦＡ及びＣＨ３ＣＮ−０．０５％ＴＦＡを連続的に加えることにより、３つの工程において溶出を連続的に行う。
【０１３４】
従って、３つの分画が回収される。それらは、カラムにより保持されないタンパク質及び塩に相当する分画（分画ＮＲ）、４０％ＣＨ３ＣＮにより希釈されたタンパク質を含む分画（４０％ＡＣＮ分画）及び１００％ＣＨ３ＣＮにより希釈されたタンパク質を含む分画（１００％ＡＣＮ分画）である。溶媒を容量に依存して、Speed Vac Concentrator又はRotavaporを用いて蒸発させる。
【０１３５】
表３はＲｕｍＣの精製から得られる分画の脱塩のために用いられる溶液の容量を示している（結果及び考察を参照）。これらの容量は、Sep-Pakの相の容量に依存する。
【０１３６】
表３：Sep-Pakによる脱塩に用いられる溶液の容量
【０１３７】
【表３】
【０１３８】
１５．温度耐性試験
ＲｕｍＣを含む分画を分割し、ヒートブロックを用いて５分〜１５分間それぞれを異なる温度で熱し、その後に４℃で保存する。その後に、それらを用いて抗菌活性試験を行う。
【０１３９】
１６．ｐＨ耐性試験
ＲｕｍＣを含む分画を分割し、それぞれを所望の緩衝液により約１０倍に希釈する。室温で１０分間置いた後に、それぞれの溶液をVivaspin 500 3kDaろ過装置に吸着し、その後に製造業者の説明書に従って遠心分離を行う。Vivaspin 500により保持されている分画に緩衝液を加え、そのろ過装置に対して再び遠心分離を行う。Vivaspin 500 3kDaにより保持された、すなわち、ＲｕｍＣを含む分画のそれぞれの容量は、開始時の容量と一致するように緩衝液を用いて調節する。これらの分画を４℃で保存し、その後に、それらを用いて抗菌活性試験を行う。
【０１４０】
Vivaspin 500 3kDaろ過装置は、ｐＨ９以上には耐えられない。従って、酸性又は中性のｐＨの緩衝液のみを用いた。構成は以下の通りである。
【０１４１】
ｐＨ２緩衝液：５０ｍＭ ＫＣｌ−１３ｍＭ ＨＣｌ
ｐＨ４．４緩衝液：０．２Ｍ ｐＨ４．４ 酢酸ナトリウム緩衝液
ｐＨ７緩衝液：５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４−３９ｍＭ ＮａＯＨ。
【０１４２】
（結果及び考察）
１．盲腸の内容物からのＲｕｍＣの精製
Ruminococcus gnavus E1菌株は培養可能であるにもかかわらず、ＲｕｍＣは、試験された培養条件下のインビトロにおいて産生されない。ＲｕｍＣを精製するために、E1菌株を宿しているモノゼニックラットの盲腸の内容物を用いること、又は、インビトロにおいてＲｕｍＣを産生できるR.gnavus変異株を作製することが必要である（第２節を参照）。
【０１４３】
１．１．モノゼニックラットの盲腸の内容物の希釈
第１工程として、ＰＢＳにより盲腸の内容物を希釈した。
【０１４４】
１．２．壊死細胞片の除去
精製の第２工程において、盲腸の内容物を遠心分離することにより、細菌、壊死細胞片及び食物の残留物を除去する。
【０１４５】
１．３．濃縮
前記のように調製された溶液をAmicon Ultra-15 PL-5システムにより濃縮し、その後に、分子ふるいカラムにかける。
【０１４６】
１．４．抗菌活性試験
得られた全ての分画をC.perfringens CpA菌株に対して試験した。これは、モノゼニックラットの盲腸の内容物中に抗C.perfringens物質が存在するかどうか確認する試験であった。
【０１４７】
陰性対照としてアゼニックラット（微生物を含まない）の盲腸の内容物を用いた。抗C.perfringens活性は検出されなかった。従って、モノゼニックラットの盲腸の内容物に含まれる抗C.perfringens物質は、実際にR.gnavus E1に特異的である。
【０１４８】
その後は、それぞれの精製試験の後に、抗C.perfringens活性試験を続けた。第１段階において、負の結果がこの試験の感度の許容限界と関連しないことが確実であることに注意し、活性があるかどうかのみを調べた。第２段階において、確立されていたプロトコールを用いて定量試験を行った。
【０１４９】
１．５．セファデックスＧ−７５カラムによる分子ふるい
分子ふるいは、セファデックスＧ−７５カラム（２．４×１８７ｃｍ）により行われた。回収した２ｍＬの６００分画のそれぞれの２８０ｎｍにおける吸光度を検出することにより、溶出をモニタリングした。
【０１５０】
事前にMicrocon YM-3を用いて濃縮された分画を用いて、抗菌活性試験を行った。
【０１５１】
３２５分画〜３５８の分画は、C.perfringensに対して活性があることを証明し、新規の活性ＧＦ分画を構成するためにこれらを貯えた（図１の陰影領域）。
【０１５２】
アゼニックラットの盲腸の内容物を用いた対照群の溶出プロファイルは、モノゼニックラットの盲腸の内容物を用いて得られた検体の溶出プロファイルと比較されたが、抗C.perfringens活性は検出されなかった。
【０１５３】
１．６．ＲｕｍＣの大きさの評価
活性ＧＦ分画にあるＲｕｍＣの大きさを評価するために、分子量が知られている標準タンパク質を前記と同一のセファデックスＧ−７５カラムに吸着させ、それぞれの溶出容量を測定した（図２Ａ）。その後に、物質の分子量の対数（ｌｏｇ（ＭＭ））とその溶出容量（Ｖｅ）との釣り合いを定義する較正曲線を描いた（図２Ｂ）。６８３ｍＬの溶出容量の平均値を用いると、外挿であるが、抗菌物質は選択された標準タンパク質の範囲内にあり、その分子量は、約５２００Ｄａであると評価された。
【０１５４】
１．７．陽イオン交換樹脂によるクロマトグラフィ
カルボキシメチル（ＣＭ）−Sepherogelカラムによる陽イオン交換クロマトグラフィに活性ＧＦ分画をかける場合、ＨＰＬＣ法を用いることが予測された。ｐＨ５においてＮａＣｌの濃度勾配を用いて溶出を行い、これを２１４ｎｍにおいてモニタリングした（図３）。
【０１５５】
活性は３２分〜３８分に見られ（活性ＣＭ分画）、これはＮａＣｌの濃度が０．２Ｍ〜０．３Ｍに対応する。この技術によると、保持されていない分画、特に全ての黄色の色素の混入を除去することができた。
【０１５６】
質量分析法による活性ＣＭ分画の分析により、約４２００ｋＤａの単一のペプチドを含むことが示される（結果は示さず）。
【０１５７】
この分画に対してＮ末端の配列決定法を行った。初めの１１アミノ酸は、AGVIX(N/S)GXAV（配列番号１０）と決定された。この配列は、周知のタンパク質との強い相同性は示されていない。
【０１５８】
また、配列決定法は２つの主要でない配列を明らかにした。
【０１５９】
１．８．逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィ
２１４ｎｍにおける種々の吸収ピークが得られた。
【０１６０】
活性はａ（又は２重ピーク）及びｂ（又は単一ピーク）として示されている２つの分画において明らかにされた（図４）。これら２つの分画の質量分析法による分析により、３つの主要なペプチドの存在が明らかとなり、それぞれのペプチドの分子量は４２３０Ｄａ〜４４６０Ｄａである。（図４Ｂ及び図４Ｃ）。
【０１６１】
盲腸の内容物からのＲｕｍＣの精製を、３つのクロマトグラフィ、すなわち、分子ふるい、陽イオン交換クロマトグラフィ及び逆相クロマトグラフィを用いて再び行った。得られた溶出プロファイルは、第１の試験の溶出プロファイルと同等である。従って、ＲｕｍＣの精製法は、再現性があるため採用できる。
【０１６２】
盲腸の内容物からＲｕｍＣを精製する方法を要約した模式図を図５に示す。
【０１６３】
１．９．精製収率及び精製因子
慣習により、溶液中の任意の活性単位（ＡＡＵ）の数値は、活性のある最終希釈度の逆数となるように定義される。従って、精製により得られたそれぞれの活性分画の希釈系列液（２倍）に対して抗C.perfringens活性の試験を行った。
【０１６４】
精製因子は、それぞれの分画のタンパク質のAAU/mgで表される特異的活性との比較により得られる。種々の分画におけるタンパク質の量の評価は、質量吸光係数Ｅ０．１％である１．８を用いて、２８０ｎｍにおけるそれらの測定値から推定された。
【０１６５】
表４はモノゼニックラットの盲腸の内容物からＲｕｍＣを精製するためのプロトコールの工程における活性収率及び精製因子を示す。
【０１６６】
表４：１０ｇのモノゼニックラットの盲腸からインビボにおいてＲｕｍＣを精製するときの活性収率及び精製因子
【０１６７】
【表４】
【０１６８】
１．１０．ペプチド配列の決定
２重ピーク分画及び単一ピーク分画における生成物の分子量は異なるが、エドマン法により、AGXIXSGSVAV（配列番号３）である単一の主要なＮ末端配列を決めることが可能である。
【０１６９】
関連する２つの分画において、AGPAYXVGYXGNNGAVT（配列番号２）である１７残基の主要でない配列も明らかにされた。
【０１７０】
２．無作為の変異誘導による変異株の作製
用いられた技術は、R.gnavus L14菌株の無作為の変異誘導であった。この菌株は、インビトロでＲｕｍＡを産生する能力を失ったが、インビボでＲｕｍＣを合成できるR.gnavus E1の自然発生的な変異体である。この菌株は、強力なアルキル化剤であるＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＧ）処理を受けた。
【０１７１】
同一のL14菌株培養液を分割したそれぞれに、ＮＧの濃度を増やしていくように処理した（０μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ）。処理後に、種々の細胞懸濁液を懸濁し、培養シャーレに播いた。培養後に、コロニーを数えることにより、細胞懸濁液中の生細胞の濃度を推定することができた。
【０１７２】
対照濃度（ＮＧ処理をしていないチューブ１）と比較することにより、それぞれの処理における死亡率が決定できた。ＮＧによる処理が効果的であったと思える。死亡率は５０％〜９９％であり、濃度と共に増大する。
【０１７３】
所望の変異体を見つけるために、種々の処理において生存したクローンから無作為に選択された約８６０のコロニーを、トリプシンが添加された寒天培地において２次培養し、その後に、それらに対し抗C.perfringens活性試験を行った。
【０１７４】
８３クローンはトリプシンの存在下で寒天培地において、抗C.perfringens物質を産生できることを見いだした。
【０１７５】
これらのクローンのうち２０クローンを、より厳密な特徴付けのために選択した。
【０１７６】
第１段階において、クローンに影響している変異に対して、ＰＣＲによりｒｕｍＡの染色体組織を復元しないことを確認した。
【０１７７】
その後に、選択された２０クローンに対して、トリプシンの存在下又は非存在下で寒天培地及び液体培地において、抗Clostridium perfringens活性試験を行った。
【０１７８】
トリプシンを添加した寒天培地において、試験した２０クローンのうちの７つの周囲に成長抑制によるハローが認められた。
【０１７９】
その一方で、トリプシンを添加していない寒天培地において、抗C.perfringens物質を産生したクローンは無かった。従って、トリプシンはバクテリオシンの合成において常に重要である。トリプシンを含んでいる液体培地において培養されたクローンは、抗C.perfringens物質を産生しない。
【０１８０】
３．変異株を用いる精製
産生及び精製試験は、産生能を有する７つのクローンのうちの１つのクローンである変異体９−１７に対して行った。
【０１８１】
その試験を種々の細胞濃度及びトリプシン濃度を含む軟寒天培地において行った。変異体の培養の後に、その寒天培地を細かく砕き、上清（ＳＮ９−１７）を回収するために遠心分離した。この上清をC.perfringensに対して試験し、活性を実証した。質量分析法による分析をこの活性上清に対して行った（図７Ａ）。
【０１８２】
３．１．ＦＰＬＣ法を用いた陽イオン交換樹脂によるクロマトグラフィ
イオン交換クロマトグラフィを行う前に、検体を脱塩する必要がある。
【０１８３】
第１の試験は、AmiconによるＳＮ９−１７の脱塩が不十分であることを示した。従って、Sep-Pakによる検体の脱塩は、予備的な精製工程として考えられるべきである。
【０１８４】
Sep-Pakからのタンパク質の溶出は、４０％アセトニトリル溶液を用いて行われる。Rotavaporによりアセトニトリルを蒸発させた後に、その溶液は、ｐＨ５の２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液により希釈されることにより、ｐＨ５に平衡化される。６５ｍＬのＳＮ９−１７からｐＨ５に平衡化された５０ｍＬの脱塩化ＳＮ９−１７が得られ、これをカルボキシメチル−セファロース陽イオン交換カラムに吸着させる。
【０１８５】
０Ｍ〜０．４ＭのＮａＣｌの濃度勾配を４０分間かけて変化させた。対照が２８０ｎｍの吸収において変動させるとき、ほんのわずかなタンパク質が、０．２Ｍ〜０．３ＭのＮａＣｌを用いて溶出された分画に存在するにもかかわらず、抗C.perfringens活性は、この分画において認められた。（図６）。盲腸の内容物からＲｕｍＣを精製する間に、それはすでに見られた。活性分画を蓄積した後に、Sep-Pakにより脱塩及び濃縮を行った。この分画（活性ＣＭ分画）に対する質量分析法により、陽イオン交換クロマトグラフィによってなされた精製において実質的に得られたものを確認し、２５００Ｄａ未満の分子量を有する全ての混入物を示す（図７Ｂ）。
【０１８６】
３．２．ＣＭ分画の分子ふるい
活性ＣＭ分画の分子ふるいは、１０ｋＤａ未満の質量を有するペプチドの分離ができるカラムを用いたＦＰＬＣ法により行われた。溶出は２８０ｎｍの吸光度の変動を検出することによりモニターされる。タンパク質の量は少なく、分離は不十分であることがわかる（図示せず）。それにもかかわらず、選択された分画において抗C.perfringens活性を試験した。吸着された活性の５％のみがふるいの後に認められた。従って、この技術を精製のために採用しなかった。その一方で、活性分画（ＧＦ４７−５０）は、質量分析法により分析され、４２３５Ｄａのペプチドに対して実質的に純粋であることが証明された（図８）。
【０１８７】
３．３．ＣＭ分画のろ過
活性ＣＭ分画から混入物を除去する他の試みは、ろ過装置を用いて行われた。ＲｕｍＣは５ｋＤａフィルターにより（わずかに小さな分子量を有するにもかかわらず）保持されるため、第１の試験を、分離限界が５ｋＤａであるVivaspin 500を用いて行った。残念ながら、不純物もそのフィルターに保持される。但し、それらの分子量は２．５ｋＤａ未満である。具体的に、質量分析法において、精製により得られたいかなるものも認められなかった（結果は示さず）。従って。第２の試験を、分離限界が１０ｋＤａであるMicroconろ過装置を用いて試みた。具体的に、その分子量にもかかわらず、ＲｕｍＣが１０ｋＤａフィルターにより保持される（１０ｋＤａ Ｒ分画）ことが以前に述べられていた。質量分析法は以前の結果を確認し、混入物の多くの割合が保持されない分画において除去されることを可能とする（図７Ｃ）。
【０１８８】
３．４．１０ｋＤａ Ｒ分画のＨＰＬＣ法による逆相クロマトグラフィ
３つのＲｕｍＣのピーク（４２３５Ｄａ、４３２４Ｄａ及び４４５６Ｄａ）を含む１０ｋＤａ Ｒ分画を逆相クロマトグラフィにかけた。流速及び勾配の条件は、盲腸の内容物からＲｕｍＣを精製するための条件と同一であり、得られた結果は同等である。２つの異なる分画は、C.perfringensに対する活性がある２重ピーク分画及び単一ピーク分画である。
【０１８９】
３．５．精製収率及び精製因子
精製プロトコールを評価するために、定量的活性試験をそれぞれの活性分画の２倍の系列希釈液を用いて行った。それぞれの分画に含まれる任意活性単位（ＡＡＵ）の数値を算出し、精製収率が推定した（表５）。活性物質の相当な損失は、培養上清の脱塩の工程において見られ、陽イオン交換クロマトグラフィの後に、さらなる脱塩工程が続く。その損失は、陽イオン交換クロマトグラフィにおいて起こるおそれは十分にありそうだが、これはプロトコールの正当性における疑いを認めない。
【０１９０】
表５：変異体９−１７の培養上清からのＲｕｍＣの精製における収率
【０１９１】
【表５】
【０１９２】
精製プロトコールを評価するための他の重要な判断基準は、それぞれの工程により設けられている精製において得られたものの実証である。精製因子は、それぞれの工程における特異的活性（タンパク質のAAU/mg）を比較することにより決定される。しかし、これを行うためには、それぞれの分画に含まれるタンパク質の質量を測定しなければならない。精製モニタリングは、感度が理由で質量分析法により行われ、あまりにも多くの生体材料の消費を避けることを可能とした。この方法は定量的でないが、精製されたものは非常に明らかに示された。
【０１９３】
３．６．質量分析法
２重ピーク及び単一ピークの分画を質量分析法により分析した。得られた結果は、盲腸の内容物を用いる精製から得られた分画を用いて得られた結果と同一である。２重ピーク分画は、４３２４Ｄａ及び４４５６Ｄａのペプチドを含むが、単一ピーク分画は、４２３５Ｄａのペプチドを含む。
【０１９４】
３．７．配列決定
これらの分画に対して配列決定を行った。
【０１９５】
単一ピーク分画において、得られた配列は、すでに決定された配列であるAGXIXSGSVAV（配列番号３）と同一である。主要でない配列は、AGPAY（配列番号１１）として第５のサイクルに現れる。
【０１９６】
２重ピーク分画に関しては、AGXVXSGSTAV（配列番号１２）でありわずかに異なる。主要でない配列は、AGPAY（配列番号１１）であり同一である。
【０１９７】
変異株からのＲｕｍＣの精製を要約した模式図を図９に示している。
【０１９８】
精製されたＲｕｍＣの生産は、非常に単純化されている。
【０１９９】
４．ＲｕｍＣペプチドの特徴付け
４．１．異なる菌株に関する抗菌活性
ＲｕｍＣの抗菌活性について、R.gnavus E1（ＳＮ ＣＣＥ１）菌株を宿すモノゼニックラットの盲腸の内容物の上清を濃縮した第１段階を用いて、異なるグラム陽性病原菌株及びグラム陰性病原菌株に対して試験した。他の試験として、ＳＮ ＣＣＥ１に感受性のある菌株に対して、２つの精製された分画を用いて行った。その結果は表６に示す。
【０２００】
表６：異なる病原菌株に対するＲｕｍＣの活性試験の結果
【０２０１】
【表６】
【０２０２】
試験された全てのClostridium perfringens菌株は、ＲｕｍＣペプチドに感受性がある。
【０２０３】
４．２．C.perfringensに対する抗菌力
ＲｕｍＣの抗菌力について、精製されたＲｕｍＣ分画のそれぞれの最低阻害濃度をインビボで測定すること、及びC.perfringensに対して用いられる対照抗生物質であるメトロニダゾールの最小阻害濃度と比較することにより評価した。
【０２０４】
これを行うために、２重ピーク及び単一ピークの分画の２倍系列希釈液を調製した（１／５１２希釈まで）。これらの種々の希釈液及び異なる濃度のメトロニダゾール溶液を用いて、抗C.perfringens活性試験を行った（結果は示さず）。この試験において、メトロニダゾールの最小阻害濃度は２５μｇ／ｍＬである。この結果は、以前にDabard等により得られた結果（Dabard等.,Appl.Environ.Microbiol.,67,4111-4118,2001）と一致している。
【０２０５】
２重ピーク及び単一ピークの分画に関して、濃縮溶液（希釈液１）のみは活性である。これらの溶液の濃度は正確に分かっていないが、エドマン法により約４０μｇ／ｍＬと推定できる。
【０２０６】
C.perfringensに対するＲｕｍＣの抗菌力は、メトロニダゾールの抗菌力と同等であると考えられる。
【０２０７】
４．３．温度耐性
熱に対するＲｕｍＣの耐性についての第１の予備試験を、同一のペプチド量を異なる温度で１５分間置くことにより行った。インビボの２つのＲｕｍＣ分画（２重ピーク及び単一ピーク分画）において、７５℃で１５分間の処理は活性に影響はなかった。しかしながら、１００℃では、ペプチドは１５分以内に完全に不活性化される。
【０２０８】
９−１７株の培養上清から精製されたＲｕｍＣ検体を用いて、これらの試験を完了した。種々の温度における保温時間を５分とした。１００℃における保温時間を１５分とした。
【０２０９】
試験した第１の温度を８０℃とした。３つのペプチドを含む精製された分画である活性ＣＭ分画を用いて、第１の試験を行った。
【０２１０】
２重ピーク及び単一ピーク分画と対照的に、活性ＣＭ分画は１００℃で１５分間の処理に耐える。
【０２１１】
その後に、ＧＦ４７−５０分画について試験した。４２３５Ｄａのペプチドのみを含むこの純粋な分画は、１００℃で１５分間の処理に影響を受ける。また、それは、９０℃で５分間の処理にも影響を受ける（表７）。
【０２１２】
表７：温度耐性試験の要約表
【０２１３】
【表７】
【０２１４】
４．４．ｐＨ耐性
活性ＣＭ分画に含まれているペプチドのｐＨ耐性を、ｐＨ２、ｐＨ４．４及びｐＨ７において試験した。
【０２１５】
ｐＨ２において見られた活性は、ｐＨ７において見られた活性と同等である。４℃で２４時間置いた後に、ｐＨ２において活性の損失は見られない。
【０２１６】
従って、本発明のペプチドは、酸性ｐＨに対する耐性を有し、特に動物の栄養又は薬物の分野において用いるのに適している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の配列のペプチド、
配列番号１のポリペプチドと少なくとも８０％の相同性を有するペプチドを含んでいるペプチド、
配列番号２の配列のペプチド、
及び配列番号２のポリペプチドと少なくとも８０％の相同性を有するペプチドを含んでいるペプチドのうちから選択されるペプチドを含んでいることを特徴とする抗菌活性を有するペプチド。
【請求項２】
配列番号３の配列のペプチドをさらに含んでいる請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
配列番号４、配列番号５又は配列番号６の配列のペプチドから選択されるペプチドをさらに含んでいる請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
質量分析法により測定された分子量が４０００Ｄａから４６００Ｄａまでである請求項１〜３のうちのいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項５】
Ruminococcus gnavus変異株から単離された請求項１〜４のうちのいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項６】
２００６年１２月１９日にＣＮＣＭ Ｉ−３７０５番として、ＣＮＣＭ（Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F-75015 Paris）に寄託されたRuminococcus gnavus菌株から単離された請求項５に記載のペプチド。
【請求項７】
配列番号７、配列番号８又は配列番号９の配列のポリヌクレオチド、
配列番号７、配列番号８又は配列番号９の配列のポリヌクレオチドとハイブリッド形成するポリヌクレオチド、
及び請求項１〜６のうちのいずれか１項に記載のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドのうちから選択されるポリヌクレオチドを含んでいることを特徴とする抗菌活性をコードしているポリヌクレオチド。
【請求項８】
転写方向に、
宿主生物において機能するプロモータ、
請求項７に記載のポリヌクレオチド、
及び前記宿主生物におけるターミネータ配列を含んでいることを特徴とする発現カセット。
【請求項９】
請求項７に記載のポリヌクレオチド及び／又は請求項８に記載の発現カセットを含んでいるベクター。
【請求項１０】
請求項７に記載のポリヌクレオチド、請求項８に記載の発現カセット及び／又は請求項９に記載のベクターを用いて形質転換された宿主生物。
【請求項１１】
２００６年１２月１９日にＣＮＣＭ Ｉ−３７０５番として、ＣＮＣＭ（Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F-75015 Paris）に寄託されたRuminococcus gnavus菌株。
【請求項１２】
請求項１０に記載の宿主生物又は請求項１１に記載の菌株によって得られるタンパク質混合物又は発酵マスト。
【請求項１３】
請求項１〜６のうちのいずれか１項に記載のペプチド、請求項１０に記載の宿主生物、請求項１１に記載の菌株、請求項１０に記載の宿主生物の発酵マスト又は請求項１１に記載の菌株の発酵マストを含んでいる組成物。
【請求項１４】
液体状又は粉末状である請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
請求項１〜６のうちのいずれか１項に記載のペプチド、請求項１０に記載の宿主生物、請求項１１に記載の菌株、請求項１０に記載の宿主生物の発酵マスト又は請求項１１に記載の菌株の発酵マストを含んでいる栄養性添加物。
【請求項１６】
液体状又は粉末状である請求項１５に記載の栄養性添加物。
【請求項１７】
動物のための栄養基礎成分及び請求項１５又は１６に記載の栄養性添加物を含んでいることを特徴とする飼料。
【請求項１８】
薬物、栄養性添加物又は飼料の製造のための、請求項１〜６のうちのいずれか１項に記載のペプチド、請求項１０に記載の宿主生物、請求項１１に記載の菌株、請求項１０に記載の宿主生物の発酵マスト又は請求項１１に記載の菌株の発酵マストの用途。
【請求項１９】
ブタ又は家禽の壊死性腸炎の予防又は治療を目的とする薬物又は栄養性添加物の製造のための請求項１８に記載の用途。
【請求項２０】
ヒトの消化器疾患の予防又は治療を目的とする薬物又は栄養性添加物の製造のための請求項１８に記載の用途。
【請求項２１】
動物に処理するための請求項１〜６のうちのいずれか１項に記載のペプチドの非治療的用途。
【請求項２２】
前記ペプチドは、前記動物に内在的な菌株又は前記動物に外因的な菌株から得られる請求項２１に記載の用途。
【請求項２３】
前記ペプチドは前記動物に内在的な菌株から得られ、前記動物に内在的な菌株による前記ペプチドの産生は促進される請求項２１に記載の用途。
【請求項２４】
前記ペプチドは前記動物に内在的な菌株から得られ、前記動物に内在的な菌株の成長は促進される請求項２１に記載の用途。
【請求項１】
配列番号１の配列のペプチド、
配列番号１のポリペプチドと少なくとも８０％の相同性を有するペプチドを含んでいるペプチド、
配列番号２の配列のペプチド、
及び配列番号２のポリペプチドと少なくとも８０％の相同性を有するペプチドを含んでいるペプチドのうちから選択されるペプチドを含んでいることを特徴とする抗菌活性を有するペプチド。
【請求項２】
配列番号３の配列のペプチドをさらに含んでいる請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
配列番号４、配列番号５又は配列番号６の配列のペプチドから選択されるペプチドをさらに含んでいる請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
質量分析法により測定された分子量が４０００Ｄａから４６００Ｄａまでである請求項１〜３のうちのいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項５】
Ruminococcus gnavus変異株から単離された請求項１〜４のうちのいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項６】
２００６年１２月１９日にＣＮＣＭ Ｉ−３７０５番として、ＣＮＣＭ（Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F-75015 Paris）に寄託されたRuminococcus gnavus菌株から単離された請求項５に記載のペプチド。
【請求項７】
配列番号７、配列番号８又は配列番号９の配列のポリヌクレオチド、
配列番号７、配列番号８又は配列番号９の配列のポリヌクレオチドとハイブリッド形成するポリヌクレオチド、
及び請求項１〜６のうちのいずれか１項に記載のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドのうちから選択されるポリヌクレオチドを含んでいることを特徴とする抗菌活性をコードしているポリヌクレオチド。
【請求項８】
転写方向に、
宿主生物において機能するプロモータ、
請求項７に記載のポリヌクレオチド、
及び前記宿主生物におけるターミネータ配列を含んでいることを特徴とする発現カセット。
【請求項９】
請求項７に記載のポリヌクレオチド及び／又は請求項８に記載の発現カセットを含んでいるベクター。
【請求項１０】
請求項７に記載のポリヌクレオチド、請求項８に記載の発現カセット及び／又は請求項９に記載のベクターを用いて形質転換された宿主生物。
【請求項１１】
２００６年１２月１９日にＣＮＣＭ Ｉ−３７０５番として、ＣＮＣＭ（Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F-75015 Paris）に寄託されたRuminococcus gnavus菌株。
【請求項１２】
請求項１０に記載の宿主生物又は請求項１１に記載の菌株によって得られるタンパク質混合物又は発酵マスト。
【請求項１３】
請求項１〜６のうちのいずれか１項に記載のペプチド、請求項１０に記載の宿主生物、請求項１１に記載の菌株、請求項１０に記載の宿主生物の発酵マスト又は請求項１１に記載の菌株の発酵マストを含んでいる組成物。
【請求項１４】
液体状又は粉末状である請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
請求項１〜６のうちのいずれか１項に記載のペプチド、請求項１０に記載の宿主生物、請求項１１に記載の菌株、請求項１０に記載の宿主生物の発酵マスト又は請求項１１に記載の菌株の発酵マストを含んでいる栄養性添加物。
【請求項１６】
液体状又は粉末状である請求項１５に記載の栄養性添加物。
【請求項１７】
動物のための栄養基礎成分及び請求項１５又は１６に記載の栄養性添加物を含んでいることを特徴とする飼料。
【請求項１８】
薬物、栄養性添加物又は飼料の製造のための、請求項１〜６のうちのいずれか１項に記載のペプチド、請求項１０に記載の宿主生物、請求項１１に記載の菌株、請求項１０に記載の宿主生物の発酵マスト又は請求項１１に記載の菌株の発酵マストの用途。
【請求項１９】
ブタ又は家禽の壊死性腸炎の予防又は治療を目的とする薬物又は栄養性添加物の製造のための請求項１８に記載の用途。
【請求項２０】
ヒトの消化器疾患の予防又は治療を目的とする薬物又は栄養性添加物の製造のための請求項１８に記載の用途。
【請求項２１】
動物に処理するための請求項１〜６のうちのいずれか１項に記載のペプチドの非治療的用途。
【請求項２２】
前記ペプチドは、前記動物に内在的な菌株又は前記動物に外因的な菌株から得られる請求項２１に記載の用途。
【請求項２３】
前記ペプチドは前記動物に内在的な菌株から得られ、前記動物に内在的な菌株による前記ペプチドの産生は促進される請求項２１に記載の用途。
【請求項２４】
前記ペプチドは前記動物に内在的な菌株から得られ、前記動物に内在的な菌株の成長は促進される請求項２１に記載の用途。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２０１０−５２７６２５（Ｐ２０１０−５２７６２５Ａ）
【公表日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５０９８６０（Ｐ２０１０−５０９８６０）
【出願日】平成２０年５月１６日（２００８．５．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００８／０００６８３
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１５２２５２
【国際公開日】平成２０年１２月１８日（２００８．１２．１８）
【出願人】（５０７２００９６１）アディッソ・フランス・エス．エー．エス． (12)
【氏名又は名称原語表記】ＡＤＩＳＳＥＯ ＦＲＡＮＣＥ Ｓ．Ａ．Ｓ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月１６日（２００８．５．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００８／０００６８３
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１５２２５２
【国際公開日】平成２０年１２月１８日（２００８．１２．１８）
【出願人】（５０７２００９６１）アディッソ・フランス・エス．エー．エス． (12)
【氏名又は名称原語表記】ＡＤＩＳＳＥＯ ＦＲＡＮＣＥ Ｓ．Ａ．Ｓ．
【Ｆターム（参考）】
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