抗菌適用のためのペプチド配列、それらの分岐形態、及びその使用
本発明は、アミノ末端からカルボキシ末端に、ＫＫＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号１、ＲＲＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号２、ＫＲＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号３、ＲＫＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号４又はその誘導体の群より選択されるアミノ酸配列を有する抗菌ペプチド及びその使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特にテトラ分岐ＭＡＰ形態で合成された場合、プロテアーゼ活性に対して特に耐性であり、結果的に、インビボでの使用に非常に適する強力な抗菌ペプチド配列の同定に関する。本発明の配列（ＫＫＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号１、ＲＲＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号２、ＫＲＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号３、ＲＫＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号４）は、最初のアミノ末端残基としてＧｌｎをもたらす以前に報告されたペプチドＭ６に由来する。Ｇｌｎの除去は、ペプチド安定性及びロット間均一性における予期せぬ、驚くべき改善を与え、そして、結果的に、Ｍ６ペプチドについて特に困難であるペプチド合成のために信頼できる方法を可能にした。
【０００２】
背景技術
多剤耐性細菌の増大する緊急事態は、抗生物質が臨床において広く使用されるそれらの国々の大半における世界的な懸念である。多くの病原菌（黄色ブドウ球菌、結核菌、一部の腸球菌、緑膿菌、及び多くの他のグラム陰性菌など）が、大半の従来の抗生物質に対して、ならびに新世代の抗生物質に対して耐性を発生している（Wenzel and Edmond 2000）。従って、新たな抗生物質を開発することがますます重要になっている。この要求のため、研究者のコミュニティー及び製薬会社が新たな抗菌薬剤を考えることが急務となる。抗菌ペプチドが、一般的に耐性細菌の選択を起こす従来の抗生物質に対する最良の代用物の１つであると考えられる（Hancock and Sahl 2006）。大半の抗菌ペプチドが、動物（ヒト、植物、及び真菌を含む）の先天免疫の成分である（Zasloff, 2002）。それらは、通常、６〜５０のアミノ酸残基からなり、正味の正電荷を有する。カチオン性ペプチドが、選択的に、アニオン性細菌膜と、及び他の負電荷を帯びた構造（例えばＬＰＳ及びＤＮＡなど）と相互作用する。真核生物膜が、それらの外層において、通常、細菌膜より低く、異なって負電荷を帯びており、それらは、また、コレステロール分子により安定化される。これらの違いは、カチオン性ペプチドの特異性の基礎である。カチオン性抗菌ペプチドの作用機構は、結果的に、細菌膜に対するそれらの特異的結合に起因し、それによって細胞浸透及び、一部の場合において、代謝経路阻害が惹起される。
【０００３】
多くの試験が、次に、それらの作用機構、真核細胞でのそれらの毒性、及び局所又は全身投与された場合でのそれらの治療効力を試験することによる抗菌ペプチド配列の同定及び特性付けを目指した。残念なことに、２つの主な問題によって今まで抗菌ペプチド薬物の開発が妨げられた。第１は、細菌についての天然抗菌ペプチドの選択性が一般的に低すぎ、それらは、真核細胞、特に赤血球について非常に有毒であると思われ、高レベルの溶血を引きおこすことである。第２は、インビボでのペプチドの一般的に短い半減期に関連する。これらは、少数のカチオン性ペプチドしか過去１０年間に市場に届いていないことの主な理由である（ポリミキシン及びダプトマイシンは２つの成功例である）。
【０００４】
数年前、研究者が、合理的な設計又はコンビナトリアルライブラリーのスクリーニングにより実験室において選択された非天然の新規ペプチド配列の同定に集中し始めた。目的は、細菌についての一般的な毒性及び特異性の点でより良好な生物学的特性ならびに薬物開発のための改善された半減期を伴うペプチドを見出すことであった。
【０００５】
本発明者らの実験室において、非天然ペプチド配列が同定され、それは特にグラム陰性菌に対して強い抗菌活性を示した（Pini et al., 2005）。ペプチド（ＱＫＫＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号５、Ｍ６と呼ばれる）は、コンビナトリアルライブラリーから同定された配列の合理的な改変により得られ、４つの同一のペプチド配列がリジンコアにより一緒に連結されたＭＡＰテトラ分岐形態で合成された。この分子は、プロテアーゼ及びペプチダーゼに対して高い耐性を示し、従って、短い半減期の問題を克服する（Bracci et al., 2003; Falciani et al., 2007）。分岐抗菌ペプチドＭ６は、既に、多くの細菌（いくつかの多剤耐性臨床分離株を含む）に対するその生物活性について、ＤＮＡとのその相互作用について、いくつかの真核生物細胞株に対するインビトロでの毒性について、ならびに、その溶血活性について、その免疫原性について、腹腔内又は静脈内注射された場合でのそのインビボでの毒性について特徴付けられている（Pini et al., 2007）。
【０００６】
Ｍ６特性付けのために行われた全ての実験の間に、本発明者らは、Ｍ６の異なる合成によって非相同活性（バッチ間相違点）を伴うペプチドが産生されたことに気付いた（図１Ａ）。マススペクトロメトリー分析によって、Ｍ６の最初のアミノ酸、即ちＧｌｎが、ピログルタミン酸に変換されることが明らかになった（図１Ｂ）。ピログルタミン酸を含むが、Ｇｌｎを含まない異なるペプチドの存在は、予測不可能なパーセンテージで、バッチ間で変化する。この二次産物の完全除去は実際に不可能である。第１に、なぜなら、主な産物との類似の保持時間のため、ＨＰＬＣ精製の間に容易に捨てられないからであり、第２に、なぜなら、それは、溶液中にある場合に、親ペプチドから持続的に産生されるからである。ピロＧｌｕアナログは、Ｇｌｎアナログに関して、感知できる抗菌活性の低下を示すため、混合物の全活性はバッチ間で変動した（図１Ａ）。
【０００７】
バッチ間での相違点を最小限にするために、前臨床実験のため及び、恐らくは、工業的製造のための大スケールペプチド産生の観点から、本発明者らは、Ｍ６から最初のＧｌｎ残基を除去し、また、最初の２つのＬｙｓをＡｒｇと置換し、又は、最初の２つの残基をＬｙｓ及びＡｒｇで代用した。これによって、Ｍ６配列中に存在する最初のＧｌｎを取り除いた以下の９−ｍｅｒ配列が産生された：ＫＫＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号１、Ｍ３３と呼ぶ；ＲＲＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号２、Ｍ３４と呼ぶ；ＫＲＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号３、Ｍ３５と呼ぶ；ＲＫＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号４、Ｍ３６と呼ぶ。これらの配列は本願の対象である。
【０００８】
新たなペプチドを、以下の実施例に記載するいくつかの特性付けに供した。
【０００９】
実際的には、Ｍ６ペプチド配列のＮ末端の単一アミノ酸残基の除去、及び最初の２つの位置でのＬｙｓ及びＡｒｇの可能な代用は、より良好な抗菌活性を産生し、副毒性及び作用機構の点での任意の異なる挙動の原因にはならない。実際に、それによって合成負担における強い改善が産まれ、ペプチドＭ３３、Ｍ３４、Ｍ３５、及びＭ３６の配列が、Ｍ６に関する工業的開発のためにずっとより適するようになる。Ｍ３３、Ｍ３４、Ｍ３５、及びＭ３６配列は、改善された安定性及びバッチ間均一性のおかげで、抗菌薬物の開発のための理想的な候補である。
【００１０】
発明の説明
本発明の対象は、ペプチド配列ＫＫＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号１、Ｍ３３、ＲＲＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号２、Ｍ３４、ＫＲＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号３、Ｍ３５、ＲＫＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号４、Ｍ３６であって、単量体構造又はデンドリマー構造で、好ましくは以下の一般式：
【化１】
（式中、Ｒは、Ｍ３３、Ｍ３４、Ｍ３５、及びＭ３６の群において選ばれる配列を伴う単量体ペプチドであり（全てのＲが、１つのＭＡＰ分子において同じ配列である）、Ｘは三官能性分子であり、ＺはＸ又は以下の化学基：
【化２】
（式中、Ｒ及びＸは上に定義される）としての三官能性分子である）
に従う多抗原性ペプチド（ＭＡＰ）形態で合成される。
【００１１】
本発明のさらなる対象は、アミノ末端からカルボキシ末端に、ＫＫＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号１、ＲＲＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号２、ＫＲＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号３、ＲＫＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号４又はその誘導体の群より選択されるアミノ酸配列を有する抗菌ペプチドであって、ここで１つのアミノ酸残基がアラニン残基により置換され、又は、ここで１つの正電荷アミノ酸を別の正電荷アミノ酸により置換される。好ましくは、ペプチドは線形形態である。より好ましくは、ペプチドは、ポリアクリルアミドの骨格上で、デキストラン単位の骨格上で、又はエチレングリコール単位の骨格上で多量体化される。さらに好ましくは、ペプチドは、以下の式：
【化３】
（式中、Ｒは、請求項１において主張されるペプチドであり；Ｘは三官能性分子であり；ｍ＝０又は１；ｎ＝０又は１；ｍ及びｎが０の場合、ペプチドは二量体であり；ｍ＝１及びｎ＝０の場合、ペプチドは四量体であり、ｍ＝１及びｎ＝１の場合、ペプチドは八量体である）を有する多抗原性ペプチド（ＭＡＰ）の形態である。
【００１２】
好ましくは、Ｘは三官能性単位である。より好ましくは、三官能性単位は少なくとも２つの機能性アミノ基を含む。さらに好ましくは、Ｘは、リジン、オルニチン、ノルリジン（nor-lysine）、又はアミノアラニンである。さらに好ましくは、Ｘは、アスパラギン酸又はグルタミン酸である。より好ましくは、Ｘは、プロピレングリコール、コハク酸、ジイソシアネート、又はジアミン誘導体である。
【００１３】
本発明のさらなる対象は、医学的使用のための上に記載されるペプチドである。好ましくは抗菌薬物としてである。
【００１４】
本発明のさらなる対象は、医薬的に許容可能な有効量の上に記載するペプチドを含む医薬的組成物である。好ましくは、組成物は、全身使用のために個人において注射される溶液の形態、より好ましくはＬＰＳ中和のための解毒剤として注射される溶液の形態、さらに好ましくは洗眼液、洗口剤、軟膏、又は局所使用のための溶液の形態である。
【００１５】
本発明のさらなる対象は、本発明のペプチドを含む抗菌活性を伴う殺菌剤及び／又は界面活性剤の調製である。
【００１６】
また、本発明の対象は、食品産物及び／又は化粧品産物及び／又はホメオパシー産物の調製のための保存剤としての本発明のペプチドの使用である。
【００１７】
本発明の対象は、医学的、獣医的、及び農学的適用のための抗菌薬剤としてのそのようなペプチドの使用である。
【００１８】
本発明の配列は、分子組成及び生物学的活性の両方の点でのそれらの安定性及び強いバッチ間均一性のため、既に記載したＭ６ペプチドに関して有利である。Ｍ６配列（ＱＫＫＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号５）は、最初のＮ末端残基としてＧｌｎアミノ酸を含んだ。このアミノ酸は、予測不可能な量でピログルタミン酸に自然に変換される傾向があった。バッチ中のピログルタミン酸の存在によって、ピログルタミン酸のパーセンテージに依存して、全ペプチド活性における感知できる減少が起こった（図１Ａ）。実際に、Ｍ６ペプチドの抗菌活性は長期間で一貫しておらず、これは製造のスケールアップに負の影響を与える。単純で、明らかにわずかなＭ６配列からの最初のＧｌｎの除去、ならびに、恐らくは、最初の２つの残基のＬｙｓ及びＡｒｇでの代用によって、強く改善された安定性及びバッチ間均一性を伴う新たなペプチド配列が産生され、大規模製造が信頼できるようになる。この重大な特性は、その非常に有望な抗菌活性とともに、ペプチドＭ３３、Ｍ３４、Ｍ３５、及びＭ３６を新たな抗菌薬物の開発のための最適な候補にする。本発明は、本明細書において、以下の図を参照する非限定的な例により記載される：
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】大腸菌ＴＧ１細胞に対する抗菌活性。以下のテトラ分岐ペプチドの比較：Ｍ６バッチ１合成（三角）、Ｍ６バッチ２合成（四角）、Ｍ６バッチ３合成（白丸）、それらは最初のアミノ酸、ピロＭ６（アステリスク）としてＧｌｎとピロＧｌｕの混合物を含み（パーセンテージは不明）、ここで最初のアミノ酸は１００%ピロＧｌｕであり、及びＭ３３（黒丸）、それにおいて最初のＧｌｎが欠失した。１００%ピロＧｌｕを含むペプチドは最悪の結果を与え、ＧｌｎのピロＧｌｕへの修飾によって抗菌活性が減少することが確認された。Ｇｌｎ及びピロＧｌｕの両方を含むＭ６ペプチドは、中間の抗菌活性を示した。Ｍ６配列からの最初の残基の除去によってペプチド活性が改善された（Ｍ３３についての曲線により実証された通りである）。ＳＤは、３つの異なる実験を用いて得られた。Ｍ３３の（ならびに、また、Ｍ３４、Ｍ３５、及びＭ３６の、本明細書で示さず）多くの異なる合成によって、任意の変動する結果を伴わない完全に重複する結果が与えられた。
【図１Ｂ】テトラ分岐ペプチドＭ６粗製混合物のマススペクトロメトリー分析 Ｍ６の算出された分子量は５１９５Daであった。２つの主なピークが存在し、１つは非修飾Ｍ６に対応する５１９７Daで、１つは二次産物に対応する５１７９Daで、１つのピロＧｌｕが、４つのＧｌｎの１つの場所の最初の位置にある。
【図１Ｃ】血清中での２４時間のインキュベーション後でのテトラ分岐ペプチドＭ３３のマススペクトロメトリー分析 ペプチドは、予測分子量（４６８３DA）で単一ピークとして現われる。
【図２】ヒト赤血球細胞を用いて３又は２４時間インキュベートされたテトラ分岐Ｍ３３ペプチドにより惹起された溶血のパーセンテージ。最高濃度では、それはわずかに無視できる溶血活性を起こした。
【図３Ａ】ＬＰＳの中和によるＴＮＦ−α放出の阻害。Ｒａｗ ２６４．７細胞を、緑膿菌からのＬＰＳ（２０ng/ml）及びＭ３３とインキュベートした。三角は、ＬＰＳと異なる濃度のＭ３３を用いたインキュベーションを示す。四角は、Ｍ３３だけを用いたインキュベーションを示す。
【図３Ｂ】ＬＰＳの中和によるＴＮＦ−α放出の阻害。Ｒａｗ ２６４．７細胞を、肺炎桿菌からのＬＰＳ（５ng/ml）及びＭ３３とインキュベートした。三角は、ＬＰＳと異なる濃度のＭ３３を用いたマクロファージのインキュベーションを示す。四角は、Ｍ３３だけを用いたマクロファージのインキュベーションを示す。ＳＤは、３つの異なる実験を用いて得られた。１００%は、Ｍ３３なしでＬＰＳを用いてインキュベートされた場合にマクロファージにより産生されるＴＮＦ−αの最大量を示す。他のパーセンテージは、ＬＰＳ及びＭ３３を用いてインキュベートされた場合にマクロファージにより産生されるＴＮＦ−αの量を示す（１００%に対する）。ＴＮＦ−αの基礎レベルは無視できた。Ｍ３３のＭＩＣは、矢印により示される。
【図４Ａ】テトラ分岐Ｍ３３ペプチドのインビボでの抗菌活性。Ａ．Ｂａｌｂ−ｃマウス（２０g）に、致死量の大腸菌ＴＧ１細胞（１．５×１０９CFU）を用いて腹腔内注射した。実線（Ｃｔｒ）は、細菌（Ｍ３３なし）だけを腹腔内注射されたマウスを示す。破線は、細菌を腹腔内注射され、３０分後にＭ３３ペプチド（１０mg/Kg）を１回注射されたマウスを示す。
【図４Ｂ】テトラ分岐Ｍ３３ペプチドのインビボでの抗菌活性。Ｂａｌｂ−ｃマウス（２０g）に、致死量の緑膿菌細胞（ＡＴＣＣ ２７８５３ １×１０７CFU）を用いて腹腔内注射した。実線（Ｃｔｒ）は、細菌だけを受けたマウスを示す；他の群は、３０分後に細菌及び単回用量のＭ３３を受けた（Ｍ３３の用量については図を参照のこと）。
【図４Ｃ】テトラ分岐Ｍ３３ペプチドのインビボでの抗菌活性。Ｂａｌｂ−ｃマウス（２０g）に、致死量の緑膿菌細胞（多剤耐性ＶＲ １４７臨床分離株、１．５×１０７CFU）を用いて腹腔内注射した。実線（Ｃｔｒ）は、細菌だけを受けたマウスを示す；破線は、細菌及び単回用量のＭ３３（２５mg/Kg）を受けたマウスを示す。
【図４Ｄ】テトラ分岐Ｍ３３ペプチドのインビボでの抗菌活性。Ｂａｌｂ−ｃマウス（２０g）に、致死量の緑膿菌細胞（ＡＴＣＣ ２７８５３ １×１０７CFU）を用いて腹腔内注射した。実線（Ｃｔｒ）は、細菌だけを受けたマウスを示す；長い破線は、細菌及び細菌の３０分後と１２時間後に２回のＭ３３注射（５mg/Kg×２）を受けたマウス；短い破線は、細菌及び細菌の３０分後、１２時間後と２４時間後に３回のＭ３３注射（５mg/Kg×３）を受けたマウス（Ｐ＜０．０５）。
【００２０】
発明の詳細な説明
ペプチド合成
単量体ペプチドを、自動シンセサイザー（MultiSynTech, Witten, Germany）により、Rink Amide MBHA樹脂（Nova Biochem）上で、９フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）化学及びＯ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート／１，３ジイソプロピルエチルアミン活性化を使用してペプチドアミドとして合成した。分岐ペプチド分子（ＭＡＰ）をＦｍｏｃ４−Ｌｙｓ２−Ｌｙｓ−βＡｌａ Ｗａｎｇ樹脂上で合成した。側鎖保護基は、Ｇｌｎについてはトリチル、Ｌｙｓについてはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、Ａｒｇについて２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル、及びＳｅｒについてｔｅｒｔ−ブチルエーテルであった。ペプチドを次に樹脂から切断し、水及びトリイソプロピルシランを含むトリフルオロ酢酸（９５／２．５／２．５）を用いて脱保護した。粗ペプチドを、逆相クロマトグラフィーにより、Vydac C18コラム上で精製した。最終産物の同一性及び純度を、Ettan（商標）MALDI-TOFマススペクトロメトリー（ＭＳ）（Amersham Biosciences）により確認した。
【００２１】
テトラ分岐Ｍ３３、Ｍ３４、Ｍ３５、及びＭ３６のプロテアーゼ耐性
合計１０μlの１０mMペプチド溶液を、３７℃で、１０μlのヒト血清とインキュベートした。サンプルを２４時間のインキュベーション後に回収し、１５０μlメタノールを用いて沈殿し、２分間にわたり１０，０００×gで遠心した。粗溶液を次に高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及びＭＳにより分析した。ＨＰＬＣをVydac C18カラムを用いて実施し、粗溶液を注入前に０．１%トリフルオロ酢酸を用いて５倍希釈し、２８０nmでモニターした。
【００２２】
ペプチドＭ３３、Ｍ３４、Ｍ３５、及びＭ３６の安定性
大腸菌ＴＧ１株の単一コロニーを２×ＴＹ培地中で０．２ＯＤ６００まで培養した。図１に表わす通りに希釈した２５μlのペプチド及び先の培養に由来する２５μlの大腸菌を、９６ウェルプレート中で７５分間にわたり３７℃で穏やかに撹拌しながらインキュベートした。コントロールとして、本発明者らは、２５μlの大腸菌及び２５μlの培地だけ（１００%生存率）を用いてインキュベートした１つのウェルを使用した。インキュベーション後、全てのウェルの溶液を１：１０００希釈し、寒天２×ＴＹプレート上にプレーティングした。プレートを一晩３０℃でインキュベートした。次の日、プレート上に増殖したコロニー（CFU/ml）をカウントした。
【００２３】
異なるバッチのテトラ分岐ペプチドＭ６（ＱＫＫＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号５）は、同じ実験において並行して分析された場合、大腸菌に対して相違する結果を提供した（図１ＡのＭ６バッチ１、２、及び３）。テトラ分岐Ｍ６を、従って、マススペクトロメトリーにより分析し、それによって２つの主なピークが明らかになり、１つはＭ６の標準分子量に、他は最初の残基としてピロＧｌｕを含むテトラ分岐ペプチドの分子量に対応する（図１Ｂ）。同一手順により得られたＭ６の異なる調製物は、常に異なる割合で２つのピークを伴うＭＳプロファイルを与え、最初のＧｌｎのピロＧｌｕへの変換が予測不可能なパーセンテージで生じることが確認された。Ｇｌｎの代わりでのピロＧｌｕの存在によってＭ６の抗菌活性が損なわれ、最初のアミノ酸が１００%ピロＧｌｕであるテトラ分岐ペプチドにより実証される通りである（図１ＡのピロＭ６）。従って、ペプチドＭ６が新たな薬物の開発のための真の候補であると考えることはできない。
【００２４】
ペプチドＭ６配列（ＱＫＫＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号５）からの最初のアミノ酸の除去、及び最初の２つのＬｙｓのＡｒｇでの可能な置換、又はこれらの２つのアミノ酸の代用によって、４つの新たな配列（ＫＫＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号１、ＲＲＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号２、ＫＲＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号３、ＲＫＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号４）が産生され、異なる期間に行われた合成に由来するペプチドの高度に安定な活性を伴う。
【００２５】
特に、Ｍ３３：ＫＫＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号１と呼ばれるペプチドを多くの異なるバッチ中で合成し、それらの全てが同じＭＳプロファイルを与え、単一ピークがテトラ分岐Ｍ３３の分子量に対応した（図１Ｃ）。予測通り、テトラ分岐Ｍ３３は、また、血清中で２４時間にわたりインキュベートされた場合、タンパク質分解に対して非常に安定であった（図１Ｃ）。実際に、Ｍ６の配列からの最初の残基の除去によって、バッチ間の均一性が安定化されただけでなく、ペプチドの抗菌活性も改善された（図１Ａ中のＭ３３）。
【００２６】
Ｍ３３、Ｍ３４、Ｍ３５、及びＭ３６の多くの異なる合成では、結果における任意の変動なく完全に重複する結果が与えられた。
【００２７】
上で実証された安定性のため、ペプチドＭ３３、Ｍ３４、Ｍ３５、及びＭ３６が、新たな抗菌医薬の作製のための非常に魅力的な候補になる。
【００２８】
テトラ分岐ペプチドＭ３３、Ｍ３４、Ｍ３５、及びＭ３６の抗菌活性
最小阻止濃度（ＭＩＣ）を、臨床研究所規格委員会（ＮＣＣＬＳ）により推奨される標準的な微量希釈アッセイにより、カチオン添加ミューラー・ヒントン（ＭＨ）ブロス（Oxoid Ltd. Basingstoke, UK）及び５×１０４CFU/ウェルの細菌接種材料を最終容積１００μl中で使用して決定した。結果を、３７℃で２４時間のインキュベーション後に目視検査により記録した。
【００２９】
Ｍ３３、Ｍ４、Ｍ３５、及びＭ３６のＭＩＣを、いくつかの細菌種（グラム陰性病原菌及びまた黄色ブドウ球菌を含む）の株に対して決定した（表１）。
【００３０】
マイクロモル範囲のＭＩＣが、いくつかのグラム陰性菌（緑膿菌、アシネトバクター・バウマンニ、及び大半の腸内細菌科を含む）に対して観察された（プロテウス・ミラビリス、セラチア・マルセセンス、及びバークホルデリア・セパシアを除く）。ペプチドの活性は、種々の耐性機構（例えば広域スペクトルのベータ−ラクタマーゼ及びカルバペネマーゼなど）を伴うＭＤＲ株（ＣＦ患者からのＭＤＲ緑膿菌株を含む）に対して保持された。Ｍ３３、Ｍ４、Ｍ５、及びＭ６の抗菌プロファイルならびに効力は、全般的にポリミキシンＢのものと類似していたが、Ｍ３３、Ｍ３４、Ｍ３５、及びＭ３６も黄色ブドウ球菌に対してある程度の活性を有すると思われた（表１）。
【００３１】
【表１】
ａテストされた株は（示した）参照株又は臨床分離株（大半がＭＤＲ表現型を示している）のいずれかを含んだ；関連する耐性形質及び耐性機構が示される：＿ＦＱｒ、フルオロキノロンに耐性；ＡＧｒ、アミノグリコシド（ゲンタマイシン、アミカシン、及び／又はトブラマイシン）に耐性；ＥＳＣｒ、広域スペクトルのセファロスポリンに耐性；ＮＥＭｒ、カルバペネム（イミペネム及び／又はメロペネム）に耐性、ＥＲＴｒ、エルタペネムに耐性；ＣＯＬＮＳ、コリスチンに非感受性；ＥＳＢＬ、広域スペクトルのβラクタマーゼ；ＭＢＬ、メタロ−β−ラクタマーゼ；ＯＸＡ、オキサシリナーゼ；ＭＲ、メチシリン耐性；ＶＡＮｉ、バンコマイシン中間体
ｂ嚢胞性線維症患者からの臨床分離株
ｃムコイド表現型
【００３２】
本発明に記載されるペプチドは、グラム陰性細菌について特に選択的であるように思われた。恐らくは、なぜなら、それらはＬＰＳ（グラム陰性菌にだけ構成的に存在する）に強く結合するからである。両親媒性プロファイル、及び大過剰のペプチドの正電荷は、それらが、細菌膜と相互作用し、類似の構造を伴う抗菌ペプチドについて記載された作用機構の１つにより細胞に侵入しうることも示唆する。
【００３３】
テトラ分岐ペプチドＭ３３、Ｍ３４、Ｍ３５、及びＭ３６の溶血活性
新鮮ヒト赤血球の溶血を、Parpartの方法（以下にまとめる）を使用して決定した。較正曲線を、種々の濃度のＮａＣｌを伴うリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、１１０mMリン酸ナトリウム）中に新鮮ヒト赤血球を浮遊させ、室温で３０分間インキュベートすることにより構築した。サンプルを５００×gで５分間遠心し、ヘモグロビン放出を、５４０nmで上清の吸光度を測定することによりモニターした。０．１% ＮａＣｌを用いて得られた吸光度は１００%溶解に、１% ＮａＣｌを用いた吸光度は０%溶解に対応する。ＰＢＳ中に溶解されたペプチドを、いくつかの濃度でヒト赤血球溶液に加えた。結果として得られた浮遊液を別々に３７℃で２時間及び２４時間にわたりインキュベートした。ヘモグロビンの放出を、遠心後に５４０nmで上清の吸光度を測定することによりモニターし、溶血パーセンテージを、較正曲線を使用して算出した。非常に重要な特性は、今までに記載された大半の抗菌ペプチドに反して、Ｍ３３、Ｍ３４、Ｍ３５、及びＭ３６ペプチドが実際的には無視できる溶血悪性度を示し（図２）、全身投与を通じたそれらの可能な使用も示唆する。
【００３４】
リポポリサッカリド（ＬＰＳ）の中和
グラム陰性細菌感染において、ＬＰＳの放出が、敗血症及び敗血性ショックの病態生理に関与することが公知である。同じく効果的にＬＰＳを中和する抗菌ペプチドが、敗血症と戦う際にかなり重要である。最初に、テトラ分岐Ｍ３３をリムルス・アメボサイト・ライセートテスト（E-toxate）において分析し、ＬＰＳに起因するサンプルゲル化を中和するその能力を実証した（示さず）。次に、それを、Ｒａｗ ２６４．７マクロファージによるＬＰＳ誘導性ＴＮＦ−α分泌の阻害について検証した。Ｍ３３は、マクロファージが緑膿菌血清型１０ ＡＴＣＣ２７３１６（図３Ａ）及び肺炎桿菌ＡＴＣＣ１５３８０（図３Ｂ）からのＬＰＳ（ＥＣ５０がそれぞれ４ｅ−８M及び２．６ｅ−７M）を用いて刺激された場合、用量依存的な様式でＴＮＦ−α分泌を遮断できた。顕著に、ＭＩＣに対応する濃度（緑膿菌及び肺炎桿菌について１．５〜３μM）で、Ｍ３３はＴＮＦ−α産生を９０%超（マクロファージが緑膿菌からのＬＰＳを用いて刺激された場合）及び８０%超（マクロファージが肺炎桿菌からのＬＰＳを用いて刺激された場合）減少させた。Ｍ３３は、マクロファージを３倍のＭＩＣ濃度でインキュベートした場合、定量可能な量のＴＮＦ−αを刺激した。
【００３５】
インビボでの抗菌活性
テトラ分岐Ｍ３３ペプチドを、致死量の細菌を用いて感染させたマウスにおけるその抗菌活性について分析した。２つの異なる細菌種を使用した（大腸菌及び緑膿菌）。腹腔内（ｉｐ）注射後に１００%致死感染（ＬＤ１００）を起こす最小数の細菌は、大腸菌ＴＧ１、緑膿菌ＡＴＣＣ ２７８５３、及びＭＤＲ臨床分離株緑膿菌ＶＲ１４３／９７についてそれぞれ１．５×１０９、１×１０７、及び１．５×１０７であった。細菌ＬＤ１００はマウスを２０〜２４時間で殺す。Ｂａｌｂ−ｃマウスをＬＤ１００の細菌を用いて感染させ、３０分後にペプチドを用いて腹腔内投与により処置した。
【００３６】
大腸菌ＴＧ１を用いた感染後、Ｍ３３は、濃度１０mg/Kgの単回投与で投与された場合、動物を敗血症の徴候及び死亡（７日間生存）から保護した（図４Ａ）。マウスを緑膿菌ＡＴＣＣ ２７８５３を用いて攻撃した後、濃度２５mg/Kg及び１２．５mg/Kgの単回用量で投与されたＭ３３は、動物の７５%及び２５%を保護し、６．５mg/Kgでは、それは動物を、死亡からを保護しなかったが、死亡は未処置コントロールと比較して遅延した（図４Ｂ）。最後に、緑膿菌ＶＲ−１４３／９７、ポリミキシンＢだけに感受性であるＭＤＲ株（１９）、及び現在イタリアで蔓延するクローンの代表（Cornaglia et al., 2000）を使用し、マウスを攻撃した。濃度２５mg/Kgの単回用量で投与されたＭ３３は、動物の１００%を保護した（図４Ｃ）。Ｍ３３を、次に、緑膿菌ＡＴＣＣ ２７８５３を用いた感染後に複数用量で投与された場合にその活性について分析した。マウスを５mg/Kg Ｍ３３の２用量を用いて１２時間毎に処置した場合（感染後３０分後と１２時間後）、死亡が遅延された。マウスを５mg/Kg Ｍ３３の３用量を用いて１２時間毎に処置した場合（感染後３０分後、１２時間後及び２４時間後）、敗血症の徴候からの完全保護が得られ、１００%が感染後７日を超えて生存した（図４Ｄ）。
【００３７】
Ｍ３３は、ペプチド用量１００mg/Kg（本明細書において報告する用量の４倍）を用いて腹腔内処置された動物において見かけ上の毒性徴候を産生しなかった（示さず）。Ｍ３３のインビボでの抗菌活性も、ＬＤ１００の緑膿菌ＡＴＣＣ ２７８５３を用いた感染及び単回用量（２５mg/Kg）のＭ３３を用いた処置後に血液、腹水、脾臓、及び肝臓において細菌を異なる回数でカウントすることにより評価した。感染から１８時間後、血液は見かけ上細菌がなくなり、腹水、脾臓、及び肝臓における細菌数はコントロールよりも有意に低くなった。４０時間後、全てのサンプリングされた身体部位には見かけ上細菌がなくなった（表２）。
【００３８】
【表２】
ａ緑膿菌１×１０７CFU/マウスを用いて腹腔内注射された瀕死の動物（感染から１８時間後に屠殺された）
ｂ緑膿菌１×１０７CFU/マウスを用いて腹腔内注射され、Ｍ３３（２５mg/Kg）を用いて処置され、感染から１８時間後に屠殺された動物
ｃ緑膿菌１×１０７CFU/マウスを用いて腹腔内注射され、Ｍ３３（２５mg/Kg）を用いて処置され、感染から４０時間後に屠殺された動物
【００３９】
【表３】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特にテトラ分岐ＭＡＰ形態で合成された場合、プロテアーゼ活性に対して特に耐性であり、結果的に、インビボでの使用に非常に適する強力な抗菌ペプチド配列の同定に関する。本発明の配列（ＫＫＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号１、ＲＲＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号２、ＫＲＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号３、ＲＫＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号４）は、最初のアミノ末端残基としてＧｌｎをもたらす以前に報告されたペプチドＭ６に由来する。Ｇｌｎの除去は、ペプチド安定性及びロット間均一性における予期せぬ、驚くべき改善を与え、そして、結果的に、Ｍ６ペプチドについて特に困難であるペプチド合成のために信頼できる方法を可能にした。
【０００２】
背景技術
多剤耐性細菌の増大する緊急事態は、抗生物質が臨床において広く使用されるそれらの国々の大半における世界的な懸念である。多くの病原菌（黄色ブドウ球菌、結核菌、一部の腸球菌、緑膿菌、及び多くの他のグラム陰性菌など）が、大半の従来の抗生物質に対して、ならびに新世代の抗生物質に対して耐性を発生している（Wenzel and Edmond 2000）。従って、新たな抗生物質を開発することがますます重要になっている。この要求のため、研究者のコミュニティー及び製薬会社が新たな抗菌薬剤を考えることが急務となる。抗菌ペプチドが、一般的に耐性細菌の選択を起こす従来の抗生物質に対する最良の代用物の１つであると考えられる（Hancock and Sahl 2006）。大半の抗菌ペプチドが、動物（ヒト、植物、及び真菌を含む）の先天免疫の成分である（Zasloff, 2002）。それらは、通常、６〜５０のアミノ酸残基からなり、正味の正電荷を有する。カチオン性ペプチドが、選択的に、アニオン性細菌膜と、及び他の負電荷を帯びた構造（例えばＬＰＳ及びＤＮＡなど）と相互作用する。真核生物膜が、それらの外層において、通常、細菌膜より低く、異なって負電荷を帯びており、それらは、また、コレステロール分子により安定化される。これらの違いは、カチオン性ペプチドの特異性の基礎である。カチオン性抗菌ペプチドの作用機構は、結果的に、細菌膜に対するそれらの特異的結合に起因し、それによって細胞浸透及び、一部の場合において、代謝経路阻害が惹起される。
【０００３】
多くの試験が、次に、それらの作用機構、真核細胞でのそれらの毒性、及び局所又は全身投与された場合でのそれらの治療効力を試験することによる抗菌ペプチド配列の同定及び特性付けを目指した。残念なことに、２つの主な問題によって今まで抗菌ペプチド薬物の開発が妨げられた。第１は、細菌についての天然抗菌ペプチドの選択性が一般的に低すぎ、それらは、真核細胞、特に赤血球について非常に有毒であると思われ、高レベルの溶血を引きおこすことである。第２は、インビボでのペプチドの一般的に短い半減期に関連する。これらは、少数のカチオン性ペプチドしか過去１０年間に市場に届いていないことの主な理由である（ポリミキシン及びダプトマイシンは２つの成功例である）。
【０００４】
数年前、研究者が、合理的な設計又はコンビナトリアルライブラリーのスクリーニングにより実験室において選択された非天然の新規ペプチド配列の同定に集中し始めた。目的は、細菌についての一般的な毒性及び特異性の点でより良好な生物学的特性ならびに薬物開発のための改善された半減期を伴うペプチドを見出すことであった。
【０００５】
本発明者らの実験室において、非天然ペプチド配列が同定され、それは特にグラム陰性菌に対して強い抗菌活性を示した（Pini et al., 2005）。ペプチド（ＱＫＫＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号５、Ｍ６と呼ばれる）は、コンビナトリアルライブラリーから同定された配列の合理的な改変により得られ、４つの同一のペプチド配列がリジンコアにより一緒に連結されたＭＡＰテトラ分岐形態で合成された。この分子は、プロテアーゼ及びペプチダーゼに対して高い耐性を示し、従って、短い半減期の問題を克服する（Bracci et al., 2003; Falciani et al., 2007）。分岐抗菌ペプチドＭ６は、既に、多くの細菌（いくつかの多剤耐性臨床分離株を含む）に対するその生物活性について、ＤＮＡとのその相互作用について、いくつかの真核生物細胞株に対するインビトロでの毒性について、ならびに、その溶血活性について、その免疫原性について、腹腔内又は静脈内注射された場合でのそのインビボでの毒性について特徴付けられている（Pini et al., 2007）。
【０００６】
Ｍ６特性付けのために行われた全ての実験の間に、本発明者らは、Ｍ６の異なる合成によって非相同活性（バッチ間相違点）を伴うペプチドが産生されたことに気付いた（図１Ａ）。マススペクトロメトリー分析によって、Ｍ６の最初のアミノ酸、即ちＧｌｎが、ピログルタミン酸に変換されることが明らかになった（図１Ｂ）。ピログルタミン酸を含むが、Ｇｌｎを含まない異なるペプチドの存在は、予測不可能なパーセンテージで、バッチ間で変化する。この二次産物の完全除去は実際に不可能である。第１に、なぜなら、主な産物との類似の保持時間のため、ＨＰＬＣ精製の間に容易に捨てられないからであり、第２に、なぜなら、それは、溶液中にある場合に、親ペプチドから持続的に産生されるからである。ピロＧｌｕアナログは、Ｇｌｎアナログに関して、感知できる抗菌活性の低下を示すため、混合物の全活性はバッチ間で変動した（図１Ａ）。
【０００７】
バッチ間での相違点を最小限にするために、前臨床実験のため及び、恐らくは、工業的製造のための大スケールペプチド産生の観点から、本発明者らは、Ｍ６から最初のＧｌｎ残基を除去し、また、最初の２つのＬｙｓをＡｒｇと置換し、又は、最初の２つの残基をＬｙｓ及びＡｒｇで代用した。これによって、Ｍ６配列中に存在する最初のＧｌｎを取り除いた以下の９−ｍｅｒ配列が産生された：ＫＫＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号１、Ｍ３３と呼ぶ；ＲＲＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号２、Ｍ３４と呼ぶ；ＫＲＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号３、Ｍ３５と呼ぶ；ＲＫＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号４、Ｍ３６と呼ぶ。これらの配列は本願の対象である。
【０００８】
新たなペプチドを、以下の実施例に記載するいくつかの特性付けに供した。
【０００９】
実際的には、Ｍ６ペプチド配列のＮ末端の単一アミノ酸残基の除去、及び最初の２つの位置でのＬｙｓ及びＡｒｇの可能な代用は、より良好な抗菌活性を産生し、副毒性及び作用機構の点での任意の異なる挙動の原因にはならない。実際に、それによって合成負担における強い改善が産まれ、ペプチドＭ３３、Ｍ３４、Ｍ３５、及びＭ３６の配列が、Ｍ６に関する工業的開発のためにずっとより適するようになる。Ｍ３３、Ｍ３４、Ｍ３５、及びＭ３６配列は、改善された安定性及びバッチ間均一性のおかげで、抗菌薬物の開発のための理想的な候補である。
【００１０】
発明の説明
本発明の対象は、ペプチド配列ＫＫＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号１、Ｍ３３、ＲＲＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号２、Ｍ３４、ＫＲＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号３、Ｍ３５、ＲＫＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号４、Ｍ３６であって、単量体構造又はデンドリマー構造で、好ましくは以下の一般式：
【化１】
（式中、Ｒは、Ｍ３３、Ｍ３４、Ｍ３５、及びＭ３６の群において選ばれる配列を伴う単量体ペプチドであり（全てのＲが、１つのＭＡＰ分子において同じ配列である）、Ｘは三官能性分子であり、ＺはＸ又は以下の化学基：
【化２】
（式中、Ｒ及びＸは上に定義される）としての三官能性分子である）
に従う多抗原性ペプチド（ＭＡＰ）形態で合成される。
【００１１】
本発明のさらなる対象は、アミノ末端からカルボキシ末端に、ＫＫＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号１、ＲＲＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号２、ＫＲＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号３、ＲＫＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号４又はその誘導体の群より選択されるアミノ酸配列を有する抗菌ペプチドであって、ここで１つのアミノ酸残基がアラニン残基により置換され、又は、ここで１つの正電荷アミノ酸を別の正電荷アミノ酸により置換される。好ましくは、ペプチドは線形形態である。より好ましくは、ペプチドは、ポリアクリルアミドの骨格上で、デキストラン単位の骨格上で、又はエチレングリコール単位の骨格上で多量体化される。さらに好ましくは、ペプチドは、以下の式：
【化３】
（式中、Ｒは、請求項１において主張されるペプチドであり；Ｘは三官能性分子であり；ｍ＝０又は１；ｎ＝０又は１；ｍ及びｎが０の場合、ペプチドは二量体であり；ｍ＝１及びｎ＝０の場合、ペプチドは四量体であり、ｍ＝１及びｎ＝１の場合、ペプチドは八量体である）を有する多抗原性ペプチド（ＭＡＰ）の形態である。
【００１２】
好ましくは、Ｘは三官能性単位である。より好ましくは、三官能性単位は少なくとも２つの機能性アミノ基を含む。さらに好ましくは、Ｘは、リジン、オルニチン、ノルリジン（nor-lysine）、又はアミノアラニンである。さらに好ましくは、Ｘは、アスパラギン酸又はグルタミン酸である。より好ましくは、Ｘは、プロピレングリコール、コハク酸、ジイソシアネート、又はジアミン誘導体である。
【００１３】
本発明のさらなる対象は、医学的使用のための上に記載されるペプチドである。好ましくは抗菌薬物としてである。
【００１４】
本発明のさらなる対象は、医薬的に許容可能な有効量の上に記載するペプチドを含む医薬的組成物である。好ましくは、組成物は、全身使用のために個人において注射される溶液の形態、より好ましくはＬＰＳ中和のための解毒剤として注射される溶液の形態、さらに好ましくは洗眼液、洗口剤、軟膏、又は局所使用のための溶液の形態である。
【００１５】
本発明のさらなる対象は、本発明のペプチドを含む抗菌活性を伴う殺菌剤及び／又は界面活性剤の調製である。
【００１６】
また、本発明の対象は、食品産物及び／又は化粧品産物及び／又はホメオパシー産物の調製のための保存剤としての本発明のペプチドの使用である。
【００１７】
本発明の対象は、医学的、獣医的、及び農学的適用のための抗菌薬剤としてのそのようなペプチドの使用である。
【００１８】
本発明の配列は、分子組成及び生物学的活性の両方の点でのそれらの安定性及び強いバッチ間均一性のため、既に記載したＭ６ペプチドに関して有利である。Ｍ６配列（ＱＫＫＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号５）は、最初のＮ末端残基としてＧｌｎアミノ酸を含んだ。このアミノ酸は、予測不可能な量でピログルタミン酸に自然に変換される傾向があった。バッチ中のピログルタミン酸の存在によって、ピログルタミン酸のパーセンテージに依存して、全ペプチド活性における感知できる減少が起こった（図１Ａ）。実際に、Ｍ６ペプチドの抗菌活性は長期間で一貫しておらず、これは製造のスケールアップに負の影響を与える。単純で、明らかにわずかなＭ６配列からの最初のＧｌｎの除去、ならびに、恐らくは、最初の２つの残基のＬｙｓ及びＡｒｇでの代用によって、強く改善された安定性及びバッチ間均一性を伴う新たなペプチド配列が産生され、大規模製造が信頼できるようになる。この重大な特性は、その非常に有望な抗菌活性とともに、ペプチドＭ３３、Ｍ３４、Ｍ３５、及びＭ３６を新たな抗菌薬物の開発のための最適な候補にする。本発明は、本明細書において、以下の図を参照する非限定的な例により記載される：
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】大腸菌ＴＧ１細胞に対する抗菌活性。以下のテトラ分岐ペプチドの比較：Ｍ６バッチ１合成（三角）、Ｍ６バッチ２合成（四角）、Ｍ６バッチ３合成（白丸）、それらは最初のアミノ酸、ピロＭ６（アステリスク）としてＧｌｎとピロＧｌｕの混合物を含み（パーセンテージは不明）、ここで最初のアミノ酸は１００%ピロＧｌｕであり、及びＭ３３（黒丸）、それにおいて最初のＧｌｎが欠失した。１００%ピロＧｌｕを含むペプチドは最悪の結果を与え、ＧｌｎのピロＧｌｕへの修飾によって抗菌活性が減少することが確認された。Ｇｌｎ及びピロＧｌｕの両方を含むＭ６ペプチドは、中間の抗菌活性を示した。Ｍ６配列からの最初の残基の除去によってペプチド活性が改善された（Ｍ３３についての曲線により実証された通りである）。ＳＤは、３つの異なる実験を用いて得られた。Ｍ３３の（ならびに、また、Ｍ３４、Ｍ３５、及びＭ３６の、本明細書で示さず）多くの異なる合成によって、任意の変動する結果を伴わない完全に重複する結果が与えられた。
【図１Ｂ】テトラ分岐ペプチドＭ６粗製混合物のマススペクトロメトリー分析 Ｍ６の算出された分子量は５１９５Daであった。２つの主なピークが存在し、１つは非修飾Ｍ６に対応する５１９７Daで、１つは二次産物に対応する５１７９Daで、１つのピロＧｌｕが、４つのＧｌｎの１つの場所の最初の位置にある。
【図１Ｃ】血清中での２４時間のインキュベーション後でのテトラ分岐ペプチドＭ３３のマススペクトロメトリー分析 ペプチドは、予測分子量（４６８３DA）で単一ピークとして現われる。
【図２】ヒト赤血球細胞を用いて３又は２４時間インキュベートされたテトラ分岐Ｍ３３ペプチドにより惹起された溶血のパーセンテージ。最高濃度では、それはわずかに無視できる溶血活性を起こした。
【図３Ａ】ＬＰＳの中和によるＴＮＦ−α放出の阻害。Ｒａｗ ２６４．７細胞を、緑膿菌からのＬＰＳ（２０ng/ml）及びＭ３３とインキュベートした。三角は、ＬＰＳと異なる濃度のＭ３３を用いたインキュベーションを示す。四角は、Ｍ３３だけを用いたインキュベーションを示す。
【図３Ｂ】ＬＰＳの中和によるＴＮＦ−α放出の阻害。Ｒａｗ ２６４．７細胞を、肺炎桿菌からのＬＰＳ（５ng/ml）及びＭ３３とインキュベートした。三角は、ＬＰＳと異なる濃度のＭ３３を用いたマクロファージのインキュベーションを示す。四角は、Ｍ３３だけを用いたマクロファージのインキュベーションを示す。ＳＤは、３つの異なる実験を用いて得られた。１００%は、Ｍ３３なしでＬＰＳを用いてインキュベートされた場合にマクロファージにより産生されるＴＮＦ−αの最大量を示す。他のパーセンテージは、ＬＰＳ及びＭ３３を用いてインキュベートされた場合にマクロファージにより産生されるＴＮＦ−αの量を示す（１００%に対する）。ＴＮＦ−αの基礎レベルは無視できた。Ｍ３３のＭＩＣは、矢印により示される。
【図４Ａ】テトラ分岐Ｍ３３ペプチドのインビボでの抗菌活性。Ａ．Ｂａｌｂ−ｃマウス（２０g）に、致死量の大腸菌ＴＧ１細胞（１．５×１０９CFU）を用いて腹腔内注射した。実線（Ｃｔｒ）は、細菌（Ｍ３３なし）だけを腹腔内注射されたマウスを示す。破線は、細菌を腹腔内注射され、３０分後にＭ３３ペプチド（１０mg/Kg）を１回注射されたマウスを示す。
【図４Ｂ】テトラ分岐Ｍ３３ペプチドのインビボでの抗菌活性。Ｂａｌｂ−ｃマウス（２０g）に、致死量の緑膿菌細胞（ＡＴＣＣ ２７８５３ １×１０７CFU）を用いて腹腔内注射した。実線（Ｃｔｒ）は、細菌だけを受けたマウスを示す；他の群は、３０分後に細菌及び単回用量のＭ３３を受けた（Ｍ３３の用量については図を参照のこと）。
【図４Ｃ】テトラ分岐Ｍ３３ペプチドのインビボでの抗菌活性。Ｂａｌｂ−ｃマウス（２０g）に、致死量の緑膿菌細胞（多剤耐性ＶＲ １４７臨床分離株、１．５×１０７CFU）を用いて腹腔内注射した。実線（Ｃｔｒ）は、細菌だけを受けたマウスを示す；破線は、細菌及び単回用量のＭ３３（２５mg/Kg）を受けたマウスを示す。
【図４Ｄ】テトラ分岐Ｍ３３ペプチドのインビボでの抗菌活性。Ｂａｌｂ−ｃマウス（２０g）に、致死量の緑膿菌細胞（ＡＴＣＣ ２７８５３ １×１０７CFU）を用いて腹腔内注射した。実線（Ｃｔｒ）は、細菌だけを受けたマウスを示す；長い破線は、細菌及び細菌の３０分後と１２時間後に２回のＭ３３注射（５mg/Kg×２）を受けたマウス；短い破線は、細菌及び細菌の３０分後、１２時間後と２４時間後に３回のＭ３３注射（５mg/Kg×３）を受けたマウス（Ｐ＜０．０５）。
【００２０】
発明の詳細な説明
ペプチド合成
単量体ペプチドを、自動シンセサイザー（MultiSynTech, Witten, Germany）により、Rink Amide MBHA樹脂（Nova Biochem）上で、９フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）化学及びＯ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート／１，３ジイソプロピルエチルアミン活性化を使用してペプチドアミドとして合成した。分岐ペプチド分子（ＭＡＰ）をＦｍｏｃ４−Ｌｙｓ２−Ｌｙｓ−βＡｌａ Ｗａｎｇ樹脂上で合成した。側鎖保護基は、Ｇｌｎについてはトリチル、Ｌｙｓについてはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、Ａｒｇについて２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル、及びＳｅｒについてｔｅｒｔ−ブチルエーテルであった。ペプチドを次に樹脂から切断し、水及びトリイソプロピルシランを含むトリフルオロ酢酸（９５／２．５／２．５）を用いて脱保護した。粗ペプチドを、逆相クロマトグラフィーにより、Vydac C18コラム上で精製した。最終産物の同一性及び純度を、Ettan（商標）MALDI-TOFマススペクトロメトリー（ＭＳ）（Amersham Biosciences）により確認した。
【００２１】
テトラ分岐Ｍ３３、Ｍ３４、Ｍ３５、及びＭ３６のプロテアーゼ耐性
合計１０μlの１０mMペプチド溶液を、３７℃で、１０μlのヒト血清とインキュベートした。サンプルを２４時間のインキュベーション後に回収し、１５０μlメタノールを用いて沈殿し、２分間にわたり１０，０００×gで遠心した。粗溶液を次に高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及びＭＳにより分析した。ＨＰＬＣをVydac C18カラムを用いて実施し、粗溶液を注入前に０．１%トリフルオロ酢酸を用いて５倍希釈し、２８０nmでモニターした。
【００２２】
ペプチドＭ３３、Ｍ３４、Ｍ３５、及びＭ３６の安定性
大腸菌ＴＧ１株の単一コロニーを２×ＴＹ培地中で０．２ＯＤ６００まで培養した。図１に表わす通りに希釈した２５μlのペプチド及び先の培養に由来する２５μlの大腸菌を、９６ウェルプレート中で７５分間にわたり３７℃で穏やかに撹拌しながらインキュベートした。コントロールとして、本発明者らは、２５μlの大腸菌及び２５μlの培地だけ（１００%生存率）を用いてインキュベートした１つのウェルを使用した。インキュベーション後、全てのウェルの溶液を１：１０００希釈し、寒天２×ＴＹプレート上にプレーティングした。プレートを一晩３０℃でインキュベートした。次の日、プレート上に増殖したコロニー（CFU/ml）をカウントした。
【００２３】
異なるバッチのテトラ分岐ペプチドＭ６（ＱＫＫＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号５）は、同じ実験において並行して分析された場合、大腸菌に対して相違する結果を提供した（図１ＡのＭ６バッチ１、２、及び３）。テトラ分岐Ｍ６を、従って、マススペクトロメトリーにより分析し、それによって２つの主なピークが明らかになり、１つはＭ６の標準分子量に、他は最初の残基としてピロＧｌｕを含むテトラ分岐ペプチドの分子量に対応する（図１Ｂ）。同一手順により得られたＭ６の異なる調製物は、常に異なる割合で２つのピークを伴うＭＳプロファイルを与え、最初のＧｌｎのピロＧｌｕへの変換が予測不可能なパーセンテージで生じることが確認された。Ｇｌｎの代わりでのピロＧｌｕの存在によってＭ６の抗菌活性が損なわれ、最初のアミノ酸が１００%ピロＧｌｕであるテトラ分岐ペプチドにより実証される通りである（図１ＡのピロＭ６）。従って、ペプチドＭ６が新たな薬物の開発のための真の候補であると考えることはできない。
【００２４】
ペプチドＭ６配列（ＱＫＫＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号５）からの最初のアミノ酸の除去、及び最初の２つのＬｙｓのＡｒｇでの可能な置換、又はこれらの２つのアミノ酸の代用によって、４つの新たな配列（ＫＫＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号１、ＲＲＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号２、ＫＲＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号３、ＲＫＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号４）が産生され、異なる期間に行われた合成に由来するペプチドの高度に安定な活性を伴う。
【００２５】
特に、Ｍ３３：ＫＫＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号１と呼ばれるペプチドを多くの異なるバッチ中で合成し、それらの全てが同じＭＳプロファイルを与え、単一ピークがテトラ分岐Ｍ３３の分子量に対応した（図１Ｃ）。予測通り、テトラ分岐Ｍ３３は、また、血清中で２４時間にわたりインキュベートされた場合、タンパク質分解に対して非常に安定であった（図１Ｃ）。実際に、Ｍ６の配列からの最初の残基の除去によって、バッチ間の均一性が安定化されただけでなく、ペプチドの抗菌活性も改善された（図１Ａ中のＭ３３）。
【００２６】
Ｍ３３、Ｍ３４、Ｍ３５、及びＭ３６の多くの異なる合成では、結果における任意の変動なく完全に重複する結果が与えられた。
【００２７】
上で実証された安定性のため、ペプチドＭ３３、Ｍ３４、Ｍ３５、及びＭ３６が、新たな抗菌医薬の作製のための非常に魅力的な候補になる。
【００２８】
テトラ分岐ペプチドＭ３３、Ｍ３４、Ｍ３５、及びＭ３６の抗菌活性
最小阻止濃度（ＭＩＣ）を、臨床研究所規格委員会（ＮＣＣＬＳ）により推奨される標準的な微量希釈アッセイにより、カチオン添加ミューラー・ヒントン（ＭＨ）ブロス（Oxoid Ltd. Basingstoke, UK）及び５×１０４CFU/ウェルの細菌接種材料を最終容積１００μl中で使用して決定した。結果を、３７℃で２４時間のインキュベーション後に目視検査により記録した。
【００２９】
Ｍ３３、Ｍ４、Ｍ３５、及びＭ３６のＭＩＣを、いくつかの細菌種（グラム陰性病原菌及びまた黄色ブドウ球菌を含む）の株に対して決定した（表１）。
【００３０】
マイクロモル範囲のＭＩＣが、いくつかのグラム陰性菌（緑膿菌、アシネトバクター・バウマンニ、及び大半の腸内細菌科を含む）に対して観察された（プロテウス・ミラビリス、セラチア・マルセセンス、及びバークホルデリア・セパシアを除く）。ペプチドの活性は、種々の耐性機構（例えば広域スペクトルのベータ−ラクタマーゼ及びカルバペネマーゼなど）を伴うＭＤＲ株（ＣＦ患者からのＭＤＲ緑膿菌株を含む）に対して保持された。Ｍ３３、Ｍ４、Ｍ５、及びＭ６の抗菌プロファイルならびに効力は、全般的にポリミキシンＢのものと類似していたが、Ｍ３３、Ｍ３４、Ｍ３５、及びＭ３６も黄色ブドウ球菌に対してある程度の活性を有すると思われた（表１）。
【００３１】
【表１】
ａテストされた株は（示した）参照株又は臨床分離株（大半がＭＤＲ表現型を示している）のいずれかを含んだ；関連する耐性形質及び耐性機構が示される：＿ＦＱｒ、フルオロキノロンに耐性；ＡＧｒ、アミノグリコシド（ゲンタマイシン、アミカシン、及び／又はトブラマイシン）に耐性；ＥＳＣｒ、広域スペクトルのセファロスポリンに耐性；ＮＥＭｒ、カルバペネム（イミペネム及び／又はメロペネム）に耐性、ＥＲＴｒ、エルタペネムに耐性；ＣＯＬＮＳ、コリスチンに非感受性；ＥＳＢＬ、広域スペクトルのβラクタマーゼ；ＭＢＬ、メタロ−β−ラクタマーゼ；ＯＸＡ、オキサシリナーゼ；ＭＲ、メチシリン耐性；ＶＡＮｉ、バンコマイシン中間体
ｂ嚢胞性線維症患者からの臨床分離株
ｃムコイド表現型
【００３２】
本発明に記載されるペプチドは、グラム陰性細菌について特に選択的であるように思われた。恐らくは、なぜなら、それらはＬＰＳ（グラム陰性菌にだけ構成的に存在する）に強く結合するからである。両親媒性プロファイル、及び大過剰のペプチドの正電荷は、それらが、細菌膜と相互作用し、類似の構造を伴う抗菌ペプチドについて記載された作用機構の１つにより細胞に侵入しうることも示唆する。
【００３３】
テトラ分岐ペプチドＭ３３、Ｍ３４、Ｍ３５、及びＭ３６の溶血活性
新鮮ヒト赤血球の溶血を、Parpartの方法（以下にまとめる）を使用して決定した。較正曲線を、種々の濃度のＮａＣｌを伴うリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、１１０mMリン酸ナトリウム）中に新鮮ヒト赤血球を浮遊させ、室温で３０分間インキュベートすることにより構築した。サンプルを５００×gで５分間遠心し、ヘモグロビン放出を、５４０nmで上清の吸光度を測定することによりモニターした。０．１% ＮａＣｌを用いて得られた吸光度は１００%溶解に、１% ＮａＣｌを用いた吸光度は０%溶解に対応する。ＰＢＳ中に溶解されたペプチドを、いくつかの濃度でヒト赤血球溶液に加えた。結果として得られた浮遊液を別々に３７℃で２時間及び２４時間にわたりインキュベートした。ヘモグロビンの放出を、遠心後に５４０nmで上清の吸光度を測定することによりモニターし、溶血パーセンテージを、較正曲線を使用して算出した。非常に重要な特性は、今までに記載された大半の抗菌ペプチドに反して、Ｍ３３、Ｍ３４、Ｍ３５、及びＭ３６ペプチドが実際的には無視できる溶血悪性度を示し（図２）、全身投与を通じたそれらの可能な使用も示唆する。
【００３４】
リポポリサッカリド（ＬＰＳ）の中和
グラム陰性細菌感染において、ＬＰＳの放出が、敗血症及び敗血性ショックの病態生理に関与することが公知である。同じく効果的にＬＰＳを中和する抗菌ペプチドが、敗血症と戦う際にかなり重要である。最初に、テトラ分岐Ｍ３３をリムルス・アメボサイト・ライセートテスト（E-toxate）において分析し、ＬＰＳに起因するサンプルゲル化を中和するその能力を実証した（示さず）。次に、それを、Ｒａｗ ２６４．７マクロファージによるＬＰＳ誘導性ＴＮＦ−α分泌の阻害について検証した。Ｍ３３は、マクロファージが緑膿菌血清型１０ ＡＴＣＣ２７３１６（図３Ａ）及び肺炎桿菌ＡＴＣＣ１５３８０（図３Ｂ）からのＬＰＳ（ＥＣ５０がそれぞれ４ｅ−８M及び２．６ｅ−７M）を用いて刺激された場合、用量依存的な様式でＴＮＦ−α分泌を遮断できた。顕著に、ＭＩＣに対応する濃度（緑膿菌及び肺炎桿菌について１．５〜３μM）で、Ｍ３３はＴＮＦ−α産生を９０%超（マクロファージが緑膿菌からのＬＰＳを用いて刺激された場合）及び８０%超（マクロファージが肺炎桿菌からのＬＰＳを用いて刺激された場合）減少させた。Ｍ３３は、マクロファージを３倍のＭＩＣ濃度でインキュベートした場合、定量可能な量のＴＮＦ−αを刺激した。
【００３５】
インビボでの抗菌活性
テトラ分岐Ｍ３３ペプチドを、致死量の細菌を用いて感染させたマウスにおけるその抗菌活性について分析した。２つの異なる細菌種を使用した（大腸菌及び緑膿菌）。腹腔内（ｉｐ）注射後に１００%致死感染（ＬＤ１００）を起こす最小数の細菌は、大腸菌ＴＧ１、緑膿菌ＡＴＣＣ ２７８５３、及びＭＤＲ臨床分離株緑膿菌ＶＲ１４３／９７についてそれぞれ１．５×１０９、１×１０７、及び１．５×１０７であった。細菌ＬＤ１００はマウスを２０〜２４時間で殺す。Ｂａｌｂ−ｃマウスをＬＤ１００の細菌を用いて感染させ、３０分後にペプチドを用いて腹腔内投与により処置した。
【００３６】
大腸菌ＴＧ１を用いた感染後、Ｍ３３は、濃度１０mg/Kgの単回投与で投与された場合、動物を敗血症の徴候及び死亡（７日間生存）から保護した（図４Ａ）。マウスを緑膿菌ＡＴＣＣ ２７８５３を用いて攻撃した後、濃度２５mg/Kg及び１２．５mg/Kgの単回用量で投与されたＭ３３は、動物の７５%及び２５%を保護し、６．５mg/Kgでは、それは動物を、死亡からを保護しなかったが、死亡は未処置コントロールと比較して遅延した（図４Ｂ）。最後に、緑膿菌ＶＲ−１４３／９７、ポリミキシンＢだけに感受性であるＭＤＲ株（１９）、及び現在イタリアで蔓延するクローンの代表（Cornaglia et al., 2000）を使用し、マウスを攻撃した。濃度２５mg/Kgの単回用量で投与されたＭ３３は、動物の１００%を保護した（図４Ｃ）。Ｍ３３を、次に、緑膿菌ＡＴＣＣ ２７８５３を用いた感染後に複数用量で投与された場合にその活性について分析した。マウスを５mg/Kg Ｍ３３の２用量を用いて１２時間毎に処置した場合（感染後３０分後と１２時間後）、死亡が遅延された。マウスを５mg/Kg Ｍ３３の３用量を用いて１２時間毎に処置した場合（感染後３０分後、１２時間後及び２４時間後）、敗血症の徴候からの完全保護が得られ、１００%が感染後７日を超えて生存した（図４Ｄ）。
【００３７】
Ｍ３３は、ペプチド用量１００mg/Kg（本明細書において報告する用量の４倍）を用いて腹腔内処置された動物において見かけ上の毒性徴候を産生しなかった（示さず）。Ｍ３３のインビボでの抗菌活性も、ＬＤ１００の緑膿菌ＡＴＣＣ ２７８５３を用いた感染及び単回用量（２５mg/Kg）のＭ３３を用いた処置後に血液、腹水、脾臓、及び肝臓において細菌を異なる回数でカウントすることにより評価した。感染から１８時間後、血液は見かけ上細菌がなくなり、腹水、脾臓、及び肝臓における細菌数はコントロールよりも有意に低くなった。４０時間後、全てのサンプリングされた身体部位には見かけ上細菌がなくなった（表２）。
【００３８】
【表２】
ａ緑膿菌１×１０７CFU/マウスを用いて腹腔内注射された瀕死の動物（感染から１８時間後に屠殺された）
ｂ緑膿菌１×１０７CFU/マウスを用いて腹腔内注射され、Ｍ３３（２５mg/Kg）を用いて処置され、感染から１８時間後に屠殺された動物
ｃ緑膿菌１×１０７CFU/マウスを用いて腹腔内注射され、Ｍ３３（２５mg/Kg）を用いて処置され、感染から４０時間後に屠殺された動物
【００３９】
【表３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ末端からカルボキシ末端に、ＫＫＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号１、ＲＲＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号２、ＫＲＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号３、ＲＫＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号４又はその機能的誘導体の群より選択されるアミノ酸配列を有し、ここで１つのアミノ酸残基がアラニン残基により置換され、又はここで１つの正電荷アミノ酸が別の正電荷アミノ酸により置換される、抗菌ペプチド。
【請求項２】
線形形態である、請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
ポリアクリルアミドの骨格上で、デキストラン単位の骨格上で、又はエチレングリコール単位の骨格上で多量体化される、請求項２記載のペプチド。
【請求項４】
以下の式：
【化４】
（式中、Ｒは、請求項１において主張されるペプチドであり；Ｘは三官能性分子であり；ｍ＝０又は１；ｎ＝０又は１；ｍ及びｎが０の場合、ペプチドは二量体であり；ｍ＝１及びｎ＝０の場合、ペプチドは四量体であり、ｍ＝１及びｎ＝１の場合、ペプチドは八量体である）を有する多抗原性ペプチド（ＭＡＰ）の形態である、請求項１記載のペプチド。
【請求項５】
Ｘが三官能性単位である、請求項４記載のＭＡＰペプチド。
【請求項６】
三官能性単位が少なくとも２つの機能性アミノ基を含む、請求項５記載のＭＡＰペプチド。
【請求項７】
Ｘがリジン、オルニチン、ノルリジン、又はアミノアラニンである、請求項６記載のＭＡＰペプチド。
【請求項８】
Ｘがアスパラギン酸又はグルタミン酸である、請求項４記載のＭＡＰペプチド。
【請求項９】
Ｘがプロピレングリコール、コハク酸、ジイソシアネート、又はジアミン誘導体である、請求項４記載のＭＡＰペプチド。
【請求項１０】
医学的使用のための請求項１〜９のいずれか一項記載のペプチド。
【請求項１１】
抗菌薬物としての請求項１〜１０のいずれか一項記載のペプチド。
【請求項１２】
医薬的に許容可能な有効量の請求項１０又は１１記載のペプチドを含む医薬的組成物。
【請求項１３】
全身使用のために個人において注射される溶液の形態である、請求項１２記載の医薬的組成物。
【請求項１４】
ＬＰＳ中和のための解毒剤として注射される溶液の形態である、請求項１２記載の医薬的組成物。
【請求項１５】
洗眼液、洗口剤、軟膏、又は局所使用のための溶液の形態である、請求項１２記載の医薬的組成物。
【請求項１６】
請求項１〜１１記載のペプチドを含む抗菌活性を伴う殺菌剤及び／又は界面活性剤。
【請求項１７】
食品産物及び／又は化粧品産物及び／又はホメオパシー産物の調製のための保存剤としての請求項１〜１１記載のペプチドの使用。
【請求項１】
アミノ末端からカルボキシ末端に、ＫＫＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号１、ＲＲＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号２、ＫＲＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号３、ＲＫＩＲＶＲＬＳＡ、配列番号４又はその機能的誘導体の群より選択されるアミノ酸配列を有し、ここで１つのアミノ酸残基がアラニン残基により置換され、又はここで１つの正電荷アミノ酸が別の正電荷アミノ酸により置換される、抗菌ペプチド。
【請求項２】
線形形態である、請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
ポリアクリルアミドの骨格上で、デキストラン単位の骨格上で、又はエチレングリコール単位の骨格上で多量体化される、請求項２記載のペプチド。
【請求項４】
以下の式：
【化４】
（式中、Ｒは、請求項１において主張されるペプチドであり；Ｘは三官能性分子であり；ｍ＝０又は１；ｎ＝０又は１；ｍ及びｎが０の場合、ペプチドは二量体であり；ｍ＝１及びｎ＝０の場合、ペプチドは四量体であり、ｍ＝１及びｎ＝１の場合、ペプチドは八量体である）を有する多抗原性ペプチド（ＭＡＰ）の形態である、請求項１記載のペプチド。
【請求項５】
Ｘが三官能性単位である、請求項４記載のＭＡＰペプチド。
【請求項６】
三官能性単位が少なくとも２つの機能性アミノ基を含む、請求項５記載のＭＡＰペプチド。
【請求項７】
Ｘがリジン、オルニチン、ノルリジン、又はアミノアラニンである、請求項６記載のＭＡＰペプチド。
【請求項８】
Ｘがアスパラギン酸又はグルタミン酸である、請求項４記載のＭＡＰペプチド。
【請求項９】
Ｘがプロピレングリコール、コハク酸、ジイソシアネート、又はジアミン誘導体である、請求項４記載のＭＡＰペプチド。
【請求項１０】
医学的使用のための請求項１〜９のいずれか一項記載のペプチド。
【請求項１１】
抗菌薬物としての請求項１〜１０のいずれか一項記載のペプチド。
【請求項１２】
医薬的に許容可能な有効量の請求項１０又は１１記載のペプチドを含む医薬的組成物。
【請求項１３】
全身使用のために個人において注射される溶液の形態である、請求項１２記載の医薬的組成物。
【請求項１４】
ＬＰＳ中和のための解毒剤として注射される溶液の形態である、請求項１２記載の医薬的組成物。
【請求項１５】
洗眼液、洗口剤、軟膏、又は局所使用のための溶液の形態である、請求項１２記載の医薬的組成物。
【請求項１６】
請求項１〜１１記載のペプチドを含む抗菌活性を伴う殺菌剤及び／又は界面活性剤。
【請求項１７】
食品産物及び／又は化粧品産物及び／又はホメオパシー産物の調製のための保存剤としての請求項１〜１１記載のペプチドの使用。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【公表番号】特表２０１２−５０４５９７（Ｐ２０１２−５０４５９７Ａ）
【公表日】平成２４年２月２３日（２０１２．２．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５２９６７１（Ｐ２０１１−５２９６７１）
【出願日】平成２１年１０月５日（２００９．１０．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００９／０５４３４７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０３８２２０
【国際公開日】平成２２年４月８日（２０１０．４．８）
【出願人】（５０７２７４１０２）ウニヴェルシタ・デグリ・ストゥディ・ディ・シエナ (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年２月２３日（２０１２．２．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月５日（２００９．１０．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００９／０５４３４７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０３８２２０
【国際公開日】平成２２年４月８日（２０１０．４．８）
【出願人】（５０７２７４１０２）ウニヴェルシタ・デグリ・ストゥディ・ディ・シエナ (2)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]